WO2022220503A1 - Crispr 시스템을 이용한 유전자 발현 조절 시스템 - Google Patents

Crispr 시스템을 이용한 유전자 발현 조절 시스템 Download PDF

Info

Publication number
WO2022220503A1
WO2022220503A1 PCT/KR2022/005135 KR2022005135W WO2022220503A1 WO 2022220503 A1 WO2022220503 A1 WO 2022220503A1 KR 2022005135 W KR2022005135 W KR 2022005135W WO 2022220503 A1 WO2022220503 A1 WO 2022220503A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
seq
dcas12f1
cas12f1
region
Prior art date
Application number
PCT/KR2022/005135
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김용삼
김도연
진현정
정동민
고정헌
Original Assignee
주식회사 진코어
한국생명공학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 진코어, 한국생명공학연구원 filed Critical 주식회사 진코어
Priority to US18/287,118 priority Critical patent/US20240200105A1/en
Priority to EP22788359.2A priority patent/EP4324920A1/en
Priority to CA3216819A priority patent/CA3216819A1/en
Publication of WO2022220503A1 publication Critical patent/WO2022220503A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/09—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a nuclear localisation signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/095—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a nuclear export signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a gene expression control system using CRISPR technology. More specifically, the present invention relates to a gene expression regulation system (abbreviated as CRISRP regulation system) using CRISPR technology comprising a Cas12f1 fusion protein and an engineered Cas12f1 guide RNA for effectively regulating the expression of a target gene, and to the use thereof .
  • CRISRP regulation system a gene expression regulation system using CRISPR technology comprising a Cas12f1 fusion protein and an engineered Cas12f1 guide RNA for effectively regulating the expression of a target gene
  • the CRISRP regulation system is a technology for regulating the expression of a target gene using the CRISPR/Cas system, and is being developed using the CRISPR/Cas9 system, which is currently the most studied.
  • the CRISPR regulatory system is characterized by using a dCas9 fusion protein comprising a guide RNA and a domain regulating the transcription of a gene.
  • the CRISPR regulatory system is classified into a CRISPR activation system and a CRISPR interference system according to the type of the transcriptional regulatory domain fused to the Cas9 protein.
  • This CRISPR regulation system can be used as an effective solution to regulate the expression of a specific gene when the specific gene is overexpressed or underexpressed.
  • the dCas9 protein mainly used in the CRISPR regulatory system is large in size, so it is difficult to make a fusion protein for the CRISPR regulatory system and package it in a vector such as AAV to deliver it to cells.
  • a solution is being sought through efforts such as a method of splitting the Cas9 protein and delivering it into cells with multiple vectors, and the development and application of a relatively small Cas protein.
  • An object of the present specification is to provide a composition for regulating gene expression for suppressing the expression of a target gene.
  • An object of the present specification is to provide a gene expression inhibition method using a composition for regulating gene expression for inhibiting the expression of a target gene.
  • An object of the present specification is to provide a composition for regulating gene expression to promote expression of a target gene.
  • An object of the present specification is to provide a method for promoting gene expression using a composition for regulating gene expression for promoting expression of a target gene.
  • composition for regulating gene expression, for inhibiting the expression of a target gene comprising:
  • the transcription-inhibiting Cas12f1 fusion protein includes a dead Cas12f1 (dCas12f1) protein and a transcription-inhibiting protein,
  • the dCas12f1 protein contains aspartic acid (D) at the 326th amino acid, glutamic acid at the 422th amino acid (E), arginine at the 490th amino acid (R), or aspartic acid at the 510th amino acid in the amino acid sequence constituting the wild-type Cas12f1 protein.
  • D is substituted with alanine (A), glutamine (Q), leucine (L), tryptophan (W) or valine (V),
  • the transcription inhibitory protein is a protein or peptide that inhibits or inhibits the transcription of a gene
  • the engineered Cas12f1 guide RNA comprises:
  • the spacer comprises 10 or more and 50 or less nucleotides and has a sequence complementary to the target sequence
  • the sequence of the U-rich tail is represented by (UaN)bUc, wherein N is one of adenosine (A), uridine (U), cytidine (C), and guanosine (G), wherein a, b, c is an integer, a is 1 or more and 5 or less, b is 0 or more,
  • the sequence of the engineered scaffold region is characterized in that it differs from 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACCAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3' (SEQ ID NO: 7),
  • the sequence of the engineered scaffold region consists of the following sequences linked in order from the 5' end to the 3' end:
  • the present specification provides a method for inhibiting the expression of a target gene in a cell, comprising:
  • a transcriptional inhibitory Cas12f1 fusion protein or a nucleic acid encoding the same and delivering the engineered Cas12f1 guide RNA or a nucleic acid encoding the same into a cell;
  • a CRISPR interference complex may be formed in the cell
  • the transcription-inhibiting Cas12f1 fusion protein includes a dead Cas12f1 (dCas12f1) protein and a transcription-inhibiting protein,
  • the dCas12f1 protein contains aspartic acid (D) at the 326th amino acid, glutamic acid at the 422th amino acid (E), arginine at the 490th amino acid (R), or aspartic acid at the 510th amino acid in the amino acid sequence constituting the wild-type Cas12f1 protein.
  • D is substituted with alanine (A), glutamine (Q), leucine (L), tryptophan (W) or valine (V),
  • the transcription inhibitory protein is a protein or peptide that inhibits or inhibits the transcription of a gene
  • the engineered guide Cas12f1 RNA contains:
  • the spacer comprises 10 or more and 50 or less nucleotides and has a sequence complementary to the target sequence
  • the sequence of the U-rich tail is represented by (UaN)bUc, wherein N is one of adenosine (A), uridine (U), cytidine (C), and guanosine (G), wherein a, b, c is an integer, a is 1 or more and 5 or less, b is 0 or more,
  • the sequence of the engineered scaffold region is characterized in that it differs from 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACCAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3' (SEQ ID NO: 7),
  • the sequence of the engineered scaffold region consists of the following sequences linked in order from the 5' end to the 3' end:
  • composition for regulating gene expression, for promoting expression of a target gene comprising:
  • the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein includes a dead Cas12f1 (dCas12f1) protein and a transcriptionally active protein,
  • the dCas12f1 protein contains aspartic acid (D) at the 326th amino acid, glutamic acid at the 422th amino acid (E), arginine at the 490th amino acid (R), or aspartic acid at the 510th amino acid in the amino acid sequence constituting the wild-type Cas12f1 protein.
  • D is substituted with alanine (A), glutamine (Q), leucine (L), tryptophan (W) or valine (V),
  • the transcriptional activation protein is a DNA-binding protein or DNA-binding peptide capable of binding to an enhancer or promoter-proximal element
  • the engineered Cas12f1 guide RNA comprises:
  • the spacer comprises 10 or more and 50 or less nucleotides and has a sequence complementary to the target sequence
  • the sequence of the U-rich tail is represented by (UaN)bUc, wherein N is one of adenosine (A), uridine (U), cytidine (C), and guanosine (G), wherein a, b, c is an integer, a is 1 or more and 5 or less, b is 0 or more,
  • the sequence of the engineered scaffold region is characterized in that it differs from 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACCAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3' (SEQ ID NO: 7),
  • the sequence of the engineered scaffold region consists of the following sequences linked in order from the 5' end to the 3' end:
  • the present specification provides a method for promoting the expression of a target gene in a cell, comprising:
  • a transcriptionally active Cas12f1 fusion protein or a nucleic acid encoding the same a transcriptionally active Cas12f1 fusion protein or a nucleic acid encoding the same; and delivering the engineered Cas12f1 guide RNA or a nucleic acid encoding the same into a cell;
  • a CRISPR activation complex may be formed in the cell
  • the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein includes a dead Cas12f1 (dCas12f1) protein and a transcriptionally active protein,
  • the dCas12f1 protein contains aspartic acid (D) at the 326th amino acid, glutamic acid at the 422th amino acid (E), arginine at the 490th amino acid (R), or aspartic acid at the 510th amino acid in the amino acid sequence constituting the wild-type Cas12f1 protein.
  • D is substituted with alanine (A), glutamine (Q), leucine (L), tryptophan (W) or valine (V),
  • the transcriptional activation protein is a DNA-binding protein or DNA-binding peptide capable of binding to an enhancer or promoter-proximal element
  • the engineered guide Cas12f1 RNA contains:
  • the spacer comprises 10 or more and 50 or less nucleotides and has a sequence complementary to the target sequence
  • the sequence of the U-rich tail is represented by (UaN)bUc, wherein N is one of adenosine (A), uridine (U), cytidine (C), and guanosine (G), wherein a, b, c is an integer, a is 1 or more and 5 or less, b is 0 or more,
  • the sequence of the engineered scaffold region is characterized in that it differs from 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACCAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3' (SEQ ID NO: 7),
  • the sequence of the engineered scaffold region consists of the following sequences linked in order from the 5' end to the 3' end:
  • the expression of a target gene can be regulated. Specifically, when a CRISPR expression control system comprising a transcription-inhibiting Cas12f1 fusion protein and an engineered Cas12f1 guide RNA is used, the expression of a target gene can be suppressed. In addition, when a CRISPR expression control system comprising a transcriptionally active Cas12f1 fusion protein and an engineered Cas12f1 guide RNA is used, the expression of a target gene can be promoted.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustratively showing the engineered Cas12f1 guide RNA disclosed herein.
  • Example 6 to 9 are graphs showing average indel efficiencies for Examples 1.2.1 to Example 1.2.13 targeting DY10 among the examples disclosed in Experimental Example 2;
  • Ex is an abbreviation for Example
  • Comp is an abbreviation for Comparative Example
  • Control is a negative control.
  • 16 to 17 are graphs showing average indel efficiencies for Examples 2.1.1 to 2.1.15 targeting DY2 among the examples disclosed in Experimental Example 3.1. In this case, Ex is an abbreviation for Example.
  • Example 22 to 23 are graphs showing average indel efficiencies for Examples 3.2.1 to 3.2.12 targeting DY10 among the examples disclosed in Experimental Example 3.2. In this case, Ex is an abbreviation for Example.
  • Example 24 to 26 are graphs showing the average indel efficiency for each example disclosed in Experimental Example 4.1. Average indel efficiencies are shown for Examples 4.4.1 to Example 4.4.4 targeting FUS, Examples 4.5.1 to Example 4.5.2 targeting GAK, and Example 4.6.1 targeting MLH, respectively. . In this case, Ex is an abbreviation for Example.
  • FIG. 30 schematically shows the design of various modules of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein.
  • 31 shows the results of confirming the effect of inhibiting the expression of a target gene using variously designed transcription-inhibiting Cas12f1 fusion proteins.
  • 35 shows the results of confirming the effect of inhibiting the expression of a target gene using a transcription-inhibiting Cas12f1 fusion protein containing KRAB.
  • 36 shows the results of confirming the effect of inhibiting the expression of a target gene using a transcription-inhibiting Cas12f1 fusion protein including DNMT.
  • FIG. 40 shows the results of confirming the effect of inhibiting the expression of a target gene using a transcription-inhibiting Cas12f1 fusion protein comprising a plurality of KRABs.
  • 41 shows the results of confirming the effect of inhibiting the expression of a target gene using a transcription-inhibiting Cas12f1 fusion protein comprising a plurality of KRAB and MeCP2.
  • Figure 46 shows the results of confirming the indel efficiency by selecting a target located in the promoter to confirm the effect of inhibiting the expression of the PCSK9 gene.
  • 49 shows the results of confirming the indel efficiency for the target located in the promoter of the PCSK9 gene using the optimal guide RNA.
  • Fig. 54 shows a schematic diagram of a transcriptionally active Cas12f1 fusion protein containing VP64.
  • 55 shows the results of confirming the increase in expression of the OCT4 gene using a CRISPR expression control system including a transcriptionally active Cas12f1 fusion protein including VP64.
  • the term 'about' refers to 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7 with respect to a reference amount, level, value, number, frequency, percent, fixture, size, amount, weight or length. , means an amount, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, amount, weight or length varying by 6, 5, 4, 3, 2 or 1%.
  • each nucleoside is It should be construed as meaning a nucleotide comprising
  • operably linked in gene expression technology, means that a specific component is linked to another component, such that the specific component is linked such that it functions in an intended manner.
  • a promoter sequence when operatively linked with a coding sequence, it is meant that the promoter is linked so as to affect the transcription and/or expression of the coding sequence in a cell.
  • the term includes all meanings recognized by those skilled in the art, and may be appropriately interpreted according to the context.
  • target gene or target nucleic acid
  • target gene or “target nucleic acid” basically refers to a gene or nucleic acid in a cell that is a target of gene expression regulation.
  • the target gene or target nucleic acid may be used interchangeably, and may refer to the same subject.
  • the target gene or target nucleic acid may refer to both a unique gene or nucleic acid possessed by a target cell, or an externally-derived gene or nucleic acid, unless otherwise specified, and is not particularly limited as long as it can be a target for gene expression regulation.
  • the target gene or target nucleic acid may be single-stranded DNA, double-stranded DNA, and/or RNA.
  • the term includes all meanings recognized by those skilled in the art, and may be appropriately interpreted according to the context.
  • target sequence refers to a specific sequence recognized by a CRISPR activation complex or a CRISPR interference complex to regulate expression of a target gene or target nucleic acid.
  • the target sequence may be appropriately selected depending on the purpose.
  • target sequence refers to a sequence included in a target gene or target nucleic acid sequence, and refers to a sequence having complementarity with a spacer sequence included in a guide RNA provided herein or an engineered guide RNA.
  • the spacer sequence is determined in consideration of the sequence of the target gene or target nucleic acid and the PAM sequence recognized by the Cas12f1 fusion protein.
  • the target sequence may refer only to a specific strand that complementarily binds to the guide RNA of the CRISPR activation complex or CRISPR interference complex, and may refer to the entire target double strand including the specific strand portion, which is appropriate according to the context. interpreted.
  • the term includes all meanings recognized by those skilled in the art, and may be appropriately interpreted according to the context.
  • vector refers to any material capable of transporting genetic material into a cell.
  • the vector may be a DNA molecule comprising the genetic material of interest, for example, a nucleic acid encoding a Cas12f1 fusion protein of a CRISPR expression control system, and/or a nucleic acid encoding a guide RNA, but is not limited thereto not.
  • the above terms include all meanings recognized by those skilled in the art, and may be appropriately interpreted according to the context.
  • the term “found in nature” means an unmodified object found in the natural world, and is used to distinguish it from an “engineered object” that has been artificially deformed.
  • the “genes, nucleic acids, DNA, RNA, etc. found in nature” are used as a concept encompassing all genes, nucleic acids, DNA, and RNA in wild-type and mature form (active form).
  • the term includes all other meanings recognized by those skilled in the art, and should be appropriately interpreted according to the context.
  • engineered is a term used to distinguish substances, molecules, etc. having a constitution that already exist in nature, and means that artificial modifications are applied to the substances, molecules, etc.
  • engineered guide RNA it refers to a guide RNA in which an artificial change is applied to the composition of a guide RNA existing in nature.
  • the term includes all meanings recognized by those skilled in the art, and may be appropriately interpreted according to the context.
  • NLS refers to a peptide of a certain length that acts as a kind of “tag” attached to a protein to be transported when a substance outside the cell nucleus is transported into the nucleus by nuclear transport, or its means sequence.
  • the NLS is the NLS of the SV40 virus large T-antigen having the amino acid sequence PKKKRKV (SEQ ID NO: 278); NLS from nucleoplasmin (eg, nucleoplasmin bipartite NLS having the sequence KRPAATKKAGQAKKKK (SEQ ID NO: 279)); c-myc NLS having the amino acid sequence PAAKRVKLD (SEQ ID NO: 280) or RQRRNELKRSP (SEQ ID NO: 281); hRNPA1 M9 NLS having the sequence NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY (SEQ ID NO: 282); sequence RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV (SEQ ID NO: 283) of the IBB domain from importin-alpha; sequences VSRKRPRP (SEQ ID NO: 284) and PPKKARED (SEQ ID NO: 285) of myoma T protein
  • NES refers to a peptide of a certain length that acts as a kind of "tag” attached to a protein to be transported when a material inside the cell nucleus is transported to the outside of the nucleus by nuclear transport, or its means sequence.
  • NES includes all meanings recognized by those skilled in the art, and may be appropriately interpreted according to the context.
  • the term “tag” refers to a functional domain added to facilitate the tracking and/or separation and purification of peptides or proteins.
  • the tag includes a histidine (His) tag, a V5 tag, a FLAG tag, an influenza hemagglutinin (HA) tag, a Myc tag, a VSV-G tag, and a tag protein such as a thioredoxin (Trx) tag, a green fluorescent protein (GFP), yellow fluorescent protein (YFP), cyan fluorescent protein (CFP), blue fluorescent protein (BFP), autofluorescent proteins such as HcRED, DsRed, and glutathione-S-transferase (GST), horseradish ( horseradish) peroxidase (HRP), chloramphenicol acetyltransferase (CAT) beta-galactosidase, beta-glucuronidase, reporter genes such as luciferase, but are not limited thereto.
  • His histidine
  • the CRISPR/Cas12f system belongs to the V-F subtype of the type V CRISPR/Cas system, which is further divided into V-F1 to V-F3 variants.
  • the CRISPR/Cas12f system is one of the effector proteins named Cas14 in a previous study (Harrington et al., Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes, Science 362, 839-842 (2016)), Cas14a, Cas14b, and Cas14c variants.
  • CRISPR/Cas14 systems comprising Among them, the CRISPR/Cas14a system including the Cas14a effector protein is classified as the CRISPR/Cas12f1 system (Makarova et al., Nature Reviews, Microbiology volume 18, 67 (2020)). Recent previous studies (Takeda et al., Structure of the miniature type V-F CRISPR-Cas effector enzyme, Molecular Cell 81, 1-13 (2021), Xiao et al., Structural basis for the dimerization-dependent CRISPR-Cas12f nuclease, bioRxiv (2020)), etc., revealed the structure of the CRISPR/Cas12f1 complex.
  • the CRISPR/Cas12f1 system is characterized in that the size of the Cas12f1 protein is significantly smaller than that of the CRISPR/Cas9 system. This feature makes it possible to solve the difficulty of developing a fusion protein due to the size of most of the Cas nucleases previously studied, the difficulty of loading into AAV (adeno-associated virus), and the difficulty of applying it as a therapeutic agent.
  • AAV adeno-associated virus
  • the CRISPR The /Cas12f1 system did not show cleavage activity for double-stranded DNA in cells, or even showed cleavage activity, but its efficiency was very low, so it was difficult to actively utilize it for gene editing.
  • the present inventors recently developed an engineered Cas12f1 guide RNA to increase the intracellular gene editing activity of the CRISPR/Cas12f1 system.
  • the CRISPR regulation system which has been difficult to be used efficiently due to the difficulty of developing a fusion protein according to the large size of Cas9 and AAV vector packaging, can be more efficiently used. is expected to be available as
  • the CRISPR regulatory system comprises an engineered Cas12f1 guide RNA and a Cas12f1 fusion protein.
  • the CRISPR control system can be divided into a CRISPR activation system and a CRISPR interference system according to the Cas12f1 fusion protein.
  • the CRISPR activation system serves to increase or promote the expression of a target to be regulated, that is, a target gene.
  • the CRISPR interference system serves to inhibit or inhibit the expression of a target gene. This effect is due to the expression regulatory domain included in the Cas12f1 fusion protein, and the effect of the CRISPR regulatory system varies depending on the transcriptional activation protein or the transcriptional inhibitory protein, which is the expression control domain.
  • the CRIPSR regulatory system comprises a Cas12f1 fusion protein and an engineered Cas12f1 guide RNA.
  • the Cas12f1 fusion protein includes a modified Cas12f1 protein and an expression control domain.
  • the effect of the CRIPSR regulatory system may vary depending on the type of the expression regulatory domain.
  • the CRIPSR regulatory system may be a CRISPR interference system for inhibiting or suppressing the expression of a target gene.
  • the CRISPR interference system is characterized by comprising a transcription-inhibiting Cas12f1 fusion protein and an engineered Cas12f1 guide RNA.
  • the transcription-inhibiting Cas12f1 fusion protein is characterized in that it includes a modified Cas12f1 protein and a transcription-inhibiting protein.
  • the CRIPSR regulatory system may be a CRISPR activation system for increasing or promoting expression of a target gene.
  • the CRISPR activation system is characterized in that it comprises a transcriptionally active Cas12f1 fusion protein and an engineered Cas12f1 guide RNA.
  • the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein is characterized in that it includes a modified Cas12f1 protein and a transcriptionally active protein.
  • the CRISPR regulatory system provided herein comprises a Cas12f1 fusion protein.
  • the Cas12f1 fusion protein serves as an expression control protein that regulates the expression of a target gene.
  • the Cas12f1 fusion protein comprises a modified Cas12f1 protein and an expression regulatory domain.
  • the CRISPR regulatory system may increase or enhance, inhibit or inhibit the expression of a target gene according to the expression regulatory domain of the Cas12f1 fusion protein.
  • the efficiency of the CRISPR regulatory system may differ depending on the type, number, combination, and fusion location of the expression control domains included in the Cas12f1 fusion protein.
  • the Cas12f1 fusion protein comprises a modified Cas12f1 protein and an expression regulatory domain.
  • the modified Cas12f1 protein is characterized in that at least a portion of the sequence of the wild-type Cas12f1 protein is modified, and is a Cas12f1 variant whose function is altered when compared to the wild-type Cas12f1 protein due to the modification.
  • the modified Cas12f1 protein is characterized in that the function is changed so that it cannot cut all the double strands of the target nucleic acid or the target gene.
  • the expression control domain is characterized in that it is a protein that activates or inhibits transcription of a target gene.
  • the Cas12f1 fusion protein may include a modified Cas12f1 protein and a transcriptional activation protein.
  • the CRISPR regulation system including the Cas12f1 fusion protein is characterized in that it increases or improves the expression of the target gene.
  • the Cas12f1 fusion protein may include a modified Cas12f1 protein and a transcription inhibitory protein.
  • the CRISPR regulation system including the Cas12f1 fusion protein inhibits or suppresses the expression of a target gene.
  • the Cas12f1 fusion protein provided herein is characterized in that it comprises a modified Cas12f1 protein whose function is altered such that the double strand of the target nucleic acid or target gene cannot be cleaved.
  • the modified Cas12f1 protein is characterized in that at least one amino acid sequence of the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein is modified.
  • the Cas12f1 fusion protein provided herein is characterized by including a protein that activates or inhibits transcription of a target gene into an expression control domain.
  • the expression control domain is characterized in that it is a transcriptional activation protein or a transcriptional inhibition protein.
  • the transcriptional activation protein may be VP64, Sun Tag, VPR (VP64, p65, Rta) or TV (TAL, VP64).
  • the transcription inhibitory protein may be KRAB, DNMT, MeCP2, HDAC, LSD, SRDX SALL1 or SDS3.
  • the Cas12f1 fusion protein provided herein may include two or more expression control domains, and in this case, the type, number, combination, and fusion site of the expression control domains may be variously designed.
  • the various modularization of the Cas12f1 fusion protein enables the development of a more effective CRISPR regulatory system by taking advantage of the small size of the Cas12f1 protein.
  • the efficiency of the CRISPR regulatory system may differ according to various modularizations, and the CRISPR regulatory system including the optimal Cas12f1 fusion protein may be designed through various modularizations according to the target gene.
  • the Cas12f1 fusion protein may include a modified Cas12f1 protein and two or more transcription inhibitory proteins.
  • the two or more transcription inhibitory proteins may be different proteins.
  • all of the different transcription inhibitory proteins may be located at the N-terminus of the modified Cas12f1 protein.
  • the different transcription inhibitory proteins may all be located at the C-terminus of the modified Cas12f1 protein.
  • the different transcription inhibitory proteins may be located at the N-terminus or C-terminus of the modified Cas12f1 protein, respectively.
  • the Cas12f1 fusion protein provided herein is characterized in that it comprises a linker connecting the modified Cas12f1 protein and the expression control domain.
  • the linker is characterized in that it is an amino acid sequence that does not affect the function and structure of the modified Cas12f1 protein and the expression control domain.
  • the Cas12f1 fusion protein provided herein is used in the CRISPR/Cas12f1 system, unlike the case of using the wild-type Cas12f1 protein, the effect of increasing or inhibiting the expression of the target gene without double-stranded cleavage of the target gene appears.
  • the existing CRISPR/Cas12f1 system is being used in the field of gene editing technology (knockout of a target gene or knock-in of a target gene, etc.) It can control the expression of a target gene without (such as nucleic acid modification due to double-strand break), so it can be used in various gene expression control technologies.
  • the Cas12f1 fusion protein provided herein can be used for gene expression control together with the engineered Cas12f1 guide RNA.
  • the engineered Cas12f1 guide RNA can be used for preparing a composition for regulating gene expression.
  • the Cas12f1 fusion protein for the CRISPR regulatory system includes a modified Cas12f1 protein.
  • the modified Cas12f1 protein may be one in which at least one amino acid sequence is modified from the amino acid sequence of a wild-type Cas12f1 protein existing in nature.
  • the sequence encoding the modified Cas12f1 protein may be a Cas12f1 sequence that is human codon-optimized for the modified Cas12f1 protein.
  • the modified Cas12f1 protein has an altered function of the wild-type Cas12f1 protein existing in nature.
  • the modified Cas12f1 protein is a wild-type Cas12f1 protein in which the target nucleic acid or double-strand break function of the target gene is removed.
  • modified Cas12f1 protein is referred to as "dead Cas12f1 protein (dCas12f1 protein)" used Unless specifically limited, as used herein, “modified Cas12f1 protein” refers to a dCas12f1 protein that cannot perform double-strand breaks of a target nucleic acid or a target gene.
  • Cas12f1 fusion proteins provided herein include modified Cas12f1 proteins.
  • the modified Cas12f1 protein may be one in which at least one or more of the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein is modified.
  • the wild-type Cas12f1 protein may be derived from the Cas14 family (Harrington et al., Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes, Science 362, 839-842 (2016)). In one embodiment, the wild-type Cas12f1 protein may be an uncultured archaeon-derived Cas14a protein (Harrington et al., Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes, Science 362, 839-842 (2018)). In one embodiment, the wild-type Cas12f1 protein may be a wild-type Cas14a1 protein. In one embodiment, the wild-type Cas12f1 protein may have the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 260.
  • the dCas12f1 protein included in the Cas12f1 fusion protein provided herein may have an altered or lost function of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may be modified such that it cannot cut all double strands of the target nucleic acid or target gene.
  • the dCas12f1 protein included in the Cas12f1 fusion protein provided herein may be one in which at least one amino acid in the amino acid sequence constituting the wild-type Cas12f1 protein is substituted with another amino acid. Accordingly, the dCas12f1 may have at least one amino acid sequence different from that of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein is arginine (R) at the 490th amino acid, aspartic acid at the 510th amino acid (D), glutamic acid at the 422th amino acid (E), and aspartic acid at the 326th amino acid in the amino acid sequence constituting the wild-type Cas12f1 protein. At least one or more amino acids in (D) may be substituted with other amino acids.
  • the dCas12f1 protein may be one in which arginine (R), which is the 490th amino acid in the amino acid sequence constituting the wild-type Cas12f1 protein, is substituted with another amino acid.
  • R arginine
  • the other amino acid may be alanine (A), glutamine (Q), leucine (L) or tryptophan (W), but is not limited thereto.
  • the dCas12f1 protein may be one in which aspartic acid (D), which is the 510th amino acid in the amino acid sequence constituting the wild-type Cas12f1 protein, is substituted with another amino acid.
  • D aspartic acid
  • the other amino acid may be alanine (A), leucine (L) or valine (V), but is not limited thereto.
  • the dCas12f1 protein may be one in which glutamic acid (E), which is the 422th amino acid in the amino acid sequence constituting the wild-type Cas12f1 protein, is substituted with another amino acid.
  • the other amino acid may be alanine (A), but is not limited thereto.
  • the dCas12f1 protein may be one in which aspartic acid (D), which is the 326th amino acid in the amino acid sequence constituting the wild-type Cas12f1 protein, is substituted with another amino acid.
  • D aspartic acid
  • the other amino acid may be alanine (A), but is not limited thereto.
  • the dCas12f1 protein may be one in which arginine (R), which is the 490th amino acid in the amino acid sequence constituting the wild-type Cas12f1 protein, is substituted with alanine (A).
  • R arginine
  • A alanine
  • the dCas12f1 protein may have an alanine at position 490 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may have the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 261.
  • the dCas12f1 protein may be expressed as "R490A dCas12f1 protein" or "dCas12f1 R490A protein".
  • the dCas12f1 protein may be one in which arginine (R), which is the 490th amino acid in the amino acid sequence constituting the wild-type Cas12f1 protein, is substituted with glutamine (Q).
  • R arginine
  • Q glutamine
  • the dCas12f1 protein may have glutamine at position 490 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may have the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 262.
  • the dCas12f1 protein may be expressed as "R490Q dCas12f1 protein" or "dCas12f1 R490Q protein".
  • the dCas12f1 protein may be one in which arginine (R), which is the 490th amino acid in the amino acid sequence constituting the wild-type Cas12f1 protein, is substituted with leucine (L).
  • R arginine
  • L leucine
  • the dCas12f1 protein may have a leucine at position 490 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may have the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 264.
  • the dCas12f1 protein may be expressed as "R490L dCas12f1 protein" or "dCas12f1 R490L protein".
  • the dCas12f1 protein may be one in which arginine (R), which is the 490th amino acid in the amino acid sequence constituting the wild-type Cas12f1 protein, is substituted with tryptophan (W).
  • R arginine
  • W tryptophan
  • the dCas12f1 protein may have tryptophan at position 490 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may have the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 265.
  • the dCas12f1 protein may be expressed as "R490W dCas12f1 protein" or "dCas12f1 R490W protein".
  • the dCas12f1 protein may be one in which aspartic acid (D), which is the 510th amino acid in the amino acid sequence constituting the wild-type Cas12f1 protein, is substituted with alanine (A).
  • D aspartic acid
  • A alanine
  • the dCas12f1 protein may have an alanine at position 510 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may have the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 266.
  • the dCas12f1 protein may be referred to as "D510A dCas12f1 protein" or "dCas12f1 D510A protein".
  • the dCas12f1 protein may be one in which aspartic acid (D), which is the 510th amino acid in the amino acid sequence constituting the wild-type Cas12f1 protein, is substituted with leucine (L).
  • D aspartic acid
  • L leucine
  • the dCas12f1 protein may have the 510th leucine compared to the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may have the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 267.
  • the dCas12f1 protein may be expressed as "D510L dCas12f1 protein" or "dCas12f1 D510L protein".
  • the dCas12f1 protein may be one in which aspartic acid (D), which is the 510th amino acid in the amino acid sequence constituting the wild-type Cas12f1 protein, is substituted with valine (V).
  • D aspartic acid
  • V valine
  • the dCas12f1 protein may have a valine at position 510 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may have the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 268.
  • the dCas12f1 protein may be expressed as "D510V dCas12f1 protein" or "dCas12f1 D510V protein".
  • the dCas12f1 protein may be one in which glutamic acid (E), which is the 422th amino acid in the amino acid sequence constituting the wild-type Cas12f1 protein, is substituted with alanine (A).
  • E glutamic acid
  • A alanine
  • the dCas12f1 protein may have an alanine at position 422 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may have the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 269.
  • the dCas12f1 protein may be expressed as "E422A dCas12f1 protein" or "dCas12f1 E422A protein".
  • the dCas12f1 protein may be one in which aspartic acid (D), which is the 326th amino acid in the amino acid sequence constituting the wild-type Cas12f1 protein, is substituted with alanine (A).
  • D aspartic acid
  • A alanine
  • the dCas12f1 protein may have an alanine at position 326 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may have the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 271.
  • the dCas12f1 protein may be expressed as "D326A dCas12f1 protein" or "dCas12f1 D326A protein".
  • the Cas12f1 fusion protein for the CRISPR regulatory system includes an expression regulatory domain.
  • a protein that activates or inhibits transcription of a target gene into the expression control domain may be a transcription activation protein or a transcription inhibition protein.
  • the expression control domain is a transcriptional activation protein
  • the Cas12f1 fusion protein including the same may be used as a CRISPR regulatory system for increasing or promoting expression of a target gene.
  • the expression control domain is a transcription inhibition protein
  • the Cas12f1 fusion protein including the same may be used as a CRISPR regulation system for inhibiting or suppressing the expression of a target gene.
  • the expression control domain may be a transcriptional activation protein.
  • the transactivation protein may be a protein that acts to activate or promote transcription of a target gene.
  • the transcriptional activation protein may be a DNA binding protein capable of binding to an enhancer of a target gene or a promoter-proximal element.
  • the transcriptional activation protein binds to the regulatory DNA region located near the promoter and promotes gene transcription by promoting the binding of the transcription machinery to the promoter through protein-protein interaction with the general transcription machinery (such as RNA polymerase and general transcription factors). can do.
  • the transcriptional activation protein may promote the transcription of the gene by triggering the RNA polymerase to be released from the promoter to proceed with the synthesis along the DNA.
  • the transcriptional activation protein may be VP64.
  • the expression control domain may be a transcriptional inhibition protein.
  • the transcriptional inhibitory protein may be a protein that inhibits or inhibits transcription of a target gene.
  • the transcriptional inhibitory protein may be a DNA-binding protein or peptide that binds to an operator or silencer of the target gene to inhibit or inhibit expression of the target gene.
  • the transcription inhibitory protein may inhibit or inhibit gene transcription by blocking the attachment of the RNA polymerase to the promoter.
  • the transcription inhibitory protein may be a protein or peptide that inhibits or inhibits gene transcription by inducing a structural change of chromatin. In this case, the structural change of the chromatin may be due to methylation, demethylation, acetylation, deacetylation, or the like.
  • the transcription inhibitory protein may be KRAB, DNMT, MeCP2, LSD or HDAC.
  • the DNMT may be DNMT1, TRDMT1, or DNMT3.
  • the HDAC may be HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10, or HDAC11.
  • One Cas12f1 fusion protein may comprise at least one expression regulatory domain.
  • the expression control domain may be a transcriptional activation protein or a transcriptional inhibition protein.
  • one Cas12f1 fusion protein may include a plurality of expression control domains.
  • the plurality of expression control domains are all domains having the same function, and may be a protein that promotes transcriptional activity or inhibits transcriptional activity. That is, all of the plurality of expression control domains may be transcriptional activation proteins or all transcriptional inhibitory proteins.
  • the plurality of expression control domains have the same function and do not necessarily have to be the same protein. For example, when the plurality of expression control domains are all transcriptional inhibitory proteins, a plurality of one type of transcriptional inhibitory protein may exist or a plurality of different types of transcriptional inhibitory proteins may exist.
  • the expression control domain may be located at the N-terminus and/or C-terminus of the modified Cas12f1 protein included in the Cas12f1 fusion protein, that is, the dCas12f1 protein.
  • the expression control domains are all located at the N-terminus of the dCas12f1 protein, all at the C-terminus of the dCas12f1 protein, or some are located at the N-terminus of the dCas12f1 protein The rest may be located at the C-terminus of the dCas12f1 protein.
  • all of the two expression control domains may be located at the N-terminus of the dCas12f1 protein.
  • both of the two expression control domains may be located at the C-terminus of the dCas12f1 protein.
  • one of the two expression control domains may be located at the C-terminus of the dCas12f1 protein, and the other one may be located at the N-terminus of the dCas12f1 protein.
  • all of the three expression control domains may be located at the N-terminus of the dCas12f1 protein.
  • all of the three expression control domains may be located at the C-terminus of the dCas12f1 protein.
  • two of the three expression control domains may be located at the C-terminus of the dCas12f1 protein, and the other one may be located at the N-terminus of the dCas12f1 protein.
  • one of the three expression control domains may be located at the C-terminus of the dCas12f1 protein, and the other two may be located at the N-terminus of the dCas12f1 protein.
  • the expression control domain may be a transcriptional activation protein.
  • the transcriptional activation protein may be VP64.
  • the expression control domain may have the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 272.
  • the expression control domain may be a transcriptional inhibition protein.
  • the transcription inhibitory protein may be KRAB.
  • the expression control domain may have the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 274.
  • the expression control domain may be a transcriptional inhibition protein.
  • the transcription inhibitory protein may be MeCP2.
  • the expression control domain may have the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 275.
  • the expression control domain may be a transcriptional inhibition protein.
  • the transcription inhibitory protein may be DNMT3.
  • the expression control domain may have the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 276.
  • the expression control domain may be a transcriptional inhibition protein.
  • the transcriptional inhibitory protein may be HDAC3.
  • the expression control domain may have the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 277.
  • the Cas12f1 fusion protein for the CRISPR regulatory system includes a linker to connect the dCas12f1 protein and the expression regulatory domain.
  • the linker is characterized in that it is an amino acid sequence that does not affect the function and structure of the dCas12f1 protein and the expression control domain.
  • the Cas12f1 fusion protein for the CRISPR regulatory system provided herein may further comprise one or more additional domains.
  • the additional domain may be located at the N-terminus and/or C-terminus of the Cas12f1 fusion protein.
  • the additional domain may be located between the dCas12f1 protein and the expression control domain included in the Cas12f1 fusion protein.
  • the additional domain may be a Nuclear Localization Sequence (NLS) or a Nuclear Export Sequence (NES).
  • NLS Nuclear Localization Sequence
  • NES Nuclear Export Sequence
  • the NLS may be any one of those exemplified in the NLS paragraph of “Definitions of Terms”, but is not limited thereto.
  • the additional domain may be a tag.
  • the tag may be any one of those exemplified in the tag paragraph of “Definition of Terms”, but is not limited thereto.
  • the Cas12f1 fusion protein for the CRISPR regulatory system provided herein is divided into two types according to functions.
  • the Cas12f1 fusion protein may be a transcriptionally active Cas12f1 fusion protein that functions to increase or promote expression of a target gene.
  • the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein is dCas12f1 protein; and a transcriptional activation protein as an expression control domain.
  • the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein is used in a CRISPR regulation system for increasing or enhancing the expression of a target gene, that is, a CRISPR activation system.
  • the Cas12f1 fusion protein may be a transcription inhibitory Cas12f1 fusion protein that functions to inhibit or inhibit expression of a target gene.
  • the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein is dCas12f1 protein; and a transcriptional inhibition protein as an expression control domain.
  • the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein is used in a CRISPR regulation system for inhibiting or suppressing the expression of a target gene, that is, a CRISPR interference system.
  • the Cas12f1 fusion protein for the CRISPR regulatory system can improve or optimize its function through various modularizations.
  • the modularization is characterized in that the number, type, and position of the expression control domain included in the Cas12f1 fusion protein are variously controlled.
  • an optimized transcriptional activation Cas12f1 fusion protein or transcription inhibition Cas12f1 fusion protein can be developed and used more effectively in a CRISPR activation system or a CRISPR interference system.
  • the Cas12f1 fusion protein can variously control the number, type, and position of the additional domains in the Cas12f1 fusion protein as well as the expression control domain.
  • the Cas12f1 fusion protein may include a dCas12f1 protein and two transcription inhibitory proteins.
  • the two transcription-inhibiting proteins may be the same type of transcription-inhibiting proteins.
  • the two transcription-inhibiting proteins may be different types of transcription-inhibiting proteins.
  • both of the two transcription inhibitory proteins may be located at the N-terminus of the dCas12f1 protein.
  • both of the two transcription inhibitory proteins may be located at the C-terminus of the dCas12f1 protein.
  • the two transcription inhibitory proteins may be located one at the N-terminus and one at the C-terminus of the dCas12f1 protein.
  • the Cas12f1 fusion protein may further comprise one or more additional domains.
  • the additional domain may be located at the N-terminus and/or C-terminus of the Cas12f1 fusion protein.
  • the additional domain may be located between the dCas12f1 protein and the transcriptional inhibition protein.
  • the positions of the dCas12f1 protein, the transcription inhibitory protein, and the additional domain included in the Cas12f1 fusion protein can be variously controlled.
  • the Cas12f1 fusion protein provided herein may be a transcriptionally active Cas12f1 fusion protein.
  • the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein may include a dCas12f1 protein and at least one transcriptionally active protein.
  • the transcriptional activation protein may be located at the N-terminus or C-terminus of the dCas12f1 protein.
  • the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein may further include at least one NLS as an additional domain.
  • the NLS may be located at the N-terminus and/or C-terminus of the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein.
  • the NLS may be located between the dCas12f1 protein and the transcriptional activation protein.
  • the dCas12f1 protein, the transcriptionally active protein, and the NLS included in the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein may be linked by a linker.
  • the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein may include a dCas12f1 protein and two or more transcriptionally active proteins.
  • the two or more transcriptional activation proteins may be located at the N-terminus and/or C-terminus of the dCas12f1 protein.
  • the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein may further include at least one NLS as an additional domain.
  • the NLS may be located at the N-terminus and/or C-terminus of the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein.
  • the NLS may be located between the dCas12f1 protein and the transcriptional activation protein.
  • the dCas12f1 protein, the transcriptionally active protein, and the NLS included in the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein may be linked by a linker.
  • the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein is one in which a dCas12f1 protein and a transcriptionally active protein are sequentially linked in an N-terminal to C-terminal direction; or a transcriptional activation protein and a dCas12f1 protein linked in sequence
  • the dCas12f1 protein and the transcriptional activation protein may be connected by a linker.
  • the dCas12f1 protein may be one in which arginine (R), which is the 490th amino acid in the amino acid sequence constituting the wild-type Cas12f1 protein, is substituted with alanine (A), glutamine (Q), leucine (L) or tryptophan (W).
  • R arginine
  • A alanine
  • Q glutamine
  • L leucine
  • W tryptophan
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 R490A protein having an alanine at position 490 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 R490Q protein having glutamine at position 490 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 R490L protein having a leucine at position 490 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 R490W protein having a tryptophan at position 490 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may have at least one amino acid sequence among the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 261, 262, 264 and 265.
  • the dCas12f1 protein may be one in which aspartic acid (D), which is the 510th amino acid in the amino acid sequence constituting the wild-type Cas12f1 protein, is substituted with alanine (A), leucine (L) or valine (V).
  • D aspartic acid
  • A alanine
  • L leucine
  • V valine
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 D510A protein having an alanine at position 510 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 D510L protein having a leucine at position 510 when compared with the amino acid sequence of a wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 D510V protein having a valine at position 510 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may have at least one amino acid sequence among the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 266 to 268.
  • the transcriptional activation protein may be VP64.
  • the transcriptional activation protein may have the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 272.
  • the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein may further comprise one or more NLSs as additional domains.
  • the one or more NLSs may be located at the N-terminus and/or C-terminus of the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein.
  • the one or more NLSs may be located between the dCas12f1 protein and the transcriptional activation protein.
  • the one or more NLSs may be linked to the dCas12f1 protein and/or the transcriptional activation protein by a linker.
  • the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein may have the following structure in the direction from the N-terminus to the C-terminus: [dCas12f1 R490A protein]-[VP64]; [dCas12f1 R490Q protein]-[VP64]; [dCas12f1 R490L protein]-[VP64]; [dCas12f1 R490W protein]-[VP64]; [VP64]-[dCas12f1 R490A protein]; [VP64]-[dCas12f1 R490Q protein]; [VP64]-[dCas12f1 R490L protein]; or [VP64]-[dCas12f1 R490W protein].
  • the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein may further comprise one or more NLSs.
  • the at least one NLS comprises the N-terminus of the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein, the C-terminus of the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein and/or a dCas12f1 protein (dCas12f1 R490A protein, dCas12f1 R490Q protein, dCas12f1 R490L protein or dCas12f1 R490W protein) and VP64 can be located between
  • the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein may have the following structure in the direction from the N-terminus to the C-terminus: [dCas12f1 D510A protein]-[VP64]; [dCas12f1 D510L protein]-[VP64]; [dCas12f1 D510V protein]-[VP64]; [VP64]-[dCas12f1 D510A protein]; [VP64]-[dCas12f1 D510L protein]; or [VP64]-[dCas12f1 D510V protein].
  • the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein may further comprise one or more NLSs.
  • the one or more NLSs may be located between the N-terminus of the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein, the C-terminus of the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein, and/or between the dCas12f1 protein (dCas12f1 D510A protein, dCas12f1 D510L protein or dCas12f1 D510V protein) and VP64.
  • dCas12f1 protein dCas12f1 D510A protein, dCas12f1 D510L protein or dCas12f1 D510V protein
  • the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein is one in which a dCas12f1 protein, a transcriptionally active protein, and a transcriptionally active protein are sequentially linked in an N-terminal to C-terminal direction;
  • the transcriptional activation protein, the transcriptional activation protein, and the dCas12f1 protein may be sequentially linked.
  • the dCas12f1 protein and the transcriptional activation protein may be connected by a linker.
  • the dCas12f1 protein may be one in which arginine (R), which is the 490th amino acid in the amino acid sequence constituting the wild-type Cas12f1 protein, is substituted with alanine (A), glutamine (Q), leucine (L) or tryptophan (W).
  • R arginine
  • A alanine
  • Q glutamine
  • L leucine
  • W tryptophan
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 R490A protein having an alanine at position 490 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 R490Q protein having glutamine at position 490 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 R490L protein having a leucine at position 490 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 R490W protein having a tryptophan at position 490 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may have at least one amino acid sequence among the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 261, 262, 264 and 265.
  • the dCas12f1 protein may be one in which aspartic acid (D), which is the 510th amino acid in the amino acid sequence constituting the wild-type Cas12f1 protein, is substituted with alanine (A), leucine (L) or valine (V).
  • D aspartic acid
  • A alanine
  • L leucine
  • V valine
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 D510A protein having an alanine at position 510 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 D510L protein having a leucine at position 510 when compared with the amino acid sequence of a wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 D510V protein having a valine at position 510 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may have at least one amino acid sequence among the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 266 to 268.
  • the transcriptional activation protein may be VP64.
  • the transcriptional activation protein may have the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 272.
  • the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein may further comprise one or more NLSs as additional domains.
  • the one or more NLSs may be located at the N-terminus and/or C-terminus of the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein.
  • the one or more NLSs may be located between the dCas12f1 protein and the transcriptional activation protein.
  • the one or more NLSs may be located between the transcriptionally active proteins.
  • the one or more NLSs may be linked to the dCas12f1 protein and/or the transcriptional activation protein by a linker.
  • the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein may have the following structure in the direction from the N-terminus to the C-terminus: [dCas12f1 R490A protein]-[VP64]-[VP64]; [dCas12f1 R490Q protein]-[VP64]-[VP64]; [dCas12f1 R490L protein]-[VP64]-[VP64]; [dCas12f1 R490W protein]-[VP64]-[VP64]; [VP64]-[VP64]-[dCas12f1 R490A protein]; [VP64]-[VP64]-[dCas12f1 R490Q protein]; [VP64]-[VP64]-[dCas12f1 R490L protein]; or [VP64]-[VP64]-[dCas12f1 R490W protein].
  • the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein may further comprise one or more NLSs. wherein the at least one NLS is between the N terminus of the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein, the C terminus of the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein, between the dCas12f1 protein (dCas12f1 R490A protein, dCas12f1 R490Q protein, dCas12f1 R490L protein or dCas12f1 R490W protein) and VP64; / or between VP64 and VP64.
  • the at least one NLS is between the N terminus of the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein, the C terminus of the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein, between the dCas12f1 protein (dCas12f1 R490A protein, dCas12f1 R490Q protein, dCas12f1 R490L protein or dC
  • the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein may have the following structure in the N-terminal to C-terminal direction: [dCas12f1 D510A protein]-[VP64]-[VP64]; [dCas12f1 D510L protein]-[VP64]-[VP64]; [dCas12f1 D510V protein]-[VP64]-[VP64]; [VP64]-[VP64]-[dCas12f1 D510A protein]; [VP64]-[VP64]-[dCas12f1 D510L protein]; or [VP64]-[VP64]-[dCas12f1 D510V protein].
  • the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein may further comprise one or more NLSs. wherein the at least one NLS is between the N-terminus of the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein, the C-terminus of the transcriptionally active Cas12f1 fusion protein, between dCas12f1 protein (dCas12f1 D510A protein, dCas12f1 D510L protein or dCas12f1 D510V protein) and VP64 and/or VP64 It can be located between VP64.
  • the Cas12f1 fusion protein provided herein may be a transcriptional inhibition Cas12f1 fusion protein.
  • the transcription-inhibiting Cas12f1 fusion protein may include a dCas12f1 protein and at least one transcription-inhibiting protein.
  • the transcription inhibitory protein may be located at the N-terminus or C-terminus of the dCas12f1 protein.
  • the transcriptional inhibition Cas12f1 fusion protein may further include at least one NLS as an additional domain.
  • the NLS may be located at the N-terminus and/or C-terminus of the transcription inhibitory Cas12f1 fusion protein.
  • the NLS may be located between the dCas12f1 protein and the transcription inhibitory protein.
  • the dCas12f1 protein, the transcription inhibitory protein, and the NLS included in the transcription-inhibiting Cas12f1 fusion protein may be connected by a linker.
  • the transcription-inhibiting Cas12f1 fusion protein may include a dCas12f1 protein and two or more transcription-inhibiting proteins.
  • the two or more transcription inhibitory proteins may be located at the N-terminus and/or C-terminus of the dCas12f1 protein.
  • the transcriptional inhibition Cas12f1 fusion protein may further include at least one NLS as an additional domain.
  • the NLS may be located at the N-terminus and/or C-terminus of the transcription inhibitory Cas12f1 fusion protein.
  • the NLS may be located between the dCas12f1 protein and the transcription inhibitory protein.
  • the dCas12f1 protein, the transcription inhibitory protein, and the NLS included in the transcription-inhibiting Cas12f1 fusion protein may be connected by a linker.
  • the transcription-inhibiting Cas12f1 fusion protein is one in which a dCas12f1 protein and a transcription-inhibiting protein are sequentially linked in an N-terminal to C-terminal direction;
  • the transcription inhibitory protein and the dCas12f1 protein may be sequentially linked.
  • the dCas12f1 protein and the transcription inhibitory protein may be connected by a linker.
  • the dCas12f1 protein may be one in which arginine (R), which is the 490th amino acid in the amino acid sequence constituting the wild-type Cas12f1 protein, is substituted with alanine (A), glutamine (Q), leucine (L) or tryptophan (W).
  • R arginine
  • A alanine
  • Q glutamine
  • L leucine
  • W tryptophan
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 R490A protein having an alanine at position 490 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 R490Q protein having glutamine at position 490 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 R490L protein having a leucine at position 490 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 R490W protein having a tryptophan at position 490 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may have at least one amino acid sequence among the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 261, 262, 264 and 265.
  • the dCas12f1 protein may be one in which aspartic acid (D), which is the 510th amino acid in the amino acid sequence constituting the wild-type Cas12f1 protein, is substituted with alanine (A), leucine (L) or valine (V).
  • D aspartic acid
  • A alanine
  • L leucine
  • V valine
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 D510A protein having an alanine at position 510 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 D510L protein having a leucine at position 510 when compared with the amino acid sequence of a wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 D510V protein having a valine at position 510 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may have at least one amino acid sequence among the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 266 to 268.
  • the transcriptional inhibitory protein may be KRAB, MeCP2, DNMT3 or HDAC3.
  • the transcription inhibitory protein may have at least one amino acid sequence among the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 274 to 277.
  • the transcriptional inhibition Cas12f1 fusion protein may further include one or more NLS as an additional domain.
  • the one or more NLSs may be located at the N-terminus and/or C-terminus of the transcription-inhibiting Cas12f1 fusion protein.
  • the one or more NLSs may be located between the dCas12f1 protein and the transcription inhibitory protein.
  • the one or more NLSs may be linked to the dCas12f1 protein and/or the transcription inhibitory protein by a linker.
  • the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein may have the following structure in the direction from the N-terminus to the C-terminus: [dCas12f1 R490A protein]-[KRAB]; [dCas12f1 R490Q protein]-[KRAB]; [dCas12f1 R490L protein]-[KRAB]; [dCas12f1 R490W protein]-[KRAB]; [KRAB]-[dCas12f1 R490A protein]; [KRAB]-[dCas12f1 R490Q protein]; [KRAB]-[dCas12f1 R490L protein]; or [KRAB]-[dCas12f1 R490W protein].
  • the transcriptional inhibition Cas12f1 fusion protein may further comprise one or more NLSs.
  • the at least one NLS comprises the N-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, the C-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein and/or a dCas12f1 protein (dCas12f1 R490A protein, dCas12f1 R490Q protein, dCas12f1 R490L protein or dCas12f1 R490W protein) and KRAB can be located between
  • the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein may have the following structure in the direction from the N-terminus to the C-terminus: [dCas12f1 D510A protein]-[KRAB]; [dCas12f1 D510L protein]-[KRAB]; [dCas12f1 D510V protein]-[KRAB]; [KRAB]-[dCas12f1 D510A protein]; [KRAB]-[dCas12f1 D510L protein]; or [KRAB]-[dCas12f1 D510V protein].
  • the transcriptional inhibition Cas12f1 fusion protein may further comprise one or more NLSs.
  • the at least one NLS may be located between the N-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, the C-terminus of the transcription-inhibiting Cas12f1 fusion protein and/or the dCas12f1 protein (dCas12f1 D510A protein, dCas12f1 D510L protein or dCas12f1 D510V protein) and KRAB.
  • the dCas12f1 protein dCas12f1 D510A protein, dCas12f1 D510L protein or dCas12f1 D510V protein
  • the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein may have the following structure in the direction from the N-terminus to the C-terminus: [dCas12f1 R490A protein]-[DNMT3]; [dCas12f1 R490Q protein]-[DNMT3]; [dCas12f1 R490L protein]-[DNMT3]; [dCas12f1 R490W protein]-[DNMT3]; [DNMT3]-[dCas12f1 R490A protein]; [DNMT3]-[dCas12f1 R490Q protein]; [DNMT3]-[dCas12f1 R490L protein]; or [DNMT3]-[dCas12f1 R490W protein].
  • the transcriptional inhibition Cas12f1 fusion protein may further comprise one or more NLSs.
  • the at least one NLS is the N-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, the C-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein and/or dCas12f1 protein (dCas12f1 R490A protein, dCas12f1 R490Q protein, dCas12f1 R490L protein or dCas12f1 R490W protein) and DNMT3 can be located between
  • the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein may have the following structure in the direction from the N-terminus to the C-terminus: [dCas12f1 D510A protein]-[DNMT3]; [dCas12f1 D510L protein]-[DNMT3]; [dCas12f1 D510V protein]-[DNMT3]; [DNMT3]-[dCas12f1 D510A protein]; [DNMT3]-[dCas12f1 D510L protein]; or [DNMT3]-[dCas12f1 D510V protein].
  • the transcriptional inhibition Cas12f1 fusion protein may further comprise one or more NLSs.
  • the at least one NLS may be located between the N-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, the C-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, and/or dCas12f1 protein (dCas12f1 D510A protein, dCas12f1 D510L protein or dCas12f1 D510V protein) and DNMT3.
  • dCas12f1 protein dCas12f1 D510A protein, dCas12f1 D510L protein or dCas12f1 D510V protein
  • the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein may have the following structure in the direction from the N-terminus to the C-terminus: [dCas12f1 R490A protein]-[MeCP2]; [dCas12f1 R490Q protein]-[MeCP2]; [dCas12f1 R490L protein]-[MeCP2]; [dCas12f1 R490W protein]-[MeCP2]; [MeCP2]-[dCas12f1 R490A protein]; [MeCP2]-[dCas12f1 R490Q protein]; [MeCP2]-[dCas12f1 R490L protein]; or [MeCP2]-[dCas12f1 R490W protein].
  • the transcriptional inhibition Cas12f1 fusion protein may further comprise one or more NLSs.
  • the at least one NLS comprises the N-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, the C-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein and/or the dCas12f1 protein (dCas12f1 R490A protein, dCas12f1 R490Q protein, dCas12f1 R490L protein or dCas12f1 R490W protein) and MeCP2 can be located between
  • the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein may have the following structure in the N-terminal to C-terminal direction: [dCas12f1 D510A protein]-[MeCP2]; [dCas12f1 D510L protein]-[MeCP2]; [dCas12f1 D510V protein]-[MeCP2]; [MeCP2]-[dCas12f1 D510A protein]; [MeCP2]-[dCas12f1 D510L protein]; or [MeCP2]-[dCas12f1 D510V protein].
  • the transcriptional inhibition Cas12f1 fusion protein may further comprise one or more NLSs.
  • the at least one NLS may be located between the N-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, the C-terminus of the transcription-inhibiting Cas12f1 fusion protein, and/or the dCas12f1 protein (dCas12f1 D510A protein, dCas12f1 D510L protein or dCas12f1 D510V protein) and MeCP2.
  • the dCas12f1 protein dCas12f1 D510A protein, dCas12f1 D510L protein or dCas12f1 D510V protein
  • the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein may have the following structure in the N-terminal to C-terminal direction: [dCas12f1 R490A protein]-[HDAC3]; [dCas12f1 R490Q protein]-[HDAC3]; [dCas12f1 R490L protein]-[HDAC3]; [dCas12f1 R490W protein]-[HDAC3]; [HDAC3]-[dCas12f1 R490A protein]; [HDAC3]-[dCas12f1 R490Q protein]; [HDAC3]-[dCas12f1 R490L protein]; or [HDAC3]-[dCas12f1 R490W protein].
  • the transcriptional inhibition Cas12f1 fusion protein may further comprise one or more NLSs.
  • the at least one NLS is the N-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, the C-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, and/or a dCas12f1 protein (dCas12f1 R490A protein, dCas12f1 R490Q protein, dCas12f1 R490L protein or dCas12f1 R490W protein) and HDAC3 can be located between
  • the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein may have the following structure in the direction from the N-terminus to the C-terminus: [dCas12f1 D510A protein]-[HDAC3]; [dCas12f1 D510L protein]-[HDAC3]; [dCas12f1 D510V protein]-[HDAC3]; [HDAC3]-[dCas12f1 D510A protein]; [HDAC3]-[dCas12f1 D510L protein]; or [HDAC3]-[dCas12f1 D510V protein].
  • the transcriptional inhibition Cas12f1 fusion protein may further comprise one or more NLSs.
  • the at least one NLS may be located between the N-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, the C-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein and/or dCas12f1 protein (dCas12f1 D510A protein, dCas12f1 D510L protein or dCas12f1 D510V protein) and HDAC3.
  • dCas12f1 D510A protein, dCas12f1 D510L protein or dCas12f1 D510V protein HDAC3.
  • the transcription-inhibiting Cas12f1 fusion protein is one in which a dCas12f1 protein, a transcription-inhibiting protein and a transcription-inhibiting protein are sequentially linked in an N-terminal to C-terminal direction;
  • the transcriptional inhibitory protein, the transcriptional inhibitory protein, and the dCas12f1 protein may be sequentially linked.
  • the dCas12f1 protein and the transcription inhibitory protein may be connected by a linker.
  • the dCas12f1 protein may be one in which arginine (R), which is the 490th amino acid in the amino acid sequence constituting the wild-type Cas12f1 protein, is substituted with alanine (A), glutamine (Q), leucine (L) or tryptophan (W).
  • R arginine
  • A alanine
  • Q glutamine
  • L leucine
  • W tryptophan
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 R490A protein having an alanine at position 490 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 R490Q protein having glutamine at position 490 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 R490L protein having a leucine at position 490 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 R490W protein having a tryptophan at position 490 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may have at least one amino acid sequence among the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 261, 262, 264 and 265.
  • the dCas12f1 protein may be one in which aspartic acid (D), which is the 510th amino acid in the amino acid sequence constituting the wild-type Cas12f1 protein, is substituted with alanine (A), leucine (L) or valine (V).
  • D aspartic acid
  • A alanine
  • L leucine
  • V valine
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 D510A protein having an alanine at position 510 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 D510L protein having a leucine at position 510 when compared with the amino acid sequence of a wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 D510V protein having a valine at position 510 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may have at least one amino acid sequence among the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 266 to 268.
  • the transcriptional inhibitory protein may be KRAB, MeCP2, DNMT3 or HDAC3.
  • the transcription inhibitory protein may have at least one amino acid sequence among the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 274 to 277.
  • the transcriptional inhibition Cas12f1 fusion protein may further include one or more NLS as an additional domain.
  • the one or more NLSs may be located at the N-terminus and/or C-terminus of the transcription-inhibiting Cas12f1 fusion protein.
  • the one or more NLSs may be located between the dCas12f1 protein and the transcription inhibitory protein.
  • the one or more NLSs may be located between the transcription inhibitory proteins.
  • the one or more NLSs may be linked to the dCas12f1 protein and/or the transcription inhibitory protein by a linker.
  • the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein may have the following structure in the N-terminal to C-terminal direction: [dCas12f1 R490A protein]-[KRAB]-[KRAB]; [dCas12f1 R490Q protein]-[KRAB]-[KRAB]; [dCas12f1 R490L protein]-[KRAB]-[KRAB]; [dCas12f1 R490W protein]-[KRAB]-[KRAB]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 R490A protein]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 R490Q protein]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 R490L protein]; or [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 R490W protein].
  • the transcriptional inhibition Cas12f1 fusion protein may further comprise one or more NLSs.
  • the at least one NLS is the N-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, the C-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, between the dCas12f1 protein (dCas12f1 R490A protein, dCas12f1 R490Q protein, dCas12f1 R490L protein or dCas12f1 R490W protein) and KRAB; / or located between KRAB and KRAB.
  • the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein may have the following structure in the direction from the N-terminus to the C-terminus: [dCas12f1 D510A protein]-[KRAB]-[KRAB]; [dCas12f1 D510L protein]-[KRAB]-[KRAB]; [dCas12f1 D510V protein]-[KRAB]-[KRAB]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 D510A protein]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 D510L protein]; or [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 D510V protein].
  • the transcriptional inhibition Cas12f1 fusion protein may further comprise one or more NLSs.
  • the at least one NLS is the N-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, the C-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, between the dCas12f1 protein (dCas12f1 D510A protein, dCas12f1 D510L protein or dCas12f1 D510V protein) and KRAB and/or KRAB and/or KRAB It may be located between the KRABs.
  • the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein may have the following structure in the direction from the N-terminus to the C-terminus: [dCas12f1 R490A protein]-[KRAB]-[MeCP2]; [dCas12f1 R490Q protein]-[KRAB]-[MeCP2]; [dCas12f1 R490L protein]-[KRAB]-[MeCP2]; [dCas12f1 R490W protein]-[KRAB]-[MeCP2]; [dCas12f1 R490A protein]-[MeCP2]-[KRAB]; [dCas12f1 R490Q protein]-[MeCP2]-[KRAB]; [dCas12f1 R490L protein]-[MeCP2]-[KRAB]; [dCas12f1 R490W protein]-[MeCP2]-[
  • the transcriptional inhibition Cas12f1 fusion protein may further comprise one or more NLSs.
  • the at least one NLS is between the N-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, the C-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, between the dCas12f1 protein (dCas12f1 R490A protein, dCas12f1 R490Q protein, dCas12f1 R490L protein or dCas12f1 R490W protein) and KRAB; between dCas12f1 protein (dCas12f1 R490A protein, dCas12f1 R490Q protein, dCas12f1 R490L protein or dCas12f1 R490W protein) and MeCP2 and/or between KRAB and MeCP2.
  • the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein may have the following structure in the direction from the N-terminus to the C-terminus: [dCas12f1 D510A protein]-[KRAB]-[MeCP2]; [dCas12f1 D510L protein]-[KRAB]-[MeCP2]; [dCas12f1 D510V protein]-[KRAB]-[MeCP2]; [dCas12f1 D510A protein]-[MeCP2]-[KRAB]; [dCas12f1 D510L protein]-[MeCP2]-[KRAB]; [dCas12f1 D510V protein]-[MeCP2]-[KRAB]; [KRAB]-[MeCP2]-[dCas12f1 D510V protein]-[MeCP2]-[KRAB]; [KRAB]-[MeCP2]-[dCa
  • the transcriptional inhibition Cas12f1 fusion protein may further comprise one or more NLSs.
  • the at least one NLS is the N-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, the C-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, between the dCas12f1 protein (dCas12f1 D510A protein, dCas12f1 D510L protein or dCas12f1 D510V protein) and MeCP2 and/or KRAB and It may be located between MeCP2.
  • the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein may have the following structure in the direction from the N-terminus to the C-terminus: [dCas12f1 R490A protein]-[KRAB]-[DNMT3]; [dCas12f1 R490Q protein]-[KRAB]-[DNMT3]; [dCas12f1 R490L protein]-[KRAB]-[DNMT3]; [dCas12f1 R490W protein]-[KRAB]-[DNMT3]; [dCas12f1 R490A protein]-[DNMT3]-[KRAB]; [dCas12f1 R490Q protein]-[DNMT3]-[KRAB]; [dCas12f1 R490L protein]-[DNMT3]-[KRAB]; [dCas12f1 R490W protein]-[DNMT3]-[KRAB]; [dC
  • the transcriptional inhibition Cas12f1 fusion protein may further comprise one or more NLSs.
  • the at least one NLS is between the N-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, the C-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, between the dCas12f1 protein (dCas12f1 R490A protein, dCas12f1 R490Q protein, dCas12f1 R490L protein or dCas12f1 R490W protein) and KRAB; It may be located between dCas12f1 protein (dCas12f1 R490A protein, dCas12f1 R490Q protein, dCas12f1 R490L protein or dCas12f1 R490W protein) and DNMT3 and/or between KRAB and DNMT3.
  • the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein may have the following structure in the N-terminal to C-terminal direction: [dCas12f1 D510A protein]-[KRAB]-[DNMT3]; [dCas12f1 D510L protein]-[KRAB]-[DNMT3]; [dCas12f1 D510V protein]-[KRAB]-[DNMT3]; [dCas12f1 D510A protein]-[DNMT3]-[KRAB]; [dCas12f1 D510L protein]-[DNMT3]-[KRAB]; [dCas12f1 D510V protein]-[DNMT3]-[KRAB]; [KRAB]-[DNMT3]-[dCas12f1 D510A protein]; [KRAB]-[DNMT3]-[dCas12f1 D510A protein]; [KRAB]-[DNMT3]-[d
  • the transcriptional inhibition Cas12f1 fusion protein may further comprise one or more NLSs.
  • the at least one NLS is between the N-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, the C-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, between dCas12f1 protein (dCas12f1 D510A protein, dCas12f1 D510L protein or dCas12f1 D510V protein) and DNMT3 and/or KRAB It may be located between DNMT3.
  • the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein may have the following structure in the direction from the N-terminus to the C-terminus: [dCas12f1 R490A protein]-[KRAB]-[HDAC3]; [dCas12f1 R490Q protein]-[KRAB]-[HDAC3]; [dCas12f1 R490L protein]-[KRAB]-[HDAC3]; [dCas12f1 R490W protein]-[KRAB]-[HDAC3]; [dCas12f1 R490A protein]-[HDAC3]-[KRAB]; [dCas12f1 R490Q protein]-[HDAC3]-[KRAB]; [dCas12f1 R490L protein]-[HDAC3]-[KRAB]; [dCas12f1 R490W protein]-[HDAC3]-[KRAB]; [dC
  • the transcriptional inhibition Cas12f1 fusion protein may further comprise one or more NLSs.
  • the at least one NLS is between the N-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, the C-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, between the dCas12f1 protein (dCas12f1 R490A protein, dCas12f1 R490Q protein, dCas12f1 R490L protein or dCas12f1 R490W protein) and KRAB; between dCas12f1 protein (dCas12f1 R490A protein, dCas12f1 R490Q protein, dCas12f1 R490L protein or dCas12f1 R490W protein) and HDAC3 and/or between KRAB and HDAC3.
  • the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein may have the following structure in the direction from the N-terminus to the C-terminus: [dCas12f1 D510A protein]-[KRAB]-[HDAC3]; [dCas12f1 D510L protein]-[KRAB]-[HDAC3]; [dCas12f1 D510V protein]-[KRAB]-[HDAC3]; [dCas12f1 D510A protein]-[HDAC3]-[KRAB]; [dCas12f1 D510L protein]-[HDAC3]-[KRAB]; [dCas12f1 D510V protein]-[HDAC3]-[KRAB]; [KRAB]-[HDAC3]-[dCas12f1 D510A protein]; [KRAB]-[HDAC3]-[dCas12f1 D510A protein]; [KRAB]-[HDAC3]
  • the transcriptional inhibition Cas12f1 fusion protein may further comprise one or more NLSs.
  • the at least one NLS is the N-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, the C-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, between dCas12f1 protein (dCas12f1 D510A protein, dCas12f1 D510L protein or dCas12f1 D510V protein) and HDAC3 and/or KRAB and It can be located between HDAC3.
  • the transcription-inhibiting Cas12f1 fusion protein may be one in which the transcription-inhibiting protein, the dCas12f1 protein, and the transcription-inhibiting protein are sequentially linked from the N-terminus to the C-terminus.
  • the dCas12f1 protein and the transcription inhibitory protein may be connected by a linker.
  • the transcriptional inhibitory protein may be KRAB, MeCP2, DNMT3 or HDAC3.
  • the transcription inhibitory protein may have at least one amino acid sequence among the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 274 to 277.
  • the dCas12f1 protein may be one in which arginine (R), which is the 490th amino acid in the amino acid sequence constituting the wild-type Cas12f1 protein, is substituted with alanine (A), glutamine (Q), leucine (L) or tryptophan (W).
  • R arginine
  • A alanine
  • Q glutamine
  • L leucine
  • W tryptophan
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 R490A protein having an alanine at position 490 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 R490Q protein having glutamine at position 490 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 R490L protein having a leucine at position 490 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 R490W protein having a tryptophan at position 490 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may have at least one amino acid sequence among the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 261, 262, 264 and 265.
  • the dCas12f1 protein may be one in which aspartic acid (D), which is the 510th amino acid in the amino acid sequence constituting the wild-type Cas12f1 protein, is substituted with alanine (A), leucine (L) or valine (V).
  • D aspartic acid
  • A alanine
  • L leucine
  • V valine
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 D510A protein having an alanine at position 510 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 D510L protein having a leucine at position 510 when compared with the amino acid sequence of a wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 D510V protein having a valine at position 510 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may have at least one amino acid sequence among the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 266 to 268.
  • the transcriptional inhibition Cas12f1 fusion protein may further include one or more NLS as an additional domain.
  • the one or more NLSs may be located at the N-terminus and/or C-terminus of the transcription-inhibiting Cas12f1 fusion protein.
  • the one or more NLSs may be located between the dCas12f1 protein and the transcription inhibitory protein.
  • the one or more NLSs may be located between the transcription inhibitory proteins.
  • the one or more NLSs may be linked to the dCas12f1 protein and/or the transcription inhibitory protein by a linker.
  • the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein may have the following structure in the direction from the N-terminus to the C-terminus: [KRAB]-[dCas12f1 R490A protein]-[KRAB]; [KRAB]-[dCas12f1 R490Q protein]-[KRAB]; [KRAB]-[dCas12f1 R490L protein]-[KRAB]; [KRAB]-[dCas12f1 R490W protein]-[KRAB]; [KRAB]-[dCas12f1 R490A protein]-[KRAB]; [KRAB]-[dCas12f1 R490Q protein]-[KRAB]; [KRAB]-[dCas12f1 R490L protein]-[KRAB]; or [KRAB]-[dCas12f1 R490W protein]-[KRAB].
  • the transcriptional inhibition Cas12f1 fusion protein may further comprise one or more NLSs.
  • the at least one NLS comprises the N-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, the C-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein and/or a dCas12f1 protein (dCas12f1 R490A protein, dCas12f1 R490Q protein, dCas12f1 R490L protein or dCas12f1 R490W protein) and KRAB can be located between
  • the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein may have the following structure in the N-terminal to C-terminal direction: [KRAB]-[dCas12f1 D510A protein]-[KRAB]; [KRAB]-[dCas12f1 D510L protein]-[KRAB]; [KRAB]-[dCas12f1 D510V protein]-[KRAB]; [KRAB]-[dCas12f1 D510A protein]-[KRAB]; [KRAB]-[dCas12f1 D510L protein]-[KRAB]; or [KRAB]-[dCas12f1 D510V protein]-[KRAB].
  • the transcriptional inhibition Cas12f1 fusion protein may further comprise one or more NLSs.
  • the at least one NLS may be located between the N-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, the C-terminus of the transcription-inhibiting Cas12f1 fusion protein and/or the dCas12f1 protein (dCas12f1 D510A protein, dCas12f1 D510L protein or dCas12f1 D510V protein) and KRAB.
  • the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein may have the following structure in the N-terminal to C-terminal direction: [KRAB]-[dCas12f1 R490A protein]-[MeCP2]; [KRAB]-[dCas12f1 R490Q protein]-[MeCP2]; [KRAB]-[dCas12f1 R490L protein]-[MeCP2]; [KRAB]-[dCas12f1 R490W protein]-[MeCP2]; [MeCP2]-[dCas12f1 R490A protein]-[KRAB]; [MeCP2]-[dCas12f1 R490Q protein]-[KRAB]; [MeCP2]-[dCas12f1 R490L protein]-[KRAB]; or [MeCP2]-[dCas12f1 R490W protein]-[[K
  • the transcriptional inhibition Cas12f1 fusion protein may further comprise one or more NLSs.
  • the at least one NLS is the N-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, the C-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, between the dCas12f1 protein (dCas12f1 R490A protein, dCas12f1 R490Q protein, dCas12f1 R490L protein or dCas12f1 R490W protein) and KRAB; / or between the dCas12f1 protein (dCas12f1 R490A protein, dCas12f1 R490Q protein, dCas12f1 R490L protein or dCas12f1 R490W protein) and MeCP2.
  • the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein may have the following structure in the direction from the N-terminus to the C-terminus: [KRAB]-[dCas12f1 D510A protein]-[MeCP2]; [KRAB]-[dCas12f1 D510L protein]-[MeCP2]; [KRAB]-[dCas12f1 D510V protein]-[MeCP2]; [MeCP2]-[dCas12f1 D510A protein]-[KRAB]; [MeCP2]-[dCas12f1 D510L protein]-[KRAB]; or [MeCP2]-[dCas12f1 D510V protein]-[KRAB].
  • the transcriptional inhibition Cas12f1 fusion protein may further comprise one or more NLSs.
  • the at least one NLS is the N-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, the C-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, between the dCas12f1 protein (dCas12f1 D510A protein, dCas12f1 D510L protein or dCas12f1 D510V protein) and KRAB and/or dCas12f1 protein (dCas12f1 D510A protein, dCas12f1 D510L protein, or dCas12f1 D510V protein) and MeCP2.
  • the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein may have the following structure in the direction from the N-terminus to the C-terminus: [KRAB]-[dCas12f1 R490A protein]-[DNMT3]; [KRAB]-[dCas12f1 R490Q protein]-[DNMT3]; [KRAB]-[dCas12f1 R490L protein]-[DNMT3]; [KRAB]-[dCas12f1 R490W protein]-[DNMT3]; [DNMT3]-[dCas12f1 R490A protein]-[KRAB]; [DNMT3]-[dCas12f1 R490Q protein]-[KRAB]; [DNMT3]-[dCas12f1 R490L protein]-[KRAB]; or [DNMT3]-[dCas12f1 R490W protein]-[KRAB].
  • the transcriptional inhibition Cas12f1 fusion protein may further comprise one or more NLSs.
  • the at least one NLS is the N-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, the C-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, between the dCas12f1 protein (dCas12f1 R490A protein, dCas12f1 R490Q protein, dCas12f1 R490L protein or dCas12f1 R490W protein) and KRAB; / or between dCas12f1 protein (dCas12f1 R490A protein, dCas12f1 R490Q protein, dCas12f1 R490L protein or dCas12f1 R490W protein) and DNMT3.
  • the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein may have the following structure in the direction from the N-terminus to the C-terminus: [KRAB]-[dCas12f1 D510A protein]-[DNMT3]; [KRAB]-[dCas12f1 D510L protein]-[DNMT3]; [KRAB]-[dCas12f1 D510V protein]-[DNMT3]; [DNMT3]-[dCas12f1 D510A protein]-[KRAB]; [DNMT3]-[dCas12f1 D510L protein]-[KRAB]; or [DNMT3]-[dCas12f1 D510V protein]-[KRAB].
  • the transcriptional inhibition Cas12f1 fusion protein may further comprise one or more NLSs.
  • the at least one NLS is the N-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, the C-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, between the dCas12f1 protein (dCas12f1 D510A protein, dCas12f1 D510L protein or dCas12f1 D510V protein) and KRAB and/or dCas12f1 protein (dCas12f1 D510A protein, dCas12f1 D510L protein, or dCas12f1 D510V protein) and DNMT3.
  • the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein may have the following structure in the direction from the N-terminus to the C-terminus: [KRAB]-[dCas12f1 R490A protein]-[HDAC3]; [KRAB]-[dCas12f1 R490Q protein]-[HDAC3]; [KRAB]-[dCas12f1 R490L protein]-[HDAC3]; [KRAB]-[dCas12f1 R490W protein]-[HDAC3]; [HDAC3]-[dCas12f1 R490A protein]-[KRAB]; [HDAC3]-[dCas12f1 R490Q protein]-[KRAB]; [HDAC3]-[dCas12f1 R490L protein]-[KRAB]; or [HDAC3]-[dCas12f1 R490W protein]-[KRAB].
  • the transcriptional inhibition Cas12f1 fusion protein may further comprise one or more NLSs.
  • the at least one NLS is the N-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, the C-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, between the dCas12f1 protein (dCas12f1 R490A protein, dCas12f1 R490Q protein, dCas12f1 R490L protein or dCas12f1 R490W protein) and KRAB; / or between dCas12f1 protein (dCas12f1 R490A protein, dCas12f1 R490Q protein, dCas12f1 R490L protein or dCas12f1 R490W protein) and HDAC3.
  • the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein may have the following structure in the N-terminal to C-terminal direction: [KRAB]-[dCas12f1 D510A protein]-[HDAC3]; [KRAB]-[dCas12f1 D510L protein]-[HDAC3]; [KRAB]-[dCas12f1 D510V protein]-[HDAC3]; [HDAC3]-[dCas12f1 D510A protein]-[KRAB]; [HDAC3]-[dCas12f1 D510L protein]-[KRAB]; or [HDAC3]-[dCas12f1 D510V protein]-[KRAB].
  • the transcriptional inhibition Cas12f1 fusion protein may further comprise one or more NLSs.
  • the at least one NLS is the N-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, the C-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, between the dCas12f1 protein (dCas12f1 D510A protein, dCas12f1 D510L protein or dCas12f1 D510V protein) and KRAB and/or dCas12f1 protein (dCas12f1 D510A protein, dCas12f1 D510L protein, or dCas12f1 D510V protein) and HDAC3.
  • the transcription-inhibiting Cas12f1 fusion protein may include a dCas12f1 protein and three or more transcriptionally active proteins.
  • the transcription-inhibiting Cas12f1 fusion protein is one in which a dCas12f1 protein, a transcription-inhibiting protein, a transcription-inhibiting protein and a transcription-inhibiting protein are sequentially linked in an N-terminal to C-terminal direction; a transcription inhibition protein, a transcription inhibition protein, a transcription inhibition protein, and a dCas12f1 protein linked in order; a transcription inhibitory protein, a transcription inhibition protein, a dCas12f1 protein, and a transcription inhibition protein linked in order;
  • the transcription inhibition protein, the dCas12f1 protein, the transcription inhibition protein, and the transcription inhibition protein may be sequentially linked.
  • the dCas12f1 protein and the transcription inhibitory protein may be connected by a linker.
  • the transcriptional inhibitory protein may be KRAB, MeCP2, DNMT3 or HDAC3.
  • the transcription inhibitory protein may have at least one amino acid sequence among the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 274 to 277.
  • the dCas12f1 protein may be one in which arginine (R), which is the 490th amino acid in the amino acid sequence constituting the wild-type Cas12f1 protein, is substituted with alanine (A), glutamine (Q), leucine (L) or tryptophan (W).
  • R arginine
  • A alanine
  • Q glutamine
  • L leucine
  • W tryptophan
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 R490A protein having an alanine at position 490 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 R490Q protein having glutamine at position 490 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 R490L protein having a leucine at position 490 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 R490W protein having a tryptophan at position 490 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may have at least one amino acid sequence among the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 261, 262, 264 and 265.
  • the dCas12f1 protein may be one in which aspartic acid (D), which is the 510th amino acid in the amino acid sequence constituting the wild-type Cas12f1 protein, is substituted with alanine (A), leucine (L) or valine (V).
  • D aspartic acid
  • A alanine
  • L leucine
  • V valine
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 D510A protein having an alanine at position 510 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 D510L protein having a leucine at position 510 when compared with the amino acid sequence of a wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may be a dCas12f1 D510V protein having a valine at position 510 when compared with the amino acid sequence of the wild-type Cas12f1 protein.
  • the dCas12f1 protein may have at least one amino acid sequence among the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 266 to 268.
  • the transcriptional inhibition Cas12f1 fusion protein may further include one or more NLS as an additional domain.
  • the one or more NLSs may be located at the N-terminus and/or C-terminus of the transcription-inhibiting Cas12f1 fusion protein.
  • the one or more NLSs may be located between the dCas12f1 protein and the transcription inhibitory protein.
  • the one or more NLSs may be located between the transcription inhibitory proteins.
  • the one or more NLSs may be linked to the dCas12f1 protein and/or the transcription inhibitory protein by a linker.
  • the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein may have the following structure in the N-terminal to C-terminal direction: [dCas12f1 R490A protein]-[KRAB]-[KRAB]-[MeCP2]; [dCas12f1 R490Q protein]-[KRAB]-[KRAB]-[MeCP2]; [dCas12f1 R490L protein]-[KRAB]-[KRAB]-[MeCP2]; [dCas12f1 R490W protein]-[KRAB]-[KRAB]-[MeCP2]; [dCas12f1 R490A protein]-[KRAB]-[KRAB]-[DNMT3]; [dCas12f1 R490Q protein]-[KRAB]-[KRAB]-[DNMT3]; [dCas12f1 R490L protein]-[KRA
  • the transcriptional inhibition Cas12f1 fusion protein may further comprise one or more NLSs.
  • the at least one NLS is between the N-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, the C-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, between the dCas12f1 protein (dCas12f1 R490A protein, dCas12f1 R490Q protein, dCas12f1 R490L protein or dCas12f1 R490W protein) and KRAB; It may be located between KRAB and KRAB, between KRAB and MeCP2, between KRAB and DNMT3 and/or between KRAB and HDAC3.
  • the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein may have the following structure in the direction from the N-terminus to the C-terminus: [dCas12f1 D510A protein]-[KRAB]-[KRAB]-[MeCP2]; [dCas12f1 D510L protein]-[KRAB]-[KRAB]-[MeCP2]; [dCas12f1 D510V protein]-[KRAB]-[KRAB]-[MeCP2]; [dCas12f1 D510A protein]-[KRAB]-[KRAB]-[DNMT3]; [dCas12f1 D510L protein]-[KRAB]-[KRAB]-[DNMT3]; [dCas12f1 D510V protein]-[KRAB]-[KRAB]-[DNMT3]; [dCas12f1 D510V protein]-[KRAB]-[KRAB
  • the transcriptional inhibition Cas12f1 fusion protein may further comprise one or more NLSs.
  • the at least one NLS is the N-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, the C-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, between dCas12f1 protein (dCas12f1 D510A protein, dCas12f1 D510L protein, or dCas12f1 D510V protein) and KRAB, between KRAB and KRAB , between KRAB and MeCP2, between KRAB and DNMT3 and/or between KRAB and HDAC3.
  • the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein may have the following structure in the N-terminal to C-terminal direction: [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 R490A protein]-[MeCP2]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 R490Q protein]-[MeCP2]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 R490L protein]-[MeCP2]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 R490W protein]-[MeCP2]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 R490A protein]-[DNMT3]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 R490Q protein]-[DNMT3]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1
  • the transcriptional inhibition Cas12f1 fusion protein may further comprise one or more NLSs.
  • the at least one NLS is between the N-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, the C-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, between the dCas12f1 protein (dCas12f1 R490A protein, dCas12f1 R490Q protein, dCas12f1 R490L protein or dCas12f1 R490W protein) and KRAB; Between dCas12f1 protein (dCas12f1 R490A protein, dCas12f1 R490Q protein, dCas12f1 R490L protein or dCas12f1 R490W protein) and MeCP2, between dCas12f1 protein (dCas12f1 R490A protein, dCas12f1 R490A protein
  • the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein may have the following structure in the direction from the N-terminus to the C-terminus: [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 D510A protein]-[MeCP2]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 D510L protein]-[MeCP2]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 D510V protein]-[MeCP2]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 D510A protein]-[DNMT3]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 D510L protein]-[DNMT3]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 D510V protein]-[DNMT3]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 D510V protein
  • the transcriptional inhibition Cas12f1 fusion protein may further comprise one or more NLSs.
  • the at least one NLS is the N-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, the C-terminus of the transcription-inhibited Cas12f1 fusion protein, between the dCas12f1 protein (dCas12f1 D510A protein, dCas12f1 D510L protein, or dCas12f1 D510V protein) and KRAB, dCas12f1 protein (dCas12f1 protein (dCas12f1 protein (dCas12f1 protein) Between D510A protein, dCas12f1 D510L protein or dCas12f1 D510V protein) and MeCP2, between dCas12f1 protein (dCas12f1 D510A protein, dCas12f1 D510L protein, or dCas12f1 D510V protein) and
  • the CRISPR regulatory system provided herein includes a guide RNA of the CRISPR/Cas12f1 system.
  • the guide RNA may be a wild-type Cas12f1 guide RNA existing in nature or a Cas12f1 guide RNA engineered to improve the efficiency of the CRISPR/Cas12f1 system.
  • Cas12f1 guide RNA can be largely divided into a spacer and a scaffold region, and the scaffold region is composed of five stems (named Stem 1 to Stem 5) and one pseudoknot (PK).
  • the Cas12f1 guide RNA includes two structures in which a part of tracrRNA (tracrRNA anti-repeat) and a part of crRNA repeat (crRNA repeat) are complementary to form a duplex. Named as tracrRNA anti-repeat (R:AR) moiety.
  • the Stem 5 (R:AR2), and PK (R:AR1) form this crRNA repeat-tracrRNA anti-repeat duplex structure.
  • the CRISPR regulatory system may use an engineered Cas12f1 guide RNA that targets a gene to regulate expression, that is, a transcriptional regulatory region of a target gene. More specifically, the CRISPR regulatory system includes an engineered Cas12f1 guide RNA that complementarily binds to a target sequence present in the transcriptional regulatory region of the target gene.
  • the transcriptional regulatory region of the target gene includes all regions that control transcription of the target gene, such as a promoter, an enhancer, a promoter-proximal element, an operator, and a silencer.
  • the engineered Cas12f1 guide RNA included in the CRISPR regulatory system forms a complex with the Cas12f1 fusion protein, and functions to position the Cas12f1 fusion protein in the transcriptional regulatory region of the target gene.
  • Cas12f1 guide RNAs engineered for the CRISPR regulatory system.
  • the engineered Cas12f1 guide RNA has a new structure added to the guide RNA found in nature, and a part of its structure has been modified.
  • the engineered Cas12f1 guide RNA is characterized by including a U-rich tail, which is a new structure, at the 3' end of the structure.
  • the engineered Cas12f1 guide RNA is characterized in that at least a portion of the scaffold region, which interacts with the Cas12f1 protein, is modified.
  • the engineered Cas12f1 guide RNA may include an engineered scaffold region, a spacer, and a U-rich tail.
  • the engineered scaffold region is characterized in that it is different from the scaffold region of guide RNA found in nature.
  • the engineered Cas12f1 guide RNA provided herein is characterized by adding a U-rich tail to the guide RNA found in nature.
  • the U-rich tail is located at the 3'-end portion of the engineered Cas12f1 guide RNA, and is a portion richly containing uridine.
  • the engineered Cas12f1 guide RNA may include a U-rich tail rich in uridine at the 3' end portion.
  • the sequence of the U-rich tail may be expressed as (U a N) b U c .
  • N is one of A, U, C, or G, wherein a, b, and c are integers, wherein a is 1 or more and 5 or less, b is 0 or more and 2 or less, and c is 1 or more and 10 or less.
  • the engineered Cas12f1 guide RNA provided herein is characterized in that a part of its scaffold portion is modified compared to the guide RNA found in nature.
  • the scaffold region is a region containing tracrRNA and a portion of crRNA, and functions to interact with the Cas12f1 protein. The scaffold region will be described in more detail below.
  • the engineered Cas12f1 guide RNA may include an engineered scaffold region.
  • the engineered scaffold region is characterized in that the scaffold region of the guide RNA found in nature is modified. Therefore, the engineered scaffold region has a sequence different from that of the guide RNA found in nature.
  • the engineered scaffold region may be one in which some regions of the scaffold region of guide RNA found in nature have been removed.
  • the engineered scaffold region may have one or more nucleotides removed from the scaffold region of guide RNA found in nature.
  • the engineered Cas12f1 guide RNA provided herein is used in the CRISPR/Cas12f1 system, the gene editing activity in cells is dramatically improved compared to when the guide RNA found in nature is used.
  • the engineered Cas12f1 guide RNA has a length equal to or shorter than that of a guide RNA found in nature, so it has high application potential in the field of gene editing technology.
  • the use of the engineered Cas12f1 guide RNA makes it possible to fully utilize the advantages of the CRISPR/Cas12f1 system (eg, the advantage of very small size) for gene editing and gene expression regulation technology.
  • the engineered Cas12f1 guide RNA provided herein can be used for gene expression control together with Cas12f1 protein.
  • the engineered Cas12f1 guide RNA can be used for preparing a composition for regulating gene expression.
  • the present specification provides a U-rich tail that can be introduced to improve the efficiency of the CRISPR regulatory system.
  • the U-rich tail sequence is characterized in that it is linked to the 3' end of the crRNA spacer among the engineered Cas12f1 guide RNAs, and increases the editing efficiency of the CRISPR/Cas12f1 system using the engineered Cas12f1 guide RNA for the target nucleic acid. play a role
  • the U-rich tail sequence basically contains an abundance of uridine, and includes a sequence in which one or more uridine is continuous.
  • the U-rich tail sequence may further include additional bases other than uridine according to the actual use environment and expression environment (eg, eukaryotic cell or prokaryotic cell internal environment) of the engineered CRISPR/Cas12f1 system.
  • the U-rich tail sequence may be a U-rich tail sequence disclosed in the PCT/KR2020/014961 application.
  • U-rich tail sequence disclosed in the PCT/KR2020/014961 application.
  • the U-rich tail sequence includes a sequence in which one or more uridine is continuous.
  • the U-rich tail sequence is 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 , 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 uridines may comprise a contiguous sequence.
  • the U-rich tail sequence provided herein is a modified uridine repeat sequence including one ribonucleoside (A, C, G) other than uridine every 1 to 5 repeats of uridine. may include.
  • the modified uridine sequence is particularly useful when designing vectors expressing engineered crRNAs.
  • the U-rich tail sequence may include a sequence in which one or more UV, UUV, UUUV, UUUUV, and/or UUUUUV is repeated.
  • V is one of adenosine (A), cytidine (C), and guanosine (G).
  • the U-rich tail sequence may be expressed as (U a N) b U c .
  • N is one of adenosine (A), uridine (U), cytidine (C), and guanosine (G).
  • a, b, and c are integers, a is 1 or more and 5 or less, and b is 0 or more.
  • b may be 0 or more and 2 or less.
  • c may be 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10.
  • c may be an integer within the two numerical ranges selected in the previous sentence. For example, c may be 1 or more and 6 or less.
  • sequence of the U-rich tail is 5'-U-3', 5'-UU-3', 5'-UUU-3', 5'-UUUU-3', 5'-UUUUU- 3', 5'-UUUUUUU-3', 5'-UUURUUU-3', 5'-UUURUUUU-3' (SEQ ID NO: 646), 5'-UUUURU-3', 5'-UUUURUU-3', 5' -UUUURUU-3', 5'-UUUURUUU-3', 5'-UUUURUUUU-3', 5'-UUUURUUUU-3' (SEQ ID NO: 647), or 5'-UUUUURUUUUUUU-3' (SEQ ID NO: 648).
  • sequence of the U-rich tail is 5'-U-3', 5'-UU-3', 5'-UUU-3', 5'-UUUU-3', 5'-UUUUU- 3', 5'-UUUUUU-3', 5'-UUUAUUU-3', 5'-UUUAUUUU-3' (SEQ ID NO: 254), 5'-UUUUUAU-3', 5'-UUUUAUU-3', 5' -UUUUAUUU-3', 5'-UUUUAUUUU-3', 5'-UUUUAUUUUU-3' (SEQ ID NO: 255), 5'-UUUUUUUUUUU-3' (SEQ ID NO: 256), 5'-UUUGUU-3', 5' -UUUGUUUGUUU-3' (SEQ ID NO: 257), 5'-UUUUGU-3', 5' -UUUGUU
  • sequence of the U-rich tail may be 5'-UUUUUU-3', 5'-UUUUUAUUUUUU-3' (SEQ ID NO: 256), or 5'-UUUUGUUUUUUU-3' (SEQ ID NO: 259). . In one embodiment, the sequence of the U-rich tail may be 5'-UUUUUAUUUU-3'.
  • Cas12f1 guide RNA found in nature is divided into tracrRNA and crRNA, and the crRNA can be further divided into a crRNA repeat sequence portion and a spacer.
  • the portion of the Cas12f1 guide RNA that interacts with the Cas12f1 protein is collectively referred to as a scaffold region.
  • the scaffold region includes tracrRNA and a portion of crRNA, but does not necessarily refer to one molecule of RNA.
  • the scaffold region may be subdivided into a first region, a second region, a third region, a fourth region, a fifth region, and a sixth region.
  • the subdivided region is described on tracrRNA or crRNA, the first to fourth regions are included in tracrRNA, and the fifth to sixth regions are included in crRNA, specifically crRNA repeat sequence.
  • n-th region or “n-th region found in nature” (n is an integer greater than or equal to 1 and less than or equal to 6) described below basically refers to each part of the Cas12f1 guide RNA found in nature.
  • the region corresponding to the above classification criteria in the engineered Cas12f1 guide RNA is generally described as “modified n-th region” to “n-th region of engineered scaffold region”.
  • n-th region included in the engineered scaffold region
  • the term “n-th region” may be used interchangeably.
  • the target referred to by the "n-th region” eg, whether it is a region included in an engineered Cas12f1 guide RNA or a region included in a guide RNA found in nature
  • tracrRNA or “crRNA” in the present specification, it includes all meanings that can be recognized by those skilled in the art of CRISPR/Cas. This is generally used as a term to refer to each molecule of dual guide RNA found in nature, but it can also be used to refer to each corresponding portion of a single guide RNA in which the tracrRNA and crRNA are linked by a linker. Unless otherwise specified, when only tracrRNA and crRNA are described, it means tracrRNA and crRNA constituting the CRISPR/Cas12f1 system.
  • tracrRNA ⁇ 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3' ( ⁇ 1) ⁇ 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUUUCCUCUCCAAUUCUGCACAA-3' ( ⁇ 2) ⁇ ⁇ ⁇ .
  • the tracrRNA comprises a first region, a second region, a third region, and a fourth region. In one embodiment, the tracrRNA is one in which the first region, the second region, the third region, and the fourth region are sequentially linked from the 5' end to the 3' end.
  • the sequence of crRNA comprises a crRNA repeat sequence and a spacer sequence.
  • the crRNA repeat sequence may be 5'-GAAUGAAGGAAUGCAAC-3' (SEQ ID NO: 3) or 5'-GUUGCAGAACCCGAAUAGACGAAUGAAGGAAUGCAAC-3' (SEQ ID NO: 4).
  • the crRNA repeat sequence comprises a fifth region and a sixth region.
  • the spacer sequence may vary depending on the target sequence and generally comprises 10 to 50 nucleotides.
  • the crRNA is one in which a fifth region, a sixth region, and a spacer are sequentially linked in a direction from the 5' end to the 3' end (SEQ ID NO: 5 or 6).
  • the scaffold region When used herein as a “scaffold region”, it refers to the rest of the guide RNAs found in nature except for the spacer. Specifically, the scaffold region includes tracrRNA, and a portion of crRNA. Specifically, a portion of the crRNA may be a portion of a crRNA repeat sequence.
  • the scaffold region is generally known as a portion capable of interacting with a Cas protein. In the present specification, the scaffold region is divided into first to sixth regions, and each region will be described in more detail below.
  • first region refers to a region including the 5' end of tracrRNA.
  • the first region may include nucleotides forming a Stem structure in the CRISPR/Cas12f1 complex, and may include nucleotides adjacent thereto.
  • the first region includes a Stem 1 moiety (Takeda et al., Structure of the miniature type V-F CRISPR-Cas effector enzyme, Molecular Cell 81, 1-13 (2021)).
  • the first region may include one or more nucleotides adjacent to the Stem 1 portion.
  • the first region comprises a disordered region in the CRISPR/Cas12f1 complex that does not interact with the Cas12f1 protein.
  • the first region may mean from the 1st nucleotide to the 11th nucleotide from the 5' end of the tracrRNA represented by SEQ ID NO: 1 or 2.
  • the sequence of the first region may be 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAA-3' (SEQ ID NO: 10).
  • second region When used herein as a "second region", it refers to a region located in the 3'-end direction of the first region in tracrRNA.
  • the second region may include nucleotides forming a Stem structure in the CRISPR/Cas12f1 complex, and may include nucleotides adjacent thereto.
  • the stem structure is different from the stem included in the first region.
  • the second region includes a Stem 2 moiety (Takeda et al., Structure of the miniature type V-F CRISPR-Cas effector enzyme, Molecular Cell 81, 1-13 (2021)).
  • the second region may include one or more nucleotides adjacent to the Stem 2 portion.
  • the second region may include one or more nucleotides that interact with the RuvC domain of one Cas12f1 protein forming a dimer and/or the RuvC domain of another Cas12f1 protein forming a dimer in the CRISPR/Cas12f1 complex.
  • the second region comprises a disordered region in the CRISPR/Cas12f1 complex that does not interact with the Cas12f1 protein.
  • the second region may mean from the 22nd nucleotide to the 72nd nucleotide from the 5' end of the tracrRNA represented by SEQ ID NO: 1 or 2.
  • the sequence of the second region may be 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3' (SEQ ID NO: 11).
  • third region refers to a region located in the 3'-end direction of the second region in tracrRNA.
  • the third region may include nucleotides forming a stem structure in the CRISPR/Cas12f1 complex and nucleotides forming a complementary bond with some nucleotides included in crRNA, and may include nucleotides adjacent thereto.
  • the third region consists of a Stem 4 portion (Takeda et al., Structure of the miniature type V-F CRISPR-Cas effector enzyme, Molecular Cell 81, 1-13 (2021)) and a Stem 3-PK (R:AR-1) portion and nucleotides belonging to the heavy tracrRNA (Takeda et al., Structure of the miniature type V-F CRISPR-Cas effector enzyme, Molecular Cell 81, 1-13 (2021)).
  • the third region may include one or more nucleotides adjacent to nucleotides belonging to tracrRNA among the Stem 4 portion and/or the Stem 3-PK (R:AR-1) portion.
  • the third region comprises one or more nucleotides that interact with the WED domain and/or the RuvC domain of one Cas12f1 protein forming a dimer in the CRISPR/Cas12f1 complex.
  • the nucleotide may be a nucleotide belonging to tracrRNA in the Stem 3-PK (R:AR-1) portion.
  • the third region includes one or more nucleotides that interact with the RuvC domain of one Cas12f1 protein forming a dimer and/or the REC domain of another Cas12f1 protein forming a dimer in the CRISPR/Cas12f1 complex.
  • the nucleotide may be a nucleotide included in the Stem 4 portion.
  • the third region comprises one or more nucleotides complementary to one or more nucleotides included in the sixth region of the crRNA.
  • the third region may mean from the 73rd nucleotide to the 127th nucleotide from the 5' end of the tracrRNA represented by SEQ ID NO: 1 or 2.
  • the sequence of the third region may be 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGA-3' (SEQ ID NO: 12).
  • the fourth region refers to a region located at the 3' end of the third region of tracrRNA.
  • the fourth region may include nucleotides capable of forming a complementary bond with some nucleotides included in crRNA in the CRISPR/Cas12f1 complex, and may include nucleotides adjacent thereto.
  • the fourth region includes a nucleotide belonging to tracrRNA in Stem 5 (R:AR-2) (Takeda et al., Structure of the miniature type V-F CRISPR-Cas effector enzyme, Molecular Cell 81, 1-13 (2021)) ).
  • the fourth region may include one or more nucleotides adjacent to a nucleotide belonging to tracrRNA in Stem 5 (R:AR-2).
  • the fourth region may include one or more nucleotides that interact with the WED domain and/or the ZF domain of one Cas12f1 protein forming a dimer in the CRISPR/Cas12f1 complex.
  • the nucleotide may be a nucleotide belonging to tracrRNA in Stem 5 (R:AR-2).
  • the fourth region may include one or more nucleotides complementary to one or more nucleotides included in the fifth region of the crRNA.
  • the fourth region comprises a disordered region in the CRISPR/Cas12f1 complex that does not interact with the Cas12f1 protein.
  • the fourth region may mean from the 128th nucleotide to the 140th nucleotide from the 5' end of the tracrRNA represented by SEQ ID NO: 1. In one embodiment, the fourth region may mean from the 128th nucleotide to the 162th nucleotide from the 5' end of the tracrRNA represented by SEQ ID NO: 2.
  • sequence of the fourth region may be 5'-AACAAAUUCAUUU-3' (SEQ ID NO: 13) or 5'-AACAAAUUCAUUUUUCCUCUCCCAAUUCUGCACAA-3' (SEQ ID NO: 14).
  • the fifth region When used herein as a "fifth region”, it refers to a region including the crRNA 5' end.
  • the fifth region includes nucleotides that form a complementary bond with one or more nucleotides of the fourth region in the CRISPR/Cas12f1 complex, and may include nucleotides adjacent thereto.
  • the fifth region includes a nucleotide belonging to the crRNA of the Stem 5 (R:AR-2) portion (Takeda et al., Structure of the miniature type V-F CRISPR-Cas effector enzyme, Molecular Cell 81, 1-13 (2021) )).
  • the fifth region may include one or more nucleotides adjacent to a nucleotide belonging to the crRNA of the Stem 5 (R:AR-2) portion.
  • the fifth region may include one or more nucleotides that interact with the WED domain, the REC domain and/or the ZF domain of one Cas12f1 protein constituting a dimer in the CRISPR/Cas12f1 complex.
  • the nucleotide may be a nucleotide belonging to crRNA in Stem 5 (R:AR-2).
  • the fifth region may include one or more nucleotides complementary to one or more nucleotides included in the fourth region.
  • the fifth region comprises a disordered region in the CRISPR/Cas12f1 complex that does not interact with the Cas12f1 protein.
  • the fifth region may mean from the 1st nucleotide to the 10th nucleotide from the 5' end of the crRNA represented by SEQ ID NO: 3. In one embodiment, the fifth region may mean from the 1st nucleotide to the 30th nucleotide from the 5' end of the crRNA represented by SEQ ID NO: 4. In one embodiment, the sequence of the fifth region may be 5'-GAAUGAAGGA-3' (SEQ ID NO: 15) or 5'-GUUGCAGAACCCGAAUAGACGAAUGAAGGA-3' (SEQ ID NO: 16).
  • sixth region refers to a region located in the 3'-end direction of the fifth region in crRNA.
  • the sixth region includes nucleotides that form a complementary bond with one or more nucleotides of the third region in the CRISPR/Cas12f1 complex, and may include nucleotides adjacent thereto.
  • the sixth region includes a nucleotide belonging to crRNA in the PK (R:AR-1) portion (Takeda et al., Structure of the miniature type V-F CRISPR-Cas effector enzyme, Molecular Cell 81, 1-13 (2021)) ).
  • the sixth region may include one or more nucleotides adjacent to a nucleotide belonging to the crRNA of the PK (R:AR-1) portion.
  • the sixth region includes one or more nucleotides that interact with the WED domain, ZF domain and/or RuvC domain of one Cas12f1 protein constituting a dimer in the CRISPR/Cas12f1 complex.
  • the nucleotide may be a nucleotide belonging to crRNA in the Stem 3-PK (R:AR-1) portion.
  • the sixth region may mean from the 11th nucleotide to the 17th nucleotide from the 5' end of the crRNA represented by SEQ ID NO: 3. In one embodiment, the sixth region may mean from the 31st nucleotide to the 37th nucleotide from the 5' end of the crRNA represented by SEQ ID NO: 4. In one embodiment, the sequence of the sixth region may be 5'-AUGCAAC-3'.
  • spacer refers to one or more nucleotides that hybridize with a portion of a target sequence in the CRISPR/Cas12f1 system.
  • the spacer refers to 10 to 50 consecutive nucleotides near the 3' end of the crRNA of the guide RNA in the CRISPR/Cas12f1 system.
  • the spacer is designed to correspond to the target sequence of the target nucleic acid to be edited using the CRISPR/Cas12f1 system. In other words, the spacer may have various sequences depending on the target sequence of the target nucleic acid.
  • the present specification provides an engineered scaffold region that can be introduced to improve the targeting efficiency in the target gene of the CRISPR regulatory system.
  • the engineered scaffold region synergizes with the aforementioned U-rich tail, thereby improving the targeting efficiency in the target gene of the CRISPR regulatory system using the engineered Cas12f1 guide RNA.
  • the engineered scaffold region is characterized in that it has a sequence and/or structure different from that of the scaffold region of Cas12f1 guide RNA found in nature (hereinafter, the scaffold region found in nature) is modified in one or more places. .
  • the function of the engineered scaffold region is the same as or has a function similar to that of the scaffold region found in nature.
  • the engineered scaffold region comprises a region corresponding to each portion of the scaffold region found in nature.
  • the engineered scaffold region includes a first region, a second region, a third region, a fourth region, a fifth region, and a sixth region, which is the first region contained in the scaffold region found in nature.
  • Each of the first to sixth areas corresponds to each other.
  • the engineered scaffold region may not include a region corresponding to the first region and/or the second region among scaffold regions found in nature.
  • the engineered Cas12f1 guide RNA provided herein may be a single guide RNA molecule. Accordingly, the engineered scaffold region provided herein may be one in which one or more of each region is modified, and additionally, the 3' end of the tracrRNA fourth region and the 5' end of the crRNA fifth region may be linked through a linker.
  • the engineered scaffold region is one or more modified in a scaffold region found in nature, and the 3' end of the fourth region and the 5' end of the fifth region are linked through a linker.
  • the linker may be 5'-GAAA-3'.
  • the engineered scaffold region provided herein may be a first region modified from a scaffold region found in nature.
  • the engineered scaffold region may include a deformed first region.
  • the modified first region has one or more nucleotides removed from the first region of the scaffold region found in nature.
  • the removed nucleotide is a nucleotide selected from the region forming the Stem structure in the CRISPR/Cas12f1 complex.
  • the engineered scaffold region included in the engineered Cas12f1 guide RNA may include one in which one or more nucleotides included in the first region among scaffold regions found in nature have been removed.
  • the removed nucleotide may be a nucleotide included in a portion forming a stem structure in the CRISPR/Cas12f1 complex among the first regions found in nature.
  • the removed nucleotide is Stem 1 (Takeda et al., Structure of the miniature type V-F CRISPR-Cas effector enzyme, Molecular Cell 81, 1-13 (2021)) in the first region found in nature.
  • the removed nucleotide may be a nucleotide that does not interact with the Cas12f1 protein in the CRISPR/Cas12f1 complex among the first regions found in nature.
  • the modified first region is characterized in that it comprises a 5'-A-3' sequence in the 3'-terminal direction.
  • the engineered scaffold region may be one in which a first region among scaffold regions found in nature has been removed. In other words, the engineered scaffold region may not include a region corresponding to the first region among scaffold regions found in nature.
  • the first region of the engineered scaffold region may have one or more nucleotides removed from the first region of the scaffold region found in nature.
  • the modified first region of the engineered scaffold region may have 1 to 20 nucleotides removed from the 5' end of the first region of the scaffold region found in nature.
  • the modified first region is 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 at the 5' end of the first region of the scaffold region found in nature. 5, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20 consecutive nucleotides may be removed.
  • the modified first region may be one in which consecutive nucleotides within two numerical ranges selected in the previous sentence are removed from the 5' end of the first region of the scaffold region found in nature. For example, 1 to 3 consecutive nucleotides at the 5' end may be removed from the first region of the scaffold region found in nature.
  • the modified first region comprises at least one nucleotide, which may be 5'-A-3'.
  • the engineered scaffold region provided herein may be one in which the first region among scaffold regions found in nature has been removed.
  • the engineered scaffold region may not include a region corresponding to the first region of the scaffold region found in nature.
  • the sequence of the modified first region is 5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA -3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 5'-AAGUGGAGAA-3' (SEQ ID NO: 17), 5 '-AAAGUGGAGAA-3' (SEQ ID NO: 18), 5'-UAAAGUGGAGAA-3' (SEQ ID NO: 19), 5'-AUAAAGUGGAGAA-3' (SEQ ID NO: 20), 5'-GAUAAAGUGGAGAA-3' (SEQ ID NO: 21) , 5'-UGAUAAAGUGGAGAA-3' (SEQ ID NO: 22), 5'-CUGAUAAAGUGGAGAA-3' (SEQ ID NO: 23), 5'-ACUGAUAAAGUGGAGAA-3' (SEQ ID NO: 24),
  • sequence of the engineered scaffold region in which the first region is modified may comprise:
  • sequence of the engineered scaffold region in which the first region is modified may comprise:
  • sequence of the engineered scaffold region in which the first region is modified may comprise:
  • the sequence of the engineered scaffold region in which the first region is modified is in the 5' to 3' terminal direction
  • 5'-AUGCAAC-3' may be linked.
  • the linker may be 5'-GAAA-3'.
  • sequence of the engineered scaffold region from which the first region has been removed may comprise:
  • sequence of the engineered scaffold region from which the first region has been removed may comprise:
  • sequence of the engineered scaffold region from which the first region has been removed may comprise:
  • the sequence of the engineered scaffold region from which the first region has been removed is in the 5' to 3' terminal direction
  • 5'-AUGCAAC-3' may be linked.
  • the linker may be 5'-GAAA-3'.
  • sequence of the engineered scaffold region from which the first region is removed may be 5'CCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3' (SEQ ID NO: 487).
  • the engineered scaffold region included in the engineered guide RNA provided herein may be a second region modified from a scaffold region found in nature.
  • the engineered scaffold region may include a modified second region.
  • the modified second region has one or more nucleotides removed from the second region of the scaffold region found in nature.
  • the removed nucleotide is a nucleotide selected from the region forming the Stem structure in the CRISPR/Cas12f1 complex.
  • the engineered scaffold region included in the engineered Cas12f1 guide RNA may include one in which one or more nucleotides included in the second region among scaffold regions found in nature have been removed.
  • the removal of the nucleotide may occur in a portion forming a stem structure among the second region found in the natural world, and the nucleotide may be removed in units of a base pair.
  • the removed nucleotide may be a nucleotide included in a portion forming a stem structure in the CRISPR/Cas12f1 complex among the second region found in nature.
  • the removed nucleotide is Stem 2 (Takeda et al., Structure of the miniature type V-F CRISPR-Cas effector enzyme, Molecular Cell 81, 1-13 (2021)) in the second region found in nature. It may be a nucleotide belonging to In one embodiment, the removed nucleotide may be a nucleotide that does not interact with the Cas12f1 protein in the CRISPR/Cas12f1 complex among the second region found in nature.
  • the modified second region is characterized in that it has a 5'-G-3' sequence in the 3'-terminal direction.
  • the engineered scaffold region may be one in which the second region among the scaffold regions found in nature is removed. In other words, the engineered scaffold region may not include a region corresponding to the second region among scaffold regions found in nature.
  • Second Region Modification 1 Remove some nucleotides
  • the second region of the engineered scaffold region may have one or more nucleotides removed from the second region of the scaffold region found in nature.
  • the modified second region of the engineered scaffold region may have 1 to 51 nucleotides removed from the second region of the scaffold region found in nature.
  • the modified second region is the second region of the scaffold region found in nature, based on the sequence of SEQ ID NO: 11, 1st to 22nd nucleotides from the 5' end, and/or 27th to 51st nucleotides One or more of the second nucleotides may be removed.
  • the modified second region is the second region of the scaffold region found in nature, based on the sequence of SEQ ID NO: 11, 1st to 22nd nucleotides from the 5' end, and/or 27th to 51st nucleotides At least one of the second nucleotides may be removed and the 23rd to 26th nucleotides may be substituted with another.
  • the modified second region is 1, 2, 3 of the 1st to 22nd nucleotides from the 5' end based on the sequence of SEQ ID NO: 11 in the second region of the scaffold region found in nature. Dogs, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, or 22 consecutive nucleotides may be removed.
  • the modified second region is 1, 2, 3 of the 27th to 51st nucleotides from the 5' end based on the sequence of SEQ ID NO: 11 in the second region of the scaffold region found in nature. Dogs, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, or 25 consecutive nucleotides may be removed.
  • the sequence of the modified second region comprises at least 5'-G-3'.
  • the modification of the second region may be one in which one or more pairs of nucleotides complementary to each other included in the portion forming the stem structure are removed.
  • the modified second region is, in the second region of the scaffold region found in nature, based on the sequence of SEQ ID NO: 11, 1st to 22nd nucleotides, and 27th to 50th nucleotides from the 5' end In the CRISPR/Cas12f1 complex, one or more pairs of nucleotides constituting a base pair may be removed.
  • the modified second region is, in the second region of the scaffold region found in nature, based on the sequence of SEQ ID NO: 11, 1st to 22nd nucleotides, and 27th to 50th nucleotides from the 5' end In the CRISPR/Cas12f1 complex, one or more pairs of nucleotides forming a base pair and/or one or more nucleotides not forming a base pair may be removed.
  • the modified second region is, in the second region of the scaffold region found in nature, based on the sequence of SEQ ID NO: 11, 1st to 22nd nucleotides, and 27th to 50th nucleotides from the 5' end In the CRISPR/Cas12f1 complex, one or more pairs of nucleotides constituting a base pair and/or one or more pairs of mismatched nucleotides may be removed.
  • the modified second region may have at least one of the sequences set forth in SEQ ID NOs: 139 to 149.
  • the engineered scaffold region provided herein may be one in which the second region among scaffold regions found in nature has been removed.
  • the engineered scaffold region may have no region corresponding to the second region of the scaffold region found in nature.
  • the sequence of the modified second region is 5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5'-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', 5'-CCUUAGGUGG -3' (SEQ ID NO: 342), 5'-CCGUUAGGUGG-3' (SEQ ID NO: 343), 5'-CCGCUUAGGGUGG-3' (SEQ ID NO: 344), 5'-CCGCUUUAGAGGUGG-3' (SEQ ID NO: 345), 5' -CCGCUUUUAGAAGGUGG-3' (SEQ ID NO: 346), 5'-CCGCUUCUUAGGAAGGUGG-3' (SEQ ID NO: 347), 5'-CCGCUUCAUUAGUGAAGGUGG-3' (SEQ ID NO: 348), 5'-CCGCUUCACUUAGGUGAAGGUGG-3' (SEQ ID NO: 349), 5'-CCGCUUCACUUAGAGUGAAGGUGG-3' (SEQ ID NO
  • sequence of the modified second region may be at least one of the sequences set forth in SEQ ID NOs: 363 to 378.
  • sequence of the engineered scaffold region in which the second region is modified may comprise:
  • sequence of the engineered scaffold region in which the second region is modified may comprise:
  • sequence of the engineered scaffold region in which the second region is modified may comprise:
  • the sequence of the engineered scaffold region in which the second region is modified is 5' to 3', SEQ ID NO: 10, 5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5 '-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', and a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 342 to 362, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, linker, SEQ ID NO: 15, and 5'-AUGCAAC-3' may be connected.
  • the linker may be 5'-GAAA-3'.
  • sequence of the engineered scaffold region with the second region removed may comprise:
  • sequence of the engineered scaffold region with the second region removed may comprise:
  • sequence of the engineered scaffold region with the second region removed may comprise:
  • sequence of the engineered scaffold region from which the second region has been removed is 5' to 3', SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, linker, SEQ ID NO: 15, and 5' -AUGCAAC-3' may be connected.
  • the linker may be 5'-GAAA-3'.
  • sequence of the engineered scaffold region with the second region removed may be 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAAGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3' (SEQ ID NO: 407).
  • the engineered scaffold region included in the engineered guide RNA provided herein may be a third region modified from a scaffold region found in nature.
  • the engineered scaffold region may include a modified third region.
  • the modified third region is one in which one or more nucleotides have been removed from the third region of the scaffold region found in nature.
  • the removed nucleotide is a nucleotide selected from the region forming the Stem structure in the CRISPR/Cas12f1 complex.
  • the engineered scaffold region included in the engineered Cas12f1 guide RNA may include one in which one or more nucleotides included in the third region among scaffold regions found in nature have been removed.
  • the removal of the nucleotide may occur in a portion forming a stem structure among the third region found in nature, and the nucleotide may be removed in units of base pairs.
  • the removed nucleotide may be a nucleotide included in a portion forming a stem structure in the CRISPR/Cas12f1 complex among the third region found in nature.
  • the removed nucleotide is Stem 4 (Takeda et al., Structure of the miniature type V-F CRISPR-Cas effector enzyme, Molecular Cell 81, 1-13 (2021)) in the third region found in nature. It may be a nucleotide belonging to
  • the modified third region is characterized in that it has 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAG-3' (SEQ ID NO: 475), 5'-UUCG-3', and 5'-CUCGA-3' sequences.
  • the third region of the engineered scaffold region may have one or more nucleotides removed from the third region of the scaffold region found in nature.
  • the modified third region of the engineered scaffold region may have 1 to 20 nucleotides removed from the third region of the scaffold region found in nature.
  • the modified third region is the third region of the scaffold region found in nature, based on the sequence of SEQ ID NO: 12, the 27th to the 36th nucleotides from the 5' end, and/or the 41st to the 50th One or more of the second nucleotides may be removed.
  • the modified second region is 1, 2, 3 of the 27th to 36th nucleotides from the 5' end, based on the sequence of SEQ ID NO: 12, in the second region of the scaffold region found in nature. Dogs, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 consecutive nucleotides may be removed.
  • the modified second region is 1, 2, 3 of the 41st to 50th nucleotides from the 5' end, based on the sequence of SEQ ID NO: 12, in the second region of the scaffold region found in nature. Dogs, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 consecutive nucleotides may be removed.
  • the modification of the third region may be one in which one or more pairs of nucleotides complementary to each other included in the portion forming the stem structure are removed.
  • the modified third region is, in the third region of the scaffold region found in nature, based on the sequence of SEQ ID NO: 12, the 27th to 36th nucleotides from the 5' end, and the 41st to the 50th nucleotides In the CRISPR/Cas12f1 complex, one or more pairs of nucleotides constituting a base pair may be removed.
  • the modified third region is, in the third region of the scaffold region found in nature, based on the sequence of SEQ ID NO: 12, the 27th to 36th nucleotides from the 5' end, and the 41st to the 50th nucleotides In the CRISPR/Cas12f1 complex, one or more pairs of nucleotides forming a base pair and/or one or more nucleotides not forming a base pair may be removed.
  • the modified third region is, in the third region of the scaffold region found in nature, based on the sequence of SEQ ID NO: 12, the 27th to 36th nucleotides from the 5' end, and the 41st to the 50th nucleotides In the CRISPR/Cas12f1 complex, one or more pairs of nucleotides constituting a base pair and/or one or more pairs of mismatched nucleotides may be removed.
  • sequence of the modified third region is 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGA-3' (SEQ ID NO: 434), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGGAUCUUUUUCGAAAGUAACCCUCGAAGCUACCGAAAGUAACCCUCGAAGCUCAUCGAAAGUAACCCUCGAAGAG-3' (SEQ ID NO: 434) 436), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUCUUCGGAGUAACCCUCGA-3' (SEQ ID NO: 437), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCGAGUAACCCUCGA-3' (SEQ ID NO: 438), 5'-GCUGCAUGCAGCAGCUAGCUAGCUAGCUAGCUAGCUAGGA-3' (SEQ ID NO: 438), 5'-GCUGUAACCGUCUUGCAUCAGUG
  • sequence of the engineered scaffold region in which the third region is modified may comprise:
  • sequence of the engineered scaffold region in which the third region is modified may comprise:
  • sequence of the engineered scaffold region in which the third region is modified may comprise:
  • the sequence of the engineered scaffold region in which the second region is modified is from the 5' end to the 3' end in the group consisting of SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 434 to 447
  • the selected sequence, a linker, SEQ ID NO: 15, and 5'-AUGCAAC-3' may be linked.
  • the linker may be 5'-GAAA-3'.
  • the engineered scaffold region provided herein may be a modified region of the fourth and fifth regions from the scaffold region found in nature. Since the fourth region and the fifth region include a portion that hybridizes with each other in the CRISPR/Cas12f1 complex to constitute a stem, the corresponding portion may be modified together to constitute an engineered scaffold region.
  • the engineered scaffold region may include a modified fourth region and/or a modified fifth region.
  • the modified fourth region is characterized in that one or more nucleotides have been removed from the fourth region of the scaffold region found in nature.
  • the modified fifth region is characterized in that one or more nucleotides have been removed from the fifth region of the scaffold region found in nature.
  • the engineered scaffold region included in the engineered Cas12f1 guide RNA may have one or more nucleotides removed from the fourth region and/or the fifth region among scaffold regions found in nature.
  • the modified fourth region is characterized in that it has a 5'-AACAAA-3' sequence in the 5'-terminal direction.
  • the modified fifth region is characterized in that it has a 5'-GGA-3' sequence in the 3'-terminal direction.
  • the fourth region of the engineered scaffold region may be one in which one or more nucleotides have been removed from the fourth region among scaffold regions found in nature.
  • the fifth region of the engineered scaffold region may have one or more nucleotides removed from the fifth region among scaffold regions found in nature.
  • the modified fourth region of the engineered scaffold region may have 1 to 7 nucleotides removed from the fourth region of the scaffold region found in nature. In one embodiment, the modified fourth region of the engineered scaffold region may have 1 to 28 nucleotides removed from the fourth region of the scaffold region found in nature. In one embodiment, the modified fourth region may be one in which one or more of the 7th to 13th nucleotides from the 5' end have been removed from the fourth region of the scaffold region found in nature, based on the sequence of SEQ ID NO: 13. have. In one embodiment, the modified fourth region may be one in which at least one of the 7th to 34th nucleotides from the 5' end has been removed from the fourth region of the scaffold region found in nature, based on the sequence of SEQ ID NO: 14. have.
  • sequence of the modified fourth region is characterized in that it comprises at least 5'-AACAAA-3'.
  • the modified fifth region of the engineered scaffold region may have 1 to 7 nucleotides removed from the fifth region of the scaffold region found in nature. In one embodiment, the modified fifth region of the engineered scaffold region may have 1 to 27 nucleotides removed from the fifth region of the scaffold region found in nature. In one embodiment, the modified fifth region may be one in which one or more of the 1st to 7th nucleotides from the 5' end have been removed from the fifth region of the scaffold region found in nature, based on the sequence of SEQ ID NO: 15. have.
  • the modified fifth region may be one in which at least one of the 1st to 27th nucleotides from the 5' end has been removed from the 5th region of the scaffold region found in nature, based on the sequence of SEQ ID NO: 16. have.
  • the sequence of the modified fifth region comprises at least 5'-GGA-3'.
  • the fourth region and the fifth region complement each other in the CRISPR/Cas12 complex to form a stem. Since the above-described modification of the fourth region and the fifth region targets one or more nucleotides constituting the stem, the modification of the fourth region and the fifth region may be to remove the nucleotides constituting the stem in units of a base pair. have.
  • the modified fourth region and the fifth region are, in the fourth region and the fifth region of the scaffold region found in nature, based on SEQ ID NO: 13, the 7th to 13th nucleotides, and SEQ ID NO: Based on the 15th sequence, one or more pairs of nucleotides constituting a base pair in the CRISPR/Cas12f1 complex among the 1st to 7th nucleotides may be removed.
  • the modified fourth region and the fifth region are, in the fourth region and the fifth region of the scaffold region found in nature, based on SEQ ID NO: 13, the 7th to 13th nucleotides, and SEQ ID NO: 15 Based on the sequence, one or more pairs of nucleotides forming a base pair and/or one or more nucleotides not forming a base pair in the CRISPR/Cas12f1 complex among the 1st to 7th nucleotides may be removed.
  • the modified fourth region and the fifth region are, in the fourth region and the fifth region of the scaffold region found in nature, based on SEQ ID NO: 13, the 7th to 13th nucleotides, and SEQ ID NO: 15 Based on the sequence, one or more pairs of nucleotides constituting a base pair in the CRISPR/Cas12f1 complex among the first to seventh nucleotides and/or one or more pairs of mismatched nucleotides may be removed.
  • the modified fourth region and the fifth region are, in the fourth region and fifth region of the scaffold region found in nature, based on SEQ ID NO: 14, the 7th to 34th nucleotides, and SEQ ID NO: Based on the 16th sequence, one or more pairs of nucleotides constituting a base pair in the CRISPR/Cas12f1 complex among the 1st to 27th nucleotides may be removed.
  • the modified fourth region and the fifth region are, in the fourth region and fifth region of the scaffold region found in nature, based on SEQ ID NO: 14, the 7th to 34th nucleotides, and SEQ ID NO: Based on the 16th sequence, one or more pairs of nucleotides forming a base pair and/or one or more nucleotides not forming a base pair in the CRISPR/Cas12f1 complex among the 1st to 27th nucleotides may be removed.
  • the modified fourth region and the fifth region are, in the fourth region and fifth region of the scaffold region found in nature, based on SEQ ID NO: 14, the 7th to 34th nucleotides, and SEQ ID NO: Based on the 16th sequence, one or more pairs of nucleotides constituting a base pair in the CRISPR/Cas12f1 complex and/or one or more pairs of mismatched nucleotides among the 1st to 27th nucleotides may be removed.
  • the sequence of the modified fourth region is 5'-AACAAA-3', 5'-AACAAAU-3', 5'-AACAAAUU-3', 5'-AACAAAUUC-3', 5'-AACAAAAUUCA It may be selected from the group consisting of -3' (SEQ ID NO: 67), 5'-AACAAAUUCAU-3' (SEQ ID NO: 68), and 5'-AACAAAUUCAUU-3' (SEQ ID NO: 69).
  • the sequence of the modified fourth region is 5'-AACAAA-3', 5'-AACAAAU-3', 5'-AACAAAUU-3', 5'-AACAAAUUC-3', 5'-AACAAAAUUCA -3' (SEQ ID NO: 67), 5'-AACAAAUUCAU-3' (SEQ ID NO: 68), 5'-AACAAAUUCAUU-3' (SEQ ID NO: 69), 5'-AACAAAUUCAUUU-3' (SEQ ID NO: 70), 5' -AACAAAUUCAUUUU-3' (SEQ ID NO: 71), 5'-AACAAAUUCAUUUUU-3' (SEQ ID NO: 72), 5'-AACAAAUUCAUUUUUC-3' (SEQ ID NO: 73), 5'-AACAAAUUCAUUUUUCC-3' (SEQ ID NO: 74), 5'-AACAAAUUCAUUUUUCCU-3' (SEQ ID NO: 67), 5
  • the sequence of the modified fifth region is 5'-GGA-3', 5'-AGGA-3', 5'-AAGGA-3', 5'-GAAGGA-3', 5'-UGAAGGA It may be selected from -3', 5'-AUGAAGGA-3', and 5'-AAUGAAGGA-3'.
  • the sequence of the modified fifth region is 5'-GGA-3', 5'-AGGA-3', 5'-AAGGA-3', 5'-GAAGGA-3', 5'-UGAAGGA -3', 5'-AUGAAGGA-3', 5'-AAUGAAGGA-3', 5'-GAAUGAAGGA-3' (SEQ ID NO: 91), 5'-CGAAUGAAGGA-3' (SEQ ID NO: 92), 5'-ACGAAUGAAGGA -3' (SEQ ID NO: 93), 5'-GACGAAUGAAGGA-3' (SEQ ID NO: 94), 5'-AGACGAAUGAAGGA-3' (SEQ ID NO: 95), 5'-UAGACGAAUGAAGGA-3' (SEQ ID NO: 96), 5' -AUAGACGAAUGAAGGA-3' (SEQ ID NO: 97), 5'-AAUAGACGAAUGAAGGA-3' (SEQ ID NO: 98), 5'-GAAUAGACGA
  • sequence of the engineered scaffold region in which the fourth region and the fifth region are modified may comprise:
  • sequence of the engineered scaffold region in which the fourth region and the fifth region are modified may comprise:
  • sequence of the engineered scaffold region in which the fourth region and the fifth region are modified may comprise:
  • the sequence of the engineered scaffold region in which the fourth region and the fifth region are modified is from the 5' end to the 3' end direction
  • 5'-AUGCAAC-3' may be linked.
  • the engineered scaffold region included in the engineered Cas12f1 guide RNA provided herein may be a combination of one or more modifications for each region described above with a scaffold region found in nature.
  • the engineered scaffold region may include a deformed first region and a deformed second region.
  • the engineered scaffold region may include a deformed second region, and the first region may be removed.
  • the engineered scaffold region may include a deformed first region, and the second region may be removed.
  • the engineered scaffold region may have the first region and the second region removed.
  • the engineered scaffold region may include a deformed first region and a modified third region.
  • the engineered scaffold region may include a modified third region, and the first region may be removed.
  • the engineered scaffold region may include a first region that is modified, a fourth region that is modified several times, and a fifth region that is modified.
  • the engineered scaffold region may include a deformed fourth region and a fifth region, and the first region may be removed.
  • the engineered scaffold region may include a modified second region and a modified third region.
  • the engineered scaffold region may include a modified third region, and the second region may be removed.
  • the engineered scaffold region may include a modified second region and a deformed fourth region and a fifth region.
  • the engineered scaffold region may include a deformed fourth region and a fifth region, and the second region may be removed.
  • the engineered scaffold region may include a modified third region and a modified fourth region and a fifth region.
  • the engineered scaffold region may include a deformed first region, a deformed second region, and a third deformed region.
  • the engineered scaffold region may include a deformed second region and a deformed third region, and the first region may be removed.
  • the engineered scaffold region may include a deformed first region and a deformed third region, and the second region may be removed.
  • the engineered scaffold region may include a modified third region, and the first region and the second region may be removed.
  • the engineered scaffold region may include a deformed first region, a deformed second region, and a fourth and fifth deformed region.
  • the engineered scaffold region may include a deformed second region, a deformed fourth region, and a fifth region, and the first region may be removed.
  • the engineered scaffold region may include a deformed first region, a deformed fourth region, and a fifth region, and the second region may be removed.
  • the engineered scaffold region may include a deformed fourth region and a fifth region, and the first region and the second region may be removed.
  • the engineered scaffold region may include a deformed first region, a deformed third region, and a fourth and fifth deformed region.
  • the engineered scaffold region may include a third deformed region, a deformed fourth region, and a fifth region, and the first region may be removed.
  • the engineered scaffold region may include a second modified region, a third modified region, and a fourth and fifth modified region.
  • the engineered scaffold region may include a modified third region, a deformed fourth region, and a fifth region, and the second region may be removed.
  • the engineered scaffold region may include a first deformed region, a second deformed region, a third deformed region, and a fourth and fifth deformed region.
  • the engineered scaffold region may include a second deformed region, a deformed third region, and a fourth and fifth deformed region, in which the first region is removed.
  • the engineered scaffold region may include a deformed first region, a deformed third region, and a deformed fourth region and a fifth region, and the second region may be removed.
  • the engineered scaffold region may include a modified third region, a deformed fourth region, and a fifth region, in which the first region and the second region are removed.
  • the deformed region is the same as described in the section on deformation of each region.
  • the engineered scaffold region comprises a deformed first region and a deformed second region.
  • the modified first region includes all the modifications described in the paragraph “Engineered scaffold region 1 - first region deformation”.
  • the modified second region includes all of the modifications described in the paragraph “Engineered scaffold region 2 - second region deformation”.
  • the engineered scaffold sequence in which the first region and the second region are modified may comprise:
  • the engineered scaffold sequence in which the first region and the second region are modified may comprise:
  • the sequence of the engineered scaffold region in which the first region and the second region are modified is in the 5' to 3' terminal direction
  • 5'-AUGCAAC-3' may be linked.
  • the linker may be 5'-GAAA-3'.
  • sequence of the engineered scaffold region in which the first region and the second region are modified may be 5'-ACCGCUUCACCAUUAGUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3' (SEQ ID NO: 207).
  • the engineered scaffold region includes a deformed second region, wherein the first region has been removed.
  • the engineered scaffold region does not include a region corresponding to the first region of the scaffold region found in nature.
  • the modified second region includes all of the modifications described in the paragraph “Engineered scaffold region 2 - second region deformation”.
  • the engineered scaffold sequence with the second region modified and the first region removed may comprise:
  • the engineered scaffold sequence in which the second region is modified and the first region is removed is 5' to 3' terminal direction
  • 5'-AUGCAAC-3' may be linked.
  • the linker may be 5'-GAAA-3'.
  • the engineered scaffold region includes a deformed first region and the second region is removed.
  • the modified first region includes all the modifications described in the paragraph “Engineered scaffold region 1 - first region deformation”.
  • the engineered scaffold region does not include a region corresponding to the second region of the scaffold region found in nature.
  • the engineered scaffold sequence in which the first region is modified and the second region is removed may comprise:
  • the engineered scaffold sequence in which the first region is modified and the second region is removed is 5' to 3' end direction
  • 5'-AUGCAAC-3' may be linked.
  • the linker may be 5'-GAAA-3'.
  • the engineered scaffold region has the first region and the second region removed. In this case, the engineered scaffold region does not include a region corresponding to the first region of the scaffold region found in nature. In this case, the engineered scaffold region does not include a region corresponding to the second region of the scaffold region found in nature.
  • the engineered scaffold sequence from which the first region and the second region are removed may comprise:
  • the engineered scaffold sequence from which the first region and the second region are removed is 5' to 3' terminal direction
  • 5'-AUGCAAC-3' may be linked.
  • the linker may be 5'-GAAA-3'.
  • the engineered scaffold region comprises a first modified region and a third modified region.
  • the modified first region includes all the modifications described in the paragraph “Engineered scaffold region 1 - first region deformation”.
  • the modified third region includes all of the modifications described in the paragraph “Engineered scaffold region 3 - third region deformation”.
  • the engineered scaffold sequence in which the first region and the third region are modified may comprise:
  • the engineered scaffold sequence in which the first region and the third region are modified is from the 5' end to the 3' end
  • 5'-AUGCAAC-3' may be linked.
  • the linker may be 5'-GAAA-3'.
  • the engineered scaffold region includes a modified third region and the first region is removed.
  • the modified third region includes all of the modifications described in the paragraph “Engineered scaffold region 3 - third region deformation”.
  • the engineered scaffold region does not include a region corresponding to the first region of the scaffold region found in nature.
  • the engineered scaffold region with the third region deformed and the first region removed may comprise:
  • the engineered scaffold region in which the third region is modified and the first region is removed is in the 5'-to- 3'-end direction
  • 5'-AUGCAAC-3' may be linked.
  • the linker may be 5'-GAAA-3'.
  • the engineered scaffold region comprises a deformed first region, and a deformed fourth region and a fifth region.
  • the modified first region includes all the modifications described in the paragraph “Engineered scaffold region 1 - first region deformation”.
  • the modified fourth region and the fifth region include all of the modifications described in the paragraph “Engineered scaffold region 3 - fourth region and fifth region deformation”.
  • the engineered scaffold sequence in which the first region and the fourth and fifth regions are modified may comprise:
  • the engineered scaffold sequence in which the first region and the fourth and fifth regions are modified may comprise:
  • the sequence of the engineered scaffold region in which the first region and the fourth region and the fifth region are modified is in the 5′ to 3′ terminal direction
  • 5'-AUGCAAC-3' may be linked.
  • sequence of the engineered scaffold region in which the first region and the fourth region and the fifth region are modified may be 5'-ACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAGAAAGGAAUGCAAC-3' (SEQ ID NO: 208).
  • the engineered scaffold region includes a deformed fourth region and a fifth region, wherein the first region is removed.
  • the modified fourth region and the fifth region include all of the modifications described in the paragraph “Engineered scaffold region 3 - fourth region and fifth region deformation”.
  • the engineered scaffold region does not include a region corresponding to the first region of the scaffold region found in nature.
  • the engineered scaffold sequence in which the fourth and fifth regions are modified and the first region is removed may comprise:
  • the engineered scaffold sequence in which the fourth region and the fifth region are modified and the first region is removed is 5' to 3' end direction
  • 5'-AUGCAAC-3' may be linked.
  • the engineered scaffold region comprises a modified second region and a modified third region.
  • the modified second region includes all of the modifications described in the paragraph “Engineered scaffold region 2 - second region deformation”.
  • the modified third region includes all of the modifications described in the paragraph “Engineered scaffold region 3 - third region deformation”.
  • the engineered scaffold sequence in which the second region and the third region are modified may comprise:
  • the engineered scaffold sequence in which the second region and the third region are modified is from the 5' end to the 3' end
  • 5'-AUGCAAC-3' may be linked.
  • the linker may be 5'-GAAA-3'.
  • the engineered scaffold region includes a modified third region, and the second region is removed.
  • the modified third region includes all of the modifications described in the paragraph “Engineered scaffold region 3 - third region deformation”.
  • the engineered scaffold region does not include a region corresponding to the second region of the scaffold region found in nature.
  • the engineered scaffold region with the third region deformed and the second region removed may comprise:
  • the engineered scaffold region in which the third region is modified and the second region is removed is in a 5'-to 3'-end direction
  • 5'-AUGCAAC-3' may be linked.
  • the linker may be 5'-GAAA-3'.
  • the engineered scaffold region comprises a modified second region and a modified fourth region and a fifth region.
  • the modified second region includes all of the modifications described in the paragraph “Engineered scaffold region 2 - second region deformation”.
  • the modified fourth region and the fifth region include all the modifications described in the paragraph "Engineered scaffold region 4 - fourth region and fifth region deformation”.
  • the engineered scaffold sequence in which the second region and the fourth and fifth regions are modified may comprise:
  • the engineered scaffold sequence in which the second region and the fourth and fifth regions are modified may comprise:
  • the sequence of the engineered scaffold region in which the second region and the fourth region and the fifth region are modified is in the 5′ to 3′ terminal direction
  • 5'-AUGCAAC-3' may be linked.
  • sequence of the engineered scaffold region in which the second and fourth and fifth regions are modified may be 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACUUAGAGUGAAGGUGGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAGAAAGGAAUGCAAC-3' (SEQ ID NO:209).
  • the engineered scaffold region includes a deformed fourth region and a fifth region, and the second region is removed.
  • the modified fourth and fifth regions include all of the modifications described in the paragraph "Engineered scaffold region 3 - fourth region and fifth region deformation".
  • the engineered scaffold region does not include a region corresponding to the second region of the scaffold region found in nature.
  • the engineered scaffold sequence with the fourth and fifth regions modified and the second region removed may comprise:
  • the engineered scaffold sequence in which the fourth region and the fifth region are modified and the first region is removed is 5' to 3' end direction
  • 5'-AUGCAAC-3' may be linked.
  • the engineered scaffold region comprises a modified third region and a modified fourth region and a fifth region.
  • the modified third region includes all of the modifications described in the paragraph “Engineered scaffold region 3 - third region deformation”.
  • the modified fourth region and the fifth region include all the modifications described in the paragraph "Engineered scaffold region 4 - fourth region and fifth region deformation”.
  • the engineered scaffold sequence in which the third region and the fourth and fifth regions are modified may comprise:
  • the sequence of the engineered scaffold region in which the third region and the fourth region and the fifth region are modified is in the 5′ to 3′ terminal direction
  • 5'-AUGCAAC-3' may be linked.
  • the engineered scaffold region comprises a deformed first region, a deformed second region, and a modified third region.
  • the modified first region includes all the modifications described in the paragraph “Engineered scaffold region 1 - first region deformation”.
  • the modified second region includes all of the modifications described in the paragraph “Engineered scaffold region 2 - second region deformation”.
  • the modified third region includes all of the modifications described in the paragraph “Engineered scaffold region 3 - third region deformation”.
  • the engineered scaffold sequence in which the first region, the second region, and the third region are modified may comprise:
  • the engineered scaffold sequence in which the first region, the second region, and the third region are modified is 5' to 3' end
  • 5'-AUGCAAC-3' may be linked.
  • the linker may be 5'-GAAA-3'.
  • the engineered scaffold region includes a second deformed region and a third deformed region, wherein the first region is removed.
  • the modified second region includes all of the modifications described in the paragraph “Engineered scaffold region 2 - second region deformation”.
  • the modified third region includes all of the modifications described in the paragraph “Engineered scaffold region 3 - third region deformation”.
  • the engineered scaffold region does not include a region corresponding to the first region of the scaffold region found in nature.
  • the engineered scaffold sequence in which the second region and the third region have been modified and the first region removed may comprise:
  • the engineered scaffold sequence in which the second region and the third region are modified and the first region removed is 5' to 3' end direction
  • 5'-AUGCAAC-3' may be linked.
  • the linker may be 5'-GAAA-3'.
  • the engineered scaffold region includes a deformed first region and a deformed third region, wherein the second region is removed.
  • the modified first region includes all the modifications described in the paragraph “Engineered scaffold region 1 - first region deformation”.
  • the modified third region includes all of the modifications described in the paragraph “Engineered scaffold region 3 - third region deformation”.
  • the engineered scaffold region does not include a region corresponding to the second region of the scaffold region found in nature.
  • the engineered scaffold sequence in which the first region and the third region have been modified and the second region removed may comprise:
  • the engineered scaffold sequence in which the first region and the third region have been modified and the second region removed is 5' to 3' end direction

