CN117660609A

CN117660609A - 基于LwaCas13a的非扩增核酸检测组合物、试剂盒和方法

Info

Publication number: CN117660609A
Application number: CN202311591904.1A
Authority: CN
Inventors: 马立新; 王飞; 曾莞婷; 陈晚苹; 翟超
Original assignee: Hubei University
Current assignee: Hubei University
Priority date: 2023-11-24
Filing date: 2023-11-24
Publication date: 2024-03-08

Abstract

本发明公开了基于LwaCas13a的非扩增核酸检测组合物、试剂盒和方法，所述组合物和试剂盒中包括URH以及靶向该URH的crRNA‑1，所述URH为具有茎环结构的单链RNA分子，且其环的部分序列中带有U碱基位点，其茎的部分序列为与crRNA‑1识别互补的结合区域。本发明利用LwaCas13a和URH构建了荧光信号循环放大机制，能够有效增加核酸检测的灵敏度，而且检测结果可靠、检测时间仅需5‑10min、操作简便，本发明为无扩增核酸检测提供了一种新的途径和策略。

Description

基于LwaCas13a的非扩增核酸检测组合物、试剂盒和方法

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种基于LwaCas13a的非扩增核酸检测组合物、试剂盒和方法。

背景技术

SARS-CoV-2是一种新型冠状病毒，属于冠状病毒家族，是继SARS-CoV和中东呼吸综合征MERS-CoV后，第七种被认识的可感染人类、第三种可引起严重临床综合征的冠状病毒病原体。SARS-CoV-2是一种有着高扩散能力的病毒，通过飞沫、直接接触和被感染的物体传播，并且也由无症状感染者传播。由于SARS-CoV-2的潜伏时间长，扩散能力高，使得其具有较强的传染性。目前针对的靶标主要包含SARS-CoV-2基因组中3段保守基因序列：开放读码框1ab(open reading frame 1ab,ORF1ab)、核壳蛋白(nucleocapsid protein,N)基因以及包膜蛋白(envelop,E)基因。

新布尼亚病毒SFTSV是一种可引起原因不明的严重发热伴血小板减少综合征(SFTS)的RNA病毒。它由出现发热、血小板减少和多器官功能障碍的患者中分离出来，RNA序列分析表明，该病毒是一种新发现的布尼亚病毒科细小病毒属。研究发现，SFTSV具有高度保守的三个基因组片段，分别命名为L、M和S。L段包含6368个核苷酸，其中一个开放阅读框编码2084个氨基酸。M段包含3378个核苷酸和一个开放阅读框，编码1073个氨基酸的糖蛋白(Gn和Gc)前体。S段包含1744个核苷酸的反义RNA，编码两种蛋白质，N蛋白和NSs蛋白，它们的方向相反，被一个62bp的基因间区隔开。这种疾病导致高死亡率和发病率，同样威胁全球公共健康。如何能够快速检测SFTSV对于在资源匮乏的环境中预防流行病至关重要。

现有的核酸检测方法，按照进行检测的原理，大致能够被分为需要扩增和不需要扩增的两大类。在需要扩增的核酸检测方法中，核酸扩增试验(NAATs)如实时RT-PCR是SARS-CoV-2诊断检测的首选方法，甚至被作为目前公认的SARS-CoV-2诊断的金标准，总的来说，这些方法都需要聚合酶实现扩增以提高灵敏度以满足检测要求，所以存在复杂模板情况下会因非特异性扩增而导致假阳性和引物特异性差扩增失败导致的假阴性等问题。此外，还有一些不需要对待检测靶进行扩增，而是通过其他手段使检测信号放大的检测方法，简称为非扩增核酸检测方法。以非扩增方式进行核酸检测在时间成本，专业仪器设备的限制等方面与扩增的检测方法相比具有较好的优势，但因其省去直接对待检测靶标的扩增步骤，检测的灵敏度往往比较低。非扩增的核酸检测方法相较于需要扩增的核酸检测方法来说，起始时间更晚，研究的数量和深度都逊色于后者，还有很多空白领域值得研究，还能提出更多具有创造性的想法。就目前此领域的研究程度来说，非扩增的核酸检测方法无法同时在检测时间和灵敏度上都优于基于RT-PCR的核酸检测方法，因此我们试图构建一种高灵敏度、高特异性、快速的非扩增核酸检测技术，为核酸检测领域提供新的可靠的技术选择。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提供一种非扩增核酸检测技术，以解决目前RNA病毒核酸检测中存在的假阴性高或灵敏度低或检测耗时长的问题。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明第一方面提供了一种基于LwaCas13a的非扩增核酸检测组合物，包括URH(富含U的发夹结构RNA，U-rich hairpin structure RNA)以及靶向该URH的crRNA-1；所述URH为具有茎环结构的单链RNA分子，且其环的部分序列中带有U碱基位点，其茎的部分序列为与crRNA-1识别互补的结合区域。

