WO2023075569A1 - 분할된 t7 프로모터를 이용한 등온 단일 반응용 프로브 세트 및 이의 용도 - Google Patents

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WO2023075569A1
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WO
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detecting
probe
cov
sars
isothermal
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PCT/KR2022/016927
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박기수
윤태휘
신지예
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건국대학교 산학협력단
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
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    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage

Definitions

  • the present technology relates to a system for quickly and conveniently detecting various target molecules, and is designed to produce a large amount of fluorescent RNA aptamer in the presence of target molecules at isotherm by newly introducing a T7 promoter split into a three-way junction construct. Accordingly, it is possible to overcome the limitations of existing on-site diagnosis, and various applications are possible through high-sensitivity detection of multiple target molecules and detection in which analysis is performed without an additional extraction process.
  • SARS-CoV-2 Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus
  • qRT-PCR quantitative reverse transcription polymerase chain reaction
  • Isothermal nucleic acid amplification methods using various strand displacement polymerases have been developed to compensate for the disadvantages of these temperature control-based methods and for test convenience.
  • Isothermal amplification methods were developed to compensate for the disadvantages of temperature control-based methods and to facilitate point-of-care testing.
  • most isothermal amplification methods require a denaturation/annealing step through temperature control prior to initiation of the reaction.
  • SMART Signal-mediated amplification of RNA technology
  • RNA technology based on a three-way junction structure
  • SMART Signal-mediated amplification of RNA technology
  • the fluorescent RNA aptamer has high specificity and affinity for a specific molecule, and thus exhibits a high fluorescence signal upon binding. Compared to antibody molecules, which are proteins, it has high thermal and chemical stability, so it is widely used in not only intracellular experiments but also extracellular experiments. These fluorescent RNA aptamers are inexpensive, have low background signals, and have the advantage of being applicable to multiplex analysis.
  • the present inventors have completed the present invention by focusing on target detection using a three-way conjugation structure that is very specific and can easily distinguish changes in target molecules while using one enzyme.
  • the present inventors have made efforts to develop a new isothermal nucleic acid amplification technology capable of rapidly detecting target molecules while overcoming the disadvantages of conventional SMART analysis.
  • a novel isothermal nucleic acid amplification based on a three-way junction structure technology (37 ° C) was invented, and the probe was designed to be inexpensive and easy to perform multiple analyzes without additional labeling.
  • an object of the present invention is to provide an isothermal one-pot reaction probe set for detecting one or more target molecules, including a first probe and a second probe.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for detecting a target molecule comprising an isothermal single reaction probe set for detecting a target molecule including the first probe and the second probe.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for detecting a target molecule, including the composition for detecting a target molecule, a polymerase, and an isothermal single reaction solution.
  • Another object of the present invention is to provide a method for detecting a target molecule using the isothermal single reaction probe set for detecting the target molecule.
  • Another object of the present invention is to provide an on-site molecular diagnosis method using an isothermal single reaction probe set for detecting a target molecule.
  • An object of the present invention is to provide an isothermal one-pot reaction probe set for detecting SARS-CoV-2 and/or detecting a mutation thereof, including a third probe and a fourth probe.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for detecting SARS-CoV-2 and/or detecting a mutation thereof, including the probe set.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for detecting SARS-CoV-2 and/or detecting its mutation, comprising the composition for detecting SARS-CoV-2 and/or its mutation, a polymerase and an isothermal single reaction solution. is to do
  • Another object of the present invention is to provide a method for detecting SARS-CoV-2 and/or its mutation using the isothermal single reaction probe set for detecting SARS-CoV-2 and/or its mutation.
  • Another object of the present invention is to provide an on-site molecular diagnosis method using an isothermal single reaction probe set for detecting SARS-CoV-2 and/or its mutation.
  • the present invention provides an isothermal one-pot reaction probe set for detecting one or more target molecules, including the following first and second probes:
  • the first probe is a promoter probe (PP) having a structure including the following general formulas I and II,
  • X is an aptamer sequence region with an interactive label system comprising one label or multiple labels that generates a detectable signal
  • Y is a sequence complementary to the T7 promoter
  • Z is a site that binds or connects to a target molecule
  • X and Y are deoxyribonucleotides
  • Ya is a partial sequence of the T7 promoter; Ya is a deoxyribonucleotide;
  • the second probe is a promoter probe (PP) having a structure consisting of the following general formula (III),
  • Yb is absent or is a partial sequence of the T7 promoter and is a deoxyribonucleotide
  • Z' is a site that binds or connects to a target molecule
  • the first probe and the second probe are characterized in that, after binding or being linked to a target molecule, transcription is initiated by a polymerase to generate a signal.
  • the target molecule may be nucleic acid, protein, cell and ATP.
  • Z and Z' are nucleic acid sequences complementary to the nucleic acid to be detected, and when the target molecule is a protein, Z and Z' are An antibody capable of binding to a protein, an aptamer, and when the target molecule is a cell, Z and Z 'are any one selected from the group consisting of extracellular proteins, cellular phospholipids, bacterial peptidoglycan, and LPS
  • An antibody or aptamer capable of binding to the above, and when the target molecule is ATP, Z and Z' may be characterized in that they are split aptamers capable of binding to ATP.
  • the Ya and Yb are partial sequences of the T7 promoter, and the Ya and Yb form the T7 promoter when arranged consecutively in the order of Ya and Yb, and the Ya:Yb split ratio is It may be characterized as 20:0 to 15:5.
  • the split ratio of Ya:Yb may be 16:4.
  • the label may be selected from the group consisting of a chemical label, an enzyme label, a radioactive label, a fluorescent label, a luminescent label, a chemiluminescent label, and a metal label.
  • the general formula I of the first probe may be modified to general formula I', which further includes an overlapping sequence W between Y and Z;
  • the general formula III of the second probe is characterized in that it can be modified to the general formula III' further comprising an overlapping sequence W' between Yb and Z'
  • It may be an isothermal single reaction probe set for detecting a target molecule.
  • the length of the overlapping sequences W and W' may be 1bp or 2bp.
  • the isothermal single reaction may be carried out at a constant temperature in the range of 15 °C to 50 °C.
  • the probe set may be characterized in detecting circular RNA separately from linear RNA.
  • the polymerase is bacteriophage T7 RNA polymerase, bacteriophage T3 polymerase, bacteriophage RNA polymerase, bacteriophage ⁇ II polymerase, Salmonella bacteriophage sp6 polymerase, Pseudomonas bacteriophage gh-1 polymerase, Escherichia coli ( E. coli RNA polymerase holoenzyme, E. coli RNA polymerase core enzyme, human RNA polymerase I, human RNA polymerase II, human RNA polymerase III, human mitochondrial RNA polymerase and their It may be selected from the group consisting of variants.
  • the isothermal single reaction is unified into a single reaction solution containing Tris-HCl, MgCl 2 , DTT, spermidine, rNTPs, RNase inhibitors and SSB (Single-Stranded DNA Binding Protein) It may be characterized as concurrently performed.
  • the present invention also provides a composition for detecting a target molecule comprising the isothermal single reaction probe set for detecting the target molecule.
  • the composition may include two or more isothermal single reaction probe sets for detecting two or more target molecules.
  • the two or more isothermal single reaction probe sets for detecting target molecules each include different interactive labeling systems; Each of the two or more probe sets binds to different target molecules; Due to this, multiple detection of different target molecules may be possible.
  • the isothermal single reaction may be carried out at a constant temperature in the range of 15 °C to 50 °C.
  • the present invention also provides a kit for detecting a target molecule, including the composition for detecting a target molecule, a polymerase, and an isothermal single reaction solution.
  • the present invention provides a method for detecting a target molecule using the isothermal single reaction probe set for detecting the target molecule.
  • an isothermal nucleic acid amplification step may be included prior to the method of detecting the target molecule.
  • the isothermal nucleic acid amplification reaction may be RPA (Recombinase Polymerase Amplification).
  • the present invention also provides an on-site molecular diagnosis method using the isothermal single reaction probe set for detecting a target nucleic acid sequence.
  • the molecular diagnosis method can be used to detect pathogenic microorganisms.
  • the pathogenic microorganisms are Staphylococcus Aureus, Vibrio vulnificus, E. coli, Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus). East Respiratory Syndrome Coronavirus), Influenza A virus, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus, Respiratory Syndrome Virus (RSV), Human Immunodeficiency Virus (HIV), Herpes Simplex Virus ( HSV), human papillomavirus (HPV), human parainfluenza virus (HPIV), dengue fever virus, hepatitis B virus (HBV), yellow fever virus, rabies virus, plasmodium, cytomegalovirus (CMV), Mycobacterium tuberculosis, Chlamydia trachomatis, Rotavirus, Human metapneumovirus (hMPV), Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, Ebola virus, Zika virus, Henipah virus,
  • the present invention provides an isothermal one-pot reaction probe set for detecting SARS-CoV-2 and/or detecting a mutation thereof, including a third probe and a fourth probe,
  • the third probe is a promoter probe (PP) having a structure including the following general formulas IV and V,
  • A is an aptamer sequence region having an interactive label system including one label or multiple labels that generates a detectable signal;
  • B is a sequence complementary to the T7 promoter;
  • C is an Upstream Hybridization Sequence (UHS) site having a hybridization sequence complementary to SARS-CoV-2 and/or its mutant nucleic acid sequence;
  • the SARS-CoV-2 nucleic acid sequence is DNA or RNA;
  • A, B and C are deoxyribonucleotides;
  • Ba is a partial sequence of the T7 promoter; Ba is a deoxyribonucleotide;
  • the fourth probe is a promoter probe (PP) having a structure consisting of the following general formula (VI),
  • Bb does not exist or is a partial sequence of the T7 promoter;
  • C' is a DHS (Downstream Hybridization Sequence) site having a hybridization sequence complementary to SARS-CoV-2 and/or its mutant nucleic acid sequence;
  • the SARS-CoV-2 nucleic acid sequence is DNA or RNA;
  • Bb and C' are deoxyribonucleotides;
  • the third probe and the fourth probe are hybridized with SARS-CoV-2 and / or its mutant nucleic acid sequence and then transcription is initiated by a polymerase to generate a signal, SARS-CoV-2 detection and /
  • an isothermal single reaction probe set for detecting a mutation thereof is provided.
  • the Ba and Bb are partial sequences of the T7 promoter, and the Ba and Bb form the T7 promoter when arranged consecutively in the order of the Ba and the Bb, and the Ba:Bb split ratio is It may be characterized as 20:0 to 15:5.
  • the Ba:Bb split ratio may be 16:4.
  • the label may be selected from the group consisting of a chemical label, an enzyme label, a radioactive label, a fluorescent label, a luminescent label, a chemiluminescent label, and a metal label.
  • the general formula IV of the third probe may be modified to general formula IV', which further includes an overlapping sequence D between B and C;
  • formula VI of the fourth probe can be modified to formula VI', which further includes overlapping sequence D' between Bb and C';
  • It may be an isothermal single reaction probe set for detecting SARS-CoV-2 and/or detecting mutations thereof.
  • the overlapping sequences D and D' may have lengths of 1 bp or 2 bp.
  • the isothermal single reaction may be carried out at a constant temperature in the range of 15 °C to 50 °C.
  • the polymerase is bacteriophage T7 RNA polymerase, bacteriophage T3 polymerase, bacteriophage RNA polymerase, bacteriophage ⁇ II polymerase, Salmonella bacteriophage sp6 polymerase, Pseudomonas bacteriophage gh-1 polymerase, Escherichia coli ( E. coli RNA polymerase holoenzyme, E. coli RNA polymerase core enzyme, human RNA polymerase I, human RNA polymerase II, human RNA polymerase III, human mitochondrial RNA polymerase and their It may be selected from the group consisting of variants.
  • the isothermal single reaction is unified into a single reaction solution containing Tris-HCl, MgCl 2 , DTT, spermidine, rNTPs, RNase inhibitors and SSB (Single-Stranded DNA Binding Protein) It may be characterized as concurrently performed.
  • the nucleic acid sequence region of SARS-CoV-2 and / or its mutant is an isothermal for detecting SARS-CoV-2 and / or its mutant, characterized in that the N gene or the S gene. It may be a single reaction probe set.
  • the isothermal single reaction probe set for detecting SARS-CoV-2 binds specifically to N gene
  • the third probe consists of SEQ ID NO: 37 and the fourth probe SEQ ID NO: 38. probe set; and at least one probe set selected from the group consisting of probe sets of SEQ ID NO: 41 as the third probe and SEQ ID NO: 42 as the fourth probe.
  • the isothermal single reaction probe set for detecting mutation specifically binds to the S gene
  • the third probe includes SEQ ID NO: 45 and the fourth probe includes a probe set consisting of SEQ ID NO: 49 can do.
  • the present invention provides a composition for detecting SARS-CoV-2 and/or detecting a mutation thereof, including the probe set.
  • the present invention provides a kit for detecting SARS-CoV-2 and/or detecting a mutation thereof, including the composition for detecting SARS-CoV-2 and/or mutant thereof, a polymerase, and an isothermal single reaction solution.
  • the present invention provides a method for detecting SARS-CoV-2 and/or a mutation thereof using an isothermal single reaction probe set for detecting SARS-CoV-2 and/or a mutation thereof.
  • isothermal nucleic acid amplification may be performed prior to the method for detecting SARS-CoV-2 and/or its mutation.
  • the isothermal nucleic acid amplification reaction may be RPA (Recombinase Polymerase Amplification).
  • the present invention also provides an on-site molecular diagnosis method under isothermal single reaction conditions using the isothermal single reaction probe set for detecting SARS-CoV-2 and/or its mutation.
  • target molecules can be quickly and conveniently detected with only one enzyme in one tube.
  • it provides an isothermal nucleic acid amplification method in which the design of the probe is simple and additional labeling is not required, and a direct system without pretreatment can be implemented with only heat treatment.
  • multiplex analysis is possible in one tube, and various molecular diagnoses including viruses and pathogens are possible.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of Split T7 promoter-based isothermal Amplification with RNA Aptamer (hereinafter referred to as "STAR") for target molecule detection.
  • the STAR reaction of the present invention has three important components: a STAR DNA probe, T7 RNA polymerase and a fluorescent dye.
  • the STAR DNA probe forms a three-way junction structure and a double-stranded T7 promoter with a nick site is completed.
  • T7 RNA polymerase can bind to the T7 promoter and initiate transcription to generate large amounts of luminescent RNA aptamers.
  • the RNA aptamer then combines with the fluorescent dye to generate a highly enhanced fluorescent signal.
  • One-step reaction occurs within 30 minutes at 37°C.
  • Figure 2 shows a schematic diagram when the target molecule is a protein or a cell.
  • FIG. 3 shows the results of splitting at various ratios of the split T7 promoter.
  • Figure 5 shows the results of the stability of the T7 promoter when the bulge structure was inserted into the three-way junction structure.
  • Figure 6 shows the concentration of DTT and MgCl 2 in the composition of the buffer for optimization of the reaction conditions.
  • Figure 9 is a result of comparing the transcription efficiency of the T7 promoter of the 3-way junction structure and the linear structure when using the optimized buffer.
  • FIG. 12 is a schematic diagram showing that it can be used as a method for detecting circular RNA, distinguished from linear RNA.
  • 13 is a result showing that detection intensity is increased when an isothermal nucleic acid amplification reaction is performed prior to performing a STAR reaction.
  • Figure 14 relates to the detection sensitivity of each locus of the SARS-CoV-2 N gene
  • Figure 14A shows a schematic diagram of a part of the SARS-CoV-2 N gene and the target RNA locus (1-5)
  • Figure 14B is a heatmap showing the detection sensitivity of STAR using 5 sets of DNA probes for different loci (L1-L5) of the N gene
  • Figure 14C is the detection limit of STAR at L2 and L4, STAR probe sets are 100 nM for
  • Figure 15 shows two sets of STAR probe combinations to improve sensitivity.
  • Figure 15A is a schematic diagram of the SARS-CoV-2 N gene and two different loci of human coronaviruses, the nucleotides of other viral RNA sequences different from SARS-CoV-2 are shaded gray.
  • 15B is an agarose gel electrophoresis image of a STAR probe set with N gene RNA, the concentrations of the L2 and L4 probe sets are 500 nM, respectively (a and b), and the concentration of each probe set when the L2 and L4 probes are present simultaneously 250 nM(c).
  • FIG. 15C shows the fluorescence signals measured in the presence of L2 probe set (100 nM), L4 probe set (100 nM), and both L2 and L4 probe sets (50 nM+50 nM), with target N gene RNA concentration being 1 nM.
  • Figure 15D shows the detection limit of using STAR probe set combinations at L2 and L4, where the concentration of STAR probe set is 50 nM at each different locus.
  • Figure 15E shows the detection specificity of the STAR assay when using two STAR probe sets (L2 and L4), the concentration of SARS-CoV-2 N gene RNA was 1 nM and the rest was 100 nM, and the STAR probe sets (L2 and L4) The concentration of each was 50 nM.
  • Figure 16 shows the application of STAR for SARS-CoV-2 D614G mutation detection.
  • Figure 16A shows a schematic diagram of STAR analysis for the D614G mutation in the S gene of SARS-CoV-2, with the mutation site in yellow and a mismatch sequence shown in red to avoid false positive signals in the wild-type target.
  • Figure 16B shows the Malachite Green (MG) signal intensities obtained after STAR using different nucleobases (A, T, G and C) at the N4 position.
  • Figure 16C shows the detection limits of STAR for the D614G mutation, with concentrations of target RNA ranging from 1 nM to 100 fM.
  • Figure 16D shows the results of detection of the D614G mutation in mixtures of mutant/wild target with different molar ratios (0%, 0.1%, 1%, 10%, 50% and 100%).
  • FIG. 17 shows a system for multiple detection.
  • Figure 17A is a schematic diagram of one-pot multiple STAR for simultaneous detection of SARS-CoV-2 N gene and D614G mutation.
  • Figure 17B is the normalized fluorescence emission spectra of TO1-biotin and MG binding to mango aptamer and MG aptamer, respectively.
  • 17C is a heat map showing the results of one-pot, multiplex detection of the N gene and the D614G mutation, and the target RNA concentration was 10 nM.
  • 17D shows the results of one-pot multiple detection of N gene and D614G mutation at different concentrations.
  • Figure 18A is a schematic diagram of pathogen detection using STAR.
  • STAR probes are designed for the 16s rRNA region of pathogens, (i) one is STAR using extracted total RNA and (ii) the other is pyrolysis.
  • Direct STAR using cell lysate obtained through 18B detection of bacterial 16S rRNA using STAR. Total RNA concentrations ranging from 100 pg/ ⁇ L to 100 fg/ ⁇ L were tested.
  • 18C is a heat map showing the results of direct STAR for the detection of different pathogens, and the concentration of each pathogen is 10 3 cells/ ⁇ L.
  • the transcription reaction by the target material is effectively generated by controlling the division ratio of the T7 promoter sequence, and based on this, the T7 promoter based on the 3-way junction structure is formed only when the target molecule is present. Through this, it was possible to obtain an amplified signal with only one polymerase in one tube.
  • an additional three-way junction structure was designed to bind to various regions in the target molecule, and through this, it was possible to achieve an increase in sensitivity.
  • the present invention when the target molecule is a nucleic acid sequence, can easily distinguish changes in the sequence very specifically, and has the characteristics of amplifying a sequence subordinate to the target molecule rather than amplifying the target molecule as it is, based on this
  • the present invention is an isothermal one-pot reaction probe set for detecting one or more target molecules, including a first probe and a second probe,
  • the first probe is a promoter probe (PP) having a structure including the following general formulas I and II,
  • X is an aptamer sequence region with an interactive label system comprising one label or multiple labels that generates a detectable signal
  • Y is a sequence complementary to the T7 promoter
  • Z is a site that binds or connects to a target molecule
  • X and Y are deoxyribonucleotides
  • Ya is a partial sequence of the T7 promoter; Ya is a deoxyribonucleotide;
  • the second probe is a promoter probe (PP) having a structure consisting of the following general formula (III),
  • Yb is absent or is a partial sequence of the T7 promoter and is a deoxyribonucleotide
  • Z' is a site that binds or connects to a target molecule
  • first probe and the second probe generate a signal by initiating transcription by a polymerase after hybridization with a target molecule
  • An isothermal single reaction probe set for detecting a target molecule is provided.
  • the first probe of the probe set of the present invention each contains a structure comprising three different portions in one oligonucleotide molecule and another oligonucleotide molecule: one label that generates a detectable signal or X as an aptamer sequence having an interactive marker system including multiple markers, Y as a sequence complementary to the T7 promoter, and Z as a site that binds or connects to a target molecule; A partial sequence of the T7 promoter complementary to Y, Ya.
  • the second probe of the probe set of the present invention also has a structure including one or two unique sites in one oligonucleotide molecule: a sequence complementary to Y and part of the T7 promoter, and a sequence continuous with Ya. Yb with; Z', which is a site that binds or connects to a target molecule.
  • Yb may not exist in the case of 20:0 according to the division ratio described later.
  • This structure allows the probe set of the present invention to be a probe that exhibits a high detection effect in a short time under isothermal single reaction conditions in a unified step.
  • the term "probe” binds to a target nucleic acid of complementary sequence through one or more types of chemical bonds, usually through complementary base pairing, usually through hydrogen bond formation, thus forming a duplex structure. It is a nucleic acid that can A probe binds or hybridizes to a "probe binding site".
  • a probe may be labeled with a detectable label to facilitate detection of the probe once it has hybridized to its complementary target. Alternatively, however, the probe may be unlabeled, but detected directly or indirectly by specific binding to a labeled ligand. Probes can vary considerably in size. Generally probes are at least 7 to 15 nucleotides in length. Other probes are at least 20, 30 or 40 nucleotides in length.
  • probes are somewhat longer, at least 50, 60, 70, 80, or 90 nucleotides in length. Other probes are even longer, at least 100, 150, 200 or more nucleotides in length.
  • the probe may also be of any length within any range bounded by any of the above values (eg, 15-20 nucleotides in length).
  • the term "molecule” refers to all types of biomolecules or cells to be detected, and biomolecules are target molecules that constitute and function in a living body, and the main ones are proteins, nucleic acids, polysaccharides, and lipids that have a large size. It refers to organic substances such as amino acids, nucleotides, monosaccharides, and vitamins, metals such as iron and copper, and inorganic ions as large macromolecules and low-molecular substances. Biomolecules extracted from the natural environment, synthetically produced biomolecules, and biomolecules modified by attachment of an initiator are all included. In the present invention, it may preferably be a nucleic acid, protein, or cell.
  • target nucleic acid sequence refers to all types of nucleic acids to be detected, and chromosomal sequences derived from different species, subspecies, or variants, or chromosomal mutations within the same species. It can be characterized by all types of DNA including genomic DNA, mitochondrial DNA, and viral DNA, or all types of RNA including mRNA, ribosomal RNA, non-coding RNA, tRNA, and viral RNA, but is not limited thereto. It doesn't work.
  • oligonucleotide means an oligomer of nucleotides.
  • nucleic acid refers to a polymer of nucleotides.
  • sequence refers to an oligonucleotide or nucleotide sequence of a nucleic acid.
  • the oligonucleotide or nucleic acid can be DNA, RNA, or analogs thereof (eg, phosphorothioate analogs).
  • An oligonucleotide or nucleic acid may also include modified bases and/or backbones (eg, modified phosphate linkages or modified sugar moieties).
  • Non-limiting examples of synthetic backbones that confer stability and/or other benefits to a nucleic acid may include phosphorothioate linkages, peptide nucleic acids, locked nucleic acids, xylose nucleic acids or analogs thereof.
  • nucleic acid includes, for example, genomic DNA; complementary DNA (cDNA), which is the DNA representation of mRNA, usually obtained by reverse transcription or amplification of messenger RNA (mRNA); DNA molecules produced synthetically or by amplification; and any form of DNA or RNA, including mRNA.
  • cDNA complementary DNA
  • mRNA messenger RNA
  • nucleic acid includes single-stranded molecules as well as double or triple-stranded nucleic acids.
  • the nucleic acid strands need not be coextensive (ie, the double-stranded nucleic acid need not be double-stranded along the entire length of both strands).
  • nucleic acid also includes any chemical modification thereof, such as by methylation and/or capping.
  • Nucleic acid modifications can include the addition of chemical groups, including additional charge, polarizability, hydrogen bonding, electrostatic interactions, and functionality, to individual nucleic acid bases or to the nucleic acid as a whole. These modifications include 2' per-position modification, 5-position pyrimidine modification, 8-position purine modification, modification at cytosine exocyclic amine, substitution of 5-bromo-uracil, backbone modification, isobasic isocytidine and isoguanidine. It may include base modifications such as specific base pair combinations such as
  • two single-stranded DNA probes are designed such that the target recognition site is exposed, enabling isothermal hybridization of the probe set with the target molecule.
  • the "site binding to or linked to the target molecule” included in the probe means a sequence that is complementary to a portion of the nucleic acid sequence of the target molecule and thus capable of hybridizing with the target molecule.
  • the "site binding to or linked to the target molecule” may have a sequence complementary to a portion of the target molecule by 90% or more, preferably by 95% or more.
  • the "site bound to or linked to the target molecule” means a region capable of binding to or linked to the target molecule protein in an aptamer serving as a probe.
  • the length of the "site coupled to or linked to the target molecule” may be appropriately adjusted according to the target molecule, and is not limited to a specific length.
  • the "site bound to or linked to the target molecule” may consist of around 22 nucleotides, but when the target molecule is mRNA or protein, "the site bound to or linked to the target molecule" "region" may be shorter or longer.
  • hybridization means that double-stranded nucleic acids are formed by hydrogen bonding between single-stranded nucleic acids having complementary nucleotide sequences, and is used in a similar sense to annealing.
  • hybridization includes cases in which the base sequences between two single strands are completely complementary (perfect match) as well as exceptional cases in which some base sequences are not complementary (mismatch).
  • the term "complementary” refers to the ability for precise pairing between two nucleotides. That is, two nucleic acids are considered complementary to each other at that position if a nucleotide at a given position in a nucleic acid can form a hydrogen bond with a nucleotide in another nucleic acid.
  • Complementarity between two single-stranded nucleic acid molecules can be "partial", where only a portion of the nucleotides are bound, or complementarity can be complete, when total complementarity exists between the single-stranded molecules. The degree of complementarity between nucleic acid strands has a significant impact on the efficiency and strength of hybridization between nucleic acid strands.
  • the first probe binds to an upstream hybridization sequence (UHS) of the target nucleic acid sequence, has a sequence complementary to the T7 promoter, and has an aptamer sequence.
  • UHS upstream hybridization sequence
  • Ya included in Formula II of the first probe corresponds to a partial sequence of the T7 promoter
  • Yb in Formula III of the second probe is also a partial sequence of the T7 promoter
  • Ya and Yb are consecutive sequences. It constitutes the T7 promoter and corresponds to two fragments.
  • the probe set forms a three-way junction structure and a double-stranded T7 promoter with a nick site is completed.
  • the polymerase cannot bind, and the polymerase binds only when the target nucleic acid sequence exists, and the pressure of the first probe Transcription of the tamer site is initiated (see Figure 1).
  • the final product can be identified.
  • the first probe and the second probe each have a site that binds to or connects to the target protein or cell.
  • an antibody or an aptamer that specifically binds to a target site of a protein or cell may be present in a bound or linked form.
  • aptamers they can be connected through complementary sequences such as oligonucleotides (DNA, etc.) of a certain length ( ⁇ tens of nucleotides), and in the case of antibodies, they can be combined through NHS (N-hydroxysuccinimide) ester synthesis.
  • the probe set forms a three-way junction structure and a double-stranded T7 promoter having a nick site is completed. Therefore, since the sequence of the T7 promoter is split into Ya and Yb when the target protein does not exist, the polymerase cannot bind, and the polymerase binds only when the target protein or cell exists, and the pressure of the first probe Transcription of the tamer site is initiated (see Figure 2).
  • Aptamer used as a reporter is a single-stranded nucleic acid (DNA, RNA or modified nucleic acid) having a stable tertiary structure and being able to bind to a target molecule with high affinity and specificity. nucleic acids).