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 CRISPR 조절 시스템에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 표적 유전자의 발현을 효과적으로 조절하기 위한 Cas12f1 융합 단백질 및 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR 조절 시스템 및 이의 이용에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 Cas12f1 융합 단백질 및 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR 조절 시스템을 이용한 표적 유전자의 발현 조절 방법에 관한 것이다.

Description

CRISPR 시스템을 이용한 유전자 발현 조절 시스템
본 발명은 CRISPR 기술을 이용한 유전자 발현 조절 시스템에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 표적 유전자의 발현을 효과적으로 조절하기 위한 Cas12f1 융합 단백질 및 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR 기술을 이용한 유전자 발현 조절 시스템(CRISRP 조절 시스템으로 약칭함) 및 이의 이용에 관한 것이다.
CRISRP 조절 시스템은 CRISPR/Cas 시스템을 이용한 표적 유전자의 발현을 조절하는 기술로, 현재 가장 많이 연구된 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 개발되고 있다. 일반적으로, CRISPR 조절 시스템은 가이드 RNA와 유전자의 전사를 조절하는 도메인을 포함하는 dCas9 융합 단백질을 이용하는 것을 특징으로 한다. 이때, Cas9 단백질에 융합되는 전사 조절 도메인의 종류에 따라 CRISPR 조절 시스템은 CRISPR activation 시스템과 CRISPR interference 시스템으로 분류된다. 이러한 CRISPR 조절 시스템은 특정 유전자가 과발현되거나 적게 발현되는 경우 특정 유전자의 발현을 조절하기 위해 효과적인 해결책으로 이용될 수 있다. 하지만, CRISPR 조절 시스템에 주로 이용되는 dCas9 단백질은 그 크기가 커서 CRISPR 조절 시스템을 위한 융합 단백질을 만들고 이를 세포에 전달하기 위해 AAV 등의 벡터에 패키징 하는데 어려움이 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해, Cas9 단백질을 split 하여 여러 벡터로 세포 내 전달하는 방법 및 상대적으로 크기가 작은 Cas 단백질의 개발 및 이의 적용 등의 노력으로 해결책을 모색하고 있는 상황이다.
본 명세서에서는 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 유전자 발현 조절용 조성물을 제공하고자 한다.
본 명세서에서는 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 유전자 발현 조절용 조성물을 이용한 유전자 발현 억제 방법을 제공하고자 한다.
본 명세서에서는 표적 유전자의 발현을 촉진하기 위한 유전자 발현 조절용 조성물을 제공하고자 한다.
본 명세서에서는 표적 유전자의 발현을 촉진하기 위한 유전자 발현 조절용 조성물을 이용한 유전자 발현 촉진 방법을 제공하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 명세서는 다음을 포함하는, 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한, 유전자 발현 조절용 조성물을 제공한다:
전사 저해 Cas12f1 융합 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산; 및
엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산,
이때, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 dead Cas12f1(dCas12f1) 단백질 및 전사 저해 단백질을 포함하고,
상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질을 구성하는 아미노산 서열 중 326번째 아미노산인 아스파트산(D), 422번째 아미노산인 글루탐산(E), 490번째 아미노산인 아르기닌(R) 또는 510번째 아미노산인 아스파트산(D)이 알라닌(A), 글루타민(Q), 류신(L), 트립토판(W) 또는 발린(V)으로 치환된 것이며,
상기 전사 저해 단백질은 유전자의 전사를 저해 또는 억제하는 단백질 또는 펩타이드이며,
이때, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 다음을 포함하고:
엔지니어링 된 스캐폴드 영역;
스페이서; 및
U-rich tail,
이때, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA의 5'말단에서 3'말단 방향으로, 엔지니어링 된 스캐폴드 영역, 스페이서, 및 U-rich tail이 순서대로 연결되어 있고,
상기 스페이서는 10개 이상 50개 이하의 뉴클레오타이드를 포함하며, 상기 표적 서열과 상보적인 서열을 가지고,
상기 U-rich tail의 서열은 (UaN)bUc로 표현되며, 상기 N은 아데노신(A), 유리딘(U), 사이티딘(C), 구아노신(G) 중 하나이고, 상기 a, b, c는 정수이고, a는 1 이상 5 이하, b는 0 이상이고,
상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACCAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 7)과 상이한 것을 특징으로 하며,
상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로 다음 서열이 순서대로 연결된 것임:
5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA-3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 5'-AAGUGGAGAA-3'(서열번호 17), 5'-AAAGUGGAGAA-3'(서열번호 18), 5'-UAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 19), 5'-AUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 20), 5'-GAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 21), 5'-UGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 22), 5'-CUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 23), 5'-ACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 24), 5'-CACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 25), 5'-UCACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 26), 5'-UUCACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 27), 및 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 10)로 이뤄진 군에서 선택된 서열;
5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5'-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', 5'-CCUUAGGUGG-3'(서열번호 342), 5'-CCGUUAGGUGG-3'(서열번호 343), 5'-CCGCUUAGGGUGG-3'(서열번호 344), 5'-CCGCUUUAGAGGUGG-3'(서열번호 345), 5'-CCGCUUUUAGAAGGUGG-3'(서열번호 346), 5'-CCGCUUCUUAGGAAGGUGG-3'(서열번호 347), 5'-CCGCUUCAUUAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 348), 5'-CCGCUUCACUUAGGUGAAGGUGG-3'(서열번호 349), 5'-CCGCUUCACUUAGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 350), 5'-CCGCUUCACCUUAGGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 351), 5'-CCGCUUCACCAUUAGUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 352), 5'-CCGCUUCACCAAUUAGUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 353), 5'-CCGCUUCACCAAAUUAGCUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 354), 5'-CCGCUUCACCAAAAUUAGACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 355), 5'-CCGCUUCACCAAAAGUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 356), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUUAGGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 357), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUUUAGAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 358), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUUAGUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 359), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUUAGUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 360), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUUUAGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 361), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUCUUAGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 362), 및 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 11)로 이뤄진 군에서 선택된 서열;
5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 434), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUUUCGAAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 435), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUUCGAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 436), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUCUUCGGAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 437), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCGAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 438), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUCGGUAACCCUCGA-3'(서열번호 439), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGUUCGUAACCCUCGA-3'(서열번호 440), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUUUCGAACCCUCGA-3'(서열번호 441), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUUCGACCCUCGA-3'(서열번호 442), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUUCGCCCUCGA-3'(서열번호 443), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAUUCGCCCUCGA-3'(서열번호 444), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAUUCGCCUCGA-3'(서열번호 445), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAUUCGCCUCGA-3'(서열번호 446), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGUUCGCUCGA-3'(서열번호 447), 및 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 12)로 이뤄진 군에서 선택된 서열;
5'-AACAAAGAAAGGA-3'(서열번호 111), 5'-AACAAAUGAAAAGGA-3'(서열번호 112), 5'-AACAAAUUGAAAAAGGA-3'(서열번호 113), 5'-AACAAAUUCGAAAGAAGGA-3'(서열번호 114), 5'-AACAAAUUCAGAAAUGAAGGA-3'(서열번호 115), 5'-AACAAAUUCAUGAAAAUGAAGGA-3'(서열번호 116), 5'-AACAAAUUCAUUGAAAAAUGAAGGA-3'(서열번호 117), 및 5'-AACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGA-3'(서열번호 118)에서 선택된 서열; 및
5'-AUGCAAC-3'.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 명세서에서는 다음을 포함하는, 세포 내에서 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공한다:
전사 저해 Cas12f1 융합 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산; 및 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산을 세포 내로 전달하는 것,
이로 인해 상기 세포 내에서 CRISPR interference 복합체가 형성될 수 있으며,
이로 인해 상기 표적 유전자의 전사가 CRISPR interference 복합체에 의해 억제될 수 있고,
이때, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 dead Cas12f1(dCas12f1) 단백질 및 전사 저해 단백질을 포함하고,
상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질을 구성하는 아미노산 서열 중 326번째 아미노산인 아스파트산(D), 422번째 아미노산인 글루탐산(E), 490번째 아미노산인 아르기닌(R) 또는 510번째 아미노산인 아스파트산(D)이 알라닌(A), 글루타민(Q), 류신(L), 트립토판(W) 또는 발린(V)으로 치환된 것이며,
상기 전사 저해 단백질은 유전자의 전사를 저해 또는 억제하는 단백질 또는 펩타이드이며,
이때, 엔지니어링 된 가이드 Cas12f1 RNA는 다음을 포함하고:
엔지니어링 된 스캐폴드 영역;
스페이서; 및
U-rich tail,
이때, 상기 엔지니어링 된 가이드 Cas12f1 RNA의 5'말단에서 3'말단 방향으로, 엔지니어링 된 스캐폴드 영역, 스페이서, 및 U-rich tail이 순서대로 연결되어 있고,
상기 스페이서는 10개 이상 50개 이하의 뉴클레오타이드를 포함하며, 표적 서열과 상보적인 서열을 가지고,
상기 U-rich tail의 서열은 (UaN)bUc로 표현되며, 상기 N은 아데노신(A), 유리딘(U), 사이티딘(C), 구아노신(G) 중 하나이고, 상기 a, b, c는 정수이고, a는 1 이상 5 이하, b는 0 이상이고,
상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACCAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 7)과 상이한 것을 특징으로 하며,
상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로 다음 서열이 순서대로 연결된 것임:
5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA-3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 5'-AAGUGGAGAA-3'(서열번호 17), 5'-AAAGUGGAGAA-3'(서열번호 18), 5'-UAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 19), 5'-AUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 20), 5'-GAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 21), 5'-UGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 22), 5'-CUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 23), 5'-ACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 24), 5'-CACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 25), 5'-UCACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 26), 5'-UUCACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 27), 및 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 10)로 이뤄진 군에서 선택된 서열;
5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5'-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', 5'-CCUUAGGUGG-3'(서열번호 342), 5'-CCGUUAGGUGG-3'(서열번호 343), 5'-CCGCUUAGGGUGG-3'(서열번호 344), 5'-CCGCUUUAGAGGUGG-3'(서열번호 345), 5'-CCGCUUUUAGAAGGUGG-3'(서열번호 346), 5'-CCGCUUCUUAGGAAGGUGG-3'(서열번호 347), 5'-CCGCUUCAUUAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 348), 5'-CCGCUUCACUUAGGUGAAGGUGG-3'(서열번호 349), 5'-CCGCUUCACUUAGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 350), 5'-CCGCUUCACCUUAGGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 351), 5'-CCGCUUCACCAUUAGUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 352), 5'-CCGCUUCACCAAUUAGUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 353), 5'-CCGCUUCACCAAAUUAGCUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 354), 5'-CCGCUUCACCAAAAUUAGACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 355), 5'-CCGCUUCACCAAAAGUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 356), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUUAGGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 357), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUUUAGAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 358), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUUAGUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 359), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUUAGUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 360), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUUUAGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 361), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUCUUAGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 362), 및 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 11)로 이뤄진 군에서 선택된 서열;
5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 434), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUUUCGAAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 435), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUUCGAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 436), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUCUUCGGAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 437), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCGAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 438), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUCGGUAACCCUCGA-3'(서열번호 439), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGUUCGUAACCCUCGA-3'(서열번호 440), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUUUCGAACCCUCGA-3'(서열번호 441), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUUCGACCCUCGA-3'(서열번호 442), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUUCGCCCUCGA-3'(서열번호 443), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAUUCGCCCUCGA-3'(서열번호 444), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAUUCGCCUCGA-3'(서열번호 445), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAUUCGCCUCGA-3'(서열번호 446), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGUUCGCUCGA-3'(서열번호 447), 및 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 12)로 이뤄진 군에서 선택된 서열;
5'-AACAAAGAAAGGA-3'(서열번호 111), 5'-AACAAAUGAAAAGGA-3'(서열번호 112), 5'-AACAAAUUGAAAAAGGA-3'(서열번호 113), 5'-AACAAAUUCGAAAGAAGGA-3'(서열번호 114), 5'-AACAAAUUCAGAAAUGAAGGA-3'(서열번호 115), 5'-AACAAAUUCAUGAAAAUGAAGGA-3'(서열번호 116), 5'-AACAAAUUCAUUGAAAAAUGAAGGA-3'(서열번호 117), 및 5'-AACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGA-3'(서열번호 118)에서 선택된 서열; 및
5'-AUGCAAC-3'.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 명세서는 다음을 포함하는, 표적 유전자의 발현을 촉진하기 위한, 유전자 발현 조절용 조성물을 제공한다:
전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산; 및
엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산,
이때, 상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질은 dead Cas12f1(dCas12f1) 단백질 및 전사 활성 단백질을 포함하고,
상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질을 구성하는 아미노산 서열 중 326번째 아미노산인 아스파트산(D), 422번째 아미노산인 글루탐산(E), 490번째 아미노산인 아르기닌(R) 또는 510번째 아미노산인 아스파트산(D)이 알라닌(A), 글루타민(Q), 류신(L), 트립토판(W) 또는 발린(V)으로 치환된 것이며,
상기 전사 활성 단백질은 인핸서 또는 프로모터 근위 요소(promoter-proximal element)에 결합할 수 있는 DNA 결합 단백질 또는 DNA 결합 펩타이드이며,
이때, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 다음을 포함하고:
엔지니어링 된 스캐폴드 영역;
스페이서; 및
U-rich tail,
이때, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA의 5'말단에서 3'말단 방향으로, 엔지니어링 된 스캐폴드 영역, 스페이서, 및 U-rich tail이 순서대로 연결되어 있고,
상기 스페이서는 10개 이상 50개 이하의 뉴클레오타이드를 포함하며, 상기 표적 서열과 상보적인 서열을 가지고,
상기 U-rich tail의 서열은 (UaN)bUc로 표현되며, 상기 N은 아데노신(A), 유리딘(U), 사이티딘(C), 구아노신(G) 중 하나이고, 상기 a, b, c는 정수이고, a는 1 이상 5 이하, b는 0 이상이고,
상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACCAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 7)과 상이한 것을 특징으로 하며,
상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로 다음 서열이 순서대로 연결된 것임:
5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA-3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 5'-AAGUGGAGAA-3'(서열번호 17), 5'-AAAGUGGAGAA-3'(서열번호 18), 5'-UAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 19), 5'-AUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 20), 5'-GAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 21), 5'-UGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 22), 5'-CUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 23), 5'-ACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 24), 5'-CACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 25), 5'-UCACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 26), 5'-UUCACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 27), 및 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 10)로 이뤄진 군에서 선택된 서열;
5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5'-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', 5'-CCUUAGGUGG-3'(서열번호 342), 5'-CCGUUAGGUGG-3'(서열번호 343), 5'-CCGCUUAGGGUGG-3'(서열번호 344), 5'-CCGCUUUAGAGGUGG-3'(서열번호 345), 5'-CCGCUUUUAGAAGGUGG-3'(서열번호 346), 5'-CCGCUUCUUAGGAAGGUGG-3'(서열번호 347), 5'-CCGCUUCAUUAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 348), 5'-CCGCUUCACUUAGGUGAAGGUGG-3'(서열번호 349), 5'-CCGCUUCACUUAGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 350), 5'-CCGCUUCACCUUAGGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 351), 5'-CCGCUUCACCAUUAGUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 352), 5'-CCGCUUCACCAAUUAGUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 353), 5'-CCGCUUCACCAAAUUAGCUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 354), 5'-CCGCUUCACCAAAAUUAGACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 355), 5'-CCGCUUCACCAAAAGUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 356), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUUAGGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 357), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUUUAGAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 358), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUUAGUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 359), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUUAGUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 360), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUUUAGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 361), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUCUUAGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 362), 및 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 11)로 이뤄진 군에서 선택된 서열;
5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 434), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUUUCGAAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 435), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUUCGAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 436), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUCUUCGGAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 437), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCGAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 438), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUCGGUAACCCUCGA-3'(서열번호 439), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGUUCGUAACCCUCGA-3'(서열번호 440), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUUUCGAACCCUCGA-3'(서열번호 441), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUUCGACCCUCGA-3'(서열번호 442), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUUCGCCCUCGA-3'(서열번호 443), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAUUCGCCCUCGA-3'(서열번호 444), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAUUCGCCUCGA-3'(서열번호 445), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAUUCGCCUCGA-3'(서열번호 446), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGUUCGCUCGA-3'(서열번호 447), 및 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 12)로 이뤄진 군에서 선택된 서열;
5'-AACAAAGAAAGGA-3'(서열번호 111), 5'-AACAAAUGAAAAGGA-3'(서열번호 112), 5'-AACAAAUUGAAAAAGGA-3'(서열번호 113), 5'-AACAAAUUCGAAAGAAGGA-3'(서열번호 114), 5'-AACAAAUUCAGAAAUGAAGGA-3'(서열번호 115), 5'-AACAAAUUCAUGAAAAUGAAGGA-3'(서열번호 116), 5'-AACAAAUUCAUUGAAAAAUGAAGGA-3'(서열번호 117), 및 5'-AACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGA-3'(서열번호 118)에서 선택된 서열; 및
5'-AUGCAAC-3'.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 명세서에서는 다음을 포함하는, 세포 내에서 표적 유전자의 발현을 촉진하는 방법을 제공한다:
전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산; 및 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산을 세포 내로 전달하는 것,
이로 인해 상기 세포 내에서 CRISPR activation 복합체가 형성될 수 있으며,
이로 인해 상기 표적 유전자의 전사가 CRISPR activation 복합체에 의해 억제될 수 있고,
이때, 상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질은 dead Cas12f1(dCas12f1) 단백질 및 전사 활성 단백질을 포함하고,
상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질을 구성하는 아미노산 서열 중 326번째 아미노산인 아스파트산(D), 422번째 아미노산인 글루탐산(E), 490번째 아미노산인 아르기닌(R) 또는 510번째 아미노산인 아스파트산(D)이 알라닌(A), 글루타민(Q), 류신(L), 트립토판(W) 또는 발린(V)으로 치환된 것이며,
상기 전사 활성 단백질은 인핸서 또는 프로모터 근위 요소(promoter-proximal element)에 결합할 수 있는 DNA 결합 단백질 또는 DNA 결합 펩타이드이며,
이때, 엔지니어링 된 가이드 Cas12f1 RNA는 다음을 포함하고:
엔지니어링 된 스캐폴드 영역;
스페이서; 및
U-rich tail,
이때, 상기 엔지니어링 된 가이드 Cas12f1 RNA의 5'말단에서 3'말단 방향으로, 엔지니어링 된 스캐폴드 영역, 스페이서, 및 U-rich tail이 순서대로 연결되어 있고,
상기 스페이서는 10개 이상 50개 이하의 뉴클레오타이드를 포함하며, 표적 서열과 상보적인 서열을 가지고,
상기 U-rich tail의 서열은 (UaN)bUc로 표현되며, 상기 N은 아데노신(A), 유리딘(U), 사이티딘(C), 구아노신(G) 중 하나이고, 상기 a, b, c는 정수이고, a는 1 이상 5 이하, b는 0 이상이고,
상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACCAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 7)과 상이한 것을 특징으로 하며,
상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로 다음 서열이 순서대로 연결된 것임:
5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA-3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 5'-AAGUGGAGAA-3'(서열번호 17), 5'-AAAGUGGAGAA-3'(서열번호 18), 5'-UAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 19), 5'-AUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 20), 5'-GAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 21), 5'-UGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 22), 5'-CUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 23), 5'-ACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 24), 5'-CACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 25), 5'-UCACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 26), 5'-UUCACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 27), 및 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 10)로 이뤄진 군에서 선택된 서열;
5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5'-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', 5'-CCUUAGGUGG-3'(서열번호 342), 5'-CCGUUAGGUGG-3'(서열번호 343), 5'-CCGCUUAGGGUGG-3'(서열번호 344), 5'-CCGCUUUAGAGGUGG-3'(서열번호 345), 5'-CCGCUUUUAGAAGGUGG-3'(서열번호 346), 5'-CCGCUUCUUAGGAAGGUGG-3'(서열번호 347), 5'-CCGCUUCAUUAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 348), 5'-CCGCUUCACUUAGGUGAAGGUGG-3'(서열번호 349), 5'-CCGCUUCACUUAGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 350), 5'-CCGCUUCACCUUAGGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 351), 5'-CCGCUUCACCAUUAGUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 352), 5'-CCGCUUCACCAAUUAGUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 353), 5'-CCGCUUCACCAAAUUAGCUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 354), 5'-CCGCUUCACCAAAAUUAGACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 355), 5'-CCGCUUCACCAAAAGUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 356), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUUAGGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 357), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUUUAGAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 358), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUUAGUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 359), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUUAGUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 360), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUUUAGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 361), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUCUUAGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 362), 및 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 11)로 이뤄진 군에서 선택된 서열;
5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 434), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUUUCGAAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 435), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUUCGAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 436), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUCUUCGGAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 437), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCGAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 438), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUCGGUAACCCUCGA-3'(서열번호 439), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGUUCGUAACCCUCGA-3'(서열번호 440), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUUUCGAACCCUCGA-3'(서열번호 441), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUUCGACCCUCGA-3'(서열번호 442), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUUCGCCCUCGA-3'(서열번호 443), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAUUCGCCCUCGA-3'(서열번호 444), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAUUCGCCUCGA-3'(서열번호 445), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAUUCGCCUCGA-3'(서열번호 446), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGUUCGCUCGA-3'(서열번호 447), 및 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 12)로 이뤄진 군에서 선택된 서열;
5'-AACAAAGAAAGGA-3'(서열번호 111), 5'-AACAAAUGAAAAGGA-3'(서열번호 112), 5'-AACAAAUUGAAAAAGGA-3'(서열번호 113), 5'-AACAAAUUCGAAAGAAGGA-3'(서열번호 114), 5'-AACAAAUUCAGAAAUGAAGGA-3'(서열번호 115), 5'-AACAAAUUCAUGAAAAUGAAGGA-3'(서열번호 116), 5'-AACAAAUUCAUUGAAAAAUGAAGGA-3'(서열번호 117), 및 5'-AACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGA-3'(서열번호 118)에서 선택된 서열; 및
5'-AUGCAAC-3'.
본 명세서에서 제공하는 Cas12f1 융합 단백질 및 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR 발현 조절 시스템을 이용하면, 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 구체적으로, 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질 및 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR 발현 조절 시스템을 사용하는 경우, 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 또한, 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 및 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR 발현 조절 시스템을 사용하는 경우, 표적 유전자의 발현을 촉진할 수 있다.
도 1은 본 명세서에서 개시하는 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 예시적으로 나타낸 모식도이다.
도 2 내지 도 5는 실험예 2에 개시된 실시예 중, DY2를 표적으로 하는 Example 1.1.1 내지 Example 1.1.13에 대한 평균 indel 효율을 나타낸 그래프이다. 이때, Ex는 Example, Comp는 Comparative Example을 나타내는 약어이며, Control은 음성 대조군을 나타낸다.
도 6 내지 도 9는 실험예 2에 개시된 실시예 중, DY10을 표적으로 하는 Example 1.2.1 내지 Example 1.2.13에 대한 평균 indel 효율을 나타낸 그래프이다. 이때, Ex 는 Example, Comp는 Comparative Example을 나타내는 약어이며, Control은 음성 대조군을 나타낸다.
도 10 내지 도 13은 실험예 2에 개시된 실시예 중, Intergenic22를 표적으로 하는 Example 1.3.1 내지 Example 1.3.13에 대한 평균 indel 효율을 나타낸 그래프이다. 이때, Ex 는 Example, Comp는 Comparative Example을 나타내는 약어이며, Control은 음성 대조군을 나타낸다.
도 14 내지 도 15는 실험예 2에 개시된 실시예 중, DY2를 표적으로 하는 Comparative Example 1.1.1, DY10을 표적으로 하는 Comparative Example 1.2.1, 및 각각의 Control의 Indel 효율을 나타낸 그래프이다.
도 16 내지 도 17은 실험예 3.1에 개시된 실시예 중 DY2를 표적으로 하는 Example 2.1.1 내지 Example 2.1.15에 대한 평균 indel 효율을 나타낸 그래프이다. 이때, Ex는 Example을 나타내는 약어이다.
도 18 내지 도 19는 실험예 3.1에 개시된 실시예 중, DY10을 표적으로 하는 Example 2.2.1 내지 Example 2.2.15에 대한 평균 indel 효율을 나타낸 그래프이다. 이때, Ex는 Example을 나타내는 약어이다.
도 20 내지 도 21은 실험예 3.2에 개시된 실시예 중 DY2를 표적으로 하는 Example 3.1.1 내지 Example 3.1.12에 대한 평균 indel 효율을 나타낸 그래프이다. 이때, Ex는 Example을 나타내는 약어이다.
도 22 내지 도 23는 실험예 3.2에 개시된 실시예 중, DY10을 표적으로 하는 Example 3.2.1 내지 Example 3.2.12에 대한 평균 indel 효율을 나타낸 그래프이다. 이때, Ex는 Example을 나타내는 약어이다.
도 24 내지 도 26은 실험예 4.1에 개시된 각각의 실시예에 대한 평균 indel 효율을 나타낸 그래프이다. FUS를 표적으로 하는 Example 4.4.1 내지 Example 4.4.4, GAK를 표적으로 하는 Example 4.5.1 내지 Example 4.5.2, 및 MLH를 표적으로 하는 Example 4.6.1에 대한 평균 indel 효율이 각각 도시되어 있다. 이때, Ex는 Example을 나타내는 약어이다.
도 27은 실험예 5의 Large scale validation 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 28은 실험예 6의 in vitro cleavage assay 결과를 나타낸 것이다.
도 29는 다양한 dead Cas12f1의 cleavage 활성 제거 유무를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 30은 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 다양한 모듈 설계를 모식화하여 나타낸 것이다.
도 31은 다양하게 설계된 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질을 이용한 표적 유전자의 발현 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 32는 다양하게 설계된 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질을 이용한 표적 유전자의 발현 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 33은 다양하게 설계된 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질을 이용한 표적 유전자의 발현 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 34는 다양하게 설계된 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질을 이용한 표적 유전자의 발현 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 35는 KRAB을 포함하는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질을 이용한 표적 유전자의 발현 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 36은 DNMT를 포함하는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질을 이용한 표적 유전자의 발현 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 37은 KRAB과 MeCP2를 포함하는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질을 이용한 표적 유전자의 발현 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 38은 KRAB을 포함하는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질을 이용한 표적 유전자의 발현 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 39는 KRAB과 MeCP2를 포함하는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질을 이용한 표적 유전자의 발현 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 40은 복수 개의 KRAB을 포함하는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질을 이용한 표적 유전자의 발현 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 41은 복수 개의 KRAB과 MeCP2를 포함하는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질을 이용한 표적 유전자의 발현 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 42는 HDAC를 포함하는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질을 이용한 표적 유전자의 발현 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 43은 KRAB과 MeCP2를 포함하는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질을 이용한 표적 유전자의 발현 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 44는 복수 개의 KRAB과 MeCP2를 포함하는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질을 이용한 표적 유전자의 발현 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 45는 KRAB과 MeCP2를 포함하는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질을 이용한 표적 유전자의 발현 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 46은 PCSK9 유전자의 발현 저해 효과를 확인하기 위해 promoter에 위치하는 타겟을 선정하여 indel 효율을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 47은 타겟팅 효율을 높이기 위하여 guide RNA optimization, spacer optimization한 결과를 나타낸 것이다.
도 48은 타겟팅 효율을 높이기 위하여 guide RNA optimization, spacer optimization한 결과를 나타낸 것이다.
도 49는 최적의 guide RNA를 이용해 PCSK9 유전자의 promoter에 위치하는 타겟에 대한 indel 효율을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 50은 다양하게 설계된 CRISPR 발현 조절 시스템을 이용하여 HepG2 세포에서 PCSK9 유전자 발현 저해를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 51은 다양하게 설계된 CRISPR 발현 조절 시스템을 이용하여 Hep3B 세포에서 PCSK9 유전자 발현 저해를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 52는 다양하게 설계된 CRISPR 발현 조절 시스템을 이용하여 Huh7 세포에서 PCSK9 유전자 발현 저해를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 53은 다양하게 설계된 CRISPR 발현 조절 시스템을 이용하여 HepG2 세포에서 PCSK9 유전자 발현 저해를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 54는 VP64를 포함하는 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질의 모식도를 나태난 것이다.
도 55는 VP64를 포함하는 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질을 포함하는 CRISPR 발현 조절 시스템을 이용하여 OCT4 유전자의 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
약
본 명세서에서 사용되는 '약'이라는 용어는 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치구, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
A,T,C,G, 및 U
본 명세서에서 사용되는 A, T, C, G 및 U 기호는 당업계 통상의 기술자가 이해하는 의미로 해석된다. 문맥 및 기술에 따라 DNA 또는 RNA 상에서 염기, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드로 적절히 해석될 수 있다. 예를 들어, 염기를 의미하는 경우는 각각 아데닌(A), 티민(T), 시토신(C), 구아닌(G) 또는 우라실(U) 자체로 해석될 수 있고, 뉴클레오사이드를 의미하는 경우는 각각 아데노신(A), 티미딘(T), 시티딘(C), 구아노신(G) 또는 유리딘(U)으로 해석될 수 있으며, 서열에서 뉴클레오타이드를 의미하는 경우는 상기 각각의 뉴클레오사이드를 포함하는 뉴클레오타이드를 의미하는 것으로 해석되어야 한다.
작동 가능하게 연결된(operably linked)
본 명세서에서 사용되는 "작동 가능하게 연결된"이라는 용어는 유전자 발현 기술에 있어서, 특정 구성이 다른 구성과 연결되어, 상기 특정 구성이 의도된 방식대로 기능할 수 있도록 연결되어 있는 것을 의미한다. 예를 들어, 프로모터 서열이 암호화 서열과 작동적으로 연결되었다고 할 때, 상기 프로모터가 상기 암호화 서열의 세포 내에서의 전사 및/또는 발현에 영향을 미칠 수 있도록 연결된 것을 의미한다. 또한, 상기 용어는 당업계 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함하며, 문맥에 따라 적절히 해석될 수 있다.
표적 유전자 또는 표적 핵산
본 명세서에서 사용되는 "표적 유전자" 또는 "표적 핵산"은 기본적으로, 유전자 발현 조절의 대상이 되는 세포 내 유전자, 또는 핵산을 의미한다. 상기 표적 유전자 또는 표적 핵산은 혼용될 수 있으며, 서로 동일한 대상을 지칭할 수 있다. 상기 표적 유전자 또는 표적 핵산은 달리 기재되지 않은 한, 대상 세포가 가진 고유한 유전자 또는 핵산, 혹은 외부 유래의 유전자 또는 핵산 모두를 의미할 수 있으며, 유전자 발현 조절의 대상이 될 수 있다면 특별히 제한되지 않는다. 상기 표적 유전자 또는 표적 핵산은 단일가닥 DNA, 이중가닥 DNA, 및/또는 RNA일 수 있다. 또한, 상기 용어는 당업계 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함하며, 문맥에 따라 적절히 해석될 수 있다.
표적 서열
본 명세서에서 사용되는 "표적 서열"은 CRISPR activation 복합체 또는 CRISPR interference 복합체가 표적 유전자 또는 표적 핵산의 발현을 조절하기 위해 인식하는 특정 서열을 의미한다. 상기 표적 서열은 그 목적에 따라 적절히 선택될 수 있다. 구체적으로, "표적 서열"은 표적 유전자 또는 표적 핵산 서열 내에 포함된 서열이며, 본 명세서에서 제공하는 가이드 RNA, 또는 엔지니어링 된 가이드 RNA에 포함된 스페이서 서열과 상보성을 가지는 서열을 의미한다. 일반적으로, 상기 스페이서 서열은 표적 유전자 또는 표적 핵산의 서열 및 Cas12f1 융합 단백질이 인식하는 PAM 서열을 고려하여 결정된다. 상기 표적 서열은 CRISPR activation 복합체 또는 CRISPR interference 복합체의 가이드 RNA와 상보적으로 결합하는 특정 가닥만을 지칭할 수 있으며, 상기 특정 가닥 부분을 포함하는 표적 이중 가닥 전체를 지칭할 수도 있으며, 이는 문맥에 따라 적절히 해석된다. 또한, 상기 용어는 당업계 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함하며, 문맥에 따라 적절히 해석될 수 있다.
벡터
본 명세서에서 사용되는 "벡터"는 달리 특정되지 않는 한, 유전 물질을 세포 내로 운반할 수 있는 모든 물질을 통틀어 일컫는다. 예를 들어, 벡터는 대상이 되는 유전 물질, 예를 들어 CRISPR 발현 조절 시스템의 Cas12f1 융합 단백질을 암호화하는 핵산, 및/또는 가이드 RNA를 암호화하는 핵산을 포함하는 DNA 분자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 용어는 당업계 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함하며, 문맥에 따라 적절히 해석될 수 있다.
자연계에서 발견되는
본 명세서에서 "자연계에서 발견되는" 이라는 용어는, 자연계에서 발견되는, 변형되지 않은 대상을 의미하며, 인위적인 변형이 가해진 "엔지니어링 된 대상"과 구분하기 위해 사용된다. 상기 "자연계에서 발견되는" 유전자, 핵산, DNA, RNA 등은 야생형 및 mature form (active form)의 유전자, 핵산, DNA, RNA를 모두 포괄하는 개념으로 사용된다. 상기 용어는 그 외 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함하며, 문맥에 따라 적절히 해석되어야 한다.
엔지니어링 된
본 명세서에서 사용되는 "엔지니어링 된"이란 용어는 자연계에 이미 존재하는 구성을 가진 물질, 분자 등과 구분하기 위해 사용하는 용어로, 상기 물질, 분자 등에 인위적인 변형이 가해진 것을 의미한다. 예를 들어, "엔지니어링 된 가이드 RNA"의 경우, 자연계에 존재하는 가이드 RNA의 구성에 인위적인 변경이 가해진 가이드 RNA를 의미한다. 또한, 상기 용어는 당업계 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함하며, 문맥에 따라 적절히 해석될 수 있다.
NLS(Nuclear Localization Sequence, or Signal)
본 명세서에서 "NLS"라 함은, 핵 수송(nuclear transport) 작용으로 세포 핵 외부의 물질을 핵 내부로 수송할 때, 수송 대상인 단백질에 붙어 일종의 "태그"역할을 하는 일정 길이의 펩타이드, 또는 그 서열을 의미한다. 구체적으로, 상기 NLS는 아미노산 서열 PKKKRKV(서열번호 278)을 갖는 SV40 바이러스 대형 T-항원의 NLS; 뉴클레오플라스민(nucleoplasmin)으로부터의 NLS(예를 들어, 서열 KRPAATKKAGQAKKKK(서열번호 279)를 갖는 뉴클레오플라스민 이분(bipartite) NLS); 아미노산 서열 PAAKRVKLD(서열번호 280) 또는 RQRRNELKRSP(서열번호 281)를 갖는 c-myc NLS; 서열 NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY(서열번호 282)를 갖는 hRNPA1 M9 NLS; 임포틴-알파로부 터의 IBB 도메인의 서열 RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV(서열번호 283); 마이오 마(myoma) T 단백질의 서열 VSRKRPRP(서열번호 284) 및 PPKKARED(서열번호 285); 인간 p53의 서열 PQPKKKPL(서열번호 286); 마우스 c-abl IV의 서열 SALIKKKKKMAP(서열번호 287); 인플루엔자 바이러스 NS1의 서열 DRLRR(서열번호 288) 및 PKQKKRK(서열번호 289); 간염 바이러스 델타 항원의 서열 RKLKKKIKKL(서열번호 290); 마우스 Mx1 단백질의 서열 REKKKFLKRR(서열번호 291); 인간 폴리(ADP-리보스) 중합효소의 서열 KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(서열번호 292); 또는 스테로이드 호르몬 수용체(인간) 글루코코르티코이드의 서열 RKCLQAGMNLEARKTKK(서열번호 293)로부터 유래된 NLS 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에서 사용되는 "NLS"라는 용어는 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함하며, 문맥에 따라 적절하게 해석될 수 있다.
NES(Nuclear Export Sequence, or Signal)
본 명세서에서 "NES"라 함은, 핵 수송(nuclear transport) 작용으로 세포 핵 내부의 물질을 핵 외부로 수송할 때, 수송 대상인 단백질에 붙어 일종의 "태그"역할을 하는 일정 길이의 펩타이드, 또는 그 서열을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 "NES"라는 용어는 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함하며, 문맥에 따라 적절하게 해석될 수 있다.
태그
본 명세서에서 "태그"라 함은, 펩타이드, 또는 단백질의 추적 및/또는 분리정제를 쉽게 하기 위하여 부가되는 기능적 도메인을 통틀어 일컫는다. 구체적으로, 상기 태그는 히스티딘(His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루 티닌(HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그 및 티오레독신(Trx) 태그 등의 태그 단백질, 녹색 형광 단백질(GFP), 황색 형광 단백질(YFP), 청록색 형관 단백질(CFP), 청색 형광 단백질(BFP), HcRED, DsRed 등의 자가형광 단백질, 및 글루타티온-S-트랜스 퍼라제(GST), 호스라디시(horseradish) 과산화효소(HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 베타-갈락토시다제, 베타 -글루쿠로니다제, 루시퍼라제 등의 리포터 유전자를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서 사용되는 "태그"라는 용어는 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함하며, 문맥에 따라 적절하게 해석될 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사 또는 동일한 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 이하에 기재된다. 본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 및 기타 다른 참고문헌은 전체가 참고로 포함된다. 추가로, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적이며, 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
이하 본 발명을 설명한다.
배경기술 - CRISPR/Cas12f1 시스템
CRISPR/Cas12f1 시스템
CRISPR/Cas12f 시스템은 type V CRISPR/Cas 시스템 중 V-F 서브타입에 속하고, 이는 다시 V-F1 내지 V-F3의 베리언트로 나뉜다. CRISPR/Cas12f 시스템은 선행연구(Harrington et al., Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes, Science 362, 839-842 (2018))에서 Cas14로 명명된 이펙터 단백질 중, Cas14a, Cas14b, 및 Cas14c 변이체를 포함하는 CRISPR/Cas14 시스템을 포함한다. 이 중, Cas14a 이펙터 단백질을 포함하는 CRISPR/Cas14a 시스템은 CRISPR/Cas12f1 시스템으로 분류된다(Makarova et al., Nature Reviews, Microbiology volume 18, 67 (2020)). 최근 선행 연구(Takeda et al., Structure of the miniature type V-F CRISPR-Cas effector enzyme, Molecular Cell 81, 1-13 (2021), Xiao et al., Structural basis for the dimerization-dependent CRISPR-Cas12f nuclease, bioRxiv (2020)) 등을 통해 상기 CRISPR/Cas12f1 복합체의 구조가 밝혀졌다.
CRISPR/Cas12f1 시스템을 이용한 CRIPSR 조절 시스템
상기 CRISPR/Cas12f1 시스템은 CRISPR/Cas9 시스템에 비하여 Cas12f1 단백질의 크기가 현저히 작다는 특징이 있다. 이러한 특징은 기존에 연구된 대부분의 Cas 뉴클레아제의 크기로 인한 융합 단백질 개발의 어려움, AAV (아데노 관련 바이러스)에 탑재의 어려움 및 이로 인한 치료제로서 적용 어려움을 해결 가능하게 한다. 하지만 이러한 장점에도 불구하고, 선행 연구(Harrington et al., Science 362, 839-842 (2018), Tautvydas Karvelis et al., Nucleic Acids Research 48, 5016-5023 (2020))에서 밝혀진 바로는, 상기 CRISPR/Cas12f1 시스템은 세포 내에서 이중 가닥 DNA에 대한 절단 활성을 보이지 않거나, 절단 활성을 보이더라도 그 효율이 매우 낮아 이를 적극적으로 유전자 편집에 활용하기 힘들다는 한계를 가지고 있었다. 하지만 이러한 한계를 극복하기 위해, 최근 본 발명자들은 CRISPR/Cas12f1 시스템의 세포 내 유전자 편집 활성을 높이기 위한, 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 개발하였다.
따라서, 표적 특이성이 향상된 엔지니어링 된 가이드 RNA 및 작은 크기의 Cas12f1 단백질을 이용한다면, 기존의 Cas9의 큰 크기에 따른 융합 단백질의 개발 및 AAV 벡터 패키징의 어려움으로 효율적으로 사용되기 어려웠던 CRISPR 조절 시스템을 보다 효율적으로 이용할 수 있을 것으로 기대된다.
이하에서, CRISPR/Cas12f1 시스템을 이용한 CRISPR 조절 시스템에 대해 자세히 설명한다.
<CRISPR 조절 시스템(CRISPR regulatory system)>
본 명세서에서는 CRISPR/Cas12f1 시스템을 이용한 CRISPR 조절 시스템을 제공한다. 보다 구체적으로 상기 CRISPR 조절 시스템은 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA와 Cas12f1 융합 단백질을 포함한다. 이때, 상기 CRISPR 조절 시스템은 상기 Cas12f1 융합 단백질에 따라 CRISPR activation 시스템 및 CRISPR interference 시스템으로 구분할 수 있다. 상기 CRISPR activation 시스템은 발현을 조절하고자 하는 대상, 즉, 표적 유전자의 발현을 증가 또는 촉진시키는 역할을 한다. 반면에, 상기 CRISPR interference 시스템은 표적 유전자의 발현을 저해 또는 억제하는 역할을 한다. 이러한 효과는 상기 Cas12f1 융합 단백질에 포함된 발현 조절 도메인에 의한 것으로, 상기 발현 조절 도메인인 전사 활성 단백질 또는 전사 저해 단백질에 따라 CRISPR 조절 시스템의 효과가 달라진다.
상기 CRIPSR 조절 시스템은 Cas12f1 융합 단백질 및 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 포함한다. 이때, 상기 Cas12f1 융합 단백질은 변형된 Cas12f1 단백질 및 발현 조절 도메인을 포함한다. 상기 CRIPSR 조절 시스템은 상기 발현 조절 도메인의 종류에 따라 그 효과가 달라질 수 있다.
일 구현예로, 상기 CRIPSR 조절 시스템은 표적 유전자의 발현을 저해 또는 억제하기 위한 CRISPR interference 시스템일 수 있다. 상기 CRISPR interference 시스템은 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질 및 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 포함하는 것을 특징으로 한다. 이때, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 변형된 Cas12f1 단백질 및 전사 저해 단백질을 포함하는 것을 특징으로 한다.
일 구현예로, 상기 CRIPSR 조절 시스템은 표적 유전자의 발현을 증가 또는 촉진하기 위한 CRISPR activation 시스템일 수 있다. 상기 CRISPR activation 시스템은 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 및 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 포함하는 것을 특징으로 한다. 이때, 상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질은 변형된 Cas12f1 단백질 및 전사 활성 단백질을 포함하는 것을 특징으로 한다.
이하에서 각 구성에 대해 자세히 설명한다.
1. 발현 조절 단백질 - Cas12f1 융합 단백질
본 명세서에서 제공하는 CRISPR 조절 시스템은 Cas12f1 융합 단백질을 포함한다. 상기 Cas12f1 융합 단백질은 표적 유전자의 발현을 조절하는 발현 조절 단백질로서 역할한다. 기본적으로 상기 Cas12f1 융합 단백질은 변형된 Cas12f1 단백질 및 발현 조절 도메인을 포함한다. 상기 CRISPR 조절 시스템은 상기 Cas12f1 융합 단백질의 발현 조절 도메인에 따라 표적 유전자의 발현을 증가 또는 향상시키거나 저해 또는 억제시킬 수 있다. 또한, 상기 Cas12f1 융합 단백질에 포함된 발현 조절 도메인의 종류, 개수, 조합 및 융합 위치에 따라 CRISPR 조절 시스템의 효율에 차이가 생길 수 있다.
본 명세서에서는 CRISPR 조절 시스템을 위한 Cas12f1 융합 단백질을 제공한다. 상기 Cas12f1 융합 단백질은 변형된 Cas12f1 단백질 및 발현 조절 도메인을 포함한다. 상기 변형된 Cas12f1 단백질은 야생형 Cas12f1 단백질 서열에서 적어도 일부 서열이 변형된 것으로, 상기 변형으로 인해 야생형 Cas12f1 단백질과 비교할 때, 기능이 변경된 Cas12f1 변이체인 것을 특징으로 한다. 상기 변형된 Cas12f1 단백질은 표적 핵산 또는 표적 유전자의 이중 가닥을 전부 절단할 수 없도록 기능이 변경된 것을 특징으로 한다. 상기 발현 조절 도메인은 표적 유전자의 전사를 활성화시키거나 또는 저해시키는 단백질인 것을 특징으로 한다.
일 구현예로, 상기 Cas12f1 융합 단백질은 변형된 Cas12f1 단백질 및 전사 활성 단백질를 포함할 수 있다. 이때, 상기 Cas12f1 융합 단백질을 포함하는 CRISPR 조절 시스템은 표적 유전자의 발현을 증가 또는 향상시키는 것을 특징으로 한다.
다른 일 구현예로, 상기 Cas12f1 융합 단백질은 변형된 Cas12f1 단백질 및 전사 저해 단백질를 포함할 수 있다. 이때, 상기 Cas12f1 융합 단백질을 포함하는 CRISPR 조절 시스템은 표적 유전자의 발현을 저해 또는 억제시키는 것을 특징으로 한다.
Cas12f1 융합 단백질의 특징 1 - 변형된 Cas12f1 단백질 포함
본 명세서에서 제공하는 Cas12f1 융합 단백질은 표적 핵산 또는 표적 유전자의 이중 가닥을 절단할 수 없도록 기능이 변경된 변형된 Cas12f1 단백질을 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 변형된 Cas12f1 단백질은 야생형 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열 중 적어도 하나의 아미노산 서열이 변형된 것을 특징으로 한다.
Cas12f1 융합 단백질의 특징 2 - 발현 조절 도메인 포함
본 명세서에서 제공하는 Cas12f1 융합 단백질은 발현 조절 도메인으로 표적 유전자의 전사를 활성화시키거나 또는 저해시키는 단백질을 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 발현 조절 도메인은 전사 활성 단백질 또는 전사 저해 단백질인 것을 특징으로 한다.
일 구현예로, 상기 전사 활성 단백질은 VP64, Sun Tag, VPR(VP64, p65, Rta) 또는 TV(TAL, VP64)일 수 있다.
다른 일 구현예로, 상기 전사 저해 단백질은 KRAB, DNMT, MeCP2, HDAC, LSD, SRDX SALL1 또는 SDS3 일 수 있다.
Cas12f1 융합 단백질의 특징 3 - 다양한 모듈화
본 명세서에서 제공하는 Cas12f1 융합 단백질은 둘 이상의 발현 조절 도메인을 포함할 수 있으며, 이때, 발현 조절 도메인의 종류, 개수, 조합 및 융합 위치를 다양하게 설계 가능한 것을 특징으로 한다. 이러한 Cas12f1 융합 단백질의 다양한 모듈화는 Cas12f1 단백질이 작은 크기를 가진다는 장점을 활용하여 더 효과적인 CRISPR 조절 시스템의 개발을 가능하게 한다. 다양한 모듈화에 따라 CRISPR 조절 시스템의 효율에 차이가 생길 수 있으며, 표적 유전자에 따라 다양한 모듈화를 통해 최적의 Cas12f1 융합 단백질을 포함하는 CRISPR 조절 시스템을 설계할 수 있다.
일 구현예로, 상기 Cas12f1 융합 단백질은 변형된 Cas12f1 단백질 및 둘 이상의 전사 저해 단백질을 포함할 수 있다. 이때, 상기 둘 이상의 전사 저해 단백질은 서로 다른 단백질일 수 있다. 이때, 상기 서로 다른 전사 저해 단백질은 모두 상기 변형된 Cas12f1 단백질의 N 말단에 위치할 수 있다. 또는, 상기 서로 다른 전사 저해 단백질은 모두 상기 변형된 Cas12f1 단백질의 C 말단에 위치할 수 있다. 또는, 상기 서로 다른 전사 저해 단백질은 각각 상기 변형된 Cas12f1 단백질의 N 말단 또는 C 말단에 위치할 수 있다.
Cas12f1 융합 단백질의 특징 4 - 링커 포함
본 명세서에서 제공하는 Cas12f1 융합 단백질은 변형된 Cas12f1 단백질과 발현 조절 도메인을 연결하는 링커를 포함하는 것을 특징으로 한다. 이때, 상기 링커는 변형된 Cas12f1 단백질과 발현 조절 도메인의 기능 및 구조에 영향을 주지 않는 아미노산 서열인 것을 특징으로 한다.
Cas12f1 융합 단백질의 효과
본 명세서에서 제공하는 Cas12f1 융합 단백질을 CRISPR/Cas12f1 시스템에 사용하는 경우, 야생형 Cas12f1 단백질을 사용하는 경우와 달리, 표적 유전자의 이중 가닥 절단 없이 표적 유전자의 발현을 증가 또는 저해시키는 효과가 나타난다. 기존의 CRISPR/Cas12f1 시스템은 유전자 편집 기술 분야(표적 유전자의 넉아웃이나 목적 유전자의 넉인 등)에 활용되고 있는 반면, Cas12f1 융합 단백질을 이용한 CRISPR/Cas12f1 시스템, 즉, CRISPR 조절 시스템은 별도의 유전자 편집(이중 가닥 절단에 따른 핵산 변형 등) 없이 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있어 다양한 유전자 발현 조절 기술에 활용할 수 있게 된다.
Cas12f1 융합 단백질의 용도
본 명세서에서 제공하는 Cas12f1 융합 단백질은 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA와 함께 유전자 발현 조절 용도로 사용될 수 있다. 또한, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 유전자 발현 조절용 조성물을 제조하기 위한 용도로 사용할 수 있다.
이하에서, Cas12f1 융합 단백질의 구성 및 다양한 구현예에 대해 설명한다.
1) 변형된 Cas12f1 단백질
변형된 Cas12f1 단백질 - 개괄
본 명세서에서 제공하는 CRISPR 조절 시스템을 위한 Cas12f1 융합 단백질은 변형된 Cas12f1 단백질이 포함된다. 기본적으로, 상기 변형된 Cas12f1 단백질은 자연계에 존재하는 야생형 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열에서 적어도 하나의 아미노산 서열이 변형된 것일 수 있다. 상기 변형된 Cas12f1 단백질을 암호화하는 서열은 변형된 Cas12f1 단백질에 대해 인간 코돈-최적화된 Cas12f1 서열일 수 있다. 또한, 상기 변형된 Cas12f1 단백질은 자연계에 존재하는 야생형 Cas12f1 단백질의 기능이 변경된 것이다. 구체적으로, 상기 변형된 Cas12f1 단백질은 야생형 Cas12f1 단백질의 표적 핵산 또는 표적 유전자의 이중 가닥 절단 기능이 제거된 것으로, 이하에서, 변형된 Cas12f1 단백질은 "dead Cas12f1 단백질(dCas12f1 단백질)"로 지칭하며 혼용되어 사용된다. 특별히 한정하지 않는 한, 본 명세서에서 "변형된 Cas12f1 단백질"이라고 할 때, 이는 표적 핵산 또는 표적 유전자의 이중 가닥 절단을 할 수 없는 dCas12f1 단백질을 의미한다.
변형된 Cas12f1 단백질 - 야생형 Cas12f1 단백질
본 명세서에서 제공하는 Cas12f1 융합 단백질은 변형된 Cas12f1 단백질을 포함한다. 이때, 상기 변형된 Cas12f1 단백질은 야생형 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상이 변형된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 야생형 Cas12f1 단백질은 Cas14 패밀리(Harrington et al., Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes, Science 362, 839-842 (2018))에서 유래한 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 야생형 Cas12f1 단백질은 Uncultured archaeon 유래의 Cas14a 단백질(Harrington et al., Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes, Science 362, 839-842 (2018))일 수 있다. 일 구현예로, 상기 야생형 Cas12f1 단백질은 야생형 Cas14a1 단백질일 수 있다. 일 구현예로, 상기 야생형 Cas12f1 단백질은 서열번호 260에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
dCas12f1 단백질 - 야생형 Cas12f1 단백질의 기능 변경
본 명세서에서 제공하는 Cas12f1 융합 단백질에 포함된 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 기능이 변경 또는 상실된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 dCas12f1 단백질은 표적 핵산 또는 표적 유전자의 이중 가닥 전부를 절단할 수 없도록 변형된 것일 수 있다.
dCas12f1 단백질 - 변형된 아미노산 서열
본 명세서에서 제공하는 Cas12f1 융합 단백질에 포함된 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질을 구성하는 아미노산 서열 중 적어도 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 따라서, 상기 dCas12f1은 야생형 Cas12f1 단백질과 비교하여 적어도 다른 하나의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질을 구성하는 아미노산 서열 중 490번째 아미노산인 아르기닌(R), 510번째 아미노산인 아스파트산(D), 422번째 아미노산인 글루탐산(E) 및 326번째 아미노산인 아스파트산(D) 중 적어도 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
dCas12f1 단백질 구현예
일 구현예로, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질을 구성하는 아미노산 서열 중 490번째 아미노산인 아르기닌(R)이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 이때, 상기 다른 아미노산은 알라닌(A), 글루타민(Q), 류신(L) 또는 트립토판(W)일 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니다.
일 구현예로, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질을 구성하는 아미노산 서열 중 510번째 아미노산인 아스파트산(D)이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 이때, 상기 다른 아미노산은 알라닌(A), 류신(L) 또는 발린(V)일 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니다.
일 구현예로, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질을 구성하는 아미노산 서열 중 422번째 아미노산인 글루탐산(E)이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 이때, 상기 다른 아미노산은 알라닌(A)일 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니다.
일 구현예로, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질을 구성하는 아미노산 서열 중 326번째 아미노산인 아스파트산(D)이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 이때, 상기 다른 아미노산은 알라닌(A)일 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니다.
dCas12f1 단백질 예시 1
일 구현예로, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질을 구성하는 아미노산 서열 중 490번째 아미노산인 아르기닌(R)이 알라닌(A)으로 치환된 것일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 490번째 알라닌을 가질 수 있다. 상기 dCas12f1 단백질은 서열번호 261에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이러한 상기 dCas12f1 단백질은 "R490A dCas12f1 단백질" 또는 "dCas12f1 R490A 단백질"로 표시할 수 있다.
일 구현예로, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질을 구성하는 아미노산 서열 중 490번째 아미노산인 아르기닌(R)이 글루타민(Q)으로 치환된 것일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 490번째 글루타민을 가질 수 있다. 상기 dCas12f1 단백질은 서열번호 262에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이러한 상기 dCas12f1 단백질은 "R490Q dCas12f1 단백질" 또는 "dCas12f1 R490Q 단백질"로 표시할 수 있다.
일 구현예로, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질을 구성하는 아미노산 서열 중 490번째 아미노산인 아르기닌(R)이 류신(L)으로 치환된 것일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 490번째 류신을 가질 수 있다. 상기 dCas12f1 단백질은 서열번호 264에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이러한 상기 dCas12f1 단백질은 "R490L dCas12f1 단백질" 또는 "dCas12f1 R490L 단백질"로 표시할 수 있다.
일 구현예로, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질을 구성하는 아미노산 서열 중 490번째 아미노산인 아르기닌(R)이 트립토판(W)으로 치환된 것일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 490번째 트립토판을 가질 수 있다. 상기 dCas12f1 단백질은 서열번호 265에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이러한 상기 dCas12f1 단백질은 "R490W dCas12f1 단백질" 또는 "dCas12f1 R490W 단백질"로 표시할 수 있다.
dCas12f1 단백질 예시 2
일 구현예로, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질을 구성하는 아미노산 서열 중 510번째 아미노산인 아스파트산(D)이 알라닌(A)으로 치환된 것일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 510번째 알라닌을 가질 수 있다. 상기 dCas12f1 단백질은 서열번호 266에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이러한 상기 dCas12f1 단백질은 "D510A dCas12f1 단백질" 또는 "dCas12f1 D510A 단백질"로 표시할 수 있다.
일 구현예로, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질을 구성하는 아미노산 서열 중 510번째 아미노산인 아스파트산(D)이 류신(L)으로 치환된 것일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 510번째 류신을 가질 수 있다. 상기 dCas12f1 단백질은 서열번호 267에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이러한 상기 dCas12f1 단백질은 "D510L dCas12f1 단백질" 또는 "dCas12f1 D510L 단백질"로 표시할 수 있다.
일 구현예로, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질을 구성하는 아미노산 서열 중 510번째 아미노산인 아스파트산(D)이 발린(V)으로 치환된 것일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 510번째 발린을 가질 수 있다. 상기 dCas12f1 단백질은 서열번호 268에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이러한 상기 dCas12f1 단백질은 "D510V dCas12f1 단백질" 또는 "dCas12f1 D510V 단백질"로 표시할 수 있다.
dCas12f1 단백질 예시 3
일 구현예로, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질을 구성하는 아미노산 서열 중 422번째 아미노산인 글루탐산(E)이 알라닌(A)으로 치환된 것일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 422번째 알라닌을 가질 수 있다. 상기 dCas12f1 단백질은 서열번호 269에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이러한 상기 dCas12f1 단백질은 "E422A dCas12f1 단백질" 또는 "dCas12f1 E422A 단백질"로 표시할 수 있다.
dCas12f1 단백질 예시 4
일 구현예로, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질을 구성하는 아미노산 서열 중 326번째 아미노산인 아스파트산(D)이 알라닌(A)으로 치환된 것일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 326번째 알라닌을 가질 수 있다. 상기 dCas12f1 단백질은 서열번호 271에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이러한 상기 dCas12f1 단백질은 "D326A dCas12f1 단백질" 또는 "dCas12f1 D326A 단백질"로 표시할 수 있다.
2) 발현 조절 도메인
발현 조절 도메인 - 개괄
본 명세서에서 제공하는 CRISPR 조절 시스템을 위한 Cas12f1 융합 단백질은 발현 조절 도메인이 포함된다. 상기 발현 조절 도메인으로 표적 유전자의 전사를 활성화시키거나 또는 저해시키는 단백질로, 전사 활성 단백질 또는 전사 저해 단백질일 수 있다. 상기 발현 조절 도메인이 전사 활성 단백질인 경우, 이를 포함하는 상기 Cas12f1 융합 단백질은 표적 유전자의 발현을 증가 또는 촉진시키기 위한 CRISPR 조절 시스템으로 이용될 수 있다. 또는, 상기 발현 조절 도메인이 전사 저해 단백질인 경우, 이를 포함하는 상기 Cas12f1 융합 단백질은 표적 유전자의 발현을 저해 또는 억제시키기 위한 CRISPR 조절 시스템으로 이용될 수 있다.
발현 조절 도메인의 종류 1 - 전사 활성 단백질
일 구현예로, 상기 발현 조절 도메인은 전사 활성 단백질일 수 있다. 상기 전사활성 단백질은 표적 유전자의 전사를 활성 또는 촉진시키는 역할을 하는 단백질일 수 있다. 상기 전사 활성 단백질은 표적 유전자의 인핸서 또는 프로모터 근위 요소(promoter-proximal element)에 결합할 수 있는 DNA 결합 단백질일 수 있다. 상기 전사 활성 단백질은 프로모터 근처에 위치한 조절 DNA 부위에 결합하여 일반적인 transcription machinery (RNA 중합효소 및 일반적인 transcription factors 등)와 단백질-단백질 상호작용을 통해 프로모터에 transcription machinery의 결합을 촉진하여 유전자의 전사를 촉진할 수 있다. 또는 상기 전사 활성 단백질은 RNA 중합효소가 프로모터로부터 방출되어 DNA를 따라 합성을 진행하도록 촉발하여 유전자의 전사를 촉진할 수 있다.
일 구현예로, 상기 전사 활성 단백질은 VP64일 수 있다.
발현 조절 도메인의 종류 2 - 전사 저해 단백질
일 구현예로, 상기 발현 조절 도메인은 전사 저해 단백질일 수 있다. 상기 전사저해 단백질은 표적 유전자의 전사를 저해 또는 억제시키는 역할을 하는 단백질일 수 있다. 상기 전사저해 단백질은 표적 유전자의 operator 또는 silencer에 결합하여 표적 유전자의 발현을 저해 또는 억제하는 DNA 결합 단백질 또는 펩타이드일 수 있다. 이때, 상기 전사 저해 단백질은 RNA 중합효소가 프로모터에 부착되는 것을 차단하여 유전자의 전사를 저해 또는 억제할 수 있다. 또는 상기 전사 저해 단백질은 크로마틴의 구조변화를 유도하여 유전자의 전사를 저해 또는 억제하는 단백질 또는 펩타이드일 수 있다. 이때, 상기 크로마틴의 구조변화는 메틸화(methylation), 탈메틸화(demethylation), 아세틸화(acetylation), 탈아세틸화(deacetylation) 등에 의한 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 전사 저해 단백질은 KRAB, DNMT, MeCP2, LSD 또는 HDAC일 수 있다. 이때, 상기 DNMT는 DNMT1, TRDMT1 또는 DNMT3일 수 있다. 이때, 상기 HDAC는 HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC8, HDAC9, HDAC10 또는 HDAC11일 수 있다.
발현 조절 도메인 - Cas12f1 융합 단백질 상의 개수
하나의 Cas12f1 융합 단백질은 적어도 하나의 발현 조절 도메인을 포함할 수 있다. 이때, 상기 발현 조절 도메인은 전사 활성 단백질 또는 전사 저해 단백질일 수 있다. 또는, 하나의 Cas12f1 융합 단백질은 복수 개의 발현 조절 도메인을 포함할 수 있다. 이때, 상기 복수 개의 발현 조절 도메인은 모두 동일한 기능을 하는 도메인으로, 전사 활성을 촉진하거나 전사 활성을 저해하는 기능을 하는 단백질일 수 있다. 즉, 상기 복수 개의 발현 조절 도메인은 모두 전사 활성 단백질이거나 또는 모두 전사 저해 단백질일 수 있다. 다만, 상기 복수 개의 발현 조절 도메인은 기능이 동일할 뿐 반드시 동일한 단백질일 필요는 없다. 예를 들어, 상기 복수 개의 발현 조절 도메인이 모두 전사 저해 단백질인 경우, 한 종류의 전사 저해 단백질이 복수 개로 존재하거나, 또는 여러 종류의 전사 저해 단백질이 복수 개로 존재하는 것일 수 있다.
발현 조절 도메인 - Cas12f1 융합 단백질 상의 위치
상기 발현 조절 도메인은 Cas12f1 융합 단백질에 포함된 변형된 Cas12f1 단백질, 즉, dCas12f1 단백질의 N 말단 및/또는 C 말단에 위치할 수 있다. 상기 Cas12f1 융합 단백질에 포함된 발현 조절 도메인이 둘 이상인 경우, 상기 발현 조절 도메인은 dCas12f1 단백질의 N 말단에 모두 위치하거나, dCas12f1 단백질의 C 말단에 모두 위치하거나, 또는 일부는 dCas12f1 단백질의 N 말단에 위치하고 나머지는 dCas12f1 단백질의 C 말단에 위치할 수 있다.
일 구현예로, 상기 Cas12f1 융합 단백질에 포함된 발현 조절 도메인이 2개인 경우, 상기 2개의 발현 조절 도메인은 모두 dCas12f1 단백질의 N 말단에 모두 위치할 수 있다. 또는, 상기 2개의 발현 조절 도메인은 모두 dCas12f1 단백질의 C 말단에 모두 위치할 수 있다. 또는, 상기 2개의 발현 조절 도메인 중 1개는 dCas12f1 단백질의 C 말단에 위치하고, 나머지 1개는 dCas12f1 단백질의 N 말단에 모두 위치할 수 있다.
일 구현예로, 상기 Cas12f1 융합 단백질에 포함된 발현 조절 도메인이 3개인 경우, 상기 3개의 발현 조절 도메인은 모두 dCas12f1 단백질의 N 말단에 모두 위치할 수 있다. 또는, 상기 3개의 발현 조절 도메인은 모두 dCas12f1 단백질의 C 말단에 모두 위치할 수 있다. 또는, 상기 3개의 발현 조절 도메인 중 2개는 dCas12f1 단백질의 C 말단에 위치하고, 나머지 1개는 dCas12f1 단백질의 N 말단에 모두 위치할 수 있다. 또는, 상기 3개의 발현 조절 도메인 중 1개는 dCas12f1 단백질의 C 말단에 위치하고, 나머지 2개는 dCas12f1 단백질의 N 말단에 모두 위치할 수 있다.
발현 조절 도메인 예시
일 구현예로, 상기 발현 조절 도메인은 전사 활성 단백질일 수 있다. 이때, 상기 전사 활성 단백질은 VP64일 수 있다. 상기 발현 조절 도메인은 서열번호 272에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일 구현예로, 상기 발현 조절 도메인은 전사 저해 단백질일 수 있다. 이때, 상기 전사 저해 단백질은 KRAB일 수 있다. 상기 발현 조절 도메인은 서열번호 274에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일 구현예로, 상기 발현 조절 도메인은 전사 저해 단백질일 수 있다. 이때, 상기 전사 저해 단백질은 MeCP2일 수 있다. 상기 발현 조절 도메인은 서열번호 275에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일 구현예로, 상기 발현 조절 도메인은 전사 저해 단백질일 수 있다. 이때, 상기 전사 저해 단백질은 DNMT3일 수 있다. 상기 발현 조절 도메인은 서열번호 276에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일 구현예로, 상기 발현 조절 도메인은 전사 저해 단백질일 수 있다. 이때, 상기 전사 저해 단백질은 HDAC3일 수 있다. 상기 발현 조절 도메인은 서열번호 277에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
3) 링커
본 명세서에서 제공하는 CRISPR 조절 시스템을 위한 Cas12f1 융합 단백질은 dCas12f1 단백질과 발현 조절 도메인을 연결하기 위해 링커가 포함된다. 이때, 상기 링커는 dCas12f1 단백질과 발현 조절 도메인의 기능 및 구조에 영향을 주지 않는 아미노산 서열인 것을 특징으로 한다.
4) 추가 도메인
본 명세서에서 제공하는 CRISPR 조절 시스템을 위한 Cas12f1 융합 단백질은 하나 이상의 추가 도메인을 더 포함할 수 있다. 상기 추가 도메인은 상기 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단 및/또는 C 말단에 위치할 수 있다. 또는 상기 추가 도메인은 상기 Cas12f1 융합 단백질에 포함된 dCas12f1 단백질과 발현 조절 도메인의 사이에 위치할 수 있다.
일 구현예로, 상기 추가 도메인은 NLS(Nuclear Localization Sequence), 또는 NES(Nuclear Export Sequence)일 수 있다. 구체적으로, 상기 NLS는 "용어의 정의" 중 NLS 단락에 예시된 것 중 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구현예로, 상기 추가 도메인은 태그일 수 있다. 구체적으로, 상기 태그는 "용어의 정의" 중 태그 단락에 예시된 것 중 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
5) Cas12f1 융합 단백질
Cas12f1 융합 단백질 - 개괄
본 명세서에서 제공하는 CRISPR 조절 시스템을 위한 Cas12f1 융합 단백질은 기능에 따라 두 종류로 구분된다. 우선, 상기 Cas12f1 융합 단백질은 표적 유전자의 발현을 증가 또는 촉진하는 기능을 하는 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질일 수 있다. 구체적으로 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질은 dCas12f1 단백질; 및 발현 조절 도메인으로 전사 활성 단백질을 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질은 표적 유전자의 발현을 증가 또는 향상시키기 위한 CRISPR 조절 시스템, 즉, CRISPR activation 시스템에 이용된다. 두번째로, 상기 Cas12f1 융합 단백질은 표적 유전자의 발현을 저해 또는 억제하는 기능을 하는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질일 수 있다. 구체적으로 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질은 dCas12f1 단백질; 및 발현 조절 도메인으로 전사 저해 단백질을 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질은 표적 유전자의 발현을 저해 또는 억제시키기 위한 CRISPR 조절 시스템, 즉, CRISPR interference 시스템에 이용된다.
Cas12f1 융합 단백질 - 모듈화
본 명세서에서 제공하는 CRISPR 조절 시스템을 위한 Cas12f1 융합 단백질은 다양한 모듈화를 통해 기능을 향상시키거나 최적화시킬 수 있다. 이때, 상기 모듈화는 Cas12f1 융합 단백질에 포함된 발현 조절 도메인의 개수, 종류 및 Cas12f1 융합 단백질 내 위치를 다양하게 조절하는 것을 특징으로 한다. 이러한 모듈화를 통해 최적화된 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 또는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질을 개발하여 CRISPR activation 시스템 또는 CRISPR interference 시스템에 보다 효과적으로 이용할 수 있다. 또한, 상기 Cas12f1 융합 단백질은 발현 조절 도메인 뿐만 아니라 추가 도메인의 개수, 종류 및 Cas12f1 융합 단백질 내 위치를 다양하게 조절할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 Cas12f1 융합 단백질은 dCas12f1 단백질 및 2개의 전사 저해 단백질을 포함할 수 있다. 이때, 상기 2개의 전사 저해 단백질은 동일한 종류의 전사 저해 단백질일 수 있다. 또는 상기 2개의 전사 저해 단백질은 서로 다른 종류의 전사 저해 단백질일 수 있다. 이때, 상기 2개의 전사 저해 단백질은 모두 dCas12f1 단백질의 N 말단에 위치할 수 있다. 또는 상기 2개의 전사 저해 단백질은 모두 dCas12f1 단백질의 C 말단에 위치할 수 있다. 또는 상기 2개의 전사 저해 단백질은 dCas12f1 단백질의 N 말단 및 C 말단에 하나씩 위치할 수 있다. 상기 Cas12f1 융합 단백질은 하나 이상의 추가 도메인을 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 추가 도메인은 상기 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단 및/또는 C 말단에 위치할 수 있다. 또는 상기 추가 도메인은 상기 dCas12f1 단백질 및 전사 저해 단백질 사이에 위치할 수 있다. 상기 Cas12f1 융합 단백질에 포함된 dCas12f1 단백질, 전사 저해 단백질 및 추가 도메인의 위치는 다양하게 조절할 수 있다.
Cas12f1 융합 단백질 - 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 구현예
본 명세서에서 제공하는 Cas12f1 융합 단백질은 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질일 수 있다.
일 구현예로, 상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질은 dCas12f1 단백질 및 적어도 하나의 전사 활성 단백질을 포함할 수 있다. 이때, 상기 전사 활성 단백질은 dCas12f1 단백질의 N 말단 또는 C 말단에 위치할 수 있다. 상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질은 추가 도메인으로 적어도 하나의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 NLS는 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단 및/또는 C 말단에 위치할 수 있다. 또는 상기 NLS는 상기 dCas12f1 단백질과 전사 활성 단백질 사이에 위치할 수 있다. 이때, 상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질에 포함된 dCas12f1 단백질, 전사 활성 단백질 및 NLS는 링커에 의해 연결될 수 있다.
일 구현예로, 상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질은 dCas12f1 단백질 및 둘 이상의 전사 활성 단백질을 포함할 수 있다. 이때, 상기 둘 이상의 전사 활성 단백질은 dCas12f1 단백질의 N 말단 및/또는 C 말단에 위치할 수 있다. 상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질은 추가 도메인으로 적어도 하나의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 NLS는 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단 및/또는 C 말단에 위치할 수 있다. 또는 상기 NLS는 상기 dCas12f1 단백질과 전사 활성 단백질 사이에 위치할 수 있다. 이때, 상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질에 포함된 dCas12f1 단백질, 전사 활성 단백질 및 NLS는 링커에 의해 연결될 수 있다.
이하에서, 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질의 다양한 예시를 설명한다. 하기 예시는 단순 예시로, 이에 제한되지 않는다.
Cas12f1 융합 단백질 - 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 예시 1
일 구현예로, 상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로, dCas12f1 단백질 및 전사 활성 단백질이 순서대로 연결된 것; 또는 전사 활성 단백질 및 dCas12f1 단백질이 순서대로 연결된 것
일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질과 전사 활성 단백질은 링커에 의해 연결될 수 있다.
상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질을 구성하는 아미노산 서열 중 490번째 아미노산인 아르기닌(R)이 알라닌(A), 글루타민(Q), 류신(L) 또는 트립토판(W)으로 치환된 것일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 490번째 알라닌을 가지는 dCas12f1 R490A 단백질일 수 있다. 또는, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 490번째 글루타민을 가지는 dCas12f1 R490Q 단백질일 수 있다. 또는, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 490번째 류신을 가지는 dCas12f1 R490L 단백질일 수 있다. 또는, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 490번째 트립토판을 가지는 dCas12f1 R490W 단백질일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질은 서열번호 261, 262, 264 및 265에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또는, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질을 구성하는 아미노산 서열 중 510번째 아미노산인 아스파트산(D)이 알라닌(A), 류신(L) 또는 발린(V)으로 치환된 것일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 510번째 알라닌을 가지는 dCas12f1 D510A 단백질일 수 있다. 또는, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 510번째 류신을 가지는 dCas12f1 D510L 단백질일 수 있다. 또는, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 510번째 발린을 가지는 dCas12f1 D510V 단백질일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질은 서열번호 266 내지 268에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 전사 활성 단백질은 VP64일 수 있다. 이때, 상기 전사 활성 단백질은 서열번호 272에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질은 추가 도메인으로 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS는 상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단 및/또는 C 말단에 위치할 수 있다. 또는, 상기 하나 이상의 NLS는 상기 dCas12f1 단백질과 전사 활성 단백질 사이에 위치할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS는 링커에 의해 dCas12f1 단백질 및/또는 전사 활성 단백질과 연결될 수 있다.
일 예로, 상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 다음과 같은 구조를 가질 수 있다: [dCas12f1 R490A 단백질]-[VP64]; [dCas12f1 R490Q 단백질]-[VP64]; [dCas12f1 R490L 단백질]-[VP64]; [dCas12f1 R490W 단백질]-[VP64]; [VP64]-[dCas12f1 R490A 단백질]; [VP64]-[dCas12f1 R490Q 단백질]; [VP64]-[dCas12f1 R490L 단백질]; 또는 [VP64]-[dCas12f1 R490W 단백질]. 상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질은 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS은 상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단, 상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질의 C 말단 및/또는 dCas12f1 단백질(dCas12f1 R490A 단백질, dCas12f1 R490Q 단백질, dCas12f1 R490L 단백질 또는 dCas12f1 R490W 단백질)과 VP64 사이에 위치할 수 있다.
