KR20230063086A - 분할된 t7 프로모터를 이용한 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 분할된 T7 프로모터를 이용한 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 하나의 튜브 안에서 하나의 효소만으로 신속하고 간편한 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이의 검출이 가능하다. T7 프로모터 서열의 분할 비율의 조절을 통하여 전사 반응이 효과적으로 일어나도록 설계하였으며, 추가적인 민감도 상승을 위해, SARS-CoV-2의 여러 영역에 결합할 수 있도록 추가적인 3-방향 접합 구조를 설계하였다. 본 발명은 SARS-CoV-2의 돌연변이가 발생한 경우에도 매우 특이적으로 서열의 변화를 용이하게 구별할 수 있으며, 각기 다른 두 종류의 light-up RNA 압타머를 디자인하여 하나의 튜브에서 두개 이상의 분자를 동시에 확인할 수 있는 다중 분석(multiplex analysis)을 구현하였다. 본 발명을 이용하는 경우, 기존 방식의 발명보다 간편, 신속하며 민감하게 검출할 수 있어 우수하다.
Description
본 기술은 신속, 간편하게 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2, SARS-CoV-2) 및 이의 돌연변이를 검출하는 시스템에 관한 것으로 3-방향 접합 구조체에 분할된 T7 프로모터를 새롭게 도입하여, 등온에서 SARS-CoV-2 존재 하에 다량의 형광 RNA 압타머를 생성하도록 설계하였다. 이를 통해 기존 현장진단의 한계를 극복할 수 있으며, 고감도 검출 및 추가적인 핵산 추출 과정 없이 분석이 진행되는 검출을 통하여 다양한 응용이 가능하다.
2019년 12월, 새로운 호흡기 전염성 RNA 바이러스인 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV-2) 및 변이 바이러스가 발병되었으며 전 세계로 빠르게 확산되었다. 따라서 바이러스 전파를 억제하기 위한 빠르고 편리하게 SARS-CoV-2 검출하는 기술이 요구되는 실정이다.
현재 SARS-CoV-2 검출에서 가장 많이 사용되는 방법은 핵산 증폭기반의 qRT-PCR(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction)이다. 다양한 프라이머-프로브 세트가 밝혀져 있으며 매우 민감한 검출한계를 가지는 장점이 있으나, 모든 PCR 테스트는 온도 조절 장치가 필요하며 전문 실험실에서 진행되므로 오랜 시간(1-2일)이 걸리고 가격이 비싸다는 단점이 존재한다.
이러한 온도조절기반의 방법의 단점을 보완하고 검사 편의성을 위한 다양한 strand displacement polymerase를 사용한 등온 핵산 증폭 방법들이 개발되었다. 등온 증폭 방법은 온도 제어 기반 방법의 단점을 보완하고 현장 진료 테스트를 용이하게 하기 위해 개발되었다. 그러나 대부분의 등온 증폭 방법은 반응 개시 전에 온도 조절을 통한 변성(denaturation)/어닐링(annealing) 단계가 필요하다. 또한, 다양한 효소에 대한 반응을 최적화하기가 어렵고 검출 단계가 복잡하다는 단점이 있다. 특히, SARS-CoV-2의 경우 대부분의 등온 증폭 방법은 RNA를 cDNA로 변환하는 방식으로 진행되며, DNA 증폭 산물을 대량으로 생산하기 때문에 변환된 cDNA와 증폭된 DNA가 쉽게 분해되지 않아 오염에 취약하다. 이러한 오염은 반응을 방해하여 높은 가양성을 초래할 수 있습니다. 따라서 SARS-CoV-2를 탐지하기 위해서는 빠른 단일 단계 등온 증폭 방법이 여전히 필요했다.
3-방향 접합(Three-way junction) 구조 기반의 signal-mediated amplification of RNA technology(SMART)는 gDNA, total RNA 등에 적용이 가능하며, 다양한 핵산 바이오 마커의 고감도 검출에 사용되어져 왔다. 하지만, SMART 기술의 우수한 장점에도 불구하고, DNA 중합효소 와 RNA 중합효소 두 가지 효소를 필요로 한다는 한계가 있으며, 두 효소가 같이 존재할 경우 비 특이적인 신호를 발생하므로 one-step 반응이 불가능하고, 반응시간도 오래 걸린다는 단점이 있다.
한편, 형광 RNA 압타머는 특정 분자에 높은 특이성과 친화력을 가지고 있어 결합 시 높은 형광 신호를 나타내는 특성을 가지고 있다. 단백질인 항체 분자와 비교하여 열적, 화학적으로 높은 안정성을 갖으므로 세포 내 실험 뿐 아니라 세포 외 실험에서도 많이 사용되고 있다. 이러한 형광 RNA 압타머는 가격이 저렴하고 낮은 배경 신호를 가지며 다중 분석에도 적용 가능한 장점을 가지고 있다.
SMART기술과 관련하여, 국제 공개특허공보 WO 99/37806은 표적핵산서열을 검출하기 위한 SMART 기술에 대하여 개시하고 있으나, 2개의 중합효소를 이용하여 표적하는 핵산을 검출했으며, 하나의 중합효소만을 이용한 기술에 대해서는 개시된 바 없다.
이에, 본 연구자들은 하나의 효소를 사용하면서도 매우 특이적이며 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이를 쉽게 검출할 수 있는 3-방향 접합 구조를 완성하는 데에 중점을 두어 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명자들은 기존 SMART 분석의 단점을 극복하면서 타겟 서열을 신속하게 검출할 수 있는 새로운 등온 핵산 증폭 기술을 개발하기위해 노력한 결과, SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이를 신속하게 분석할 수 있는 3-방향 접합(three-way junction) 구조 기반 신규 등온 핵산증폭기술(37℃)을 발명하였으며 추가적인 라벨링 없이 저렴하고 쉽게 프로브를 디자인하여 다중 분석이 가능하도록 설계하였다.
본 발명의 목적은 제1프로브 및 제2프로브를 포함하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응(isothermal one-pot reaction) 프로브 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 프로브 세트를 포함하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 조성물, 중합효소 및 등온 단일 반응 용액을 포함하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트를 이용하여 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트를 이용한 현장용 분자 진단 방법을 제공하는 것이다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속 하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반 적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 제1프로브 및 제2프로브를 포함하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응(isothermal one-pot reaction) 프로브 세트를 제공하며,
상기 제1프로브는 하기 일반식 I 및 II를 포함하는 구조를 갖는 프로모터 프로브(promoter probe, PP)이고,
[일반식 I]
5'-X-Y-Z-3'
[일반식 II]
3'-Ya-5'
상기 일반식 I에서,
X는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 하나의 표지(label) 또는 다수의 표지를 포함하는 상호작용적 표지 시스템을 갖는 압타머 서열 부위이고;
Y는 T7 프로모터에 상보적인 서열이며;
Z는 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이 핵산서열과 상보적인 혼성화 서열을 갖는 UHS(Upstream Hybridization Sequence) 부위이며; 상기 SARS-CoV-2 핵산서열은 DNA 또는 RNA이고;
X, Y 및 Z는 디옥시리보뉴클레오타이드이며;
상기 일반식 II에서,
Ya는 T7 프로모터의 일부 서열이고; Ya는 디옥시리보뉴클레오타이드이며;
상기 제2프로브는 하기 일반식 (III)으로 이루어진 구조를 갖는 프로모터 프로브(promoter probe,PP)이고,
[일반식 III]
3'-Yb-Z'-5'
상기 일반식 (III)에서,
Yb는 존재하지 않거나, T7 프로모터의 일부 서열이고;
Z’은 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이 핵산서열과 상보적인 혼성화 서열을 갖는 DHS(Downstream Hybridization Sequence) 부위이며; 상기 SARS-CoV-2 핵산서열은 DNA 또는 RNA이고;
Yb 및 Z’는 디옥시리보뉴클레오타이드이며;
상기 제1프로브 및 제2프로브는 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이 핵산서열과 혼성화 된 후 중합효소에 의해 전사가 개시되어 시그널을 생성하는 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 Ya 및 Yb는 T7 프로모터의 일부 서열이며, 상기 Ya 및 Yb는 상기 Ya 및 상기 Yb 순서로 연속적으로 배열될 경우 상기 T7 프로모터를 이루고, Ya : Yb 분할 비율은 20:0 내지 15:5 인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 Ya : Yb 분할 비율은 16:4일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 표지는 화학적 표지, 효소 표지, 방사능 표지, 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지 및 금속 표지로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제1프로브의 상기 일반식 I은, Y와 Z 사이에 중첩서열 W를 추가로 포함한 일반식 I'로 변형될 수 있고;
[일반식 I']
5'-X-Y-W-Z-3'
상기 제2프로브의 상기 일반식 III은, Yb와 Z' 사이에 중첩서열 W'를 추가로 포함한 일반식 III'으로 변형될수 있는 것을 특징으로 하는;
[일반식 III']
3'-Yb-W'-Z'-5'
SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 중첩서열 W 및 W'의 길이는 1bp 또는 2bp일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 등온 단일 반응은, 15℃ 내지 50℃ 범위의 일정한 온도에서 수행될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 중합효소는 박테리오파지 T7 RNA 중합 효소, 박테리오파지 T3 중합 효소, 박테리오파지 RNA 중합 효소, 박테리오파지 ΦII 중합 효소, 살모넬라 박테리오파지 sp6 중합 효소, 슈도모나스 박테리오파지 gh-1 중합효소, 대장균(E. coli) RNA 중합효소 홀로효소(holoenzyme), 대장균(E. coli) RNA 중합효소 코어 효소, 인간 RNA 중합효소 I, 인간 RNA 중합효소 II, 인간 RNA 중합효소 III, 인간 미토콘드리아 RNA 중합효소 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 등온 단일 반응은 Tris-HCl, MgCl2, DTT, 스페르미딘, rNTPs, RNase 억제제 및 SSB(Single-Stranded DNA Binding Protein)가 포함된 단일 반응 용액으로 일원화되어 동시 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이의 핵산 서열 부위는 N 유전자 또는 S 유전자 인 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 검출용 등온 단일반응 프로브 세트는 N 유전자에 특이적으로 결합하고, 상기 제1프로브는 서열번호 37, 제2프로브는 서열번호 38로 이루어진 프로브 세트; 및 상기 제1프로브는 서열번호 41, 제2프로브는 서열번호 42로 이루어진 프로브 세트로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 프로브 세트를 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어, 상기 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트는 S 유전자에 특이적으로 결합하고, 상기 제1프로브는 서열번호 45 및 제2프로브는 서열번호 49로 이루어진 프로브 세트를 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 프로브 세트를 포함하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 조성물, 중합효소 및 등온 단일 반응 용액을 포함하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트를 이용하여 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이를 검출하는 방법이전에, 등온 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 등온 핵산 증폭 반응은 RPA(Recombinase Polymerase Amplification)일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 이용한 등온 단일 반응 조건하에서의 현장용 분자 진단 방법을 제공한다.
본 발명은 하나의 튜브 안에서 하나의 효소만으로 신속하고 간편한 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이의 검출이 가능하다. 또한, 프로브의 설계가 간편하며 추가적인 라벨링이 필요 없을 뿐만 아니라, 열처리 만으로 전처리 없는 direct 시스템의 구현이 가능한 등온 핵산 증폭 방법을 제공한다. 또한, 하나의 튜브 안에서 다중 검출(multiplex analysis)이 가능하다.
도 1은 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이 검출을 위한 Split T7 promoter-based isothermal Amplification with RNA Aptamer(이하 "STAR"라고 명명)의 개략도를 나타낸다.
도 2는 분할 T7 프로모터의 다양한 비율에서의 분할 결과를 나타낸다.
도 3은 중첩 길이의 최적화 결과를 나타낸다.
도 4는 3-방향 접합 구조에 bulge 구조를 넣었을 때의 T7 프로모터의 안정성에 관한 결과를 나타낸다.
도 5는 반응조건의 최적화를 위한 버퍼의 조성 중 DTT와 MgCl2의 농도를 나타낸다.
도 6은 스페르미딘과 단일 가닥 DNA 결합 단백질(SSB)의 최적의 농도를 찾기 위해 측정한 형광강도 결과이다.
도 7은 T7 RNA 중합효소 농도별, 반응시간, 반응온도, 냉각 방법에 따른 형광강도 결과를 나타낸다.
도 8은 최적화된 버퍼를 이용한 경우 3-방향 접합 구조와 선형 구조의 T7 프로모터의 전사효율을 비교한 결과이다.
도 9는 3-방향 접합 구조를 확인하기 위한 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 10은 STAR의 각 요소가 없는 형광 스펙트럼 결과이다.
도 11은 STAR 반응 전 등온 핵산 증폭 반응으로 RPA(Recombinase Polymerase Amplification)를 수행한 결과를 나타낸다.
도 12는 SARS-CoV-2 N 유전자의 각 유전자좌위의 검출 감도에 관한 것으로, 도 12A는 SARS-CoV-2 N 유전자의 일부와 표적 RNA의 유전자좌(1-5)의 개략도를 나타내며, 도 12B는 N 유전자의 다른 유전자좌(L1-L5)에 대한 5개 세트의 DNA 프로브를 사용한 STAR의 검출 감도를 보여주는 히트맵, 도 12C는 L2 및 L4에서 STAR의 검출 한계로, STAR 프로브 세트는 각 유전자좌에 대해 100nM이다.
도 13은 감도를 개선하기 위한 두 세트의 STAR 프로브 조합을 나타낸다. 도 13A는 SARS-CoV-2 N 유전자와 다른 인간 코로나바이러스의 두 가지 다른 유전자좌의 개략도로, SARS-CoV-2와 다른 다른 바이러스 RNA 서열의 뉴클레오티드는 회색으로 흐릿하다. 도 13B는 N 유전자 RNA로 설정된 STAR 프로브의 아가로스 겔 전기영동 이미지로, L2 및 L4 프로브 세트의 농도는 각각 500nM이고(a 및 b), L2 및 L4 프로브가 동시에 존재할 때 각 프로브 세트의 농도는 250nM(c)이다. 도 13C는 L2 프로브 세트(100nM), L4 프로브 세트(100nM), L2 및 L4 프로브 세트(50nM+50nM) 모두의 존재 하에서 측정된 형광 신호를 나타내며, 표적 N 유전자 RNA의 농도는 1nM이다. 도 13D는 L2 및 L4에서 STAR 프로브 세트 조합 사용의 검출 한계로, STAR 프로브 세트의 농도는 각각의 다른 유전자좌에서 50nM이다. 도 13E는 2개의 STAR 프로브 세트(L2 및 L4) 사용 시 STAR 분석의 검출 특이성을 나타낸 것으로, SARS-CoV-2 N 유전자 RNA의 농도는 1nM이었고 나머지는 100nM이었으며, STAR 프로브 세트(L2 및 L4)의 농도는 각각 50nM이었다.
도 14는 SARS-CoV-2 D614G 돌연변이 검출을 위한 STAR의 적용을 나타낸 것이다. 도 14A는 SARS-CoV-2의 S 유전자에서 D614G 돌연변이에 대한 STAR 분석의 개략도를 나타내며, 돌연변이 부위는 노란색으로, 야생형 타겟에서 위양성 신호를 피하기 위해 빨간색으로 표시된 불일치 시퀀스를 추가했다. 도 14B는 N4 위치에서 다른 핵염기(A, T, G 및 C)를 사용하여 STAR 후에 얻은 말라카이트 그린(MG) 신호 강도를 나타낸다. 도 14C는 D614G 돌연변이에 대한 STAR의 검출 한계로, 표적 RNA의 농도는 1 nM에서 100 fM 범위이다. 도 14D는 상이한 몰비(0%, 0.1%, 1%, 10%, 50% 및 100%)를 갖는 돌연변이/야생 표적의 혼합물에서 D614G 돌연변이의 검출한 결과를 나타낸다.