  • aptamers capable of binding to various target molecules, including low-molecular-weight organic substances, peptides, and membrane proteins, have been continuously discovered.
  • Aptamers are often compared to single antibodies because of their unique high affinity (usually pM level) and specificity of being able to bind to target molecules, and in particular, they have high potential as alternative antibodies to the extent that they are called "chemical antibodies.”
  • the binding between the aptamer and a specific chemical molecule can be confirmed by a method such as expressing fluorescence due to different absorption wavelength bands and emission wavelength bands depending on the substance to be bound.
  • any kind of aptamer and reaction material may be used as long as they can generate a detectable signal as a desired effect.
  • the target molecule is a target nucleic acid sequence
  • the first probe and the second probe respectively hybridize with the target nucleic acid sequence
  • the first probe and the second probe are immediately adjacent to each other (immediately adjacent to each other). ) located at the location.
  • Y of the first probe; Ya of the first probe and Yb of the second probe are hybridized to form one T7 promoter structure.
  • adjacent used herein while referring to the hybridization position of the first probe and the second probe is located so that the ends of Ya and Yb in the two probes can be connected to each other, and Ya and Yb hybridize with Y. It means close enough that it can be.
  • the target molecule is a protein, peptide, nucleic acid, carbohydrate, lipid, polysaccharide, glycoprotein, hormone, receptor, antigen, antibody, virus, pathogen, toxic substance, substrate, metabolite, ATP, cocaine, mercury, transition state analogs, cofactors, inhibitors, drugs, dyes, nutrients, growth factors, cells, tissues, etc., but not limited to, virtually any chemical or biological action It will be an effector and means a target molecule that can be used with molecules of any size.
  • the target molecule may be nucleic acids, proteins, cells and ATP.
  • Z and Z' are nucleic acid sequences complementary to the nucleic acid to be detected, and when the target molecule is a protein, Z and Z' are An antibody or aptamer capable of binding to a protein, and when the target molecule is a cell, Z and Z 'are any one selected from the group consisting of extracellular proteins, cellular phospholipids, bacterial peptidoglycan, and LPS An antibody or aptamer capable of binding to the above, and when the target molecule is ATP, Z and Z' may be a split aptamer capable of binding to ATP.
  • the target molecule is ATP
  • a substance such as ATP corresponds to a small molecule
  • Z and Z' may be separate aptamer sites capable of binding to ATP.
  • the paper A. Chen et al. See “Split aptamers and their applications in sandwich aptasensors” Trends in Analytical Chemistry 80 (2016) 581-593.
  • the target molecule is ATP
  • sites that bind or link to target molecules include antibodies, peptides, nucleic acids, and aptamers.
  • An antibody is a substance that causes an antigen-antibody reaction by binding specifically to an epitope of an antigen.
  • Aptamer refers to a small (20 to 60 nucleotide) single-stranded nucleic acid (DNA or RNA) fragment that has high affinity and specific binding characteristics to various types of substances, from small-molecular compounds to proteins.
  • the probe includes a linker region coupled between an aptamer sequence region having an interactive label system including one label or multiple labels generating the detectable signal and a region binding or connecting to the target molecule. may additionally be included.
  • the linker region may be introduced to one end of the probe to reach a site that binds to or connects to a target molecule, and the specific type of the linker region is not particularly limited, but, for example, the linker region may be a nucleotide with a short nucleic acid sequence of 4 to 10.
  • the Ya and Yb are partial sequences of the T7 promoter, and when the Ya and Yb are arranged consecutively in the order of Ya and Yb, the T7 promoter , and the Ya:Yb split ratio may be 20:0 to 15:5.
  • the polymerase binds to the T7 promoter and cannot initiate transcription, and finally, the first and second probes Since no signal from the label on the transcription product is generated, detection of the target molecule is not achieved.
  • Ya of the first probe and Yb of the second probe are arranged consecutively to form a T7 promoter, and the transcription process is initiated by the polymerase.
  • a product of X of the first probe containing the aptamer sequence may be produced.
  • the core of the present invention is the effective formation of a split T7 promoter in the presence of a target molecule by inducing a three-way junction structure
  • the existing T7 promoter was split and the transcription efficiency according to each ratio was analyzed.
  • nick sites were sequentially inserted from the 5' end of the T7 promoter to produce divided T7 promoters at various ratios. .
  • the transcription reaction of the resulting product was monitored. As shown in FIG.
  • the division ratio may be appropriately adjusted, and most preferably, the Ya:Yb division ratio may be 16:4.
  • the label may be selected from the group consisting of a chemical label, an enzyme label, a radioactive label, a fluorescent label, a luminescent label, a chemiluminescent label, and a metal label.
  • the general formula I of the first probe may be modified to general formula I', which further includes an overlapping sequence W between Y and Z;
  • the general formula III of the second probe is characterized in that it can be modified into the general formula III' further including an overlapping sequence W' between Yb and Z';
  • It may be an isothermal single reaction probe set for detecting a target molecule.
  • Overlapping sequences W and W' are complementary to each other.
  • Example 1-2 structural optimization was performed to apply the T7 promoter in a 16:4 ratio of Ya:Yb to the three-way junction construct.
  • the 16-nucleotide on the 3' side of the T7 promoter complementarily binds to a single template (Signal template, ST) and is universal. Only when the target RNA is present, the first probe consisting of ST and split T7-16 (Split T7-16, ST-16) and the second probe (Split T7-4, ST-4) are combined to detect the presence of a nick site. Since a complete T7 promoter must be formed, the Tm value of the overlapping sequence part is the most important factor, and the Tm value was adjusted by placing an additional overlapping sequence (0-4bp).
  • the length of the overlapping sequences W and W' may be 1bp or 2bp.
  • the isothermal single reaction may be performed at a constant temperature in the range of 15 °C to 50 °C.
  • the temperature in the range of 15 ° C to 50 ° C is a temperature known in the art at which enzymes act, and is not limited thereto as long as the desired effect of the present invention can be obtained.
  • the constant temperature of the isothermal single reaction is preferably 34°C to 40°C.
  • the probe set can detect circular RNA separately from linear RNA.
  • the first probe and the second probe of the present invention can each bind to both ends of the linear RNA, and only when both ends of the linear RNA bind to form circular RNA, the first probe and the second probe can bind, and the T7 promoter is completed. Therefore, the probe set of the present invention can be used to detect circular RNA because the T7 promoter can be formed only in the case of circular RNA, which is different from linear RNA, and thus transcription can proceed.
  • the polymerase is bacteriophage T7 RNA polymerase, bacteriophage T3 polymerase, bacteriophage RNA polymerase, bacteriophage ⁇ II polymerase, Salmonella bacteriophage sp6 polymerase, Pseudomonas bacteriophage gh-1 polymerase, Escherichia coli (E coli) RNA polymerase holoenzyme, E. coli RNA polymerase core enzyme, human RNA polymerase I, human RNA polymerase II, human RNA polymerase III, human mitochondrial RNA polymerase and variants thereof It may be selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • bacteriophage T7 RNA polymerase was used as the polymerase.
  • the isothermal single reaction is unified into a single reaction solution containing Tris-HCl, MgCl 2 , DTT, spermidine, rNTPs, RNase inhibitors and SSB (Single-Stranded DNA Binding Protein) to simultaneously It can be characterized as being carried out.
  • Examples 1-3 optimization experiments were performed for buffer, enzyme, reaction time and reaction temperature to obtain the best performance of the proposed probe set.
  • the single reaction solution preferably contains 1 to 50 mM of MgCl 2 , 0.1 to 10 mM of DTT, 0.1 to 10 mM of spermidine, 1 to 100 ng/ ⁇ L of single-stranded DNA binding protein (SSB), 1 to 100 U of T7 RNA polymerase, more preferably 1 to 30 mM MgCl 2 , 0.5 to 5 mM DTT, 1 to 5 mM spermidine, and 10 to 50 ng/ ⁇ L of single-stranded DNA binding protein (SSB) , 10 to 50 U of T7 RNA polymerase, most preferably 10 mM MgCl 2 , 1.5 mM DTT, 3 mM spermidine, 20 ng/ ⁇ L of single-stranded DNA binding protein (SSB), 20 U of T7 RNA Polymerase may be included (Figs. 6 to 9).
  • the present invention also provides a composition for detecting a target molecule comprising the isothermal single reaction probe set for detecting the target molecule.
  • a composition for detecting a target molecule may further include tools and/or reagents generally used for detection and/or analysis of a target molecule, in addition to nucleic acid sequences and peptides that specifically bind to the target molecule.
  • tools or reagents may include suitable carriers, labels capable of generating a detectable signal, solubilizers, detergents, buffers, stabilizers, and the like.
  • the labeling material is a fluorescent material, it may further include a substrate necessary for measuring fluorescence intensity.
  • Suitable carriers include soluble carriers such as physiologically acceptable buffers known in the art (eg, PBS, etc.); insoluble carriers such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester, polyacrylonitrile, fluororesin, cross-linked dextran, polysaccharides and the like; Polymers such as magnetic microparticles plated with metal on latex, other paper, glass, metal, agarose, and/or combinations thereof may be included.
  • physiologically acceptable buffers known in the art (eg, PBS, etc.)
  • insoluble carriers such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester, polyacrylonitrile, fluororesin, cross-linked dextran, polysaccharides and the like
  • Polymers such as magnetic microparticles plated with metal on latex, other paper, glass, metal, agarose, and/or combinations thereof may be included.
  • the composition may include two or more isothermal single reaction probe sets for detecting two or more target molecules.
  • the two or more isothermal single reaction probe sets for detecting target molecules each include different interactive labeling systems; Each of the two or more probe sets binds to different target molecules; Due to this, multiple detection of different target molecules may be possible.
  • the two or more types of targets may be different target sites present in a single pathogen, and in this case, a more accurate and precise diagnosis is possible by effectively detecting different sites of the target.
  • detection probes were designed using SARS-CoV-2 as a target material and targeting different target sites.
  • probes targeting the two loci indicated by L2 and L4 were designed, and as a result, it was found that the two probes specifically bind to each region of the target nucleic acid sequence (see FIG. 15). Therefore, more accurate detection is possible because other parts of the target are effectively detected.
  • the two or more types of targets may be interactively different molecular diagnostic targets, such as infectious harmful microorganisms, and in this case, simultaneous detection and diagnosis of different pathogens is possible.
  • Example 6 of the present invention detection of two pathogenic bacteria was performed, and as a result, it was confirmed that both E.coli and MRSA specifically bind to each probe to generate high fluorescence signals. Therefore, the present invention enables detection and diagnosis of different pathogens individually or simultaneously.
  • the isothermal single reaction may be carried out at a constant temperature in the range of 15 °C to 50 °C.
  • the present invention also provides a kit for detecting a target molecule, including the composition for detecting a target molecule, a polymerase, and an isothermal single reaction solution.
  • kit of the present invention may additionally include various polynucleotide molecules, enzymes, and various buffers and reagents.
  • the kit of the present invention may contain reagents necessary for carrying out positive control and negative control reactions. Optimal amounts of reagents to be used in any one particular reaction can be readily determined by one skilled in the art having the knowledge of the disclosure herein.
  • kit of the present invention is designed to detect a target molecule by the probe set of the present invention described above, the description of redundant information is omitted to avoid complexity in the present specification.
  • the present invention provides a method for detecting a target molecule using the isothermal single reaction probe set for detecting a target molecule, and may specifically include the following steps:
  • step (b) initiating transcription by treating the hybridization product of step (a) with a polymerase
  • step (c) treating the transcription product of step (b) with an aptamer-reactive material to detect signal generation of the aptamer in the transcription product.
  • the signal generation in step (c) is characterized by indicating the presence of the target molecule in the sample.
  • the target molecule detection method of the present invention is characterized in that the target molecule is detected under isothermal single reaction conditions without a separate amplification reaction.
  • the method of detecting a target molecule using the probe set of the present invention is designed to simultaneously occur the hybridization step, the transcription reaction, and the aptamer signal reaction, and the steps (a) to (c) of the present invention are carried out in one container. can be performed simultaneously in
  • the aptamer used to confirm the final signal is not limited to malachite green aptamer, and any kind of RNA-based fluorescent aptamer can be used.
  • an isothermal nucleic acid amplification reaction may be performed prior to the method of detecting the target molecule using the isothermal single reaction probe set for detecting the target molecule.
  • the type of isothermal nucleic acid amplification reaction is not particularly limited, but in one embodiment of the present invention, the isothermal nucleic acid amplification reaction may be RPA (Recombinase Polymerase Amplification).
  • the term "recombinant-polymerase amplification method” refers to a technology that can confirm DNA and RNA amplification, and unlike conventional PCR, it uses a DNA binding protein and a recombinase to quickly and accurately target sequences (target It is a technique that can amplify the sequence). Since the RPA method can be amplified even under isothermal conditions using mesophilic polymerase, it has the advantage of being able to detect and diagnose viruses in a short time with an isothermal device without special equipment.
  • step (a) When RPA was performed before step (a), it was confirmed that the signal was amplified compared to when the STAR reaction of the present invention was performed (see FIG. 13). Therefore, it can be used as a method for more sensitively detecting a target molecule by performing an isothermal nucleic acid amplification reaction in conjunction with the present invention.
  • the present invention also provides an on-site molecular diagnosis method using the isothermal single reaction probe set for detecting a target molecule.
  • on-site molecular diagnosis method refers to a method that enables on-site diagnosis in the medical field and precisely diagnoses by directly examining the molecular level in the cell and the gene (RNA, DNA) of the pathogen.
  • the point-of-care molecular diagnosis method may include the following steps:
  • step (b) initiating transcription by treating the hybridization product of step (a) with a polymerase
  • step (c) treating the transcription product of step (b) with an aptamer-reactive material to detect signal generation of the aptamer in the transcription product.
  • the signal generation in step (c) is characterized by indicating the presence of the target molecule in the sample.
  • the molecular diagnosis method can be used to detect pathogenic microorganisms.
  • pathogenic microorganism means a microorganism parasitic on the human body and causing disease, and is not limited to the pathogenic microorganisms described in the Examples of the present invention, and can be applied to all pathogenic microorganisms.
  • the pathogenic microorganisms are Staphylococcus Aureus, Vibrio vulnificus, E. coli, Middle East Respiratory Syndrome coronavirus Coronavirus), Influenza A virus, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus, Respiratory Syncytial Virus (RSV), Human Immunodeficiency Virus (HIV), Herpes Simplex Virus (HSV), Human papillomavirus (HPV), human parainfluenza virus (HPIV), dengue fever virus, hepatitis B virus (HBV), yellow fever virus, rabies virus, plasmodium, cytomegalovirus (CMV), mycobacterium tuberculosis, chlamydia trachomatis, rotavirus, human metapneumovirus (hMPV), Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, Ebola virus, Zika virus, henipavirus, norovirus, Lassavirus, rhino
  • the present invention also provides an isothermal one-pot reaction probe set for detecting SARS-CoV-2 and/or detecting a mutation thereof, including a third probe and a fourth probe,
  • the third probe is a promoter probe (PP) having a structure including the following general formulas IV and V,
  • A is an aptamer sequence region with an interactive label system comprising one label or multiple labels that generates a detectable signal
  • B is a sequence complementary to the T7 promoter
  • A is an Upstream Hybridization Sequence (UHS) site having a hybridization sequence complementary to SARS-CoV-2 and/or its mutant nucleic acid sequence;
  • the SARS-CoV-2 and/or mutant nucleic acid sequence thereof is DNA or RNA;
  • A, B and C are deoxyribonucleotides
  • Ba is a partial sequence of the T7 promoter; Ba is a deoxyribonucleotide;
  • the fourth probe is a promoter probe (PP) having a structure consisting of the following general formula (VI),
  • Bb is absent or is part of the sequence of the T7 promoter
  • C' is a DHS (Downstream Hybridization Sequence) site having a hybridization sequence complementary to SARS-CoV-2 and/or its mutant nucleic acid sequence;
  • the SARS-CoV-2 and/or mutant nucleic acid sequence thereof is DNA or RNA;
  • Bb and C' are deoxyribonucleotides
  • the third probe and the fourth probe are hybridized with SARS-CoV-2 and / or its mutant nucleic acid sequence and then transcription is initiated by a polymerase to generate a signal, SARS-CoV-2 detection and / Alternatively, an isothermal single reaction probe set for detecting a mutation thereof is provided.
  • the third probe of the probe set of the present invention each contains a structure comprising three different portions in one oligonucleotide molecule and another oligonucleotide molecule: one label that generates a detectable signal or A, which is an aptamer sequence region having an interactive marker system including multiple markers, B, which is a sequence complementary to the T7 promoter, and C, which is a region that hybridizes with SARS-CoV-2 and/or its mutants; A partial sequence of the T7 promoter complementary to B, Ba.
  • the fourth probe of the probe set of the present invention also has a structure including one or two unique sites in one oligonucleotide molecule: a sequence complementary to B and part of the T7 promoter, and a sequence continuous with Ba. with Bb; C', a site that hybridizes with SARS-CoV-2 and/or its mutants.
  • Bb may not exist in the case of 20:0 according to the division ratio described later.
  • This structure allows the probe set of the present invention to be a probe that exhibits a high detection effect in a short time under isothermal single reaction conditions in a unified step.
  • two single-stranded DNA probes are designed so that the target recognition site is exposed, enabling hybridization of the probe set with SARS-CoV-2 in an isothermal temperature.
  • C of the third probe binds to the Upstream Hybridization Sequence (UHS) of SARS-CoV-2 and/or its mutants, has a sequence complementary to the T7 promoter, and has an aptamer sequence.
  • Ba included in the general formula V of the third probe corresponds to a partial sequence of the T7 promoter
  • Bb in the general formula VI of the fourth probe is also a partial sequence of the T7 promoter
  • Ba and Bb are consecutive sequences. It constitutes the T7 promoter and corresponds to two fragments.
  • the probe set forms a three-way junction structure and a double-stranded T7 promoter with a nick site is completed.
  • the final product can be identified.
  • the third probe and the fourth probe hybridize with the SARS-CoV-2 and/or its mutant
  • the third probe and the fourth probe are positioned immediately adjacent to each other. located in
  • B of the third probe; Ba of the third probe and Bb of the fourth probe are hybridized to form one T7 promoter structure.
  • adjacent used in this specification while referring to the hybridization positions of the third and fourth probes is located so that the ends of Ba and Bb in the two probes can be connected to each other, and Ba and Bb hybridize with B. It means close enough that it can be.
  • the probe includes a linker region coupled between an aptamer sequence region having an interactive label system including one label or multiple labels generating the detectable signal and a region binding or connecting to the target molecule. may additionally include.
  • the linker region may be introduced to one end of the probe to reach a site that binds to or connects to a target molecule, and the specific type of the linker region is not particularly limited, but, for example, the linker region may be a nucleotide with a short nucleic acid sequence of 4 to 10.
  • the Ba and Bb are partial sequences of the T7 promoter, and when the Ba and Bb are arranged consecutively in the order of the Ba and the Bb, the T7 promoter and the Ba:Bb split ratio may be 20:0 to 15:5.
  • the T7 promoter sequence is divided into the third and fourth probes, when SARS-CoV-2 and/or its mutants do not exist, the polymerase cannot bind to the T7 promoter and initiate transcription, and finally Since signals from the labels on the transcription products of the third and fourth probes are not generated, detection of SARS-CoV-2 and/or its mutants is not achieved.
  • Ba of the third probe and Bb of the fourth probe are arranged consecutively to form the T7 promoter, and the transcription process is initiated by the polymerase.
  • a product of A of the third probe containing the aptamer sequence may be produced.
  • the division ratio may be appropriately adjusted, and most preferably, the Ba:Bb division ratio may be 16:4.
  • the label may be selected from the group consisting of a chemical label, an enzyme label, a radioactive label, a fluorescent label, a luminescent label, a chemiluminescent label, and a metal label.
  • the general formula IV of the third probe may be modified to general formula IV', which further includes an overlapping sequence D between B and C;
  • formula VI of the fourth probe can be modified to formula VI', which further includes overlapping sequence D' between Bb and C';
  • It may be an isothermal single reaction probe set for detecting SARS-CoV-2 and/or detecting mutations thereof.
  • Example 1-2 structural optimization was performed to apply the T7 promoter with a Ba:Bb ratio of 16:4 to the three-way junction construct.
  • the 16-nucleotide on the 3' side of the T7 promoter complementarily binds to a single template (Signal template, ST) and is universal.
  • the first probe consisting of ST and split T7-16 (Split T7-16, ST-16) and the second probe (Split T7-4, ST-4) only if SARS-CoV-2 and/or its mutants are present. ) must be combined to form a complete T7 promoter with a nick site, so the Tm value of the overlapping sequence part is the most important factor, and the Tm value was adjusted by placing additional overlapping sequences (0-4bp).
  • the overlapping sequences D and D' may have lengths of 1 bp or 2 bp.
  • the single isothermal reaction may be performed at a constant temperature in the range of 15°C to 50°C.
  • the temperature in the range of 15 ° C to 50 ° C is a temperature known in the art at which enzymes act, and is not limited thereto as long as the desired effect of the present invention can be obtained.
  • the constant temperature of the isothermal single reaction is preferably 34°C to 40°C.
  • the polymerases are bacteriophage T7 RNA polymerase, bacteriophage T3 polymerase, bacteriophage RNA polymerase, bacteriophage ⁇ II polymerase, Salmonella Bacteriophage sp6 polymerase, Pseudomonas bacteriophage gh-1 polymerase, E. coli RNA polymerase holoenzyme, E. coli RNA polymerase core enzyme, human RNA polymerase I, human RNA polymerase II, human RNA polymerase III, human mitochondrial RNA polymerase, and variants thereof, but is not limited thereto.
  • bacteriophage T7 RNA polymerase was used as the polymerase.
  • the isothermal single reaction is Tris-HCl, MgCl 2 , DTT, spermidine, rNTPs, RNase inhibitors and SSB (Single -Stranded DNA Binding Protein) can be characterized in that it is performed simultaneously by being unified into a single reaction solution.
  • Examples 1-3 optimization experiments were performed for buffer, enzyme, reaction time and reaction temperature to obtain the best performance of the proposed probe set.
  • the single reaction solution preferably contains 1 to 50 mM of MgCl 2 , 0.1 to 10 mM of DTT, 0.1 to 10 mM of spermidine, 1 to 100 ng/ ⁇ L of single-stranded DNA binding protein (SSB), 1 to 100 U of T7 RNA polymerase, more preferably 1 to 30 mM MgCl 2 , 0.5 to 5 mM DTT, 1 to 5 mM spermidine, and 10 to 50 ng/ ⁇ L of single-stranded DNA binding protein (SSB) , 10 to 50 U of T7 RNA polymerase, most preferably 10 mM MgCl 2 , 1.5 mM DTT, 3 mM spermidine, 20 ng/ ⁇ L of single-stranded DNA binding protein (SSB), 20 U of T7 RNA Polymerase may be included (Figs. 6 to 8).
  • the nucleic acid sequence region of SARS-CoV-2 and/or its mutants may be the N gene or the S gene.
  • the isothermal single reaction probe set for detecting SARS-CoV-2 specifically binds to N gene
  • the third probe is a probe composed of SEQ ID NO: 37 and the fourth probe is SEQ ID NO: 38 set; and SEQ ID NO: 41 as the third probe and SEQ ID NO: 42 as the fourth probe.
  • the N gene of SARS-CoV-2 was used as a target material, and detection probes were designed targeting different regions within the N gene.
  • probes targeting the two loci indicated by L2 and L4 were designed, and it was found that the two probes specifically bind to each region of the target nucleic acid sequence (see FIG. 14).
  • the third probe binding to L2 is a probe set consisting of SEQ ID NO: 37 and the fourth probe consisting of SEQ ID NO: 38
  • the third probe binding to L4 is a probe set consisting of SEQ ID NO: 41
  • the fourth probe is a probe set consisting of SEQ ID NO: 42.
  • the type G virus in which amino acid 614 of the spike protein, which plays an important role in virus invasion into cells, is changed from aspartic acid (D) to glycine (G), has rapidly increased in Europe and the United States since March, and is now almost extinct. It is present in most regions. According to recent reports, it has been confirmed that more than 70 coronavirus mutations have occurred, and 8 mutations with increased transmissibility (D614G, etc.) are S-type (amino acid at position 614 of S protein is D), G-type (S protein The amino acid at position 614 of G) was confirmed.
  • detection was performed for the D614G mutation, but is not limited thereto.
  • a target is determined, it is possible to detect various mutations by adjusting the probe sequence through programming.
  • the third probe of the isothermal single reaction probe set for mutation detection may be any one of SEQ ID NOs: 45 to 48, and the fourth probe may be a probe set consisting of SEQ ID NO: 49.
  • the isothermal single reaction probe set for detecting mutations specifically binds to the S gene, and the third probe may be a probe set composed of SEQ ID NO: 45 and the fourth probe SEQ ID NO: 49.
  • the present invention also provides a composition for detecting SARS-CoV-2 and/or detecting a mutation thereof comprising the probe set.
  • compositions for detecting SARS-CoV-2 and/or detecting its mutations are generally used for detecting and/or analyzing target molecules other than nucleic acid sequences and peptides that specifically bind to SARS-CoV-2 and/or its mutants. It may further include tools and/or reagents. Such tools or reagents may include suitable carriers, labels capable of generating a detectable signal, solubilizers, detergents, buffers, stabilizers, and the like. When the labeling material is a fluorescent material, it may further include a substrate necessary for measuring fluorescence intensity.
  • Suitable carriers include soluble carriers such as physiologically acceptable buffers known in the art (eg, PBS, etc.); insoluble carriers such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester, polyacrylonitrile, fluororesin, cross-linked dextran, polysaccharides and the like; Polymers such as magnetic microparticles plated with metal on latex, other paper, glass, metal, agarose, and/or combinations thereof may be included.
  • physiologically acceptable buffers known in the art (eg, PBS, etc.)
  • insoluble carriers such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester, polyacrylonitrile, fluororesin, cross-linked dextran, polysaccharides and the like
  • Polymers such as magnetic microparticles plated with metal on latex, other paper, glass, metal, agarose, and/or combinations thereof may be included.
  • the present invention also provides a kit for detecting SARS-CoV-2 and/or detecting a mutation thereof, comprising a composition for detecting SARS-CoV-2 and/or detecting a mutation thereof, a polymerase and an isothermal single reaction solution.
  • kit of the present invention may additionally include various polynucleotide molecules, enzymes, and various buffers and reagents.
  • the kit of the present invention may contain reagents necessary for carrying out positive control and negative control reactions. Optimal amounts of reagents to be used in any one particular reaction can be readily determined by one skilled in the art having the knowledge of the disclosure herein.
  • kit of the present invention is designed to detect SARS-CoV-2 and/or detect mutations thereof by the probe set of the present invention described above, duplicate descriptions are omitted to avoid complexity in the present specification. do.
  • the present invention provides a method for detecting SARS-CoV-2 and / or its mutations using the isothermal single reaction probe set for detecting SARS-CoV-2 and / or its mutations, specifically following the steps may include:
  • the sample is treated with an isothermal one-pot reaction probe set for detecting SARS-CoV-2 and/or detecting a mutation thereof, consisting of the third and fourth probes of the present invention, to detect SARS-CoV-2 combining or hybridizing with -2 and/or a mutant thereof;
  • step (b) initiating transcription by treating the hybridization product of step (a) with a polymerase
  • step (c) treating the transcription product of step (b) with an aptamer-reactive material to detect signal generation of the aptamer in the transcription product.
  • the signal generation in step (c) is characterized by indicating the presence of SARS-CoV-2 and / or its mutants in the sample.
  • the method for detecting SARS-CoV-2 and/or its mutation using the probe set of the present invention is designed to simultaneously occur the hybridization step, transcription reaction, and aptamer signal reaction, and the present invention (a) to ( Step c) can be performed simultaneously in one container.
  • the aptamer used to confirm the final signal is not limited to malachite green aptamer, and any kind of RNA-based fluorescent aptamer can be used.
  • an isothermal nucleic acid amplification reaction may be performed prior to the method for detecting SARS-CoV-2 and/or its mutation.