일 예로, 상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 다음과 같은 구조를 가질 수 있다: [dCas12f1 D510A 단백질]-[VP64]; [dCas12f1 D510L 단백질]-[VP64]; [dCas12f1 D510V 단백질]-[VP64]; [VP64]-[dCas12f1 D510A 단백질]; [VP64]-[dCas12f1 D510L 단백질]; 또는 [VP64]-[dCas12f1 D510V 단백질]. 상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질은 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS은 상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단, 상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질의 C 말단 및/또는 dCas12f1 단백질(dCas12f1 D510A 단백질, dCas12f1 D510L 단백질 또는 dCas12f1 D510V 단백질)과 VP64 사이에 위치할 수 있다.
Cas12f1 융합 단백질 - 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 예시 2
일 구현예로, 상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로, dCas12f1 단백질, 전사 활성 단백질 및 전사 활성 단백질이 순서대로 연결된 것; 또는 전사 활성 단백질, 전사 활성 단백질 및 dCas12f1 단백질이 순서대로 연결된 것일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질과 전사 활성 단백질은 링커에 의해 연결될 수 있다.
상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질을 구성하는 아미노산 서열 중 490번째 아미노산인 아르기닌(R)이 알라닌(A), 글루타민(Q), 류신(L) 또는 트립토판(W)으로 치환된 것일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 490번째 알라닌을 가지는 dCas12f1 R490A 단백질일 수 있다. 또는, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 490번째 글루타민을 가지는 dCas12f1 R490Q 단백질일 수 있다. 또는, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 490번째 류신을 가지는 dCas12f1 R490L 단백질일 수 있다. 또는, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 490번째 트립토판을 가지는 dCas12f1 R490W 단백질일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질은 서열번호 261, 262, 264 및 265에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또는, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질을 구성하는 아미노산 서열 중 510번째 아미노산인 아스파트산(D)이 알라닌(A), 류신(L) 또는 발린(V)으로 치환된 것일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 510번째 알라닌을 가지는 dCas12f1 D510A 단백질일 수 있다. 또는, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 510번째 류신을 가지는 dCas12f1 D510L 단백질일 수 있다. 또는, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 510번째 발린을 가지는 dCas12f1 D510V 단백질일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질은 서열번호 266 내지 268에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 전사 활성 단백질은 VP64일 수 있다. 이때, 상기 전사 활성 단백질은 서열번호 272에 제시된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질은 추가 도메인으로 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS는 상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단 및/또는 C 말단에 위치할 수 있다. 또는, 상기 하나 이상의 NLS는 상기 dCas12f1 단백질과 전사 활성 단백질 사이에 위치할 수 있다. 또는, 상기 하나 이상의 NLS는 상기 전사 활성 단백질들 사이에 위치할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS는 링커에 의해 dCas12f1 단백질 및/또는 전사 활성 단백질과 연결될 수 있다.
일 예로, 상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 다음과 같은 구조를 가질 수 있다: [dCas12f1 R490A 단백질]-[VP64]-[VP64]; [dCas12f1 R490Q 단백질]-[VP64]-[VP64]; [dCas12f1 R490L 단백질]-[VP64]-[VP64]; [dCas12f1 R490W 단백질]-[VP64]-[VP64]; [VP64]-[VP64]-[dCas12f1 R490A 단백질]; [VP64]-[VP64]-[dCas12f1 R490Q 단백질]; [VP64]-[VP64]-[dCas12f1 R490L 단백질]; 또는 [VP64]-[VP64]-[dCas12f1 R490W 단백질]. 상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질은 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS은 상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단, 상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질의 C 말단, dCas12f1 단백질(dCas12f1 R490A 단백질, dCas12f1 R490Q 단백질, dCas12f1 R490L 단백질 또는 dCas12f1 R490W 단백질)과 VP64 사이 및/또는 VP64과 VP64 사이에 위치할 수 있다.
일 예로, 상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 다음과 같은 구조를 가질 수 있다: [dCas12f1 D510A 단백질]-[VP64]-[VP64]; [dCas12f1 D510L 단백질]-[VP64]-[VP64]; [dCas12f1 D510V 단백질]-[VP64]-[VP64]; [VP64]-[VP64]-[dCas12f1 D510A 단백질]; [VP64]-[VP64]-[dCas12f1 D510L 단백질]; 또는 [VP64]-[VP64]-[dCas12f1 D510V 단백질]. 상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질은 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS은 상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단, 상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질의 C 말단, dCas12f1 단백질(dCas12f1 D510A 단백질, dCas12f1 D510L 단백질 또는 dCas12f1 D510V 단백질)과 VP64 사이 및/또는 VP64과 VP64 사이에 위치할 수 있다.
Cas12f1 융합 단백질 - 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질 구현예
본 명세서에서 제공하는 Cas12f1 융합 단백질은 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질일 수 있다.
일 구현예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 dCas12f1 단백질 및 적어도 하나의 전사 저해 단백질을 포함할 수 있다. 이때, 상기 전사 저해 단백질은 dCas12f1 단백질의 N 말단 또는 C 말단에 위치할 수 있다. 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 추가 도메인으로 적어도 하나의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 NLS는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단 및/또는 C 말단에 위치할 수 있다. 또는 상기 NLS는 상기 dCas12f1 단백질과 전사 저해 단백질 사이에 위치할 수 있다. 이때, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질에 포함된 dCas12f1 단백질, 전사 저해 단백질 및 NLS는 링커에 의해 연결될 수 있다.
일 구현예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 dCas12f1 단백질 및 둘 이상의 전사 저해 단백질을 포함할 수 있다. 이때, 상기 둘 이상의 전사 저해 단백질은 dCas12f1 단백질의 N 말단 및/또는 C 말단에 위치할 수 있다. 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 추가 도메인으로 적어도 하나의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 NLS는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단 및/또는 C 말단에 위치할 수 있다. 또는 상기 NLS는 상기 dCas12f1 단백질과 전사 저해 단백질 사이에 위치할 수 있다. 이때, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질에 포함된 dCas12f1 단백질, 전사 저해 단백질 및 NLS는 링커에 의해 연결될 수 있다.
이하에서, 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 다양한 예시를 설명한다. 하기 예시는 단순 예시로, 이에 제한되지 않는다.
Cas12f1 융합 단백질 - 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질 예시 1
일 구현예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로, dCas12f1 단백질 및 전사 저해 단백질이 순서대로 연결된 것; 또는 전사 저해 단백질 및 dCas12f1 단백질이 순서대로 연결된 것일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질과 전사 저해 단백질은 링커에 의해 연결될 수 있다.
상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질을 구성하는 아미노산 서열 중 490번째 아미노산인 아르기닌(R)이 알라닌(A), 글루타민(Q), 류신(L) 또는 트립토판(W)으로 치환된 것일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 490번째 알라닌을 가지는 dCas12f1 R490A 단백질일 수 있다. 또는, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 490번째 글루타민을 가지는 dCas12f1 R490Q 단백질일 수 있다. 또는, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 490번째 류신을 가지는 dCas12f1 R490L 단백질일 수 있다. 또는, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 490번째 트립토판을 가지는 dCas12f1 R490W 단백질일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질은 서열번호 261, 262, 264 및 265에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또는, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질을 구성하는 아미노산 서열 중 510번째 아미노산인 아스파트산(D)이 알라닌(A), 류신(L) 또는 발린(V)으로 치환된 것일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 510번째 알라닌을 가지는 dCas12f1 D510A 단백질일 수 있다. 또는, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 510번째 류신을 가지는 dCas12f1 D510L 단백질일 수 있다. 또는, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 510번째 발린을 가지는 dCas12f1 D510V 단백질일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질은 서열번호 266 내지 268에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 전사 저해 단백질은 KRAB, MeCP2, DNMT3 또는 HDAC3일 수 있다. 이때, 상기 전사 저해 단백질은 서열번호 274 내지 277에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 추가 도메인으로 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS는 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단 및/또는 C 말단에 위치할 수 있다. 또는, 상기 하나 이상의 NLS는 상기 dCas12f1 단백질과 전사 저해 단백질 사이에 위치할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS는 링커에 의해 dCas12f1 단백질 및/또는 전사 저해 단백질과 연결될 수 있다.
일 예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 다음과 같은 구조를 가질 수 있다: [dCas12f1 R490A 단백질]-[KRAB]; [dCas12f1 R490Q 단백질]-[KRAB]; [dCas12f1 R490L 단백질]-[KRAB]; [dCas12f1 R490W 단백질]-[KRAB]; [KRAB]-[dCas12f1 R490A 단백질]; [KRAB]-[dCas12f1 R490Q 단백질]; [KRAB]-[dCas12f1 R490L 단백질]; 또는 [KRAB]-[dCas12f1 R490W 단백질]. 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS은 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 C 말단 및/또는 dCas12f1 단백질(dCas12f1 R490A 단백질, dCas12f1 R490Q 단백질, dCas12f1 R490L 단백질 또는 dCas12f1 R490W 단백질)과 KRAB 사이에 위치할 수 있다.
일 예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 다음과 같은 구조를 가질 수 있다: [dCas12f1 D510A 단백질]-[KRAB]; [dCas12f1 D510L 단백질]-[KRAB]; [dCas12f1 D510V 단백질]-[KRAB]; [KRAB]-[dCas12f1 D510A 단백질]; [KRAB]-[dCas12f1 D510L 단백질]; 또는 [KRAB]-[dCas12f1 D510V 단백질]. 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS은 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 C 말단 및/또는 dCas12f1 단백질(dCas12f1 D510A 단백질, dCas12f1 D510L 단백질 또는 dCas12f1 D510V 단백질)과 KRAB 사이에 위치할 수 있다.
일 예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 다음과 같은 구조를 가질 수 있다: [dCas12f1 R490A 단백질]-[DNMT3]; [dCas12f1 R490Q 단백질]-[DNMT3]; [dCas12f1 R490L 단백질]-[DNMT3]; [dCas12f1 R490W 단백질]-[DNMT3]; [DNMT3]-[dCas12f1 R490A 단백질]; [DNMT3]-[dCas12f1 R490Q 단백질]; [DNMT3]-[dCas12f1 R490L 단백질]; 또는 [DNMT3]-[dCas12f1 R490W 단백질]. 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS은 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 C 말단 및/또는 dCas12f1 단백질(dCas12f1 R490A 단백질, dCas12f1 R490Q 단백질, dCas12f1 R490L 단백질 또는 dCas12f1 R490W 단백질)과 DNMT3 사이에 위치할 수 있다.
일 예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 다음과 같은 구조를 가질 수 있다: [dCas12f1 D510A 단백질]-[DNMT3]; [dCas12f1 D510L 단백질]-[DNMT3]; [dCas12f1 D510V 단백질]-[DNMT3]; [DNMT3]-[dCas12f1 D510A 단백질]; [DNMT3]-[dCas12f1 D510L 단백질]; 또는 [DNMT3]-[dCas12f1 D510V 단백질]. 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS은 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 C 말단 및/또는 dCas12f1 단백질(dCas12f1 D510A 단백질, dCas12f1 D510L 단백질 또는 dCas12f1 D510V 단백질)과 DNMT3 사이에 위치할 수 있다.
일 예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 다음과 같은 구조를 가질 수 있다: [dCas12f1 R490A 단백질]-[MeCP2]; [dCas12f1 R490Q 단백질]-[MeCP2]; [dCas12f1 R490L 단백질]-[MeCP2]; [dCas12f1 R490W 단백질]-[MeCP2]; [MeCP2]-[dCas12f1 R490A 단백질]; [MeCP2]-[dCas12f1 R490Q 단백질]; [MeCP2]-[dCas12f1 R490L 단백질]; 또는 [MeCP2]-[dCas12f1 R490W 단백질]. 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS은 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 C 말단 및/또는 dCas12f1 단백질(dCas12f1 R490A 단백질, dCas12f1 R490Q 단백질, dCas12f1 R490L 단백질 또는 dCas12f1 R490W 단백질)과 MeCP2 사이에 위치할 수 있다.
일 예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 다음과 같은 구조를 가질 수 있다: [dCas12f1 D510A 단백질]-[MeCP2]; [dCas12f1 D510L 단백질]-[MeCP2]; [dCas12f1 D510V 단백질]-[MeCP2]; [MeCP2]-[dCas12f1 D510A 단백질]; [MeCP2]-[dCas12f1 D510L 단백질]; 또는 [MeCP2]-[dCas12f1 D510V 단백질]. 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS은 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 C 말단 및/또는 dCas12f1 단백질(dCas12f1 D510A 단백질, dCas12f1 D510L 단백질 또는 dCas12f1 D510V 단백질)과 MeCP2 사이에 위치할 수 있다.
일 예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 다음과 같은 구조를 가질 수 있다: [dCas12f1 R490A 단백질]-[HDAC3]; [dCas12f1 R490Q 단백질]-[HDAC3]; [dCas12f1 R490L 단백질]-[HDAC3]; [dCas12f1 R490W 단백질]-[HDAC3]; [HDAC3]-[dCas12f1 R490A 단백질]; [HDAC3]-[dCas12f1 R490Q 단백질]; [HDAC3]-[dCas12f1 R490L 단백질]; 또는 [HDAC3]-[dCas12f1 R490W 단백질]. 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS은 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 C 말단 및/또는 dCas12f1 단백질(dCas12f1 R490A 단백질, dCas12f1 R490Q 단백질, dCas12f1 R490L 단백질 또는 dCas12f1 R490W 단백질)과 HDAC3 사이에 위치할 수 있다.
일 예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 다음과 같은 구조를 가질 수 있다: [dCas12f1 D510A 단백질]-[HDAC3]; [dCas12f1 D510L 단백질]-[HDAC3]; [dCas12f1 D510V 단백질]-[HDAC3]; [HDAC3]-[dCas12f1 D510A 단백질]; [HDAC3]-[dCas12f1 D510L 단백질]; 또는 [HDAC3]-[dCas12f1 D510V 단백질]. 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS은 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 C 말단 및/또는 dCas12f1 단백질(dCas12f1 D510A 단백질, dCas12f1 D510L 단백질 또는 dCas12f1 D510V 단백질)과 HDAC3 사이에 위치할 수 있다.
Cas12f1 융합 단백질 - 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질 예시 2
일 구현예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로, dCas12f1 단백질, 전사 저해 단백질 및 전사 저해 단백질이 순서대로 연결된 것; 또는 전사 저해 단백질, 전사 저해 단백질 및 dCas12f1 단백질이 순서대로 연결된 것일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질과 전사 저해 단백질은 링커에 의해 연결될 수 있다.
상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질을 구성하는 아미노산 서열 중 490번째 아미노산인 아르기닌(R)이 알라닌(A), 글루타민(Q), 류신(L) 또는 트립토판(W)으로 치환된 것일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 490번째 알라닌을 가지는 dCas12f1 R490A 단백질일 수 있다. 또는, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 490번째 글루타민을 가지는 dCas12f1 R490Q 단백질일 수 있다. 또는, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 490번째 류신을 가지는 dCas12f1 R490L 단백질일 수 있다. 또는, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 490번째 트립토판을 가지는 dCas12f1 R490W 단백질일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질은 서열번호 261, 262, 264 및 265에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또는, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질을 구성하는 아미노산 서열 중 510번째 아미노산인 아스파트산(D)이 알라닌(A), 류신(L) 또는 발린(V)으로 치환된 것일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 510번째 알라닌을 가지는 dCas12f1 D510A 단백질일 수 있다. 또는, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 510번째 류신을 가지는 dCas12f1 D510L 단백질일 수 있다. 또는, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 510번째 발린을 가지는 dCas12f1 D510V 단백질일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질은 서열번호 266 내지 268에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 전사 저해 단백질은 KRAB, MeCP2, DNMT3 또는 HDAC3일 수 있다. 이때, 상기 전사 저해 단백질은 서열번호 274 내지 277에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 추가 도메인으로 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS는 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단 및/또는 C 말단에 위치할 수 있다. 또는, 상기 하나 이상의 NLS는 상기 dCas12f1 단백질과 전사 저해 단백질 사이에 위치할 수 있다. 또는, 상기 하나 이상의 NLS는 상기 전사 저해 단백질들 사이에 위치할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS는 링커에 의해 dCas12f1 단백질 및/또는 전사 저해 단백질과 연결될 수 있다.
일 예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 다음과 같은 구조를 가질 수 있다: [dCas12f1 R490A 단백질]-[KRAB]-[KRAB]; [dCas12f1 R490Q 단백질]-[KRAB]-[KRAB]; [dCas12f1 R490L 단백질]-[KRAB]-[KRAB]; [dCas12f1 R490W 단백질]-[KRAB]-[KRAB]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 R490A 단백질]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 R490Q 단백질]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 R490L 단백질]; 또는 [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 R490W 단백질]. 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS은 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 C 말단, dCas12f1 단백질(dCas12f1 R490A 단백질, dCas12f1 R490Q 단백질, dCas12f1 R490L 단백질 또는 dCas12f1 R490W 단백질)과 KRAB 사이 및/또는 KRAB과 KRAB 사이에 위치할 수 있다.
일 예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 다음과 같은 구조를 가질 수 있다: [dCas12f1 D510A 단백질]-[KRAB]-[KRAB]; [dCas12f1 D510L 단백질]-[KRAB]-[KRAB]; [dCas12f1 D510V 단백질]-[KRAB]-[KRAB]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 D510A 단백질]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 D510L 단백질]; 또는 [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 D510V 단백질]. 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS은 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 C 말단, dCas12f1 단백질(dCas12f1 D510A 단백질, dCas12f1 D510L 단백질 또는 dCas12f1 D510V 단백질)과 KRAB 사이 및/또는 KRAB과 KRAB 사이에 위치할 수 있다.
일 예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 다음과 같은 구조를 가질 수 있다: [dCas12f1 R490A 단백질]-[KRAB]-[MeCP2]; [dCas12f1 R490Q 단백질]-[KRAB]-[MeCP2]; [dCas12f1 R490L 단백질]-[KRAB]-[MeCP2]; [dCas12f1 R490W 단백질]-[KRAB]-[MeCP2]; [dCas12f1 R490A 단백질]-[MeCP2]-[KRAB]; [dCas12f1 R490Q 단백질]-[MeCP2]-[KRAB]; [dCas12f1 R490L 단백질]-[MeCP2]-[KRAB]; [dCas12f1 R490W 단백질]-[MeCP2]-[KRAB]; [KRAB]-[MeCP2]-[dCas12f1 R490A 단백질]; [KRAB]-[MeCP2]-[dCas12f1 R490Q 단백질]; [KRAB]-[MeCP2]-[dCas12f1 R490L 단백질]; [KRAB]-[MeCP2]-[dCas12f1 R490W 단백질]; [MeCP2]-[KRAB]-[dCas12f1 R490A 단백질]; [MeCP2]-[KRAB]-[dCas12f1 R490Q 단백질]; [MeCP2]-[KRAB]-[dCas12f1 R490L 단백질]; 또는 [MeCP2]-[KRAB]-[dCas12f1 R490W 단백질]. 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS은 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 C 말단, dCas12f1 단백질(dCas12f1 R490A 단백질, dCas12f1 R490Q 단백질, dCas12f1 R490L 단백질 또는 dCas12f1 R490W 단백질)과 KRAB 사이, dCas12f1 단백질(dCas12f1 R490A 단백질, dCas12f1 R490Q 단백질, dCas12f1 R490L 단백질 또는 dCas12f1 R490W 단백질)과 MeCP2 사이 및/또는 KRAB과 MeCP2 사이에 위치할 수 있다.
일 예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 다음과 같은 구조를 가질 수 있다: [dCas12f1 D510A 단백질]-[KRAB]-[MeCP2]; [dCas12f1 D510L 단백질]-[KRAB]-[MeCP2]; [dCas12f1 D510V 단백질]-[KRAB]-[MeCP2]; [dCas12f1 D510A 단백질]-[MeCP2]-[KRAB]; [dCas12f1 D510L 단백질]-[MeCP2]-[KRAB]; [dCas12f1 D510V 단백질]-[MeCP2]-[KRAB]; [KRAB]-[MeCP2]-[dCas12f1 D510A 단백질]; [KRAB]-[MeCP2]-[dCas12f1 D510L 단백질]; [KRAB]-[MeCP2]-[dCas12f1 D510V 단백질]; [MeCP2]-[KRAB]-[dCas12f1 D510A 단백질]; [MeCP2]-[KRAB]-[dCas12f1 D510L 단백질]; 또는 [MeCP2]-[KRAB]-[dCas12f1 D510V 단백질]. 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS은 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 C 말단, dCas12f1 단백질(dCas12f1 D510A 단백질, dCas12f1 D510L 단백질 또는 dCas12f1 D510V 단백질)과 MeCP2 사이 및/또는 KRAB과 MeCP2 사이에 위치할 수 있다.
일 예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 다음과 같은 구조를 가질 수 있다: [dCas12f1 R490A 단백질]-[KRAB]-[DNMT3]; [dCas12f1 R490Q 단백질]-[KRAB]-[DNMT3]; [dCas12f1 R490L 단백질]-[KRAB]-[DNMT3]; [dCas12f1 R490W 단백질]-[KRAB]-[DNMT3]; [dCas12f1 R490A 단백질]-[DNMT3]-[KRAB]; [dCas12f1 R490Q 단백질]-[DNMT3]-[KRAB]; [dCas12f1 R490L 단백질]-[DNMT3]-[KRAB]; [dCas12f1 R490W 단백질]-[DNMT3]-[KRAB]; [KRAB]-[DNMT3]-[dCas12f1 R490A 단백질]; [KRAB]-[DNMT3]-[dCas12f1 R490Q 단백질]; [KRAB]-[DNMT3]-[dCas12f1 R490L 단백질]; [KRAB]-[DNMT3]-[dCas12f1 R490W 단백질]; [DNMT3]-[KRAB]-[dCas12f1 R490A 단백질]; [DNMT3]-[KRAB]-[dCas12f1 R490Q 단백질]; [DNMT3]-[KRAB]-[dCas12f1 R490L 단백질]; 또는 [DNMT3]-[KRAB]-[dCas12f1 R490W 단백질]. 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS은 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 C 말단, dCas12f1 단백질(dCas12f1 R490A 단백질, dCas12f1 R490Q 단백질, dCas12f1 R490L 단백질 또는 dCas12f1 R490W 단백질)과 KRAB 사이, dCas12f1 단백질(dCas12f1 R490A 단백질, dCas12f1 R490Q 단백질, dCas12f1 R490L 단백질 또는 dCas12f1 R490W 단백질)과 DNMT3 사이 및/또는 KRAB과 DNMT3 사이에 위치할 수 있다.
일 예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 다음과 같은 구조를 가질 수 있다: [dCas12f1 D510A 단백질]-[KRAB]-[DNMT3]; [dCas12f1 D510L 단백질]-[KRAB]-[DNMT3]; [dCas12f1 D510V 단백질]-[KRAB]-[DNMT3]; [dCas12f1 D510A 단백질]-[DNMT3]-[KRAB]; [dCas12f1 D510L 단백질]-[DNMT3]-[KRAB]; [dCas12f1 D510V 단백질]-[DNMT3]-[KRAB]; [KRAB]-[DNMT3]-[dCas12f1 D510A 단백질]; [KRAB]-[DNMT3]-[dCas12f1 D510L 단백질]; [KRAB]-[DNMT3]-[dCas12f1 D510V 단백질]; [DNMT3]-[KRAB]-[dCas12f1 D510A 단백질]; [DNMT3]-[KRAB]-[dCas12f1 D510L 단백질]; 또는 [DNMT3]-[KRAB]-[dCas12f1 D510V 단백질]. 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS은 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 C 말단, dCas12f1 단백질(dCas12f1 D510A 단백질, dCas12f1 D510L 단백질 또는 dCas12f1 D510V 단백질)과 DNMT3 사이 및/또는 KRAB과 DNMT3 사이에 위치할 수 있다.
일 예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 다음과 같은 구조를 가질 수 있다: [dCas12f1 R490A 단백질]-[KRAB]-[HDAC3]; [dCas12f1 R490Q 단백질]-[KRAB]-[HDAC3]; [dCas12f1 R490L 단백질]-[KRAB]-[HDAC3]; [dCas12f1 R490W 단백질]-[KRAB]-[HDAC3]; [dCas12f1 R490A 단백질]-[HDAC3]-[KRAB]; [dCas12f1 R490Q 단백질]-[HDAC3]-[KRAB]; [dCas12f1 R490L 단백질]-[HDAC3]-[KRAB]; [dCas12f1 R490W 단백질]-[HDAC3]-[KRAB]; [KRAB]-[HDAC3]-[dCas12f1 R490A 단백질]; [KRAB]-[HDAC3]-[dCas12f1 R490Q 단백질]; [KRAB]-[HDAC3]-[dCas12f1 R490L 단백질]; [KRAB]-[HDAC3]-[dCas12f1 R490W 단백질]; [HDAC3]-[KRAB]-[dCas12f1 R490A 단백질]; [HDAC3]-[KRAB]-[dCas12f1 R490Q 단백질]; [HDAC3]-[KRAB]-[dCas12f1 R490L 단백질]; 또는 [HDAC3]-[KRAB]-[dCas12f1 R490W 단백질]. 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS은 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 C 말단, dCas12f1 단백질(dCas12f1 R490A 단백질, dCas12f1 R490Q 단백질, dCas12f1 R490L 단백질 또는 dCas12f1 R490W 단백질)과 KRAB 사이, dCas12f1 단백질(dCas12f1 R490A 단백질, dCas12f1 R490Q 단백질, dCas12f1 R490L 단백질 또는 dCas12f1 R490W 단백질)과 HDAC3 사이 및/또는 KRAB과 HDAC3 사이에 위치할 수 있다.
일 예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 다음과 같은 구조를 가질 수 있다: [dCas12f1 D510A 단백질]-[KRAB]-[HDAC3]; [dCas12f1 D510L 단백질]-[KRAB]-[HDAC3]; [dCas12f1 D510V 단백질]-[KRAB]-[HDAC3]; [dCas12f1 D510A 단백질]-[HDAC3]-[KRAB]; [dCas12f1 D510L 단백질]-[HDAC3]-[KRAB]; [dCas12f1 D510V 단백질]-[HDAC3]-[KRAB]; [KRAB]-[HDAC3]-[dCas12f1 D510A 단백질]; [KRAB]-[HDAC3]-[dCas12f1 D510L 단백질]; [KRAB]-[HDAC3]-[dCas12f1 D510V 단백질]; [HDAC3]-[KRAB]-[dCas12f1 D510A 단백질]; [HDAC3]-[KRAB]-[dCas12f1 D510L 단백질]; 또는 [HDAC3]-[KRAB]-[dCas12f1 D510V 단백질]. 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS은 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 C 말단, dCas12f1 단백질(dCas12f1 D510A 단백질, dCas12f1 D510L 단백질 또는 dCas12f1 D510V 단백질)과 HDAC3 사이 및/또는 KRAB과 HDAC3 사이에 위치할 수 있다.
Cas12f1 융합 단백질 - 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질 예시 3
일 구현예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로, 전사 저해 단백질, dCas12f1 단백질 및 전사 저해 단백질이 순서대로 연결된 것일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질과 전사 저해 단백질은 링커에 의해 연결될 수 있다.
상기 전사 저해 단백질은 KRAB, MeCP2, DNMT3 또는 HDAC3일 수 있다. 이때, 상기 전사 저해 단백질은 서열번호 274 내지 277에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질을 구성하는 아미노산 서열 중 490번째 아미노산인 아르기닌(R)이 알라닌(A), 글루타민(Q), 류신(L) 또는 트립토판(W)으로 치환된 것일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 490번째 알라닌을 가지는 dCas12f1 R490A 단백질일 수 있다. 또는, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 490번째 글루타민을 가지는 dCas12f1 R490Q 단백질일 수 있다. 또는, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 490번째 류신을 가지는 dCas12f1 R490L 단백질일 수 있다. 또는, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 490번째 트립토판을 가지는 dCas12f1 R490W 단백질일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질은 서열번호 261, 262, 264 및 265에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또는, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질을 구성하는 아미노산 서열 중 510번째 아미노산인 아스파트산(D)이 알라닌(A), 류신(L) 또는 발린(V)으로 치환된 것일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 510번째 알라닌을 가지는 dCas12f1 D510A 단백질일 수 있다. 또는, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 510번째 류신을 가지는 dCas12f1 D510L 단백질일 수 있다. 또는, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 510번째 발린을 가지는 dCas12f1 D510V 단백질일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질은 서열번호 266 내지 268에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 추가 도메인으로 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS는 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단 및/또는 C 말단에 위치할 수 있다. 또는, 상기 하나 이상의 NLS는 상기 dCas12f1 단백질과 전사 저해 단백질 사이에 위치할 수 있다. 또는, 상기 하나 이상의 NLS는 상기 전사 저해 단백질들 사이에 위치할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS는 링커에 의해 dCas12f1 단백질 및/또는 전사 저해 단백질과 연결될 수 있다.
일 예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 다음과 같은 구조를 가질 수 있다: [KRAB]-[dCas12f1 R490A 단백질]-[KRAB]; [KRAB]-[dCas12f1 R490Q 단백질]-[KRAB]; [KRAB]-[dCas12f1 R490L 단백질]-[KRAB]; [KRAB]-[dCas12f1 R490W 단백질]-[KRAB]; [KRAB]-[dCas12f1 R490A 단백질]-[KRAB]; [KRAB]-[dCas12f1 R490Q 단백질]-[KRAB]; [KRAB]-[dCas12f1 R490L 단백질]-[KRAB]; 또는 [KRAB]-[dCas12f1 R490W 단백질]-[KRAB]. 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS은 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 C 말단 및/또는 dCas12f1 단백질(dCas12f1 R490A 단백질, dCas12f1 R490Q 단백질, dCas12f1 R490L 단백질 또는 dCas12f1 R490W 단백질)과 KRAB 사이에 위치할 수 있다.
일 예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 다음과 같은 구조를 가질 수 있다: [KRAB]-[dCas12f1 D510A 단백질]-[KRAB]; [KRAB]-[dCas12f1 D510L 단백질]-[KRAB]; [KRAB]-[dCas12f1 D510V 단백질]-[KRAB]; [KRAB]-[dCas12f1 D510A 단백질]-[KRAB]; [KRAB]-[dCas12f1 D510L 단백질]-[KRAB]; 또는 [KRAB]-[dCas12f1 D510V 단백질]-[KRAB]. 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS은 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 C 말단 및/또는 dCas12f1 단백질(dCas12f1 D510A 단백질, dCas12f1 D510L 단백질 또는 dCas12f1 D510V 단백질)과 KRAB 사이에 위치할 수 있다.
일 예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 다음과 같은 구조를 가질 수 있다: [KRAB]-[dCas12f1 R490A 단백질]-[MeCP2]; [KRAB]-[dCas12f1 R490Q 단백질]-[MeCP2]; [KRAB]-[dCas12f1 R490L 단백질]-[MeCP2]; [KRAB]-[dCas12f1 R490W 단백질]-[MeCP2]; [MeCP2]-[dCas12f1 R490A 단백질]-[KRAB]; [MeCP2]-[dCas12f1 R490Q 단백질]-[KRAB]; [MeCP2]-[dCas12f1 R490L 단백질]-[KRAB]; 또는 [MeCP2]-[dCas12f1 R490W 단백질]-[KRAB]. 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS은 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 C 말단, dCas12f1 단백질(dCas12f1 R490A 단백질, dCas12f1 R490Q 단백질, dCas12f1 R490L 단백질 또는 dCas12f1 R490W 단백질)과 KRAB 사이 및/또는 dCas12f1 단백질(dCas12f1 R490A 단백질, dCas12f1 R490Q 단백질, dCas12f1 R490L 단백질 또는 dCas12f1 R490W 단백질)과 MeCP2 사이에 위치할 수 있다.
일 예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 다음과 같은 구조를 가질 수 있다: [KRAB]-[dCas12f1 D510A 단백질]-[MeCP2]; [KRAB]-[dCas12f1 D510L 단백질]-[MeCP2]; [KRAB]-[dCas12f1 D510V 단백질]-[MeCP2]; [MeCP2]-[dCas12f1 D510A 단백질]-[KRAB]; [MeCP2]-[dCas12f1 D510L 단백질]-[KRAB]; 또는 [MeCP2]-[dCas12f1 D510V 단백질]-[KRAB]. 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS은 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 C 말단, dCas12f1 단백질(dCas12f1 D510A 단백질, dCas12f1 D510L 단백질 또는 dCas12f1 D510V 단백질)과 KRAB 사이 및/또는 dCas12f1 단백질(dCas12f1 D510A 단백질, dCas12f1 D510L 단백질 또는 dCas12f1 D510V 단백질)과 MeCP2 사이에 위치할 수 있다.
일 예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 다음과 같은 구조를 가질 수 있다: [KRAB]-[dCas12f1 R490A 단백질]-[DNMT3]; [KRAB]-[dCas12f1 R490Q 단백질]-[DNMT3]; [KRAB]-[dCas12f1 R490L 단백질]-[DNMT3]; [KRAB]-[dCas12f1 R490W 단백질]-[DNMT3]; [DNMT3]-[dCas12f1 R490A 단백질]-[KRAB]; [DNMT3]-[dCas12f1 R490Q 단백질]-[KRAB]; [DNMT3]-[dCas12f1 R490L 단백질]-[KRAB]; 또는 [DNMT3]-[dCas12f1 R490W 단백질]-[KRAB]. 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS은 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 C 말단, dCas12f1 단백질(dCas12f1 R490A 단백질, dCas12f1 R490Q 단백질, dCas12f1 R490L 단백질 또는 dCas12f1 R490W 단백질)과 KRAB 사이 및/또는 dCas12f1 단백질(dCas12f1 R490A 단백질, dCas12f1 R490Q 단백질, dCas12f1 R490L 단백질 또는 dCas12f1 R490W 단백질)과 DNMT3 사이에 위치할 수 있다.
일 예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 다음과 같은 구조를 가질 수 있다: [KRAB]-[dCas12f1 D510A 단백질]-[DNMT3]; [KRAB]-[dCas12f1 D510L 단백질]-[DNMT3]; [KRAB]-[dCas12f1 D510V 단백질]-[DNMT3]; [DNMT3]-[dCas12f1 D510A 단백질]-[KRAB]; [DNMT3]-[dCas12f1 D510L 단백질]-[KRAB]; 또는 [DNMT3]-[dCas12f1 D510V 단백질]-[KRAB]. 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS은 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 C 말단, dCas12f1 단백질(dCas12f1 D510A 단백질, dCas12f1 D510L 단백질 또는 dCas12f1 D510V 단백질)과 KRAB 사이 및/또는 dCas12f1 단백질(dCas12f1 D510A 단백질, dCas12f1 D510L 단백질 또는 dCas12f1 D510V 단백질)과 DNMT3 사이에 위치할 수 있다.
일 예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 다음과 같은 구조를 가질 수 있다: [KRAB]-[dCas12f1 R490A 단백질]-[HDAC3]; [KRAB]-[dCas12f1 R490Q 단백질]-[HDAC3]; [KRAB]-[dCas12f1 R490L 단백질]-[HDAC3]; [KRAB]-[dCas12f1 R490W 단백질]-[HDAC3]; [HDAC3]-[dCas12f1 R490A 단백질]-[KRAB]; [HDAC3]-[dCas12f1 R490Q 단백질]-[KRAB]; [HDAC3]-[dCas12f1 R490L 단백질]-[KRAB]; 또는 [HDAC3]-[dCas12f1 R490W 단백질]-[KRAB]. 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS은 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 C 말단, dCas12f1 단백질(dCas12f1 R490A 단백질, dCas12f1 R490Q 단백질, dCas12f1 R490L 단백질 또는 dCas12f1 R490W 단백질)과 KRAB 사이 및/또는 dCas12f1 단백질(dCas12f1 R490A 단백질, dCas12f1 R490Q 단백질, dCas12f1 R490L 단백질 또는 dCas12f1 R490W 단백질)과 HDAC3 사이에 위치할 수 있다.
일 예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 다음과 같은 구조를 가질 수 있다: [KRAB]-[dCas12f1 D510A 단백질]-[HDAC3]; [KRAB]-[dCas12f1 D510L 단백질]-[HDAC3]; [KRAB]-[dCas12f1 D510V 단백질]-[HDAC3]; [HDAC3]-[dCas12f1 D510A 단백질]-[KRAB]; [HDAC3]-[dCas12f1 D510L 단백질]-[KRAB]; 또는 [HDAC3]-[dCas12f1 D510V 단백질]-[KRAB]. 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS은 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 C 말단, dCas12f1 단백질(dCas12f1 D510A 단백질, dCas12f1 D510L 단백질 또는 dCas12f1 D510V 단백질)과 KRAB 사이 및/또는 dCas12f1 단백질(dCas12f1 D510A 단백질, dCas12f1 D510L 단백질 또는 dCas12f1 D510V 단백질)과 HDAC3 사이에 위치할 수 있다.
Cas12f1 융합 단백질 - 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질 예시 4
일 구현예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 dCas12f1 단백질 및 3개 이상의 전사 활성 단백질을 포함할 수 있다.
일 구현예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로, dCas12f1 단백질, 전사 저해 단백질, 전사 저해 단백질 및 전사 저해 단백질이 순서대로 연결된 것; 전사 저해 단백질, 전사 저해 단백질, 전사 저해 단백질 및 dCas12f1 단백질이 순서대로 연결된 것; 전사 저해 단백질, 전사 저해 단백질, dCas12f1 단백질 및 전사 저해 단백질이 순서대로 연결된 것; 또는 전사 저해 단백질, dCas12f1 단백질, 전사 저해 단백질 및 전사 저해 단백질이 순서대로 연결된 것 일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질과 전사 저해 단백질은 링커에 의해 연결될 수 있다.
상기 전사 저해 단백질은 KRAB, MeCP2, DNMT3 또는 HDAC3일 수 있다. 이때, 상기 전사 저해 단백질은 서열번호 274 내지 277에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질을 구성하는 아미노산 서열 중 490번째 아미노산인 아르기닌(R)이 알라닌(A), 글루타민(Q), 류신(L) 또는 트립토판(W)으로 치환된 것일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 490번째 알라닌을 가지는 dCas12f1 R490A 단백질일 수 있다. 또는, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 490번째 글루타민을 가지는 dCas12f1 R490Q 단백질일 수 있다. 또는, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 490번째 류신을 가지는 dCas12f1 R490L 단백질일 수 있다. 또는, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 490번째 트립토판을 가지는 dCas12f1 R490W 단백질일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질은 서열번호 261, 262, 264 및 265에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또는, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질을 구성하는 아미노산 서열 중 510번째 아미노산인 아스파트산(D)이 알라닌(A), 류신(L) 또는 발린(V)으로 치환된 것일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 510번째 알라닌을 가지는 dCas12f1 D510A 단백질일 수 있다. 또는, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 510번째 류신을 가지는 dCas12f1 D510L 단백질일 수 있다. 또는, 상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열과 비교하였을 때 510번째 발린을 가지는 dCas12f1 D510V 단백질일 수 있다. 이때, 상기 dCas12f1 단백질은 서열번호 266 내지 268에 제시된 아미노산 서열 중 적어도 하나의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 추가 도메인으로 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS는 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단 및/또는 C 말단에 위치할 수 있다. 또는, 상기 하나 이상의 NLS는 상기 dCas12f1 단백질과 전사 저해 단백질 사이에 위치할 수 있다. 또는, 상기 하나 이상의 NLS는 상기 전사 저해 단백질들 사이에 위치할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS는 링커에 의해 dCas12f1 단백질 및/또는 전사 저해 단백질과 연결될 수 있다.
일 예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 다음과 같은 구조를 가질 수 있다: [dCas12f1 R490A 단백질]-[KRAB]-[KRAB]-[MeCP2]; [dCas12f1 R490Q 단백질]-[KRAB]-[KRAB]-[MeCP2]; [dCas12f1 R490L 단백질]-[KRAB]-[KRAB]-[MeCP2]; [dCas12f1 R490W 단백질]-[KRAB]-[KRAB]-[MeCP2]; [dCas12f1 R490A 단백질]-[KRAB]-[KRAB]-[DNMT3]; [dCas12f1 R490Q 단백질]-[KRAB]-[KRAB]-[DNMT3]; [dCas12f1 R490L 단백질]-[KRAB]-[KRAB]-[DNMT3]; [dCas12f1 R490W 단백질]-[KRAB]-[KRAB]-[DNMT3]; [dCas12f1 R490A 단백질]-[KRAB]-[KRAB]-[HDAC3]; [dCas12f1 R490Q 단백질]-[KRAB]-[KRAB]-[HDAC3]; [dCas12f1 R490L 단백질]-[KRAB]-[KRAB]-[HDAC3]; [dCas12f1 R490W 단백질]-[KRAB]-[KRAB]-[HDAC3]; [dCas12f1 R490A 단백질]-[KRAB]-[MeCP2]-[KRAB]; [dCas12f1 R490Q 단백질]-[KRAB]-[MeCP2]-[KRAB]; [dCas12f1 R490L 단백질]-[KRAB]-[MeCP2]-[KRAB]; [dCas12f1 R490W 단백질]-[KRAB]-[MeCP2]-[KRAB]; [dCas12f1 R490A 단백질]-[KRAB]-[DNMT3]-[KRAB]; [dCas12f1 R490Q 단백질]-[KRAB]-[DNMT3]-[KRAB]; [dCas12f1 R490L 단백질]-[KRAB]-[DNMT3]-[KRAB]; [dCas12f1 R490W 단백질]-[KRAB]-[DNMT3]-[KRAB]; [dCas12f1 R490A 단백질]-[KRAB]-[HDAC3]-[KRAB]; [dCas12f1 R490Q 단백질]-[KRAB]-[HDAC3]-[KRAB]; [dCas12f1 R490L 단백질]-[KRAB]-[HDAC3]-[KRAB] 또는 [dCas12f1 R490W 단백질]-[KRAB]-[HDAC3]-[KRAB]. 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS은 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 C 말단, dCas12f1 단백질(dCas12f1 R490A 단백질, dCas12f1 R490Q 단백질, dCas12f1 R490L 단백질 또는 dCas12f1 R490W 단백질)과 KRAB 사이, KRAB과 KRAB 사이, KRAB과 MeCP2 사이, KRAB과 DNMT3 사이 및/또는 KRAB과 HDAC3 사이에 위치할 수 있다.
일 예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 다음과 같은 구조를 가질 수 있다: [dCas12f1 D510A 단백질]-[KRAB]-[KRAB]-[MeCP2]; [dCas12f1 D510L 단백질]-[KRAB]-[KRAB]-[MeCP2]; [dCas12f1 D510V 단백질]-[KRAB]-[KRAB]-[MeCP2]; [dCas12f1 D510A 단백질]-[KRAB]-[KRAB]-[DNMT3]; [dCas12f1 D510L 단백질]-[KRAB]-[KRAB]-[DNMT3]; [dCas12f1 D510V 단백질]-[KRAB]-[KRAB]-[DNMT3]; [dCas12f1 D510A 단백질]-[KRAB]-[KRAB]-[HDAC3]; [dCas12f1 D510L 단백질]-[KRAB]-[KRAB]-[HDAC3]; [dCas12f1 D510V 단백질]-[KRAB]-[KRAB]-[HDAC3]; [dCas12f1 D510A 단백질]-[KRAB]-[MeCP2]-[KRAB]; D510 [dCas12f1 D510L 단백질]-[KRAB]-[MeCP2]-[KRAB]; [dCas12f1 D510V 단백질]-[KRAB]-[MeCP2]-[KRAB]; [dCas12f1 D510A 단백질]-[KRAB]-[DNMT3]-[KRAB]; [dCas12f1 D510L 단백질]-[KRAB]-[DNMT3]-[KRAB]; [dCas12f1 D510V 단백질]-[KRAB]-[DNMT3]-[KRAB]; [dCas12f1 D510A 단백질]-[KRAB]-[HDAC3]-[KRAB]; [dCas12f1 D510L 단백질]-[KRAB]-[HDAC3]-[KRAB] 또는 [dCas12f1 D510V 단백질]-[KRAB]-[HDAC3]-[KRAB]. 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS은 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 C 말단, dCas12f1 단백질(dCas12f1 D510A 단백질, dCas12f1 D510L 단백질 또는 dCas12f1 D510V 단백질)과 KRAB 사이, KRAB과 KRAB 사이, KRAB과 MeCP2 사이, KRAB과 DNMT3 사이 및/또는 KRAB과 HDAC3 사이에 위치할 수 있다.
일 예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 다음과 같은 구조를 가질 수 있다: [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 R490A 단백질]-[MeCP2]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 R490Q 단백질]-[MeCP2]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 R490L 단백질]-[MeCP2]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 R490W 단백질]-[MeCP2]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 R490A 단백질]-[DNMT3]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 R490Q 단백질]-[DNMT3]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 R490L 단백질]-[DNMT3]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 R490W 단백질]-[DNMT3]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 R490A 단백질]-[HDAC3]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 R490Q 단백질]-[HDAC3]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 R490L 단백질]-[HDAC3]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 R490W 단백질]-[HDAC3]; [KRAB]-[MeCP2]-[dCas12f1 R490A 단백질]-[KRAB]; [KRAB]-[MeCP2]-[dCas12f1 R490Q 단백질]-[KRAB]; [KRAB]-[MeCP2]-[dCas12f1 R490L 단백질]-[KRAB]; [KRAB]-[MeCP2]-[dCas12f1 R490W 단백질]-[KRAB]; [KRAB]-[DNMT3]-[dCas12f1 R490A 단백질]-[KRAB]; [KRAB]-[DNMT3]-[dCas12f1 R490Q 단백질]-[KRAB]; [KRAB]-[DNMT3]-[dCas12f1 R490L 단백질]-[KRAB]; [KRAB]-[DNMT3]-[dCas12f1 R490W 단백질]-[KRAB]; [KRAB]-[HDAC3]-[dCas12f1 R490A 단백질]-[KRAB]; [KRAB]-[HDAC3]-[dCas12f1 R490Q 단백질]-[KRAB]; [KRAB]-[HDAC3]-[dCas12f1 R490L 단백질]-[KRAB] 또는 [KRAB]-[HDAC3]-[dCas12f1 R490W 단백질]-[KRAB]. 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS은 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 C 말단, dCas12f1 단백질(dCas12f1 R490A 단백질, dCas12f1 R490Q 단백질, dCas12f1 R490L 단백질 또는 dCas12f1 R490W 단백질)과 KRAB 사이, dCas12f1 단백질(dCas12f1 R490A 단백질, dCas12f1 R490Q 단백질, dCas12f1 R490L 단백질 또는 dCas12f1 R490W 단백질)과 MeCP2 사이, dCas12f1 단백질(dCas12f1 R490A 단백질, dCas12f1 R490Q 단백질, dCas12f1 R490L 단백질 또는 dCas12f1 R490W 단백질)과 DNMT3 사이, dCas12f1 단백질(dCas12f1 R490A 단백질, dCas12f1 R490Q 단백질, dCas12f1 R490L 단백질 또는 dCas12f1 R490W 단백질)과 HDAC3 사이, KRAB과 KRAB 사이, KRAB과 MeCP2 사이, KRAB과 DNMT3 사이 및/또는 KRAB과 HDAC3 사이에 위치할 수 있다.
일 예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 다음과 같은 구조를 가질 수 있다: [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 D510A 단백질]-[MeCP2]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 D510L 단백질]-[MeCP2]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 D510V 단백질]-[MeCP2]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 D510A 단백질]-[DNMT3]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 D510L 단백질]-[DNMT3]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 D510V 단백질]-[DNMT3]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 D510A 단백질]-[HDAC3]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 D510L 단백질]-[HDAC3]; [KRAB]-[KRAB]-[dCas12f1 D510V 단백질]-[HDAC3]; [KRAB]-[MeCP2]-[dCas12f1 D510A 단백질]-[KRAB]; [KRAB]-[MeCP2]-[dCas12f1 D510L 단백질]-[KRAB]; [KRAB]-[MeCP2]-[dCas12f1 D510V 단백질]-[KRAB]; [KRAB]-[DNMT3]-[dCas12f1 D510A 단백질]-[KRAB]; [KRAB]-[DNMT3]-[dCas12f1 D510L 단백질]-[KRAB]; [KRAB]-[DNMT3]-[dCas12f1 D510V 단백질]-[KRAB]; [KRAB]-[HDAC3]-[dCas12f1 D510A 단백질]-[KRAB]; [KRAB]-[HDAC3]-[dCas12f1 D510L 단백질]-[KRAB] 또는 [KRAB]-[HDAC3]-[dCas12f1 D510V 단백질]-[KRAB]. 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 하나 이상의 NLS를 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 하나 이상의 NLS은 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 N 말단, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질의 C 말단, dCas12f1 단백질(dCas12f1 D510A 단백질, dCas12f1 D510L 단백질 또는 dCas12f1 D510V 단백질)과 KRAB 사이, dCas12f1 단백질(dCas12f1 D510A 단백질, dCas12f1 D510L 단백질 또는 dCas12f1 D510V 단백질)과 MeCP2 사이, dCas12f1 단백질(dCas12f1 D510A 단백질, dCas12f1 D510L 단백질 또는 dCas12f1 D510V 단백질)과 DNMT3 사이, dCas12f1 단백질(dCas12f1 D510A 단백질, dCas12f1 D510L 단백질 또는 dCas12f1 D510V 단백질)과 HDAC3 사이, KRAB과 KRAB 사이, KRAB과 MeCP2 사이, KRAB과 DNMT3 사이 및/또는 KRAB과 HDAC3 사이에 위치할 수 있다.
2. 엔지니어링 된 가이드 RNA
본 명세서에서 제공하는 CRISPR 조절 시스템은 CRISPR/Cas12f1 시스템의 가이드 RNA를 포함한다. 상기 가이드 RNA는 자연계에 존재하는 야생형 Cas12f1 가이드 RNA 또는 CRISPR/Cas12f1 시스템의 효율 향상을 위해 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA일 수 있다.
Cas12f1 가이드 RNA는 크게 스페이서, 및 스캐폴드 영역으로 나눌 수 있으며, 상기 스캐폴드 영역은 다섯개의 Stem (Stem 1 내지 Stem 5로 명명) 및 하나의 pseudoknot (PK)로 구성된다. 상기 Cas12f1 가이드 RNA는 tracrRNA의 일부(tracrRNA anti-repeat), 및 crRNA 반복 부분(crRNA repeat)의 일부가 상보적으로 결합하여 듀플렉스(duplex)를 이루고 있는 구조를 2개 포함하며, 이를 편의상 crRNA repeat-tracrRNA anti-repeat(R:AR) 부분으로 명명한다. 상기 Stem 5(R:AR2), 및 PK(R:AR1)는 이러한 crRNA repeat-tracrRNA anti-repeat 듀플렉스 구조를 이루고 있다.
본 명세서에서 제공하는 CRISPR 조절 시스템은 발현을 조절하고자 하는 유전자, 즉, 표적 유전자의 전사 조절 영역을 표적하는 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 이용할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 CRISPR 조절 시스템은 표적 유전자의 전사 조절 영역 내에 존재하는 표적 서열과 상보적 결합을 하는 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 포함한다. 이때, 상기 표적 유전자의 전사 조절 영역은 프로모터, 인핸서, 프로모터 근위 요소(promoter-proximal element), operator 및 silencer 등의 표적 유전자의 전사를 조절하는 영역을 모두 포함한다. 상기 CRISPR 조절 시스템에 포함된 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 Cas12f1 융합 단백질과 복합체를 형성하여 Cas12f1 융합 단백질이 표적 유전자의 전사 조절 영역에 위치하도록 역할하는 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서는 CRISPR 조절 시스템을 위해 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 제공한다. 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 자연계에서 발견되는 가이드 RNA에 새로운 구성을 추가하고, 또한 그 구조 일부를 변형한 것이다. 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 그 구성의 3'말단에 새로운 구성인 U-rich tail을 포함하는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 그 구성 중 Cas12f1 단백질과 상호작용하는 역할을 하는 스캐폴드 영역의 적어도 일부가 변형된 것을 특징으로 한다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 엔지니어링 된 스캐폴드 영역, 스페이서, 및 U-rich tail을 포함할 수 있다. 이때, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 가이드 RNA의 스캐폴드 영역과는 다른 것을 특징으로 한다.
엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA의 특징 1 - U-rich tail 포함
본 명세서에서 제공하는 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 자연계에서 발견되는 가이드 RNA에 U-rich tail이 추가된 것을 특징으로 한다. 상기 U-rich tail은 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA의 3'말단 부분에 위치하며, 유리딘이 풍부하게 포함된 부분이다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 3'말단 부분에 유리딘이 풍부하게 포함된 U-rich tail을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 U-rich tail의 서열은 (UaN)bUc로 표현될 수 있다. 이때, 상기 N은 A, U, C, 또는 G 중 하나이며, 상기 a, b, c는 정수이고, 상기 a는 1 이상 5 이하, b는 0 이상 2 이하, c는 1 이상 10 이하일 수 있다.
엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA의 특징 2 - 스캐폴드 영역의 한 군데 이상이 변형됨
본 명세서에서 제공하는 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 자연계에서 발견되는 가이드 RNA와 비교하여, 그 스캐폴드 부분의 일부가 변형된 것을 특징으로 한다. 스캐폴드 영역은 tracrRNA 및 crRNA의 일부를 포함하는 영역으로, Cas12f1 단백질과 상호작용하는 기능을 한다. 상기 스캐폴드 영역에 대해서는 이하 더 자세히 설명할 것이다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 엔지니어링 된 스캐폴드 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 가이드 RNA의 스캐폴드 영역이 변형된 것임을 특징으로 한다. 따라서, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 가이드 RNA의 스캐폴드 영역과는 상이한 서열을 가진다. 일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 가이드 RNA의 스캐폴드 영역 중 일부 영역이 제거된 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 가이드 RNA의 스캐폴드 영역에 포함된 하나 이상의 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다.
엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA의 효과
본 명세서에서 제공하는 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 CRISPR/Cas12f1 시스템에 사용하는 경우, 자연계에서 발견되는 가이드 RNA를 사용하는 경우에 비해 세포 내에서 유전자 편집 활성이 극적으로 향상되는 효과가 나타난다. 또한, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 자연계에서 발견되는 가이드 RNA와 길이가 동등하거나, 더 짧은 길이를 가져 유전자 편집 기술 분야에서 응용 가능성이 높다. 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 사용하면 CRISPR/Cas12f1 시스템의 장점 (예를 들어, 크기가 매우 작다는 장점)을 충분히 유전자 편집 및 유전자 발현 조절 기술에 활용할 수 있게 된다.
엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA의 용도
본 명세서에서 제공하는 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 Cas12f1 단백질과 함께 유전자 발현 조절 용도로 사용될 수 있다. 또한, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 유전자 발현 조절용 조성물을 제조하기 위한 용도로 사용할 수 있다.
이하에서, 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA의 구성 및 다양한 구현예에 대해 설명한다.
1) U-rich tail
U-rich tail - 개괄
본 명세서에서는 CRISPR 조절 시스템의 효율 향상을 위해 도입할 수 있는 U-rich tail을 제공한다. 상기 U-rich tail 서열은 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA 중 crRNA의 스페이서의 3'말단에 연결되어 있는 것을 특징으로 하며, 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA가 사용된 CRISPR/Cas12f1 시스템의 표적 핵산에 대한 편집 효율을 높이는 역할을 한다. 상기 U-rich tail 서열은 기본적으로 유리딘을 풍부하게 포함하고 있으며, 유리딘이 하나 이상 연속된 서열을 포함한다. 상기 U-rich tail 서열은 엔지니어링 된 CRISPR/Cas12f1 시스템의 실제 사용 환경 및 발현 환경(예를 들어, 진핵 세포 또는 원핵 세포 내부 환경)에 따라 유리딘 외 추가적인 염기를 더 포함할 수 있다.
상기 U-rich tail 서열은 PCT/KR2020/014961출원에 개시된 U-rich tail 서열일 수 있다. 이하 본 명세서에서 U-rich tail 서열을 지칭할 때, PCT/KR2020/014961출원에 개시된 상기 U-rich tail 서열에 대한 내용 및 실험 결과를 모두 포함하는 것으로 이해해야 한다.
U-rich tail 서열 구조 1 - 유리딘 연속 서열
U-rich tail 서열을 설계하는 데 있어 중요한 점 중 하나는, 유리딘이 하나 이상 연속된 서열을 풍부하게 포함시키는 것이다. 본 발명자들은 실험을 통해 유리딘이 1개 이상 연속된 서열인 U-rich tail 서열을 CRISPR/Cas12f1 시스템에 도입한 경우, 상기 CRISPR/Cas12f1 복합체의 유전자 편집 효율이 향상되는 것을 발견했다. 따라서, 본 명세서에서 제공하는 U-rich tail 서열은 유리딘이 하나 이상 연속된 서열을 포함한다.
일 구현예로, 상기 U-rich tail 서열은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 또는 20개의 유리딘이 연속된 서열을 포함할 수 있다.
U-rich tail 서열 구조 2 - 변형된 유리딘 연속 서열
본 명세서에서 제공하는 U-rich tail 서열은 유리딘이 1개 내지 5개 반복될 때마다, 유리딘이 아닌 다른 리보뉴클레오사이드(A, C, G)가 하나씩 포함된 변형된 유리딘 반복 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 유리딘 연속 서열은 특히 엔지니어링 된 crRNA를 발현하는 벡터를 설계할 때 유용하다.
일 구현예로, 상기 U-rich tail 서열은 UV, UUV, UUUV, UUUUV, 및/또는 UUUUUV 가 하나 이상 반복된 서열을 포함할 수 있다. 이때, 상기 V는 아데노신(A), 사이티딘(C), 구아노신(G) 중 하나이다.
U-rich tail 서열 - 구현예
일 구현예로, 상기 U-rich tail 서열은 (UaN)bUc로 표현될 수 있다. 이때, 상기 N은 아데노신(A), 유리딘(U), 사이티딘(C), 구아노신(G) 중 하나이다. 이때, 상기 a, b, c는 정수이고, a는 1 이상 5 이하, b는 0 이상이다. 일 구현예로, 상기 b는 0 이상 2 이하일 수 있다. 일 구현예로, 상기 c는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 수 있다. 일 구현예로, 상기 c는 바로 이전 문장에서 선택된 두 수치범위 내의 정수일 수 있다. 예를 들어, 상기 c는 1 이상 6 이하일 수 있다.
U-rich tail 서열 예시
일 구현예로, 상기 U-rich tail의 서열은 5'-U-3', 5'-UU-3', 5'-UUU-3', 5'-UUUU-3', 5'-UUUUU-3', 5'-UUUUUU-3', 5'-UUURUUU-3', 5'-UUURUUURUUU-3'(서열번호 646), 5'-UUUURU-3', 5'-UUUURUU-3', 5'-UUUURUUU-3', 5'-UUUURUUUU-3', 5'-UUUURUUUUU-3'(서열번호 647), 또는 5'-UUUURUUUUUU-3'(서열번호 648)일 수 있다. 일 구현예로, 상기 U-rich tail의 서열은 5'-U-3', 5'-UU-3', 5'-UUU-3', 5'-UUUU-3', 5'-UUUUU-3', 5'-UUUUUU-3', 5'-UUUAUUU-3', 5'-UUUAUUUAUUU-3'(서열번호 254), 5'-UUUUAU-3', 5'-UUUUAUU-3', 5'-UUUUAUUU-3', 5'-UUUUAUUUU-3', 5'-UUUUAUUUUU-3'(서열번호 255), 5'-UUUUAUUUUUU-3'(서열번호 256), 5'-UUUGUUU-3', 5'-UUUGUUUGUUU-3'(서열번호 257), 5'-UUUUGU-3', 5'-UUUUGUU-3', 5'-UUUUGUUU-3', 5'-UUUUGUUUU-3', 5'-UUUUGUUUUU-3'(서열번호 258), 또는 5'-UUUUGUUUUUU-3'(서열번호 259)일 수 있다.
일 구현예로, 상기 U-rich tail의 서열은 5'-UUUUUU-3', 5'-UUUUAUUUUUU-3'(서열번호 256), 또는 5'-UUUUGUUUUUU-3'(서열번호 259) 일 수 있다. 일 구현예로, 상기 U-rich tail의 서열은 5'-UUUUAUUUU-3'일 수 있다.
2) Cas12f1 가이드 RNA의 부분을 지칭하는 용어의 설명
Cas12f1 가이드 RNA의 부분 - 개괄
자연계에서 발견되는 Cas12f1 가이드 RNA는 tracrRNA 및 crRNA로 나뉘며, 상기 crRNA는 다시 crRNA 반복 서열 부분 및 스페이서로 나눌 수 있다는 것이 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.
상기 기준과는 별개로, 본 명세서에서는 상기 Cas12f1 가이드 RNA 중 Cas12f1 단백질과 상호작용하는 부분을 통틀어 스캐폴드 영역이라 지칭한다. 상기 스캐폴드 영역은 tracrRNA 및 crRNA의 일부를 포함하며, 반드시 한 분자의 RNA를 지칭하는 것은 아니다. 상기 스캐폴드 영역은 다시 제1 영역, 제2 영역, 제3 영역, 제4 영역, 제5 영역, 및 제6 영역으로 세분화될 수 있다. 상기 세분화된 영역을 tracrRNA, crRNA 상에서 서술하면, 상기 제1 영역 내지 제4 영역은 tracrRNA에 포함되고, 상기 제5 영역 내지 상기 제6 영역은 crRNA, 구체적으로 crRNA 반복 서열 부분에 포함된다.
이하 서술되는 "제n 영역", 또는 "자연계에서 발견되는 제n 영역" (n은 1 이상 6이하의 정수)은 기본적으로 자연계에서 발견되는 Cas12f1 가이드 RNA의 각 부분을 지칭한다. 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA 내 상기 분류 기준과 대응되는 영역은 일반적으로 "변형된 제n 영역" 내지 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 제n 영역"으로 서술된다.
다만, 엔지니어링 된 스캐폴드 영역에 포함된 제n 영역일지라도, 달리 변형되지 않아 자연계에서 발견되는 제n 영역과 동일한 경우가 있을 수 있는데, 그 때에 한해 "제n 영역"이라는 용어는 혼용될 수 있다. 이때, 상기 "제n 영역"이 지칭하는 대상(예를 들어, 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA에 포함된 영역인지, 자연계에서 발견되는 가이드 RNA에 포함된 영역인지 여부)은 문맥에 따라 적절히 해석되어야 한다.
tracrRNA, crRNA
본 명세서에서 "tracrRNA", "crRNA"라고 쓰는 경우, CRISPR/Cas 기술 분야에서 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함한다. 이는, 자연계에서 발견되는 듀얼 가이드 RNA의 각 분자를 지칭하는 용어로 사용되는 것이 일반적이지만, 상기 tracrRNA 및 crRNA를 링커로 연결한 싱글 가이드 RNA의 각 해당 부분을 지칭하는데도 사용될 수 있다. 달리 서술하지 않는 한, tracrRNA 및 crRNA라고만 기재하는 경우 CRISPR/Cas12f1 시스템을 구성하는 tracrRNA 및 crRNA를 의미한다.
일 구현예로, tracrRNA의 서열은 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3' (서열번호 1) 또는 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUUUCCUCUCCAAUUCUGCACAA-3' (서열번호 2)일 수 있다. 일 구현예로, 상기 tracrRNA는 제1 영역, 제2 영역, 제3 영역, 및 제4 영역을 포함한다. 일 구현예로, 상기 tracrRNA는 5'말단에서 3'말단 방향으로, 제1 영역, 제2 영역, 제3 영역, 및 제4 영역이 순서대로 연결된 것이다.
일 구현예로, crRNA의 서열은 crRNA 반복 서열 및 스페이서 서열을 포함한다. 이때, 상기 crRNA 반복 서열은 5'-GAAUGAAGGAAUGCAAC-3' (서열번호 3) 또는 5'-GUUGCAGAACCCGAAUAGACGAAUGAAGGAAUGCAAC-3' (서열번호 4일) 수 있다. 상기 crRNA 반복 서열은 제5 영역, 및 제6 영역을 포함한다. 상기 스페이서 서열은 표적 서열에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 10 내지 50개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일 구현예로, 상기 crRNA는 5'말단에서 3'말단 방향으로, 제5 영역, 제6 영역, 및 스페이서가 순서대로 연결된 것이다(서열번호 5 또는 6).
스캐폴드 영역 - 개괄
본 명세서에서 "스캐폴드 영역"이라고 쓰는 경우, 자연계에서 발견되는 가이드 RNA의 부분 중 스페이서를 제외한 나머지 부분을 통틀어 지칭한다. 구체적으로, 상기 스캐폴드 영역은 tracrRNA, 및 crRNA의 일부를 포함한다. 구체적으로, 상기 crRNA의 일부는 crRNA 반복 서열 부분일 수 있다. 상기 스캐폴드 영역은 일반적으로 Cas 단백질과 상호작용할 수 있는 부분으로 알려져있다. 본 명세서에서는 상기 스캐폴드 영역을 제1 영역 내지 제6 영역으로 나누어 서술하며, 각 영역에 대해서는 이하 더 자세히 설명한다.
스캐폴드 영역 1 - 제1 영역
본 명세서에서 "제1 영역"이라고 쓰는 경우, tracrRNA의 5'말단을 포함하는 영역을 지칭한다. 상기 제1 영역은 CRISPR/Cas12f1 복합체 내에서 Stem 구조를 형성하는 뉴클레오타이드를 포함하고, 이와 인접한 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
상기 제1 영역은 Stem 1 부분(Takeda et al., Structure of the miniature type V-F CRISPR-Cas effector enzyme, Molecular Cell 81, 1-13 (2021))을 포함한다. 상기 제1 영역은 상기 Stem 1 부분과 인접한 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
상기 제1 영역은 CRISPR/Cas12f1 복합체에서, Cas12f1 단백질과 상호작용하지 않는 disordered region을 포함한다.
일 구현예로, 상기 제1 영역은 서열번호 1 또는 2로 표현되는 tracrRNA의 5'말단으로부터 1번째 뉴클레오타이드부터 11번째 뉴클레오타이드까지를 의미할 수 있다. 일 구현예로, 상기 제1 영역의 서열은 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAA-3' (서열번호 10)일 수 있다.
스캐폴드 영역 2 - 제2 영역
본 명세서에서 "제2 영역"이라고 쓰는 경우, tracrRNA 내 상기 제1 영역의 3'말단 방향에 위치한 영역을 지칭한다. 상기 제2 영역은 CRISPR/Cas12f1 복합체 내에서 Stem 구조를 형성하는 뉴클레오타이드를 포함하고, 이와 인접한 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이때, 상기 Stem 구조는 상기 제1 영역에 포함된 Stem과는 다른 것이다.
상기 제2 영역은 Stem 2 부분(Takeda et al., Structure of the miniature type V-F CRISPR-Cas effector enzyme, Molecular Cell 81, 1-13 (2021))을 포함한다. 상기 제2 영역은 상기 Stem 2 부분과 인접한 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
상기 제2 영역은 CRISPR/Cas12f1 복합체에서, 이량체를 이루는 하나의 Cas12f1 단백질의 RuvC 도메인, 및/또는 이량체 이루는 다른 하나의 Cas12f1 단백질의 RuvC 도메인과 상호작용하는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 상기 제2 영역은 CRISPR/Cas12f1 복합체에서, Cas12f1 단백질과 상호작용하지 않는 disordered region을 포함한다.
일 구현예로, 상기 제2 영역은 서열번호 1 또는 2로 표현되는 tracrRNA의 5'말단으로부터 22번째 뉴클레오타이드부터 72번째 뉴클레오타이드까지를 의미할 수 있다. 일 구현예로, 상기 제2 영역의 서열은 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3' (서열번호 11일) 수 있다.
스캐폴드 영역 3 - 제3 영역
본 명세서에서 "제3 영역"이라고 쓰는 경우, tracrRNA 내 상기 제2 영역의 3'말단 방향에 위치한 영역을 지칭한다. 상기 제3 영역은 CRISPR/Cas12f1 복합체 내에서 Stem 구조를 형성하는 뉴클레오타이드, 및 crRNA에 포함된 일부 뉴클레오타이드와 상보적인 결합을 형성하고 있는 뉴클레오타이드를 포함하고, 이와 인접한 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
상기 제3 영역은 Stem 4 부분(Takeda et al., Structure of the miniature type V-F CRISPR-Cas effector enzyme, Molecular Cell 81, 1-13 (2021)) 및 Stem 3-PK (R:AR-1) 부분 중 tracrRNA에 속한 뉴클레오타이드(Takeda et al., Structure of the miniature type V-F CRISPR-Cas effector enzyme, Molecular Cell 81, 1-13 (2021))를 포함한다. 상기 제3 영역은 상기 Stem 4 부분 및/또는 Stem 3-PK (R:AR-1) 부분 중 tracrRNA에 속한 뉴클레오타이드와 인접한 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
상기 제3 영역은 CRISPR/Cas12f1 복합체에서, 이량체를 이루는 하나의 Cas12f1 단백질의 WED 도메인, 및/또는 RuvC 도메인과 상호작용하는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다. 이때, 상기 뉴클레오타이드는 Stem 3-PK (R:AR-1) 부분 중 tracrRNA에 속한 뉴클레오타이드일 수 있다.
상기 제3 영역은 CRISPR/Cas12f1 복합체에서, 이량체를 이루는 하나의 Cas12f1 단백질의 RuvC 도메인 및/또는 이량체를 이루는 다른 하나의 Cas12f1 단백질의 REC 도메인과 상호작용하는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다. 이때, 상기 뉴클레오타이드는 Stem 4 부분에 포함된 뉴클레오타이드일 수 있다.
상기 제3 영역은 crRNA의 제6 영역에 포함된 하나 이상의 뉴클레오타이드와 상보적으로 결합하는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예로, 상기 제3 영역은 서열번호 1 또는 2로 표현되는 tracrRNA의 5'말단으로부터 73번째 뉴클레오타이드부터 127번째 뉴클레오타이드까지를 의미할 수 있다. 일 구현예로, 상기 제3 영역의 서열은 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGA-3' (서열번호 12일) 수 있다.
스캐폴드 영역 4 - 제4 영역
본 명세서에서 "제4 영역"이라고 쓰는 경우, tracrRNA의 제3 영역의 3'말단 방향에 위치한 영역을 지칭한다. 상기 제4 영역은 CRISPR/Cas12f1 복합체 내에서 crRNA에 포함된 일부 뉴클레오타이드와 상보적인 결합을 형성할 수 있는 뉴클레오타이드를 포함하고, 이와 인접한 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
상기 제4 영역은 Stem 5 (R:AR-2) 중 tracrRNA에 속한 뉴클레오타이드를 포함한다(Takeda et al., Structure of the miniature type V-F CRISPR-Cas effector enzyme, Molecular Cell 81, 1-13 (2021)). 상기 제4 영역은 상기 Stem 5 (R:AR-2) 중 tracrRNA에 속한 뉴클레오타이드와 인접한 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
상기 제4 영역은 CRISPR/Cas12f1 복합체에서, 이량체를 이루는 하나의 Cas12f1 단백질의 WED 도메인, 및/또는 ZF 도메인과 상호작용하는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이때 상기 뉴클레오타이드는 Stem 5 (R:AR-2) 중 tracrRNA에 속한 뉴클레오타이드일 수 있다.
상기 제4 영역은 crRNA의 제5 영역에 포함된 하나 이상의 뉴클레오타이드와 상보적으로 결합하는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 상기 제4 영역은 CRISPR/Cas12f1 복합체에서, Cas12f1 단백질과 상호작용하지 않는 disordered region을 포함한다.
일 구현예로, 상기 제4 영역은 서열번호 1으로 표현되는 tracrRNA의 5'말단으로부터 128번째 뉴클레오타이드부터 140번째 뉴클레오타이드까지를 의미할 수 있다. 일 구현예로, 상기 제4 영역은 서열번호 2으로 표현되는 tracrRNA의 5'말단으로부터 128번째 뉴클레오타이드부터 162번째 뉴클레오타이드까지를 의미할 수 있다.
일 구현예로, 상기 제4 영역의 서열은 5'-AACAAAUUCAUUU-3' (서열번호 13) 또는 5'-AACAAAUUCAUUUUUCCUCUCCAAUUCUGCACAA-3' (서열번호 14일) 수 있다.
스캐폴드 영역 5 - 제5 영역
본 명세서에서 "제5 영역"이라고 쓰는 경우, crRNA 5'말단을 포함하는 영역을 지칭한다. 상기 제5 영역은 CRISPR/Cas12f1 복합체 내에서 상기 제4 영역의 하나 이상의 뉴클레오타이드와 상보적인 결합을 형성하는 뉴클레오타이드를 포함하며, 이와 인접한 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
상기 제5 영역은 Stem 5 (R:AR-2) 부분 중 crRNA에 속한 뉴클레오타이드를 포함한다(Takeda et al., Structure of the miniature type V-F CRISPR-Cas effector enzyme, Molecular Cell 81, 1-13 (2021)). 상기 제5 영역은 상기 Stem 5 (R:AR-2) 부분 중 crRNA에 속한 뉴클레오타이드와 인접한 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
상기 제5 영역은 CRISPR/Cas12f1 복합체에서, 이량체를 이루는 하나의 Cas12f1 단백질의 WED 도메인, REC 도메인 및/또는 ZF 도메인과 상호작용하는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이때 상기 뉴클레오타이드는 Stem 5 (R:AR-2) 중 crRNA에 속한 뉴클레오타이드일 수 있다.
상기 제5 영역은 상기 제4 영역에 포함된 하나 이상의 뉴클레오타이드와 상보적으로 결합하는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 상기 제5 영역은 CRISPR/Cas12f1 복합체에서, Cas12f1 단백질과 상호작용하지 않는 disordered region을 포함한다.
일 구현예로, 상기 제5 영역은 서열번호 3로 표현되는 crRNA의 5'말단으로부터 1번째 뉴클레오타이드부터 10번째 뉴클레오타이드까지를 의미할 수 있다. 일 구현예로, 상기 제5 영역은 서열번호 4로 표현되는 crRNA의 5'말단으로부터 1번째 뉴클레오타이드부터 30번째 뉴클레오타이드까지를 의미할 수 있다. 일 구현예로, 상기 제5 영역의 서열은 5'-GAAUGAAGGA-3' (서열번호 15) 또는 5'-GUUGCAGAACCCGAAUAGACGAAUGAAGGA-3' (서열번호 16)일 수 있다.
스캐폴드 영역 6 - 제6 영역
본 명세서에서 "제6 영역"이라고 쓰는 경우, crRNA 내 상기 제5 영역의 3'말단 방향에 위치한 영역을 지칭한다. 상기 제6 영역은 CRISPR/Cas12f1 복합체 내에서 상기 제3 영역의 하나 이상의 뉴클레오타이드와 상보적인 결합을 형성하는 뉴클레오타이드를 포함하며, 이와 인접한 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
상기 제6 영역은 PK (R:AR-1) 부분 중 crRNA에 속한 뉴클레오타이드를 포함한다(Takeda et al., Structure of the miniature type V-F CRISPR-Cas effector enzyme, Molecular Cell 81, 1-13 (2021)). 상기 제6 영역은 상기 PK (R:AR-1) 부분 중 crRNA에 속한 뉴클레오타이드와 인접한 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
상기 제6 영역은 CRISPR/Cas12f1 복합체에서, 이량체를 이루는 하나의 Cas12f1 단백질의 WED 도메인, ZF 도메인 및/또는 RuvC 도메인과 상호작용하는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다. 이때, 상기 뉴클레오타이드는 Stem 3-PK (R:AR-1) 부분 중 crRNA에 속한 뉴클레오타이드일 수 있다.
일 구현예로, 상기 제6 영역은 서열번호 3로 표현되는 crRNA의 5'말단으로부터 11번째 뉴클레오타이드부터 17번째 뉴클레오타이드까지를 의미할 수 있다. 일 구현예로, 상기 제6 영역은 서열번호 4로 표현되는 crRNA의 5'말단으로부터 31번째 뉴클레오타이드부터 37번째 뉴클레오타이드까지를 의미할 수 있다. 일 구현예로, 상기 제6 영역의 서열은 5'-AUGCAAC-3'일 수 있다.
스페이서
본 명세서에서 "스페이서"라 쓰는 경우, CRISPR/Cas12f1 시스템에서 표적 서열 부분과 혼성화되는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 지칭한다. 상기 스페이서는, CRISPR/Cas12f1 시스템에서 가이드 RNA의 crRNA의 3'말단 부근의 10개 내지 50개의 연속된 뉴클레오타이드를 지칭한다. 상기 스페이서는 CRISPR/Cas12f1 시스템을 사용하여 편집하고자 하는 표적 핵산의 표적 서열에 대응하여 설계된다. 달리 표현하면, 상기 스페이서는 표적 핵산의 표적 서열에 따라 다양한 서열을 가질 수 있다.
3) 엔지니어링 된 스캐폴드 영역 - 개괄
엔지니어링 된 스캐폴드 영역 개괄
본 명세서에서는 CRISPR 조절 시스템의 표적 유전자 내 타겟팅 효율 향상을 위해 도입할 수 있는 엔지니어링 된 스캐폴드 영역을 제공한다. 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 전술한 U-rich tail과 시너지를 일으켜, 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA가 사용된 CRISPR 조절 시스템의 표적 유전자 내 타겟팅 효율을 향상시킨다. 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 Cas12f1 가이드 RNA의 스캐폴드 영역(이하, 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역)에서 한 군데 이상이 변형되어, 이와는 다른 서열 및/또는 구조를 가지게 된 것이 특징이다.
이때, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 기능은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역과 동일하거나, 유사한 기능을 가진다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 각 부분에 대응하는 영역을 포함한다. 구체적으로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 제1 영역, 제2 영역, 제3 영역, 제4 영역, 제5 영역, 및 제6 영역을 포함하며, 이는 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역에 포함된 제1 영역 내지 제6 영역에 각각 대응된다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역 중 제1 영역 및/또는 제2 영역에 대응되는 영역을 포함하지 않을 수 있다.
싱글 가이드 RNA를 만들기 위한 변형
본 명세서에서 제공하는 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 한 분자의 싱글 가이드 RNA일 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 제공하는 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 각 영역 중 하나 이상이 변형된 것이고, 추가적으로 tracrRNA 제4 영역의 3'말단 및 crRNA 제5 영역의 5' 말단이 링커를 통해 연결된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역에서 한 군데 이상이 변형되고, 상기 제4 영역의 3'말단 및 상기 제5 영역의 5'말단이 링커를 통해 연결된 것일 수 있다. 이때, 상기 링커는 5'-GAAA-3'일 수 있다.
4) 엔지니어링 된 스캐폴드 영역 1 - 제1 영역 변형
제1 영역 변형 개괄
본 명세서에서 제공하는 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역에서 제1 영역이 변형된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제1 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 변형된 제1 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제1 영역에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 제거된 것이다. 이때, 상기 제거된 뉴클레오타이드는 CRISPR/Cas12f1 복합체에서 Stem 구조를 형성하는 영역에서 선택된 뉴클레오타이드이다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA에 포함된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은, 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역 중 제1 영역에 포함된 하나 이상의 뉴클레오타이드가 제거된 것을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 제거된 뉴클레오타이드는 상기 자연계에서 발견되는 제1 영역 중 CRISPR/Cas12f1 복합체에서 Stem 구조를 형성 부분에 포함된 뉴클레오타이드일 수 있다. 일 구현예로, 상기 제거된 뉴클레오타이드는 상기 자연계에서 발견되는 제1 영역 중 Stem 1 (Takeda et al., Structure of the miniature type V-F CRISPR-Cas effector enzyme, Molecular Cell 81, 1-13 (2021))에 속하는 뉴클레오타이드일 수 있다. 일 구현예로, 상기 제거된 뉴클레오타이드는 상기 자연계에서 발견되는 제1 영역 중 CRISPR/Cas12f1 복합체에서 Cas12f1 단백질과 상호작용하지 않는 뉴클레오타이드일 수 있다.
일 구현예로, 상기 변형된 제1 영역은 3'말단 방향에 5'-A-3' 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역을 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역 중 제1 영역이 제거된 것일 수 있다. 달리 표현해, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역 중 제1 영역과 대응되는 영역을 포함하지 않을 수 있다.
제1 영역 변형 내용 1 - 일부 뉴클레오타이드 제거
상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 제1 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제1 영역에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 변형된 제1 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제1 영역에서 5'말단의 1개 내지 20개의 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 변형된 제1 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제1 영역에서 5'말단의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 또는 20개의 연속된 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 변형된 제1 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제1 영역에서 5'말단에서 바로 이전 문장에서 선택된 두 개의 수치범위 내 연속된 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다. 예를 들어, 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제1 영역에서 5'말단의 1개 내지 3개의 연속된 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 변형된 제1 영역은 적어도 하나의 뉴클레오타이드를 포함하며, 이는 5'-A-3'일 수 있다.
제1 영역 변형 내용 2 - 제1 영역 제거
본 명세서에서 제공하는 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역 중 제1 영역이 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제1 영역과 대응되는 영역을 포함하지 않을 수 있다.
제1 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열 예시
일 구현예로, 상기 변형된 제1 영역의 서열은 5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA-3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 5'-AAGUGGAGAA-3'(서열번호 17), 5'-AAAGUGGAGAA-3'(서열번호 18), 5'-UAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 19), 5'-AUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 20), 5'-GAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 21), 5'-UGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 22), 5'-CUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 23), 5'-ACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 24), 5'-CACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 25), 5'-UCACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 26), 및 5'-UUCACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 27)에서 선택된 것일 수 있다.
일 구현예로, 제1 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA-3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 서열번호 17 내지 27으로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 11,
서열번호 12, 및
서열번호 13이 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로, 서열번호 15 및 5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제1 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'-ACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 119), 5'-AACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 120), 5'-GAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 121), 5'-AGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 122), 5'-GAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 123), 5'-GGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 124), 5'-UGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 125), 5'-GUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 126), 5'-AGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 127), 5'-AAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 128), 5'-AAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 129), 5'-UAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 130), 5'-AUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 131), 5'-GAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 132), 5'-UGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 133), 5'-CUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 134), 5'-ACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 135), 5'-CACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 136), 5'-UCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 137), 및 5'-UUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 138)로 이뤄진 군에서 선택된 서열; 및
