CN115896100A

CN115896100A - 一种基因检测分子及应用

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Publication number: CN115896100A
Application number: CN202210778479.6A
Authority: CN
Inventors: 请求不公布姓名
Original assignee: Zaozhuang Kangze Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zaozhuang Kangze Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-07-04
Filing date: 2022-07-04
Publication date: 2023-04-04

Abstract

本发明公开了一种基于RNaseHII核酸酶独特切割作用的分子信标、包含该分子信标的检测组合物、以及利用该分子信标进行基因检测的方法。利用热稳定性RNaseHII核酸酶，本发明提供的基因检测方法能够在较高的温度条件下，实现对目标核酸序列的检测。本发明提供的检测方法能够很好地抑制由非特异杂交产生的背景信号，提高检测的特异性和灵敏度。

Description

一种基因检测分子及应用

技术领域

本发明属于核酸检测领域，具体涉及一种核酸分子信标及其应用。

背景技术

在基础研究以及临床实践中，核酸检测具有广泛的应用，尤其在病原体检测中发挥了重要的作用。聚合酶链式扩增(PCR)是目前主流的病原体核酸检测技术，具有极高的检测特异性和灵敏度。但由于PCR方案对检测环境、设备、人员的要求较高，其在临床上的应用也受到了一定程度的限制。

分子信标(Molecular beacon)是另一项具有临床应用潜力的核酸检测技术，是以碱基互补配对原则、荧光共振能量转移原理为基础独立发展起来的一项核酸检测技术。分子信标是一个能形成“茎环结构”的单链寡聚核苷酸分子，长度一般为25-35个核苷酸，其一端被荧光基团标记，另一端被荧光淬灭基团标记。分子信标的5’端、3’端邻近核酸序列互补，能形成双链的“茎状区域”，使荧光基团和淬灭基团相互靠近。基于荧光共振能量转移原理，荧光基团发出的荧光几乎完全被淬灭基团吸收，并以热的形式散发出去，这使得以“茎环结构”形态存在的分子信标的荧光本底值极低。当“茎环结构”被破坏后，荧光基团与淬灭基团分离，不再发生荧光能量共振转移现象，使得荧光信号的检测值升高，且荧光信号的强度与被破坏的“茎环结构”的量成正比。

自分子信标技术建立以来，在实时定量PCR、基因突变分析、病原体检测等多个方面得到了应用。理想状态下，该技术的检测特异性依赖于信标分子的“环状区域”序列与被检测核酸靶序列之间形成的具有严格碱基互补配对的杂交双链。但在实际检测中，由于被检测样本的复杂性，分子信标的杂交不仅发生在“环状区域”与被检测的核酸靶序列之间，也会发生在“茎状”区域序列与非靶序列之间。此外，由于检测温度较低，非特异性杂交也会导致背景信号增强。

就分子信标的实际应用情况来看，由于序列、反应条件等因素导致的非特异性杂交，是影响检测特异性的核心问题，也是后续技术发展中需要克服的障碍。

发明内容

针对分子信标技术中的问题，本发明提供了一种新颖的解决方案。利用RNase H2核酸酶独特的切割作用，在较高的温度条件下实现对目标核酸序列的特异性检测。

RNase H2核酸酶是逆转录病毒整合酶超家族的一个成员，参与基因组序列的切除修复过程。该核酸酶保守地存在于真核、以及原核细胞中，能够识别DNA双链中出现的单个核糖核苷酸掺入，并在核糖核苷酸的5’端进行切割。

在本发明提供的分子信标“环状区域”的靶序列识别区中，存在一个核糖核苷酸，其他的核苷酸为脱氧核糖核苷酸。当分子信标的靶序列识别区与被检测核酸分子的靶序列之间形成杂交双链后，PaRNase H2蛋白能够识别、结合这种双链结构，并在分子信标的核糖核苷酸位点的5’端进行切割。切割作用会破坏分子信标原有的“茎环结构”，使荧光基团与淬灭基团分离，这样就能检测到荧光基团发出的荧光信号，从而实现对目标核酸序列的检测。

本发明对荧光基团和淬灭基团不做具体限定，本领域技术人员可利用现有知识进行选择。在本发明的具体实施方式中，所述荧光基团包括但不限于FAM、Hex、TET、Cy3、JOE、ROX或VIC，所述淬灭基团包括但不限于Dabcyl、BHQI、BHQ2或TAMRA。

本发明的有益效果

利用热稳定性RNase H2核酸酶独特的切割作用，能在较高的温度条件下实现分子信标对靶序列的检测，优化分子信标技术的检测能力。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不能用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验，通常按照常规的实验条件，如分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，Sambrook等人著)中所描述的实验条件，或按照设备或试剂盒制造厂商建议的实验条件进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均进行三次独立的重复实验。

实施例一、PaRNase H2蛋白的表达及纯化

Pyrococcus abyssi是一种嗜热菌，编码PaRNase H2(Gene ID:1495420；Locustag:PAB_RS02765；蛋白编号:WP_010867642)核酸酶。PaRNase H2核酸酶能够耐受95℃的高温，适合于本发明目的应用。可以理解，除PaRNase H2核酸酶以外，其他的能够在高于室温的条件下，具有与PaRNase H2核酸酶类似作用的核酸酶，也能应用于本发明提供的分子信标检测，实现本发明的目的。

