CN111235313A - 一种快速检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas13方法 - Google Patents

一种快速检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas13方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种快速检测新型冠状病毒的CRISPR方法，基于CRISPR‑Cas13系统快速检测新型冠状病毒的方法，通过制备各组分的LwaCas13a蛋白、EiCsm6蛋白、Csm6活化剂、LwaCas13a‑crRNA、RNase抑制剂、反应缓冲液、LF‑Reporter的检测试剂盒，将待检测液混合，整个混合操作均在0℃温度进行，然后通过在恒温水浴锅中孵育一定时间后，加入无RNA酶的DEPC水溶液补足50微升，采用一次性核酸检测试纸条进行检测阴性或阳性，与常规方法相比，极大的提高了新型冠状病毒的检测效率，检测时间仅需半个小时，达到了易用、便携和快速检测新冠病毒的目标，且大大降低成本。

Description

一种快速检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas13方法
技术领域
本发明属于病毒核苷酸的检测方法领域，特别涉及一种快速检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas13方法。
背景技术
通过对新型冠状病检测市场分析发现，大部分新型冠状病检测方法存在着检测方法设备要求高、检测时间长和专业技术人员要求高等问题，同时，大部分的新型冠状病检测方法无法在医疗专用设备薄弱的普通医院和医疗机构快速的进行检测。目前具体在进行检测时，用来诊断新型冠状病毒COVID-19主要为核酸RT-PCR技术，但其面临着检测设备要求高、设备不足以及检测时间过长(2-3小时)等缺点，在一定程度上减缓了疾病检测的速度。
随着疫情的发展，开发出易用、便携和快速的新型冠状病检测方法来专用设备薄弱甚至普通检测者的需求是有待克服的难题，同时，一种易用、便携和快速检测新冠病毒的检测方法显得越发重要。
发明内容
本发明的目的是对于新冠病毒COVID-19的诊断，提供了一种基于CRISPR-Cas13系统快速检测新型冠状病毒的方法，与常规方法相比，本方法具有设备要求低、检测速度快、灵敏度高等优势，达到了易用、便携和快速检测新冠病毒的目标。
提供了一种用于快速检测新型冠状病毒的检测试剂盒，包括250nM LwaCas13a蛋白、200nM EiCsm6蛋白、20uM Csm6活化剂、2.5uM LwaCas13a-crRNA、RNase抑制剂、反应缓冲液、20uM RNA报告基团LF-Reporter、新型冠状病毒RNA；所述反应缓冲液为40mM Tris-HCl、60mM NaCl、6mM MgCl2的混合液，pH为7.3；其中，LwaCas13a蛋白、EiCsm6蛋白、Csm6活化剂、LwaCas13a-crRNA、RNase抑制剂、反应缓冲液、LF-Reporter的体积比为3～5：0.5～1.5：0.5～1.5：0.5～1.5：0.5～1.5：10～14：1～2混合而成。
作为改进，检测试剂盒中组分的混合是在0℃温度进行，添加待检测液后，充分混合，在35.8-38.5℃水浴锅中孵育30-40分钟，再添加无RNA酶的DEPC水溶液，采用一次性核酸检测试纸条检测阴性或阳性。
作为改进，检测试剂盒用于检测的新型冠状病毒RNA的浓度不小于10fM，其Orf1abRNA基因序列如如SEQ ID NO.1所示。
作为改进，当检测试剂盒为20微升体系时，试剂盒中包括250nM LwaCas13a蛋白4微升、200nM EiCsm6蛋白1微升、20uM Csm6活化剂0.5微升、2.5uM LwaCas13a-crRNA 0.5微升、RNase抑制剂1微升、反应缓冲液(40mM Tris-HCl、60mM NaCl、6mM MgCl2、pH7.3 11微升、20uM LF-Reporter 1微升，剩余为待检测液。
同时，还提供了一种快速检测新型冠状病毒的CRISPR方法，
(1)配制待检测液的稀释液
将待检测液与无RNA酶的DEPC混合进行稀释，配制一定体积及溶度的稀释液备用；
(2)配制检测试剂
先配制40mM Tris-HCl、60mM NaCl、6mM MgCl2的反应缓冲液，其中pH为7.3，再按照体积比3～5：0.5～1.5：0.5～1.5：0.5～1.5：0.5～1.5：10～14：1～2依次将250nMLwaCas13a蛋白、200nM EiCsm6蛋白、20uM Csm6活化剂、2.5uM LwaCas13a-crRNA、RNase抑制剂、反应缓冲液、20uM LF-Reporter准备各组分，再将步骤(1)中待检测液添加；
(3)孵育处理
混合液配制过程一直在0℃温度进行操作，充分混合后，将检测试剂混合液在预热的36.5-37.5℃水浴锅中孵育30-40分钟；