  • the type of isothermal nucleic acid amplification reaction is not particularly limited, but in one embodiment of the present invention, the isothermal nucleic acid amplification reaction may be RPA (Recombinase Polymerase Amplification).
  • step (a) When RPA was performed before step (a), it was confirmed that the signal was amplified compared to when the STAR reaction of the present invention was performed (see FIG. 13). Therefore, it can be used as a method for more sensitively detecting SARS-CoV-2 and/or its mutations by performing an isothermal nucleic acid amplification reaction in conjunction with the present invention.
  • the present invention also provides an on-site molecular diagnosis method using the probe set.
  • the point-of-care molecular diagnosis method may include the following steps:
  • step (b) initiating transcription by treating the hybridization product of step (a) with a polymerase
  • step (c) treating the transcription product of step (b) with an aptamer-reactive material to detect signal generation of the aptamer in the transcription product.
  • the signal generation in step (c) is characterized by indicating the presence of SARS-CoV-2 detection and/or mutation thereof in the sample.
  • the method of detecting a target molecule using the probe set of the present invention acts as a powerful diagnostic method for detecting a target molecule of a target, providing a short diagnosis time, high sensitivity and specificity, and a simple analysis procedure, Since it does not require expensive equipment and diagnostic experts, it will be a suitable diagnostic method for emerging infectious diseases that require rapid response.
  • RNA sequences were synthesized by Bionics (Seoul, Korea). All plasmids were purchased from Integrated DNA Technology (Skokie, IL, USA). T7 RNA polymerase, RNase inhibitor, T4 gene 32 protein (single-stranded binding protein) and ribonucleotide (rNTP) solutions were purchased from Enzynomics (Daejeon, Korea). HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit, Monarch RNA Cleanup Kit and DNase I were purchased from New England Biolabs (Ipswich, GA, USA). Bacterial RNA kits were purchased from OMNI International (Kennesaw, NY, USA).
  • Tris-HCl and MgCl 2 were purchased from Biosesang (Seongnam, Korea). Dithiothreitol (DTT) was purchased from ThermoFisher Scientific (Seoul, Korea). TO1-3PEG-biotin fluorophore (TO1-biotin) was purchased from Applied Biological Materials (Richmond, Canada). Malachite green chloride and spermidine were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). All experiments were performed with DEPC-treated water to prevent RNA degradation.
  • the sequence of the oligonucleotide used in the present invention is as follows.
  • aureus L1-ST-4 CCTGTTTGATCCCCAAA TAAT 55
  • the underlined portion indicates the mango aptamer sequence and the MG aptamer sequence, and the bolded portion indicates the T7 promoter region.
  • S gene (D614G Mutation) of SARS-CoV-2 underlined, bold, and italicized parts indicate mutation sites.
  • the part marked in bold represents the T7 promoter region.
  • SARS-CoV-2 S gene G614, D614G Mutation
  • underlined, bold, and italicized parts indicate mutation sites.
  • Target RNA was generated via in vitro transcription.
  • the sequence information of the target RNA used in the present invention is shown in [Table 3].
  • the core of the present invention is the effective formation of a split T7 promoter in the presence of target RNA by inducing a three-way junction structure, first, the existing T7 promoter was split prior to the present invention and the transcription efficiency according to each ratio was analyzed (Fig. 3). ).
  • the reaction mixture contained 2 ⁇ L of SP1, SP2 and T (1 ⁇ M each), 2 ⁇ L 10x T7 buffer, 0.8 ⁇ L T7 RNA polymerase (2 U/ ⁇ L), 0.4 ⁇ L RNase inhibitor (0.08 U/ ⁇ L), 2 ⁇ L TO1 -Consisted of biotin (1 ⁇ M), 1 ⁇ L rNTP (2.5 mM each) and 11.8 ⁇ L DEPC treated water.
  • the reaction mixture was incubated at 37° C. for 1 hour and then transferred to a 384-well plate. Fluorescent signals were measured at excitation and emission wavelengths of 507 nm and 547 nm, respectively, using a microplate reader (SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader, Molecular Devices, USA).
  • Target RNA was generated via in vitro transcription . Sequence information of the target RNA used in the present invention is shown in [Table 3].
  • each plasmid was used as a PCR template and a DNA sequence corresponding to the target RNA region was first generated using primers containing a T7 promoter sequence.
  • a transcription reaction solution consisting of 1 ⁇ g of template DNA, 1.5 ⁇ L of 10X reaction buffer (final 0.75x), 1.5 ⁇ L of rNTP (7.5 mM each), 1.5 ⁇ L of T7 RNA polymerase mix, and 14.5 ⁇ L of DEPC treated water was prepared.
  • a transcription reaction was performed by incubation at 37° C. for 16 hours, and then the PCR product was degraded by DNase I.
  • RNA transcription products were purified using the Monarch RNA Cleanup Kit, quantified as nanodrops at a wavelength of 260 nm, and stored at -80 °C before use.
  • split T7 promoters at various ratios were prepared by sequentially inserting nick sites from the 5' end of the T7 promoter. The transcriptional reaction was monitored by measuring the fluorescence signal of TO-1 biotin after transcription by placing the complementary sequence of the mango aptamer on the template.
  • sequences of SEQ ID NOs: 1 to 13 in [Table 1] were used as the sequence of the split T7 promoter DNA probe.
  • T+SP2 or T+SP1+SP2 in the intact T7 promoter resulted in efficient transcription indicated by high fluorescence signal.
  • Using the split T7 promoter in a 1:19 ratio increased the signal compared to the intact T7 promoter even though nicks were present (T+SP1+SP2).
  • transcription occurred effectively when T+SP2 was present.
  • the split ratio was changed from 2:18 to 4:16, transcription occurred effectively in the presence of T+SP1+SP2.
  • the fluorescence value decreased rapidly due to the absence of SP1, indicating that the 3-nucleotide portion of the 5' side of the T7 promoter is important for T7 RNA polymerase to specifically recognize the T7 promoter.
  • T7 RNA polymerase is normally It can be understood that it does not mean that it is not recognized.
  • the 16-nucleotide on the 3' side of the T7 promoter complementarily binds to the signal template and is universal. Only when the target RNA is present, the first probe consisting of ST and ST-16 and the second probe (ST-4) must be combined to form a complete T7 promoter with a nick site, so the Tm value of the overlapping part is the most important factor and additional overlapping sequences (0-4 bp) were placed to adjust the Tm value.
  • the additional overlapping sequence portion basically includes 4 bp of the 5' portion of the T7 promoter.
  • the appropriate additional overlapping sequence was set to 2bp, and the total overlapping region was set to 6bp (4bp from the T7 promoter).
  • the overlapping sequence is an optimized structure in which no bulge structure is generated without adding anything other than 2 bp complementary to each other.
  • the concentration of DTT was 0.375 mM to 1.5 mM and the concentration of MgCl 2 was 0 to 20 mM, and the number of each case (25; 5X5) was tested three times to measure the fluorescence intensity.
  • Fluorescence intensity of spermidine was measured at concentrations of 0 to 5 mM for the presence and absence of a target, and fluorescence intensity of single-stranded DNA binding protein (SSB) was also measured at a concentration of 0 to 50 ng/ul.
  • T7 RNA polymerase was measured at 0 to 80 U, reaction time at 0 to 120 minutes, and reaction temperatures at 25, 30, 37, and 41 degrees. In addition, in order to optimize the annealing method, fast cooling, slow cooling, and no cooling (w/o cooling) were compared.
  • the ideal conditions were as follows: 10 mM MgCl 2 , 1.5 mM DTT (FIG. 6), 3 mM spermidine, and 20 ng/ ⁇ L of single-stranded DNA binding protein (SSB). ) (Fig. 7), 20 U of T7 RNA polymerase, reaction time 30 minutes, reaction temperature was 37 ° C (Fig. 8), no cooling was performed.
  • the present invention is a fusion technology of a split T7 promoter based on a three-way junction structure and a fluorescent RNA aptamer technology, and a fluorescent signal is amplified when a target nucleic acid biomarker is present.
  • DNA probes are composed of two types of single-stranded DNA.
  • the single template (Signal template, ST) consists of a sequence complementary to Mango aptamer, one of the fluorescent RNA aptamers (yellow), a T7 promoter sequence (blue), and a sequence complementary to half of the target sequence (black).
  • Split T7-16 (Split T7-16, ST-16) is a partial sequence (16mer; blue) of the T7 promoter and is complementary to the T7 promoter of ST.
  • the Tm value is 56.3 °C, which is universal because it complementarily binds to ST regardless of the target material in the reaction at 37 °C.
  • Gel electrophoresis was performed to confirm the three-way junction structure, and FIG. 10 shows the results of polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Split T7-4 (ST-4) consists of a partial sequence (4mer; blue) of the T7 promoter and a sequence capable of complementary binding to the other half target sequence (black). All reactions of the present invention are conducted at 37°C. Although the 5'-ATTATT-3' sequence of ST is complementary to ST-4, it was designed to prevent binding at 37°C because the Tm value was 12°C. Therefore, if the target material does not exist, the ST and ST-4 probes among the DNA probes cannot bind, and thus cannot form a complete double-stranded T7 promoter due to a three-way junction structure. When a target substance is present, the target RNA preferentially binds to the complementary sequences of ST and ST-4, respectively, to form a three-way junction structure. This results in a double-stranded T7 promoter with a nick site.
  • FIG. 9 formation of a three-way junction structure was confirmed through PAGE analysis in the presence of the target and T7 RNA polymerase-catalyzed transcription reaction.
  • ST and ST-16 hybridized with each other (a), and ST, ST-16, and ST-4 did not form a three-way junction structure in the absence of a target (d).
  • the presence of T7 RNA polymerase formed a 3-way junction structure that generated large amounts of light-up RNA aptamers through transcription (h).
  • RNA transcription by T7 RNA polymerase occurs and mango aptamer is generated. Finally, it combines with To1-biotin, a fluorescent dye that can bind to mango aptamer, and shows a high fluorescence signal.
  • To1-biotin a fluorescent dye that can bind to mango aptamer, and shows a high fluorescence signal.
  • the double-stranded T7 promoter with a nick site essential for RNA transcription is not formed and Mango aptamers are not generated. Therefore, binding between the mango aptamer and TO1-biotin does not occur, and a negligible fluorescence signal appears.
  • the formation efficiency of the three-way junction structure which is the core of STAR, may be different for each target region and may lead to different detection sensitivities.
  • SARS-CoV-2 As a target material, 5 types of probes were designed for a certain region (Nucleotide positions 28809-29188) of the N gene (FIG. 14A).
  • the sequence of the N gene was referred to NCBI Accession number NC_045512.
  • sequences of SEQ ID NOs: 35 to 44 in [Table 1] were used.
  • FIG. 14 In order to improve sensitivity based on the experimental results for each region (FIG. 14), a method of simultaneously using two probes was introduced as a method of targeting various regions of the target gene (N gene) in one reaction. Based on the results of Example 2, STAR probes targeting L2 and L4 with the highest sensitivity were selected.
  • Figure 15A shows a schematic diagram of two different loci of human coronaviruses that differ from the SARS-CoV-2 N gene, showing that the nucleotides of other viral RNA sequences that differ from SARS-CoV-2 are shaded in gray. Sequence information of each DNA probe is shown in [Table 2] described above, and sequence information of target RNA is shown in [Table 3] described above.
  • each STAR probe binds to each locus of the target RNA region to generate a signal
  • the signal can be amplified.
  • agarose gel electrophoresis was first performed as described in Examples 1-5.
  • the concentrations of the L2 and L4 probe sets are 500 nM, respectively (a and b), and when the L2 and L4 probes are present simultaneously, the concentration of each probe set is 250 nM (c). As a result, as shown in FIG.
  • All reagents for STAR were pre-mixed for detection of target RNA; 4 ⁇ L 10X STAR buffer (400 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl 2 , 15 mM DTT, 30 mM spermidine), 6 ⁇ L STAR probe set (2 ⁇ L Signal Template (2 ⁇ M), 2 ⁇ L Split T7-16 (2 ⁇ M) and 2 ⁇ L Split T7 -4 (2 ⁇ M)), 4 ⁇ L TO1-Biotin (1 ⁇ M) or 2 ⁇ L Malachite Green Chloride (100 ⁇ M)), 4 ⁇ L SSB (20 ng/ ⁇ L), 4 ⁇ L rNTP (2.5 mM each), 0.4 ⁇ L T7 RNA polymerase (0.5 U/ ⁇ l), 0.8 ⁇ L RNase inhibitor (0.08 U/ ⁇ L) and DEPC-water (up to 36 ⁇ L).
  • the order of mixing reagents can be arbitrarily mixed until the target RNA is added.
  • 4 ⁇ L of target RNA was added and the reaction mixture was incubated at 37° C. for 30 minutes.
  • 50 nM of each STAR probe set (L2 and L4) was added.
  • the reaction mixture was transferred to a 384-well plate, where the fluorescence signal corresponding to TO1-biotin binding to mango aptamer was read using a microplate reader (SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader, Molecular Devices, USA), respectively. It was measured at excitation and emission wavelengths of 507 nm and 547 nm. 616 nm and 665 nm were used as excitation and emission wavelengths to measure fluorescence signals emitted from malachite green binding to malachite green aptamer.
  • Detection limits were determined using the STAR probe set combination at L2 and L4.
  • the concentration of the STAR probe set is 50 nM at each different locus. It was shown that the target RNA can be determined up to 10 2 copies/ ⁇ L through targeting two loci, which is 600-fold improved compared to targeting one locus, which is useful for screening SARS-CoV-2 in real clinical situations. sufficient (Fig. 15D).
  • STAR specificity of STAR was evaluated with DNA probes designed to not bind to six human coronaviruses, including other alpha and beta coronaviruses. Nucleotides of six coronaviruses different from the SARS-CoV-2 region are shown in gray (Fig. 15A). In the presence of 100 nM concentrations of the six coronavirus RNAs, fluorescence signals were similar to those observed for NTC, and highly enhanced fluorescence signals were generated only for SARS-CoV-2 N gene at 1 nM (Fig. 15E). This indicates that only the target SARS-CoV-2 can be specifically and sensitively detected even when the RNA target concentration is small.
  • the D614G mutation is known to exist in all SARS-CoV-2 variants, including alpha, beta, and delta.
  • Fig. 16A mutations are shown in yellow, and mismatched sequences shown in red were added to avoid false positive signals in the wild target.
  • adenine (A) is substituted with guanine (G) at position 23403 of the SARS-CoV-2 genomic RNA
  • G guanine
  • a specific STAR probe was rationally designed to identify this change, and for multiplexed experiments, malachite green aptamer and A fluorogenic dye (malachite green) with a different wavelength was used (Fig. 16A).
  • the sequence of the DNA probe the sequences of SEQ ID NOs: 45 to 49 in [Table 1] were used.
  • 16D also shows that 0.1% of the mutant targets were distinct from wild targets, comparable to or better than other methods, confirming the superior specificity of the present invention.
  • FIG. 17A shows a schematic diagram of one-pot multiple STAR for simultaneous detection of SARS-CoV-2 N gene and D614G mutation.
  • FIG. 17B shows normalized fluorescence emission spectra of TO1-biotin and MG binding to mango aptamer and MG aptamer, respectively.
  • the fluorescence emission spectra of TO1-biotin were recorded from 520 nm to 570 nm and an excitation wavelength of 480 nm, and the fluorescence emission spectra of malachite green were recorded from 640 nm to 720 nm and an excitation wavelength of 600 nm. It became. It was confirmed that TO1-biotin and malachite green produced distinct fluorescence emission spectra (green and red) without interference after binding to mango and malachite green aptamers, respectively (FIG. 17B).
  • the STAR probe for the N gene generated a highly enhanced fluorescence signal (green) through the production of mango aptamer only when the N gene of SARS-CoV-2 was present, and the STAR probe for the D614G mutation produced highly enhanced fluorescence generated a signal.
  • 17C shows a heat map showing the results of one-pot multiple detection of N gene and D614G mutation.
  • the concentration of the target RNA was 10 nM, and only when the D614G mutation was present, a malachite green aptamer was formed to generate a fluorescent signal (red), demonstrating the possibility of multiple analysis (FIG. 17C).
  • E. coli Esscherichia coli
  • S. aureus S. aureus Aureus
  • FIG. 18 16S rRNA, which is present in large quantities in pathogens, was selected as a target and sequenced to other bacterial genera to design E. coli and S. aureus-specific STAR probes.
  • the sequences of SEQ ID NOs: 85 and 86 in [Table 3] were used, and the sequences of SEQ ID NOs: 50 to 57 in [Table 1] were used as the sequence information of the DNA probe used.
  • the experiment was conducted in two ways. One method is to detect total RNA extracted from the pathogen, and the other is to detect it by conducting a direct experiment in which analysis is performed immediately after heat treatment of the pathogen without an additional nucleic acid extraction process (FIG. 17A).
  • the method of extracting nucleic acids proceeds as follows. E. coli and S. aureus were first cultured in Luria-Bertani liquid medium at 37°C for 24 hours with shaking (150 rpm). Total RNA was then extracted from 1 ml medium using a bacterial RNA extraction kit.
  • the bacterial pellet was resuspended in DEPC-treated water and dissolved by heating at 95 ° C. for 5 minutes. 4 ⁇ L of lysate was used for STAR analysis according to the procedure described above.
  • direct STAR was performed using the pathogen at a concentration of 10 3 cells/ ⁇ L.
  • STAR was performed with E. coli and S. aureus specific STAR probes.
  • 18C shows a heat map showing the results of direct STAR for the detection of pathogenic bacteria.
  • the concentration of each pathogen is 10 3 cells/ ⁇ L.
  • the method of the present invention can be used to detect various biomarkers of pathogenic bacteria as well as viruses, and can be directly detected only with heat treatment without pretreatment. Therefore, when using the present invention, multiple detection and direct systems can be constructed with only one enzyme in one tube, and can be used for simple and rapid detection of pathogenic bacteria.

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Abstract

본 발명은 분할 된 T7 프로모터를 이용한 등온 단일 반응용 프로브 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 3-방향 접합 구조체에 분할된 T7 프로모터를 새롭게 도입하여, 등온에서 타겟 분자의 존재 하에 다량의 형광 RNA 압타머를 생성하도록 설계하였으며, 하나의 튜브 안에서 하나의 효소만으로 신속하고 간편한 핵산 바이오 마커검출이 가능하다. 다중 핵산 바이오 마커의 고감도 검출 및 추가적인 핵산 추출 과정 없이 분석이 진행되는 검출을 통하여 다양한 응용이 가능하며, 하나의 튜브 안에서 다중 검출(multiplex analysis)을 할 수 있을 뿐만 아니라 바이러스, 병원균을 포함하여 다양한 분자진단이 가능하여 우수하다.

Description

분할된 T7 프로모터를 이용한 등온 단일 반응용 프로브 세트 및 이의 용도
본 기술은 신속, 간편하게 다양한 타겟 분자를 검출하는 시스템에 관한 것으로 3-방향 접합 구조체에 분할된 T7 프로모터를 새롭게 도입하여, 등온에서 타겟 분자의 존재 하에 다량의 형광 RNA 압타머를 생성하도록 설계하였다. 이에 따라 기존 현장진단의 한계를 극복할 수 있으며, 다중 타겟 분자의 고감도 검출 및 추가적인 추출 과정 없이 분석이 진행되는 검출을 통하여 다양한 응용이 가능하다.
한편, 본 출원은 하기 국가연구개발사업에 의해 지원받았다.
[이 발명을 지원한 국가연구개발사업]
[과제고유번호] 1711157003
[과제번호] 2020R1C1C1012275
[부처명] 과학기술정보통신부
[과제관리(전문)기관명] 한국연구재단
[연구사업명] 개인기초연구(과기정통부)(R＆D)
[연구과제명] 엑소좀 SELEX 기술(E-SELEX)과 이를 이용한 암 진단 바이오 마커 발굴 및 초고감도 검출 시스템 개발
[기여율] 1/1
[과제수행기관명] 건국대학교 산학협력단(서울)
[연구기간] 2022-03-01 ~ 2023-02-28
2019년 12월, 새로운 호흡기 전염성 RNA 바이러스인 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV-2) 및 변이 바이러스가 발병되었으며 전 세계로 빠르게 확산되었다. 따라서 바이러스 전파를 억제하기 위한 빠르고 편리하게 SARS-CoV-2 검출하는 기술이 요구되는 실정이다.
현재 SARS-CoV-2 검출에서 가장 많이 사용되는 방법은 핵산 증폭기반의 qRT-PCR(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction)이다. 다양한 프라이머-프로브 세트가 밝혀져 있으며 매우 민감한 검출한계를 가지는 장점이 있으나, 모든 PCR 테스트는 온도 조절 장치가 필요하며 전문　실험실에서 진행되므로 오랜 시간(1-2일)이 걸리고 가격이 비싸다는 단점이 존재한다.
이러한 온도조절기반의 방법의 단점을 보완하고 검사 편의성을 위한 다양한 strand displacement polymerase를 사용한 등온 핵산 증폭 방법들이 개발되었다. 등온 증폭 방법은 온도 제어 기반 방법의 단점을 보완하고 현장 진료 테스트를 용이하게 하기 위해 개발되었다. 그러나 대부분의 등온 증폭 방법은 반응 개시 전에 온도 조절을 통한 변성(denaturation)/어닐링(annealing) 단계가 필요하다. 또한, 다양한 효소에 대한 반응을 최적화하기가 어렵고 검출 단계가 복잡하다는 단점이 있다. 특히, SARS-CoV-2의 경우 대부분의 등온 증폭 방법은 RNA를 cDNA로 변환하는 방식으로 진행되며, DNA 증폭 산물을 대량으로 생산하기 때문에 변환된 cDNA와 증폭된 DNA가 쉽게 분해되지 않아 오염에 취약하다. 이러한 오염은 반응을 방해하여 높은 위양성을 초래할 수 있다. 따라서 SARS-CoV-2를 탐지하기 위해서는 빠른 단일 단계 등온 증폭 방법이 여전히 필요하다.
3-방향 접합(Three-way junction) 구조 기반의 signal-mediated amplification of RNA technology(SMART)는 gDNA, total RNA 등에 적용이 가능하며, 다양한 핵산 바이오 마커의 고감도 검출에 사용되어져 왔다. 하지만, SMART 기술의 우수한 장점에도 불구하고, DNA 중합효소 와 RNA 중합효소 두 가지 효소를 필요로 한다는 한계가 있으며, 두 효소가 같이 존재할 경우 비 특이적인 신호를 발생하므로 one-step 반응이 불가능하고, 반응시간도 오래 걸린다는 단점이 있다.
한편, 형광 RNA 압타머는 특정 분자에 높은 특이성과 친화력을 가지고 있어 결합 시 높은 형광 신호를 나타내는 특성을 가지고 있다. 단백질인 항체 분자와 비교하여 열적, 화학적으로 높은 안정성을 갖으므로 세포 내 실험뿐 아니라 세포 외 실험에서도 많이 사용되고 있다. 이러한 형광 RNA 압타머는 가격이 저렴하고 낮은 배경 신호를 가지며 다중 분석에도 적용 가능한 장점을 가지고 있다.
SMART 기술과 관련하여, 국제 공개특허공보 WO 99/37806은 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 SMART 기술에 대하여 개시하고 있으나, 2개의 중합효소를 이용하여 타겟하는 핵산을 검출했으며, 하나의 중합효소만을 이용한 기술에 대해서는 개시된 바 없다.
이에, 본 발명자들은 하나의 효소를 사용하면서도 매우 특이적이며 타겟 분자의 변화를 쉽게 구별할 수 있는 3-방향 접합 구조를 사용한 타겟 검출에 중점을 두어 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명자들은 기존 SMART 분석의 단점을 극복하면서 타겟 분자를 신속하게 검출할 수 있는 새로운 등온 핵산 증폭 기술을 개발하기 위해 노력한 결과, 3-방향 접합(three-way junction) 구조 기반 신규 등온 핵산증폭기술(37℃)을 발명하였으며 추가적인 라벨링 없이 저렴하고 쉽게 프로브를 디자인하여 다중 분석이 가능하도록 설계하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 제1프로브 및 제2프로브를 포함하는, 하나 이상의 타겟 분자 검출용 등온 단일반응(isothermal one-pot reaction) 프로브 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 제1프로브 및 제2프로브를 포함하는 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 포함하는 타겟 분자 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 타겟 분자 검출용 조성물, 중합효소 및 등온 단일 반응 용액을 포함하는, 타겟 분자 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 이용하여 타겟 분자를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 이용한 현장용 분자 진단 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 제3프로브 및 제4프로브를 포함하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응(isothermal one-pot reaction) 프로브 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 프로브 세트를 포함하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 조성물, 중합효소 및 등온 단일 반응 용액을 포함하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트를 이용하여 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트를 이용한 현장용 분자 진단 방법을 제공하는 것이다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속 하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 다음의 제1프로브 및 제2프로브를 포함하는, 하나 이상의 타겟 분자 검출용 등온 단일반응(isothermal one-pot reaction) 프로브 세트를 제공한다:
상기 제1프로브는 하기 일반식 I 및 II를 포함하는 구조를 갖는 프로모터 프로브(promoter probe, PP)이고,
[일반식 I]
5'-X-Y-Z-3'
[일반식 II]
3'-Ya-5'
상기 일반식 I에서,
X는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 하나의 표지(label) 또는 다수의 표지를 포함하는 상호작용적 표지 시스템을 갖는 압타머 서열 부위이고;
Y는 T7 프로모터에 상보적인 서열이며;
Z는 타겟 분자에 결합 또는 연결되는 부위이며;
X 및 Y는 디옥시리보뉴클레오타이드이며;
상기 일반식 II에서,
Ya는 T7 프로모터의 일부 서열이고; Ya는 디옥시리보뉴클레오타이드이며;
상기 제2프로브는 하기 일반식 (III)으로 이루어진 구조를 갖는 프로모터 프로브(promoter probe,PP)이고,
[일반식 III]
3'-Yb-Z'-5'
상기 일반식 (III)에서,
Yb는 존재하지 않거나, T7 프로모터의 일부 서열이고, 디옥시리보뉴클레오타이드이며;
Z’은 타겟 분자에 결합 또는 연결되는 부위이며;
상기 제1프로브 및 제2프로브는 타겟 분자와 결합 또는 연결된 후 중합효소에 의해 전사가 개시되어 시그널을 생성하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 타겟 분자는 핵산, 단백질, 세포 및 ATP일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 타겟 분자가 핵산인 경우, Z 및 Z'은 검출하고자 하는 핵산에 상보적으로 결합하는 핵산 서열이고, 상기 타겟 분자가 단백질인 경우, Z 및 Z'은 상기 단백질에 결합할 수 있는 항체, 압타머이고, 상기 타겟 분자가 세포인 경우, Z 및 Z'은 세포 외 단백질, 세포의 인지질, 균의 펩티도글라이칸 및 LPS로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상에 결합할 수 있는 항체, 압타머이고, 상기 타겟 분자가 ATP인 경우, Z 및 Z'은 ATP에 결합할 수 있는 split 압타머인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 Ya 및 Yb는 T7 프로모터의 일부 서열이며, 상기 Ya 및 Yb는 상기 Ya 및 상기 Yb 순서로 연속적으로 배열될 경우 상기 T7 프로모터를 이루고, Ya : Yb 분할 비율은 20:0 내지 15:5 인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 Ya : Yb 분할 비율은 16:4일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 표지는 화학적 표지, 효소 표지, 방사능 표지, 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지 및 금속 표지로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제1프로브의 상기 일반식 I은, Y와 Z 사이에 중첩서열 W를 추가로 포함한 일반식 I'로 변형될 수 있고;
[일반식 I']
5'-X-Y-W-Z-3'
상기 제2프로브의 상기 일반식 III은, Yb와 Z' 사이에 중첩서열 W'를 추가로 포함한 일반식 III'으로 변형될수 있는 것을 특징으로 하는
[일반식 III']
3'-Yb-W'-Z'-5'
타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 중첩서열 W 및 W'의 길이는 1bp 또는 2bp일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 등온 단일 반응은, 15℃ 내지 50℃ 범위의 일정한 온도에서 수행될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프로브 세트는 선형 RNA(linear RNA)와 구분하여 원형 RNA(circular RNA)를 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 중합효소는 박테리오파지 T7 RNA 중합 효소, 박테리오파지 T3 중합 효소, 박테리오파지 RNA 중합 효소, 박테리오파지 ΦII 중합 효소, 살모넬라 박테리오파지 sp6 중합 효소, 슈도모나스 박테리오파지 gh-1 중합효소, 대장균(E. coli) RNA 중합효소 홀로효소(holoenzyme), 대장균(E. coli) RNA 중합효소 코어 효소, 인간 RNA 중합효소 I, 인간 RNA 중합효소 II, 인간 RNA 중합효소 III, 인간 미토콘드리아 RNA 중합효소 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 등온 단일 반응은 Tris-HCl, MgCl2, DTT, 스페르미딘, rNTPs, RNase 억제제 및 SSB(Single-Stranded DNA Binding Protein)가 포함된 단일 반응 용액으로 일원화되어 동시 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 포함하는, 타겟 분자 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 2종 이상의 타겟 분자를 검출하기 위한 2종 이상의 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 2종 이상의 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트는 각각 서로 상이한 상호작용적 표지 시스템을 포함하고; 상기 2종 이상의 프로브 세트 각각은 각각 서로 상이한 타겟 분자에 결합하여; 이로 인해 서로 상이한 타겟 분자의 다중 검출이 가능할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 등온 단일 반응은, 15℃ 내지 50℃ 범위의 일정한 온도에서 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 타겟 분자 검출용 조성물, 중합효소 및 등온 단일 반응 용액을 포함하는, 타겟 분자 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 이용하여 타겟 분자를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 타겟 분자를 검출하는 방법 이전에, 등온핵산증폭 반응을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 등온핵산증폭 반응은 RPA(Recombinase Polymerase Amplification)일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 타겟 핵산서열 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 이용한 현장용 분자 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 분자 진단 방법은 병원성 미생물 검출에 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 병원성 미생물은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus Aureus), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 대장균(E. coli), 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus), 인플루엔자 A 바이러스(Influenza A virus), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus), 호흡기 세포 융합 바이러스(RSV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV), 인유두종 바이러스(HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스(HPIV), 뎅기열 바이러스, B형 간염 바이러스(Hepatitis B Virus (HBV)), 황열병 바이러스, 광견병 바이러스, 플라스모디움, 거대세 포바이러스(CMV), 미코박테리움 튜버큘로시스, 클라미디아 트라코마티스, 로타바이러스, 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 크리민 콩고 출혈열 바이러스 (Crimean-Congo hemorrhagic fever virus), 에볼라 바이러스, 지카 바이러스, 헤니파바이러스, 노로바이러스, 라사바이러스, 리노바이러스, 플라비바이러스, 리프트 밸리 열 바이러스, 수족구병 바이러스, 살모넬라(Salmonella sp.), 쉬켈라(Shigella sp.), 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae sp.), 슈도모나스(Pseudomonas sp.), 모락셀라(Moraxella sp.), 헬리코박터(Helicobacter sp.) 및 스테노트로 포모나스(Stenotrophomonas sp.)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상일 수 있다.