由于Cas13a的反式切割活性并不是完全随机的，而是具有一定的特异性，如LwaCas13a只在含有U的位置进行反式切割，特别是polyU的部分具有较强的切割活性(Multiplexed and Portable Nucleic Acid Detection Platform with Cas13,Cas12a,and Csm6.Science2018,360(6387),439-444)。同时为了缩短检测时间，提高效率，不使用传统核酸检测方法中的反转录定量聚合酶链反应(RT-PCR)的方式将待检测靶进行扩增。因此，本发明尝试利用LwaCas13a的特性放大信号，设计一条可行使循环放大信号功能的RNA结构，以实现用非扩增方式对RNA靶标进行检测的目的。

本发明根据LwaCas13a的反式切割活性特点，设计了一个富含U的具有茎环结构的单链RNA(URH)用作信号放大的工具，URH的环的部分富含U碱基位点，而不带有U碱基位点的茎的部分序列设计为与crRNA-1识别互补的结合区域。

本发明利用LwaCas13a和URH构建了荧光信号循环放大机制，增加了核酸检测的灵敏度，实现了无扩增快速核酸检测。其机理具体为：利用LwaCas13a的反式切割活性，将URH从U碱基位点处切开或切断，使其形成一条RNA单链后与crRNA-1匹配后再与LwaCas13a结合，形成三元复合物后再次激活LwaCas13a的反式切割活性，并对URH的U碱基位点进行切割，从而使整个检测体系中的酶切反应可以通过此种方式循环起来，起到放大检测信号的作用。

优选地，在上述组合物中，所述URH的茎环结构包括但不限于为单个茎环结构或多个茎环结构单元的核酸结构。

优选地，在上述组合物中，所述URH的茎的部分不含有U碱基位点。可以理解的是，URH的茎的部分即使含有U碱基位点(如本发明一实施例中所用的URH 10、URH 12和URH14)，也能实现荧光信号的循环放大，但检测效果明显低于不含有U碱基位点的URH。

更为优选地，在本发明一实施例中，URH具体为序列如下所示的单链RNA分子：

AGUCUCUCUCUCUUUUUGACGCCGCACCACACCAGAGCCCUUUGAGAGAGAGA(SEQ ID NO.1)。

可以理解的是，若URH为由如SEQ ID NO.1所示的单链RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代、和/或缺失、和/或添加得到的与如SEQ ID NO.1所示的单链RNA分子具有相同功能的单链RNA分子时，仍属于本发明的保护范围。

对于如SEQ ID NO.1所示的URH，本发明实施例中进一步提供了与其对应的crRNA-1，具体为以下单链RNA分子：

GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACCUCUGGUGUGGUGCGGCG UC(SEQ IDNO.2)；

或为由如SEQ ID NO.2所示的单链RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代、和/或缺失、和/或添加得到的与如SEQ ID NO.2所示的单链RNA分子具有相同功能的单链RNA分子。

本发明第二方面提供了一种基于LwaCas13a的非扩增核酸检测试剂盒，该试剂盒中包括URH和crRNA-1。

优选地，在上述试剂盒中，还包括：

具有反式切割活性的LwaCas13a；

靶向待测靶标的crRNA-2；

两端分别带有荧光发射基团和荧光淬灭基团的分子信标。

更为优选地，在上述试剂盒中，还包括其他用于构建非扩增核酸检测体系的试剂和耗材，如LwaCas13a的反应缓冲液、反应管等。在本发明的一个实施例中，反应缓冲液包含10mM Tris-HCl(pH8.6)、1mM DTT、40mM KCl和1.5mM MgCl₂。

更为优选地，所述分子信标为含连续4-6个U碱基的RNA链；在本发明一实施例中，分子信标含连续5个U碱基。

所述分子信标一端带荧光发射基团，一端带荧光淬灭基团，二者组成荧光共振能量转移对，其中荧光发射基团包括但不限于6-羧基荧光素，荧光淬灭基团包括但不限于BHQ。

本发明第三方面提供了上述基于LwaCas13a的非扩增核酸检测组合物、试剂盒在RNA检测中的应用，其中RNA包括但不限于miRNA、mRNA等。

本发明第四方面提供了上述基于LwaCas13a的非扩增核酸检测组合物、试剂盒在RNA病毒检测中的应用，其中RNA病毒包括但不限于SARS病毒、MERS病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、新型冠状病毒、艾滋病病毒、全部流感病毒、丙型肝炎病毒、柯萨奇病毒、登革热病毒、乙型脑炎病毒、鼻病毒、脊髓灰质炎病毒轮状病毒、烟草花叶病毒等。

本发明第五方面提供了一种用于SARS-CoV-2检测的非扩增核酸检测试剂盒，具体包括本发明所述的URH和crRNA-1，以及靶向SARS-CoV-2基因组某处靶位点的crRNA-2。

