CN112159817A - 靶向新型冠状病毒棘突的基因、试剂盒、筛选方法及应用 - Google Patents

靶向新型冠状病毒棘突的基因、试剂盒、筛选方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112159817A
CN112159817A CN202011073334.3A CN202011073334A CN112159817A CN 112159817 A CN112159817 A CN 112159817A CN 202011073334 A CN202011073334 A CN 202011073334A CN 112159817 A CN112159817 A CN 112159817A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
crrna
cov
cells
rna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202011073334.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112159817B (zh
Inventor
康春生
王琳
周俊虎
王琦雪
王蕴非
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin Medical University General Hospital
Original Assignee
Tianjin Medical University General Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin Medical University General Hospital filed Critical Tianjin Medical University General Hospital
Priority to CN202011073334.3A priority Critical patent/CN112159817B/zh
Publication of CN112159817A publication Critical patent/CN112159817A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112159817B publication Critical patent/CN112159817B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开一种靶向新型冠状病毒棘突的基因、试剂盒、筛选方法及应用，涉及基因工程技术领域。用于靶向新型冠状病毒SARS‑CoV‑2棘突的基因的RNA序列为SEQ ID NO：6。对抗SARS‑CoV‑2感染的特异性治疗试剂盒包含所述的基因。本发明分筛选出降解S效率最高的crRNA序列，从而达到有效降低细胞内病毒载量的目的。本发明巧妙地结合生物信息学模拟与生物学实验，针对性设计的CRISPR‑Cas13a系统能特异性识别并降解人肺泡上皮细胞内的S RNA。本发明所设计的crRNA有望在对抗SARS‑CoV‑2感染的特异性治疗工具及药物的开发中得到应用。

Description

靶向新型冠状病毒棘突的基因、试剂盒、筛选方法及应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种靶向新型冠状病毒棘突的基因、试剂盒、筛选方法及应用。
背景技术
目前，新型冠状病毒SARS-CoV-2引起了冠状病毒肺炎(COVID-19)的全球大流行，然而目前尚无针对SARS-CoV-2的特异性治疗药物。
洛匹那韦，利托那韦，瑞德西韦和氯喹等抗病毒药物虽然在体外显示出对SARS-CoV或SARS-CoV-2的抑制活性，但这些药物对COVID-19患者的临床结局无明显益处。
而临床证据不推荐使用皮质类固醇进行治疗，因其获益少且并发症严重。恢复期血浆或免疫球蛋白具有潜在的治疗能力，但其安全性和有效性仍需要通过大规模临床试验来验证。
因此，迫切需要开发针对这种致命疾病的特异性和有效的治疗手段。
Cas13a是一种RNA引导的CRISPR效应子，能靶向并切割单链RNA(ssRNA)，作为RNA病毒感染性疾病和恶性肿瘤的治疗和诊断工具，引起了极大的关注。
CRISPR-Cas13a系统由两个部分组成，包括靶向RNA的CRISPR-RNA(crRNA)和由crRNA引导的RNA酶Cas13a。
棘突(Spike,S)位于冠状病毒的包膜上，它通过与宿主细胞表面受体相互作用而介导了冠状病毒进入细胞的过程。鉴于S蛋白在中和抗体和保护性免疫反应的产生中发挥的关键作用，它已成为药物设计的重要抗原表位。但是目前尚缺乏针对SARS-CoV-2 S的有效抗病毒技术。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
(1)现有药物无法特异性针对SARS-CoV-2关键结构棘突(S)的问题。
(2)现有技术没有用于特异性识别并降解细胞中SARS-CoV-2 S的、结合生物信息学方法和基于CRISPR-Cas13a系统的RNA编辑技术，造成现有技术提供的药物不能有效降低细胞内病毒载量。
解决以上问题及缺陷的难度为：
怎样迅速找出SARS-CoV-2 S上的区别于SARS-CoV和MERS-CoV的S的特异性RNA片段，并快速和准确地设计和筛选出高效率靶向该特异性RNA片段的crRNA序列。
解决以上问题及缺陷的意义为：
高效靶向SARS-CoV-2关键结构性蛋白S的RNA的crRNA对于开发针对SARS-CoV-2的诊断和治疗性工具都具有十分重要的价值。
发明内容
为克服相关技术中存在的问题，本发明公开实施例提供了一种靶向新型冠状病毒棘突的基因、试剂盒、筛选方法及应用。具体涉及一种基于CRISPR/Cas13a基因编辑系统的识别并降解新型冠状病毒SARS-CoV-2棘突(S)的方法。
本发明为了解决现有药物无法特异性针对SARS-CoV-2关键结构棘突(S)的问题，结合了生物信息学方法和基于CRISPR-Cas13a系统的RNA编辑技术，提出了一种基于CRISPR-Cas13a系统的识别并降解人细胞中SARS-CoV-2 S的技术。
所述技术方案如下：
根据本发明公开实施例的第一方面，提供一种用于靶向新型冠状病毒SARS-CoV-2棘突的基因，所述用于靶向新型冠状病毒SARS-CoV-2棘突的基因的RNA序列为SEQ ID NO：6。
根据本发明公开实施例的第二方面，提供一种对抗SARS-CoV-2感染的特异性治疗试剂盒，所述对抗SARS-CoV-2感染的特异性治疗试剂盒包含所述的基因。
根据本发明公开实施例的第三方面，提供一种包含所述基因的crRNA文库，所述crRNA文库还包含RNA序列SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：5，以及SEQ ID NO：7～SEQ ID NO：39。
优选地，所述crRNA文库基于作为SARS-CoV-2的靶向位点的靶RNA序列，利用叠瓦状方式构建；所述靶RNA序列的RNA为SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46。
根据本发明公开实施例的第四方面，提供一种利用所述crRNA文库中的靶RNA序列编码的蛋白，所述蛋白包括：
所述SEQ ID NO：45编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：43，所述SEQ ID NO：46编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：44。
进一步，所述蛋白通过氨基酸序列比对、蛋白三维结构比对、与受体分子对接，获得的位于SARS-CoV-2 S上的特异性片段。
根据本发明公开实施例的第五方面，提供一种转染所述基因用于识别并降解S效率检测的细胞。
根据本发明公开实施例的第六方面，提供一种用于靶向新型冠状病毒SARS-CoV-2棘突的基因筛选方法，所述筛选方法包括：
(1)通过氨基酸序列比对、蛋白三维结构比对、与受体分子对接的生物信息学方法，获得到位于SARS-CoV-2 S上的特异性片段，编码所述特异性片段片段的RNA为靶RNA序列；
(2)采用叠瓦状方式设计针对所述靶RNA序列构建crRNA文库；
(3)计算构建的crRNA文库中RNA序列SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：39不同crRNA的GC含量，筛选出GC含量大于或等于0.5的SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：12 12个crRNA序列；