본 발명은 제3프로브 및 제4프로브를 포함하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응(isothermal one-pot reaction) 프로브 세트를 제공하며,
상기 제3프로브는 하기 일반식 IV 및 V를 포함하는 구조를 갖는 프로모터 프로브(promoter probe, PP)이고,
[일반식 IV]
5’-A-B-C-3’
[일반식 V]
3'-Ba-5'
상기 일반식 IV에서, A는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 하나의 표지(label) 또는 다수의 표지를 포함하는 상호작용적 표지 시스템을 갖는 압타머 서열 부위이고; B는 T7 프로모터에 상보적인 서열이며; C는 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이 핵산서열과 상보적인 혼성화 서열을 갖는 UHS(Upstream Hybridization Sequence) 부위이며; 상기 SARS-CoV-2 핵산서열은 DNA 또는 RNA이고; A, B 및 C는 디옥시리보뉴클레오타이드이며;
상기 일반식 V에서, Ba는 T7 프로모터의 일부 서열이고; Ba는 디옥시리보뉴클레오타이드이며;
상기 제4프로브는 하기 일반식 (VI)으로 이루어진 구조를 갖는 프로모터 프로브(promoter probe,PP)이고,
[일반식 VI]
3'-Bb-C'-5'
상기 일반식 (VI)에서, Bb는 존재하지 않거나, T7 프로모터의 일부 서열이고; C’은 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이 핵산서열과 상보적인 혼성화 서열을 갖는 DHS(Downstream Hybridization Sequence) 부위이며; 상기 SARS-CoV-2 핵산서열은 DNA 또는 RNA이고; Bb 및 C’는 디옥시리보뉴클레오타이드이며; 상기 제3프로브 및 제4프로브는 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이 핵산서열과 혼성화 된 후 중합효소에 의해 전사가 개시되어 시그널을 생성하는 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 Ba 및 Bb는 T7 프로모터의 일부 서열이며, 상기 Ba 및 Bb는 상기 Ba 및 상기 Bb 순서로 연속적으로 배열될 경우 상기 T7 프로모터를 이루고, Ba : Bb 분할 비율은 20:0 내지 15:5 인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 Ba : Bb 분할 비율은 16:4일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 표지는 화학적 표지, 효소 표지, 방사능 표지, 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지 및 금속 표지로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제3프로브의 상기 일반식 IV은, B와 C 사이에 중첩서열 D를 추가로 포함한 일반식 IV'로 변형될 수 있고;
[일반식 IV']
5'-A-B-D-C-3'
상기 제4프로브의 상기 일반식 VI은, Bb와 C' 사이에 중첩서열 D'를 추가로 포함한 일반식 VI'으로 변형될수 있는 것을 특징으로 하는;
[일반식 VI']
3'-Bb-D'-C'-5'
SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 중첩서열 D 및 D'의 길이는 1bp 또는 2bp일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 등온 단일 반응은, 15℃ 내지 50℃ 범위의 일정한 온도에서 수행될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 중합효소는 박테리오파지 T7 RNA 중합 효소, 박테리오파지 T3 중합 효소, 박테리오파지 RNA 중합 효소, 박테리오파지 ΦII 중합 효소, 살모넬라 박테리오파지 sp6 중합 효소, 슈도모나스 박테리오파지 gh-1 중합효소, 대장균(E. coli) RNA 중합효소 홀로효소(holoenzyme), 대장균(E. coli) RNA 중합효소 코어 효소, 인간 RNA 중합효소 I, 인간 RNA 중합효소 II, 인간 RNA 중합효소 III, 인간 미토콘드리아 RNA 중합효소 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 등온 단일 반응은 Tris-HCl, MgCl2, DTT, 스페르미딘, rNTPs, RNase 억제제 및 SSB(Single-Stranded DNA Binding Protein)가 포함된 단일 반응 용액으로 일원화되어 동시 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이의 핵산 서열 부위는 N 유전자 또는 S 유전자 인 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 검출용 등온 단일반응 프로브 세트는 N 유전자에 특이적으로 결합하고, 상기 제3프로브는 서열번호 37, 제4프로브는 서열번호 38로 이루어진 프로브 세트; 및 상기 제3프로브는 서열번호 41, 제4프로브는 서열번호 42로 이루어진 프로브 세트로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 프로브 세트를 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어, 상기 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트는 S 유전자에 특이적으로 결합하고, 상기 제3프로브는 서열번호 45 및 제4프로브는 서열번호 49로 이루어진 프로브 세트를 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 프로브 세트를 포함하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 조성물, 중합효소 및 등온 단일 반응 용액을 포함하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트를 이용하여 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이를 검출하는 방법이전에, 등온 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 등온 핵산 증폭 반응은 RPA(Recombinase Polymerase Amplification)일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 이용한 등온 단일 반응 조건하에서의 현장용 분자 진단 방법을 제공한다.
본 발명은 하나의 튜브 안에서 하나의 효소만으로 신속하고 간편하게 타겟 분자의 검출이 가능하다. 또한, 프로브의 설계가 간편하며 추가적인 라벨링이 필요 없을 뿐만 아니라, 열처리 만으로 전처리 없는 direct 시스템의 구현이 가능한 등온 핵산증폭 방법을 제공한다. 또한, 하나의 튜브 안에서 다중 검출(multiplex analysis)이 가능하며, 바이러스, 병원균을 포함하여 다양한 분자진단이 가능하다.
도 1은 타겟 분자 검출을 위한 Split T7 promoter-based isothermal Amplification with RNA Aptamer(이하 "STAR"라고 명명)의 개략도를 나타낸다. 본 발명의 STAR 반응은 세 가지 중요한 구성 요소는 STAR DNA 프로브, T7 RNA 중합효소 및 형광 염료이다. 타겟 RNA의 존재 하에, STAR DNA 프로브는 3방향 접합 구조를 형성하고 닉 부위를 갖는 이중 가닥 T7 프로모터가 완성된다. T7 RNA 중합효소는 T7 프로모터에 결합할 수 있고 많은 양의 발광하게 하는 RNA 압타머 생성을 위한 전사를 개시할 수 있다. 그 후, RNA 압타머는 형광 염료와 결합하여 고도로 향상된 형광 신호를 생성한다. One-step 반응은 37℃에서 30분 이내에 일어난다.
도 2는 타겟 분자가 단백질 또는 세포인 경우의 개략도를 나타낸다.
도 3은 분할 T7 프로모터의 다양한 비율에서의 분할 결과를 나타낸다.
도 4은 중첩 길이의 최적화 결과를 나타낸다.
도 5는 3-방향 접합 구조에 bulge 구조를 넣었을 때의 T7 프로모터의 안정성에 관한 결과를 나타낸다.
도 6은 반응조건의 최적화를 위한 버퍼의 조성 중 DTT와 MgCl2의 농도를 나타낸다.
도 7은 스페르미딘과 단일 가닥 DNA 결합 단백질(SSB)의 최적의 농도를 찾기 위해 측정한 형광강도 결과이다.
도 8은 T7 RNA 중합효소 농도별, 반응시간, 반응온도, 냉각 방법에 따른 형광강도 결과를 나타낸다.
도 9는 최적화된 버퍼를 이용한 경우 3-방향 접합 구조와 선형 구조의 T7 프로모터의 전사효율을 비교한 결과이다.
도 10은 3-방향 접합 구조를 확인하기 위한 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
도 11은 STAR의 각 요소가 없는 형광 스펙트럼 결과이다.
도 12는 선형 RNA 와 구분하여 원형 RNA(circular RNA)를 검출하는 방법으로 이용될 수 있음을 나타낸 개략도이다.
도 13은 STAR 반응을 수행하기 이전에 등온 핵산 증폭 반응을 수행하는 경우 검출 강도가 증가됨이 나타난 결과이다.
도 14는 SARS-CoV-2 N 유전자의 각 유전자 좌위의 검출 감도에 관한 것으로, 도 14A는 SARS-CoV-2 N 유전자의 일부와 타겟 RNA의 유전자좌(1-5)의 개략도를 나타내며, 도 14B는 N 유전자의 다른 유전자좌(L1-L5)에 대한 5개 세트의 DNA 프로브를 사용한 STAR의 검출 감도를 보여주는 히트맵, 도 14C는 L2 및 L4에서 STAR의 검출 한계로, STAR 프로브 세트는 각 유전자좌에 대해 100nM이다.
도 15는 감도를 개선하기 위한 두 세트의 STAR 프로브 조합을 나타낸다. 도 15A는 SARS-CoV-2 N 유전자와 다른 인간 코로나바이러스의 두 가지 다른 유전자좌의 개략도로, SARS-CoV-2와 다른 다른 바이러스 RNA 서열의 뉴클레오타이드는 회색으로 흐릿하다. 도 15B는 N 유전자 RNA로 설정된 STAR 프로브의 아가로스 겔 전기영동 이미지로, L2 및 L4 프로브 세트의 농도는 각각 500nM이고(a 및 b), L2 및 L4 프로브가 동시에 존재할 때 각 프로브 세트의 농도는 250nM(c)이다. 도 15C는 L2 프로브 세트(100nM), L4 프로브 세트(100nM), L2 및 L4 프로브 세트(50nM+50nM) 모두의 존재 하에서 측정된 형광 신호를 나타내며, 타겟 N 유전자 RNA의 농도는 1nM이다. 도 15D는 L2 및 L4에서 STAR 프로브 세트 조합 사용의 검출 한계로, STAR 프로브 세트의 농도는 각각의 다른 유전자좌에서 50nM이다. 도 15E는 2개의 STAR 프로브 세트(L2 및 L4) 사용 시 STAR 분석의 검출 특이성을 나타낸 것으로, SARS-CoV-2 N 유전자 RNA의 농도는 1nM이었고 나머지는 100nM이었으며, STAR 프로브 세트(L2 및 L4)의 농도는 각각 50nM이었다.
도 16은 SARS-CoV-2 D614G 돌연변이 검출을 위한 STAR의 적용을 나타낸 것이다. 도 16A는 SARS-CoV-2의 S 유전자에서 D614G 돌연변이에 대한 STAR 분석의 개략도를 나타내며, 돌연변이 부위는 노란색으로, 야생형 타겟에서 위양성 신호를 피하기 위해 빨간색으로 표시된 불일치 시퀀스를 추가했다. 도 16B는 N4 위치에서 다른 핵염기(A, T, G 및 C)를 사용하여 STAR 후에 얻은 말라카이트 그린(MG) 신호 강도를 나타낸다. 도 16C는 D614G 돌연변이에 대한 STAR의 검출 한계로, 타겟 RNA의 농도는 1 nM에서 100 fM 범위이다. 도 16D는 상이한 몰비(0%, 0.1%, 1%, 10%, 50% 및 100%)를 갖는 돌연변이/야생 타겟의 혼합물에서 D614G 돌연변이의 검출한 결과를 나타낸다.
도 17은 다중 검출을 위한 시스템을 나타낸다. 도 17A는 SARS-CoV-2 N 유전자 및 D614G 돌연변이의 동시 검출을 위한 one-pot 다중 STAR의 개략도이다. 도 17B는 망고 압타머 및 MG 압타머에 각각 결합하는 TO1-비오틴 및 MG의 정규화된 형광 방출 스펙트럼이다. 도 17C는 N 유전자 및 D614G 돌연변이의 원팟, 다중 검출 결과를 보여주는 히트맵으로, 타겟 RNA의 농도는 10nM이다. 도 17D는 다른 농도에서 N 유전자 및 D614G 돌연변이의 one-pot 다중 검출 결과를 나타낸다.
도 18은 병원체 검출을 위한 시스템을 나타낸다. 도 18A는 STAR를 사용한 병원체 검출의 개략도로, 병원체 검출을 위해 STAR 프로브는 병원체의 16s rRNA 영역에 대해 설계되었으며, (i) 하나는 추출된 total RNA를 이용한 STAR이고 (ii) 다른 하나는 열분해를 통해 얻은 cell lysate를 이용한 direct STAR이다. 도 18B는 STAR를 사용한 박테리아 16S rRNA의 검출. 100pg/μL에서 100fg/μL 범위의 총 RNA 농도를 테스트했다. 도 18C는 다른 병원체의 검출을 위한 직접 STAR의 결과를 보여주는 히트맵으로, 각 병원체의 농도는 103 cells/μL이다.
상술한 바와 같이, 등온 증폭 반응을 이용하면서도, 두개의 효소를 이용하는 경우 비특이적 신호를 발생시키고, one-step 반응이 불가능하며 반응시간도 오래 걸린다는 단점을 극복하고자 하는 필요성이 대두되었다. 본 발명자들은 기존 SMART 분석의 단점을 극복하면서 타겟 분자를 신속하게 검출할 수 있는 새로운 등온 증폭 기술을 개발하기 위해 노력한 결과, 타겟 분자를 신속하게 분석할 수 있는 3-방향 접합 기반 신규 등온 증폭 기술을 발명하였다. 본 발명에 따른 발명에서는 T7 프로모터 서열의 분할 비율의 조절을 통하여 타겟 물질에 의한 전사 반응이 효과적으로 일어나도록 설계하였으며, 이를 기반으로, 타겟 분자가 존재할 경우에만 3-방향 접합 구조 기반의 T7 프로모터가 형성되고, 이를 통해 하나의 튜브안에서 중합효소 하나만으로 증폭된 신호를 얻을 수 있도록 하였다. 또한, 추가적인 민감도 상승을 위해, 타겟 분자에서 여러 영역에 결합할 수 있도록 추가적인 3-방향 접합 구조를 설계하였으며, 이를 통해 민감도 상승을 이루어 낼 수 있었다. 본 발명은 타겟 분자가 핵산 서열인 경우, 매우 특이적으로 서열의 변화를 용이하게 구별할 수 있으며, 타겟 분자를 그대로 증폭하는 것이 아닌 타겟 분자의 종속적인 서열을 증폭하는 특성을 가지며, 이를 바탕으로 각기 다른 두 종류의 light-up RNA 압타머를 디자인하여 하나의 튜브에서 두개 이상의 분자를 동시에 확인할 수 있는 다중 분석(multiplex analysis)을 구현하였다. 뿐만 아니라, 본 발명의 우수성을 바탕으로 다양한 병원균의 검출에도 적용하여 추가적인 핵산 추출 과정 없이 병원성 미생물의 핵산 바이오 마커를 성공적으로 검출할 수 있는 방식도 검증하였으므로, 기존 방식의 발명보다 간편, 신속하며 민감하게 검출할 수 있어 우수하다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 제1프로브 및 제2프로브를 포함하는, 하나 이상의 타겟 분자 검출용 등온 단일반응(isothermal one-pot reaction) 프로브 세트로서,
상기 제1프로브는 하기 일반식 I 및 II를 포함하는 구조를 갖는 프로모터 프로브(promoter probe, PP)이고,
[일반식 I]
5'-X-Y-Z-3'
[일반식 II]
3'-Ya-5'
상기 일반식 I에서,
X는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 하나의 표지(label) 또는 다수의 표지를 포함하는 상호작용적 표지 시스템을 갖는 압타머 서열 부위이고;
Y는 T7 프로모터에 상보적인 서열이며;
Z는 타겟 분자에 결합 또는 연결되는 부위이며;
X 및 Y는 디옥시리보뉴클레오타이드이며;
상기 일반식 II에서,
Ya는 T7 프로모터의 일부 서열이고; Ya는 디옥시리보뉴클레오타이드이며;
상기 제2프로브는 하기 일반식 (III)으로 이루어진 구조를 갖는 프로모터 프로브(promoter probe,PP)이고,
[일반식 III]
3'-Yb-Z'-5'
상기 일반식 (III)에서,
Yb는 존재하지 않거나, T7 프로모터의 일부 서열이고, 디옥시리보뉴클레오타이드이며;
Z’은 타겟 분자에 결합 또는 연결되는 부위이며;
상기 제1프로브 및 제2프로브는 타겟 분자와 혼성화 된 후 중합효소에 의해 전사가 개시되어 시그널을 생성하는 것을 특징으로 하는,
타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 제공한다.
본 발명의 프로브 세트의 제1프로브는 각각 한 올리고뉴클레오타이드 분자 안에 3개의 다른 부위(portion)을 포함하는 구조와 다른 한 올리고뉴클레오타이드 분자를 포함한다: 검출 가능한 시그널을 발생시키는 하나의 표지(label) 또는 다수의 표지를 포함하는 상호작용적 표지 시스템을 갖는 압타머 서열 부위인 X, T7 프로모터에 상보적인 서열인 Y, 타겟 분자에 결합 또는 연결되는 부위인 Z; Y와 상보적인 T7 프로모터의 일부 서열인 Ya.
또한, 본 발명의 프로브 세트의 제2프로브도 한 올리고뉴클레오타이드 분자 안에 1개 또는 2개의 고유한 다른 부위를 포함하는 구조를 갖는다: Y와 상보적이고 T7 프로모터의 일부 서열이며, Ya와 연속적인 서열을 갖는 Yb; 타겟 분자에 결합 또는 연결되는 부위인 Z'. Yb는 후술하는 분할 비율에 따라 20:0인 경우는 존재하지 않을 수 있다.
이러한 구조는 본 발명의 프로브 세트가 일원화된 단계로 등온 단일 반응 조건 하에서 단시간에 높은 검출 효과를 나타내는 프로브가 되도록 한다.
본 발명에서 용어 "프로브"는 하나 이상 유형의 화학 결합을 통하여, 일반적으로 상보적 염기쌍 형성을 통하여, 보통 수소 결합 형성을 통하여 상보적인 서열의 타겟 핵산에 결합하고 따라서 이중나선(duplex) 구조를 형성할 수 있는 핵산이다. 프로브는 "프로브 결합 부위"에 결합 또는 혼성화한다. 특히, 일단 프로브가 프로브의 상보적인 타겟에 혼성화하면 프로브의 검출을 용이하게 하도록 프로브는 검출가능한 표지로 표지될 수 있다. 그러나 대안적으로, 프로브는 표지화되지 않을 수 있지만, 표지화된 리간드와의 특이적 결합에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 프로브는 크기가 상당히 다양할 수 있다. 일반적으로 프로브는 길이가 적어도 7 내지 15개 뉴클레오타이드다. 다른 프로브는 길이가 적어도 20, 30 또는 40개 뉴클레오타이드다. 또 다른 프로브는 다소 더 길며, 길이가 적어도 50, 60, 70, 80, 또는 90개 뉴클레오타이드다. 또 다른 프로브는 더욱 더 길며, 길이가 적어도 100, 150, 200개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드다. 프로브는 또한 상기 값(예컨대, 길이 가 15~20개 뉴클레오타이드)의 임의의 값으로 한정된 임의의 범위 내에 있는 임의의 길이의 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 "분자"는 검출하고자 하는 모든 종류의 생체 분자 혹은 세포를 의미하며, 생체분자는 생체를 구성하고 기능을 담당하는 표적 분자로 가장 주된 것은 단백질, 핵산, 다당류 및 지질과 같은 크기가 큰 거대 분자들과 저분자물질로 아미노산, 뉴클레오타이드, 단당류, 비타민 등의 유기물질, 철, 구리등의 금속, 무기이온 등을 의미한다. 자연 환경으로부터 추출된 생체분자, 합성에 의해 생성된 생체분자, 개시인자의 부착에 의해 변형된 생체분자를 모두 포함한다. 본 발명에서 바람직하게는 핵산, 단백질 및 세포일 수 있다.
본 발명에서 용어 "타겟 핵산서열”는 검출하고자 하는 모든 종류의 핵산을 의미하며, 서로 다른 종(species), 아종(subspecies), 또는 변종(variant) 유래의 염색체 염기서열 또는 동일 종 내 염색체 돌연변이를 포함한다. 이는 genomic DNA와 mitochondrial DNA, viral DNA를 포함하는 모든 종류의 DNA 또는 mRNA, ribosomal RNA, non-coding RNA, tRNA, viral RNA 등을 포함하는 모든 종류의 RNA를 특징으로 할 수 있으나 이에 국한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드의 올리고머를 의미한다. 본원에 사용된 용어 "핵산"은 뉴클레오타이드의 중합체를 의미한다. 본원에 사용된 용어 "서열"은 올리고뉴클레오타이드 또는 핵산의 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 올리고뉴클레오타이드 또는 핵산은 DNA, RNA, 또는 그의 유사체(예컨대, 포스포로티오에이트 유사체)일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 또는 핵산은 개질된 염기 및/또는 골격(예컨대, 개질된 포스페이트 연결부 또는 개질된 당 모이어티)도 또한 포함할 수 있다. 핵산에 안정성 및/또는 다른 이점을 부여하는 합성 골격의 비-제한적 예시는 포스포로티오에이트 연결부, 펩타이드 핵산, 잠금 핵산, 자일로스핵산 또는 그의 유사체를 포함할 수 있다.
용어 핵산은, 예를 들어 유전체 DNA; 상보 DNA(cDNA)(이는 보통 전령 RNA(mRNA)의 역전사 또는 증폭으로 얻어지는 mRNA의 DNA 표현임); 합성으로 또는 증폭으로 생성된 DNA 분자; 및 mRNA를 포함한 임의의 형태의 DNA 또는 RNA를 포함한다.
용어 핵산은 단일 가닥 분자뿐만 아니라 이중 또는 삼중 가닥 핵산을 포함한다. 이중 또는 삼중 가닥 핵산에서, 핵산 가닥은 동연(coextensive)일 필요는 없다(즉, 이중 가닥 핵산은 양 가닥의 전체 길이를 따라 이중 가닥일필요는 없다).
용어 핵산은 또한 메틸화 및/또는 캡핑과 같은 것에 의한 이의 임의의 화학적 개질을 포함한다. 핵산 개질은 개별적인 핵산 염기 또는 핵산 전체에 추가적인 전하, 분극률, 수소 결합, 정전기 상호작용, 및 기능성을 포함하는 화학기의 첨가를 포함할 수 있다. 이러한 개질은 2' 위치 당 개질, 5 위치 피리미딘 개질, 8 위치 퓨린개질, 시토신 환외(exocyclic) 아민에서의 개질, 5-브로모-우라실의 치환, 주쇄 개질, 이소염기 이소시티딘 및 이소구아니딘과 같은 특이 염기 쌍 조합 등과 같은 염기 개질을 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 프로브 디자인은 두개의 단일 가닥 DNA 프로브가 타겟 인식 부위가 노출되도록 설계되어 등온에서 타겟 분자와 프로브 세트의 혼성화를 가능하게 한다.
상기 프로브에 포함되어 있는 "타겟 분자에 결합 또는 연결되는 부위"는 타겟 분자가 핵산인 경우, 타겟 분자의 핵산 서열 일부분과 상보적인 서열을 가져 타겟 분자와 혼성화 될 수 있는 서열을 의미한다. 예를 들어, 상기 "타겟 분자에 결합 또는 연결되는 부위"은 타겟 분자의 일부분과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상 상보적인 서열을 갖는 것일 수 있다. 만일 타겟 분자가 단백질인 경우, 상기 "타겟 분자에 결합 또는 연결되는 부위"는 프로브로서 작용하는 압타머에 있어서 타겟 분자인 단백질에 결합 또는 연결될 수 있는 영역을 의미한다. 상기 "타겟 분자에 결합 또는 연결되는 부위"는 타겟 분자에 따라 적절히 그 길이를 조절할 수 있고, 특정 길이로 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 타겟 분자가 miRNA인 경우, "타겟 분자에 결합 또는 연결되는 부위"는 22개 내외의 뉴클레오타이드로 구성될 수 있으나, 타겟 분자가 mRNA나 단백질인 경우, "타겟 분자에 결합 또는 연결되는 부위"는 그보다 짧거나 더 길 수 있다.
본 발명에서 용어 "혼성화"는 상보적 염기서열을 가진 단일가닥 핵산들 간 수소결합에 의해 이중가닥 핵산이 형성되는 것을 의미하며, 어닐링(annealing)과 유사한 의미로 사용된다. 다만 조금 더 넓은 의미에서, 혼성화는 두 개의 단일가닥 간 염기서열이 완전히 상보적인 경우(perfect match)와 더불어 예외적으로 일부의 염기서열이 상보적이지 않은 경우(mismatch)까지 포함한다.
본 발명에서 용어 “상보”는 2개의 뉴클레오타이드 사이의 정확한 쌍형성에 대한 능력을 지칭한다. 즉, 핵산의 주어진 위치에서 뉴클레오타이드가 다른 핵산의 뉴클레오타이드와 수소 결합을 할 수 있다면, 2개의 핵산은 그 위치에서 서로 상보적인 것으로 여겨진다. 뉴클레오타이드의 일부만이 결합하여 2개의 단일 가닥 핵산 분자 사이의 상보성은 “부분적”일 수 있거나, 또는 전체 상보성이 단일 가닥 분자 사이에 존재할 때 상보성은 완전할 수 있다. 핵산 가닥 사이의 상보성의 정도는 핵산 가닥 사이의 혼성화의 효율 및 강도에 상당한 영향을 미친다.
