CN111257555A - 新冠病毒核酸重组酶介导等温扩增侧向层析胶体金快速检测方法及试纸条 - Google Patents
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Abstract
一种新冠病毒核酸重组酶介导等温扩增侧向层析胶体金快速检测用试纸条，包括衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫；所述硝酸纤维膜上设有检测线和质控线；质控线上喷涂羊抗鼠抗体，检测线上喷涂链霉亲和素；金标结合垫上喷涂有胶体金标记的鼠抗异硫氰荧光素抗体。样品经过酶介导等温扩增获得的扩增产物滴加到样品垫，根据颜色反应即可获得检测结果。本发明的检测结果的判读是根据胶体金试纸条上的检测线是否显色进行判别，无需复杂的专业背景，通过肉眼判读即可完成。
Description
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域，涉及一种新冠病毒核酸重组酶介导等温扩增侧向层析胶体金快速检测方法及试纸条。
背景技术
目前新型冠状病毒的核酸检测是对病例确诊的唯一手段，实时荧光定量RT-PCR技术被广泛运用，获批的检测试剂生产厂家很多,产能也满足实际需求，但该方法需要BSL-2级实验室、实时荧光定量PCR仪和核酸提取仪等苛刻条件和昂贵设备，且检测周期较长(3-4小时)，试剂耗材成本高。目前只能在部分市级疾控中心和三甲医疗机构中开展，检测能力不能满足实际需求，急需一种能在普通实验室操作、无需高档设备、快速检测、直接判读的核酸检测方法。
等温扩增是指在特殊的重组酶的作用下，对目标模板基因在等温的条件下实现指数级扩增的反应。因等温扩增反应是在等温的条件下实现的扩增反应，因此，无需专业的扩增仪器即可实现目标基因的扩增，从而有利于快速定性和下游的定量分析。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新冠病毒核酸重组酶介导等温扩增侧向层析胶体金快速检测方法及试纸条。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种新冠病毒核酸重组酶介导等温扩增侧向层析胶体金快速检测用试纸条，包括衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫；所述硝酸纤维膜上设有检测线和质控线；质控线上喷涂羊抗鼠抗体，检测线上喷涂链霉亲和素；金标结合垫上喷涂有胶体金标记的鼠抗异硫氰荧光素抗体；所述金标结合垫的制备方法包括：
步骤1：用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成胶体金溶液；
步骤2：用0.1mol/L的K2CO3调节胶体金溶液的pH值为8.0，将1mL pH值为8.0的胶体金溶液加入1.5mL离心管中，然后加入1μL浓度为1mg/mL的抗异硫氰荧光素单克隆抗体溶液，在旋转混合仪上室温反应1h，然后加入80μL的质量分数为10％的BSA溶液，继续在旋转混合仪上室温反应30min，得到金标抗体溶液；将金标抗体溶液10000rpm离心10min；吸取凝聚的金颗粒形成的沉淀20μL，最后用80μL重悬液将吸取出的沉淀重悬，4℃保存备用，获得异硫氰荧光素胶体金标记抗体；
步骤3：将6μL的异硫氰荧光素胶体金标记抗体，吸附于玻璃纤维棉中，37℃干燥，制备的异硫氰荧光素金标结合垫为金标结合垫。
优选的技术方案为：所述重悬液为所述重悬液为含1％蔗糖的7％BSA溶液。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种新冠病毒核酸重组酶介导等温扩增侧向层析胶体金快速检测方法，包括下列步骤：
步骤1：将采集的样本加入裂解液中，提取得到核酸提取物；
步骤2：进行等温扩增反应；
等温扩增体系包括如下的反应物：
所有扩增反应物加完后加水补足体积到45-48uL；在进行等温扩增反应之前，向等温扩增体系中加入2-5uL激活剂；加完激活剂后，将等温扩增反应体系置于37-40度的等温扩增反应装置的反应容器中，进行扩增反应20-30分钟，然后升温至70-80度的条件下反应10-15min，然后冷却到室温；将扩增产物滴加到权利要求1或2的试纸条的样品垫上，待反应3-5分钟后，观察试纸条上检测线和质控线，通过检测线和质控线的出现情况对检测结果进行判断；