本实施例以PaRNase H2蛋白为例，说明热稳定性PaRNase H2蛋白的表达、纯化过程。

通过检索基因数据库，获得PaRNase H2蛋白的cDNA序列。对原始序列进行密码子优化，合成全长的cDNA序列，在其氨基末端加上六个连续的组氨酸标记，用于辅助表达蛋白的纯化。按照novagen公司提供的《PET系统操作手册》，将带有组氨酸标记的PaRNase H2蛋白序列插入到原核表达载体pet20b中，构建PaRNase H2表达载体。将该表达载体转入大肠杆菌，进行扩增，对获得的表达质粒进行基因测序验证。

获得测序正确的原核表达载体，再次转入大肠杆菌宿主细胞中，将其中的一个单克隆在37℃条件下培养过夜。取400uL过夜培养液，加入到100mL含有氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃条件下震荡培养3小时左右，使菌液的OD₆₀₀值达到0.3-0.6。加入0.5mM的IPTG溶液，在37℃条件下培养过夜，诱导蛋白表达。

按照常规的实验方案，利用镍柱纯化带有组氨酸标记的PaRNase H2蛋白，将纯化的PaRNase H2核酸酶进行定量，贮存于-20℃条件下备用，贮存液成分为：10mM Tris pH8.0、1mM EDTA、100mM NaCl、0.1％Triton X-100、50％甘油。

对获得的PaRNase H2核酸酶进行活性测定，研究表明我们制备了纯化的PaRNaseH2核酸酶。

实施例二、基于PaRNase H2核酸酶的分子信标检测

为了研究PaRNase H2核酸酶的对本发明提供的分子信标的切割作用，我们首先建立了基于PaRNase H2核酸酶的分子信标检测反应体系。进一步的，我们利用该反应体系，分析了三个信标分子对靶序列的检测情况。

1、分子信标及靶位点片段的设计、合成

针对三个被检测核酸序列，设计分子信标，命名为MB01(SEQ ID NO:0101)、MB02(SEQ ID NO:0102)、MB03(SEQ ID NO:0103)。相应的，将它们的靶位点命名为MB01-T(SEQID NO:0201)、MB02-T(SEQ ID NO:0202)、MB03-T(SEQ ID NO:0203)。合成上述三个分子信标、以及靶位点片段。

MB01(SEQ ID NO:0101)

MB01-T(SEQ ID NO:0201)3’-TTCGCCTAGAGCGTTCATTTTTG--G- GCGAGGTTCGAGGTGGTACATCC-5’

MB02(SEQ ID NO:0102)

MB02-T(SEQ ID NO:0202)3’-CTTGCAATCATGCCTTCGGGAAGC--T- TAGTATGTCCCTGGGTGGGCAGA

MB03(SEQ ID NO:0103)

MB03-T(SEQ ID NO:0203)3’-TTGACCCCCCGTCACAATTGTGC--C- ACAGTGGTACAAGTTTTAATGAATC

注：粗体显示的核苷酸为分子信标的“茎状区域”序列；(rC)、(rA)、(rG)为核糖核苷酸；其余的为脱氧核糖核苷酸；带下划线的核苷酸为分子信标的作用靶位点序列。

2、PaRNase H2核酸酶添加量的优化

1)为了优化PaRNase H2核酸酶的添加量，设置如下7组反应体系，PaRNase H2核酸酶的添加浓度分别为0.5ng/uL、1.0ng/uL、2.0ng/uL，3.0ng/uL、4.0ng/uL、5.0ng/uL、6.0ng/uL。

对每个反应设置三次独立的重复实验。

其中，“MB01”为分子信标溶液，浓度为5uM；“5×Reaction Buffer”的成分为：50mMTris-Cl(pH 8.0)，250mM NaCl，20mM MgCl₂，50ug/mL BSA，0.05％Triton X-100。

2)将反应体系置于70℃条件下，反应60分钟；反应结束后，加入EDTA至终浓度20mM终止反应，冷却至室温。

3)荧光分光光度计检测：a)设置荧光基团对应的激发波长与发射波长；b)使用40uL容积比色皿，纯水清洗比色皿，使用反应体系中除分子信标及核酸链以外的组分作为溶剂进行基线校准；c)纯水清洗比色皿，吸取20uL反应液润洗比色皿；d)吸取70uL检测荧光信号强度，测量三次读数取均值作为一次实验所得结果。

实验结果如下。可以看出，当PaRNase H2核酸酶的添加浓度为1.0ng/uL时，即能满足检测需求。为了保证切割反应的充分性，将PaRNase H2核酸酶的添加浓度固定为2.0ng/uL，其在检测反应中的终浓度为0.04ng/uL。

3、信标分子对靶序列的检测

进一步的，利用建立的检测反应体系，分析了三个分子信标对靶序列的检测情况。根据实验内容，设置如下反应体系。

其中，“分子信标MB”为分子信标溶液，浓度为5uM；“靶位点片段”为含有被检测核酸分子的样本；PaRNase H2核酸酶的反应终浓度为4ng/100uL；“5×Reaction Buffer”的成分为50mM Tris-Cl(pH 8.0)，250mM NaCl，20mM MgCl₂，50ug/mL BSA，0.05％Triton X-100。