타겟 분자가 타겟 핵산 서열인 경우, 제1프로브는 타겟 핵산서열의 UHS(Upstream Hybridization Sequence)에 결합하며, T7 프로모터와 상보적인 서열을 지니고, 압타머 서열을 갖고 있다. 제1프로브의 일반식 II에 포함되는 Ya는 T7 프로모터의 일부 서열에 해당하며, 제2프로브의 일반식 III에서의 Yb 또한 T7 프로모터의 나머지 일부 서열이며, Ya와 Yb는 연속적인 서열로 하나의 T7 프로모터를 이루며, 분할된 두개의 조각에 해당한다. 타겟 RNA의 존재 하에, 프로브 세트는 3방향 접합 구조를 형성하고 닉 부위(nick site)를 갖는 이중 가닥 T7 프로모터가 완성된다. 따라서, 타겟 핵산 서열이 존재하지 않는 경우에는 T7 프로모터의 서열이 Ya와 Yb로 분할되어 있으므로, 중합효소가 결합할 수 없으며, 타겟 핵산 서열이 존재하는 경우에만 중합효소가 결합하여 제1프로브의 압타머 부위의 전사가 개시된다(도 1참조).
제1프로브의 압타머 서열부위 X에 의해 특정 물질에 반응하여 시그널을 생성하므로, 최종 생산물을 확인할 수 있다.
타겟 분자가 단백질 혹은 세포인 경우, 제1프로브 및 제2프로브는 각각의 타겟 단백질 혹은 세포에 결합 또는 연결되는 부위를 갖는다. 예시적으로 도 2에 나타난 바와 같이, 단백질 혹은 세포의 타겟 부위에 특이적으로 결합하는 항체(antibody) 또는 압타머(aptamer)가 결합 또는 연결된 형태로 존재할 수 있다. 압타머의 경우, 일정한 길이(~수십 뉴클레오타이드)의 올리고뉴클레오타이드(DNA 등) 등의 상보적인 서열을 통해 연결될 수 있으며 항체의 경우 NHS(N-hydroxysuccinimide) ester synthesis등으로 결합할 수 있다.
상기의 타겟 핵산서열이 존재하는 경우와 마찬가지로, 타겟 단백질 혹은 세포의 존재 하에, 프로브 세트는 3방향 접합 구조를 형성하고 닉 부위(nick site)를 갖는 이중 가닥 T7 프로모터가 완성된다. 따라서, 타겟 단백질이 존재하지 않는 경우에는 T7 프로모터의 서열이 Ya와 Yb로 분할되어 있으므로, 중합효소가 결합할 수 없으며, 타겟 단백질 혹은 세포가 존재하는 경우에만 중합효소가 결합하여 제1프로브의 압타머 부위의 전사가 개시된다(도 2 참조).
본 발명에 있어서, 리포터로 사용되는 "압타머(Aptamer)"는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 타겟 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형 핵산)이다.
SELEX(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)라는 압타머 발굴 기술이 개발된 이후, 저분자 유기물, 펩타이드, 막 단백질까지 다양한 타겟분자에 결합할 수 있는 압타머들이 계속해서 발굴되어 왔다. 압타머는 고유의 높은 친화성(보통 pM 수준)과 특이성으로 타겟분자에 결합할 수 있다는 특성 때문에 자주 단일 항체와 비교가 되고, 특히 "화학 항체"라고 할 만큼 대체항체로서의 높은 가능성이 있다. 또한 결합하는 물질에 따라 흡수하는 파장대와 방출되는 파장대가 달라 형광을 발현하는 등의 방법으로 압타머와 특정 화학 분자의 결합을 확인할 수 있다.
본 발명의 압타머 및 상기 압타머와 상호 작용하는 반응 물질은 목적 효과로서 검출 가능한 시그널을 발생할 수 있는 한, 어떠한 종류의 압타머 및 반응 물질을 이용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 타겟 분자가 타겟 핵산서열인 경우, 제1프로브 및 제2프로브가 상기 타겟 핵산서열과 각각 혼성화 할 때, 제1프로브 및 제2프로브는 서로 바로 근접한 (immediately adjacent) 위치에 위치한다.
제1프로브의 Y와; 제1프로브의 Ya 및 제2프로브의 Yb가 혼성화되며, 하나의 T7 프로모터 구조가 형성된다. 본 명세서에서 제1프로브 및 제2프로브의 혼성화 위치를 언급하면서 사용되는 용어 "근접한(adjacent)"은 상기 두 프로브에서 Ya와 Yb의 말단이 서로 연결될 수 있도록 위치하였으며, Ya와 Yb가 Y와 혼성화될 수 있을 정도로 충분히 인접해 있는 것을 의미한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 타겟 분자는 단백질, 펩타이드, 핵산, 탄수화물, 지질(lipid), 다당류, 당단백질, 호르몬, 수용체, 항원, 항체, 바이러스, 병원균, 독성 물질, 기질, 대사 산물, ATP, 코카인, 수은, 전이 상태 유사체(transition state analog), 보조 인자(cofactor), 저해제, 약, 염료, 영양분, 성장 인자, 세포, 조직 등일 수 있으나, 이로 제한되지 않으며, 거의 모든 화학적 또는 생물학적 작동체(effector)가 될 것이며 어떤 크기의 분자들이든 사용될 수 있는 표적분자 등을 의미한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 타겟 분자는 핵산, 단백질, 세포 및 ATP일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 타겟 분자가 핵산인 경우, Z 및 Z'은 검출하고자 하는 핵산에 상보적으로 결합하는 핵산 서열이고, 상기 타겟 분자가 단백질인 경우, Z 및 Z'은 상기 단백질에 결합할 수 있는 항체 또는 압타머이고, 상기 타겟 분자가 세포인 경우, Z 및 Z'은 세포 외 단백질, 세포의 인지질, 균의 펩티도글라이칸 및 LPS로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상에 결합할 수 있는 항체, 압타머이고, 상기 타겟 분자가 ATP인 경우, Z 및 Z'은 ATP에 결합할 수 있는 split 압타머일 수 있다.
구체적으로, 상기 타겟 분자가 ATP인 경우, 바람직하게는, ATP와 같은 물질은 크기가 작은 분자에 해당하는 바, Z와 Z'은 ATP에 결합할 수 있는 별도의 분할된 압타머 부위일 수 있다. 상세하게는 논문 A. Chen et al. " Split aptamers and their applications in sandwich aptasensors" Trends in Analytical Chemistry 80 (2016) 581-593에 개시된 내용을 참고한다. 이에 기재된 바와 같이, 타겟 분자가 ATP인 경우 온전한 ATP에 결합하는 DNA 압타머를 절반으로 잘라서, 2가닥의 DNA aptamer (Split DNA aptamer)를 만들어서 사용할 수 있음을 의미하며, 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 사용 가능하다.
타겟 분자에 결합 또는 연결되는 부위는 대표적으로 항체, 펩타이드, 핵산 및 압타머 등이 있다.
항체는 항원의 항원결정부(epitope)과 특이적 결합을 하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질이다. 압타머(aptamer)는 저분자 화합물로부터 단백질까지 다양한 종류의 물질에 높은 친화성과 특이적으로 결합할 수 있는 특성을 가지는 작은 (20~60 뉴클레오타이드) 단일가닥핵산 (DNA 혹은 RNA) 조각을 뜻한다.
상기 프로브는 상기 검출 가능한 시그널을 발생시키는 하나의 표지 또는 다수의 표지를 포함하는 상호작용적 표지 시스템을 갖는 압타머 서열 부위 및 상기 타겟 분자와 결합 또는 연결되는 부위 사이에 결합된 링커(linker) 영역을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 링커 영역은 프로브의 일 말단에 타겟 분자와 결합 또는 연결되는 부위에 도달하기 위해 도입될 수 있으며, 상기 링커 영역의 구체적인 종류는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 상기 링커 영역은 4 내지 10개의 짧은 핵산 서열을 갖는 뉴클레오타이드일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 프로브 세트에 있어서, 상기 Ya 및 Yb는 T7 프로모터의 일부 서열이며, 상기 Ya 및 Yb는 상기 Ya 및 상기 Yb 순서로 연속적으로 배열될 경우 상기 T7 프로모터를 이루고, Ya : Yb 분할 비율은 20:0 내지 15:5 일 수 있다.
T7 프로모터 서열이 제1프로브와 제2프로브에 분할되어 존재하기 때문에 타겟 분자가 존재하지 않는 경우에는 T7 프로모터에 중합효소가 결합하여 전사가 개시될 수 없으며, 최종적으로 제1프로브 및 제2프로브의 전사 결과물 상의 표지로부터 나오는 시그널이 생성되지 않으므로, 타겟 분자의 검출은 달성되지 않는다. 타겟 분자가 존재하는 경우, 제1프로브의 Ya와 제2프로브의 Yb가 연속적으로 배열되어 T7 프로모터를 이루고, 중합효소에 의해 전사과정이 개시된다. 전사과정이 개시되는 경우, 상기 압타머 서열을 함유하는 제1프로브의 X의 산물이 생성될 수 있다.
기존 SMART(Signal mediated amplification of RNA technology) 기술은 DNA 중합효소를 이용하고, 그 이후 RNA 중합효소를 순차적으로 이용하여 2개의 효소를 이용해야 했으며, 이에 따라 두개의 효소가 같이 존재하는 경우 비특이적인 신호를 발생시키므로, one-step 반응이 불가능하고, 반응 시간 또한 오래 걸렸었다. 다만, 본 발명은 T7 RNA 프로모터를 DNA 중합효소에 의해 생성하는 단계를 생략하였으며, 대신 T7 프로모터를 분할하여 타겟이 존재하지 않는 경우에는 T7 프로모터 자체가 생성되지 않도록 하였다. 이를 통해 하나의 중합효소만으로도 타겟 분자를 검출할 수 있는 시스템을 도입하였으며, 하나의 효소를 사용하므로 비특이적인 신호의 발생이 적고, 반응 시간 짧아졌으므로, 신속한 반응이 가능하다.
즉, 본 발명의 핵심은 3방향 접합 구조를 유도하여 타겟 분자의 존재 하에서 분할 T7 프로모터의 효과적인 형성이기 때문에, 본 발명에 있어서, 기존의 T7 프로모터를 분할하여 각 비율에 따른 전사 효율을 분석하였다. 구체적으로, 본 발명의 일실시예에 있어서, 실시예 1-1에서는 T7 프로모터 형성을 조절하기 위해서 T7 프로모터의 5' 말단 부분부터 순차적으로 닉 부위를 삽입하여 다양한 비율로 분할된 T7 프로모터를 제작하였다. 압타머의 상보적 서열을 주형에 배치하여 전사 후, 생성된 산물의 전사 반응을 모니터링 하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 5' 말단 부위부터 0:20부터 5:15까지 순차적으로 삽입한 결과, 3:17 비율 이후에는 SP1의 부재로 인해 형광 값이 급격히 낮아졌으며, 이는 T7 프로모터 5'쪽의 3-뉴클레오타이드 부분이 T7 RNA 중합효소가 T7 프로모터를 특이적으로 인식하는데 중요함을 나타내며, 5:15의 경우 SP1와 SP2가 모두 존재하는 경우에도 전사가 거의 진행되지 않는 것을 확인하였으며, 이로 보아 T7 프로모터의 5'쪽의 5-mer 이후 닉 부위가 존재하면 T7 RNA 중합효소가 정상적으로 인식하지 못함을 알 수 있다. 3방향 접합구조 형성을 통하여 온전한 이중가닥 형태의 T7 프로모터를 이루기 위해서는 5' 말단 부위로부터 4:16 분할 비가 가장 적합하다는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 일실시예에 있어서, 분할비율은 적절하게 조절될 수 있으며, 가장 바람직하게는 Ya : Yb 분할 비율은 16:4일 수 있다.
본 발명의 프로브 세트에 있어서, 상기 표지는 화학적 표지, 효소 표지, 방사능 표지, 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지 및 금속 표지로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 제1프로브의 상기 일반식 I은, Y와 Z 사이에 중첩서열 W를 추가로 포함한 일반식 I'로 변형될 수 있고;
[일반식 I']
5'-X-Y-W-Z-3'
상기 제2프로브의 상기 일반식 III은, Yb와 Z' 사이에 중첩서열 W'를 추가로 포함한 일반식 III'으로 변형될수 있는 것을 특징으로 하는;
[일반식 III']
3'-Yb-W'-Z'-5'
타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트일 수 있다.
상기 중첩서열은 타겟 분자가 존재하는 경우, 3방향 접합 구조가 너무 짧은 중첩으로 인해 완벽히 이루어지지 않아 T7 프로모터가 형성이 안되어 전사가 효과적으로 이루어지지 않는 점을 극복하기 위하여 도입되었다. 중첩서열 W와 W'은 서로 상보적이다.
따라서, 바람직한 일실시예에 있어서, 구체적으로, 실시예 1-2에서 상기 Ya:Yb의 16:4 비율의 T7 프로모터를 3방향 접합 구조체에 적용시키기 위한 구조 최적화를 진행하였다. T7 프로모터 3'쪽의 16-뉴클레오타이드는 단일 주형(Signal template, ST)에 상보적으로 결합하며 보편적이다. 타겟 RNA가 존재하는 경우에만 ST와 분할된 T7-16(Split T7-16, ST-16)으로 구성된 첫 번째 프로브와 두 번째 프로브(Split T7-4, ST-4)를 결합하여 닉 부위가 있는 완전한 T7 프로모터를 형성해야 하므로, 중첩서열 부분의 Tm value가 가장 중요 요인이며 추가 중첩서열(0~4bp)을 배치하여 Tm value를 조절하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 중첩서열(N=0)이 T7 프로모터의 4bp일 경우 타겟서열이 존재하지 않을 때 형광이 나오지 않아 구조를 형성하지 않는 목적에 적합하나, 타겟 핵산서열이 존재할 때에 3방향 구조가 너무 짧은 중첩으로 인해 완벽히 이루어지지 않아 T7 프로모터가 형성이 안되어 전사가 효과적으로 수행되지 않음을 확인할 수 있다. 중첩 서열을 1bp이상 추가한 경우(N=1), 타겟서열이 존재할 때만 높은 형광 값을 나타냄을 확인하였다. 이를 통해 3-way 접합 구조를 안정적으로 형성하고 전사 반응을 유도하기 위해서는 T7 프로모터부터의 4bp 외에 적어도 1bp의 중첩이 필요함을 확인했다. 추가된 중첩 서열이 3bp를 초과하는 경우, 타겟서열이 존재하지 않아도 비특이적인 전사가 진행되므로, 적절한 추가 중첩서열은 2bp로 설정되었고, 전체 중첩 영역은 6bp(T7 프로모터로부터 4bp)로 설정되었다. 또한, 실시예 1-2에서 확인한 바와 같이, 상보적이지 않은 경우, 3-방향 접합 구조에 bulge가 형성되어 구조의 안정성이 떨어질 수 있다(도 5).
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 중첩서열 W 및 W'의 길이는 1bp 또는 2bp일 수 있다.
본 발명의 프로브 세트에 있어서, 상기 등온 단일 반응은, 15℃ 내지 50℃ 범위의 일정한 온도에서 수행될 수 있다. 상기 15℃ 내지 50℃ 범위의 온도는 당업계에 효소가 작용하는 것으로 알려진 온도로서, 본 발명의 목적 효과를 획득할 수 있는 한, 이에 제한되지 않는다. 다만, 본 발명의 실시예 1-3에서 확인한 바와 같이, 본 발명의 반응은 37℃인 경우, 효율이 가장 좋은 것을 확인하였다(도 8C). 따라서, 상기 등온 단일 반응의 일정한 온도는 바람직하게는 34℃ 내지 40℃이다.
본 발명의 프로브 세트에 있어서, 프로브 세트는 선형 RNA(linear RNA)와 구분하여 원형 RNA(circular RNA)를 검출할 수 있다. 구체적으로, 도 12에 나타난 바와 같이, 선형 RNA의 양 말단에 본 발명의 제1프로브와 제2프로브가 각각 결합할 수 있고, 선형 RNA의 양 말단이 결합하여 원형 RNA를 만드는 경우에만 제1프로브와 제2프로브가 결합이 가능하고, T7 프로모터가 완성된다. 따라서, 본 발명의 프로브 세트를 이용하여 선형 RNA와는 구별되게 원형 RNA의 경우에만 T7 프로모터가 형성이 될 수 있어 전사의 진행이 가능하므로 원형 RNA의 검출에 이용할 수 있다.
본 발명의 프로브 세트에 있어서, 상기 중합효소는 박테리오파지 T7 RNA 중합 효소, 박테리오파지 T3 중합 효소, 박테리오파지 RNA 중합 효소, 박테리오파지 ΦII 중합 효소, 살모넬라 박테리오파지 sp6 중합 효소, 슈도모나스 박테리오파지 gh-1 중합효소, 대장균(E. coli) RNA 중합효소 홀로효소(holoenzyme), 대장균(E. coli) RNA 중합효소 코어 효소, 인간 RNA 중합효소 I, 인간 RNA 중합효소 II, 인간 RNA 중합효소 III, 인간 미토콘드리아 RNA 중합효소 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는 중합효소는 박테리오파지 T7 RNA 중합효소를 이용하였다.
본 발명의 프로브 세트에 있어서, 상기 등온 단일 반응은 Tris-HCl, MgCl2, DTT, 스페르미딘, rNTPs, RNase 억제제 및 SSB(Single-Stranded DNA Binding Protein)가 포함된 단일 반응 용액으로 일원화되어 동시 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
구체적으로, 일 실시예에 있어서 실시예 1-3에서는 제안된 프로브세트의 최상의 성능을 얻기 위해 버퍼, 효소, 반응 시간 및 반응 온도에 대한 최적화 실험을 수행하였다.
본 발명에서, 상기 단일 반응 용액은 바람직하게는, 1 내지 50mM의 MgCl2, 0.1 내지 10mM의 DTT, 0.1 내지 10mM의 스페르미딘, 1 내지 100ng/μL의 단일 가닥 DNA 결합 단백질(SSB), 1 내지 100U의 T7 RNA 중합효소를 포함하며, 보다 바람직하게는 1 내지 30mM의 MgCl2, 0.5 내지 5mM의 DTT, 1 내지 5mM의 스페르미딘, 10 내지 50ng/μL의 단일 가닥 DNA 결합 단백질(SSB), 10 내지 50U의 T7 RNA 중합효소를 포함하고, 가장 바람직하게는 10mM의 MgCl2, 1.5mM의 DTT, 3mM의 스페르미딘, 20ng/μL의 단일 가닥 DNA 결합 단백질(SSB), 20U의 T7 RNA 중합효소를 포함할 수 있다(도 6 내지 도 9).
본 발명은 또한 상기 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 포함하는, 타겟 분자 검출용 조성물을 제공한다.
타겟 분자 검출용 조성물은 타겟 분자와 특이적으로 결합하는 핵산서열, 펩타이드 외에 타겟 분자의 검출 및/또는 분석에 일반적으로 사용되는 도구 및/또는 시약을 더 포함할 수 있다. 이러한 도구나 시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함될 수 있다. 표지물질이 형광물질인 경우에는 형광 세기를 측정하는 데 필요한 기질 등을 더 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 가용성 담체, 예를 들어, 당업계에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액(예를 들어, PBS 등); 불용성 담체, 예를 들어, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드 등; 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및/또는 이들의 조합이 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 조성물은 2종 이상의 타겟 분자를 검출하기 위한 2종 이상의 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 상기 2종 이상의 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트는 각각 서로 상이한 상호작용적 표지 시스템을 포함하고; 상기 2종 이상의 프로브 세트 각각은 각각 서로 상이한 타겟 분자에 결합하여; 이로 인해 서로 상이한 타겟 분자의 다중 검출이 가능할 수 있다.
즉, 상기 2종 이상의 타겟은 단일 병원체에 존재하는 서로 다른 타겟 부위일 수 있으며, 이 경우, 타겟의 다른 부위를 효과적으로 검출하여 더욱 정확하고 정밀한 진단이 가능하다.
구체적으로, 본 발명의 실시예 2 및 3에서는 SARS-CoV-2를 타겟 물질로 하여 서로 다른 타겟 부위를 타겟으로 검출용 프로브를 설계하였다. 그 결과, L2, L4로 표시되는 두 유전좌위를 대상으로 하는 프로브를 디자인하였으며, 그 결과 두개의 프로브가 타겟 핵산서열의 각 영역에 특이적으로 결합하는 것으로 나타났다(도 15 참조). 따라서, 타겟의 다른 부위를 효과적으로 검출하였으므로 더욱 정확한 검출이 가능하다.
뿐만 아니라, 하나의 튜브에서 SARS-CoV-2의 D614G 돌연변이 및 N 유전자의 동시 검출을 테스트하였으며, 여기서 망고 압타머 및 말라카이트 그린 압타머는 각각 SARS-CoV-2의 N 유전자 및 D614G가 간섭 없이 형광을 방출하였다(도 17C). 100 fM까지 N 유전자와 D614G에 대한 타겟을 동시에 분석할 수 있어, 매우 민감하게 검출이 가능함을 확인하였다(도 17D).
또한, 상기 2 종 이상의 타겟은 상호작용적으로 상이한 분자 진단 대상, 예컨대, 감염성 유해 미생물일 수 있고, 이 경우, 서로 다른 병원체를 동시 검출 및 진단이 가능하다.
구체적으로, 본 발명의 실시예 6에서는 두 병원성 박테리아에 대한 검출을 수행하였으며, 그 결과 E.coli와 MRSA 모두 각각의 프로브에 특이적으로 결합하여 높은 형광 신호를 발생시키는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명으로 서로 다른 병원체를 개별적으로 또는 동시에 검출 및 진단이 가능하다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 등온 단일 반응은, 15℃ 내지 50℃ 범위의 일정한 온도에서 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 타겟 분자 검출용 조성물, 중합효소 및 등온 단일 반응 용액을 포함하는, 타겟 분자 검출용 키트를 제공한다.
본 명세서에서 상술한 본 발명의 키트는 추가적으로, 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 효소, 다양한 버퍼 및 시약을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 양성 대조군 및 음성 대조군 반응을 실시하는 데 필수한 시약을 포함할 수 있다. 어떤 하나의 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 키트는 상기 서술된 본 발명의 프로브 세트에 의한 타겟 분자 검출을 실시하기 위하여 제작되기 때문에, 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
또한, 본 발명은 상기 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 이용하여 타겟 분자를 검출하는 방법을 제공하며, 구체적으로 다음의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 샘플에, 본 발명의 제1프로브 및 제2프로브로 구성되는 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응(isothermal one-pot reaction) 프로브 세트를 처리하여 타겟 분자와 결합 또는 혼성화시키는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 혼성화 산물에 중합효소를 처리하여 전사를 개시시키는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 전사 산물에 압타머-반응 물질을 처리하여 전사 산물 내 압타머의 시그널 생성을 검출하는 단계.
이때, 상기 단계 (c)의 시그널 생성은 샘플 중 타겟 분자의 존재를 나타내는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 타겟 분자 검출 방법은, 별도의 증폭반응 없이, 등온 단일 반응 조건하에서 타겟 분자를 검출하는 것을 특징으로 한다.
따라서, 본 발명의 프로브 세트를 이용하는 타겟 분자를 검출하는 방법은 혼성화 단계, 전사 반응, 압타머의 시그널 반응까지 동시에 일어나도록 설계된 것이며, 본 발명의 (a) 내지 (c)단계는 하나의 용기 내에서 동시에 수행 가능하다.
또한, 최종 신호 확인에 사용되는 압타머는 말라카이트 그린 압타머로 제한하지 않으며 어떠한 종류의 RNA 기반의 형광 압타머도 사용 가능하다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 이용하여 타겟 분자를 검출하는 방법 이전에, 등온 핵산 증폭 반응을 수행할 수 있다.
등온 핵산 증폭 반응의 종류는 특별히 제한되지 않지만, 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 등온 핵산 증폭 반응은 RPA(Recombinase Polymerase Amplification)일 수 있다.
본 명세서에 있어서 용어 "재조합-중합효소 증폭법"은 DNA 및 RNA 증폭을 확인할 수 있는 기술을 의미하며, 기존 PCR 과는 다르게 DNA 결합 단백질과 재조합효소(recombinase)를 이용하여 빠르고 정확하게 타겟 서열(target sequence)을 증폭시킬 수 있는 기술이다. RPA 방법은 중온성 중합효소(mesophilic polymerase)를 이용하여 등온 조건에서도 증폭이 가능하므로, 특별한 장비 없이 등온 장치만 있으면 단시간 안에 바이러스를 검출 및 진단할 수 있는 장점이 있다.
상기 (a) 단계 이전에 RPA를 실시하면, 본 발명의 STAR 반응을 진행하였을 때에 비하여 신호가 증폭되는 것을 확인하였다(도 13참조). 따라서, 본 발명과 연계하여 등온 핵산 증폭반응을 수행하여 타겟 분자를 더욱 민감하게 검출하는 방법으로 이용할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 이용한 현장용 분자 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 명세서에 있어서 "현장용 분자 진단 방법"이란, 의료현장에서 속하게 현장 진단이 가능하며, 세포 내의 분자 수준, 병균의 유전자(RNA, DNA)를 직접 검사하여 정밀하게 진단하는 방법을 의미한다.
상기 현장용 분자 진단 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다:
(a) 샘플에, 제1프로브 및 제2프로브로 구성되는 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응(isothermal one-pot reaction) 프로브 세트를 처리하여 타겟 분자와 혼성화시키는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 혼성화 산물에 중합효소를 처리하여 전사를 개시시키는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 전사 산물에 압타머-반응 물질을 처리하여 전사 산물 내 압타머의 시그널 생성을 검출하는 단계.
이때, 상기 단계 (c)의 시그널 생성은 샘플 중 타겟 분자의 존재를 나타내는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 현장용 분자 진단 방법에 있어서, 상기 분자 진단 방법은 병원성 미생물 검출에 사용될 수 있다.
본 발명의 명세서에 있어서 "병원성 미생물"이란, 인체에 기생하여 질환을 일으키는 미생물을 의미하며, 본 발명의 실시예에 기재된 병원성 미생물에 제한되지 않으며, 모든 병원성 미생물에 적용이 가능하다.
본 발명의 현장용 진단 방법에 있어서, 상기 병원성 미생물은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus Aureus), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 대장균(E. coli), 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus), 인플루엔자 A 바이러스(Influenza A virus), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus), 호흡기 세포 융합 바이러스(RSV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV), 인유두종 바이러스(HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스(HPIV), 뎅기열 바이러스, B형 간염 바이러스(Hepatitis B Virus (HBV)), 황열병 바이러스, 광견병 바이러스, 플라스모디움, 거대세 포바이러스(CMV), 미코박테리움 튜버큘로시스, 클라미디아 트라코마티스, 로타바이러스, 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 크리민 콩고 출혈열 바이러스 (Crimean-Congo hemorrhagic fever virus), 에볼라 바이러스, 지카 바이러스, 헤니파바이러스, 노로바이러스, 라사바이러스, 리노바이러스, 플라비바이러스, 리프트 밸리 열 바이러스, 수족구병 바이러스, 살모넬라(Salmonella sp.), 쉬켈라(Shigella sp.), 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae sp.), 슈도모나스(Pseudomonas sp.), 모락셀라(Moraxella sp.), 헬리코박터(Helicobacter sp.) 및 스테노트로 포모나스(Stenotrophomonas sp.)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 제3프로브 및 제4프로브를 포함하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응(isothermal one-pot reaction) 프로브 세트로서,
상기 제3프로브는 하기 일반식 IV 및 V를 포함하는 구조를 갖는 프로모터 프로브(promoter probe, PP)이고,
[일반식 IV]
5’-A-B-C-3’
[일반식 V]
3'-Ba-5'
상기 일반식 IV에서,
A는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 하나의 표지(label) 또는 다수의 표지를 포함하는 상호작용적 표지 시스템을 갖는 압타머 서열 부위이고;
B는 T7 프로모터에 상보적인 서열이며;
C는 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이 핵산서열과 상보적인 혼성화 서열을 갖는 UHS(Upstream Hybridization Sequence) 부위이며; 상기 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이 핵산서열은 DNA 또는 RNA이고;
A, B 및 C는 디옥시리보뉴클레오타이드이며;
상기 일반식 V에서,
Ba는 T7 프로모터의 일부 서열이고; Ba는 디옥시리보뉴클레오타이드이며;
상기 제4프로브는 하기 일반식 (VI)으로 이루어진 구조를 갖는 프로모터 프로브(promoter probe,PP)이고,
[일반식 VI]
3'-Bb-C'-5'
상기 일반식 (VI)에서,
Bb는 존재하지 않거나, T7 프로모터의 일부 서열이고;
C’은 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이 핵산서열과 상보적인 혼성화 서열을 갖는 DHS(Downstream Hybridization Sequence) 부위이며; 상기 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이 핵산서열은 DNA 또는 RNA이고;
Bb 및 C’는 디옥시리보뉴클레오타이드이며;
상기 제3프로브 및 제4프로브는 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이 핵산서열과 혼성화 된 후 중합효소에 의해 전사가 개시되어 시그널을 생성하는 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 제공한다.
