CN105779602B - 一种检测端粒酶活性的胶体金试纸条及试剂盒与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种检测端粒酶活性的胶体金试纸条及试剂盒与应用，属于分子检测领域。该胶体金试纸条中硝酸纤维素膜上设有用T‑DNA‑链霉亲和素偶合物溶液印制的隐形检测线。本发明在胶体金表面修饰端粒酶引物P‑DNA，并利用端粒酶引物的核苷酸序列在端粒酶的催化下延伸的特性，使得胶体金表面的引物延伸出重复序列，再通过胶体金试纸条检测线上修饰的捕获探针T‑DNA捕获胶体金并进行显色，从而实现对端粒酶样品活性的快速检测。本发明提供的检测端粒酶活性的胶体金试纸条及试剂盒，价格低廉、快速简便、特异性高，无需采用复杂仪器设备，用于解决现有技术中步骤复杂、检测耗时、可重复性差或需要采用特殊检测仪器等问题。

Description

一种检测端粒酶活性的胶体金试纸条及试剂盒与应用

技术领域

本发明属于分子检测领域，具体涉及一种检测端粒酶活性的胶体金试纸条及试剂盒与应用。

背景技术

端粒酶是一种能够在真核生物染色体末端DNA重复添加序列(TTAGGG)_n并使DNA得以延长的逆转录酶。端粒酶的活性在正常组织细胞中受到明显抑制，而在大多数肿瘤细胞中大量表达且活性明显增强，这一特点使得端粒酶活性的检测成为了肿瘤诊断与治疗中的重要课题，高灵敏地检测端粒酶活性对于癌症等相关疾病的早期诊断和药物筛选有重要的意义。

传统检测端粒酶活性的技术主要是建立在聚合酶链反应(PCR)基础上的对端粒酶重复延伸片段(TTAGGG)进行扩增(TRAP)来检测端粒酶活性，但是此方法耗时、操作繁琐，且需要PCR仪才能完成。近年来也发展出了一些不需要PCR步骤的检测方法，如基于荧光、电化学等响应信号的检测方法，这些方法具有较高的灵敏度，但检测探针合成步骤复杂、分析方法需要大量准备工作、可重复性差或需要应用特殊的检测仪器等缺点，使这些端粒酶活性检测方法难以在生物研究、医学诊断等实际应用领域推广和使用。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种检测端粒酶活性的胶体金试纸条。

本发明的另一目的在于提供所述的检测端粒酶活性的胶体金试纸条的制备方法。

本发明的另一目的在于提供一种检测端粒酶活性的试剂盒。

本发明的再一目的在于提供一种检测端粒酶活性的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种检测端粒酶活性的胶体金试纸条，由底板、缓冲液板、样品板、硝酸纤维素膜和吸水板构成，将底板、缓冲液板、样品板、硝酸纤维素膜和吸水板按如下结构组装：底板在最下层，硝酸纤维素膜粘贴在底板上的中间部位，样品板位于硝酸纤维素膜的上部的一侧并与之重叠，缓冲液板位于样品板的上部与之重叠，吸水板位于硝酸纤维素膜的上部相对于样品板的另一侧并与硝酸纤维素膜重叠；所述的硝酸纤维素膜上设有用捕获探针(T-DNA)-链霉亲和素偶合物溶液印制的隐形检测线，以及用对照探针(C-DNA)-链霉亲和素偶合物印制的隐形控制线。所述的隐形检测线靠近样品板，隐形控制线靠近吸水板。

所述的隐形检测线宽2mm，与样品板相隔6mm，所述的隐形控制线宽2mm与样品板相隔12mm。

所述的底板的材料优选为PVC塑料。

所述的缓冲液板的材料优选为玻璃纤维。

所述的样品板的材料优选为玻璃纤维，其处理方法为：用样品板处理缓冲液浸润，置于干燥器中室温保存；所述的样品板处理缓冲液为：pH 8.0，体积百分比0.25％的TritonX-100，0.05M Tris-HCl，0.15M NaCl。