针对每个分子信标，设置5个反应体系，每个反应中添加不同浓度的靶位点片段。在不同反应体系中，靶位点片段的添加终浓度分别为20nM、2nM、200pM、20pM、2pM、200fM。按照上面描述的方法，开展分子信标检测实验。对每个反应设置三次独立的重复实验，实验结果如下。

实验结果显示，对于由不同的信标分子与靶序列形成的双链结构，PaRNase H2核酸酶均能进行有效的切割，表明该切割作用是具有普适性的。实验结果还表明，对于不同的分子信标而言，本发明提供的检测方案能够检测pM级浓度的靶位点片段。

实施例三、对单碱基变异基因的检测

细胞基因变异是恶性肿瘤一种重要的致病机制，主要表现为蛋白编码序列的碱基突变、基因融合等形式，其中蛋白编码序列的单碱基突变是最常见的一种变异形式，检测单碱基突变基因对肿瘤患者的早期筛查具有重要的意义。在肿瘤发生的早期阶段，肿瘤细胞数量少，要实现对其所携带的微量、甚至是痕迹量的变异基因的检测，就需要克服海量的正常细胞基因组背景的干扰。为了实现对单碱基变异基因的检测，我们开展本实施例研究。

1、对单碱基变异基因片段的检测

为了研究本发明提供的检测方案对靶序列单碱基变异的辨别能力，我们以MB01、MB02、MB03的靶位点为基础，设计了单碱基变异的靶位点序列。MB01的单碱基变异靶序列为MB01-T(SEQ ID NO:0201)、MB01-TS2(SEQ ID NO:0302)和MB01-TS3(SEQ ID NO:0303)，MB02的单碱基变异靶序列为MB02-TS1(SEQ ID NO:0304)、MB02-TS2(SEQ ID NO:0305)和MB02-TS3(SEQ ID NO:0306)，MB03的单碱基变异靶序列为MB03-TS1(SEQ ID NO:0307)、MB03-TS2(SEQ ID NO:0308)和MB03-TS3(SEQ ID NO:0309)。

MB01 5’-FAM-CGAATGTGCAAGTAAAAAC(rC)CGCTCCAAGCTCACATTCG-BHQ1-3’

MB01-T 3’-TTCGCCTAGAGCGTTCATTTTTG--G-GCGAGGTTCGAGGTGGTACATCC-5’

MB01-TS1

MB01-TS2

MB01-TS3

MB02 5’-Cy5—ACGTTAGTAGAAGCCCTTCG(rA)ATCATACAGGGTACTAACGT-BHQ2

MB02-T 3’-CTTGCAATCATGCCTTCGGGAAGC--T-TAGTATGTCCCTGGGTGGGCAGA

MB02-TS1

MB02-TS2

MB02-TS3

MB03 5’-TET—CTTGCAATGTGTTAACACG(rG)TGTCACCATGTATTGCAAG-TAMRA

MB03-T 3’-TTGACCCCCCGTCACAATTGTGC--C-ACAGTGGTACAAGTTTTAATGAATC

MB03-TS1

MB03-TS2

MB03-TS3

注：粗体显示的核苷酸为变异核苷酸；(rC)、(rA)、(rG)为核糖核苷酸；其余的为脱氧核糖核苷酸；带下划线的核苷酸为靶序列。

为了实现对肿瘤细胞来源的单碱基突变基因的特异性检测，首先需要能将其与正常细胞携带的野生型基因片段区分开来，具有对单碱基突变基因片段的选择性区分能力。为此，我们设置了如下反应体系。“信标分子/靶位点片段”的配对情况：MB01/MB01-T；MB01/MB01-TS1；MB01/MB01-TS2；MB01/MB01-TS3；MB02/MB02-T；MB02/MB02-TS1；MB02/MB02-TS2；MB02/MB02-TS3；MB03/MB03-T；MB03/MB03-TS1；MB03/MB03-TS2；MB03/MB03-TS3。

按照实施例二描述的方案，对完全配对的靶位点和单碱基错配的靶位点进行分子信标检测，实验结果如下。

实验结果显示，分子信标与靶位点之间的单碱基错配，会显著抑制PaRNase核酸酶对分子信标的切割作用。提示与靶位点之间的错配会影响分子信标对错配靶位点的识别和结合能力。

2、杂交温度对检测特异性的影响

为了研究杂交温度对检测特异性的影响，我们按照上一节的描述，分别在40℃、50℃、60℃、70℃的条件下，对“信标分子/靶位点片段”MB01/MB01-T、MB01/MB01-TS1、MB01/MB01-TS2、MB01/MB01-TS3、MB02/MB02-T、MB02/MB02-TS1、MB02/MB02-TS2、MB02/MB02-TS3、MB03/MB03-T、MB03/MB03-TS1、MB03/MB03-TS2、MB03/MB03-TS3进行检测，实验结果如下。