본 발명의 프로브 세트의 제3프로브는 각각 한 올리고뉴클레오타이드 분자 안에 3개의 다른 부위(portion)를 포함하는 구조와 다른 한 올리고뉴클레오타이드 분자를 포함한다: 검출 가능한 시그널을 발생시키는 하나의 표지(label) 또는 다수의 표지를 포함하는 상호작용적 표지 시스템을 갖는 압타머 서열 부위인 A, T7 프로모터에 상보적인 서열인 B, SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이와 혼성화되는 부위인 C; B와 상보적인 T7 프로모터의 일부 서열인 Ba.
또한, 본 발명의 프로브 세트의 제4프로브도 한 올리고뉴클레오타이드 분자 안에 1개 또는 2개의 고유한 다른 부위를 포함하는 구조를 갖는다: B와 상보적이고 T7 프로모터의 일부 서열이며, Ba와 연속적인 서열을 갖는 Bb; SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이와 혼성화되는 부위인 C'. Bb는 후술하는 분할 비율에 따라 20:0인 경우는 존재하지 않을 수 있다.
이러한 구조는 본 발명의 프로브 세트가 일원화된 단계로 등온 단일 반응 조건 하에서 단시간에 높은 검출 효과를 나타내는 프로브가 되도록 한다.
보다 구체적으로, 본 발명의 프로브 디자인은 두개의 단일 가닥 DNA 프로브가 타겟 인식 부위가 노출되도록 설계되어 등온에서 SARS-CoV-2와 프로브 세트의 혼성화를 가능하게 한다.
제3프로브의 C는 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이의 UHS(Upstream Hybridization Sequence)에 결합하며, T7 프로모터와 상보적인 서열을 지니고, 압타머 서열을 갖고 있다. 제3프로브의 일반식 V에 포함되는 Ba는 T7 프로모터의 일부 서열에 해당하며, 제4프로브의 일반식 VI에서의 Bb 또한 T7 프로모터의 나머지 일부 서열이며, Ba와 Bb는 연속적인 서열로 하나의 T7 프로모터를 이루며, 분할된 두개의 조각에 해당한다. SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이의 존재 하에, 프로브 세트는 3방향 접합 구조를 형성하고 닉 부위(nick site)를 갖는 이중 가닥 T7 프로모터가 완성된다. 따라서, SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이가 존재하지 않는 경우에는 T7 프로모터의 서열이 Ba와 Bb로 분할되어 있으므로, 중합효소가 결합할 수 없으며, SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이가 존재하는 경우에만 중합효소가 결합하여 제3프로브의 압타머 부위의 전사가 개시된다(도 1참조).
제3프로브의 압타머 서열부위 A에 의해 특정 물질에 반응하여 시그널을 생성하므로, 최종 생산물을 확인할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 제3프로브 및 제4프로브가 상기 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이와 각각 혼성화 할 때, 제3프로브 및 제4프로브는 서로 바로 근접한 (immediately adjacent) 위치에 위치한다.
제3프로브의 B와; 제3프로브의 Ba 및 제4프로브의 Bb가 혼성화되며, 하나의 T7 프로모터 구조가 형성된다. 본 명세서에서 제3프로브 및 제4프로브의 혼성화 위치를 언급하면서 사용되는 용어 "근접한(adjacent)"은 상기 두 프로브에서 Ba와 Bb의 말단이 서로 연결될 수 있도록 위치하였으며, Ba와 Bb가 B와 혼성화될 수 있을 정도로 충분히 인접해 있는 것을 의미한다.
상기 프로브는 상기 검출 가능한 시그널을 발생시키는 하나의 표지 또는 다수의 표지를 포함하는 상호작용적 표지 시스템을 갖는 압타머 서열 부위 및 상기 타겟 분자와 결합 또는 연결되는 부위 사이에 결합된 링커(linker) 영역을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 링커 영역은 프로브의 일 말단에 타겟 분자와 결합 또는 연결되는 부위에 도달하기 위해 도입될 수 있으며, 상기 링커 영역의 구체적인 종류는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 상기 링커 영역은 4 내지 10개의 짧은 핵산 서열을 갖는 뉴클레오타이드일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 프로브 세트에 있어서, 상기 Ba 및 Bb는 T7 프로모터의 일부 서열이며, 상기 Ba 및 Bb는 상기 Ba 및 상기 Bb 순서로 연속적으로 배열될 경우 상기 T7 프로모터를 이루고, Ba : Bb 분할 비율은 20:0 내지 15:5 일 수 있다.
T7 프로모터 서열이 제3프로브와 제4프로브에 분할되어 존재하기 때문에 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이가 존재하지 않는 경우에는 T7 프로모터에 중합효소가 결합하여 전사가 개시될 수 없으며, 최종적으로 제3프로브 및 제4프로브의 전사 결과물 상의 표지로부터 나오는 시그널이 생성되지 않으므로, SARS-CoV-2및/또는 이의 돌연변이의 검출은 달성되지 않는다. SARS-CoV-2및/또는 이의 돌연변이가 존재하는 경우, 제3프로브의 Ba와 제4프로브의 Bb가 연속적으로 배열되어 T7 프로모터를 이루고, 중합효소에 의해 전사과정이 개시된다. 전사과정이 개시되는 경우, 상기 압타머 서열을 함유하는 제3프로브의 A의 산물이 생성될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 분할비율은 적절하게 조절될 수 있으며, 가장 바람직하게는 Ba : Bb 분할 비율은 16:4일 수 있다.
본 발명의 프로브 세트에 있어서, 상기 표지는 화학적 표지, 효소 표지, 방사능 표지, 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지 및 금속 표지로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 제3프로브의 상기 일반식 IV은, B와 C 사이에 중첩서열 D를 추가로 포함한 일반식 IV'로 변형될 수 있고;
[일반식 IV']
5'-A-B-D-C-3'
상기 제4프로브의 상기 일반식 VI은, Bb와 C' 사이에 중첩서열 D'를 추가로 포함한 일반식 VI'으로 변형될수 있는 것을 특징으로 하는;
[일반식 VI']
3'-Bb-D'-C'-5'
SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트일 수 있다.
상기 중첩서열은 SARS-CoV-2및/또는 이의 돌연변이가 존재하는 경우, 3방향 접합 구조가 너무 짧은 중첩으로 인해 완벽히 이루어지지 않아 T7 프로모터가 형성이 안되어 전사가 효과적으로 이루어지지 않는 점을 극복하기 위하여 도입되었다. 중첩서열 D와 D'은 서로 상보적이다.
따라서, 바람직한 일실시예에 있어서, 구체적으로, 실시예 1-2에서 상기 Ba:Bb의 16:4 비율의 T7 프로모터를 3방향 접합 구조체에 적용시키기 위한 구조 최적화를 진행하였다. T7 프로모터 3'쪽의 16-뉴클레오타이드는 단일 주형(Signal template, ST)에 상보적으로 결합하며 보편적이다. SARS-CoV-2및/또는 이의 돌연변이가 존재하는 경우에만 ST와 분할된 T7-16(Split T7-16, ST-16)으로 구성된 첫 번째 프로브와 두 번째 프로브(Split T7-4, ST-4)를 결합하여 닉 부위가 있는 완전한 T7 프로모터를 형성해야 하므로, 중첩서열 부분의 Tm value가 가장 중요 요인이며 추가 중첩서열(0~4bp)을 배치하여 Tm value를 조절하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 중첩서열(N=0)이 T7 프로모터의 4bp일 경우 SARS-CoV-2가 존재하지 않을 때 형광이 나오지 않아 구조를 형성하지 않는 목적에 적합하나, SARS-CoV-2가 존재할 때에 3방향 구조가 너무 짧은 중첩으로 인해 완벽히 이루어지지 않아 T7 프로모터가 형성이 안되어 전사가 효과적으로 수행되지 않음을 확인할 수 있다. 중첩 서열을 1bp이상 추가한 경우(N=1), SARS-CoV-2가 존재할 때만 높은 형광 값을 나타냄을 확인하였다. 이를 통해 3-way 접합 구조를 안정적으로 형성하고 전사 반응을 유도하기 위해서는 T7 프로모터부터의 4bp 외에 적어도 1bp의 중첩이 필요함을 확인했다. 추가된 중첩 서열이 3bp를 초과하는 경우, SARS-CoV-2가 존재하지 않아도 비특이적인 전사가 진행되므로, 적절한 추가 중첩서열은 2bp로 설정되었고, 전체 중첩 영역은 6bp(T7 프로모터로부터 4bp)로 설정되었다. 또한, 실시예 1-2에서 확인한 바와 같이, 상보적이지 않은 경우, 3-방향 접합 구조에 bulge가 형성되어 구조의 안정성이 떨어질 수 있다(도 5).
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 중첩서열 D 및 D'의 길이는 1bp 또는 2bp일 수 있다.
본 발명의 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트에 있어서, 상기 등온 단일 반응은, 15℃ 내지 50℃ 범위의 일정한 온도에서 수행될 수 있다. 상기 15℃ 내지 50℃ 범위의 온도는 당업계에 효소가 작용하는 것으로 알려진 온도로서, 본 발명의 목적 효과를 획득할 수 있는 한, 이에 제한되지 않는다. 다만, 본 발명의 실시예 1-3에서 확인한 바와 같이, 본 발명의 반응은 37℃인 경우, 효율이 가장 좋은 것을 확인하였다(도 8C). 따라서, 상기 등온 단일 반응의 일정한 온도는 바람직하게는 34℃ 내지 40℃이다.
본 발명의 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트에 있어서, 상기 중합효소는 박테리오파지 T7 RNA 중합 효소, 박테리오파지 T3 중합 효소, 박테리오파지 RNA 중합 효소, 박테리오파지 ΦII 중합 효소, 살모넬라 박테리오파지 sp6 중합 효소, 슈도모나스 박테리오파지 gh-1 중합효소, 대장균(E. coli) RNA 중합효소 홀로효소(holoenzyme), 대장균(E. coli) RNA 중합효소 코어 효소, 인간 RNA 중합효소 I, 인간 RNA 중합효소 II, 인간 RNA 중합효소 III, 인간 미토콘드리아 RNA 중합효소 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 중합효소는 박테리오파지 T7 RNA 중합효소를 이용하였다.
본 발명의 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트에 있어서, 상기 등온 단일 반응은 Tris-HCl, MgCl2, DTT, 스페르미딘, rNTPs, RNase 억제제 및 SSB(Single-Stranded DNA Binding Protein)가 포함된 단일 반응 용액으로 일원화되어 동시 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
구체적으로, 일 실시예에 있어서 실시예 1-3에서는 제안된 프로브세트의 최상의 성능을 얻기 위해 버퍼, 효소, 반응 시간 및 반응 온도에 대한 최적화 실험을 수행하였다.
본 발명에서, 상기 단일 반응 용액은 바람직하게는, 1 내지 50mM의 MgCl2, 0.1 내지 10mM의 DTT, 0.1 내지 10mM의 스페르미딘, 1 내지 100ng/μL의 단일 가닥 DNA 결합 단백질(SSB), 1 내지 100U의 T7 RNA 중합효소를 포함하며, 보다 바람직하게는 1 내지 30mM의 MgCl2, 0.5 내지 5mM의 DTT, 1 내지 5mM의 스페르미딘, 10 내지 50ng/μL의 단일 가닥 DNA 결합 단백질(SSB), 10 내지 50U의 T7 RNA 중합효소를 포함하고, 가장 바람직하게는 10mM의 MgCl2, 1.5mM의 DTT, 3mM의 스페르미딘, 20ng/μL의 단일 가닥 DNA 결합 단백질(SSB), 20U의 T7 RNA 중합효소를 포함할 수 있다(도 6 내지 도 8).
본 발명의 프로브 세트에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이의 핵산 서열 부위는 N 유전자 또는 S 유전자 인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 프로브 세트에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 검출용 등온 단일반응 프로브 세트는 N 유전자에 특이적으로 결합하고, 상기 제3프로브는 서열번호 37, 제4프로브는 서열번호 38로 이루어진 프로브 세트; 및 상기 제3프로브는 서열번호 41, 제4프로브는 서열번호 42로 이루어진 프로브 세트로 이루어진 군에서 선택되는 1종을 포함하는 프로브 세트일 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 실시예 2 및 3에서는 SARS-CoV-2의 N 유전자를 타겟 물질로 하여 N 유전자 내의 서로 다른 부위를 타겟으로 검출용 프로브를 설계하였다. 그 결과, L2, L4로 표시되는 두 유전좌위를 대상으로 하는 프로브를 디자인하였으며, 두개의 프로브가 타겟 핵산서열의 각 영역에 특이적으로 결합하는 것으로 나타났다(도 14 참조). L2에 결합하는 제3프로브는 서열번호 37, 제4프로브는 서열번호 38로 이루어진 프로브 세트이며, L4에 결합하는 제3프로브는 서열번호 41, 제4프로브는 서열번호 42로 이루어진 프로브 세트이다. 이를 각각 이용하는 경우, 정량적으로 100fM까지 검출이 가능함을 나타낸다(도 14C).
나아가, L2와 L4에 동시에 결합하는 프로브를 동시에 처리한 경우, 하나의 프로브 세트를 사용한 경우보다 형광강도가 증가함을 확인하였다(도 15C). 따라서, 타겟하는 SARS-CoV-2 또는 이의 돌연변이 RNA 농도가 낮은 제한된 상황에서 신호 개선을 위한 방법으로 사용될 수 있다.
한편, 바이러스의 세포 내 침입 시 중요한 역할을 하는 스파이크 단백질의 614번 아미노산을 아스파트산 (D)에서 글리신 (G)로 바뀐 G형의 바이러스는 3월 이후 유럽과 미국에서 급격히 증가해 현재는 거의 대부분 지역에서 나타나고 있다. 최근 보고된 바에 따르면 70여개 넘는 코로나바이러스 변이가 발생한 것으로 확인되었고, 전파력이 증가된 변이가 8개(D614G 등)로 S형(S 단백질의 614번위치의 아미노산이 D), G형(S 단백질의 614번 위치의 아미노산이 G) 등이 확인되었다.
본 발명에서는 D614G 돌연변이에 대해서 검출을 시행하였으나, 이에 제한되지 않는다. 타겟이 정해지는 경우 프로그래밍을 통해 프로브 서열을 조절하여 다양한 돌연변이의 검출이 가능하다.
돌연변이 검출에 있어, 4번째 위치(N4)에서 상이한 핵염기들(A, T, G, 및 C)을 평가하여 야생 타겟으로부터 돌연변이체(D614G)의 효과적인 구별을 부여하는 최상의 것을 찾아내었다. 그 결과, 도 16B의 결과는 N4 위치의 G가 돌연변이 타겟(D614G)의 존재 하에 높은 형광 신호를 생성하면서 야생 타겟의 존재 하에 백그라운드 노이즈를 최소화한다는 것을 나타냈다.
본 발명의 프로브 세트에 있어서, 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트의 제3프로브는 서열번호 45 내지 48 중 어느 하나일 수 있고, 제4프로브는 서열번호 49로 이루어진 프로브 세트일 수 있다. 바람직하게는 상기 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트는 S 유전자에 특이적으로 결합하고, 상기 제3프로브는 서열번호 45 및 제4프로브는 서열번호 49로 이루어진 프로브 세트일 수 있다.
뿐만 아니라, 하나의 튜브에서 SARS-CoV-2의 D614G 돌연변이 및 N 유전자의 동시 검출을 테스트하였으며, 여기서 망고 압타머 및 말라카이트 그린 압타머는 각각 SARS-CoV-2의 N 유전자 및 D614G가 간섭 없이 형광을 방출하였다(도 17C). 100 fM까지 N 유전자와 D614G에 대한 타겟을 동시에 분석할 수 있어, 매우 민감하게 검출이 가능함을 확인하였다(도 17D). 따라서, 본 발명의 프로브 세트를 이용하는 경우 SARS-CoV-2 및 돌연변이의 민감한 검출이 가능하다.
본 발명은 또한 상기 프로브 세트를 포함하는 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 조성물을 제공한다.
SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 조성물은 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이와 특이적으로 결합하는 핵산서열, 펩타이드 외에 타겟 분자의 검출 및/또는 분석에 일반적으로 사용되는 도구 및/또는 시약을 더 포함할 수 있다. 이러한 도구나 시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함될 수 있다. 표지물질이 형광물질인 경우에는 형광 세기를 측정하는 데 필요한 기질 등을 더 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 가용성 담체, 예를 들어, 당업계에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액(예를 들어, PBS 등); 불용성 담체, 예를 들어, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드 등; 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및/또는 이들의 조합이 포함될 수 있다.
본 발명은 또한 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 조성물, 중합효소 및 등온 단일 반응 용액을 포함하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 키트를 제공한다.
본 명세서에서 상술한 본 발명의 키트는 추가적으로, 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 효소, 다양한 버퍼 및 시약을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 양성 대조군 및 음성 대조군 반응을 실시하는 데 필수한 시약을 포함할 수 있다. 어떤 하나의 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은, 본 명세서에 개시사항을 습득한 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 키트는 상기 서술된 본 발명의 프로브 세트에 의한 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출을 실시하기 위하여 제작되기 때문에, 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
또한, 본 발명은 상기 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트를 이용하여 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이를 검출하는 방법을 제공하며, 구체적으로 다음의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 샘플에, 본 발명의 제3프로브 및 제4프로브로 구성되는 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일 반응(isothermal one-pot reaction) 프로브 세트를 처리하여 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이와 결합 또는 혼성화시키는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 혼성화 산물에 중합효소를 처리하여 전사를 개시시키는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 전사 산물에 압타머-반응 물질을 처리하여 전사 산물 내 압타머의 시그널 생성을 검출하는 단계.
이때, 상기 단계 (c)의 시그널 생성은 샘플 중 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이의 존재를 나타내는 것을 특징으로 한다.
따라서, 본 발명의 프로브 세트를 이용하는 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이를 검출하는 방법은 혼성화 단계, 전사 반응, 압타머의 시그널 반응까지 동시에 일어나도록 설계된 것이며, 본 발명의 (a) 내지 (c)단계는 하나의 용기 내에서 동시에 수행 가능하다.
또한, 최종 신호 확인에 사용되는 압타머는 말라카이트 그린 압타머로 제한하지 않으며 어떠한 종류의 RNA 기반의 형광 압타머도 사용 가능하다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이를 검출하는 방법 이전에, 등온 핵산 증폭 반응을 수행할 수 있다.
등온 핵산 증폭 반응의 종류는 특별히 제한되지 않지만, 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 등온 핵산 증폭 반응은 RPA(Recombinase Polymerase Amplification)일 수 있다.
상기 (a) 단계 이전에 RPA를 실시하면, 본 발명의 STAR 반응을 진행하였을 때에 비하여 신호가 증폭되는 것을 확인하였다(도 13참조). 따라서, 본 발명과 연계하여 등온 핵산 증폭반응을 수행하여 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이를 더욱 민감하게 검출하는 방법으로 이용할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 프로브 세트를 이용한 현장용 분자 진단 방법을 제공한다. 상기 현장용 분자 진단 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다:
(a) 샘플에, 제3프로브 및 제4프로브로 구성되는 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일 반응(isothermal one-pot reaction) 프로브 세트를 처리하여 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이와 혼성화시키는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 혼성화 산물에 중합효소를 처리하여 전사를 개시시키는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 전사 산물에 압타머-반응 물질을 처리하여 전사 산물 내 압타머의 시그널 생성을 검출하는 단계.
이때, 상기 단계 (c)의 시그널 생성은 샘플 중 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이의 존재를 나타내는 것을 특징으로 한다.
즉, 본 발명의 프로브 세트를 이용한 타겟 분자 검출 방법은 목적 대상의 타겟 분자 탐지를 위한 강력한 진단 방법으로 작용하여 짧은 진단 시간, 높은 감도 및 특이도(specificity) 및 간단한 분석 절차를 제공할 뿐만 아니라, 비싼 기기 및 진단 전문가를 필요로 하지 않으므로, 신속한 대응이 필요한 신종 감염병에 적합한 진단 방법이 될 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[준비예]
시약 및 재료의 준비
모든 DNA 서열은 Bionics(서울, 한국)에 의해 합성되었다. 모든 플라스미드는 Integrated DNA Technology (Skokie, IL, USA)에서 구입했다. T7 RNA 중합효소, RNase 억제제, T4 유전자 32 단백질(단일 가닥 결합 단백질) 및 리보뉴클레오타이드(rNTP) 용액은 Enzynomics(대전, 한국)에서 구입했다. HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit, Monarch RNA Cleanup Kit 및 DNase Ⅰ은 New England Biolabs(Ipswich, GA, USA)에서 구입했다. 박테리아 RNA 키트는 OMNI International(Kennesaw, NY, USA)에서 구입했다. Tris-HCl 및 MgCl2는 Biosesang(성남, 한국)에서 구입했다. 디티오트레이톨(DTT)은 ThermoFisher Scientific(서울, 한국)에서 구입했다. TO1-3PEG-비오틴 형광단(TO1-비오틴)은 Applied Biological Materials(캐나다 리치몬드)에서 구입했다. 말라카이트 그린 클로라이드와 스페르미딘은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입했다. 모든 실험은 RNA 분해를 방지하기 위해 DEPC 처리된 물로 수행되었다.
DNA 올리고뉴클레오타이드의 준비
본 발명에서 이용한 올리고뉴클레오타이드의 서열은 다음과 같다.
DNA Probe Sequence (5'→3') 서열번호
Split promoter template GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTACTTA AAA ATC CCG GCC AGA TTT TGC CAA TCA CCC TAT AGT GAG TCG TAT TA GTTAGA TTT TGC CAA TCA 1
Split promoter 1-0 TTGGCAAAATCTAAC 2
Split promoter 2-20 TAATACGACTCACTATAGGG 3
Split promoter 1-1 TTGGCAAAATCTAACT 4
Split promoter 2-19 AATACGACTCACTATAGGG 5
Split promoter 1-2 TTGGCAAAATCTAACTA 6
Split promoter 2-18 ATACGACTCACTATAGGG 7
Split promoter 1-3 TTGGCAAAATCTAACTAA 8
Split promoter 2-17 TACGACTCACTATAGGG 9
Split promoter 1-4 TTGGCAAAATCTAACTAAT 10
Split promoter 2-16 ACGACTCACTATAGGG 11
Split promoter 1-5 TTGGCAAAATCTAACTAATA 12
Split promoter 2-15 CGACTCACTATAGGG 13
N gene of SARS-CoV-2
Split T7-16 (ST-16)-Universal ACGACTCACTATAGGG 14
Overlap 0-ST GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATGCCAGCCATTCTAG 15
Overlap 0-ST-4 CAGCATCACCGCCATTAAT 16
Overlap 1-ST GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTGCCAGCCATTCTAG 17
Overlap 1-ST-4 CAGCATCACCGCCATATAAT 18
Overlap 2-ST GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTTGCCAGCCATTCTAG 19
Overlap 2-ST-4 CAGCATCACCGCCATAATAAT 20
Overlap 3-ST GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTTTGCCAGCCATTCTAG 21
Overlap 3-ST-4 CAGCATCACCGCCATAAATAAT 22
Overlap 4-ST GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTTTTGCCAGCCATTCTAG 23
Overlap 4-ST-4 CAGCATCACCGCCATAAAATAAT 24
Bulge 1-ST GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTTTGCCAGCCATTCTAG 25
Bulge 1-ST-4 CAGCATCACCGCCATTAATAAT 26
Bulge 2-ST GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTTTTGCCAGCCATTCTAG 27
Bulge 2-ST-4 CAGCATCACCGCCATTTAATAAT 28
Bulge 3-ST GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTTTTTGCCAGCCATTCTAG 29
Bulge 3-ST-4 CAGCATCACCGCCATTTTAATAAT 30
Bulge 4-ST GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTTTTTTGCCAGCCATTCTAG 31
Bulge 4-ST-4 CAGCATCACCGCCATTTTTAATAAT 32
Bulge 5-ST GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTTTTTTTGCCAGCCATTCTAG 33
Bulge 5-ST-4 CAGCATCACCGCCATTTTTTAATAAT 34
Locus 1-ST GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTATGAGGAACGAGAAG 35
Locus 1-ST-4 TGTTGCGACTACGTGAATAAT 36
Locus 2-ST GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTTGCCAGCCATTCTAG 37
Locus 2-ST-4 CAGCATCACCGCCATAATAAT 38
Locus 3-ST GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTGCT TTA GTG GCA GTA 39
Locus 3-ST-4 TGT GTT ACA TTG TATTAAT 40
Locus 4-ST GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTTGTTACATTGTATGC 41
Locus 4-ST-4 TCTGCCGAAAGCTTGAATAAT 42
Locus 5-ST GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTAGTTCCTGGTCCCCA 43
Locus 5-ST-4 GTTCCTTGTCTGATTAATAAT 44
S gene (D614G Mutation) of SARS-CoV-2
Signal template-G GGATCCATTCGTTACCTGGCTCTCGCCAGTCGGGATCC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTAGTT G ACACCCTGAT 45
Signal template-A GGATCCATTCGTTACCTGGCTCTCGCCAGTCGGGATCC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTAGTT A ACACCCTGAT 46
Signal template-T GGATCCATTCGTTACCTGGCTCTCGCCAGTCGGGATCC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTAGTT T ACACCCTGAT 47
Signal template-C GGATCCATTCGTTACCTGGCTCTCGCCAGTCGGGATCC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTAGTT C ACACCCTGAT 48
D614G Mutation ST-4 CAGGGACTTCTGTGCAATAAT 49
16S rRNA of Escherichia coli and Staphylococcus aureus
E. coli L1-ST GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTCGGGTAACGTCAATG 50
E. coli L1-ST-4 CCGGTGCTTCTTCTGAATAAT 51
E. coli L2-ST GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTCCACGCTTTCGCACC 52
E. coli L2-ST-4 AATCCTGTTTGCTCCAATAAT 53
S. aureus L1-ST GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTCGCTTTCGCACATCA 54
S. aureus L1-ST-4 CCTGTTTGATCCCCAAATAAT 55
S. aureus L2-ST GTACGACAACTACCCCATACCAAACCTTCCTTCGTAC CCCTATAGTGAGTCGTATTATTGGACTTAACCCAACA 56
S. aureus L2-ST-4 GTTGCGCTCGTTGCGAATAAT 57
밑줄 친 부분은 망고 압타머 서열, MG 압타머 서열을 의미하며, 굵은 글씨로 표시한 부분은 T7 프로모터 부위를 나타낸다. S gene (D614G Mutation) of SARS-CoV-2에서, 밑줄, 굵은글씨, 기울임체로 표시한 부분은 돌연변이 부위를 나타낸다.