所述的硝酸纤维素膜的处理方法优选为：用喷膜仪将6μL捕获探针(T-DNA)-链霉亲和素偶合物溶液喷到隐形检测线的位置，将6μL对照探针(C-DNA)-链霉亲和素偶合物溶液喷到隐形控制线的位置，置于室温下干燥1h，并于4℃干燥保存；所述的链霉亲和素溶液浓度为0.67mg/mL，所述的T-DNA和C-DNA的浓度均为33μM；

所述的吸水板的材料优选为吸水纤维。

所述的捕获探针(T-DNA)为5'-TTT TTT TTT T CTA ACC CTA ACC CTA ACC-3'；

所述的对照探针(C-DNA)为5'-TTT TTT TTT T AAC TCT GCT CGA CGG ATT-3'；

所述的检测端粒酶活性的胶体金试纸条的制备方法，包括如下步骤：

附着于底板(材料为PVC塑料)上且依次紧密相连的缓冲液板(材料为玻璃纤维)、样品板(材料为玻璃纤维)、硝酸纤维素膜和吸水板(材料为吸水纤维)；所述的紧密连接的方式优选为硝酸纤维素膜粘贴在底板上的中间部位，样品板位于硝酸纤维素膜上部的一侧并与之重叠2mm，缓冲液板位于样品板的上部与之重叠2mm，吸水板位于硝酸纤维素膜上部相对于样品板和缓冲液板的另一侧并与硝酸纤维素膜重叠2mm；最后用切条机切成4mm宽的条。硝酸纤维素膜上有一条含捕获探针(T-DNA)-链霉亲和素偶合物的隐形检测线和一条含对照探针(C-DNA)-链霉亲和素偶合物的隐形控制线，隐形检测线靠近样品板，隐形控制线靠近吸水板；隐形检测线宽度为2mm与样品板相隔6mm，控制线宽度为2mm与样品板相隔12mm。

一种检测端粒酶活性的试剂盒，包括上述胶体金试纸条、延伸反应溶液以及交联缓冲液。

所述的延伸反应溶液包含扩增缓冲液、dNTPs和修饰了P-DNA的胶体金溶液。

所述的P-DNA为5'-SH-(CH₂)₆-TTT TTT TTTTAAT CCG TCG AGC AGA GTT-3'。

所述的扩增缓冲液的成分优选为：1×TRAP buffer，具体包含：20mM Tris–HCl pH8.3，1.5mM MgCl₂，63mM KCl，0.005％Tween 20，1mM EGTA，BSA 0.1mg/mL。

所述的dNTPs成分优选为：dATP、dTTP、dCTP、dGTP，浓度范围为：100μM～2mM，浓度优选为：1mM。

所述的修饰了P-DNA的胶体金溶液中胶体金的浓度范围为：1nM～50nM，优选为：10nM。

所述的交联缓冲液优选为包含：20mM Na₃PO₄，质量百分比5％BSA，质量百分比8％蔗糖。

所述的检测端粒酶活性的试剂盒在端粒酶活性检测中的应用。

一种检测端粒酶活性的方法，包括如下步骤：

在胶体金表面修饰端粒酶引物(P-DNA)，并利用端粒酶引物的核苷酸序列在端粒酶的催化下延伸的特性，使得胶体金表面的引物延伸出重复序列，再通过胶体金试纸条检测线上修饰的捕获探针T-DNA捕获胶体金并进行显色，从而实现对端粒酶样品活性的快速检测。

