CN113667775A - 一种用于hcv病毒核酸检测的dna探针、试纸条及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于HCV病毒核酸检测的DNA探针、试纸条及其应用，该DNA探针的检测方法利用催化发夹自组装技术偶联侧向免疫层析试纸条即可快速检测患者样本中的HCV。本发明提供的DNA探针能在30分钟内即可完成检测，且操作简单，检测结果具有高灵敏性和高特异性；在加样孔滴加反应液后，随着层析作用缓慢向结合垫处流动，当存在目标链target时形成H1+H2杂交双链，此时，结合垫处标记的纳米微球能够捕获H2标记的生物素，形成亲和素‑纳米微球‑H1+H2杂交双链复合物；反应液继续向前流动，在检测线T处，包被的抗地高辛抗体捕获H1标记的地高辛，形成亲和素‑纳米微球‑H1+H2杂交双链‑抗地高辛复合物。

Description

一种用于HCV病毒核酸检测的DNA探针、试纸条及其应用

技术领域

本发明涉及核酸检测技术领域，具体是一种用于HCV病毒核酸检测的DNA探针、试纸条及其应用。

背景技术

丙型肝炎病毒属黄病毒科，HCV的基因组由单股正链RNA组成，总长9.4kb，可分为6个基因型。HCV的感染已成为全球公共卫生问题，我国为高危地区，将近80％的感染者发展成慢性肝炎并引起肝硬化。由于HCV的疫苗尚未研发，因此丙型肝炎病毒的检测对HCV感染防治具有重要意义，预防病症，控制病毒传播有效管理患者。目前，临床实验室检查主要以核酸检测和血清抗体检测为主。血清抗体检测主要用于丙型肝炎的筛查，但是易出现假阴性结果。对于抗-HCV阳性者应进一步检测HCV-RNA，以确定是否为现症感染,然而核酸PCR方法复杂，对于环境和技术人员要求严格。丙型肝炎防治指南(2019版)指出，HCV的实验室检查仍然以HCV-RNA检测作为金标准，应用最为广泛的q-PCR方法成熟，特异性高，并可以实现HCV基因分型。但是，q-PCR需要在精密的大型荧光定量PCR仪上进行长时操作，对于操作人员有一定的技术要求，其仪器昂贵，耗时较长很难在小型医院及偏远地区开展检测，因此PCR很难实现现场即时检测(POCT)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于HCV病毒核酸检测的DNA探针、试纸条及其应用，利用侧向免疫层析试纸条，无需RNA提取，在等温无酶环境下即可快速、高特异性、高灵敏度地检测HCV核酸，实现HCV现场即时检测。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种用于HCV病毒核酸检测的DNA探针，所述DNA探针包括探针H1和探针H2，序列如下：

探针H1:CCGGTTCCGCAGACCACTATGCCATGTGTAGACATAGTGGTCTGCG

探针H2:CACTATGTCTACACATGGCATAGTGGTCTGCGCCATGTGTAGA

进一步地，所述探针H1和探针H2均设计成发夹结构，探针H1的5’端由地高辛修饰，探针H2的5’端由生物素修饰。

进一步地，所述DNA探针与目的检测序列混合，目标检测序列触发反应，形成H1+H2杂交双链。

进一步地，所述DNA探针与目的检测序列混合产物通过非还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证，包括以下步骤：

S21、将探针H1和探针H2在经过退火处理并将探针H1和探针H2与目标检测序列稀释至1μM，取5μL探针H1、15μL探针H2和5μL目标序列充分混匀，在37℃水浴锅中反应30分钟；

S22、将S21中混合液用6xDNA上样缓冲液稀释，取20μL上样进行电泳，电泳凝胶泳通过EB染色后凝胶成像显示泳道条带。

一种用于HCV病毒核酸检测的试纸条，所述试纸条为侧向免疫层析试纸条，H1+H2杂交双链通过侧向免疫层析试纸条检测。

进一步地，所述侧向免疫层析试纸条分别由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫构成。

进一步地，所述结合垫上包被有AlexaFluor647荧光素和亲和素双标记的纳米微球，硝酸纤维素膜标有检测线和质控线。

进一步地，所述检测线处通过喷洒抗地高辛/地高辛单克隆抗体制备，质控线通过在其上涂抹生物素形成。

所述侧向免疫层析试纸条在加样孔滴加反应液后，随着层析作用缓慢向结合垫处流动，当存在目标链target时形成H1+H2杂交双链，此时，结合垫处标记的纳米微球能够捕获H2标记的生物素，形成亲和素-纳米微球-H1+H2杂交双链复合物；反应液继续向前流动，在检测线处，包被的抗地高辛抗体捕获H1标记的地高辛，形成亲和素-纳米微球-H1+H2杂交双链-抗地高辛复合物；当目标序列不存在时，两条探针不能结合，质控线处捕获H2探针。