实验结果显示，在70℃的检测条件下，对与分子信标完全匹配的靶位点、以及与分子信标存在单碱基错配靶位点之间的检测值的差异最大。提示检测温度的提高，有利于提高检测特异性。

3、对单碱基变异片段混合物的检测

在实际应用场景中，单碱基变异基因检测的难点在于携带变异基因的肿瘤细胞的数量通常较少，因此在检测过程中会受到大量正常细胞携带的占绝对多数的野生型基因的干扰。为了实现对微量的单碱基突变基因的检测，通常会针对突变位点设计分子信标；这样，当分子信标作用于野生型基因位点时，分子信标与野生型位点之间就会出现单碱基的错配。

为了模拟这种检测场景，我们将代表单碱基突变序列的、与分子信标完全匹配的靶位点片段(MB01-T，MB02-T，MB03-T)和代表野生型序列的、与分子信标之间存在单碱基错配的靶位点片段(MB01-TS1，MB02-TS1，MB03-TS1)按一定的比例进行混合，作为混合靶位点片段开展分子信标检测。

设置如下反应体系。其中，“混合靶位点片段”的组成情况为：MB01-T/MB01-TS1的比例为50:50、20:80、2:98、0.2:99.8、0.1:99.9、0.05:99.95、0.02:99.98；MB02-T/MB02-TS1的比例为50:50、20:80、2:98、0.2:99.8、0.1:99.9、0.05:99.95、0.02:99.98；MB03-T/MB03-TS1的比例为50:50、20:80、2:98、0.2:99.8、0.1:99.9、0.05:99.95、0.02:99.98。

按照实施例二描述的方案，对上述“混合靶位点片段”进行分子信标检测，实验结果如下。

实验结果表明，对单碱基突变序列占比仅为1‰的样本而言，本发明提供的检测方案能够对突变序列进行准确检测。

实施例四、对融合序列片段的检测

基因融合是细胞肿瘤化的另一种重要机制，常常会导致癌基因的异常激活、或抑癌基因的功能抑制。为了利用本发明提供的方案，实现对融合基因的检测，我们开展本实施例研究。

1、对融合序列片段混合物的检测

为了研究本发明提供的检测方案对融合序列片段的检测能力，我们以分子信标MB01、MB02、MB03的靶位点为基础，设计了上、下游融合序列的靶位点片段。针对靶位点MB01-T，设计上游融合序列靶位点片段MB01-FU(SEQ ID NO:0401)和下游融合序列靶位点片段MB01-FD(SEQ ID NO:0402)；针对靶位点MB02-T，设计上游融合序列靶位点片段MB02-FU(SEQ ID NO:0403)和下游融合序列靶位点片段MB02-FD(SEQ ID NO:0404)；针对靶位点MB03-T，设计上游融合序列靶位点片段MB03-FU(SEQ ID NO:0405)和下游融合序列靶位点片段MB03-FD(SEQ ID NO:0406)。

MB01(SEQ ID NO:0101)

MB01-T(SEQ ID NO:0201) 3’-TTCGCCTAGAGCGTTCATTTTTG--G- GCGAGGTTCGAGGTGGTACATCC-5’

MB01-FU(SEQ ID NO:0401) 3’-TCAGATCCTCTGGATTAACAGTG--G- GCGAGGTTCGAGGTGGTACATCC-5’

MB01-FD(SEQ ID NO:0402) 3’-TTCGCCTAGAGCGTTCATTTTTG--C-CGCCACAATTGTGCCCGATTTCG-5’

MB02(SEQ ID NO:0102)

MB02-T(SEQ ID NO:0202) 3’-CTTGCAATCATGCCTTCGGGAAGC--T- TAGTATGTCCCTGGGTGGGCAGA

MB02-FU(SEQ ID NO:0403) 3’-AGACAAATGTCCCAACGGGCCCAG--T- TAGTATGTCCCTGGGTGGGCAGA

MB02-FD(SEQ ID NO:0404) 3’-CTTGCAATCATGCCTTCGGGAAGC--G-TTCTGTTTACAGGGTTGCCCGTG

MB03(SEQ ID NO:0103)

MB03-T(SEQ ID NO:0203) 3’-TTGACCCCCCGTCACAATTGTGC--C- ACAGTGGTACAAGTTTTAATGAATC

MB03-FU(SEQ ID NO:0405) 3’-CTAAGTGCGCAACATTTTACTCG--C-ACAGTGGTACAAGTTTTAATGAATC

MB03-FD(SEQ ID NO:0406) 3’-TTGACCCCCCGTCACAATTGTGC--G-CTAAGTGCGCAACATTTTACTCGTC

注：粗体显示的核苷酸为分子信标的“茎杆结构”序列；(rC)、(rA)、(rG)为核糖核苷酸；其余的为脱氧核糖核苷酸；带下划线的核苷酸为靶序列或部分靶序列。

与单碱基突变序列的检测类似，检测融合基因的难点也在于携带融合基因的肿瘤细胞的数量通常较少，因此在检测过程中会受到大量正常细胞携带的占绝对多数的野生型基因的干扰。为了实现对微量的融合基因的检测，通常会针对融合基因位点设计分子信标；这样，当分子信标作用于融合基因位点上、下游的野生型基因位点时，分子信标与野生型位点之间就会出现大量的碱基错配。