优选地，在上述用于SARS-CoV-2检测的非扩增核酸检测试剂盒中，crRNA-2是针对SARS-CoV-2的N基因和/或针对SARS-CoV-2的ORF1ab基因设计的与LwaCas13a匹配的RNA单链分子或其组合，具体为crRNAORF、crRNA N4和crRNA N7中的任一个或多个组合；具体的：

所述crRNA ORF为以下单链RNA分子：

GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACCCAACCUCUUCUGUAAUU UUUAAA(SEQ IDNO.3)，

或由如SEQ ID NO.3所示的单链RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代、和/或缺失、和/或添加后得到的与如SEQ ID NO.3所示的单链RNA分子具有相同功能的RNA分子；

所述crRNA N4为以下单链RNA分子：

GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACUUUGCGGCCAAUGUUUGU AA(SEQ IDNO.4)，

或由如SEQ ID NO.4所示的单链RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代、和/或缺失、和/或添加后得到的与如SEQ ID NO.4所示的单链RNA分子具有相同功能的RNA分子；

所述crRNA N7为以下单链RNA分子：

GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACUUGGUGUAUUCAAGGCUC CC(SEQ IDNO.5)，

或由如SEQ ID NO.5所示的单链RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代、和/或缺失、和/或添加后得到的与如SEQ ID NO.5所示的单链RNA分子具有相同功能的RNA分子。

本发明第六方面提供了一种用于SFTSV检测的非扩增核酸检测试剂盒，具体包括本发明所述的URH和crRNA-1，以及靶向SFTSV基因组某处靶位点的crRNA-2。

优选地，在上述用于SFTSV检测的非扩增核酸检测试剂盒中，crRNA-2是针对SFTSV的M基因和/或S基因设计的与LwaCas13a匹配的RNA单链分子或其组合，具体为crRNAL、crRNA M和crRNA S中的任一个或多个组合；具体的：

所述crRNA L为以下单链RNA分子：

GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACCUCCUGUCAUUGCUUCCC UGAAC(SEQ IDNO.7)，

或由如SEQ ID NO.7所示的单链RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代、和/或缺失、和/或添加后得到的与如SEQ ID NO.7所示的单链RNA分子具有相同功能的RNA分子；

所述crRNA M为以下单链RNA分子：

GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACAAUUGCGAGUGGUUCCUG AGCCAUGACG(SEQID NO.8)，

或由如SEQ ID NO.8所示的单链RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代、和/或缺失、和/或添加后得到的与如SEQ ID NO.8所示的单链RNA分子具有相同功能的RNA分子；

所述crRNA S为以下单链RNA分子：

GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGUUCAUCAUUGUCUUUGC CCUGACUCGA(SEQID NO.9)，

或由如SEQ ID NO.10所示的单链RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代、和/或缺失、和/或添加后得到的与如SEQ ID NO.9所示的单链RNA分子具有相同功能的RNA分子。

本发明第七方面提供了一种基于LwaCas13a的非扩增核酸检测方法，其包含以下步骤：

S1、对URH进行退火处理；

S2、将退火处理后的URH与crRNA-1、LwaCas13、识别待测靶标的crRNA-2和分子信标配制成预混液，加入待检核酸样本，检测荧光信号。

在上述检测方法中，URH经退火处理后会形成二级结构，当待检核酸样本中的靶标RNA被crRNA-2识别并激活LwaCas13a的反式剪切活性，会优先剪切URH的U碱基位点，从而生成去除茎环结构的RNA单链产物；该产物又可作为crRNA-1的识别对象，结合Cas13a/crRNAURH复合物，再次激活Cas13a反式切割活性；重复循环上述过程并累计激活大量LwaCas13a，LwaCas13a剪切分子信标产生荧光信号。

本发明方法适用于RNA靶标检测和DNA靶标检测，仅需预先按常规方法将DNA靶标转录为RNA即可。

优选地，在上述检测方法中，所述URH的退火条件为：先于65～95℃处理1～10min，再缓慢冷却至25℃。

更为优选地，所述URH的退火方式为：将URH置于KOD buffer中，95℃、5min，再以0.1℃/s速度降至25℃。

优选地，在上述检测方法中，步骤S2所述待检核酸样本由生物来源试样或环境来源试样经提取并纯化所得核酸样品；具体可采用现有技术中的常规试剂盒进行裂解、提取。其中所述生物来源拭样包括但不限于痰液、咽拭子、血液、灌洗液、排泄物、呕吐物等。

优选地，在上述检测方法中，步骤S2所述检测荧光信号的方式包括但不限于：利用Q-PCR仪的荧光检测功能跟踪荧光信号动力学，或荧光仪上检测荧光信号改变，以检测上述反应产物中荧光基团的发光情况，从而判断待检核酸样本中是否有待测靶标。