所述的检测端粒酶活性的方法，包括如下具体步骤：

(1)细胞收集及细胞内端粒酶的提取：通过离心收集细胞，对细胞进行酶解，然后提取细胞内的端粒酶；

(2)在胶体金表面修饰端粒酶引物(P-DNA)；

(3)胶体金试纸条的制备：按照上述步骤制备得到；

(4)延伸反应：在含有扩增缓冲液、dNTPs和修饰了P-DNA的胶体金溶液的EP管中加入待测端粒酶提取物样品，在23℃～37℃下恒温孵育，使P-DNA发生延伸反应，在3'端延伸出(TTAGGG)_n延伸序列，其中，n为2～10的自然数，得到延伸反应产物溶液。

(5)测试：将延伸反应产物溶液滴加到上述胶体金试纸条的样品板上，继而将交联缓冲液滴加到缓冲液板上，在吸水板作用下使样品板上的延伸反应产物溶液流过硝酸纤维素膜的隐形检测线及隐形控制线。隐形检测线上的T-DNA与延伸序列互补配对，从而使表面发生延伸反应的胶体金沉积在隐形检测线上；隐形控制线上的C-DNA与P-DNA互补配对，使胶体金沉积在隐形控制线上作为对照。

(6)读取结果：根据检测线及控制线的显色结果判断样品中的端粒酶活性，并进行半定量分析。

步骤(1)所述的细胞收集及细胞内端粒酶的提取方法优选为：4℃以下离心分离出细胞后用CHAPS裂解液裂解细胞，再离心后取上清液即得所需待测样本；细胞样品可来自实验室培养的肿瘤细胞或者人体中取样或自然脱落的细胞，例如尿液中的沉降细胞、膀胱洗出液中的细胞、外周血细胞、活检组织等。其中，采用CHAPS裂解液裂解细胞，进一步优选地，CHAPS裂解液包括10mM pH7.5的Tris-HCl、1mM MgCl2、1mM EGTA、0.1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)、5mMβ-巯基乙醇、质量分数为0.5％的3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)以及质量分数为10％的甘油。

步骤(2)所述的胶体金为商品化的胶体金颗粒，直径为8～20nm，进一步优选地，所述胶体金颗粒直径为13nm。

步骤(2)所述的端粒酶引物(P-DNA)为5'-SH-(CH₂)₆-TTT TTT TTTTAAT CCG TCGAGC AGA GTT-3'。

步骤(2)所述的在胶体金表面修饰端粒酶引物(P-DNA)的方法优选为：将5'端修饰有巯基的P-DNA、醋酸缓冲液(pH 5.2)和TCEP(磷酸三氯乙酯)混匀，室温、避光孵育；在不断的摇动下，加入胶体金溶液，密封，室温避光振荡反应；缓慢震荡下逐滴加入Tris醋酸缓冲液，再逐滴加入NaCl，避光孵育；离心，收集沉淀即得到胶体金探针，实现了在胶体金表面修饰端粒酶引物(P-DNA)。

步骤(4)中所述的扩增缓冲液的成分优选为1×TRAP，具体包含20mM Tris–HCl pH8.3，1.5mM MgCl₂，63mM KCl，0.005％Tween 20，1mM EGTA，BSA 0.1mg/mL。

步骤(4)中所述的dNTPs成分优选为：dATPs、dTTPs、dCTPs、dGTPs，浓度范围为：50μM～2mM，浓度优选为：1mM。

步骤(4)中所述的修饰了P-DNA的胶体金溶液中胶体金的浓度范围为：1nM～50nM，优选为：10nM。

步骤(4)中所述的延伸反应条件为：在23℃～37℃下恒温振荡孵育5～120min，进一步优选为：37℃下恒温孵育60min。

步骤(5)中所述的交联缓冲液成分优选为包含：20mM Na₃PO₄，质量百分比5％BSA，质量百分比8％蔗糖。

步骤(5)中所述的测试过程优选为：将20μL由步骤(4)得到的延伸反应产物溶液滴加到胶体金试纸条的样品板上，继而把30μL交联缓冲液滴加到胶体金试纸条的缓冲液板上，15min之内读取结果。