DNA Probe Sequence (5'→3') 서열번호
SARS-CoV-2 N gene_IVT-FP TAATACGACTCACTATAGGGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGT 58
SARS-CoV-2 N gene_IVT-RP AACATTGGCCGCAAATTGCA 59
SARS-CoV-1_IVT-FP TAATACGACTCACTATAGGGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGC 60
SARS-CoV-1_IVT-RP GGTGTGACTTCCATGCCAAT 61
MERS-CoV_IVT-FP TAATACGACTCACTATAGGGATAGTCAATCATCTTCAAGA 62
MERS-CoV_IVT-RP TTCTGATGGGTAAGTTTAAA 63
HCoV-229E-FP TAATACGACTCACTATAGGGGTGCTCCTTCCCGGTCTCAG 64
HCoV-229E-RP CTTCCAAAGTTGTGGTCAAG 65
HCoV-NL63-FP TAATACGACTCACTATAGGGGCTCTAATAACTCATCTCGT 66
HCoV-NL63-RP TCCCCCATATTGTGATTAAA 67
HCoV-OC43-FP TAATACGACTCACTATAGGGCTGCTCCTAATTCCAGATCT 68
HCoV-OC43-RP AACTCTAATCTTGATCCAAA 69
HCoV-HKU1-FP TAATACGACTCACTATAGGGCTGCTTCTAATAGTCGACCA 70
HCoV-HKU1-RP AAGTCTAATTTAGAACCAAA 71
SARS-CoV-2 S gene (G614)_IVT-FP TAATACGACTCACTATAGGGTCTAACCAGGTTGCTGTTCTTTATCAGG G TGTTAACTGCACAGAAGTCCC 72
SARS-CoV-2 S gene (G614)_IVT-RP GGAGTAAGTTGATCTGCATGAATAGCAACAGGGACTTCTGTGCAGTTAAC 73
SARS-CoV-2 S gene (D614)_IVT-FP TAATACGACTCACTATAGGGTCTAACCAGGTTGCTGTTCTTTATCAGG A TGTTAACTGCACAGAAGTCCC 74
SARS-CoV-2 S gene (D614)_IVT-RP GGAGTAAGTTGATCTGCATGAATAGCAACAGGGACTTCTGTGCAGTTAAC 75
굵은 글씨로 표시한 부분은 T7 프로모터 부위를 나타낸다. SARS-CoV-2 S gene (G614, D614G Mutation)에서, 밑줄, 굵은글씨, 기울임체로 표시한 부분은 돌연변이 부위를 나타낸다.
타겟 RNA 서열의 준비
타겟 RNA는 시험관내 전사를 통해 생성되었다. 본 발명에서 이용한 타겟 RNA의 서열 정보는 [표 3]과 같다.
Name Sequence (5'→3') Size (bp) 서열번호
SARS-CoV-2 N gene
 GCAGUCAAGCCUCUUCUCGUUCCUCAUCACGUAGUCGCAACAGUUCAAGAAAUUCAACUCCAGGCAGCAGUAGGGGAACUUCUCCUGCUAGAAUGGCUGGCAAUGGCGGUGAUGCUGCUCUUGCUUUGCUGCUGCUUGACAGAUUGAACCAGCUUGAGAGCAAAAUGUCUGGUAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACUGUCACUAAGAAAUCUGCUGCUGAGGCUUCUAAGAAGCCUCGGCAAAAACGUACUGCCACUAAAGCAUACAAUGUAACACAAGCUUUCGGCAGACGUGGUCCAGAACAAACCCAAGGAAAUUUUGGGGACCAGGAACUAAUCAGACAAGGAACUGAUUACAAACAUUGGCCGCAAAUUGCA 380 76
SARS-CoV-1
 GCAGUCAAGCCUCUUCUCGCUCCUCAUCACGUAGUCGCGGUAAUUCAAGAAAUUCAACUCCUGGCAGCAGUAGGGGAAAUUCUCCUGCUCGAAUGGCUAGCGGAGGUGGUGAAACUGCCCUCGCGCUAUUGCUGCUAGACAGAUUGAACCAGCUUGAGAGCAAAGUUUCUGGUAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACUGUCACUAAGAAAUCUGCUGCUGAGGCAUCUAAAAAGCCUCGCCAAAAACGUACUGCCACAAAACAGUACAACGUCACUCAAGCAUUUGGGAGACGUGGUCCAGAACAAACCCAAGGAAAUUUCGGGGACCAAGACCUAAUCAGACAAGGAACUGAUUACAAACAUUGGCCGCAAAUUGCACAAUUUGCUCCAAGUGCCUCUGCAUUCUUUGGAAUGUCACGCAUUGGCAUGGAAGUCACACC 442 77
MERS-CoV AUAGUCAAUCAUCUUCAAGAGCCUCUAGCUUAAGCAGAAACUCUUCCAGAUCUAGUUCACAAGGUUCAAGAUCAGGAAACUCUACCCGCGGCACUUCUCCAGGUCCAUCUGGAAUCGGAGCAGUAGGAGGUGAUCUACUUUACCUUGAUCUUCUGAACAGACUACAAGCCCUUGAGUCUGGCAAAGUAAAGCAAUCGCAGCCAAAAGUAAUCACUAAGAAAGAUGCUGCUGCUGCUAAAAAUAAGAUGCGCCACAAGCGCACUUCCACCAAAAGUUUCAACAUGGUGCAAGCUUUUGGUCUUCGCGGACCAGGAGACCUCCAGGGAAACUUUGGUGAUCUUCAAUUGAAUAAACUCGGCACUGAGGACCCACGUUGGCCCCAAAUUGCUGAGCUUGCUCCUACAGCCAGUGCUUUUAUGGGUAUGUCGCAAUUUAAACUUACCCAUCAGAA 451 78
HCoV-229E GUGCUCCUUCCCGGUCUCAGUCGAGGUCGCAGAGUCGCGGUCGUGGUGAAUCCAAACCUCAAUCUCGGAAUCCUUCAAGUGACAGAAACCAUAACAGUCAGGAUGACAUCAUGAAGGCAGUUGCUGCGGCUCUUAAAUCUUUAGGUUUUGACAAGCCUCAGGAAAAAGAUAAAAAGUCAGCGAAAACGGGUACUCCUAAGCCUUCUCGUAAUCAGAGUCCUGCUUCUUCUCAAACUUCUGCCAAGAGUCUUGCUCGUUCUCAGAGUUCUGAAACAAAAGAACAAAAGCAUGAAAUGCAAAAGCCACGGUGGAAAAGACAGCCUAAUGAUGAUGUGACAUCUAAUGUCACACAAUGUUUUGGCCCCAGAGACCUUGACCACAACUUUGGAAG 391 79
HCoV-NL63 GCUCUAAUAACUCAUCUCGUGCUAGCAGUCGUUCUUCAACUCGUAACAACUCACGAGACUCUUCUCGUAGCACUUCAAGACAACAGUCUCGCACUCGUUCUGAUUCUAACCAGUCUUCUUCAGAUCUUGUUGCUGCUGUUACUUUGGCUUUAAAGAACUUAGGUUUUGAUAACCAGUCGAAGUCACCUAGUUCUUCUGGUACUUCCACUCCUAAGAAACCUAAUAAGCCUCUUUCUCAACCCAGGGCUGAUAAGCCUUCUCAGUUGAAGAAACCUCGUUGGAAGCGUGUUCCUACCAGAGAGGAAAAUGUUAUUCAGUGCUUUGGUCCUCGUGAUUUUAAUCACAAUAUGGGGGA 355 80
HCoV-OC43 CUGCUCCUAAUUCCAGAUCUACUUCGCGCACAUCCAGCAGAGCCUCUAGUGCAGGAUCGCGUAGUAGAGCCAAUUCUGGCAAUAGAACCCCUACCUCUGGUGUAACACCUGACAUGGCUGAUCAAAUUGCUAGUCUUGUUCUGGCAAAACUUGGCAAGGAUGCCACUAAACCUCAGCAAGUAACUAAGCAUACUGCCAAAGAAGUCAGACAGAAAAUUUUGAAUAAGCCCCGCCAGAAGAGGAGCCCCAAUAAACAAUGCACUGUUCAGCAGUGUUUUGGUAAGAGAGGCCCUAAUCAGAAUUUUGGUGGUGGAGAAAUGUUAAAACUUGGAACUAGUGACCCACAGUUCCCCAUUCUUGCAGAACUCGCACCCACAGCUGGUGCGUUUUUCUUUGGAUCAAGAUUAGAGUU 412 81
HCoV-HKU1 CUGCUUCUAAUAGUCGACCAGGUUCACGUUCUCAAUCACGUGGACCCAAUAAUCGUUCAUUAAGUAGAAGUAAUUCUAAUUUUAGACAUUCAGAUUCUAUAGUAAAACCUGAUAUGGCUGAUGAGAUCGCUAAUCUUGUUUUAGCCAAGCUUGGUAAAGAUUCUAAACCUCAGCAAGUCACUAAGCAAAAUGCCAAGGAAAUCAGGCAUAAAAUUUUAACAAAACCUCGCCAAAAGCGAACUCCUAAUAAACAUUGUAAUGUUCAACAGUGUUUUGGUAAAAGAGGACCUUCUCAAAAUUUUGGUAAUGCUGAAAUGUUAAAGCUUGGUACUAAUGAUCCUCAGUUUCCUAUUCUUGCAGAAUUAGCUCCUACACCAGGUGCUUUUUUCUUUGGUUCUAAAUUAGACUU 409 82
SARS-CoV-2 S gene (G614) UCUAACCAGGUUGCUGUUCUUUAUCAGGGUGUUAACUGCACAGAAGUCCCUGUUGCUAUUCAUGCAGAUCAACUUACUCC 80 83
SARS-CoV-2 S gene (D614) UCUAACCAGGUUGCUGUUCUUUAUCAGGAUGUUAACUGCACAGAAGUCCCUGUUGCUAUUCAUGCAGAUCAACUUACUCC 80 84
E. coli 16S rRNA AGACUCCUACGGGAGGCAGCAGUGGGGAAUAUUGCACAAUGGGCGCAAGCCUGAUGCAGCCAUGCNGCGUGUAUGAAGAAGGCCUUCGGGUUGUAAAGUACUUUCAGCGGGGAGGAAGGGAGUAAAGUUAAUACCUUUGCUCAUUGACGUUACCCGCAGAAGAAGCACCGGCUAACUCCGUGCCAGCAGCCGCGGUAAUACGGAGGGUGCAAGCGUUAAUCGGAAUUACUGGGCGUAAAGCGCACGCAGGCGGUUUGUUAAGUCAGAUGUGAAAUCCCCGGGCUCAACCUGGGAACUGCAUCUGAUACUGGCAAGCUUGAGUCUCGUAGAGGGGGGUAGAAUUCCAGGUGUAGCGGUGAAAUGCGUAGAGAUCUGGAGGAAUACCGGUGGCGAAGGCGGCCCCCUGGACGAAGACUGACGCUCAGGUGCGAAAGCGUGGGGAGCAAACAGGAUUAGAUACCCUGGUAGUCCACGCCGUAAACGAUGUCGACUUGGAGGUUGUGCCCUUGAGGCGUGGCUUCCGGANNUAACGCGUUAAGUCGACCGCCUGGGGAGUACGGCCGCAAGGUUAAAACUCAAAUGAAUUGACGGGGGCCGCACAAGCGGUGGA 610
(327-936)		 85
S. aureus 16S rRNA CAGAAGAGGAAAGUGGAAUUCCAUGUGUAGCGGUGAAAUGCGCAGAGAUAUGGAGGAACACCAGUGGCGAAGGCGACUUUCUGGUCUGUAACUGACGCUGAUGUGCGAAAGCGUGGGGAUCAAACAGGAUUAGAUACCCUGGUAGUCCACGCCGUAAACGAUGAGUGCUAAGUGUUAGGGGGUUUCCCGCCCCUUAGUGCUGCAGCUAACGCAUUAAGCACUCCGCCUGGGGAGUACGACCGCAAGGUUGAAACUCAAAGGAAUUGACGGGGACCCGCACAAGCGGUGGAGCAUGUGGUUUAAUUCGAAGCAACGCGAAGAACCUUACCAAAUCUUGACAUCCUUUGACAACUCUAGAGAUAGAGCCUUCCCCUUCGGGGGACAAAGUGACAGGUGGUGCAUGGUUGUCGUCAGCUCGUGUCGUGAGAUGUUGGGUUAAGUCCCGCAACGAGCGCAACCCUUAAGCUUAGUUGCCAUCAUUAAGUUGGGCACUCUAAGUUGACUGCCGGUGACAAACCGGAGGA 524
(666-1188)		 86
[실시예 1]
Split T7 프로모터 기반 DNA 프로브 및 반응 조건의 최적화
1-1. T7 프로모터 분할 비율
본 발명의 핵심은 3방향 접합 구조를 유도하여 타겟 RNA의 존재 하에서 split T7 프로모터의 효과적인 형성이기 때문에, 우선 본 발명에 앞서 기존의 T7 프로모터를 분할하여 각 비율에 따른 전사 효율을 분석하였다(도 3).
분할 T7 프로모터로 전사를 확인하기 위해 3가지 유형의 DNA 프로브(분할 프로모터 1(Split Promoter 1, SP1), 분할 프로모터 2(Split Promoter 2, SP2) 및 주형(Template, T))를 사용하여 전사 반응을 수행했다. 반응 혼합물은 2 μL의 SP1, SP2 및 T(각각 1 μM), 2 μL 10x T7 버퍼, 0.8 μL T7 RNA 중합효소(2 U/μL), 0.4 μL RNase 억제제(0.08 U/μL), 2 μL TO1-비오틴(1μM), 1μL rNTP(각각 2.5mM) 및 11.8μL DEPC 처리수로 구성되었다. 반응 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 384-웰 플레이트로 옮겼다. 형광 신호는 마이크로 플레이트 리더(SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader, Molecular Devices, USA)를 사용하여 각각 507 nm 및 547 nm의 여기(excitation) 및 방출(emission) 파장에서 측정되었다.
타겟 RNA는 시험관내 전사를 통해 생성되었다. 본 발명에서 이용한 타겟 RNA의 서열 정보 상기 [표 3]과 같다.
구체적으로, 각각의 플라스미드를 PCR 주형으로 하고, T7 프로모터 서열을 포함하는 프라이머를 이용하여 먼저 타겟 RNA 영역에 해당하는 DNA 서열을 생성하였다. 다음으로, 주형 DNA 1μg, 10X 반응 완충액 1.5μL(최종 0.75x), rNTP 1.5μL(각각 7.5mM), T7 RNA 중합효소 Mix 1.5μL, DEPC 처리수 14.5μL로 이루어진 전사 반응 용액을 준비했다. 그 다음 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션하여 전사 반응을 수행하였고, 그 후 DNaseⅠ에 의한 PCR 산물이 분해되었다. RNA 전사 산물은 Monarch RNA Cleanup Kit를 이용하여 정제하고 260 nm 파장에서 나노드롭으로 정량하여 -80 ℃에서 보관한 후 사용하였다.
T7 프로모터 형성을 조절하기 위해서 T7 프로모터의 5' 말단 부분부터 순차적으로 닉 부위를 삽입하여 다양한 비율로 분할 된 T7 프로모터를 제작하였다. 망고 압타머의 상보적 서열을 주형에 배치하여 전사 후, TO-1 비오틴의 형광 신호를 측정함으로써, 전사 반응을 모니터링하였다. 분할된 T7 프로모터 DNA 프로브의 서열은 전술한 [표 1]의 서열번호 1 내지 13의 서열을 사용하였다.
그 결과, 도 3에 도시된 바와 같이, 온전한 T7 프로모터(0:20 분할 비율)에서 T+SP2 또는 T+SP1+SP2의 추가는 높은 형광 신호로 나타나는 효과적인 전사를 초래했다. 1:19 비율의 분할 T7 프로모터를 사용하면 닉 부위가 존재하더라도(T+SP1+SP2) 손상되지 않은 T7 프로모터에 비해 신호가 증가했다. 또한, T+SP2가 존재하는 경우 전사가 효과적으로 발생하였다. 분할 비율을 2:18에서 4:16으로 변경했을 때, 전사는 T+SP1+SP2의 존재 하에서 효과적으로 발생하였다. 3:17 비율 이후에는 SP1의 부재로 인해 형광 값이 급격히 낮아졌으며, 이는 T7 프로모터 5'쪽의 3-뉴클레오타이드 부분이 T7 RNA 중합효소가 T7 프로모터를 특이적으로 인식하는데 중요하다는 것을 의미함을 알 수 있다. 또한, 5:15의 경우 SP1와 SP2가 모두 존재하는 경우에도 전사가 거의 진행되지 않는 것을 확인하였으며, 이로 보아 T7 프로모터의 5'쪽의 5-mer 이후 닉 부위가 존재하면 T7 RNA 중합효소가 정상적으로 인식하지 못함을 의미함을 알 수 있다.
3-방향 접합 구조 형성을 통하여 온전한 이중 가닥 형태의 T7 프로모터를 이루기 위해서는 4:16 분할 비가 가장 적합하다는 것을 확인하였다.
1-2. 중첩서열의 최적화
이후 4:16 비율의 T7 프로모터를 3-방향 접합구조체에 적용시키기 위한 구조 최적화를 진행하였다(도 4).
T7 프로모터 3'쪽의 16-뉴클레오타이드는 Signal template에 상보적으로 결합하며 보편적이다. 타겟 RNA가 존재하는 경우에만 ST 및 ST-16으로 구성된 첫 번째 프로브와 두 번째 프로브(ST-4)를 결합하여 닉 부위가 있는 완전한 T7 프로모터를 형성해야 하므로, 중첩 부분의 Tm value가 가장 중요 요인이며 추가 중첩서열(0~4bp)을 배치하여 Tm value를 조절하였다. 추가 중첩서열 부분은 기본적으로 T7 프로모터 5'부분의 4bp를 포함하고 있다.
중첩처열의 최적화를 진행하기 위한 DNA 프로브의 서열은 전술한 [표 1]의 서열번호 13 내지 24의 서열을 사용하였다.
우선 중첩서열(N=0)이 T7 프로모터의 4bp일 경우 타겟서열이 존재하지 않을 때 형광이 나오지 않아 구조를 형성하지 않는 목적에 적합하였다. 하지만 target이 존재할 때에 3-방향 접합 구조가 너무 짧은 중첩으로 인해 완벽히 이루어지지 않아 T7 프로모터가 형성이 안되어 전사가 효과적으로 수행되지 않음을 확인할 수 있다. 중첩 서열을 1bp이상 추가한 경우(N=1), 타겟서열이 존재할 때만 높은 형광 값을 나타냄을 확인하였다. 이를 통해 3-방향 접합 구조를 안정적으로 형성하고 전사 반응을 유도하기 위해서는 T7 프로모터부터의 4bp 외에 적어도 1bp의 중첩이 필요함을 확인했다. 추가된 중첩 서열이 3bp를 초과하는 경우, 타겟서열이 존재하지 않아도 비특이적인 전사가 진행되었다.
따라서, 적절한 추가 중첩서열은 2bp로 설정되었고, 전체 중첩 영역은 6bp(T7 프로모터로부터 4bp)로 설정되었다.
이후 3-방향 접합 구조에 bulge구조를 넣어 이중가닥 닉 부위가 존재하는 T7 프로모터의 안정성을 실험하였다(도 5). Bulge 구조가 도입된 경우의 ST와 ST-4의 DNA서열은 전술한 [표 1]의 서열번호 25 내지 34의 서열을 사용하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 bulge가 들어가면 오히려 구조의 안정성이 떨어져 타겟 핵산서열이 존재하여도 three way 구조가 제대로 형성되지 못하여 전사가 덜 일어나는 것을 확인하였다. 따라서, 중첩서열은 서로 상보적인 2bp 이외에는 추가하지 않고 bulge 구조가 생성되지 않는 것이 최적화되는 구조임을 확인하였다.
1-3. 반응 조건의 최적화
제안된 STAR의 최상의 성능을 얻기 위해 버퍼, 효소, 반응 시간 및 반응 온도에 대한 최적화 실험을 수행했다.
DTT의 농도를 0.375 mM 내지 1.5mM, MgCl2의 농도를 0 내지 20 mM으로 하여 각각의 경우의 수(25가지; 5X5)를 모두 3번씩 실험하여 형광강도를 측정하였다. 스페르미딘은 0 내지 5mM 농도에서 타겟이 있는 경우와 없는 경우를 대비하여 형광강도를 측정하였으며, 단일 가닥 DNA 결합 단백질(SSB)도 0 내지 50 ng/ul에서의 형광강도를 측정하였다. T7 RNA중합효소는 0 내지 80U에서, 반응시간은 0 내지 120 분에서, 반응 온도는 25, 30, 37, 41도에서 측정하였다. 또한, 어닐링(annealing) 방법을 최적화하기 위하여 급성냉각(Fast cooling), 느린냉각(slow cooling), 냉각을 진행하지 않음(w/o cooling)을 비교하였다.
그 결과 도 6 내지 도 9에 나타난 바와 같이, 이상적인 조건은 다음과 같았다: 10mM의 MgCl2, 1.5mM의 DTT(도 6), 3mM의 스페르미딘, 20ng/μL의 단일 가닥 DNA 결합 단백질(SSB)(도 7), 20U의 T7 RNA 중합효소, 반응시간 30분, 반응 온도는 37℃(도 8), 냉각은 따로 진행하지 않음.
즉, 프로브와 타겟 RNA의 효율적인 혼성화를 매개할 수 있는 스페르미딘과 SSB의 최적화된 양으로 인해, 3-방향 접합 구조가 효과적으로 형성되어 초기 열 변성 및 냉각 단계 없이도 전사 반응을 유도할 수 있는 조건을 확인하였다. 따라서, 등온 조건(37℃)에서 전체 분석 작업을 수행해야 하는 필요성을 고려할 때 실제 현장 적용 측면에서 매우 유리하다.
1-4. 3-방향 접합 구조와 선형 구조인 경우의 전사 효율 비교
최종적으로 최적화된 버퍼와 3-방향 접합 구조를 기존 T7 프로모터와 비교하기 위하여 단일 가닥 RNA에 결합하여 높은 형광 신호를 방출하는 SYBR Green II를 사용하여 실시간 형광 모니터링을 수행하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 기존 T7 프로모터와 비교하여 큰 차이가 없고, 오히려 3방향 접합 구조의 전사가 선형 구조의 전사와 거의 비슷한 전사효율을 갖는다는 것을 알 수 있었다.
1-5. 3-방향 접합 구조를 확인하기 위한 겔 전기영동 수행
본 발명은 3-방향 접합 구조체 기반의 분할 T7 프로모터와 형광 RNA 압타머 기술을 융합한 기술로서 타겟 핵산 바이오 마커가 존재할 때 형광신호가 증폭된다.
DNA 프로브들은 2종류의 단일 가닥 DNA로 구성되어 있다. 단일 주형(Signal template, ST)는 형광 RNA 압타머 중 하나인 망고 압타머의 상보적인 서열(노랑), T7 프로모터 서열(파랑) 그리고 타겟 서열의 절반과 상보적인 서열 (검정)로 이루어져 있다. 분할된 T7-16(Split T7-16, ST-16)은 T7 프로모터의 일부 서열(16mer; 파랑)이며 ST의 T7 프로모터와 상보적이다. Tm 값은 56.3℃로 37℃ 반응에서 타겟물질과 상관없이 ST에 상보적으로 결합하므로 보편적이다. 3-방향 접합 구조를 확인하기 위한 겔 전기영동을 수행하였으며, 도 10는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 결과를 나타낸다.
3-방향 접합 구조의 형성은 8% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 PAGE(Poly Acrylamide Gel Electrophoresis)로 확인하였다. 샘플은 1μM의 신호 템플릿(ST), 1μM Split T7-16(ST-16), 1μM Split T7-4(ST-4), 500nM N 유전자 RNA 및 0.5U/μL T7 RNA 중합효소를 37℃에서 30분간 배양하여 준비했다. 준비된 샘플을 겔에 로드하고 40분 동안 200V에서 1X TBE 완충액으로 로딩했다. 또한, 135V에서 1시간 동안 1X TBE 완충액에서 2% 아가로스 겔을 사용하여 아가로스 겔 전기영동을 수행하였다. GreenStar Nucleic Acid 염색 용액(Bioneer, Daejeon, Korea)을 사용하여 결과를 시각화하고 ChemiDoc(Bio-rad, CA, USA)를 사용하여 겔을 스캔했다.
분할 T7-4(ST-4)는 T7 프로모터의 일부 서열 (4mer; 파랑)과 나머지 절반의 타겟서열과 상보적으로 결합 가능한 서열(검정)로 이루어져 있다. 본 발명의 모든 반응은 37℃에서 진행된다. ST의 5'-ATTATT-3' 서열이 ST-4에 상보적이나 Tm 값이 12℃ 이므로 37℃에서 결합이 불가능하도록 디자인하였다. 따라서 타겟물질이 존재하지 않으면 DNA 프로브들 중 ST와 ST-4 프로브는 결합할 수 없으며 이에 따라 3-방향 접합 구조를 이루지 못하여 완전한 이중가닥 T7 프로모터를 형성하지 못한다. 타겟물질이 존재할 때는 타겟 RNA가 우선적으로 ST와 ST-4의 각각 타겟 물질의 상보적인 서열과 결합하여 3-방향 접합 구조체를 형성한다. 이를 통해 닉 부위가 존재하는 이중 가닥의 T7 프로모터를 이루게 된다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, PAGE 분석을 통해 타겟 및 T7 RNA 중합효소 촉매 전사 반응의 존재 하에서 3-방향 접합 구조의 형성을 확인하였다. 도 9에 도시된 바와 같이 ST와 ST-16은 서로 혼성화 되었고(a), ST, ST-16, 및 ST-4는 타겟의 부재하에서 3-방향 접합 구조를 형성하지 않았다(d). 또한, 모든 DNA 프로브와 타겟이 존재할 때(g), T7 RNA 중합효소의 존재가 전사(h)를 통해 많은 양의 light-up RNA 압타머를 생성하는 3-방향 접합 구조가 형성되었다.
1-6. 다양한 반응 조건에서 형광 방출 스펙트럼 평가
다음으로, STAR의 각 요소가 없는 형광 스펙트럼을 평가하였다(도 11). T7 RNA 중합효소에 의한 RNA 전사가 일어나게 되며 망고 압타머를 생성하게 된다. 최종적으로 망고 압타머와 결합 가능한 형광염료인 To1-비오틴과 결합하여 높은 형광신호를 나타나게 된다. DNA 프로브(ST, ST-16, ST-4) 중 하나 또는 타겟서열이 없으면 RNA 전사에 필수적인 닉 부위가 있는 이중가닥 T7 프로모터가 형성되지 않고 망고 압타머가 생성되지 않는다. 따라서 망고 압타머와 TO1-비오틴의 결합이 일어나지 않고 무시 가능한 형광 신호가 나타난다. 또한 TO1-비오틴 또는 T7 RNA 중합효소가 없는 경우에도 형광 신호가 나타나지 않는다. 모든 요소가 존재할 때만(w/all) 높은 형광 신호가 생성되어 STAR의 모든 요소가 각각 타겟 RNA의 one-pot 검출에 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다.
[실시예 2]
SARS-CoV-2 N 유전자의 각 유전자좌위의 검출 감도 측정
본 발명에서는 STAR의 핵심인 3-방향 접합 구조의 형성 효율이 각 타겟 영역에 대해 다를 수 있고 다른 검출 감도로 이어질 수 있다고 가정하였다. SARS-CoV-2를 타겟 물질로 선정하여 N 유전자의 일정 영역(Nucleotide positions 28809-29188)에 대하여 5 종류의 프로브를 설계하였다(도 14A). N 유전자의 서열은 NCBI Accession number NC_045512를 참고하였다. 5종의 프로브에 대한 구체적인 서열 정보는 전술한 [표 1]의 서열번호 35 내지 44의 서열을 사용하였다.
DNA STAR의 다중 서열 정렬을 통해 각 영역이 SARS-CoV-2에 특이적임을 확인한 후, 100pM(6 × 107copy/μL)에서 100fM(6 ×104 copy/μL), 타겟의 존재(F) 형광 신호를 타겟의 부재(FNTC; 비타겟 대조군)로 나누어 배수 변화를 계산하였다. 도 14B의 히트맵에 나타난 바와 같이, 전사 효율은 표적화 유전자좌에 의존적이었다. 5개의 DNA 프로브 세트(Locus 1-5) 중 L2 및 L4에 대한 DNA 프로브는 다른 프로브(L1, L3 및 L5)보다 더 높은 배수 변화를 보였고 타겟 N 유전자를 100 fM까지 결정했다(도 14C). 그 결과, 각 영역에 대하여 민감도가 상이함을 확인하였으며, 5개의 영역 중 L2, L4가 정량적으로 100fM까지 검출이 가능함을 확인하였다.
