CN114262730A - 一种基于Cas13a和中介物介导的双级联循环激活无扩增快速检测RNA方法 - Google Patents

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CN114262730A CN202111009684.8A CN202111009684A CN114262730A CN 114262730 A CN114262730 A CN 114262730A CN 202111009684 A CN202111009684 A CN 202111009684A CN 114262730 A CN114262730 A CN 114262730A
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杨晓兰
曾宏威
胡小蕾
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Abstract

本发明建立一种基于Cas13a和中介物介导的双级联循环激活无扩增快速检测RNA方法,属于生物检测技术领域。设计优选Cas13a反式剪切中介物发夹结构及产物对应引导CrRNA。靶RNA识别并结合Cas13a/RNA1复合物,激活Cas13a高效反式剪切中介物发夹结构生成含脚趾的产物双链RNA2为次级靶;次级靶RNA2识别并激活Cas13a/RNA2复合物,循环剪切中介物发夹结构并累积激活Cas13a,累积活性Cas13a最终剪切报告RNA,由此实现双级联循环激活Cas13a无扩增快速检测RNA。该方法快速、简单、特异性及灵敏度良好,且所设计中介物及对应引导CrRNA组合,对不同疾病相关RNA及病毒RNA通用。所建立方法和试剂盒可用于生物样本中疾病相关微量RNA及微量病毒RNA的快速检测。

Description

一种基于Cas13a和中介物介导的双级联循环激活无扩增快速 检测RNA方法
技术领域
本发明属于RNA无扩增快速检测技术领域,涉及RNA靶识别并激活Cas13a后中介物介导的双级联循环激活Cas13a快速放大信号用于RNA定量检测的方法和试剂盒。
背景技术
与疾病相关的RNA包括mRNA、micRNA、rRNA、tRNA,都参与了基因表达、基因调控和代谢调控等,可作为疾病诊断的早期标志物[Cell Metabolism,2018,27,714-739]。RNA病毒是以RNA为遗传物质的病毒,如SARS病毒、MERS病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、一小部分噬菌体、新型冠状病毒、艾滋病病毒、丙型肝炎病毒、乙型脑炎病毒、全部流感病毒、鼻病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、登革热病毒、轮状病毒、烟草花叶病毒等[Reviews inMedical Virology,2021,31]。RNA稳定性差,易发生变异。疾病相关的RNA和RNA病毒的快速检测和早筛早诊具有重要意义。
现有临床检测RNA方法是RT-PCR,其需要反复变性退火等过程,操作繁琐、耗时长。一系列基于等温扩增RNA检测方法被开发,如RCA,EXPAR,NASBA;但基于扩增的信号放大策略体系复杂,耗时较长。新兴CRISPR-Cas基因剪切系统[Science,2007,315,1709-1712,Crispr Journal,2018,1,325-336,Nature Reviews Microbiology,2020,18,67-83],通过Cas酶引导RNA(CrRNA)定点识别靶序列并结合而被激活,可高效地非特异性剪切报告核酸单链,利用Cas13a/12a的特异性识别和非特异性剪切,有望实现核酸检测的高灵敏度,高特异性检测。2018年,张锋、Jennifer相继在Science发文[Science,2018,360,444-448,Science, 2021,371,791-791],将Crispr-Cas13a、Crispr-Cas12a联合等温扩增建立了RNA病毒检测方法即“SHERLOCK”、“DETECTR”。经逆转录及LAMP联合Crispr检测SARS-CoV-2[Nature Biomedical Engineering,2020,4,1150-1158]。但这些方法均需要联合逆转录和等温扩增过程,体系仍然较为复杂且耗时长;有研究者应用CRISPR-Cas建立微流控体系直接检测micro RNA,但灵敏度有限[Acs Sensors,2019,4, 1048-1054]。仍需开发快速、简便、灵敏、特异检测RNA新方法。
