CN117363708A - 一种基于Cas免扩增核酸检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及核酸检测领域，特别涉及一种基于Cas免扩增核酸检测方法及其应用。所述scDNA是通过采用不完全互补配对的iDNA与靶ssDNA退火杂交形成的具有ssDNA凸起的双链结构，所述scDNA上的ssDNA凸起能被活化的Cas蛋白非特异切割。本发明巧妙地设计iDNA与靶ssDNA杂交形成具有ssDNA凸起的双链体scDNA，利用scDNA和Cas组成的正反馈核酸回路开发基于Cas的免扩增核酸检测新技术。与大多数CRISPR‑Dx技术相比，本发明具有以下优势：检测快速，仅需15 min即可；检测灵敏度高，比无正反馈的CRISPR/Cas检测高8个数量级。
Description
技术领域
本发明涉及核酸检测领域，特别涉及一种基于Cas免扩增核酸检测方法及其应用。
背景技术
成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced shortpalindrome repeats，CRISPR)及其相关蛋白(CRISPR associated proteins，Cas)基因组成的CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌的获得性免疫系统，通过特异性识别并剪切噬菌体或质粒等的特定序列进而抵御外源遗传物质的入侵。CRISPR/Cas系统在机理基本明确后就被开发用于基因编辑，并以其特异性高、可编程性强、简单高效等特点迅速从众多具有竞争力的基因编辑技术中脱颖而出，为体内基因编辑带来了革命性突破。2016年Pardee等运用CRISPR/Cas9系统开发了一种区分寨卡病毒亚型的分子传感器，自此CRISPR/Cas系统逐渐进入核酸检测领域，为体外诊断开拓了新的方向。随后相继发现结构单一、分子量小的Cas13a、Cas12a和Cas14a1等蛋白，这些蛋白既具有各自的特性，又在与向导RNA(guideRNA，gRNA)形成的复合物特异性识别结合目标核酸后，均具有非特异性切割的反式切割活性，从而被广泛应用于核酸检测。
CRISPR/Cas系统中CRISPR RNA(crRNA)引导的Cas蛋白与靶核酸结合的亲和力有限，直接进行核酸检测的检出限约为pM水平，这灵敏度很难满足临床诊断的要求。因此，为了获得更高的检测灵敏度，大部分基于Cas的核酸检测技术需要对目标核酸进行预扩增(常见的有聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)和等温扩增)。基于PCR预扩增的Cas核酸检测方法具有高灵敏度，但热循环过程需要大型且昂贵的PCR仪，检测周期也相对较长，这使其在基层的推广和现场实时检测受到了极大的限制。虽然靶核酸的预扩增可以用重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)、环介导等温扩增、滚环扩增等多种等温扩增方法来取代PCR，减少对专业仪器设备的依赖，但是核酸扩增过程可能会产生非特异性扩增子、延长检测周期并增加操作的复杂性和样本交叉污染的风险，不可避免地对分析和应用造成了极大的限制。同时，靶核酸预扩增步骤和CRISPR/Cas检测步骤的兼容性问题是基于CRISPR/Cas系统的核酸检测技术商业化应用的一个关键障碍，这些均使得基于CRISPR/Cas系统的核酸检测技术在简便性、成本和可用性等方面存在固有的局限性。
为了克服CRISPR/Cas核酸检测技术需要靶核酸预扩增的局限性，降低操作难度和可能的交叉污染风险，科学家们探索了多种基于CRISPR/Cas系统的免扩增核酸检测策略。目前，针对CRISPR/Cas系统的反应动力学过程建立的免扩增CRISPR/Cas检测策略主要分为4大类。一是对CRISPR/Cas系统的crRNA进行优化。最优的crRNA长度以及碱基组成往往能使Cas蛋白发挥最佳的酶切能力，而且多种crRNA组合在一起可以显著提高CRISPR/Cas核酸检测技术的检测灵敏度。Fozouni和Zeng等利用多种crRNA协同组合提高单一靶核酸的激活效率，构建免扩增检测平台。二是构建数字CRISPR/Cas超灵敏检测平台。通过将CRISPR/Cas反应体系限制在皮升或飞升大小的反应体积中来提高靶核酸的反应浓度，以达到仪器可检出水平，实现免扩增核酸检测。三是CRISPR/Cas系统偶联其他灵敏信号传感器，比如电化学标签-金属电极传感器、纳米孔、表面增强拉曼散射生物传感器、石墨烯场效应管等。通过设计相关探针，将核酸识别的信号转化为电信号或拉曼散射信号，提高检测灵敏度。四是级联信号放大检测策略。主要包括串联蛋白酶反应系统与核酸回路系统。CRISPR/Cas核酸检测技术的检测灵敏度受限于单一Cas蛋白的催化效率，因此将不同类型的多个Cas蛋白串联或Cas蛋白与其他酶串联，可以实现信号的级联放大。