(4)利用生物信息学模拟所述12个crRNA不同序列crRNA与靶RNA、Cas13a蛋白的结合，计算复合物结合能，根据结合能大小，筛选出结合稳定性最高的SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10为计算机筛选出的潜在最佳crRNA候选序列；
(5)Cas13a慢病毒的包装和crRNA的合成、细胞培养和转染、在细胞水平crRNA识别并降解S效率的检测、筛选，获得SEQ ID NO：6序列在上皮细胞中S的显著降解。
(6)为证实crRNA6针对SARS-CoV-2 S的特异性，检测Cas13a-crRNA6对细胞内SARS-CoV S(用S’来表示)的RNA水平的影响。
优选地，所述步骤(5)、(6)中Cas13a慢病毒的包装和crRNA的合成包括：
1)S和Cas13a慢病毒的包装：S/S’和Cas13a慢病毒表达载体分别选用pCDH-EF1和GV341；采用瞬时共转染法，将含有表达S/S’或Cas13a的质粒和包装质粒等转染体系转入HEK293T细胞，使细胞内进行慢病毒的包装；包装好的慢病毒颗粒分泌到细胞外培养上清中，收集上清获取慢病毒；
2)crRNA的合成：首先，使用T7侧翼引物，通过PCR生成crRNA的DNA模板；在95℃下加热5min使反应混合物变性，随后在冰上急冷10min，并在72℃下孵育30min来进行引物延伸；然后使用T7 sgRNA MICscriptTM试剂盒将T7 PCR产物进行体外转录；使用EzOmicsTMRNA Quick Clear试剂盒对转录的crRNA进行纯化；
所述细胞培养和转染包括：人肝癌细胞HepG2细胞在10％FBS，和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基中培养；人肺泡Ⅱ型上皮AT2细胞在添加10％FBS，10ng/ml角质形成细胞生长因子KGF和1％青霉素-链霉素的DMEM/F-12的培养基中，置于37℃和5％CO2的环境中生长，每隔1天更换1次培养基；
用Lipofectamine R3000将crRNA转染到细胞中；
所述在细胞水平crRNA识别并降解S效率的检测包括：
1)qRT-PCR：将细胞在TRIzol试剂中裂解；按照TRIzol：氯仿的体积5：1的比例加入氯仿，震荡10秒，静置2min；12000g离心15min，取上清；加入适量异丙醇，混匀后静置10min；12000g离心10min，弃上清；加入适量75％乙醇，轻轻洗涤沉淀，7500g离心5min，弃上清；晾干后加入适量的DEPC H2O溶解RNA；然后使用逆转录试剂盒进行cDNA的合成；用SYBR GreenMaster Mix试剂在DNA Engine Opticon 2两色qRT-PCR检测系统上进行qRT-PCR实验；所用PCR引物包括：SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42(S’-F,tggtatgtttggctcggctt；S’-R,gcagcaagaac cacaagagc)。
2)Western blot实验：用RIPA缓冲液分别裂解相等数量的AT2细胞，表达S的AT2细胞，表达S和Cas13a的AT2细胞以及表达S，Cas13a和crRNA-6的AT2细胞；通过BCA测定法测定细胞裂解物的总蛋白浓度；首先将标准品按照0，1，2，4，8，12，16，20μL加到96孔板的标准品孔中，加PBS稀释液补足到20μL；加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加PBS稀释液稀释到20μL；将50体积的BCA试剂A与1体积的BCA试剂B充分混匀配成BCA工作液后，各孔均加入200μL的BCA工作液，37℃放置30min；在562nm波长下比色，记录吸光值，根据标准曲线计算样品的蛋白浓度；每个样品用10％的SDS-PAGE凝胶分离，将凝胶转移到PVDF膜上，然后在5％的BSA中封闭2h；然后将膜在一抗SARS-CoV-2 S抗体、GAPDH抗体中孵育16小时，用TBST洗涤膜3遍，并在HRP偶联的二抗中孵育1h；在TBST中洗涤3次后，使用增强的化学发光法对蛋白条带进行成像；
3)免疫荧光：在用crRNA-6处理后48小时，将爬片上的AT2细胞用于免疫荧光实验；首先将细胞玻片固定在4％多聚甲醛中，用0.5％Triton X-100透化，并用5％BSA封闭；将载玻片在一抗SARS-CoV-2 S抗体在4℃孵育16小时；用PBS洗涤3次后，将细胞玻片与荧光偶联的二抗AlexaFluor 594，在25℃下孵育1小时；将载玻片用PBS洗涤3次，然后用带有DAPI的ProLongTM Gold Antifade封片剂进行封片；拍照；
所述筛选包括：
1)根据GC含量、结合能分析的结果，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQID NO：6，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10与Cas13a蛋白、病毒RNA形成的复合物稳定性可能较高，即SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10可能是潜在最佳crRNA序列；
2)根据HepG2细胞和AT2细胞的qRT-PCR结果：在HepG2细胞，与对照组相比，转染SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，的HepG2细胞的S RNA表达水平降低最为显著；而在AT2细胞，与对照组相比，转染SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12的AT2细胞的S RNA表达水平降低最为显著；综合两种细胞的结果，SEQ IDNO：6是靶向S RNA效率最高的crRNA序列；
3)western blot检测、免疫荧光分析结果，SEQ ID NO：6在AT2细胞中引起S蛋白水平的显著降低；
4)通过生物信息学分析与生物学实验相结合的方式筛选出高效率靶向SARS-CoV-2 S RNA的crRNA序列SEQ ID NO：6，Cas13a-crRNA6复合物(Cas13a以慢病毒转染的方式在细胞表达，crRNA直接转染进细胞)引起人肺泡Ⅱ型上皮细胞中S的显著降解。
5)另外qRT-PCR结果还显示：Cas13a-crRNA6没有引起人肺泡Ⅱ型上皮细胞中SARS-CoV S(S’)的RNA的表达水平的改变，说明crRNA6的特异性。
根据本发明公开实施例的第七方面，提供一种所述用于靶向新型冠状病毒SARS-CoV-2棘突的基因的crRNA在制备对抗SARS-CoV-2感染的特异性治疗药物上的应用。
本发明公开的实施例提供的技术方案可以包括以下有益效果：
本发明设计出39条crRNA并对其进行筛选，其中6号序列(crRNA-6)是本发明的创新序列，其可作为用于靶向新型冠状病毒SARS-CoV-2棘突(S)的RNA。
本发明主要结合了生物信息学方法和生物学实验。在本发明中，先利用生物信息学方法找到位于SARS-CoV-2 S蛋白的受体结合域(Receptor-Binding-Domain,RBD)的特异性节段，将该节段对应的RNA序列用作SARS-CoV-2的靶向位点。
利用叠瓦状方式设计出针对该靶RNA序列的crRNA文库，根据GC含量和计算机模拟结合能分析筛选出与靶RNA和Cas13a结合力最强的crRNA候选序列。
分别构建表达S和Cas13a的慢病毒，合成候选的crRNA序列，转染人肺泡Ⅱ型上皮细胞，筛选出降解S效率最高的crRNA序列，从而达到有效降低细胞内病毒载量的目的。
此外，为了验证筛选出的crRNA序列的特异性，检测Cas13-crRNA是否能降低细胞内SARS-CoV S的RNA水平。
相比于现有技术，本发明巧妙地结合生物信息学模拟与生物学实验，设计并筛选出特异性针对SARS-CoV-2 S的crRNA序列，针对性设计的CRISPR-Cas13a系统能有效识别并降解人肺泡上皮细胞内的S RNA。本发明所设计的crRNA有望在对抗SARS-CoV-2感染的特异性治疗工具及药物的开发中得到应用。
结合实验或试验数据和现有技术对比得到的效果和优点：快速准确地找到SARS-CoV-2 S上的区别于SARS-CoV S的特异性片段，并快速设计和筛选出特异性靶向SARS-CoV-2 S上该RNA片段的crRNA序列，该crRNA序列与Cas13a能有效降解人肺泡Ⅱ型上皮细胞中的SARS-CoV-2 S，而对SARS-CoV S无影响，即该发明筛选出的crRNA序列具有高度特异性。
当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本公开。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本公开的实施例，并与说明书一起用于解释本公开的原理。
图1是本发明实施例提供的SARS-CoV-2 S和SARS-CoV S的受体结合域(RBD)的氨基酸序列比对、三维结构叠合比对图。
图2是本发明实施例提供的SARS-CoV-2 S和SARS-CoV S与宿主细胞表面受体ACE2的对接分析图。