5'-GAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 3).
일 구현예로, 제1 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA-3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 및 서열번호 17 내지 27으로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 11,
서열번호 12, 및
서열번호 14가 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로, 서열번호 16 및 5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제1 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'에서 3'말단 방향으로,
5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA-3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 및 서열번호 17 내지 27로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 11,
서열번호 12,
서열번호 13,
링커,
서열번호 15, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 것일 수 있다.
이때, 상기 링커는 5'-GAAA-3'일 수 있다.
일 구현예로, 제1 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'-ACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 168), 5'-AACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 169), 5'-GAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 170), 5'-AGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 171), 5'-GAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 172), 5'-GGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 173), 5'-UGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 174), 5'-GUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 175), 5'-AGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 176), 5'-AAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 177), 5'-AAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 178), 5'-UAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 179), 5'-AUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 180), 5'-GAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 181), 5'-UGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 182), 5'-CUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 183), 5'-ACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 184), 5'-CACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 185), 5'-UCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 186), 및 5'-UUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 187)에서 선택된 서열일 수 있다.
제1 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열 예시
일 구현예로, 제1 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
서열번호 11,
서열번호 12, 및
서열번호 13이 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로, 서열번호 15 및 5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제1 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 379); 및
서열번호 3.
일 구현예로, 제1 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
서열번호 11,
서열번호 12, 및
서열번호 14가 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로, 서열번호 16 및 5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제1 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'에서 3'말단 방향으로,
서열번호 11,
서열번호 12,
서열번호 13,
링커,
서열번호 15, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 것일 수 있다.
이때, 상기 링커는 5'-GAAA-3'일 수 있다.
일 구현예로, 제1 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'CCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 487)일 수 있다.
5) 엔지니어링 된 스캐폴드 영역 2 - 제2 영역 변형
제2 영역 변형 개괄
본 명세서에서 제공하는 엔지니어링 된 가이드 RNA에 포함된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역에서 제2 영역이 변형된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제2 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 변형된 제2 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제2 영역에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 제거된 것이다. 이때, 상기 제거된 뉴클레오타이드는 CRISPR/Cas12f1 복합체에서 Stem 구조를 형성하는 영역에서 선택된 뉴클레오타이드이다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA에 포함된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은, 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역 중 제2 영역에 포함된 하나 이상의 뉴클레오타이드가 제거된 것을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 뉴클레오타이드의 제거는 상기 자연계에서 발견되는 제2 영역 중 Stem 구조를 형성하는 부분에서 일어난 것이고, 뉴클레오타이드가 베이스 페어 단위로 제거된 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 제거된 뉴클레오타이드는 상기 자연계에서 발견되는 제2 영역 중 CRISPR/Cas12f1 복합체에서 Stem 구조를 형성하는 부분에 포함된 뉴클레오타이드일 수 있다. 일 구현예로, 상기 제거된 뉴클레오타이드는 상기 자연계에서 발견되는 제2 영역 중 Stem 2 (Takeda et al., Structure of the miniature type V-F CRISPR-Cas effector enzyme, Molecular Cell 81, 1-13 (2021))에 속하는 뉴클레오타이드일 수 있다. 일 구현예로, 상기 제거된 뉴클레오타이드는 상기 자연계에서 발견되는 제2 영역 중 CRISPR/Cas12f1 복합체에서 Cas12f1 단백질과 상호작용하지 않는 뉴클레오타이드일 수 있다.
일 구현예로, 상기 변형된 제2 영역은 3'말단 방향에 5'-G-3' 서열을 가지는 것을 특징으로 한다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역을 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역 중 제2 영역이 제거된 것일 수 있다. 달리 표현해, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역 중 제2 영역과 대응되는 영역을 포함하지 않을 수 있다.
제2 영역 변형 내용 1 - 일부 뉴클레오타이드 제거
상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 제2 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제2 영역에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 변형된 제2 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제2 영역에서 1개 내지 51개의 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 변형된 제2 영역은 상기 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제2 영역에서, 서열번호 11 서열 기준, 5'말단으로부터 1번째 내지 22번째 뉴클레오타이드, 및/또는 27번째 내지 51번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상이 제거된 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 변형된 제2 영역은 상기 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제2 영역에서, 서열번호 11 서열 기준, 5'말단으로부터 1번째 내지 22번째 뉴클레오타이드, 및/또는 27번째 내지 51번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상이 제거되고, 23번째 내지 26번째 뉴클레오타이드가 다른 것으로 치환된 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 변형된 제2 영역은 상기 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제2 영역에서, 서열번호 11 서열 기준, 5'말단으로부터 1번째 내지 22번째 뉴클레오타이드 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 또는 22개의 연속된 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 변형된 제2 영역은 상기 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제2 영역에서, 서열번호 11 서열 기준, 5'말단으로부터 27번째 내지 51번째 뉴클레오타이드 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 또는 25개의 연속된 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 변형된 제2 영역의 서열은 적어도 5'-G-3'을 포함하는 것을 특징으로 한다.
제2 영역 변형 내용 2 - 베이스 페어 단위 제거
상기 제2 영역의 변형은 Stem 구조를 형성하는 부분에 포함된 서로 상보적인 결합을 하는 한 쌍 이상의 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 변형된 제2 영역은 상기 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제2 영역에서, 서열번호 11 서열 기준, 5'말단으로부터 1번째 내지 22번째 뉴클레오타이드, 및 27번째 내지 50번째 뉴클레오타이드 중 CRISPR/Cas12f1 복합체에서 베이스 페어를 이루는 1쌍 이상의 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 변형된 제2 영역은 상기 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제2 영역에서, 서열번호 11 서열 기준, 5'말단으로부터 1번째 내지 22번째 뉴클레오타이드, 및 27번째 내지 50번째 뉴클레오타이드 중 CRISPR/Cas12f1 복합체에서 베이스 페어를 이루는 1쌍 이상의 뉴클레오타이드 및/또는 베이스 페어를 이루지 않는 1개 이상의 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 변형된 제2 영역은 상기 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제2 영역에서, 서열번호 11 서열 기준, 5'말단으로부터 1번째 내지 22번째 뉴클레오타이드, 및 27번째 내지 50번째 뉴클레오타이드 중 CRISPR/Cas12f1 복합체에서 베이스 페어를 이루는 1쌍 이상의 뉴클레오타이드 및/또는 미스매치인 1쌍 이상의 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 변형된 제2 영역은 서열번호 139 내지 149에 제시된 서열 중 적어도 하나의 서열을 가질 수 있다.
제2 영역 변형 내용 3 - 제2 영역 제거
본 명세서에서 제공하는 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역 중 제2 영역이 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제2 영역과 대응되는 영역이 없는 것일 수 있다.
제2 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열 예시
일 구현예로, 상기 변형된 제2 영역의 서열은 5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5'-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', 5'-CCUUAGGUGG-3'(서열번호 342), 5'-CCGUUAGGUGG-3'(서열번호 343), 5'-CCGCUUAGGGUGG-3'(서열번호 344), 5'-CCGCUUUAGAGGUGG-3'(서열번호 345), 5'-CCGCUUUUAGAAGGUGG-3'(서열번호 346), 5'-CCGCUUCUUAGGAAGGUGG-3'(서열번호 347), 5'-CCGCUUCAUUAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 348), 5'-CCGCUUCACUUAGGUGAAGGUGG-3'(서열번호 349), 5'-CCGCUUCACUUAGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 350), 5'-CCGCUUCACCUUAGGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 351), 5'-CCGCUUCACCAUUAGUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 352), 5'-CCGCUUCACCAAUUAGUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 353), 5'-CCGCUUCACCAAAUUAGCUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 354), 5'-CCGCUUCACCAAAAUUAGACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 355), 5'-CCGCUUCACCAAAAGUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 356), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUUAGGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 357), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUUUAGAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 358), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUUAGUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 359), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUUAGUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 360), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUUUAGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 361) 및 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUCUUAGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 362)로 이뤄진 군에서 선택된 서열일 수 있다.
일 구현예로, 변형된 제2 영역의 서열은 서열번호 363 내지 378로 제시된 서열 중 적어도 하나의 서열일 수 있다.
일 구현예로, 제2 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
서열번호 10,
5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5'-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', 및 서열번호 342 내지 362로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 12, 및
서열번호 13이 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로, 서열번호 15 및 5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제2 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAAGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 381), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAAUUAGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 382), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACUUAGGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 383), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACUUAGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 384), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCUUAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 385), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGUUAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 386), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUAGGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 387), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUUAGAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 388), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUUUAGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 389), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCUUAGGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 390), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCAUUAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 391), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACUUAGGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 392), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACUUAGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 393), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCUUAGGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 394), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAUUAGUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 395), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAUUAGUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 396), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAUUAGCUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 397), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAUUAGACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 398), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 399), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUUAGGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 400), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUUUAGAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 401), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUUAGUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 402), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUUAGUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 403), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUUUAGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 404), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCUUAGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 405), 및 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCUUAGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 406)로 이뤄진 군에서 선택된 서열; 및
서열번호 3.
일 구현예로, 제2 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
서열번호 10,
5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5'-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', 및 서열번호 342 내지 362로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 12,
서열번호 14가 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로, 서열번호 16 및 5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제2 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로, 서열번호 10, 5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5'-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', 및 서열번호 342 내지 362로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 서열번호 12, 서열번호 13, 링커, 서열번호 15, 및 5'-AUGCAAC-3'가 연결된 것일 수 있다.
이때, 상기 링커는 5'-GAAA-3'일 수 있다.
일 구현예로, 제2 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAAGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 408), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAAUUAGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 409), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACUUAGGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 410), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACUUAGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 411), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCUUAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 412), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGUUAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 413), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUAGGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 414), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUUAGAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 415), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUUUAGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 416), 5’-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCUUAGGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 417), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCAUUAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 418), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACUUAGGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 419), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACUUAGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 420), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCUUAGGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 421), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAUUAGUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 422), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAUUAGUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 423), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAUUAGCUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 424), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAUUAGACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 425), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 426), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUUAGGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 427), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUUUAGAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 428), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUUAGUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 429), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUUAGUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 430), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUUUAGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 431), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCUUAGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 432), 및 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCUUAGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 433)로 이뤄진 군에서 선택된 서열일 수 있다.
제2 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열 예시
일 구현예로, 제2 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
서열번호 10,
서열번호 12, 및
서열번호 13이 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로, 서열번호 15 및 5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제2 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAAGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 380); 및
서열번호 3.
일 구현예로, 제2 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
서열번호 10,
서열번호 12,
서열번호 14이 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로, 서열번호 16 및 5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제2 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 13, 링커, 서열번호 15, 및 5'-AUGCAAC-3'가 연결된 것일 수 있다.
이때, 상기 링커는 5'-GAAA-3'일 수 있다.
일 구현예로, 제2 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAAGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 407)일 수 있다.
6) 엔지니어링 된 스캐폴드 영역 3 - 제3 영역 변형
제3 영역 변형 개괄
본 명세서에서 제공하는 엔지니어링 된 가이드 RNA에 포함된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역에서 제3 영역이 변형된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제3 영역을 포함할 수 있다. 이때, 상기 변형된 제3 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제3 영역에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 제거된 것이다. 이때, 상기 제거된 뉴클레오타이드는 CRISPR/Cas12f1 복합체에서 Stem 구조를 형성하는 영역에서 선택된 뉴클레오타이드이다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA에 포함된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은, 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역 중 제3 영역에 포함된 하나 이상의 뉴클레오타이드가 제거된 것을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 뉴클레오타이드의 제거는 상기 자연계에서 발견되는 제3 영역 중 Stem 구조를 형성하는 부분에서 일어난 것이고, 뉴클레오타이드가 베이스 페어 단위로 제거된 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 제거된 뉴클레오타이드는 상기 자연계에서 발견되는 제3 영역 중 CRISPR/Cas12f1 복합체에서 Stem 구조를 형성하는 부분에 포함된 뉴클레오타이드일 수 있다. 일 구현예로, 상기 제거된 뉴클레오타이드는 상기 자연계에서 발견되는 제3 영역 중 Stem 4 (Takeda et al., Structure of the miniature type V-F CRISPR-Cas effector enzyme, Molecular Cell 81, 1-13 (2021))에 속하는 뉴클레오타이드일 수 있다.
일 구현예로, 상기 변형된 제3 영역은 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAG-3'(서열번호 475), 5'-UUCG-3', 및 5'-CUCGA-3' 서열을 가지는 것을 특징으로 한다.
제3 영역 변형 내용 1 - 일부 뉴클레오타이드 제거
상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 제3 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제3 영역에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 변형된 제3 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제3 영역에서 1개 내지 20개의 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 변형된 제3 영역은 상기 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제3 영역에서, 서열번호 12 서열 기준, 5'말단으로부터 27번째 내지 36번째 뉴클레오타이드, 및/또는 41번째 내지 50번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상이 제거된 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 변형된 제2 영역은 상기 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제2 영역에서, 서열번호 12 서열 기준, 5'말단으로부터 27번째 내지 36번째 뉴클레오타이드 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 연속된 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 변형된 제2 영역은 상기 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제2 영역에서, 서열번호 12 서열 기준, 5'말단으로부터 41번째 내지 50번째 뉴클레오타이드 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 연속된 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다.
제3 영역 변형 내용 2 - 베이스 페어 단위 제거
상기 제3 영역의 변형은 Stem 구조를 형성하는 부분에 포함된 서로 상보적인 결합을 하는 한 쌍 이상의 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 변형된 제3 영역은 상기 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제3 영역에서, 서열번호 12 서열 기준, 5'말단으로부터 27번째 내지 36번째 뉴클레오타이드, 및 41번째 내지 50번째 뉴클레오타이드 중 CRISPR/Cas12f1 복합체에서 베이스 페어를 이루는 1쌍 이상의 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 변형된 제3 영역은 상기 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제3 영역에서, 서열번호 12 서열 기준, 5'말단으로부터 27번째 내지 36번째 뉴클레오타이드, 및 41번째 내지 50번째 뉴클레오타이드 중 CRISPR/Cas12f1 복합체에서 베이스 페어를 이루는 1쌍 이상의 뉴클레오타이드 및/또는 베이스 페어를 이루지 않는 1개 이상의 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 변형된 제3 영역은 상기 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제3 영역에서, 서열번호 12 서열 기준, 5'말단으로부터 27번째 내지 36번째 뉴클레오타이드, 및 41번째 내지 50번째 뉴클레오타이드 중 CRISPR/Cas12f1 복합체에서 베이스 페어를 이루는 1쌍 이상의 뉴클레오타이드 및/또는 미스매치인 1쌍 이상의 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다.
제3 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열 예시
일 구현예로, 상기 변형된 제3 영역의 서열은 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 434), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUUUCGAAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 435), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUUCGAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 436), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUCUUCGGAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 437), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCGAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 438), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUCGGUAACCCUCGA-3'(서열번호 439), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGUUCGUAACCCUCGA-3'(서열번호 440), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUUUCGAACCCUCGA-3'(서열번호 441), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUUCGACCCUCGA-3'(서열번호 442), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUUCGCCCUCGA-3'(서열번호 443), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAUUCGCCCUCGA-3'(서열번호 444), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAUUCGCCUCGA-3'(서열번호 445), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAUUCGCCUCGA-3'(서열번호 446), 및 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGUUCGCUCGA-3'(서열번호 447)로 이뤄진 군에서 선택된 서열일 수 있다.
일 구현예로, 제3 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
서열번호 10,
서열번호 11,
서열번호 434 내지 447로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
서열번호 13이 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로, 서열번호 15 및 5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제3 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUUUCGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 448), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUUCGAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 449), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUCUUCGGAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 450), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCGAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 451), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUCGGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 452), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGUUCGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 453), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUUUCGAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 454), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUUCGACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 455), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUUCGCCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 456), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAUUCGCCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 457), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAUUCGCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 458), 및 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAUUCGCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 459), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGUUCGCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 460)로 이뤄진 군에서 선택된 서열; 및
서열번호 3.
일 구현예로, 제3 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
서열번호 10,
서열번호 11,
서열번호 434 내지 447로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
서열번호 14가 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로, 서열번호 16 및 5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제2 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 434 내지 447로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 링커, 서열번호 15, 및 5'-AUGCAAC-3'가 연결된 것일 수 있다.
이때, 상기 링커는 5'-GAAA-3'일 수 있다.
일 구현예로, 제3 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 461), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUUUCGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 462), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUUCGAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 463), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUCUUCGGAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 464), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCGAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 465), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUCGGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 466), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGUUCGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 467), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUUUCGAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 468), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUUCGACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 469), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUUCGCCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 470), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAUUCGCCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 471), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAUUCGCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 472), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAUUCGCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 473), 및 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGUUCGCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 474)로 이뤄진 군에서 선택된 서열일 수 있다.
7) 엔지니어링 된 스캐폴드 영역 4 - 제4 영역 및 제5 영역 변형
제4 영역 및 제5 영역 변형 개괄
본 명세서에서 제공하는 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역에서 제4 영역 및 제5 영역이 변형된 것일 수 있다. 상기 제4 영역 및 제5 영역은 CRISPR/Cas12f1 복합체 내에서 서로 혼성화되어 Stem을 구성하는 부분을 포함하므로, 해당 부분이 같이 변형되어 엔지니어링 된 스캐폴드 영역을 구성할 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제4 영역 및/또는 변형된 제5 영역을 포함할 수 있다.
변형된 제4 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제4 영역에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 제거된 것을 특징으로 한다. 변형된 제5 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제5 영역에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 제거된 것을 특징으로 한다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA에 포함된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은, 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역 중 제4 영역 및/또는 제5 영역의 하나 이상의 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 변형된 제4 영역은 5'말단 방향에 5'-AACAAA-3' 서열을 가지는 것을 특징으로 한다. 일 구현예로, 상기 변형된 제5 영역은 3'말단 방향에 5'-GGA-3' 서열을 가지는 것을 특징으로 한다.
제4 영역 및 제5 영역 변형 내용 1 - 일부 뉴클레오타이드 제거
상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 제4 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역 중 제4 영역에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다. 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 제5 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역 중 제5 영역에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 변형된 제4 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제4 영역에서 1개 내지 7개의 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 변형된 제4 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제4 영역에서 1개 내지 28개의 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 변형된 제4 영역은 상기 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제4 영역에서, 서열번호 13 서열 기준, 5'말단으로부터 7번째 내지 13번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상이 제거된 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 변형된 제4 영역은 상기 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제4 영역에서, 서열번호 14 서열 기준, 5'말단으로부터 7번째 내지 34번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상이 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 변형된 제4 영역의 서열은 적어도 5'-AACAAA-3'을 포함하는 것을 특징으로 한다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 변형된 제5 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제5 영역에서 1개 내지 7개의 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 변형된 제5 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제5 영역에서 1개 내지 27개의 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 변형된 제5 영역은 상기 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제5 영역에서, 서열번호 15 서열 기준, 5'말단으로부터 1번째 내지 7번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상이 제거된 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 변형된 제5 영역은 상기 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제5 영역에서, 서열번호 16 서열 기준, 5'말단으로부터 1번째 내지 27번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상이 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 변형된 제5 영역의 서열은 적어도 5'-GGA-3'을 포함하는 것을 특징으로 한다.
제4 영역 및 제5 영역 변형 내용 3 - 베이스 페어 단위 제거
상기 제4 영역 및 제5 영역은 CRISPR/Cas12 복합체 내에서 서로 상보적으로 결합하여 Stem을 이루는 것으로 알려져 있다. 전술한 제4 영역 및 제5 영역의 변형은 이러한 Stem을 구성하는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 대상으로 하므로, 상기 제4 영역 및 제5 영역의 변형은 Stem을 구성하는 뉴클레오타이드들을 베이스 페어 단위로 제거하는 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 변형된 제4 영역 및 제5 영역은 상기 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제4 영역 및 제5 영역에서, 서열번호 13 서열 기준, 7번째 내지 13번째 뉴클레오타이드 및, 서열번호 15 서열 기준, 1번째 내지 7번째 뉴클레오타이드 중 CRISPR/Cas12f1 복합체에서 베이스 페어를 이루는 1쌍 이상의 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 변형된 제4 영역 및 제5 영역은 상기 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제4 영역 및 제5 영역에서, 서열번호 13 서열 기준, 7번째 내지 13번째 뉴클레오타이드 및, 서열번호 15 서열 기준, 1번째 내지 7번째 뉴클레오타이드 중 CRISPR/Cas12f1 복합체에서 베이스 페어를 이루는 1쌍 이상의 뉴클레오타이드 및/또는 베이스 페어를 이루지 않는 1개 이상의 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 변형된 제4 영역 및 제5 영역은 상기 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제4 영역 및 제5 영역에서, 서열번호 13 서열 기준, 7번째 내지 13번째 뉴클레오타이드 및, 서열번호 15 서열 기준, 1번째 내지 7번째 뉴클레오타이드 중 CRISPR/Cas12f1 복합체에서 베이스 페어를 이루는 1쌍 이상의 뉴클레오타이드 및/또는 미스매치인 1쌍 이상의 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 변형된 제4 영역 및 제5 영역은 상기 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제4 영역 및 제5 영역에서, 서열번호 14 서열 기준, 7번째 내지 34번째 뉴클레오타이드 및, 서열번호 16 서열 기준, 1번째 내지 27번째 뉴클레오타이드 중 CRISPR/Cas12f1 복합체에서 베이스 페어를 이루는 1쌍 이상의 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 변형된 제4 영역 및 제5 영역은 상기 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제4 영역 및 제5 영역에서, 서열번호 14 서열 기준, 7번째 내지 34번째 뉴클레오타이드 및, 서열번호 16 서열 기준, 1번째 내지 27번째 뉴클레오타이드 중 CRISPR/Cas12f1 복합체에서 베이스 페어를 이루는 1쌍 이상의 뉴클레오타이드 및/또는 베이스 페어를 이루지 않는 1개 이상의 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 변형된 제4 영역 및 제5 영역은 상기 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제4 영역 및 제5 영역에서, 서열번호 14 서열 기준, 7번째 내지 34번째 뉴클레오타이드 및, 서열번호 16 서열 기준, 1번째 내지 27번째 뉴클레오타이드 중 CRISPR/Cas12f1 복합체에서 베이스 페어를 이루는 1쌍 이상의 뉴클레오타이드 및/또는 미스매치인 1쌍 이상의 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다.
변형된 제4 영역 및 제5 영역 서열 예시
일 구현예로, 상기 변형된 제4 영역의 서열은 5'-AACAAA-3', 5'-AACAAAU-3', 5'-AACAAAUU-3', 5'-AACAAAUUC-3', 5'-AACAAAUUCA-3'(서열번호 67), 5'-AACAAAUUCAU-3'(서열번호 68), 및 5'-AACAAAUUCAUU-3'(서열번호 69)로 이뤄진 군에서 선택된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 변형된 제4 영역의 서열은 5'-AACAAA-3', 5'-AACAAAU-3', 5'-AACAAAUU-3', 5'-AACAAAUUC-3', 5'-AACAAAUUCA-3'(서열번호 67), 5'-AACAAAUUCAU-3'(서열번호 68), 5'-AACAAAUUCAUU-3'(서열번호 69), 5'-AACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 70), 5'-AACAAAUUCAUUUU-3'(서열번호 71), 5'-AACAAAUUCAUUUUU-3'(서열번호 72), 5'-AACAAAUUCAUUUUUC-3'(서열번호 73), 5'-AACAAAUUCAUUUUUCC-3'(서열번호 74), 5'-AACAAAUUCAUUUUUCCU-3'(서열번호 75), 5'-AACAAAUUCAUUUUUCCUC-3'(서열번호 76), 5'-AACAAAUUCAUUUUUCCUCU-3'(서열번호 77), 5'-AACAAAUUCAUUUUUCCUCUC-3'(서열번호 78), 5'-AACAAAUUCAUUUUUCCUCUCC-3'(서열번호 79), 5'-AACAAAUUCAUUUUUCCUCUCCA-3'(서열번호 80), 5'-AACAAAUUCAUUUUUCCUCUCCAA-3'(서열번호 81), 5'-AACAAAUUCAUUUUUCCUCUCCAAU-3'(서열번호 82), 5'-AACAAAUUCAUUUUUCCUCUCCAAUU-3'(서열번호 83), 5'-AACAAAUUCAUUUUUCCUCUCCAAUUC-3'(서열번호 84), 5'-AACAAAUUCAUUUUUCCUCUCCAAUUCU-3'(서열번호 85), 5'-AACAAAUUCAUUUUUCCUCUCCAAUUCUG-3'(서열번호 86), 5'-AACAAAUUCAUUUUUCCUCUCCAAUUCUGC-3'(서열번호 87), 5'-AACAAAUUCAUUUUUCCUCUCCAAUUCUGCA-3'(서열번호 88), 5'-AAACAAAUUCAUUUUUCCUCUCCAAUUCUGCAC-3'(서열번호 89), 및 5'-AACAAAUUCAUUUUUCCUCUCCAAUUCUGCACA-3'(서열번호 90)로 이뤄진 군에서 선택된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 변형된 제5 영역의 서열은 5'-GGA-3', 5'-AGGA-3', 5'-AAGGA-3', 5'-GAAGGA-3', 5'-UGAAGGA-3', 5'-AUGAAGGA-3', 및 5'-AAUGAAGGA-3'에서 선택된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 변형된 제5 영역의 서열은 5'-GGA-3', 5'-AGGA-3', 5'-AAGGA-3', 5'-GAAGGA-3', 5'-UGAAGGA-3', 5'-AUGAAGGA-3', 5'-AAUGAAGGA-3', 5'-GAAUGAAGGA-3'(서열번호 91), 5'-CGAAUGAAGGA-3'(서열번호 92), 5'-ACGAAUGAAGGA-3'(서열번호 93), 5'-GACGAAUGAAGGA-3'(서열번호 94), 5'-AGACGAAUGAAGGA-3'(서열번호 95), 5'-UAGACGAAUGAAGGA-3'(서열번호 96), 5'-AUAGACGAAUGAAGGA-3'(서열번호 97), 5'-AAUAGACGAAUGAAGGA-3'(서열번호 98), 5'-GAAUAGACGAAUGAAGGA-3'(서열번호 99), 5'-CGAAUAGACGAAUGAAGGA-3'(서열번호 100), 5'-CCGAAUAGACGAAUGAAGGA-3'(서열번호 101), 5'-CCCGAAUAGACGAAUGAAGGA-3'(서열번호 102), 5'-ACCCGAAUAGACGAAUGAAGGA-3'(서열번호 103), 5'-AACCCGAAUAGACGAAUGAAGGA-3'(서열번호 104), 5'-GAACCCGAAUAGACGAAUGAAGGA-3'(서열번호 105), 5'-AGAACCCGAAUAGACGAAUGAAGGA-3'(서열번호 106), 5'-CAGAACCCGAAUAGACGAAUGAAGGA-3'(서열번호 107), 5'-GCAGAACCCGAAUAGACGAAUGAAGGA-3'(서열번호 108), 5'-UGCAGAACCCGAAUAGACGAAUGAAGGA-3'(서열번호 109), 및 5'-UUGCAGAACCCGAAUAGACGAAUGAAGGA-3'(서열번호 110)로 이뤄진 군에서 선택된 것일 수 있다.
일 구현예로, 제4 영역 및 제5 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
서열번호 10,
서열번호 11,
서열번호 12, 및
5'-AACAAA-3', 5'-AACAAAU-3', 5'-AACAAAUU-3', 5'-AACAAAUUC-3', 서열번호 67 내지 69로 이뤄진 군에서 선택된 서열이 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-GGA-3', 5'-AGGA-3', 5'-AAGGA-3', 5'-GAAGGA-3', 5'-UGAAGGA-3', 5'-AUGAAGGA-3', 및 5'-AAUGAAGGA-3'로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제4 영역 및 제5 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAA-3'(서열번호 150), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAU-3'(서열번호 151), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUU-3'(서열번호 152), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUC-3'(서열번호 153), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCA-3'(서열번호 154), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAU-3'(서열번호 155), 및 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUU-3'(서열번호 156)로 이뤄진 군에서 선택된 서열; 및
5'-GGAAUGCAAC-3'(서열번호 161), 5'-AGGAAUGCAAC-3'(서열번호 162), 5'-AAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 163), 5'-GAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 164), 5'-UGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 165), 5'-AUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 166), 및 5'-AAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 167)로 이뤄진 군에서 선택된 서열.
일 구현예로, 제4 영역 및 제5 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
서열번호 10,
서열번호 11,
서열번호 12, 및
5'-AACAAA-3', 5'-AACAAAU-3', 5'-AACAAAUU-3', 5'-AACAAAUUC-3', 서열번호 67 내지 90으로 이뤄진 군에서 선택된 서열이 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-GGA-3', 5'-AGGA-3', 5'-AAGGA-3', 5'-GAAGGA-3', 5'-UGAAGGA-3', 5'-AUGAAGGA-3', 5'-AAUGAAGGA-3', 서열번호 91 내지 110으로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제4 영역 및 제5 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로,
서열번호 10,
서열번호 11,
서열번호 12, 및
5'-AACAAAGAAAGGA-3'(서열번호 111), 5'-AACAAAUGAAAAGGA-3'(서열번호 112), 5'-AACAAAUUGAAAAAGGA-3'(서열번호 113), 5'-AACAAAUUCGAAAGAAGGA-3'(서열번호 114), 5'-AACAAAUUCAGAAAUGAAGGA-3'(서열번호 115), 5'-AACAAAUUCAUGAAAAUGAAGGA-3'(서열번호 116), 및 5'-AACAAAUUCAUUGAAAAAUGAAGGA-3'(서열번호 117)에서 선택된 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 것일 수 있다.
일 구현예로, 제4 영역 및 제5 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAGAAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 200), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUGAAAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 201), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUGAAAAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 202), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCGAAAGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 203), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAGAAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 204), 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUGAAAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 205), 및 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUGAAAAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 206)로 이뤄진 군에서 선택된 것일 수 있다.
8) 엔지니어링 된 스캐폴드 영역 6 - 각 변형의 조합
각 변형의 조합 개괄
본 명세서에서 제공하는 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA에 포함된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은, 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역에 전술한 각 영역 별 변형이 하나 이상 조합된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제1 영역, 및 변형된 제2 영역을 포함할 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제2 영역을 포함하고, 제1 영역이 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제1 영역을 포함하고, 제2 영역이 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 제1 영역 및 제2 영역이 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제1 영역, 및 변형된 제3 영역을 포함할 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제3 영역을 포함하고, 제1 영역이 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제1 영역, 몇 변형된 제4 영역 및 제5 영역을 포함할 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제4 영역 및 제5 영역을 포함하고, 제1 영역이 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제2 영역 및 변형된 제3 영역을 포함할 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제3 영역을 포함하고, 제2 영역이 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제2 영역 및 변형된 제4 영역 및 제5 영역을 포함할 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제4 영역 및 제5 영역을 포함하고, 제2 영역이 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제3 영역 및 변형된 제4 영역 및 제5 영역을 포함할 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제1 영역, 변형된 제2 영역, 및 변형된 제3 영역을 포함할 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제2 영역 및 변형된 제3 영역을 포함하고, 제1 영역이 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제1 영역 및 변형된 제3 영역을 포함하고, 제2 영역이 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제3 영역을 포함하고, 제1 영역 및 제2 영역이 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제1 영역, 변형된 제2 영역, 및 변형된 제4 영역 및 제5 영역을 포함할 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제2 영역 및 변형된 제4 영역 및 제5 영역을 포함하고, 제1 영역이 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제1 영역 및 변형된 제4 영역 및 제5 영역을 포함하고, 제2 영역이 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제4 영역 및 제5 영역을 포함하고, 제1 영역 및 제2 영역이 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제1 영역, 변형된 제3 영역, 및 변형된 제4 영역 및 제5 영역을 포함할 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제3 영역 및 변형된 제4 영역 및 제5 영역을 포함하고, 제1 영역이 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제2 영역, 변형된 제3 영역, 및 변형된 제4 영역 및 제5 영역을 포함할 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제3 영역 및 변형된 제4 영역 및 제5 영역을 포함하고, 제2 영역이 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제1 영역, 변형된 제2 영역, 변형된 제3 영역, 및 변형된 제4 영역 및 제5 영역을 포함할 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제2 영역, 변형된 제3 영역, 및 변형된 제4 영역 및 제5 영역을 포함하고, 제1 영역이 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제1 영역, 변형된 제3 영역, 및 변형된 제4 영역 및 제5 영역을 포함하고, 제2 영역이 제거된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제3 영역 및 변형된 제4 영역 및 제5 영역을 포함하고, 제1 영역 및 제2 영역이 제거된 것일 수 있다.
이때, 상기 변형된 영역은 전술한 각 영역의 변형 단락에서 설명된 바와 같다.
각 변형의 조합 1 - 제1 영역 변형 및 제2 영역 변형
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제1 영역 및 변형된 제2 영역을 포함한다. 이때, 상기 변형된 제1 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 1 - 제1 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 변형된 제2 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 2 - 제2 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다.
일 구현예로, 제1 영역 및 제2 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA-3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 서열번호 17 내지 27으로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5'-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', 및 서열번호 342 내지 362로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 12, 및
서열번호 13이 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로, 서열번호 15 및 5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제1 영역 및 제2 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-ACCGCUUCACCAUUAGUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 157); 및
5'-GAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 3).
일 구현예로, 제1 영역 및 제2 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'에서 3'말단 방향으로,
5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA-3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 서열번호 17 내지 27으로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5'-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', 및 서열번호 342 내지 362로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 12,
서열번호 13,
링커,
서열번호 15, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 것일 수 있다.
이때, 상기 링커는 5'-GAAA-3'일 수 있다.
일 구현예로, 제1 영역 및 제2 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'-ACCGCUUCACCAUUAGUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 207)일 수 있다.
각 변형의 조합 2 - 제2 영역 변형 및 제1 영역 제거
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제2 영역을 포함하고, 제1 영역이 제거된 것이다. 이때, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제1 영역과 대응되는 영역을 포함하지 않는다. 이때, 상기 변형된 제2 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 2 - 제2 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다.
일 구현예로, 제2 영역이 변형되고, 제1 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5'-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', 및 서열번호 342 내지 362로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 12, 및
서열번호 13이 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로, 서열번호 15 및 5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제2 영역이 변형되고, 제1 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 5'에서 3'말단 방향으로,
5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5'-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', 및 서열번호 342 내지 362로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 12,
서열번호 13,
링커,
서열번호 15, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 것일 수 있다.
이때, 상기 링커는 5'-GAAA-3'일 수 있다.
각 변형의 조합 3 - 제1 영역 변형 및 제2 영역 제거
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제1 영역을 포함하고, 제2 영역이 제거된 것이다. 이때, 상기 변형된 제1 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 1 - 제1 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제2 영역과 대응되는 영역을 포함하지 않는다.
일 구현예로, 제1 영역이 변형되고, 제2 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA-3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 서열번호 17 내지 27으로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 12, 및
서열번호 13이 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로, 서열번호 15 및 5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제1 영역이 변형되고, 제2 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA-3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 서열번호 17 내지 27으로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 12,
서열번호 13,
링커,
서열번호 15, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 것일 수 있다.
이때, 상기 링커는 5'-GAAA-3'일 수 있다.
각 변형의 조합 4 - 제1 영역 제거 및 제2 영역 제거
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 제1 영역 및 제2 영역이 제거된 것이다. 이때, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제1 영역과 대응되는 영역을 포함하지 않는다. 이때, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제2 영역과 대응되는 영역을 포함하지 않는다.
일 구현예로, 상기 제1 영역 및 제2 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
서열번호 12, 및
서열번호 13이 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로, 서열번호 15 및 5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제1 영역 및 제2 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 5'에서 3'말단 방향으로,
서열번호 12,
서열번호 13,
링커,
서열번호 15, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 것일 수 있다.
이때, 상기 링커는 5'-GAAA-3'일 수 있다.
각 변형의 조합 5 - 제1 영역 변형 및 제3 영역 변형
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제1 영역 및 변형된 제3 영역을 포함한다. 이때, 상기 변형된 제1 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 1 - 제1 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 변형된 제3 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 3 - 제3 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다.
일 구현예로, 제1 영역 및 제3 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA-3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 서열번호 17 내지 27으로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 11,
서열번호 434 내지 447로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
서열번호 13이 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로, 서열번호 15 및 5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제1 영역 및 제3 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA-3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 서열번호 17 내지 27으로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 11,
서열번호 12,
서열번호 434 내지 447로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
링커,
서열번호 15, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 것일 수 있다.
이때, 상기 링커는 5'-GAAA-3'일 수 있다.
각 변형의 조합 6 - 제3 영역 변형 및 제1 영역 제거
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제3 영역을 포함하고, 제1 영역이 제거된 것이다. 이때, 상기 변형된 제3 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 3 - 제3 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제1 영역과 대응되는 영역을 포함하지 않는다.
일 구현예로, 제3 영역이 변형되고 제1 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
서열번호 11,
서열번호 434 내지 447로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
서열번호 13이 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로, 서열번호 15 및 5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제3 영역이 변형되고 제1 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 5'말단에서 3'말단 방향으로,
서열번호 11,
서열번호 434 내지 447로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
링커,
서열번호 15, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 것일 수 있다.
이때, 상기 링커는 5'-GAAA-3'일 수 있다.
각 변형의 조합 7 - 제1 영역 변형 및 제4 영역 및 제5 영역 변형
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제1 영역, 및 변형된 제4 영역 및 제5 영역을 포함한다. 이때, 상기 변형된 제1 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 1 - 제1 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 변형된 제4 영역 및 제5 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 3 - 제4 영역 및 제5 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다.
일 구현예로, 제1 영역, 및 제4 영역 및 제5 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA-3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 서열번호 17 내지 27으로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 11,
서열번호 12, 및
5'-AACAAA-3', 5'-AACAAAU-3', 5'-AACAAAUU-3', 5'-AACAAAUUC-3', 서열번호 67 내지 69로 이뤄진 군에서 선택된 서열이 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-GGA-3', 5'-AGGA-3', 5'-AAGGA-3', 5'-GAAGGA-3', 5'-UGAAGGA-3', 5'-AUGAAGGA-3', 및 5'-AAUGAAGGA-3'로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제1 영역, 및 제4 영역 및 제5 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-ACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAA-3'(서열번호 158); 및
5'-GGAAUGCAAC-3'(서열번호 161).
일 구현예로, 제1 영역 및 제4 영역 및 제5 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'에서 3'말단 방향으로,
5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA-3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 서열번호 17 내지 27으로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 11,
서열번호 12,
서열번호 111 내지 117에서 선택된 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 것일 수 있다.
일 구현예로, 제1 영역 및 제4 영역 및 제5 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'-ACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAGAAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 208)일 수 있다.
각 변형의 조합 8 - 제4 영역 및 제5 영역 변형 및 제1 영역 제거
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제4 영역 및 제5 영역을 포함하고, 제1 영역이 제거된 것이다. 이때, 상기 변형된 제4 영역 및 제5 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 3 - 제4 영역 및 제5 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제1 영역과 대응되는 영역을 포함하지 않는다.
일 구현예로, 제4 영역 및 제5 영역이 변형되고, 제1 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
서열번호 11,
서열번호 12, 및
5'-AACAAA-3', 5'-AACAAAU-3', 5'-AACAAAUU-3', 5'-AACAAAUUC-3', 서열번호 67 내지 69로 이뤄진 군에서 선택된 서열이 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-GGA-3', 5'-AGGA-3', 5'-AAGGA-3', 5'-GAAGGA-3', 5'-UGAAGGA-3', 5'-AUGAAGGA-3', 및 5'-AAUGAAGGA-3'로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제4 영역 및 제5 영역이 변형되고, 제1 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로,
서열번호 11,
서열번호 12,
서열번호 111 내지 117에서 선택된 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 것일 수 있다.
각 변형의 조합 9 - 제2 영역 변형 및 제3 영역 변형
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제2 영역 및 변형된 제3 영역을 포함한다. 이때, 상기 변형된 제2 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 2 - 제2 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 변형된 제3 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 3 - 제3 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다.
일 구현예로, 제2 영역 및 제3 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
서열번호 10,
5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5'-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', 및 서열번호 342 내지 362로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 434 내지 447로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
서열번호 13이 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로, 서열번호 15 및 5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제2 영역 및 제3 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로,
서열번호 10,
5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5'-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', 및 서열번호 342 내지 362로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 434 내지 447로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
링커,
서열번호 15, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 것일 수 있다.
이때, 상기 링커는 5'-GAAA-3'일 수 있다.
각 변형의 조합 10 - 제3 영역 변형 및 제2 영역 제거
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제3 영역을 포함하고, 제2 영역이 제거된 것이다. 이때, 상기 변형된 제3 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 3 - 제3 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제2 영역과 대응되는 영역을 포함하지 않는다.
일 구현예로, 제3 영역이 변형되고 제2 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
서열번호 10,
서열번호 434 내지 447로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
서열번호 13이 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로, 서열번호 15 및 5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제3 영역이 변형되고 제2 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 5'말단에서 3'말단 방향으로,
서열번호 10,
서열번호 434 내지 447로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
링커,
서열번호 15, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 것일 수 있다.
이때, 상기 링커는 5'-GAAA-3'일 수 있다.
각 변형의 조합 11 - 제2 영역 변형 및 제4 영역 및 제5 영역 변형
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제2 영역 및 변형된 제4 영역 및 제5 영역을 포함한다. 이때, 상기 변형된 제2 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 2 - 제2 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 변형된 제4 영역 및 제5 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 4 - 제4 영역 및 제5 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다.
일 구현예로, 제2 영역, 및 제4 영역 및 제5 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
서열번호 10,
5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5'-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', 및 서열번호 342 내지 362로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 12, 및
5'-AACAAA-3', 5'-AACAAAU-3', 5'-AACAAAUU-3', 5'-AACAAAUUC-3', 서열번호 67 내지 69로 이뤄진 군에서 선택된 서열이 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-GGA-3', 5'-AGGA-3', 5'-AAGGA-3', 5'-GAAGGA-3', 5'-UGAAGGA-3', 5'-AUGAAGGA-3', 및 5'-AAUGAAGGA-3'로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제2 영역, 및 제4 영역 및 제5 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAUUAGUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAA-3'(서열번호 159); 및
5'-GGAAUGCAAC-3'(서열번호 161).
일 구현예로, 제2 영역 및 제4 영역 및 제5 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'에서 3'말단 방향으로,
서열번호 10,
5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5'-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', 및 서열번호 342 내지 362로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 12,
서열번호 111 내지 117에서 선택된 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 것일 수 있다.
일 구현예로, 제2 영역 및 제4 영역 및 제5 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACUUAGAGUGAAGGUGGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAGAAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 209)일 수 있다.
각 변형의 조합 12 - 제4 영역 및 제5 영역 변형, 및 제2 영역 제거
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제4 영역 및 제5 영역을 포함하고, 제2 영역이 제거된 것이다. 이때, 상기 변형된 제4 영역 및 제5 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 3 - 제4 영역 및 제5 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제2 영역과 대응되는 영역을 포함하지 않는다.
일 구현예로, 제4 영역 및 제5 영역이 변형되고, 제2 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
서열번호 10,
서열번호 12, 및
5'-AACAAA-3', 5'-AACAAAU-3', 5'-AACAAAUU-3', 5'-AACAAAUUC-3', 서열번호 67 내지 69로 이뤄진 군에서 선택된 서열이 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-GGA-3', 5'-AGGA-3', 5'-AAGGA-3', 5'-GAAGGA-3', 5'-UGAAGGA-3', 5'-AUGAAGGA-3', 및 5'-AAUGAAGGA-3'로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제4 영역 및 제5 영역이 변형되고, 제1 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로,
서열번호 10,
서열번호 12,
서열번호 111 내지 117에서 선택된 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 것일 수 있다.
각 변형의 조합 13 - 제3 영역 변형, 및 제4 영역 및 제5 영역 변형
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제3 영역 및 변형된 제4 영역 및 제5 영역을 포함한다. 이때, 상기 변형된 제3 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 3 - 제3 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 변형된 제4 영역 및 제5 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 4 - 제4 영역 및 제5 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다.
일 구현예로, 제3 영역, 및 제4 영역 및 제5 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
서열번호 10,
서열번호 11,
서열번호 434 내지 447로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
5'-AACAAA-3', 5'-AACAAAU-3', 5'-AACAAAUU-3', 5'-AACAAAUUC-3', 서열번호 67 내지 69로 이뤄진 군에서 선택된 서열이 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-GGA-3', 5'-AGGA-3', 5'-AAGGA-3', 5'-GAAGGA-3', 5'-UGAAGGA-3', 5'-AUGAAGGA-3', 및 5'-AAUGAAGGA-3'로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제3 영역 및 제4 영역 및 제5 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'에서 3'말단 방향으로,
서열번호 10,
서열번호 11,
서열번호 434 내지 447로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 111 내지 117에서 선택된 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 것일 수 있다.
각 변형의 조합 14 - 제1 영역 변형, 제2 영역 변형, 및 제3 영역 변형
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제1 영역, 변형된 제2 영역, 및 변형된 제3 영역을 포함한다. 이때, 상기 변형된 제1 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 1 - 제1 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 변형된 제2 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 2 - 제2 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 변형된 제3 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 3 - 제3 영역 변형” 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다.
일 구현예로, 제1 영역, 제2 영역, 및 제3 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA-3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 서열번호 17 내지 27으로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5'-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', 및 서열번호 342 내지 362로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 434 내지 447로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
서열번호 13이 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로, 서열번호 15 및 5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제1 영역, 제2 영역, 및 제3 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA-3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 서열번호 17 내지 27으로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5'-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', 및 서열번호 342 내지 362로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 434 내지 447로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
서열번호 13,
링커,
서열번호 15, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 것일 수 있다.
이때, 상기 링커는 5'-GAAA-3'일 수 있다.
각 변형의 조합 15 - 제2 영역 변형, 제3 영역 변형, 및 제1 영역 제거
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제2 영역, 변형된 제3 영역을 포함하고, 제1 영역이 제거된 것이다. 이때, 상기 변형된 제2 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 2 - 제2 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 변형된 제3 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 3 - 제3 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제1 영역과 대응되는 영역을 포함하지 않는다.
일 구현예로, 제2 영역, 및 제3 영역이 변형되고, 제1 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5'-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', 및 서열번호 342 내지 362로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 434 내지 447로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
서열번호 13이 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로, 서열번호 15 및 5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제2 영역, 및 제3 영역이 변형되고, 제1 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5'-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', 및 서열번호 342 내지 362로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 434 내지 447로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
서열번호 13,
링커,
서열번호 15, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 것일 수 있다.
이때, 상기 링커는 5'-GAAA-3'일 수 있다.
각 변형의 조합 16 - 제1 영역 변형, 제3 영역 변형, 및 제2 영역 제거
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제1 영역, 변형된 제3 영역을 포함하고, 제2 영역이 제거된 것이다. 이때, 상기 변형된 제1 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 1 - 제1 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 변형된 제3 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 3 - 제3 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제2 영역과 대응되는 영역을 포함하지 않는다.
일 구현예로, 제1 영역, 및 제3 영역이 변형되고, 제2 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA-3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 서열번호 17 내지 27으로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 434 내지 447로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
서열번호 13이 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로, 서열번호 15 및 5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제1 영역, 및 제3 영역이 변형되고, 제2 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA-3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 서열번호 17 내지 27으로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 434 내지 447로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
서열번호 13,
링커,
서열번호 15, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 것일 수 있다.
이때, 상기 링커는 5'-GAAA-3'일 수 있다.
각 변형의 조합 17 - 제3 영역 변형, 제1 영역 제거, 및 제2 영역 제거