为了模拟这种检测场景，我们将代表融合基因位点的、与分子信标完全匹配的靶位点片段(MB01-T，MB02-T，MB03-T)和代表野生型上、下游基因位点的、与分子信标之间存在碱基错配的靶位点片段(MB01-FU，MB01-FD；MB02-FU，MB02-FD；MB03-FU，MB03-FD)按一定的比例进行混合，作为混合靶位点片段开展分子信标检测。

设置如下反应体系。其中，“混合靶位点片段”的组成情况为：MB01-T/MB01-FU/MB01-FD的比例为20:40:40、10:45:45、2:49:49、0.5:49.75:49.75、0.2:49.9:49.9、0.1:49.95:49.95、0.05:49.975:49.975、0.02:49.99:49.99；MB02-T/MB02-FU/MB02-FD的比例为20:40:40、10:45:45、2:49:49、0.5:49.75:49.75、0.2:49.9:49.9、0.1:49.95:49.95、0.05:49.975:49.975、0.02:49.99:49.99；MB03-T/MB03-FU/MB03-FD的比例为20:40:40、10:45:45、2:49:49、0.5:49.75:49.75、0.2:49.9:49.9、0.1:49.95:49.95、0.05:49.975:49.975、0.02:49.99:49.99。

按照实施例二描述的方案，对上述“混合靶位点片段”进行检测，实验结果如下。

实验结果表明，对融合序列片段占比仅为2‰的样本而言，本发明提供的检测方案能够对融合序列片段进行准确检测。

实施例五、对细胞融合基因的检测

我们以EML4-ALK融合基因的检测为例，开展本实施例研究。

人类棘皮动物微管相关蛋白样4基因(Echinoderm microtubule-associatedprotein like 4，EML4，NM_019063.5)与间变性淋巴瘤激酶基因(Anaplastic lymphomakinase，ALK，NM_004304.5)，分别位于人类2号染色体的p21和p23区带，相隔约10Mb的距离。在非小细胞肺癌患者体内，这两个基因常常会发生融合，形成具有致瘤性的EML4-ALK融合基因。通过对临床肿瘤标本的研究，十余年来人类鉴定了一批具有生物学活性的EML4-ALK融合基因，我们选取其中的五个为代表，开展研究。这五个融合基因分别为EML4-ALK融合基因1、EML4-ALK融合基因2、EML4-ALK融合基因4、EML4-ALK融合基因5a、EML4-ALK融合基因7，相关研究文献为Soda M et al.Identification of the transforming EML4-ALK fusiongene in non-small-cell lung cancer.Nature.448:561,2007(EML4-ALK融合基因1、EML4-ALK融合基因2)；Takeuchi K et al.Multiplex reverse transcription-PCRscreening for EML4-ALK fusion transcripts.Clin CancerRes.14:6618,2008(EML4-ALK融合基因4、EML4-ALK融合基因5a)；Takeuchi K et al.KIF5B-ALK,a novel fusiononcokinase identified by an immunohistochemistry-based diagnostic systemforALK-positive lung cancer.Clin CancerRes.15:3143,2009(EML4-ALK融合基因7)。

1、对细胞基因组DNA融合基因的检测

针对这五个融合基因的基因组序列，分别设计靶向基因融合位点的分子信标、以及靶位点片段。具体的，EML4-ALK融合基因1的靶位点片段EML4-ALK-1T(SEQ ID NO:0502)和靶向该位点的分子信标EML4-ALK-1(SEQ ID NO:0501)，EML4-ALK融合基因2的靶位点片段EML4-ALK-2T(SEQ ID NO:0504)和靶向该位点的分子信标EML4-ALK-2(SEQ ID NO:0503)，EML4-ALK融合基因4的靶位点片段EML4-ALK-4T(SEQ ID NO:0506)和靶向该位点的分子信标EML4-ALK-4(SEQ ID NO:0505)，EML4-ALK融合基因5a的靶位点片段EML4-ALK-5aT(SEQ ID NO:0508)和靶向该位点的分子信标EML4-ALK-5a(SEQ ID NO:0507)，EML4-ALK融合基因7的靶位点片段EML4-ALK-7T(SEQ ID NO:0510)和靶向该位点的分子信标EML4-ALK-7(SEQ ID NO:0509)。

EML4-ALK-1

EML4-ALK-1T 3’-GAGGACCACGAAGGCCGCCATGT--g-aaatccaggaaagggtccacacc-5’