(4)检测及结果
将步骤(3)中试剂放入反应管中，添加一定体积的无RNA酶的DEPC水补足50微升，混合，将其置于室温管架中，将一次性核酸检测试纸条放入每个反应管中，然后等待反应液流过试纸条，阳性对照样品应仅显示蓝色检测线，而阴性对照样品显示红色和蓝色两条检测线。
作为改进，其中，该方法用于检测浓度不小于10fM的新型冠状病毒RNA，其Orf1abRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
同时，还提供了Csm6活化剂在包含上述任一用于快速检测新型冠状病毒的检测试剂盒中的应用，其基因序列如SEQ ID NO.4所示。
有益效果：本发明提供了一种快速检测新型冠状病毒的CRISPR方法，是基于CRISPR-Cas13系统快速检测新型冠状病毒的方法，是通过将CRISPR-Cas13系统应用于检测新型冠状病毒，所用RNA试剂除了RNA报告基团LF-Reporter为直接合成，其他RNA序列片段均可以使用T7转录酶从合成的DNA寡核苷酸产生从而大大降低成本,本方法检测时间仅需半个小时，设备要求只需恒温水浴锅，极大的提高了新型冠状病毒的检测效率。
与常规方法相比，本方法具有设备要求低、检测速度快、灵敏度高等优势，达到了易用、便携和快速检测新冠病毒的目标。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1为实施例1中核酸检测试纸条的结构对照示意图。
图2为实施例2中实验员一所用核酸检测试纸条的结构对照示意图。
图3为实施例2中实验员二所用核酸检测试纸条的结构对照示意图。
图4为实施例2中实验员三所用核酸检测试纸条的结构对照示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
CRISPR-Cas13(C2c2)系统在单个CRISPR RNA(crRNA)的引导下，它能识别并结合目标序列ssRNA或mRNA(类似于RNA干扰)并切割，同时，这激发了它对周围ssRNA分子的非特异性切割功能。利用激活的Cas13对周围ssRNA分子的非特异性切割活性，可以设计带有报告基团标记的RNA，切割后的报告基团可通过试纸条来检测，从而表示目标核酸的存在。
本发明中涉及的原料本方法所用试剂：无RNA酶的DEPC水(Biosharp)；RNA酶抑制剂(Solarbio)；检测新型冠状病毒的LwaCas13a-crRNA购于南京金斯瑞生物科技有限公司；RNA报告基团LF-Reporter购于南京金斯瑞生物科技有限公司；LwaCas13a蛋白购于天益健康科学研究院；EiCsm6蛋白购于天益健康科学研究院；一次性核酸检测试纸条为JY0201，Tiosbio。
其中，本发明中RNA报告基团LF-Reporter的基因序列如SEQ IDNO.3所示：
5'-/56-FAM/mArArUrGrGrCmAmArArUrGrGrCmA/3Bio/-3'。
Csm6活化剂的基因序列如SEQ ID NO.4所示：5'-rArArArArArArUrUrUrUrU-3'。
检测新型冠状病毒的LwaCas13a-crRNA的基因序列如SEQ ID NO.2所示：
5'-GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACCCUUUCCACAUACCGCAGACGGU-3'。
新型冠状病毒RNA，其Orf1ab RNA基因序列如SEQ ID NO.1所示：：
5'CCCUGUGGGUUUUACACUUAAAAACACAGUCUGUACCGUCUGCGGUAUGUGGAAAGGUUAUGGCUGUAGUUGUGAUCAACUCCGCGAACCCAUGCUUCAGUCAGCUGAUGCACAAUCGU3'
反应缓冲液按照40mM Tris-HCl、60mM NaCl、6mM MgCl2；分析纯进行获得的，其中pH 7.3。
一种用于快速检测新型冠状病毒的检测试剂盒，检测试剂盒包括250nMLwaCas13a蛋白、200nM EiCsm6蛋白、20uM Csm6活化剂、2.5uM LwaCas13a-crRNA、RNase抑制剂、反应缓冲液、20uM LF-Reporter、新型冠状病毒RNA；所述反应缓冲液为40mM Tris-HCl、60mM NaCl、6mM MgCl2的混合液，pH为7.3；其中，LwaCas13a蛋白、EiCsm6蛋白、Csm6活化剂、LwaCas13a-crRNA、RNase抑制剂、反应缓冲液、LF-Reporter的体积比为3～5：0.5～1.5：0.5～1.5：0.5～1.5：0.5～1.5：10～14：1～2混合而成。
检测试剂盒中各组分的混合是在0℃温度进行，添加待检测液后，充分混合，在36.5-37.5℃水浴锅中孵育30-40分钟，其中反应酶的最合适温度为37℃，水浴锅中孵育时间要超过30分钟，为30-120分钟，优选30-40分钟。再添加合适的无RNA酶的DEPC水溶液补足50微升，采用一次性核酸检测试纸条检测阴性或阳性。