도 15는 다중 검출을 위한 시스템을 나타낸다. 도 15A는 SARS-CoV-2 N 유전자 및 D614G 돌연변이의 동시 검출을 위한 one-pot 다중 STAR의 개략도이다. 도 15B는 망고 압타머 및 MG 압타머에 각각 결합하는 TO1-비오틴 및 MG의 정규화된 형광 방출 스펙트럼이다. 도 15C는 N 유전자 및 D614G 돌연변이의 원팟, 다중 검출 결과를 보여주는 히트맵으로, 표적 RNA의 농도는 10nM이다. 도 15D는 다른 농도에서 N 유전자 및 D614G 돌연변이의 one-pot 다중 검출 결과를 나타낸다.
도 2는 분할 T7 프로모터의 다양한 비율에서의 분할 결과를 나타낸다.
도 3은 중첩 길이의 최적화 결과를 나타낸다.
도 4는 3-방향 접합 구조에 bulge 구조를 넣었을 때의 T7 프로모터의 안정성에 관한 결과를 나타낸다.
도 5는 반응조건의 최적화를 위한 버퍼의 조성 중 DTT와 MgCl2의 농도를 나타낸다.
도 6은 스페르미딘과 단일 가닥 DNA 결합 단백질(SSB)의 최적의 농도를 찾기 위해 측정한 형광강도 결과이다.
도 7은 T7 RNA 중합효소 농도별, 반응시간, 반응온도, 냉각 방법에 따른 형광강도 결과를 나타낸다.
도 8은 최적화된 버퍼를 이용한 경우 3-방향 접합 구조와 선형 구조의 T7 프로모터의 전사효율을 비교한 결과이다.
도 9는 3-방향 접합 구조를 확인하기 위한 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 10은 STAR의 각 요소가 없는 형광 스펙트럼 결과이다.
도 11은 STAR 반응 전 등온 핵산 증폭 반응으로 RPA(Recombinase Polymerase Amplification)를 수행한 결과를 나타낸다.
도 12는 SARS-CoV-2 N 유전자의 각 유전자좌위의 검출 감도에 관한 것으로, 도 12A는 SARS-CoV-2 N 유전자의 일부와 표적 RNA의 유전자좌(1-5)의 개략도를 나타내며, 도 12B는 N 유전자의 다른 유전자좌(L1-L5)에 대한 5개 세트의 DNA 프로브를 사용한 STAR의 검출 감도를 보여주는 히트맵, 도 12C는 L2 및 L4에서 STAR의 검출 한계로, STAR 프로브 세트는 각 유전자좌에 대해 100nM이다.
도 13은 감도를 개선하기 위한 두 세트의 STAR 프로브 조합을 나타낸다. 도 13A는 SARS-CoV-2 N 유전자와 다른 인간 코로나바이러스의 두 가지 다른 유전자좌의 개략도로, SARS-CoV-2와 다른 다른 바이러스 RNA 서열의 뉴클레오티드는 회색으로 흐릿하다. 도 13B는 N 유전자 RNA로 설정된 STAR 프로브의 아가로스 겔 전기영동 이미지로, L2 및 L4 프로브 세트의 농도는 각각 500nM이고(a 및 b), L2 및 L4 프로브가 동시에 존재할 때 각 프로브 세트의 농도는 250nM(c)이다. 도 13C는 L2 프로브 세트(100nM), L4 프로브 세트(100nM), L2 및 L4 프로브 세트(50nM+50nM) 모두의 존재 하에서 측정된 형광 신호를 나타내며, 표적 N 유전자 RNA의 농도는 1nM이다. 도 13D는 L2 및 L4에서 STAR 프로브 세트 조합 사용의 검출 한계로, STAR 프로브 세트의 농도는 각각의 다른 유전자좌에서 50nM이다. 도 13E는 2개의 STAR 프로브 세트(L2 및 L4) 사용 시 STAR 분석의 검출 특이성을 나타낸 것으로, SARS-CoV-2 N 유전자 RNA의 농도는 1nM이었고 나머지는 100nM이었으며, STAR 프로브 세트(L2 및 L4)의 농도는 각각 50nM이었다.
도 14는 SARS-CoV-2 D614G 돌연변이 검출을 위한 STAR의 적용을 나타낸 것이다. 도 14A는 SARS-CoV-2의 S 유전자에서 D614G 돌연변이에 대한 STAR 분석의 개략도를 나타내며, 돌연변이 부위는 노란색으로, 야생형 타겟에서 위양성 신호를 피하기 위해 빨간색으로 표시된 불일치 시퀀스를 추가했다. 도 14B는 N4 위치에서 다른 핵염기(A, T, G 및 C)를 사용하여 STAR 후에 얻은 말라카이트 그린(MG) 신호 강도를 나타낸다. 도 14C는 D614G 돌연변이에 대한 STAR의 검출 한계로, 표적 RNA의 농도는 1 nM에서 100 fM 범위이다. 도 14D는 상이한 몰비(0%, 0.1%, 1%, 10%, 50% 및 100%)를 갖는 돌연변이/야생 표적의 혼합물에서 D614G 돌연변이의 검출한 결과를 나타낸다.
도 15는 다중 검출을 위한 시스템을 나타낸다. 도 15A는 SARS-CoV-2 N 유전자 및 D614G 돌연변이의 동시 검출을 위한 one-pot 다중 STAR의 개략도이다. 도 15B는 망고 압타머 및 MG 압타머에 각각 결합하는 TO1-비오틴 및 MG의 정규화된 형광 방출 스펙트럼이다. 도 15C는 N 유전자 및 D614G 돌연변이의 원팟, 다중 검출 결과를 보여주는 히트맵으로, 표적 RNA의 농도는 10nM이다. 도 15D는 다른 농도에서 N 유전자 및 D614G 돌연변이의 one-pot 다중 검출 결과를 나타낸다.
상술한 바와 같이, 등온 증폭 반응을 이용하면서도, 두개의 효소를 이용하는 경우 비특이적 신호를 발생시키고, one-step 반응이 불가능하며 반응시간도 오래 걸린다는 단점을 극복하고자 하는 필요성이 대두되었다. 본 발명자들은 기존 SMART 분석의 단점을 극복하면서 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이를 신속하게 검출할 수 있는 새로운 등온 증폭 기술을 개발하기 위해 노력한 결과, SARS-CoV-2를 신속하게 분석할 수 있는 3-방향 접합 기반 신규 등온 증폭 기술을 발명하였다. 본 발명에 따른 발명에서는 T7 프로모터 서열의 분할 비율의 조절을 통하여 전사 반응이 효과적으로 일어나도록 설계하였으며, 이를 기반으로, 표적하는 SARS-CoV-2가 존재할 경우에만 3-방향 접합 구조 기반의 T7 프로모터가 형성되고, 이를 통해 하나의 튜브안에서 중합효소 하나만으로 증폭된 신호를 얻을 수 있도록 하였다. 또한, 추가적인 민감도 상승을 위해, SARS-CoV-2의 여러 영역에 결합할 수 있도록 추가적인 3-방향 접합 구조를 설계하였으며, 이를 통해 민감도 상승을 이루어 낼 수 있었다. 본 발명은 SARS-CoV-2의 돌연변이가 발생한 경우에도 매우 특이적으로 서열의 변화를 용이하게 구별할 수 있으며, SARS-CoV-2를 그대로 증폭하는 것이 아닌 종속적인 서열을 증폭하는 특성을 가지며, 이를 바탕으로 각기 다른 두 종류의 light-up RNA 압타머를 디자인하여 하나의 튜브에서 두개 이상의 분자를 동시에 확인할 수 있는 다중 분석(multiplex analysis)을 구현하였다. 본 발명을 이용하는 경우, 기존 방식의 발명보다 간편, 신속하며 민감하게 검출할 수 있어 우수하다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 제1프로브 및 제2프로브를 포함하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응(isothermal one-pot reaction) 프로브 세트로서,
상기 제1프로브는 하기 일반식 I 및 II를 포함하는 구조를 갖는 프로모터 프로브(promoter probe, PP)이고,
[일반식 I]
5'-X-Y-Z-3'
[일반식 II]
3'-Ya-5'
상기 일반식 I에서,
X는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 하나의 표지(label) 또는 다수의 표지를 포함하는 상호작용적 표지 시스템을 갖는 압타머 서열 부위이고;
Y는 T7 프로모터에 상보적인 서열이며;
Z는 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이 핵산서열과 상보적인 혼성화 서열을 갖는 UHS(Upstream Hybridization Sequence) 부위이며; 상기 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이 핵산서열은 DNA 또는 RNA이고;
X, Y 및 Z는 디옥시리보뉴클레오타이드이며;
상기 일반식 II에서,
Ya는 T7 프로모터의 일부 서열이고; Ya는 디옥시리보뉴클레오타이드이며;
상기 제2프로브는 하기 일반식 (III)으로 이루어진 구조를 갖는 프로모터 프로브(promoter probe,PP)이고,
[일반식 III]
3'-Yb-Z'-5'
상기 일반식 (III)에서,
Yb는 존재하지 않거나, T7 프로모터의 일부 서열이고;
Z’은 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이 핵산서열과 상보적인 혼성화 서열을 갖는 DHS(Downstream Hybridization Sequence) 부위이며; 상기 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이 핵산서열은 DNA 또는 RNA이고;
Yb 및 Z’는 디옥시리보뉴클레오타이드이며;
상기 제1프로브 및 제2프로브는 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이 핵산서열과 혼성화 된 후 중합효소에 의해 전사가 개시되어 시그널을 생성하는 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 제공한다.
본 발명의 프로브 세트의 제1프로브는 각각 한 올리고뉴클레오타이드 분자 안에 3개의 다른 부위(portion)를 포함하는 구조와 다른 한 올리고뉴클레오타이드 분자를 포함한다: 검출 가능한 시그널을 발생시키는 하나의 표지(label) 또는 다수의 표지를 포함하는 상호작용적 표지 시스템을 갖는 압타머 서열 부위인 X, T7 프로모터에 상보적인 서열인 Y, SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이와 혼성화되는 부위인 Z; Y와 상보적인 T7 프로모터의 일부 서열인 Ya.
또한, 본 발명의 프로브 세트의 제2프로브도 한 올리고뉴클레오타이드 분자 안에 1개 또는 2개의 고유한 다른 부위를 포함하는 구조를 갖는다: Y와 상보적이고 T7 프로모터의 일부 서열이며, Ya와 연속적인 서열을 갖는 Yb; SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이와 혼성화되는 부위인 Z'. Yb는 후술하는 분할 비율에 따라 20:0인 경우는 존재하지 않을 수 있다.
이러한 구조는 본 발명의 프로브 세트가 일원화된 단계로 등온 단일 반응 조건 하에서 단시간에 높은 검출 효과를 나타내는 프로브가 되도록 한다.
본 발명에서 용어 "프로브"는 하나 이상 유형의 화학 결합을 통하여, 일반적으로 상보적 염기쌍 형성을 통하여, 보통 수소 결합 형성을 통하여 상보적인 서열의 타겟 핵산에 결합하고 따라서 이중나선(duplex) 구조를 형성할 수 있는 핵산이다. 프로브는 "프로브 결합 부위"에 결합 또는 혼성화한다. 특히, 일단 프로브가 프로브의 상보적인 타겟에 혼성화하면 프로브의 검출을 용이하게 하도록 프로브는 검출가능한 표지로 표지될 수 있다. 그러나 대안적으로, 프로브는 표지화되지 않을 수 있지만, 표지화된 리간드와의 특이적 결합에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 프로브는 크기가 상당히 다양할 수 있다. 일반적으로 프로브는 길이가 적어도 7 내지 15개 뉴클레오타이드다. 다른 프로브는 길이가 적어도 20, 30 또는 40개 뉴클레오타이드다. 또 다른 프로브는 다소 더 길며, 길이가 적어도 50, 60, 70, 80, 또는 90개 뉴클레오타이드다. 또 다른 프로브는 더욱 더 길며, 길이가 적어도 100, 150, 200개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드다. 프로브는 또한 상기 값(예컨대, 길이 가 15~20개 뉴클레오타이드)의 임의의 값으로 한정된 임의의 범위 내에 있는 임의의 길이의 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드의 올리고머를 의미한다. 본원에 사용된 용어 "핵산"은 뉴클레오타이드의 중합체를 의미한다. 본원에 사용된 용어 "서열"은 올리고뉴클레오타이드 또는 핵산의 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 올리고뉴클레오타이드 또는 핵산은 DNA, RNA, 또는 그의 유사체(예컨대, 포스포로티오에이트 유사체)일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 또는 핵산은 개질된 염기 및/또는 골격(예컨대, 개질된 포스페이트 연결부 또는 개질된 당 모이어티)도 또한 포함할 수 있다. 핵산에 안정성 및/또는 다른 이점을 부여하는 합성 골격의 비-제한적 예시는 포스포로티오에이트 연결부, 펩타이드 핵산, 잠금 핵산, 자일로스핵산 또는 그의 유사체를 포함할 수 있다.
용어 핵산은, 예를 들어 유전체 DNA; 상보 DNA(cDNA)(이는 보통 전령 RNA(mRNA)의 역전사 또는 증폭으로 얻어지는 mRNA의 DNA 표현임); 합성으로 또는 증폭으로 생성된 DNA 분자; 및 mRNA를 포함한 임의의 형태의 DNA 또는 RNA를 포함한다.
용어 핵산은 단일 가닥 분자뿐만 아니라 이중 또는 삼중 가닥 핵산을 포함한다. 이중 또는 삼중 가닥 핵산에서, 핵산 가닥은 동연(coextensive)일 필요는 없다(즉, 이중 가닥 핵산은 양 가닥의 전체 길이를 따라 이중 가닥일필요는 없다).
용어 핵산은 또한 메틸화 및/또는 캡핑과 같은 것에 의한 이의 임의의 화학적 개질을 포함한다. 핵산 개질은 개별적인 핵산 염기 또는 핵산 전체에 추가적인 전하, 분극률, 수소 결합, 정전기 상호작용, 및 기능성을 포함하는 화학기의 첨가를 포함할 수 있다. 이러한 개질은 2' 위치 당 개질, 5 위치 피리미딘 개질, 8 위치 퓨린개질, 시토신 환외(exocyclic) 아민에서의 개질, 5-브로모-우라실의 치환, 주쇄 개질, 이소염기 이소시티딘 및 이소구아니딘과 같은 특이 염기 쌍 조합 등과 같은 염기 개질을 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 프로브 디자인은 두개의 단일 가닥 DNA 프로브가 타겟 인식 부위가 노출되도록 설계되어 등온에서 SARS-CoV-2와 프로브 세트의 혼성화를 가능하게 한다.
본 발명에서 용어 "혼성화"는 상보적 염기서열을 가진 단일가닥 핵산들 간 수소결합에 의해 이중가닥 핵산이 형성되는 것을 의미하며, 어닐링(annealing)과 유사한 의미로 사용된다. 다만 조금 더 넓은 의미에서, 혼성화는 두 개의 단일가닥 간 염기서열이 완전히 상보적인 경우(perfect match)와 더불어 예외적으로 일부의 염기서열이 상보적이지 않은 경우(mismatch)까지 포함한다.
본 발명에서 용어 “상보”는 2개의 뉴클레오타이드 사이의 정확한 쌍형성에 대한 능력을 지칭한다. 즉, 핵산의 주어진 위치에서 뉴클레오타이드가 다른 핵산의 뉴클레오타이드와 수소 결합을 할 수 있다면, 2개의 핵산은 그 위치에서 서로 상보적인 것으로 여겨진다. 뉴클레오타이드의 일부만이 결합하여 2개의 단일 가닥 핵산 분자 사이의 상보성은 “부분적”일 수 있거나, 또는 전체 상보성이 단일 가닥 분자 사이에 존재할 때 상보성은 완전할 수 있다. 핵산 가닥 사이의 상보성의 정도는 핵산 가닥 사이의 혼성화의 효율 및 강도에 상당한 영향을 미친다.