核酸回路系统通常是设计具有一定结构的探针作为中间体。当Cas效应蛋白被目标核酸激活后，非特异性切割中间体，导致中间产物转化，继续激活Cas效应蛋白，从而激发后续的核酸循环回路，形成信号指数级放大，如催化发夹组装、CRISPR/Cas自催化放大网络(CONAN)等。四大类免扩增CRISPR/Cas检测策略中，多种crRNA协同组合成本高并且可能会发生更多的脱靶事件，导致假阳性结果，靶标微量化检测步骤复杂，电化学传感器的重现性一直都是业界的难题，相比较而言针对CRISPR/Cas体系的级联信号放大检测策略是最有价值的研究方向。但是级联信号放大检测策略中的串联蛋白酶反应系统需要多个酶，成本高；催化发夹组装需要联合电化学生物传感器，操作复杂；CONAN检测需要两条gRNA，而gRNA的合成比DNA的合成更复杂，昂贵，并且检测时间长达4小时，检测周期较长。因此需要进一步开发出反应条件温和，灵敏度高，检测时间短，操作简便，适宜于现场部署和即时检测的基于Cas免扩增基因检测新技术。
发明内容
本发明旨在提供一种基于Cas免扩增核酸检测方法，该方法具有灵敏度高，检测时间短，操作简便的优点，具有即时检测的潜力。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种scDNA，是通过采用不完全互补配对的iDNA与靶ssDNA退火杂交形成的具有ssDNA凸起的双链结构，所述scDNA上的ssDNA凸起能被活化的Cas蛋白非特异切割。
如图1所示，scDNA上形成一个能够被活化的Cas蛋白非特异切割的单链DNA凸起。
当一条DNA单链上有连续多个碱基与其互补链不互补配对时，这两条DNA单链退火杂交，不互补配对的碱基就会形成单链DNA凸起结构。单链DNA凸起结构产生于不完全互补配对的两条DNA单链的杂交。
在其中一个优选的实施例中，scDNA上的ssDNA凸起两端的T碱基分别被荧光基团和淬灭基团修饰。
在其中一个优选的实施例中，荧光基团包括6-羧基荧光素(6-carboxy-fluorescein，FAM)、四氯-6-羧基荧光素(tetrachloro fluorescein，TET)、2,7-二甲基-4,5-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、六氯-6-甲基荧光素(HEX)、6-羧基四甲基若丹明(carboxytetramethyl rhodamine，TAMRA)和5H-吲哚菁(CY5)中的一种；所述淬灭基团包括与荧光基团相对应的无荧光淬灭基团1(black-hole-quencher 1，BHQ1)、无荧光淬灭基团2(black-hole-quencher 2，BHQ2)和无荧光淬灭基团3(black-hole-quencher 1，BHQ3)中的一种。
在其中一个优选的实施例中，scDNA的ssDNA凸起两端的T碱基分别被FAM荧光基团和BHQ1淬灭基团修饰。
在其中一个优选的实施例中，被活化的Cas包括Cas12a、、Cas12b、Cas13a或Cas14a1。
可选地，所述Cas12a可以但不限于为AsCas12a、FnCas12a、MbCas12a和LbCas12a中的一种或多种。
本申请通过采用不完全互补配对的iDNA与靶ssDNA退火杂交形成具有ssDNA凸起的双链结构scDNA，并且在scDNA的ssDNA凸起两端的T碱基上分别加上FAM荧光基团与BHQ1淬灭基团进行修饰，此时FAM的荧光被BHQ1通过邻近诱导的高效荧光共振能量转移有效淬灭。当痕量的靶核酸激活Cas后，活化的Cas去非特异切割scDNA的ssDNA凸起。切割后由于热力学不稳定性，断裂的iDNA从靶ssDNA上掉下来，iDNA上的FAM荧光基团与BHQ1淬灭基团远离，从而产生荧光信号。同时，使得原本被iDNA封闭的靶ssDNA释放出来，释放出的靶ssDNA进一步激活Cas的附属切割活性，活化的Cas再去切割scDNA的ssDNA凸起，如此往复，不断循环，指数级放大荧光信号，实现靶核酸的免扩增检测。
在其中一个优选的实施例中，所述靶ssDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.12中任意一条所示。
在其中一个优选的实施例中，iDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.14-SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22-SEQ ID NO.32中任意一条所示。
构建CRISPR/Cas自催化驱动的正反馈核酸回路有3个关键点，第一是与靶ssDNA不完全互补配对的iDNA可以将靶ssDNA进行有效封闭，降低背景信号；第二是scDNA的ssDNA凸起能被Cas非特异切割，并且切割后断裂的iDNA能从靶ssDNA上脱离下来，释放出被封闭的靶ssDNA；第三是释放的靶ssDNA能够激活Cas的附属切割活性。