检测试剂盒用于检测的新型冠状病毒RNA的浓度不小于10fM，其Orf1ab RNA基因序列为如SEQ ID NO.1所示。
作为本发明的具体实施方式为：当检测试剂盒为20微升体系时，检测试剂盒包括250nM LwaCas13a蛋白4微升、200nM EiCsm6蛋白1微升、20uM Csm6活化剂0.5微升、2.5uMLwaCas13a-crRNA 0.5微升、RNase抑制剂1微升、反应缓冲液(40mM Tris-HCl、60mM NaCl、6mM MgCl2、pH7.3 11微升、20uM LF-Reporter 1微升、剩余为待检测的检测液。
同时，本发明中的一种快速检测新型冠状病毒的CRISPR方法，
(1)配制待检测液的稀释液
将待检测液与无RNA酶的DEPC混合进行稀释，配制一定体积及溶度的稀释液备用；
(2)配制检测试剂
先配制40mM Tris-HCl、60mM NaCl、6mM MgCl2的反应缓冲液，其中pH为7.3，再按照体积比3～5：0.5～1.5：0.5～1.5：0.5～1.5：0.5～1.5：10～14：1～2依次将250nMLwaCas13a蛋白、200nM EiCsm6蛋白、20uM Csm6活化剂、2.5uM LwaCas13a-crRNA、RNase抑制剂、反应缓冲液、20uM LF-Reporter准备组分，再将步骤(1)中待检测液添加，组成固定体系的检测试剂混合液；
(3)孵育处理
混合液配制过程一直在0℃温度进行操作，充分混合后，将检测试剂在预热的35.8-38.5℃水浴锅中孵育30-40分钟；
(4)检测及结果
将步骤(3)中试剂放入反应管中，添加合适的无RNA酶的DEPC水补足50微升，混合，将其置于室温管架中，将一次性核酸检测试纸条放入每个反应管中，然后等待反应液流过试纸条，阳性对照样品应仅显示蓝色检测线，而阴性对照样品显示红色和蓝色两条检测线。
该方法用于检测浓度为不小于10fM的新型冠状病毒RNA，其Orf1ab RNA基因序列为如SEQ IDNO.1所示。
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述
实施例1检测新冠病毒RNA片段
首先，准备浓度为10pM新冠病毒RNA片段溶液。
配制阳性对照样品组和阴性对照组(新型冠状病毒RNA片段用1微升的无rna酶DEPC水代替)。按照20微升体系配制如下：
250nM LwaCas13a蛋白4微升、200nM EiCsm6蛋白1微升、20uM Csm6活化剂0.5微升、2.5uM LwaCas13a-crRNA 0.5微升、RNase抑制剂1微升、反应缓冲液(40mM Tris-HCl、60mM NaCl、6mM MgCl2、pH 7.3)11微升、LF-Reporter(20uM)1微升、新型冠状病毒RNA片段1微升。
设置阴性对照组：新型冠状病毒RNA片段用1微升的无rna酶DEPC水代替。
上述配制操作应在冰上进行操作，充分混合后，在预热的37℃水浴锅中于孵育30分钟。孵育后，每个20ul反应物中添加30ul无RNA酶的DEPC水并充分混合，将混合后的反应液置于室温管架中，将一次性核酸检测试纸条放入每个反应管中，然后等待反应液流过试纸条。阳性对照样品应仅显示蓝色检测线，而阴性对照样品显示红色和蓝色两条检测线，如图1所示。
图中可见，使用合成新冠病毒Orf1ab基因RNA片段，能够稳定的检测到10pM新冠病毒RNA片段溶液浓度的新冠病毒RNA序列。
实施例2检测5种不同浓度的新冠病毒RNA片段
首先用无RNA酶的DEPC水配制6种浓度为分别为10pM、1pM、100fM、10fM、1fM、0的新冠病毒RNA片段稀释液。
按照20微升体系配制如下：
250nM LwaCas13a蛋白4微升、200nM EiCsm6蛋白1微升、20uM Csm6活化剂0.5微升、2.5uM LwaCas13a-crRNA 0.5微升、RNase抑制剂1微升、反应缓冲液(40mM Tris HCl、60mM NaCl、6mM MgCl2、pH 7.3)11微升、LF-Reporter(20uM)1微升、不同稀释浓度新型冠状病毒RNA片段1微升。
上述配制操作应在冰上进行操作，充分混合后，在预热的37℃水浴锅中于孵育30分钟。孵育后，每个20ul反应物中添加30ul无rna酶的DEPC水并充分混合，将混合后的反应液置于室温管架中，将一次性核酸检测试纸条放入每个反应管中，然后等待反应液流过试纸条。阳性对照样品应仅显示蓝色检测线，而阴性对照样品显示红色和蓝色两条检测线，如图2所示。同时，为了验证结果的稳定性，由不同的实验员分别单独重复一次上述方法，结果如图3、图4所示：
结果表明使用合成新冠病毒Orf1ab基因RNA片段的梯度稀释液，能够稳定的检测到浓度为100fM新冠病毒RNA片段，对于低于10fM浓度的新冠病毒RNA片段检测不灵敏。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳市创新医学科技有限公司