优选地，在上述检测方法中，对步骤S2所述LwaCas13与crRNA-2进行预组装，然后再用于配制预混液。

本发明第八方面提供了一种用于SARS-CoV-2病毒的核酸检测方法，具体为：

S1、以待测样品的RNA抽提物为待检核酸样本；

S2、对如URH进行退火处理；

S3、将退火处理后的URH与crRNA-1、crRNA-2(选自SEQ ID NO.3～5)、LwaCas13、分子信标配制成预混液，加入待检核酸样本进行反应；

S4、利用Q-PCR仪的荧光检测功能检测上述反应产物中荧光基团的发光情况，判断待检测样品中核酸的情况，从而判断待测样品中是否有新型冠状病毒SARS-CoV-2核酸。

在上述方法中，步骤S4的判断方法具体为：若荧光值大于负对照(未添加待检核酸样本)，则待测样品中含有新型冠状病毒SARS-CoV-2，若小于等于负对照，则待测样品中没有新型冠状病毒SARS-CoV-2。

本发明第九方面提供了一种用于新布尼亚病毒SFTSV的核酸检测方法，具体为：

S1、以待测样品的RNA抽提物为待检核酸样本；

S2、对如URH进行退火处理；

S3、将退火处理后的URH与crRNA-1、crRNA-2(选自SEQ ID NO.7～9)、LwaCas13、分子信标配制成预混液，加入待检核酸样本进行反应；

S4、利用Q-PCR仪的荧光检测功能检测上述反应产物中荧光基团的发光情况，判断待检测样品中核酸的情况，从而判断待测样品中是否有新布尼亚病毒SFTSV核酸。

在上述方法中，步骤S4具体为：若荧光值大于负对照(未添加待检核酸样本)，则待测样品中含有新布尼亚病毒SFTSV，若小于等于负对照，则待测样品中没有新布尼亚病毒SFTSV。

可以理解的是，对于不同的RNA病毒检测，只需更换本发明提供的非扩增核酸检测试剂盒和检测方法中的crRNA-2即可。

本发明的有益效果为：

(1)本发明根据LwaCas13a的反式切割活性特点，设计了一个可用作信号放大工具的URH以及与其配套的crRNA-1，利用LwaCas13a和URH构建了荧光信号循环放大机制，可显著增加核酸检测的灵敏度，使得整个检测过程不需要扩增，而且具有了能与RT-PCR比拟的灵敏度；

(2)本发明可以在一个管子，一个仪器，一个温度下完成核酸检测，使检测操作过程的简便性大幅度提升，同时也减少了样品污染的可能性；

(3)本发明检测时间短，只需5-10min；

(4)本发明适用范围广，实验结果表明，在对靶向的位点进行筛选，挑选出合适的crRNA的情况下，可以对不同的其他RNA病毒(如SARS-CoV-2、SFTSV等)进行检测。

附图说明

图1为本发明利用LwaCas13a的反式切割活性与URH反复循环扩大荧光信号进行核酸检测的原理示意图，图中以SARS-CoV-2病毒ORF基因为例。

图2为本发明设计原理的验证结果图。

图3为实施例3中检测不同浓度模拟靶的荧光强度散点图。

图4为本发明方法对100份SARS-CoV-2临床样本的检测结果图。

图5为本发明方法对16份SFTSV临床样本的检测结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例和附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。应当理解的是，以下实施例仅用于更加清楚地说明本申请的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本申请的保护范围。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。

本发明所述crRNA是CRISPR RNA的简写，crRNA与靶标序列通过碱基配对作用结合，并与LwaCas13a结合，成为具有RNA切割能力的复合体。本发明涉及两种crRNA，具体为crRNA-1和crRNA-2，其中crRNA-1为靶向URH的crRNA，crRNA-2为靶向待测靶标(如SARS-CoV-2的ORF1ab基因/N基因、SFTSV的M基因/S基因等)的crRNA。

本发明实施例中所用LwaCas13a是来源于韦德纤毛菌Leptotrichiawadei(Lwa)的VI型CRISPR-Cas系统效应蛋白，具有RNA介导的RNA内切酶活性。在靶标单链RNA存在PFS序列的情况下，可特异性地切割靶标RNA。此外，LwaCas13a还具有依赖于靶标单链RNA的反式切割活性。

本发明所述分子信标(molecular beacon)是一种5’端荧光发光基团标记、3’端荧光淬灭基团标记的寡核苷酸链。

目前病毒检测仍依赖聚合酶实现扩增以满足检测灵敏度的要求，而非扩增方式进行核酸检测在时间成本、专业仪器设备的限制等方面则具有优势，但灵敏度往往较低。

为了解决非扩增核酸检测的灵敏度低的技术问题，本发明提供了一种基于LwaCas13a的非扩增核酸检测组合物、试剂盒和方法，通过LwaCas13a和URH形成的荧光信号循环放大机制，增加了核酸检测的灵敏度，实现了无扩增快速核酸检测。