为了满足这三个条件，在其中一个优选的实施例中，ssDNA凸起的长度为7nt-21nt；ssDNA凸起的位置在靶ssDNA的3’端第11碱基与第12个碱基之间；靶ssDNA与iDNA的退火杂交比例小于等于1:1.5。
在其中一个优选的实施例中，ssDNA凸起为7nt-21nt的T碱基。
在其中一个优选的实施例中，靶ssDNA的序列长度为12nt-20nt。
在其中一个优选的实施例中，靶ssDNA的序列长度不少于14nt。
在其中一个优选的实施例中，通过crRNA引导Cas蛋白识别目标靶ssDNA，靶ssDNA与crRNA互补序列的长度不少于14nt才能有效激活Cas的核酸酶活性。
在其中一个优选的实施例中，靶ssDNA与crRNA互补序列的长度为6nt-20nt。
另一方面，本申请提供了基于Cas免扩增核酸检测方法，包括：
提供待测样品，所述待测样品中可能含有靶核酸；
配制反应体系，所述反应体系包括Cas蛋白、scDNA、crRNA；所述scDNA是通过采用不完全互补配对的iDNA与靶ssDNA退火杂交形成的具有ssDNA凸起的双链结构，所述scDNA上的ssDNA凸起能被活化的Cas非特异切割；
将所述待测样品加至所述反应体系中，经恒温定时反应，crRNA引导Cas蛋白识别靶核酸，被靶核酸激活，活化的Cas蛋白非特异切割scDNA上的ssDNA凸起，切割后，断裂的iDNA与靶ssDNA分离，iDNA上的荧光基团与淬灭基团远离，从而产生荧光信号；同时，原本被iDNA封闭的靶ssDNA释放，释放出的靶ssDNA进一步激活Cas的附属切割活性，活化的Cas继续切割scDNA上的ssDNA凸起，循环往复，放大荧光信号，检测荧光信号，确定待测样品中是否含有靶核酸。
在其中一个优选的实施例中，所述靶核酸为双链DNA、单链DNA或RNA。可选地，所述靶核酸为血液、组织、细胞生物样本和/或微生物的基因组。可选地，所述待测样品可以但不限于为细胞、细菌、组织和血液。所述待测样品可经过核酸提取处理，例如，使用核酸提取试剂盒，根据核酸提取试剂盒说明书提供的核酸提取技术提取获得的总核酸样品。其中，所述待测样品可以但不限于来源于包括人类在内的哺乳动物或植物。
在其中一个优选的实施例中，所述反应体系还包括缓冲液。
所述反应体系中的所述缓冲液有利于保持Cas蛋白的高活性，以及提升反应过程中Cas蛋白被激活后的反式切割活性。可选地，所述缓冲液可以但不限于使用DEPC水进行配制。所述DEPC水是指用DEPC(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的MiliQ纯水，无色液体；不含杂质RNA、DNA和蛋白质。可选地，所述缓冲液的pH为7.0-7.8。一实施方式中，所述缓冲液的pH为7.2-7.8。另一实施方式中，所述缓冲液的pH为7.4-7.6。例如，所述缓冲液的pH具体为7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7或7.8。可选地，所述缓冲液的成分包括Tris-HCl、氯化钾(KCl)、氯化镁(MgCl2)、甘油(glycerol)、肝素(heparin)和二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)中的一种或多种。
在其中一个优选的实施例中，所述核酸检测方法的检测下限为50aM。
在其中一个优选的实施例中，所述核酸检测方法可以用于各种癌症的核酸序列检测。可选地，所述核酸检测方法可以用于肝癌、膀胱癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、鼻咽癌或淋巴癌的核酸序列检测。
第三方面，本申请还提供了一种试剂盒，用于核酸检测，包括本申请所述的scDNA。
在其中一个优选的实施例中，所述试剂盒还包括Cas蛋白、crRNA和缓冲液。
具体地，所述试剂盒包括一盒体，设置在所述盒体内的多种试剂和使用说明书。所述多种试剂包括荧光检测探针、Cas蛋白、crRNA和缓冲液。所述多种试剂可以但不限于分别独立封装，例如，所述多种试剂可以分别通过冷冻干燥的方式封装在试剂瓶中。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本研究巧妙地设计iDNA与靶ssDNA杂交形成具有ssDNA凸起的双链体scDNA，利用scDNA和Cas组成的正反馈核酸回路开发基于Cas的免扩增核酸检测新技术。具体流程是靶ssDNA与iDNA按一定比例进行退火杂交，形成具有ssDNA凸起结构的双链体scDNA。一旦靶核酸激活Cas，活化的Cas就会非特异性切割杂交双链体scDNA中的ssDNA凸起结构，导致scDNA的Tm值下降，靶ssDNA和断裂的iDNA片段从scDNA中释放出来，从而产生荧光信号。