Cas13a可特异性识别RNA并被激活后高效剪切报告核酸单链,为RNA的检测提供较理想工具酶,但现有基于Cas13a的RNA检测仍需前端扩增靶RNA以提高灵敏度。为进一步降低时间消耗、降低设备门槛、简化操作步骤,本发明旨在建立RNA靶识别并激活Cas13a后中介物介导再循环激活Cas13a快速放大信号的定量检测技术,开发微量靶标RNA无扩增快速检测新方法。
发明内容
1.一种基于Cas13a和中介物介导的双级联循环激活无扩增快速检测RNA方法,其特征过程和原理如下:
当Cas13a与Cas酶引导RNA(CrRNA)形成复合物Cas13a/CrRNA后,靶RNA识别并结合CrRNA可变区,产生双螺旋RNA的刚性结构,使半拳状Cas13a酶构象改变为紧握拳状结构而被激活,具有特异性顺式剪切靶RNA和高效非特异反式剪切RNA活性;靶RNA激活Cas13a/CrRNA的结合摩尔比为1:1,基于靶定量激活非特异反式剪切的碱基偏好性,设计荧光报告探针,检测荧光改变而定量靶RNA;当靶RNA 浓度过低时,只能产生微量活化Cas13a,导致难以检出探针信号,或需要延长剪切时间,此时须结合信号放大技术;LbuCas13a酶反式剪切碱基偏好U>G>A=C,一定时间内只剪切U碱基;Cas13a/CrRNA复合物既能结合单链靶RNA而被激活,经实验发现Cas13a/CrRNA复合物也可以从双链RNA的脚趾端启动分支链迁移的链置换反应而被激活。
基于以上特性,本发明设计了中介物发夹结构,构建基于Cas13a和中介物介导的双级联循环激活无扩增快速检测RNA方法;所述方法原理如下:
靶RNA1识别并结合Cas13a与引导CrRNA1的复合物(Cas13a/CrRNA1),激活Cas13a并高效反式剪切中介物发夹结构(HP)生成带脚趾的双链RNA2为次级靶;次级靶RNA2识别并激活Cas13a与次级靶引导RNA2的复合物(Cas13a/CrRNA2),循环剪切中介物发夹结构再激活Cas13a,短时间内激活大量Cas13a 酶,最终实现报告RNA的高效剪切;由此构建基于Cas13a和中介物介导的双级联循环激活无扩增快速检测RNA方法。
2.如权利要求1所述方法,其中中介物发夹结构,包括但不限于如下单元结构序列和特征:
5’-GUUUUGUGUGUGUUUGCCGAUUCAAACACACACAAAAC-3’
5’-GUUUUGUGUGUGUUUGCCGAUUUUAACACACACAAAAC-3’
5’-GGCGUGUUUUGUGUGUGUUUGCCGAUUCAAACACACACAAAACACGCC-3’
5’-CGUGGCGUGUUUUGUGUGUGUUUGCCGAUUCAAACACACACAAAACACGCCACG-3’
Figure RE-GDA0003368619560000021
所述中介物发夹结构特征在于1)发夹结构为纯RNA链,2)环端靠3’端包含至少2个U碱基,优选 2-4个U碱基,环端另有4-8个非U碱基,3)发夹结构的茎端包含至少14-20个互补碱基对,优选14-个互补碱基对,4)环端和茎端可识别权利要求1所述次级靶引导RNA2的可变区,5)茎末端另设计含3-6 对互补配对为阻碍碱基,与权利要求1所述次级靶引导RNA2的可变区不能互补配对。
3.如权利要求1-2所述方法,其中中介物发夹结构包括但不限于单个发夹结构或多个发夹结构单元的耦合核酸结构。
4.如权利要求1-3所述方法,其中中介物被反式剪切生成的双链含脚趾次级靶,其特异性识别并结合的引导CrRNA2包括但不限于如下结构序列和特征:
5’-GACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACUCGGCAAACACACACAAAAC-3’
Figure RE-GDA0003368619560000022
所述CrRNA2包括不变区与可变区两部分,其中不变区结合Cas13a蛋白酶,所述可变区与权利要求2 所述中介物的3’端20-26个碱基互补配对。
5.如权利要求1-4所述方法,其中中介物介导的双级联循环激活反应特征过程在于:
1)靶RNA1识别并激活的Cas13a反式剪切活性,优先剪切如权利要求2和3所述中介物发夹结构的两个U碱基位点,生成含粘性末端的RNA2双链结构,作为次级靶;
2)次级靶结合Cas13a/CrRNA2复合物,发生分支链迁移的链置换反应,并激活Cas13a反式剪切,重复过程1)循环剪切中介物并累积激活大量Cas13a。
6.如权利要求1-4所述方法,其中中介物及其剪切后次级靶的引导CrRNA2的结构组合,通用于不同靶RNA;通用于不同靶DNA,仅预先按常规方法将靶DNA转录为RNA即可。
7.如权利要求1所述基于Cas13a和中介物介导的双级联循环激活无扩增RNA检测方法,其特征步骤如下:
1)将Cas13a与CrRNA1混和,混合比Cas13a:CrRNA为5:1~1:1,优选2:1,冰上或室温预孵育5~20 分钟形成复合物Cas13a/CrRNA1;
2)将Cas13a与CrRNA2混匀,混合比Cas13a:CrRNA为5:1~1:1,优选2:1,冰上或室温预孵育5~20 分钟形成复合物Cas13a/CrRNA2;
3)将待测样品、预孵育Cas13a/CrRNA1、预退火的中介物、预孵育Cas13a/CrRNA2、10×反应缓冲液、焦碳酸二乙酯处理水,共40微升,混匀,20~37摄氏度孵育10~60分钟,优选37摄氏度孵育15分钟;
4)将10微升报告探针加入如上3)所得反应混合物中,总体积为50微升,使中介物终浓度为50皮摩尔/升~50纳摩尔/升,优选100~200皮摩尔/升,Cas13a/CrRNA1、Cas13a/CrRNA2终浓度均为10皮摩尔/ 升~50纳摩尔/升,优选1~10纳摩尔/升,再优选10纳摩尔/升,报告探针终浓度为100~1000纳摩尔/升,优选20~200纳摩尔/升,混匀后20~30秒在PCR仪上跟踪荧光信号动力学,或荧光仪上检测荧光信号改变。
8.如权利要求1-7所述方法,其中介物预退火条件为65~95摄氏度1~10分钟,优选为95摄氏度5分钟,0.1摄氏度/秒缓慢冷却至25摄氏度。
9.如权利要求1-7所述方法,其反应缓冲液可选4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液,优选20毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液pH=7.5,含1摩尔/升氯化钠和10%甘油。
10.如权利要求1-7所述方法,其报告探针可选含连续4-6个U碱基的RNA链,优选5个U碱基的 RNA链,其一端带荧光发射基团,一端带荧光淬灭基团,二者组成荧光共振能量转移对,其中荧光发射基团包括但不限于6-羧基荧光素,荧光淬灭基团包括但不限于BHQ;报告探针还可5-15个碱基的RNA链,含连续2-6个U碱基,一端带净电荷为零或负离子的聚集诱导发光基团。
11.如权利要求1-7所述方法,其Cas13a包括LbuCas13a,LwaCas13a,LbaCas13a。
12.如权利要求1-7所述方法,其Cas13a为LbuCas13a,通过质粒pET28a-LbuCas13a-SUMO-6×His、经大肠杆菌感受态细胞DE3表达纯化所得。
13.如权利要求1-12所述方法,适用于疾病相关RNA包括但不限于miRNA、mRNA。
14.如权利要求1-12所述方法,适用于RNA病毒基因,包括但不限于SARS病毒、MERS病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、新型冠状病毒(COVID-19)、艾滋病病毒(为逆转录病毒)、全部流感病毒、丙型肝炎病毒、柯萨奇病毒、登革热病毒、乙型脑炎病毒、鼻病毒、脊髓灰质炎病毒轮状病毒、烟草花叶病毒。
15.如权利要求1-12所述方法,其待测样品选自生物来源试样、环境来源试样,所述试样按常规试剂盒方法裂解、进一步提取所得RNA或DNA样品,和/或直接用权利要求9所述反应缓冲液稀释4~10倍所得样品。
16.根据权利要求1-12所述的方法,其待测样本选自痰液、咽拭子、血液、灌洗液、排泄物、呕吐物,所述试样按常规试剂盒方法裂解、进一步提取所得RNA或DNA样品,和/或所述试样直接用权利要求9 所述反应缓冲液稀释4-10倍所得样品。
17.如权利要求1-12所述基于Cas13a和中介物介导的双级联循环激活无扩增RNA检测方法的试剂盒,其含有:Cas13a,优选反应缓冲液,焦碳酸二乙酯处理水,中介物及中介物剪切次级靶的CrRNA,报告探针。