为了便于说明本发明原理，以SARS-CoV-2病毒ORF基因作检测靶标为例进行说明。

如图1所示，本发明利用LwaCas13a和URH共同放大荧光信号的原理具体为：本发明当检测体系中没有待检测靶标时，经过退火处理后的URH理论上能够全部形成二级结构，将能与crRNA-1识别互补的区域覆盖住，不产生荧光信号；当检测体系中含有待检测靶标时，靶标就会与体系中靶向待检测靶标的crRNA-2和LwaCas13a的二元复合物结合并激活反式切割活性，从而使URH中带U的部分被降解，露出与crRNA-1识别互补的结合区域，成为新的LwaCas13a/crRNA-1/URH三元复合物，激活的反式切割活性进行反复循环，从而起到放大信号的作用。最终，在反应一段时间内，加入待检测靶标样本的荧光值与不加待检测靶标的负对照样本将会有明显差距，由此便可在待检测核酸物质浓度极低的条件下，短时间内得到较为准确的核酸检测结果。

以下实施例所用荧光基团为FAM(6-Carboxy-fluorescein，6-羧基-荧光素)，所用荧光淬灭基团为BHQ-1；所用PCR仪的型号为Bio-Rad伯乐PCR仪T100，所用Q-PCR仪的型号为伯乐bio-rad CFX384 Touch荧光定量PCR仪。

以下实施例所用LwaCas13a，通过质粒pET28a-SUMO-LwaCas13a-6×His，经大肠杆菌感受态细胞BL21 DE3表达纯化所得，具体制备方式可参考现有技术，本发明不做赘述。

以下实施例涉及的URH、crRNA和arget RNA ORF等单链RNA，均由人工合成。RNA链溶解于经DEPC处理的水中，浓度用Nanodrop 8000Nanodrop 8000(Thermo FisherScientific，USA)测量。

以下实施例所涉及到的其他试剂和仪器，若无特殊说明，均可从商业途径获得；以下实施例所涉及的方法，若无特殊说明，均为常规方法。

实施例1

本例旨在通过实验以证实本发明的原理，主要体现在以下几个方面：①URH能在退火处理后形成相应的二级结构，②使用的LwaCas13a有活性且能与设计的crRNA与之相对应的靶标进行正确位置的切割，③在整个检测的体系内不加入待检测靶的情况下TRNA不被切开或是不能被完全切开。

本例的实验过程具体如下：

选取SARS-COV-19基因序列中Orf1ab基因中的一段长度为36nt的序列进行人工合成，并用作待检测RNA靶标(target RNA ORF)，其序列具体为：

AAAUAAUAGUUUAAAAAUUACAGAAGAGGUUGGCCA(SEQ ID NO.6)。

target RNAORF对应的cr RNA记作crRNA ORF，其序列具体为：

GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACCCAACCUCUUCUGUAAUU UUUAAA(SEQ IDNO.3)。

设计了茎长度分别为10，12，14nt的三种URH，将其依次命名为URH 10(SEQ IDNO.10)，URH 12(SEQ ID NO.11)，URH 14(SEQ ID NO.12)。并提供了与之对应的crRNA-1。

先将合成的终浓度为3μM的三种URH，在KOD buffer条件下，95℃孵育5min，再以0.1℃/s速度降至25℃进行退火处理。

反应总体系共10μL，0.5μL LwaCas13a(10μM)，0.25μL crRNA ORF(1μM)，1.75μLcrRNA-1(1μM)，1μL经过退火处理的URH(3μM)，1μL taget RNAORF(1μM)，0.25μL RNA酶抑制剂(Riblock)，在LwaCas13a反应缓冲液(10mM Tris-HCl pH8.6，1mM DTT，40mM KCl，1.5mMMgCl₂)中37℃反应30min。最后加入0.5μL 10Xloading，用聚丙烯酰胺浓度为10％的非变形PAGE，在120V恒压条件下1XTBE缓冲液中电泳40min后，用Syber gold在1XTBE缓冲液中染色10min后用紫外成像仪成像。

其中，核酸聚丙烯酰胺凝胶(10％)的制备方法是：将5mL 40％的丙烯酰胺、1ml 10×TBE(三硼酸盐-EDTA)缓冲液、2mL甲酰胺、9μL 10％ APS和1μL TEMED混合，然后加入无菌ddH₂O，使总体积达到10毫升。然后，在10μL样品中加入10μL 2×上样缓冲液(95％甲酰胺、0.25％SDS、0.25％溴酚蓝和0.25％二甲苯青酚FF)，在95℃孵育5分钟。用0.5×TBE缓冲液在150V下进行凝胶电泳90分钟，然后用SYBR Gold(Invitrogen,USA)进行电泳染色。

对上述实验过程，模拟检测体系中负对照(不加入target RNA ORF)和实验组(加入target RNAORF)两种基本情况。非变性PAGE胶结果如图2所示：在不加入靶(targetRNAORF)时(第2，5，8泳道)，形成正确二级结构的URH还保留有一部分，没有被LwaCas13a的反式切割活性切开，可观察到还是有部分被切开(条带颜色变浅)，可能是退火不够完全的缘故，导致其没有形成正确的茎环结构，露出了能被crRNA-1识别并结合的部位，从而可能导致其在作为检测方法使用时会产生一定的背景荧光值；不过，在体系中加入靶(targetRNAORF)后(第3，6，9泳道)，几乎所有的URH都被切开，只留下URH中不含U的部分序列及其与crRNA-1形成的二元复合物。可见，三种URH都能在不加入靶时不被完全切开，而且茎的长度越长越不容易被切开，在加入靶之后，所有URH除了URH 14之外都被完全切开，只剩下不含U的部分序列及其相对应crRNA-1的二元复合物。