上游引物F：5’-CGTCTGCGGTATGTGGA-3’；
下游引物R：5’-TGTAGATGTCAAAAGCCCTGTA-3’；
检测线呈现红色，则为阳性，检测线不显色，则为阴性。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
本方法由等温扩增与试纸条判读两个步骤构成，扩增部分时间为20-30分钟，结果判读部分时间为3-5分钟，较传统的RT-PCR方法缩短2-3小时，能满足现场快速、高通量筛查的需求。
附图说明
图1检测结果图。
图2新冠病毒核酸等温扩增胶体金试纸条检测流程。
图3几种常见的新冠病毒检测方法比较。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
请参阅图1-3。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
实施例1：一种新冠病毒核酸重组酶介导等温扩增侧向层析胶体金快速检测方法
1、等温扩增引物设计：
根据序列Wuhan seafood market pneumonia virus isolate Wuhan-Hu-1,complete genome(NCBI Reference Sequence:NC_045512.2)，应用dnastar lasergene7.1软件设计引物。orf1ab，长度197。
上游引物F：5’-CGTCTGCGGTATGTGGA-3’；
下游引物R：5’-TGTAGATGTCAAAAGCCCTGTA-3’；
2、核酸制备
取140μL样本(咽拭子、鼻咽拭子、血浆、血清、尿液、病毒分离培养物)，本实施例具体为咽拭子，加入含有5.6μg Carrier RNA的560μL的AVL裂解液中，按QIAamp Viral RNAMini Handbook(Qiagen公司，catalog#52904/52906)说明书提取病毒RNA，洗脱体积50μL。
3、等温扩增
取5uL目标病毒的核酸提取物，加入到等温扩增混合溶液反应体系中，等温扩增体系包括2uL的biotin标记的上游引物F和2uL的FITC标记的下游引物R，在扩增体系中加入3uL的逆转录酶，1uL的RNA抑制酶，所有扩增反应物加完后加水补足体积到48uL。在进行等温扩增反应之前，向扩增体系中加入2uL激活剂。加完激活剂后，立刻将扩增反应体系至于37-40度的反应容器中，进行扩增反应25分钟后，将扩增体系置于75度的温度下反应12min，待冷却到室温后。取2uL扩增产物与28uL上样液(PD)混合后，滴加到胶体金试纸条的样品垫上，待反应3-5分钟后，观察胶体金侧向层析试纸条上检测线(T线)和质控线(C线)，通过T线和C线的出现情况对检测结果的阴阳性进行判断。生物素标记的上游引物F，异硫氰基荧光素标记的下游引物R由上海生工生物工程公司合成。重悬液的配置方法：100mLPBS中加入7mg BSA和1mg蔗糖。逆转录酶、RNA抑制酶、激活剂等试剂均购自美国普洛麦格公司。
结果展示：通过分子扩增后，将扩增产物直接滴加于胶体金标记侧向层析试纸条，产生的条带清晰，阳性标本检测线(T线)呈现肉眼可以分辨的红色，阴性标本不显色(T线)，控制线(C线)表明检测结果有效，检测结果如图1所示，由左至右，第一～第三个为阳性，均为红色，第四个为阴性标本，不显色；第五个为水，不显色。与实时荧光定量RT-PCR法高度一致。
等温扩增无需复杂、昂贵的PCR仪、核酸提取仪等设备，使用恒温金属浴或水浴保持恒定的反应温度即可实现目标基因的扩增反应，在少量样本的情况下，甚至在家庭可用酸奶机、带发酵功能的烤箱等具有相对固定温度加热器件代替金属浴进行；检测结果的判读是根据胶体金试纸条上的检测线是否显色进行判别，无需复杂的专业背景，通过肉眼判读即可完成。
目前有报道显示新冠病毒核酸检测重组酶介导等温扩增方法被广泛采用，但多采用专用仪器进行荧光检测，胶体金技术也主要被用于新冠病毒的抗体(IgG、IgM)检测，两者结合进行新冠病毒核酸检测技术由于存在一定技术瓶颈还没有被其他单位研发和应用，几种常见的新冠病毒检测方法比较见图3。