DNA探针的应用，所述DNA探针应用于HCV病毒核酸检测。

本发明的有益效果：

1、本发明DNA探针配合侧向免疫层析试纸条，高效的对HCV进行检测，操作简单方便，降低医疗工作者检测难度；

2、本发明DNA探针检测过程无需提取RNA，在等温无酶环境下即可快速、高特异性、高灵敏度地检测HCV核酸，实现HCV现场即时检测。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1是催化发夹自组装系统偶联侧向免疫层析试纸条检测HCV的示意图；A表示催化发夹自组装反应放大信号原理；B表示试纸条检测催化发夹自组装产物H1+H2杂交双链的原理；

图2是本发明设计的目标序列及探针H1和探针H2序列；

图3是电泳验证催化发夹自组装检测HCV可行性；

图4催化发夹自组装系统偶联侧向免疫层析试纸条检测HCV的灵敏度；

图5催化发夹自组装系统偶联侧向免疫层析试纸条检测HCV的特异性；

图6化发夹自组装系统偶联侧向免疫层析试纸条检测HCV检测临床阳性标本；

图7是特异性研究所需序列表；

图8为侧向免疫层析试纸条结构示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

如图1所示，探针检测管制备

S11、根据HCV-5’UTR保守区进行多序列比对，并选出含有21个碱基的保守序列作为目标检测序列(Target)，如图2所示；

S12、根据筛选的目标检测序列设计两条发夹探针H1和H2,分别用地高辛(Digoxin)修饰H1的5’端，生物素(Biotin)修饰H2的5’端，当目标检测序列存在时，由目标检测序列触发反应，依次打开发夹探针H1和探针H2，由于序列互补形成H1+H2杂交双链；

S13、将探针H1和H2分别用TNaK+Mg²⁺(20×10^-3m Tris,pH 7.5；140×10^-3m NaCl；5×10^-3m KCl，5×10^-3mMgCl)缓冲液溶解至200nM，并进行退火，在95℃下处理10分钟后逐渐降至室温2小时；

S14、退火后分别取5μL探针H1和15μL探针H2于检测管中，并放置-20℃冰箱备用。

实施例2

电泳验证催化发夹自组装系统可行性

S21、通过6-15％(优选12％)的非还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证系统，将探针H1、H2在经过退火处理并将探针与目标检测序列稀释至1μM，各取5μL探针H1、15μL探针H2以及5μL目标序列充分混匀，在37℃水浴锅中反应30分钟，

S22、将S21中混合液用6x上样缓冲液稀释后，取20μL上样，在110V、60分钟的条件下进行电泳，电泳凝胶泳通过EB染色10分钟后凝胶成像显示泳道1-6条带，分别是:探针H1，H2，目标检测序列，两种探针H1和H2混合物，探针H1和目标序列混合物，探针H1、H2和目标序列混合物。

如图3所示，上述电泳结果表明，不存在目标检测序列时，所设计两个发夹探针H1和H2不能够互相结合，只有当目标检测序列同时存在时，两个探针H1和H2的发夹结构依次被打开，并能结合形成H1+H2杂交双链。

实施例3

催化发夹自组装系统偶联侧向免疫层析试纸条检测HCV的灵敏度分析

S31、根据目标检测序列合成DNA目标链(DNA目标链为单链)，将合成的DNA目标链用TNaK+Mg²⁺缓冲液溶解至200nM，并以正常人群血清作为稀释液进行稀释，浓度由10nM倍比稀释至1fM；

S32、取80μL DNA目标链溶液加入至步骤S14所制备的检测管溶液中，充分混匀，在37℃水浴锅中反应30分钟得到反应液；

S33、将S32中反应液取80μL滴加至侧向免疫层析试纸条，15分钟后在荧光检测仪上读取检测线与质控线处荧光值。

如图8所示，侧向免疫层析试纸条用于检测由地高辛和生物素修饰的H1+H2杂交双链，侧向免疫层析试纸条分别由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫构成。结合垫上包被有AlexaFluor647荧光素和亲和素双标记的纳米微球，硝酸纤维素膜标有检测线(T)和质控线(C)，硝酸纤维素膜的检测线处通过喷洒小鼠抗地高辛/地高辛单克隆抗体制备，质控线通过在其上涂抹生物素形成。