18.如权利要求17所述基于Cas13a和中介物介导的双级联循环激活无扩增RNA检测试剂盒,其中 Cas13a包括LbuCas13a,LwaCas13a,LbaCas13a。
19.如权利要求17所述基于Cas13a和中介物介导的双级联循环激活无扩增RNA检测试剂盒,其中中介物为权利要求2和3所述结构和特征。
20.如权利要求17所述基于Cas13a和中介物介导的双级联循环激活无扩增RNA检测试剂盒,其中如权利要求1和5所述过程切割后生成次级靶的引导CrRNA2为权利要求4所述结构和特征。
21.如权利要求20所述次级靶的引导CrRNA2与权利要求11和12所述Cas13a的混合比 Cas13a:CrRNA为5:1~1:1,优选2:1,冰上或室温预孵育5~20分钟形成复合物Cas13a/CrRNA2,优选室温预孵育10分钟。
22.如权利要求17所述基于Cas13a和中介物介导的双级联循环激活无扩增RNA检测试剂盒,其中报告探针可选含连续4-6个U碱基的RNA链,优选5个U碱基的RNA链,其一端带荧光发射基团,一端带荧光淬灭基团,二者组成荧光共振能量转移对,其中荧光发射基团包括但不限于6-羧基荧光素,荧光淬灭基团包括但不限于BHQ;其中报告探针可选6-15个碱基的RNA链,含连续2-6个U碱基的RNA链,一端带净电荷为零或负离子的聚集诱导发光基团。
23.如权利要求17所述Cas13a和Cas13a/CrRNA复合物保存条件可选-80~-20摄氏度,保存缓冲液可选如权利要求9所述反应缓冲液(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液,优选500 毫摩尔/升咪唑、20毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液pH=7.5,含1摩尔/升氯化钠和10%甘油; CrRNA1及CrRNA2保存条件可选-80~-20摄氏度,其储存液包括但不限于焦碳酸二乙酯处理水。
24.如权利要求1-23所述基于Cas13a和中介物介导的双级联循环激活无扩增RNA检测方法和试剂盒,其应用特点在于快速、简单、特异、且灵敏度较高。
25.如权利要求1-23所述方法和试剂盒,其中中介物及其次级靶的引导CrRNA2的结构组合,对不同核酸靶通用。
26.根据权利要求1-23中所述的试剂盒,其还包含试剂盒的操作步骤说明书。
附图说明
附图1 Cas13a循环双级联信号放大原理图
附图2 CrRNA制备图
附图3 LbuCas13a蛋白表达纯化图
附图4双级联循环激活信号与无中介物直接检测法对比图
附图5不同浓度中介物双级联循环激活反应信号对比图
附图6双级联循环激活方法中介物浓度优化图
附图7双级联循环激活方法靶标浓度响应图
附图8双级联循环激活方法靶标浓度响应线性图
附图9方法重复性实验图
附图10方法特异性实验图
具体实施方式
本发明设计并合成Cas13a循环双级联相关反应物,并建立基于Cas13a循环双级联无扩增快速检测 RNA方法,用于快速高灵敏检测RNA。
实施例1:CrRNA1及CrRNA2体外转录
全程置于冰上,无菌操作台操作。针对CrRNA1及CrRNA2,共设计合成4条DNA母链,提前30分钟预热水浴锅,预冷低温离心机,取1OD对应正反DNA单链,于4摄氏度、12000转/分转速离心3分钟使干粉置于管底,分别加13微升焦碳酸二乙酯处理水,振荡混匀,瞬时离心,各取10微升加入另一个EP 管中,振荡混匀,瞬时离心。94摄氏度水浴5分钟,EP管在水浴锅中缓慢冷却至室温,置于-20摄氏度冰箱备用;提前取出T7RNA聚合酶,5×T7转录缓冲液,核酸酶抑制剂,三磷酸核苷混合物NTP,DNA 双链模板,置于冰上备用。
取2毫升无菌无酶EP管按下列体系依次加入各组分:
Figure RE-GDA0003368619560000051
加入前五种组分并混匀后,水浴至室温,再加入T7 RNA聚合酶吹打混匀,5×T7转录缓冲液(200 毫摩尔/升Tris-HCl,pH=7.9,含30毫摩尔/升MgCl2、50毫摩尔/升二硫苏糖醇、50毫摩尔/升NaCl和 10毫摩尔/升亚精胺),37℃反应12小时;加入60微升DNase I,40微升10×DNaseI反应缓冲液,37摄氏度孵育1小时。TIAGEN试剂盒纯化转录产物,NanoDrop2000测定CrRNA浓度如图(附图2):CrRNA(+) 表示加入DNA母链,CrRNA(-)表示未加入DNA母链。-80摄氏度保存。