同时释放出的靶ssDNA进一步激活Cas的附属切割活性，活化的Cas再去切割scDNA的ssDNA凸起结构，如此往复，不断循环，从而实现荧光信号的指数放大，并且实现靶核酸的免扩增检测。与大多数CRISPR-Dx技术相比，基于Cas的免扩增核酸检测新技术具有以下优势：(1)在37℃下一锅法检测，避免了涉及多个酶和程序的额外靶标扩增步骤，实现了一种真正的恒温一步法检测；(2)检测快速，仅需15min即可完成检测；(3)检测灵敏度极高，达到了50aM，比无正反馈的CRISPR/Cas检测技术高8个数量级，足以满足临床诊断的灵敏度要求；(4)本研究开发的基于Cas的免扩增核酸检测新技术具有免扩增，反应条件温和，灵敏度高，检测时间短，操作简便等特点，显示出与便携式设备的良好兼容性以及现场部署和即时检测潜力；(5)此外，该技术原理可进一步扩展到其他具有附带切割活性的Cas效应蛋白，比如Cas13a和Cas14a1，继而开发出新的免扩增核酸检测技术。这些特性成功解决了目前基于Cas的核酸检测技术所面临的一步快速精准检测的挑战。
附图说明
图1基于Cas12a的免扩增核酸检测新技术原理示意图；
图2是比较不同长度的靶ssDNA对Cas12a核酸酶的激活作用；A：crRNA-1与不同长度的靶ssDNA的详细序列；B：不同长度的靶ssDNA和空白对照的荧光值；图中的BC为空白对照(Nuclease-Free Water)；C不同长度的靶ssDNA和空白对照的荧光值曲线；图中的BC为空白对照(Nuclease-Free Water)；
图3是比较与crRNA-1具有不同互补配对碱基数的靶ssDNA对Cas12a核酸酶的激活作用；A：crRNA-1以及与其具有不同互补配对碱基数的靶ssDNA的详细序列；B：与crRNA-1具有不同互补配对碱基数的靶ssDNA和空白对照的荧光值；图中的BC为空白对照(Nuclease-Free Water)；C：与crRNA-1具有不同互补配对碱基数的靶ssDNA和空白对照的荧光值曲线；图中的BC为空白对照(Nuclease-Free Water)；
图4是ssDNA-14与ssDNA-14互补链不同比例的退火杂交对靶ssDNA-14的封闭作用；A：ssDNA-14和ssDNA-14互补链的详细序列以及DINAMelt分析ssDNA-14/ssDNA-14互补链双链体的热稳定性；B：ssDNA-14与ssDNA-14互补链按不同比例进行退火杂交的产物和空白对照的荧光值；图中的BC为空白对照(Nuclease-Free Water)；C：ssDNA-14与ssDNA-14互补链按不同比例进行退火杂交的产物和空白对照的荧光值曲线；图中的BC为空白对照(Nuclease-Free Water)；
图5是不同长度iDNA片段与ssDNA-14杂交的产物靶ssDNA-14/iDNA片段双链体对Cas12a核酸酶的激活作用；A：ssDNA-14、iDNA-11、iDNA-12、iDNA-13、iDNA-14、iDNA-15、iDNA-16和iDNA-17的详细序列以及DINAMelt分析靶ssDNA-14/iDNA片段双链体的热稳定性；B：ssDNA-14、不同ssDNA-14/iDNA片段双链体和空白对照(Nuclease-Free Water)的荧光值曲线；图中的BC为空白对照(Nuclease-Free Water)；
图6是活化Cas12a对scDNA中不同长度和不同碱基组成的凸起ssDNA以及相应线性iDNA探针进行反式裂解分析；A：nrDNA、iDNA-1、iDNA-2、iDNA-3、iDNA-4、scDNA-1、scDNA-2、scDNA-3与scDNA-4的详细序列以及DINAMelt分析scDNA-1、scDNA-2、scDNA-3与scDNA-4的热稳定性；B：用CRISPR/Cas12a荧光检测体系对靶ssDNA-14进行检测，分别以scDNA-1、scDNA-2、scDNA-3和scDNA-4作为活化Cas12a的反式切割底物，比较活化Cas12a对不同凸起ssDNA的反式裂解活性；C：用CRISPR/Cas12a荧光检测体系对靶ssDNA-14进行检测，分别以iDNA-1、iDNA-2、iDNA-3和iDNA-4作为活化Cas12a的反式切割底物，比较活化Cas12a对不同线性iDNA探针的反式裂解活性；
图7是与ssDNA-14具有不同长度不互补配对序列的iDNA对靶ssDNA-14的封闭作用；A：ssDNA-14、iDNA7、iDNA8、iDNA9、iDNA10、iDNA11和iDNA12的详细序列以及DINAMelt分析不同ssDNA-14/iDNA双链体的热稳定性；B：不同ssDNA-14/iDNA双链体和ssDNA-14的荧光值，数据以mean±SD表示，ANOVADunnett’s检验，n＝3；****，p<0.0001；C：不同ssDNA-14/iDNA双链体和ssDNA-14的荧光值曲线；