本发明的基本原理如图1所示。

当样品中含有端粒酶且具备活性时，提取的端粒酶在EP管中催化胶体金表面修饰的引物(P-DNA)发生延伸反应，延伸出(TTAGGG)重复序列。然后将延伸反应产物溶液滴加到样品板上，再在缓冲液板上滴加交联缓冲液，通过层析作用交联缓冲液携带胶体金进入硝酸纤维素膜。在纤维素膜检测线区域标记有捕获探针(T-DNA)，可识别(TTAGGG)重复序列，因此延伸后的P-DNA在检测线区域与T-DNA互补配对，使胶体金沉积下来，形成明显的红色线；过量的胶体金或没发生延伸反应的胶体金继续层析，在控制线位置与对照探针(C-DNA)互补配对，从而形成第二条红色线。

当样品中不含端粒酶或者端粒酶不具有活性时，P-DNA不能与T-DNA互补配对，此时检测线区域没有胶体金沉积，不显红色线，胶体金只有层析到控制线区域才沉积，即试纸条上只有一条红色控制线。

若检测线和控制线处都无红色的线出现，则表明试纸条已经失效，检测失败，样品需要重新检测。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供的检测端粒酶活性的胶体金试纸条及试剂盒，价格低廉、快速简便、特异性高，用于解决现有技术中步骤复杂、检测耗时、可重复性差或需要采用特殊检测仪器等问题。

(2)本发明在胶体金颗粒表面修饰端粒酶引物，并利用端粒酶引物的核苷酸序列在端粒酶的催化下延伸的特性，使得胶体金颗粒表面的引物延伸出重复序列，再通过试纸条检测线上修饰的T-DNA捕获胶体金颗粒并进行显色，从而实现对端粒酶样品活性的快速检测。

(3)本发明提供的基于胶体金试纸条实现了端粒酶活性的检测，无需采用复杂仪器设备，可实现对端粒酶活性的廉价、快速、准确、特异性分析。

附图说明

图1是本发明原理的示意图；其中，图1A：端粒酶提取及通过胶体金试纸条检测端粒酶活性的示意图；图1B：胶体金试纸条阳性检测原理。

图2是实施例1方法对不同处理样品进行检测的结果图。

图3是实施例1方法对提取自不同数量肿瘤细胞的端粒酶的检测结果图。

图4是实施例2中加入端粒酶抑制剂后的的检测结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)细胞收集及细胞内端粒酶的提取。

使用DMEM培养基(含10％胎牛血清)在37℃恒温培养箱(95％空气、5％CO₂)分别培养多种肿瘤细胞(293T、Hela、HepG2、A549)(所有细胞系购买于美国模式培养物集存库(ATCC))，细胞密度达到80％后，用胰酶将细胞消化并计数，收集10⁶个细胞于1.5mL EP管中，3600rpm、4℃离心5min得到细胞并用0℃PBS洗涤两遍，将收集到的细胞重悬于100μL预冷的CHAPS裂解液(含10mM Tris–HCl，pH 7.5，1mM MgCl₂，1mM EGTA，0.1mM PMSF，5mMβ-巯基乙醇，5％CHAPS和10％甘油)中，冰浴裂解30min，裂解期间轻轻振荡3～5次，继而12000rpm、4℃离心20min，上清即为含有端粒酶的提取物，小心收集上清，分装后迅速液氮冷冻，最后于-80℃保存。

(2)在胶体金表面修饰端粒酶引物(P-DNA)。

将20μL 200μM的5'端修饰有巯基的P-DNA、0.66μL 500μM的醋酸缓冲液(pH 5.2)和1μL 10μM TCEP(磷酸三氯乙酯)混匀，室温、避光孵育1小时；在不断振摇下，加入1mL10nM的胶体金溶液，密封，室温避光并在振荡器(600rpm)反应16小时；之后缓慢震荡下逐滴加入20μL 500mM的Tris醋酸缓冲液(pH 8.2)，再逐滴加入200μL 1M NaCl，避光孵育一天；在12000rpm、4℃条件下离心30分钟，收集沉淀即得到胶体金探针，实现了在胶体金表面修饰端粒酶引物(P-DNA)。