제1프로브의 Z는 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이의 UHS(Upstream Hybridization Sequence)에 결합하며, T7 프로모터와 상보적인 서열을 지니고, 압타머 서열을 갖고 있다. 제1프로브의 일반식 II에 포함되는 Ya는 T7 프로모터의 일부 서열에 해당하며, 제2프로브의 일반식 III에서의 Yb 또한 T7 프로모터의 나머지 일부 서열이며, Ya와 Yb는 연속적인 서열로 하나의 T7 프로모터를 이루며, 분할된 두개의 조각에 해당한다. SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이의 존재 하에, 프로브 세트는 3방향 접합 구조를 형성하고 닉 부위(nick site)를 갖는 이중 가닥 T7 프로모터가 완성된다. 따라서, SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이가 존재하지 않는 경우에는 T7 프로모터의 서열이 Ya와 Yb로 분할되어 있으므로, 중합효소가 결합할 수 없으며, SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이가 존재하는 경우에만 중합효소가 결합하여 제1프로브의 압타머 부위의 전사가 개시된다(도 1참조).
제1프로브의 압타머 서열부위 X에 의해 특정 물질에 반응하여 시그널을 생성하므로, 최종 생산물을 확인할 수 있다.
본 발명에 있어서, 리포터로 사용되는 "압타머(Aptamer)"는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 타겟 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형 핵산)이다.
SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)라는 압타머 발굴 기술이 개발된 이후, 저분자 유기물, 펩타이드, 막 단백질까지 다양한 타겟분자에 결합할 수 있는 압타머들이 계속해서 발굴되어 왔다. 압타머는 고유의 높은 친화성(보통 pM 수준)과 특이성으로 타겟분자에 결합할 수 있다는 특성 때문에 자주 단일 항체와 비교가 되고, 특히 "화학 항체"라고 할 만큼 대체항체로서의 높은 가능성이 있다. 또한 결합하는 물질에 따라 흡수하는 파장대와 방출되는 파장대가 달라 형광을 발현하는 등의 방법으로 압타머와 특정 화학 분자의 결합을 확인할 수 있다.
본 발명의 압타머 및 상기 압타머와 상호 작용하는 반응 물질은 목적 효과로서 검출 가능한 시그널을 발생할 수 있는 한, 어떠한 종류의 압타머 및 반응 물질을 이용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 제1프로브 및 제2프로브가 상기 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이와 각각 혼성화 할 때, 제1프로브 및 제2프로브는 서로 바로 근접한 (immediately adjacent) 위치에 위치한다.
제1프로브의 Y와; 제1프로브의 Ya 및 제2프로브의 Yb가 혼성화되며, 하나의 T7 프로모터 구조가 형성된다. 본 명세서에서 제1프로브 및 제2프로브의 혼성화 위치를 언급하면서 사용되는 용어 "근접한(adjacent)"은 상기 두 프로브에서 Ya와 Yb의 말단이 서로 연결될 수 있도록 위치하였으며, Ya와 Yb가 Y와 혼성화될 수 있을 정도로 충분히 인접해 있는 것을 의미한다.
상기 프로브는 상기 검출 가능한 시그널을 발생시키는 하나의 표지 또는 다수의 표지를 포함하는 상호작용적 표지 시스템을 갖는 압타머 서열 부위 및 상기 타겟 분자와 결합 또는 연결되는 부위 사이에 결합된 링커(linker) 영역을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 링커 영역은 프로브의 일 말단에 타겟 분자와 결합 또는 연결되는 부위에 도달하기 위해 도입될 수 있으며, 상기 링커 영역의 구체적인 종류는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 상기 링커 영역은 4 내지 10개의 짧은 핵산 서열을 갖는 뉴클레오타이드일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 프로브 세트에 있어서, 상기 Ya 및 Yb는 T7 프로모터의 일부 서열이며, 상기 Ya 및 Yb는 상기 Ya 및 상기 Yb 순서로 연속적으로 배열될 경우 상기 T7 프로모터를 이루고, Ya : Yb 분할 비율은 20:0 내지 15:5 일 수 있다.
T7 프로모터 서열이 제1프로브와 제2프로브에 분할되어 존재하기 때문에 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이가 존재하지 않는 경우에는 T7 프로모터에 중합효소가 결합하여 전사가 개시될 수 없으며, 최종적으로 제1프로브 및 제2프로브의 전사 결과물 상의 표지로부터 나오는 시그널이 생성되지 않으므로, SARS-CoV-2및/또는 이의 돌연변이의 검출은 달성되지 않는다. SARS-CoV-2및/또는 이의 돌연변이가 존재하는 경우, 제1프로브의 Ya와 제2프로브의 Yb가 연속적으로 배열되어 T7 프로모터를 이루고, 중합효소에 의해 전사과정이 개시된다. 전사과정이 개시되는 경우, 상기 압타머 서열을 함유하는 제1프로브의 X의 산물이 생성될 수 있다.
기존 SMART(Signal mediated amplification of RNA technology) 기술은 DNA 중합효소를 이용하고, 그 이후 RNA 중합효소를 순차적으로 이용하여 2개의 효소를 이용해야 했으며, 이에 따라 두개의 효소가 같이 존재하는 경우 비특이적인 신호를 발생시키므로, one-step 반응이 불가능하고, 반응 시간 또한 오래 걸렸었다. 다만, 본 발명은 T7 RNA 프로모터를 DNA 중합효소에 의해 생성하는 단계를 생략하였으며, 대신 T7 프로모터를 분할하여 타겟이 존재하지 않는 경우에는 T7 프로모터 자체가 생성되지 않도록 하였다. 이를 통해 하나의 중합효소만으로도 타겟 분자를 검출할 수 있는 시스템을 도입하였으며, 하나의 효소를 사용하므로 비특이적인 신호의 발생이 적고, 반응 시간 짧아졌으므로, 신속한 반응이 가능하다.
즉, 본 발명의 핵심은 3방향 접합 구조를 유도하여 SARS-CoV-2및/또는 이의 돌연변이의 존재 하에서 분할 T7 프로모터의 효과적인 형성이기 때문에, 본 발명에 있어서, 기존의 T7 프로모터를 분할하여 각 비율에 따른 전사 효율을 분석하였다. 구체적으로, 본 발명의 일실시예에 있어서, 실시예 1-1에서는 T7 프로모터 형성을 조절하기 위해서 T7 프로모터의 5' 말단 부분부터 순차적으로 닉 부위를 삽입하여 다양한 비율로 분할된 T7 프로모터를 제작하였다. 압타머의 상보적 서열을 주형에 배치하여 전사 후, 생성된 산물의 전사 반응을 모니터링 하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, 5' 말단 부위부터 0:20부터 5:15까지 순차적으로 삽입한 결과, 3:17 비율 이후에는 SP1의 부재로 인해 형광 값이 급격히 낮아졌으며, 이는 T7 프로모터 5'쪽의 3-뉴클레오타이드 부분이 T7 RNA 중합효소가 T7 프로모터를 특이적으로 인식하는데 중요함을 나타내며, 5:15의 경우 SP1와 SP2가 모두 존재하는 경우에도 전사가 거의 진행되지 않는 것을 확인하였으며, 이로 보아 T7 프로모터의 5'쪽의 5-mer 이후 닉 부위가 존재하면 T7 RNA 중합효소가 정상적으로 인식하지 못함을 알 수 있다. 3방향 접합구조 형성을 통하여 온전한 이중가닥 형태의 T7 프로모터를 이루기 위해서는 5' 말단 부위로부터 4:16 분할 비가 가장 적합하다는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 일실시예에 있어서, 분할비율은 적절하게 조절될 수 있으며, 가장 바람직하게는 Ya : Yb 분할 비율은 16:4일 수 있다.
본 발명의 프로브 세트에 있어서, 상기 표지는 화학적 표지, 효소 표지, 방사능 표지, 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지 및 금속 표지로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 제1프로브의 상기 일반식 I은, Y와 Z 사이에 중첩서열 W를 추가로 포함한 일반식 I'로 변형될 수 있고;
[일반식 I']
5'-X-Y-W-Z-3'
상기 제2프로브의 상기 일반식 III은, Yb와 Z' 사이에 중첩서열 W'를 추가로 포함한 일반식 III'으로 변형될수 있는 것을 특징으로 하는;
[일반식 III']
3'-Yb-W'-Z'-5'
SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트일 수 있다.
상기 중첩서열은 SARS-CoV-2및/또는 이의 돌연변이가 존재하는 경우, 3방향 접합 구조가 너무 짧은 중첩으로 인해 완벽히 이루어지지 않아 T7 프로모터가 형성이 안되어 전사가 효과적으로 이루어지지 않는 점을 극복하기 위하여 도입되었다. 중첩서열 W와 W'은 서로 상보적이다.
따라서, 바람직한 일실시예에 있어서, 구체적으로, 실시예 1-2에서 상기 Ya:Yb의 16:4 비율의 T7 프로모터를 3방향 접합 구조체에 적용시키기 위한 구조 최적화를 진행하였다. T7 프로모터 3'쪽의 16-뉴클레오타이드는 단일 주형(Signal template, ST)에 상보적으로 결합하며 보편적이다. SARS-CoV-2및/또는 이의 돌연변이가 존재하는 경우에만 ST와 분할된 T7-16(Split T7-16, ST-16)으로 구성된 첫 번째 프로브와 두 번째 프로브(Split T7-4, ST-4)를 결합하여 닉 부위가 있는 완전한 T7 프로모터를 형성해야 하므로, 중첩서열 부분의 Tm value가 가장 중요 요인이며 추가 중첩서열(0~4bp)을 배치하여 Tm value를 조절하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 중첩서열(N=0)이 T7 프로모터의 4bp일 경우 SARS-CoV-2가 존재하지 않을 때 형광이 나오지 않아 구조를 형성하지 않는 목적에 적합하나, SARS-CoV-2가 존재할 때에 3방향 구조가 너무 짧은 중첩으로 인해 완벽히 이루어지지 않아 T7 프로모터가 형성이 안되어 전사가 효과적으로 수행되지 않음을 확인할 수 있다. 중첩 서열을 1bp이상 추가한 경우(N=1), SARS-CoV-2가 존재할 때만 높은 형광 값을 나타냄을 확인하였다. 이를 통해 3-way 접합 구조를 안정적으로 형성하고 전사 반응을 유도하기 위해서는 T7 프로모터부터의 4bp 외에 적어도 1bp의 중첩이 필요함을 확인했다. 추가된 중첩 서열이 3bp를 초과하는 경우, SARS-CoV-2가 존재하지 않아도 비특이적인 전사가 진행되므로, 적절한 추가 중첩서열은 2bp로 설정되었고, 전체 중첩 영역은 6bp(T7 프로모터로부터 4bp)로 설정되었다. 또한, 실시예 1-2에서 확인한 바와 같이, 상보적이지 않은 경우, 3-방향 접합 구조에 bulge가 형성되어 구조의 안정성이 떨어질 수 있다(도 4).
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 중첩서열 W 및 W'의 길이는 1bp 또는 2bp일 수 있다.
본 발명의 프로브 세트에 있어서, 상기 등온 단일 반응은, 15℃ 내지 50℃ 범위의 일정한 온도에서 수행될 수 있다. 상기 15℃ 내지 50℃ 범위의 온도는 당업계에 효소가 작용하는 것으로 알려진 온도로서, 본 발명의 목적 효과를 획득할 수 있는 한, 이에 제한되지 않는다. 다만, 본 발명의 실시예 1-3에서 확인한 바와 같이, 본 발명의 반응은 37℃인 경우, 효율이 가장 좋은 것을 확인하였다(도 7C). 따라서, 상기 등온 단일 반응의 일정한 온도는 바람직하게는 34℃ 내지 40℃이다.
본 발명의 프로브 세트에 있어서, 상기 중합효소는 박테리오파지 T7 RNA 중합 효소, 박테리오파지 T3 중합 효소, 박테리오파지 RNA 중합 효소, 박테리오파지 ΦII 중합 효소, 살모넬라 박테리오파지 sp6 중합 효소, 슈도모나스 박테리오파지 gh-1 중합효소, 대장균(E. coli) RNA 중합효소 홀로효소(holoenzyme), 대장균(E. coli) RNA 중합효소 코어 효소, 인간 RNA 중합효소 I, 인간 RNA 중합효소 II, 인간 RNA 중합효소 III, 인간 미토콘드리아 RNA 중합효소 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 중합효소는 박테리오파지 T7 RNA 중합효소를 이용하였다.
본 발명의 프로브 세트에 있어서, 상기 등온 단일 반응은 Tris-HCl, MgCl2, DTT, 스페르미딘, rNTPs, RNase 억제제 및 SSB(Single-Stranded DNA Binding Protein)가 포함된 단일 반응 용액으로 일원화되어 동시 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
구체적으로, 일 실시예에 있어서 실시예 1-3에서는 제안된 프로브세트의 최상의 성능을 얻기 위해 버퍼, 효소, 반응 시간 및 반응 온도에 대한 최적화 실험을 수행하였다.
본 발명에서, 상기 단일 반응 용액은 바람직하게는, 1 내지 50mM의 MgCl2, 0.1 내지 10mM의 DTT, 0.1 내지 10mM의 스페르미딘, 1 내지 100ng/μL의 단일 가닥 DNA 결합 단백질(SSB), 1 내지 100U의 T7 RNA 중합효소를 포함하며, 보다 바람직하게는 1 내지 30mM의 MgCl2, 0.5 내지 5mM의 DTT, 1 내지 5mM의 스페르미딘, 10 내지 50ng/μL의 단일 가닥 DNA 결합 단백질(SSB), 10 내지 50U의 T7 RNA 중합효소를 포함하고, 가장 바람직하게는 10mM의 MgCl2, 1.5mM의 DTT, 3mM의 스페르미딘, 20ng/μL의 단일 가닥 DNA 결합 단백질(SSB), 20U의 T7 RNA 중합효소를 포함할 수 있다(도 5 내지 도 7).
본 발명의 프로브 세트에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 상기 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이의 핵산 서열 부위는 N 유전자 또는 S 유전자 인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 프로브 세트에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 검출용 등온 단일반응 프로브 세트는 N 유전자에 특이적으로 결합하고, 상기 제1프로브는 서열번호 37, 제2프로브는 서열번호 38로 이루어진 프로브 세트; 및 상기 제1프로브는 서열번호 41, 제2프로브는 서열번호 42로 이루어진 프로브 세트로 이루어진 군에서 선택되는 1종을 포함하는 프로브 세트일 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 실시예 2 및 3에서는 SARS-CoV-2의 N 유전자를 타겟 물질로 하여 N 유전자 내의 서로 다른 부위를 타겟으로 검출용 프로브를 설계하였다. 그 결과, L2, L4로 표시되는 두 유전좌위를 대상으로 하는 프로브를 디자인하였으며, 두개의 프로브가 타겟 핵산서열의 각 영역에 특이적으로 결합하는 것으로 나타났다(도 12 참조). L2에 결합하는 제1프로브는 서열번호 37, 제2프로브는 서열번호 38로 이루어진 프로브 세트이며, L4에 결합하는 제1프로브는 서열번호 41, 제2프로브는 서열번호 42로 이루어진 프로브 세트이다. 이를 각각 이용하는 경우, 정량적으로 100fM까지 검출이 가능함을 나타낸다(도 12C).
나아가, L2와 L4에 동시에 결합하는 프로브를 동시에 처리한 경우, 하나의 프로브 세트를 사용한 경우보다 형광강도가 증가함을 확인하였다(도 13C). 따라서, 타겟하는 SARS-CoV-2 또는 이의 돌연변이 RNA 농도가 낮은 제한된 상황에서 신호 개선을 위한 방법으로 사용될 수 있다.
한편, 바이러스의 세포 내 침입 시 중요한 역할을 하는 스파이크 단백질의 614번 아미노산을 아스파트산 (D)에서 글리신 (G)로 바뀐 G형의 바이러스는 3월 이후 유럽과 미국에서 급격히 증가해 현재는 거의 대부분 지역에서 나타나고 있다. 최근 보고된 바에 따르면 70여개 넘는 코로나바이러스 변이가 발생한 것으로 확인되었고, 전파력이 증가된 변이가 8개(D614G 등)로 S형(S 단백질의 614번위치의 아미노산이 D), G형(S 단백질의 614번 위치의 아미노산이 G) 등이 확인되었다.