图8是基于Cas12a的免扩增核酸检测新技术与CRISPR/Cas12a荧光检测的灵敏度；A：ssDNA-14/iDNA12转化为scDNA-5且被活化Cas12a切割后释放出靶ssDNA-14的示意图；B：构建的含有靶dsDNA质粒的测序结果。红色框标注的序列为crRNA-1的识别序列；C：基于Cas12a的免扩增核酸检测新技术检测不同浓度含有靶dsDNA的质粒，比较不同浓度质粒与空白对照(Nuclease-Free Water)之间的荧光值差异；图中的BC为空白对照(Nuclease-Free Water)，数据以mean±SD表示，ANOVA Dunnett’s检验，n＝3，****，p<0.0001；***，p<0.001；**，p<0.01；*，p<0.05；ns，p>0.05；D：CRISPR/Cas12a荧光检测体系检测不同浓度含有靶dsDNA的质粒，比较不同浓度质粒与空白对照组(Nuclease-Free Water)之间的荧光值差异；图中的BC为空白对照(Nuclease-Free Water)。数据以mean±SD表示，ANOVADunnett’s检验，n＝3，****，p<0.0001；ns，p>0.05。
具体实施方式
以下将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
本发明中需用到的ssDNA、iDNA、crRNA及探针如下：
表1ssDNA、iDNA、crRNA及探针序列
附注：FAM，6-carboxy-fluorescein，6-羧基荧光素；BHQ1，black-hole-quencher1，无荧光淬灭基团1。
实施例1
探索靶ssDNA长度对Cas12a核酸酶活性的影响
(1)合成识别序列为20个核苷酸的crRNA-1以及靶ssDNA长度分别为12nt、14nt、16nt、18nt、20nt的ssDNA-12nt、ssDNA-14nt、ssDNA-16nt、ssDNA-18nt、ssDNA-20nt(图2-A和表1)；
(2)用CRISPR/Cas12a荧光检测体系对不同长度的靶ssDNA和空白对照(Nuclease-Free Water)进行检测，每个样本设3个复孔，根据需要检测的样本数量来配制Cas12a荧光检测混合反应体系并混匀，具体反应体系(每个反应)如下：
混匀，短暂离心后置于荧光定量PCR仪中，设置37℃持续孵育，每隔1min读取1次荧光值，计算△荧光值(△荧光值＝终点荧光值-初始荧光值)；
(3)结果如图2-B和图2-C所示，当靶ssDNA的长度大于或等于12nt时，均能激活Cas12a的非特异性切割活性，但是12nt长的靶ssDNA产生的荧光信号要明显弱于14nt及以上长度的靶ssDNA。表明靶ssDNA的长度会影响Cas12a的核酸酶活性，太短的靶ssDNA不能有效激活Cas12a的核酸酶活性，只有当靶ssDNA的长度不少于14nt时才能有效激活Cas12a的核酸酶活性，产生明显的荧光信号。
实施例2
探索靶ssDNA与crRNA互补配对碱基数对Cas12a核酸酶活性的影响
由于scDNA中的iDNA与靶ssDNA不完全互补配对，此时若靶ssDNA与crRNA的识别序列完全互补配对，则crRNA会凭借其与靶ssDNA更高的亲和力置换掉已结合的iDNA，继而与靶ssDNA结合激活Cas12a，产生假阳性信号。故为了避免此情况的发生，我们对靶ssDNA与crRNA识别序列互补配对碱基数对Cas12a核酸酶活性的影响进行了探索。
(1)基于实施例1中的探索结果，为了能有效激活Cas12a的核酸酶活性，我们合成了20nt长且分别与crRNA-1识别序列具有6nt、8nt、10nt、12nt、14nt、16nt、18nt以及20nt互补的靶ssDNA-6、ssDNA-8、ssDNA-10、ssDNA-12、ssDNA-14、ssDNA-16、ssDNA-18、ssDNA-20nt(图3-A和表1)；
(2)用实施例1中的CRISPR/Cas12a荧光检测体系对与crRNA-1具有不同互补配对碱基数的靶ssDNA和空白对照(Nuclease-Free Water)进行检测，每个样本设3个复孔，根据需要检测的样本数量来配制Cas12a荧光检测混合反应体系并混匀，具体反应体系如实施例1中所述。混匀，短暂离心后置于荧光定量PCR仪中，设置37℃持续孵育，每隔1min读取1次荧光值，计算△荧光值(△荧光值＝终点荧光值-初始荧光值)；
(3)结果如图3-B与图3-C所示，当靶ssDNA与crRNA-1互补配对碱基数为10个或10个以下时，与空白对照组(Nuclease-Free Water)一样，未产生可检出的荧光信号。随着靶ssDNA与crRNA-1互补配对碱基数的增加，产生的荧光信号也随之增加，当靶ssDNA与crRNA-1互补配对碱基数增加到14时，荧光信号强度达到峰值。表明靶ssDNA与crRNA互补序列长度在CRISPR/Cas12a系统中扮演着重要的角色，靶ssDNA与crRNA互补序列长度不少于14nt才能有效激活Cas12a的核酸酶活性。结合实施例1中的探索结果，同时为了增加scDNA的热力学稳定性，我们选择只有14个碱基与crRNA-1识别区互补且20nt长的靶ssDNA-14来构建scDNA。