图3是本发明实施例提供的对GC含量大于0.5的crRNA候选序列与Cas13a、靶向病毒RNA之间进行结合能分析，计算相应对接分数图。
其中，图3(a)Cas13a与crRNA-1～12的对接分数；图3(b)Cas13a与crRNA、靶向病毒RNA之间的对接分数。
图4是本发明实施例提供的S的mRNA表达量图(以GAPDH为内参)。
其中，图4(a)qRT-PCR分析显示Cas13a-crRNA-1～12对HepG2细胞中S的mRNA表达量的影响；图4(b)qRT-PCR分析显示Cas13a-crRNA-1～12对AT2细胞中S的mRNA表达量的影响。
图5是本发明实施例提供的CRISPR-Cas13a系统在表达S的人肺泡Ⅱ型上皮细胞AT2中引起S蛋白的水平降低图。
其中，图5A Western blot条带；图5B灰度值统计；图5C激光共聚焦图片；图5D S的平均荧光强度统计。
图6是本发明实施例提供的S’的mRNA表达量图(以GAPDH为内参)。
图7是本发明实施例提供的crRNA-6序列筛选图。
具体实施方式
这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本公开相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本公开的一些方面相一致的装置和方法的例子。
本发明通过氨基酸序列比对、蛋白三维结构比对、与受体分子对接等一系列生物信息学方法，找到位于SARS-CoV-2 S上的特异性片段，编码该片段的RNA包括：
“ugacuuuagauaguccggccaucguguggaacauuaccacaacuuccaaaauuaacaaugaaaggaaauguuagu”。
将上述片段作为靶RNA序列，采用叠瓦状方式设计针对该靶RNA的crRNA文库。
计算不同crRNA的GC含量，筛选出GC含量大于或等于0.5的12个crRNA序列。
利用生物信息学模拟不同crRNA与靶RNA、Cas13a蛋白的结合，计算复合物结合能，根据结合能大小，筛选出结合稳定性最高的6个crRNA，视为潜在最优crRNA候选序列。
在细胞水平检测crRNA引导的CRISPR-Cas13a系统识别并降解SARS-CoV-2 S和SARS-CoV S(S’)的效率，主要步骤如下：
(1)S/S’、Cas13a慢病毒和crRNA的设计与合成：S/S’慢病毒表达载体选用pCDH-EF1，Cas13a慢病毒表达载体选用GV341。采用瞬时共转染法，将含有表达S/S’或Cas13a的质粒和包装质粒等转染体系转入HEK293T细胞，使细胞内进行慢病毒的包装。包装好的慢病毒颗粒分泌到细胞外培养上清中，收集上清获取慢病毒。为合成crRNA，首先使用T7侧翼引物，通过PCR生成crRNA的DNA模板。在95℃下加热5min使反应混合物变性，随后在冰上急冷10min，并在72℃下孵育30min来进行引物延伸。然后使用T7 sgRNA MICscriptTM试剂盒将T7 PCR产物进行体外转录。使用EzOmicsTM RNA Quick Clear试剂盒对转录的crRNA进行纯化。
(2)CRISPR-Cas13a靶向并降解细胞中S RNA：首先用慢病毒转染的方式使人肝癌细胞、人肺泡Ⅱ型上皮细胞稳定表达S蛋白；将表达Cas13a的慢病毒以感染复数为20对细胞进行转染，使用嘌呤霉素筛选7天后，将crRNA转入细胞中，48小时后，收集细胞，提取总RNA，进行qRT-PCR实验检测S的RNA水平。提取总蛋白，Western blot和免疫荧光实验检测S蛋白表达水平。
(3)为证实crRNA6针对SARS-CoV-2 S的特异性，检测Cas13a-crRNA6对细胞内SARS-CoV S(用S’来表示)的RNA水平的影响。
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。
实施例
1、寻找SARS-CoV-2 S的特异性片段：采用序列比对、三维结构叠合分析、分子对接模拟等综合方法实现。如图1提供的SARS-CoV-2 S和SARS-CoV S的受体结合域(RBD)的氨基酸序列比对、三维结构叠合比对图。
(1)序列比对：从NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得SARS-CoV-2S，SARS-CoV S和MERS-CoV S的基因序列。SARS-CoV-2 S，SARS-CoV S和MERS-CoV S的序列号分别为MN908947.3，AY278488.2和KF600652.1。使用Clustal w2.1和Exprint 2.0进行S蛋白序列比对和可视化。
根据序列比对结果，SARS-CoV-2 S蛋白的受体结合结构域(Receptor-Binding-Domain,RBM)有两个片段的残基明显异于SARS-CoV S蛋白相应片段的残基，将SARS-CoV-2S蛋白上的这两个片段命名为片段1(Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly AsnTyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn SEQ ID NO：43)和片段2(Thr GluIle Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr PhePro Leu Gln Ser SEQ ID NO：44)，编码片段1和片段2的RNA序列分别为：
“agauuguuagaacuaag auuccaaccaccauuaauauuaauggacauaucuaacaaauccuucagauua”SEQ ID NO：45
和“ugacuuuagauaguccggccaucguguggaacauuaccacaacuuccaaaauuaacaaugaaaggaaauguuagu”SEQ ID NO：46。
(2)三维结构叠合分析：从PDB数据库(https://www.rcsb.org/)获得了SARS-CoV-2 S，SARS-CoV S和MERS-CoV S的蛋白质三维结构。
SARS-CoV-2 S的PDB ID为6VXX(
Figure BDA0002715872380000081
)，6LZG(
Figure BDA0002715872380000082
)和6M0J(
Figure BDA0002715872380000083
)。SARS-CoVS的PDB ID为6NB6(
Figure BDA0002715872380000084
)。MERS-CoV S的PDB ID为5X59(
Figure BDA0002715872380000085
)。还从PDB(ID：5XWP)获得了Cas13a-crRNA-靶RNA三元复合物的晶体结构。根据叠合分析结果，SARS-CoV-2 S上的片段-2与SARS-CoV S、MERS-CoV S上的相应片段具有较大的构象差异。
(3)分子对接模拟：使用ZDock进行对接模拟，在所有可能的空间构象和相互作用模式中，选择具有最低能量的构象进行可视化分析。使用PyMol v1.60进行可视化分析。结果显示RBD上的片段-2在S与ACE2相互作用中发挥着关键作用。
图2是本发明提供的SARS-CoV-2 S和SARS-CoV S与宿主细胞表面受体ACE2的对接分析图。
2、crRNA的设计：遵循叠瓦状的设计原则，利用CRISPR-RNA靶向预测和可视化在线工具(http://bioinfolab.miamioh.edu/CRISPR-RT)设计靶向上述特异性片段的crRNA文库，共包含39个crRNA序列。
crRNA-1:ugacuuuagauaguccggccaucgugug SEQ ID NO：1；
crRNA-2:gacuuuagauaguccggccaucgugugg SEQ ID NO：2；
crRNA-3:acuuuagauaguccggccaucgugugga SEQ ID NO：3；
crRNA-4:uuuagauaguccggccaucguguggaac SEQ ID NO：4；
crRNA-5:uuagauaguccggccaucguguggaaca SEQ ID NO：5；
crRNA-6:uagauaguccggccaucguguggaacau SEQ ID NO：6；
crRNA-7:agauaguccggccaucguguggaacauu SEQ ID NO：7；
crRNA-8:uaguccggccaucguguggaacauuacc SEQ ID NO：8；
crRNA-9:guccggccaucguguggaacauuaccaC SEQ ID NO：9；
crRNA-10:uccggccaucguguggaacauuaccaca SEQ ID NO：10；
crRNA-11:cggccaucguguggaacauuaccacaac SEQ ID NO：11；
crRNA-12:ggccaucguguggaacauuaccacaacu SEQ ID NO：12；