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제3 영역을 포함하고, 제1 영역 및 제2 영역이 제거된 것이다. 이때, 상기 변형된 제3 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 3 - 제3 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제1 영역과 대응되는 영역을 포함하지 않는다. 이때, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제2 영역과 대응되는 영역을 포함하지 않는다.
일 구현예로, 제3 영역이 변형되고, 제1 영역 및 제2 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 다음을 포함할 수 있다.
5'말단에서 3'말단 방향으로,
서열번호 434 내지 447로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
서열번호 13이 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로, 서열번호 15 및 5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제3 영역이 변형되고, 제1 영역 및 제2 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로,
서열번호 434 내지 447로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
서열번호 13,
링커,
서열번호 15, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 것일 수 있다.
이때, 상기 링커는 5'-GAAA-3'일 수 있다.
각 변형의 조합 18 - 제1 영역 변형, 제2 영역 변형, 및 제4 영역 및 제5 영역 변형
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제1 영역, 변형된 제2 영역 및 변형된 제4 영역 및 제5 영역을 포함한다. 이때, 상기 변형된 제1 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 1 - 제1 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 변형된 제2 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 2 - 제2 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 변형된 제4 영역 및 제5 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 4 - 제4 영역 및 제5 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다.
일 구현예로, 제1 영역, 제2 영역, 및 제4 영역 및 제5 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA-3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 서열번호 17 내지 27으로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5'-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', 및 서열번호 342 내지 362로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 12, 및
5'-AACAAA-3', 5'-AACAAAU-3', 5'-AACAAAUU-3', 5'-AACAAAUUC-3', 서열번호 67 내지 69로 이뤄진 군에서 선택된 서열이 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-GGA-3', 5'-AGGA-3', 5'-AAGGA-3', 5'-GAAGGA-3', 5'-UGAAGGA-3', 5'-AUGAAGGA-3', 및 5'-AAUGAAGGA-3'로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제1 영역, 제2 영역, 및 제4 영역 및 제5 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-ACCGCUUCACCAUUAGUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAA-3'(서열번호 160); 및
5'-GGAAUGCAAC-3'(서열번호 161).
일 구현예로, 제1 영역, 제2 영역 및 제4 영역 및 제5 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'에서 3'말단 방향으로,
5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA-3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 서열번호 17 내지 27으로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5'-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', 및 서열번호 342 내지 362로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 12,
서열번호 111 내지 117에서 선택된 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 것일 수 있다.
일 구현예로, 제1 영역, 제2 영역 및 제4 영역 및 제5 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'-ACCGCUUCACUUAGAGUGAAGGUGGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAGAAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 210)일 수 있다.
각 변형의 조합 19 - 제2 영역 변형, 제4 영역 및 제5 영역 변형, 및 제1 영역 제거
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제2 영역, 변형된 제4 영역 및 제5 영역을 포함하고, 제1 영역이 제거된 것이다. 이때, 상기 변형된 제2 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 2 - 제2 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 변형된 제4 영역 및 제5 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 3 - 제4 영역 및 제5 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제1 영역과 대응되는 영역을 포함하지 않는다.
일 구현예로, 제2 영역, 및 제4 영역 및 제5 영역이 변형되고, 제1 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5'-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', 및 서열번호 342 내지 362로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 12, 및
5'-AACAAA-3', 5'-AACAAAU-3', 5'-AACAAAUU-3', 5'-AACAAAUUC-3', 서열번호 67 내지 69로 이뤄진 군에서 선택된 서열이 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-GGA-3', 5'-AGGA-3', 5'-AAGGA-3', 5'-GAAGGA-3', 5'-UGAAGGA-3', 5'-AUGAAGGA-3', 및 5'-AAUGAAGGA-3'로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제2 영역, 및 제4 영역 및 제5 영역이 변형되고, 제1 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5'-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', 및 서열번호 342 내지 362로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 12,
서열번호 111 내지 117에서 선택된 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 것일 수 있다.
각 변형의 조합 20 - 제1 영역 변형, 제4 영역 및 제5 영역 변형, 및 제2 영역 제거
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제1 영역, 변형된 제4 영역 및 제5 영역을 포함하고, 제2 영역이 제거된 것이다. 이때, 상기 변형된 제1 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 1 - 제1 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 변형된 제4 영역 및 제5 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 3 - 제4 영역 및 제5 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제2 영역과 대응되는 영역을 포함하지 않는다.
일 구현예로, 제1 영역, 제4 영역 및 제5 영역이 변형되고, 제2 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA-3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 서열번호 17 내지 27으로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 12, 및
5'-AACAAA-3', 5'-AACAAAU-3', 5'-AACAAAUU-3', 5'-AACAAAUUC-3', 서열번호 67 내지 69로 이뤄진 군에서 선택된 서열이 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-GGA-3', 5'-AGGA-3', 5'-AAGGA-3', 5'-GAAGGA-3', 5'-UGAAGGA-3', 5'-AUGAAGGA-3', 및 5'-AAUGAAGGA-3'로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제1 영역, 제4 영역 및 제5 영역이 변형되고, 제2 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA-3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 서열번호 17 내지 27으로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 12,
서열번호 111 내지 117에서 선택된 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 것일 수 있다.
각 변형의 조합 21 - 제4 영역 및 제5 영역 변형, 제1 영역 제거, 및 제2 영역 제거
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제4 영역 및 제5 영역을 포함하고, 제1 영역 및 제2 영역이 제거된 것이다. 이때, 상기 변형된 제4 영역 및 제5 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 3 - 제4 영역 및 제5 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제1 영역과 대응되는 영역을 포함하지 않는다. 이때, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제2 영역과 대응되는 영역을 포함하지 않는다.
일 구현예로, 제4 영역 및 제5 영역이 변형되고, 제1 영역 및 제2 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
서열번호 12, 및
5'-AACAAA-3', 5'-AACAAAU-3', 5'-AACAAAUU-3', 5'-AACAAAUUC-3', 서열번호 67 내지 69로 이뤄진 군에서 선택된 서열이 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-GGA-3', 5'-AGGA-3', 5'-AAGGA-3', 5'-GAAGGA-3', 5'-UGAAGGA-3', 5'-AUGAAGGA-3', 및 5'-AAUGAAGGA-3'로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제4 영역 및 제5 영역이 변형되고, 제1 영역 및 제2 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로,
서열번호 12,
서열번호 111 내지 117에서 선택된 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 것일 수 있다.
각 변형의 조합 22 - 제1 영역 변형, 제3 영역 변형, 및 제4 영역 및 제5 영역 변형
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제1 영역, 변형된 제3 영역 및 변형된 제4 영역 및 제5 영역을 포함한다. 이때, 상기 변형된 제1 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 1 - 제1 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 변형된 제3 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 3 - 제3 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 변형된 제4 영역 및 제5 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 4 - 제4 영역 및 제5 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다.
일 구현예로, 제1 영역, 제3 영역, 및 제4 영역 및 제5 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA-3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 서열번호 17 내지 27으로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 11,
서열번호 434 내지 447로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
5'-AACAAA-3', 5'-AACAAAU-3', 5'-AACAAAUU-3', 5'-AACAAAUUC-3', 서열번호 67 내지 69로 이뤄진 군에서 선택된 서열이 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-GGA-3', 5'-AGGA-3', 5'-AAGGA-3', 5'-GAAGGA-3', 5'-UGAAGGA-3', 5'-AUGAAGGA-3', 및 5'-AAUGAAGGA-3'로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제1 영역, 제3 영역, 및 제4 영역 및 제5 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA-3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 서열번호 17 내지 27으로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 11,
서열번호 434 내지 447로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 111 내지 117에서 선택된 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 것일 수 있다.
각 변형의 조합 23 - 제3 영역 변형, 제4 영역 및 제5 영역 변형, 및 제1 영역 제거
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제3 영역, 및 변형된 제4 영역 및 제5 영역을 포함하고, 제1 영역이 제거된 것이다. 이때, 상기 변형된 제3 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 3 - 제3 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 변형된 제4 영역 및 제5 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 3 - 제4 영역 및 제5 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제1 영역과 대응되는 영역을 포함하지 않는다.
일 구현예로, 제3 영역, 및 제4 영역 및 제5 영역이 변형되고, 제1 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 다음을 포함할 수 있다:
서열번호 11,
서열번호 434 내지 447로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
5'-AACAAA-3', 5'-AACAAAU-3', 5'-AACAAAUU-3', 5'-AACAAAUUC-3', 서열번호 67 내지 69로 이뤄진 군에서 선택된 서열이 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-GGA-3', 5'-AGGA-3', 5'-AAGGA-3', 5'-GAAGGA-3', 5'-UGAAGGA-3', 5'-AUGAAGGA-3', 및 5'-AAUGAAGGA-3'로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제3 영역, 및 제4 영역 및 제5 영역이 변형되고, 제1 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로,
서열번호 11,
서열번호 434 내지 447로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 111 내지 117에서 선택된 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 것일 수 있다.
각 변형의 조합 24 - 제2 영역 변형, 제3 영역 변형, 및 제4 영역 및 제5 영역 변형
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제2 영역, 변형된 제3 영역 및 변형된 제4 영역 및 제5 영역을 포함한다. 이때, 상기 변형된 제1 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 2 - 제2 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 변형된 제3 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 3 - 제3 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 변형된 제4 영역 및 제5 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 4 - 제4 영역 및 제5 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다.
일 구현예로, 제2 영역, 제3 영역, 및 제4 영역 및 제5 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
서열번호 10,
5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5'-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', 및 서열번호 342 내지 362로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 434 내지 447로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
5'-AACAAA-3', 5'-AACAAAU-3', 5'-AACAAAUU-3', 5'-AACAAAUUC-3', 서열번호 67 내지 69로 이뤄진 군에서 선택된 서열이 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-GGA-3', 5'-AGGA-3', 5'-AAGGA-3', 5'-GAAGGA-3', 5'-UGAAGGA-3', 5'-AUGAAGGA-3', 및 5'-AAUGAAGGA-3'로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제2 영역, 제3 영역, 및 제4 영역 및 제5 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로,
서열번호 10,
5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5'-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', 및 서열번호 342 내지 362로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 434 내지 447로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 111 내지 117에서 선택된 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 것일 수 있다.
각 변형의 조합 25 - 제3 영역 변형, 제4 영역 및 제5 영역 변형, 및 제2 영역 제거
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제3 영역, 및 변형된 제4 영역 및 제5 영역을 포함하고, 제2 영역이 제거된 것이다. 이때, 상기 변형된 제3 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 3 - 제3 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 변형된 제4 영역 및 제5 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 3 - 제4 영역 및 제5 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제2 영역과 대응되는 영역을 포함하지 않는다.
일 구현예로, 제3 영역, 및 제4 영역 및 제5 영역이 변형되고, 제2 영역이 제거된 엔지니어린 된 스캐폴드 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
서열번호 10,
서열번호 434 내지 447로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
5'-AACAAA-3', 5'-AACAAAU-3', 5'-AACAAAUU-3', 5'-AACAAAUUC-3', 서열번호 67 내지 69로 이뤄진 군에서 선택된 서열이 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-GGA-3', 5'-AGGA-3', 5'-AAGGA-3', 5'-GAAGGA-3', 5'-UGAAGGA-3', 5'-AUGAAGGA-3', 및 5'-AAUGAAGGA-3'로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제3 영역, 및 제4 영역 및 제5 영역이 변형되고, 제2 영역이 제거된 엔지니어린 된 스캐폴드 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로,
서열번호 10,
서열번호 434 내지 447로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 111 내지 117에서 선택된 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 것일 수 있다.
각 변형의 조합 26 - 제1 영역 변형, 제2 영역 변형, 제3 영역 변형, 및 제4 영역 및 제5 영역 변형
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제1 영역, 변형된 제2 영역, 변형된 제3 영역 및 변형된 제4 영역 및 제5 영역을 포함한다. 이때, 상기 변형된 제1 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 1 - 제1 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 변형된 제2 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 2 - 제2 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 변형된 제3 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 3 - 제3 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 변형된 제4 영역 및 제5 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 4 - 제4 영역 및 제5 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다.
일 구현예로, 제1 영역, 제2 영역, 제3 영역, 및 제4 영역 및 제5 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA-3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 서열번호 17 내지 27으로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5'-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', 및 서열번호 342 내지 362로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 434 내지 447로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
5'-AACAAA-3', 5'-AACAAAU-3', 5'-AACAAAUU-3', 5'-AACAAAUUC-3', 서열번호 67 내지 69로 이뤄진 군에서 선택된 서열이 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-GGA-3', 5'-AGGA-3', 5'-AAGGA-3', 5'-GAAGGA-3', 5'-UGAAGGA-3', 5'-AUGAAGGA-3', 및 5'-AAUGAAGGA-3'로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제1 영역, 제2 영역, 제3 영역, 및 제4 영역 및 제5 영역이 변형된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA-3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 서열번호 17 내지 27으로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5'-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', 및 서열번호 342 내지 362로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 434 내지 447로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 111 내지 117에서 선택된 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 것일 수 있다.
각 변형의 조합 27 - 제2 영역 변형, 제3 영역 변형, 제4 영역 및 제5 영역 변형, 및 제1 영역 제거
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제2 영역, 변형된 제3 영역 및 변형된 제4 영역 및 제5 영역을 포함하고, 제1 영역이 제거된 것이다. 이때, 상기 변형된 제2 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 2 - 제2 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 변형된 제3 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 3 - 제3 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 변형된 제4 영역 및 제5 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 4 - 제4 영역 및 제5 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제1 영역과 대응되는 영역을 포함하지 않는다.
일 구현예로, 제2 영역, 제3 영역, 및 제4 영역 및 제5 영역이 변형되고, 제1 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5'-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', 및 서열번호 342 내지 362로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 434 내지 447로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
5'-AACAAA-3', 5'-AACAAAU-3', 5'-AACAAAUU-3', 5'-AACAAAUUC-3', 서열번호 67 내지 69로 이뤄진 군에서 선택된 서열이 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-GGA-3', 5'-AGGA-3', 5'-AAGGA-3', 5'-GAAGGA-3', 5'-UGAAGGA-3', 5'-AUGAAGGA-3', 및 5'-AAUGAAGGA-3'로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제2 영역, 제3 영역, 및 제4 영역 및 제5 영역이 변형되고, 제1 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5'-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', 및 서열번호 342 내지 362로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 434 내지 447로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 111 내지 117에서 선택된 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 것일 수 있다.
각 변형의 조합 28 - 제1 영역 변형, 제3 영역 변형, 제4 영역 및 제5 영역 변형, 및 제2 영역 제거
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제1 영역, 변형된 제3 영역 및 변형된 제4 영역 및 제5 영역을 포함하고, 제2 영역이 제거된 것이다. 이때, 상기 변형된 제1 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 1 - 제1 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 변형된 제3 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 3 - 제3 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 변형된 제4 영역 및 제5 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 4 - 제4 영역 및 제5 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제2 영역과 대응되는 영역을 포함하지 않는다.
일 구현예로, 제1 영역, 제3 영역, 및 제4 영역 및 제5 영역이 변형되고, 제2 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 다음을 포함할 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA-3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 서열번호 17 내지 27으로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 434 내지 447로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
5'-AACAAA-3', 5'-AACAAAU-3', 5'-AACAAAUU-3', 5'-AACAAAUUC-3', 서열번호 67 내지 69로 이뤄진 군에서 선택된 서열이 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-GGA-3', 5'-AGGA-3', 5'-AAGGA-3', 5'-GAAGGA-3', 5'-UGAAGGA-3', 5'-AUGAAGGA-3', 및 5'-AAUGAAGGA-3'로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제1 영역, 제3 영역, 및 제4 영역 및 제5 영역이 변형되고, 제2 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA-3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 서열번호 17 내지 27으로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 434 내지 447로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 111 내지 117에서 선택된 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 것일 수 있다.
각 변형의 조합 29 - 제3 영역 변형, 제4 영역 변형, 제1 영역 제거, 및 제2 영역 제거
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 변형된 제3 영역 및 변형된 제4 영역 및 제5 영역을 포함하고, 제1 영역 및 제2 영역이 제거된 것이다. 이때, 상기 변형된 제3 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 3 - 제3 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 변형된 제4 영역 및 제5 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 4 - 제4 영역 및 제5 영역 변형" 단락에서 설명된 변형을 모두 포함한다. 이때, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제1 영역과 대응되는 영역을 포함하지 않는다. 이때, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제2 영역과 대응되는 영역을 포함하지 않는다.
일 구현예로, 제3 영역, 및 제4 영역 및 제5 영역이 변형되고, 제1 영역 및 제2 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 다음을 포함할 수 있다:
서열번호 434 내지 447로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
5'-AACAAA-3', 5'-AACAAAU-3', 5'-AACAAAUU-3', 5'-AACAAAUUC-3', 서열번호 67 내지 69로 이뤄진 군에서 선택된 서열이 연결된 서열; 및
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-GGA-3', 5'-AGGA-3', 5'-AAGGA-3', 5'-GAAGGA-3', 5'-UGAAGGA-3', 5'-AUGAAGGA-3', 및 5'-AAUGAAGGA-3'로 이뤄진 군에서 선택된 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 서열.
일 구현예로, 제3 영역, 및 제4 영역 및 제5 영역이 변형되고, 제1 영역 및 제2 영역이 제거된 엔지니어링 된 스캐폴드 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로,
서열번호 434 내지 447로 이뤄진 군에서 선택된 서열,
서열번호 111 내지 117에서 선택된 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'가 연결된 것일 수 있다.
각 변형의 조합 30 - 제6 영역의 추가적인 변형
전술한 바, 제6 영역 또한 그 기능이 손상되지 않는 범위 내에서 변형될 수 있으므로, 본 명세서에서 제공하는 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 전술한 제1 영역, 제2 영역, 제3 영역, 제4 영역, 및/또는 제5 영역의 변형 내지 제1 영역 및/또는 제2 영역의 제거 외, 제6 영역이 추가적으로 변형된 것일 수 있다.
9) 엔지니어링 된 스캐폴드 영역 6 - 상동성 있는 서열 포함
본 명세서에서 제공하는 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 1 - 제1 영역 변형", "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 2 - 제2 영역 변형", "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 3 - 제3 영역 변형", "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 4 - 제4 영역 및 제5 영역 변형", 및 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역 5 - 각 변형의 조합" 단락에서 서술된 엔지니어링 된 스캐폴드 영역(이하, 전술한 엔지니어링 된 스캐폴드 영역)의 서열과 상동성 있는 서열을 포함한다.
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 전술한 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열 중 어느 하나와 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, 60%, 59%, 58%, 57%, 56%, 55%, 54%, 53%, 52%, 51%, 또는 50% 일치하는, 또는 상동성 있는 서열일 수 있다. 일 구현예로, 상기 스캐폴드 서열은 전술한 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열 중 어느 하나와 바로 이전 문장에서 선택된 두 수치 범위 내 일치하는 서열일 수 있다. 예를 들어, 상기 스캐폴드 서열은 전술한 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열 중 어느 하나와 90% 내지 100% 일치하는 서열일 수 있다.
10) 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA
엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA 개괄
본 명세서에서는 CRISPR 조절 시스템의 세포 내 표적 유전자 타겟팅 효율을 높이기 위한, 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 제공한다. 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 엔지니어링 된 스캐폴드, 스페이서, 및 U-rich tail을 포함한다. 이때, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드는 전술한 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역"에서 설명된 것 중 어느 하나일 수 있다. 이때, 상기 U-rich tail은 "U-rich tail" 단락에서 설명된 것 중 어느 하나일 수 있다.
싱글 가이드 RNA 또는 듀얼 가이드 RNA
상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 싱글 가이드 RNA 또는 듀얼 가이드 RNA일 수 있다. 상기 듀얼 가이드 RNA는 가이드 RNA가 tracrRNA 및 crRNA의 두 분자 RNA로 구성된 것을 의미한다. 상기 싱글 가이드 RNA는 (엔지니어링 된) tracrRNA의 3'말단 및 (엔지니어링 된) crRNA의 5' 말단이 링커를 통해 연결된 것을 의미한다. 달리 표현하면, 상기 듀얼 가이드 RNA에서, 엔지니어링 된 스캐폴드에 포함된 제4 영역의 3'말단 및 제5 영역의 5'말단이 링커를 통해 연결된 것을 의미한다. 이때, 엔지니어링 된 스캐폴드의 각 영역은 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역" 단락들에서 설명된 변형, 및 그 구체적인 서열을 모두 포함할 수 있다.
엔지니어링 된 싱글 가이드 RNA 예시 1
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 5'말단에서 3'말단 방향으로, 엔지니어링 된 스캐폴드 영역, 스페이서, 및 U-rich tail이 순서대로 연결된 것일 수 있다.
상기 스페이서는 10 내지 50 뉴클레오타이드 길이를 가지며, 표적 서열과 상보적인 서열을 가진다.
상기 U-rich tail의 서열은 유리딘 연속 서열, 또는 변형된 유리딘 연속 서열일 수 있다. 일 예로, 상기 U-rich tail 서열은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 또는 20개의 유리딘이 연속된 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 예로, 상기 U-rich tail 서열은 UV, UUV, UUUV, UUUUV, 및/또는 UUUUUV가 하나 이상 반복된 서열을 포함할 수 있다. 이때, 상기 V는 아데노신(A), 사이티딘(C), 구아노신(G) 중 하나이다.
상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 5'말단에서 3'말단 방향으로, 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역과 대응되는 제1 영역, 제2 영역, 제3 영역, 제4 영역, 링커, 제5 영역, 제6 영역이 순서대로 연결된 것이며, 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역과 비교해 제1 영역, 제2 영역, 제4 영역, 및 제5 영역에서 선택된 하나 이상의 영역이 변형된 것일 수 있다.
일 예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 제1 영역이 변형된 경우, 상기 변형된 제1 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제1 영역에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다. 이때, 상기 제거된 뉴클레오타이드는 상기 제1 영역 중 Stem 1 (Takeda et al., Structure of the miniature type V-F CRISPR-Cas effector enzyme, Molecular Cell 81, 1-13 (2021))에 속하는 뉴클레오타이드일 수 있다. 이때, 상기 변형된 제1 영역의 서열은 5'-A-3'을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 제2 영역이 변형된 경우, 상기 변형된 제2 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제2 영역에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다. 이때, 상기 뉴클레오타이드의 제거는 상기 제2 영역 중 Stem 2 구조(Takeda et al., Structure of the miniature type V-F CRISPR-Cas effector enzyme, Molecular Cell 81, 1-13 (2021))를 형성하는 부분에서 일어난 것이고, 서로 베이스 페어를 이루는 뉴클레오타이드가 쌍 단위로 제거된 것일 수 있다. 이때, 상기 변형된 제2 영역의 서열은 적어도 5'-CCGCUUCACCA-3'(서열번호 51) 및 5'-UGAGUGAAGGUG-3'(서열번호 52)을 포함하는 것을 특징으로 한다. 더 구체적으로, 상기 변형된 제2 영역의 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로 5'-CCGCUUCACCA-3'(서열번호 51) 및 5'-UGAGUGAAGGUG-3'(서열번호 52)가 순서대로 연결되어 있을 수 있으며, 적절한 중간 서열을 통해 연결되어 있을 수 있다. 일 예로, 상기 중간 서열은 5'-UUAG-3', 5'-AUUAGU-3', 5'-AAUUAGCU-3', 5'-AAAUUAGACU-3'(서열번호 58), 5'-AAAGUUAGAACU-3'(서열번호 59), 5'-AAAGCUUAGGAACU-3'(서열번호 60), 5'-AAAGCUUUAGAGAACU-3'(서열번호 61), 5'-AAAGCUGUUAGUUAGAACU-3'(서열번호 62), 5'-AAAGCUGUUAGUAGAACU-3'(서열번호 63), 5'-AAAGCUGUUUAGAUUAGAACU-3'(서열번호 64), 5'-AAAGCUGUCUUAGGAUUAGAACU-3'(서열번호 65), 및 5'-AAAGCUGUCCUUAGGGAUUAGAACU-3'(서열번호 66)로 이뤄진 군에서 선택된 것일 수 있다.
또 다른 예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 제4 영역 및 제5 영역이 변형된 경우, 상기 변형된 제4 영역 및 제5 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역 중 제4 영역 및/또는 제5 영역의 하나 이상의 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다. 이때, 상기 뉴클레오타이드의 제거는 상기 제4 영역 및 제5 영역 중 Stem 5 (R:AR-2) 구조(Takeda et al., Structure of the miniature type V-F CRISPR-Cas effector enzyme, Molecular Cell 81, 1-13 (2021))를 형성하는 부분에서 일어난 것이고, 서로 베이스 페어를 이루는 뉴클레오타이드가 쌍 단위로 제거된 것일 수 있다. 이때, 상기 변형된 제4 영역의 서열은 적어도 5'-AACAAA-3'을 포함하는 것을 특징으로 한다. 이때, 상기 변형된 제5 영역의 서열은 적어도 5'-GGA-3'을 포함하는 것을 특징으로 한다.
엔지니어링 된 싱글 가이드 RNA 예시 2
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 5'말단에서 3'말단 방향으로, 엔지니어링 된 스캐폴드 영역, 스페이서, 및 U-rich tail이 순서대로 연결된 것일 수 있다.
상기 스페이서는 10 내지 50 뉴클레오타이드 길이를 가지며, 표적 서열과 상보적인 서열을 가진다.
상기 U-rich tail의 서열은 (UaN)bUc로 표현될 수 있다. 이때, 상기 N은 아데노신(A), 유리딘(U), 사이티딘(C), 구아노신(G) 중 하나이고, 상기 a, b, c는 정수이고, a는 1 이상 5 이하, b는 0 이상이다. 일 예로, 상기 U-rich tail의 서열은 5'-UUUUAUUUU-3'일 수 있다. 일 예로, 상기 U-rich tail의 서열은 5'-UUUUGUUUU-3'일 수 있다.
상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로 다음 서열이 순서대로 연결된 것이다:
5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA-3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 5'-AAGUGGAGAA-3'(서열번호 17), 5'-AAAGUGGAGAA-3'(서열번호 18), 5'-UAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 19), 5'-AUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 20), 5'-GAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 21), 5'-UGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 22), 5'-CUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 23), 5'-ACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 24), 5'-CACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 25), 5'-UCACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 26), 5'-UUCACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 27), 및 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 10)로 이뤄진 군에서 선택된 서열;
5'-CCGCUUCACUUAGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 350), 5'-CCGCUUCACCUUAGGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 351), 5'-CCGCUUCACCAUUAGUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 39), 5'-CCGCUUCACCAAUUAGUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 40), 5'-CCGCUUCACCAAAUUAGCUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 41), 5'-CCGCUUCACCAAAAUUAGACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 42), 5'-CCGCUUCACCAAAAGUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 43), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUUAGGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 44), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUUUAGAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 45), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUUAGUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 46), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUUAGUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 47), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUUUAGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 48), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUCUUAGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 49), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUCCUUAGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 50), 및 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 11)로 이뤄진 군에서 선택된 서열;
5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 12);
5'-AACAAAGAAAGGA-3'(서열번호 111), 5'-AACAAAUGAAAAGGA-3'(서열번호 112), 5'-AACAAAUUGAAAAAGGA-3'(서열번호 113), 5'-AACAAAUUCGAAAGAAGGA-3'(서열번호 114), 5'-AACAAAUUCAGAAAUGAAGGA-3'(서열번호 115), 5'-AACAAAUUCAUGAAAAUGAAGGA-3'(서열번호 116), 5'-AACAAAUUCAUUGAAAAAUGAAGGA-3'(서열번호 117), 및 5'-AACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGA-3'(서열번호 118)에서 선택된 서열; 및
5'-AUGCAAC-3',
이때, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 7)과 상이한 것을 특징으로 한다.
엔지니어링 된 싱글 가이드 RNA 예시 3
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 5'말단에서 3'말단 방향으로, 엔지니어링 된 스캐폴드 영역, 스페이서, 및 U-rich tail이 순서대로 연결된 것일 수 있다.
상기 스페이서는 10 내지 50 뉴클레오타이드 길이를 가지며, 표적 서열과 상보적인 서열을 가진다.
상기 U-rich tail의 서열은 (UaN)bUc로 표현될 수 있다. 이때, 상기 N은 아데노신(A), 유리딘(U), 사이티딘(C), 구아노신(G) 중 하나이다. 이때, 상기 a, b, c는 정수이고, a는 1 이상 5 이하, b는 0 이상이다. 일 예로, 상기 U-rich tail의 서열은 5'-UUUUAUUUU-3'일 수 있다. 일 예로, 상기 U-rich tail의 서열은 5'-UUUUGUUUU-3'일 수 있다.
상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로 다음 서열이 순서대로 연결된 것이다:
5'-A-3'로 표현되는 제1 서열;
5'-CCGCUUCACCA-3'(서열번호 51)로 표현되는 제2 서열;
5'-UUAG-3'로 표현되는 제3 서열;
5'-UGAGUGAAGGUG-3'(서열번호 52)로 표현되는 제4 서열;
5'-GGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 12)로 표현되는 제5 서열;
5'-AACAAA-3'로 표현되는 제6 서열;
링커;
5'-GGA-3'로 표현되는 제7 서열; 및
5'-AUGCAAC-3'로 표현되는 제8 서열.
일 예로, 상기 링커는 5'-GAAA-3'일 수 있다.
또 다른 예로, 상기 링커는 5'-GAAA-3', 5'-UGAAAA-3', 5'-UUGAAAAA-3', 5'-UUCGAAAGAA-3'(서열번호 642), 5'-UUCAGAAAUGAA-3'(서열번호 643), 5'-UUCAUGAAAAUGAA-3'(서열번호 644), 및 5'-UUCAUUGAAAAAUGAA-3'(서열번호 645)로 이뤄진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 구현예의 일 구체예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'-A-3', 5'-GA-3', 5'-AGA-3', 5'-GAGA-3', 5'-GGAGA-3', 5'-UGGAGA-3', 5'-GUGGAGA-3', 5'-AGUGGAGA-3', 5'-AAGUGGAGA-3', 5'-AAAGUGGAGA-3'(서열번호 28), 5'-UAAAGUGGAGA-3'(서열번호 29), 5'-AUAAAGUGGAGA-3'(서열번호 30), 5'-GAUAAAGUGGAGA-3'(서열번호 31), 5'-UGAUAAAGUGGAGA-3'(서열번호 32), 5'-CUGAUAAAGUGGAGA-3'(서열번호 33), 5'-ACUGAUAAAGUGGAGA-3'(서열번호 34), 5'-CACUGAUAAAGUGGAGA-3'(서열번호 35), 5'-UCACUGAUAAAGUGGAGA-3'(서열번호 36), 5'-UUCACUGAUAAAGUGGAGA-3'(서열번호 37), 및 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGA-3'(서열번호 38)로 이뤄진 군에서 선택된 제9 서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 이때, 상기 제9 서열의 3'말단은 상기 제1 서열의 5'말단과 연결되어 있을 수 있다.
상기 구현예의 또 다른 구체예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-AAA-3', 5'-AAAG-3', 5'-AAAGC-3', 5'-AAAGCU-3', 5'-AAAGCUG-3', 5'-AAAGCUGU-3', 5'-AAAGCUGUC-3', 5'-AAAGCUGUCC-3'(서열번호 53), 및 5'-AAAGCUGUCCC-3'(서열번호 54)로 이뤄진 군에서 선택된 제10 서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 이때, 상기 제2 서열의 3'말단 및 상기 제3 서열의 5'말단은 상기 제10 서열을 통해 연결되어 있을 수 있다.
상기 구현예의 또 다른 구체예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'-U-3', 5'-CU-3', 5'-ACU-3', 5'-AACU-3', 5'-GAACU-3', 5'-AGAACU-3', 5'-UAGAACU-3', 5'-UUAGAACU-3', 5'-AUUAGAACU-3', 5'-GAUUAGAACU-3'(서열번호 55), 5'-GGAUUAGAACU-3'(서열번호 56), 및 5'-GGGAUUAGAACU-3'(서열번호 57)로 이뤄진 군에서 선택된 제11 서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 이때, 상기 제3 서열의 3'말단 및 상기 제4 서열의 5'말단은 상기 제11 서열을 통해 연결되어 있을 수 있다.
상기 구현예의 또 다른 구체예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-AAA-3', 5'-AAAG-3', 5'-AAAGC-3', 5'-AAAGCU-3', 5'-AAAGCUG-3', 5'-AAAGCUGU-3', 5'-AAAGCUGUC-3', 5'-AAAGCUGUCC-3'(서열번호 53), 및 5'-AAAGCUGUCCC-3'(서열번호 54)로 이뤄진 군에서 선택된 제10 서열 및 5'-U-3', 5'-CU-3', 5'-ACU-3', 5'-AACU-3', 5'-GAACU-3', 5'-AGAACU-3', 5'-UAGAACU-3', 5'-UUAGAACU-3', 5'-AUUAGAACU-3', 5'-GAUUAGAACU-3'(서열번호 55), 5'-GGAUUAGAACU-3'(서열번호 56), 및 5'-GGGAUUAGAACU-3'(서열번호 57)로 이뤄진 군에서 선택된 제11 서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 이때, 상기 제2 서열의 3'말단 및 상기 제3 서열의 5'말단은 상기 제10 서열을 통해 연결되어 있고, 상기 제3 서열의 3'말단 및 상기 제4 서열의 5'말단은 상기 제11 서열을 통해 연결되어 있을 수 있다.
일 예로, 상기 제10 서열이 5'-A-3'인 경우, 상기 제11 서열은 5'-U-3'일 수 있다. 또 다른 예로, 상기 제10 서열이 5'-AA-3'인 경우, 상기 제11 서열은 5'-CU-3'일 수 있다. 또 다른 예로, 상기 제10 서열이 5'-AAA-3'인 경우, 상기 제11 서열은 5'-ACU-3'일 수 있다. 또 다른 예로, 상기 제10 서열이 5'-AAAG-3'인 경우, 상기 제11 서열은 5'-AACU-3'일 수 있다. 또 다른 예로, 상기 제10 서열이 5'-AAAGC-3'인 경우, 상기 제11 서열은 5'-GAACU-3'일 수 있다. 또 다른 예로, 상기 제10 서열이 5'-AAAGCU-3'인 경우, 상기 제11 서열은 5'-AGAACU-3'일 수 있다. 또 다른 예로, 상기 제10 서열이 5'-AAAGCUG-3'인 경우, 상기 제11 서열은 5'-UAGAACU-3' 또는 5'-UUAGAACU-3' 일 수 있다. 또 다른 예로, 상기 제10 서열이 5'-AAAGCUGU-3'인 경우, 상기 제11 서열은 5'-AUUAGAACU-3' 일 수 있다. 또 다른 예로, 상기 제10 서열이 5'-AAAGCUGUC-3'인 경우, 상기 제11 서열은 5'-GAUUAGAACU-3'(서열번호 55) 일 수 있다. 또 다른 예로, 상기 제10 서열이 5'-AAAGCUGUCC-3'(서열번호 53)인 경우, 상기 제11 서열은 5'-GGAUUAGAACU-3'(서열번호 56) 일 수 있다. 또 다른 예로, 상기 제10 서열이 5'-AAAGCUGUCCC-3'(서열번호 54)인 경우, 상기 제11 서열은 5'-GGGAUUAGAACU-3'(서열번호 57) 일 수 있다.
상기 구현예의 또 다른 구체예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'-U-3', 5'-UU-3', 5'-UUC-3', 5'-UUCA-3', 5'-UUCAU-3', 5'-UUCAUU-3', 및 5'-UUCAUUU-3'로 이뤄진 군에서 선택된 제 12서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 이때, 상기 제6 서열의 3'말단 및 상기 링커의 5'말단은 상기 제12 서열을 통해 연결되어 있을 수 있다.
상기 구현예의 또 다른 구체예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-UGAA-3', 5'-AUGAA-3', 5'-AAUGAA-3', 및 5'-GAAUGAA-3'로 이뤄진 군에서 선택된 제 13서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 이때, 상기 링커의 3'말단 및 상기 제7 서열의 5'말단은 상기 제13 서열을 통해 연결되어 있을 수 있다.
상기 구현예의 또 다른 구체예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'-U-3', 5'-UU-3', 5'-UUC-3', 5'-UUCA-3', 5'-UUCAU-3', 5'-UUCAUU-3', 및 5'-UUCAUUU-3'로 이뤄진 군에서 선택된 제 12서열, 및 5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-UGAA-3', 5'-AUGAA-3', 5'-AAUGAA-3', 및 5'-GAAUGAA-3'로 이뤄진 군에서 선택된 제 13서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 이때, 상기 제6 서열의 3'말단 및 상기 링커의 5'말단은 상기 제12 서열을 통해 연결되고, 상기 링커의 3'말단 및 상기 제7 서열의 5'말단은 상기 제13 서열을 통해 연결되어 있을 수 있다.
일 예로, 상기 제12 서열이 5'-U-3'인 경우, 상기 제13 서열은 5'-A-3'일 수 있다. 또 다른 예로, 상기 제12 서열이 5'-UU-3'인 경우, 상기 제13 서열은 5'-AA-3'일 수 있다. 또 다른 예로, 상기 제12 서열이 5'-UUC-3'인 경우, 상기 제13 서열은 5'-GAA-3'일 수 있다. 또 다른 예로, 상기 제12 서열이 5'-UUCA-3'인 경우, 상기 제13 서열은 5'-UGAA-3'일 수 있다. 또 다른 예로, 상기 제12 서열이 5'-UUCAU-3'인 경우, 상기 제13 서열은 5'-AUGAA-3'일 수 있다. 또 다른 예로, 상기 제12 서열이 5'-UUCAUU-3'인 경우, 상기 제13 서열은 5'-AAUGAA-3'일 수 있다. 또 다른 예로, 상기 제12 서열이 5'-UUCAUUU-3'인 경우, 상기 제13 서열은 5'-GAAUGAA-3'일 수 있다.
엔지니어링 된 싱글 가이드 RNA 예시 4
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 5'말단에서 3'말단 방향으로, 엔지니어링 된 스캐폴드 영역, 스페이서, 및 U-rich tail이 순서대로 연결된 것일 수 있다.
상기 스페이서는 10 내지 50 뉴클레오타이드 길이를 가지며, 표적 서열과 상보적인 서열을 가진다.
상기 U-rich tail의 서열은 유리딘 연속 서열, 또는 변형된 유리딘 연속 서열일 수 있다. 일 예로, 상기 U-rich tail 서열은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 또는 20개의 유리딘이 연속된 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 예로, 상기 U-rich tail 서열은 UV, UUV, UUUV, UUUUV, 및/또는 UUUUUV가 하나 이상 반복된 서열을 포함할 수 있다. 이때, 상기 V는 아데노신(A), 사이티딘(C), 구아노신(G) 중 하나이다.
상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 5'말단에서 3'말단 방향으로, 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역과 대응되는 제1 영역, 제2 영역, 제3 영역, 제4 영역, 링커, 제5 영역, 제6 영역이 순서대로 연결된 것이며, 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역과 비교해 제1 영역, 제2 영역, 제3 영역, 제4 영역, 및 제5 영역에서 선택된 하나 이상의 영역이 변형된 것일 수 있다. 더 나아가, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역과 대응되는 제1 영역 및/또는 제2 영역이 제거된 것일 수 있다.
일 예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 제1 영역이 변형된 경우, 상기 변형된 제1 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제1 영역에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다. 이때, 상기 제거된 뉴클레오타이드는 상기 제1 영역 중 Stem 1 (Takeda et al., Structure of the miniature type V-F CRISPR-Cas effector enzyme, Molecular Cell 81, 1-13 (2021))에 속하는 뉴클레오타이드일 수 있다. 이때, 상기 변형된 제1 영역의 서열은 5'-A-3'을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 제2 영역이 변형된 경우, 상기 변형된 제2 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제2 영역에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다. 이때, 상기 뉴클레오타이드의 제거는 상기 제2 영역 중 Stem 2 구조(Takeda et al., Structure of the miniature type V-F CRISPR-Cas effector enzyme, Molecular Cell 81, 1-13 (2021))를 형성하는 부분에서 일어난 것이고, 서로 베이스 페어를 이루는 뉴클레오타이드가 쌍 단위로 제거된 것일 수 있다. 이때, 상기 변형된 제2 영역의 서열은 적어도 5'-G-3'을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 제3 영역이 변형된 경우, 상기 변형된 제3 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역의 제3 영역에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다. 이때, 상기 뉴클레오타이드의 제거는 상기 제3 영역 중 Stem 4 구조(Takeda et al., Structure of the miniature type V-F CRISPR-Cas effector enzyme, Molecular Cell 81, 1-13 (2021))를 형성하는 부분에서 일어난 것이고, 서로 베이스 페어를 이루는 뉴클레오타이드가 쌍 단위로 제거된 것일 수 있다. 이때, 상기 변형된 제3 영역의 서열은 적어도 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAG-3'(서열번호 475), 및 5'-CUCGA-3'을 포함하는 것을 특징으로 한다. 더 구체적으로, 상기 변형된 제3 영역의 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAG-3'(서열번호 475) 및 5'-CUCGA-3'가 순서대로 연결되어 있을 수 있으며, 적절한 중간 서열을 통해 연결되어 있을 수 있다. 일 예로, 상기 중간 서열은 5'-UUCG-3', 5'-AUUCGC-3', 5'-AAUUCGC-3', 5'-AAUUCGCC-3', 5'-AAGUUCGCC-3', 5'-AAGUUCGACC-3'(서열번호 476), 5'-AAGUUUCGAACC-3'(서열번호 477), 5'-AAGUGUUCGUAACC-3'(서열번호 478), 5'-AAGUGCUUCGGUAACC-3'(서열번호 479), 5'-AAGUGCUUUCGAGUAACC-3'(서열번호 480), 5'-AAGUGCUCUUCGGAGUAACC-3'(서열번호 481), 5'-AAGUGCUUUUCGAAGUAACC-3'(서열번호 482), 5'-AAGUGCUUUUUCGAAAGUAACC-3'(서열번호 483), 및 5'-AAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACC-3'(서열번호 484)로 이뤄진 군에서 선택된 것일 수 있다.
또 다른 예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 제4 영역 및 제5 영역이 변형된 경우, 상기 변형된 제4 영역 및 제5 영역은 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역 중 제4 영역 및/또는 제5 영역의 하나 이상의 뉴클레오타이드가 제거된 것일 수 있다. 이때, 상기 뉴클레오타이드의 제거는 상기 제4 영역 및 제5 영역 중 Stem 5 (R:AR-2) 구조(Takeda et al., Structure of the miniature type V-F CRISPR-Cas effector enzyme, Molecular Cell 81, 1-13 (2021))를 형성하는 부분에서 일어난 것이고, 서로 베이스 페어를 이루는 뉴클레오타이드가 쌍 단위로 제거된 것일 수 있다. 이때, 상기 변형된 제4 영역의 서열은 적어도 5'-AACAAA-3'을 포함하는 것을 특징으로 한다. 이때, 상기 변형된 제5 영역의 서열은 적어도 5'-GGA-3'을 포함하는 것을 특징으로 한다.
엔지니어링 된 싱글 가이드 RNA 예시 5
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 5'말단에서 3'말단 방향으로, 엔지니어링 된 스캐폴드 영역, 스페이서, 및 U-rich tail이 순서대로 연결된 것일 수 있다.
상기 스페이서는 10 내지 50 뉴클레오타이드 길이를 가지며, 표적 서열과 상보적인 서열을 가진다.
상기 U-rich tail의 서열은 (UaN)bUc로 표현될 수 있다. 이때, 상기 N은 아데노신(A), 유리딘(U), 사이티딘(C), 구아노신(G) 중 하나이고, 상기 a, b, c는 정수이고, a는 1 이상 5 이하, b는 0 이상이다. 일 예로, 상기 U-rich tail의 서열은 5'-UUUUAUUUU-3'일 수 있다. 일 예로, 상기 U-rich tail의 서열은 5'-UUUUGUUUU-3'일 수 있다.
상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로 다음 서열이 순서대로 연결된 것이다:
5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA-3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 5'-AAGUGGAGAA-3'(서열번호 17), 5'-AAAGUGGAGAA-3'(서열번호 18), 5'-UAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 19), 5'-AUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 20), 5'-GAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 21), 5'-UGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 22), 5'-CUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 23), 5'-ACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 24), 5'-CACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 25), 5'-UCACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 26), 5'-UUCACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 27), 및 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 10)로 이뤄진 군에서 선택된 서열;
5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5'-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', 5'-CCUUAGGUGG-3'(서열번호 342), 5'-CCGUUAGGUGG-3'(서열번호 343), 5'-CCGCUUAGGGUGG-3'(서열번호 344), 5'-CCGCUUUAGAGGUGG-3'(서열번호 345), 5'-CCGCUUUUAGAAGGUGG-3'(서열번호 346), 5'-CCGCUUCUUAGGAAGGUGG-3'(서열번호 347), 5'-CCGCUUCAUUAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 348), 5'-CCGCUUCACUUAGGUGAAGGUGG-3'(서열번호 349), 5'-CCGCUUCACUUAGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 350), 5'-CCGCUUCACCUUAGGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 351), 5'-CCGCUUCACCAUUAGUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 352), 5'-CCGCUUCACCAAUUAGUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 353), 5'-CCGCUUCACCAAAUUAGCUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 354), 5'-CCGCUUCACCAAAAUUAGACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 355), 5'-CCGCUUCACCAAAAGUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 356), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUUAGGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 357), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUUUAGAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 358), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUUAGUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 359), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUUAGUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 360), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUUUAGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 361), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUCUUAGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 362), 및 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 11)로 이뤄진 군에서 선택된 서열;
5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 434), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUUUCGAAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 435), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUUCGAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 436), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUCUUCGGAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 437), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCGAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 438), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUCGGUAACCCUCGA-3'(서열번호 439), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGUUCGUAACCCUCGA-3'(서열번호 440), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUUUCGAACCCUCGA-3'(서열번호 441), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUUCGACCCUCGA-3'(서열번호 442), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUUCGCCCUCGA-3'(서열번호 443), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAUUCGCCCUCGA-3'(서열번호 444), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAUUCGCCUCGA-3'(서열번호 445), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAUUCGCCUCGA-3'(서열번호 446), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGUUCGCUCGA-3'(서열번호 447), 및 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 12)로 이뤄진 군에서 선택된 서열;
5'-AACAAAGAAAGGA-3'(서열번호 111), 5'-AACAAAUGAAAAGGA-3'(서열번호 112), 5'-AACAAAUUGAAAAAGGA-3'(서열번호 113), 5'-AACAAAUUCGAAAGAAGGA-3'(서열번호 114), 5'-AACAAAUUCAGAAAUGAAGGA-3'(서열번호 115), 5'-AACAAAUUCAUGAAAAUGAAGGA-3'(서열번호 116), 5'-AACAAAUUCAUUGAAAAAUGAAGGA-3'(서열번호 117), 및 5'-AACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGA-3'(서열번호 118)에서 선택된 서열; 및
5'-AUGCAAC-3',
이때, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 7)과 상이한 것을 특징으로 한다.
엔지니어링 된 싱글 가이드 RNA 예시 6
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 5'말단에서 3'말단 방향으로, 엔지니어링 된 스캐폴드 영역, 스페이서, 및 U-rich tail이 순서대로 연결된 것일 수 있다.
상기 스페이서는 10 내지 50 뉴클레오타이드 길이를 가지며, 표적 서열과 상보적인 서열을 가진다.
상기 U-rich tail의 서열은 (UaN)bUc로 표현될 수 있다. 이때, 상기 N은 아데노신(A), 유리딘(U), 사이티딘(C), 구아노신(G) 중 하나이다. 이때, 상기 a, b, c는 정수이고, a는 1 이상 5 이하, b는 0 이상이다. 일 예로, 상기 U-rich tail의 서열은 5'-UUUUAUUUU-3'일 수 있다. 일 예로, 상기 U-rich tail의 서열은 5'-UUUUGUUUU-3'일 수 있다.
상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로 다음 서열이 순서대로 연결된 것이다:
5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAG-3'(서열번호 475)로 표현되는 제1 서열;
5'-UUCG-3'로 표현되는 제2 서열;
5'-CUCGA-3'로 표현되는 제3 서열;
5'-AACAAA-3'로 표현되는 제4 서열;
링커;
5'-GGA-3'로 표현되는 제5 서열; 및
5'-AUGCAAC-3'로 표현되는 제6 서열.
일 예로, 상기 링커는 5'-GAAA-3'일 수 있다.
또 다른 예로, 상기 링커는 5'-GAAA-3', 5'-UGAAAA-3', 5'-UUGAAAAA-3', 5'-UUCGAAAGAA-3'(서열번호 642), 5'-UUCAGAAAUGAA-3'(서열번호 643), 5'-UUCAUGAAAAUGAA-3'(서열번호 644), 및 5'-UUCAUUGAAAAAUGAA-3'(서열번호 645)로 이뤄진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 구현예의 일 구체예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA-3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 5'-AAGUGGAGAA-3'(서열번호 17), 5'-AAAGUGGAGAA-3'(서열번호 18), 5'-UAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 19), 5'-AUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 20), 5'-GAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 21), 5'-UGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 22), 5'-CUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 23), 5'-ACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 24), 5'-CACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 25), 5'-UCACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 26), 5'-UUCACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 27), 및 5’-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 10)로 이뤄진 군에서 선택된 제7 서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 이때 상기 제7 서열의 3'말단은 상기 제1 서열의 5'말단과 연결되어 있을 수 있다.
상기 구현예의 일 구체예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5'-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', 5'-CCUUAGGUGG-3'(서열번호 342), 5'-CCGUUAGGUGG-3'(서열번호 343), 5'-CCGCUUAGGGUGG-3'(서열번호 344), 5'-CCGCUUUAGAGGUGG-3'(서열번호 345), 5'-CCGCUUUUAGAAGGUGG-3'(서열번호 346), 5'-CCGCUUCUUAGGAAGGUGG-3'(서열번호 347), 5'-CCGCUUCAUUAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 348), 5'-CCGCUUCACUUAGGUGAAGGUGG-3'(서열번호 349), 5'-CCGCUUCACUUAGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 350), 5'-CCGCUUCACCUUAGGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 351), 5'-CCGCUUCACCAUUAGUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 352), 5'-CCGCUUCACCAAUUAGUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 353), 5'-CCGCUUCACCAAAUUAGCUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 354), 5'-CCGCUUCACCAAAAUUAGACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 355), 5'-CCGCUUCACCAAAAGUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 356), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUUAGGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 357), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUUUAGAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 358), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUUAGUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 359), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUUAGUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 360), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUUUAGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 361), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUCUUAGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 362) 및 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 11)로 이뤄진 군에서 선택된 제8 서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 이때 상기 제8 서열의 3'말단은 상기 제1 서열의 5'말단과 연결되어 있을 수 있다.
상기 구현예의 일 구체예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA-3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 5'-AAGUGGAGAA-3'(서열번호 17), 5'-AAAGUGGAGAA-3'(서열번호 18), 5'-UAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 19), 5'-AUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 20), 5'-GAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 21), 5'-UGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 22), 5'-CUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 23), 5'-ACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 24), 5'-CACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 25), 5'-UCACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 26), 5'-UUCACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 27), 및 5’-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 10)로 이뤄진 군에서 선택된 제7 서열을 추가적으로 포함하고, 5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5'-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', 5'-CCUUAGGUGG-3'(서열번호 342), 5'-CCGUUAGGUGG-3'(서열번호 343), 5'-CCGCUUAGGGUGG-3'(서열번호 344), 5'-CCGCUUUAGAGGUGG-3'(서열번호 345), 5'-CCGCUUUUAGAAGGUGG-3'(서열번호 346), 5'-CCGCUUCUUAGGAAGGUGG-3'(서열번호 347), 5'-CCGCUUCAUUAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 348), 5'-CCGCUUCACUUAGGUGAAGGUGG-3'(서열번호 349), 5'-CCGCUUCACUUAGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 350), 5'-CCGCUUCACCUUAGGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 351), 5'-CCGCUUCACCAUUAGUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 352), 5'-CCGCUUCACCAAUUAGUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 353), 5'-CCGCUUCACCAAAUUAGCUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 354), 5'-CCGCUUCACCAAAAUUAGACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 355), 5'-CCGCUUCACCAAAAGUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 356), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUUAGGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 357), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUUUAGAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 358), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUUAGUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 359), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUUAGUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 360), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUUUAGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 361), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUCUUAGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 362), 및 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 11)로 이뤄진 군에서 선택된 제8 서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 이때 상기 제8 서열의 3'말단은 상기 제1 서열의 5'말단과 연결되어 있고, 상기 제7 서열의 3'말단은 상기 제8 서열의 5'말단과 연결되어 있을 수 있다.
상기 구현예의 일 구체예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-AAG-3', 5'-AAGU-3', 5'-AAGUG-3', 5'-AAGUGC-3', 5'-AAGUGCU-3', 5'-AAGUGCUU-3', 5'-AAGUGCUUU-3', 5'-AAGUGCUUUC-3'(서열번호 485)로 이뤄진 군에서 선택된 제9 서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 이때, 상기 제1 서열의 3'말단 및 상기 제2 서열의 5'말단은 상기 제9 서열을 통해 연결되어 있을 수 있다.
상기 구현예의 일 구체예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'-C-3', 5'-CC-3', 5'-ACC-3', 5'-AACC-3', 5'-UAACC-3', 5'-GUAACC-3', 5'-AGUAACC-3', 5'-AAGUAACC-3', 5'-AAAGUAACC-3', 5'-GAAAGUAACC-3'(서열번호 486)로 이뤄진 군에서 선택된 제10 서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 이때, 상기 제2 서열의 3'말단 및 상기 제3 서열의 5'말단은 상기 제10 서열을 통해 연결되어 있을 수 있다.
상기 구현예의 일 구체예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-AAG-3', 5'-AAGU-3', 5'-AAGUG-3', 5'-AAGUGC-3', 5'-AAGUGCU-3', 5'-AAGUGCUU-3', 5'-AAGUGCUUU-3', 5'-AAGUGCUUUC-3'(서열번호 485)로 이뤄진 군에서 선택된 제9 서열을 추가적으로 포함하고, 5'-C-3', 5'-CC-3', 5'-ACC-3', 5'-AACC-3', 5'-UAACC-3', 5'-GUAACC-3', 5'-AGUAACC-3', 5'-AAGUAACC-3', 5'-AAAGUAACC-3', 5'-GAAAGUAACC-3'(서열번호 486)로 이뤄진 군에서 선택된 제10 서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 이때, 상기 제1 서열의 3'말단 및 상기 제2 서열의 5'말단은 상기 제9 서열을 통해 연결되어 있고, 상기 제2 서열의 3'말단 및 상기 제3 서열의 5'말단은 상기 제10 서열을 통해 연결되어 있을 수 있다.
일 예로, 상기 제9 서열이 5'-A-3'인 경우, 상기 제10 서열은 5'-C-3'일 수 있다. 또 다른 예로, 상기 제9 서열이 5'-AA-3'인 경우, 상기 제10 서열은 5'-C-3', 또는 5'-CC-3'일 수 있다. 또 다른 예로, 상기 제9 서열이 5'-AAG-3'인 경우, 상기 제10 서열은 5'-CC-3', 또는 5'-ACC-3'일 수 있다. 또 다른 예로, 상기 제9 서열이 5'-AAGU-3'인 경우, 상기 제10 서열은 5'-AACC-3'일 수 있다. 또 다른 예로, 상기 제9 서열이 5'-AAGUG-3'인 경우, 상기 제10 서열은 5'-UAACC-3'일 수 있다. 또 다른 예로, 상기 제9 서열이 5'-AAGUGC-3'인 경우, 상기 제10 서열은 5'-GUAACC-3'일 수 있다. 또 다른 예로, 상기 제9 서열이 5'-AAGUGCU-3'인 경우, 상기 제10 서열은 5'-AGUAACC-3'일 수 있다. 또 다른 예로, 상기 제9 서열이 5'-AAGUGCUC-3'인 경우, 상기 제10 서열은 5'-GAGUAACC-3'일 수 있다. 또 다른 예로, 상기 제9 서열이 5'-AAGUGCUU-3'인 경우, 상기 제10 서열은 5'-AAGUAACC-3'일 수 있다. 또 다른 예로, 상기 제9 서열이 5'-AAGUGCUUU-3'인 경우, 상기 제10 서열은 5'-AAAGUAACC-3'일 수 있다. 또 다른 예로, 상기 제9 서열이 5'-AAGUGCUUUC-3'(서열번호 485)인 경우, 상기 제10 서열은 5'-GAAAGUAACC-3'(서열번호 486)일 수 있다.
상기 구현예의 또 다른 구체예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'-U-3', 5'-UU-3', 5'-UUC-3', 5'-UUCA-3', 5'-UUCAU-3', 5'-UUCAUU-3', 및 5'-UUCAUUU-3'로 이뤄진 군에서 선택된 제 11서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 이때, 상기 제4 서열의 3'말단 및 상기 링커의 5'말단은 상기 제11 서열을 통해 연결되어 있을 수 있다.
상기 구현예의 또 다른 구체예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-UGAA-3', 5'-AUGAA-3', 5'-AAUGAA-3', 및 5'-GAAUGAA-3'로 이뤄진 군에서 선택된 제 12서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 이때, 상기 링커의 3'말단 및 상기 제5 서열의 5'말단은 상기 제12 서열을 통해 연결되어 있을 수 있다.
상기 구현예의 또 다른 구체예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'-U-3', 5'-UU-3', 5'-UUC-3', 5'-UUCA-3', 5'-UUCAU-3', 5'-UUCAUU-3', 및 5'-UUCAUUU-3'로 이뤄진 군에서 선택된 제 11서열, 및 5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-UGAA-3', 5'-AUGAA-3', 5'-AAUGAA-3', 및 5'-GAAUGAA-3'로 이뤄진 군에서 선택된 제 12서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 이때, 상기 제4 서열의 3'말단 및 상기 링커의 5'말단은 상기 제11 서열을 통해 연결되고, 상기 링커의 3'말단 및 상기 제5 서열의 5'말단은 상기 제12 서열을 통해 연결되어 있을 수 있다.
일 예로, 상기 제11 서열이 5'-U-3'인 경우, 상기 제12 서열은 5'-A-3'일 수 있다. 또 다른 예로, 상기 제11 서열이 5'-UU-3'인 경우, 상기 제12 서열은 5'-AA-3'일 수 있다. 또 다른 예로, 상기 제11 서열이 5'-UUC-3'인 경우, 상기 제12 서열은 5'-GAA-3'일 수 있다. 또 다른 예로, 상기 제11 서열이 5'-UUCA-3'인 경우, 상기 제12 서열은 5'-UGAA-3'일 수 있다. 또 다른 예로, 상기 제11 서열이 5'-UUCAU-3'인 경우, 상기 제12 서열은 5'-AUGAA-3'일 수 있다. 또 다른 예로, 상기 제11 서열이 5'-UUCAUU-3'인 경우, 상기 제12 서열은 5'-AAUGAA-3'일 수 있다. 또 다른 예로, 상기 제11 서열이 5'-UUCAUUU-3'인 경우, 상기 제12 서열은 5'-GAAUGAA-3'일 수 있다.
엔지니어링 된 싱글 가이드 RNA 서열 예시
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 싱글 가이드 RNA는 서열번호 211 내지 서열번호 253, 서열번호 296 내지 서열번호 308, 서열번호 311 내지 서열번호 323, 서열번호 326 내지 서열번호 338, 서열번호 488 내지 서열번호 541, 및 서열번호 545 내지 서열번호 551 에서 선택된 서열을 가질 수 있다.
엔지니어링 된 듀얼 가이드 RNA 예시
일 구현예로, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 엔지니어링 된 스캐폴드 영역, 스페이서, 및 U-rich tail을 포함한다.
상기 스페이서는 10 내지 50 뉴클레오타이드 길이를 가지며, 표적 서열과 상보적인 서열을 가진다.
상기 U-rich tail의 서열은 (UaN)bUc로 표현될 수 있다. 이때, 상기 N은 아데노신(A), 유리딘(U), 사이티딘(C), 구아노신(G) 중 하나이다. 이때, 상기 a, b, c는 정수이고, a는 1 이상 5 이하, b는 0 이상이다.
일 예로, 상기 U-rich tail의 서열은 5'-UUUUAUUUU-3'일 수 있다.
상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 다음 서열을 포함한다:
5'말단에서 3'말단 방향으로,
5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA-3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 5'-AAGUGGAGAA-3'(서열번호 17), 5'-AAAGUGGAGAA-3'(서열번호 18), 5'-UAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 19), 5'-AUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 20), 5'-GAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 21), 5'-UGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 22), 5'-CUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 23), 5'-ACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 24), 5'-CACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 25), 5'-UCACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 26), 5'-UUCACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 27), 및 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 10)로 이뤄진 군에서 선택된 제1 서열,
5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5'-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', 5'-CCUUAGGUGG-3'(서열번호 342), 5'-CCGUUAGGUGG-3'(서열번호 343), 5'-CCGCUUAGGGUGG-3'(서열번호 344), 5'-CCGCUUUAGAGGUGG-3'(서열번호 345), 5'-CCGCUUUUAGAAGGUGG-3'(서열번호 346), 5'-CCGCUUCUUAGGAAGGUGG-3'(서열번호 347), 5'-CCGCUUCAUUAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 348), 5'-CCGCUUCACUUAGGUGAAGGUGG-3'(서열번호 349), 5'-CCGCUUCACUUAGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 350), 5'-CCGCUUCACCUUAGGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 351), 5'-CCGCUUCACCAUUAGUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 352), 5'-CCGCUUCACCAAUUAGUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 353), 5'-CCGCUUCACCAAAUUAGCUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 354), 5'-CCGCUUCACCAAAAUUAGACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 355), 5'-CCGCUUCACCAAAAGUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 356), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUUAGGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 357), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUUUAGAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 358), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUUAGUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 359), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUUAGUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 360), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUUUAGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 361), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUCUUAGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 362), 및 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 11)로 이뤄진 군에서 선택된 제2 서열,
5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 434), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUUUCGAAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 435), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUUCGAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 436), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUCUUCGGAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 437), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCGAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 438), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUCGGUAACCCUCGA-3'(서열번호 439), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGUUCGUAACCCUCGA-3'(서열번호 440), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUUUCGAACCCUCGA-3'(서열번호 441), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUUCGACCCUCGA-3'(서열번호 442), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUUCGCCCUCGA-3'(서열번호 443), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAUUCGCCCUCGA-3'(서열번호 444), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAUUCGCCUCGA-3'(서열번호 445), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAUUCGCCUCGA-3'(서열번호 446), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGUUCGCUCGA-3'(서열번호 447), 및 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 12)로 이뤄진 군에서 선택된 제3 서열,
5'-AACAAA-3', 5'-AACAAAU-3', 5'-AACAAAUU-3', 5'-AACAAAUUC-3', 5'-AACAAAUUCA-3'(서열번호 67), 5'-AACAAAUUCAU-3'(서열번호 68), 5'-AACAAAUUCAUU-3'(서열번호 69), 및 5'-AACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 13)로 이뤄진 군에서 선택된 제4 서열이 연결된 엔지니어링 된 tracrRNA; 및
5'-GGA-3', 5'-AGGA-3', 5'-AAGGA-3', 5'-GAAGGA-3', 5'-UGAAGGA-3', 5'-AUGAAGGA-3', 5'-AAUGAAGGA-3', 및 5'-GAAUGAAGGA-3'(서열번호 15)으로 이뤄진 군에서 선택된 제5 서열, 및
5'-AUGCAAC-3'로 표현되는 제6 서열이 연결된 엔지니어링 된 crRNA 반복 서열 부분,
이때, 상기 엔지니어링 된 crRNA 반복 서열 부분의 3'말단은 상기 스페이서의 5'말단과 연결 되어 있다.
이때, 상기 엔지니어링 된 tracrRNA의 서열은 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 1)과 상이하고, 및/또는 상기 엔지니어링 된 crRNA 반복 서열 부분은 5'-GAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 3)과 상이하다.
일 예로, 상기 엔지니어링 된 tracrRNA의 서열은 서열번호 1과 동일하고, 상기 엔지니어링 된 crRNA 반복 서열 부분은 서열번호 3과 상이할 수 있다. 또 다른 일 예로, 상기 엔지니어링 된 tracrRNA의 서열은 서열번호 1과 상이하고, 상기 엔지니어링 된 crRNA 반복 서열 부분은 서열번호 3과 동일할 수 있다. 또 다른 일 예로, 상기 엔지니어링 된 tracrRNA의 서열은 서열번호 1과 상이하고, 상기 엔지니어링 된 crRNA 반복 서열 부분은 서열번호 3과 상이할 수 있다.
일 예로, 상기 엔지니어링 된 tracrRNA의 서열은 상기 제1 서열 및/또는 제2 서열을 포함하지 않을 수 있다.
구체적으로, 상기 엔지니어링 된 tracrRNA의 서열은 다음으로 이뤄진 군에서 선택된 것일 수 있다:
5'말단에서 3'말단 방향으로, 상기 제2 서열, 상기 제3 서열, 및 상기 제4 서열이 연결된 서열,
5'말단에서 3'말단 방향으로, 상기 제1 서열, 상기 제3 서열, 및 상기 제4 서열이 연결된 서열, 및
5'말단에서 3'말단 방향으로, 상기 제3 서열, 및 상기 제4 서열이 연결된 서열.
일 예로, 상기 엔지니어링 된 tracrRNA가 5'-AACAAA-3'를 포함하는 경우, 상기 엔지니어링 된 crRNA는 5'-GGA-3'를 포함할 수 있다. 또 다른 예로, 상기 엔지니어링 된 tracrRNA가 5'-AACAAAU-3'를 포함하는 경우, 상기 엔지니어링 된 crRNA는 5'-AGGA-3'를 포함할 수 있다. 또 다른 예로, 상기 엔지니어링 된 tracrRNA가 5'-AACAAAUU-3'를 포함하는 경우, 상기 엔지니어링 된 crRNA는 5'-AAGGA-3'를 포함할 수 있다. 또 다른 예로, 상기 엔지니어링 된 tracrRNA가 5'-AACAAAUUC-3'를 포함하는 경우, 상기 엔지니어링 된 crRNA는 5'-GAAGGA-3'를 포함할 수 있다. 또 다른 예로, 상기 엔지니어링 된 tracrRNA가 5'-AACAAAUUCA-3'(서열번호 67)를 포함하는 경우, 상기 엔지니어링 된 crRNA는 5'-UGAAGGA-3'를 포함할 수 있다. 또 다른 예로, 상기 엔지니어링 된 tracrRNA가 5'-AACAAAUUCAU-3'(서열번호 68)를 포함하는 경우, 상기 엔지니어링 된 crRNA는 5'-AUGAAGGA-3'를 포함할 수 있다. 또 다른 예로, 상기 엔지니어링 된 tracrRNA가 5'-AACAAAUUCAUU-3'(서열번호 69)를 포함하는 경우, 상기 엔지니어링 된 crRNA는 5'-AAUGAAGGA-3'를 포함할 수 있다. 또 다른 예로, 상기 엔지니어링 된 tracrRNA가 5'-AACAAAUUCAUUU-3'(서열번호 70)를 포함하는 경우, 상기 엔지니어링 된 crRNA는 5'-GAAUGAAGGA-3'(서열번호 91)를 포함할 수 있다.
3. CRISPR activation 복합체 및 CRISPR interference 복합체
CRISPR activation 복합체 및 CRISPR interference 복합체 - 개괄
본 명세서에서는 CRISPR activation 복합체 및 CRISPR interference 복합체를 제공한다. 상기 CRISPR activation 복합체는 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 및 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 포함한다. 상기 CRISPR interference 복합체는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질 및 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 포함한다. 이때, 상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 및 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 "5) Cas12f1 융합 단백질" 섹션에서 설명된 것이다. 이때, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 "10) 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA" 섹션에서 설명된 것이다.