实施例3
探索靶ssDNA与iDNA的杂交比例
scDNA的构建是通过退火杂交实现的，其中靶ssDNA与iDNA的杂交比例非常重要，为了充分封闭住靶ssDNA同时又不影响检测灵敏度，本研究对靶ssDNA与iDNA的杂交比例进行了探索。
(1)合成与靶ssDNA-14完全互补的ssDNA-14互补链；
(2)将靶ssDNA-14与ssDNA-14互补链以不同比例进行退火杂交产生热稳定的双链产物(图4-A)，根据所需量来配制退火杂交体系并混匀，具体反应体系及条件如下：
退火杂交反应体系(每个反应):以ssDNA-14:ssDNA-14互补链＝1:2为例
退火杂交反应条件：
(3)用实施例1中的CRISPR/Cas12a荧光检测体系对退火杂交产物、未杂交的靶ssDNA-14以及空白对照(Nuclease-Free Water)进行检测，比较它们产生的荧光信号强度。每个样本设3个复孔，根据需要检测的样本数量来配制Cas12a荧光检测混合反应体系并混匀，具体反应体系如实施例1中所述。混匀，短暂离心后置于荧光定量PCR仪中，设置37℃持续孵育，每隔1min读取1次荧光值，计算△荧光值(△荧光值＝终点荧光值-初始荧光值)；
(4)结果如图4-B与图4-C所示，相较于未杂交的靶ssDNA-14，所有比例的退火杂交产物产生的荧光信号强度均显著下降，当靶ssDNA-14与其完全互补的互补链以1:1.5及以下的比例进行退火杂交时，与空白对照组一样，均未产生可检出的荧光信号，表明靶ssDNA-14全部被封闭住，不能激活Cas12a的附属切割活性。结果表明，通过退火杂交可以实现靶ssDNA-14的有效封闭，成功抑制其对Cas12a核酸酶活性的激活。因此，为了确保靶ssDNA-14完全被iDNA互补结合封闭住，降低背景信号，本研究中靶ssDNA-14与iDNA的退火杂交比例采用1:2进行。
实施例4
探索scDNA的凸起ssDNA位置
针对前面提到构建CRISPR/Cas12a自催化驱动的正反馈核酸回路的第二个关键点，活化的Cas12a反式切割scDNA的凸起ssDNA后，断裂的iDNA片段能从靶ssDNA上脱离下来，释放出被封闭的靶ssDNA，我们探索了scDNA的凸起ssDNA位置。
(1)利用DINAMelt计算分析Cas12a反式切割scDNA的凸起ssDNA后，靶ssDNA-14和断裂的iDNA片段组成的双链体的Tm值(图5-A)，Tm值越高，靶ssDNA-14越不容易被释放出来；
(2)为了使靶ssDNA充分释放，我们设计合成了与靶ssDNA-14分别存在11、12、13、14、15、16、17个碱基互补配对的互补链iDNA-11、iDNA-12、iDNA-13、iDNA-14、iDNA-15、iDNA-16、iDNA-17(图5-A)；
(3)将它们分别与靶ssDNA-14以2:1的比例进行退火杂交，根据所需量来配制退火杂交体系并混匀，具体反应体系及条件如实施例3中所述：
(4)用实施例1中的CRISPR/Cas12a荧光检测体系对退火杂交产物、未杂交的靶ssDNA-14以及空白对照(Nuclease-Free Water)进行检测，比较他们产生的荧光信号强度。每个样本设3个复孔，根据需要检测的样本数量来配制Cas12a荧光检测混合反应体系并混匀，具体反应体系如实施例1中所述。混匀，短暂离心后置于荧光定量PCR仪中，设置37℃持续孵育，每隔1min读取1次荧光值，计算△荧光值(△荧光值＝终点荧光值-初始荧光值)；
(5)结果如图5-B所示，靶ssDNA-14与iDNA-11的退火杂交产物ssDNA-14/iDNA-11与靶ssDNA-14的荧光信号强度相当，均明显增强。随着iDNA与靶ssDNA-14互补的碱基数越多，其双链体ssDNA-14/iDNA的Tm值越高，荧光信号强度越弱，到14个以上碱基互补时，同空白对照组一样，无可检出的荧光信号，荧光检测结果同DINAMelt理论计算的Tm值结论相一致。因此，为了使scDNA的凸起ssDNA被活化的Cas12a切割后，能够充分释放出靶ssDNA-14，本研究把凸起ssDNA位置设置在靶ssDNA-14的3’端第11碱基与第12个碱基之间来构建scDNA。
实施例5
探索scDNA的凸起ssDNA长度
(1)合成一个相对于crRNA-1无关的ssDNA(unrelated ssDNA，nrDNA)以及与该nrDNA具有不同长度不同碱基组成的不互补配对序列的iDNA-1、iDNA-2、iDNA-3、iDNA-4，并且在iDNA不互补配对序列两端的T碱基上分别加上FAM荧光基团与BHQ1淬灭基团进行修饰(图6-A)；
(2)将nrDNA分别与iDNA-1、iDNA-2、iDNA-3、iDNA-4按2:1的比例进行退火杂交，以确保线性iDNA全部被nrDNA互补配对结合成双链结构。根据所需量来配制退火杂交体系并混匀，具体反应体系及条件如实施例3中所述：