본 발명에서는 D614G 돌연변이에 대해서 검출을 시행하였으나, 이에 제한되지 않는다. 타겟이 정해지는 경우 프로그래밍을 통해 프로브 서열을 조절하여 다양한 돌연변이의 검출이 가능하다.
돌연변이 검출에 있어, 4번째 위치(N4)에서 상이한 핵염기들(A, T, G, 및 C)을 평가하여 야생 타겟으로부터 돌연변이체(D614G)의 효과적인 구별을 부여하는 최상의 것을 찾아내었다. 그 결과, 도 14B의 결과는 N4 위치의 G가 돌연변이 타겟(D614G)의 존재 하에 높은 형광 신호를 생성하면서 야생 타겟의 존재 하에 백그라운드 노이즈를 최소화한다는 것을 나타냈다.
본 발명의 프로브 세트에 있어서, 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트의 제1프로브는 서열번호 45 내지 48 중 어느 하나일 수 있고, 제2프로브는 서열번호 49로 이루어진 프로브 세트일 수 있다. 바람직하게는 상기 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트는 S 유전자에 특이적으로 결합하고, 상기 제1프로브는 서열번호 45 및 제2프로브는 서열번호 49로 이루어진 프로브 세트일 수 있다.
뿐만 아니라, 하나의 튜브에서 SARS-CoV-2의 D614G 돌연변이 및 N 유전자의 동시 검출을 테스트하였으며, 여기서 망고 압타머 및 말라카이트 그린 압타머는 각각 SARS-CoV-2의 N 유전자 및 D614G가 간섭 없이 형광을 방출하였다(도 15C). 100 fM까지 N 유전자와 D614G에 대한 타겟을 동시에 분석할 수 있어, 매우 민감하게 검출이 가능함을 확인하였다(도 15D). 따라서, 본 발명의 프로브 세트를 이용하는 경우 SARS-CoV-2 및 돌연변이의 민감한 검출이 가능하다.
본 발명은 또한 상기 프로브 세트를 포함하는 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 조성물을 제공한다.
SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 조성물은 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이와 특이적으로 결합하는 핵산서열, 펩타이드 외에 타겟 분자의 검출 및/또는 분석에 일반적으로 사용되는 도구 및/또는 시약을 더 포함할 수 있다. 이러한 도구나 시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함될 수 있다. 표지물질이 형광물질인 경우에는 형광 세기를 측정하는 데 필요한 기질 등을 더 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 가용성 담체, 예를 들어, 당업계에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액(예를 들어, PBS 등); 불용성 담체, 예를 들어, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드 등; 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및/또는 이들의 조합이 포함될 수 있다.
본 발명은 또한 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 조성물, 중합효소 및 등온 단일 반응 용액을 포함하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 키트를 제공한다.
본 명세서에서 상술한 본 발명의 키트는 추가적으로, 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 효소, 다양한 버퍼 및 시약을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 양성 대조군 및 음성 대조군 반응을 실시하는 데 필수한 시약을 포함할 수 있다. 어떤 하나의 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 키트는 상기 서술된 본 발명의 프로브 세트에 의한 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출을 실시하기 위하여 제작되기 때문에, 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
또한, 본 발명은 상기 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트를 이용하여 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이를 검출하는 방법을 제공하며, 구체적으로 다음의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 샘플에, 본 발명의 제1프로브 및 제2프로브로 구성되는 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일 반응(isothermal one-pot reaction) 프로브 세트를 처리하여 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이와 결합 또는 혼성화시키는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 혼성화 산물에 중합효소를 처리하여 전사를 개시시키는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 전사 산물에 압타머-반응 물질을 처리하여 전사 산물 내 압타머의 시그널 생성을 검출하는 단계.
이때, 상기 단계 (c)의 시그널 생성은 샘플 중 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이의 존재를 나타내는 것을 특징으로 한다.
따라서, 본 발명의 프로브 세트를 이용하는 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이를 검출하는 방법은 혼성화 단계, 전사 반응, 압타머의 시그널 반응까지 동시에 일어나도록 설계된 것이며, 본 발명의 (a) 내지 (c)단계는 하나의 용기 내에서 동시에 수행 가능하다.
또한, 최종 신호 확인에 사용되는 압타머는 말라카이트 그린 압타머로 제한하지 않으며 어떠한 종류의 RNA 기반의 형광 압타머도 사용 가능하다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이를 검출하는 방법 이전에, 등온 핵산 증폭 반응을 수행할 수 있다.
등온 핵산 증폭 반응의 종류는 특별히 제한되지 않지만, 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 등온 핵산 증폭 반응은 RPA(Recombinase Polymerase Amplification)일 수 있다.
본 명세서에 있어서 용어 "재조합-중합효소 증폭법"은 DNA 및 RNA 증폭을 확인할 수 있는 기술을 의미하며, 기존 PCR 과는 다르게 DNA 결합 단백질과 재조합효소(recombinase)를 이용하여 빠르고 정확하게 타겟 서열(target sequence)을 증폭시킬 수 있는 기술이다. RPA 방법은 중온성 중합효소(mesophilic polymerase)를 이용하여 등온 조건에서도 증폭이 가능하므로, 특별한 장비 없이 등온 장치만 있으면 단시간 안에 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이를 검출할 수 있는 장점이 있다.
상기 (a) 단계 이전에 RPA를 실시하면, 본 발명의 STAR 반응을 진행하였을 때에 비하여 신호가 증폭되는 것을 확인하였다(도 11참조). 따라서, 본 발명과 연계하여 등온 핵산 증폭반응을 수행하여 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이를 더욱 민감하게 검출하는 방법으로 이용할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 프로브 세트를 이용한 현장용 분자 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 명세서에 있어서 "현장용 분자 진단 방법"이란, 의료현장에서 속하게 현장 진단이 가능하며, 세포 내의 분자 수준, 병균의 유전자(RNA, DNA)를 직접 검사하여 정밀하게 진단하는 방법을 의미한다.
상기 현장용 분자 진단 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다:
(a) 샘플에, 제1프로브 및 제2프로브로 구성되는 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일 반응(isothermal one-pot reaction) 프로브 세트를 처리하여 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이와 혼성화시키는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 혼성화 산물에 중합효소를 처리하여 전사를 개시시키는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 전사 산물에 압타머-반응 물질을 처리하여 전사 산물 내 압타머의 시그널 생성을 검출하는 단계.
이때, 상기 단계 (c)의 시그널 생성은 샘플 중 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이의 존재를 나타내는 것을 특징으로 한다.
즉, 본 발명의 프로브 세트를 이용한 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출 방법은 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 탐지를 위한 강력한 진단 방법으로 작용하여 짧은 진단 시간, 높은 감도 및 특이도(specificity) 및 간단한 분석 절차를 제공할 뿐만 아니라, 비싼 기기 및 진단 전문가를 필요로 하지 않으므로, 신속한 대응이 필요한 신종 감염병에 적합한 진단 방법이 될 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[준비예]
시약 및 재료의 준비
모든 DNA 서열은 Bionics(서울, 한국)에 의해 합성되었다. 모든 플라스미드는 Integrated DNA Technology (Skokie, IL, USA)에서 구입했다. T7 RNA 중합효소, RNase 억제제, T4 유전자 32 단백질(단일 가닥 결합 단백질) 및 리보뉴클레오타이드(rNTP) 용액은 Enzynomics(대전, 한국)에서 구입했다. HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit, Monarch RNA Cleanup Kit 및 DNase Ⅰ은 New England Biolabs(Ipswich, GA, USA)에서 구입했다. 박테리아 RNA 키트는 OMNI International(Kennesaw, NY, USA)에서 구입했다. Tris-HCl 및 MgCl2는 Biosesang(성남, 한국)에서 구입했다. 디티오트레이톨(DTT)은 ThermoFisher Scientific(서울, 한국)에서 구입했다. TO1-3PEG-비오틴 형광단(TO1-비오틴)은 Applied Biological Materials(캐나다 리치몬드)에서 구입했다. 말라카이트 그린 클로라이드와 스페르미딘은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입했다. 모든 실험은 RNA 분해를 방지하기 위해 DEPC 처리된 물로 수행되었다.
DNA 올리고뉴클레오타이드의 준비
본 발명에서 이용한 올리고뉴클레오타이드의 서열은 다음과 같다.
| DNA Probe | Sequence (5'→3') | 서열번호 |
| Split promoter template | GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTACTTA AAA ATC CCG GCC AGA TTT TGC CAA TCA CCC TAT AGT GAG TCG TAT TA GTTAGA TTT TGC CAA TCA | 1 |
| Split promoter 1-0 | TTGGCAAAATCTAAC | 2 |
| Split promoter 2-20 | TAATACGACTCACTATAGGG | 3 |
| Split promoter 1-1 | TTGGCAAAATCTAACT | 4 |
| Split promoter 2-19 | AATACGACTCACTATAGGG | 5 |
| Split promoter 1-2 | TTGGCAAAATCTAACTA | 6 |
| Split promoter 2-18 | ATACGACTCACTATAGGG | 7 |
| Split promoter 1-3 | TTGGCAAAATCTAACTAA | 8 |
| Split promoter 2-17 | TACGACTCACTATAGGG | 9 |
| Split promoter 1-4 | TTGGCAAAATCTAACTAAT | 10 |
| Split promoter 2-16 | ACGACTCACTATAGGG | 11 |
| Split promoter 1-5 | TTGGCAAAATCTAACTAATA | 12 |
| Split promoter 2-15 | CGACTCACTATAGGG | 13 |
| N gene of SARS-CoV-2 | ||
| Split T7-16 (ST-16)-Universal | ACGACTCACTATAGGG | 14 |
| Overlap 0-ST | GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATGCCAGCCATTCTAG | 15 |
| Overlap 0-ST-4 | CAGCATCACCGCCATTAAT | 16 |
| Overlap 1-ST | GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTGCCAGCCATTCTAG | 17 |
| Overlap 1-ST-4 | CAGCATCACCGCCATATAAT | 18 |
| Overlap 2-ST | GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTTGCCAGCCATTCTAG | 19 |
| Overlap 2-ST-4 | CAGCATCACCGCCATAATAAT | 20 |
| Overlap 3-ST | GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTTTGCCAGCCATTCTAG | 21 |
| Overlap 3-ST-4 | CAGCATCACCGCCATAAATAAT | 22 |
| Overlap 4-ST | GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTTTTGCCAGCCATTCTAG | 23 |
| Overlap 4-ST-4 | CAGCATCACCGCCATAAAATAAT | 24 |
| Bulge 1-ST | GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTTTGCCAGCCATTCTAG | 25 |
| Bulge 1-ST-4 | CAGCATCACCGCCATTAATAAT | 26 |
| Bulge 2-ST | GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTTTTGCCAGCCATTCTAG | 27 |
| Bulge 2-ST-4 | CAGCATCACCGCCATTTAATAAT | 28 |
| Bulge 3-ST | GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTTTTTGCCAGCCATTCTAG | 29 |
| Bulge 3-ST-4 | CAGCATCACCGCCATTTTAATAAT | 30 |
| Bulge 4-ST | GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTTTTTTGCCAGCCATTCTAG | 31 |
| Bulge 4-ST-4 | CAGCATCACCGCCATTTTTAATAAT | 32 |
| Bulge 5-ST | GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTTTTTTTGCCAGCCATTCTAG | 33 |
| Bulge 5-ST-4 | CAGCATCACCGCCATTTTTTAATAAT | 34 |
| Locus 1-ST | GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTATGAGGAACGAGAAG | 35 |
| Locus 1-ST-4 | TGTTGCGACTACGTGAATAAT | 36 |
| Locus 2-ST | GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTTGCCAGCCATTCTAG | 37 |
| Locus 2-ST-4 | CAGCATCACCGCCATAATAAT | 38 |
| Locus 3-ST | GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTGCT TTA GTG GCA GTA | 39 |
| Locus 3-ST-4 | TGT GTT ACA TTG TATTAAT | 40 |
| Locus 4-ST | GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTTGTTACATTGTATGC | 41 |
| Locus 4-ST-4 | TCTGCCGAAAGCTTGAATAAT | 42 |
| Locus 5-ST | GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTAGTTCCTGGTCCCCA | 43 |
| Locus 5-ST-4 | GTTCCTTGTCTGATTAATAAT | 44 |
| S gene (D614G Mutation) of SARS-CoV-2 | ||
| Signal template-G | GGATCCATTCGTTACCTGGCTCTCGCCAGTCGGGATCC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTAGTT G ACACCCTGAT | 45 |
| Signal template-A | GGATCCATTCGTTACCTGGCTCTCGCCAGTCGGGATCC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTAGTT A ACACCCTGAT | 46 |
| Signal template-T | GGATCCATTCGTTACCTGGCTCTCGCCAGTCGGGATCC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTAGTT T ACACCCTGAT | 47 |
| Signal template-C | GGATCCATTCGTTACCTGGCTCTCGCCAGTCGGGATCC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTAGTT C ACACCCTGAT | 48 |
| D614G Mutation ST-4 | CAGGGACTTCTGTGCAATAAT | 49 |
| 16S rRNA of Escherichia coli and Staphylococcus aureus | ||
| E. coli L1-ST | GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTCGGGTAACGTCAATG | 50 |
| E. coli L1-ST-4 | CCGGTGCTTCTTCTGAATAAT | 51 |
| E. coli L2-ST | GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTCCACGCTTTCGCACC | 52 |
| E. coli L2-ST-4 | AATCCTGTTTGCTCCAATAAT | 53 |
| S. aureus L1-ST | GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTCGCTTTCGCACATCA | 54 |
| S. aureus L1-ST-4 | CCTGTTTGATCCCCAAATAAT | 55 |
| S. aureus L2-ST | GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTGGACTTAACCCAACA | 56 |
| S. aureus L2-ST-4 | GTTGCGCTCGTTGCGAATAAT | 57 |
밑줄 친 부분은 망고 압타머 서열, MG 압타머 서열을 의미하며, 굵은 글씨로 표시한 부분은 T7 프로모터 부위를 나타낸다. S gene (D614G Mutation) of SARS-CoV-2에서, 밑줄, 굵은글씨, 기울임체로 표시한 부분은 돌연변이 부위를 나타낸다.
| DNA Probe | Sequence (5'→3') | 서열번호 |
| SARS-CoV-2 N gene_IVT-FP | TAATACGACTCACTATAGGGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGT | 58 |
| SARS-CoV-2 N gene_IVT-RP | AACATTGGCCGCAAATTGCA | 59 |
| SARS-CoV-1_IVT-FP | TAATACGACTCACTATAGGGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGC | 60 |
| SARS-CoV-1_IVT-RP | GGTGTGACTTCCATGCCAAT | 61 |
| MERS-CoV_IVT-FP | TAATACGACTCACTATAGGGATAGTCAATCATCTTCAAGA | 62 |
| MERS-CoV_IVT-RP | TTCTGATGGGTAAGTTTAAA | 63 |
| HCoV-229E-FP | TAATACGACTCACTATAGGGGTGCTCCTTCCCGGTCTCAG | 64 |
| HCoV-229E-RP | CTTCCAAAGTTGTGGTCAAG | 65 |
| HCoV-NL63-FP | TAATACGACTCACTATAGGGGCTCTAATAACTCATCTCGT | 66 |
| HCoV-NL63-RP | TCCCCCATATTGTGATTAAA | 67 |
| HCoV-OC43-FP | TAATACGACTCACTATAGGGCTGCTCCTAATTCCAGATCT | 68 |
| HCoV-OC43-RP | AACTCTAATCTTGATCCAAA | 69 |
| HCoV-HKU1-FP | TAATACGACTCACTATAGGGCTGCTTCTAATAGTCGACCA | 70 |
| HCoV-HKU1-RP | AAGTCTAATTTAGAACCAAA | 71 |
| SARS-CoV-2 S gene (G614)_IVT-FP | TAATACGACTCACTATAGGGTCTAACCAGGTTGCTGTTCTTTATCAGG G TGTTAACTGCACAGAAGTCCC | 72 |
| SARS-CoV-2 S gene (G614)_IVT-RP | GGAGTAAGTTGATCTGCATGAATAGCAACAGGGACTTCTGTGCAGTTAAC | 73 |
| SARS-CoV-2 S gene (D614)_IVT-FP | TAATACGACTCACTATAGGGTCTAACCAGGTTGCTGTTCTTTATCAGG A TGTTAACTGCACAGAAGTCCC | 74 |
| SARS-CoV-2 S gene (D614)_IVT-RP | GGAGTAAGTTGATCTGCATGAATAGCAACAGGGACTTCTGTGCAGTTAAC | 75 |
굵은 글씨로 표시한 부분은 T7 프로모터 부위를 나타낸다. SARS-CoV-2 S gene (G614, D614G Mutation)에서, 밑줄, 굵은글씨, 기울임체로 표시한 부분은 돌연변이 부위를 나타낸다.