일 구현예로, 본 명세서에서는 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 및 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 포함하는, 표적 유전자의 발현을 증가 또는 촉진할 수 있는 CRISPR activation 복합체를 제공한다. 이때, 상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질은 "5) Cas12f1 융합 단백질" 섹션에서 설명된 것 중 어느 하나일 수 있다. 이때, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 "10) 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA" 섹션에서 설명된 것 중 어느 하나일 수 있다. 상기 CRISPR activation 복합체는 표적 유전자의 인핸서 또는 프로모터 근처에 위치한 조절 DNA 부위에 결합하여 일반적인 transcription machinery (RNA 중합효소 및 일반적인 transcription factors 등)와 단백질-단백질 상호작용을 통해 프로모터에 transcription machinery의 결합을 촉진하여 유전자의 전사를 촉진할 수 있다. 또는 상기 CRISPR activation 복합체는 표적 유전자의 인핸서 또는 프로모터 근처에 위치한 조절 DNA 부위에 결합하여 RNA 중합효소가 프로모터로부터 방출되어 DNA를 따라 합성을 진행하도록 촉발하여 유전자의 전사를 촉진할 수 있다.
일 구현예로, 본 명세서에서는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질 및 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 포함하는, 표적 유전자의 발현을 저해 또는 억제할 수 있는 CRISPR interference 복합체를 제공한다. 이때, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 "5) Cas12f1 융합 단백질" 섹션에서 설명된 것 중 어느 하나일 수 있다. 이때, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 "10) 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA" 섹션에서 설명된 것 중 어느 하나일 수 있다. 상기 CRISPR interference 복합체 표적 유전자의 operator 또는 silencer에 결합하여 RNA 중합효소가 프로모터에 부착되는 것을 차단하여 유전자의 전사를 저해 또는 억제할 수 있다.
전사 활성 Cas12f1 융합 단백질
본 명세서에서 제공되는 CRISPR activation 복합체를 구성하는 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질은 "5) Cas12f1 융합 단백질" 섹션에서 설명된 것과 동일한 특징 및 구조를 가진다.
전사 저해 Cas12f1 융합 단백질
본 명세서에서 제공되는 CRISPR interference 복합체를 구성하는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 "5) Cas12f1 융합 단백질" 섹션에서 설명된 것과 동일한 특징 및 구조를 가진다.
엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA
본 명세서에서 제공되는 CRISPR activation 복합체 또는 CRISPR interference 복합체를 구성하는 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 "10) 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA" 섹션에서 설명된 것과 동일한 특징 및 구조를 가진다.
CRISPR activation 복합체의 예시
일 구현예로, 상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 dCas12f1 R490A 단백질 및 VP64이 순서대로 연결된 것이고, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 서열번호 211 내지 서열번호 253, 서열번호 296 내지 서열번호 308, 서열번호 311 내지 서열번호 323, 서열번호 326 내지 서열번호 338, 서열번호 488 내지 서열번호 541, 및 서열번호 545 내지 서열번호 551로 이뤄진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지며, 상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 및 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA가 결합하여 CRISPR activation 복합체를 이루고 있을 수 있다.
CRISPR interference 복합체의 예시
일 구현예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 KRAB 및 dCas12f1 D510A 단백질이 순서대로 연결된 것이고, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 서열번호 211 내지 서열번호 253, 서열번호 296 내지 서열번호 308, 서열번호 311 내지 서열번호 323, 서열번호 326 내지 서열번호 338, 서열번호 488 내지 서열번호 541, 및 서열번호 545 내지 서열번호 551로 이뤄진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지며, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질 및 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA가 결합하여 CRISPR interference 복합체를 이루고 있을 수 있다.
일 구현예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 DNMT3 및 dCas12f1 D510A 단백질이 순서대로 연결된 것이고, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 서열번호 211 내지 서열번호 253, 서열번호 296 내지 서열번호 308, 서열번호 311 내지 서열번호 323, 서열번호 326 내지 서열번호 338, 서열번호 488 내지 서열번호 541, 및 서열번호 545 내지 서열번호 551로 이뤄진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지며, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질 및 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA가 결합하여 CRISPR interference 복합체를 이루고 있을 수 있다.
일 구현예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 DNMT3 및 dCas12f1 R490A 단백질이 순서대로 연결된 것이고, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 서열번호 211 내지 서열번호 253, 서열번호 296 내지 서열번호 308, 서열번호 311 내지 서열번호 323, 서열번호 326 내지 서열번호 338, 서열번호 488 내지 서열번호 541, 및 서열번호 545 내지 서열번호 551로 이뤄진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지며, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질 및 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA가 결합하여 CRISPR interference 복합체를 이루고 있을 수 있다.
일 구현예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 KRAB, MeCP2 및 dCas12f1 D510A 단백질이 순서대로 연결된 것이고, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 서열번호 211 내지 서열번호 253, 서열번호 296 내지 서열번호 308, 서열번호 311 내지 서열번호 323, 서열번호 326 내지 서열번호 338, 서열번호 488 내지 서열번호 541, 및 서열번호 545 내지 서열번호 551로 이뤄진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지며, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질 및 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA가 결합하여 CRISPR interference 복합체를 이루고 있을 수 있다.
일 구현예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 KRAB, MeCP2 및 dCas12f1 R490A 단백질이 순서대로 연결된 것이고, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 서열번호 211 내지 서열번호 253, 서열번호 296 내지 서열번호 308, 서열번호 311 내지 서열번호 323, 서열번호 326 내지 서열번호 338, 서열번호 488 내지 서열번호 541, 및 서열번호 545 내지 서열번호 551로 이뤄진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지며, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질 및 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA가 결합하여 CRISPR interference 복합체를 이루고 있을 수 있다.
일 구현예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 dCas12f1 R490A 단백질 및 KRAB이 순서대로 연결된 것이고, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 서열번호 211 내지 서열번호 253, 서열번호 296 내지 서열번호 308, 서열번호 311 내지 서열번호 323, 서열번호 326 내지 서열번호 338, 서열번호 488 내지 서열번호 541, 및 서열번호 545 내지 서열번호 551로 이뤄진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지며, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질 및 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA가 결합하여 CRISPR interference 복합체를 이루고 있을 수 있다.
일 구현예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 dCas12f1 D510A 단백질 및 KRAB이 순서대로 연결된 것이고, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 서열번호 211 내지 서열번호 253, 서열번호 296 내지 서열번호 308, 서열번호 311 내지 서열번호 323, 서열번호 326 내지 서열번호 338, 서열번호 488 내지 서열번호 541, 및 서열번호 545 내지 서열번호 551로 이뤄진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지며, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질 및 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA가 결합하여 CRISPR interference 복합체를 이루고 있을 수 있다.
일 구현예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 dCas12f1 D510A 단백질, KRAB 및 MeCP2이 순서대로 연결된 것이고, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 서열번호 211 내지 서열번호 253, 서열번호 296 내지 서열번호 308, 서열번호 311 내지 서열번호 323, 서열번호 326 내지 서열번호 338, 서열번호 488 내지 서열번호 541, 및 서열번호 545 내지 서열번호 551로 이뤄진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지며, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질 및 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA가 결합하여 CRISPR interference 복합체를 이루고 있을 수 있다.
일 구현예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 dCas12f1 R490A 단백질, KRAB 및 MeCP2이 순서대로 연결된 것이고, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 서열번호 211 내지 서열번호 253, 서열번호 296 내지 서열번호 308, 서열번호 311 내지 서열번호 323, 서열번호 326 내지 서열번호 338, 서열번호 488 내지 서열번호 541, 및 서열번호 545 내지 서열번호 551로 이뤄진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지며, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질 및 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA가 결합하여 CRISPR interference 복합체를 이루고 있을 수 있다.
일 구현예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 dCas12f1 R490A 단백질, KRAB 및 KRAB이 순서대로 연결된 것이고, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 서열번호 211 내지 서열번호 253, 서열번호 296 내지 서열번호 308, 서열번호 311 내지 서열번호 323, 서열번호 326 내지 서열번호 338, 서열번호 488 내지 서열번호 541, 및 서열번호 545 내지 서열번호 551로 이뤄진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지며, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질 및 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA가 결합하여 CRISPR interference 복합체를 이루고 있을 수 있다.
일 구현예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 dCas12f1 D510A 단백질, KRAB 및 KRAB이 순서대로 연결된 것이고, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 서열번호 211 내지 서열번호 253, 서열번호 296 내지 서열번호 308, 서열번호 311 내지 서열번호 323, 서열번호 326 내지 서열번호 338, 서열번호 488 내지 서열번호 541, 및 서열번호 545 내지 서열번호 551로 이뤄진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지며, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질 및 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA가 결합하여 CRISPR interference 복합체를 이루고 있을 수 있다.
일 구현예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 dCas12f1 D510A 단백질, KRAB, KRAB 및 MeCP2가 순서대로 연결된 것이고, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 서열번호 211 내지 서열번호 253, 서열번호 296 내지 서열번호 308, 서열번호 311 내지 서열번호 323, 서열번호 326 내지 서열번호 338, 서열번호 488 내지 서열번호 541, 및 서열번호 545 내지 서열번호 551로 이뤄진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지며, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질 및 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA가 결합하여 CRISPR interference 복합체를 이루고 있을 수 있다.
일 구현예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 dCas12f1 R490A 단백질 및 HDAC3이 순서대로 연결된 것이고, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 서열번호 211 내지 서열번호 253, 서열번호 296 내지 서열번호 308, 서열번호 311 내지 서열번호 323, 서열번호 326 내지 서열번호 338, 서열번호 488 내지 서열번호 541, 및 서열번호 545 내지 서열번호 551로 이뤄진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지며, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질 및 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA가 결합하여 CRISPR interference 복합체를 이루고 있을 수 있다.
일 구현예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 KRAB, dCas12f1 D510A 단백질 및 MeCP2가 순서대로 연결된 것이고, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 서열번호 211 내지 서열번호 253, 서열번호 296 내지 서열번호 308, 서열번호 311 내지 서열번호 323, 서열번호 326 내지 서열번호 338, 서열번호 488 내지 서열번호 541, 및 서열번호 545 내지 서열번호 551로 이뤄진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지며, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질 및 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA가 결합하여 CRISPR interference 복합체를 이루고 있을 수 있다.
일 구현예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 KRAB, MeCP2, dCas12f1 R490A 단백질 및 KRAB이 순서대로 연결된 것이고, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 서열번호 211 내지 서열번호 253, 서열번호 296 내지 서열번호 308, 서열번호 311 내지 서열번호 323, 서열번호 326 내지 서열번호 338, 서열번호 488 내지 서열번호 541, 및 서열번호 545 내지 서열번호 551로 이뤄진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지며, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질 및 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA가 결합하여 CRISPR interference 복합체를 이루고 있을 수 있다.
일 구현예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 MeCP2, dCas12f1 R490A 단백질 및 KRAB이 순서대로 연결된 것이고, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 서열번호 211 내지 서열번호 253, 서열번호 296 내지 서열번호 308, 서열번호 311 내지 서열번호 323, 서열번호 326 내지 서열번호 338, 서열번호 488 내지 서열번호 541, 및 서열번호 545 내지 서열번호 551로 이뤄진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지며, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질 및 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA가 결합하여 CRISPR interference 복합체를 이루고 있을 수 있다.
일 구현예로, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 N 말단에서 C 말단 방향으로 MeCP2, dCas12f1 D510A 단백질 및 KRAB이 순서대로 연결된 것이고, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 서열번호 211 내지 서열번호 253, 서열번호 296 내지 서열번호 308, 서열번호 311 내지 서열번호 323, 서열번호 326 내지 서열번호 338, 서열번호 488 내지 서열번호 541, 및 서열번호 545 내지 서열번호 551로 이뤄진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가지며, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질 및 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA가 결합하여 CRISPR interference 복합체를 이루고 있을 수 있다.
4. CRISPR 발현 조절 시스템의 각 구성요소를 발현시키기 위한 벡터
벡터 - 개괄
본 명세서에서는 CRISPR 발현 조절 시스템의 구성 요소를 발현시키기 위한 벡터를 제공한다. 상기 벡터는 Cas12f1 융합 단백질, 및/또는 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 발현시키도록 구성된다. 상기 벡터의 서열은 상기 CRISPR 발현 조절 시스템의 구성요소 중 하나를 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나, 둘 이상의 구성요소를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 벡터의 서열은 Cas12f1 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및/또는 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 상기 벡터의 서열은 하나 이상의 프로모터 서열을 포함한다. 상기 프로모터는 Cas12f1 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및/또는 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 서열과 작동적으로 연결되어, 세포 내에서 상기 핵산 서열의 전사가 촉진될 수 있도록 한다. 상기 Cas12f1 융합 단백질은 "2. 발현 조절 단백질 - Cas12f1 융합 단백질" 섹션에서 설명된 Cas12f1 융합 단백질과 동일한 특징 및 구성을 가진다. 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 "3. 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA" 섹션에서 설명된 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA와 동일한 특징 및 구성을 가진다.
상기 벡터의 서열은 Cas12f1 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 벡터의 서열은 Cas12f1 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제1 서열, 및 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제2 서열을 포함할 수 있다. 상기 벡터의 서열은 Cas12f1 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 세포 내에서 발현시키기 위한 프로모터 서열, 및 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 서열을 세포 내에서 발현시키기 위한 프로모터 서열을 포함하고, 상기 프로모터들은 각 발현 대상과 작동적으로 연결(operably linked)되어 있다. 일 구현예로, 상기 벡터의 서열은 상기 제1 서열과 작동 가능하게 연결된 제1 프로모터 서열, 및 상기 제2 서열과 작동 가능하게 연결된 제2 프로모터 서열을 포함할 수 있다.
상기 벡터의 서열은 Cas12f1 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 둘 이상의 서로 다른 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 벡터의 서열은 Cas12f1 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제1 서열, 제1 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제2 서열, 제2 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제3 서열을 포함할 수 있다. 더 나아가, 상기 벡터의 서열은 상기 제1 서열과 작동 가능하게 연결된 제1 프로모터 서열, 상기 제2 서열과 작동 가능하게 연결된 제2 프로모터 서열, 상기 제3 서열과 작동 가능하게 연결된 제3 프로모터 서열을 포함할 수 있다.
발현 대상 - Cas12f1 융합 단백질
상기 벡터는 Cas12f1 융합 단백질을 발현하도록 구성된 것일 수 있다. 이때, 상기 Cas12f1 융합 단백질은 "2. 발현 조절 단백질 - Cas12f1 융합 단백질" 섹션에서 설명된 것과 동일한 구성 및 특징을 가진다.
일 구현예로, 상기 벡터는 Cas12f1 융합 단백질을 발현하도록 구성된 것일 수 있다. 이때, 상기 Cas12f1 융합 단백질은 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질일 수 있다. 또는, 상기 Cas12f1 융합 단백질은 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질일 수 있다. 일 구현예로, 상기 벡터는 표적 유전자의 발현을 촉진하기 위한 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질을 발현하도록 구성된 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 벡터는 표적 유전자의 발현을 저해 또는 억제하기 위한 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질을 발현하도록 구성된 것일 수 있다.
발현 대상 - 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA
상기 벡터는 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 발현하도록 구성된 것일 수 있다. 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 "3. 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA" 섹션에서 설명한 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA와 동일한 특징 및 구성을 가진다. 상기 벡터는 둘 이상의 서로 다른 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 발현하도록 구성된 것일 수 있다.
발현 대상 - 부가 구성 요소
상기 벡터는 전술한 발현 대상 외, NLS, 태그 단백질 등의 부가 구성 요소를 발현하도록 구성된 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 부가 구성 요소는 상기 Cas12f1 융합 단백질 및/또는 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA와는 독립적으로 발현될 수 있다. 또 다른 구현예로, 상기 부가 구성 요소는 상기 Cas12f1 융합 단백질 및/또는 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA와 연결되어 발현될 수 있다. 이때, 상기 부가 구성 요소는 CRISPR 발현 조절 시스템을 발현시키고자 할 때 일반적으로 발현시키는 구성 요소일 수 있으며, 공지기술을 참조할 수 있다. 예를 들어, 상기 부가 발현 요소는, "용어의 설명" 중 "태그" 단락에서 설명된 태그 중 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 부가 발현 요소는, 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트암모늄 (glufosinate ammonium) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저 항성 유전자, 암피실린(ampicillin), 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신 (Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
벡터 구성 - Cas12f1 융합 단백질 발현 서열
상기 벡터 서열은 상기 Cas12f1 융합 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이때, 상기 Cas12f1 단백질은 "2. 발현 조절 단백질 - Cas12f1 융합 단백질" 섹션에서 설명된 것과 동일한 구성 및 특징을 가진다.
일 구현예로, 상기 벡터의 서열은 Cas12f1 융합 단백질을 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 이때, 상기 Cas12f1 단백질은 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질일 수 있다. 또는, 상기 Cas12f1 단백질은 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질일 수 있다. 일 구현예로, 상기 벡터의 서열은 Cas12f1 융합 단백질을 암호화하는 인간 코돈 최적화된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 벡터의 서열은 표적 유전자의 발현을 촉진하기 위한 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질을 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 벡터의 서열은 표적 유전자의 발현을 저해 또는 억제하기 위한 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질을 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.
벡터 구성 - 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA 발현 서열
일 구현예로, 상기 벡터의 서열은 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터의 서열은 서열번호 211 내지 서열번호 253, 서열번호 296 내지 서열번호 308, 서열번호 311 내지 서열번호 323, 서열번호 326 내지 서열번호 338, 서열번호 488 내지 서열번호 541, 및 서열번호 545 내지 서열번호 551로 이뤄진 군에서 선택된 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예로, 상기 벡터의 서열은 둘 이상의 서로 다른 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터의 서열은 서열번호 211 내지 서열번호 253, 서열번호 296 내지 서열번호 308, 서열번호 311 내지 서열번호 323, 서열번호 326 내지 서열번호 338, 서열번호 488 내지 서열번호 541, 및 서열번호 545 내지 서열번호 551로 이뤄진 군에서 각각 선택된 제1 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 암호화하는 서열, 및 제2 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.
벡터 구성 - 프로모터 서열
상기 벡터 서열은 각 구성요소를 암호화하는 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터 서열을 포함한다. 상기 벡터의 발현 대상을 세포 내에서 발현시키려면, 각 구성 요소를 암호화하는 서열에 프로모터 서열을 작동적으로 연결시켜 세포 내에서 RNA 전사 인자가 활성화될 수 있도록 해야 한다. 상기 프로모터 서열은 대응하는 RNA 전사 인자, 또는 발현 환경에 따라 달리 설계할 수 있으며, CRISPR/Cas 시스템의 구성 요소를 세포 내에서 적절히 발현시킬 수 있는 것이라면 제한되지 않는다. 상기 프로모터 서열은 RNA 중합효소(예를 들어, RNA Pol I, Pol II, 또는 Pol III)의 전사를 촉진시키는 프로모터일 수 있다. 예를 들어, 상기 프로모터는 SV40 초기 프로모터, mouse mammary tumor virus long terminal repeat(LTR) 프로모터, adenovirus major late 프로모터 (Ad MLP), herpes simplex virus (HSV) 프로모터, CMV immediate early promoter region (CMVIE)와 같은 cytomegalovirus (CMV) 프로모터, rous sarcoma virus (RSV) 프로모터, human U6 small nuclear 프로모터 (U6) (Miyagishi et al., Nature Biotechnology 20, 497 - 500 (2002)), enhanced U6 프로모터 (e.g., Xia et al., Nucleic Acids Res. 2003 Sep 1;31(17)), human H1 프로모터 (H1), 및 7SK 중 하나 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구현예로, 상기 벡터 서열은 Cas12f1 융합 단백질을 암호화하는 서열, 및 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 이때, 상기 프로모터 서열은 상기 Cas12f1 융합 단백질을 암호화하는 서열과 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일 구현예로, 상기 벡터 서열은 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 암호화하는 서열, 및 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 이때, 상기 프로모터 서열은 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 암호화하는 서열과 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일 구현예로, 상기 벡터 서열은 Cas12f1 융합 단백질을 암호화하는 서열, 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 암호화하는 서열, 및 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 이때, 상기 프로모터 서열은 상기 Cas12f1 융합 단백질을 암호화하는 서열, 및 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 암호화하는 서열과 작동적으로 연결되며, 상기 프로모터 서열로 인해 활성화된 전사 인자가 상기 Cas12f1 융합 단백질 및 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 발현시킨다.
벡터 구성 - 둘 이상의 프로모터 서열 포함 가능
일 구현예로, 상기 벡터 서열은 제1 프로모터 서열, Cas12f1 융합 단백질을 암호화하는 제1 서열, 제2 프로모터 서열 및 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 암호화하는 제2 서열을 포함할 수 있다. 이때, 상기 제1 프로모터 서열은 상기 제1 서열과 작동적으로 연결되고, 상기 제2 프로모터 서열은 상지 제2 서열과 작동적으로 연결되며, 상기 제1 프로모터 서열에 의해 상기 제1 서열의 전사가 유도되고, 상기 제2 프로모터 서열에 의해 상기 제2 서열의 전사가 유도된다. 이때, 상기 제1 프로모터 및 상기 제2 프로모터는 동일한 종류의 프로모터일 수 있다. 이때, 상기 제1 프로모터 및 상기 제2 프로모터는 상이한 종류의 프로모터일 수 있다.
일 구현예로, 상기 벡터 서열은 제1 프로모터 서열, Cas12f1 융합 단백질을 암호화하는 제1 서열, 제2 프로모터 서열, 제1 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 암호화하는 제2 서열, 제3 프로모터 서열 및 제2 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 암호화하는 제3 서열을 포함할 수 있다. 이때, 상기 제1 프로모터 서열은 상기 제1 서열과 작동적으로 연결되고, 상기 제2 프로모터 서열은 상기 제2 서열과 작동적으로 연결되고, 상기 제3 프로모터 서열은 상기 제3 서열과 작동적으로 연결되며, 상기 제1 프로모터 서열에 의해 상기 제1 서열의 전사가 유도되고, 상기 제2 프로모터 서열에 의해 상기 제2 서열의 전사가 유도되며, 상기 제3 프로모터 서열에 의해 상기 제3 서열의 전사가 유도된다. 이때, 상기 제2 프로모터 및 상기 제3 프로모터는 동일한 종류의 프로모터일 수 있다. 구체적으로, 상기 제2 프로모터 서열 및 상기 제3 프로모터 서열은 U6 프로모터 서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이때, 상기 제2 프로모터 및 상기 제3 프로모터는 상이한 종류의 프로모터일 수 있다. 구체적으로, 상기 제2 프로모터는 U6 프로모터 서열, 상기 제3 프로모터는 H1 프로모터 서열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
벡터 구성 - 종결 신호
상기 벡터는 상기 프로모터 서열과 작동 가능하게 연결된 종결 신호를 포함할 수 있다. 상기 벡터 서열이 상기 프로모터 서열을 포함하는 경우, RNA 전사 인자에 의해 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결된 서열의 전사가 유도되는데, 이러한 RNA 전사 인자의 전사 종결을 유도하는 서열을 종결 신호라고 일컫는다. 상기 종결 신호는, 프로모터 서열의 종류에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 상기 프로모터가 U6, 또는 H1 프로모터일 경우, 상기 프로모터는 티미딘 연속 서열(예를 들어, TTTTTT (T6) 서열)을 종결 신호로 인식한다.
일 구현예로, 상기 벡터 서열이 U6 프로모터 서열을 포함하는 경우, 상기 U6 프로모터 서열과 작동 가능하게 연결된, 티미딘 연속 서열이 종결 신호로 작용할 수 있다. 일 구현예로, 상기 티미딘 연속 서열은 5개 이상의 티미딘이 연속으로 연결된 서열일 수 있다. 일 구현예로, 상기 벡터 서열이 H1 프로모터 서열을 포함하는 경우, 상기 H1 프로모터 서열과 작동 가능하게 연결된, 티미딘 연속 서열이 종결 신호로 작용할 수 있다. 일 구현예로, 상기 티미딘 연속 서열은 5개 이상의 티미딘이 연속으로 연결된 서열일 수 있다.
벡터 구성 - 기타 구성
상기 벡터 서열은 상기 구성 외, 목적에 따라 필요한 구성요소를 포함할 수 있다.
일 구현예로, 상기 벡터 서열은 조절/제어 구성요소 서열, 및/또는 부가 구성 요소 서열을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 부가 구성 요소는 형질주입된 세포를 비형질주입 세포로부터 구별하기 위한 목적으로 부가된 것일 수 있다. 이때, 상기 조절/제어 구성요소 서열 및 부가 구성 요소는 프로모터, 인핸서, 인트론, 폴리아데닐화 신호, 코작 공통(Kozak consensus) 서열, 내부 리보솜 유입 부위(IRES, Internal Ribosome Entry Site), 스플라이스 억셉터, 2A 서열 및/또는 복제원점(replication origin)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이때, 상기 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점, 및/또는 BBV 복제원점일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
벡터 종류 - 바이러스 벡터
상기 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다.
일 구현예로, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 백시니아바이러스, 폭스바이러스 및 단순포진 바이러스로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다. 일 구현예로, 상기 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스일 수 있다.
벡터 종류 - 비바이러스 벡터
상기 벡터는 비바이러스 벡터일 수 있다. 일 구현예로, 상기 비바이러스 벡터는 플라스미드, 파지, 네이키드 DNA, DNA 복합체, 및 mRNA로 구성된 군에서 선택되는 1 이상일 수 있다. 일 구현예로, 상기 플라스미드는 pcDNA 시리즈, pS456, pG1806, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, 및 pUC19으로 이뤄진 군에서 선택된 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 파지는 λgt4λB, λ-Charon, λΔz1, 및 M13으로 이뤄진 군에서 선택된 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 벡터는 PCR 앰플리콘(amplicon)일 수 있다.
벡터 형태 - 원형 또는 선형 벡터
상기 벡터는 원형 또는 선형 형태일 수 있다. 상기 벡터가 선형 벡터인 경우, 상기 선형 벡터 서열이 종결 신호를 따로 포함하지 않더라도, 그 3'말단에서 RNA 전사가 종결된다. 이와 비교하여, 상기 벡터가 원형 벡터인 경우, 상기 원형 벡터 서열이 종결 신호를 따로 포함하지 않는다면, RNA 전사가 종결되지 않게 된다. 따라서, 상기 벡터로 원형 벡터를 사용하는 경우, 의도한 대상을 발현하기 위해서는 각 프로모터 서열과 관련된 전사 인자에 대응하는 종결 신호가 포함되어야 한다.
일 구현예로, 상기 벡터는 선형 벡터일 수 있다. 일 구현예로, 상기 벡터는 선형의 앰플리콘일 수 있다. 일 구현예로, 상기 벡터는 서열번호 211 내지 서열번호 253, 서열번호 296 내지 서열번호 308, 서열번호 311 내지 서열번호 323, 서열번호 326 내지 서열번호 338, 서열번호 488 내지 서열번호 541, 및 서열번호 545 내지 서열번호 551로 이뤄진 군에서 선택된 서열과 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 선형의 앰플리콘일 수 있다. 일 구현예로, 상기 벡터는 서열번호 211 내지 서열번호 253, 서열번호 296 내지 서열번호 308, 서열번호 311 내지 서열번호 323, 서열번호 326 내지 서열번호 338, 서열번호 488 내지 서열번호 541, 및 서열번호 545 내지 서열번호 551로 이뤄진 군에서 선택된 서열과 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 선형의 앰플리콘일 수 있다.
일 구현예로, 상기 벡터는 원형 벡터일 수 있다. 일 구현예로, 상기 벡터는 서열번호 211 내지 서열번호 253, 서열번호 296 내지 서열번호 308, 서열번호 311 내지 서열번호 323, 서열번호 326 내지 서열번호 338, 서열번호 488 내지 서열번호 541, 및 서열번호 545 내지 서열번호 551로 이뤄진 군에서 선택된 서열과 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 원형 벡터일 수 있다. 일 구현예로, 상기 벡터는 서열번호 211 내지 서열번호 253, 서열번호 296 내지 서열번호 308, 서열번호 311 내지 서열번호 323, 서열번호 326 내지 서열번호 338, 서열번호 488 내지 서열번호 541, 및 서열번호 545 내지 서열번호 551로 이뤄진 군에서 선택된 서열과 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 원형 벡터일 수 있다.
벡터 - 서열 예시
일 구현예로, 상기 벡터의 서열은 서열번호 211 내지 서열번호 253, 서열번호 296 내지 서열번호 308, 서열번호 311 내지 서열번호 323, 서열번호 326 내지 서열번호 338, 서열번호 488 내지 서열번호 541, 및 서열번호 545 내지 서열번호 551로 이뤄진 군에서 선택된 서열과 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질을 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예로, 상기 벡터의 서열은 서열번호 211 내지 서열번호 253, 서열번호 296 내지 서열번호 308, 서열번호 311 내지 서열번호 323, 서열번호 326 내지 서열번호 338, 서열번호 488 내지 서열번호 541, 및 서열번호 545 내지 서열번호 551로 이뤄진 군에서 선택된 서열과 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질을 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.
5. CRISPR 발현 조절 시스템의 각 구성요소를 포함하는 유전자 발현 조절용 조성물
본 명세서에서는, CRISPR 발현 조절 시스템의 각 구성요소를 포함하는 유전자 발현 조절용 조성물을 개시한다. 일 구현예로, 본 명세서에서는 다음을 포함하는 유전자 발현 조절용 조성물을 개시한다: Cas12f1 융합 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산; 및 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산. 이때, 상기 Cas12f1 융합 단백질은 "2. 발현 조절 단백질 - Cas12f1 융합 단백질" 섹션에서 개시된 것일 수 있다. 이때, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 "3. 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA" 섹션에 개시된 것일 수 있다.
상기 유전자 발현 조절용 조성물은 상기 CRISPR 발현 조절 시스템의 각 구성요소 외 유전자 발현 조절 용도에 필요한 적절한 물질을 추가로 포함할 수 있다.
6. 핵산의 화학적인 변형
본 명세서에서는 엔지니어링 된 crRNA 또는 이를 암호화하는 핵산, 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산, 및/또는 CRISPR 발현 조절 시스템의 구성 요소를 발현시키기 위한 벡터 등 핵산을 포함하거나, 핵산으로 이뤄진 구성 요소를 제공한다. 이때, 상기 구성 요소에서 "핵산"이라 함은, 자연계에 존재하는 DNA, 또는 RNA일 수 있고, 상기 구성 핵산의 일부 또는 전부에 화학적 변형이 일어난, 변형된 핵산일 수 있다. 일 구현예로, 상기 구성 핵산은 자연계에 존재하는 DNA, 및/또는 RNA일 수 있다. 일 구현예로, 상기 구성 핵산은 하나 이상의 뉴클레오타이드가 화학적으로 변형된 것일 수 있다. 이때, 상기 화학적 변형은 당업자에게 알려진 핵산의 변형을 모두 포함한다. 구체적으로, 상기 화학적 변형은 (WO 2019/089820 A1)에 기재된 핵산의 변형을 모두 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
7. CRISPR 발현 조절 시스템을 이용한 유전자 발현 조절 방법
유전자 발현 조절 방법 - 개괄
본 명세서에서는 CRISPR 발현 조절 시스템을 이용하여 대상 세포 내의 표적 유전자의 발현을 조절하는 방법을 제공한다. 상기 표적 유전자는 표적 서열을 포함한다. 상기 유전자 발현 조절 방법은, 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA, 및 Cas12f1 융합 단백질, 또는 각각을 암호화하는 핵산을 표적 유전자를 포함하고 있는 대상 세포 내에 전달하는 것을 포함한다. 그 결과, 상기 대상 세포 내에 CRISPR activation 복합체 또는 CRISPR interference 복합체가 주입되거나, CRISPR activation 복합체 또는 CRISPR interference 복합체의 형성이 유도되며, 상기 CRISPR activation 복합체 또는 CRISPR interference 복합체에 의해 표적 유전자의 발현이 조절된다. 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 "3. 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA" 섹션에서 설명된 것과 동일한 특징 및 구조를 가진다. 상기 Cas12f1 융합 단백질은 "2. 발현 조절 단백질 - Cas12f1 융합 단백질" 섹션에서 설명된 것과 동일한 특징 및 구성을 가진다. 상기 CRISPR activation 복합체 및 CRISPR interference 복합체는 "4. 상기 CRISPR activation 복합체 및 CRISPR interference 복합체" 섹션에서 설명된 것과 동일한 특징 및 구성을 가진다.
일 구현예로, 표적 유전자의 발현을 촉진하기 위해, 상기 유전자 발현 조절 방법은 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산, 및 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산을 대상 세포 내로 전달하는 것을 포함할 수 있다.
이때, 상기 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질은 dCas12f1 단백질 및 전사 활성 단백질을 포함한다.
이때, 상기 dCas12f1 단백질은 전술한 "1) 변형된 Cas12f1 단백질" 섹션 중 어느 하나에서 서술된 것과 동일한 특징 및 구조를 가진다. 일 예로, 상기 dCas12f1 단백질은 서열번호 261, 262, 264, 265, 266, 267, 268, 269 및 271으로 이뤄진 군에서 선택된 서열로 표현될 수 있다. 상기 전사 활성 단백질은 전술한 "2) 발현 조절 도메인" 섹션 중 어느 하나에서 서술된 것과 동일한 특징 및 구조를 가진다. 일 예로, 상기 전사 활성 단백질은 VP64일 수 있다.
이때, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 엔지니어링 된 스캐폴드 영역, 스페이서, 및 U-rich tail을 포함한다.
이때, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 전술한 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역" 단락 중 어느 하나에서 서술된 것과 동일한 특징 및 구조를 가진다. 일 예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 서열번호 168 내지 187으로 이뤄진 군에서 선택된 서열로 표현될 수 있다. 또 다른 예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 서열번호 188 내지 199으로 이뤄진 군에서 선택된 서열로 표현될 수 있다. 또 다른 예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 서열번호 200 내지 206으로 이뤄진 군에서 선택된 서열로 표현될 수 있다. 또 다른 예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 서열번호 207 내지 210으로 이뤄진 군에서 선택된 서열로 표현될 수 있다.
이때, 상기 스페이서 서열은 상기 대상 세포 내에 포함된 표적 유전자에 존재하는 표적 서열과 상보적으로 결합할 수 있다.
이때, 상기 U-rich tail의 서열은 (UaN)bUc로 표현되며, 상기 N은 아데노신(A), 유리딘(U), 사이티딘(C), 구아노신(G) 중 하나이고, 상기 a, b, c는 정수이고, a는 1 이상 5 이하, b는 0 이상일 수 있다. 일 예로, 상기 U-rich tail의 서열은 5'-UUUUAUUUU-3'일 수 있다. 일 예로, 상기 U-rich tail의 서열은 5'-UUUUGUUUU-3'일 수 있다.
일 구현예로, 표적 유전자의 발현을 저해 또는 억제하기 위해, 상기 유전자 발현 조절 방법은 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산, 및 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산을 대상 세포 내로 전달하는 것을 포함할 수 있다.
이때, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 dCas12f1 단백질 및 전사 저해 단백질을 포함한다.
이때, 상기 dCas12f1 단백질은 전술한 "1) 변형된 Cas12f1 단백질" 섹션 중 어느 하나에서 서술된 것과 동일한 특징 및 구조를 가진다. 일 예로, 상기 dCas12f1 단백질은 서열번호 261, 262, 264, 265, 266, 267, 268, 269 및 271으로 이뤄진 군에서 선택된 서열로 표현될 수 있다. 상기 전사 저해 단백질은 전술한 "2) 발현 조절 도메인" 섹션 중 어느 하나에서 서술된 것과 동일한 특징 및 구조를 가진다. 일 예로, 상기 전사 저해 단백질은 KRAB, MeCP2, DNMT3 및/또는 HDAC3일 수 있다.
이때, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 엔지니어링 된 스캐폴드 영역, 스페이서, 및 U-rich tail을 포함한다.
이때, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 전술한 "엔지니어링 된 스캐폴드 영역" 단락 중 어느 하나에서 서술된 것과 동일한 특징 및 구조를 가진다. 일 예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 서열번호 168 내지 187으로 이뤄진 군에서 선택된 서열로 표현될 수 있다. 또 다른 예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 서열번호 188 내지 199으로 이뤄진 군에서 선택된 서열로 표현될 수 있다. 또 다른 예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 서열번호 200 내지 206으로 이뤄진 군에서 선택된 서열로 표현될 수 있다. 또 다른 예로, 상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역은 서열번호 207 내지 210으로 이뤄진 군에서 선택된 서열로 표현될 수 있다.
이때, 상기 스페이서 서열은 상기 대상 세포 내에 포함된 표적 유전자에 존재하는 표적 서열과 상보적으로 결합할 수 있다.
이때, 상기 U-rich tail의 서열은 (UaN)bUc로 표현되며, 상기 N은 아데노신(A), 유리딘(U), 사이티딘(C), 구아노신(G) 중 하나이고, 상기 a, b, c는 정수이고, a는 1 이상 5 이하, b는 0 이상일 수 있다. 일 예로, 상기 U-rich tail의 서열은 5'-UUUUAUUUU-3'일 수 있다. 일 예로, 상기 U-rich tail의 서열은 5'-UUUUGUUUU-3'일 수 있다.
대상 세포
일 구현예로, 상기 대상 세포는 원핵 세포일 수 있다. 일 구현예로, 상기 대상 세포는 진핵 세포일 수 있다. 구체적으로, 상기 진핵 세포는 식물 세포, 동물 세포, 및/또는 인간 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
표적 서열 결정
CRISPR activation 복합체 또는 CRISPR interference 복합체로 발현을 조절하고자 하는 표적 유전자는 유전자 발현 조절의 목적, 대상 세포 환경, Cas12f1 융합 단백질이 인식하는 PAM 서열, 및/또는 기타 변수를 고려하여 결정할 수 있다. 이때, 표적 유전자 내에 존재하는 적절한 길이의 표적 서열을 결정할 수 있다면, 그 방법은 특별히 제한되지 않으며, 공지된 기술을 활용할 수 있다.
표적 서열에 따른 스페이서 서열 결정
상기 표적 서열이 결정되고 나면, 이에 대응하는 스페이서 서열을 설계한다. 상기 스페이서 서열은 상기 표적 서열과 상보적으로 결합할 수 있는 서열로 설계된다. 일 구현예로, 상기 스페이서 서열은 상기 표적 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 서열로 설계된다. 일 구현예로, 상기 스페이서 서열은 상기 표적 핵산과 상보적으로 결합할 수 있도록 설계된다. 일 구현예로, 상기 스페이서 서열은 상기 표적 핵산의 표적 가닥 서열에 포함된 표적 서열과 상보적인 서열로 설계된다. 일 구현예로, 상기 스페이서 서열은 상기 표적 핵산의 비표적 가닥 서열에 포함된 프로토스페이서의 DNA 서열에 상응하는 RNA 서열로 설계된다. 구체적으로, 상기 스페이서 서열은, 상기 프로토스페이서 서열과 동일한 염기 서열을 가지되, 상기 염기 서열에 포함된 티미딘 각각이 모두 유리딘으로 치환된 서열로 설계된다.
표적 서열과 스페이서 서열의 상보성
일 구현예로, 상기 스페이서 서열은 상기 표적 서열과 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 상보적인 서열일 수 있다. 일 구현예로, 상기 스페이서 서열은 상기 표적 서열과 바로 이전 문장에서 선택된 수치 범위 내 상보적인 서열일 수 있다. 예를 들어, 상기 스페이서 서열은 상기 표적 서열과 60% 내지 90% 상보적인 서열일 수 있다. 또 다른 예를 들어, 상기 스페이서 서열은 상기 표적 서열과 90% 내지 100% 상보적인 서열일 수 있다.
표적 서열과 스페이서 서열 간 미스매치 개수
일 구현예로, 상기 스페이서 서열은 상기 표적 서열과 0개, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 미스매치를 가지는 상보적인 서열일 수 있다. 일 구현예로, 상기 스페이서 서열은 바로 이전 문장에서 선택된 수치 범위 내의 미스매치를 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 스페이서 서열은 상기 표적 서열과 1개 내지 5개의 미스매치를 가질 수 있다. 또 다른 예를 들어, 상기 스페이서 서열은 상기 표적 서열과 6개 내지 10개의 미스매치를 기질 수 있다.
CRISPR activation 복합체 또는 CRISPR interference 복합체 이용
본 명세서에서 제공하는 유전자 발현 조절 방법은 CRISPR activation 복합체 또는 CRISPR interference 복합체가 표적 특이적으로 유전자의 전사를 조절하는 활성을 가지는 점을 이용한다. 상기 CRISPR activation 복합체 및 CRISPR interference 복합체는 "4. CRISPR activation 복합체 및 CRISPR interference 복합체" 섹션에서 설명된 CRISPR activation 복합체 및 CRISPR interference 복합체와 동일한 특징 및 구성을 가진다.
CRISPR activation 복합체 또는 CRISPR interference 복합체 각 구성 요소의 세포 내 전달
본 명세서에서 제공하는 유전자 발현 조절 방법은 대상 세포 내에서 CRISPR activation 복합체 또는 CRISPR interference 복합체가 표적 유전자와 접촉하는 것을 전제로 한다. 따라서, 상기 CRISPR activation 복합체 또는 CRISPR interference 복합체가 상기 표적 유전자와 접촉하는 것을 유도하기 위해, 상기 유전자 발현 조절 방법은 상기 CRISPR activation 복합체 또는 CRISPR interference 복합체의 각 구성요소를 대상 세포 내에 전달하는 것을 포함한다. 일 구현예로, 상기 유전자 발현 조절 방법은 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산 및 Cas12f1 융합 단백질(전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 또는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질) 또는 이를 암호화하는 핵산을 대상 세포 내에 전달하는 것을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 유전자 발현 조절 방법은 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA 및 Cas12f1 융합 단백질(전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 또는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질)을 대상 세포 내에 전달하는 것을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 유전자 발현 조절 방법은 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 및 Cas12f1 융합 단백질(전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 또는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질)을 대상 세포 내에 전달하는 것을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 유전자 발현 조절 방법은 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA 및 Cas12f1 융합 단백질(전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 또는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질)을 암호화하는 핵산을 대상 세포 내에 전달하는 것을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 유전자 발현 조절 방법은 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 및 Cas12f1 융합 단백질(전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 또는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질)을 암호화하는 핵산을 대상 세포 내에 전달하는 것을 포함할 수 있다. 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산, 및 Cas12f1 융합 단백질(전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 또는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질) 또는 이를 암호화하는 핵산은 다양한 전달 형태로, 다양한 전달 방법을 이용하여 대상 세포 내에 전달될 수 있다.
전달 형태 - RNP
상기 전달 형태로, 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA 및 Cas12f1 융합 단백질(전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 또는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질)이 결합한 리보뉴클레오프로틴(Ribonucleoprotein, RNP)를 이용할 수 있다. 일 구현예로, 상기 유전자 발현 조절 방법은 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA 및 Cas12f1 융합 단백질(전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 또는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질)이 결합한 CRISPR activation 복합체 또는 CRISPR interference 복합체를 대상 세포 내에 주입하는 것을 포함할 수 있다.
전달 형태 - 비바이러스 벡터
또 다른 전달 형태로, 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 서열 및 Cas12f1 융합 단백질(전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 또는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질)을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 비바이러스 벡터를 이용할 수 있다. 일 구현예로, 상기 유전자 발현 조절 방법은 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 서열 및 Cas12f1 융합 단백질(전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 또는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질)을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 비바이러스 벡터를 대상 세포 내에 주입하는 것을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 비바이러스 벡터는 플라스미드, 네이키드 DNA, DNA 복합체, 또는 mRNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또 다른 구현예로, 상기 유전자 발현 조절 방법은 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제1 비바이러스 벡터, 및 Cas12f1 융합 단백질(전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 또는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질)을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제2 비바이러스 벡터를 대상 세포 내에 주입하는 것을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 제1 비바이러스 벡터 및 상기 제2 비바이러스 벡터는 각각 플라스미드, 네이키드 DNA, DNA 복합체, 및 mRNA로 이뤄진 군에서 선택된 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
전달 형태 - 바이러스 벡터
또 다른 전달 형태로, 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 서열 및 Cas12f1 융합 단백질(전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 또는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질)을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 이용할 수 있다. 일 구현예로, 상기 유전자 발현 조절 방법은 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 서열 및 Cas12f1 융합 단백질(전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 또는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질)을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 대상 세포 내에 주입하는 것을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 백시니아바이러스, 폭스바이러스 및 단순포진 바이러스로 구성된 군에서 선택된 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구현예로, 상기 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스일 수 있다.
또 다른 구현예로, 상기 유전자 발현 조절 방법은 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제1 바이러스 벡터, 및 Cas12f1 융합 단백질(전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 또는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질)을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제2 바이러스 벡터를 대상 세포 내에 주입하는 것을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 제1 바이러스 벡터 및 제2 바이러스 벡터는 각각 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 백시니아바이러스, 폭스바이러스 및 단순포진 바이러스로 구성된 군에서 선택된 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
전달 방법 - 일반적인 전달 수단
상기 전달 방법은, 세포 내로 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산, 및 Cas12f1 융합 단백질(전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 또는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질) 또는 이를 암호화하는 핵산을 적절한 전달 형태로 세포 내로 전달할 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않는다. 일 구현예로, 상기 전달 방법은 전기천공법, 유전자총, 초음파천공법, 자기주입법(magnetofection), 및/또는 일시적인 세포 압축 또는 스퀴징일 수 있다.
전달 방법 - 나노파티클
상기 전달 방법은, 상기 CRISPR 발현 조절 시스템에 포함된 적어도 하나의 구성요소를 나노파티클을 이용하여 전달하는 것일 수 있다. 이때, 상기 전달 방법은 당업계 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있는 공지된 방법일 수 있다. 예를 들어, 상기 나노파티클 전달 방법은 (WO 2019/089820 A1)에 개시된 방법일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구현예로, 상기 전달 방법은 Cas12f1 융합 단백질(전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 또는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질) 또는 이를 암호화하는 핵산 및/또는 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산을 나노파티클을 이용하여 전달하는 것일 수 있다. 일 구현예로, 상기 전달 방법은 Cas12f1 융합 단백질(전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 또는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질) 또는 이를 암호화하는 핵산, 제1 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산, 및/또는 제2 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산을 나노파티클을 이용하여 전달하는 것일 수 있다. 이때, 상기 전달 방법은 양이온성 리포좀법, 초산 리튬-DMSO, 지질-매개 형질감염(transfection), 인산칼슘 침전법(precipitation), lipofection, PEI(Polyethyleneimine)-매개 형질감염, DEAE-dextran 매개 형질감염, 및/또는 나노파티클-매개 핵산 전달(Panyam et., al Adv Drug Deliv Rev. 2012 Sep 13. pii: S0169-409X(12)00283-9. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.023 참조)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이때, 상기 CRISPR/Cas12f1 시스템의 구성 요소는 RNP, 비바이러스 벡터, 및/또는 바이러스 벡터 형태일 수 있다. 예를 들어, 상기 CRISPR 발현 조절 시스템의 구성 요소는 각 구성요소를 암호화하는 mRNA 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
전달 형태 및 방법 - 조합 가능
상기 유전자 발현 조절 방법은 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산, 및 Cas12f1 융합 단백질(전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 또는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질) 또는 이를 암호화하는 핵산을 세포 내 전달하는 것을 포함하는데, 이때 상기 구성의 전달 형태 및/또는 전달 방법은 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 일 구현예로, 상기 유전자 발현 조절 방법은 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산은 제1 전달 형태로 전달하고, Cas12f1 융합 단백질(전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 또는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질) 또는 이를 암호화하는 핵산은 제2 전달 형태로 전달하는 것을 포함할 수 있다. 이때, 상기 제1 전달 형태 및 상기 제2 전달 형태는 각각 전술한 전달 형태 중 어느 하나일 수 있다. 일 구현예로, 상기 유전자 발현 조절 방법은 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산은 제1 전달 방법으로 전달하고, Cas12f1 융합 단백질(전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 또는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질) 또는 이를 암호화하는 핵산은 제2 전달 방법으로 전달하는 것을 포함할 수 있다. 이때, 상기 제1 전달 방법 및 상기 제2 전달 방법은 각각 전술한 전달 방법 중 어느 하나일 수 있다.
전달 순서
상기 유전자 발현 조절 방법은 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산, 및 Cas12f1 융합 단백질(전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 또는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질) 또는 이를 암호화하는 핵산을 세포 내 전달하는 것을 포함하는데, 이때 상기 구성이 세포 내에 동시에 전달될 수 있지만, 시간차를 두고 순차적으로 전달될 수 있다.
일 구현예로, 상기 유전자 발현 조절 방법은 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산, 및 Cas12f1 융합 단백질(전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 또는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질) 또는 이를 암호화하는 핵산을 동시에 전달하는 것을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 유전자 발현 조절 방법은 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산을 세포 내로 전달한 후, 시간 차를 두고 Cas12f1 융합 단백질(전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 또는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질) 또는 이를 암호화하는 핵산을 세포 내로 전달하는 것을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 유전자 발현 조절 방법은 Cas12f1 융합 단백질(전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 또는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질) 또는 이를 암호화하는 핵산을 세포 내로 전달한 후, 시간 차를 두고 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 세포 내로 전달하는 것을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 유전자 발현 조절 방법은 Cas12f1 융합 단백질(전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 또는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질)을 암호화하는 핵산을 세포 내로 전달한 후, 시간 차를 두고 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 세포 내로 전달하는 것을 포함할 수 있다.
CRISPR activation 복합체 또는 CRISPR interference 복합체가 표적 핵산과 접촉
본 명세서에서 제공하는 유전자 발현 조절 방법에서, 표적 유전자의 발현 조절은 대상 세포 내에서 CRISPR activation 복합체 또는 CRISPR interference 복합체가 표적 유전자와 접촉하면서 이뤄진다. 따라서, 상기 유전자 발현 조절 방법은 CRISPR activation 복합체 또는 CRISPR interference 복합체가 대상 세포 내에서 접촉하도록 하거나, 접촉을 유도하는 것을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 유전자 발현 조절 방법은 CRISPR activation 복합체 또는 CRISPR interference 복합체가 대상 세포 내에서 표적 유전자와 접촉하는 것을 포함할 수 있다. 일 구현예로, 상기 유전자 발현 조절 방법은 CRISPR activation 복합체 또는 CRISPR interference 복합체가 대상 세포 내에서 표적 유전자와 접촉하도록 유도하는 것을 포함할 수 있다. 이때, 상기 유도는 상기 CRISPR activation 복합체 또는 CRISPR interference 복합체가 세포 내에서 표적 유전자와 접촉하도록 하는 방법이라면 특별히 제한되지 않는다. 일 구현예로, 상기 유도는 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산, 및 Cas12f1 융합 단백질(전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 또는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질) 또는 이를 암호화하는 핵산을 세포 내에 전달하는 것일 수 있다.
유전자 발현 조절 결과
본 명세서에서 제공하는 유전자 발현 조절 방법의 수행 결과로, 표적 유전자의 발현이 촉진(또는 증가) 또는 억제(또는 저해)될 수 있다. 이때, 상기 발현은 표적 유전자의 mRNA로의 전사를 의미할 수 있다. 일반적으로, 표적 유전자의 발현이 촉진(또는 증가)되면, 해당 유전자의 mRNA의 발현양이 증가하고 해당 유전자에 의해 암호화된 단백질의 생산이 증가된다. 또한, 표적 유전자의 발현이 억제(또는 저해)되면, 해당 유전자의 mRNA의 발현양이 감소하고 해당 유전자에 의해 암호화된 단백질의 생산이 감소된다. 일 구현예로, 상기 유전자 발현 조절 방법의 수행 결과, 표적 유전자에 의해 암호화된 단백질의 생산이 증가 또는 감소될 수 있다.
유전자 발현 조절 방법 예시
일 구현예로, 상기 유전자 발현 조절 방법은 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA 및 Cas12f1 융합 단백질(전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 또는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질)이 결합한 리보뉴클레오프로틴 형태의 CRISPR activation 복합체 또는 CRISPR interference 복합체를 진핵 세포 내에 전달하는 것을 포함할 수 있다. 이때, 상기 전달은 전기천공법, 또는 lipofection을 이용한 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 유전자 발현 조절 방법은 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 및 Cas12f1 융합 단백질(전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 또는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질)을 암호화하는 핵산을 진핵 세포 내에 전달하는 것을 포함할 수 있다. 이때, 상기 전달은 전기천공법, 또는 lipofection을 이용한 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 유전자 발현 조절 방법은 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 서열 및 Cas12f1 융합 단백질(전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 또는 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질)을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 진핵세포 내에 전달하는 것을 포함할 수 있다.
실험예
이하, 실험예 및 실시예를 통해 본 명세서가 제공하는 발명에 대해 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 명세서에 의해 개시되는 내용을 예시하기 위한 것으로, 본 명세서에 의해 개시되는 내용의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
1. 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA의 효과
실험예 1. 실험 재료 준비
실험예 1.1 플라스미드 벡터 설계 및 제조
인간 세포에서 발현하기 위해, Cas12f1 유전자를 코돈-최적화 시켰으며(서열번호 270), 상기 최적화된 서열이 벡터 제조를 위해 합성되었다. 최종적으로 Cas12f1 단백질을 암호화하는 서열에는 chicken β-actin 프로모터, 5'- 및 3'-말단의 핵 위치 신호 서열(nuclear localization signal sequence), 자가 절단 T2A 펩타이드로 연결된 eGFP를 인코딩하는 서열이 부가되었다. 상기 Cas12f1 단백질의 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 DNA 서열을 [표01]에 나타냈다.
[표01]
Figure PCTKR2022005135-appb-I000001
(엔지니어링 된) Cas12f1 가이드 RNA를 암호화하는 주형 DNA가 합성되었고, pTwist Amp plasmid vector (Twist Bioscience)에 클로닝되었다. 필요한 경우, 상기 벡터는 U6-상보적 forward primer 및 protospacer-상보적 reverse primer를 사용하여, 상기 가이드 RNA 암호화 서열의 증폭을 위한 주형으로 사용되었다. Gibson assembly를 사용하여, 상기 코돈-최적화 된 Cas12f1 유전자를 포함하는 벡터에 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 암호화하는 올리고뉴클레오타이드를 클로닝함으로써, 엔지니어링 된 CRISPR/Cas12f1 시스템에 대한 벡터를 제조하였다.
실험예 1.2 Cas12f1 가이드 RNA 엔지니어링
엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA 3'말단에 대한 U-rich tail 연결은, 서열-변형된 primer 및 Cas12f1 가이드 RNA 플라스미드 벡터의 존재 하, Pfu PCR Master Mix5 (Biofact)를 사용하여 수행되었다. 상기 PCR 앰플리콘은 HiGeneTM Gel&PCR Purification System (Biofact)을 사용하여 정제되었다. 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA의 엔지니어링 된 스캐폴드 영역 중 제2 영역, 제4 영역 및 제5 영역의 변형은 ApoI 및 BamHI 제한 효소를 사용하여 선형화된 가이드 RNA-암호화 벡터에 변형된 서열 (Macrogen)을 전달하는 합성 올리고뉴클레오타이드를 클로닝하여 수행되었다. 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA의 엔지니어링 된 스캐폴드 영역 중 제1 영역의 변형은, tracrRNA의 5'말단 부분을 표적으로 하는 forward primer 및 U6 프로모터 영역을 표적으로 하는 reverse primer를 사용하여 캐노니컬(canonical), 또는 엔지니어링 된 주형 플라스미드 벡터의 PCR 증폭에 의해 수행되었다. 상기 PCR 증폭은 Q5 Hot Start high-fidelity DNA polymerase (NEB)에 의해 수행되었으며, PCR 산물은 KLD Enzyme Mix (NEB)를 사용하여 결찰되었다(ligated). 상기 결찰된(ligated) PCR 산물은 DH5α E.coli 세포로 형질도입(transformed)되었다. Sanger 시퀀싱 분석에 의해 Mutagenesis가 확인되었다. 변형된 플라스미드 벡터는 NucleoBond ® Xtra Midi EF kit (MN)를 사용하여 정제되었다. 정제된 플라스미드 1 마이크로그램이 T7 RNA polymerase (NEB) 및 NTPs (Jena Bioscience)를 사용한 mRNA 합성의 주형으로 사용되었다. 상기 제조된 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 Monarch® RNA cleanup kit (NEB)를 사용하여 정제하고, 극저온 바이알(cryogenic vials)에 분취하여 액체 질소에 보관하였다.
실험예 1.3 세포 배양 및 형질도입(transfection)
HEK293 T 세포(LentX-293T, Takara)가 10%의 열-불활성화 된 fetal bovine serum (FBS) 혈청(Corning) 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 배지에서, 5% CO2 조건 하 배양되었다. 세포 형질주입은 전기천공법(electroporation) 또는 lipofection으로 수행되었다. 전기천공법의 경우, 실험예1.2에서 제조된 Cas12f1 단백질을 암호화하는 플라스미드 벡터및 가이드 RNA(및 엔지니어링 된 가이드 RNA)를 암호화하는 DNA 각 2-5 μg를 Neon transfection system (Invitrogen)을 사용해 4X105 HEK-293 T세포에 형질주입(transfection) 하였다. 상기 전기천공법은 1300V, 10 mA, 3 pulse 조건 하 수행하였다. lipofection을 위해, 6-15 μL FuGene 시약을 (Promega) 2-5 μg의 Cas12f1 단백질을 암호화하는 플라스미드 벡터 및 1.5-5 μg의 PCR 앰플리콘과 15분동안 혼합하였다. 상기 혼합물(300 μL)이 형질주입 1일 전에 1X106개의 세포가 플레이팅 된 1.5 ml DMEM 배지에 첨가되었다. 상기 세포들을 상기 혼합물의 존재 하 1 내지 10일 간 배양시켰다. 배양 후, 상기 세포들이 수집되었고, 상기 세포의 게놈 DNA가 PureHelixTM genomic DNA preparation kit (NanoHelix)를 사용하거나, Maxwell RSC Cultured cells DNA Kit (Promega)를 사용하여 수작업으로 분리되었다.
실험예 1.4 세포 내 인델 효율 측정
HEK-293 T세포로부터 분리된 게놈 DNA 중, 프로토스페이서를 포함하는 영역을 표적-특이적 프라이머를 사용하여 KAPA HiFi HotStart DNA polymerase (Roche)의 존재 하 PCR을 수행하였다. 상기 증폭 방법은 제조사의 지시를 따랐다. Illumina TruSeq HT dual indexes를 포함하는 상기 증폭의 결과물인 PCR 앰플리콘을 Illumina iSeq 100를 사용하여 150-bp 페어 엔드 시퀀싱을 수행하였다. 인델 빈도는 MAUND를 사용하여 계산되었다. 상기 MAUND는 https://github.com/ibscge/maund 에서 제공된다.
실험예 1.5 Quantitave real-time PCR
HEK293 T세포에 RNeasy Miniprep kit (Qiagen) 또는 Maxwell RSC miRNA Tissue Kit (Promega)또는 DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen)를 사용하여 가이드 RNA(또는 엔지니어링 된 가이드 RNA) 또는 게놈 DNA를 각각 추출하였다. 가이드 RNA를 정량화하기 위해서, RNA특이적 프라이머를 ligation 하고, crRNA-특이적 프라이머를 사용해 cDNA를 합성하였다. 상기 cDNA는 주형으로써 정량적 real-time PCR에 사용되었다. real-time PCR은 KAFA SYBR FAST qPCR Master Mix(2X) Kit (KAPAbiosystems)를 사용하여 분석되었다.
실험예 1.6 통계 분석
각 실험예 별 실험은 3번씩 수행하였으며, 각 값의 평균값을 분석에 사용하였다.
실험예 2. 엔지니어링 된 CRISPR/Cas12f1 시스템의 인델 효율 비교 1
엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 사용한 엔지니어링 된 CRISPR/Cas12f1 시스템의 인델 효율을 측정하기 위해, 실험예 1.1 내지 1.2에 의해 각 실시예를 제조하였다. 실험에 사용한 표적 서열은 다음 [표02]에 나타냈다.
[표02]
Figure PCTKR2022005135-appb-I000002
각 실시예 별 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA의 서열은 다음 [표03] 내지 [표08]에 나타냈다.
[표03]
Figure PCTKR2022005135-appb-I000003
[표04]
Figure PCTKR2022005135-appb-I000004
[표05]
Figure PCTKR2022005135-appb-I000005
[표06]
Figure PCTKR2022005135-appb-I000006
[표07]
Figure PCTKR2022005135-appb-I000007
[표08]
Figure PCTKR2022005135-appb-I000008
이때, 각 표적 서열 별로,
1) Comparative Example 1.n.1은 자연계에서 발견되는 Cas12f1 tracrRNA 및 자연계에서 발견되는 Cas12f1 crRNA를 5'-GAAA-3'로 연결시킨 싱글 가이드 RNA(서열번호 8),
2) Comparative Example 1.n.2는 자연계에서 발견되는 스캐폴드 영역, 스페이서, 및 5'-UUUUAUUUU-3'로 표현되는 U-rich tail을 가지는 싱글 가이드 RNA(서열번호 9),
3) Example 1.n.1 내지 1.n.3은 변형된 제1 영역을 가지는 엔지니어링 된 스캐폴드 영역, 스페이서, 및 5'-UUUUAUUUU-3'로 표현되는 U-rich tail을 가지는 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA,
4) Example 1.n.4 내지 1.n.6는 변형된 제2 영역을 가지는 엔지니어링 된 스캐폴드 영역, 스페이서, 및 5'-UUUUAUUUU-3'로 표현되는 U-rich tail을 가지는 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA,
5) Example 1.n.7 내지 1.n.9는 변형된 제4 영역 및 제5 영역을 가지는 엔지니어링 된 스캐폴드 영역, 스페이서, 및 5'-UUUUAUUUU-3'로 표현되는 U-rich tail을 가지는 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA,
6) Example 1.n.10은 변형된 제1 영역 및 제2 영역을 가지는 엔지니어링 된 스캐폴드 영역, 스페이서, 및 5'-UUUUAUUUU-3'로 표현되는 U-rich tail을 가지는 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA,
7) Example 1.n.11은 변형된 제1 영역 및 제4 영역 및 제5 영역을 가지는 엔지니어링 된 스캐폴드 영역, 스페이서, 및 5'-UUUUAUUUU-3'로 표현되는 U-rich tail을 가지는 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA,
8) Example 1.n.12는 변형된 제2 영역 및 제4 영역 및 제5 영역을 가지는 엔지니어링 된 스캐폴드 영역, 스페이서, 및 5'-UUUUAUUUU-3'로 표현되는 U-rich tail을 가지는 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA,
9) Example 1.n.13은 변형된 제1 영역, 제2 영역, 및 제4 영역 및 제5 영역을 가지는 엔지니어링 된 스캐폴드 영역, 스페이서, 및 5'-UUUUAUUUU-3'로 표현되는 U-rich tail을 가지는 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 나타낸다.
이때, n은 표적 서열 별로, 1, 2, 또는 3이며, n이 1인 경우 Target 1(DY2), n이 2인 경우, Target 2(DY10), n이 3인 경우, Target3(Intergenic-22 )를 나타낸다.
상기 실시예 별 제조된 벡터를 실험예 1.3에 의해 HEK293 T세포에 형질도입(transfection)하고, 실험예 1.4 내지 1.5에 의해 인델 발생 효율을 측정하였다. 이를 실험예 1.6에 의해 분석한 결과가 도 2 내지 도 13에 나타나있다.
실험예 3. 엔지니어링 된 CRISPR/Cas12f1 시스템의 인델 효율 비교 2
실험예 3.1 엔지니어링 된 CRISPR/Cas12f1 시스템의 인델 효율 비교 2-1
엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 사용한 엔지니어링 된 CRISPR/Cas12f1 시스템의 인델 효율을 측정하기 위해, 실험예 1.1 내지 1.2에 의해 각 실시예를 제조하였다. 실험에 사용한 표적 서열은 다음 [표09]에 나타냈다.
[표09]
Figure PCTKR2022005135-appb-I000009
각 실시예 별 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA의 서열은 다음 [표10] 내지 [표13]에 나타냈다.
[표10]
Figure PCTKR2022005135-appb-I000010
[표11]
Figure PCTKR2022005135-appb-I000011
[표12]
Figure PCTKR2022005135-appb-I000012
[표13]
Figure PCTKR2022005135-appb-I000013
상기 실시예 별 제조된 벡터를 실험예 1.3에 의해 HEK293 T세포에 형질도입(transfection)하고, 실험예 1.4 내지 1.5에 의해 인델 발생 효율을 측정하였다. 이를 실험예 1.6에 의해 분석한 결과가 도 16 내지 도 19에 나타나있다.
실험예 3.2 엔지니어링 된 CRISPR/Cas12f1 시스템의 인델 효율 비교 2-2
엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 사용한 엔지니어링 된 CRISPR/Cas12f1 시스템의 인델 효율을 측정하기 위해, 실험예 1.1 내지 1.2에 의해 각 실시예를 제조하였다. 실험에 사용한 표적 서열은 [표09]에 나타낸 바와 같다.
각 실시예 별 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA의 서열은 다음 [표14] 내지 [표17]에 나타냈다.
[표14]
Figure PCTKR2022005135-appb-I000014
[표15]
Figure PCTKR2022005135-appb-I000015
[표16]
Figure PCTKR2022005135-appb-I000016
[표17]
Figure PCTKR2022005135-appb-I000017
상기 실시예 별 제조된 벡터를 실험예 1.3에 의해 HEK293 T세포에 형질도입(transfection)하고, 실험예 1.4 내지 1.5에 의해 인델 발생 효율을 측정하였다. 이를 실험예 1.6에 의해 분석한 결과가 도 20 내지 도 23에 나타나있다.
실험예 3.3 실험 결과
상기 실험 결과를 동일 표적에 대한 이전 실험 데이터와 비교해 보면(도 14 및 도 15 참조), 자연계에서 발견되는 tracrRNA 및 crRNA를 링커로 연결한 Cas12f1 싱글 가이드 RNA보다 실험예 3.1, 실험예 3.2의 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 포함하는, 엔지니어링 된 CRISPR/Cas12f1 시스템의 유전자 편집 효율이 더 높은 것을 알 수 있다. 이러한 결과에 따라, 실험예 3.2, 실험예 3.3의 실시예에 나타난 가이드 RNA의 변형이 유전자 편집 효율을 향상시키는 것을 유추할 수 있다. 또한, 실험예 2 및 실험예 3에서 얻어진 실험 결과를 참조하면, 변형된 제1 영역, 및/또는 변형된 제2 영역을 포함하는 엔지니어링된 Cas12f1 가이드 RNA를 포함하는, 엔지니어링 된 CRISPR/Cas12f1 시스템이, 자연계에서 발견되는 CRISPR/Cas12f1 시스템, 및 자연계에서 발견되는 tracrRNA 및 crRNA를 링커로 연결한 Cas12f1 싱글 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR/Cas12f1 시스템보다 유전자 편집 효율이 더 높을 것이라 유추할 수 있다.
실험예 4. 엔지니어링 된 CRISPR/Cas12f1 시스템의 인델 효율 비교 4
실험예 4.1 엔지니어링 된 CRISPR/Cas12f1 시스템의 인델 효율 비교 4-1
엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 사용한 엔지니어링 된 CRISPR/Cas12f1 시스템의 인델 효율을 측정하기 위해, 실험예 1.1 내지 1.2에 의해 각 실시예를 제조하였다. 실험에 사용한 표적 서열은 다음 [표18]에 나타냈다.
[표18]
Figure PCTKR2022005135-appb-I000018
각 실시예 별 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA의 서열은 다음 [표19]에 나타냈다.
[표19]
Figure PCTKR2022005135-appb-I000019
상기 실시예 별 제조된 벡터를 실험예 1.3에 의해 HEK293 T세포에 형질도입(transfection)하고, 실험예 1.4 내지 1.5에 의해 인델 발생 효율을 측정하였다. 이를 실험예 1.6에 의해 분석한 결과가 도 24 내지 도 26에 나타나있다.
실험예 4.2 실험 결과
상기 실험 결과, 변형된 제3 영역을 가지는 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 포함하는, 엔지니어링 된 CRISPR/Cas12f1 시스템의 유전자 편집 효율이 자연계에서 발견되는 스캐폴드를 가지는 CRISPR/Cas12f1 시스템, 및 자연계에서 발견되는 tracrRNA 및 crRNA를 링커로 연결한 Cas12f1 싱글 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR/Cas12f1 시스템보다 유전자 편집 효율이 더 높을 것이라 유추할 수 있다.
실험예 5. Large scale validation
상기 실험예 2 내지 실험예 4는 몇 개의 내인성 표적에 대해서만 인델 효율을 측정한 결과이다. 상기 결과를 보충하기 위해, 더 광범위한 표적에 대해 유전자 편집이 가능한 지 여부를 실험하였다.
1) in silico로, 5'-TTTR-N20-NGG-3' 서열을 가지는 내인성 타겟을 검색하여, 88개의 표적을 무작위로 선택하였다 (표20 내지 표22). 이는, Cas9, Cas12a, 및 Cas12f1 모두로 편집이 가능한 서열이므로, 각 CRISPR/Cas 시스템의 유전자 편집 효율을 비교할 수 있는 표적이다.
[표20]
Figure PCTKR2022005135-appb-I000020
[표21]
Figure PCTKR2022005135-appb-I000021
[표22]
Figure PCTKR2022005135-appb-I000022
2) CRISPR/SpCas9 시스템, CRISPR/AsCas12a 시스템, 자연계에서 발견되는 CRISPR/Cas12f1 시스템 또는 엔지니어링 된 CRISPR/Cas12f1 시스템의 각 구성을 HEK293-T 세포에 형질 감염(transfection) 시켰다. 이때, 엔지니어링 된 CRISPR/Cas12f1 시스템에 사용된 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 다음 [표23]에 정리되어 있다.
[표23]
Figure PCTKR2022005135-appb-I000023
이때, 상기 서열 중 5'-(N)20-3' 부분은 스페이서 서열로, 상기 [표20] 내지 [표22]에 나타난 프로토스페이서 서열에 대응되는 스페이서 서열로 각각 설계되었다.
3) 형질 감염 후, 상기 88개의 표적에 대한 유전자 편집 효율은 도 27 및 표24에 나타내었다.
[표24]
Figure PCTKR2022005135-appb-I000024
실험 결과, 본 명세서에서 개시하고 있는 엔지니어링 된 CRISPR/Cas12f1 시스템은 1) 자연계에서 발견되는 CRISPR/Cas12f1 시스템에 비해 유전자 편집 효율이 월등히 높으며, 2) 진핵 세포 내 임의의 표적에 대해 CRISPR/SpCas9 시스템 및 CRISPR/AsCas12a 시스템과 견줄 수 있는 유전자 편집 효율을 보이고, 3) 일부 표적에 대해서는 타 CRISPR/Cas 시스템보다 더 높은 유전자 편집 효율을 보일 수 있음을 알 수 있었다.
실험예 6. in vitro cleavage assay
본 명세서에서 개시하고 있는 엔지니어링 된 CRISPR/Cas12f1 시스템의 유전자 절단 양상을 보충적으로 관찰하기 위하여, in vitro cleavage assay를 진행하였다. 실험예 6에서 사용한 표적 protospacer 서열은 5'-TTTAAGAACACATACCCCTGGGCC-3'(서열번호 341, 이하 Intergenic-22)로, 상기 표적의 PAM 서열은 5'-TTTA-3'이다.
실험예 6에서 사용한 (엔지니어링 된) Cas12f1 가이드 RNA는 다음 [표25]에 나타나있다.
[표25]
Figure PCTKR2022005135-appb-I000025
실험 방법은 다음과 같다.
1) Recombinant Cas14 (2.5 μg)와 Canonical, MS2/MS3/MS4, 및 MS2/MS3/MS4/MS5 의 sgRNA를 각각 2μg을 인큐베이션하여 RNA complex를 형성시켰다.
2) 이를 표적 서열(Intergenic-22)을 포함하고 있는 플라스미드 벡터 (5 μg)와 37℃에서 3 시간 동안 반응시켜 In vitro cleavage assay를 진행하였다.
3) Positive control로써 Apa1 restriction enzyme cut을 진행하였다.
4) Cleavage가 된 DNA를 Ultrasonicator인 Covaris (M220)를 가지고 다음의 조건에서 DNA shearing을 진행하였다.
Peak incident power: 50W, Duty factor: 20%, Cycles per Burst: 200 cpb, Treatment time: 110 sec.
5) 조각난 DNA를 DNA purification kit를 이용하여 정제하였다.
6) 정제된 DNA를 T4 ligase를 이용하여 End-filling을 수행하였다.
7) 그 후 NEBNext® UltraTM II DNA Library Prep Kit for Illumina® (NEB, # E7103) kit와 NEBNext® Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers Set 1) (NEB, # E7600) kit를 이용하여 DNA library를 제작하였다.
8) qPCR을 수행하여 각 샘플의 농도를 동일하게 조절하였다.
9) 제작된 library를 Illumina iSeq 100을 사용하여 150-bp paired-end sequencing 하였다.
10) 분석된 서열은 IGV 프로그램으로 alignment하였다.
상기 실험 결과를 도 28에 도시하였다.
실험 결과, 본 명세서에서 개시하는 엔지니어링 된 가이드 RNA를 포함하는, 엔지니어링 된 CRISPR/Cas12f1 시스템은 자연계에서 발견되는 CRISPR/Cas12f1 시스템과 비교하여 비표적 가닥(Non-target strand, NTS)에 대한 절단 활성이 더 높은 것으로 나타났다. 상기 결과는 본 명세서에서 개시하는 엔지니어링 된 CRISPR/Cas12f1 시스템의 향상된 유전자 편집 활성에 영향을 미치는 요인으로 판단된다.
2. 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 이용한 CRISPR 발현 조절 시스템의 효과
실험예 1. Dead Cas12f1 단백질
Cas12f1을 발현하는 벡터를 mutagenesis 방법으로 Cas12f1을 dead 형태로 변형시켰다. Dead 형태는 D326A, E422A, R490A 또는 D510A이며, R490Q, R490W, R490L, D510L, D510V 또는 그 외 cleavage 활성을 상실하는 변이가 된 형태이다. 각각의 mutagenesis에 사용한 프라이머는 다음 [표26]에 나타내었다.
[표26]
Figure PCTKR2022005135-appb-I000026
만들어진 dead Cas12f1의 cleavage 활성이 제거되었는지 확인하기 위하여 HEK293T 세포에 5'-CACACACACAGTGGGCTACCATT-3'(서열번호 668)를 타겟 하여 transfection 하였다. Transfection 96시간 후 gDNA를 추출하여 NGS분석을 통하여 indel 발생을 비교하였다(도 29).
실험예 2. 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질을 이용한 CRISPR 발현 조절 시스템
실험예 2.1 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질 설계
발현 조절 시스템 모듈 제작을 위해 KRAB, MeCP2, DNMT3A 각각 또는 조합을 Cas12f1의 N 말단 혹은 C 말단에 클로닝 하였다(도 30). template를 사용하여 KOD-one (TOYOBO)로 Vector와 Insert fragment를 증폭 후 Gibson Assembly® Master Mix (NEB)를 사용하여 protocol 대로 Ligation을 진행하였다. 각 vector, insert fragment 제작을 위해 사용한 template DNA와 프라이머는 다음 [표27] 및 [표28]과 같다.
[표27]
Figure PCTKR2022005135-appb-I000027
[표28]
Figure PCTKR2022005135-appb-I000028
실험예 2.2 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질 및 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR interference 복합체의 발현 억제(또는 저해) 효과
각 모듈 플라스미드를 HEK293T cell에 각 1.5 μg, 타겟팅을 위한 guide RNA cassette를 0.5 μg을 transfection한 후 96시간 후에 cell을 수확하였다. Maxwell® RSC miRNA Tissue Kit (Promega)를 사용하여 RNA를 추출하였다. 1 μg의 RNA를 SuperScript IV Reverse Transcriptase (Invitrogen)를 사용하여 cDNA 합성을 protocol대로 진행하였다. 이 합성된 cDNA를 주형으로 각 타겟의 발현 억제효과를 확인하였다(도 31 내지 45). 비교군으로 사용한 타겟은 18s를 사용하였고 qPCR을 위해 사용한 primer는 다음 [표29]와 같다.
[표29]
Figure PCTKR2022005135-appb-I000029
실시예 2.3 CRIPSR interference 복합체를 이용한 PCSK9 유전자의 발현 저해 효과
PCSK9 유전자의 발현 저해 효과를 확인하기 위해 promoter에 위치하는 타겟을 선정하여 indel 효율을 확인하였다. HEK293T cell에 Cas12f1과 guide RNA를 코딩하고 있는 벡터 2μg을 각각 transfection 하였고 transfection 96시간 후 cell을수확하여 NGS를 통해 indel효율을 분석하였다(도 46). 이때, 사용된 gRNA 정보는 다음 [표30]과 같다.
[표30]
Figure PCTKR2022005135-appb-I000030
타겟팅 효율을 높이기 위하여 guide RNA optimization, spacer optimization을 진행하여 최적의 guide RNA 형태를 확인하였다(도 47 내지 49).
또한, PCSK9이 많이 발현하는 Huh7, HepG2, Hep3B cell에서 선정한 타겟에 대하여 유전자 발현 저해를 확인하기 위하여 제작한 각각의 모듈로 mRNA level을 비교하였다(도 50 내지 53).
실험예 3. 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질을 이용한 CRISPR 발현 조절 시스템
실험예 3.1 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 설계
Cas12f1을 발현하는 벡터를 mutagenesis 방법으로 Cas12f1을 dead 형태로 변형하였다. Dead 형태는 D326A, E422A, R490A 또는 D510A이고, 그 외 cleavage 활성을 상실하는 변이가 된 형태이다. dCas12f1의 C term 말단에 전사활성 단백질인 VP64를 fusion하여 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질을 제작하였다(도 54).
실험예 3.2 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 및 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR activation 복합체의 발현 촉진 효과
OCT4 gene을 타겟팅 하는 타겟을 선정하였다. 선정한 타겟은 다음 [표31]와 같다. 제작한 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질과 각각의 guide RNA를 코딩하는 벡터를 HEK293T 세포에 FugeneHD(Promega) reagent를 사용하여 transfection 하였다. transfection방법은 reagent의 protocol을 따른다. Transfection 72시간 후 Cell을 수확하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 사용하여 SuperScript iV(Invitrogen)kit를 사용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA를 주형으로 사용하여 qPCR로 expression 변화를 분석하였다(도 55).
[표31]
Figure PCTKR2022005135-appb-I000031
본 명세서에서는 유전자 발현 조절에 사용할 수 있는 CRISPR 발현 조절 시스템을 제공하며, 특히, 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질 및 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR 발현 조절 시스템 및/또는 전사 활성 Cas12f1 융합 단백질 및 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 포함하는 CRISPR 발현 조절 시스템을 제공한다. 본 명세서에서 제공하는 CRISPR 발현 조절 시스템을 유전자 발현 조절에 사용하는 경우, 표적 유전자의 발현을 억제 또는 촉진하는 용도로 사용할 수 있다.