crRNA-13:caucguguggaacauuaccacaacuucc SEQ ID NO：13；
crRNA-14:aucguguggaacauuaccacaacuucca SEQ ID NO：14；
crRNA-15:ucguguggaacauuaccacaacuuccaa SEQ ID NO：15；
crRNA-16:cguguggaacauuaccacaacuuccaaa SEQ ID NO：16；
crRNA-17:guguggaacauuaccacaacuuccaaaA SEQ ID NO：17；
crRNA-18:uguggaacauuaccacaacuuccaaaau SEQ ID NO：18；
crRNA-19:guggaacauuaccacaacuuccaaaauu SEQ ID NO：19；
crRNA-20:uggaacauuaccacaacuuccaaaauua SEQ ID NO：20；
crRNA-21:gaacauuaccacaacuuccaaaauuaac SEQ ID NO：21；
crRNA-22:aacauuaccacaacuuccaaaauuaaca SEQ ID NO：22；
crRNA-23:acauuaccacaacuuccaaaauuaacaa SEQ ID NO：23；
crRNA-24:cauuaccacaacuuccaaaauuaacaau SEQ ID NO：24；
crRNA-25:auuaccacaacuuccaaaauuaacaaug SEQ ID NO：25；
crRNA-26:uuaccacaacuuccaaaauuaacaauga SEQ ID NO：26；
crRNA-27:uaccacaacuuccaaaauuaacaaugaa SEQ ID NO：27；
crRNA-28:accacaacuuccaaaauuaacaaugaaa SEQ ID NO：28；
crRNA-29:ccacaacuuccaaaauuaacaaugaaag SEQ ID NO：29；
crRNA-30:cacaacuuccaaaauuaacaaugaaagg SEQ ID NO：30；
crRNA-31:acaacuuccaaaauuaacaaugaaagga SEQ ID NO：31；
crRNA-32:caacuuccaaaauuaacaaugaaaggaa SEQ ID NO：32；
crRNA-33:aacuuccaaaauuaacaaugaaaggaaa SEQ ID NO：33；
crRNA-34:acuuccaaaauuaacaaugaaaggaaau SEQ ID NO：34；
crRNA-35:cuuccaaaauuaacaaugaaaggaaaug SEQ ID NO：35；
crRNA-36:uuccaaaauuaacaaugaaaggaaaugu SEQ ID NO：36；
crRNA-37:uccaaaauuaacaaugaaaggaaauguu SEQ ID NO：37；
crRNA-38:ccaaaauuaacaaugaaaggaaauguua SEQ ID NO：38；
crRNA-39:caaaauuaacaaugaaaggaaauguuag SEQ ID NO：39；
其中SEQ ID NO：6可作为用于靶向新型冠状病毒SARS-CoV-2棘突(S)的RNA。
3、计算机筛选潜在最佳crRNA候选序列：
(1)首先计算crRNA的GC含量，筛选出12个GC含量大于0.5的crRNA,crRNA-1～12；
crRNA-1:ugacuuuagauaguccggccaucgugug SEQ ID NO：1，GC含量0.5；
crRNA-2:gacuuuagauaguccggccaucgugugg SEQ ID NO：2，GC含量0.54；
crRNA-3:acuuuagauaguccggccaucgugugga SEQ ID NO：3，GC含量0.5；
crRNA-4:uuuagauaguccggccaucguguggaac SEQ ID NO：4，GC含量0.5；
crRNA-5:uuagauaguccggccaucguguggaaca SEQ ID NO：5，GC含量0.5；
crRNA-6:uagauaguccggccaucguguggaacau SEQ ID NO：6，GC含量0.5；
crRNA-7:agauaguccggccaucguguggaacauu SEQ ID NO：7，GC含量0.5；
crRNA-8:uaguccggccaucguguggaacauuacc SEQ ID NO：8，GC含量0.54；
crRNA-9:guccggccaucguguggaacauuaccaC SEQ ID NO：9，GC含量0.57；
crRNA-10:uccggccaucguguggaacauuaccaca SEQ ID NO：10，GC含量0.54；
crRNA-11:cggccaucguguggaacauuaccacaac SEQ ID NO：11，GC含量0.54；
crRNA-12:ggccaucguguggaacauuaccacaacu SEQ ID NO：12，GC含量0.5。
(2)对于GC含量大于0.5的crRNA，计算机模拟其与Cas13a蛋白、靶RNA的对接，计算出Cas13a-crRNA、Cas13a-crRNA-RNA复合物的结合能，根据结合能大小进行筛选，由于结合能越小，复合物越稳定，结合能最小的crRNA-5，6，9，10被视为计算机筛选出的潜在最佳crRNA候选序列。
单链crRNA与Cas13a的分子对接结果：
Figure BDA0002715872380000101
Figure BDA0002715872380000111
单链crRNA、单链病毒RNA与Cas13a的分子对接结果：
Figure BDA0002715872380000112
上述内容如图3提供的对GC含量大于0.5的crRNA候选序列与Cas13a、靶向病毒RNA之间进行结合能分析，计算相应对接分数图。图3(a)Cas13a与crRNA-1～12的对接分数；图3(b)Cas13a与crRNA、靶向病毒RNA之间的对接分数。
4、Cas13a慢病毒的包装和crRNA的合成：
(1)S/S’和Cas13a慢病毒的包装：S/S’和Cas13a慢病毒表达载体分别选用pCDH-EF1和GV341。采用瞬时共转染法，将含有表达S/S’或Cas13a的质粒和包装质粒等转染体系转入HEK293T细胞，使细胞内进行慢病毒的包装。包装好的慢病毒颗粒分泌到细胞外培养上清中，收集上清获取慢病毒。
(2)crRNA的合成：首先，使用T7侧翼引物，通过PCR生成crRNA的DNA模板。在95℃下加热5min使反应混合物变性，随后在冰上急冷10min，并在72℃下孵育30min来进行引物延伸。然后使用T7 sgRNA MICscriptTM试剂盒(Biomics Biotech，江苏，中国)将T7 PCR产物进行体外转录。使用EzOmicsTM RNA Quick Clear试剂盒(Biomics Biotech，江苏，中国)对转录的crRNA进行纯化。
5、细胞培养和转染：人肝癌细胞HepG2细胞在10％FBS(Gibco，加利福尼亚，美国)，和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基(Gibco，加利福尼亚，美国)中培养。人肺泡Ⅱ型上皮(AT2)细胞在添加10％FBS，10ng/ml角质形成细胞生长因子(KGF)和1％青霉素-链霉素的DMEM/F-12的培养基中，置于37℃和5％CO2的环境中生长，每隔1天更换1次培养基。
用Lipofectamine R3000(Invitrogen，加利福尼亚，美国)将crRNA转染到细胞中。
6、在细胞水平crRNA识别并降解S效率的检测：
(1)qRT-PCR：将细胞在TRIzol试剂(Invitrogen，加利福尼亚，美国)中混匀，冰上孵育10min。按照TRIzol：氯仿的体积5：1的比例加入氯仿，震荡10秒，静置2min。12,000g离心(4℃)15min，混合液分三层，包括最下面的苯酚-氯仿有机相，中间相和上层水相，小心转移上层水相到新的EP管。加入适量异丙醇，混匀后静置10min。12,000g离心(4℃)10min，弃上清。加入适量75％乙醇，轻轻洗涤沉淀，7500g离心(4℃)5min，弃上清。室温下风干后加入适量的DEPC H2O溶解RNA。然后使用逆转录试剂盒(RR047A，TaKaRa，日本)进行cDNA的合成。
逆转录体系：
Figure BDA0002715872380000121
逆转录过程为：42℃孵育40min，85℃加热5min，4℃保存。
接着，用SYBR Green Master Mix试剂(Life Technologies)在DNA EngineOpticon 2两色qRT-PCR检测系统上进行qRT-PCR实验。所用PCR引物包括：
S-F,ggctgcgttatagcttggaatt；