타겟 RNA 서열의 준비
타겟 RNA는 시험관내 전사를 통해 생성되었다. 본 발명에서 이용한 타겟 RNA의 서열 정보는 [표 3]과 같다.
| Name | Sequence (5'→3') | Size (bp) | 서열번호 |
| SARS-CoV-2 N gene |
GCAGUCAAGCCUCUUCUCGUUCCUCAUCACGUAGUCGCAACAGUUCAAGAAAUUCAACUCCAGGCAGCAGUAGGGGAACUUCUCCUGCUAGAAUGGCUGGCAAUGGCGGUGAUGCUGCUCUUGCUUUGCUGCUGCUUGACAGAUUGAACCAGCUUGAGAGCAAAAUGUCUGGUAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACUGUCACUAAGAAAUCUGCUGCUGAGGCUUCUAAGAAGCCUCGGCAAAAACGUACUGCCACUAAAGCAUACAAUGUAACACAAGCUUUCGGCAGACGUGGUCCAGAACAAACCCAAGGAAAUUUUGGGGACCAGGAACUAAUCAGACAAGGAACUGAUUACAAACAUUGGCCGCAAAUUGCA | 380 | 76 |
| SARS-CoV-1 |
GCAGUCAAGCCUCUUCUCGCUCCUCAUCACGUAGUCGCGGUAAUUCAAGAAAUUCAACUCCUGGCAGCAGUAGGGGAAAUUCUCCUGCUCGAAUGGCUAGCGGAGGUGGUGAAACUGCCCUCGCGCUAUUGCUGCUAGACAGAUUGAACCAGCUUGAGAGCAAAGUUUCUGGUAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACUGUCACUAAGAAAUCUGCUGCUGAGGCAUCUAAAAAGCCUCGCCAAAAACGUACUGCCACAAAACAGUACAACGUCACUCAAGCAUUUGGGAGACGUGGUCCAGAACAAACCCAAGGAAAUUUCGGGGACCAAGACCUAAUCAGACAAGGAACUGAUUACAAACAUUGGCCGCAAAUUGCACAAUUUGCUCCAAGUGCCUCUGCAUUCUUUGGAAUGUCACGCAUUGGCAUGGAAGUCACACC | 442 | 77 |
| MERS-CoV | AUAGUCAAUCAUCUUCAAGAGCCUCUAGCUUAAGCAGAAACUCUUCCAGAUCUAGUUCACAAGGUUCAAGAUCAGGAAACUCUACCCGCGGCACUUCUCCAGGUCCAUCUGGAAUCGGAGCAGUAGGAGGUGAUCUACUUUACCUUGAUCUUCUGAACAGACUACAAGCCCUUGAGUCUGGCAAAGUAAAGCAAUCGCAGCCAAAAGUAAUCACUAAGAAAGAUGCUGCUGCUGCUAAAAAUAAGAUGCGCCACAAGCGCACUUCCACCAAAAGUUUCAACAUGGUGCAAGCUUUUGGUCUUCGCGGACCAGGAGACCUCCAGGGAAACUUUGGUGAUCUUCAAUUGAAUAAACUCGGCACUGAGGACCCACGUUGGCCCCAAAUUGCUGAGCUUGCUCCUACAGCCAGUGCUUUUAUGGGUAUGUCGCAAUUUAAACUUACCCAUCAGAA | 451 | 78 |
| HCoV-229E | GUGCUCCUUCCCGGUCUCAGUCGAGGUCGCAGAGUCGCGGUCGUGGUGAAUCCAAACCUCAAUCUCGGAAUCCUUCAAGUGACAGAAACCAUAACAGUCAGGAUGACAUCAUGAAGGCAGUUGCUGCGGCUCUUAAAUCUUUAGGUUUUGACAAGCCUCAGGAAAAAGAUAAAAAGUCAGCGAAAACGGGUACUCCUAAGCCUUCUCGUAAUCAGAGUCCUGCUUCUUCUCAAACUUCUGCCAAGAGUCUUGCUCGUUCUCAGAGUUCUGAAACAAAAGAACAAAAGCAUGAAAUGCAAAAGCCACGGUGGAAAAGACAGCCUAAUGAUGAUGUGACAUCUAAUGUCACACAAUGUUUUGGCCCCAGAGACCUUGACCACAACUUUGGAAG | 391 | 79 |
| HCoV-NL63 | GCUCUAAUAACUCAUCUCGUGCUAGCAGUCGUUCUUCAACUCGUAACAACUCACGAGACUCUUCUCGUAGCACUUCAAGACAACAGUCUCGCACUCGUUCUGAUUCUAACCAGUCUUCUUCAGAUCUUGUUGCUGCUGUUACUUUGGCUUUAAAGAACUUAGGUUUUGAUAACCAGUCGAAGUCACCUAGUUCUUCUGGUACUUCCACUCCUAAGAAACCUAAUAAGCCUCUUUCUCAACCCAGGGCUGAUAAGCCUUCUCAGUUGAAGAAACCUCGUUGGAAGCGUGUUCCUACCAGAGAGGAAAAUGUUAUUCAGUGCUUUGGUCCUCGUGAUUUUAAUCACAAUAUGGGGGA | 355 | 80 |
| HCoV-OC43 | CUGCUCCUAAUUCCAGAUCUACUUCGCGCACAUCCAGCAGAGCCUCUAGUGCAGGAUCGCGUAGUAGAGCCAAUUCUGGCAAUAGAACCCCUACCUCUGGUGUAACACCUGACAUGGCUGAUCAAAUUGCUAGUCUUGUUCUGGCAAAACUUGGCAAGGAUGCCACUAAACCUCAGCAAGUAACUAAGCAUACUGCCAAAGAAGUCAGACAGAAAAUUUUGAAUAAGCCCCGCCAGAAGAGGAGCCCCAAUAAACAAUGCACUGUUCAGCAGUGUUUUGGUAAGAGAGGCCCUAAUCAGAAUUUUGGUGGUGGAGAAAUGUUAAAACUUGGAACUAGUGACCCACAGUUCCCCAUUCUUGCAGAACUCGCACCCACAGCUGGUGCGUUUUUCUUUGGAUCAAGAUUAGAGUU | 412 | 81 |
| HCoV-HKU1 | CUGCUUCUAAUAGUCGACCAGGUUCACGUUCUCAAUCACGUGGACCCAAUAAUCGUUCAUUAAGUAGAAGUAAUUCUAAUUUUAGACAUUCAGAUUCUAUAGUAAAACCUGAUAUGGCUGAUGAGAUCGCUAAUCUUGUUUUAGCCAAGCUUGGUAAAGAUUCUAAACCUCAGCAAGUCACUAAGCAAAAUGCCAAGGAAAUCAGGCAUAAAAUUUUAACAAAACCUCGCCAAAAGCGAACUCCUAAUAAACAUUGUAAUGUUCAACAGUGUUUUGGUAAAAGAGGACCUUCUCAAAAUUUUGGUAAUGCUGAAAUGUUAAAGCUUGGUACUAAUGAUCCUCAGUUUCCUAUUCUUGCAGAAUUAGCUCCUACACCAGGUGCUUUUUUCUUUGGUUCUAAAUUAGACUU | 409 | 82 |
| SARS-CoV-2 S gene (G614) | UCUAACCAGGUUGCUGUUCUUUAUCAGGGUGUUAACUGCACAGAAGUCCCUGUUGCUAUUCAUGCAGAUCAACUUACUCC | 80 | 83 |
| SARS-CoV-2 S gene (D614) | UCUAACCAGGUUGCUGUUCUUUAUCAGGAUGUUAACUGCACAGAAGUCCCUGUUGCUAUUCAUGCAGAUCAACUUACUCC | 80 | 84 |
| E. coli 16S rRNA | AGACUCCUACGGGAGGCAGCAGUGGGGAAUAUUGCACAAUGGGCGCAAGCCUGAUGCAGCCAUGCNGCGUGUAUGAAGAAGGCCUUCGGGUUGUAAAGUACUUUCAGCGGGGAGGAAGGGAGUAAAGUUAAUACCUUUGCUCAUUGACGUUACCCGCAGAAGAAGCACCGGCUAACUCCGUGCCAGCAGCCGCGGUAAUACGGAGGGUGCAAGCGUUAAUCGGAAUUACUGGGCGUAAAGCGCACGCAGGCGGUUUGUUAAGUCAGAUGUGAAAUCCCCGGGCUCAACCUGGGAACUGCAUCUGAUACUGGCAAGCUUGAGUCUCGUAGAGGGGGGUAGAAUUCCAGGUGUAGCGGUGAAAUGCGUAGAGAUCUGGAGGAAUACCGGUGGCGAAGGCGGCCCCCUGGACGAAGACUGACGCUCAGGUGCGAAAGCGUGGGGAGCAAACAGGAUUAGAUACCCUGGUAGUCCACGCCGUAAACGAUGUCGACUUGGAGGUUGUGCCCUUGAGGCGUGGCUUCCGGANNUAACGCGUUAAGUCGACCGCCUGGGGAGUACGGCCGCAAGGUUAAAACUCAAAUGAAUUGACGGGGGCCGCACAAGCGGUGGA | 610 (327-936) |
85 |
| S. aureus 16S rRNA | CAGAAGAGGAAAGUGGAAUUCCAUGUGUAGCGGUGAAAUGCGCAGAGAUAUGGAGGAACACCAGUGGCGAAGGCGACUUUCUGGUCUGUAACUGACGCUGAUGUGCGAAAGCGUGGGGAUCAAACAGGAUUAGAUACCCUGGUAGUCCACGCCGUAAACGAUGAGUGCUAAGUGUUAGGGGGUUUCCCGCCCCUUAGUGCUGCAGCUAACGCAUUAAGCACUCCGCCUGGGGAGUACGACCGCAAGGUUGAAACUCAAAGGAAUUGACGGGGACCCGCACAAGCGGUGGAGCAUGUGGUUUAAUUCGAAGCAACGCGAAGAACCUUACCAAAUCUUGACAUCCUUUGACAACUCUAGAGAUAGAGCCUUCCCCUUCGGGGGACAAAGUGACAGGUGGUGCAUGGUUGUCGUCAGCUCGUGUCGUGAGAUGUUGGGUUAAGUCCCGCAACGAGCGCAACCCUUAAGCUUAGUUGCCAUCAUUAAGUUGGGCACUCUAAGUUGACUGCCGGUGACAAACCGGAGGA | 524 (666-1188) |
86 |
Split T7 프로모터 기반 DNA 프로브 및 반응 조건의 최적화
1-1.
T7 프로모터 분할 비율
본 발명의 핵심은 3방향 접합 구조를 유도하여 타겟 RNA의 존재 하에서 split T7 프로모터의 효과적인 형성이기 때문에, 우선 본 발명에 앞서 기존의 T7 프로모터를 분할하여 각 비율에 따른 전사 효율을 분석하였다(도 2).
분할 T7 프로모터로 전사를 확인하기 위해 3가지 유형의 DNA 프로브(분할 프로모터 1(Split Promoter 1, SP1), 분할 프로모터 2(Split Promoter 2, SP2) 및 주형(Template, T))를 사용하여 전사 반응을 수행했다. 반응 혼합물은 2 μL의 SP1, SP2 및 T(각각 1 μM), 2 μL 10x T7 버퍼, 0.8 μL T7 RNA 중합효소(2 U/μL), 0.4 μL RNase 억제제(0.08 U/μL), 2 μL TO1-비오틴(1μM), 1μL rNTP(각각 2.5mM) 및 11.8μL DEPC 처리수로 구성되었다. 반응 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 384-웰 플레이트로 옮겼다. 형광 신호는 마이크로 플레이트 리더(SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader, Molecular Devices, USA)를 사용하여 각각 507 nm 및 547 nm의 여기(excitation) 및 방출(emission) 파장에서 측정되었다.
타겟 RNA는 시험관내 전사를 통해 생성되었다. 본 발명에서 이용한 타겟 RNA의 서열 정보 상기 [표 3]과 같다.
구체적으로, 각각의 플라스미드를 PCR 주형으로 하고, T7 프로모터 서열을 포함하는 프라이머를 이용하여 먼저 타겟 RNA 영역에 해당하는 DNA 서열을 생성하였다. 다음으로, 주형 DNA 1μg, 10X 반응 완충액 1.5μL(최종 0.75x), rNTP 1.5μL(각각 7.5mM), T7 RNA 중합효소 Mix 1.5μL, DEPC 처리수 14.5μL로 이루어진 전사 반응 용액을 준비했다. 그 다음 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션하여 전사 반응을 수행하였고, 그 후 DNaseⅠ에 의한 PCR 산물이 분해되었다. RNA 전사 산물은 Monarch RNA Cleanup Kit를 이용하여 정제하고 260 nm 파장에서 나노드롭으로 정량하여 -80 ℃에서 보관한 후 사용하였다.
T7 프로모터 형성을 조절하기 위해서 T7 프로모터의 5' 말단 부분부터 순차적으로 닉 부위를 삽입하여 다양한 비율로 분할 된 T7 프로모터를 제작하였다. 망고 압타머의 상보적 서열을 주형에 배치하여 전사 후, TO-1 비오틴의 형광 신호를 측정함으로써, 전사 반응을 모니터링하였다. 분할된 T7 프로모터 DNA 프로브의 서열은 전술한 [표 1]의 서열번호 1 내지 13의 서열을 사용하였다.
그 결과, 도 3에 도시된 바와 같이, 온전한 T7 프로모터(0:20 분할 비율)에서 T+SP2 또는 T+SP1+SP2의 추가는 높은 형광 신호로 나타나는 효과적인 전사를 초래했다. 1:19 비율의 분할 T7 프로모터를 사용하면 닉 부위가 존재하더라도(T+SP1+SP2) 손상되지 않은 T7 프로모터에 비해 신호가 증가했다. 또한, T+SP2가 존재하는 경우 전사가 효과적으로 발생하였다. 분할 비율을 2:18에서 4:16으로 변경했을 때, 전사는 T+SP1+SP2의 존재 하에서 효과적으로 발생하였다. 3:17 비율 이후에는 SP1의 부재로 인해 형광 값이 급격히 낮아졌으며, 이는 T7 프로모터 5'쪽의 3-뉴클레오타이드 부분이 T7 RNA 중합효소가 T7 프로모터를 특이적으로 인식하는데 중요하다는 것을 의미함을 알 수 있다. 또한, 5:15의 경우 SP1와 SP2가 모두 존재하는 경우에도 전사가 거의 진행되지 않는 것을 확인하였으며, 이로 보아 T7 프로모터의 5'쪽의 5-mer 이후 닉 부위가 존재하면 T7 RNA 중합효소가 정상적으로 인식하지 못함을 의미함을 알 수 있다.
3-방향 접합 구조 형성을 통하여 온전한 이중 가닥 형태의 T7 프로모터를 이루기 위해서는 4:16 분할 비가 가장 적합하다는 것을 확인하였다.