EML4-ALK-2

EML4-ALK-2T 3’-CGAGGACCACGAAGGCCGCCATGT--t-catgttataaagtatcagagggc

EML4-ALK-4

EML4-ALK-4T 3’-ATGAGTCCCGAGTAGGTCGTATA--g-agataaagagaaagtcctaagtcta

EML4-ALK-5a

EML4-ALK-5aT 3’-CGAGGACCACGAAGGCCGCCATGT--g-aaatgaactctgactaaaaaagtga

EML4-ALK-7

EML4-ALK-7T 3’-GTACCGAACGTCGAGGACCACGA--g-ataaagagaaagtcctaagtctagt

注：粗体显示的核苷酸为分子信标的“茎杆结构”序列；(rC)、(rA)、(rG)为核糖核苷酸；其余的为脱氧核糖核苷酸；带下划线的核苷酸为靶序列。

获得并培养表达各种EML4-ALK融合基因的非小细胞肺癌细胞株(阳性细胞)、以及表达野生型EML4、ALK基因的HEK293T细胞(阴性细胞)。对EML4-ALK融合基因表达细胞、以及HEK293T细胞进行计数，按一定的比例，将两种细胞进行混合，得到含有不同比例EML4-ALK融合基因细胞的混合细胞样本，用以模拟含有不同浓度肿瘤细胞的临床样本。其中，EML4-ALK融合基因细胞的含量分别为50％、20％、10％、5％、2％、5‰、2‰、1‰。

分别获得含有不同浓度融合基因表达细胞的混合细胞样本，提取细胞样本的基因组DNA，作为混合靶位点片段开展分子信标检测。针对每个反应，进行三次独立的重复实验。

实验结果表明，本发明提供的基因组DNA检测方案，能够检测融合基因表达细胞含量为2％的混合细胞样本。

2、对融合基因mRNA的检测

为了提高对变异基因检测的灵敏度，我们进一步在mRNA水平，开展了对融合基因的检测。

针对这五个融合基因的cDNA序列，分别设计靶向其cDNA融合位点的分子信标、以及cDNA靶位点片段。具体的，EML4-ALK融合基因1的cDNA靶位点片段cEML4-ALK-1T(SEQ IDNO:0512)和靶向该位点的分子信标cEML4-ALK-1(SEQ ID NO:0511)，EML4-ALK融合基因2的cDNA靶位点片段cEML4-ALK-2T(SEQ ID NO:0514)和靶向该位点的分子信标cEML4-ALK-2(SEQ ID NO:0513)，EML4-ALK融合基因4的cDNA靶位点片段cEML4-ALK-4T(SEQ ID NO:0516)和靶向该位点的分子信标cEML4-ALK-4(SEQ ID NO:0515)，EML4-ALK融合基因5a的cDNA靶位点片段cEML4-ALK-5aT(SEQ ID NO:0518)和靶向该位点的分子信标cEML4-ALK-5a(SEQ ID NO:0517)，EML4-ALK融合基因7的cDNA靶位点片段cEML4-ALK-7T(SEQ ID NO:0520)和靶向该位点的分子信标cEML4-ALK-7(SEQ ID NO:0519)。

cEML4-ALK-1

cEML4-ALK-1T 3’------------tttcctggattt--c-ACATGGCGGCCT------------5’

cEML4-ALK-2

cEML4-ALK-2T 3’--------------tttataacatg--a-ACATGGCGGCC--------------5’

cEML4-ALK-4

cEML4-ALK-4T 3’-------------tctctttatct--c-TATACGACCTA---------------5’

cEML4-ALK-5a

cEML4-ALK-5aT 3’--------------agagttcattt--c- ACATGGCGGCC---------------5’

cEML4-ALK-7

cEML4-ALK-7T 3’-------------tttctctttat--c-TCGTGGTCCTC---------------5’

分别获得含有不同浓度融合基因表达细胞的混合细胞样本，提取细胞总RNA。将其中的mRNA逆转录成cDNA，作为混合靶位点片段开展分子信标检测。针对每个反应，进行三次独立的重复实验。

实验结果表明，以mRNA为对象进行检测，能进一步提高本发明方案的检测灵敏度。

实施例五、与等温扩增结合的分子信标检测方案

在低丰度变异基因的检测中，除了要克服野生型同源序列的干扰以外，基因组中的海量非同源序列也会带来不利的影响。为了克服非同源序列的影响，进一步提高检测的灵敏度，我们将核酸等温扩增技术与本发明提出的分子信标检测技术进行结合，开展本实施例研究。一方面，利用核酸等温扩增对目标基因区域进行扩增，提高靶位点序列的丰度；另一方面，根据本发明提供的分子信标检测方案，利用较高的检测温度，提高靶位点检测的特异性。

针对沙眼衣原体Ct serovar D株的ompA基因序列，设计4条LAMP引物，具体如下：

F3-Ct 5’-CGCTATTAGCTTACGTGCT

B3-Ct 5’-ATTAGTGAACCACTCTGCA

FIP-Ct 5’-CTCCCATAGAAAATGTTTTAGGGATTTTACGGAGACTATGTTTTCG

BIP-Ct 5’-CGCTGCTGCAAACTATTGTAAATGCTTATTGTAGGCC

按照常规的技术方案，将沙眼衣原体Ct serovar D株接种到培养的HeLa细胞中，使其感染HeLa细胞并在其中扩增。利用细菌基因组DNA提取试剂盒，提取沙眼衣原体的基因组DNA。利用培养细胞基因组DNA提取试剂盒，提取未感染沙眼衣原体的HeLa细胞的基因组DNA。