实施例2:Cas13a蛋白表达
表达质粒pET-28a-LbuCas13a-sumo-6×His,取1微升于100微升大肠杆菌DE3感受态载体,冰上静置 30分钟,42摄氏度水浴90秒,冰上静置10分钟;加入900微升培养基,于37摄氏度、200转/分培养2 小时至产生絮状物,离心,取下层菌液涂布平板培养基,过夜培养,挑取单个菌株扩大培养,异丙基-β-D- 硫代半乳糖苷诱导表达蛋白,电泳评估后,选取高表达菌株扩大培养并保菌;取高表达菌株1毫升加入150 毫升肉汤培养基,37摄氏度、180转/分、摇床孵育7.5小时至600波长吸光度为600;收集菌体超声破菌, 13000转/分、4摄氏度离心30分钟,收集上层清液,镍柱纯化:4摄氏度下20毫摩尔/升咪唑洗杂、500 毫摩尔/升咪唑洗脱。洗脱液加入类泛素蛋白sumo酶,4摄氏度过夜,肝素柱纯化2次,1纳摩尔/升NaCl 洗脱,超滤浓缩至终浓度1毫克/毫升;所得LbuCas13a如图(附图3),成功表达纯化出LbuCas13a酶。
实施例3:双级联检测miRNA-21可行性验证
加入4微升1微摩尔/升Cas13a酶、2微升1微摩尔/升CrRNA1于无菌无酶EP管中,混匀,瞬时离心,冰上静置10分钟;另取EP管,加入同比例Cas13a酶、CrRNA2,操作条件同上;取4支EP管,编号a、b、c、d(反应缓冲液为100毫摩尔/升Tris-HCl pH=7.5、500毫摩尔/升KCl、15毫摩尔/升MgCl2);
a管双级联反应:0.5微升5纳摩尔/升miRNA-21、5微升10×反应缓冲液、1.5微升Cas13a/CrRNA1 预混液、1.5微升Cas13a/CrRNA2预混液、0.5微升15纳摩尔/升中介物HP;
b管单独中介物反应:0.5微升5纳摩尔/升中介物、5微升10×反应缓冲液、1.5微升Cas13a/CrRNA1 预混液、0.5微升15纳摩尔/升中介物HP;
c管直接检测miRNA-21:0.5微升5纳摩尔/升miRNA-21、5微升10×反应缓冲液、1.5微升 Cas13a/CrRNA1预混液、0.5微升15纳摩尔/升中间反应底物HP;
d管空白探针组:5微升10×反应缓冲液、1.5微升Cas13a/CrRNA1预混液、1.5微升Cas13a/CrRNA2 预混液,加入焦碳酸二乙酯处理水补齐40微升,混匀,瞬时离心;
上述混合物37摄氏度孵育10分钟,加入10微升2微摩尔/升报告RNA,至总体系50微升,混匀后跟踪60分钟荧光信号,结果如图(附图4):F-C,Cas13a直接检测靶RNA组,S-C,模拟剪切后中介物 HP双链RNA直接激活Cas13a检测组,D-C,Cas13a循环双级联组检测靶RNA组,Blank,无靶组。
由附图3可见,60分钟之内,循环双级联组初始反应速度和荧光强度均显著高于CrRNA直接检测组和中介物介导双级联组,且在10分钟之内,双级联循环组荧光强度已达到峰值,表明所提出双级联循环无扩增快速检测方法优于直接检测法。
实施例4:双级联中介物浓度优化
取a、b两支200微升EP管预孵育形成Cas13a/CrRNA1和Cas13a/CrRNA2:a中加入6微升1微摩尔/升Cas13a酶、3微升浓度1微摩尔/升CrRNA1;b中加入6微升1微摩尔/升Cas13a酶、3微升浓度1 微摩尔/升CrRNA2;混匀,瞬时离心,冰上静置10分钟;
取7支200微升EP管,编号1~7号,1~6号分别加入5微升10×反应缓冲液(100毫摩尔/升Tris-HCl pH=8.0、500毫摩尔/升KCl、15毫摩尔/升MgCl2)、1.5微升Cas13a/CrRNA1预混液、1.5微升Cas13a/CrRNA2 预混液;取0.5微升10纳摩尔/升中介物分别加入1、2号,0.5微升15纳摩尔/升中介物分别加入3、4号, 0.5微升20纳摩尔/升中介物分别加入5、6号,0.5微升5纳摩尔/升miRNA-21分别加入2、5、6号,7 号管加入5微升10×反应缓冲液,所有组焦碳酸二乙酯处理水补齐至总体积40微升,混匀,瞬时离心,37 摄氏度孵育10分钟;加入10微升2微摩尔/升报告RNA,至总体系50微升,混匀后跟踪30分钟荧光信号,结果如图(附图5);
可以看出当中介物终浓度在100皮摩尔/升~200皮摩尔/升范围内,初始反应速率信噪比先增加再降低,当中介物为150皮摩尔/升时为最适中介物反应浓度,如图(附图6);