技术原理：根据新型冠状病毒全基因序列设计扩增引物序列并进行优化和功能设计，使得基于功能化设计引物探针对的扩增产物均为双标记扩增产物。使用自带裂解液的样品管对临床病毒各种样本(包括咽拭子、鼻拭子、痰液、眼结膜拭子粪便、抗凝血和血清等等)进行收集，经过快速裂解处理后，直接取处理样本加入到重组酶介导的等温扩增体系中，经过金属浴或水浴进行快速等温扩增后(20-30分钟)，得到双标记扩增产物。阳性样本经过快速扩增后，扩增体系中存在大量双标记功能化扩增产物，将扩增产物直接滴加于胶体金标记的侧向层析试纸条，抗体修饰的胶体金纳米粒子和固定于胶体金试纸条检测线上的抗体同时识别双标记扩增产物，在测试线上形成基于双标记双链扩增产物的夹心结构，从而将胶体金纳米粒子固定于试纸条的检测线上，使检测线呈现肉眼可以分辨的红色，判读为病毒阳性结果。
阴性样本中不含有目标病毒基因，扩增体系中扩增后不存在扩增产物。将扩增体系的溶液滴加于胶体金侧向层析试纸条样品垫上，由于扩增产物中不存在双标记功能化双链核酸结构，因此，在胶体金试纸条的检测线上不会形成夹心结构，抗体标记的胶体金纳米粒子不会被固定于试纸条的检测线上，检测线不呈现颜色，判断检测结果为阴性。
本方法为新冠病毒核酸重组酶介导等温扩增侧向层析胶体金快速检测试纸条法，简称新冠病毒核酸等温扩增胶体金捕获法，其扩增及捕获检测均不需要特殊的仪器研制成功后可广泛运用于基层疾控中心和医疗机构，甚至是家庭，对高风险人群开展快速筛查，及时发现病人，及时隔离，提高监测及时性和敏感性，快速有效控制新冠肺炎的传播。
实施例2：一种新冠病毒核酸重组酶介导等温扩增侧向层析胶体金快速检测方法
一种新冠病毒核酸重组酶介导等温扩增侧向层析胶体金快速检测用试纸条，包括衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫；所述硝酸纤维膜上设有检测线和质控线；质控线上喷涂羊抗鼠抗体，检测线上喷涂链霉亲和素；金标结合垫上喷涂有胶体金标记的鼠抗异硫氰荧光素抗体；所述金标结合垫的制备方法包括：
步骤1：用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成胶体金溶液；
步骤2：用0.1mol/L的K2CO3调节胶体金溶液的pH值为8.0，将1mL pH值为8.0的胶体金溶液加入1.5mL离心管中，然后加入1μL浓度为1mg/mL的抗异硫氰荧光素单克隆抗体溶液，在旋转混合仪上室温反应1h，然后加入80μL的质量分数为10％的BSA溶液，继续在旋转混合仪上室温反应30min，得到金标抗体溶液；将金标抗体溶液10000rpm离心10min；吸取凝聚的金颗粒形成的沉淀20μL，最后用80μL重悬液将吸取出的沉淀重悬，4℃保存备用，获得异硫氰荧光素胶体金标记抗体；
步骤3：将6μL的异硫氰荧光素胶体金标记抗体，吸附于玻璃纤维棉中，37℃干燥，制备的异硫氰荧光素金标结合垫为金标结合垫。
所述重悬液为所述重悬液为含1％蔗糖的7％BSA溶液。
检测方法，包括下列步骤：
步骤1：将采集的样本加入裂解液中，提取得到核酸提取物；
步骤2：进行等温扩增反应；
等温扩增体系包括如下的反应物：
所有扩增反应物加完后加水补足体积到45uL；在进行等温扩增反应之前，向等温扩增体系中加入2uL激活剂；加完激活剂后，将等温扩增反应体系置于37度的等温扩增反应装置的反应容器中，进行扩增反应20分钟，然后升温至70度的条件下反应10min，然后冷却到室温；将扩增产物滴加到试纸条的样品垫上，待反应3-5分钟后，观察试纸条上检测线和质控线，通过检测线和质控线的出现情况对检测结果进行判断；
上游引物F：5’-CGTCTGCGGTATGTGGA-3’；
下游引物R：5’-TGTAGATGTCAAAAGCCCTGTA-3’；
检测线呈现红色，则为阳性，检测线不显色，则为阴性。
实施例3：一种新冠病毒核酸重组酶介导等温扩增侧向层析胶体金快速检测方法
一种新冠病毒核酸重组酶介导等温扩增侧向层析胶体金快速检测用试纸条，包括衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫；所述硝酸纤维膜上设有检测线和质控线；质控线上喷涂羊抗鼠抗体，检测线上喷涂链霉亲和素；金标结合垫上喷涂有胶体金标记的鼠抗异硫氰荧光素抗体；所述金标结合垫的制备方法包括：
步骤1：用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成胶体金溶液；