所述的端粒酶引物(P-DNA)为：5'-SH-(CH₂)₆-TTT TTT TTTTAAT CCG TCG AGC AGAGTT-3'。

(3)胶体金试纸条的制备。

胶体金试纸条由底板、缓冲液板、样品板、硝酸纤维素膜和吸水板构成，将底板、缓冲液板、样品板、硝酸纤维素膜和吸水板按如下结构组装：底板(材料为PVC塑料)在最下层，硝酸纤维素膜粘贴在底板上的中间部位，样品板(材料为玻璃纤维)位于硝酸纤维素膜的上部的一侧并与之重叠2mm，缓冲液板(材料为玻璃纤维)位于样品板的上部与之重叠2mm，吸水板(材料为吸水纤维)位于硝酸纤维素膜的上部相对于样品板的另一侧并与硝酸纤维素膜重叠2mm；所述的硝酸纤维素膜上设有用捕获探针(T-DNA)-链霉亲和素偶合物溶液印制的隐形检测线，以及用对照探针(C-DNA)-链霉亲和素偶合物印制的隐形控制线。所述的隐形检测线靠近样品板，隐形控制线靠近吸水板；隐形检测线宽度为2mm与样品板相隔6mm，隐形控制线宽度为2mm与样品板相隔12mm。

所述的硝酸纤维素膜的处理方法为：用喷膜仪将6μL捕获探针(T-DNA)-链霉亲和素偶合物溶液喷到隐形检测线的位置，将6μL对照探针(C-DNA)-链霉亲和素偶合物溶液喷到隐形控制线的位置，置于室温下干燥1h，并于4℃干燥保存；所述的链霉亲和素溶液浓度为0.67mg/mL，所述的T-DNA和C-DNA的浓度均为33μM。

所述的捕获探针(T-DNA)为5'-TTT TTT TTT T CTA ACC CTA ACC CTA ACC-3'。

所述的对照探针(C-DNA为5'-TTT TTT TTT T AAC TCT GCT CGA CGG ATT-3'。

(4)延伸反应。

将2μL待测端粒酶提取物加入48μL扩增缓冲液(即1×TRAP缓冲液，含20mM Tris–HCl pH 8.3，1.5mM MgCl₂，63mM KCl，0.005％Tween 20，1mM EGTA，BSA 0.1mg/mL)、1mMdNTPs、10nM修饰了P-DNA的胶体金溶液，在37℃恒温孵育30min，使P-DNA发生延伸反应，在3'端延伸出(TTAGGG)_n延伸序列，其中，n为2～10的自然数，得到延伸反应产物溶液。

(5)测试。

将20μL延伸反应产物溶液缓慢滴加到胶体金试纸条的样品板上，等待10min后，继而将30μL交联缓冲液(20mM Na₃PO₄，质量百分比5％BSA，质量百分比8％蔗糖)滴加到缓冲液板上，在吸水板作用下使样品板上的延伸反应溶液流过硝酸纤维素膜的隐形检测线及隐形控制线，隐形检测线上的T-DNA与延伸序列互补配对，从而使表面发生延伸反应的胶体金沉积在隐形检测线上，检测线显现红色；隐形控制线上的C-DNA与P-DNA互补配对，使胶体金沉积在隐形控制线上作为对照。

(6)读取结果。

根据检测线及控制线的显色结果判断样品中的端粒酶活性，并进行半定量分析。当样品中含有端粒酶且具备活性时，提取的端粒酶在EP管中催化胶体金表面修饰的引物(P-DNA)发生延伸反应，延伸出(TTAGGG)_n重复序列，因此延伸后的P-DNA在检测线区域与T-DNA互补配对，使胶体金沉积下来，形成明显的红色线；过量的胶体金或没发生延伸反应的胶体金继续层析，在控制线位置与对照探针(C-DNA)互补配对，从而形成第二条红色线。