S-R,gtgggttggaaaccatatgattg；SEQ ID NO：40。
GAPDH-F,tgcaccaccaactgcttagc；
GAPDH-R,ggcatggactgtggtcatgag，SEQ ID NO：41。
S’-F,tggtatgtttggctcggctt；
S’-R,gcagcaagaac cacaagagc，SEQ ID NO：42。
在本发明中，PCR体系包括：
Figure BDA0002715872380000131
qRT-PCR过程为：预变性95℃加热120s,变性95℃加热20s,58℃退火20s,72℃延伸20s。
(2)Western blot实验：用RIPA缓冲液(R0010，Solarbio，北京)分别裂解相等数量的AT2细胞，表达S的AT2细胞，表达S和Cas13a的AT2细胞以及表达S，Cas13a和crRNA-6的AT2细胞。通过BCA测定法测定细胞裂解物的总蛋白浓度。首先将标准品按照0，1，2，4，8，12，16，20μL加到96孔板的标准品孔中，加PBS稀释液补足到20μL。加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加PBS稀释液稀释到20μL。将50体积的BCA试剂A与1体积的BCA试剂B充分混匀配成BCA工作液后，各孔均加入200μL的BCA工作液，37℃放置30min。在562nm波长下比色，记录吸光值，根据标准曲线计算样品的蛋白浓度。为了进行western blot实验，每个样品(20μL)用10％的SDS-PAGE凝胶分离，100V恒压电泳120min结束，将凝胶转移到PVDF膜上，然后在5％的BSA中封闭2h(25℃)。然后将膜在一抗SARS-CoV-2 S抗体(GTX632604，GeneTex，USA)、GAPDH抗体(60004-1-Ig，Proteintech，USA)中孵育16小时(4℃)，用TBST洗涤膜3遍，每次5min。接着在室温下在HRP偶联的二抗中孵育1h。在TBST中洗涤3次，每次5min后，使用增强的化学发光法(ECL)对蛋白条带进行成像。
(4)免疫荧光：在用crRNA-6处理后48小时，将爬片上的AT2细胞用于免疫荧光实验。首先用PBS轻轻洗涤细胞玻片，接着将细胞玻片固定在4％多聚甲醛中约15min(25℃)，用0.5％Triton X-100处理10min(25℃)进行透化，并用5％BSA溶液封闭约30min(25℃)。将载玻片在一抗SARS-CoV-2 S抗体(GTX632604，GeneTex，美国)在4℃孵育16小时。用PBS洗涤3次每次5min，将细胞玻片与荧光偶联的二抗AlexaFluor 594(Life Technologies，USA)，在25℃下孵育1小时。将载玻片用PBS洗涤3次，然后用带有DAPI的ProLongTM GoldAntifade封片剂(#P36930，Life Technologies)进行封片。使用荧光共聚焦显微镜(Olympus，日本)观察并拍照。
7、筛选结果，如图7提供的crRNA-6序列筛选图。
(1)根据GC含量、结合能分析的结果，crRNA-3，crRNA-4，crRNA-5，crRNA-6，crRNA-9，crRNA-10与Cas13a蛋白、病毒RNA形成的复合物稳定性可能较高，即crRNA-3，crRNA-4，crRNA-5，crRNA-6，crRNA-9，crRNA-10可能是潜在最佳crRNA序列。
(2)根据HepG2细胞和AT2细胞的qRT-PCR结果：在HepG2细胞，与对照组相比，转染了crRNA-2，crRNA-3，crRNA-5，crRNA-6的HepG2细胞的S RNA表达水平降低最为显著；而在AT2细胞，与对照组相比，转染了crRNA-6，crRNA-10，crRNA-11，crRNA-12的AT2细胞的S RNA表达水平降低最为显著。综合两种细胞的结果，crRNA-6可能是靶向S RNA效率最高的crRNA序列。
如图4提供的S的mRNA表达量图(以GAPDH为内参)。图4(a)qRT-PCR分析显示Cas13a-crRNA-1～12对HepG2细胞中S的mRNA表达量的影响；图4(b)qRT-PCR分析显示Cas13a-crRNA-1～12对AT2细胞中S的mRNA表达量的影响。
(3)western blot检测、免疫荧光分析结果，crRNA-6可在AT2细胞中引起S蛋白水平的显著降低。如图5提供的CRISPR-Cas13a系统在表达S的人肺泡Ⅱ型上皮细胞AT2中引起S蛋白的水平降低图。图5A Western blot条带；图5B灰度值统计；图5C激光共聚焦图片；图5D S的平均荧光强度统计。
(4)qRT-PCR结果还显示：Cas13a-crRNA6没有引起人肺泡Ⅱ型上皮细胞中SARS-CoV S(S’)的RNA的表达水平的改变，如图6提供的S’的mRNA表达量图(以GAPDH为内参)所示。说明crRNA6的特异性。
(5)综上所述，通过生物信息学分析与生物学实验相结合的方式筛选出高效率靶向SARS-CoV-2 S RNA的crRNA序列crRNA-6，Cas13a-crRNA6复合物可引起人肺泡Ⅱ型上皮细胞中S的显著降解，但不会改变细胞内S’的RNA水平的改变。
本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的公开后，将容易想到本公开的其它实施方案。本申请旨在涵盖本公开的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本公开的一般性原理并包括本公开未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本公开的真正范围和精神由所附的权利要求指出。
应当理解的是，本公开并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本公开的范围应由所附的权利要求来限制。
序列表
<110> 天津医科大学总医院
<120> 靶向新型冠状病毒棘突的基因、试剂盒、筛选方法及应用
<160> 46
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ugacuuuaga uaguccggcc aucgugug 28
<210> 2
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gacuuuagau aguccggcca ucgugugg 28
<210> 3
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acuuuagaua guccggccau cgugugga 28
<210> 4
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
uuuagauagu ccggccaucg uguggaac 28
<210> 5
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
uuagauaguc cggccaucgu guggaaca 28
<210> 6
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
uagauagucc ggccaucgug uggaacau 28
<210> 7
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agauaguccg gccaucgugu ggaacauu 28
<210> 8
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
uaguccggcc aucgugugga acauuacc 28
<210> 9
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
guccggccau cguguggaac auuaccac 28
<210> 10
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
uccggccauc guguggaaca uuaccaca 28
<210> 11
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cggccaucgu guggaacauu accacaac 28
<210> 12
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggccaucgug uggaacauua ccacaacu 28
<210> 13
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
caucgugugg aacauuacca caacuucc 28
<210> 14