Claims (22)

  1. 다음을 포함하는, 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한, 유전자 발현 조절용 조성물:
    전사 저해 Cas12f1 융합 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산; 및
    엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산,
    이때, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 dead Cas12f1(dCas12f1) 단백질 및 전사 저해 단백질을 포함하고,
    상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질을 구성하는 아미노산 서열 중 326번째 아미노산인 아스파트산(D), 422번째 아미노산인 글루탐산(E), 490번째 아미노산인 아르기닌(R) 또는 510번째 아미노산인 아스파트산(D)이 알라닌(A), 글루타민(Q), 류신(L), 트립토판(W) 또는 발린(V)으로 치환된 것이며,
    상기 전사 저해 단백질은 유전자의 전사를 저해 또는 억제하는 단백질 또는 펩타이드임,
    이때, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA는 다음을 포함함:
    엔지니어링 된 스캐폴드 영역;
    스페이서; 및
    U-rich tail,
    이때, 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA의 5'말단에서 3'말단 방향으로, 엔지니어링 된 스캐폴드 영역, 스페이서, 및 U-rich tail이 순서대로 연결되어 있고,
    상기 스페이서는 10개 이상 50개 이하의 뉴클레오타이드를 포함하며, 상기 표적 서열과 상보적인 서열을 가지고,
    상기 U-rich tail의 서열은 (UaN)bUc로 표현되며, 상기 N은 아데노신(A), 유리딘(U), 사이티딘(C), 구아노신(G) 중 하나이고, 상기 a, b, c는 정수이고, a는 1 이상 5 이하, b는 0 이상이고,
    상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACCAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 7)과 상이한 것을 특징으로 하며,
    상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로 다음 서열이 순서대로 연결된 것임:
    5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA-3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 5'-AAGUGGAGAA-3'(서열번호 17), 5'-AAAGUGGAGAA-3'(서열번호 18), 5'-UAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 19), 5'-AUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 20), 5'-GAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 21), 5'-UGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 22), 5'-CUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 23), 5'-ACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 24), 5'-CACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 25), 5'-UCACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 26), 5'-UUCACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 27), 및 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 10)로 이뤄진 군에서 선택된 서열;
    5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5'-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', 5'-CCUUAGGUGG-3'(서열번호 342), 5'-CCGUUAGGUGG-3'(서열번호 343), 5'-CCGCUUAGGGUGG-3'(서열번호 344), 5'-CCGCUUUAGAGGUGG-3'(서열번호 345), 5'-CCGCUUUUAGAAGGUGG-3'(서열번호 346), 5'-CCGCUUCUUAGGAAGGUGG-3'(서열번호 347), 5'-CCGCUUCAUUAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 348), 5'-CCGCUUCACUUAGGUGAAGGUGG-3'(서열번호 349), 5'-CCGCUUCACUUAGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 350), 5'-CCGCUUCACCUUAGGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 351), 5'-CCGCUUCACCAUUAGUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 352), 5'-CCGCUUCACCAAUUAGUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 353), 5'-CCGCUUCACCAAAUUAGCUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 354), 5'-CCGCUUCACCAAAAUUAGACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 355), 5'-CCGCUUCACCAAAAGUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 356), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUUAGGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 357), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUUUAGAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 358), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUUAGUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 359), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUUAGUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 360), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUUUAGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 361), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUCUUAGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 362), 및 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 11)로 이뤄진 군에서 선택된 서열;
    5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 434), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUUUCGAAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 435), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUUCGAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 436), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUCUUCGGAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 437), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCGAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 438), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUCGGUAACCCUCGA-3'(서열번호 439), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGUUCGUAACCCUCGA-3'(서열번호 440), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUUUCGAACCCUCGA-3'(서열번호 441), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUUCGACCCUCGA-3'(서열번호 442), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUUCGCCCUCGA-3'(서열번호 443), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAUUCGCCCUCGA-3'(서열번호 444), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAUUCGCCUCGA-3'(서열번호 445), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAUUCGCCUCGA-3'(서열번호 446), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGUUCGCUCGA-3'(서열번호 447), 및 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 12)로 이뤄진 군에서 선택된 서열;
    5'-AACAAAGAAAGGA-3'(서열번호 111), 5'-AACAAAUGAAAAGGA-3'(서열번호 112), 5'-AACAAAUUGAAAAAGGA-3'(서열번호 113), 5'-AACAAAUUCGAAAGAAGGA-3'(서열번호 114), 5'-AACAAAUUCAGAAAUGAAGGA-3'(서열번호 115), 5'-AACAAAUUCAUGAAAAUGAAGGA-3'(서열번호 116), 5'-AACAAAUUCAUUGAAAAAUGAAGGA-3'(서열번호 117), 및 5'-AACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGA-3'(서열번호 118)에서 선택된 서열; 및
    5'-AUGCAAC-3'.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 dCas12f1 단백질은 dCas12f1 R490A 단백질, dCas12f1 R490Q 단백질, dCas12f1 R490L 단백질 또는 dCas12f1 R490W 단백질인 것을 특징으로 하는 유전자 발현 조절용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 dCas12f1 단백질은 dCas12f1 D510A 단백질, dCas12f1 D510L 단백질 또는 dCas12f1 D510V 단백질인 것을 특징으로 하는 유전자 발현 조절용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 dCas12f1 단백질은 dCas12f1 D326A 단백질 또는 dCas12f1 E422A 단백질인 것을 특징으로 하는 유전자 발현 조절용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 전사 저해 단백질은 RNA 중합효소가 표적 유전자의 프로모터에 부착되는 것을 차단하거나 크로마틴의 구조변화를 유도하여 유전자의 전사를 저해 또는 억제하는 단백질 또는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 유전자 발현 조절용 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 전사 저해 단백질은 KRAB, MeCP2, DNMT, LSD 또는 HDAC인 것을 특징으로 하는 유전자 발현 조절용 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 하나 이상의 전사 저해 단백질을 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 조절용 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 전사 저해 단백질은 KRAB, MeCP2, DNMT, LSD 또는 HDAC인 것을 특징으로 하는 유전자 발현 조절용 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 하나 이상의 NLS 또는 NES를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 조절용 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 U-rich tail의 서열은 5'-UUUURUUUU-3'로 표현되는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 조절용 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA에 포함된 상기 스캐폴드 영역의 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로 다음 서열이 순서대로 연결된 것을 특징으로 하는 유전자 발현 조절용 조성물:
    5'-A-3';
    5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 11);
    5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 12);
    5'-AACCAAAGAAAGGA-3'(서열번호 111); 및
    5'-AUGCAAC-3'.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA에 포함된 상기 스캐폴드 영역의 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로 다음 서열이 순서대로 연결된 것을 특징으로 하는 유전자 발현 조절용 조성물:
    5'-A-3';
    5'-CCGCUUCACUUAGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 350);
    5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 12);
    5'-AACCAAAGAAAGGA-3'(서열번호 111); 및
    5'-AUGCAAC-3'.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 벡터 형태인 것을 특징으로 하는 유전자 발현 조절용 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 조성물은 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질을 암호화하는 핵산과 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 암호화하는 핵산을 위한 프로모터를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 조절용 조성물.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 벡터는 플라스미드, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 백시니아바이러스, 폭스바이러스 및 단순포진 바이러스로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 유전자 발현 조절용 조성물.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA 및 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질이 결합한 리보뉴클레오프로틴(Ribonucleoprotein, RNP) 형태인 것을 특징으로 하는 유전자 발현 조절용 조성물.
  17. 다음을 포함하는, 세포 내에서 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법:
    전사 저해 Cas12f1 융합 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산; 및 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산을 세포 내로 전달하는 것,
    이로 인해 상기 세포 내에서 CRISPR interference 복합체가 형성될 수 있으며,
    이로 인해 상기 표적 유전자의 전사가 CRISPR interference 복합체에 의해 억제될 수 있고,
    이때, 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질은 dead Cas12f1(dCas12f1) 단백질 및 전사 저해 단백질을 포함하고,
    상기 dCas12f1 단백질은 야생형의 Cas12f1 단백질을 구성하는 아미노산 서열 중 326번째 아미노산인 아스파트산(D), 422번째 아미노산인 글루탐산(E), 490번째 아미노산인 아르기닌(R) 또는 510번째 아미노산인 아스파트산(D)이 알라닌(A), 글루타민(Q), 류신(L), 트립토판(W) 또는 발린(V)으로 치환된 것이며,
    상기 전사 저해 단백질은 유전자의 전사를 저해 또는 억제하는 단백질 또는 펩타이드임,
    이때, 엔지니어링 된 가이드 Cas12f1 RNA는 다음을 포함함:
    엔지니어링 된 스캐폴드 영역;
    스페이서; 및
    U-rich tail,
    이때, 상기 엔지니어링 된 가이드 Cas12f1 RNA의 5'말단에서 3'말단 방향으로, 엔지니어링 된 스캐폴드 영역, 스페이서, 및 U-rich tail이 순서대로 연결되어 있고,
    상기 스페이서는 10개 이상 50개 이하의 뉴클레오타이드를 포함하며, 표적 서열과 상보적인 서열을 가지고,
    상기 U-rich tail의 서열은 (UaN)bUc로 표현되며, 상기 N은 아데노신(A), 유리딘(U), 사이티딘(C), 구아노신(G) 중 하나이고, 상기 a, b, c는 정수이고, a는 1 이상 5 이하, b는 0 이상이고,
    상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAACCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGGGCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGAAACCAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGAAUGCAAC-3'(서열번호 7)과 상이한 것을 특징으로 하며,
    상기 엔지니어링 된 스캐폴드 영역의 서열은 5'말단에서 3'말단 방향으로 다음 서열이 순서대로 연결된 것임:
    5'-A-3', 5'-AA-3', 5'-GAA-3', 5'-AGAA-3', 5'-GAGAA-3', 5'-GGAGAA-3', 5'-UGGAGAA-3', 5'-GUGGAGAA-3', 5'-AGUGGAGAA-3', 5'-AAGUGGAGAA-3'(서열번호 17), 5'-AAAGUGGAGAA-3'(서열번호 18), 5'-UAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 19), 5'-AUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 20), 5'-GAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 21), 5'-UGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 22), 5'-CUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 23), 5'-ACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 24), 5'-CACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 25), 5'-UCACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 26), 5'-UUCACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 27), 및 5'-CUUCACUGAUAAAGUGGAGAA-3'(서열번호 10)로 이뤄진 군에서 선택된 서열;
    5'-G-3', 5'-UUAGG-3', 5'-CUUAGGG-3', 5'-CUUAGUGG-3', 5'-CCUUAGGUGG-3'(서열번호 342), 5'-CCGUUAGGUGG-3'(서열번호 343), 5'-CCGCUUAGGGUGG-3'(서열번호 344), 5'-CCGCUUUAGAGGUGG-3'(서열번호 345), 5'-CCGCUUUUAGAAGGUGG-3'(서열번호 346), 5'-CCGCUUCUUAGGAAGGUGG-3'(서열번호 347), 5'-CCGCUUCAUUAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 348), 5'-CCGCUUCACUUAGGUGAAGGUGG-3'(서열번호 349), 5'-CCGCUUCACUUAGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 350), 5'-CCGCUUCACCUUAGGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 351), 5'-CCGCUUCACCAUUAGUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 352), 5'-CCGCUUCACCAAUUAGUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 353), 5'-CCGCUUCACCAAAUUAGCUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 354), 5'-CCGCUUCACCAAAAUUAGACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 355), 5'-CCGCUUCACCAAAAGUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 356), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUUAGGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 357), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUUUAGAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 358), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUUAGUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 359), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUUAGUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 360), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUUUAGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 361), 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUCUUAGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 362), 및 5'-CCGCUUCACCAAAAGCUGUCCCUUAGGGGAUUAGAACUUGAGUGAAGGUGG-3'(서열번호 11)로 이뤄진 군에서 선택된 서열;
    5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 434), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUUUCGAAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 435), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUUCGAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 436), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUCUUCGGAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 437), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCGAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 438), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUCGGUAACCCUCGA-3'(서열번호 439), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGUUCGUAACCCUCGA-3'(서열번호 440), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUUUCGAACCCUCGA-3'(서열번호 441), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUUCGACCCUCGA-3'(서열번호 442), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUUCGCCCUCGA-3'(서열번호 443), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAUUCGCCCUCGA-3'(서열번호 444), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAUUCGCCUCGA-3'(서열번호 445), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAUUCGCCUCGA-3'(서열번호 446), 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGUUCGCUCGA-3'(서열번호 447), 및 5'-GCUGCUUGCAUCAGCCUAAUGUCGAGAAGUGCUUUCUUCGGAAAGUAACCCUCGA-3'(서열번호 12)로 이뤄진 군에서 선택된 서열;
    5'-AACAAAGAAAGGA-3'(서열번호 111), 5'-AACAAAUGAAAAGGA-3'(서열번호 112), 5'-AACAAAUUGAAAAAGGA-3'(서열번호 113), 5'-AACAAAUUCGAAAGAAGGA-3'(서열번호 114), 5'-AACAAAUUCAGAAAUGAAGGA-3'(서열번호 115), 5'-AACAAAUUCAUGAAAAUGAAGGA-3'(서열번호 116), 5'-AACAAAUUCAUUGAAAAAUGAAGGA-3'(서열번호 117), 및 5'-AACAAAUUCAUUUGAAAGAAUGAAGGA-3'(서열번호 118)에서 선택된 서열; 및
    5'-AUGCAAC-3'.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 전달은 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질 및 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 CRISPR interference 복합체로써 세포 내에 주입하는 것인 방법.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 전달은 상기 전사 저해 Cas12f1 융합 단백질을 암호화하는 핵산 및 상기 엔지니어링 된 Cas12f1 가이드 RNA를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 세포 내에 주입하는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 벡터는 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 백시니아바이러스, 폭스바이러스 및 단순포진 바이러스로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제17항에 있어서,
    상기 세포는 진핵 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
PCT/KR2022/005135 2021-04-16 2022-04-08 Crispr 시스템을 이용한 유전자 발현 조절 시스템 WO2022220503A1 (ko)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18/287,118 US20240200105A1 (en) 2021-04-16 2022-04-08 Gene expression regulatory system using crispr system
EP22788359.2A EP4324920A1 (en) 2021-04-16 2022-04-08 Gene expression regulatory system using crispr system
CA3216819A CA3216819A1 (en) 2021-04-16 2022-04-08 Gene expression regulatory system using crispr system