(3)把退火杂交产物scDNA-1、scDNA-2、scDNA-3和scDNA-4作为Cas12a附属切割的底物进行荧光检测反应，同时增加一组未进行退火杂交的线性iDNA作为Cas12a附属切割的探针。每个样本设3个复孔，根据需要检测的样本数量来配制Cas12a荧光检测混合反应体系并混匀，具体反应体系如实施例1中所述。混匀，短暂离心后置于荧光定量PCR仪中，设置37℃持续孵育，每隔1min读取1次荧光值，计算△荧光值(△荧光值＝终点荧光值-初始荧光值)；
(4)结果如图6-B所示，当scDNA的凸起ssDNA长度为7nt时，荧光信号强度很弱，只有几百。其中相较于FAM-TTTATTT-BHQ1凸起，FAM-TTTTTTT-BHQ1凸起的荧光信号增长更多，说明Cas12a的反式切割更倾向于切割富含T的ssDNA。此外，随着凸起长度的增加，荧光信号也增加，当凸起长度为12nt和21nt时，产生了显著的荧光信号，说明活化的Cas12a能够对scDNA的凸起ssDNA进行有效降解，而且凸起ssDNA的长度越长，Cas12a的附属切割效率越高。同时，比较未杂交组iDNA探针与杂交组scDNA探针，发现未杂交组的线性探针产生的荧光信号更强，说明Cas12a的反式切割更倾向于线性ssDNA(图6-B和图6-C)。
(5)接着，我们进一步将iDNA与靶ssDNA-14的不互补配对序列长度在7nt-12nt之间进行了优化。我们设计合成了与靶ssDNA-14分别具有7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt不互补配对序列的iDNA7、iDNA8、iDNA9、iDNA10、iDNA11、iDNA12(图7-A)；
(6)将iDNA7、iDNA8、iDNA9、iDNA10、iDNA11、iDNA12分别与ssDNA-14以2:1的比例进行退火杂交，根据所需量来配制退火杂交体系并混匀，具体反应体系及条件如实施例3中所述：
(7)用实施例1中的CRISPR/Cas12a荧光检测体系对退火杂交产物ssDNA-14/iDNA7、ssDNA-14/iDNA8、ssDNA-14/iDNA9、ssDNA-14/iDNA10、ssDNA-14/iDNA11和ssDNA-14/iDNA12以及靶ssDNA-14进行检测，比较它们产生的荧光信号强度。每个样本设3个复孔，根据需要检测的样本数量来配制Cas12a荧光检测混合反应体系并混匀，具体反应体系如实施例1中所述。混匀，短暂离心后置于荧光定量PCR仪中，设置37℃持续孵育，每隔1min读取1次荧光值，计算△荧光值(△荧光值＝终点荧光值-初始荧光值)；
(8)结果如图7-B和图7-C所示，随着iDNA与ssDNA-14不互补配对的凸起ssDNA长度的增加，产生的背景荧光信号也随之增加，但是增加很少，没有统计学差异，且他们均与靶ssDNA-14的荧光值存在显著性差异，说明iDNA与靶ssDNA-14不互补配对的凸起ssDNA长度在7nt-12nt之间，均能有效封闭住靶ssDNA-14。结合前述探索结果，活化的Cas12a能够对12nt的凸起ssDNA进行有效的切割，同时，为了充分发挥基于Cas12a的免扩增核酸检测新技术的放大效应，提高检测效率，缩短检测时间，我们采用与ssDNA-14具有12nt不互补配对序列的iDNA来构建scDNA，并用于后续实验。
实施例6
开发基于Cas12a的免扩增核酸检测新技术并探索其灵敏度
(1)将ssDNA-14/iDNA12双链体的12nt长凸起ssDNA两端的T碱基分别加上FAM荧光基团与BHQ1淬灭基团进行修饰，得到具有产生荧光信号能力的scDNA-5(图8-A)；
(2)将靶dsDNA基因序列合成后连接到PUC57载体中，得到含有靶dsDNA的质粒；将构建好的含有靶dsDNA的质粒转化至Top10感受态细胞中，均匀涂布于LB平板上，倒置于37℃培养箱培养过夜；从LB平板中挑取一单克隆菌株接入液体LB培养基中，37℃培养过夜；取适量菌液进行测序鉴定(图8-B)，对鉴定成功的菌液采用试剂盒(E.Z.N.APlasmid MiniKit)进行质粒抽提；将抽提的质粒梯度稀释至5nM、500pM、50pM、5pM、500fM、50fM、5fM、500aM、50aM和5aM浓度；
(3)在前述最优的实验条件下，用本研究开发的基于Cas12a的免扩增核酸检测新技术对不同浓度的质粒以及空白对照组(Nuclease-Free Water)进行检测来评估其灵敏度，每个样本设3个复孔，根据需要检测的样本数量来配制基于Cas12a的免扩增核酸检测混合反应体系并混匀，具体反应体系(每个反应)如下：
混匀，短暂离心后置于荧光定量PCR仪中，设置37℃持续孵育，每隔1min读取1次荧光值，计算△荧光值(△荧光值＝终点荧光值-初始荧光值)；