侧向免疫层析试纸条在加样孔滴加反应液后，随着层析作用缓慢向结合垫处流动，当存在目标检测序列target时形成H1+H2杂交双链，此时，结合垫处标记的纳米微球能够捕获H2标记的生物素，形成亲和素-纳米微球-H1+H2杂交双链复合物；反应液继续向前流动，在检测线T处，包被的抗地高辛抗体捕获H1标记的地高辛，形成亲和素-纳米微球-H1+H2杂交双链-抗地高辛复合物；当目标检测序列不存在时，两条探针不能结合，质控线处捕获H2探针，最后，检测线和质控线的荧光强度通过荧光检测装置进行定量。

检测结果如图4所示，以阴性空白对照所测荧光值的x+3SD为临床Cuttoff值，并以该值设置最低检测限，显示最低检测灵敏度可至10fM。

实施例4

催化发夹自组装系统偶联侧向免疫层析试纸条检测HCV的特异性分析

S41、根据目标检测序列分别设计四条突变序列，分别为单碱基错配(mismatch-1)、双碱基错配(mismatch-2)、插入单碱基序列(insert)、缺失单碱基序列(deletion)，序列如图7所示；

S42、将S41中的四条序列分别用TNaK+Mg²⁺缓冲液溶解至200nM，并取80μL加入检测管中，充分混匀，在37℃水浴锅中反应30分钟得到反应液；

S33、将S42中反应液取80μL滴加至侧向免疫层析试纸条，15分钟后再荧光检测仪上读取检测线与质控线处荧光值。

检测结果如图5所示，目标检测序列所测得荧光值与突变序列所测荧光值存在明显差异，结果表明该检测方法对于HCV检测有高度特异性。

实施例5

催化发夹自组装系统偶联侧向免疫层析试纸条检测HCV临床阳性标本

S51、收集5例HCV核酸检测阳性标本与5例阴性标本，取80μL血清标本分别加入步骤S14的检测管中，充分混匀，在37℃水浴锅中反应30分钟得到反应液；

S52、将反应液取80μL滴加至侧向免疫层析试纸条，15分钟后再荧光检测仪上读取检测线与质控线处荧光值。

结果如图6所示，将5例阴性标本所测得荧光值取均值，所测得5例阳性标本荧光值均与阴性均值存在倍数差异。结果表明该检测方法可用于检测HCV临床标本。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

Claims (9)

1.一种用于HCV病毒核酸检测的DNA探针，其特征在于，所述DNA探针包括探针H1和探针H2，序列如下：

探针H1:CCGGTTCCGCAGACCACTATGCCATGTGTAGACATAGTGGTCTGCG

探针H2:CACTATGTCTACACATGGCATAGTGGTCTGCGCCATGTGTAGA

2.根据权利要求1所述的一种用于HCV病毒核酸检测的DNA探针，其特征在于，所述探针H1和探针H2均设计成发夹结构，探针H1的5’端由地高辛修饰，探针H2的5’端由生物素修饰。

3.根据权利要求1所述的一种用于HCV病毒核酸检测的DNA探针，其特征在于，所述DNA探针与目的检测序列混合，目标检测序列触发反应，形成H1+H2杂交双链。

4.根据权利要求1所述的一种用于HCV病毒核酸检测的DNA探针，其特征在于，所述DNA探针与目的检测序列混合产物通过非还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证，包括以下步骤：

S21、将探针H1和探针H2在经过退火处理并将探针H1和探针H2与目标检测序列稀释至1μM，取5μL探针H1、15μL探针H2和5μL目标序列充分混匀，在37℃水浴锅中反应30分钟；

S22、将S21中混合液用6xDNA上样缓冲液稀释，取20μL上样进行电泳，电泳凝胶泳通过EB染色后凝胶成像显示泳道条带。

5.据权利要求3所述的一种用于HCV病毒核酸检测的试纸条，其特征在于，所述试纸条为侧向免疫层析试纸条，H1+H2杂交双链通过侧向免疫层析试纸条检测。

6.据权利要求5所述的一种用于HCV病毒核酸检测的试纸条，其特征在于，所述侧向免疫层析试纸条分别由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫构成。

7.据权利要求6所述的一种用于HCV病毒核酸检测的试纸条，其特征在于，所述结合垫上包被有AlexaFluor647荧光素和亲和素双标记的纳米微球，硝酸纤维素膜标有检测线和质控线。

8.据权利要求7所述的一种用于HCV病毒核酸检测的试纸条，其特征在于，所述检测线处通过喷洒抗地高辛/地高辛单克隆抗体制备，质控线通过在其上涂抹生物素形成。

9.根据权利要求1所述的DNA探针的应用，其特征在于，所述DNA探针应用于HCV病毒核酸检测。

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