1-2. 중첩서열의 최적화
이후 4:16 비율의 T7 프로모터를 3-방향 접합구조체에 적용시키기 위한 구조 최적화를 진행하였다(도 3).
T7 프로모터 3'쪽의 16-뉴클레오타이드는 Signal template에 상보적으로 결합하며 보편적이다. 타겟 RNA가 존재하는 경우에만 ST 및 ST-16으로 구성된 첫 번째 프로브와 두 번째 프로브(ST-4)를 결합하여 닉 부위가 있는 완전한 T7 프로모터를 형성해야 하므로, 중첩 부분의 Tm value가 가장 중요 요인이며 추가 중첩서열(0~4bp)을 배치하여 Tm value를 조절하였다. 추가 중첩서열 부분은 기본적으로 T7 프로모터 5'부분의 4bp를 포함하고 있다.
중첩처열의 최적화를 진행하기 위한 DNA 프로브의 서열은 전술한 [표 1]의 서열번호 13 내지 24의 서열을 사용하였다.
우선 중첩서열(N=0)이 T7 프로모터의 4bp일 경우 타겟서열이 존재하지 않을 때 형광이 나오지 않아 구조를 형성하지 않는 목적에 적합하였다. 하지만 target이 존재할 때에 3-방향 접합 구조가 너무 짧은 중첩으로 인해 완벽히 이루어지지 않아 T7 프로모터가 형성이 안되어 전사가 효과적으로 수행되지 않음을 확인할 수 있다. 중첩 서열을 1bp이상 추가한 경우(N=1), 타겟서열이 존재할 때만 높은 형광 값을 나타냄을 확인하였다. 이를 통해 3-방향 접합 구조를 안정적으로 형성하고 전사 반응을 유도하기 위해서는 T7 프로모터부터의 4bp 외에 적어도 1bp의 중첩이 필요함을 확인했다. 추가된 중첩 서열이 3bp를 초과하는 경우, 타겟서열이 존재하지 않아도 비특이적인 전사가 진행되었다.
따라서, 적절한 추가 중첩서열은 2bp로 설정되었고, 전체 중첩 영역은 6bp(T7 프로모터로부터 4bp)로 설정되었다.
이후 3-방향 접합 구조에 bulge구조를 넣어 이중가닥 닉 부위가 존재하는 T7 프로모터의 안정성을 실험하였다(도 4). Bulge 구조가 도입된 경우의 ST와 ST-4의 DNA서열은 전술한 [표 1]의 서열번호 25 내지 34의 서열을 사용하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 bulge가 들어가면 오히려 구조의 안정성이 떨어져 타겟 핵산서열이 존재하여도 three way 구조가 제대로 형성되지 못하여 전사가 덜 일어나는 것을 확인하였다. 따라서, 중첩서열은 서로 상보적인 2bp 이외에는 추가하지 않고 bulge 구조가 생성되지 않는 것이 최적화되는 구조임을 확인하였다.
1-3. 반응 조건의 최적화
제안된 STAR의 최상의 성능을 얻기 위해 버퍼, 효소, 반응 시간 및 반응 온도에 대한 최적화 실험을 수행했다.
DTT의 농도를 0.375 mM 내지 1.5mM, MgCl2의 농도를 0 내지 20 mM으로 하여 각각의 경우의 수(25가지; 5X5)를 모두 3번씩 실험하여 형광강도를 측정하였다. 스페르미딘은 0 내지 5mM 농도에서 타겟이 있는 경우와 없는 경우를 대비하여 형광강도를 측정하였으며, 단일 가닥 DNA 결합 단백질(SSB)도 0 내지 50 ng/ul에서의 형광강도를 측정하였다. T7 RNA중합효소는 0 내지 80U에서, 반응시간은 0 내지 120 분에서, 반응 온도는 25, 30, 37, 41도에서 측정하였다. 또한, 어닐링(annealing) 방법을 최적화하기 위하여 급성냉각(Fast cooling), 느린냉각(slow cooling), 냉각을 진행하지 않음(w/o cooling)을 비교하였다.
그 결과 도 5 내지 도 7에 나타난 바와 같이, 이상적인 조건은 다음과 같았다: 10mM의 MgCl2, 1.5mM의 DTT(도 5), 3mM의 스페르미딘, 20ng/μL의 단일 가닥 DNA 결합 단백질(SSB)(도 6), 20U의 T7 RNA 중합효소, 반응시간 30분, 반응 온도는 37℃(도 7), 냉각은 따로 진행하지 않음.
즉, 프로브와 타겟 RNA의 효율적인 혼성화를 매개할 수 있는 스페르미딘과 SSB의 최적화된 양으로 인해, 3-방향 접합 구조가 효과적으로 형성되어 초기 열 변성 및 냉각 단계 없이도 전사 반응을 유도할 수 있는 조건을 확인하였다. 따라서, 등온 조건(37℃)에서 전체 분석 작업을 수행해야 하는 필요성을 고려할 때 실제 현장 적용 측면에서 매우 유리하다.
1-4. 3-방향 접합 구조와 선형 구조인 경우의 전사 효율 비교
최종적으로 최적화된 버퍼와 3-방향 접합 구조를 기존 T7 프로모터와 비교하기 위하여 단일 가닥 RNA에 결합하여 높은 형광 신호를 방출하는 SYBR Green II를 사용하여 실시간 형광 모니터링을 수행하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 기존 T7 프로모터와 비교하여 큰 차이가 없고, 오히려 3방향 접합 구조의 전사가 선형 구조의 전사와 거의 비슷한 전사효율을 갖는다는 것을 알 수 있었다.
1-5. 3-방향 접합 구조를 확인하기 위한 겔 전기영동 수행
본 발명은 3-방향 접합 구조체 기반의 분할 T7 프로모터와 형광 RNA 압타머 기술을 융합한 기술로서 타겟 핵산 바이오 마커가 존재할 때 형광신호가 증폭된다.
DNA 프로브들은 2종류의 단일 가닥 DNA로 구성되어 있다. 단일 주형(Signal template, ST)는 형광 RNA 압타머 중 하나인 망고 압타머의 상보적인 서열(노랑), T7 프로모터 서열(파랑) 그리고 타겟 서열의 절반과 상보적인 서열 (검정)로 이루어져 있다. 분할된 T7-16(Split T7-16, ST-16)은 T7 프로모터의 일부 서열(16mer; 파랑)이며 ST의 T7 프로모터와 상보적이다. Tm 값은 56.3℃로 37℃ 반응에서 타겟물질과 상관없이 ST에 상보적으로 결합하므로 보편적이다. 3-방향 접합 구조를 확인하기 위한 겔 전기영동을 수행하였으며, 도 10는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
3-방향 접합 구조의 형성은 8% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 PAGE(Poly Acrylamide Gel Electrophoresis)로 확인하였다. 샘플은 1μM의 신호 템플릿(ST), 1μM Split T7-16(ST-16), 1μM Split T7-4(ST-4), 500nM N 유전자 RNA 및 0.5U/μL T7 RNA 중합효소를 37℃에서 30분간 배양하여 준비했다. 준비된 샘플을 겔에 로드하고 40분 동안 200V에서 1X TBE 완충액으로 로딩했다. 또한, 135V에서 1시간 동안 1X TBE 완충액에서 2% 아가로스 겔을 사용하여 아가로스 겔 전기영동을 수행하였다. GreenStar Nucleic Acid 염색 용액(Bioneer, Daejeon, Korea)을 사용하여 결과를 시각화하고 ChemiDoc(Bio-rad, CA, USA)를 사용하여 겔을 스캔했다.
분할 T7-4(ST-4)는 T7 프로모터의 일부 서열 (4mer; 파랑)과 나머지 절반의 타겟서열과 상보적으로 결합 가능한 서열(검정)로 이루어져 있다. 본 발명의 모든 반응은 37℃에서 진행된다. ST의 5'-ATTATT-3' 서열이 ST-4에 상보적이나 Tm 값이 12℃ 이므로 37℃에서 결합이 불가능하도록 디자인하였다. 따라서 타겟물질이 존재하지 않으면 DNA 프로브들 중 ST와 ST-4 프로브는 결합할 수 없으며 이에 따라 3-방향 접합 구조를 이루지 못하여 완전한 이중가닥 T7 프로모터를 형성하지 못한다. 타겟물질이 존재할 때는 타겟 RNA가 우선적으로 ST와 ST-4의 각각 타겟 물질의 상보적인 서열과 결합하여 3-방향 접합 구조체를 형성한다. 이를 통해 닉 부위가 존재하는 이중 가닥의 T7 프로모터를 이루게 된다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, PAGE 분석을 통해 타겟 및 T7 RNA 중합효소 촉매 전사 반응의 존재 하에서 3-방향 접합 구조의 형성을 확인하였다. 도 9에 도시된 바와 같이 ST와 ST-16은 서로 혼성화 되었고(a), ST, ST-16, 및 ST-4는 타겟의 부재하에서 3-방향 접합 구조를 형성하지 않았다(d). 또한, 모든 DNA 프로브와 타겟이 존재할 때(g), T7 RNA 중합효소의 존재가 전사(h)를 통해 많은 양의 light-up RNA 압타머를 생성하는 3-방향 접합 구조가 형성되었다.
1-6. 다양한 반응 조건에서 형광 방출 스펙트럼 평가
다음으로, STAR의 각 요소가 없는 형광 스펙트럼을 평가하였다(도 10). T7 RNA 중합효소에 의한 RNA 전사가 일어나게 되며 망고 압타머를 생성하게 된다. 최종적으로 망고 압타머와 결합 가능한 형광염료인 To1-비오틴과 결합하여 높은 형광신호를 나타나게 된다. DNA 프로브(ST, ST-16, ST-4) 중 하나 또는 타겟서열이 없으면 RNA 전사에 필수적인 닉 부위가 있는 이중가닥 T7 프로모터가 형성되지 않고 망고 압타머가 생성되지 않는다. 따라서 망고 압타머와 TO1-비오틴의 결합이 일어나지 않고 무시 가능한 형광 신호가 나타난다. 또한 TO1-비오틴 또는 T7 RNA 중합효소가 없는 경우에도 형광 신호가 나타나지 않는다. 모든 요소가 존재할 때만(w/all) 높은 형광 신호가 생성되어 STAR의 모든 요소가 각각 타겟 RNA의 one-pot 검출에 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다.
SARS-CoV-2 N 유전자의 각 유전자좌위의 검출 감도 측정
본 발명에서는 STAR의 핵심인 3-방향 접합 구조의 형성 효율이 각 타겟 영역에 대해 다를 수 있고 다른 검출 감도로 이어질 수 있다고 가정하였다. SARS-CoV-2를 타겟 물질로 선정하여 N 유전자의 일정 영역(Nucleotide positions 28809-29188)에 대하여 5 종류의 프로브를 설계하였다(도 12A). N 유전자의 서열은 NCBI Accession number NC_045512를 참고하였다. 5종의 프로브에 대한 구체적인 서열 정보는 전술한 [표 1]의 서열번호 35 내지 44의 서열을 사용하였다.
DNA STAR의 다중 서열 정렬을 통해 각 영역이 SARS-CoV-2에 특이적임을 확인한 후, 100pM(6ⅹ107copy/μL)에서 100fM(6 ⅹ104 copy/μL), 타겟의 존재(F) 형광 신호를 타겟의 부재(FNTC; 비타겟 대조군)로 나누어 배수 변화를 계산하였다. 도 12B의 히트맵에 나타난 바와 같이, 전사 효율은 표적화 유전자좌에 의존적이었다. 5개의 DNA 프로브 세트(Locus 1-5) 중 L2 및 L4에 대한 DNA 프로브는 다른 프로브(L1, L3 및 L5)보다 더 높은 배수 변화를 보였고 타겟 N 유전자를 100 fM까지 결정했다(도 12C). 도 12C의 왼쪽 형광강도 결과는 L2에 대한 결과이고, 오른쪽 형광강도 결과는 L4에 대한 결과이다. 종합하면, 각 영역에 대하여 민감도가 상이함을 확인하였으며, 5개의 영역 중 L2, L4가 정량적으로 100fM까지 검출이 가능함을 확인하였다.
STAR의 검출 감도를 향상시키기 위한 2개의 유전자좌 타겟화
영역별 실험 결과(도 12)를 바탕으로 민감도를 향상시키기 위하여 하나의 반응에서 타겟 유전자(N gene)의 다양한 영역을 타겟화하는 방식으로 두 개의 프로브를 동시에 사용하는 방법을 도입하였다. 실시예 2의 결과를 기반으로 민감도가 가장 뛰어났던 L2 및 L4를 타겟으로 하는 STAR 프로브가 선택되었다. 도 13A는 SARS-CoV-2 N 유전자와 다른 인간 코로나바이러스의 두 가지 다른 유전자좌의 개략도를 나타내며, SARS-CoV-2와 다른 다른 바이러스 RNA 서열의 뉴클레오타이드는 회색으로 흐릿한 것을 나타낸다. 각각의 DNA 프로브 서열 정보는 전술한 [표 2]와 같으며, 타겟 RNA의 서열 정보는 전술한 [표 3]과 같다.
각각의 STAR 프로브는 타겟 RNA 영역의 각각의 유전자좌에 결합하여 신호를 생성하므로 신호를 증폭할 수 있다. 두 영역(L2 및 L4)의 STAR 프로브가 동시에 하나의 타겟에 결합하는지 확인하기 위해 실시예 1-5에서 전술한 바와 같이 아가로스 겔 전기영동을 먼저 수행하였다. L2 및 L4 프로브 세트의 농도는 각각 500nM이며(a 및 b), L2 및 L4 프로브가 동시에 존재할 때 각 프로브 세트의 농도는 250nM(c)이다. 그 결과, 도 13B와 같이 두 개의 프로브 세트가 동시에 존재하는 경우(c) 단일 프로브 세트(L2 또는 L4)만 존재하는 경우(a 및 b)보다 전기영동 이동도가 감소하며, 이는 더 높은 밴드 위치에 의해 확인되었다. 이러한 결과는 두 개의 STAR 프로브가 타겟 RNA의 각 영역에 특이적으로 결합한다는 것을 증명한다.
타겟 RNA의 검출을 위해 STAR에 대한 모든 시약이 미리 혼합되었다; 4 μL 10X STAR 완충액(400mM Tris-HCl, 100mM MgCl2, 15mM DTT, 30mM 스페르미딘), 6μL STAR 프로브 세트(2μL Signal Template (2μM), 2μL Split T7-16(2 μM) 및 2 μL Split T7-4(2 μM)), 4 μL TO1-비오틴(1 μM) 또는 2 μL 말라카이트 그린 염화물(100 μM)), 4 μL SSB(20 ng/μL), 4 μL rNTP (각각 2.5mM), 0.4μL T7 RNA 중합효소(0.5U/μl), 0.8μL RNase 억제제(0.08U/μL) 및 DEPC-물(최대 36μL). 타겟 RNA가 첨가되기 전까지 시약의 혼합 순서는 임의로 혼합될 수 있다. 다음, 4μL의 타겟 RNA를 첨가하고 반응 혼합물을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. N 유전자에서 이중 타겟화를 위해(도 13A), 각 STAR 프로브 세트(L2 및 L4)의 50nM이 추가되었다. 마지막으로, 반응 혼합물을 384-웰 플레이트로 옮기고, 여기서 망고 압타머에 대한 TO1-비오틴 결합에 상응하는 형광 신호는 마이크로플레이트 판독기(SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader, Molecular Devices, USA)를 사용하여 각각 507 nm 및 547 nm의 여기 및 방출 파장에서 측정되었다. 말라카이트 그린 압타머에 결합하는 말라카이트 그린에서 나오는 형광 신호 측정은 616 nm 및 665 nm를 여기 및 방출 파장으로 사용하였다.