从上述结果可知：URH能够在不加靶的条件下，保持没有被激活，即URH仍保留退火后形成的茎环结构状态；而在加入靶后，LwaCas13a的反式切割活性能成功破坏URH的二级结构，形成一条较短的RNA单链，激活了URH作为荧光信号放大器的功能。

由此可见，本发明方法的设计原理是可行的，我们能够通过URH的二级结构控制体系中有无的靶时LwaCas13a的反式切割活性被激活的程度。而且在本发明方法中，URH的茎的长度越长可能产生的背景值越小；但另一方面，正因其茎的长度较长，不易被切开且释放出用于循环放大的URH减少，当降低待检测靶浓度时，会无法完全激活URH的循环体系，从而导致检测方法的灵敏度下降。

实施例2

对URH序列进行优化后，本例提供了一种基于LwaCas13a的非扩增核酸检测组合物，由URH和crRNA-1组成。

其中，URH的序列为(SEQ ID NO.1)：

AGUCUCUCUCUCUUUUUGACGCCGCACCACACCAGAGCCCUUUGAGAGAGAGA，

crRNA-1的序列为(SEQ ID NO.2)：

GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACCUCUGGUGUGGUGCGGCGUC。

实施例3

本例以靶target RNAORF(同实施例1)为例，并使用实施例2中的组合物，对本发明方法进行初步的灵敏度分析，具体过程如下：

将合成的模拟靶target RNAORF用DEPC水分别稀释浓度至1μM、1nM、1pM、1fM、10aM备用。再将合成的终浓度为2μM的URH(同实施例2)在KOD buffer，95℃、5min，再以0.1℃/s速度降至25℃进行退火处理。

整个反应体系总体积为50μL，其中包括0.45μL LwaCas13a(28μM)、1.25μL crRNA-1(1μM)、6.25μL crRNAORF(1μM)、5μL10×LwaCas13a reaction buffer(10mM Tris-HCl pH8.6,1mM DTT,40mM KCl,1.5mM MgCl₂)、1.25μLRilblock、23.3μL DEPC水、5μL退火处理后的URH，5μL target RNAORF，2.5μL FQ分子信标(10μM)混合均匀放入Bio-rad Real-timefluorescence quantitative PCR instrument(USA)中反应，37℃反应10分钟，每一分钟测一次荧光值。背景校正的荧光值是通过减去从只含有分子信标和LwaCas13a reactionbuffer的反应中得到的荧光值而得到的。

检测结果如图3所示，表明本发明方法初步在对于模拟靶的检测过程中，灵敏度可达到1aM，只是模拟靶浓度过低(1aM)的情况下会存在检测不到的情况，不过此问题可通过条件优化和多重靶协同作用来改善。

实施例4

本例提供了一种用于SARS-COV-19检测的试剂盒，其中，试剂盒包括实施例2提供的URH和crRNA-1，还包括LwaCas13a、crRNA-2、分子信标。

其中，crRNA-2根据相应的靶点设计得到，本例选择ORF1ab基因片段(A Protocolfor Detection of COVID-19Using CRISPR Diagnostics)上的一个靶位点和核壳蛋白(N)基因片段(Amplification-Free Detection of SARS-CoV-2with CRISPR-Cas13a andMobile Phone Microscopy.Cell2021,184(2),323-333.e9)上的三个靶位点作为核酸检测的靶位点。crRNA中的5’直接重复(DR)序列参考了已发表的结果(SHERLOCK:Nucleic AcidDetection with CRISPR Nucleases.Nat.Protoc.2019,14(10),2986-3012)，间隔序列长度设置为20nt。从目标RNA 中选择间隔序列作为20nt的反向互补核酸序列，然后将间隔序列与5’直接重复序列连接生成完整的crRNA。所得crRNA-2具体包括以下：

crRNA ORF的序列为：

GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACCCAACCUCUUCUGUAAUUUUUAAA(SEQ IDNO.3)；

crRNA N4的序列为：

GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACUUUGCGGCCAAUGUUUGUAA(SEQ IDNO.4)；

crRNA N7的序列为：

GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACUUGGUGUAUUCAAGGCUCCC(SEQ IDNO.5)。

分子信标为：5’-6-FAM-UUUUU-BHQ1-3’。

实施例5

基于实施例4中的检测试剂盒，本例提供了一种用于SARS-COV-19检测的方法，具体如下：

(1)URH的退火处理。

将人工合成的终浓度为2μM的URH在KOD buffer，95℃、5min，再以0.1℃/s速度降至25℃进行退火处理。整个反应体系总体积为50ul，具体如表1所示。