实施例5:检测miRNA-21的浓度响应和重复性考察
1微升1微摩尔/升Cas13a酶、0.5微升1微摩尔/升CrRNA于无菌无酶EP管中,漩涡混匀器混匀,瞬时离心,冰上静置10分钟;另取EP管,加入Cas13a酶、CrRNA2,操作条件同上;取EP管,依次加入反应各组分,包括5微升10×反应缓冲液(100毫摩尔/升Tris-HCl pH=8.0、500毫摩尔/升KCl、15毫摩尔/升MgCl2)、1.5微升摩尔浓度Cas13a/CrRNA1预混液、1.5微升摩尔浓度Cas13a/CrRNA2预混液、0.5 微升15纳摩尔/升中介物HP、0.5微升1~5000皮摩尔/升、miRNA-21、36微升焦碳酸二乙酯处理水,总体积40微升,漩涡混匀器混匀,瞬时离心,37摄氏度孵育10分钟;加入10微升2微摩尔/升报告RNA,至总体系50微升,检测15分钟荧光信号,结果如图(附图7);荧光强度与miRNA-21浓度在50皮摩尔/升~10 飞摩尔/升范围呈线性相关(Y=0.2218X+0.4778,R2=0.9995),如图(附图8);最低定量限94.69fM,最低检测限能达到17.05fM。
取高(50皮摩尔/升)、中(1皮摩尔/升)、低(10飞摩尔/升)三种浓度重复测定3次,结果见(附图9),变异系数分别为5.7%、16.1%、5.5%,重复性良好。本方法在提前准备复合物情况下,整个流程在15~30分钟之内完成;
实施例6:方法特异性考察
取EP管加入5微升浓度1微摩尔/升Cas13a酶、0.5微升浓度1微摩尔/升CrRNA1于无菌无酶EP管中,漩涡混匀器混匀,瞬时离心,冰上静置10分钟;另取EP管,加入Cas13a酶、CrRNA2,操作条件同上;取5支EP管,编号a、b、c、d、e,依次加入5微升10×反应缓冲液(100毫摩尔/升Tris-HCl缓冲液, pH=8.0,含500毫摩尔/升KCl、15毫摩尔/升MgCl2)、1.5微升Cas13a/CrRNA1预混液、1.5微升 Cas13a/CrRNA2预混液、0.5微升15纳摩尔/升中介物HP,a、b、c、d管分别加入0.5微升5纳摩尔/升 miRNA-21、miRNA-17、miRNA-29a、miRNA-141,每管加入36微升焦碳酸二乙酯处理水,总体积40微升,漩涡混匀器混匀,瞬时离心,37摄氏度孵育10分钟;加入10微升2微摩尔/升报告RNA,至总体系 50微升,置于QIAGENRotor-gene Q实时荧光定量PCR仪器上,跟踪30分钟荧光信号改变,结果如(附图 10);可见只有靶RNA存在情况下才表现出极高反应初速度和荧光强度,非靶及无靶情况下,反应初速度相对极慢,荧光强度基本与背景一致;有靶条件下加入报告探针2~3分钟即可检出显著信号,总流程在15分钟之内完成。

Claims (26)

1.一种基于Cas13a和中介物介导的双级联循环激活无扩增快速检测RNA方法,其特征过程和原理如下:
当Cas13a与Cas酶引导RNA(CrRNA)形成复合物Cas13a/CrRNA后,靶RNA识别并结合CrRNA可变区,产生双螺旋RNA的刚性结构,使半拳状Cas13a酶构象改变为紧握拳状结构而被激活,具有特异性顺式剪切靶RNA和高效非特异反式剪切RNA活性;靶RNA激活Cas13a/CrRNA的结合摩尔比为1:1,基于靶定量激活非特异反式剪切的碱基偏好性,设计荧光报告探针,检测荧光改变而定量靶RNA;当靶RNA浓度过低时,只能产生微量活化Cas13a,导致难以检出探针信号,或需要延长剪切时间,此时须结合信号放大技术;LbuCas13a酶反式剪切碱基偏好U>G>A=C,一定时间内只剪切U碱基;Cas13a/CrRNA复合物既能结合单链靶RNA而被激活,经实验发现Cas13a/CrRNA复合物也可以从双链RNA的脚趾端启动分支链迁移的链置换反应而被激活。
基于以上特性,本发明设计了中介物发夹结构,构建基于Cas13a和中介物介导的双级联循环激活无扩增快速检测RNA方法;所述方法原理如下:
靶RNA1识别并结合Cas13a与引导CrRNA1的复合物(Cas13a/CrRNA1),激活Cas13a并高效反式剪切中介物发夹结构(HP)生成带脚趾的双链RNA2为次级靶;次级靶RNA2识别并激活Cas13a与次级靶引导RNA2的复合物(Cas13a/CrRNA2),循环剪切中介物发夹结构再激活Cas13a,短时间内激活大量Cas13a酶,最终实现报告RNA的高效剪切;由此构建基于Cas13a和中介物介导的双级联循环激活无扩增快速检测RNA方法。