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aucgugugga acauuaccac aacuucca 28
<210> 15
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ucguguggaa cauuaccaca acuuccaa 28
<210> 16
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cguguggaac auuaccacaa cuuccaaa 28
<210> 17
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
guguggaaca uuaccacaac uuccaaaa 28
<210> 18
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
uguggaacau uaccacaacu uccaaaau 28
<210> 19
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
guggaacauu accacaacuu ccaaaauu 28
<210> 20
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
uggaacauua ccacaacuuc caaaauua 28
<210> 21
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gaacauuacc acaacuucca aaauuaac 28
<210> 22
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aacauuacca caacuuccaa aauuaaca 28
<210> 23
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
acauuaccac aacuuccaaa auuaacaa 28
<210> 24
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cauuaccaca acuuccaaaa uuaacaau 28
<210> 25
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
auuaccacaa cuuccaaaau uaacaaug 28
<210> 26
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
uuaccacaac uuccaaaauu aacaauga 28
<210> 27
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
uaccacaacu uccaaaauua acaaugaa 28
<210> 28
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
accacaacuu ccaaaauuaa caaugaaa 28
<210> 29
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ccacaacuuc caaaauuaac aaugaaag 28
<210> 30
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cacaacuucc aaaauuaaca augaaagg 28
<210> 31
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
acaacuucca aaauuaacaa ugaaagga 28
<210> 32
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
caacuuccaa aauuaacaau gaaaggaa 28
<210> 33
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
aacuuccaaa auuaacaaug aaaggaaa 28
<210> 34
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
acuuccaaaa uuaacaauga aaggaaau 28
<210> 35
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
cuuccaaaau uaacaaugaa aggaaaug 28
<210> 36
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
uuccaaaauu aacaaugaaa ggaaaugu 28
<210> 37
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
uccaaaauua acaaugaaag gaaauguu 28
<210> 38
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ccaaaauuaa caaugaaagg aaauguua 28
<210> 39
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
caaaauuaac aaugaaagga aauguuag 28
<210> 40
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ggctgcgtta tagcttggaa ttgtgggttg gaaaccatat gattg 45
<210> 41
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
tgcaccacca actgcttagc ggcatggact gtggtcatga g 41
<210> 42
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
tggtatgttt ggctcggctt gcagcaagaa ccacaagagc 40
<210> 43
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn
20
<210> 44
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly
1 5 10 15
Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
20 25
<210> 45
<211> 69
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
agauuguuag aacuaagauu ccaaccacca uuaauauuaa uggacauauc uaacaaaucc 60
uucagauua 69
<210> 46
<211> 75
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
ugacuuuaga uaguccggcc aucgugugga acauuaccac aacuuccaaa auuaacaaug 60
aaaggaaaug uuagu 75

Claims (10)

1.一种用于靶向新型冠状病毒SARS-CoV-2棘突的基因，其特征在于，所述用于靶向新型冠状病毒SARS-CoV-2棘突的基因的RNA序列为SEQ ID NO：6。
2.一种对抗SARS-CoV-2感染的特异性治疗试剂盒，其特征在于，所述对抗SARS-CoV-2感染的特异性治疗试剂盒包含权利要求1所述的基因。
3.一种包含权利要求1所述基因的crRNA文库，其特征在于，所述crRNA文库还包含RNA序列SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：5，以及SEQ ID NO：7～SEQ ID NO：39。
4.如权利要求3所述的crRNA文库，其特征在于，所述crRNA文库基于作为SARS-CoV-2的靶向位点的靶RNA序列，利用叠瓦状方式构建；
所述靶RNA序列的RNA为SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46。
5.一种利用权利要求4所述crRNA文库中的靶RNA序列编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白包括：
所述SEQ ID NO：45编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：43；