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210050093 2021-04-16
KR10-2021-0050093 2021-04-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022220503A1 true WO2022220503A1 (ko) 2022-10-20

Family

ID=83640431

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2022/005135 WO2022220503A1 (ko) 2021-04-16 2022-04-08 Crispr 시스템을 이용한 유전자 발현 조절 시스템

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20240200105A1 (ko)
EP (1) EP4324920A1 (ko)
KR (3) KR20220144317A (ko)
CN (1) CN116568803A (ko)
CA (1) CA3216819A1 (ko)
WO (1) WO2022220503A1 (ko)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023250511A3 (en) * 2022-06-24 2024-02-08 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for reducing low-density lipoprotein through targeted gene repression
US12054756B2 (en) 2022-03-01 2024-08-06 Epicrispr Biotechnologies, Inc. Engineered nucleases, compositions, and methods of use thereof
US12098399B2 (en) 2023-10-02 2024-09-24 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for epigenetic regulation of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) gene expression

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20240062618A (ko) 2022-11-02 2024-05-09 현대모비스 주식회사 이미지 자동 변환이 가능한 커뮤니케이션 라이팅 시스템

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019089820A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 The Regents Of The University Of California Casz compositions and methods of use
KR20190058358A (ko) * 2017-11-21 2019-05-29 한국생명공학연구원 CRISPR/Cpf1 시스템을 이용한 유전체 편집용 조성물 및 이의 용도
US20190345483A1 (en) * 2016-05-12 2019-11-14 President And Fellows Of Harvard College AAV Split Cas9 Genome Editing and Transcriptional Regulation

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20190345483A1 (en) * 2016-05-12 2019-11-14 President And Fellows Of Harvard College AAV Split Cas9 Genome Editing and Transcriptional Regulation
WO2019089820A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 The Regents Of The University Of California Casz compositions and methods of use
KR20190058358A (ko) * 2017-11-21 2019-05-29 한국생명공학연구원 CRISPR/Cpf1 시스템을 이용한 유전체 편집용 조성물 및 이의 용도

Non-Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIN MOON SU, LEE JEONG MI, KANG JEONG GU, LEE NAN-EE, HA DAE-IN, KIM DO YON, KIM SUN HEE, YOO KWANGSUN, KIM DAESIK, KO JEONG-HEON,: "Highly efficient genome editing by CRISPR-Cpf1 using CRISPR RNA with a uridinylate-rich 3′-overhang", NATURE COMMUNICATIONS, vol. 9, no. 1, 1 December 2018 (2018-12-01), XP055785455, DOI: 10.1038/s41467-018-06129-w *
HARRINGTON ET AL., SCIENCE, vol. 362, 2018, pages 839 - 842
HARRINGTON ET AL.: "Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes", SCIENCE, vol. 362, 2018, pages 839 - 842, XP055614750, DOI: 10.1126/science.aav4294
KARVELIS TAUTVYDAS, BIGELYTE GRETA, YOUNG JOSHUA K, HOU ZHENGLIN, ZEDAVEINYTE RIMANTE, BUDRE KAROLINA, PAULRAJ SUSHMITHA, DJUKANOV: "PAM recognition by miniature CRISPR–Cas12f nucleases triggers programmable double-stranded DNA target cleavage", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 48, no. 9, 21 May 2020 (2020-05-21), GB , pages 5016 - 5023, XP055920188, ISSN: 0305-1048, DOI: 10.1093/nar/gkaa208 *
KIM DO YON; LEE JEONG MI; MOON SU BIN; CHIN HYUN JUNG; PARK SEYEON; LIM YOUJUNG; KIM DAESIK; KOO TAEYOUNG; KO JEONG-HEON; KIM YONG: "Efficient CRISPR editing with a hypercompact Cas12f1 and engineered guide RNAs delivered by adeno-associated virus", NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 40, no. 1, 2 September 2021 (2021-09-02), New York, pages 94 - 102, XP037667066, ISSN: 1087-0156, DOI: 10.1038/s41587-021-01009-z *
LUCAS B. HARRINGTON, DAVID BURSTEIN, JANICE S. CHEN, DAVID PAEZ-ESPINO, ENBO MA, ISAAC P. WITTE, JOSHUA C. COFSKY, NIKOS C. KYRPID: "Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes", SCIENCE, vol. 362, no. 6416, 16 November 2018 (2018-11-16), US , pages 839 - 842, XP055614750, ISSN: 0036-8075, DOI: 10.1126/science.aav4294 *
MAKAROVA ET AL., NATURE REVIEWS, MICROBIOLOGY, vol. 18, no. 67, 2020
MIYAGISHI ET AL., NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 20, 2002, pages 497 - 500
PANYAM, ADV DRUG DELIV REV., 13 September 2012 (2012-09-13)
TAKEDA ET AL.: "Structure of the miniature type V-F CRISPR-Cas effector enzyme", MOLECULAR CELL, vol. 81, 2021, pages 1 - 13
TAUTVYDAS KARVELIS ET AL., NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 48, 2020, pages 5016 - 5023
XIA ET AL., NUCLEIC ACIDS RES., vol. 31, no. 17, 1 September 2003 (2003-09-01)
XIAO ET AL.: "Structural basis for the dimerization-dependent CRISPR-Cas12f nuclease", BIORXIV, 2020

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12054756B2 (en) 2022-03-01 2024-08-06 Epicrispr Biotechnologies, Inc. Engineered nucleases, compositions, and methods of use thereof
WO2023250511A3 (en) * 2022-06-24 2024-02-08 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for reducing low-density lipoprotein through targeted gene repression
US12098399B2 (en) 2023-10-02 2024-09-24 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for epigenetic regulation of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) gene expression

Also Published As

Publication number Publication date
KR20220144343A (ko) 2022-10-26
EP4324920A1 (en) 2024-02-21
KR102690083B1 (ko) 2024-08-01
KR20220144317A (ko) 2022-10-26
KR20240118053A (ko) 2024-08-02
CN116568803A (zh) 2023-08-08
US20240200105A1 (en) 2024-06-20
CA3216819A1 (en) 2022-10-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2022220503A1 (ko) Crispr 시스템을 이용한 유전자 발현 조절 시스템
WO2021086083A2 (ko) CRISPR/Cas12f1 시스템 효율화를 위한 엔지니어링 된 가이드 RNA 및 그 용도
WO2022075813A1 (ko) Crispr/cas12f1 시스템 효율화를 위한 엔지니어링 된 가이드 rna 및 그 용도
WO2022075816A1 (ko) Crispr/cas12f1(cas14a1) 시스템 효율화를 위한 엔지니어링 된 가이드 rna 및 이의 용도
WO2019009682A2 (ko) 표적 특이적 crispr 변이체
WO2022075808A1 (ko) Crispr/cas12f1 시스템 효율화를 위한 u-rich tail을 포함하는 엔지니어링 된 가이드 rna 및 그 용도
WO2020235974A2 (ko) 단일염기 치환 단백질 및 이를 포함하는 조성물
AU2013335451C1 (en) Composition for cleaving a target DNA comprising a guide RNA specific for the target DNA and Cas protein-encoding nucleic acid or Cas protein, and use thereof
CN101301309A (zh) 其它新形式的干扰rna分子
WO2017188797A1 (ko) In vivo에서 rna-가이드 뉴클레아제의 활성을 고처리량 방식으로 평가하는 방법
WO2022060185A1 (ko) 표적화된 탈아미노효소 및 이를 이용한 염기 교정
WO2016021973A1 (ko) 캄필로박터 제주니 crispr/cas 시스템 유래 rgen을 이용한 유전체 교정
WO2010090452A2 (ko) 세포 내 전달능이 증가된 작은 간섭 rna 복합체
WO2015152693A2 (ko) 신규 이중 나선 올리고 rna 및 이를 포함하는 섬유증 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물
CN101310015A (zh) 在两个功能性亚结构域中具有突变的laglidadg归巢核酸内切酶变体及其用途
WO2012165854A9 (ko) 표적 유전자 발현 억제 및 면역 반응을 동시에 유발하는 이중가닥의 긴 간섭 ｒｎａ
CN101522899A (zh) 安全性改善的表达载体
WO2018088694A2 (ko) 인위적으로 조작된 sc 기능 조절 시스템
WO2023059115A1 (ko) 유전자 편집을 위한 target 시스템 및 이의 용도
WO2023153845A2 (ko) 상동지정복구를 위한 target 시스템 및 이를 이용한 유전자 편집 방법
CN100580092C (zh) 用于禽流感病毒检测和分型的基因芯片
WO2020218657A1 (ko) 표적 특이적 crispr 변이체
WO2014054927A1 (ko) 엠피레귤린 특이적 이중 나선 올리고 rna, 그러한 이중나선 올리고 rna를 포함하는 이중나선 올리고 rna 구조체 및 이를 포함하는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 조성물
CN1330666C (zh) 低氧－诱导因子1αHIF－1α变体和鉴定HIF－1α调节剂的方法
WO2018194438A1 (ko) 비복제 아데노 바이러스 생산 세포주 및 이의 제조방법

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22788359

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 3216819

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 18287118

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2022788359

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022788359

Country of ref document: EP

Effective date: 20231116