(4)同时用实施例1中的CRISPR/Cas12a荧光检测体系(含有靶dsDNA的质粒替代靶ssDNA)对不同浓度的质粒(浓度为5nM、500pM、50pM、5pM、500fM、50fM、5fM、500aM、50aM和5aM的含有靶dsDNA的质粒)以及空白对照组(Nuclease-Free Water)进行检测，每个样本设3个复孔，根据需要检测的样本数量来配制Cas12a荧光检测混合反应体系并混匀，得到无正反馈的CRISPR/Cas12a荧光检测体系，具体反应体系如实施例1中所述。混匀，短暂离心后置于荧光定量PCR仪中，设置37℃持续孵育，每隔1min读取1次荧光值，计算△荧光值(△荧光值＝终点荧光值-初始荧光值)；
(5)结果如图8-C和图8-D所示，Cas12a自催化驱动的正反馈免扩增核酸检测新技术可直接检测到不经扩增的50aM靶dsDNA，而相比之下，无正反馈的CRISPR/Cas12a荧光检测体系的最低检测浓度为5nM。正反馈回路的耦合将Cas12a的检测灵敏度提高了8个数量级，明显优于传统的核酸电路，与其他需要额外聚合酶扩增的CRISPR-Dx技术检测灵敏度相当。此外，对比图8-C和8-D中两种技术在信号放大方面的性能。结果显示，在靶dsDNA浓度为500pM的情况下，得益于正反馈回路的指数信号放大效应，基于Cas12a的免扩增核酸检测新技术产生的荧光增量是CRISPR/Cas12a产生荧光增量的13.43倍(图8-C和图8-D)。这样的对比结果也说明自催化驱动的正反馈回路在CRISPR/Cas12a免扩增核酸检测中具有优越的信号增益。
上述实施例阐明的内容应当理解为这些实施例仅用于更清楚地说明本发明，而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本实施例的各种等价形式的修改均落入本发明所附权利要求所限定的范围。
Claims (12)
1.一种scDNA，其特征在于，所述scDNA是通过采用不完全互补配对的iDNA与靶ssDNA退火杂交形成的具有ssDNA凸起的双链结构，所述scDNA上的ssDNA凸起能被活化的Cas蛋白非特异切割。
2.根据权利要求1所述的scDNA，其特征在于，所述scDNA上的ssDNA凸起两端的T碱基分别被荧光基团和淬灭基团修饰。
3.根据权利要求1所述的scDNA，其特征在于，被活化的Cas包括Cas12a、Cas12b、Cas13a或Cas14a1。
4.根据权利要求1所述的scDNA，其特征在于，所述靶ssDNA的核苷酸序列如SEQ IDNO.1- SEQ ID NO.12中任意一条所示。
5.根据权利要求1所述的scDNA，其特征在于，iDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.14- SEQID NO.20、SEQ ID NO.22-SEQ ID NO.32中任意一条所示。
6.根据权利要求1所述的scDNA，其特征在于，ssDNA凸起的长度为7 nt-21 nt；ssDNA凸起的位置在靶ssDNA的3’端第11碱基与第12个碱基之间；靶ssDNA与iDNA的退火杂交比例小于等于1:1.5。
7.根据权利要求1所述的scDNA，其特征在于，靶ssDNA的序列长度不少于14 nt。
8.根据权利要求1-7任一项所述的scDNA，其特征在于，靶ssDNA与crRNA互补序列的长度为14 nt-20nt。
9.基于Cas免扩增核酸检测方法，其特征在于，包括：
提供待测样品，所述待测样品中可能含有靶核酸；
配制反应体系，所述反应体系包括Cas蛋白、scDNA、crRNA；所述scDNA是通过采用不完全互补配对的iDNA与靶ssDNA退火杂交形成的具有ssDNA凸起的双链结构，所述scDNA上的ssDNA凸起能被活化的Cas非特异切割；
将所述待测样品加至所述反应体系中，经恒温定时反应，crRNA引导Cas蛋白识别靶核酸，被痕量的靶核酸激活，活化的Cas蛋白非特异切割scDNA上的ssDNA凸起，切割后，断裂的iDNA片段与靶ssDNA分离，iDNA上的荧光基团与淬灭基团远离，从而产生荧光信号；同时，原本被iDNA封闭的靶ssDNA释放，释放出的靶ssDNA进一步激活Cas的附属切割活性，活化的Cas继续切割scDNA上的ssDNA凸起，循环往复，放大荧光信号，检测荧光信号，确定待测样品中是否含有靶核酸。
10.根据权利要求9所述的基于Cas免扩增核酸检测方法，其特征在于，所述靶核酸为双链DNA、单链DNA或RNA。
11.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-7任一项所述的scDNA。
12.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Cas蛋白、crRNA和缓冲液。
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