두 개의 프로브 세트를 동시에 사용하는 경우 형광 강도를 하나만 사용한 경우와 비교하였다. L2 프로브 세트(100nM), L4 프로브 세트(100nM), 개별적으로, L2 및 L4 프로브 세트(50nM+50nM) 모두의 존재하에서 측정된 형광 신호를 측정하였으며, 타겟 N 유전자 RNA의 농도는 1nM였다. 두 개의 프로브 세트를 동시에(L2+L4) 사용하는 경우 형광 신호가 증가함을 확인하였으며(도 13C), 특히 타겟 RNA 농도가 낮은 제한된 상황에서 특히나 신호 개선을 위한 좋은 방법으로 사용할 수 있음을 나타내었다.
L2 및 L4에서 STAR 프로브 세트 조합 사용시 검출 한계를 측정하였다. STAR 프로브 세트의 농도는 각각의 다른 유전자좌에서 50nM이다. 타겟 RNA는 2개의 유전자좌 타겟화를 통해 102copy/μL까지 결정이 가능함을 나타냈으며, 하나의 유전자좌를 타겟으로 하는 것에 비해 600배 개선되었고, 이는 실제 임상 상황에서 SARS-CoV-2의 스크리닝에 충분함을 나타낸다(도 13D).
뿐만 아니라, STAR의 특이성은 다른 알파 코로나바이러스 및 베타 코로나바이러스를 포함하여 6개의 인간 코로나바이러스에 결합하지 않도록 설계된 DNA 프로브로 평가되었다. SARS-CoV-2 영역과 다른 6개의 코로나바이러스의 뉴클레오타이드는 회색으로 표시된다(도 13A). 100nM 농도의 6개의 코로나바이러스 RNA가 존재할 때 형광 신호는 NTC에서 관찰된 것과 유사했으며 고도로 강화된 형광 신호는 1nM의 SARS-CoV-2 N 유전자에 대해서만 생성되었다(도 13E). 이는 RNA 타겟 농도가 작은 상황에서도 타겟으로 하는 SARS-CoV-2만을 특이적이고 민감하게 검출할 수 있음을 나타낸다.
SARS-CoV-2 D614G 돌연변이 검출을 위한 Multiplex STAR
SARS-CoV-2의 D614G 돌연변이를 타겟으로 선택하여 STAR의 다용도 적용 가능성을 입증하는 실험을 진행했다. 또한 단일 튜브에서 SARS-CoV-2의 D614G 변이와 N 유전자의 동시 검출을 위한 다중 검출도 확인했다.
D614G 돌연변이는 알파, 베타, 델타 등 모든 SARS-CoV-2 변이체에 존재하는 것으로 알려져 있다. 도 16A에서 돌연변이는 노란색으로 표시하였으며, 와일드 타겟에서 위양성 신호를 피하기 위해 빨간색으로 표시된 불일치 시퀀스를 추가하였다. SARS-CoV-2 genomic RNA의 23403번 위치에서 아데닌(A)이 구아닌(G)으로 치환됨에 따라 이러한 변화를 식별할 수 있도록 특정 STAR 프로브를 합리적으로 설계하였으며, 다중화 실험을 위해 말라카이트 그린 압타머 및 다른 파장을 갖는 fluorogenic 염료(말라카이트 그린)를 사용하였다(도 14A). DNA 프로브의 서열은 전술한 [표 1]의 서열번호 45 내지 49의 서열을 사용하였다.
다중 분석은 4μL 10xSTAR 완충액(400mM Tris-HCl, 100mM MgCl2, 15mM DTT, 30mM 스페르미딘), 3μL L2 프로브 세트(각 2μM), 3μL L4 프로브 세트(각 2μM), 6μL D614G 돌연변이 프로브 세트(각각 2μM), 4μL TO1-비오틴(1μM), 2μL 말라카이트 그린 클로라이드(100μM), 4μL SSB(20ng/μL), 4μL rNTP(각 2.5mM), 0.4μL T7 RNA 중합효소(0.5U/μL), 0.8μL RNase 억제제(0.08U/μL) 및 DEPC-water(최대 32μL)에 8μL의 타겟 RNA가 추가되었다.
4번째 위치(N4)에서 상이한 핵염기들(A, T, G, 및 C)을 평가하여 야생 타겟(wild type)으로부터 돌연변이체(D614G)의 효과적인 구별을 부여하는 최상의 것을 찾아내었으며, 그 결과 도 14B의 결과는 N4 위치의 G가 돌연변이 타겟(D614G)의 존재 하에 높은 형광 신호를 생성하면서 야생 타겟의 존재 하에 백그라운드 노이즈를 최소화한다는 것을 나타냈다. DNA 프로브 서열은 전술한 [표 2]의 서열번호 72 내지 75의 서열을 사용하였으며, 타겟 RNA 서열정보는 전술한 [표 3]의 서열번호 83 및 84를 사용하였다.
그 결과, 돌연변이에 대하여 100fM의 검출 한계를 얻었으며 야생형(wild type)이 돌연변이 검출에 간섭이 없는 것을 확인하였다(도 14C). 또한, 제안된 STAR를 사용하여 서로 다른 몰비(0%, 0.1%, 1%, 10%, 50% 및 100%)를 갖는 돌연변이체/야생 타겟의 혼합물을 분석하였다.
또한, 도 14D는 돌연변이 타겟의 0.1%가 야생 타겟과 구별됨을 나타내며, 이는 다른 방법과 비슷하거나 다른 방법보다 우수하므로, 본 발명의 우수한 특이성을 확인시켜준다.
다중 검출을 위한 시스템
하나의 튜브에서 SARS-CoV-2의 D614G 돌연변이 및 N 유전자의 동시 검출을 위한 다중 STAR가 입증되었으며, 여기서 망고 압타머 및 말라카이트 그린 압타머는 각각 SARS-CoV-2의 N 유전자 및 D614G에 해당한다. 도 15A는 SARS-CoV-2 N 유전자 및 D614G 돌연변이의 동시 검출을 위한 one-pot 다중 STAR의 개략도를 나타낸다.
동시 검출을 위해 망고 및 말라카이트 그린 압타머를 이용했으므로, 두개의 압타머가 간섭 없이 형광 방출여부를 확인하고자 하였다. 그 결과, 도 15B는 망고 압타머 및 MG 압타머에 각각 결합하는 TO1-비오틴 및 MG의 정규화된 형광 방출 스펙트럼을 나타낸다. TO1-비오틴의 형광 방출 스펙트럼(fluorescence emission spectra)은 520 nm에서 570 nm 및 여기 파장(excitation wavelength) 480 nm에서 기록되었고, 말라카이트 그린의 형광 방출 스펙트럼은 640 nm에서 720 nm 및 여기 파장 600 nm에서 기록되었다. 망고 및 말라카이트 그린 압타머에 각각 결합한 후 TO1-비오틴 및 말라카이트 그린은 간섭 없이 뚜렷한 형광 방출 스펙트럼(녹색 및 적색)을 생성함을 확인했다(도 15B).
또한, N 유전자에 대한 STAR 프로브는 SARS-CoV-2의 N 유전자가 존재할 때만 망고 압타머의 생성을 통해 고도로 강화된 형광 신호(녹색)를 생성했으며, D614G 돌연변이에 대한 STAR 프로브는 고도로 강화된 형광 신호를 생성했다. 도 15C는 N 유전자 및 D614G 돌연변이의 one-pot 다중 검출 결과를 보여주는 히트맵을 나타낸다. 타겟 RNA의 농도는 10nM이었으며, D614G 돌연변이가 존재할 때만 말라카이트 그린 압타머를 형성하여 형광 신호(적색)를 생성하여 다중 분석 가능성을 입증했다(도 15C).
N 유전자에 대한 STAR 프로브와 D614G에 대한 STAR 프로브가 동시에 존재하는 다중화 실험에서 SARS-CoV-2의 N 유전자와 D614G 모두에 대한 민감도를 평가하였다. 100 fM까지 N 유전자와 D614G에 대한 타겟을 동시에 분석할 수 있음을 확인하였다(도 15D).
따라서, 본 발명의 STAR 프로브로 상이한 타겟 핵산서열의 다중 검출을 민감하고 간섭없이 수행할 수 있음을 확인하였다.
SEQUENCE LISTING
<110> KONKUK UNIVERSITY INDUSTRIAL COOPERATION CORP
<120> Probe Set for Isothermal One-Pot Reaction using Split T7 promoter
and Uses Thereof
<130> 1069767
<160> 86
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 105
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Split promoter template
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<212> DNA
<213> Artificial
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Split promoter 2-18
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Split promoter 1-3
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<212> DNA
<213> Artificial
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<223> Split promoter 2-17
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tacgactcac tataggg 17
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Split promoter 1-4
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ttggcaaaat ctaactaat 19
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Split promoter 2-16
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<213> Artificial
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<223> Split promoter 1-5
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Split promoter 2-15
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cgactcacta taggg 15
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Split T7-16 (ST-16)-Universal
<400> 14
acgactcact ataggg 16
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Overlap 0-ST
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cagccattct ag 72
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Overlap 0-ST-4
<400> 16
cagcatcacc gccattaat 19
<210> 17
<211> 73
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Overlap 1-ST
<400> 17
gtacgacaac taccccatac caaaccttcc ttcgtacccc tatagtgagt cgtattattg 60
ccagccattc tag 73
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Overlap 1-ST-4
<400> 18
cagcatcacc gccatataat 20
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Overlap 2-ST
<400> 19
gtacgacaac taccccatac caaaccttcc ttcgtacccc tatagtgagt cgtattattt 60
gccagccatt ctag 74
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Overlap 2-ST-4
<400> 20
cagcatcacc gccataataa t 21
<210> 21
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Overlap 3-ST
<400> 21
gtacgacaac taccccatac caaaccttcc ttcgtacccc tatagtgagt cgtattattt 60
tgccagccat tctag 75
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Overlap 3-ST-4
<400> 22
cagcatcacc gccataaata at 22
<210> 23
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Overlap 4-ST
<400> 23
gtacgacaac taccccatac caaaccttcc ttcgtacccc tatagtgagt cgtattattt 60
ttgccagcca ttctag 76
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Overlap 4-ST-4
<400> 24
cagcatcacc gccataaaat aat 23
<210> 25
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Bulge 1-ST
<400> 25
gtacgacaac taccccatac caaaccttcc ttcgtacccc tatagtgagt cgtattattt 60
tgccagccat tctag 75
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Bulge 1-ST-4
<400> 26
cagcatcacc gccattaata at 22
<210> 27
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Bulge 2-ST
<400> 27
gtacgacaac taccccatac caaaccttcc ttcgtacccc tatagtgagt cgtattattt 60
ttgccagcca ttctag 76
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Bulge 2-ST-4
<400> 28
cagcatcacc gccatttaat aat 23
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<211> 77
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Bulge 3-ST
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gtacgacaac taccccatac caaaccttcc ttcgtacccc tatagtgagt cgtattattt 60
tttgccagcc attctag 77
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Bulge 3-ST-4
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Bulge 4-ST
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gtacgacaac taccccatac caaaccttcc ttcgtacccc tatagtgagt cgtattattt 60
ttttgccagc cattctag 78
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<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Bulge 4-ST-4
<400> 32
cagcatcacc gccattttta ataat 25
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<211> 79
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Bulge 5-ST
<400> 33
gtacgacaac taccccatac caaaccttcc ttcgtacccc tatagtgagt cgtattattt 60
tttttgccag ccattctag 79
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<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Bulge 5-ST-4
<400> 34
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Locus 1-ST
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gtacgacaac taccccatac caaaccttcc ttcgtacccc tatagtgagt cgtattatta 60
tgaggaacga gaag 74
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Locus 1-ST-4
<400> 36
tgttgcgact acgtgaataa t 21
<210> 37
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Locus 2-ST
<400> 37
gtacgacaac taccccatac caaaccttcc ttcgtacccc tatagtgagt cgtattattt 60
gccagccatt ctag 74
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Locus 2-ST-4
<400> 38
cagcatcacc gccataataa t 21
<210> 39
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Locus 3-ST
<400> 39
gtacgacaac taccccatac caaaccttcc ttcgtacccc tatagtgagt cgtattattg 60
ctttagtggc agta 74
<210> 40
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Locus 3-ST-4
<400> 40
tgtgttacat tgtattaat 19
<210> 41
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Locus 4-ST
<400> 41
gtacgacaac taccccatac caaaccttcc ttcgtacccc tatagtgagt cgtattattt 60
gttacattgt atgc 74
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Locus 4-ST-4
<400> 42
tctgccgaaa gcttgaataa t 21
<210> 43
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Locus 5-ST
<400> 43
gtacgacaac taccccatac caaaccttcc ttcgtacccc tatagtgagt cgtattatta 60
gttcctggtc ccca 74
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Locus 5-ST-4
<400> 44
gttccttgtc tgattaataa t 21
<210> 45
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Signal template-G
<400> 45
ggatccattc gttacctggc tctcgccagt cgggatcccc ctatagtgag tcgtattatt 60
agttgacacc ctgat 75
<210> 46
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Signal template-A
<400> 46
ggatccattc gttacctggc tctcgccagt cgggatcccc ctatagtgag tcgtattatt 60
agttaacacc ctgat 75
<210> 47
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Signal template-T
<400> 47
ggatccattc gttacctggc tctcgccagt cgggatcccc ctatagtgag tcgtattatt 60
agtttacacc ctgat 75
<210> 48
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Signal template-C
<400> 48
ggatccattc gttacctggc tctcgccagt cgggatcccc ctatagtgag tcgtattatt 60
agttcacacc ctgat 75
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> D614G Mutation ST-4
<400> 49
cagggacttc tgtgcaataa t 21
<210> 50
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> E. coli L1-ST
<400> 50
gtacgacaac taccccatac caaaccttcc ttcgtacccc tatagtgagt cgtattattc 60
gggtaacgtc aatg 74
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> E. coli L1-ST-4
<400> 51
ccggtgcttc ttctgaataa t 21
<210> 52
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> E. coli L2-ST
<400> 52
gtacgacaac taccccatac caaaccttcc ttcgtacccc tatagtgagt cgtattattc 60
cacgctttcg cacc 74
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> E. coli L2-ST-4
<400> 53
aatcctgttt gctccaataa t 21
<210> 54
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> S. aureus L1-ST
<400> 54
gtacgacaac taccccatac caaaccttcc ttcgtacccc tatagtgagt cgtattattc 60
gctttcgcac atca 74
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> S. aureus L1-ST-4
<400> 55
cctgtttgat ccccaaataa t 21
<210> 56
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> S. aureus L2-ST
<400> 56
gtacgacaac taccccatac caaaccttcc ttcgtacccc tatagtgagt cgtattattg 60
gacttaaccc aaca 74
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> S. aureus L2-ST-4
<400> 57
gttgcgctcg ttgcgaataa t 21
<210> 58
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SARS-CoV-2 N gene_IVT-FP
<400> 58
taatacgact cactataggg gcagtcaagc ctcttctcgt 40
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SARS-CoV-2 N gene_IVT-RP
<400> 59
aacattggcc gcaaattgca 20
<210> 60
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SARS-CoV-1_IVT-FP
<400> 60
taatacgact cactataggg gcagtcaagc ctcttctcgc 40
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SARS-CoV-1_IVT-RP
<400> 61
ggtgtgactt ccatgccaat 20
<210> 62
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> MERS-CoV_IVT-FP
<400> 62
taatacgact cactataggg atagtcaatc atcttcaaga 40
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> MERS-CoV_IVT-RP
<400> 63
ttctgatggg taagtttaaa 20
<210> 64
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> HCoV-229E-FP
<400> 64
taatacgact cactataggg gtgctccttc ccggtctcag 40
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> HCoV-229E-RP
<400> 65
cttccaaagt tgtggtcaag 20
<210> 66
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> HCoV-NL63-FP
<400> 66
taatacgact cactataggg gctctaataa ctcatctcgt 40
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> HCoV-NL63-RP