表1URH退火体系的配置

试剂	体积	终浓度
			URH	1μL	2μM
Riblock	1.25μL	/
			10×KOD buffer	5μL	1×
H₂O	补齐至50μL	/

注，1×KOD buffer(10mMTris-HClpH8.8，100mMKCl，100mM(NH₄)₂SO₄、20mMMgSO₄、1％TritonX-100、1mg/ml BSA)

(2)配置检测所用的母液。

表2SARS-COV-19检测体系的配置

试剂	体积	终浓度
			LwaCas13a-crRNA ORF RNP	5μL	300nM
LwaCas13a-crRNA N4 RNP	5μL	300nM
			LwaCas13a-crRNAN7 RNP	5μL	300nM
10×LwaCas13a reaction buffer	5μL	1×
			crRNA-1	5μL	150mM
退火后的URH	5μL	200mM
			Riblock	1.25μL	/
待检测的核酸样本	5μL	/
			分子信标	5μL	500mM
H₂O	补齐至50μL	/

表2中的LwaCas13a-crRNARNP复合物是通过将3μM的LwaCas13a与3μM的crRNA-2在室温下孵育10分钟而单独预组装得到的。另外，在实际检测时，建议将表2中的三种LwaCas13a-crRNA RNP复合物同时加入使用，单独使用一种或两种容易发生灵敏度降低或靶浓度较低时检测不到的情况(如实施例3所示)。

(3)荧光信号的检测。

按表2将各组分混合均匀放入Bio-rad Real-time fluorescence quantitativePCR instrument(USA)中反应，37℃、10min，每一分钟测一次荧光值。背景校正的荧光值是通过减去负对照得到的荧光值而得到的。每组设置三个负对照(即不加入表2中的待检测的核酸样本的情况)，最终以三个负对照的平均值作为本组的背景校正的荧光值。

若荧光值大于负对照，则证明有目标RNA，若小于等于负对照，则证明无目标RNA。

实施例6

针对SARS-CoV-2病毒，本例对比了本发明方法与RT-PCR的检测结果。

图4为本发明方法的100份SARS-CoV-2临床样本(来源于湖北省疾控中心)的去背景荧光强度(检测过程见实施例5)与每个样本通过RT-PCR获得的Ct值(来源于湖北省疾控中心提供的样本信息)的散点对比图，其中临床阴性样本的Ct值设定为45。

图4结果显示：对于几乎所有的样本，本发明的检测方法都能产生一定的绝对荧光值，能够与每一组的空白对照组的背景荧光值区分开来，差值大多集中在500-1100之间，根据各个样本Ct值的不同而荧光值也有所不同；在100个样本中，有15个两个基因的Ct值均高于40的阴性样本，对于这15个阴性样本的检测，本发明的检测方法在减去背景荧光值后还是显示有一定的荧光值。将所有样本的信息用散点图表示在一张图里后发现，所有阴性样本的荧光值都低于一定的范围内，可见，我们可以通过设定一个阈值来判定本发明方法检测的一个样本呈阳性还是阴性。在图中位于临床阴性的样本区域指向的荧光数值都在200以内，因此可将此方法的阴性判定阈值设为200。在100样本中，对100个样本的阴阳性判定都是准确的，临床样本检测准确率高达100％。

实施例7

与实施例4不同的是，本例试剂盒用于SFTSV的核酸检测，且本例试剂盒中的crRNA-2分别根据NCBI公布的SFTSV基因序列中L基因(KY848825.1)、M基因(KY848826.1)、S基因(KY848827.1)设计得到(方法同实施例2)，所得crRNA-2具体包括以下：

crRNAL的序列为：

GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACCUCCUGUCAUUGCUUCCCUGAAC(SEQ IDNO.7)；

crRNAM的序列为：

GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACAAUUGCGAGUGGUUCCUGAGCCAUGACG(SEQID NO.8)；

crRNAS的序列为：

GAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGUUCAUCAUUGUCUUUGCCCUGACUCGA(SEQID NO.9)；

实施例8

基于实施例7中的检测试剂盒，本例提供了一种用于SFTSV病毒的检测方法，除检测体系如表3所示外，其余操作过程同实施例3一致。

表3SFTSV检测体系的配置

试剂	体积	终浓度
			LwaCas13a-crRNA L RNP	5μL	300nM
LwaCas13a-crRNA M RNP	5μL	300nM
			LwaCas13a-crRNANS RNP	5μL	300nM
10×LwaCas13a reaction buffer	5μL	1×
			crRNA-1	5μL	150mM
退火后的URH	5μL	200mM
			Riblock	1.25μL	/
待检测的核酸样本	5μL	/
			分子信标	5μL	500mM
H₂O	补齐至50μL	/