根据实施例1步骤(3)的方法制作检测端粒酶活性的胶体金试纸条，并用于检测从肿瘤细胞提取得到的端粒酶的活性，检测结果如图2所示，空白样(细胞裂解液)及热失活处理端粒酶(在95℃下加热5min)不能使胶体金表面修饰的P-DNA发生延伸反应，因此试纸条上没有红色检测线(T线)；而活性端粒酶样品(端粒酶提取物来自293T细胞)可使试纸条上显现明显的红色检测线，且检测线颜色深度与肿瘤细胞数量密切相关(图3)(端粒酶提取物来自293T细胞)。

实施例2

(1)细胞收集及细胞内端粒酶的提取。参照实施例1步骤(1)的方法步骤。

(2)在胶体金表面修饰端粒酶引物(P-DNA)。参照实施例1步骤(2)的方法步骤。

(3)胶体金试纸条的制备。参照实施例1步骤(3)的方法步骤。

(4)延伸反应。

将50μM的端粒酶抑制剂(如TMPyP4，购自Sigma-Aldrich公司)与从10000个293T细胞提取出来的端粒酶提取物混匀后，在50μL扩增缓冲液(即1×TRAP缓冲液，含20mM Tris–HCl pH 8.3，1.5mM MgCl₂，63mM KCl，0.005％Tween 20，1mM EGTA，BSA 0.1mg/mL)、1mMdNTPs、10nM修饰了P-DNA的胶体金溶液)中于37℃恒温孵育60min，在孵育过程中，TMPyP4通过抑制端粒酶活性，从而抑制P-DNA的延伸反应，使3'端不能或较少延伸出(TTAGGG)_n重复序列(n为2～10的自然数)，得到延伸反应产物溶液。

(5)测试。

将20μL延伸反应产物溶液缓慢滴加到胶体金试纸条的样品板上，等待10min后，继而将30μL交联缓冲液(20mM Na₃PO₄，质量百分比5％BSA，质量百分比8％蔗糖)滴加到缓冲液板上，在吸水板作用下使样品板上的延伸反应溶液流过硝酸纤维素膜的隐形检测线及隐形控制线，隐形检测线上的T-DNA与延伸序列互补配对，从而使表面发生延伸反应的胶体金沉积在隐形检测线上，检测线显现红色；隐形控制线上的C-DNA与P-DNA互补配对，使胶体金沉积在隐形控制线上作为对照。

(6)读取结果。

根据检测线及控制线的显色结果判断端粒酶抑制剂对端粒酶活性的抑制效果，并进行半定量分析。当含有端粒酶的样品中不加入端粒酶抑制剂时，样品中的端粒酶具有活性，可在EP管中催化胶体金表面修饰的引物(P-DNA)发生延伸反应，延伸出(TTAGGG)_n重复序列，因此延伸后的P-DNA在检测线区域与T-DNA互补配对，使胶体金沉积下来，形成明显的红色线，当含有端粒酶的样品中加入了端粒酶抑制剂时，样品中的端粒酶活性被抑制，不能或较少的催化胶体金表面修饰的引物(P-DNA)发生延伸反应，因此反应后的P-DNA不能有效的与T-DNA互补配对，胶体金不能有效的沉积下来，红色线较淡或无红色线(见图4)。过量的胶体金或没发生延伸反应的胶体金继续层析，在控制线位置与对照探针(C-DNA)互补配对，从而形成第二条红色线。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种检测端粒酶活性的试剂盒，其特征在于：包括检测端粒酶活性的胶体金试纸条、延伸反应溶液以及交联缓冲液；