所述SEQ ID NO：46编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：44。
6.如权利要求5所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白通过氨基酸序列比对、蛋白三维结构比对、与受体分子对接，获得的位于SARS-CoV-2S上的特异性片段。
7.一种转染权利要求1所述基因用于识别并降解S效率检测的细胞。
8.一种用于靶向新型冠状病毒SARS-CoV-2棘突的基因筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括：
(1)通过氨基酸序列比对、蛋白三维结构比对、与受体分子对接的生物信息学方法，获得到位于SARS-CoV-2S上的特异性片段，编码所述特异性片段片段的RNA为靶RNA序列；
(2)采用叠瓦状方式设计针对所述靶RNA序列构建crRNA文库；
(3)计算构建的crRNA文库中RNA序列SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：39不同crRNA的GC含量，筛选出GC含量大于或等于0.5的SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：12 12个crRNA序列；
(4)利用生物信息学模拟所述12个crRNA不同序列crRNA与靶RNA、Cas13a蛋白的结合，计算复合物结合能，根据结合能大小，筛选出结合稳定性最高的SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10为计算机筛选出的潜在最佳crRNA候选序列；
(5)Cas13a慢病毒的包装和crRNA的合成、细胞培养和转染、在细胞水平crRNA识别并降解S效率的检测、筛选，获得SEQ ID NO：6序列在上皮细胞中S的显著降解；
(6)证实crRNA6针对SARS-CoV-2S的特异性，检测Cas13a-crRNA6对细胞内SARS-CoV S的RNA水平的影响。
9.如权利要求8所述的用于靶向新型冠状病毒SARS-CoV-2棘突的基因筛选方法，其特征在于，所述步骤(5)、(6)中Cas13a慢病毒的包装和crRNA的合成包括：
1)S/S’和Cas13a慢病毒的包装：S/S’和Cas13a慢病毒表达载体分别选用pCDH-EF1和GV341；采用瞬时共转染法，将含有表达S/S’或Cas13a的质粒和包装质粒等转染体系转入HEK293T细胞，使细胞内进行慢病毒的包装；包装好的慢病毒颗粒分泌到细胞外培养上清中，收集上清获取慢病毒；
2)crRNA的合成：首先，使用T7侧翼引物，通过PCR生成crRNA的DNA模板；在95℃下加热5min使反应混合物变性，随后在冰上急冷10min，并在72℃下孵育30min来进行引物延伸；然后使用T7 sgRNA MICscriptTM试剂盒将T7 PCR产物进行体外转录；使用EzOmicsTM RNAQuick Clear试剂盒对转录的crRNA进行纯化；
所述细胞培养和转染包括：人肝癌细胞HepG2细胞在10％FBS，和1％青霉素-链霉素的DMEM培养基中培养；人肺泡Ⅱ型上皮AT2细胞在添加10％FBS，10ng/ml角质形成细胞生长因子KGF和1％青霉素-链霉素的DMEM/F-12的培养基中，置于37℃和5％CO2的环境中生长，每隔1天更换1次培养基；
用Lipofectamine R3000将crRNA转染到细胞中；
所述在细胞水平crRNA识别并降解S效率的检测包括：
1)qRT-PCR：将细胞在TRIzol试剂中裂解；按照TRIzol：氯仿的体积5：1的比例加入氯仿，震荡10秒，静置2min；12000g离心15min，取上清；加入适量异丙醇，混匀后静置10min；12000g离心10min，弃上清；加入适量75％乙醇，轻轻洗涤沉淀，7500g离心5min，弃上清；晾干后加入适量的DEPC H2O溶解RNA；然后使用逆转录试剂盒进行cDNA的合成；用SYBR GreenMaster Mix试剂在DNA Engine Opticon 2两色qRT-PCR检测系统上进行qRT-PCR实验；所用PCR引物包括：SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42；
2)Western blot实验：用RIPA缓冲液分别裂解相等数量的AT2细胞，表达S的AT2细胞，表达S和Cas13a的AT2细胞以及表达S，Cas13a和crRNA-6的AT2细胞；通过BCA测定法测定细胞裂解物的总蛋白浓度；首先将标准品按照0，1，2，4，8，12，16，20μL加到96孔板的标准品孔中，加PBS稀释液补足到20μL；加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加PBS稀释液稀释到20μL；将50体积的BCA试剂A与1体积的BCA试剂B充分混匀配成BCA工作液后，各孔均加入200μL的BCA工作液，37℃放置30min；在562nm波长下比色，记录吸光值，根据标准曲线计算样品的蛋白浓度；每个样品用10％的SDS-PAGE凝胶分离，将凝胶转移到PVDF膜上，然后在5％的BSA中封闭2h；然后将膜在一抗SARS-CoV-2S抗体、GAPDH抗体中孵育16小时，用TBST洗涤膜3遍，并在HRP偶联的二抗中孵育1h；在TBST中洗涤3次后，使用增强的化学发光法对蛋白条带进行成像；
3)免疫荧光：在用crRNA-6处理后48小时，将爬片上的AT2细胞用于免疫荧光实验；首先将细胞玻片固定在4％多聚甲醛中，用0.5％Triton X-100透化，并用5％BSA封闭；将载玻片在一抗SARS-CoV-2S抗体在4℃孵育16小时；用PBS洗涤3次后，将细胞玻片与荧光偶联的二抗AlexaFluor 594，在25℃下孵育1小时；将载玻片用PBS洗涤3次，然后用带有DAPI的ProLongTM Gold Antifade封片剂进行封片；拍照；
所述筛选包括：
1)根据GC含量、结合能分析的结果，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：6，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10与Cas13a蛋白、病毒RNA形成的复合物稳定性可能较高，即SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10可能是潜在最佳crRNA序列；
2)根据HepG2细胞和AT2细胞的qRT-PCR结果：在HepG2细胞，与对照组相比，转染SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，的HepG2细胞的S RNA表达水平降低最为显著；而在AT2细胞，与对照组相比，转染SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ IDNO：12的AT2细胞的S RNA表达水平降低最为显著；综合两种细胞的结果，SEQ ID NO：6是靶向S RNA效率最高的crRNA序列；
3)western blot检测、免疫荧光分析结果，SEQ ID NO：6在AT2细胞中引起S蛋白水平的显著降低；
4)通过生物信息学分析与生物学实验相结合的方式筛选出高效率靶向SARS-CoV-2 SRNA的crRNA序列SEQ ID NO：6，Cas13a-crRNA6复合物引起人肺泡Ⅱ型上皮细胞中S的显著降解；
5)qRT-PCR结果显示crRNA6的特异性：Cas13a-crRNA6没有引起人肺泡Ⅱ型上皮细胞中SARS-CoV S的RNA的表达水平的改变。
10.一种如权利要求1所述用于靶向新型冠状病毒SARS-CoV-2棘突的基因的crRNA在制备对抗SARS-CoV-2感染的特异性治疗药物上的应用。
CN202011073334.3A 2020-10-09 2020-10-09 靶向新型冠状病毒棘突的基因、试剂盒、筛选方法及应用 Active CN112159817B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011073334.3A CN112159817B (zh) 2020-10-09 2020-10-09 靶向新型冠状病毒棘突的基因、试剂盒、筛选方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011073334.3A CN112159817B (zh) 2020-10-09 2020-10-09 靶向新型冠状病毒棘突的基因、试剂盒、筛选方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112159817A true CN112159817A (zh) 2021-01-01
CN112159817B CN112159817B (zh) 2022-04-08