<400> 67
tcccccatat tgtgattaaa 20
<210> 68
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> HCoV-OC43-FP
<400> 68
taatacgact cactataggg ctgctcctaa ttccagatct 40
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> HCoV-OC43-RP
<400> 69
aactctaatc ttgatccaaa 20
<210> 70
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> HCoV-HKU1-FP
<400> 70
taatacgact cactataggg ctgcttctaa tagtcgacca 40
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> HCoV-HKU1-RP
<400> 71
aagtctaatt tagaaccaaa 20
<210> 72
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SARS-CoV-2 S gene (G614)_IVT-FP
<400> 72
taatacgact cactataggg tctaaccagg ttgctgttct ttatcagggt gttaactgca 60
cagaagtccc 70
<210> 73
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SARS-CoV-2 S gene (G614)_IVT-RP
<400> 73
ggagtaagtt gatctgcatg aatagcaaca gggacttctg tgcagttaac 50
<210> 74
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SARS-CoV-2 S gene (D614)_IVT-FP
<400> 74
taatacgact cactataggg tctaaccagg ttgctgttct ttatcaggat gttaactgca 60
cagaagtccc 70
<210> 75
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SARS-CoV-2 S gene (D614)_IVT-RP
<400> 75
ggagtaagtt gatctgcatg aatagcaaca gggacttctg tgcagttaac 50
<210> 76
<211> 380
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> SARS-CoV-2 N gene
<400> 76
gcagucaagc cucuucucgu uccucaucac guagucgcaa caguucaaga aauucaacuc 60
caggcagcag uaggggaacu ucuccugcua gaauggcugg caauggcggu gaugcugcuc 120
uugcuuugcu gcugcuugac agauugaacc agcuugagag caaaaugucu gguaaaggcc 180
aacaacaaca aggccaaacu gucacuaaga aaucugcugc ugaggcuucu aagaagccuc 240
ggcaaaaacg uacugccacu aaagcauaca auguaacaca agcuuucggc agacgugguc 300
cagaacaaac ccaaggaaau uuuggggacc aggaacuaau cagacaagga acugauuaca 360
aacauuggcc gcaaauugca 380
<210> 77
<211> 442
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> SARS-CoV-1
<400> 77
gcagucaagc cucuucucgc uccucaucac guagucgcgg uaauucaaga aauucaacuc 60
cuggcagcag uaggggaaau ucuccugcuc gaauggcuag cggagguggu gaaacugccc 120
ucgcgcuauu gcugcuagac agauugaacc agcuugagag caaaguuucu gguaaaggcc 180
aacaacaaca aggccaaacu gucacuaaga aaucugcugc ugaggcaucu aaaaagccuc 240
gccaaaaacg uacugccaca aaacaguaca acgucacuca agcauuuggg agacgugguc 300
cagaacaaac ccaaggaaau uucggggacc aagaccuaau cagacaagga acugauuaca 360
aacauuggcc gcaaauugca caauuugcuc caagugccuc ugcauucuuu ggaaugucac 420
gcauuggcau ggaagucaca cc 442
<210> 78
<211> 451
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> MERS-CoV
<400> 78
auagucaauc aucuucaaga gccucuagcu uaagcagaaa cucuuccaga ucuaguucac 60
aagguucaag aucaggaaac ucuacccgcg gcacuucucc agguccaucu ggaaucggag 120
caguaggagg ugaucuacuu uaccuugauc uucugaacag acuacaagcc cuugagucug 180
gcaaaguaaa gcaaucgcag ccaaaaguaa ucacuaagaa agaugcugcu gcugcuaaaa 240
auaagaugcg ccacaagcgc acuuccacca aaaguuucaa cauggugcaa gcuuuugguc 300
uucgcggacc aggagaccuc cagggaaacu uuggugaucu ucaauugaau aaacucggca 360
cugaggaccc acguuggccc caaauugcug agcuugcucc uacagccagu gcuuuuaugg 420
guaugucgca auuuaaacuu acccaucaga a 451
<210> 79
<211> 391
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> HCoV-229E
<400> 79
gugcuccuuc ccggucucag ucgaggucgc agagucgcgg ucguggugaa uccaaaccuc 60
aaucucggaa uccuucaagu gacagaaacc auaacaguca ggaugacauc augaaggcag 120
uugcugcggc ucuuaaaucu uuagguuuug acaagccuca ggaaaaagau aaaaagucag 180
cgaaaacggg uacuccuaag ccuucucgua aucagagucc ugcuucuucu caaacuucug 240
ccaagagucu ugcucguucu cagaguucug aaacaaaaga acaaaagcau gaaaugcaaa 300
agccacggug gaaaagacag ccuaaugaug augugacauc uaaugucaca caauguuuug 360
gccccagaga ccuugaccac aacuuuggaa g 391
<210> 80
<211> 355
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> HCoV-NL63
<400> 80
gcucuaauaa cucaucucgu gcuagcaguc guucuucaac ucguaacaac ucacgagacu 60
cuucucguag cacuucaaga caacagucuc gcacucguuc ugauucuaac cagucuucuu 120
cagaucuugu ugcugcuguu acuuuggcuu uaaagaacuu agguuuugau aaccagucga 180
agucaccuag uucuucuggu acuuccacuc cuaagaaacc uaauaagccu cuuucucaac 240
ccagggcuga uaagccuucu caguugaaga aaccucguug gaagcguguu ccuaccagag 300
aggaaaaugu uauucagugc uuugguccuc gugauuuuaa ucacaauaug gggga 355
<210> 81
<211> 412
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> HCoV-OC43
<400> 81
cugcuccuaa uuccagaucu acuucgcgca cauccagcag agccucuagu gcaggaucgc 60
guaguagagc caauucuggc aauagaaccc cuaccucugg uguaacaccu gacauggcug 120
aucaaauugc uagucuuguu cuggcaaaac uuggcaagga ugccacuaaa ccucagcaag 180
uaacuaagca uacugccaaa gaagucagac agaaaauuuu gaauaagccc cgccagaaga 240
ggagccccaa uaaacaaugc acuguucagc aguguuuugg uaagagaggc ccuaaucaga 300
auuuuggugg uggagaaaug uuaaaacuug gaacuaguga cccacaguuc cccauucuug 360
cagaacucgc acccacagcu ggugcguuuu ucuuuggauc aagauuagag uu 412
<210> 82
<211> 409
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> HCoV-HKU1
<400> 82
cugcuucuaa uagucgacca gguucacguu cucaaucacg uggacccaau aaucguucau 60
uaaguagaag uaauucuaau uuuagacauu cagauucuau aguaaaaccu gauauggcug 120
augagaucgc uaaucuuguu uuagccaagc uugguaaaga uucuaaaccu cagcaaguca 180
cuaagcaaaa ugccaaggaa aucaggcaua aaauuuuaac aaaaccucgc caaaagcgaa 240
cuccuaauaa acauuguaau guucaacagu guuuugguaa aagaggaccu ucucaaaauu 300
uugguaaugc ugaaauguua aagcuuggua cuaaugaucc ucaguuuccu auucuugcag 360
aauuagcucc uacaccaggu gcuuuuuucu uugguucuaa auuagacuu 409
<210> 83
<211> 80
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> SARS-CoV-2 S gene (G614)
<400> 83
ucuaaccagg uugcuguucu uuaucagggu guuaacugca cagaaguccc uguugcuauu 60
caugcagauc aacuuacucc 80
<210> 84
<211> 80
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> SARS-CoV-2 S gene (D614)
<400> 84
ucuaaccagg uugcuguucu uuaucaggau guuaacugca cagaaguccc uguugcuauu 60
caugcagauc aacuuacucc 80
<210> 85
<211> 610
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> E. coli 16S rRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (66)..(66)
<223> n is a, c, g, or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (526)..(527)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 85
agacuccuac gggaggcagc aguggggaau auugcacaau gggcgcaagc cugaugcagc 60
caugcngcgu guaugaagaa ggccuucggg uuguaaagua cuuucagcgg ggaggaaggg 120
aguaaaguua auaccuuugc ucauugacgu uacccgcaga agaagcaccg gcuaacuccg 180
ugccagcagc cgcgguaaua cggagggugc aagcguuaau cggaauuacu gggcguaaag 240
cgcacgcagg cgguuuguua agucagaugu gaaauccccg ggcucaaccu gggaacugca 300
ucugauacug gcaagcuuga gucucguaga gggggguaga auuccaggug uagcggugaa 360
augcguagag aucuggagga auaccggugg cgaaggcggc ccccuggacg aagacugacg 420
cucaggugcg aaagcguggg gagcaaacag gauuagauac ccugguaguc cacgccguaa 480
acgaugucga cuuggagguu gugcccuuga ggcguggcuu ccggannuaa cgcguuaagu 540
cgaccgccug gggaguacgg ccgcaagguu aaaacucaaa ugaauugacg ggggccgcac 600
aagcggugga 610
<210> 86
<211> 524
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> S. aureus 16S rRNA
<400> 86
cagaagagga aaguggaauu ccauguguag cggugaaaug cgcagagaua uggaggaaca 60
ccaguggcga aggcgacuuu cuggucugua acugacgcug augugcgaaa gcguggggau 120
caaacaggau uagauacccu gguaguccac gccguaaacg augagugcua aguguuaggg 180
gguuucccgc cccuuagugc ugcagcuaac gcauuaagca cuccgccugg ggaguacgac 240
cgcaagguug aaacucaaag gaauugacgg ggacccgcac aagcggugga gcaugugguu 300
uaauucgaag caacgcgaag aaccuuacca aaucuugaca uccuuugaca acucuagaga 360
uagagccuuc cccuucgggg gacaaaguga cagguggugc augguugucg ucagcucgug 420
ucgugagaug uuggguuaag ucccgcaacg agcgcaaccc uuaagcuuag uugccaucau 480
uaaguugggc acucuaaguu gacugccggu gacaaaccgg agga 524
Claims (18)
- 제1프로브 및 제2프로브를 포함하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응(isothermal one-pot reaction) 프로브 세트로서,
상기 제1프로브는 하기 일반식 I 및 II를 포함하는 구조를 갖는 프로모터 프로브(promoter probe, PP)이고,
[일반식 I]
5'-X-Y-Z-3'
[일반식 II]
3'-Ya-5'
상기 일반식 I에서,
X는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 하나의 표지(label) 또는 다수의 표지를 포함하는 상호작용적 표지 시스템을 갖는 압타머 서열 부위이고;
Y는 T7 프로모터에 상보적인 서열이며;
Z는 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이 핵산서열과 상보적인 혼성화 서열을 갖는 UHS(Upstream Hybridization Sequence) 부위이며; 상기 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이 핵산서열은 DNA 또는 RNA이고;
X, Y 및 Z는 디옥시리보뉴클레오타이드이며;
상기 일반식 II에서,
Ya는 T7 프로모터의 일부 서열이고; Ya는 디옥시리보뉴클레오타이드이며;
상기 제2프로브는 하기 일반식 (III)으로 이루어진 구조를 갖는 프로모터 프로브(promoter probe,PP)이고,
[일반식 III]
3'-Yb-Z'-5'
상기 일반식 (III)에서,
Yb는 존재하지 않거나, T7 프로모터의 일부 서열이고;
Z’은 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이 핵산서열과 상보적인 혼성화 서열을 갖는 DHS(Downstream Hybridization Sequence) 부위이며; 상기 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이 핵산서열은 DNA 또는 RNA이고;
Yb 및 Z’는 디옥시리보뉴클레오타이드이며;
상기 제1프로브 및 제2프로브는 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이 핵산서열과 혼성화 된 후 중합효소에 의해 전사가 개시되어 시그널을 생성하는 것을 특징으로 하는,
SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응(isothermal one-pot reaction) 프로브 세트.
- 제1항에 있어서,
상기 Ya 및 Yb는 T7 프로모터의 일부 서열이며,
상기 Ya 및 Yb는 상기 Ya 및 상기 Yb 순서로 연속적으로 배열될 경우 상기 T7 프로모터를 이루고,
Ya : Yb 분할 비율은 20:0 내지 15:5 인 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트.
- 제2항에 있어서,
상기 Ya : Yb 분할 비율은 16:4 인 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트.
- 제1항에 있어서,
상기 표지는 화학적 표지, 효소 표지, 방사능 표지, 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지 및 금속 표지로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트.
- 제1항에 있어서,
상기 제1프로브의 상기 일반식 I은, Y와 Z 사이에 중첩서열 W를 추가로 포함한 일반식 I'로 변형될 수 있고;
[일반식 I']
5'-X-Y-W-Z-3'
상기 제2프로브의 상기 일반식 III은, Yb와 Z' 사이에 중첩서열 W'를 추가로 포함한 일반식 III'으로 변형될수 있는 것을 특징으로 하는;
[일반식 III']
3'-Yb-W'-Z'-5'
SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트.
- 제5항에 있어서,
중첩서열 W 및 W'의 길이는 1bp 또는 2bp인 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트.
- 제1항에 있어서,
상기 등온 단일 반응은, 15℃ 내지 50℃ 범위의 일정한 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트.
- 제1항에 있어서,
상기 중합효소는 박테리오파지 T7 RNA 중합 효소, 박테리오파지 T3 중합 효소, 박테리오파지 RNA 중합 효소, 박테리오파지 ΦII 중합 효소, 살모넬라 박테리오파지 sp6 중합 효소, 슈도모나스 박테리오파지 gh-1 중합효소, 대장균(E. coli) RNA 중합효소 홀로효소(holoenzyme), 대장균(E. coli) RNA 중합효소 코어 효소, 인간 RNA 중합효소 I, 인간 RNA 중합효소 II, 인간 RNA 중합효소 III, 인간 미토콘드리아 RNA 중합효소 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트.
- 제1항에 있어서,
상기 등온 단일 반응은 Tris-HCl, MgCl2, DTT, 스페르미딘, rNTPs, RNase 억제제 및 SSB(Single-Stranded DNA Binding Protein)가 포함된 단일 반응 용액으로 일원화되어 동시 수행되는 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트.
- 제1항에 있어서,
상기 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이의 핵산 서열 부위는 N 유전자 또는 S 유전자 인 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트.
- 제10항에 있어서,
상기 SARS-CoV-2 검출용 등온 단일반응 프로브 세트는 N 유전자에 특이적으로 결합하고,
상기 제1프로브는 서열번호 37, 제2프로브는 서열번호 38로 이루어진 프로브 세트; 및
상기 제1프로브는 서열번호 41, 제2프로브는 서열번호 42로 이루어진 프로브 세트로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 프로브 세트를 포함하는 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트.
- 제1항에 있어서,
상기 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트는 S 유전자에 특이적으로 결합하고,
상기 제1프로브는 서열번호 45 및 제2프로브는 서열번호 49로 이루어진 프로브 세트를 포함하는 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 프로브 세트를 포함하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 조성물.
- 제13항의 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 조성물, 중합효소 및 등온 단일 반응 용액을 포함하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 키트.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트를 이용하여 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이를 검출하는 방법.
- 제15항에 있어서,
상기 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이를 검출하는 방법 이전에, 등온 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계를 포함하는 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이를 검출하는 방법.
- 제16항에 있어서,
상기 등온 핵산 증폭 반응은 RPA(Recombinase Polymerase Amplification)인 것을 특징으로 하는 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이를 검출하는 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트를 이용한 현장용 분자 진단 방법.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210147951A KR102672338B1 (ko) | 2021-11-01 | 분할된 t7 프로모터를 이용한 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트 및 이의 용도 | |
| PCT/KR2022/016927 WO2023075569A1 (ko) | 2021-11-01 | 2022-11-01 | 분할된 t7 프로모터를 이용한 등온 단일 반응용 프로브 세트 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210147951A KR102672338B1 (ko) | 2021-11-01 | 분할된 t7 프로모터를 이용한 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트 및 이의 용도 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230063086A true KR20230063086A (ko) | 2023-05-09 |
| KR102672338B1 KR102672338B1 (ko) | 2024-06-03 |
Family
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116497093A (zh) * | 2023-06-05 | 2023-07-28 | 苏州东抗生物科技有限公司 | 一种高效恒温扩增方法 |
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|---|---|---|---|---|
| CN116497093A (zh) * | 2023-06-05 | 2023-07-28 | 苏州东抗生物科技有限公司 | 一种高效恒温扩增方法 |
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