实施例9

针对SFTSV病毒，本例对比了本发明方法与RT-PCR的检测结果。

图5为本发明方法的16份SFTSV临床样本(来源于湖北省疾控中心)的去背景荧光强度(检测过程见实施例8)与每个样本通过RT-PCR获得的Ct值(来源于湖北省疾控中心提供的样本信息)的散点对比图，其中临床阴性样本的Ct值设定为45。

检测结果表明，样本号1、5、8、9、13和15为RT-PCR阴性样本，其余为阳性样本。由散点图也可看出六个阴性样本的去背景荧光强度值都250以下，因此可将此方法的阴性判定阈值设为250，且与阳性样本的荧光数值差别明显，足以判断样本的阴阳性，即检测结果与RT-PCR结果完全一致，检测准确率高达100％。

综上所述，本发明利用LwaCas13a和URH构建的荧光信号循环放大机制能够有效增加核酸检测的灵敏度，实现了无扩增快速核酸检测，而且检测结果可靠、操作简便，具有较好的应用潜力。

以上所述是本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种基于LwaCas13a的非扩增核酸检测组合物，其特征在于，包括URH以及靶向所述URH的crRNA-1；所述URH为具有茎环结构的单链RNA分子，其环的部分序列中带有U碱基位点，其茎的部分序列为与crRNA-1识别互补的结合区域。

2.根据权利要求1所述的非扩增核酸检测组合物，其特征在于，所述URH为：

如SEQ ID NO.1所示的RNA分子；

或为由如SEQ ID NO.1所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代、和/或缺失、和/或添加得到的与如SEQ ID NO.1所示的RNA分子具有相同功能的RNA分子。

3.根据权利要求2所述的非扩增核酸检测组合物，其特征在于，所述crRNA-1为：

如SEQ ID NO.2所示的单链RNA分子；

4.一种基于LwaCas13a的非扩增核酸检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1～3任一项所述的非扩增核酸检测组合物。

5.根据权利要求4所述的非扩增核酸检测试剂盒，其特征在于，还包含：

LwaCas13a；

靶向待测靶标的crRNA-2；

两端分别带有荧光发射基团和荧光淬灭基团的分子信标。

6.权利要求1～3任一项所述的非扩增核酸检测组合物或如权利要求4或5所述的非扩增核酸检测试剂盒在RNA病毒核酸检测中的应用。

7.一种用于SARS-CoV-2检测的非扩增核酸检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述的URH和crRNA-1、以及靶向待测靶标的crRNA-2，其中所述crRNA-2为crRNAORF、crRNA N4和crRNA N7中的任一个或多个组合；

所述crRNA ORF为如SEQ ID NO.3所示的单链RNA分子，或由如SEQ ID NO.3所示的单链RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代、和/或缺失、和/或添加后得到的与如SEQ ID NO.3所示的单链RNA分子具有相同功能的RNA分子；

所述crRNA N4为如SEQ ID NO.4所示的单链RNA分子，或由如SEQ ID NO.4所示的单链RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代、和/或缺失、和/或添加后得到的与如SEQ ID NO.4所示的单链RNA分子具有相同功能的RNA分子；

所述crRNA N7为如SEQ ID NO.5所示的单链RNA分子，或由如SEQ ID NO.5所示的单链RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代、和/或缺失、和/或添加后得到的与如SEQ ID NO.5所示的单链RNA分子具有相同功能的RNA分子。

8.一种用于SFTSV检测的非扩增核酸检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述的URH和crRNA-1、以及靶向待测靶标的crRNA-2；其中，所述crRNA-2为crRNA L、crRNA M和crRNA S中的任一个或多个组合；

所述crRNA L为如SEQ ID NO.7所示的单链RNA分子，或由如SEQ ID NO.7所示的单链RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代、和/或缺失、和/或添加后得到的与如SEQ ID NO.7所示的单链RNA分子具有相同功能的RNA分子；

所述crRNA M为如SEQ ID NO.8所示的单链RNA分子，或由如SEQ ID NO.8所示的单链RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代、和/或缺失、和/或添加后得到的与如SEQ ID NO.8所示的单链RNA分子具有相同功能的RNA分子；

所述crRNA S为如SEQ ID NO.9所示的单链RNA分子，或由如SEQ ID NO.9所示的单链RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代、和/或缺失、和/或添加后得到的与如SEQ ID NO.9所示的单链RNA分子具有相同功能的RNA分子。

9.一种基于LwaCas13a的非扩增核酸检测方法，其特征在于，不以疾病的诊断和治疗为目的，且检测方法包含以下步骤：

S1、对权利要求1所述的URH进行退火处理；

S2、将退火处理后的URH与权利要求1所述的crRNA-1、LwaCas13、靶向待测靶标的crRNA-2和分子信标配制成预混液，加入待检核酸样本，检测荧光信号。

10.根据权利要求9所述基于LwaCas13a的非扩增核酸检测方法，其特征在于，将步骤S2所述LwaCas13与crRNA-2预组装后用于配制预混液。