所述的检测端粒酶活性的胶体金试纸条，由底板、缓冲液板、样品板、硝酸纤维素膜和吸水板构成，将底板、缓冲液板、样品板、硝酸纤维素膜和吸水板按如下结构组装：底板在最下层，硝酸纤维素膜粘贴在底板上的中间部位，样品板位于硝酸纤维素膜的上部的一侧并与之重叠，缓冲液板位于样品板的上部与之重叠，吸水板位于硝酸纤维素膜的上部相对于样品板的另一侧并与硝酸纤维素膜重叠；所述的硝酸纤维素膜上设有用T-DNA-链霉亲和素偶合物溶液印制的隐形检测线，以及用C-DNA-链霉亲和素偶合物印制的隐形控制线；所述的隐形检测线靠近样品板，隐形控制线靠近吸水板；

所述的T-DNA为5'-TTT TTT TTT T CTA ACC CTA ACC CTA ACC-3'；

所述的C-DNA为5'-TTT TTT TTT T AAC TCT GCT CGA CGG ATT-3'；

所述的链霉亲和素的浓度为0.67mg/mL，所述的T-DNA和C-DNA的浓度均为33μM；

所述的延伸反应溶液包含扩增缓冲液、dNTPs和修饰了P-DNA的胶体金溶液；所述的P-DNA为5'-SH-(CH₂)₆-TTT TTT TTTTAAT CCG TCG AGC AGA GTT-3'；

所述的交联缓冲液为包含：20mM Na₃PO₄，质量百分比5％BSA，质量百分比8％蔗糖。

2.根据权利要求1所述的检测端粒酶活性的试剂盒，其特征在于：

所述的修饰了P-DNA的胶体金溶液中胶体金的浓度范围为：1nM～50nM。

3.根据权利要求2所述的检测端粒酶活性的试剂盒，其特征在于：

所述的修饰了P-DNA的胶体金溶液中胶体金的浓度范围为：10nM。

4.根据权利要求1所述的检测端粒酶活性的试剂盒，其特征在于：

所述的扩增缓冲液的成分为：1×TRAP buffer，具体包含：20mM Tris–HCl pH 8.3，1.5mM MgCl₂，63mM KCl，0.005％Tween 20，1mM EGTA，BSA 0.1mg/mL；

所述的dNTPs成分为：dATP、dTTP、dCTP、dGTP，浓度范围为：100μM～2mM。

5.根据权利要求4所述的检测端粒酶活性的试剂盒，其特征在于：

所述的dNTPs成分为：dATP、dTTP、dCTP、dGTP，浓度范围为：1mM。

6.权利要求1～5任一项所述的检测端粒酶活性的试剂盒在非疾病诊断和治疗目的的端粒酶活性检测中的应用。

7.一种检测端粒酶活性的方法，其特征在于包括如下步骤：所述方法为非疾病诊断和治疗方法；

(1)细胞收集及细胞内端粒酶的提取：通过离心收集细胞，对细胞进行酶解，然后提取细胞内的端粒酶；

(2)在胶体金表面修饰端粒酶引物P-DNA；

(3)胶体金试纸条的制备；所述胶体金试纸条为权利要求1中所述的检测端粒酶活性的胶体金试纸条；

(4)延伸反应：在含有扩增缓冲液、dNTPs和修饰了P-DNA的胶体金溶液的EP管中加入待测端粒酶提取物样品，恒温孵育，使P-DNA发生延伸反应，得到延伸反应产物溶液；

(5)测试：将延伸反应产物溶液滴加到上述胶体金试纸条的样品板上，继而将交联缓冲液滴加到缓冲液板上，在吸水板作用下使样品板上的延伸反应产物溶液流过硝酸纤维素膜的隐形检测线及隐形控制线；

(6)读取结果：根据检测线及控制线的显色结果判断样品中的端粒酶活性，并进行半定量分析。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：

步骤(4)中所述的延伸反应条件为：在23℃～37℃下恒温振荡孵育5～120min。

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