[실시예 3]
STAR의 검출 감도를 향상시키기 위한 2개의 유전자좌 타겟화
영역별 실험 결과(도 14)를 바탕으로 민감도를 향상시키기 위하여 하나의 반응에서 타겟 유전자(N gene)의 다양한 영역을 타겟화하는 방식으로 두 개의 프로브를 동시에 사용하는 방법을 도입하였다. 실시예 2의 결과를 기반으로 민감도가 가장 뛰어났던 L2 및 L4를 타겟으로 하는 STAR 프로브가 선택되었다. 도 15A는 SARS-CoV-2 N 유전자와 다른 인간 코로나바이러스의 두 가지 다른 유전자좌의 개략도를 나타내며, SARS-CoV-2와 다른 다른 바이러스 RNA 서열의 뉴클레오타이드는 회색으로 흐릿한 것을 나타낸다. 각각의 DNA 프로브 서열 정보는 전술한 [표 2]와 같으며, 타겟 RNA의 서열 정보는 전술한 [표 3]과 같다.
각각의 STAR 프로브는 타겟 RNA 영역의 각각의 유전자좌에 결합하여 신호를 생성하므로 신호를 증폭할 수 있다. 두 영역(L2 및 L4)의 STAR 프로브가 동시에 하나의 타겟에 결합하는지 확인하기 위해 실시예 1-5에서 전술한 바와 같이 아가로스 겔 전기영동을 먼저 수행하였다. L2 및 L4 프로브 세트의 농도는 각각 500nM이며(a 및 b), L2 및 L4 프로브가 동시에 존재할 때 각 프로브 세트의 농도는 250nM(c)이다. 그 결과, 도 15B와 같이 두 개의 프로브 세트가 동시에 존재하는 경우(c) 단일 프로브 세트(L2 또는 L4)만 존재하는 경우(a 및 b)보다 전기영동 이동도가 감소하며, 이는 더 높은 밴드 위치에 의해 확인되었다. 이러한 결과는 두 개의 STAR 프로브가 타겟 RNA의 각 영역에 특이적으로 결합한다는 것을 증명한다.
타겟 RNA의 검출을 위해 STAR에 대한 모든 시약이 미리 혼합되었다; 4 μL 10X STAR 완충액(400mM Tris-HCl, 100mM MgCl2, 15mM DTT, 30mM 스페르미딘), 6μL STAR 프로브 세트(2μL Signal Template (2μM), 2μL Split T7-16(2 μM) 및 2 μL Split T7-4(2 μM)), 4 μL TO1-비오틴(1 μM) 또는 2 μL 말라카이트 그린 염화물(100 μM)), 4 μL SSB(20 ng/μL), 4 μL rNTP (각각 2.5mM), 0.4μL T7 RNA 중합효소(0.5U/μl), 0.8μL RNase 억제제(0.08U/μL) 및 DEPC-물(최대 36μL). 타겟 RNA가 첨가되기 전까지 시약의 혼합 순서는 임의로 혼합될 수 있다. 다음, 4μL의 타겟 RNA를 첨가하고 반응 혼합물을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. N 유전자에서 이중 타겟화를 위해(도 15A), 각 STAR 프로브 세트(L2 및 L4)의 50nM이 추가되었다. 마지막으로, 반응 혼합물을 384-웰 플레이트로 옮기고, 여기서 망고 압타머에 대한 TO1-비오틴 결합에 상응하는 형광 신호는 마이크로플레이트 판독기(SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader, Molecular Devices, USA)를 사용하여 각각 507 nm 및 547 nm의 여기 및 방출 파장에서 측정되었다. 말라카이트 그린 압타머에 결합하는 말라카이트 그린에서 나오는 형광 신호 측정은 616 nm 및 665 nm를 여기 및 방출 파장으로 사용하였다.
두 개의 프로브 세트를 동시에 사용하는 경우 형광 강도를 하나만 사용한 경우와 비교하였다. L2 프로브 세트(100nM), L4 프로브 세트(100nM), 개별적으로, L2 및 L4 프로브 세트(50nM+50nM) 모두의 존재하에서 측정된 형광 신호를 측정하였으며, 타겟 N 유전자 RNA의 농도는 1nM였다. 두 개의 프로브 세트를 동시에(L2+L4) 사용하는 경우 형광 신호가 증가함을 확인하였으며(도 15C), 특히 타겟 RNA 농도가 낮은 제한된 상황에서 특히나 신호 개선을 위한 좋은 방법으로 사용할 수 있음을 나타내었다.
L2 및 L4에서 STAR 프로브 세트 조합 사용시 검출 한계를 측정하였다. STAR 프로브 세트의 농도는 각각의 다른 유전자좌에서 50nM이다. 타겟 RNA는 2개의 유전자좌 타겟화를 통해 102copy/μL까지 결정이 가능함을 나타냈으며, 하나의 유전자좌를 타겟으로 하는 것에 비해 600배 개선되었고, 이는 실제 임상 상황에서 SARS-CoV-2의 스크리닝에 충분함을 나타낸다(도 15D).
뿐만 아니라, STAR의 특이성은 다른 알파 코로나바이러스 및 베타 코로나바이러스를 포함하여 6개의 인간 코로나바이러스에 결합하지 않도록 설계된 DNA 프로브로 평가되었다. SARS-CoV-2 영역과 다른 6개의 코로나바이러스의 뉴클레오타이드는 회색으로 표시된다(도 15A). 100nM 농도의 6개의 코로나바이러스 RNA가 존재할 때 형광 신호는 NTC에서 관찰된 것과 유사했으며 고도로 강화된 형광 신호는 1nM의 SARS-CoV-2 N 유전자에 대해서만 생성되었다(도 15E). 이는 RNA 타겟 농도가 작은 상황에서도 타겟으로 하는 SARS-CoV-2만을 특이적이고 민감하게 검출할 수 있음을 나타낸다.
[실시예 4]
4-1. SARS-CoV-2 D614G 돌연변이 검출을 위한 Multiplex STAR
SARS-CoV-2의 D614G 돌연변이를 타겟으로 선택하여 STAR의 다용도 적용 가능성을 입증하는 실험을 진행했다. 또한 단일 튜브에서 SARS-CoV-2의 D614G 변이와 N 유전자의 동시 검출을 위한 다중 검출도 확인했다.
D614G 돌연변이는 알파, 베타, 델타 등 모든 SARS-CoV-2 변이체에 존재하는 것으로 알려져 있다. 도 16A에서 돌연변이는 노란색으로 표시하였으며, 와일드 타겟에서 위양성 신호를 피하기 위해 빨간색으로 표시된 불일치 시퀀스를 추가하였다. SARS-CoV-2 genomic RNA의 23403번 위치에서 아데닌(A)이 구아닌(G)으로 치환됨에 따라 이러한 변화를 식별할 수 있도록 특정 STAR 프로브를 합리적으로 설계하였으며, 다중화 실험을 위해 말라카이트 그린 압타머 및 다른 파장을 갖는 fluorogenic 염료(말라카이트 그린)를 사용하였다(도 16A). DNA 프로브의 서열은 전술한 [표 1]의 서열번호 45 내지 49의 서열을 사용하였다.
다중 분석은 4μL 10xSTAR 완충액(400mM Tris-HCl, 100mM MgCl2, 15mM DTT, 30mM 스페르미딘), 3μL L2 프로브 세트(각 2μM), 3μL L4 프로브 세트(각 2μM), 6μL D614G 돌연변이 프로브 세트(각각 2μM), 4μL TO1-비오틴(1μM), 2μL 말라카이트 그린 클로라이드(100μM), 4μL SSB(20ng/μL), 4μL rNTP(각 2.5mM), 0.4μL T7 RNA 중합효소(0.5U/μL), 0.8μL RNase 억제제(0.08U/μL) 및 DEPC-water(최대 32μL)에 8μL의 타겟 RNA가 추가되었다.
4번째 위치(N4)에서 상이한 핵염기들(A, T, G, 및 C)을 평가하여 야생 타겟(wild type)으로부터 돌연변이체(D614G)의 효과적인 구별을 부여하는 최상의 것을 찾아내었으며, 그 결과 도 16B의 결과는 N4 위치의 G가 돌연변이 타겟(D614G)의 존재 하에 높은 형광 신호를 생성하면서 야생 타겟의 존재 하에 백그라운드 노이즈를 최소화한다는 것을 나타냈다. DNA 프로브 서열은 전술한 [표 2]의 서열번호 72 내지 75의 서열을 사용하였으며, 타겟 RNA 서열정보는 전술한 [표 3]의 서열번호 83 및 84를 사용하였다.
그 결과, 돌연변이에 대하여 100fM의 검출 한계를 얻었으며 야생형(wild type)이 돌연변이 검출에 간섭이 없는 것을 확인하였다(도 16C). 또한, 제안된 STAR를 사용하여 서로 다른 몰비(0%, 0.1%, 1%, 10%, 50% 및 100%)를 갖는 돌연변이체/야생 타겟의 혼합물을 분석하였다.
또한, 도 16D는 돌연변이 타겟의 0.1%가 야생 타겟과 구별됨을 나타내며, 이는 다른 방법과 비슷하거나 다른 방법보다 우수하므로, 본 발명의 우수한 특이성을 확인시켜준다.
5-2. 다중 검출을 위한 시스템
하나의 튜브에서 SARS-CoV-2의 D614G 돌연변이 및 N 유전자의 동시 검출을 위한 다중 STAR가 입증되었으며, 여기서 망고 압타머 및 말라카이트 그린 압타머는 각각 SARS-CoV-2의 N 유전자 및 D614G에 해당한다. 도 17A는 SARS-CoV-2 N 유전자 및 D614G 돌연변이의 동시 검출을 위한 one-pot 다중 STAR의 개략도를 나타낸다.
동시 검출을 위해 망고 및 말라카이트 그린 압타머를 이용했으므로, 두개의 압타머가 간섭 없이 형광 방출여부를 확인하고자 하였다. 그 결과, 도 17B는 망고 압타머 및 MG 압타머에 각각 결합하는 TO1-비오틴 및 MG의 정규화된 형광 방출 스펙트럼을 나타낸다. TO1-비오틴의 형광 방출 스펙트럼(fluorescence emission spectra)은 520 nm에서 570 nm 및 여기 파장(excitation wavelength) 480 nm에서 기록되었고, 말라카이트 그린의 형광 방출 스펙트럼은 640 nm에서 720 nm 및 여기 파장 600 nm에서 기록되었다. 망고 및 말라카이트 그린 압타머에 각각 결합한 후 TO1-비오틴 및 말라카이트 그린은 간섭 없이 뚜렷한 형광 방출 스펙트럼(녹색 및 적색)을 생성함을 확인했다(도 17B).
또한, N 유전자에 대한 STAR 프로브는 SARS-CoV-2의 N 유전자가 존재할 때만 망고 압타머의 생성을 통해 고도로 강화된 형광 신호(녹색)를 생성했으며, D614G 돌연변이에 대한 STAR 프로브는 고도로 강화된 형광 신호를 생성했다. 도 17C는 N 유전자 및 D614G 돌연변이의 one-pot 다중 검출 결과를 보여주는 히트맵을 나타낸다. 타겟 RNA의 농도는 10nM이었으며, D614G 돌연변이가 존재할 때만 말라카이트 그린 압타머를 형성하여 형광 신호(적색)를 생성하여 다중 분석 가능성을 입증했다(도 17C).
N 유전자에 대한 STAR 프로브와 D614G에 대한 STAR 프로브가 동시에 존재하는 다중화 실험에서 SARS-CoV-2의 N 유전자와 D614G 모두에 대한 민감도를 평가하였다. 100 fM까지 N 유전자와 D614G에 대한 타겟을 동시에 분석할 수 있음을 확인하였다(도 17D).
따라서, 본 발명의 STAR 프로브로 상이한 타겟 핵산서열의 다중 검출을 민감하고 간섭없이 수행할 수 있음을 확인하였다.
[실시예 5]
병원균 검출을 위한 시스템
STAR 분석이 다양한 응용에 사용되는지 확인하기 위해 두 병원성 박테리아인 E. coli(Escherichia coli)와 S. aureus(Staphylococcus Aureus)를 검출하는 실험을 수행했다(도 18). 민감하고 특이적 검출을 위해, 병원균 내에 다량 존재하는 16S rRNA를 타겟으로 선택하고 다른 박테리아 속으로 서열 분석 후 E. coli 및 S. aureus에 특이적인 STAR 프로브를 설계했다.
타겟 RNA 서열은 전술한 [표 3]의 서열번호 85 및 86의 서열을 사용하였으며, 사용한 DNA 프로브의 서열 정보는 전술한 [표 1]의 서열번호 50 내지 57의 서열을 사용하였다.
실험은 두 가지 방법으로 진행되었다. 하나의 방법은 병원체에서 추출한 total RNA를 검출하는 것이고 다른 하나는 추가적인 핵산 추출과정 없이 병원균의 열 처리 후에 바로 분석이 진행되는 direct 실험을 진행하여 검출하는 것이다(도 17A).
두 가지 실험 방법 중 핵산을 추출하는 과정을 진행하는 방법은 다음과 같이 진행된다. E. coli와 S. aureus는 먼저 Luria-Bertani 액체 배지에서 37℃에서 24시간 동안 진탕(150rpm)하면서 배양하였다. 그런 다음 1ml 배지를 박테리아 RNA 추출 키트를 사용하여 총 RNA를 추출했다.
추가적인 핵산추출 과정 없이 진행하는 direct 방법의 경우 5000rpm에서 원심분리한 후 박테리아 펠릿을 DEPC 처리된 물에 재현탁하고 95℃에서 5분 동안 가열 용해했다. 4 μL의 용해물을 전술한 절차에 따라 STAR 분석에 사용하였다.
도 18B에 도시된 바와 같이, E. coli 와 MRSA 모두, 각각의 프로브에 특이적으로 결합하여 높은 형광 신호를 발생하는 것을 확인하였다. 추출된 총 RNA를 100pg/μL ~ 100fg/μL 범위의 농도에서 정량적으로 측정하였으며, 100fg/μL의 농도에서도 검출이 가능한 것을 확인하였다.
또한 103cells/μL 농도의 병원체를 이용하여 direct STAR를 수행하였다. 95℃에서 5분간 가열하여 각 병원체(E. coli 및 S. aureus)의 용해물을 제조한 후, E. coli 및 S. aureus 특이적 STAR 프로브로 STAR를 실행하였다. 도 18C는 병원성 세균의 검출을 위한 direct STAR의 결과를 보여주는 히트맵을 나타낸다. 각 병원체의 농도는 103cells/μL이다.
결과적으로, 본 발명의 방법이 바이러스뿐만 아니라 병원성 박테리아의 다양한 바이오마커의 검출에 사용될 수 있으며, 전처리 없이 열처리만으로도 바로 검출이 가능함을 나타낸다. 따라서, 본 발명을 이용하는 경우 하나의 튜브 안에서 하나의 효소만으로 다중 검출 및 direct시스템의 구축이 가능하며 간편하고 신속하게 병원성 박테리아의 검출에 이용될 수 있다.

Claims (41)

  1. 제1프로브 및 제2프로브를 포함하는, 하나 이상의 타겟 분자 검출용 등온 단일반응(isothermal one-pot reaction) 프로브 세트로서,
    상기 제1프로브는 하기 일반식 I 및 II를 포함하는 구조를 갖는 프로모터 프로브(promoter probe, PP)이고,
    [일반식 I]
    5'-X-Y-Z-3'
    [일반식 II]
    3'-Ya-5'
    상기 일반식 I에서,
    X는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 하나의 표지(label) 또는 다수의 표지를 포함하는 상호작용적 표지 시스템을 갖는 압타머 서열 부위이고;
    Y는 T7 프로모터에 상보적인 서열이며;
    Z는 타겟 분자에 결합 또는 연결되는 부위이며;
    X 및 Y는 디옥시리보뉴클레오타이드이며;
    상기 일반식 II에서,
    Ya는 T7 프로모터의 일부 서열이고; Ya는 디옥시리보뉴클레오타이드이며;
    상기 제2프로브는 하기 일반식 (III)으로 이루어진 구조를 갖는 프로모터 프로브(promoter probe,PP)이고,
    [일반식 III]
    3'-Yb-Z'-5'
    상기 일반식 (III)에서,
    Yb는 존재하지 않거나, T7 프로모터의 일부 서열이고, 디옥시리보뉴클레오타이드이며;
    Z’은 타겟 분자에 결합 또는 연결되는 부위이며;
    상기 제1프로브 및 제2프로브는 타겟 분자와 결합 또는 연결된 후 중합효소에 의해 전사가 개시되어 시그널을 생성하는 것을 특징으로 하는,
    타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 타겟 분자는 핵산, 단백질, 세포 및 ATP로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 타겟 분자가 핵산인 경우, Z 및 Z'은 검출하고자 하는 핵산에 상보적으로 결합하는 핵산 서열이고,
    상기 타겟 분자가 단백질인 경우, Z 및 Z'은 상기 단백질에 결합할 수 있는 항체, 압타머이고,
    상기 타겟 분자가 세포인 경우, Z 및 Z'은 세포 외 단백질, 세포의 인지질, 균의 펩티도글라이칸 및 LPS로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종 이상에 결합할 수 있는 항체, 압타머이고,
    상기 타겟 분자가 ATP인 경우, Z 및 Z'은 ATP에 결합할 수 있는 split 압타머인 것을 특징으로 하는,
    타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 Ya 및 Yb는 T7 프로모터의 일부 서열이며,
    상기 Ya 및 Yb는 상기 Ya 및 상기 Yb 순서로 연속적으로 배열될 경우 상기 T7 프로모터를 이루고,
    Ya : Yb 분할 비율은 20:0 내지 15:5 인 것을 특징으로 하는, 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 Ya : Yb 분할 비율은 16:4 인 것을 특징으로 하는, 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 표지는 화학적 표지, 효소 표지, 방사능 표지, 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지 및 금속 표지로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 제1프로브의 상기 일반식 I은, Y와 Z 사이에 중첩서열 W를 추가로 포함한 일반식 I'로 변형될 수 있고;
    [일반식 I']
    5'-X-Y-W-Z-3'
    상기 제2프로브의 상기 일반식 III은, Yb와 Z' 사이에 중첩서열 W'를 추가로 포함한 일반식 III'으로 변형될수 있는 것을 특징으로 하는;
    [일반식 III']
    3'-Yb-W'-Z'-5'
    타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트.
  8. 제7항에 있어서,
    중첩서열 W 및 W'의 길이는 1bp 또는 2bp인 것을 특징으로 하는, 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 등온 단일 반응은, 15℃ 내지 50℃ 범위의 일정한 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 프로브 세트는 선형 RNA(linear RNA)와 구분하여 원형 RNA(circular RNA)를 검출하는 것을 특징으로 하는, 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 중합효소는 박테리오파지 T7 RNA 중합 효소, 박테리오파지 T3 중합 효소, 박테리오파지 RNA 중합 효소, 박테리오파지 ΦII 중합 효소, 살모넬라 박테리오파지 sp6 중합 효소, 슈도모나스 박테리오파지 gh-1 중합효소, 대장균(E. coli) RNA 중합효소 홀로효소(holoenzyme), 대장균(E. coli) RNA 중합효소 코어 효소, 인간 RNA 중합효소 I, 인간 RNA 중합효소 II, 인간 RNA 중합효소 III, 인간 미토콘드리아 RNA 중합효소 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 등온 단일 반응은 Tris-HCl, MgCl2, DTT, 스페르미딘, rNTPs, RNase 억제제 및 SSB(Single-Stranded DNA Binding Protein)가 포함된 단일 반응 용액으로 일원화되어 동시 수행되는 것을 특징으로 하는, 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트.
  13. 제1항의 제1프로브 및 제2프로브를 포함하는 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 포함하는, 타겟 분자 검출용 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 조성물은 2종 이상의 타겟 분자를 검출하기 위한 2종 이상의 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는, 타겟 분자 검출용 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 2종 이상의 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트는 각각 서로 상이한 상호작용적 표지 시스템을 포함하고; 상기 2종 이상의 프로브 세트 각각은 각각 서로 상이한 타겟 분자에 결합하여; 이로 인해 서로 상이한 타겟 분자의 다중 검출이 가능한 것을 특징으로 하는, 타겟 분자 검출용 조성물.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 등온 단일 반응은, 15℃내지 50℃범위의 일정한 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 타겟 분자 검출용 조성물.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항의 타겟 분자 검출용 조성물, 중합효소 및 등온 단일 반응 용액을 포함하는, 타겟 분자 검출용 키트.
  18. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 이용하여 타겟 분자를 검출하는 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 타겟 분자를 검출하는 방법 이전에, 등온 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계를 포함하는 타겟 분자를 검출하는 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 등온핵산증폭 반응은 RPA(Recombinase Polymerase Amplification)인 것을 특징으로 하는 타겟 분자를 검출하는 방법.
  21. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 타겟 분자 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트를 이용한 현장용 분자 진단 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 분자 진단 방법은 병원성 미생물 검출에 사용되는 것을 특징으로 하는, 현장용 분자 진단 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 병원성 미생물은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus Aureus), 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus), 대장균(E. coli), 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus), 인플루엔자 A 바이러스(Influenza A virus), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus), 호흡기 세포 융합 바이러스(RSV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV), 인유두종 바이러스(HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스(HPIV), 뎅기열 바이러스, B형 간염 바이러스(Hepatitis B Virus (HBV)), 황열병 바이러스, 광견병 바이러스, 플라스모디움, 거대세 포바이러스(CMV), 미코박테리움 튜버큘로시스, 클라미디아 트라코마티스, 로타바이러스, 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 크리민 콩고 출혈열 바이러스 (Crimean-Congo hemorrhagic fever virus), 에볼라 바이러스, 지카 바이러스, 헤니파바이러스, 노로바이러스, 라사바이러스, 리노바이러스, 플라비바이러스, 리프트 밸리 열 바이러스, 수족구병 바이러스, 살모넬라(Salmonella sp.), 쉬켈라(Shigella sp.), 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae sp.), 슈도모나스(Pseudomonas sp.), 모락셀라(Moraxella sp.), 헬리코박터(Helicobacter sp.) 및 스테노트로 포모나스(Stenotrophomonas sp.)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는, 현장용 분자 진단 방법.
  24. 제3프로브 및 제4프로브를 포함하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응(isothermal one-pot reaction) 프로브 세트로서,
    상기 제3프로브는 하기 일반식 IV 및 V를 포함하는 구조를 갖는 프로모터 프로브(promoter probe, PP)이고,
    [일반식 IV]
    5’-A-B-C-3’
    [일반식 V]
    3'-Ba-5'
    상기 일반식 IV에서,
    A는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 하나의 표지(label) 또는 다수의 표지를 포함하는 상호작용적 표지 시스템을 갖는 압타머 서열 부위이고;
    B는 T7 프로모터에 상보적인 서열이며;
    C는 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이 핵산서열과 상보적인 혼성화 서열을 갖는 UHS(Upstream Hybridization Sequence) 부위이며; 상기 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이 핵산서열은 DNA 또는 RNA이고;
    A, B 및 C는 디옥시리보뉴클레오타이드이며;
    상기 일반식 V에서,
    Ba는 T7 프로모터의 일부 서열이고; Ba는 디옥시리보뉴클레오타이드이며;
    상기 제4프로브는 하기 일반식 (VI)으로 이루어진 구조를 갖는 프로모터 프로브(promoter probe,PP)이고,
    [일반식 VI]
    3'-Bb-C'-5'
    상기 일반식 VI에서,
    Bb는 존재하지 않거나, T7 프로모터의 일부 서열이고;
    C’은 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이 핵산서열과 상보적인 혼성화 서열을 갖는 DHS(Downstream Hybridization Sequence) 부위이며; 상기 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이 핵산서열은 DNA 또는 RNA이고;
    Bb 및 C’는 디옥시리보뉴클레오타이드이며;
    상기 제3프로브 및 제4프로브는 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이 핵산서열과 혼성화 된 후 중합효소에 의해 전사가 개시되어 시그널을 생성하는 것을 특징으로 하는,
    SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응(isothermal one-pot reaction) 프로브 세트.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 Ba 및 Bb는 T7 프로모터의 일부 서열이며,
    상기 Ba 및 Bb는 상기 Ba 및 상기 Bb 순서로 연속적으로 배열될 경우 상기 T7 프로모터를 이루고,
    Ba : Bb 분할 비율은 20:0 내지 15:5 인 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 Ba : Bb 분할 비율은 16:4 인 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트.
  27. 제24항에 있어서,
    상기 표지는 화학적 표지, 효소 표지, 방사능 표지, 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지 및 금속 표지로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트.
  28. 제24항에 있어서,
    상기 제3프로브의 상기 일반식 IV은, B와 C 사이에 중첩서열 D를 추가로 포함한 일반식 IV'로 변형될 수 있고;
    [일반식 IV']
    5'-A-B-D-C-3'
    상기 제4프로브의 상기 일반식 VI은, Bb와 C' 사이에 중첩서열 D'를 추가로 포함한 일반식 VI'으로 변형될수 있는 것을 특징으로 하는;
    [일반식 VI']
    3'-Bb-D'-C'-5'
    SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트.
  29. 제28항에 있어서,
    중첩서열 D 및 D'의 길이는 1bp 또는 2bp인 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트.
  30. 제24항에 있어서,
    상기 등온 단일 반응은, 15℃ 내지 50℃ 범위의 일정한 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트.
  31. 제24항에 있어서,
    상기 중합효소는 박테리오파지 T7 RNA 중합 효소, 박테리오파지 T3 중합 효소, 박테리오파지 RNA 중합 효소, 박테리오파지 ΦII 중합 효소, 살모넬라 박테리오파지 sp6 중합 효소, 슈도모나스 박테리오파지 gh-1 중합효소, 대장균(E. coli) RNA 중합효소 홀로효소(holoenzyme), 대장균(E. coli) RNA 중합효소 코어 효소, 인간 RNA 중합효소 I, 인간 RNA 중합효소 II, 인간 RNA 중합효소 III, 인간 미토콘드리아 RNA 중합효소 및 이의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트.
  32. 제24항에 있어서,
    상기 등온 단일 반응은 Tris-HCl, MgCl2, DTT, 스페르미딘, rNTPs, RNase 억제제 및 SSB(Single-Stranded DNA Binding Protein)가 포함된 단일 반응 용액으로 일원화되어 동시 수행되는 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트.
  33. 제24항에 있어서,
    상기 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이의 핵산 서열 부위는 N 유전자 또는 S 유전자 인 것을 특징으로 하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트.
  34. 제33항에 있어서,
    상기 SARS-CoV-2 검출용 등온 단일반응 프로브 세트는 N 유전자에 특이적으로 결합하고,
    상기 제3프로브는 서열번호 37, 제4프로브는 서열번호 38로 이루어진 프로브 세트; 및
    상기 제3프로브는 서열번호 41, 제4프로브는 서열번호 42로 이루어진 프로브 세트로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 프로브 세트를 포함하는 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트.
  35. 제24항에 있어서,
    상기 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트는 S 유전자에 특이적으로 결합하고,
    상기 제3프로브는 서열번호 45 및 제4프로브는 서열번호 49로 이루어진 프로브 세트를 포함하는 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트.
  36. 제24항 내지 제35항 중 어느 한 항의 프로브 세트를 포함하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 조성물.
  37. 제36항의 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 조성물, 중합효소 및 등온 단일 반응 용액을 포함하는, SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 키트.
  38. 제24항 내지 제35항 중 어느 한 항의 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트를 이용하여 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이를 검출하는 방법.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이를 검출하는 방법 이전에, 등온 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계를 포함하는 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이를 검출하는 방법.
  40. 제39항에 있어서,
    상기 등온 핵산 증폭 반응은 RPA(Recombinase Polymerase Amplification)인 것을 특징으로 하는 SARS-CoV-2 및/또는 이의 돌연변이를 검출하는 방법.
  41. 제24항 내지 제35항 중 어느 한 항의 SARS-CoV-2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일반응 프로브 세트를 이용한 현장용 분자 진단 방법.
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