2.权利要求1所述方法,其中中介物发夹结构,包括但不限于如下单元结构序列和特征:
5’-GUUUUGUGUGUGUUUGCCGAUUCAAACACACACAAAAC-3’
5’-GUUUUGUGUGUGUUUGCCGAUUUUAACACACACAAAAC-3’
5’-GGCGUGUUUUGUGUGUGUUUGCCGAUUCAAACACACACAAAACACGCC-3’
5’-CGUGGCGUGUUUUGUGUGUGUUUGCCGAUUCAAACACACACAAAACACGCCACG-3’
Figure DEST_PATH_IMAGE001
中介物发夹结构特征在于1)发夹结构为纯RNA链,2)环端靠3’端包含至少2个U碱基,优选2-4个U碱基,环端另有4-8个非U碱基,3)发夹结构的茎端包含至少14-20个互补碱基对,优选14-个互补碱基对,4)环端和茎端可识别权利要求1所述次级靶引导RNA2的可变区,5)茎末端另设计含3-6对互补配对为阻碍碱基,与权利要求1所述次级靶引导RNA2的可变区不能互补配对。
3.如权利要求1-2所述方法,其中中介物发夹结构包括但不限于单个发夹结构或多个发夹结构单元的耦合核酸结构。
4.如权利要求1-3所述方法,其中中介物被反式剪切生成的双链含脚趾次级靶,其特异性识别并结合的引导CrRNA2包括但不限于如下结构序列和特征:
5’-GACCACCCCAAAAAUGAAGGGGACUAAAACUCGGCAAACACACACAAAAC-3’
Figure DEST_PATH_IMAGE002
所述CrRNA2包括不变区与可变区两部分,其中不变区结合Cas13a蛋白酶,所述可变区与权利要求2所述中介物的3’端20-26个碱基互补配对。
5.如权利要求1-4所述方法,其中中介物介导的双级联循环激活反应特征过程在于:
1)靶RNA1识别并激活的Cas13a反式剪切活性,优先剪切如权利要求2和3所述中介物发夹结构的两个U碱基位点,生成含粘性末端的RNA2双链结构,作为次级靶;
2)次级靶结合Cas13a/CrRNA2复合物,发生分支链迁移的链置换反应,并激活Cas13a反式剪切,重复过程1)循环剪切中介物并累积激活大量Cas13a。
6.如权利要求1-4所述方法,其中中介物及其剪切后次级靶的引导CrRNA2的结构组合,通用于不同靶RNA,通用于不同靶DNA,仅预先按常规方法将靶DNA转录为RNA即可。
7.如权利要求1所述基于Cas13a和中介物介导的双级联循环激活无扩增RNA检测方法,其特征步骤如下:
1)将Cas13a与CrRNA1混和,混合比Cas13a:CrRNA为5:1~1:1,优选2:1,冰上或室温预孵育5~20分钟形成复合物Cas13a/CrRNA1;
2)将Cas13a与CrRNA2混匀,混合比Cas13a:CrRNA为5:1~1:1,优选2:1,冰上或室温预孵育5~20分钟形成复合物Cas13a/CrRNA2;
3)将待测样品、预孵育Cas13a/CrRNA1、预退火的中介物、预孵育Cas13a/CrRNA2、10×反应缓冲液、焦碳酸二乙酯处理水,共40微升,混匀,20~37摄氏度孵育10~60分钟,优选37摄氏度孵育15分钟;
4)将10微升报告探针加入如上3)所得反应混合物中,总体积为50微升,使中介物终浓度为50皮摩尔/升~50纳摩尔/升,优选100~200皮摩尔/升,Cas13a/CrRNA1、Cas13a/CrRNA2终浓度均为10皮摩尔/升~50纳摩尔/升,优选1~10纳摩尔/升,再优选10纳摩尔/升,报告探针终浓度为100~1000纳摩尔/升,优选20~200纳摩尔/升,混匀后20~30秒在PCR仪上跟踪荧光信号动力学,或荧光仪上检测荧光信号改变。
8.如权利要求1-7所述方法,其中介物预退火条件为65~95摄氏度1~10分钟,优选为95摄氏度5分钟,0.1摄氏度/秒缓慢冷却至25摄氏度。
9.如权利要求1-7所述方法,其反应缓冲液可选4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液,优选20毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液pH=7.5,含1摩尔/升氯化钠和10%甘油。