按一定的比例，将沙眼衣原体基因组DNA与HeLa细胞基因组DNA进行混合，得到含有不同比例沙眼衣原体基因组DNA的混合样本。其中，沙眼衣原体基因组DNA/HeLa细胞基因组DNA的比例分别为1:10⁴、1:10⁵、1:10⁶、1:10⁷、1:10⁸、1:10⁹、1:10¹⁰、1:10¹¹、1:10¹²。

以混合DNA样本为模板，设立如下的等温扩增反应体系：

其中，2×Reaction Mix由北京康为世纪生物科技有限公司提供。将反应体系置于60℃水浴中，反应60分钟；将反应体系加热至80℃，保温5分钟终止反应。

对反应终产物中的核酸成分进行定量，将核酸成分的浓度调整为5ng/uL，作为核酸模板添加到如下分子信标检测体系中。按照前面描述的方法，设计针对沙眼衣原体Ctserovar D株ompA基因的分子信标，与分子信标偶联的荧光基团为TET、荧光淬灭基团为TAMRA。

设立如下分子信标检测反应体系：

按照实施例二描述的方案，进行检测，针对每个反应，进行三次独立的重复实验。实验结果如下。

实验结果表明，将等温扩增与本发明提供的分子信标检测方案进行结合，能显著提高检测的灵敏度。

实施例六、多分子信标混合检测方案

为了提高基因检测的准确性和检测效率，可以在一次检测反应中加入针对不同基因或同一个基因设计的不同分子信标，进行检测，前提是不同分子信标的荧光基团的发射光谱之间没有相互干扰。为了展示这种应用方案，我们针对新冠病毒的五个基因变异靶位点，分别设计分子信标：S.K417N-MB(SEQ ID NO:0601)；S.K417T-MB(SEQ ID NO:0602)；S.L452R-MB(SEQ ID NO:0603)；S.d69-70-MB(SEQ ID NO:0604)；N1-MB(SEQ ID NO:0605)。将五个分子信标混合，每个分子信标的浓度均为2uM，分子信标的总浓度10uM。

S.K417N-MB

S.K417T-MB

S.L452R-MB

S.d69-70-MB

N1-MB

依据新冠病毒alpha毒株、beta毒株、gamma毒株、delta毒株的测序数据，合成各毒株的变异靶位点序列的双链DNA片段，将某种毒株的所有靶位点片段混合，作为该毒株的混合样本，进行分子信标检测。

实验结果表明，对不同毒株样本的检测情况与预期是一致的。本实施例结果提示多分析信标混合检测方案是可行的，能在一个反应中实现对由不同荧光分子标记的多个分子信标的检测。

实施例七、多次酶切的分子信标检测方案

在传统分子信标检测中，当分子信标未与被检测的靶序列杂交时，分子信标是以一种“茎环结构”的形式存在的，其5’端、3’端的荧光基团和淬灭基团相互靠近。由于荧光共振能量转移，荧光基团发出的荧光几乎完全被淬灭基团吸收并以热的形式散发，导致荧光本底极低。当信标分子与靶序列通过碱基互补配对，形成杂交双链后，“茎环结构”被破坏，荧光基团与淬灭基团分离，不再发生荧光能量共振转移，这样就能够检测到荧光基团产生的荧光信号。但如果因为“退火”等原因，导致信标分子与靶序列形成的双链结构解离，信标分子就又恢复“茎环结构”，荧光信号就又检测不到了。

与传统分子信标检测不同的是，在本发明提供的检测方案中，分子信标一旦与靶序列杂交形成双链，就会被PaRNase H2核酸酶切割，产生荧光信号。即便随后杂交双链解离，荧光基团连接的核酸片段也不会再与淬灭基团连接的核酸片段形成“茎环结构”，这样荧光信号也不会因为杂交双链的解离而消失。如果多次重复“杂交-切割-解离-再杂交-再切割”的过程，荧光信号便会逐渐积累，有助于提高分子信标的检测灵敏度。

1、多次酶切的分子信标检测方案

按照实施例二的描述，针对分子信标MB01和靶序列MB01-T，设置如下反应体系。

按照实施例二的描述，进行单次酶切和多次酶切的分子信标检测。

单次酶切检测：1)将反应体系置于70℃条件下，反应60分钟；2)加入EDTA至终浓度20mM终止反应，冷却至室温；2)进行荧光分光光度计检测，对每个反应测量三次，读数取均值作为一次实验所得结果。

多次酶切检测：1)将反应体系置于70℃条件下，反应60分钟；2)将反应体系升温至85℃，随后迅速冷却至室温；3)将步骤1)、2)重复n次；4)反应结束后，加入EDTA至终浓度20mM终止反应，冷却至室温；5)进行荧光分光光度计检测，对每个反应测量三次，读数取均值作为一次实验所得结果。

设置4组实验，重复次数(n值)分别为3次、6次、9次和12次。

实验结果显示，多次重复RNase HII的酶切过程，能显著提高荧光值的积累。

2、多次酶切的分子信标检测提高检测的灵敏度

为了检验这一过程对检测灵敏度的影响，我们以实施例三中对混合靶位点片段检测为研究对象，开展本实施例研究。按照实施例三的描述，设置如下反应体系。其中，“混合靶位点片段”的组成情况为：MB01-T/MB01-TS1的比例为50:50、20:80、2:98、0.2:99.8、0.1:99.9、0.05:99.95、0.02:99.98；MB02-T/MB02-TS1的比例为50:50、20:80、2:98、0.2:99.8、0.1:99.9、0.05:99.95、0.02:99.98；MB03-T/MB03-TS1的比例为50:50、20:80、2:98、0.2:99.8、0.1:99.9、0.05:99.95、0.02:99.98。