<120> 一种快速检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas13方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 119
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cccugugggu uuuacacuua aaaacacagu cuguaccguc ugcgguaugu ggaaagguua 60
uggcuguagu ugugaucaac uccgcgaacc caugcuucag ucagcugaug cacaaucgu 119
<210> 2
<211> 59
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gauuuagacu accccaaaaa cgaaggggac uaaaacccuu uccacauacc gcagacggu 59
<210> 3
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
mararurgrg rcmamararu rgrgrcma 28
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
rarararara rarurururu ru 22

Claims (7)

1.一种用于快速检测新型冠状病毒的检测试剂盒，其特征在于：包括250nM LwaCas13a蛋白、200nM EiCsm6蛋白、20uM Csm6活化剂、2.5uM LwaCas13a-crRNA、RNase抑制剂、反应缓冲液、20uM RNA报告基团LF-Reporter；所述反应缓冲液为40mM Tris-HCl、60mM NaCl、6mM MgCl2的混合液，pH为7.3；其中，LwaCas13a蛋白、EiCsm6蛋白、Csm6活化剂、LwaCas13a-crRNA、RNase抑制剂、反应缓冲液、LF-Reporter的体积比为3～5：0.5～1.5：0.5～1.5：0.5～1.5：0.5～1.5：10～14：1～2混合而成。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒使用时，将检测试剂盒中的各组分在0℃温度下混合，添加待检测液并充分混合后，在35.8-38.5℃℃水浴锅中孵育30-40分钟，再添加无RNA酶的DEPC水溶液，采用一次性核酸检测试纸条检测阴性或阳性。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒用于检测的新型冠状病毒RNA的浓度不小于10fM，其Orf1ab RNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：当检测试剂盒为20微升体系时，试剂盒中包括250nM LwaCas13a蛋白4微升、200nM EiCsm6蛋白1微升、20uM Csm6活化剂0.5微升、2.5uM LwaCas13a-crRNA 0.5微升、RNase抑制剂1微升、反应缓冲液(40mM Tris-HCl、60mM NaCl、6mM MgCl2、pH7.3)11微升、20uM LF-Reporter1微升，剩余为待检测液。
5.一种快速检测新型冠状病毒的CRISPR方法，其特征在于：
(1)配制待检测液的稀释液
将待检测液与无RNA酶的DEPC混合进行稀释，配制一定体积及溶度的稀释液备用；
(2)配制检测试剂
先配制40mM Tris-HCl、60mM NaCl、6mM MgCl2的反应缓冲液，其中pH为7.3，再按照体积比3～5：0.5～1.5：0.5～1.5：0.5～1.5：0.5～1.5：10～14：1～2依次将250nM LwaCas13a蛋白、200nM EiCsm6蛋白、20uM Csm6活化剂、2.5uM LwaCas13a-crRNA、RNase抑制剂、反应缓冲液、20uM LF-Reporter准备各组分，将步骤(1)中待检测液添加；
(3)孵育处理
混合液配制过程一直在0℃温度进行操作，充分混合后，将检测试剂盒内混合液在预热的35.8-38.5℃水浴锅中孵育30-40分钟；
(4)检测及结果
将步骤(3)中试剂放入反应管中，检测试纸条要求检测混合液不低于50微升，不足50微升添加适应的无RNA酶的DEPC水补足，混合，将其置于室温管架中，将一次性核酸检测试纸条放入每个反应管中，然后等待反应液流过试纸条，阳性对照样品应仅显示蓝色检测线，而阴性对照样品显示红色和蓝色两条检测线。
6.根据权利要求5所述的一种快速检测新型冠状病毒的CRISPR方法，其特征在于：其中，该方法用于检测浓度不小于10fM的新型冠状病毒RNA，其Orf1ab RNA基因序列如SEQ IDNO.1所示。
7.Csm6活化剂在包含权利要求1-4任一所述用于快速检测新型冠状病毒的检测试剂盒中的应用，其基因序列如SEQ ID NO.4所示。
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