10.如权利要求1-7所述方法,其报告探针可选含连续4-6个U碱基的RNA链,优选5个U碱基的RNA链,其一端带荧光发射基团,一端带荧光淬灭基团,二者组成荧光共振能量转移对,其中荧光发射基团包括但不限于6-羧基荧光素,荧光淬灭基团包括但不限于BHQ;报告探针还可5-15个碱基的RNA链,含连续2-6个U碱基,一端带净电荷为零或负离子的聚集诱导发光基团。
11.如权利要求1-7所述方法,其Cas13a包括LbuCas13a,LwaCas13a,LbaCas13a。
12.如权利要求1-7所述方法,其Cas13a为LbuCas13a,通过质粒pET28a-LbuCas13a-SUMO-6×His、经大肠杆菌感受态细胞DE3表达纯化所得。
13.如权利要求1-12所述方法,适用于疾病相关RNA包括但不限于miRNA、mRNA。
14.如权利要求1-12所述方法,适用于RNA病毒基因,包括但不限于SARS病毒、MERS病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、新型冠状病毒、艾滋病病毒、全部流感病毒、丙型肝炎病毒、柯萨奇病毒、登革热病毒、乙型脑炎病毒、鼻病毒、脊髓灰质炎病毒轮状病毒、烟草花叶病毒。
15.如权利要求1-12所述方法,其待测样品选自生物来源试样、环境来源试样,所述试样按常规试剂盒方法裂解、进一步提取所得RNA或DNA样品,和/或直接用权利要求9所述反应缓冲液稀释4~10倍所得样品。
16.根据权利要求1-12所述的方法,其待测样本选自痰液、咽拭子、血液、灌洗液、排泄物、呕吐物,所述试样按常规试剂盒方法裂解、进一步提取所得RNA或DNA样品,和/或所述试样直接用权利要求9所述反应缓冲液稀释4-10倍所得样品。
17.如权利要求1-12所述基于Cas13a和中介物介导的双级联循环激活无扩增RNA检测方法的试剂盒,其含有:Cas13a,优选反应缓冲液,焦碳酸二乙酯处理水,中介物及中介物剪切次级靶的CrRNA,报告探针。
18.如权利要求17所述基于Cas13a和中介物介导的双级联循环激活无扩增RNA检测试剂盒,其中Cas13a包括LbuCas13a,LwaCas13a,LbaCas13a。
19.如权利要求17所述基于Cas13a和中介物介导的双级联循环激活无扩增RNA检测试剂盒,其中中介物为权利要求2和3所述结构和特征。
20.如权利要求17所述基于Cas13a和中介物介导的双级联循环激活无扩增RNA检测试剂盒,其中如权利要求1和5所述过程切割后生成次级靶的引导CrRNA2为权利要求4所述结构和特征。
21.如权利要求20所述次级靶的引导CrRNA2与权利要求11和12所述Cas13a的混合比Cas13a:CrRNA为5:1~1:1,优选2:1,冰上或室温预孵育5~20分钟形成复合物Cas13a/CrRNA2,优选室温预孵育10分钟。
22.如权利要求17所述基于Cas13a和中介物介导的双级联循环激活无扩增RNA检测试剂盒,其中报告探针可选含连续4-6个U碱基的RNA链,优选5个U碱基的RNA链,其一端带荧光发射基团,一端带荧光淬灭基团,二者组成荧光共振能量转移对,其中荧光发射基团包括但不限于6-羧基荧光素,荧光淬灭基团包括但不限于BHQ;其中报告探针可选6-15个碱基的RNA链,含连续2-6个U碱基的RNA链,一端带净电荷为零或负离子的聚集诱导发光基团。
23.如权利要求17所述Cas13a和Cas13a/CrRNA复合物保存条件可选-80~-20摄氏度,保存缓冲液可选如权利要求9所述反应缓冲液(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液,优选500毫摩尔/升咪唑、20毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液pH=7.5,含1摩尔/升氯化钠和10%甘油;CrRNA1及CrRNA2保存条件可选-80~-20摄氏度,其储存液包括但不限于焦碳酸二乙酯处理水。
24.如权利要求1-23所述基于Cas13a和中介物介导的双级联循环激活无扩增RNA检测方法和试剂盒,其应用特点在于快速、简单、特异、且灵敏度较高。
25.如权利要求1-23所述方法和试剂盒,其中中介物及其次级靶的引导CrRNA2的结构组合,对不同核酸靶通用。
26.根据权利要求1-23中所述的试剂盒,其还包含试剂盒的操作步骤说明书。
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