步骤2：用0.1mol/L的K2CO3调节胶体金溶液的pH值为8.0，将1mL pH值为8.0的胶体金溶液加入1.5mL离心管中，然后加入1μL浓度为1mg/mL的抗异硫氰荧光素单克隆抗体溶液，在旋转混合仪上室温反应1h，然后加入80μL的质量分数为10％的BSA溶液，继续在旋转混合仪上室温反应30min，得到金标抗体溶液；将金标抗体溶液10000rpm离心10min；吸取凝聚的金颗粒形成的沉淀20μL，最后用80μL重悬液将吸取出的沉淀重悬，4℃保存备用，获得异硫氰荧光素胶体金标记抗体；
步骤3：将6μL的异硫氰荧光素胶体金标记抗体，吸附于玻璃纤维棉中，37℃干燥，制备的异硫氰荧光素金标结合垫为金标结合垫。
所述重悬液为所述重悬液为含1％蔗糖的7％BSA溶液。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种新冠病毒核酸重组酶介导等温扩增侧向层析胶体金快速检测方法，包括下列步骤：
步骤1：将采集的样本加入裂解液中，提取得到核酸提取物；
步骤2：进行等温扩增反应；
等温扩增体系包括如下的反应物：
所有扩增反应物加完后加水补足体积到48uL；在进行等温扩增反应之前，向等温扩增体系中加入5uL激活剂；加完激活剂后，将等温扩增反应体系置于40度的等温扩增反应装置的反应容器中，进行扩增反应30分钟，然后升温至80度的条件下反应15min，然后冷却到室温，获得的扩增产物滴加到试纸条的样品垫上，待反应3-5分钟后，观察试纸条上检测线和质控线，通过检测线和质控线的出现情况对检测结果进行判断；
上游引物F：5’-CGTCTGCGGTATGTGGA-3’；
下游引物R：5’-TGTAGATGTCAAAAGCCCTGTA-3’；
检测线如图1的中间部分所示，呈现红色。
以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。
Claims (3)
1.一种新冠病毒核酸重组酶介导等温扩增侧向层析胶体金快速检测用试纸条，包括衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫；其特征在于：所述硝酸纤维膜上设有检测线和质控线；质控线上喷涂羊抗鼠抗体，检测线上喷涂链霉亲和素；金标结合垫上喷涂有胶体金标记的鼠抗异硫氰荧光素抗体；所述金标结合垫的制备方法包括：
步骤1：用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成胶体金溶液；
步骤2：用0.1mol/L的K2CO3调节胶体金溶液的pH值为8.0，将1mL pH值为8.0的胶体金溶液加入1.5mL离心管中，然后加入1μL浓度为1mg/mL的抗异硫氰荧光素单克隆抗体溶液，在旋转混合仪上室温反应1h，然后加入80μL的质量分数为10％的BSA溶液，继续在旋转混合仪上室温反应30min，得到金标抗体溶液；将金标抗体溶液10000rpm离心10min；吸取凝聚的金颗粒形成的沉淀20μL，最后用80μL重悬液将吸取出的沉淀重悬，4℃保存备用，获得异硫氰荧光素胶体金标记抗体；
步骤3：将6μL的异硫氰荧光素胶体金标记抗体，吸附于玻璃纤维棉中，37℃干燥，制备的异硫氰荧光素金标结合垫为金标结合垫。
2.根据权利要求1所述的有机硅网络原位插层堆叠氧化铝材料，其特征在于：所述重悬液为所述重悬液为含1％蔗糖的7％BSA溶液。
3.一种新冠病毒核酸重组酶介导等温扩增侧向层析胶体金快速检测方法，其特征在于：包括下列步骤：
步骤1：将采集的样本加入裂解液中，提取得到核酸提取物；
步骤2：进行等温扩增反应；
等温扩增体系包括如下的反应物：
所有扩增反应物加完后加水补足体积到45-48uL；在进行等温扩增反应之前，向等温扩增体系中加入2-5uL激活剂；加完激活剂后，将等温扩增反应体系置于37-40度的等温扩增反应装置的反应容器中，进行扩增反应20-30分钟，然后升温至70-80度的条件下反应10-15min，然后冷却到室温；将扩增产物滴加到权利要求1或2的试纸条的样品垫上，待反应3-5分钟后，观察试纸条上检测线和质控线，通过检测线和质控线的出现情况对检测结果进行判断；
上游引物F：5’-CGTCTGCGGTATGTGGA-3’；
下游引物R：5’-TGTAGATGTCAAAAGCCCTGTA-3’；
检测线呈现红色，则为阳性，检测线不显色，则为阴性。
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