按照上面的描述，进行单次酶切和多次酶切的分子信标检测。

多次酶切检测：1)将反应体系置于70℃条件下，反应60分钟；2)将反应体系升温至85℃，随后迅速冷却至室温；3)将步骤1)、2)重复12次；4)反应结束后，加入EDTA至终浓度20mM终止反应，冷却至室温；5)进行荧光分光光度计检测，对每个反应测量三次，读数取均值作为一次实验所得结果。实验结果如下。

实验结果显示与单次酶切检测相比，多次酶切过程能显著提高分子信标检测的灵敏度。

Claims

1.一种具有茎环结构的寡聚核苷酸分子信标，其特征在于，所述信标分子中至少一个核苷酸为核糖核苷酸，其他的核苷酸为脱氧核糖核苷酸；所述信标分子的两个末端分别被荧光基团和荧光淬灭基团标记。

2.一种用于体外核酸分子检测的检测组合物，其特征在于，所述检测组合物含有至少一种权利要求1所述的分子信标和至少一种具有RNase H2蛋白活性的蛋白质。

3.权利要求2所述的检测组合物，其特征在于，所述具有RNase H2蛋白活性的蛋白质为热稳定性蛋白质；优选的，所述具有RNase H2蛋白活性的蛋白质为来源于Pyrococcusabyssi嗜热菌的RNase H2蛋白，以及上述蛋白的一个或多个氨基酸残基被取代、添加、缺失而形成的衍生蛋白质、上述蛋白的融合蛋白、以及为适应表达而对上述蛋白或其衍生蛋白进行密码子优化形成的衍生蛋白。

4.一种在体外样本中进行基因检测的方法，包括以下步骤：

1)提供权利要求2所述的检测组合物和含有至少一种被检测核酸分子的检测样本，所述检测组合物含有至少一种权利要求1所述的分子信标、至少一种具有RNase H2蛋白活性的蛋白质；所述分子信标能够与被检测核酸分子中具有序列同源性的目标核酸序列杂交；

2)提供合适的反应条件，将检测组合物与检测样本进行接触，使分子信标与序列同源的目标核酸序列杂交；

3)将反应体系置于40-90℃条件下进行孵育，使具有RNase H2蛋白活性的蛋白质切割与目标核酸序列杂交的分子信标；

4)检测被切割的分子信标的量。

5.一种在体外样本中进行基因检测的方法，包括以下步骤：

2)提供合适的反应条件，使检测样本中的被检测核酸分子、或包含目标核酸序列的核酸片段进行等温扩增，获得等温扩增产物；

3)提供合适的反应条件，将检测组合物与步骤2获得的等温扩增产物进行接触，使分子信标与序列同源的目标核酸序列杂交；

4)将反应体系置于40-90℃条件下进行孵育，使具有RNase H2蛋白活性的蛋白质切割与目标核酸序列杂交的分子信标；

5)检测被切割的分子信标的量。

6.一种在体外样本中进行基因检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提供权利要求2所述的检测组合物和含有至少一种被检测核酸分子的检测样本，所述检测组合物含有两种或两种以上的权利要求1所述的分子信标、至少一种具有RNase H2蛋白活性的蛋白质；所述两种或两种以上的分子信标分别被可区分的荧光基团标记；所述两种或两种以上的分子信标能够分别与被检测核酸分子中具有序列同源性的目标核酸序列杂交；

2)提供合适的反应条件，将检测组合物与检测样本进行接触，使分子信标分别与序列同源的目标核酸序列杂交；

4)利用与不同分子信标标记的可区分的荧光基团，分别检测各种分子信标被切割的量。

7.一种在体外样本中进行基因检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2)提供合适的反应条件，对检测样本中的被检测核酸分子、或包含目标核酸序列的核酸片段进行等温扩增，获得等温扩增产物；

3)提供合适的反应条件，将检测组合物与等温扩增产物进行接触，使分子信标分别与序列同源的目标核酸序列杂交；

5)利用与不同分子信标标记的可区分的荧光基团，分别检测各种分子信标被切割的量。

8.一种在体外样本中进行基因检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提供权利要求2所述的检测组合物和含有两种或两种以上被检测核酸分子的检测样本，所述检测组合物含有两种或两种以上的权利要求1所述的分子信标、至少一种具有RNase H2蛋白活性的蛋白质；所述两种或两种以上的分子信标分别被可区分的荧光基团标记；所述两种或两种以上的分子信标能够分别与同一种或不同种被检测核酸分子中具有序列同源性的目标核酸序列杂交；

9.一种在体外样本中进行基因检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

10.权利要求1-9所述的分子信标、检测组合物、基因检测方法在非诊断目的的体外样本检测中的应用。