Family

ID=73866476

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011073334.3A Active CN112159817B (zh) 2020-10-09 2020-10-09 靶向新型冠状病毒棘突的基因、试剂盒、筛选方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112159817B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022250503A1 (ko) * 2021-05-27 2022-12-01 한국과학기술원 Cas13 단백질 및 crrna를 포함하는 코로나바이러스감염증-19 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111235313A (zh) * 2020-03-08 2020-06-05 深圳市创新医学科技有限公司 一种快速检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas13方法
CN111534514A (zh) * 2020-03-09 2020-08-14 宿迁市第一人民医院 一种基于Crisper的新型冠状病毒的检测试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111235313A (zh) * 2020-03-08 2020-06-05 深圳市创新医学科技有限公司 一种快速检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas13方法
CN111534514A (zh) * 2020-03-09 2020-08-14 宿迁市第一人民医院 一种基于Crisper的新型冠状病毒的检测试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ABBOTT ET AL.: "Development of CRISPR as an Antiviral Strategy to Combat SARS-CoV-2 and Influenza", 《CELL》 *
LOTFI ET AL.: "CRISPR/Cas13: A potential therapeutic option of COVID-19", 《BIOMEDCINE & PHARMACOTHERAPY》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022250503A1 (ko) * 2021-05-27 2022-12-01 한국과학기술원 Cas13 단백질 및 crrna를 포함하는 코로나바이러스감염증-19 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
CN112159817B (zh) 2022-04-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhao et al. Novel cleavage sites identified in SARS-CoV-2 spike protein reveal mechanism for cathepsin L-facilitated viral infection and treatment strategies
Wang et al. Rapid design and development of CRISPR-Cas13a targeting SARS-CoV-2 spike protein
Freed HIV-1 assembly, release and maturation
Yang et al. Drug repurposing of itraconazole and estradiol benzoate against COVID‐19 by blocking SARS‐CoV‐2 spike protein‐mediated membrane fusion
CN114025785B (zh) 慢性炎症和病毒感染的诊断和治疗
Cai et al. Functional investigation of grass carp reovirus nonstructural protein NS80
Nuss et al. Multi-faceted proteomic characterization of host protein complement of Rift Valley fever virus virions and identification of specific heat shock proteins, including HSP90, as important viral host factors
WO2022148314A1 (zh) 外源性atg10s蛋白在制备抗病毒药物中的应用
Barrey et al. Think different with RNA therapy: can antisense oligonucleotides be used to inhibit replication and transcription of SARS-CoV-2?
Gao et al. Neuropilin‐1‐mediated SARS‐CoV‐2 infection in bone marrow‐derived macrophages inhibits osteoclast differentiation
Chen et al. Inhibition of SARS-CoV-2 pseudovirus invasion by ACE2 protecting and Spike neutralizing peptides: An alternative approach to COVID19 prevention and therapy
Fu et al. CircADAMTS6/miR‐431‐5p axis regulate interleukin‐1β induced chondrocyte apoptosis
CN112159817B (zh) 靶向新型冠状病毒棘突的基因、试剂盒、筛选方法及应用
Wang et al. SUR2B/Kir6. 1 channel openers correct endothelial dysfunction in chronic heart failure via the miR-1-3p/ET-1 pathway
CN114921519A (zh) 抑制或阻断SARS-CoV-2感染的药物筛选模型及筛选方法
Li et al. Characterization of RNA G-quadruplexes in porcine epidemic diarrhea virus genome and the antiviral activity of G-quadruplex ligands
Monette et al. Influence of HIV-1 genomic RNA on the formation of Gag biomolecular condensates
Zhu et al. Bombyx mori cypovirus (BmCPV) induces PINK1-Parkin mediated mitophagy via interaction of VP4 with host Tom40
WO2022120936A1 (zh) 一种修饰的核酸及其应用
Mazzaccaro et al. Viral agents and systemic levels of inflammatory cytokines in vulnerable and stable atherosclerotic carotid plaques
CN111154858B (zh) 一种长非编码rna及其在诊断/治疗子痫前期中的应用
CN113621598A (zh) 钙蛋白酶-1在抵抗猪流行性腹泻病毒感染中的应用
WO2022253340A1 (zh) 环状RNA Circ-ACE2翻译的多肽及其应用
Feng et al. Preparation of polyclonal antibodies to the chicken Beclin1 protein and its application in the detection of nephropathogenic infectious bronchitis virus
US20240271212A1 (en) Characterization and treatment of asthma

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant