WO2022060185A1 - 표적화된 탈아미노효소 및 이를 이용한 염기 교정 - Google Patents

표적화된 탈아미노효소 및 이를 이용한 염기 교정 Download PDF

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임가영
조성익
강범창
이성현
이현지
목영근
이지민
정유진
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기초과학연구원
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Definitions

  • the present invention relates to an isolated form of cytosine or adenine deaminase or a variant thereof, a non-toxic full-length cytosine deaminase or a variant thereof, a fusion protein comprising the same, a composition for base correction, and a method for base correction using the same. .
  • Fusion proteins in which DNA binding proteins and deaminases are linked do not produce DNA double-strand breaks (DSBs), but target nucleotide substitutions or base editing in the genome, correct point mutations that cause genetic disorders, or prokaryotic cells , enabling single nucleotide conversion in a targeted manner to introduce desired single nucleotide mutations into humans and other eukaryotic cells.
  • DLBs DNA double-strand breaks
  • nucleases such as CRISPR-Cas9, which induce small insertions or deletions (indels) at the target site, it converts a single base within a window of several nucleotides at the target site.
  • point mutations that cause genetic diseases can be corrected or single nucleotide polymorphisms (SNPs) can be generated in cultured cells, animals and plants.
  • dCas9 catalytically-deficient Cas9
  • nCas9 D10A Cas9 nickase
  • BEs pyogenes and a rat cytosine deaminase Base Editors (BEs), including rAPOBEC1; 2) Target-AID comprising dCas9 or nCas9 and PmCDA1 or human AID, which is an activation-induced cytidine deaminase (AID) ortholog of sea lamprey; 3) CRISPR-X comprising sgRNAs and dCas9 linked to MS2 RNA hairpins to recruit overactivated AID variants fused to MS2-binding protein, and the like can be exemplified.
  • BEs rAPOBEC1
  • Target-AID comprising dCas9 or nCas9 and PmCDA1 or human AID, which is an activation-induced cytidine deaminase (AID) ortholog of sea lamprey
  • CRISPR-X comprising sgRNAs and dCas9 linked to MS2 RNA hairpin
  • ZFN zinc-finger nuclease
  • TALEN transcription activator-like effector nuclease
  • CRISPR clustered regularly interspaced short palindromic repeat
  • Cas9 CRISPR-associated protein 9 mutant and base deaminase that lack nucleolysis efficiency
  • Programs such as protein base correction technology
  • Genome editing tools have been developed for genetic research of plants and improvement of crop traits through nucleotide sequence changes. However, these tools are not suitable for correcting the DNA sequence of plant organelles, including mitochondria and chloroplasts, primarily because of the difficulty in delivering guide RNAs to organelles or expressing both compounds simultaneously in organelles. Plant organelles encode several essential genes required for photosynthesis and respiration.
  • a method or tool for correcting the gene of these organelles is very necessary for the study of the function of these genes or the improvement of crop productivity and traits.
  • targeted mutations in the mitochondrial atp6 gene can lead to male infertility, a trait useful for reproduction, and specific point mutations in the 16S rRNA gene in the chloroplast genome can lead to antibiotic resistance.
  • Bacterial toxin DddA tox is an enzymatic function of a bacterial toxin derived from Burkholderia cenocepacia , and can deaminate cytosine in double-stranded DNA.
  • DddA tox is toxic to cells, so to avoid toxicity in the host cell, DddA tox is divided into two inactivated splits, each of which is capable of binding to DNA. It can be used as a functional DdCBE pair by linking to a DNA binding protein designed to be used.
  • this enzymatic reaction of deamination is activated only when two inactivated halves exist close to the target DNA by the DNA-binding protein. Therefore, cytosine to thymine base correction occurs in the middle of the two DNA binding protein binding sites.
  • Two inactive forms bound to a TALE (transcription activator-like effector) array as a DNA binding protein have a function when bound to a target DNA by TALE in the vicinity. Base conversion from cytosine to thymine is induced in the region between 14 and 18 bases between the two TALE binding sites.
  • the split form DddA tox divided into two is subject to many limitations in the experiment.
  • the full-length DddA tox cannot be cloned using general E. coli because of its toxicity, and is cloned using E. coli that also expresses an immunity gene that interferes with toxicity.
  • mitochondrial DNA plays a very important role in cellular respiration, which is accomplished through the mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) mechanism. Because the OXPHOS mechanism is essential for survival, mutations in mitochondrial DNA can cause severe dysfunction in many organs or muscles, such as high-energy-demanding tissues.
  • OXPHOS mitochondrial oxidative phosphorylation
  • normal mitochondrial DNA and mitochondrial DNA with single base mutations coexist, which causes a numerical heterogeneity of mitochondrial DNA (heteroplasmy).
  • the balance of mutation and normal mitochondrial DNA determines the development of clinically symptomatic mitochondrial disease.
  • programmable nucleases were used in a way that cuts mutant mitochondrial DNA and does not remove normal mitochondrial DNA. However, these nucleases cannot introduce or reverse specific mutations into mitochondria, probably because double-strand breaks of DNA in mitochondria are not efficiently repaired through heterologous end splicing or homologous recombination as in the nucleus.
  • Mitochondrial base correction can help create models for various diseases that have not been tried before, or create therapeutic agents to treat them. In this respect, the need for the development of highly efficient mitochondrial base editing enzymes is increasing.
  • the desired CBE cytosine base editor
  • ABE adenine base editor
  • An object of the present invention is to provide a fusion protein comprising a DNA binding protein, an isolated form of a cytosine or adenine deaminase or a variant thereof, a non-toxic full-length cytosine deaminase or a variant thereof.
  • the present invention provides (i) a DNA binding protein; And (ii) a fusion protein comprising a first fragment and a second fragment derived from cytosine deaminase or a variant thereof, wherein the first fragment and the second fragment are each bound to the DNA-binding protein It provides a fusion protein in a form that can be
  • the present invention relates to (i) a DNA binding protein; And (ii) provides a fusion protein comprising a cytosine deaminase or a non-toxic full-length cytosine deaminase derived from a variant thereof.
  • the present invention relates to (i) a DNA binding protein; (ii) cytosine deaminase or a variant thereof; And (iii) a fusion protein comprising an adenine deaminase, wherein the cytosine deaminase or a variant thereof is (a) a non-toxic full-length cytosine deaminase or (b) a first fragment derived from a cytosine deaminase or a variant thereof It provides a fusion protein comprising a sieve and a second fragment, wherein the first fragment and the second fragment are each bound to the DNA-binding protein.
  • the present invention provides a nucleic acid encoding the fusion protein.
  • the present invention provides a composition for base correction comprising the fusion protein or nucleic acid.
  • the present invention provides a composition for correcting a eukaryotic base comprising the fusion protein or nucleic acid.
  • the present invention also provides the fusion protein or nucleic acid; And NLS (nuclear localization signal) provides a composition for base correction of plant cells comprising a peptide or a nucleic acid encoding the same.
  • the present invention also provides the fusion protein or nucleic acid; And chloroplast transit peptide (chloroplast transit peptide) or provides a composition for plant cell base correction comprising a nucleic acid encoding the same.
  • the present invention also provides the fusion protein or nucleic acid; and Mitochondrial Targeting Signal (MTS) or a nucleic acid encoding the same. It provides a composition for editing plant cell bases.
  • MTS Mitochondrial Targeting Signal
  • the present invention also provides an extranuclear transport signal protein or a composition for correcting plant cell bases, further comprising a nucleic acid encoding the same.
  • the present invention also provides a plant cell base correction method comprising the step of treating plant cells with the composition.
  • the present invention also provides the fusion protein or nucleic acid; and NLS (nuclear localization signal) peptide or a nucleic acid encoding the same to plant cells.
  • the present invention also provides the fusion protein or nucleic acid; and chloroplast transit peptide (chloroplast transit peptide) or a nucleic acid encoding the same in plant cells.
  • the present invention also provides the fusion protein or nucleic acid; and Mitochondrial Targeting Signal (MTS) or a nucleic acid encoding the same in plant cells.
  • MTS Mitochondrial Targeting Signal
  • the present invention also provides the fusion protein or nucleic acid; and NLS (nuclear localization signal) peptide or a nucleic acid encoding the same.
  • the present invention also provides the fusion protein or nucleic acid; and mitochondrial targeting signal (MTS) or a nucleic acid encoding the same.
  • MTS mitochondrial targeting signal
  • the present invention also provides a composition for correcting the base of animal cells, optionally further comprising an extranuclear transport signal protein or a nucleic acid encoding the same.
  • the present invention also provides an animal cell base correction method comprising the step of treating the animal cells with the composition.
  • the present invention also provides the fusion protein or nucleic acid; and NLS (nuclear localization signal) peptide or a nucleic acid encoding the same, to the animal cells.
  • the present invention also provides the fusion protein or nucleic acid; and mitochondrial targeting signal (MTS) or a nucleic acid encoding the same, to the animal cells.
  • MTS mitochondrial targeting signal
  • the present invention also provides a composition for A-to-G base correction in prokaryotic or eukaryotic cells comprising the fusion protein or a nucleic acid encoding the fusion protein, wherein the DNA binding protein is a zinc finger protein, a TALE protein Or CRISPR-associated nuclease, the cytosine deaminase of the fusion protein or a variant thereof is derived from bacteria, and provides a composition characterized in that it is specific for double-stranded DNA.
  • the present invention also provides a composition for A-to-G base correction in prokaryotic or eukaryotic cells comprising the fusion protein or a nucleic acid encoding the fusion protein, wherein the DNA binding protein is a zinc finger protein, a TALE protein or CRISPR-associated nuclease, wherein the cytosine deaminase or variant thereof of the fusion protein is of bacterial origin and is specific for double-stranded DNA, and a DNA binding protein is bound to the N-terminus of the cytosine deaminase or variant thereof, and , It provides a composition in which a DNA-binding protein is bound to the C-terminus of the adenine deaminase of the fusion protein.
  • the present invention also provides a composition for C-to-T base correction in prokaryotic or eukaryotic cells comprising the fusion protein or a nucleic acid encoding it and UGI (uracil glycosylase inhibitor), wherein the DNA binding protein is a zinc pinker protein ( zinc finger protein), TALE protein, or CRISPR-associated nuclease, the cytosine deaminase or variant thereof of the fusion protein is a full-length non-toxic cytosine deaminase, and the cytosine deaminase or variant thereof of the fusion protein is derived from bacteria and provides a composition characterized in that it is double-stranded DNA-specific.
  • UGI uracil glycosylase inhibitor
  • the present invention also provides a composition for C-to-T base correction in prokaryotic or eukaryotic cells comprising the fusion protein or a nucleic acid encoding it and UGI (uracil glycosylase inhibitor), wherein the DNA binding protein is a zinc pinker protein ( zinc finger protein), TALE protein, or CRISPR-associated nuclease, and the cytosine deaminase or variant thereof of the fusion protein is a split cytosine deaminase comprising a first fragment and a second fragment, and the The cytosine deaminase or variant thereof is of bacterial origin and provides a composition characterized in that it is double-stranded DNA-specific.
  • UGI uracil glycosylase inhibitor
  • the present invention also provides an A-to-G base correction method in a prokaryotic or eukaryotic cell comprising the step of treating the fusion protein or a nucleic acid encoding the same in the prokaryotic or eukaryotic cell, wherein the DNA-binding protein is a zinc pinker It is a zinc finger protein, a TALE protein, or a CRISPR-associated nuclease, and the cytosine deaminase of the fusion protein or a variant thereof is derived from bacteria, and provides a method characterized in that it is specific for double-stranded DNA.
  • the present invention also provides an A-to-G base correction method in a prokaryotic or eukaryotic cell comprising the step of treating the fusion protein or a nucleic acid encoding the same in the prokaryotic or eukaryotic cell, wherein the DNA-binding protein is a zinc pinker a protein (zinc finger protein), a TALE protein, or a CRISPR-associated nuclease,
  • the DNA-binding protein is a zinc pinker a protein (zinc finger protein), a TALE protein, or a CRISPR-associated nuclease
  • the cytosine deaminase or variant thereof of the fusion protein is of bacterial origin and is specific to double-stranded DNA
  • It provides a method in which a DNA-binding protein is bound to the N-terminus of the cytosine deaminase or a variant thereof, and the DNA-binding protein is bound to the C-terminus of the adenine deaminase of the fusion protein.
  • the present invention also provides a C-to-T base correction method in a prokaryotic or eukaryotic cell comprising the step of treating the fusion protein or a nucleic acid encoding the same and UGI (uracil glycosylase inhibitor) to the prokaryotic or eukaryotic cell, wherein the
  • the DNA binding protein is a zinc finger protein, a TALE protein, or a CRISPR-associated nuclease, and the cytosine deaminase or a variant thereof of the fusion protein is derived from bacteria and is double-stranded DNA-specific. to provide.
  • the Split-DddAtox half is fused to the C terminus of Zinc Finger Protein (C type).
  • C type Zinc Finger Protein
  • the pTarget plasmid contains a spacer ranging in size from 1 to 24 bp (indicated in red) and a region of a ZFP DNA binding site (indicated in green).
  • the ZFD structure contains AA linkers of varying lengths (shown in yellow and orange) and different DddAtox cleavage sites and orientations (shown in blue).
  • c-d ZFD activity was measured at the target site of the pTarget library to investigate the influence of the variables described in (b).
  • ZFD pairs with linkers of the same (c) or different (d) lengths in the left and right ZFDs were tested.
  • Figure 2 shows the results of confirming the ZFD efficiency having various linkers in the pTarget plasmid.
  • a Frequency of corrections from C/G to non-C/G in various pTarget spacers with lengths of 1-24 bps depicted in the heat map.
  • Various ZFD constructs were tested, including different types of linkers between ZFP and cleaved DddAtox and the cleaved region of DddAtox.
  • b Overall activity of each ZFD pair. In the nomenclature used for the x-axis, the left ZFD is shown at the bottom and the right ZFD is shown at the top.
  • a Structure of the nuclear DNA target ZFD.
  • Split-DddAtox halves are fused to the C terminus (C type) or N terminus (N type) of ZFP.
  • a ZFD pair is designed in CC or NC configuration, and consists of a C-type left ZFD and C-right ZFD or N-type left ZFD and C-right ZFD, respectively.
  • cf Efficiency of ZFD-induced nucleotide correction at each nucleotide position within the spacer of NUMBL (c), INPP5D-2 (d), TRAC-CC (e) and TRAC-NC (f) target sites in HEK 293T cells.
  • g Frequency of ZFD-induced base correction in K562 cells after delivery of ZFD protein or ZFD-encoding plasmid by electroporation or direct delivery. ZFD proteins with one or four NLSs were tested and left and right ZFDs were used equimolar. The electroporation method was performed using an Amaxa 4D-Nucleofector.
  • K562 cells were incubated with cell media containing left and right ZFD proteins. Cells were treated once (1x) or twice (2x) in the same manner.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing the configuration of a ZFD targeting nuclear DNA. a-d, four possible ZFD configurations.
  • the NC and CN configurations are structurally identical, but the types of left and right ZFD configurations are different.
  • Red arrows indicate possible sites for ZFD-induced deamination.
  • c ZFD activity overview for PCR amplicons containing TRAC sites.
  • the TRAC-NC ZFD pair first deaminates cytosine to generate uracil (shown in red). The USER enzyme then cleaves uracil to create a cleft (indicated by a red triangle).
  • d Untreated PCR amplicons analyzed by agarose gel electrophoresis (left) and PCR amplicons treated with ZFD pairs (right).
  • FIG. 8 is a schematic diagram of various configurations of the mitochondrial DNA target ZFD. a-d, four possible mitoZFD configurations.
  • the NLS of the existing ZFD has been replaced by MTS and NES.
  • the NC and CN configurations are structurally identical, but the types of left and right ZFD configurations are different.
  • h Comparison of DNA changes and amino acid changes in the ND1 gene introduced by mitoZFD and TALE-DdCBE. The frequency (%) of sequencing reads for each mutant allele was determined by targeted deep sequencing. The spacer regions for the ZFD pair and TALE-DdCBE pair are indicated by blue dashed lines.
  • Single cell-derived clones were obtained for allele analysis. The frequency of C/G-to-non-C/G corrections in each single cell-derived clone was determined by targeted deep sequencing.
  • a Single cell-derived clone of HEK 293T cell population treated with ND1 target mitoZFD.
  • b Single cell-derived clone of HEK 293T cell population treated with ND2 target mitoZFD.
  • c Single cell-derived clone of an untreated HEK 293T cell population. ZFP binding sites are shown in green. Higher calibration frequencies of clones that underwent mitoZFD-induced calibration are shown in red.
  • FIG. 11 shows the results of confirming the nucleotide correction efficiency of a single cell-derived clone population isolated from MT-ZFD-treated HEK293T cells.
  • 12A and 12B show the results of confirming the nucleotide correction efficiency of a single cell-derived clone population isolated from MT-ZFD-treated HEK293T cells. Allelic analysis of single cell-derived clones showing high frequency of base corrections. The table shows the amino acids changed as a result of base correction in ND2. Red letters in the reference sequence at the top indicate spacers. Red letters in alleles indicate changes in the amino acid sequence.
  • a DNA sequences of the binding regions of mitoZFD and TALE-DdCBE pairs. Sites recognized by TALE-DdCBE are highlighted in green and blue for mitoZFD. The upper sequence represents the mtDNA heavy strand and the lower sequence represents the mtDNA light strand.
  • c Heat map of nucleotide correction activity at each nucleotide position. Red boxes indicate spacer regions for each configuration. Blue arrows indicate the location of mtDNA.
  • FIG. 15 shows the results of confirming the calibration efficiency according to the ZFD concentration, mRNA vs Plasmid.
  • a The top figure shows ZFD binding at the ND1 site. ZFD binding sites are shown in green. The target cytosine between the spacers is shown in red.
  • On-target activity determined from total mtDNA sequencing data in FIG. 14 . Activity decreases as the amount of plasmid or mRNA encoding the transfected mitoZFD decreases.
  • b Number of C/G sites corrected with a frequency of > 1% for each plasmid or mRNA amount.
  • a The top figure shows ZFD binding at the ND2 site. ZFD binding sites are shown in green. The target cytosine between the spacers is shown in red.
  • On-target activity determined from total mtDNA sequencing data in FIG. 16 . Activity decreases as the amount of plasmid or mRNA encoding the transfected mitoZFD decreases.
  • b Number of C/G sites that are base corrected with a frequency of > 1% for each plasmid or mRNA amount.
  • Figure 18 shows the results of confirming the efficiency of the entire mitochondrial sequencing / QQ mutant production and calibration.
  • QQ mitoZFD variants contain R(-5)Q mutations in each zinc finger of ZFD to eliminate non-specific DNA contacts. (If there is no R at position -5 of the zinc finger framework, a nearby K or R is converted to Q.)
  • c-d proofreading efficiency and specificity depended on the delivered dose of ZFD-encoding mRNA.
  • c Average C/G-to-T/A correction frequency for all C/Gs of the mitochondrial genome.
  • d Number of corrected C/Gs with base correction frequencies greater than 1%.
  • FIG. 20 Chloroplast and mitochondrial base correction of plants.
  • a, b, c, d chloroplast base correction frequency and pattern induced by cp-DdCBE in 16s rDNA (a, b) and psbA (c, d).
  • Split DdCBE G1333 and G1397 pairs were transfected into lettuce and rape protoplasts.
  • e Mitochondrial base correction efficiency and pattern induced by mt-DdCBE in fATP6 gene.
  • Split DdCBE G1333 and G1397 pairs were transfected into lettuce and rape protoplasts.
  • a, c, e the TALE binding region is shown in blue, the cytosine of the spacer is shown in orange. Error bars in all graphs show mean ⁇ standard deviation. 3 independent biological replicates.
  • b, d, f converted nucleotides are shown in red. Corrected allele % (mean ⁇ standard deviation) was obtained
  • FIG. 21 Plant organ DNA correction via DdCBE.
  • a Schematic diagram of plant organ mutagenesis.
  • b Efficiency for C G to T A conversion in cp-DdCBE transfected calli cultured in the absence of spectinomycin, including representative Sanger sequencing chromatograms. Converted nucleotides are marked in red to the left. Arrows show substituted nucleotides in the chromatogram.
  • c Summary of DdCBE-driven plant organ mutagenesis. Variant callus appears to have a much higher frequency of corrections than that in simulated callus.
  • d Frequency of C to T transformation induced after transfection of lettuce protoplasts with mRNA encoding cp-DdCBE against 16srDNA.
  • FIG. 22 Chloroplast and mitochondrial base correction strategy. Since chloroplast transit peptide (CTP) or mitochondrial targeting signal (MTS) is included in each of the cp-DdCBE and mt-DdCBE preproteins (preproteins), they are translated in plant cells and then transported to chloroplasts and mitochondria. Proproteins pass through the outer and inner membranes of organelles, and CTP and MTS are cleaved by interstitial processing peptidase and mitochondrial processing peptidase, respectively, followed by cp-DdCBE and mt-DdCBE (mature protein) form the final conformation.
  • CTP chloroplast transit peptide
  • MTS mitochondrial targeting signal
  • FIG. 23 Time course for correction via DdCBE plasmid in lettuce protoplasts. Transfected protoplasts were collected at each time point and analyzed for proofreading efficiency by targeted deep sequencing. Frequency (mean ⁇ standard deviation) was obtained from 3 independent experiments.
  • Figure 26 Efficiency of base editing targeting the chloroplast genome in callus.
  • Converted nucleotides in the spacer region are marked in red.
  • Figure 28 DNA-free base correction. Frequency and pattern of chloroplast base correction at target sites in 16srDNA after DdCBE mRNA transfection into lettuce protoplasts. After culturing the protoplasts for 7 days, target deep sequencing was performed. The transformed nucleotides of the spacer region of interest are marked in red.
  • 29 shows the results of gel electrophoresis showing the absence of DdCBE mRNA or DNA sequences in protoplasts and callus (M is a marker).
  • Figure 30 16 srDNA mutation selection. Red arrows show streptomycin-resistant green callus.
  • FIG 32 Off-target activity analysis at the 5 sites with the highest homology to the on-target site.
  • Five potential off-target sites of the 16s rRNA gene-specific DdCBE of the lettuce chloroplast genome were selected, including up to nine mismatches in the TALE binding site.
  • TALE binding sequences and mismatched nucleotides are indicated in blue and red, respectively.
  • Off-target mutation frequencies were measured in protoplasts and drug-resistant calli or suits transfected with DdCBE plasmids or DdCBE mRNA using target dip sequences. Frequency (mean ⁇ standard deviation) was obtained from 3 independent experiments.
  • FIG. 33 Schematic diagram of DdCBE assembly and mitochondrial DNA correction.
  • the TALE binding site is shown in gray, and the base correction range is shown in black.
  • Each repeat variable directory module is shown in orange, blue, green and yellow, in order: adenine “NI”, thymine “NG”, guanine “NN”, and “HD” for cytosine recognition.
  • Figure 34 Mouse mitochondrial ND5 point mutation resulting from base correction due to DdCBE.
  • translation codons are underlined and editable regions are marked in red.
  • Combinations for DdCBE transfection are marked left or right, -G1333 or -G1397, and -N or -C.
  • Sequence analysis data were obtained from blastocysts developed from zygotes microinjected with left-G1397-N and right-G1397-C DdCBE mRNA.
  • Targeted deep sequencing was performed by extracting genomic DNA from tissues obtained from the tail region obtained immediately after birth and from the toes 7 days and 14 days after birth. Corrected bases are marked in red. The frequency of correction of the mutant mitochondrial genome was indicated.
  • dark gray bars and light gray bars represent the correction frequencies of m.C12539T(C10) and m.G12542A(C13) mutations, respectively.
  • FIG. 35 Transmission of mutant mitochondrial DNA into germ cells.
  • b Base correction efficiency in various tissues of F1 pups (101) obtained using targeted deep sequencing of genomic DNA. Dark and light gray bars indicate the frequency of m.C12539T (C10) and m.G12542A (C13) mutations, respectively. Error bars are standard error of the mean (s.e.m.) for n 3 biologically independent samples.
  • FIG. 36 Mouse mitochondrial ND5 G12918A mutation produced by DdCBE.
  • a DdCBE target to make the m.G12918A point mutation causing a D393N change in the ND5 protein.
  • Target codons are underlined and possible correction sites are shown in red.
  • b Efficiency of cytosine-thymine base correction using DdCBE in NIH3T3 cells. Combinations of transfected DdCBE pairs are indicated. Error bars are s.e.m. n for 3 biologically independent samples (n.s. not significant, *p ⁇ 0.05, **p ⁇ 0.01, using Student’s two-tailed t test).
  • F0 ND5 point mutations
  • F0 pups carrying an ND5 point mutation that developed after microinjection of DdCBE mRNA Mutant sequence alignment identified in newborn pups. Corrected bases are indicated in red, and the correction frequency of the mutant mitochondrial gene is indicated on the right.
  • FIG. 37 Mouse mitochondrial ND5 nonsense mutations generated via cytosine deaminase-mediated base correction.
  • the m.C12336T(C9) mutation produces a Q199stop mutation in the ND5 protein, whereas the m. G12341A (C14) causes a silent Q200Q mutation.
  • Transcription triplets are underlined and possible correction positions are indicated in red.
  • FIG 38 Schematic diagram of Golden Gate cloning generating DdCBE structures. All reactions occur simultaneously in one tube. Arrows do not indicate a continuous reaction process.
  • the empty expression vector and the modular vector were digested using the BsaI enzyme to remove the linearized backbone and TALE module insert, including compatible aggregation ends.
  • T4 DNA ligase joined the backbone and six modular inserts to create the final DdCBE structure. Eight DdCBE replicating backbone plasmids were used. For SOD2MTS, these are Left-G1333-N, Left-G1333-C, Left-G1397-N, Left-G1397-C. For COX8A MTS, these are Right-G1333-N, Right-G1333-C, Right-G1397-N, and Right-G1397-C.
  • FIG 39 ND5 mutant mice (F0). (a) ND5 silent mutant mice, (b) ND5 G12918A mutant mice, (c) ND5 nonsense mutant mice generated after microinjection of DdCBEmRNA.
  • Fig. 40 (a) Schematic diagram and NES sequence of a vector containing DdCBE-NES. (b) Mouse m.G12918 ND5 gene and ND5-like sequence of chromosome 4 in the nucleus. Chromosome 5 sequence in mitochondrial TrnA and nucleus. Chromosome 6 sequence in mitochondrial Rnr2 and nucleus. (c) Calibration efficiency in the ND5 gene of DdCBE and DdCBE-NES using the NIH3T3 cell line. (d) Calibration efficiency in the TrnA gene of DdCBE and DdCBE-NES using the NIH3T3 cell line.
  • Figure 41 Improved proofreading efficiency in mouse embryos and subjects using DdCBE-NES and mitoTALEN.
  • FIG. 42 (a) Schematic diagram of DdCBE protein improvement.
  • FIG 43 (a) Graph of the base correction efficiency of the G1397 binding surface mutant. The calibration range and target cytosine are indicated above. Mutant and wild-type/TALE-free DddAtox proteins were co-transfected as indicated next. In the case of Left-DdCBE, the TALE-free DddAtox protein is G1397-N, and in the case of Right-DdCBE, the TALE-free DddAtox protein is G1397-C. (b) A heat map indicating the cytosine-thymine (guanine-adenine) base correction efficiency of DdCBE and the mutant.
  • FIG. 44 (a) G1333 binding surface mutant base correction efficiency graph. The calibration range and target cytosine are indicated above. Mutant and wild-type/TALE-free DddAtox proteins were co-transfected as indicated next. In the case of Left-DdCBE, the TALE-free DddAtox protein is G1333-N, and in the case of Right-DdCBE, the TALE-free DddAtox protein is G1333-C. (b) A heat map indicating the cytosine-thymine (guanine-adenine) base correction efficiency of DdCBE and the mutant.
  • Figure 45 shows the comparison result of the amino acid sequence of the wild type and novel full-length DddA.
  • FIG. 47 shows the results of confirming the activity of replacing thymine with cytosine of the TC motif in human cell genomic context ROR1 site (a), HEK3 site (b), and TYRO3 site (c).
  • Figure 50 is DddA-dCas9 (D10A, H840A)-UGI using human cell genomic context TYRO3 (a), ROR1 (b), HEK3 (c), EMX1 site 2 (d), TRAC site 1 (e), HBB ( f) shows the results of measuring the activity of DddA.
  • FIG. 51 Base editing efficiency of full-length DddAtox in HEK293T cells.
  • (a) Schematic of screening full-length DddAtox in a structure-based manner. Red alanine indicates that positively charged amino acid residues have been replaced by alanine.
  • (b) E. coli transformants of the DddA mutant substituted with alanine were shown, and E1347A was used as an active site mutant as a control.
  • (d) Allele frequencies of the TYRO3 region indicate C to T substitutions in red. Proto-spacer is shown in blue and proto-spacer adjacent motif (PAM) is shown in orange.
  • PAM proto-spacer adjacent motif
  • Non-toxic DddA GSVG (a) Schematic of the screening of non-toxic full-length DddAtox variants based on error-prone PCR. (b) and allele (c) correction frequencies fused to the N- and C-terminus of Cas9, nCas9 (D10A), nCas9 (H840A) and dCas9 (D10A, H840A).
  • the protospacer is shown in blue and the protospacer adjacent motif (PAM) is shown in orange.
  • Figure 53 Correction frequency at the N-terminus of nCas9 (D10A) in DddAtox variants in which positively charged amino acid residues are substituted with alanine at the TYRO3 site (a), ROR1 site 1 (b), and HEK3 site (c).
  • Proto-spacer is shown in blue and proto-spacer adjacent motif (PAM) is shown in orange.
  • FIG 54 ROR1 site 1 (a), ROR1 site 2 (b), ROR1 site 3 (c), FANCF site (d), HBB site (e), HEK3 site (f), TRAC5 site 1 (g) and EMX1 Sites (h, I, j) are respectively.
  • Proto-spacer is shown in blue and proto-spacer adjacent motif (PAM) is shown in orange. Substitutions from C to T are shown in red.
  • the target window of DddA is negative, counting proto spacer 5' upstream.
  • FIG. 55 TYRO3 site (a), ROR1 site 1 (b), ROR1 site 2 (c), ROR1 site 3 (d), FANCF site (e), HBB site (f), HEK3 of AAAAA and E1347A in HeLa cells.
  • the protospacer is shown in blue and the protospacer adjacent motif (PAM) is shown in orange.
  • DddA's target window is counted as proto-spacer 5' upstream and expressed as a negative number.
  • Target cytosine is shown in red.
  • Figure 56 Time-dependent base correction and indel rates of AAAAA and E1347A at TYRO3 site (a) and ROR1 site 1 (b).
  • FIG. 57 EMX1 site 2 (a), FANCF site (b), TRAC5 site 1 (c), TRAC5 site 2 (d), ROR1 site 1 (e), ROR1 site 2 (f), ROR1 site 3 (g) and correction, indel and allele frequencies of GSVG fused to the N-terminus of nCas9(D10A), nCas9(H840A) and dCas9 at the HBB site (h).
  • the protospacer is shown in blue and the protospacer adjacent motif (PAM) is shown in orange. Substitutions from C to T are shown in red.
  • the target window of GSVG is negative, counting proto spacer 5' upstream.
  • FIG. 58 GSVG fused to the C-terminus of nCas9(D10A), nCas9(H840A) and dCas9 at EMX1 site 2(a), EMX1 site 4(b), ROR1 site 2(c), and HBB site (d). of corrections, indels and allele frequencies.
  • the protospacer is shown in blue and the protospacer adjacent motif (PAM) is shown in orange. Substitutions from G to A are shown in red.
  • the target window of GSVG is indicated counting 3' downstream from the first position of the proto spacer.
  • FIG. 60 Mitochondrial base correction of mDdCBE in HEK293T cells. Calibration efficiency of ND4(a) and ND6(b). Target cytosine and TALE binding sites are shown in red and gray, respectively. Calibration efficiencies at ND4(c, d) and ND6(e, f) when only half of DddAtox was fused to the TALE array and the other half had no TALEs. The left TALE arrangement and the right TALE arrangement are denoted by L and R, respectively. ND6 TALE array mismatches with the reference genome are underlined in purple.
  • WT-ZFD is a C to T deaminse with only split DddAtox without adenine deaminase.
  • the left TALE-split DddAtox is attached with adenine deaminase, and the right is the base correction efficiency when using a pair of DdCBE in units of one nucleotide.
  • the green box is the area where the TALE is attached.
  • dual tale module using two TALE modules components include a full length DddAtox and TALE array on one side, and adenine deaminase and TALE array on the other side.
  • Figure 66 shows the results of confirming the nucleotide correction efficiency of the dual module targeting the ND1 site (components include TALE array, adenine deaminase (AD) and full length DddAtox (GSVG, AAAA, E1347A are variant
  • Figure 67 shows the nucleotide correction efficiency when only TadA (AD) adenine deamination enzyme is attached to the TALE binding protein targeting the ND1 site.
  • Figure 68 It shows the adenine and cytosine base correction efficiency for dual module, single module and split-DddA-AD in TALE targeting the ND1 site. If there are UGIs on both sides (from the bottom), only cytosine base correction occurs. When AD is attached to one side, both cytosine and adenine base correction occur, and when there is no UGI, it can be seen that only adenine base correction occurs selectively. Likewise, it can be seen that only adenine base correction occurs selectively in the dual module and single module.
  • correction can be used interchangeably with “editing” and refers to a method of altering a nucleic acid sequence by selective deletion of a specific genomic target.
  • specific genomic targets include, but are not limited to, chromosomal regions, genes, promoters, open reading frames, or any nucleic acid sequence.
  • single base refers to one and only one nucleotide in a nucleic acid sequence. When used in the context of single base correction, this means that a base at a specific position in a nucleic acid sequence is replaced with a different base. Such substitutions may occur by many mechanisms, including, without limitation, substitutions or modifications.
  • target or “target site” refers to a previously identified nucleoline sequence of any composition and/or length. Such target sites include, but are not limited to, chromosomal regions, genes, promoters, open reading frames, or any nucleic acid sequence.
  • on-target refers to a subsequence of a specific genomic target that may be completely complementary to a programmable DNA binding region and/or a single guide RNA sequence.
  • off-target refers to a subsequence of a specific genomic target that may be partially complementary to a programmable DNA binding region and/or a single guide RNA sequence.
  • the fusion protein according to the present invention is a fusion protein comprising a cytosine deaminase or a variant thereof, wherein the cytosine deaminase or a variant thereof is a first fragment and a second fragment derived from a cytosine deaminase or a variant thereof. and a sieve, wherein the first fragment and the second fragment are each bound to the DNA-binding protein.
  • the cytosine deaminase is an amino group leaving enzyme, and can convert cytosine (C) to uridine (U).
  • the cytosine deaminase may be the cytosine deaminase.
  • APOBEC1 apolipoprotein B editing complex 1
  • AID activation-induced deaminase
  • DNA deaminases work only on single-stranded DNA and are linked to a DNA binding protein. Therefore, it may not be suitable for base correction.
  • the cytosine deaminase may be derived from a deaminase (DddA) that acts on double-stranded DNA or an orthologue thereof. More specifically, the cytosine deaminase may be a double-stranded DNA-specific bacterial cytosine deaminase.
  • the cytosine deaminase is in a divided form, and the cytosine deaminase includes the separated first and second fragments, and each of the first and second fragments has no deaminase activity. will be.
  • the cytosine deaminase includes a first fragment and a second fragment, and each of the first fragment and the second fragment has no deaminase activity.
  • the first fragment or the second fragment of the cytosine deaminase is selected from the group consisting of G33, G44, A54, N68, G82, N98, G108 at the N-terminus of the sequence of SEQ ID NO: 1 It may contain up to one or more sequences.
  • the first fragment or the second fragment of the cytosine deaminase is a sequence from at least one selected from the group consisting of G34, P45, G55, N69, T83, A99, A109 to the C-terminus of the sequence of SEQ ID NO: 1 may include
  • the cytosine deaminase includes the first fragment of SEQ ID NO: 23 (G1333-N) and the second fragment of SEQ ID NO: 24 (G1333-C), or the first fragment of SEQ ID NO: 25 (G1397) -N) and a second fragment of SEQ ID NO: 26 (G1397-C), or a first fragment of SEQ ID NO: 23 (G1333-N) and a second fragment of SEQ ID NO: 26 (G1397-C)
  • the first fragment of SEQ ID NO: 25 (G1397-N) and the second fragment of SEQ ID NO: 24 (G1333-C) may be included.
  • G1333N, G1333C, G1397N and G1397C can be combined and used as a cleaved form of deaminase. Specifically, Left-G1333-N + Right-G133-C, Left-G1397-N + Right-G1397-C, Left-G1397-N + Right-G1333-C, or Left-G1333-N + Right-G1397- It can be used in the form of C.
  • the inventors of the present application tried to suppress undesired base correction by the DdCBE mutation through a DdCBE mutation in which an amino acid residue is substituted.
  • This off-target nucleotide correction effect is a phenomenon caused by spontaneous binding of the DddA tox deaminase fragment independent of the interaction between TALE and DNA.
  • the amino acid residue introducing the mutation is a contact site located on the surface where the dimer of DddAtox binds to each other.
  • HF-DdCBE was produced by substituting alanine for amino acid residues located on the surface of the DddA tox fragments.
  • HF-DdCBE prevented proper function when two pairs of deamination enzymes linked to TALE did not bind to DNA. .
  • whole mitochondrial genome analysis it was confirmed that HF-DdCBE is highly efficient and precise, unlike conventional DdCBE, which causes numerous unwanted and off-target C-to-T conversions in human mitochondrial DNA.
  • split dimers In the case of DddAtox, theoretically, all split dimers must be applied (recruited) to the target site of DNA to cause base correction. Even when using , target base correction occurs. To solve this problem, the split dimer replaces residues on the surface of the protein that bind to each other to prevent binding of the DdCBE pair at an unwanted position.
  • the present invention relates to a novel variant that reduces non-selective base correction by substituting amino acid residues of the cytosine deamination enzyme DddAtox.
  • the cytosine deaminase includes a first fragment of SEQ ID NO: 23 (G1333-N) and a second fragment of SEQ ID NO: 24 (G1333-C), or a first fragment of SEQ ID NO: 25 (G1397-N) and a second fragment of SEQ ID NO: 26 (G1397-C).
  • the variant of the cytosine deaminase is One or more amino acids selected may be substituted with other amino acids.
  • the variant according to the present invention is one or more selected from the group consisting of positions 87, 88, 91, 92, 95, 100, 101, 102 and 103 of the first fragment of SEQ ID NO: 25, or the first fragment of SEQ ID NO: 26
  • One or more amino acids selected from the group consisting of positions 13, 14, 15, and 16 in the bipartite are substituted with other amino acids.
  • the 'other amino acids' include alanine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, proline, tryptophan, valine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glycine, serine, threonine, tyrosine, aspartic acid, glutamic acid, arginine, histidine, lysine, the amino acids Among all known variants of these, it refers to an amino acid selected from amino acids other than the amino acid originally possessed by the wild-type protein at the mutation position. In one example, the 'other amino acid' may be alanine.
  • Y3A, L5A, I10A, S11A, V13A, G14A, T15A, F16A, Y17A, Y18A, V19A, K28A, F30A, S31A each Y1292A, L1294A, I1299A, S1300A, V1312A, G1313A, T1314A, F1315A, Y1316A, Y1317A, V1318A, K1327A, F1329A, S1330A).
  • E1361A, G1362A, L1363A, V1364A, F1365A, H1366A, K1389A, M1390A, T1391A, V1393A may include one or more amino acid substitutions selected from the group consisting of.
  • C87A, V88A, T91A, E92A, L95A, K100A, M101A, T102A, V103A C1376A, V1377A, T1380A, E1381A, L1384A, K1389A, M1390A, T1391A, V1392A, respectively)
  • one or more amino acid substitutions selected from the group consisting of K13A, V14A, F15A, and T16A may be included.
  • the cytosine deaminase variant according to the present invention may include one or more sequences selected from the group consisting of the amino acid sequences described in the table above.
  • the cytosine deaminase variant according to the present invention shows the possibility of reducing the effect of causing unwanted corrections to several bases in a non-specific target site.
  • the inventors of the present application developed a novel programmable cytosine deaminase using full-length DddA made by modifying an amino acid having a positive charge of wild-type cytosine deaminase DddA tox , which is used in an isolated form by causing intracellular toxicity. has been developed.
  • the present invention relates to (i) a DNA binding protein; and (ii) a fusion protein comprising a cytosine deaminase or a variant thereof, wherein the cytosine deaminase or a variant thereof is a non-toxic full-length cytosine deaminase.
  • an amino acid having a positive charge (KRKKK) is specifically clustered. Because DNA is negatively charged, it binds to amino acids that have a positive charge in proteins. By substituting this positively charged amino acid with an amino acid without an electrode, the DddA tox weakens the DNA-binding force, thereby lowering or eliminating intracellular toxicity. That is, a combination that does not have toxicity by substituting an amino acid having a positive charge with an amino acid without a polarity can be cloned using E. coli, thereby securing full-length DddA.
  • Wild-type DddA tox uses an isolated form divided into two due to intracellular toxicity, which imposes many limitations on the experiment.
  • an orthogonal Cas9 variant that recognizes another PAM is used.
  • the target window showing the highest activity is 40 bp between the binding of the two Cas9 variants, where undesired cytosines are also deamidated.
  • full-length DddA is not separated, it is not constrained by PAM.
  • the TC motif within 10 bp of the target position is most active, the accuracy is also high.
  • DddA In the full-length DddA, it is possible to substitute thymine for cytosine at a desired position using Cas9 as well as TALE module and zinc finger protein.
  • Existing DddAtox had to be delivered in pairs because it was separated, but full-length DddA can use only one module of the TALE module and zinc finger protein, so the target position can be selected without any restrictions.
  • DNA such as mitochondria, plant chloroplasts, or plastids as well as genomic sites, cytosine of specific DNA can be converted into thymine.
  • AAV a viral vector used for gene therapy.
  • CBE cytosine base editor
  • thymine substitutes thymine for cytosine in the R-loop formed by Cas9 binding to the target site. to deamination. Therefore, it is possible to convert cytosine to thymine in the case of a position where there is a restriction on correction with conventional CBE.
  • one or more, two or more, three or more, four or more, or five or more amino acids of the wild-type deaminase of SEQ ID NO: 1 may be substituted with other amino acids.
  • the 'other amino acids' include alanine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, proline, tryptophan, valine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glycine, serine, threonine, tyrosine, aspartic acid, glutamic acid, arginine, histidine, lysine, the amino acids Among all known variants of these, it refers to an amino acid selected from amino acids other than the amino acid originally possessed by the wild-type protein at the mutation position. In one example, the 'other amino acid' may be alanine.
  • the non-toxic full-length DddA may include a sequence selected from the group consisting of the following SEQ ID NO: 12 to SEQ ID NO: 18 depending on the type.
  • AAAAA SEQ ID No: 13
  • AAAAK SEQ ID No: 14
  • AAKAA SEQ ID No: 15
  • AAKAK (SEQ ID No: 16)
  • the full-length deaminase variant may include one or more substitutions selected from the group consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1:
  • a at position 109 is substituted with V;
  • the full-length deaminase variant comprises: S at position 37 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with G; G at position 59 is substituted with S; A at position 109 is substituted with V; and the sequence of SEQ ID NO: 19, wherein S at position 129 is replaced with G.
  • the full-length DddA GSVG can be cloned using general E. coli. It was confirmed in the human cell genomic context that the full-length DddA GSVG deaminates the cytosine of the TC motif in the target site to thymine.
  • the full-length DddA GSVG can be cloned into the N-terminal and C-terminal of Cas9, respectively. DddA GSVG linked to the N-terminal of Cas9 at the same target site can replace cytosine with thymine.
  • DddA GSVG linked to the C-terminal of Cas9 the cytosine of the TC motif in the complementary sequence of the guanine to be substituted was substituted with thymine, and the substitution of the guanine to be substituted with adenine was confirmed at the human cell genome level.
  • the full-length deaminase variant may include a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 20 to 22.
  • the DNA binding protein may be, for example, a zinc finger protein, a transcription activator-like effector (TALE) protein, a CRISPR-associated nuclease, or a combination of two or more thereof.
  • TALE transcription activator-like effector
  • the zinc finger motif of the zinc finger protein has a DNA binding domain, and the c-terminal portion of the finger specifically recognizes a DNA sequence.
  • DNA binding proteins containing 3 to 6 zinc finger motifs recognize DNA sequences.
  • each of the first fragment of the cytosine deaminase and the second fragment of the cytosine deaminase may bind to the N-terminus or the C-terminus of the zinc finger protein.
  • ZF-Left zinc finger protein
  • ZF-Right zinc finger protein
  • ZF-Left zinc finger protein
  • ZF-Right zinc finger protein
  • the C-terminus of the zinc finger protein (ZF-Left) is bound to the N-terminus of the first fragment of cytosine deaminase, and the zinc finger protein (ZF-Right) N is linked to the C-terminus of the second fragment of cytosine deaminase.
  • -Terminal bonding (CN configuration); or
  • the N-terminus of the zinc finger protein (ZF-Left) is bound to the C-terminus of the first fragment of cytosine deaminase, and the zinc finger protein (ZF-Right) N is linked to the C-terminus of the second fragment of cytosine deaminase.
  • -End can be combined (NN configuration).
  • the ZF-Left may include the following sequence of SEQ ID NO: 2:
  • the ZF-Right may include the following sequence of SEQ ID NO: 3:
  • ZF may have a different sequence depending on the DNA target.
  • ZF can be customized according to the DNA target sequence. Since ZF recognizes 3 bp of DNA, it is possible to construct a ZF combination that recognizes 9 to 18 bp DNA by concatenating 3 to 6 ZFs. For example, it can be produced using a library including modules such as GNN, TNN, CNN, or ANN.
  • the zinc finger protein may be linked to a deaminase through a linker.
  • the linker may be a peptide linker comprising 2 to 40 amino acid residues.
  • the linker may be, for example, a linker having a length of 2aa, 5aa, 10aa, 16aa, 24aa or 32aa, but is not limited thereto.
  • the linker may comprise:
  • the split deaminase and the zinc finger protein may be linked through a linker, and the zinc finger protein binds to the N-terminus of the half deaminase including the first split body, and the second split The zinc finger protein binds to the N-terminus of the half deaminase containing the sieve.
  • base conversion from C to T may occur at the spacer between the left and right ZFPs. It was confirmed that when both the left and right ZFP were linked to each of the half deaminase containing the first fragment and the half deaminase containing the second fragment through the 24 a.a linker, high proofreading efficiency was shown.
  • the TAL effector (TALE) consists of a repeated 33 to 34 amino acid sequence, and about 9 repeated variant domains (RVD) are repeated. It can recognize one nucleotide per domain and can bind to a specific DNA sequence according to the 12th-13th amino acid sequence (HD->Cytosine, NI->Adenine, NG->Thymine, NN->Guanine).
  • a de-effector (TALE) recognizes a single DNA strand within a target site. The distance between target sites may be 12-14 nucleotides.
  • the TALE domain refers to a protein domain that binds to nucleotides in a sequence-specific manner by a combination of one or more TALE-Repeats. At least one TALE-Repeat, specifically 1 to 30 TALE-Repeat, but is not limited thereto. TALE-Repeat is a site that recognizes a specific nucleotide sequence in the TALE domain.
  • the TALE domain includes an N-terminal containment region of TALE and a C-terminal containment region of TALE as a backbone structure.
  • the first TALE comprising the N-terminus of the TALE may be encoded by SEQ ID NO: 4 or 5.
  • the second TALE including the C-terminus of the TALE may be encoded by SEQ ID NO: 6 or 7.
  • a single TALE array or a first TALE array and a second TALE array may be bound, respectively, depending on the binding position of the TALE domain with respect to the cleavage site.
  • a first TALE may be bound to the first fragment of the cytosine deaminase (left TALE), and a second TALE (right TALE) may be bound to the second fragment of the cytosine deaminase.
  • Each has the structure of N'-TALE-first fragment-C' and N'-TALE-second fragment-C'.
  • a single module TALE may be coupled to the N-terminus of the cytosine deaminase.
  • a single TALE module and cytosine deaminase in the N-C direction are included.
  • a dual module TALE may be included, and in this case, the first TALE may be coupled to the N-terminus of the full-length cytosine deaminase, and the second TALE may be included separately.
  • the first TALE module and cytosine deaminase are included in the N-C direction, and have the structures of N'-TALE-cytosine deaminase-C' and N'-TALE-C'.
  • the TALE array can be customized according to the target DNA sequence.
  • the TALE array consists of modules consisting of 33 to 35 amino acid residues arranged repeatedly. These are derived from the plant pathogen Xanthmonas, and each module recognizes each A, C, G, and T base and binds to DNA. The base specificity of each module is determined by the 12th and 13th amino acid residues, which are called repeat variable di-residue (RVD). For example, a module with RVD of NN recognizes G, NI recognizes A, HD recognizes C, and NG recognizes T.
  • the TALE array can be designed to recognize 15-20bp of the target DNA sequence, consisting of a minimum of 14 and a maximum of 18 or more modules.
  • RNAs are encoded in the CRISPR array, one is crRNA (CRISPR RNA) and the other is tracrRNA (trans activating CRPSPR RNA).
  • crRNA is transcribed in the protospace region and forms a tertiary structure by binding with tracrRNA. Both types of RNA help recognize and cut foreign DNA.
  • the Cas protein is Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12g, Cas12h, Cas12i, Cas12j, Cas13a, Cas13b, Cas13c, Cas13d, Cas14, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, CsMT2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Csb3, Csx17, Csb1, Csx17, Csb2 It may be an endonuclease of Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf
  • the Cas protein is Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifactor, Eubacterium, Streptococcus (Streptococcus: Streptococcus pyogenes) , Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Flaviivola, Flavobacterium, Azospirillum, Gluconacetobacter , Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus: Staphylococcus aureus, Nitratifractor, Corynebacterium and Campylobacter ) is derived from a microorganism genus containing an ortholog of a Cas protein selected from the group consisting of, and may be simply isolated or recombined therefrom.
  • It may include a mutated form of the Cas protein. It may mean that it has been mutated to lose the endonuclease activity that cuts DNA double strands, for example, mutated target-specific nucleases and endonucleases mutated to lose endonuclease activity and have nickase activity. It may be one or more of the forms mutated to lose both the first activity and the nickase activity.
  • the base conversion by the cytosine deaminase (eg, cytosine to uradin) is performed simultaneously or sequentially regardless of the sequence, the strand or the opposite strand (such as , a nick may be introduced in the opposite strand of the strand on which the base conversion has occurred (eg, on the opposite strand of the strand where the PAM is located, between the 3rd and 4th nucleotides in the 5' end direction of the PAM sequence) nick was introduced in ).
  • Such a mutation eg, amino acid substitution, etc.
  • may occur in the catalytically active domain eg, RuvC catalytic domain in the case of Cas9.
  • mutations include catalytic aspartate residues (such as aspartate at position 10 (D10)), glutamic acid at position 762 (E762), and histidine at position 840 (H840). ), asparagine at position 854 (N854), asparagine at position 863 (N863), aspartic acid at position 986 (D986), and the like. .
  • any other amino acid to be substituted may be alanine (alanine), but is not limited thereto.
  • one or more, such as all three, of an aspartic acid at position 1135 (D1135), an arginine at position 1335 (R1335), and a threonine at position 1337 (T1337) of the Streptococcus pyogenes-derived Cas9 protein are different It may be mutated to recognize an NGA (N is any base selected from A, T, G, and C) different from the PAM sequence (NGG) of wild-type Cas9 by being substituted with an amino acid.
  • NGA is any base selected from A, T, G, and C
  • the 'other amino acids' include alanine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, proline, tryptophan, valine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glycine, serine, threonine, tyrosine, aspartic acid, glutamic acid, arginine, histidine, lysine, the amino acids Among all known variants of these, it refers to an amino acid selected from amino acids other than the amino acid originally possessed by the wild-type protein at the mutation position.
  • the 'other amino acid' may be alanine, valine, glutamine, or arginine.
  • a guide RNA may be further included.
  • the guide RNA may be, for example, at least one selected from the group consisting of CRISPR RNA (crRNA), trans-activating crRNA (tracrRNA), and single guide RNA (sgRNA), and specifically, crRNA and tracrRNA are It may be a double-stranded crRNA:tracrRNA complex bound to each other, or a single-stranded guide RNA (sgRNA) in which crRNA or a portion thereof and tracrRNA or a portion thereof are linked by an oligonucleotide linker.
  • crRNA CRISPR RNA
  • tracrRNA trans-activating crRNA
  • sgRNA single guide RNA
  • the present invention relates to (i) a DNA binding protein; (ii) cytosine deaminase or a variant thereof; And (iii) a fusion protein comprising an adenine deaminase, wherein the cytosine deaminase or a variant thereof is (a) a non-toxic full-length cytosine deaminase or (b) a first fragment derived from a cytosine deaminase or a variant thereof It relates to a fusion protein comprising a sieve and a second fragment, wherein the first fragment and the second fragment are each bound to the DNA-binding protein.
  • the inventors of the present application connect DddAtox cytosine deaminase and adenine deaminase that can cause A to G conversion to TALE or ZFP protein capable of binding to DNA to produce a base editor capable of correcting base A (base editor) did
  • DdCBE deaminase using DddAtox
  • TALE repeat as a DNA binding module.
  • DdABE can cause A to G and thus can produce different mutation patterns.
  • DdABE recognizes double-stranded DNA by itself and causes deamination, there is no additional component such as RNA.
  • RNA In the case of mitochondria and chloroplast, the mechanism of RNA delivery was not known, so the Crispr system could not be applied.
  • DdABE without these components can not only target the genomic DNA in the cell, but also target the DNA of organelles such as mitochondria and chloroplast to cause A to G conversion of specific DNA.
  • DdCBE is the only gene editing technology that targets mitochondria or organelles. Therefore, the only mutation that can be introduced across all existing technologies was C to T, but DdABE can cause A to G, so the spectrum that can introduce mutations becomes much more diverse. This enables the creation or treatment of mitochondrial disease models that have been impossible to date.
  • DdABE In the case of the existing DdCBE, two TALE modules (attached to the left and right, respectively) are required, so it cannot be mounted on AAV, a viral vector with low gene capacity in gene therapy.
  • DdABE can be used as a 'single module' that can use only one TALE module, it can be mounted on AAV viruses and has strengths in gene therapy.
  • DdABE can be used by using a split DddAtox as needed, or it can be used by using a full-length DddAtox variant, so it has high compatibility.
  • the adenine deaminase may be selected from the group consisting of, for example, apolipoprotein B editing complex 1 (APOBEC1), activation-induced deaminase (AID), and tRNA-specific adenosine deaminase (tadA), specifically tadA (tRNA). -specific adenosine deaminase).
  • APOBEC1 apolipoprotein B editing complex 1
  • AID activation-induced deaminase
  • tadA tRNA-specific adenosine deaminase
  • tRNA-specific adenosine deaminase specifically tadA
  • the adenine deaminase may be, for example, deoxy-adenine deaminase as a variant of E. coli TadA.
  • the cytosine deaminase is included in a split form, the DNA binding protein is a zinc finger protein, and the N-terminus of the zinc finger protein (ZF-Left) is bound to the C-terminus of the first fragment of the cytosine deaminase.
  • the adenine deaminase is the C-terminus of the zinc finger protein (ZF-Left).
  • cytosine deaminase may bind to the N-terminus or C-terminus of the first fragment of cytosine deaminase, the N-terminus of zinc finger protein (ZF-Right), and the N-terminus or C-terminus of the second fragment of cytosine deaminase.
  • the C-terminus of the zinc finger protein (ZF-Left) is bound to the N-terminus of the first fragment of the cytosine deaminase, and the zinc finger protein ( ZF-Right) C-terminal binding (CC configuration);
  • the C-terminus of the zinc finger protein (ZF-Left) is bound to the N-terminus of the first fragment of cytosine deaminase, and the zinc finger protein (ZF-Right) N is linked to the C-terminus of the second fragment of cytosine deaminase.
  • the N-terminus of the zinc finger protein (ZF-Left) is bound to the C-terminus of the first fragment of the cytosine deaminase, and the zinc finger protein (ZF-Right) is linked to the C-terminus of the second fragment of the cytosine deaminase.
  • N-terminal bonding Even in N-terminal bonding (NN configuration), the C terminus of the zinc finger protein (ZF-Left), the N terminus or C terminus of the first fragment of cytosine deaminase, the N terminus of the zinc finger protein (ZF-Right), It can bind to the N-terminus or C-terminus of the second fragment of the cytosine deaminase.
  • the first TALE is bound to the first fragment of the cytosine deaminase, and the second fragment is attached to the second fragment of the cytosine deaminase.
  • Two TALEs may be bound, and each has the structure of N'-TALE-first fragment DDDA-C' and N'-TALE-second fragment DDDA-C'.
  • the adenine deaminase may bind to the N-terminus or C-terminus of the first fragment of cytosine deaminase or the N-terminus or C-terminus of the second fragment of cytosine deaminase.
  • the DNA binding protein is TALE
  • it may include a single TALE module, and includes a single TALE module and a cytosine deaminase in the NC direction, wherein the adenine deaminase can bind to the C-terminal direction of a single TALE module, the N-terminus or the C-terminus of cytosine deaminase.
  • the DNA binding protein is TALE
  • it may include a dual TALE module, and a first TALE module and a cytosine deaminase in the NC direction are included, adenine deaminase and A second fragment including the second TALE may be further included, and in the structure of N'-TALE-cytosine deaminase-C' and N'-TALE-adenine deaminase-C', the adenine deaminase is N of TALE. It may bind to the terminus or C terminus.
  • UGI uracil DNA glycosylase inhibitor
  • UGI can increase base editing efficiency by inhibiting the activity of Uracil DNA glycosylase (UDG), an enzyme that repairs mutant DNA that catalyzes the removal of U from DNA.
  • UGG Uracil DNA glycosylase
  • the present invention provides a composition for A-to-G base correction in prokaryotic or eukaryotic cells comprising the fusion protein or a nucleic acid encoding the same, wherein the DNA binding protein is a zinc finger protein, a TALE protein, or CRISPR It is a related nuclease, and the cytosine deaminase of the fusion protein or a variant thereof is of bacterial origin, and relates to a composition characterized in that it is specific for double-stranded DNA.
  • the present invention provides a composition for A-to-G base correction in prokaryotic or eukaryotic cells comprising the fusion protein or a nucleic acid encoding the same, wherein the DNA binding protein is a zinc finger protein, a TALE protein, or CRISPR is a related nuclease,
  • the cytosine deaminase or variant thereof of the fusion protein is derived from bacteria and is specific for double-stranded DNA, and a DNA binding protein is bound to the N-terminus of the cytosine deaminase or variant thereof, and adenine deamination of the fusion protein It relates to a composition in which a DNA binding protein is bound to the C terminus of an enzyme.
  • the present invention provides a composition for C-to-T base correction in prokaryotic or eukaryotic cells comprising the fusion protein or a nucleic acid encoding the fusion protein and UGI (uracil glycosylase inhibitor), wherein the DNA binding protein is a zinc finger protein (zinc finger protein).
  • UGI uracil glycosylase inhibitor
  • the DNA binding protein is a zinc finger protein (zinc finger protein).
  • protein TALE protein or CRISPR-associated nuclease
  • the cytosine deaminase or variant thereof of the fusion protein is derived from bacteria, and relates to a composition characterized in that it is specific for double-stranded DNA.
  • the present invention relates to prokaryotic and eukaryotic cells comprising 1) a DNA binding protein 2) a full-length double-stranded DNA-specific bacterial cytosine deaminase or a variant thereof and 3) an E. coli TadA-derived deoxyadenine deaminase.
  • a composition (without UGI) for A-to-G base correction of ego; The composition is DddAtox from the full-length double-stranded DNA-specific bacterial cytosine deaminase Burkholderia cenocepacia .
  • the present invention relates to 1) a left DNA binding protein operably linked to a full-length double-stranded DNA specific bacterial cytosine deaminase or a variant thereof 2) a right DNA binding protein operably linked to a deoxyadenine deaminase from E.
  • compositions for A-to-G base correction in prokaryotic and eukaryotic cells comprising: a zinc finger protein (ZFP) or a transcriptional activator-like effector (TALE) array or catalytically deficient CRISPR-Cas9 (nCas9 or dCas9) or Cas12a;
  • ZFP zinc finger protein
  • TALE transcriptional activator-like effector
  • the composition is DddAtox from the full-length double-stranded DNA-specific bacterial cytosine deaminase Burkholderia cenocepacia .
  • the present invention also provides 1) DNA binding protein 2) full-length double-stranded DNA-specific bacterial cytosine deaminase or a variant thereof, 3) E. coli TadA-derived deoxyadenine deaminase, and 4) UGI (uracil glycosylase inhibitor)
  • a composition for A-to-G and C-to-T base correction in prokaryotic and eukaryotic cells comprising: a zinc finger protein (ZFP) or a transcriptional activator-like effector (TALE) array or a catalytic deletion CRISPR-Cas9 (nCas9 or dCas9) or Cas12a;
  • the composition is DddAtox from the full-length double-stranded DNA-specific bacterial cytosine deaminase Burkholderia cenocepacia .
  • the present invention further relates to prokaryotic and eukaryotic cells comprising 1) a DNA binding protein 2) a split double-stranded DNA specific bacterial cytosine deaminase or variant thereof and 3) a deoxyadenine deaminase from E. coli TadA.
  • a composition (without UGI) for A-to-G base correction of ego; The composition is DddAtox from the cleaved double-stranded DNA specific bacterial cytosine deaminase Burkholderia cenocepacia .
  • the present invention further provides 1) DNA binding protein 2) split double-stranded DNA-specific bacterial cytosine deaminase or variants thereof 3) E. coli TadA-derived deoxyadenine deaminase and 4) UGI (uracil glycosylase inhibitor)
  • a composition for A-to-G and C-to-T base correction in prokaryotic and eukaryotic cells comprising: a zinc finger protein (ZFP) or a transcriptional activator-like effector (TALE) array or a catalytic deletion CRISPR-Cas9 (nCas9 or dCas9) or Cas12a;
  • the composition is DddAtox from the cleaved double-stranded DNA specific bacterial cytosine deaminase Burkholderia cenocepacia .
  • the present invention is an A-to-G base correction method in a prokaryotic or eukaryotic cell comprising the step of treating the fusion protein or a nucleic acid encoding the same in the prokaryotic or eukaryotic cell, wherein the DNA binding protein is a zinc pinker protein ( zinc finger protein), TALE protein, or CRISPR-associated nuclease, and the cytosine deaminase or variant thereof of the fusion protein is derived from bacteria and is characterized in that it is specific for double-stranded DNA.
  • the DNA binding protein is a zinc pinker protein ( zinc finger protein), TALE protein, or CRISPR-associated nuclease
  • the cytosine deaminase or variant thereof of the fusion protein is derived from bacteria and is characterized in that it is specific for double-stranded DNA.
  • the present invention is an A-to-G base correction method in a prokaryotic or eukaryotic cell comprising the step of treating the fusion protein or a nucleic acid encoding the same in the prokaryotic or eukaryotic cell, wherein the DNA binding protein is a zinc pinker protein ( zinc finger protein), TALE protein, or CRISPR-associated nuclease, and the cytosine deaminase or variant thereof of the fusion protein is derived from bacteria, is double-stranded DNA-specific, and is located at the N-terminus of the cytosine deaminase or variant thereof.
  • the present invention provides a C-to-T base correction method in a prokaryotic or eukaryotic cell comprising the step of treating the fusion protein or a nucleic acid encoding the same and UGI (uracil glycosylase inhibitor) to the prokaryotic or eukaryotic cell, wherein the DNA
  • the binding protein is a zinc finger protein, a TALE protein, or a CRISPR-associated nuclease, and the cytosine deaminase or a variant thereof of the fusion protein is derived from bacteria and is double-stranded DNA-specific.
  • ND1-Right-TALE-1333C-AD (FIG. 63: SEQ ID No: 424)
  • ND1-Right-TALE-1397C-AD (FIGS. 62-63: SEQ ID No: 426)
  • ND1-Left-TALE-1333C (FIG. 63: SEQ ID No: 428)
  • ND1-Right-TALE-1333N (FIG. 63: SEQ ID No: 430)
  • ND1-Right-TALE-1333C (FIG. 63: SEQ ID No: 431)
  • ND1-Right-TALE-1397N (FIGS. 62-63: SEQ ID No: 432)
  • ND4-LEFT-TALE-1333N-AD (FIG. 63: SEQ ID No: 433)
  • ND4-LEFT-TALE-1333C-AD (FIG. 63: SEQ ID No: 434)
  • ND4-LEFT-TALE-1397C-AD (FIG. 63: SEQ ID No: 435)
  • TRAC-ZFP-LEFT (SEQ ID No: 450)
  • AD Adenine deaminase (AD: ABE 8e) (SEQ ID No: 458)
  • SOD2 MTS-3xHA MALSRAVCGTSRQLAPVLGYLGSRQKHSLPDYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGYPYDVPDYA (SEQ ID No: 476)
  • the fusion protein according to the present invention can be prepared by, for example, microinjection, electroporation, DEAE-dextran treatment, lipofection, nanoparticle-mediated transfection, protein transduction domain mediated introduction, and It can be delivered to the cell by various methods in the art, such as, but not limited to, PEG-mediated transfection.
  • the present invention relates to a nucleic acid encoding the fusion protein.
  • polynucleotide In reference to the above nucleic acids, "polynucleotide”, “nucleotide”, “nucleotide sequence”, and “oligonucleotide” are used interchangeably. polymeric forms of nucleotides of any length, deoxyribonucleotides or ribonucleotides, or analogs thereof.
  • a polynucleotide may have any three-dimensional structure and may perform any function, known or unknown.
  • a polynucleotide may comprise one or more modified nucleotides, such as methylated nucleotides and nucleotide analogs. Modifications to the nucleotide structure may be possible either before or after assembly of the polymer.
  • the polynucleotide may be an RNA sequence, a DNA sequence, or a combination thereof (RNA-DNA combination sequence).
  • known expression vectors such as plasmid vectors, cosmid vectors, and bacteriophage vectors can be used, and the vector can be easily prepared by those skilled in the art according to any known method using DNA recombination technology.
  • the vector may be a plasmid vector or a viral vector, and the viral vector may be specifically an adenovirus, an adeno-associated virus, a lentivirus, or a retrovirus vector,
  • the present invention is not limited thereto.
  • the recombinant expression vector may contain the nucleic acid in a form suitable for expression of the nucleic acid in the host cell, which is selected on the basis of the host cell such that the recombinant expression vector is used for expression, ie, operably-linked to the nucleic acid sequence to be expressed. It is meant to include one or more regulatory elements that may be
  • operably linked means that the nucleotide sequence of interest permits expression of the nucleotide sequence (eg, in an in vitro transcription/translation system or in a host cell when the vector is introduced into the host cell). ) means connected to the control element.
  • the recombinant expression vector may contain a form suitable for messenger RNA synthesis, including a T7 promoter, which contains one or more regulatory elements that enable mRNA synthesis in vitro, that is, messenger RNA can be synthesized by T7 polymerase.
  • Regulatory elements may include promoters, enhancers, internal ribosome entry sites (IRES), and other expression regulatory elements (eg, transcription termination signals such as polyadenylation signals and poly-U sequences). Regulatory elements include elements that direct the induction or constitutive expression of a nucleotide sequence in many types of host cells and elements that direct expression of the nucleotide sequence only in specific host cells (eg, tissue-specific regulatory sequences).
  • tissue-specific promoter directs expression primarily in a desired tissue of interest, such as muscle, neuron, bone, skin, blood, a specific organ (eg, liver, pancreas), or a specific cell type (eg, lymphocytes). can do.
  • Regulatory elements may also direct expression in a transient-dependent manner, such as a cell-cycle dependent or developmental stage-dependent manner, which may or may not be tissue or cell-type specific.
  • the vector comprises one or more pol III promoters, one or more pol II promoters, one or more pol I promoters, or a combination thereof.
  • pol III promoters include, but are not limited to, the U6 and H1 promoters.
  • pol II promoters include, but are not limited to, a retroviral Rous sarcoma virus (RSV) LTR promoter (optionally with an RSV enhancer), a cytomegalovirus (CMV) promoter (optionally with a CMV enhancer) (e.g., Boshart et al.
  • RSV Rous sarcoma virus
  • CMV cytomegalovirus
  • SV40 promoter dihydrofolate reductase promoter
  • ⁇ -actin promoter phosphoglycerol kinase (PGK) promoter
  • PGK phosphoglycerol kinase
  • Regulatory elements include enhancers such as WPRE; CMV enhancer; R-U5' segment in LTR of HTLV-I; SV40 enhancer; and an intron sequence between exons 2 and 3 of rabbit ⁇ -globin, and the like. It will be appreciated by those skilled in the art that the design of an expression vector may depend on factors such as the selection of the host cell to be transformed, the level of expression desired, and the like.
  • a vector can be introduced into a host cell to produce a transcript, protein or peptide comprising a fusion protein or peptide encoded by a nucleic acid as described herein (e.g., clustered regularly spaced short palindromic repeats ( CRISPR) transcripts, proteins, enzymes, mutants thereof, fusion proteins thereof, etc.).
  • CRISPR clustered regularly spaced short palindromic repeats
  • Beneficial vectors include lentiviruses and adeno-associated viruses, and types of such vectors can also be selected to target specific types of cells.
  • Each of the vectors is a local injection method (eg, direct injection of a lesion or target site), electroporation, lipofection, viral vectors, nanoparticles, as well as PTD (Protein translocation domain) fusion protein method, etc. It can be delivered in vivo or into a cell.
  • the nucleic acid is injected in the form of ribonucleic acid, for example, messenger ribonucleic acid mRNA, so that the gene base correction of the cell, for example, the gene base correction is possible without limitation in animal cells or plant cells.
  • ribonucleic acid for example, messenger ribonucleic acid mRNA
  • the nucleic acid according to the present invention may be in the form of mRNA, and when delivered in the form of mRNA, compared to delivery in the form of a vector using DNA, the transcription process into mRNA is unnecessary, so the initiation of gene editing may be quick. Transient protein expression is likely.
  • the inventors of the present application have found that when a cytosine base editor is injected into plant cells in the form of ribonucleic acid, for example, messenger ribonucleic acid, for plant organelle gene editing into plant cells, the off-target effect is reduced compared to delivery as a plasmid Confirmed.
  • ribonucleic acid for example, messenger ribonucleic acid
  • a cytosine base corrector in plant organelle gene editing it was demonstrated for the first time that there is an advantage in off-target effects compared to plasmids.
  • the mRNA may be delivered directly or delivered through a carrier.
  • the mRNA of the nuclease and/or the cleavage factor may be chemically modified or directly delivered in the form of synthetic self-replicative RNA.
  • Methods capable of delivering mRNA molecules to cells in vitro or in vivo are contemplated, including a method for delivering mRNA into a cell or a method for delivering mRNA into a cell of an organism such as a human or animal in vivo.
  • lipids eg, liposomes, micelles, etc.
  • nanoparticles or nanotubes include cationic compounds (eg, polyethyleneimine or PEI), or include cationic compounds (eg, for example, polyethylenimine or PEI), to deliver mRNA molecules into cells.
  • PEI polyethyleneimine
  • cationic compounds eg, for example, polyethylenimine or PEI
  • a bolistics method such as a gene gun or a biolistic particle delivery system may be used to deliver mRNA into cells.
  • the carrier may include, for example, a cell penetrating peptide (CPP), nanoparticles, or a polymer, but is not limited thereto.
  • CPP cell penetrating peptide
  • nanoparticles or a polymer, but is not limited thereto.
  • the CPP is a short peptide that facilitates cellular uptake of a variety of molecular cargoes (from nanosized particles to small chemical molecules and large fragments of DNA).
  • the composition according to the present invention may be delivered via polymer nanoparticles, metal nanoparticles, metal/inorganic nanoparticles or lipid nanoparticles.
  • the polymer nanoparticles may be, for example, DNA nanoclew synthesized by rolling circle amplification, or thread-like DNA nanoparticles.
  • DNA nanoclew may be coated with PEI to improve the endosomal escape ability, loading the mRNA into the DNA nanoparticle like a thread. This complex binds to the cell membrane, is internalized, and then moves to the nucleus through endosomal escape, so that it can be delivered.
  • the gold particles may be linked and a complex may be formed with a cationic endosomal disruptive polymer and delivered to the cell.
  • the cationic endosomes escape polymer is, for example, polyethylene imine, poly(arginine), poly(lysine), poly(histidine), poly-[2- ⁇ (2-aminoethyl)amino ⁇ -ethyl -aspartamide] (pAsp(DET)), poly(ethylene glycol) (PEG) and poly(arginine) block co-polymer, PEG and poly(lysine) block co-polymer, or PEG and poly ⁇ N-[N It may be a block co-polymer of -(2-aminoethyl)-2-aminoethyl]aspartamide ⁇ (PEG-pAsp(DET)).
  • mRNA can be encapsulated through ZIF-8 (zeolitic imidazolate framework-8).
  • the mRNA is negatively charged and can combine with cationic substances to form nanoparticles, which are receptor-mediated into the cell. It can penetrate through endocytosis or phagocytosis.
  • polyallylamine as a cationic polymer; polyethyleneimine (PEI); poly(L-lysine) (PLL); poly(L-arginine) (PLA); polyvinylamine homo- or copolymers; poly(vinylbenzyl-tri-C1-C4-alkylammonium salt); polymers of aliphatic or araliphatic dihalides and aliphatic N,N,N',N'-tetra-C1-C4-alkyl-alkylenediamines; poly(vinylpyridine) or poly(vinylpyridinium salt); poly(N,N-diallyl-N,N-di-C1-C4-alkyl-ammonium halide); homo- or copolymers of quaternized di-C 1 -C 4 -alkyl-aminoethyl acrylates or methacrylates; POLYQUADTM; polyaminoamides and the like may be included.
  • Cationic lipids may include cationic liposome preparations.
  • the lipid bilayer of the liposome protects the encapsulated nucleic acid from degradation and can prevent specific neutralization by antibodies capable of binding to the nucleic acid.
  • endosomal maturation the endosomal membrane and the liposome are fused, allowing efficient endosomal escape of cationic lipid-nucleases.
  • Representative cationic liposomes include N-[1-(2,3-dioleoloxy)-propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride (DOTMA), N-[1-(2,3-dioleoloxy) -Propyl]-N,N,N-trimethylammonium methylsulfate (DOTAP), 3 ⁇ -[N-(N',N'-dimethylaminoethane)carbamoyl]cholesterol (DC-Chol), 2,3- Dioleyloxy-N-[2(sperminecarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminium trifluoroacetate (DOSPA), 1,2-dimyristyloxypropyl-3 -dimethyl-hydroxyethyl ammonium bromide; or dimethyldioctadecylammonium bromide (DDAB).
  • DOTMA N-[1-(2,3
  • Liposomes are spherical vesicular structures composed of a single or multiple lamellar lipid bilayers surrounding an inner aqueous compartment and a relatively impermeable outer lipophilic phospholipid bilayer.
  • the liposome formulation may mainly contain natural phospholipids and lipids such as 1,2-distearolyl-sn-glycero-3-phosphatidyl choline (DSPC), sphingomyelin, phosphatidylcholine or monosialoganglioside and the like.
  • DSPC 1,2-distearolyl-sn-glycero-3-phosphatidyl choline
  • sphingomyelin phosphatidylcholine or monosialoganglioside and the like.
  • cholesterol or 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine may be added to the lipid membrane. Addition of cholesterol decreases the rapid release of encapsulated bioactive compounds into plasma or 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) increases stability.
  • the present invention relates to a composition for base correction comprising the fusion protein or the nucleic acid.
  • the present invention relates to a base correction method comprising the step of treating cells with the composition.
  • the cytosine deaminase of the fusion protein hydrolyzes the amino group of cytosine to transform it into uracil. Since uracil can base pair with adenine, cytosine-guanine base pairing through intracellular DNA replication can be corrected to uracil-adenine base pairing and finally thymine-adenine base pairing.
  • the adenine deaminase of the fusion protein hydrolyzes the amino group of adenine to transform it into the form of hypoxanthine. Since hypoxanthine can base pair with cytosine, similarly, during intracellular DNA replication, adenine-thymine base pairing can be corrected to guanine-cytosine base pairing via hypoxanthine-cytosine base pairing.
  • the cells are eukaryotic cells (eg, fungi such as yeast, eukaryotic and / or eukaryotic plant-derived cells (eg, embryonic cells, stem cells, somatic cells, germ cells, etc.)), eukaryotic animals (eg, humans, monkeys It may be a primate dog, pig, cow, sheep, goat, mouse, rat, etc.), or a eukaryotic plant (eg, algae such as green algae, corn, soybean, wheat, rice, etc.), but is not limited thereto.
  • eukaryotic cells eg, fungi such as yeast, eukaryotic and / or eukaryotic plant-derived cells (eg, embryonic cells, stem cells, somatic cells, germ cells, etc.)
  • eukaryotic animals eg, humans, monkeys It may be a primate dog, pig, cow, sheep, goat, mouse, rat, etc.
  • a eukaryotic plant eg, algae such as green
  • the present invention relates to a composition for nucleotide correction of plant cell DNA or a nucleotide correction method.
  • the fusion protein or a nucleic acid encoding the same and NLS (nuclear localization signal) peptide, chloroplast transit peptide, mitochondrial targeting signal (MTS), extranuclear transport signal protein or a nucleic acid encoding the same, It relates to a composition for editing plant cell bases will be.
  • the present invention also provides the fusion protein or nucleic acid; And NLS (nuclear localization signal) provides a composition for base correction of plant cells comprising a peptide or a nucleic acid encoding the same.
  • the present invention also provides the fusion protein or nucleic acid; And chloroplast transit peptide (chloroplast transit peptide) or provides a composition for plant cell base correction comprising a nucleic acid encoding the same.
  • the present invention also provides the fusion protein or nucleic acid; and Mitochondrial Targeting Signal (MTS) or a nucleic acid encoding the same. It provides a composition for editing plant cell bases.
  • MTS Mitochondrial Targeting Signal
  • the present invention also provides an extranuclear transport signal protein or a composition for correcting plant cell bases, further comprising a nucleic acid encoding the same.
  • composition or base correction method for the correction of plant cell nuclear DNA, mitochondrial DNA, or chloroplast DNA relates to a composition or base correction method for the correction of plant cell nuclear DNA, mitochondrial DNA, or chloroplast DNA.
  • the fusion protein can be delivered to plant cells through:
  • the polynucleotide sequence encoding the fusion protein according to the present invention may be an RNA sequence, a DNA sequence, or a combination thereof (RNA-DNA combination sequence).
  • the polynucleotide encoding the fusion protein can be delivered to plant cells through:
  • Transformation using Agrobacterium for example, Agrobacterium tumefaciens , Agrobacterium rhizogen , etc.
  • Viral vectors Geminivirus, tobacco rattle virus (TRV), tomato mosaic virus (ToMV), foxtail mosaic virus (FoMV), barley yellow striate mosaic virus (BYSMV), Sonchus yellow net rhabdovirus (SYNV), etc.;
  • the virus is, for example, a viral vector: Geminivirus, tobacco rattle virus (TRV), tomato mosaic virus (ToMV), foxtail mosaic virus (FoMV), barley yellow striate mosaic virus (BYSMV), Sonchus yellow net rhabdovirus (SYNV), etc.
  • TRV tobacco rattle virus
  • ToMV tomato mosaic virus
  • FoMV foxtail mosaic virus
  • BYSMV barley yellow striate mosaic virus
  • SYNV Sonchus yellow net rhabdovirus
  • Each of the vectors is a local injection method (eg, direct injection of a lesion or target site), electroporation, lipofection, viral vectors, nanoparticles, as well as PTD (Protein translocation domain) fusion protein method, etc. can be delivered intracellularly.
  • a local injection method eg, direct injection of a lesion or target site
  • electroporation e.g., electroporation, lipofection, viral vectors, nanoparticles, as well as PTD (Protein translocation domain) fusion protein method, etc.
  • PTD Protein translocation domain
  • the plant organ may be a mitochondrion, a chloroplast or a plastid (white body, chromatid).
  • the protein transported to the plant organ may be, for example, a chloroplast transit peptide or a mitochondrial targeting signal (MTS).
  • MTS mitochondrial targeting signal
  • Chloroplast Transit Peptide CTP
  • Mitochondrial Targeting Signal MTS
  • CTP Chloroplast Transit Peptide
  • MTS Mitochondrial Targeting Signal
  • CTP chloroplast transit peptide
  • MTS mitochondrial targeting signal
  • nucleic acid encoding the same is treated or delivered to plant cells to plant mitochondria, chloroplasts , can be used to correct bases in colored or white body DNA.
  • the extranuclear transport signal protein may be derived from, for example, Mirute virus of mice (MVM), but is not limited thereto.
  • the extranuclear transport signal protein may include, for example, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31, but is not limited thereto.
  • VDEMTKKFGTLTIHDTEK (SEQ ID NO: 31)
  • the present invention also provides a TAL (Transcription Activator-Like) effector (TALE) domain that cuts a wild-type DNA sequence but does not cut a corrected sequence, and a FokI nuclease or a nucleic acid or ZFN (zinc) encoding the same finger nuclease) or a nucleic acid encoding it, that is, mitoTALEN (Mitochondrial TALE Nuclease), a mitochondrial nuclease, or a nucleic acid encoding the same or ZFN (zinc finger nuclease) or a nucleic acid encoding the same. Even when used at the same time, higher efficiency of mitochondrial base correction can be expected.
  • TALE Transcription Activator-Like effector
  • the present invention relates to a composition for nucleotide correction of animal cell DNA or a nucleotide correction method.
  • the fusion protein or a nucleic acid encoding the same and a nuclear localization signal (NLS) peptide, a mitochondrial targeting signal (MTS), an extranuclear transport signal protein, or a nucleic acid encoding the same, to a composition for editing animal cell bases.
  • NLS nuclear localization signal
  • MTS mitochondrial targeting signal
  • extranuclear transport signal protein or a nucleic acid encoding the same
  • the present invention also provides the fusion protein or nucleic acid; and NLS (nuclear localization signal) peptide or a nucleic acid encoding the same.
  • the present invention also provides the fusion protein or nucleic acid; and mitochondrial targeting signal (MTS) or a nucleic acid encoding the same.
  • MTS mitochondrial targeting signal
  • the present invention also provides a composition for correcting the base of animal cells, optionally further comprising an extranuclear transport signal protein or a nucleic acid encoding the same.
  • the animal cells are non-human animal cells, and include an extranuclear transport signal protein or a nucleic acid encoding the same; and/or by treating a mitochondrial targeting signal (MTS) or a nucleic acid encoding the same to correct the base of mitochondrial DNA in non-human animal cells.
  • MTS mitochondrial targeting signal
  • a mitochondrial targeting signal binds and is delivered to the mitochondria.
  • MTS mitochondrial targeting signal
  • the remainder except for the N-terminal MTS protein is transferred into the mitochondria in the form of a preprotein.
  • the transfer protein part is separated, and a specific part can be base-corrected by targeting the mitochondria.
  • TALE-DdCBE TALE DddA-derived cytosine base editor containing mitochondrial transduction signal, TAL effector and cytosine deaminase (DddA tox ) or a nuclear export signal (NES) to a nucleic acid encoding the same
  • Extranuclear transport signals may reduce nuclear DNA base correction to mitochondrial-nuclear-like sequences.
  • the present invention it is possible to achieve more efficient animal mitochondrial DNA base correction, including the extranuclear transport signal protein or a nucleic acid encoding the same.
  • the extranuclear transport signal protein may be derived from, for example, Mirute virus of mice (MVM), but is not limited thereto.
  • the extranuclear transport signal protein may include, for example, the amino acid sequence of VDEMTKKFGTLTIHDTEK (SEQ ID NO: 31), but is not limited thereto.
  • the corrected nucleotide sequence is a TAL (Transcription Activator-Like) effector (TALE) domain that cannot be cut and FokI nuclease (FokI Nuclease) or a nucleic acid encoding the same or ZFN (zinc finger nuclease) or a nucleic acid encoding the same to eukaryotic cells.
  • TALE Transcription Activator-Like effector
  • extranuclear transport signal protein or nucleic acid encoding the same and/or mitochondrial targeting signal (MTS) or a nucleic acid encoding the same may be included.
  • nucleotide-correcting protein when an extranuclear transport sequence is attached to a nucleotide-correcting protein during animal mitochondrial gene editing, the nucleotide is corrected with higher efficiency, and in animal embryos, non-specific nucleotide correction of a similar sequence in the nucleus is also suppressed.
  • the present invention also further includes mitochondrial nucleic acid hydrolase mitoTALEN (Mitochondrial TALE Nuclease) or a nucleic acid encoding the same, so that even when using a mitochondrial sequence cleavage protein at the same time, higher efficiency of mitochondrial base correction can be expected.
  • Mitochondrial DNA can be cut using mitochondrial DNA nuclease mitoTALEN (Mitochondrial TALE Nuclease), and wild-type mitochondrial genomes can be cut to obtain base-corrected genomes from animals with high efficiency.
  • the present invention also further includes mitochondrial nucleic acid hydrolase mitoTALEN (Mitochondrial TALE Nuclease) or a nucleic acid encoding the same, so that even when using a mitochondrial sequence cleavage protein at the same time, higher efficiency of mitochondrial base correction can be expected.
  • mitoTALEN Mitochondrial TALE Nuclease
  • it may include a fusion protein (mitoTALEN) or a nucleic acid encoding the TAL effector domain to which a mitochondrial transduction signal is bound and FokI nuclease (FokI Nuclease) or ZFN or a nucleic acid encoding the same.
  • Mitochondrial DNA can be cut using mitochondrial DNA nuclease mitoTALEN (Mitochondrial TALE Nuclease), and wild-type mitochondrial genomes can be cut to obtain base-corrected genomes from animals with high efficiency.
  • mitoTALEN Mitochondrial TALE Nuclease
  • UGI uracil DNA glycosylase inhibitor
  • UGI can increase base editing efficiency by inhibiting the activity of Uracil DNA glycosylase (UDG), an enzyme that repairs mutant DNA that catalyzes the removal of U from DNA.
  • UGG Uracil DNA glycosylase
  • DddA-derived cytosine base correctors consisting of a fragmented bacterial toxin DddAtox, a transcription activator-like effector (TALE) designed to bind to DNA, and a uracil glycosylation inhibitor (UGI) Thymine base modifications were made possible in mitochondrial DNA.
  • DdCBEs DddA-derived cytosine base correctors
  • TALE transcription activator-like effector
  • UMI uracil glycosylation inhibitor
  • DNA-binding protein, deaminase or a variant thereof or a nucleic acid encoding the same is linked to the (1) extranuclear transport signal protein or nucleic acid encoding the same, 3) mitoTALEN (Mitochondrial TALE Nuclease) or a nucleic acid encoding it can be linked.
  • mitoTALEN Mitochondrial TALE Nuclease
  • a single or a plurality of delivery means may be used in combination in the same or different configurations.
  • Each delivery system may be a viral delivery means at the same time, one viral delivery means and the other non-viral delivery means, or simultaneously a non-viral delivery means.
  • the extranuclear transport signal protein, DdCBE, and mitoTALEN of (1) to (3) above may be mixed and delivered.
  • One or more of the above (1) to (3) can be delivered to the extranuclear transport signal protein, DdCBE, and mitoTALEN, and some can be delivered by placing the DNA sequence encoding (1) to (3) on a vector.
  • the DNA sequences encoding the above (1) to (3) can be delivered simultaneously through one vector by positioning them on the same vector, or can be delivered by being positioned on another separate vector.
  • Animals according to the present invention may include human or non-human animals.
  • the non-human transgenic animal may be an insect, an annulus, a mollusk, a brachiopod, a linear animal, a coliform, a sponge, an axon, or a vertebrate, and the vertebrate may be a fish, an amphibian, a reptile, a bird or a mammal,
  • the insect may be a fruit fly (Drosophila)
  • the linear animal may be C. elegans
  • the fish may be a zebrafish
  • the mammal may be a primate, carnivorous, carnivorous, or rodent. It may be a neck, an oxiform, a progenitor, or a progenitor
  • the rodent may be a rat or a mouse.
  • a base-corrected animal can be prepared by introducing the composition according to the present invention into an embryo of a human or non-human animal, transplanting the embryo in a surrogate mother, and impregnating the embryo.
  • the composition according to the present invention can be introduced into a fertilized egg of an animal and cultured.
  • the obtained fertilized egg can be transplanted into a surrogate mother for delivery.
  • the non-human transgenic animal may further comprise the step of confirming whether or not transgenic after delivery.
  • the non-human transgenic animals can be crossed to produce offspring transgenic animals.
  • the "offspring” refers to all transgenic animals that are viable by crossing with the non-human transgenic animal, and more specifically, by crossing the transgenic animal as a parent and transgenic animals or by crossing the transgenic animal with a normal animal. It refers to the F1 generation produced, the F2 generation produced by crossing an F1 generation animal with a normal animal, and generations thereafter, but is not limited thereto.
  • the cross may be characterized in that the cross with the transgenic animal or the normal animal.
  • the present invention may include cells, tissues and by-products isolated from the transgenic animal or progeny transgenic animal.
  • the by-product means any material derived from the transgenic rabbit, but is preferably selected from the group consisting of blood, serum, urine, feces, saliva, organs and skin, but is not limited thereto.
  • the ZFD platform includes a DNA binding protein, interbacterial toxin deaminase DDDAtox (DDDAtox), and a uracil glycosylase inhibitor (UGI).
  • DDDAtox interbacterial toxin deaminase DDDAtox
  • UGI uracil glycosylase inhibitor
  • Indels small unwanted insertions and deletions
  • ZFD does not cut DNA to make single or double-stranded breaks, so unwanted insertions and deletions (indels) by error-prone non-homologous end joinig at the target site This does not happen.
  • the recombinant ZFD proteins purified from E. coli spontaneously pass through human cells to convert the target base to another base (base conversion). This proves the proof-of-princile of gene-free gene therapy.
  • ZFNs zinc finger nucleases
  • TALE transcription activator-like effector nucleases
  • DdCBEs transcription activator-like effector nucleases
  • base editors CRISPR -Cas9
  • Cas9-linked deaminases with abolished cleavage activity include, but are not limited to.
  • ZFNs zinc finger nucleases
  • TALE transcription activator-like effector nucleases
  • DdCBEs transcription activator-like effector nucleases
  • Cas9-linked deaminases with abolished cleavage activity aka base editors
  • base editors Cas9-linked deaminases with abolished cleavage activity
  • nucleases Function as DNA binding sites
  • deaminases split DddA tox in DdCBE and CBE in CBE
  • APOBEC1 functions as a catalytic unit.
  • Crispr-cas9 has both a nuclease function and an RNA-guided DNA binding protein function.
  • Custom-designed, programmable nucleases such as ZFNs, TALENs and Cas9 cut DNA and cause double-strand breaks. It causes gene knock-out and knock-in in a targeted manner while repairing it.
  • programmable nuclease-induced double-strand breaks can lead to large deletions of unwanted genes at the target site, p53 activation, and chromosomal rearrangement during simultaneous DSB repair at the target and non-target sites.
  • programmable base correctors including cytosine and adenine base correctors (CBE and ABE)
  • CBE and ABE cytosine and adenine base correctors
  • CBE and ABE cytosine and adenine base correctors
  • ZFD zinc finger deaminase
  • zinc finger array (2 x 0.3 ⁇ 0.6 k base pair) is smaller in size than the TALE array (2 x 1.7 ⁇ 2k base pair) or S.pyogenes Cas9 (4.1 k base pair), in vivo
  • ZFD-encoded genes can be easily loaded into viral vectors with virally restricted cargo space, such as AAV.
  • AAV virally restricted cargo space
  • zinc finger arrays are engineering-friendly because they do not have bulky domains at the C-terminus or N-terminus.
  • the split DddAtox half can be fused to either the C-terminal part or the N-terminal part of the zinc finger protein.
  • zinc finger proteins have intrinsic cell-penetrating ability. This allows nucleic acid-free gene editing in human cells. These properties make zinc finger proteins an ideal platform for base correction in the nucleus or other organelles as a DNA binding module.
  • the p3s-ZFD plasmid for mammalian expression was prepared by cleaving the p3s-ABE7.10 plasmid (addgene, #113128) with HindIII and XhoI (NEB) enzymes and then modifying it.
  • the enzymatically cleaved p3s plasmid and the synthesized insert DNA were assembled using a HiFi DNA Assembly Kit (NEB). All insert DNAs encoding MTS-, ZFP (Toolgen, Sangamo and Barbas modules)-, split DddA- or UGI were synthesized by IDT.
  • the pTarget plasmid was designed to determine the optimal length of the spacer sequence for ZFD activity.
  • Each pTarget plasmid containing a multi-length spacer and two ZFP binding sites was constructed by inserting the ZFP binding sequence and the spacer sequence into the pRGS-CCR5-NHEJ reporter plasmid digested with two enzymes (EcoRI and BamHI, NEB).
  • the pET-ZFD plasmid for protein production in E. coli was generated by cutting the pET-Hisx6-rAPOBEC1-XTEN-nCas9-UGI-NLS plasmid (addgene, #89508) with NcoI and XhoI (NEB) and then modifying it.
  • the ZFD sequence was amplified from the p3s-ZFD plasmid using PCR, and Hisx6 tag and GST tag sequences were synthesized as oligonucleotides (Macrogen). All plasmids for protein purification were constructed by inserting the sequences encoding the ZFD and tag into the enzymatically digested pET plasmid using the HiFi DNA Assembly Kit (NEB). The chemically acceptable DH5 ⁇ E. coli cells were transformed with a plasmid, and the plasmid was purified with AccuPrep Plasmid Mini Extraction Kit (Bioneer) according to the manufacturer's protocol. After confirming the entire sequence by Sanger sequencing, the desired plasmid was selected.
  • NEB HiFi DNA Assembly Kit
  • HEK 293T cells (ATCC CRL-11268) were cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium (Welgene) supplemented with 10% fetal bovine serum (Welgene) and 1% antibiotic-antifungal solution (Welgene).
  • HEK 293T cells (7.5 ⁇ 104) were seeded in a 48-well plate. After 18-24 hours, when the cells have grown to 70-80%, transfect the left and right ZFD-encoding plasmids (500 ng each) with Lipofectamine 2000 (1.5 ⁇ L, Invitrogen), or pTarget plasmid (10 ng).
  • HEK 293T cells were transfected with serially diluted plasmids or mRNAs encoding ND1 or ND2 target mitoZFD pairs. The amount of structure (ng) is delivered per 7.5 ⁇ 104. mtDNA was extracted from the cells 96 hours after transfection.
  • K562 cells were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (Welgene) and 1% antibiotic-antifungal solution (Welgene).
  • An Amaxa 4D-NucleofectorTM X Unit system with program FF-120 (Lonza) was used for ZFD delivery into K562 cells by electroporation.
  • the maximum volume of substrate solution added to each sample was 2 ⁇ L.
  • K562 cells (1x105) were transfected with 220 pmol (for maximal dose) or 110 pmol (half of maximal dose) of left and right ZFD respectively for protein and 500ng of plasmid encoding left and right ZFD for plasmid. .
  • a mixture of left and right ZFD proteins (final concentration 50 ⁇ M) or a mixture of left and right ZFD encoding plasmids (500 ng each) was diluted with serum-free medium pH 7.4 containing 100 mM L-arginine and 90 ⁇ M ZnCl2 and the final volume was It was made into 20 ⁇ L.
  • K562 cells (1 ⁇ 105) were centrifuged at 100 g for 5 minutes, and the supernatant was removed. Cells were then lysed in diluted ZFD solution and incubated at 37 °C for 1 h. After incubation, the cells were centrifuged at 100 g for 5 minutes, and then a fresh culture medium was added. Cells were maintained at 30 °C (transient hypothermic conditions) or 37 °C for 18 h and then grown for two more days at 37 °C. Some cells were treated twice according to the above procedure. Cells were analyzed 96 hours after treatment.
  • the culture was placed on ice for about 1 h, after which 0.5 mM isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG; GoldBio) was added to induce ZFD protein expression and the culture was incubated at 18 °C. incubated for 14 hours.
  • IPTG isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside
  • lysis bath 50 mM Tris-HCl (Sigma-Aldrich), 500 mM NaCl (Sigma-Aldrich), 1 mM MgCl2 (Sigma-Aldrich), 10 mM 1,4-dithiothreitol (DTT; GoldBio)) , 1% Triton X-10 Sigma-Aldrich), 10% glycerol, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (Sigma-Aldrich), 1 mg/ml lysozyme from chicken egg white (Sigma-Aldrich), 100 ⁇ M ZnCl 2 (Sigma) -Aldrich), 100 mM Sigma-Aldrich), pH 8.0).
  • the cells were lysed, followed by sonication (3 min total, 5 s on, 10 s off) to further lyse the cells. After doing these, the solution was centrifuged (13,000 rpm) to extract only the supernatant. The supernatant was incubated for 1 hour by adding Glutathione Sepharose 4B (GE healthcare).
  • GE healthcare Glutathione Sepharose 4B
  • wash buffer 50 mM Tris-HCl (Sigma-Aldrich), 500 mM NaCl (Sigma-Aldrich), 10 mM DTT (GoldBio), 1 mM MgCl2 (Sigma-Aldrich), 100 ⁇ M) ZnCl2 (Sigma-Aldrich), 10% glycerol, 100 mM arginine (Sigma-Aldrich), pH 8.0
  • wash buffer 50 mM Tris-HCl (Sigma-Aldrich), 500 mM NaCl (Sigma-Aldrich), 10 mM DTT (GoldBio), 1 mM MgCl2 (Sigma-Aldrich), 100 ⁇ M) ZnCl2 (Sigma-Aldrich), 10% glycerol, 100 mM arginine (Sigma-Aldrich), pH 8.0
  • Proteins attached to resin are elution buffer (50mM Tris-HCl (Sigma-Aldrich), 500mM NaCl (Sigma-Aldrich), 1mM MgCl2 (Sigma-Aldrich), 40 mM glutathione (Sigma-Aldrich), 10% glycerol) , 1mM DTT (GoldBio), 100 ⁇ M ZnCl2 (Sigma-Aldrich), 100 mM arginine (Sigma-Aldrich), pH 8.0) was separated from the resin. Finally, the extracted protein was concentrated to a concentration of ⁇ 15 ng/ ⁇ L (200-240 pmol/ ⁇ L, depending on protein size).
  • elution buffer 50mM Tris-HCl (Sigma-Aldrich), 500mM NaCl (Sigma-Aldrich), 1mM MgCl2 (Sigma-Aldrich), 40 mM glutathione (Sigma-Aldrich), 10% glyce
  • Amplicons containing TRAC sites were prepared using PCR. 8 ⁇ g of amplicons were incubated with 2 ⁇ g of each ZFD protein (Left-G1397N and Right-G1397C) in NEB3.1 buffer containing 100 ⁇ M ZnCl2 for 1-2 h at 37 °C. After the reaction, 4 ⁇ L of Proteinase K solution (Qiagen) was added and incubated at 55 °C for 30 minutes to remove ZFD, and the amplicon was purified using a PCR purification kit (MGmed). 1 ⁇ g of purified amplicons were incubated with two USER enzymes (NEB) for 1 h at 37 °C. The amplicons were then incubated with 4 ⁇ L of proteinase K solution (Qiagen) and purified again using a PCR purification kit (MGmed). Purified PCR was electrophoresed on an agarose gel and imaged.
  • the target site was subjected to overlapping primary PCR, secondary PCR amplification, and tertiary PCR using TruSeq HT Dual index-containing primers using PrimeSTAR® GXL DNA polymerase (TAKARA).
  • TAKARA PrimeSTAR® GXL DNA polymerase
  • a DNA template comprising a T7 RNA polymerase promoter upstream of the ZFD sequence was prepared with forward and reverse primers (forward: 5'-CATCAATGGGCGTGGATAG-3' SEQ ID No: 116, reverse: 5'-CATCAATGGGCGTGGATAG-3' SEQ ID No: 117 , reverse: 5'-GACACCTACTCAGACAATGC-3' SEQ ID No: 118).
  • mRNA was synthesized in vitro using the mMESSAGE mMACHINETM T7 ULTRA Transcription Kit (Thermo Fisher). In vitro transcribed mRNA was purified using the MEGAclearTM Transcription Clean-Up Kit (Thermo Fisher) according to the manufacturer's protocol.
  • NGS library generation Illumina DNA Prep kit containing NexteraTM DNA CD Indexes (Illumina) was used to generate NGS libraries from the extracted mtDNA.
  • NGS Libraries were pooled and loaded into a MiniSeq sequencer (Illumina). The average sequencing depth was greater than 50.
  • BWA was used to align the Fastq file to the GRCh38.p13 (release v102) reference genome and correct the read pairing information and flags to generate the BAM file with SAMtools (v.1.9).
  • the REDItoolDenovo.py script from REDItools (v.1.2.1) was used to identify positions with a base correction rate greater than 1% among all cytosines and guanines in the mitochondrial genome. Positions with a base correction rate of 50% or more in the cell line were considered as single nucleotide mutations and excluded from all samples. For off-target analysis, the target site of each ZFD was excluded.
  • the remaining positions with a correction frequency ⁇ 1% were considered off-target and the number of corrected C/G nucleotides was calculated.
  • To calculate the T/A base correction frequency at the mean C/G of the offtarget of the mitochondrial genome it was averaged over all C/Gs.
  • the specificity ratio was calculated by dividing the on-target average value by the off-target average value.
  • a mitochondrial genome-wide graph was generated by plotting base correction rates at on- and off-target positions.
  • DddAtox can be cleaved at two positions (G1333 and G1397) and each half can be fused to either left or right ZFP.
  • Hek293T cells were measured by deep sequencing on the 4th day of transfection.
  • PKKKRKV (SEQ ID No: 478)
  • ZFDs with short linkers (2 and 5 amino acid (AA) linkers) have low or no efficiency.
  • the C to T base correction efficiency in spacers of 4 base pairs or more was in the range of 1% to 24% ( FIGS. 1c and 2a,c ).
  • the one with 24AA linker showed the highest editing efficiency.
  • the 24AA linker was fixed on the ZFD on the left side of the ZFD pair, and the base correction efficiency was observed by combining the right side with ZFDs having various linker lengths, and the same was done in reverse (Figs. 1d and 3). . It was found that both of them had the 24AA linker with the most efficiency.
  • ZFD with 24AA linker in human cells can catalyze C to T base correction even at chromosomal target sites in vivo.
  • 22 pairs of ZFDs targeting 11 sites (two ZFD pairs in one place) in a total of 8 genes were produced (FIG. 4).
  • 14 pairs of ZFDs were used from publicly available zinc finger resources.
  • Another eight pairs of ZFDs were made by modifying previously-characterized ZFNs (specific to CCR5 and TRAC). The reason is that ZFN cuts the target DNA at a spacer length of 5 to 7 bp, whereas ZFD operates a spacer of at least 7 or more.
  • FokI nuclease part can be fused to the N-terminal or C-terminal part to ZFP to make ZFNs with four different configurations, also two pairs of ZFDs with different configurations (Trac- NC) and split DddAtox halves were tested whether they could be fused to the N-terminal part of ZFP as well as the existing ZFP C-terminus (NC configuration is shown in Figs. 4a and 5).
  • Type C SV40 NLS-Zinc finger protein-24aa linker-DddA tox half-4aa linker-UGI
  • PKKKRKV (SEQ ID No: 478)
  • the C-to-T base correction efficiency of ZFD is 1.0% to 60%.
  • indels rarely occurred (Fig. 4b and Fig. 6), about ⁇ 0.4%.
  • the ZFD targeting CCR5 with a 5bp spacer had very poor efficiency.
  • the other 20 ZFD pairs showed an average editing efficiency of 12.0 ⁇ 3.4%, which is comparable to the cas9-derived Base Editor2, which shows an average of 8.3 ⁇ 2.2%.
  • the base correction from C to T occurred not only in the TC context but also in A C or GC C ( FIGS. 4c to 4f ).
  • a C at C 6 of NUMBL
  • the nucleotide correction efficiency of the ZFD protein was tested in vitro using a PCR amplicon having a TRAC site, and it was confirmed that the efficiency was very high. Efficiency was confirmed by cleaving the gene using uracil-specific cleavage reagent (USER), a mixture of Uracil DNA glycosylase and DNA glycosylase-lyase Endonuclease VIII (FIG. 7).
  • the TRAC-NC ZFD protein was delivered to human leukemia K562 cells, which are difficult to transfect cells, in two ways, by electroporation or direct delivery without electroporation. The ZFD protein was very efficient. Base correction from C to T showed 26.5% (electroporation) and 17% (direct delivery) ( FIG. 4G ). Taken together, these results show that either a plasmid encoding ZFD or a purified recombinant ZFD protein can be used to base-correct the nuclear DNA of human cells.
  • mitoZFDs were constructed by linking a mitochondrial targeting signal (MTS) and a nuclear export signal (NES) to the N-terminal portion of nine ZFDs designed to target mitochondrial genes ( FIG. 8 ).
  • the ZFP portion of ZFD is taken from the publicly available zinc finger resource.
  • the ZFD was manufactured to have a spacer length of 7 to 15 bp, and the DNA binding site was made to be 12 bp on both the left and right sides.
  • VDEMTKKF Minute virus if mice; MVM NES
  • Zinc fingers are connected by TGEKP linkers. (ZF1-linker-ZF2-linker-ZF3-linker-ZF4).
  • the ND2-target mitoZFD has a QQ variant.
  • This variant is one in which R or K amino acids are substituted with Q. marked in red letters.
  • the mitochondrial DNA base correction efficiency by mitoZFD in HEK293T cells is 2.6%-30% (average 14 ⁇ 3%) ( FIG. 9a ).
  • Most cytosines having a T C context in the spacer part were base-corrected with various efficiencies (FIGS. 9b-g).
  • cytosine having A CC (C 8 and C 9 ) context in the ND2 region also showed efficiencies of about 7.4% and 19.9%, respectively (FIG. 9b). This shows that ZFD-mediated C to T base correction is not limited to the TC motif.
  • Base correction is a relatively new technique that can correct target bases without DNA repair templates without causing DNA double-strand breaks.
  • Base correction can cause C to T or A to G base correction in cells, animals and plants to study the functional effects of single base mutations (SNPs), and for therapeutic applications to correct disease-causing point mutations.
  • SNPs single base mutations
  • Two types of base correction techniques have been developed. It is CRISPR-based adenine and cytosine base correction scissors and DddA-based base correction technology.
  • CRISPR-based base-correction scissors constitute a catalytically-impaired Cas9 or Cas12a as a DNA binding unit, and deaminase has a single-strand DNA specific from rat or E. coli.
  • DdCBE it consists of a TALE DNA binding array and a double-strand DNA specific DddAtox.
  • ZFD is smaller in size. This is because the size of the zinc finger protein contained in ZFD is small, whereas the size of the TALE array contained in DdCBE is large. Consequently, a gene encoding a ZFD pair can be easily loaded into an AAV vector with a small mount space, whereas a gene encoding a DdCBE pair cannot. Additionally, it is easy to engineer due to its simple ZFP properties. Since the half DddAtox can be fused to either the N-terminal or C-terminal portion of ZFP, it can be made to operate either upstream or downstream of the ZFP binding site. Moreover, ZFD recombinant proteins can spontaneously penetrate human cells without electroporation or lipofection.
  • ZFD pairs or mixed ZFD/DdCBE pairs can create unique mutation patterns. This was a pattern that could not be achieved using only DdCBE. These properties make ZFD a powerful new platform for the modeling and treatment of mitochondrial diseases.
  • Plant organelles including mitochondria and chloroplasts, each have their own genomes, encoding many essential genes for respiration and photosynthesis. Plant organelle gene editing, an unmet condition for plant genetics and biotechnology, has been limited by the lack of appropriate tools to target the DNA of these organelles.
  • Golden Gate consisting of 16 expression plasmids (8 for mitochondrial delivery of the resulting protein, and another 8 for delivery to the chloroplast) and 424 TALE subarray plasmids to assemble a DddA-derived cytosine base correction plasmid (DdCBE)
  • DdCBE DddA-derived cytosine base correction plasmid
  • DdCBE messenger RNA was transferred to the lettuce protoplast, and base correction was demonstrated in the chloroplast without DNA.
  • lettuce kali and seedlings with a correction efficiency of up to 99% that were resistant to streptomycin or spectinomycin were made.
  • DdCBEs are composed of an isolated non-toxic domain derived from the bacterial cytosine deaminase toxic substance DddAtox and a TALE array and UGI designed for a specific position. It functions to cause a substitutional cytosine deamination reaction.
  • the results of DdCBEs were used to demonstrate the fast and convenient binding of mitochondrial and chloroplast-expressing DdCBE plasmids and to demonstrate high and efficient organelle base editing in plants.
  • the DdCBE Golden Gate destination vector was constructed using the Gibson assembly method. Sequences encoding TAL N-terminal domain, HA tag, FLAG tag, TAL C-terminal domain, split DddAtox, and UGI were codon-optimized for dicot (Arabidopsis thaliana) expression, and synthesized through Integrated DNA Technology. Sequences encoding CTP from AtinfA and AtRbcS and MTS from the ATPase delta subunit and ATPase gamma subunit were amplified from Arabidopsis cDNA. For plant expression, the mammalian CMV promoter was replaced with the PcUbi promoter and the pea3A terminator in the backbone plasmid and used. To construct the vector for in-flight DdCBE mRNA transcription, a T7 promoter cassette was introduced between the PcUbi promoter and the DdCBE encoding region in the DdCBE Golden Gate destination vector.
  • the TALE array gene was constructed using a single golden gate assembly.
  • the DdCBE expression plasmid was constructed by Golden Gate assembly of BsaI digestion and T4 ligation using 424 TALE array plasmids and a destination vector.
  • Single golden gate cloning was performed as follows. 20 repetitions of 37°C and 50°C for 5 minutes each, followed by a final 50°C 15-minute reaction followed by 80°C for 5 minutes. All plant protoplast transfection vectors were purified using Plasmid Plus Midifrap Kit (Qiagen). The DNA and amino acid sequences of the vector are as follows.
  • a specific amino acid sequence for the construction of DdCBE and a specific amino acid sequence for TALE repeat are as follows.
  • DdCBE DNA template was prepared by PCR using fusion DNA polymerase (Thermo Fisher). DdCBE mRNA was synthesized and purified using an in-flight mRNA synthesis kit (Engnomics).
  • Protoplast extraction and transduction are performed according to previous studies. Cotyledons of 7-day-old lettuce and 14-day-old rapeseed are treated for 3 hours in dark conditions shaking (40 rpm) in an enzyme solution. The protoplast-enzyme mixture is obtained from a sucrose solution by washing with the same amount of W5 solution, and then centrifuging the intact protoplasts at 80 g for 7 minutes. Protoplasts are transduced using polyethylene glycol after treatment at 4° C. for 1 hour in W5 solution.
  • Lettuce protoplasts and rape protoplasts are resuspended in MMG solution and then transduced with plasmid or mRNA using PEG and incubated at room temperature for 20 minutes.
  • the PEG-protoplast mixture is rinsed 3 times using the same amount of W5 solution, and then incubated for 10 minutes while slowly inverting each time.
  • the protoplasts are then centrifuged at 100 g for 5 minutes to form pellets.
  • Lettuce protoplasts were resuspended with lettuce protoplast culture medium (LPCM) after introduction of the plasmid encoding DdCBE.
  • Protoplasts including the medium are mixed 1:1 with the medium and the medium containing low-melting agarose 2.4%, and then immediately put on a 6-well plate. After the mixture is solidified, 1 ml of liquid medium is placed on the embedded protoplast, and then cultured at 25° C. in the dark for 1 week. After the initial culture, the liquid medium on top is changed weekly with a fresh medium, and the embedded protoplasts are cultured for 16 hours under light conditions for 8 hours under dark conditions for 1 week, and then cultured for 2 weeks at 16 hours under light conditions and 8 hours under dark conditions.
  • LPCM lettuce protoplast culture medium
  • Small calli derived from protoplasts are cultured in redifferentiation medium for 4 weeks at 25°C for 16 hours under light conditions for 8 hours under dark conditions.
  • protoplasts were cultured for 1 week in dark conditions at 25°C in a liquid medium without embedding.
  • small callus embedded for a month were cultured for 4 weeks in a redifferentiation medium containing 50 mg/L streptomycin or 50 mg/L spectinomycin at 25° C. for 16 hours under light conditions for 8 hours under dark conditions. .
  • antibiotic-resistant green calli or non-antibiotics were transferred to fresh redifferentiation medium containing 200 mg/L streptomycin or 50 mg/L spectinomycin.
  • Rapeseed protoplasts introduced with the DdCBE encoding plasmid were resuspended in rapeseed culture medium.
  • the protoplast-medium mixture is transferred to a 6-well dish and incubated for 2 weeks at 25°C in the dark. Two weeks later, the protoplasts were cultured for 16 hours under light light conditions and 8 hours dark conditions for 3 weeks. The medium was replaced with very fresh medium.
  • RNA of cells cultured in a liquid medium or transformed callus was extracted using a DNA plant mini kit or an RNG plant mini kit. Cultured cells or callus were harvested by centrifugation at 10,000 rpm for 1 minute. cDNA from total RNA was reverse transcribed using RNA to cDNA EcoDry Premix (Takara).
  • the target region was amplified using a fusion enzyme and appropriate primers (Supplementary Table 1). Three rounds of PCR (first, nested PCR, second, PCR, third, indexing PCR) were performed to create a DNA sequence analysis library. After collecting the same amount of DNA, it was sequenced using MiniSeq (Illumina) equipment. Paired sequencing files were analyzed by Cas-analyzer and computer program source code.
  • DdCBE cp-DdCBE
  • mt-DdCBE DdCBE
  • the expression plasmid encodes a chloroplast transfer peptide or mitochondrial targeting sequence as a bound protein, the N- or C-terminal domain of TALE, split DddAtox (G1333N, G1333C, G1397N, and G1397C) and UGI, which have been optimized for expression in dicotyledonous plants. It is regulated by the parsley ubiquitin (PcUbi) promoter and the pea3A terminator.
  • PcUbi parsley ubiquitin
  • the custom-designed TALE DNA binding sequence and DdCBE plasmid can be created in a single subcloning step by mixing an expression vector and six TALE subarray plasmids into an E-tube.
  • a total of 424 (6X64 3 sequence recognition + 2X16 2 sequence recognition + 2 X 4 1 sequence recognition) modular TALE subarray plasmids contain a conserved T at the 5' end of the cp to recognize 16-20 nucleotides in length -DdCBE and mt-DdCBE can be made. Consequently, functionally, the DdCBE heterodimer recognizes a 32 to 40 bp DNA sequence.
  • rape protoplasts In rape protoplasts, the other combination (Left-G1333-N+Right-G1333-C) showed the highest efficiency at the four cytosine positions (C3, C4, C11, C12) and showed efficiencies up to 3.5% (C3).
  • C3 and C4 are 5'-TCC sequences, but in lettuce, they have a 5'-ACC sequence because of a relatively single nucleotide polymorphism. causative, but not in the lettuce gene.
  • the cp-DdCBE combination targeting the psbB gene of rapeseed protoplasts replaced two cytosines with TCC sequences with an efficiency of 0.36% to 4.1% ( FIG. 25 ).
  • a plasmid encoding mt-DdCBE targeting the atp6 gene of lettuce and rapeseed and the rps14 gene of rapeseed was prepared (using the Golden Gate cloning system), and the plasmid was introduced into the protoplasts of lettuce and rapeseed. After 7 days of introduction, the nucleotide correction efficiency was measured through deep sequencing ( FIGS. 20e , f , 26 ).
  • the off-target of TALE deaminase targeting the 16S rRNA site was analyzed in protoplasts, callus, and chute.
  • Five potential off-target positions selected based on the sequence similarity in the target site (50 base pairs on both sides) (Fig. 31) or chloroplast genes in callus and suits derived from single cells and having antibiotic resistance (Fig. 32) It was measured that the off-target was not visible.
  • the off-target in which TC was changed to TT was induced with a low efficiency of 1.2% to 4.1% in three of the five potential off-targets.
  • DddA-derived cytosine base correctors including the cleaved bacterial toxin DddAtox, a transcription activator-like effector (TALE) designed to bind to DNA, and a uracil glycosylase inhibitor (UGI), are targeted to modify cytosine-thymine bases.
  • TALE transcription activator-like effector
  • UMI uracil glycosylase inhibitor
  • MT-ND5 encoding a subunit of NADH dehydrogenase that catalyzes NADH dehydration and electron transfer to ubiquinone, which is a mutation associated with human mitochondrial disease, such as m.G12918A. and mutations that make an early stop codon such as m.C12336T.
  • a mitochondrial disease model could be produced in mice, and the possibility of treating mitochondrial disease was presented.
  • Plasmid assembly The TALEN (transcription activator-like effector nucleases) system was borrowed to construct the expression plasmid containing the DddA half and the final TALE-DddAtox construct.
  • the nuclear transport signal and monomers in the FokI dimer were substituted with a mitochondrial transduction signal (MTS), a DddA deaminase half and a uracil glycosylase inhibitor (UGI). Sequences encoding MTS, DddA, and UGI were synthesized in IDT.
  • MTS mitochondrial transduction signal
  • UGI uracil glycosylase inhibitor
  • the purified gene fragment was assembled using the HiFi DNA assembly kit (NEB), chemically transformed into E coli DH5a (Enzynomics), and confirmed by Sanger sequencing.
  • NEB HiFi DNA assembly kit
  • E coli DH5a Enzynomics
  • Sanger sequencing eight different expression plasmids were obtained, in which the BsaI restriction site for Golden-gate cloning was between the sequences encoding the N- and C-terminal domains.
  • the expression plasmid was loaded with a modular vector (each encoding a TALE sequence), BsaI-HFv2 (10 U), T4 DNA ligase (200 U) and reaction buffer in one tube.
  • restriction enzyme and ligase reactions were repeated 20 times at 37°C for 5 minutes and 50°C for 5 minutes in a thermocycler, followed by treatment at 50°C for 15 minutes and 80°C for 5 minutes.
  • the conjugated plasmid was introduced into E coli DH5 ⁇ through chemical transformation, and the final construct was confirmed by Sanger sequencing. Plasmids were mid-prep for cell line introduction.
  • NIH3T3 CRL-1658, American Type Culture Collection (ATCC)
  • ATCC American Type Culture Collection
  • DMEM Gibco
  • v/v 10% bovine serum
  • lipofection cells were started to grow 18-24 hours before transfection at a density of 1.5 ⁇ 10 4 cells on 12-well cell culture plates (SPL, Seoul, Korea).
  • SPL 12-well cell culture plates
  • Lipofectamine 3000 Invitrogen
  • 500 ng of each DdCBE fragment was used to introduce a total of 1,000 ng of plasmid DNA. Cells were harvested 4 days after transfection.
  • mRNA production The mRNA template was PCR amplified using Q5 DNA polymerase (NEB), and the following primers were used (F: 5'-CATCAA TGGGCGTGGATAG-3'SEQ ID No. 268, R: 5'-GACACCTACTCAGACAATGC-3 SEQ ID No. 269).
  • DdCBE mRNA was synthesized using an in vitro RNA transcription kit (mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra kit, Ambion) and then purified using the MEGAclear kit (Ambion).
  • mice All experiments involving mice were carried out with the approval of the Animal Care and Use Committee of the Institute for Basic Science. Superovulated C57BL/6J females were bred with C57BL/6J males, and ICR strain females were used as surrogates. Mice were housed in a specific pathogen-free facility under conditions of 12 h day-night cycle and constant temperature and humidity conditions (20–26 °C, 40–60%).
  • Microinjection into mouse zygotes Superovulation, embryo collection, and microinjection, the processes just before microinjection, were carried out as described in the previous paper.
  • a mixture containing left DdCBE mRNA (300 ng/ ⁇ l) and right DdCBE mRNA (300 ng/ ⁇ l) was diluted in DEPC-treated injection buffer (0.25 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 7.4), The zygote was injected into the cytoplasm using a Nikon ECLIPSE Ti micromanipulator and a FemtoJet 4i microinjector (Eppendorf).
  • Genotyping Embryos and tissues at the blastocyst stage were placed in a digestion buffer (25 mM NaOH, 0.2 mM EDTA, pH 10) and incubated at 95 °C for 20 minutes. The pH was adjusted to 7.4 as much as possible. DNeasy Blood & Tissue Kits (Qiagen) were used to isolate genomic DNA from pups, and analyzed by Sanger sequencing and targeted deep sequencing.
  • the precipitate was dissolved in 20 ⁇ l of a solution (25 mM NaOH, 0.2 mM EDTA, pH 10) and then boiled at 95 ⁇ C for 20 minutes. To lower the pH, 2 ⁇ l of 1 M HEPES (free acids, without pH adjustment) was added to the mitochondrial lysate. 1 ⁇ l of the thus prepared solution was used as a PCR template strand for high-throughput sequencing analysis.
  • DdCBE plasmid assembly To facilitate assembly of the custom-designed TALE sequence in DdCBE, an expression plasmid encoding the split DddAtox halves was constructed, resulting in a total of 424 (6 ⁇ 64 3 sequence recognition + 2 ⁇ 16 2 sequence recognition + 2) The Golden-Gate cloning system using ⁇ 4 1 sequence recognition) was used ( FIG. 33A ). As shown in Table 4, a ready-to-use DdCBE plasmid was prepared by mixing 6 TALE plasmids and an expression plasmid in the same tube, and had 15.5-18.5 repeat variable diresidue sequences (FIG. 38).
  • DdCBE recognizes 17-20 DNA sequences, including the conserved thymine sequence at the 5' end.
  • a fully functional DdCBE pair recognizes a total of 32 to 40 DNA sequences.
  • the ND5 gene encoding the Mus musculus mitochondrial NADH-ubiquinone oxidoreductase chain 5 protein was selected.
  • the ND5 protein is a key subunit of NADH dehydrogenase (ubiquinone), which catalyzes the transfer of electrons from NADH to the respiratory chain.
  • Mutations in the ND5 gene in humans are known to be associated with mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes (MELAS), and are also known to be associated with some symptoms of Leigh syndrome or Leber's hereditary optic neuropathy (LHON).
  • MELAS mitochondrial encephalomyopathy
  • MELAS lactic acidosis
  • LHON hereditary optic neuropathy
  • DdCBE plasmids were assembled, which were designed to induce two silent mutations, m.C12539T and m.G12542A.
  • This plasmid was transfected into the NIH3T3 mouse cell line, and the frequency of base correction was measured 3 days later.
  • the target range of cytosine bases was corrected with thymine with an efficiency of up to 19% ( FIG. 34A ).
  • DddAtox exclusively deaminates only cytosines in the “TC” sequence, but only two cytosines in the TC context were corrected in the experimental results. Indels or other types of point mutations were not significantly generated within the calibration target range.
  • TALE-DddAtox deaminase efficiently generated base translocations from C * G to T * A, with an efficiency of 2.2 to 25% in m.C12539 and 0.63 to 5.8% in m.G12542. Thereafter, DdCBE-injected embryos were transplanted into surrogate mothers to obtain progeny having m.C12539T and m.G12542T ( FIG. 39 ). 3 of 4 pups (F0) had C*G to T*A corrections, ranging from 1 to 27% (Fig. 34c). The two pups showed similar mutation levels in the toes and tail, and the efficiency was maintained 14 days after birth.
  • mice were transplanted into surrogate mothers, and progeny having m.C12336T and m.G12341A mutations were obtained ( FIG. 39c ).
  • Nine F0 mice (23%) out of a total of 27 showed C * G to T * A correction, and the efficiency ranged from 0.22 to 57% (Fig. 37d,e), through which the nonsense mutation of ND5 showed embryo culling. It can be seen that it does not cause

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Abstract

본 발명은 분리된 형태의 시토신 또는 아데닌 탈아미노효소 또는 이의 변이체, 비독성 전장 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체, 이를 포함하는 융합단백질, 염기 교정용 조성물 및 이를 이용하여 염기를 교정하는 방법에 관한 것이다.

Description

표적화된 탈아미노효소 및 이를 이용한 염기 교정
본 발명은 분리된 형태의 시토신 또는 아데닌 탈아미노효소 또는 이의 변이체, 비독성 전장 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체, 이를 포함하는 융합단백질, 염기 교정용 조성물 및 이를 이용하여 염기를 교정하는 방법에 관한 것이다.
DNA 결합 단백질과 탈아미노효소가 연결된 융합단백질은 DNA 이중 가닥 절단 (DSBs)을 생성하지 않고 유전체에서 표적화된 뉴클레오타이드 치환 또는 염기 교정(base editing), 유전적 장애를 유발하는 점 돌연변이를 교정하거나 원핵세포, 인간 및 다른 진핵세포에 목적하는 단일 뉴클레오타이드 변이를 도입하도록 표적화된 방식(targeted manner)으로 단일 뉴클레오타이드 전환을 가능하게 한다.
표적 부위에 작은 삽입 또는 결실(indels)을 유도하는 CRISPR-Cas9와 같은 뉴클레아제와 달리 표적 부위에서의 수 개의 뉴클레오타이드 (window of several nucleotides) 내에서 단일 염기를 변환시킨다. 따라서, 배양 세포, 동물 및 식물에서 유전 질환을 유발하는 점 돌연변이를 교정하거나 단일 염기 다형성 (SNP)을 생성할 수 있다.
DNA 결합 단백질과 탈아미노효소가 연결된 융합단백질로 1)　S.　pyogenes에서 유래하는 촉매적으로 결핍된 Cas9 (catalytically-deficient Cas9; dCas9) 또는 D10A Cas9 니케이즈 (nCas9)와, 래트의 시토신 탈아미노효소인 rAPOBEC1를 포함하는 베이스 에디터 (Base Editors; BEs); 2) dCas9 또는 nCas9와, 바다칠성장어(sea lamprey)의 AID (activation-induced cytidine　deaminase) ortholog인 PmCDA1 또는 인간 AID를 포함하는 Target-AID; 3) MS2-결합 단백질에 융합된 과활성화된 AID 변이체를 모집하기 위해 MS2 RNA 헤어핀에 연결된 sgRNAs와 dCas9를 포함하는 CRISPR-X 등이 예시될 수 있다.
이와 같이 ZFN (zinc-finger nuclease), TALEN (transcription activator-like effector nuclease), CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat) 시스템 및 핵산분해 효율이 없는 크리스퍼 연관 단백질 9 (Cas9) 변이체와 염기 탈아미노효소 단백질의 염기 교정 기술 등의 프로그램 (설정) 유전체 교정 도구들은 염기 서열의 변화를 통하여 식물의 유전적 연구와 작물 형질 개선에 발전되어 왔다. 그러나 이러한 도구들은 미토콘드리아와 엽록체를 포함한 식물 세포 기관의 DNA 서열을 교정하기에는 적합하지 않은데, 그 주된 이유는 가이드 RNA를 소기관으로 전달하거나, 두 화합물을 소기관에서 동시에 발현하는 것이 어렵기 때문이다. 식물 소기관은 광합성 및 호흡에 필요한 여러 필수적인 유전자를 암호화하고 있다. 이러한 소기관의 유전자를 교정하는 방법이나 도구는 이러한 유전자의 기능 연구나 작물 생산성과 형질 개선에 매우 필요하다. 예를 들어, 미토콘드리아 atp6 유전자의 표적 돌연변이는 번식에 유용한 특성인 웅성불임을 유발할 수 있고, 엽록체 게놈의 16S rRNA 유전자의 특정 점 돌연변이는 항생제 내성을 유발할 수 있다.
박테리아 독소 DddAtox는 Burkholderia cenocepacia에서 유래된 박테리아 독소의 효소 기능을 맡는 부분으로, 이중 나선 DNA의 시토신을 탈아미노화 할 수 있다. 탈아미노효소의 예시로, DddAtox는 세포에 독성이 있기 때문에 숙주세포에서의 독성을 피하기 위해, DddAtox는 두 개의 비활성화된 분할체(split)로 나누어 사용하는데, 각각의 반체는 DNA에 결합할 수 있도록 고안된 DNA 결합 단백질에 연결하여 기능을 갖춘 DdCBE 쌍으로써 사용할 수 있다.
원리적으로는 이러한 탈아미노화의 효소 반응은 두 개의 비활성화된 반체가 DNA 결합 단백질에 의해 목표 DNA 위에 가깝게 존재하여야 활성화되게 된다. 따라서 시토신에서 티민으로의 염기 교정은 두 개의 DNA 결합 단백질 결합 자리의 중간에서 일어나게 된다. DNA 결합 단백질로 TALE (transcription activator-like effector) 어레이에 결합된 두 개의 비활성 형태는 TALE에 의해 표적 DNA에 근처에서 결합될 때에 기능을 가진다. 시토신에서 티민으로 염기 변환은 두 TALE 결합 부위 사이의 14~18개 염기 사이의 영역에서 유도된다. 이러한 두개로 나눈 분할 형태 DddAtox는 실험에 많은 제약이 따른다.
전장 DddAtox는 독성 때문에 일반적인 대장균을 이용한 클로닝은 불가능하고 독성을 방해하는 면역 (immunity) 유전자를 함께 발현하는 대장균을 사용하여 클로닝한다.
한편, 미토콘드리아 DNA는 세포 호흡에 아주 중요한 역할을 하는데, 미토콘드리아 산화적 인산화 (OXPHOS) 기작을 통해 이루어진다. OXPHOS 기작은 생존에 필수적이기 때문에, 미토콘드리아 DNA의 돌연변이는 많은 에너지를 요구하는 조직과 같은 여러 장기나 근육에 심각한 기능 부전을 일으킬 수 있다. 주로 사람의 미토콘드리아 질병에서, 정상 미토콘드리아 DNA와 단일 염기 돌연변이가 있는 미토콘드리아 DNA는 공존하는데, 이는 미토콘드리아 DNA의 수적인 이형 상태(헤테로플라스미)를 일으킨다. 돌연변이와 정상 미토콘드리아 DNA의 균형이 임상적인 증상이 있는 미토콘드리아 질병의 발달을 결정한다. 생체 외 및 생체 내에서, 프로그래밍이 가능한 핵산가수분해효소를 돌연변이 미토콘드리아 DNA는 자르고 정상 미토콘드리아 DNA를 제거하지 않는 방식으로 사용하고 있었다. 그러나, 이러한 핵산가수분해효소는 특정한 돌연변이를 미토콘드리아에 도입하거나 되돌릴 수는 없는데, 미토콘드리아에서 DNA의 이중 가닥 절단이 핵과 같이 비상동 말단접합이나 상동 재조합을 통해 효율적으로 복구되지 않기 때문일 것이다.
미토콘드리아 염기 교정을 통해 지금까지 시도되지 못했던 다양한 질병들에 대한 모델을 만들거나, 이를 치료하는 치료제를 제작하는데 도움을 줄 수 있다. 이러한 측면에서 고효율의 미토콘드리아 염기 교정 효소의 개발의 필요성이 증대되고 있다.
이러한 기술적 배경하에서, 탈아미노화 효소의 잔기를 치환하여 비선택적인 염기 교정을 줄이거나, 신규 전장 탈아미노효소를 통해 독성을 가지지 않도록 하여, 목적하는 CBE(cytosine base editor) 또는 ABE(adenine base editor)로 사용할 수 있으며, DNA를 교정할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 DNA 결합 단백질, 분리된 형태의 시토신 또는 아데닌 탈아미노효소 또는 이의 변이체, 비독성 전장 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질을 제공하는데 있다.
본 발명의 목적은 상기 융합단백질을 코딩하는 핵산을 제공하는데 있다.
본 발명의 목적은 상기 융합단백질 또는 핵산을 포함하는 염기 교정용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 목적은 상기 조성물을 세포에 처리하는 단계를 포함하는 염기 교정 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (i) DNA 결합 단백질; 및 (ii) 시토신 탈아미노효소 (deaminase) 또는 이의 변이체 유래인 제1분할체 및 제2분할체를 포함하는 융합단백질로, 상기 제1분할체 및 제2분할체는 각각 상기 DNA 결합 단백질에 결합되는 형태인 융합단백질을 제공한다.
본 발명은 (i) DNA 결합 단백질; 및 (ii) 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체 유래 비독성 전장 시토신 탈아미노효소를 포함하는 융합단백질을 제공한다.
본 발명은 (i) DNA 결합 단백질; (ii) 시토신 탈아미노효소 (deaminase) 또는 이의 변이체; 및 (iii) 아데닌 탈아미노효소를 포함하는 융합단백질로, 상기 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체는 (a) 비독성 전장 시토신 탈아미노효소 또는 (b) 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체 유래인 제1분할체 및 제2분할체를 포함하고, 상기 제1분할체 및 제2분할체는 각각 상기 DNA 결합 단백질에 결합되는 형태인, 융합단백질을 제공한다.
본 발명은 상기 융합단백질을 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 상기 융합단백질 또는 핵산을 포함하는 염기 교정용 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 융합단백질 또는 핵산을 포함하는 진핵세포 염기 교정용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 융합단백질 또는 핵산; 및 NLS (nuclear localization signal) 펩타이드 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 식물세포 염기 교정용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 융합단백질 또는 핵산; 및 엽록체 전달 펩타이드(chloroplast transit peptide) 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 식물세포 염기 교정용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 융합단백질 또는 핵산; 및 미토콘드리아 전달 단백질 (Mitochondrial Targeting Signal, MTS) 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 식물세포 염기 교정용 조성물을 제공한다.
경우에 따라서 본 발명은 또한, 핵외 수송 신호 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는, 식물세포 염기 교정용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 조성물을 식물세포에 처리하는 단계를 포함하는 식물세포 염기 교정방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 융합단백질 또는 핵산; 및 NLS (nuclear localization signal) 펩타이드 또는 이를 코딩하는 핵산을 식물세포에 처리하는 단계를 포함하는 식물세포 염기 교정방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 융합단백질 또는 핵산; 및 엽록체 전달 펩타이드(chloroplast transit peptide) 또는 이를 코딩하는 핵산을 식물세포에 처리하는 단계를 포함하는 식물세포 염기 교정방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 융합단백질 또는 핵산; 및 미토콘드리아 전달 단백질 (Mitochondrial Targeting Signal, MTS) 또는 이를 코딩하는 핵산을 식물세포에 처리하는 단계를 포함하는 식물세포 염기 교정방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 융합단백질 또는 핵산; 및 NLS (nuclear localization signal) 펩타이드 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는, 동물세포 염기 교정용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 융합단백질 또는 핵산; 및 미토콘드리아 전달 단백질 (Mitochondrial Targeting Signal, MTS) 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는, 동물세포 염기 교정용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 경우에 따라서 핵외 수송 신호 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는, 동물세포 염기 교정용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 조성물을 동물세포에 처리하는 단계를 포함하는 동물세포 염기 교정방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 융합단백질 또는 핵산; 및 NLS (nuclear localization signal) 펩타이드 또는 이를 코딩하는 핵산을 동물세포에 처리하는 단계를 포함하는 동물세포의 염기 교정방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 융합단백질 또는 핵산; 및 미토콘드리아 전달 단백질 (Mitochondrial Targeting Signal, MTS) 또는 이를 코딩하는 핵산을 동물세포에 처리하는 단계를 포함하는 동물세포의 염기 교정방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 융합단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 원핵세포 또는 진핵세포에서의 A-to-G 염기 교정용 조성물로, 상기 DNA 결합 단백질은 징크 핑커 단백질 (zinc finger protein), TALE 단백질 또는 CRISPR 연관 뉴클레아제이고, 상기 융합단백질의 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체는 박테리아 유래이고, 이중 가닥 DNA 특이적인 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 융합단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 원핵세포 또는 진핵세포에서의 A-to-G 염기 교정용 조성물로, 상기 DNA 결합 단백질은 징크 핑커 단백질 (zinc finger protein), TALE 단백질 또는 CRISPR 연관 뉴클레아제이고, 상기 융합단백질의 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체는 박테리아 유래이고, 이중 가닥 DNA 특이적인 것이며, 상기 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체의 N 말단에 DNA 결합 단백질이 결합되어 있고, 상기 융합단백질의 아데닌 탈아미노효소의 C 말단에 DNA 결합 단백질이 결합되어 있는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 융합단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 및 UGI (uracil glycosylase inhibitor)를 포함하는 원핵세포 또는 진핵세포에서의 C-to-T 염기 교정용 조성물로, 상기 DNA 결합 단백질은 징크 핑커 단백질 (zinc finger protein), TALE 단백질 또는 CRISPR 연관 뉴클레아제이고, 상기 융합단백질의 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체는 전장 비독성 시토신 탈아미노효소이고, 상기 융합단백질의 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체는 박테리아 유래이고, 이중 가닥 DNA 특이적인 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 융합단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 및 UGI (uracil glycosylase inhibitor)를 포함하는 원핵세포 또는 진핵세포에서의 C-to-T 염기 교정용 조성물로, 상기 DNA 결합 단백질은 징크 핑커 단백질 (zinc finger protein), TALE 단백질 또는 CRISPR 연관 뉴클레아제이고, 상기 융합단백질의 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체는 제1분할체 및 제2분할체를 포함하는 분할 시토신 탈아미노효소이고, 상기 융합단백질의 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체는 박테리아 유래이고, 이중 가닥 DNA 특이적인 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 융합단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 원핵세포 또는 진핵세포에 처리하는 단계를 포함하는 원핵세포 또는 진핵세포에서의 A-to-G 염기 교정 방법으로, 상기 DNA 결합 단백질은 징크 핑커 단백질 (zinc finger protein), TALE 단백질 또는 CRISPR 연관 뉴클레아제이고, 상기 융합단백질의 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체는 박테리아 유래이고, 이중 가닥 DNA 특이적인 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 융합단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 원핵세포 또는 진핵세포에 처리하는 단계를 포함하는 원핵세포 또는 진핵세포에서의 A-to-G 염기 교정 방법으로, 상기 DNA 결합 단백질은 징크 핑커 단백질 (zinc finger protein), TALE 단백질 또는 CRISPR 연관 뉴클레아제이고,
상기 융합단백질의 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체는 박테리아 유래이고, 이중 가닥 DNA 특이적인 것이며,
상기 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체의 N 말단에 DNA 결합 단백질이 결합되어 있고, 상기 융합단백질의 아데닌 탈아미노효소의 C 말단에 DNA 결합 단백질이 결합되어 있는, 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 융합단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 및 UGI (uracil glycosylase inhibitor)를 원핵세포 또는 진핵세포에 처리하는 단계를 포함하는 원핵세포 또는 진핵세포에서의 C-to-T 염기 교정 방법으로, 상기 DNA 결합 단백질은 징크 핑커 단백질 (zinc finger protein), TALE 단백질 또는 CRISPR 연관 뉴클레아제이고, 상기 융합단백질의 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체는 박테리아 유래이고, 이중 가닥 DNA 특이적인 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
도 1은 pTarget 플라스미드를 이용한 ZFD 최적화 결과를 나타낸 것이다.
a, ZFD 구조. Split-DddAtox 반쪽은 ZFP(Zinc Finger Protein: C 유형)의 C 말단에 융합된다. b, pTarget 라이브러리를 사용한 ZFD 플랫폼 최적화. pTarget 플라스미드는 크기가 1 ~ 24bp(빨간색으로 표시됨) 범위의 스페이서 및 ZFP DNA 결합 부위(녹색으로 표시됨) 영역을 포함한다. ZFD 구조에는 다양한 길이의 AA 링커(노란색 및 주황색으로 표시)와 다른 DddAtox 분할 사이트 및 방향(파란색으로 표시)이 포함되어 있다. c-d, ZFD 활성은 (b)에 설명된 변수들의 영향을 조사하기 위해 pTarget 라이브러리의 타겟 부위에서 측정되었다. 왼쪽 및 오른쪽 ZFD에서 동일한(c) 또는 다른(d) 길이의 링커가 있는 ZFD 쌍을 테스트했다. 염기 교정 빈도는 pTarget 플라스미드의 해당 영역에 targeted deep 시퀀싱에 의해 측정되었다. 데이터는 n=2 생물학적으로 독립적인 샘플에서 얻은 평균(s.e.m.)의 평균 ± 표준 오차로 표시된다.
도 2는 pTarget 플라스미드에서의 다양한 링커를 가지는 ZFD 효율을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
a, 히트 맵에 묘사된 1-24bps의 길이를 갖는 다양한 pTarget 스페이서에서 C/G에서 비 C/G로 교정되는 빈도. ZFP와 분할된 DddAtox 사이의 있는 여러가지 종류의 링커와 DddAtox가 분할된 부위 등 다양한 ZFD 구성이 테스트되었다. b, 각 ZFD 쌍의 전체적인 활성. x축에 사용된 명명법에서 밑에는 왼쪽 ZFD가 위는 오른쪽 ZFD가 표시되어있다. c, 스페이서 길이에 따른 염기 교정 효율. "AA"는 링커에 있는 아미노산의 수를 나타낸다. 데이터는 n=2 생물학적으로 독립적인 샘플에서 얻은 평균(s.e.m.)의 평균 ± 표준 오차로 표시.
도 3은 24AA 링커와 다른 링커를 가지는 ZFD의 효율을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
히트 맵에 표시된 C/G에서 비 C/G로의 교정 효율에 대한 ZFD 링커 길이의 영향. ZFD 쌍의 왼쪽 ZFD는 24개의 AA 링커로 고정하고 오른쪽 ZFD는 가변 길이의 링커를 포함, 그 반대의 경우도 마찬가지. 오차 막대는 n = 2개의 생물학적으로 독립적인 샘플에 대한 평균(s.e.m.)의 표준 오차
도 4는 생체내 핵을 표적하는 ZFD의 활성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
a, 핵 DNA 타겟 ZFD의 구조. Split-DddAtox 반쪽은 ZFP의 C 말단(C 유형) 또는 N 말단(N 유형)에 융합된다. ZFD 쌍은 CC 또는 NC 구성으로 설계되었으며, 각각 C형 왼쪽 ZFD와 C형 오른쪽 ZFD 또는 N형 왼쪽 ZFD와 C형 오른쪽 ZFD로 구성된다. b, HEK 293T 세포의 핵 DNA 타겟 부위에서 ZFD에 의해 유도된 염기 교정 빈도. 데이터는 n=3 생물학적으로 독립적인 샘플에서 평균 ± s.e.m으로 표시. c-f, HEK 293T 세포의 NUMBL(c), INPP5D-2(d), TRAC-CC(e) 및 TRAC-NC(f) 타겟 부위의 스페이서 내의 각 염기 위치에서 ZFD 유도 염기 교정 효율. 데이터는 n=3 생물학적으로 독립적인 샘플에서 평균 ± s.e.m으로 표시. g, 전기천공 또는 직접전달 방식으로 ZFD 단백질 또는 ZFD 인코딩 플라스미를 전달 후 K562 세포에서 ZFD 유도 염기 교정 빈도. 하나 또는 네 개의 NLS가 있는 ZFD 단백질을 테스트했으며 왼쪽 및 오른쪽 ZFD를 등몰랄로 사용했다. 전기천공 방식의 경우 Amaxa 4D-Nucleofector를 사용하여 수행했다. 직접적인 전달 방법의 경우, K562 세포를 왼쪽 및 오른쪽 ZFD 단백질을 함유하는 세포 배지와 함께 인큐베이션하였다. 세포는 동일한 방식으로 한 번(1x) 또는 두 번(2x) 처리되었다. 생물학적으로 독립적인 n=2 샘플에서 데이터는 평균 ± s.e.m으로 표시
도 5는 핵 DNA를 표적하는 ZFD의 구성을 나타낸 모식도이다. a-d, 네 가지 가능한 ZFD 구성. NC 및 CN 구성은 구조적으로 동일하지만 왼쪽 및 오른쪽 ZFD 구성의 유형이 다르다.
도 6은 생체내 핵 타켓하는 ZFD의 Indel률을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 테스트된 모든 ZFD는 0.4% 미만의 빈도로 indel을 생성했다. 데이터는 n=3 생물학적으로 독립적인 샘플에서 평균 ± s.e.m으로 표시.
도 7은 In-vitro ZFD 재조합 단백질에 대한 활성 테스트 결과를 나타낸 것이다.
a, TRAC 사이트를 대상으로 하는 ZFD 쌍의 정제 단계. GST 태그가 붙은 단백질은 글루타티온 세파로스 비드를 사용하여 E. coli 세포 용해물에서 정제되었다. 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용하여 정제 단계를 모니터링했다. 젤은 쿠마시 블루로 염색되었다. 레인 1, 분자량 마커. 레인 2, 단백질 발현이 IPTG로 유도되지 않은 세포의 샘플. 레인 3, 단백질 발현이 IPTG로 유도된 세포의 샘플. 레인 4, 초음파 처리 후 가용성 분획. 레인 5, 초음파 처리 후 불용성 분획. 레인 6, 컬럼의 통과 분획. 레인 6, 세척 분획. 레인 7, 용출 분획. 대표 마커의 크기는 왼쪽에 표시된다. 빨간색 상자는 ZFD 단백질을 나타낸다. b, 왼쪽 및 오른쪽 ZFD 결합 사이트. 빨간색 화살표는 ZFD 유도 탈아미노화에 대한 가능한 사이트를 나타냄. c, TRAC 부위를 포함하는 PCR 앰플리콘에 대한 ZFD 활성 개요. TRAC-NC ZFD 쌍은 먼저 시토신을 탈아미노화하여 우라실(빨간색으로 표시)을 생성한다. 그런 다음 USER 효소는 우라실을 절단하여 틈을 생성한다(빨간색 삼각형으로 표시). d, 아가로스 겔 전기영동으로 분석한 미처리 PCR 앰플리콘(왼쪽)과 ZFD 쌍으로 처리된 PCR 앰플리콘(오른쪽).
도 8은 미토콘드리아 DNA 타켓 ZFD의 여러가지 배열 (configuration)에 대한 모식도이다. a-d, 네 가지 가능한 mitoZFD 구성. 기존 ZFD의 NLS는 MTS 및 NES로 대체되었다. NC 및 CN 구성은 구조적으로 동일하지만 왼쪽 및 오른쪽 ZFD 구성의 유형이 다르다.
도 9는 mitoZFD의 미토콘드리아 유전자 염기 교정 효율을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
a, HEK 293T 세포의 mitoZFD 및 TALE-DdCBE에 의해 유도된 mtDNA의 염기 교정 빈도. 데이터는 n=2 생물학적으로 독립적인 샘플에서 얻은 평균(s.e.m.)의 평균 ± 표준 오차로 표시. b-g, HEK 293T 세포에서, ND2(b), ND4L(c), COX2(d), ND6(e) 및 ND1(f) 타겟 부위의 스페이서 내 각 염기 위치에서의 mitoZFD 유도 염기 교정 효율 과 ND1(g) 표적 부위에서 TALE-DdCBE의 유도 염기 교정 효율. 데이터는 n=2 생물학적으로 독립적인 샘플에서 얻은 평균(s.e.m.)의 평균 ± 표준 오차로 표시. h, mitoZFD와 TALE-DdCBE에 의해 도입된 ND1 유전자의 DNA 변화와 아미노산 변화 비교. 각 돌연변이 대립유전자에 대한 시퀀싱 리드의 빈도(%)는 targeted deep 시퀀싱에 의해 측정되었다. ZFD 쌍 및 TALE-DdCBE 쌍에 대한 스페이서 영역은 파란색 점선으로 표시.
도 10은 MT-ZFD가 처리된 HEK293T 세포에서 분리한 단세포 유래 클론 집단의 염기 교정 효율을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
대립유전자 분석을 위해 단일 세포 유래 클론을 얻었다. 각 단일 세포 유래 클론에서 C/G-to-non-C/G 교정 빈도는 targeted deep 시퀀싱으로 결정되었다. a, ND1 타겟 mitoZFD로 처리된 HEK 293T 세포 집단의 단일 세포 유래 클론. b, ND2 타겟 mitoZFD로 처리된 HEK 293T 세포 집단의 단일 세포 유래 클론. c, 미처리 HEK 293T 세포 집단의 단일 세포 유래 클론. ZFP 결합 사이트는 녹색으로 표시된다. mitoZFD 유도 교정을 거친 클론의 높은 교정 빈도는 빨간색으로 표시된다.
도 11은 MT-ZFD가 처리된 HEK293T 세포에서 분리한 단세포 유래 클론 집단의 염기 교정 효율을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
높은 빈도의 염기 교정을 나타내는 단일 세포 유래 클론의 대립유전자 분석. 표는 ND1에서 염기 교정의 결과로 변경된 아미노산을 보여준다. 상단의 참조 시퀀스에서 빨간색 문자는 스페이서를 나타낸다. 대립 유전자에서 빨간색 문자는 아미노산 서열의 변화를 나타낸다. (*는 정지 코돈을 나타낸다.)
도 12a 및 도 12b는 MT-ZFD가 처리된 HEK293T 세포에서 분리한 단세포 유래 클론 집단의 염기 교정 효율을 확인한 결과를 나타낸 것이다. 높은 빈도의 염기 교정을 나타내는 단일 세포 유래 클론의 대립유전자 분석. 표는 ND2에서 염기 교정의 결과로 변경된 아미노산을 보여준다. 상단의 참조 시퀀스에서 빨간색 문자는 스페이서를 나타낸다. 대립 유전자에서 빨간색 글자는 아미노산 서열의 변화를 나타낸다.
도 13은 ZFD와 TALE-DdCBE의 조합에 의한 염기 교정 효율을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
a, mitoZFD 및 TALE-DdCBE 쌍의 결합 영역의 DNA 서열. TALE-DdCBE에 의해 인식되는 사이트는 녹색으로 강조 표시되고 mitoZFD에 대해서는 파란색으로 강조 표시된다. 상단 서열은 mtDNA heavy strand를 나타내고 하단 서열은 mtDNA light strand를 나타낸다. b, ZFD, TALE-DdCBE 및 ZFD/DdCBE 혼합 쌍에 의해 교정된 시토신의 빈도. Targeted deep 시퀀싱을 사용하여 데이터를 얻었으며 데이터는 n=2 생물학적으로 독립적인 샘플에서 얻은 평균(s.e.m.)의 평균 ± 표준 오차로 표시. c, 각 염기 위치에서 염기 교정 활성의 히트 맵. 빨간색 상자는 각 구성에 대한 스페이서 영역을 나타낸다. 파란색 화살표는 mtDNA의 위치를 나타낸다.
도 14는 ZFD 농도별, mRNA vs Plasmid에 따른 교정 효율을 확인한 결과를 나타낸 것이다. ND1 타겟 mitoZFD의 미토콘드리아 게놈 전체 타겟 특이성은 ZFD를 인코딩하는 mRNA 또는 플라스미드의 농도에 따라 다른 특이성을 가진다. mtDNA 전체 시퀀싱에 의해 결정된 on- 및 off- 타겟 염기 교정 빈도. 표시된 농도의 ND1-타겟 mitoZFD-인코딩 플라스미드 또는 mRNA로 트랜스펙션한 HEK 293T 세포의 결과가 그래프 점으로 표시됨. 빨간색 화살표는 타겟 사이트를 나타내고 빨간색 점은 타겟 사이트의 염기 교정 빈도를 나타내며 회색 점은 컨트롤에도 존재하는 SNP를 나타냄. 데이터는 n=2 생물학적으로 독립적인 샘플에서 얻은 평균(s.e.m.)의 평균 ± 표준 오차로 표시.
도 15는 ZFD 농도별, mRNA vs Plasmid에 따른 교정 효율을 확인한 결과를 나타낸 것이다. a, 상단의 도면은 ND1 사이트에서 ZFD 결합을 보여준다. ZFD 결합 사이트는 녹색으로 표시된다. 스페이서 사이에 있는 타겟 시토신은 빨간색으로 표시된다. 도 14의 전체 mtDNA 시퀀싱 데이터에서 결정된 on-타겟 활성. 트랜스펙션된 mitoZFD를 인코딩하는 플라스미드 또는 mRNA의 양이 감소함에 따라 활성이 감소한다. b, 각 플라스미드 또는 mRNA 양에 대해 > 1%의 빈도로 교정되는 C/G 사이트의 수. c, 각 플라스미드 또는 mRNA 농도에 따른 미토콘드리아 게놈의 모든 C/G에 대한 평균 C/G-to-T/A 교정 빈도. 데이터는 n=2 생물학적으로 독립적인 샘플에서 얻은 평균(s.e.m.)의 평균 ± 표준 오차로 표시.
도 16은 ZFD 농도별, mRNA vs Plasmid에 따른 교정 효율을 확인한 결과를 나타낸 것이다. mtDNA 전체 시퀀싱에 의해 결정된 on- 및 off- 타겟 염기 교정 빈도. 표시된 농도의 ND2-타겟 mitoZFD-인코딩 플라스미드 또는 mRNA로 트랜스펙션한 HEK 293T 세포의 결과가 그래프 점으로 표시됨. 빨간색 화살표는 타겟 사이트를 나타내고 빨간색 점은 타겟 사이트의 염기 교정 빈도를 나타내며 회색 점은 컨트롤에도 존재하는 SNP를 나타냄. 데이터는 n=2 생물학적으로 독립적인 샘플에서 얻은 평균(s.e.m.)의 평균 ± 표준 오차로 표시.
도 17은 ZFD 농도별, mRNA vs Plasmid에 따른 교정 효율을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
a, 상단의 도면은 ND2 사이트에서 ZFD 결합을 보여준다. ZFD 결합 사이트는 녹색으로 표시된다. 스페이서 사이에 있는 타겟 시토신은 빨간색으로 표시된다. 도 16의 전체 mtDNA 시퀀싱 데이터에서 결정된 on-타겟 활성. 트랜스펙션된 mitoZFD를 인코딩하는 플라스미드 또는 mRNA의 양이 감소함에 따라 활성이 감소한다. b, 각 플라스미드 또는 mRNA 양에 대해 > 1%의 빈도로 염기 교정되는 C/G 사이트의 수. c, 각 플라스미드 또는 mRNA 농도에 따른 미토콘드리아 게놈의 모든 C/G에 대한 평균 C/G-to-T/A 교정 빈도. 데이터는 n=2 생물학적으로 독립적인 샘플에서 얻은 평균(s.e.m.)의 평균 ± 표준 오차로 표시.
도 18은 미토콘드리아 전체 시퀀싱/QQ 변이체를 제작하고 교정 효율을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
a, QQ mitoZFD 변이체는 ZFD의 각 징크 핑거에 R(-5)Q 돌연변이를 포함하여 비특이적 DNA 접촉을 제거한다. (징크 핑거 프레임워크의 위치 -5에 R이 없으면 근처에 있는 K 또는 R이 Q로 변환된다.) b, mitoZFD 처리 세포의 mtDNA 전체 시퀀싱. On- 및 off- 사이트의 교정 빈도는 각각 빨간색과 검은색 점으로 표시된다. 데이터는 n=2 생물학적으로 독립적인 샘플에서 얻은 평균(s.e.m.)의 평균 ± 표준 오차로 표시. >1%의 효율로 C/G 에서 T/A로 염기 교정된 것은 모두 표시. c-d, 교정 효율 및 특이성은 전달된 ZFD 인코딩 mRNA의 용량에 따라 다르다. c, 미토콘드리아 게놈의 모든 C/G에 대한 평균 C/G-to-T/A 교정 빈도. d, 염기 교정 빈도가 1%를 초과하는 교정된 C/G 수.
도 19. 식물 기반 염기 교정기의 골든 게이트 조립 시스템. cp-DdCBE 및 mt-DdCBE 구조에 대한 골든 게이트 어셈블리의 개략도. 대상 서열의 각 위치에 대해 총 424개의 세트 (= 6 x64 3부 +2 x16 2부 +2 x 4 1부)에서 TALE 서브 어레이 플라스미드를 선택하고 원하는 벡터와 혼합하여 특정 서열을 대상으로 하는 DdCBE을 코딩하는 플라스미드를 생성했다.
도 20. 식물의 엽록체와 미토콘드리아 염기 교정. a, b, c, d, 16s rDNA (a, b) 및 psbA (c, d)에서 cp-DdCBE에 의해 유도된 엽록체 염기 교정 빈도와 패턴. 분할 DdCBE G1333과 G1397의 쌍을 양상추와 유채 원형질체에 형질감염 시켰다. e, fATP6 유전자에서 mt-DdCBE에 의해 유도된 미토콘드리아 염기 교정 효율과 패턴. 분할 DdCBE G1333과 G1397의 쌍을 양상추와 유채 원형질체에 형질감염 시켰다. a, c, e, TALE 결합 영역은 파란색으로 표시, 스페이서의 시토신은 주황색으로 표시. 모든 그래프에서 오차 막대는 평균 ± 표준 편차를 보여준다. 3 개의 독립적인 생물학적 복제물. b, d, f, 변환 된 뉴클레오티드는 빨간색으로 표시. 교정된 대립 유전자 % (평균 ± 표준 편차)은 3 개의 독립적인 실험에서 얻었다.
도 21. DdCBE을 통해 식물 기관 DNA 교정. a, 식물 기관 변이 유발 개략도. b, 대표적인 생어 시퀀싱 크로마토그램을 포함하여, 스펙티노마이신의 부재하에서 배양된 cp-DdCBE 형질감염 캘러스 중 C·G에서 T·A로 변환되는 것에 대한 효율. 변환된 뉴클레오티드 왼쪽에 빨간색으로 표시되어 있다. 화살표는 크로마토그램의 치환 뉴클레오티드를 보여준다. c, DdCBE 구동 식물 기관 변이 유발 요약. 변이 캘러스는 모의 처리된 캘러스에서의 빈도보다 훨씬 높은 교정 빈도를 가지는 것으로 나타난다. d, 16srDNA을 대상으로 cp-DdCBE를 코딩하는 mRNA를 상추 원형질체에 형질감염 후 유도되는 C에서 T로 변환 빈도. 오차 막대는 평균 ± s.d이다. n = 3의 독립적인 생물학적 복제물. e 2.5 개월차 스펙토마이신 내성 캘러스의 교정 빈도 및 패턴. f 대표적인 생어 시퀀싱 크로마토그램을 사용하여 DdCBE mRNA를 형질감염한 스트렙토 마이신 내성 식물 중 C·G에서 T·A로의 변환 효율. 화살표는 크로마토그램의 치환 뉴클레오티드를 보여준다. 스케일 바 : 1mm.
도 22. 엽록체와 미토콘드리아 염기 교정 전략. cp-DdCBE 및 mt-DdCBE 전단백질 (preprotein, 전구체 단백질) 각각에 CTP (chloroplast transit peptide) 또는 MTS (mitochondrial targeting signal)가 포함되어 있기 때문에, 식물세포에서 번역된 후 엽록체 및 미토콘드리아로 운송된다. 전단백질은 세포 소기관의 외막과 내막을 통과하고, CTP 및 MTS는 각각 간질 프로세싱 펩티다제 (peptidase)와 미토콘드리아 프로세싱 펩티다제에 의해 절단된 다음, cp-DdCBE과 mt-DdCBE (성숙 단백질)이 최종 형태 (conformation)을 형성한다.
도 23. 양상추 원형질체에서 DdCBE 플라스미드를 통해 교정하는 것에 대한 시간 경과. 형질감염된 원형질체를 각 시점에서 수집하고 타겟 딥 시퀀싱 (targeted deep sequencing)에 의해 교정 효율성을 분석했다. 빈도 (평균 ± 표준 편차)은 3 번의 독립적인 실험에서 얻었다.
도 24. psbB 유전자의 염기 교정 빈도. 엽록체 psbB 유전자를 표적으로 하는 cp-DdCBE 쌍 Left-G1333-N + Right-G1333-C를 코딩하는 플라스미드를 유채 원형질체에 형질감염한 후 스페이서 영역의 염기 교정 효율을 타겟 딥 시퀀싱에 의해 분석 했다. TALE 결합 영역, 대상 시토신 및 변환된 뉴클레오티드는 각각 파랑, 오렌지 및 빨간색으로 표시되어 있다. 빈도 (평균 ± 표준 편차)은 n = 3 번의 독립적인 실험에서 계산되었다.
도 25. 미토콘드리아 RPS14 유전자의 염기 교정 효율. RPS14 유전자를 대상으로 mt-DdCBE 쌍 Left-G1333-N + Right-G1333-C를 코딩하는 플라스미드를 유채 원형질체에 형질감염한 후 C에서 T로 변환 효율을 타겟 딥 시퀀싱에 의해 분석했다. TALE 결합 영역, 대상 시토신 및 변환된 뉴클레오티드는 각각 파랑, 오렌지 및 빨간색으로 표시되어 있다. 빈도 (평균 ± 표준 편차)은 n = 3 번의 독립적인 실험에서 계산되었다.
도 26. 캘러스에서 엽록체 게놈을 대상으로 하는 염기 교정 효율. 4 주간 배양 후 양상추와 유채 캘러스에서 16srDNA과 psbA 중 표적 부위에 대하여 DdCBE을 통해 염기 교정한 빈도와 패턴. 스페이서 영역의 변환된 뉴클레오티드는 빨간색으로 표시되어 있다.
도 27. 캘러스에서 미토콘드리아 게놈을 대상으로 하는 염기 교정 효율성. 유채 캘러스 중 ATP6 및 RPS14 유전자의 표적 부위에서 DdCBE을 통해 염기 교정의 빈도와 패턴이 타겟 딥 시퀀싱에 의해 확인되었다. 대상 스페이서 영역의 변환 된 뉴클레오티드는 빨간색으로 표시되어 있다.
도 28. DNA 미포함 염기 교정. 상추 원형질체에 DdCBE mRNA를 형질감염 시킨 후 16srDNA 중 타겟 사이트에서의 엽록체 염기 교정의 빈도와 패턴. 원형질체를 7 일간 배양한 후 타겟 딥 시퀀싱을 실행했다. 대상 스페이서 영역의 변환된 뉴클레오티드는 빨간색으로 표시되어 있다.
도 29는 원형질체 및 캘러스 중 DdCBE mRNA 또는 DNA 서열이 존재하지 않음을 보여주는 겔 전기영동 결과를 나타낸 것이다 (M은 마커).
도 30.16srDNA 변이 선별. 빨간색 화살표는 스트렙토마이신 내성 녹색 캘러스를 보여준다.
도 31. 항생제 내성 캘러스나 묘목에서 DdCBE 표적 부위 근처에 오프 타겟 변이는 발견되지 않았다. (a), (b) 오프 타겟 활성은 타겟 딥 시퀀싱에 의해 분석되었다. TALE 결합 부위와 스페이서 영역은 각각 녹색과 빨간색 밑줄로 표시되어 있다. (a) DdCBE 플라스미드를 형질감염한 상추 원형질체에서 배양한 스펙티노마이신 내성 캘러스. (b) 스트렙토마이신 내성의 묘목에서 얻은 슈트 (shoot).
도 32. 온-타겟 사이트와 가장 상동성이 높은 5 개의 사이트에서의 오프 타겟 활성 분석. TALE 결합 부위에 최대 9 개의 불일치를 포함하여, 양상추 엽록체 게놈의 16s rRNA 유전자 특이적 DdCBE 5 개의 잠재적인 오프 타겟 부위와 선택되었다. TALE 결합 서열 및 불일치 뉴클레오티드는 각각 파란색과 빨간색으로 표시되어 있다. 오프 타겟 변이 빈도는 표적 딥 시퀀스를 사용하여 DdCBE 플라스미드 또는 DdCBE mRNA로 형질감염된 원형질체 및 약제 내성 캘러스 또는 슈트에서 측정되었다. 빈도 (평균 ± 표준 편차)은 3 번의 독립적인 실험에서 얻었다.
도 33. DdCBE 조립 및 미토콘드리아 DNA 교정의 모식도. a 효율적인 DdCBE 구축을 위한 one-pot Golden-gate 조립의 설명. 최종 플라스미드 제작을 위한 왼쪽 및 오른쪽 모듈을 제작하기 위해 총 424개의 서열 (64개의 3개 서열 인식 서열 × 6 + 16개의 2개 서열 인식 서열×2 + 4개의 1개 서열 인식 서열 ×2) 및 발현 벡터를 섞었다. b 생쥐 미토콘드리아 DNA의 목표 유전자 ND5와 DdCBE가 상호작용하는 모식도. TALE 결합 부위는 회색으로, 염기 교정 범위는 검은색으로 표시되었다. 각각의 repeat variable diresidue module은 주황색, 파란색, 녹색 및 노란색으로 표시되었는데, 순서대로 아데닌 “NI”, 티민 “NG”, 구아닌 “NN”, 및 시토신 인식을 위한 “HD”이다.
도 34. DdCBE로 인한 염기 교정으로 생긴 생쥐 미토콘드리아 ND5 점 돌연변이. a DdCBE 탈아미노화 효소로 매개된 시토신에서 티민으로의 염기 교정 목표 서열 및 NIH3T3 세포에서의 효율. 목표 서열에서 번역 코돈은 밑줄 표시되어 있고 교정이 가능한 부위는 빨간색으로 표기되어 있다. DdCBE 형질 감염을 위한 조합은 left 또는 right, -G1333 또는 -G1397, 및 -N 또는 -C로 표기되어 있다. left-G1333-N + right-G1333-C, left-G1333-C + right-G1333-N, left-G1397-N + right-G1397-C, 및 left-G1397-C + right-G1397-N의 C10 돌연변이에 대한 P 값은 각각 순서대로 0.0012, 0.0003, 0.0014, 및 0.0009 이고, C13 돌연변이는 순서대로 0.0116, 0.0076, 0.0030, 및 0.0003이다(*p < 0.05 및 **p < 0.01, Student’s two-tailed t test 사용). b 이에 따른 생쥐 배반포에서의 염기 교정 효율. 서열 분석 데이터는 left-G1397-N과 right-G1397-C DdCBE mRNA를 미세주입한 접합체로부터 발달된 배반포로부터 얻었다. c 새로 태어난 새끼의 돌연변이 서열 정렬 도면. 타겟화 딥 시퀀싱 (Targeted deep sequencing)은 태어나자마자 얻은 꼬리 부위 및 생후 7일, 14일 후 발가락에서 얻은 조직으로에서 유전체 DNA를 추출하여 수행하였다. 교정된 염기는 빨간색으로 표시되었다. 돌연변이 미토콘드리아 유전체의 교정 빈도가 표시되었다. d 성체 F0 생쥐(sipup-1)의 다양한 조직에서의 교정 효율. 시퀀싱 데이터는 생후 50일에 각 조직에서 얻었다. 모든 그래프에서 진한 회색 막대와 밝은 회색 막대는 각각 m.C12539T(C10) 및 m.G12542A(C13) 돌연변이의 교정 빈도를 나타낸다. 오차 막대는 n = 3개의 생물학적으로 독립적인 샘플에 대한 평균(s.e.m.)의 표준 오차이다.
도 35. 돌연변이 미토콘드리아 DNA의 생식 세포로의 전달. a mtDNA 돌연변이의 생식선 전달을 관찰하기 위해 암컷 F0(sipup-3) 생쥐와 야생형 C57BL6/J 수컷을 교배하여 F1 자손(101, 102)을 얻은 후, 타겟화 딥 시퀀싱 (Targeted deep sequencing)을 수행하였다. 교정된 염기는 빨간색으로 표시하였다. 돌연변이 미토콘드리아 유전체의 교정 빈도가 표시되어 있다. b 게놈 DNA의 targeted deep sequencing을 사용하여 얻은 F1 새끼(101)의 다양한 조직에서의 염기 교정 효율. 진하고 밝은 회색 막대는 각각 m.C12539T(C10) 및 m.G12542A(C13) 돌연변이의 빈도를 나타낸다. 오차 막대는 n = 3개의 생물학적으로 독립적인 샘플에 대한 평균(s.e.m.)의 표준 오차이다.
도 36. DdCBE에 의해 생성된 생쥐 미토콘드리아 ND5 G12918A 돌연변이. a ND5 단백질에서 D393N 변화를 야기하는 m.G12918A 점 돌연변이를 만들기 위한 DdCBE 표적. 목표 코돈에 밑줄이 그어져 있고, 가능한 교정 부위가 빨간색으로 표시된다. b NIH3T3 세포에서 DdCBE를 사용한 시토신-티민 염기 교정의 효율. 형질 감염된 DdCBE 쌍의 조합이 표기되어 있다. 오차 막대는 s.e.m.이다. n = 3개의 생물학적으로 독립적인 샘플의 경우(n.s. 유의미하지 않음, *p < 0.05, **p < 0.01, Student’s two-tailed t test 사용). left-G1333-N + right-G1333-C, left-G1333-C + right-G1333-N, left-G1397-N + right-G1397-C, left-G1397-C + right-G1397-N의 C6 돌연변이에 대한 P값은 각각 0.0052, 0.0099, 0.0027 및 0.0040이다. n.s에 대한 P 값은 0.4971이다. c m.G12918A 생쥐 배반포에서 점 돌연변이 염기 교정 효율. 시퀀싱 데이터는 1 세포기 배아에 left-G1397-C 및 right-G1397-N DdCBE를 코딩하는 mRNA를 미세주입한 후, 배양하여 발달 된 배반포에서 얻었다. d ND5 점 돌연변이를 지닌 생쥐(F0). DdCBE mRNA의 미세주입 후에 발달한 ND5 점 돌연변이를 보유하고 있는 F0 새끼. 갓 태어난 새끼에서 확인된 돌연변이 서열 정렬. 교정된 염기는 빨간색으로 표시되어 있고, 오른쪽은 돌연변이 미토콘드리아 유전자의 교정 빈도를 나타낸다.
도 37. 시토신 탈아미노화 효소로 매개된 염기 교정을 통해 생성된 생쥐 미토콘드리아 ND5 넌센스 돌연변이. a m.C12336T 넌센스 돌연변이 및 m.G12341A 침묵 돌연변이를 생성하기 위한 DdCBE 목표 서열. m.C12336T(C9) 돌연변이는 ND5 단백질에서 Q199stop 돌연변이를 생성하는 반면, m. G12341A(C14)는 침묵하는 Q200Q 돌연변이를 일으킨다. 전사 트리플렛은 밑줄이 그어져 있고, 가능한 교정 위치는 빨간색으로 표시되어 있다. b NIH3T3 세포에서 넌센스 돌연변이를 생성하는 시토신-티민 염기 교정의 효율성. 형질 감염된 DdCBE 쌍의 조합이 표기되어 있다. 진하고 밝은 회색 막대는 각각 m.C12336T(C9) 및 m.G12341A(C14) 돌연변이의 빈도를 나타낸다. 오차 막대는 s.e.m.을 나타낸다. n = 3개의 생물학적으로 독립적인 샘플의 경우(n.s. 유의미하지 않음, *p < 0.05, **p < 0.01, Student’s two-tailed t test 사용). Left-G1333-N + right-G1333-C, left-G1333-C + right-G1333-N, left-G1397-N + right-G1397-C, left-G1397-C + right-G1397-N의 C9 돌연변이에 대한 P 값은 0.0065, 0.1143, 0.0266 및 0.0037이고, C14 돌연변이에 대한 P값은 각각 0.0077, 0.0144, 0.0406 및 0.0214이다. c 생쥐 배반포에서의 교정 효율. 서열 분석 데이터는 접합체에 left-G1333-N 및 right-G1333-C DdCBE를 인코딩하는 mRNA를 미세주입한 후 발달한 배반포에서 얻었다. 진하고 밝은 회색 막대는 각각 C9 및 C14 돌연변이의 빈도를 나타낸다. d 갓 태어난 새끼의 돌연변이 서열 정렬. 교정된 염기는 빨간색으로 표시되었고, 오른쪽은 돌연변이 미토콘드리아 게놈의 교정 빈도를 나타낸다. e 야생형 및 교정된 생쥐의 생거 서열 분석 크로마토그램. 빨간색 화살표는 치환된 뉴클레오티드를 나타낸다.
도 38. DdCBE 구조를 생성하는 골든 게이트 클로닝의 개략도. 모든 반응은 1 개의 튜브에서 동시에 발생한다. 화살표는 연속적인 반응 과정을 의미하지는 않는다. BsaI 효소를 사용하여 빈 발현 벡터 및 모듈 벡터를 절단하여 호환 응집 말단을 포함하여 선형화된 백본과 TALE 모듈 삽입물이 빠지도록 하였다. 다음으로, T4 DNA 리가아제가 백본과 6 개의 모듈 인서트를 결합하여 최종 DdCBE 구조를 만들었다. 8 개의 DdCBE 복제 백본 플라스미드를 사용했다. SOD2MTS의 경우 Left-G1333-N, Left-G1333-C, Left-G1397-N, Left-G1397-C이다. COX8A MTS의 경우 Right-G1333-N, Right-G1333-C, Right-G1397-N, Right-G1397-C이다.
도 39. ND5 변이 마우스 (F0). (a) ND5 침묵 돌연변이 마우스, (b) ND5 G12918A 돌연변이 마우스, (c) DdCBEmRNA 마이크로 주입 후 발생한 ND5 넌센스 돌연변이 마우스.
도 40. (a) DdCBE-NES를 포함하는 벡터 모식도 및 NES 서열. (b) Mouse m.G12918 ND5 유전자 및 핵 내 4번 염색체의 ND5-like 서열. 미토콘드리아 TrnA 및 핵 내 5번 염색체 서열. 미토콘드리아 Rnr2 및 핵 내 6번 염색체 서열. (c) NIH3T3 세포주를 이용한 DdCBE 및 DdCBE-NES의 ND5 유전자에서의 교정 효율. (d) NIH3T3 세포주를 이용한 DdCBE 및 DdCBE-NES의 TrnA 유전자에서의 교정 효율. (e) NIH3T3 세포주를 이용한 DdCBE 및 DdCBE-NES의 Rnr2 유전자에서의 교정 효율. 주황색 그래프는 DdCBE, 회색 그래프는 DdCBE-NES의 교정 효율이다. (f) mitoTALEN TALE 배열의 DNA 인식 서열. (g) mitoTALEN을 처리하거나 처리하지 않은 실험군에서의 DdCBE 염기 교정 효율. 모든 그래프는 n=2이며 오차 막대는 평균 표준 오차이다.
도 41. DdCBE-NES 및 mitoTALEN을 이용한 생쥐 배아 및 개체에서의 향상 된 교정 효율. (a) DdCBE-NES를 이용한 배반포에서의 여러 미토콘드리아 DNA 표적(mtND5, mtTrnA, mtRNR2) 염기 교정 효율. (b) DdCBE, DdCBE-NES 및 mitoTALEN을 이용한 m.G12918A 염기 교정 효율 비교. (c) 생쥐 개체에서의 m.G12918A 염기 교정 효율 비교. 모든 그래프는 n>=3이며 오차 막대는 평균 표준 오차이다. (n.s.=통계적으로 무의미함, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001을 Student’s two-tailed t-test를 이용하여 얻었다.)
도 42. (a) DdCBE 단백질 개량에 대한 모식도. (b,c) DddAtox 탈아미노화 효소의 크리스탈 구조. 결합 표면 자리의 잔기는 막대로 표현되었다. (b) G1397-N 분할 및 G1397-C 분할은 각각 순서대로 자주색과 하늘색으로 표기되었다. (b) G1333-N 분할 및 G1333-C 분할은 각각 순서대로 주황색과 녹색으로 표기되었다. (d, e) 결합 표면 돌연변이 중 G1397-N 및 G1397-C (d)와 G1333-N 및 G1333-C (e)는 빨간색으로 표시되었다.
도 43. (a) G1397 결합 표면 돌연변이의 염기 교정 효율 그래프. 교정 범위 및 목표 시토신은 위쪽에 표시되었다. 돌연변이 및 야생형/TALE-free DddAtox 단백질은 옆에 표기한 바와 같이 co-transfection되었다. Left-DdCBE의 경우 TALE-free DddAtox 단백질은 G1397-N이며, Right-DdCBE의 경우 TALE-free DddAtox 단백질은 G1397-C이다. (b) DdCBE와 돌연변이의 목표 시토신-티민(구아닌-아데닌) 염기 교정 효율을 표기한 히트맵.
도 44. (a) G1333 결합 표면 돌연변이의 염기 교정 효율 그래프. 교정 범위 및 목표 시토신은 위쪽에 표시되었다. 돌연변이 및 야생형/TALE-free DddAtox 단백질은 옆에 표기한 바와 같이 co-transfection 되었다. Left-DdCBE의 경우 TALE-free DddAtox 단백질은 G1333-N이며, Right-DdCBE의 경우 TALE-free DddAtox 단백질은 G1333-C이다. (b) DdCBE와 돌연변이의 목표 시토신-티민(구아닌-아데닌) 염기 교정 효율을 표기한 히트맵.
도 45는 Wild type과 신규 full length DddA의 아미노산 염기서열 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 46은 전장 DddA를 동물 또는 식물세포에 전달한 형태를 나타낸 것이다.
도 47은 human cell genomic context ROR1 site (a), HEK3 site (b), TYRO3 site (c) 에서 TC motif의 cytosine이 thymine으로 치환되는 활성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 48은 전장 DddA의 장점을 나타낸 것이다.
도 49는 Human cell genomic context TRAC site1 (a), TRAC site 2 (b), FANCF (c), HBB (d)에서 전장 DddA의 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 50은 DddA-dCas9(D10A, H840A)-UGI를 이용한 Human cell genomic context TYRO3 (a), ROR1 (b), HEK3 (c), EMX1 site 2 (d), TRAC site 1 (e), HBB (f)에서 DddA의 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 51. HEK293T 세포에서 전장 DddAtox의 염기교정 효율. (a) 구조 기반 방식으로 전장 DddAtox를 스크리닝하는 개략도. 적색 알라닌은 양전하를 띤 아미노산 잔기가 알라닌으로 대체된 것으로 나타냈다. (b) 알라닌으로 치환된 DddA 변이체의 E.coli 형질전환체를 나타내었고, E1347A는 대조군으로 활성부위 돌연변이체로 사용하였다. (c) TYRO3 사이트에서 DddA AAAAA 및 CBE의 교정 및 삽입결실 빈도. (d) TYRO3 부위의 대립 유전자 빈도가 C에서 T로의 치환을 빨간색으로 표시함. 프로토 스페이서는 파란색으로 표시되고 프로토 스페이서 인접 모티브(PAM)는 주황색으로 표시함
도 52. 무독성 DddA GSVG. (a) 오류가 발생하기 쉬운 PCR을 기반으로 한 무독성 전장 DddAtox 변이체 스크리닝의 개략도. Cas9, nCas9(D10A), nCas9(H840A) 및 dCas9(D10A, H840A)의 N-말단 및 C-말단에 융합된 (b) 및 대립유전자 (c) 교정 빈도. 프로토 스페이서는 파란색으로 표시되고 프로토 스페이서 인접 모티브(PAM)는 주황색으로 표시함.
도 53. TYRO3 부위(a), ROR1 부위 1(b), HEK3 부위(c)에서 양전하를 띤 아미노산 잔기가 알라닌으로 치환된 DddAtox 변이체들이 nCas9(D10A)의 N-말단에 교정 빈도. 프로토 스페이서는 파란색으로 표시되고 프로토 스페이서 인접 모티프(PAM)는 주황색으로 표시함.
도 54. ROR1 사이트 1(a), ROR1 사이트 2(b), ROR1 사이트 3(c), FANCF 사이트(d), HBB 사이트(e), HEK3 사이트(f), TRAC5 사이트 1(g) 및 EMX1 사이트(h, I, j)는 각각. 프로토 스페이서는 파란색으로 표시되고 프로토 스페이서 인접 모티프(PAM)는 주황색으로 표시함. C에서 T로의 치환은 빨간색으로 표시함. DddA의 타겟 윈도우는 프로토 스페이서 5` 업스트림으로 세어 음수로 표시함.
도 55. HeLa 세포에서 AAAAA 및 E1347A의 TYRO3 사이트(a), ROR1 사이트 1(b), ROR1 사이트 2(c), ROR1 사이트 3(d), FANCF 사이트(e), HBB 사이트(f), HEK3 사이트(g), TRAC5 사이트 1(h), TRAC5 사이트 2(i) 및 EMX1 사이트 2(j)) 에서 교정 빈도. 프로토 스페이서는 파란색으로 표시되고 프로토 스페이서 인접 모티브(PAM)는 주황색으로 표시함. DddA의 타겟 윈도우는 proto-spacer 5` 업스트림으로 세어 음수로 표시함. 표적 시토신은 빨간색으로 표시함.
도 56. TYRO3 사이트(a) 및 ROR1 사이트 1(b)에서 AAAAA 및 E1347A의 시간 종속 염기 교정 및 삽입결실 비율을 나타낸 것이다.
도 57. EMX1 사이트 2(a), FANCF 사이트(b), TRAC5 사이트 1(c), TRAC5 사이트 2(d), ROR1 사이트 1(e), ROR1 사이트 2(f), ROR1 사이트 3(g) 및 HBB 사이트(h) 에서 nCas9(D10A), nCas9(H840A) 및 dCas9의 N-말단에 융합된 GSVG의 교정, 삽입결실 및 대립유전자 빈도. 프로토 스페이서는 파란색으로 표시되고 프로토 스페이서 인접 모티브(PAM)는 주황색으로 표시함. C에서 T로의 치환은 빨간색으로 표시함. GSVG의 타겟 윈도우는 프로토 스페이서 5` 업스트림으로 세어 음수로 표시함.
도 58. EMX1 사이트 2(a), EMX1 사이트 4(b), ROR1 사이트 2(c), 및 HBB 사이트 (d)에서 nCas9(D10A), nCas9(H840A) 및 dCas9의 C-말단에 융합된 GSVG의 교정, 삽입결실 및 대립유전자 빈도. 프로토 스페이서는 파란색으로 표시되고 프로토 스페이서 인접 모티브(PAM)는 주황색으로 표시함. G에서 A로의 치환은 빨간색으로 표시함. GSVG의 타겟 윈도우는 프로토 스페이서의 첫 번째 위치에서 3' 다운스트림으로 세어 표시된다.
도 59. TYRO3(a) 및 EMX1 사이트 2(b)에서 nCas9(H840A)의 C-말단에 융합된 E1347A, GSVG, SSVG, GSAG, GSVS의 시간 종속 교정 및 삽입결실 빈도.
도 60. HEK293T 세포에서 mDdCBE의 미토콘드리아 염기 교정. ND4(a) 및 ND6(b)의 교정 효율성. 표적 시토신과 TALE 결합 부위는 각각 빨간색과 회색으로 표시함. DddAtox의 절반만 TALE 어레이에 융합되고 나머지 절반은 TALE이 없는 경우 ND4(c, d) 및 ND6(e, f)에서 교정 효율성. 왼쪽 TALE 배열과 오른쪽 TALE 배열은 각각 L과 R로 표시된다. 참조 게놈과의 ND6 TALE 어레이 미스매치는 보라색으로 밑줄이 그어져 있음.
도 61:
(a) 기존의 ZFP DNA 결합 단백질을 이용한 zinc finger cytosine deaminase(ZFD)의 모식도
(b) adenine deaminase를 ZFD에 삽입하는 곳 (빨간 화살표가 삽입위치이다)
(c) 만들어진 ZF-DdABE의 핵 DNA Trac site에서 염기 교정 효율. (C to T)
(d) 만들어진 ZF-DdABE의 핵 DNA Trac site에서 염기 교정 효율. (A to G)
(WT-ZFD는 adenine deaminase가 있지 않은 split DddAtox만 있는 C to T deaminse이다.)
(e) Mitochondria DNA를 target하는 ZF-DdABE의 ND1 site에서 효율. (C to T)
(f) Mitochondria DNA를 taeget하는 ZF-DdABE의 ND1 site에서 효율. (A to G)
도 62:
(a) TALE과 split DddAtox를 이용한 DdABE의 모식도 (구성요소로는 split DddAtox, adenine deaminse 및 TALE array가 있다.)
(b) 미토콘드리아 ND4 site를 target하는 TALE에 Adenine deaminase만 붙였을 때 염기 교정 효율
(c) 미토콘드리아 ND1 site를 target하는 TALE-split DddAtox에 adenine deaminase를 붙였을 때 염기 교정 효율
(d) 왼쪽은 DdCBE의 pair를 오른쪽에는 TALE-split DddAtox에 adenine deaminase를 붙였을 때 염기 교정 효율을 한 개 뉴클레오타이드 단위로 본 것. (초록색 박스는 TALE이 붙는 부위이다.)
(e) 왼쪽 TALE-split DddAtox에 adenine deaminase를 붙이고, 오른쪽은 DdCBE의 pair를 이용 했을 때 염기 교정 효율을 한 개 뉴클레오타이드 단위로 본 것. (초록색 박스는 TALE이 붙는 부위이다.)
도 63:
(a) UGI가 없을 때와 UGI가 있을 때의 미토콘드리아 ND1 site target DdABE의 C to T와 A to G의 염기 교정 효율 (빨간 박스는 adenine deaminase를 표시)
(b) UGI가 없을 때와 UGI가 있을 때의 미토콘드리아 ND4 site target DdABE의 C to T와 A to G의 염기 교정 효율 (빨간 박스는 adenine deaminase를 표시)
(c) 미토콘드리아 ND1 site target하는 DdABE의 구성중 가장 높은 효율을 가지는 것의 한 개 뉴클레오타이드 단위로 본 것.(초록색 박스는 TALE이 붙는 부위이다.)
(d) 미토콘드리아 ND4 site target하는 DdABE의 구성중 가장 높은 효율을 가지는 것의 한 개 뉴클레오타이드 단위로 본 것(초록색 박스는 TALE이 붙는 부위이다.)
도 64:
(a) 위: 한 개 TALE module에 모든 construct가 있는 single tale module 모식도 (구성 요소로는 Full length DddAtox, adenine deaminase 및 TALE array가 있다.)
아래: 두 개 TALE module을 사용하는 dual tale module (구성 요소로는 Full length DddAtox와 TALE array가 한쪽에, 다른 한쪽은 adenine deaminase와 TALE array가 있다.)
(b) 미토콘드리아 ND1 site를 target하는 single module 및 dual module DdABE의 염기 교정효율
(c) 미토콘드리아 ND4 site를 target하는 single module 및 dual module DdABE의 염기 교정효율
도 65는 ND1 site를 타겟하는 single module의 염기 교정 효율 (구성 요소로는 TALE array, adenine deaminase(AD) 및 full length DddAtox (GSVG, AAAA, E1347A는 각각 variant이다.))을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 66은 ND1 site를 타겟하는 dual module의 염기 교정 효율 (구성 요소로는 TALE array, adenine deaminase(AD) 및 full length DddAtox (GSVG, AAAA, E1347A는 각각 variant이다.))을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 67. (a) ND1 site를 타겟하는 TALE 결합단백질에 TadA(AD) 아데닌 탈 아민 효소만 붙었을 때 염기 교정 효율을 나타낸 것이다.
(b) ND4 site를 타겟하는 TALE 결합단백질에 TadA(AD) 아데닌 탈 아민 효소만 붙었을 때 염기 교정 효율을 나타낸 것이다.
도 68. ND1 site를 타겟하는 TALE에 dual module, single module 및 split-DddA-AD에 대한 아데닌과 시토신 염기 교정 효율을 나타낸 것이다. (맨 밑에서부터) 양쪽에 UGI가 있는 경우, 시토신 염기교정만 일어난다. 한쪽에 AD가 붙는 경우에는 시토신과 아데닌 염기교정이 모두 일어나게 되고, UGI가 없는 경우에는 선택적으로 아데닌 염기 교정만 일어나는 것을 볼 수 있다. 마찬가지로 dual module과 single module에서도 선택적으로 아데닌 염기 교정만 일어나는 것을 볼 수 있다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 명세서에서 사용되는 “교정”은 “편집”과 상호 호환적으로 사용 가능하고, 특이적 게놈 표적의 선택적 결실에 의해서 핵산 서열을 변경시키는 방법을 의미한다. 이러한 특이적 게놈 표적은 염색체 영역, 유전자, 프로모터, 오픈 리딩 프레임 또는 임의의 핵산 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 "단일 염기"는 핵산 서열 내 하나, 및 오직 하나의 뉴클레오티드를 의미한다. 단일 염기 교정의 맥락에서 사용될 때, 이것은 핵산 서열 내 특이적 위치의 염기가 상이한 염기로 치환되는 것을 의미한다. 이러한 치환은 제한없이 치환 또는 변형을 포함한, 많은 기전에 의해 일어날 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "표적" 또는 "표적 부위"는 임의 조성 및/또는 길이의 사전에 확인된 핵선 서열을 의미한다. 이러한 표적 부위는 염색체 영역, 유전자, 프로모터, 오픈 리딩 프레임 또는 임의의 핵산 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 "온-타겟”은 프로그램 가능한 DNA 결합 영역 및/또는 단일 가이드 RNA 서열과 완전하게 상보성일 수 있는 특이적 게놈 표적의 하위 서열을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 “오프-타겟”은 프로그램 가능한 DNA 결합 영역 및/또는 단일 가이드 RNA 서열과 부분적으로 상보성일 수 있는 특이적 게놈 표적의 하위 서열을 의미한다.
1. 분할 시토신 탈아미노효소 (Split Deaminase)
본 발명에 따른 융합단백질은 시토신 탈아미노효소 (deaminase) 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질로, 상기 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체는 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체 유래인 제1분할체 및 제2분할체를 포함하고, 상기 제1분할체 및 제2분할체는 각각 상기 DNA 결합 단백질에 결합되는 형태를 가진다.
상기 시토신 탈아미노효소는 아미노기 이탈 효소로, 시토신(C)을 우리딘(U)으로 전환시킬 수 있다.
상기 시토신 탈아미노효소일 수 있다. 상기 시토신 탈아미노효소로 예를 들어, APOBEC1 (apolipoprotein B editing complex 1), AID (activation-induced deaminase)의 형태가 존재하나, 대부분의 DNA 탈아미노효소들은 단일 가닥 DNA에만 작동해서 DNA 결합 단백질에 연결하여 염기 교정하는 데에는 적합하지 않을 수 있다. 구체적으로, 상기 시토신 탈아미노효소는 상기 시토신 탈아미노효소는 이중 가닥 DNA에 작용하는 탈아미노효소 (DddA) 또는 이의 오솔로그 (orthologue)에서 유래한 것일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 시토신 탈아미노효소는 이중 가닥 DNA 특이적 박테리아 시토신 탈아미노효소일 수 있다.
상기 시토신 탈아미노효소는 분할된 형태로, 상기 시토신 탈아미노효소는 분리된 제1분할체 및 제2분할체를 포함하고, 상기 제1분할체와 제2분할체 각각은 탈아미노효소 활성이 없는 것이다.
전장 시토신 탈아미노효소 중 tox 분할체에 해당하는 서열번호 1의 서열을 포함할 수 있다. 상기 시토신 탈아미노효소는 제1분할체 및 제2분할체를 포함하고, 상기 제1분할체와 제2분할체 각각은 탈아미노효소 활성이 없다.
[서열번호 1]
GSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGPTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGAIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGC
하나의 실시예에서, 상기 시토신 탈아미노효소의 제1분할체 또는 제2분할체는 서열번호 1의 서열 중 N 말단에서 G33, G44, A54, N68, G82, N98, G108로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상까지의 서열을 포함할 수 있다. 상기 시토신 탈아미노효소의 제1분할체 또는 제2분할체는 서열번호 1의 서열 중 G34, P45, G55, N69, T83, A99, A109로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상에서 C-말단까지의 서열을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 시토신 탈아미노효소는 서열번호 23의 제1분할체 (G1333-N) 및 서열번호 24의 제2분할체 (G1333-C)을 포함하거나, 서열번호 25의 제1분할체 (G1397-N) 및 서열번호 26의 제2분할체 (G1397-C)을 포함하거나, 서열번호 23의 제1분할체 (G1333-N) 및 서열번호 26의 제2분할체 (G1397-C)을 포함하거나, 서열번호 25의 제1분할체 (G1397-N) 및 서열번호 24의 제2분할체 (G1333-C)을 포함할 수 있다.
(서열번호 23) Wild-type DddAtox G1333-N
GSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGG
(서열번호 27)
GGCTCTGGTTCCTACGCCCTGGGTCCATATCAGATTAGTGCTCCCCAACTCCCCGCCTACAACGGTCAGACAGTGGGGACCTTTTACTATGTCAACGACGCCGGGGGATTGGAATCCAAGGTTTTCTCTAGCGGTGGG
(서열번호 24) Wild-type G1333-C
PTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGAIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGC
(서열번호 28)
CCAACACCTTATCCTAACTACGCTAACGCCGGGCACGTCGAGGGGCAGTCAGCTCTTTTTATGAGAGATAACGGCATTAGCGAAGGGCTTGTGTTCCATAATAATCCTGAGGGCACCTGTGGCTTCTGTGTAAATATGACCGAAACACTTCTGCCTGAGAACGCTAAAATGACTGTCGTACCACCCGAAGGCGCAATCCCAGTTAAACGGGGCGCAACCGGCGAAACCAAAGTATTCACCGGAAACAGCAATAGTCCAAAGTCCCCCACCAAGGGAGGTTGC
(서열번호 25) Wild-type DddAtox G1397-N
GSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGPTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEG
(서열번호 29)
GGTAGCTACGCACTTGGTCCTTACCAGATTAGCGCACCCCAACTCCCCGCCTATAATGGTCAAACCGTCGGGACCTTTTACTACGTAAACGATGCTGGTGGGCTGGAATCCAAAGTATTCTCCTCAGGGGGCCCTACACCCTACCCCAACTACGCCAATGCTGGTCATGTAGAAGGGCAGTCAGCACTGTTTATGCGCGATAATGGTATAAGCGAGGGGTTGGTCTTCCATAACAACCCAGAGGGTACTTGTGGCTTCTGTGTGAATATGACTGAAACCCTTCTGCCCGAAAATGCCAAGATGACTGTCGTCCCACCTGAAGGC
(서열번호 26) Wild-type DddAtox G1397-C
AIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGC
(서열번호 30)
GCCATACCTGTGAAGCGGGGAGCAACAGGGGAGACAAAGGTGTTCACAGGCAACTCTAACAGTCCAAAGAGCCCCACCAAAGGCGGGTGT
G1333N, G1333C, G1397N 및 G1397C가 조합되어 분할 형태의 탈아미노효소로 사용될 수 있다. 구체적으로, Left-G1333-N + Right-G133-C, Left-G1397-N + Right-G1397-C, Left-G1397-N + Right-G1333-C, 또는 Left-G1333-N + Right-G1397-C의 형태로 사용될 수 있다.
2. 변이체
본 출원의 발명자들은 아미노산 잔기가 치환된 DdCBE 돌연변이를 통해, 상기 DdCBE 돌연변이가 원하지 않는 염기 교정을 억제하고자 하였다. DdCBE 의 비표적 효과를 줄일 수 있는 고정밀의 DddA 유래 시토신 염기 교정기를 제시한다. 이러한 비표적 염기 교정 효과는 TALE과 DNA 사이의 상호작용과 무관하게 DddAtox 탈아미노화 효소 분할체의 자발적인 결합으로 야기되는 현상이다.
이 때 돌연변이를 도입하는 아미노산 잔기는 DddAtox의 이합체 (dimer)가 서로 결합하는 표면에 위치하는 접촉 부위이다. DddAtox 분할체 간의 표면에 위치한 아미노산 잔기를 알라닌으로 치환하여 HF-DdCBE를 제작하였으며, HF-DdCBE는 TALE에 연결 된 두개의 탈아미노화 효소 쌍이 DNA에 결합하지 못할 경우 제대로 된 기능을 하지 못하도록 하였다. 전 미토콘드리아 유전체 분석을 통해, 사람의 미토콘드리아 DNA에서 수많은 원치않는 비표적 C-to-T 전환을 일으키는 기존 DdCBE와는 달리, HF-DdCBE는 매우 효율적이고 정밀하다는 것을 확인하였다.
DddAtox의 경우 이론적으로 분할 형태의 이합체 (split dimer)가 모두 DNA의 표적 부위에 적용 (recruit) 되어야 염기 교정을 일으킬 수 있으나, 실제 실험 결과 한쪽 DdCBE는 DNA에 결합된 것과 다른 한쪽은 결합하지 않는 DdCBE를 사용할 경우에도 표적 염기 교정이 일어나게 된다. 이를 해결하고자 분할 형태의 이합체 (split dimer)가 서로 결합하는 단백질 표면의 잔기를 치환하여 원하지 않는 위치에서의 DdCBE pair의 결합을 방지하고자 한다.
이를 바탕으로, 본 발명은 시토신 탈아미노화 효소 DddAtox의 아미노산 잔기를 치환하여 비선택적인 염기 교정을 줄이는 새로운 변이체에 관한 것이다.
상기 시토신 탈아미노효소는 서열번호 23의 제1분할체 (G1333-N) 및 서열번호 24의 제2분할체 (G1333-C)을 포함하거나, 서열번호 25의 제1분할체 (G1397-N) 및 서열번호 26의 제2분할체 (G1397-C)을 포함한다.
상기 시토신 탈아미노효소의 변이체는 서열번호 23의 제1분할체 중 3, 5, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 28, 30 및 31번 위치로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 상기 서열번호 24의 제2분할체 중 13, 16, 17, 20, 21, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 56, 57, 58 및 60번 위치로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것이다.
본 발명에 따른 변이체는 상기 서열번호 25의 제1분할체 중 87, 88, 91, 92, 95, 100, 101, 102 및 103번 위치로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상 또는 상기 서열번호 26의 제2분할체 중 13, 14, 15 및 16번 위치로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것이다.
상기 '다른 아미노산'은, 알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 발린, 아스파라긴산, 시스테인, 글루타민, 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌, 히스티딘, 라이신, 상기 아미노산들의 공지된 모든 변형체 중에서, 야생형 단백질이 원래 변이 위치에 갖는 아미노산을 제외한 아미노산들 중에서 선택된 아미노산을 의미한다. 일 예에서, 상기 '다른 아미노산'은 알라닌일 수 있다.
구체적으로, 서열번호 23의 제1분할체 중 Y3A, L5A, I10A, S11A, V13A, G14A, T15A, F16A, Y17A, Y18A, V19A, K28A, F30A, S31A 구성된 군에서 선택되는 하나 이상 (각각 Y1292A, L1294A, I1299A, S1300A, V1312A, G1313A, T1314A, F1315A, Y1316A, Y1317A, V1318A, K1327A, F1329A, S1330A에 해당)의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
서열번호 24의 제2분할체 중 V13A, Q16A, S17A, F20A, M21A, E28A, G29A, L30A, V31A, F32A, H33A, K56A, M57A, T58A, V60A (각각 V1346A, Q1349A, S1350A, F1353A, M1354A, E1361A, G1362A, L1363A, V1364A, F1365A, H1366A, K1389A, M1390A, T1391A, V1393A 에 해당) 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
구체적으로, 서열번호 25의 제1분할체 중 C87A, V88A, T91A, E92A, L95A, K100A, M101A, T102A, V103A (각각 C1376A, V1377A, T1380A, E1381A, L1384A, K1389A, M1390A, T1391A, V1392A에 해당)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
상기 서열번호 26의 제2분할체 중 K13A, V14A, F15A, T16A (각각 K1410A, V1411A, F1412A, T1413A에 해당)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
Figure PCTKR2021012872-appb-img-000001
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본 발명에 따른 시토신 탈아미노효소 변이체는 위 표와 같이 기재된 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 시토신 탈아미노효소 변이체는 비특이적인 표적 부위 내 여러 염기에 원치 않는 교정을 일으키는 효과를 줄일 수 있는 가능성을 보여준다.
3. 전장 시토신 탈아미노효소
본 출원의 발명자들은 세포내 독성을 일으켜 분리된 형태 (split)로 사용하는 야생형 시토신 탈아미노효소 (Cytosine deaminase) DddAtox의 양전하를 가지는 아미노산을 변형하여 만든 전장 DddA를 이용한 새로운 프로그램가능한 시토신 탈아미노효소를 개발하였다.
본 발명은 (i) DNA 결합 단백질; 및 (ii) 시토신 탈아미노효소 (deaminase) 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질로, 상기 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체는 비독성 전장 시토신 탈아미노효소인, 융합단백질에 관한 것이다.
DddAtox의 C-말단에는 양전하를 가지는 아미노산이(KRKKK) 특이적으로 몰려 있다. DNA는 음전하를 띄기 때문에 단백질의 양전하 성질을 가지는 아미노산과 결합한다. 이 양전하를 가지는 아미노산을 전극이 없는 아미노산으로 치환하여 DddAtox가 DNA와 결합하는 힘을 약하게 하여 세포내 독성을 낮추거나 제거하려 한다. 즉, 양전하를 가지는 아미노산을 극성이 없는 아미노산으로 치환하여 독성을 가지지 않는 조합은 대장균을 이용한 클로닝이 가능하여 전장 DddA를 확보할 수 있다.
야생형 DddAtox는 세포내 독성 때문에 두 개로 나눈 분리된 형태를 이용하는데 이는 실험에 많은 제약이 따른다. 특히, Cas9을 이용할 경우 다른 PAM을 인식하는 오르쏘고날 (orthogonal) Cas9 변이체를 이용한다. 이 경우 PAM이 제한적으로 존재하기 때문에 원하는 위치에 정확히 시토신 (cytosine)을 티민(thymine)으로 탈아미노화 (deamination) 시키는 것이 어려운 경우가 많다. 또한, 가장 높은 활성이 나타나는 타겟 윈도우 (target window)는 두개의 Cas9 변이체가 바인딩하는 사이의 40bp로 이 부위에 있는 원하지 않는 시토신까지 탈아미노화된다. 그러나, 전장 DddA는 분리되지 않기 때문에 PAM의 제약을 받지 않는다. 또한, 타겟 위치에서 10bp 안에 있는 TC motif에서 가장 활성이 좋기 때문에 정확성 또한 높다.
Cas9이 타겟 사이트 (target site)에 결합해서 이루는 R-loop에 있는 ACA, GC, CC 모티프에 있는 시토신 (cytosine)을 티민(thymine)으로 탈아미노화하는 것을 확인하였다. 이는 분리된 형태에서는 확인이 되지 않는 활성이다.
전장 DddA는 Cas9뿐만 아니라, TALE 모듈, 징크 핑거 단백질을 이용하여 원하는 위치의 시토신 (cytosine)을 티민(thymine)으로 치환하는 것이 가능하다. 기존의 DddAtox는 분리된 형태라 쌍 (pair)으로 전달해야 했지만, 전장 DddA는 TALE 모듈, 징크 핑거 단백질의 한 모듈만을 이용할 수 있기 때문에 타겟 위치를 제약없이 선택할 수 있다. 또한, 게놈 사이트 (genomic site) 뿐 아니라 미토콘드리아 (mitochondria)나 식물 엽록체 (chloroplast) 또는 색소체 등의 DNA를 타겟하여 특정 DNA의 시토신 (cytosine)을 티민(thymine)으로 변환할 수 있다.
또한, 크기가 작아 유전자 치료에 사용되는 바이러스 벡터인 AAV에 모든 구조체를 넣을 수 있다. 기존에 사용하는 CBE(cytosine base editor)는 Cas9이 타겟 사이트와 바인딩하여 이루는 R-loop에 있는 시토신 (cytosine)을 티민(thymine)으로 치환하는데, 이번에 발명된 전장 DddA는 R-loop의 밖에 있는 시토신을 탈아미노화한다. 따라서 기존의 CBE로는 교정에 제약이 있는 위치의 경우 시토신 (cytosine)을 티민(thymine)으로 변환하는 것이 가능하다.
이에 기반하여, 상기 비독성 전장 시토신 탈아미노효소는 서열번호 1의 야생형 탈아미노효소 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환될 수 있다.
상기 '다른 아미노산'은, 알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 발린, 아스파라긴산, 시스테인, 글루타민, 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌, 히스티딘, 라이신, 상기 아미노산들의 공지된 모든 변형체 중에서, 야생형 단백질이 원래 변이 위치에 갖는 아미노산을 제외한 아미노산들 중에서 선택된 아미노산을 의미한다. 일 예에서, 상기 '다른 아미노산'은 알라닌일 수 있다.
상기 비독성 전장 DddA는 종류에 따라 다음의 서열번호 12 내지 서열번호 18로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함할 수 있다.
Wild type (SEQ ID No: 1)
GSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGPTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGAIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGC
A1341D KRKKA (SEQ ID No: 12)
GSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGPTPYPNYDNAGHVEGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGAIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTAGGC
AAAAA (SEQ ID No: 13)
GSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGPTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGAIPVAAGATGETAVFTGNSNSPASPTAGGC
AAAAK (SEQ ID No: 14)
GSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGPTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGAIPVAAGATGETAVFTGNSNSPASPTKGGC
AAKAA (SEQ ID No: 15)
GSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGPTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGAIPVAAGATGETKVFTGNSNSPASPTAGGC
AAKAK (SEQ ID No: 16)
GSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGPTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGAIPVAAGATGETKVFTGNSNSPASPTKGGC
KAAAA (SEQ ID No: 17)
GSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGPTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGAIPVKAGATGETAVFTGNSNSPASPTAGGC
E1347A (SEQ ID No: 18)
GSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGPTPYPNYANAGHVAGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGAIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGC
상기 전장 탈아미노효소 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 다음으로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다:
37 위치의 S가 G로 치환;
59번 위치의 G가 S로 치환;
109번 위치의 A가 V로 치환; 및
129번 위치의 S가 G로 치환.
하나의 실시예에서, 상기 전장 탈아미노효소 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 37 위치의 S가 G로 치환; 59번 위치의 G가 S로 치환; 109번 위치의 A가 V로 치환; 및 129번 위치의 S가 G로 치환을 포함하는, 서열번호 19의 서열을 포함할 수 있다.
GSVG (SEQ ID No: 19)
GSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLEGKVFSSGGPTPYPNYANAGHVESQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGVIPVKRGATGETKVFTGNSNGPKSPTKGGC
상기 전장 DddA GSVG는 일반적인 대장균을 이용한 클로닝이 가능하다. 전장 DddA GSVG가 타겟 사이트에 있는 TC motif의 시토신을 티민으로 탈아미노화 하는 것을 인간 세포 게놈 레벨 (human cell genomic context)에서 확인하였다. 전장 DddA GSVG을 Cas9의 N-terminal과 C-terminal에 각각 클로닝할 수 있다. 같은 타겟 사이트에서 Cas9의 N-terminal에 연결된 DddA GSVG는 시토신을 티민으로 치환할 수 있다. Cas9의 C-terminal에 연결된 DddA GSVG는 치환을 원하는 구아닌의 상보 서열에 있는 TC motif의 시토신을 티민으로 치환하여, 치환을 원하는 구아닌을 아데닌으로 치환하는 것을 인간 세포 게놈 레벨에서 확인하였다.
하나의 실시예에서, 상기 전장 탈아미노효소 변이체는 서열번호 20 내지 22로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함할 수 있다.
SSVG (SEQ ID No: 20)
GSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGPTPYPNYANAGHVESQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGVIPVKRGATGETKVFTGNSNGPKSPTKGGC
GSAG (SEQ ID No: 21)
GSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLEGKVFSSGGPTPYPNYANAGHVESQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGAIPVKRGATGETKVFTGNSNGPKSPTKGGC
GSVS (SEQ ID No: 22)
GSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLEGKVFSSGGPTPYPNYANAGHVESQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGVIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGC
4. DNA 결합 단백질
상기 DNA 결합 단백질은 예를 들어, 징크 핑커 단백질 (zinc finger protein), TALE (Transcription activator-like effector) 단백질, CRISPR 연관 뉴클레아제 또는 이들 중 2이상의 조합일 수 있다.
상기 징크 핑커 단백질의 징크 핑거 모티프는 DNA 결합 도메인을 가지고, 핑거의 c-말단 부분은 DNA 서열을 특이적으로 인식한다. 3 ~ 6 개의 징크 핑거 모티프를 포함하는 DNA 결합 단백질이 DNA 서열을 인식한다.
하나의 실시예에서, 상기 시토신 탈아미노효소의 제1분할체 및 시토신 탈아미노효소의 제2분할체 각각은 징크 핑거 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 결합할 수 있다.
시토신 탈아미노효소의 제1분할체 N-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Left)의 C-말단이 결합하고 시토신 탈아미노효소의 제2분할체 N-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Right) C-말단이 결합 (CC configuration);
시토신 탈아미노효소의 제1분할체 C-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Left)의 N-말단이 결합하고 시토신 탈아미노효소의 제2분할체 N-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Right) C-말단이 결합 (NC configuration);
시토신 탈아미노효소의 제1분할체 N-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Left)의 C-말단이 결합하고 시토신 탈아미노효소의 제2분할체 C-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Right) N-말단이 결합 (CN configuration); 또는
시토신 탈아미노효소의 제1분할체 C-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Left)의 N-말단이 결합하고 시토신 탈아미노효소의 제2분할체 C-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Right) N-말단이 결합 (NN configuration)할 수 있다.
상기 ZF-Left은 다음의 서열번호 2의 서열을 포함할 수 있다:
[서열번호 2]
GIHGVPAAMAERPFQCRICMRNFSDRSNLSRHIRTHTGEKPFACDICGRKFAISSNLNSHTKIHTGSQKPFQCRICMRNFSRSDNLARHIRTHTGEKPFACDICGRKFATSGNLTRHTKIHLR.
상기 ZF-Right는 다음의 서열번호 3의 서열을 포함할 수 있다:
[서열번호 3]
GIHGVPAAMAERPFQCRICMRNFSRSDNLSVHIRTHTGEKPFACDICGRKFAQKINLQVHTKIHTGEKPFQCRICMRNFSRSDVLSEHIRTHTGEKPFACDICGRKFAQRNHRTTHTKIHLR.
ZF은 DNA 타겟에 따라 서열이 달라질 수 있다. ZF은 DNA 타겟 서열에 따라 맞춤형 제작될 수 있다. ZF는 DNA 3bp를 인식하기 때문에 보통 3~6개의 ZF를 이어 붙여 9~18bp DNA를 인식하는 ZF 조합을 제작할 수 있다. 예를 들어, GNN, TNN, CNN 또는 ANN 등의 모듈이 포함된 라이브러리를 이용하여 제작할 수 있다.
경우에 따라서, 상기 징크 핑거 단백질은 링커를 통해 탈아미노효소와 연결될 수 있다. 상기 링커는 2 내지 40개 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드 링커일 수 있다. 상기 링커는 예를 들어, 2aa, 5aa, 10aa, 16aa, 24aa 또는 32aa 길이의 링커 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
하나의 실시예에서, 상기 링커는 다음을 포함할 수 있다:
2a.a 링커: GS
5a.a 링커: TGEKQ (서열번호 8)
10a.a 링커: SGAQGSTLDF (서열번호 9)
16a.a 링커: SGSETPGTSESATPES (서열번호 10);
24 a.a 링커: SGTPHEVGVYTLSGTPHEVGVYTL (서열번호 115); 또는
32a.a 링커: GSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS (서열번호 11).
본 발명에 따른 구체적 실시예에서, 분할 탈아미노효소와 징크 핑거 단백질이 링커를 통해 연결될 수 있고, 제1분할체를 포함하는 반쪽 탈아미노효소 N-말단에 징크 핑거 단백질이 결합하고, 제2분할체를 포함하는 반쪽 탈아미노효소 N-말단에 징크 핑거 단백질이 결합한다. 이 때, 왼쪽과 오른쪽 ZFP가 붙는 곳 사이인 스페이서에서 C에서 T로의 염기 전환이 일어날 수 있다. 왼쪽과 오른쪽 ZFP 모두 24 a.a 링커를 통해 제1분할체를 포함하는 반쪽 탈아미노효소 및 제2분할체를 포함하는 반쪽 탈아미노효소 각각과 연결되는 경우, 높은 교정 효율을 보임을 확인하였다.
상기 TAL 이펙터 (TALE)는 33개에서 34개의 반복된 아미노산 서열이 반복된 형태로 이루어져 있으며, 도메인(RVD, Repeated variant domain)이 약 9개 정도 반복된다. 도메인 하나당 한 개의 뉴클레오타이드를 인지 할 수 있으며, 12-13번째 아미노산 서열 에 따라 특이적인 DNA 서열과 결합 할 수 있다(HD->Cytosine, NI->Adenine, NG -> Thymine, NN -> Guanine). 탈이펙터(TALE)는 표적부위 내의 단일 DNA 가닥을 인식한다. 표적 부위 사이의 거리는 12-14 뉴클레오타이드일 수 있다.
상기 TALE 도메인은 하나 이상의 TALE-Repeat의 조합에 의해 서열-특이적 방식으로 뉴클레오티드에 결합하는 단백질 도메인을 의미한다. 적어도 하나 이상의 TALE-Repeat, 구체적으로 1 내지 30개의 TALE-Repeat를 포함하나 이에 한정되지 않는다. TALE-Repeat는 TALE 도메인 내 특정 뉴클레오티드 서열을 인식하는 부위이다.
상기 TALE 도메인에 백본 구조로 TALE의 N-말단 포함 영역 및 TALE의 C-말단 포함 영역이 포함된다. 상기 TALE의 N-말단 포함 제 1 TALE은 서열번호 4 또는 5에 의해 코딩될 수 있다. 상기 TALE의 C-말단 포함 제 2 TALE은 서열번호 6 또는 7에 의해 코딩될 수 있다.
Figure PCTKR2021012872-appb-img-000009
Figure PCTKR2021012872-appb-img-000010
절단 부위를 기준으로 상기 TALE 도메인이 결합하는 위치에 따라, 단일 TALE 어레이 (array) 또는 제 1 TALE 어레이 및 제 2 TALE 어레이가 각각 결합할 수 있다.
상기 시토신 탈아미노효소의 제1분할체에 제 1 TALE이 결합 (left TALE)되고, 상기 시토신 탈아미노효소의 제2분할체에 제 2 TALE (right TALE)이 결합될 수 있다. 각각 N'-TALE-제1분할체-C' 및 N'-TALE-제2분할체-C' 구조를 가진다.
상기 시토신 탈아미노효소가 전장인 경우 시토신 탈아미노효소의 N 말단에 단일 모듈 TALE이 결합될 수 있다. N-C 방향으로 단일 TALE 모듈 및 시토신 탈아미노효소가 포함된다. 이중 모듈 TALE이 포함될 수 있고, 이 때 전장 시토신 탈아미노효소의 N 말단에 제1 TALE이 결합되고, 제2 TALE이 별개로 포함될 수 있다. N-C 방향으로 제1 TALE 모듈 및 시토신 탈아미노효소가 포함되고, N'-TALE-시토신 탈아미노효소-C' 및 N'-TALE-C'의 구조를 가진다.
TALE array는 타겟 DNA 서열에 따라 맞춤 제작할 수 있다. TALE array는 33~35 개의 아미노산 잔기로 구성된 모듈이 반복적으로 배열되어 구성되는 데 이들은 식물 병원균 Xanthmonas에서 유래한 것으로 모듈 하나가 A, C, G, T 염기 하나씩을 각각 인식하여 DNA에 결합한다. 각각의 모듈의 염기 특이성은 12, 13번째 아미노산 잔기에 의해 결정되는데 이들을 repeat variable di-residue(RVD)라고 한다. 예를 들어 RVD가 NN인 모듈은 G를 인식하고 NI는 A, HD는 C, NG는 T를 인식한다. TALE array는 최소 14 개에서 최대 18 개 이상의 모듈로 구성되어 타겟 DNA 서열 15bp~20bp를 인식할 수 있도록 설계할 수 있다.
상기 CRISPR 연관 뉴클레아제와 관련하여, CRISPR array에는 두개의 RNA가 암호화 되어 있는데, 하나는 crRNA(CRISPR RNA)이고, 다른 하나는 tracrRNA(trans activating CRPSPR RNA)이다. crRNA는 protospace 부분에서 전사되며, tracrRNA와 결합하여 3차 구조를 형성한다. 두 종류의 RNA는 외부 DNA를 인지하고 자를 수 있도록 도와준다.
상기 Cas 단백질은 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Cas12a, Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12g, Cas12h, Cas12i, Cas12j, Cas13a, Cas13b, Cas13c, Cas13d, Cas14, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, CsMT2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3 또는 Csf4의 엔도뉴클레아제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 Cas 단백질은 코리네박터(Corynebacter), 수테렐라(Sutterella), 레지오넬라(Legionella), 트레포네마(Treponema), 피리팩터(Filifactor), 유박테리움(Eubacterium), 스트렙토코커스(Streptococcus: Streptococcus pyogenes), 락토바실러스(Lactobacillus), 미코플라즈마(Mycoplasma), 박터로이드(Bacteroides), 플라비플라비이볼라(Flaviivola), 플라보박테리움(Flavobacterium), 아조스피릴룸(Azospirillum), 글루코나세토박터(Gluconacetobacter), 나이세리아(Neisseria), 로세부리아(Roseburia), 파비바큐럼(Parvibaculum), 스타필로코커스(Staphylococcus: Staphylococcus aureus), 니트라티프랙터(Nitratifractor), 코리네박터리움(Corynebacterium) 및 캠필로박터(Campylobacter)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 Cas 단백질의 오소로그(ortholog)를 포함하는 미생물 속으로부터 유래하고, 이들로부터 단순 분리된 것 또는 재조합된 것일 수 있다.
변이된 형태의 Cas 단백질을 포함할 수 있다. DNA 이중 가닥을 절단하는 엔도뉴클레아제 활성을 상실하도록 변이된 것을 의미할 수 있으며, 예컨대, 엔도뉴클레아제 활성을 상실하고 니카아제 활성을 갖도록 변이된 변이 표적 특이적 뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제 활성과 니카아제 활성을 모두 상실하도록 변이된 형태 중 1종 이상일 수 있다.
니카아제 활성을 갖는 것인 경우, 상기 시토신 탈아미노효소에 의한 염기변환(예컨대, 시토신이 우라딘으로 변환)과 동시 또는 순서와 무관하게 순차적으로, 상기 염기 변환이 일어난 가닥 또는 그 반대 가닥 (예컨대, 염기 변환이 일어난 가닥의 반대 가닥)에서 nick이 도입될 수 있다 (예컨대, PAM이 위치하는 가닥의 반대가닥에서, PAM 서열의 5' 말단 방향으로 3번째 뉴클레오타이드와 4번째 뉴클레오타이드 사이에 해당하는 위치에 nick이 도입됨). 이와 같은 변이 (예컨대, 아미노산 치환 등)는 촉매 활성 도메인 (예컨대, Cas9의 경우 RuvC 촉매 도메인)에서 일어나는 것일 수 있다. 스트렙토코커스 피요젠스 유래 Cas9의 경우 변이는 촉매 활성을 갖는 아스파르트산 잔기 (catalytic aspartate residue; 10번째 위치의 아스파르트산 (D10) 등), 762번째 위치의 글루탐산 (E762), 840번째 위치의 히스티딘 (H840), 854번째 위치의 아스파라긴 (N854), 863번째 위치의 아스파라긴 (N863), 986번째 위치의 아스파르트산 (D986) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 임의의 다른 아미노산으로 치환된 돌연변이를 포함할 수 있다. 이 때, 치환되는 임의의 다른 아미노산은 알라닌 (alanine)일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
경우에 따라서, 스트렙토코커스 피요젠스 유래 Cas9 단백질의 1135번째 위치의 아스파르트산 (D1135), 1335번째 위치의 아르기닌 (R1335), 및 1337번째 위치의 트레오닌 (T1337) 중 하나 이상, 예컨대 3개 모두가 다른 아미노산으로 치환되어, 야생형 Cas9의 PAM 서열 (NGG)와 상이한 NGA (N은 A, T, G, 및 C 중에서 선택된 임의의 염기임)을 인식하도록 변이된 것일 수 있다.
예를 들어, 스트렙토코커스 피요젠스 유래 Cas9 단백질의 아미노산 서열 중,
(1) D10, H840, 또는 D10 + H840;
(2) D1135, R1335, T1337, 또는 D1135 + R1335 + T1337; 또는
(3) (1)과 (2) 잔기 모두에서 아미노산 치환이 일어난 것일 수 있다.
상기 '다른 아미노산'은, 알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 발린, 아스파라긴산, 시스테인, 글루타민, 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌, 히스티딘, 라이신, 상기 아미노산들의 공지된 모든 변형체 중에서, 야생형 단백질이 원래 변이 위치에 갖는 아미노산을 제외한 아미노산들 중에서 선택된 아미노산을 의미한다. 일 예에서, 상기 '다른 아미노산'은 알라닌, 발린, 글루타민, 또는 아르기닌일 수 있다.
경우에 따라서, 가이드 RNA를 추가로 포함할 수 있다. 상기 가이드 RNA는 예를 들어, CRISPR RNA (crRNA), trans-activating crRNA (tracrRNA), 및 단일 가이드 RNA (single guide RNA; sgRNA)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 구체적으로 crRNA와 tracrRNA가 서로 결합된 이중 가닥 crRNA:tracrRNA 복합체, 또는 crRNA 또는 그 일부와 tracrRNA 또는 그 일부가 올리고뉴클레오타이드 링커로 연결된 단일 가닥 가이드 RNA (sgRNA)일 수 있다.
5. 아데닌 탈아미노효소의 부가
본 발명은 (i) DNA 결합 단백질; (ii) 시토신 탈아미노효소 (deaminase) 또는 이의 변이체; 및 (iii) 아데닌 탈아미노효소를 포함하는 융합단백질로, 상기 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체는 (a) 비독성 전장 시토신 탈아미노효소 또는 (b) 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체 유래인 제1분할체 및 제2분할체를 포함하고, 상기 제1분할체 및 제2분할체는 각각 상기 DNA 결합 단백질에 결합되는 형태인, 융합단백질에 관한 것이다.
본 출원의 발명자들은 DNA에 결합할 수 있는 TALE 또는 ZFP 단백질에 DddAtox 시토신 탈아미노효소와 A to G conversion을 일으킬 수 있는 아데닌 탈아미노효소를 연결하여 A 염기를 교정 가능한 염기 교정기 (base editor)를 제작하였다.
기존의 DddAtox를 활용한 deaminase(DdCBE)의 경우 DNA binding module로써 TALE repeat을 사용하는 시토신 탈아미노효소이다. C to T 만을 일으키는 DdCBE와는 달리 DdABE는 A to G를 일으킬 수 있기 때문에 다른 변이 패턴을 만들어 낼 수 있다.
DdABE는 그 자체로 이중 가닥 DNA를 인식하여 탈아미노화를 일으키기 때문에 RNA 와 같은 부가적인 component가 없다. mitochondria나 chloroplast같은 경우 RNA를 delivery하는 기작이 알려져 있지 않아 Crispr system을 적용할 수가 없었다. 하지만 이러한 component가 없는 DdABE는 cell내의 genomic DNA를 target할 수 있는 것뿐만 아니라, mitochondria나 chloroplast와 같은 소기관의 DNA를 target하여 특정 DNA의 A to G conversion을 일으킬 수 있다.
현재 미토콘드리아나 세포 소기관을 타겟하는 유전자 교정 기술은 DdCBE가 유일하다. 따라서 기존의 모든 기술을 통틀어 도입할 수 있는 변이는 C to T 밖에 할 수 없었는데, DdABE는 A to G를 일으킬 수 있기 때문에 변이를 도입할 수 있는 스펙트럼이 훨씬 다양해진다. 이는 현재까지 불가능했던 미토콘드리아 질병 모델 제작 또는 치료를 가능하게 한다.
기존의 DdCBE 같은 경우 두 개의 TALE module(각각 왼쪽과 오른쪽에 붙는)필요하기 때문에 유전자 치료에 있어서 gene capacity 낮은 바이러스 벡터인 AAV에 탑재 할 수 없다. 하지만 DdABE는 한 개의 TALE module만을 사용할 수 있는 'single module'로 사용할 수 있기 때문에 AAV 바이러스에 탑재 할 수 있고, 유전자 치료에 강점을 가진다.
DdABE는 필요에 따라서 split 된 DddAtox를 사용해서 사용 할 수도 있고, full length DddAtox variant를 이용해서 사용할 수도 있기 때문에 호환성이 높다.
상기 아데닌 탈아미노효소는 예를 들어, APOBEC1 (apolipoprotein B editing complex 1), AID (activation-induced deaminase) 및 tadA (tRNA-specific adenosine deaminase)으로 구성된 군에서 선택될 수 있으며, 구체적으로는 tadA (tRNA-specific adenosine deaminase)일 수 있다. 상기 아데닌 탈아미노효소는 예를 들어, 대장균 TadA의 변이체로서 디옥시-아데닌 탈아미노효소 (deoxy-adenine deaminase)일 수 있다.
상기 시토신 탈아미노효소가 분할 형태로 포함되고, 상기 DNA 결합 단백질이 징크 핑거 단백질로, 시토신 탈아미노효소의 제1분할체 C-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Left)의 N-말단이 결합하고 시토신 탈아미노효소의 제2분할체 N-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Right) C-말단이 결합 (NC configuration)한 구조에서, 아데닌 탈아미노효소는 징크 핑거 단백질 (ZF-Left)의 C 말단, 시토신 탈아미노효소의 제1분할체의 N 말단 또는 C 말단, 징크 핑거 단백질 (ZF-Right)의 N 말단, 시토신 탈아미노효소의 제2분할체의 N 말단 또는 C 말단에 결합할 수 있다.
아데닌 탈아미노효소는 시토신 탈아미노효소의 제1분할체 N-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Left)의 C-말단이 결합하고 시토신 탈아미노효소의 제2분할체 N-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Right) C-말단이 결합 (CC configuration); 시토신 탈아미노효소의 제1분할체 N-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Left)의 C-말단이 결합하고 시토신 탈아미노효소의 제2분할체 C-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Right) N-말단이 결합 (CN configuration); 또는 시토신 탈아미노효소의 제1분할체 C-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Left)의 N-말단이 결합하고 시토신 탈아미노효소의 제2분할체 C-말단에 징크 핑거 단백질 (ZF-Right) N-말단이 결합 (NN configuration)에서도 징크 핑거 단백질 (ZF-Left)의 C 말단, 시토신 탈아미노효소의 제1분할체의 N 말단 또는 C 말단, 징크 핑거 단백질 (ZF-Right)의 N 말단, 시토신 탈아미노효소의 제2분할체의 N 말단 또는 C 말단에 결합할 수 있다.
상기 시토신 탈아미노효소가 분할 형태로 포함되고, 상기 DNA 결합 단백질이 TALE인 경우 상기 시토신 탈아미노효소의 제1분할체에 제1 TALE 이 결합되고, 상기 시토신 탈아미노효소의 제2분할체에 제2 TALE이 결합될 수 있으며, 각각 N'-TALE-제1분할체DDDA-C' 및 N'-TALE-제2분할체DDDA-C' 구조를 가진다. 아데닌 탈아미노효소는 시토신 탈아미노효소의 제1분할체의 N 말단 또는 C 말단 또는 시토신 탈아미노효소의 제2분할체 N 말단 또는 C 말단에 결합할 수 있다.
상기 시토신 탈아미노효소가 전장 형태로 포함되고, 상기 DNA 결합 단백질이 TALE인 경우 단일 TALE 모듈을 포함할 수 있고, N-C 방향으로 단일 TALE 모듈 및 시토신 탈아미노효소가 포함되며, 이 때 아데닌 탈아미노효소는 단일 TALE 모듈의 C 말단 방향, 시토신 탈아미노효소의 N 말단 또는 C 말단에 결합할 수 있다.
상기 시토신 탈아미노효소가 전장 형태로 포함되고, 상기 DNA 결합 단백질이 TALE인 경우 듀얼 TALE 모듈을 포함할 수 있고, N-C 방향으로 제1 TALE 모듈 및 시토신 탈아미노효소가 포함되고, 아데닌 탈아미노효소 및 제2 TALE 포함 제2분할체가 추가로 포함될 수 있으며, N'-TALE-시토신 탈아미노효소-C' 및 N'-TALE-아데닌 탈아미노효소-C'의 구조로 아데닌 탈아미노효소는 TALE의 N 말단 또는 C 말단에 결합할 수 있다.
경우에 따라서, 염기 교정 효율을 올려줄 수 있는 UGI (uracil DNA glycosylase inhibitor)를 추가로 포함할 수 있다. UGI는 DNA에서 U를 제거하는 작용을 촉매하는 돌연변이 DNA를 복구하는 효소 UDG (Uracil DNA glycosylase) 활성을 억제시켜 염기 교정 효율을 증가시킬 수 있다.
본 발명은 상기 융합단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 원핵세포 또는 진핵세포에서의 A-to-G 염기 교정용 조성물로, 상기 DNA 결합 단백질은 징크 핑커 단백질 (zinc finger protein), TALE 단백질 또는 CRISPR 연관 뉴클레아제이고, 상기 융합단백질의 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체는 박테리아 유래이고, 이중 가닥 DNA 특이적인 것을 특징으로 하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 상기 융합단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 원핵세포 또는 진핵세포에서의 A-to-G 염기 교정용 조성물로, 상기 DNA 결합 단백질은 징크 핑커 단백질 (zinc finger protein), TALE 단백질 또는 CRISPR 연관 뉴클레아제이고,
상기 융합단백질의 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체는 박테리아 유래이고, 이중 가닥 DNA 특이적인 것이며, 상기 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체의 N 말단에 DNA 결합 단백질이 결합되어 있고, 상기 융합단백질의 아데닌 탈아미노효소의 C 말단에 DNA 결합 단백질이 결합되어 있는, 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 상기 융합단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 및 UGI (uracil glycosylase inhibitor)를 포함하는 원핵세포 또는 진핵세포에서의 C-to-T 염기 교정용 조성물로, 상기 DNA 결합 단백질은 징크 핑커 단백질 (zinc finger protein), TALE 단백질 또는 CRISPR 연관 뉴클레아제이고, 상기 융합단백질의 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체는 박테리아 유래이고, 이중 가닥 DNA 특이적인 것을 특징으로 하는 조성물에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 1) DNA 결합 단백질 2) 전장 이중 가닥 DNA 특이적 박테리아 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체 및 3) E. coli TadA 유래 디옥시아데닌 탈아미노효소를 포함하는 원핵세포 및 진핵 세포에서의 A-to-G 염기 교정용 조성물(UGI 없음)로, 상기 DNA 결합 단백질은 징크 핑거 단백질 (ZFP) 또는 전사 활성화 인자 유사 이펙터 (TALE) 어레이 또는 촉매 결손 CRISPR-Cas9 (nCas9 또는 dCas9) 또는 Cas12a이고; 전장 이중 가닥 DNA 특이적 박테리아 시토신 탈아미노효소 Burkholderia cenocepacia 유래 DddAtox인 조성물이다.
본 발명은 1) 전장 이중 가닥 DNA 특이적 박테리아 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체에 작동 가능하게 연결된 왼쪽 DNA 결합 단백질 2) E. coli TadA 유래 디옥시아데닌 탈아미노효소에 작동 가능하게 연결된 오른쪽 DNA 결합 단백질을 포함하는 원핵세포 및 진핵 세포에서의 A-to-G 염기 교정용 조성물(UGI 없음)로, 상기 왼쪽 또는 오른쪽 DNA 결합 단백질은 징크 핑거 단백질 (ZFP) 또는 전사 활성화 인자 유사 이펙터 (TALE) 어레이 또는 촉매 결손 CRISPR-Cas9 (nCas9 또는 dCas9) 또는 Cas12a이고; 전장 이중 가닥 DNA 특이적 박테리아 시토신 탈아미노효소 Burkholderia cenocepacia 유래 DddAtox인 조성물이다.
본 발명은 또한, 1) DNA 결합 단백질 2) 전장 이중 가닥 DNA 특이적 박테리아 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체, 3) E. coli TadA 유래 디옥시아데닌 탈아미노효소 및 4) UGI (uracil glycosylase inhibitor)를 포함하는 원핵세포 및 진핵 세포에서의 A-to-G 및 C-to-T 염기 교정용 조성물로, 상기 DNA 결합 단백질은 징크 핑거 단백질 (ZFP) 또는 전사 활성화 인자 유사 이펙터 (TALE) 어레이 또는 촉매 결손 CRISPR-Cas9 (nCas9 또는 dCas9) 또는 Cas12a이고; 전장 이중 가닥 DNA 특이적 박테리아 시토신 탈아미노효소 Burkholderia cenocepacia 유래 DddAtox인 조성물이다.
본 발명은 더욱이, 1) DNA 결합 단백질 2) 분할된 이중 가닥 DNA 특이적 박테리아 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체 및 3) E. coli TadA 유래 디옥시아데닌 탈아미노효소를 포함하는 원핵세포 및 진핵 세포에서의 A-to-G 염기 교정용 조성물(UGI 없음)로, 상기 DNA 결합 단백질은 징크 핑거 단백질 (ZFP) 또는 전사 활성화 인자 유사 이펙터 (TALE) 어레이 또는 촉매 결손 CRISPR-Cas9 (nCas9 또는 dCas9) 또는 Cas12a이고; 분할된 이중 가닥 DNA 특이적 박테리아 시토신 탈아미노효소 Burkholderia cenocepacia 유래 DddAtox인 조성물이다.
본 발명은 더욱이, 1) DNA 결합 단백질 2) 분할된 이중 가닥 DNA 특이적 박테리아 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체 3) E. coli TadA 유래 디옥시아데닌 탈아미노효소 및 4) UGI (uracil glycosylase inhibitor)를 포함하는 원핵세포 및 진핵 세포에서의 A-to-G 및 C-to-T 염기 교정용 조성물로, 상기 DNA 결합 단백질은 징크 핑거 단백질 (ZFP) 또는 전사 활성화 인자 유사 이펙터 (TALE) 어레이 또는 촉매 결손 CRISPR-Cas9 (nCas9 또는 dCas9) 또는 Cas12a이고; 분할된 이중 가닥 DNA 특이적 박테리아 시토신 탈아미노효소 Burkholderia cenocepacia 유래 DddAtox인 조성물이다.
본 발명은 상기 융합단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 원핵세포 또는 진핵세포에 처리하는 단계를 포함하는 원핵세포 또는 진핵세포에서의 A-to-G 염기 교정 방법으로, 상기 DNA 결합 단백질은 징크 핑커 단백질 (zinc finger protein), TALE 단백질 또는 CRISPR 연관 뉴클레아제이고, 상기 융합단백질의 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체는 박테리아 유래이고, 이중 가닥 DNA 특이적인 것을 특징으로 하는 방법이다.
본 발명은 상기 융합단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 원핵세포 또는 진핵세포에 처리하는 단계를 포함하는 원핵세포 또는 진핵세포에서의 A-to-G 염기 교정 방법으로, 상기 DNA 결합 단백질은 징크 핑커 단백질 (zinc finger protein), TALE 단백질 또는 CRISPR 연관 뉴클레아제이고, 상기 융합단백질의 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체는 박테리아 유래이고, 이중 가닥 DNA 특이적인 것이며, 상기 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체의 N 말단에 DNA 결합 단백질이 결합되어 있고, 상기 융합단백질의 아데닌 탈아미노효소의 C 말단에 DNA 결합 단백질이 결합되어 있는, 방법이다.
본 발명은 상기 융합단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 및 UGI (uracil glycosylase inhibitor)를 원핵세포 또는 진핵세포에 처리하는 단계를 포함하는 원핵세포 또는 진핵세포에서의 C-to-T 염기 교정 방법으로, 상기 DNA 결합 단백질은 징크 핑커 단백질 (zinc finger protein), TALE 단백질 또는 CRISPR 연관 뉴클레아제이고, 상기 융합단백질의 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체는 박테리아 유래이고, 이중 가닥 DNA 특이적인 것을 특징으로 하는 방법이다.
본 발명에 따른 조성물 또는 방법에 포함된 구성의 구체적 서열은 다음과 같다.
ND1-ZFP-Right-1397C-AD (도.61f-g: SEQ ID No: 410)
MLGFVGRVAAAPASGALRRLTPSASLPPAQLLLRAAPTAVHPVRDYAAQDYKDDDDKVDEMTKKFGTLTIHDTEKAAEFGIRIPGEKPFQCRICMRNFSDSGNLRVHIRTHTGEKPYKCPDCGKSFSQSSSLIRHQRTHTGEKPYECDHCGKSFSQSSHLNVHKRTHTGEKPYRCKYCDRSFSISSNLQRHVRNIHLRSGTPHEVGVYTLSGTPHEVGVYTLAIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGCSGSETPGTSESATPESSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNSKRGAAGSLMNVLNYPGMNHRVEITEGILADECAALLCDFYRMPRQVFNAQKKAQSSIN
ND1-ZFP-Left-1397C-UGI (도.61f-g: SEQ ID No: 411)
MLGFVGRVAAAPASGALRRLTPSASLPPAQLLLRAAPTAVHPVRDYAAQDYKDDDDKVDEMTKKFGTLTIHDTEKAAEFGIRIPGEKPFQCRICMRNFSDSGNLRVHIRTHTGEKPYKCPDCGKSFSQSSSLIRHQRTHTGEKPYECDHCGKSFSQSSHLNVHKRTHTGEKPYRCKYCDRSFSISSNLQRHVRNIHLRSGTPHEVGVYTLSGTPHEVGVYTLAIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGCSGGSTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKML
ND1-ZFP-Right-1397N-UGI (도.61f-g: SEQ ID No: 412)
MLGFVGRVAAAPASGALRRLTPSASLPPAQLLLRAAPTAVHPVRDYAAQYPYDVPDYAVDEMTKKFGTLTIHDTEKAAEFGIHGVPAAMGGSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGPTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGSGTPHEVGVYTLSGTPHEVGVYTLYKCPECGKSFSTKNSLTEHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSSKKALTEHQRTHTGEKPYECNYCGKTFSVSSTLIRHQRIHTGEKPYRCKYCDRSFSISSNLQRHVRNIHLRSGGSTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKML
Trac-ZFP-LEFT-1397N-UGI (도.61d: SEQ ID No: 413)
MAPKKKRKVGIHGVPAAMGGSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGPTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGSGTPHEVGVYTLSGTPHEVGVYTLFQCRICMRKFATSGSLTRHTKIHTGEKPFQCRICMRNFSRSDHLSTHIRTHTGEKPFACDICGRKFATSSNRTKHTKIHTHPRAPIPKPFQCRICMRNFSRSDNLSEHIRTHTGEKPFACDICGRKFAWHSSLRVHTKIHLRSGGSTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKML
Trac-ZFP-right-1397C-AD (도.61d: SEQ ID No: 414)
MAPKKKRKVGIHGVPAAMAERPFQCRICMRNFSRSDHLSTHIRTHTGEKPFACDICGRKFADRSHLARHTKIHTGSQKPFQCRICMRKFALKQHLNEHTKIHTGEKPFQCRICMRNFSQSGNLARHIRTHTGEKPFACDICGRKFAHNSSLKDHTKIHLRSGTPHEVGVYTLSGTPHEVGVYTLAIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGCSGSETPGTSESATPESSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNSKRGAAGSLMNVLNYPGMNHRVEITEGILADECAALLCDFYRMPRQVFNAQKKAQSSIN
ND1-Left-TALE-1397N-UGI (도 62: SEQ ID No: 415)
MALSRAVCGTSRQLAPVLGYLGSRQKHSLPDYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGIRIQDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALLVGSGSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGPTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGSGGSTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKML
ND1-Left-TALE-1397C-UGI (도 62: SEQ ID No: 416)
MALSRAVCGTSRQLAPVLGYLGSRQKHSLPDYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGIRIQDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALLVGSAIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGCSGGSTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKML
ND1-Right-TALE-1397N-UGI (도 62: SEQ ID No: 417)
MASVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSLDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKGIRIQDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALLVGSGSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGPTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGSGGSTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKML
ND1-Right-TALE-1397C-UGI (도 62: SEQ ID No: 418)
MASVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSLDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKGIRIQDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALLVGSAIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGCSGGSTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKML
ND4-Left-TALE-AD (도. 62b: SEQ ID No: 419)
MALSRAVCGTSRQLAPVLGYLGSRQKHSLPDYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGYPYDVPDYAMDIADLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLGGSSGSETPGTSESATPESSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNSKRGAAGSLMNVLNYPGMNHRVEITEGILADECAALLCDFYRMPRQVFNAQKKAQSSIN
ND4-Right-TALE-AD (도. 62b: SEQ ID No: 420)
MASVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSLDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKMDIADLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLGGSSGSETPGTSESATPESSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNSKRGAAGSLMNVLNYPGMNHRVEITEGILADECAALLCDFYRMPRQVFNAQKKAQSSIN
ND1-Left-TALE-1333N-AD (도 63: SEQ ID No: 421)
MALSRAVCGTSRQLAPVLGYLGSRQKHSLPDYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGIRIQDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALLVGSGSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGSGSETPGTSESATPESSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNSKRGAAGSLMNVLNYPGMNHRVEITEGILADECAALLCDFYRMPRQVFNAQKKAQSSIN
ND1-Left-TALE-1333C-AD (도 63: SEQ ID No: 422)
MALSRAVCGTSRQLAPVLGYLGSRQKHSLPDYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGIRIQDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALLVGSPTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGAIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGCSGSETPGTSESATPESSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNSKRGAAGSLMNVLNYPGMNHRVEITEGILADECAALLCDFYRMPRQVFNAQKKAQSSIN
ND1-Right-TALE-1333N-AD (도 63: SEQ ID No: 423)
RQVFNAQKKAQSSIN
ND1-Right-TALE-1333C-AD (도 63: SEQ ID No: 424)
VFGVRNSKRGAAGSLMNVLNYPGMNHRVEITEGILADECAALLCDFYRMPRQVFNAQKKAQSSIN
ND1-Left-TALE-1397C-AD (도 62-63: SEQ ID No: 425)
MALSRAVCGTSRQLAPVLGYLGSRQKHSLPDYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGIRIQDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLLVGSAIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGCSGSETPGTSESATPESSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNSKRGAAGSLMNVLNYPGMNHRVEITEGILADECAALLCDFYRMPRQVFNAQKKAQSSIN
ND1-Right-TALE-1397C-AD (도 62-63: SEQ ID No: 426)
AALLCDFYRMPRQVFNAQKKAQSSIN
ND1-Left-TALE-1333N (도 63: SEQ ID No: 427)
MALSRAVCGTSRQLAPVLGYLGSRQKHSLPDYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGIRIQDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLGGSGSGSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGG
ND1-Left-TALE-1333C (도 63: SEQ ID No: 428)
MALSRAVCGTSRQLAPVLGYLGSRQKHSLPDYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGIRIQDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLGGSGSPTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGAIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGC
ND1-Left-TALE-1397N (도 62-63: SEQ ID No: 429)
MALSRAVCGTSRQLAPVLGYLGSRQKHSLPDYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGIRIQDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLGGSGSGSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGPTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEG
ND1-Right-TALE-1333N (도 63: SEQ ID No: 430)
MASVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSLDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKGIRIQDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALLVGSGSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGG
ND1-Right-TALE-1333C (도 63: SEQ ID No: 431)
MASVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSLDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKGIRIQDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALLVGSPTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGAIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGC
ND1-Right-TALE-1397N (도 62-63: SEQ ID No: 432)
MASVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSLDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKGIRIQDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALLVGSGSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGPTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEG
ND4-LEFT-TALE-1333N-AD (도 63: SEQ ID No: 433)
NAQKKAQSSIN
ND4-LEFT-TALE-1333C-AD (도 63: SEQ ID No: 434)
RNSKRGAAGSLMNVLNYPGMNHRVEITEGILADECAALLCDFYRMPRQVFNAQKKAQSSIN
ND4-LEFT-TALE-1397C-AD (도 63: SEQ ID No: 435)
MALSRAVCGTSRQLAPVLGYLGSRQKHSLPDYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGYPYDVPDYAMDIADLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLGGSGSAIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGCSGSETPGTSESATPESSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNSKRGAAGSLMNVLNYPGMNHRVEITEGILADECAALLCDFYRMPRQVFNAQKKAQSSIN
ND4-Right-TALE-1333N-AD (도 63: SEQ ID No: 436)
SIN
ND4-Right-TALE-1333C-AD (도 63: SEQ ID No: 437)
GSLMNVLNYPGMNHRVEITEGILADECAALLCDFYRMPRQVFNAQKKAQSSIN
ND4-Right-TALE-1397C-AD (도 63: SEQ ID No: 438)
MASVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSLDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKMDIADLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLGGSGSAIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGCSGSETPGTSESATPESSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNSKRGAAGSLMNVLNYPGMNHRVEITEGILADECAALLCDFYRMPRQVFNAQKKAQSSIN
ND1-Left-TALE-AD-GSVG (도 64: SEQ ID No: 439)
VFTGNSNGPKSPTKGGC
ND1-Left-TALE-AD-E1347A (도 64: SEQ ID No: 440)
VFTGNSNSPKSPTKGGC
ND1-Left-TALE-AD-AAAAA (도 64: SEQ ID No: 441)
VFTGNSNSPASPTAGGC
ND1-Right-TALE-AD (도 64: SEQ ID No: 442)
MASVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSLDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKGIRIQDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALLVSGSETPGTSESATPESSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNSKRGAAGSLMNVLNYPGMNHRVEITEGILADECAALLCDFYRMPRQVFNAQKKAQSSIN
ND1-Left-TALE-GSVG (도 64: SEQ ID No: 443)
MALSRAVCGTSRQLAPVLGYLGSRQKHSLPDYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGIRIQDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALLVGSGSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLEGKVFSSGGPTPYPNYANAGHVESQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGVIPVKRGATGETKVFTGNSNGPKSPTKGGC
ND1-Left-TALE-E1347A (도 64: SEQ ID No: 444)
MALSRAVCGTSRQLAPVLGYLGSRQKHSLPDYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGIRIQDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALLVGSGSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGPTPYPNYANAGHVAGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGAIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGC
ND1-Left-TALE-AAAAA (도 64 SEQ ID No: 445)
MALSRAVCGTSRQLAPVLGYLGSRQKHSLPDYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGIRIQDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAALLVGSGSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGPTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGAIPVAAGATGETAVFTGNSNSPASPTAGGC
ND1-TALE-left (SEQ ID No: 446)
DLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAAL
ND1-TALE-Right (SEQ ID No: 447)
DLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPAQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALESIVAQLSRPDPALAAL
ND4-TALE-left (SEQ ID No: 448)
MDIADLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLG
ND4-TALE-Right (SEQ ID No: 449)
MDIADLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGRPALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLG
TRAC-ZFP-LEFT (SEQ ID No: 450)
FQCRICMRKFATSGSLTRHTKIHTGEKPFQCRICMRNFSRSDHLSTHIRTHTGEKPFACDICGRKFATSSNRTKHTKIHTHPRAPIPKPFQCRICMRNFSRSDNLSEHIRTHTGEKPFACDICGRKFAWHSSLRVHTKIHLR
TRAC-ZFP-Right (SEQ ID No: 451)
FQCRICMRNFSRSDHLSTHIRTHTGEKPFACDICGRKFADRSHLARHTKIHTGSQKPFQCRICMRKFALKQHLNEHTKIHTGEKPFQCRICMRNFSQSGNLARHIRTHTGEKPFACDICGRKFAHNSSLKDHTKIHLR
ND1-ZFP-Left (SEQ ID No: 452)
FQCRICMRNFSDSGNLRVHIRTHTGEKPYKCPDCGKSFSQSSSLIRHQRTHTGEKPYECDHCGKSFSQSSHLNVHKRTHTGEKPYRCKYCDRSFSISSNLQRHVRNIHLR
ND1-ZFP-Right (SEQ ID No: 453)
YKCPECGKSFSTKNSLTEHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSSKKALTEHQRTHTGEKPYECNYCGKTFSVSSTLIRHQRIHTGEKPYRCKYCDRSFSISSNLQRHVRNIHLR
G1333N-DddAtox (SEQ ID No: 454)
GSGSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGG
G1333C-DddAtox (SEQ ID No: 455)
GSPTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGAIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGC
G1397N-DddAtox (SEQ ID No: 456)
GSGSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGPTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEG
G1397C-DddAtox (SEQ ID No: 457)
GSAIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGC
Adenine deaminase (AD: ABE 8e) (SEQ ID No: 458)
SEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNSKRGAAGSLMNVLNYPGMNHRVEITEGILADECAALLCDFYRMPRQVFNAQKKAQSSIN
Full length DddAtox variant GSVG (SEQ ID No: 459)
GSGSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLEGKVFSSGGPTPYPNYANAGHVESQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGVIPVKRGATGETKVFTGNSNGPKSPTKGGC
Full length DddAtox variant E1347A (SEQ ID No: 460)
GSGSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGPTPYPNYANAGHVAGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGAIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGC
Full length DddAtox variant AAAAA (SEQ ID No: 461)
GSGSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGPTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGAIPVAAGATGETAVFTGNSNSPASPTAGGC
UGI (SEQ ID No: 462)
TNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKML
Single module
(TALE)-linker-AD-GSVG (SEQ ID No: 463)
SGSETPGTSESATPESSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNSKRGAAGSLMNVLNYPGMNHRVEITEGILADECAALLCDFYRMPRQVFNAQKKAQSSINLVGSGSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLEGKVFSSGGPTPYPNYANAGHVESQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGVIPVKRGATGETKVFTGNSNGPKSPTKGGC
(TALE)-linker-AD-E1347A (SEQ ID No: 464)
SGSETPGTSESATPESSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNSKRGAAGSLMNVLNYPGMNHRVEITEGILADECAALLCDFYRMPRQVFNAQKKAQSSINLVGSGSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGPTPYPNYANAGHVAGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGAIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGC
(TALE)-linker-AD-AAAAA (SEQ ID No: 465)
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Dual module
(TALE) -linker-AD (SEQ ID No: 466)
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(TALE)-GSVG (SEQ ID No: 467)
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(TALE)-E1347A (SEQ ID No: 468)
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(TALE)-AAAAA (SEQ ID No: 469)
GSGSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGPTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGAIPVAAGATGETAVFTGNSNSPASPTAGGC
(TALE)-1397C-AD (SEQ ID No: 470)
GSAIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGCSGSETPGTSESATPESSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNSKRGAAGSLMNVLNYPGMNHRVEITEGILADECAALLCDFYRMPRQVFNAQKKAQSSIN
(TALE)-1333N-AD (SEQ ID No: 471)
GSGSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGSGSETPGTSESATPESSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNSKRGAAGSLMNVLNYPGMNHRVEITEGILADECAALLCDFYRMPRQVFNAQKKAQSSIN
(TALE)-1333C-AD (SEQ ID No: 472)
GSPTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGAIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGCSGSETPGTSESATPESSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNSKRGAAGSLMNVLNYPGMNHRVEITEGILADECAALLCDFYRMPRQVFNAQKKAQSSIN
Linker(AA는 아미노산을 의미함)
8AA: SGGGLGST (SEQ ID No: 473)
16AA: SGSETPGTSESATPES (SEQ ID No: 474)
32AA: SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS (SEQ ID No: 475)
SOD2 MTS-3xHA: MALSRAVCGTSRQLAPVLGYLGSRQKHSLPDYPYDVPDYAGYPYDVPDYAGYPYDVPDYA (SEQ ID No: 476)
COX8A MTS-3xFLAG:
MASVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSLDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK (SEQ ID No: 477)
5. 전달
본 발명에 따른 융합단백질은 예를 들어, 미세주입법 (microinjection), 전기천공법 (electroporation), DEAE-덱스트란 처리, 리포펙션 (lipofection), 나노파티클-매개 형질주입, 단백질 전달 도메인 매개 도입, 및 PEG-매개 형질주입 등과 같은 당업계의 다양한 방법에 의해 세포로 전달될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 융합단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
상기 핵산과 관련하여, "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드", "뉴클레오티드 서열", 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용된다. 임의의 길이의 뉴클레오티드의 폴리머 형태, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 이들의 유사체를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있으며, 공지된 또는 비공지된 임의의 기능을 수행할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드 예컨대, 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 폴리머의 어셈블리 전 또는 후에 가능할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 RNA 서열, DNA 서열, 또는 이의 조합(RNA-DNA 조합 서열)일 수 있다.
상기 융합단백질을 발현시키기 위한 수단으로서, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 등 공지의 발현 벡터를 사용할 수 있으며, 백터는 DNA 재조합 기술을 이용한 임의의 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있다.
상기 벡터는 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터일 수 있으며, 상기 바이러스 벡터는 구체적으로 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노부속 바이러스(Adeno-associated virus), 렌티바이러스(Lentivirus), 레트로바이러스(Retrovirus) 벡터일 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다.
재조합 발현 벡터는 숙주세포에서 핵산의 발현에 적합한 형태로 핵산을 포함할 수 있으며, 이는 재조합 발현 벡터가 발현을 위해 사용되도록 즉, 발현될 핵산 서열에 작동 가능하게-연결되도록 숙주세포를 기반을 선택될 수 있는 하나 이상의 조절 요소를 포함함을 의미한다.
재조합 발현 벡터 내에서, "작동 가능하게 연결된"은 관심 뉴클레오티드 서열이 뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 방식으로(예를 들어, 시험관내 전사/번역 시스템에서 또는 벡터가 숙주세포 내로 도입되는 경우 숙주세포에서) 조절 요소에 연결됨을 의미한다.
재조합 발현 벡터는 T7 promoter를 포함하여 메신저 RNA 합성에 적합한 형태를 포함할 수 있으며, 이는 기내에서 mRNA 합성을 할 수 있도록, 즉, T7 polymerase에 의해 메신저 RNA가 합성될 수 있는 하나 이상의 조절 요소를 포함함을 의미한다.
"조절 요소"는 프로모터, 인핸서, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 및 기타 발현 조정 요소(예를 들어, 전사 종결 신호 예컨대, 폴리아데닐화 신호 및 폴리-U 서열)을 포함할 수 있다. 조절 요소는 많은 유형의 숙주세포에서 뉴클레오티드 서열의 유도 또는 항상 발현을 지시하는 요소 및 특정 숙주세포에서만 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시하는 요소(예를 들어, 조직-특이적 조절 서열)를 포함한다. 조직-특이적 프로모터는 요망되는 관심 조직 예컨대, 근육, 뉴런, 뼈, 피부, 혈액, 특정 기관(예를 들어, 간, 췌장), 또는 특정 세포 유형(예를 들어, 림프구)에서 주로 발현을 지시할 수 있다. 조절 요소는 또한 조직 또는 세포-유형 특이적일 수 있거나 아닐 수 있는 세포-주기 의존성 또는 발달 단계-의존적 방식과 같은 일시적-의존적 방식으로 발현을 지시할 수 있다.
경우에 따라서 벡터는 하나 이상의 pol III 프로모터, 하나 이상의 pol II 프로모터, 하나 이상의 pol I 프로모터, 또는 이들의 조합을 포함한다. pol III 프로모터의 예는 비제한적으로 U6 및 H1 프로모터를 포함한다. pol II 프로모터의 예는 비제한적으로, 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터(임의로 RSV 인핸서를 가짐), 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(선택적으로 CMV 인핸서를 가짐)(예를 들어, Boshart et al(1985) Cell 41:521-530), SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터 및 EF1α 프로모터를 포함한다.
"조절 요소"에는 인핸서 예를 들어, WPRE; CMV 인핸서; HTLV-I의 LTR에서 R-U5' 세그먼트; SV40 인핸서; 및 토끼 β-글로빈의 엑손 2 및 3 사이의 인트론 서열 등이 포함될 수 있다. 발현 벡터의 디자인은 형질전환될 숙주세포의 선택, 요망되는 발현 수준 등과 같은 인자에 좌우될 수 있음이 당업자에 의해 인식될 것이다. 벡터는 숙주세포 내로 도입되어 본원에 기재된 바와 같은 핵산에 의해 인코딩되는 융합 단백질 또는 펩티드를 포함하는 전사물, 단백질 또는 펩티드를 생성할 수 있다(예를 들어, 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부(CRISPR) 전사물, 단백질, 효소, 이의 돌연변이체, 이의 융합 단백질 등). 유익한 벡터는 렌티바이러스 및 아데노-관련 바이러스를 포함하고, 이러한 벡터의 유형은 또한 특정 유형의 세포를 표적화하기 위해 선택될 수 있다.
상기 벡터는 각각 국소주입법 (예컨대， 병변 또는 표적 부위 직접 주입), 전기천공법 (electroporation), 리포펙션, 바이러스 벡터, 나노파티클 (nanoparticles) 뿐만 아니라, PTD (Protein translocation domain) 융합 단백질 방법 등을 통해 생체 내 또는 세포 내로 전달될 수 있다.
상기 핵산은 리보핵산, 예를 들어 메신저 리보핵산 mRNA 형태로 주입하여 세포의 유전자 염기 교정, 예를 들어 동물세포 또는 식물세포에 제한없이 유전자 염기 교정이 가능하다.
본 발명에 따른 핵산은 mRNA 형태일 수 있고, mRNA 형태로 전달하는 경우 DNA를 이용한 벡터 형태로 전달하는 것에 비해, mRNA로의 전사 과정이 불필요하여 유전자 교정 개시가 빠를 수 있다. 일시적 단백질 발현 (transient protein expression) 가능성이 높다.
본 출원의 발명자들은 식물 소기관 유전자 교정을 위해 시토신 염기 교정기 (cytosine base editor)를 리보핵산, 예를 들어 메신저 리보핵산 형태로 식물 세포에 주입하였을 때 플라스미드로 전달하는 것에 비해 비표적 효과가 감소함을 확인하였다. 식물 소기관 유전자 교정에 있어 시토신 염기 교정기를 mRNA 형태로 식물세포에 형질전환 하였을 때, 플라스미드에 비해 비표적 효과에서 장점이 있음을 최초로 입증하였다.
상기 mRNA는 직접 전달되거나, 캐리어를 통해 전달될 수 있다. 경우에 따라서, 핵산절단효소 및/또는 절단인자의 mRNA를 화학변형 (chemical modification) 하거나, 합성 자기-복제 RNA (synthetic self-replicative RNA) 형태로 직접 전달할 수 있다.
세포로 mRNA를 전달하는 방법 또는 생체 내에서 mRNA를 인간, 동물과 같은 유기체의 세포로 전달하는 방법을 포함하여, 시험관 내 또는 생체 내에서 mRNA 분자를 세포로 전달할 수 있는 방법을 고려할 수 있다. 예를 들어, 지질(예를 들어, 리포좀, 마이셀 등)을 포함하거나, 나노파티클 또는 나노튜브를 포함하거나, 양이온성 화합물(예를 들어, 폴리에틸렌이민 또는 PEI)을 포함하거나, 양이온성 화합물(예를 들어, 폴리에틸렌이민 또는 PEI)을 포함하여, mRNA 분자를 세포로 전달할 수 있다. 경우에 따라서, mRNA를 세포로 전달하기 위해서 유전자 총 또는 바이오리스틱(biolistic) 입자 전달 시스템과 같은 볼리스틱 방법(bolistics method)을 사용할 수 있다.
상기 캐리어는 예를 들어, 세포 투과성 펩타이드(CPP), 나노입자, 또는 중합체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 CPP는 다양한 분자 카고(나노크기 입자로부터 작은 화학 분자 및 DNA의 큰 단편까지)의 세포 흡수를 용이하게 하는 짧은 펩타이드이다.
상기 나노입자와 관련하여, 본 발명에 따른 조성물은 고분자 나노입자, 금속 나노입자, 금속/무기 나노입자 또는 지질 나노입자를 통해 전달될 수 있다. 상기 고분자 나노입자는 예를 들어, 롤링 써클 증폭에 의해 합성된 DNA nanoclew, 실 유사 DNA 나노입자일 수 있다. DNA nanoclew, 실 유사 DNA 나노입자에 mRNA를 로딩하고, 엔도좀 탈출능을 향상시키기 위해 PEI를 코팅할 수 있다. 이러한 복합체가 세포막에 결합하여, 내재화된 다음 엔도좀 탈출을 통해 핵으로 이동하여, 전달되도록 할 수 있다.
상기 금속 나노입자와 관련하여, 금입자를 연결시키고 양이온성 엔도좀 탈출 폴리머 (endosomal disruptive polymer)와 복합체를 형성하여 세포에 전달할 수 있다. 상기 양이온성 엔도좀 탈출 폴리머 (endosomal disruptive polymer)는 예를 들어, polyethylene imine, poly(arginine), poly(lysine), poly(histidine), poly-[2-{(2-aminoethyl)amino}-ethyl-aspartamide] (pAsp(DET)), poly(ethylene glycol) (PEG)와 poly(arginine)의 block co-polymer, PEG와 poly(lysine)의 block co-polymer, 또는 PEG와 poly{N-[N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl]aspartamide} (PEG-pAsp(DET))의 block co-polymer일 수 있다.
상기 금속/무기 나노입자와 관련하여, 예를 들어 ZIF-8 (zeolitic imidazolate framework-8)를 통해 mRNA를 캡슐화할 수 있다.
경우에 따라서, 상기 mRNA는 음이온을 띠고(negatively charged), 양이온을 띠는(cationic) 물질들과 결합하여 나노입자 (nanoparticles)를 형성할 수 있고, 이는 세포로 수용체 매개 엔도사이토시스 (receptor-mediated endocytosis) 혹은 파고사이토시스 (phagocytosis) 등을 통해 침투할 수 있다.
양이온성 중합체로 폴리알릴아민 (PAH); 폴리에틸렌이민 (PEI); 폴리(L-리신) (PLL); 폴리(L-아르기닌) (PLA); 폴리비닐아민 단일- 또는 공중합체; 폴리(비닐벤질-트리-C1-C4-알킬암모늄염); 지방족 또는 방향지방족 디할로겐화물 및 지방족 N,N,N',N'-테트라-C1-C4-알킬-알킬렌디아민의 중합체; 폴리(비닐피리딘) 또는 폴리(비닐피리디늄염); 폴리(N,N-디알릴-N,N-디-C1-C4-알킬-암모늄할로겐화물); 4차화된 디-C1-C4-알킬-아미노에틸 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트의 단일- 또는 공중합체; 폴리쿠아드(POLYQUAD)™; 폴리아미노아미드 등이 포함될 수 있다.
양이온성 지질로 양이온성 리포솜 제제를 포함할 수 있다. 리포솜의 지질 이중층은 캡슐화된 핵산을 분해로부터 보호하며, 핵산에 결합할 수 있는 항체에 의한 특이적 중화를 방지할 수 있다. 엔도좀 성숙 동안 엔도좀 멤브레인과 리포좀이 융합되어, 양이온성 지질-핵산절단효소의 효율적인 엔도좀 탈출이 가능하다. 양이온성 지질로 폴리에틸렌이민, 폴리아미도아민 (PAMAM) 성화 수지상체, 리포펙틴 (DOTMA와 DOPE의 조합), 리포펙타제, 리포펙타민(LIPOFECTAMINE)® (예컨대 리포펙타민® 2000, 리포펙타민® 3000, 리포펙타민® RNAiMAX, 리포펙타민® LTX), 세인트-레드(SAINT-RED) (시노볼룩스 세라퓨틱스(Synvolux Therapeutics)사, 네덜란드 그로닝겐 소재), DOPE, 시토펙틴 (길레드 사이언시즈(Gilead Sciences) 사, 캘리포니아 포스터 시티 소재), 및 유펙틴 (JBL사, 캘리포니아 산 루이스 오비스포 소재)가 포함될 수 있다. 대표적인 양이온성 리포솜은 N-[1-(2,3-디올레올옥시)-프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA), N-[1-(2,3-디올레올옥시)-프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 메틸술페이트 (DOTAP), 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카르바모일]콜레스테롤 (DC-Chol), 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민카르복스아미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트 (DOSPA), 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸-히드록시에틸 암모늄 브로마이드; 또는 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB)으로부터 제조될 수 있다.
지질 나노입자와 관련하여, 캐리어로 리포좀을 이용하여 전달할 수 있다. 리포좀은 내부 수성 구획을 둘러싸는 단일 또는 다중 라멜라 지질 이중층 및 상대적으로 불투과성인 외측 친지성 인지질 이중층으로 구성된 구체 소낭 구조이다. 리포좀 제형은 주로 천연 인지질 및 지질, 예컨대 1,2-디스테아로릴-sn-글리세로-3-포스파티딜 콜린(DSPC), 스핑고미엘린, 포스파티딜콜린 또는 모노시알로강글리오사이드 등을 포함할 수 있다. 경우에 따라서, 혈장 내 불안정성을 해소하기 위하여, 지질막에 콜레스테롤 또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)을 추가할 수 있다. 콜레스테롤의 첨가는 캡슐화된 생활성 화합물의 혈장 내로의 신속한 방출을 감소시키거나 또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)은 안정성을 증가시킨다.
7. 염기 교정
본 발명은 다른 관점에서, 상기 융합단백질 또는 상기 핵산을 포함하는 염기 교정용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 조성물을 세포에 처리하는 단계를 포함하는 염기 교정방법에 관한 것이다.
DNA 결합 단백질, 예를 들어 TALE 또는 ZFP (zinc finger protein)가 타겟 DNA에 결합한 후, 융합단백질의 시토신 탈아미노효소는 시토신의 아미노기를 가수분해하여 우라실의 형태로 변형시킨다. 우라실은 아데닌과 염기 쌍을 이룰 수 있기 때문에, 세포 내 DNA 복제 과정을 거쳐 시토신-구아닌 염기 쌍은 우라실-아데닌 염기 쌍을 거쳐 최종적으로 티민-아데닌 염기 쌍으로 교정될 수 있다. 또한, 융합단백질의 아데닌 탈아미노효소는 아데닌의 아미노기를 가수분해 하여 하이포잔틴(Hypoxanthine)의 형태로 변형시킨다. 하이포잔틴은 시토신과 염기쌍을 이룰 수 있기 때문에, 마찬가지로 세포 내 DNA 복제 과정에서 아데닌-티민 염기쌍은 하이포잔틴-시토신 염기 쌍을 거쳐 구아닌-시토신 염기 쌍으로 교정될 수 있다.
상기 세포는 진핵세포 (예컨대, 효모 등의 균류， 진핵 동물 및 /또는 진핵 식물 유래 세포 (예컨대, 배아세포， 줄기세포, 체세포, 생식세포 등) 등)， 진핵 동물 (예컨대， 인간, 원숭이 둥의 영장류 개， 돼지， 소， 양， 염소, 마우스，래트 등)， 또는 진핵 식물 (예컨대, 녹조류 등의 조류，옥수수, 콩，밀， 벼 등)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
(1) 식물세포 DNA의 염기 교정
본 발명은 식물세포 DNA의 염기 교정용 조성물 또는 염기 교정방법에 관한 것이다. 상기 융합단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및 NLS (nuclear localization signal) 펩타이드, 엽록체 전달 펩타이드(chloroplast transit peptide), 미토콘드리아 전달 단백질 (Mitochondrial Targeting Signal, MTS), 핵외 수송 신호 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는, 식물세포 염기 교정용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 융합단백질 또는 핵산; 및 NLS (nuclear localization signal) 펩타이드 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 식물세포 염기 교정용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 융합단백질 또는 핵산; 및 엽록체 전달 펩타이드(chloroplast transit peptide) 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 식물세포 염기 교정용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 융합단백질 또는 핵산; 및 미토콘드리아 전달 단백질 (Mitochondrial Targeting Signal, MTS) 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 식물세포 염기 교정용 조성물을 제공한다.
경우에 따라서 본 발명은 또한, 핵외 수송 신호 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는, 식물세포 염기 교정용 조성물을 제공한다.
구체적으로, 식물세포 핵 DNA, 미토콘드리아 DNA 또는 엽록체 DNA의 교정용 조성물 또는 염기 교정방법에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 융합단백질은 다음을 통해 식물세포에 전달될 수 있다:
Gene gun을 이용한 주입 (Bombardment);
PEG-매개 원형질체 형질감염 (Protoplast transfection, PEG-mediated);
전기천공에 의한 원형질체 형질감염 (Protoplast transfection, electroporation); 또는
미세주사에 의한 원형질체 주사 (Protoplast injection, microinjection).
본 발명에 따른 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 RNA 서열, DNA 서열, 또는 이의 조합(RNA-DNA 조합 서열)일 수 있다.
상기 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 다음을 통해 식물세포에 전달될 수 있다:
Agrobacterium, 예를 들어 Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogene 등을 이용한 형질전환
- binary vector,
- Viral vector: Geminivirus, tobacco rattle virus (TRV), tomato mosaic virus (ToMV), foxtail mosaic virus (FoMV), barley yellow striate mosaic virus (BYSMV), Sonchus yellow net rhabdovirus (SYNV) 등;
바이러스를 이용한 형질감염;
주입 (Bombardment, Gene gun);
PEG-매개 원형질체 형질감염 (Protoplast transfection, PEG-mediated);
전기천공에 의한 원형질체 형질감염 (Protoplast transfection, electroporation); 또는
미세주사에 의한 원형질체 주사 (Protoplast injection, microinjection).
상기 바이러스는 예를 들어, viral vector: Geminivirus, tobacco rattle virus (TRV), tomato mosaic virus (ToMV), foxtail mosaic virus (FoMV), barley yellow striate mosaic virus (BYSMV), Sonchus yellow net rhabdovirus (SYNV) 등을 예로 들 수 있다.
상기 벡터는 각각 국소주입법 (예컨대， 병변 또는 표적 부위 직접 주입), 전기천공법 (electroporation), 리포펙션, 바이러스 벡터, 나노파티클 (nanoparticles) 뿐만 아니라, PTD (Protein translocation domain) 융합 단백질 방법 등을 통해 세포내로 전달될 수 있다.
상기 식물 기관으로 수송되는 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산과 관련하여, 상기 식물 기관은 미토콘드리아, 엽록체 또는 색소체 (plastid: 백색체, 유색체)일 수 있다.
상기 식물 기관으로 수송되는 단백질은 예를 들어 엽록체 전달 펩타이드(chloroplast transit peptide) 또는 미토콘드리아 전달 단백질 (Mitochondrial Targeting Signal, MTS)일 수 있다.
예를 들어, 엽록체 전달 단백질 (Chloroplast Transit Peptide, CTP) 또는 미토콘드리아 전달 신호 단백질 (Mitochondrial Targeting Signal, MTS)이 결합하여 식물 세포 내 엽록체와 미토콘드리아에 전달된다. 엽록체와 미토콘드리아로 전달될 때 N-말단의 CTP 또는 MTS 단백질을 제외한 나머지 부분은 전-단백질 (preprotein) 형태로 엽록체와 미토콘드리아 내부로 전달된다. 엽록체와 미토콘드리아 내부로 진입 과정에서 전달 단백질 부분이 떨어져 나가게 되고 엽록체와 미토콘드리아를 타겟팅하여 특정 부분을 염기 교정할 수 있다.
상기 융합단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 이외에, CTP (chloroplast transit peptide) 또는 이를 코딩하는 핵산 또는 미토콘드리아 전달 신호 단백질 (Mitochondrial Targeting Signal, MTS) 또는 이를 코딩하는 핵산을 식물세포에 처리 또는 전달하여 식물 미토콘드리아, 엽록체, 유색체 또는 백색체 DNA의 염기를 교정할 수 있다.
미토콘드리아 유전자 교정시에 핵외 수송 서열을 염기 교정 단백질에 부착한 경우 보다 높은 효율로 염기가 교정될 수 있다. 상기 핵외 수송 신호 단백질은 예를 들어, MVM (Mirute virus of mice) 유래일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 핵외 수송 신호 단백질은 예를 들어, 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
VDEMTKKFGTLTIHDTEK (서열번호 31)
본 발명은 또한, 야생형 DNA 염기서열을 자르지만 교정된 염기서열은 자르지 못하는 TAL (Transcription Activator-Like) 이펙터 (TALE) 도메인 및 FokI 핵산 가수분해효소(FokI Nuclease) 또는 이를 코딩하는 핵산 또는 ZFN(zinc finger nuclease) 또는 이를 코딩하는 핵산 즉, 미토콘드리아 핵산 가수분해 효소인 mitoTALEN (Mitochondrial TALE Nuclease) 또는 이를 코딩하는 핵산 또는 ZFN(zinc finger nuclease) 또는 이를 코딩하는 핵산을 추가로 포함함으로써, 미토콘드리아 서열 절단 단백질을 동시에 이용하는 경우에도 보다 높은 효율의 미토콘드리아 염기 교정을 기대할 수 있다.
(2) 동물세포 DNA의 염기 교정
본 발명은 동물세포 DNA의 염기 교정용 조성물 또는 염기 교정방법에 관한 것이다. 상기 융합단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및 NLS (nuclear localization signal) 펩타이드, 미토콘드리아 전달 단백질 (Mitochondrial Targeting Signal, MTS), 핵외 수송 신호 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는, 동물세포 염기 교정용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 융합단백질 또는 핵산; 및 NLS (nuclear localization signal) 펩타이드 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는, 동물세포 염기 교정용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 융합단백질 또는 핵산; 및 미토콘드리아 전달 단백질 (Mitochondrial Targeting Signal, MTS) 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는, 동물세포 염기 교정용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 경우에 따라서 핵외 수송 신호 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는, 동물세포 염기 교정용 조성물을 제공한다.
상기 동물세포는 비인간 동물세포이고, 핵외 수송 신호 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산; 및/또는 미토콘드리아 전달 신호 단백질 (Mitochondrial Targeting Signal, MTS) 또는 이를 코딩하는 핵산을 처리하여 비인간 동물세포 미토콘드리아 DNA의 염기를 교정할 수 있다.
예를 들어, 상기 융합단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 이외에, 미토콘드리아 전달 단백질 (Mitochondrial Targeting Signal, MTS)이 결합하여 미토콘드리아에 전달된다. 미토콘드리아로 전달될 때 N-말단의 MTS 단백질을 제외한 나머지 부분은 전-단백질 (preprotein) 형태로 미토콘드리아 내부로 전달된다. 미토콘드리아 내부로 진입 과정에서 전달 단백질 부분이 떨어져 나가게 되고 미토콘드리아를 타겟팅하여 특정 부분을 염기 교정할 수 있다.
미토콘드리아 전달 신호, TAL 이펙터 및 시토신 탈아미노화 효소 (cytosine deaminase, DddAtox)를 포함하는 TALE-DdCBE (TALE DddA-derived cytosine base editor) 또는 이를 코딩하는 핵산에 핵외 수송 신호(Nuclear Export Signal, NES) 또는 이를 코딩하는 핵산이 결합된 비인간 동물세포 미토콘드리아 DNA의 염기 교정용 조성물 또는 교정방법에 관한 것이다. 핵외 수송 신호로 인해 미토콘드리아-핵 유사 서열에 대한 핵 DNA 염기 교정을 감소시킬 수 있다.
본 발명에 따르면, 핵외 수송 신호 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하여, 보다 효율적인 동물 미토콘드리아 DNA 염기 교정을 달성할 수 있다. 또한, 핵외 수송 신호로 인해 미토콘드리아-핵 유사 서열에 대한 핵 DNA 염기 교정을 감소시켜, 미토콘드리아 DNA만 교정될 수 있도록 할 수 있다.
상기 핵외 수송 신호 단백질은 예를 들어, MVM (Mirute virus of mice) 유래일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 핵외 수송 신호 단백질은 예를 들어, VDEMTKKFGTLTIHDTEK (서열번호 31)의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 (1) 핵외 수송 신호 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 및 (2) DNA 결합 단백질, 탈아미노효소 (deaminase) 또는 이의 변이체 또는 이를 코딩하는 핵산과 동시에 또는 순차적으로 교정되기 전 야생형 DNA 염기서열을 자르지만 교정된 염기서열은 자르지 못하는 TAL (Transcription Activator-Like) 이펙터 (TALE) 도메인 및 FokI 핵산 가수분해효소(FokI Nuclease) 또는 이를 코딩하는 핵산 또는 ZFN(zinc finger nuclease) 또는 이를 코딩하는 핵산을 진핵세포에 주입할 수 있다.
특히, 진핵세포 미토콘드리아 유전자의 염기 교정과 관련하여, 핵외 수송 신호 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 및/또는 미토콘드리아 전달 신호 단백질 (Mitochondrial Targeting Signal, MTS) 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 동물 미토콘드리아 유전자 교정시에 핵외 수송 서열을 염기 교정 단백질에 부착한 경우 보다 높은 효율로 염기가 교정되며, 동물 배아에서는 특히 핵내 유사 서열의 비특이적 염기 교정 역시 억제되는 것으로 나타났다.
본 발명은 또한, 미토콘드리아 핵산 가수분해 효소인 mitoTALEN (Mitochondrial TALE Nuclease) 또는 이를 코딩하는 핵산을 추가로 포함함으로써, 미토콘드리아 서열 절단 단백질을 동시에 이용하는 경우에도 보다 높은 효율의 미토콘드리아 염기 교정을 기대할 수 있다. 미토콘드리아 DNA 핵산 가수 분해 효소인 mitoTALEN (Mitochondrial TALE Nuclease)을 이용하여, 미토콘드리아 DNA를 절단할 수 있으며, 야생형(Wild-type) 미토콘드리아 유전체를 절단하여 동물에서 염기 교정된 유전체를 높은 효율로 얻을 수 있다.
본 발명은 또한, 미토콘드리아 핵산 가수분해 효소인 mitoTALEN (Mitochondrial TALE Nuclease) 또는 이를 코딩하는 핵산을 추가로 포함함으로써, 미토콘드리아 서열 절단 단백질을 동시에 이용하는 경우에도 보다 높은 효율의 미토콘드리아 염기 교정을 기대할 수 있다. 구체적으로, 미토콘드리아 전달 신호가 결합된 TAL 이펙터 도메인 및 FokI 핵산 가수분해효소(FokI Nuclease) 또는 ZFN 또는 이를 코딩하는 핵산을 갖는 융합 단백질(mitoTALEN) 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다.
미토콘드리아 DNA 핵산 가수 분해 효소인 mitoTALEN (Mitochondrial TALE Nuclease)을 이용하여, 미토콘드리아 DNA를 절단할 수 있으며, 야생형(Wild-type) 미토콘드리아 유전체를 절단하여 동물에서 염기 교정된 유전체를 높은 효율로 얻을 수 있다.
경우에 따라서, 염기 교정 효율을 올려줄 수 있는 UGI (uracil DNA glycosylase inhibitor)를 추가로 포함할 수 있다. UGI는 DNA에서 U를 제거하는 작용을 촉매하는 돌연변이 DNA를 복구하는 효소 UDG (Uracil DNA glycosylase) 활성을 억제시켜 염기 교정 효율을 증가시킬 수 있다.
구체적으로, 분할된 박테리아 독소 DddAtox, DNA에 결합할 수 있도록 고안 된 TALE (transcription activator-like effector) 및 우라실 글리코실레이즈 억제제 (UGI)로 이루어진 DddA-유래 시토신 염기 교정기 (DdCBEs)는 목표한 시토신-티민 염기 변형을 미토콘드리아 DNA에서 가능하게 하였다. 실시예에 따르면, 생쥐 배아에서 높은 효율의 미토콘드리아 DNA 교정이 가능함을 보여주었다. 미토콘드리아 유전자 중 NADH 탈수 및 유비퀴논으로의 전자전달을 촉매하는 NADH 탈수소화 효소의 서브유닛을 코딩하는 MT-ND5(ND5)를 목표로 하였는데, 이는 m.G12918A와 같이 사람의 미토콘드리아 질병과 관련된 돌연변이와 m.C12336T와 같이 이른 종결코돈을 만드는 돌연변이를 포함하였다. 이를 통해 미토콘드리아 질병 모델을 생쥐에서 제작할 수 있었고, 미토콘드리아 질병을 치료할 수 있는 가능성을 제시하였다.
상기 (1) 핵외 수송 신호 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산에 (2) DNA 결합 단백질, 탈아미노효소 (deaminase) 또는 이의 변이체 또는 이를 코딩하는 핵산이 연결되고, 상기 (2)에 핵산 가수분해 효소인 (3) mitoTALEN (Mitochondrial TALE Nuclease) 또는 이를 코딩하는 핵산을 연결할 수 있다. (1) 내지 (3)을 전달하기 위해 단일 또는 복수의 전달 수단을 동일 또는 상이한 구성으로 조합하여 사용할 수 있다.
상기 (1)은 제1전달 수단에 포함되고, (2)는 제2전달 수단에 포함되며, (3)은 제3전달 수단에 포함될 수 있다. 각각의 전달 시스템은 동시에 바이러스 전달수단이거나, 하나는 바이러스 전달수단이고 다른 하나는 비-바이러스 전달수단이거나, 동시에 비-바이러스 전달수단일 수 있다.
상기 (1) 내지 (3)의 핵외 수송 신호 단백질, DdCBE, mitoTALEN을 혼합하여 전달할 수 있다.
상기 (1) 내지 (3) 중 하나 이상은 핵외 수송 신호 단백질, DdCBE, mitoTALEN으로 전달하고, 일부는 (1) 내지 (3)를 코딩하는 DNA 서열이 벡터 상에 위치하도록 하여 전달할 수 있다.
상기 (1) 내지 (3)를 코딩하는 DNA 서열이 동일한 벡터 상에 위치하도록 하여 하나의 벡터를 통해 동시에 전달할 수 있거나, 별개의 다른 벡터상에 위치하도록 하여 전달할 수 있다.
본 발명에 따른 동물은 인간 또는 비인간 동물을 포함할 수 있다. 상기 비인간 형질전환 동물은 곤충류, 환형동물, 연체동물, 완족류, 선형동물, 강장동물, 해면류, 축색류, 척추동물일 수 있고 상기 척추동물은 어류, 양서류, 파충류, 조류 또는 포유류일 수 있으며, 상기 곤충류는 초파리(Drosophila)일 수 있고, 상기 선형동물은 예쁜꼬마선충(C. elegans)일 수 있으며, 상기 어류는 지브라피쉬(zebrafish)일 수 있고, 상기 포유류는 영장목, 식육목, 식충목, 설치목, 우제목, 기제목 또는 장비목일 수 있고, 상기 설치목은 래트 또는 마우스일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물을 인간 또는 비인간 동물의 배아에 도입하고, 상기 배아를 대리 모체에서 이식하고 임신시켜 염기 교정된 동물을 제조할 수 있다. 동물의 수정란에 본 발명에 따른 조성물을 도입하고 배양할 수 있다.
상기 수득한 수정란을 대리모에 이식하여 분만시킬 수 있다. 상기 비인간 형질전환 동물은 분만 이후 형질전환 여부를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 비인간 형질전환 동물을 교배하여 자손 형질전환 동물을 생산할 수 있다.
상기 "자손"은 상기 비인간 형질전환 동물과 교배하여 생존가능한 모든 새끼 형질전환 동물을 의미하며, 보다 구체적으로는 상기 형질전환 동물을 부모로 형질전환 동물끼리 또는 상기 형질전환 동물과 정상 동물을 교배하여 생산한 F1 세대, F1 세대의 동물과 정상 동물을 교배하여 생산한 F2세대 및 그 이후 세대를 의미하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 교배는 상기 형질전환 동물 또는 정상 동물과 교배하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명은 상기 형질전환 동물 또는 자손 형질전환 동물로부터 분리한 세포, 조직 및 부산물을 포함할 수 있다. 상기 부산물은 상기 형질전환 토끼로부터 유래한 물질 모든 것을 의미하나 바람직하게는 혈액, 혈청, 소변, 대변, 침, 장기 및 피부로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 징크 핑거 탈아미노효소 (Zinc Finger Deaminase: ZFD)
핵 DNA 또는 미토콘드리아 DNA의 염기 교정은 의생명과학연구, 의학 및 생명공학에 널리 유용하다. ZFD 플랫폼은 DNA 결합 단백질, 분할 박테리아 독성 탈아미노효소 DDDAtox(interbacterial toxin deaminase DDDAtox) 및 우라실 글리코실라제 억제제(uracil glycosylase inhibitor; UGI)를 포함한다. UGI는 인간 세포에서 원치 않는 작은 삽입 및 결실(indel)을 유도하지 않고 표적화된 C를 T로의 염기 전환을 촉매한다. 공개적으로 사용 가능한 징크 핑거 리소스를 사용하여 ZFD를 인코딩하는 플라스미드를 제작하여 핵 DNA에서 최대 60% 및 미토콘드리아 DNA에서 30% 빈도로 염기 교정을 달성했다. ZFD는 CRISPR 기반의 염기교정과는 다르게 DNA를 잘라 단일 또는 이중가닥 절단을 만들지 않기 때문에 표적 위치에서 비-상동말단부착 (error-prone non-homologous end joinig)에 의한 원하지 않는 삽입 및 결실(indel)이 발생하지 않는다. 더욱이, 대장균(E. coli)에서 정제된 재조합(recombinant)된 ZFD 단백질들은 자발적으로 사람 세포를 통과해서 타켓 염기를 다른 염기로 전환시킨다(base conversion). 이는 유전자 없는 유전자치료의 원리검증(proof-of-princile)을 입증한다.
진핵 세포 및 유기체의 게놈 교정을 위한 기술에는 zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector (TALE) nucleases (TALENs), TALE-linked split interbacterial deaminase toxin DddA-derived cytosine base editors (a.k.a. DdCBEs), CRISPR-Cas9, 및 자르는 활성이 없어진 Cas9-linked deaminases (a.k.a. base editors)가 포함 되어 있지만, 이것에만 국한되진 않는다. 이러한 도구들은 원칙적으로 두가지 기능 단위로 구성된다. DNA 결합부분과 촉매 부분이다. 따라서 징크 핑거 어레이 (zinc finger array) 또는 TALE 어레이 (array)들은 DNA 결합부분으로 기능하고, 반면에 뉴클레아제 (ZFN 및 TALEN의 경우 FokI) 또는 탈아미노효소 (DdCBE에서의 split DddAtox 및 CBE에서의 APOBEC1)가 촉매 단위로 기능한다. Crispr-cas9은 뉴클레아제 기능과 RNA로 유도되는 DNA 결합단백질(RNA-guided DNA binding protein) 기능 모두를 가지고 있다. 맞춤 설계된, 프로그램 가능한 (programmable)한 ZFN, TALEN 및 Cas9과 같은 뉴클레아제는 DNA를 잘라 두가닥 절단(double strand break)을 일으킨다. 이를 복구하면서 타겟화된 방식 (targeted manner)으로 유전자 knock-out 및 knock-in을 일으킨다. 그러나 프로그램 가능한 뉴클레아제가 유도한 두 가닥 절단은 표적 부위에서 원하지 않은 유전자의 큰 손실(large deletion), p53 활성화 및 표적부위와 표적부위가 아닌 곳의 동시 DSB 수선과정에서 염색체 재배열을 유발할 수 있다. 대조적으로, 시토신 및 아데닌 염기 교정이기(CBE and ABE)를 포함하는 프로그램 가능한 염기 교정기들은 DSB를 일으키지 않아 세포에서 이러한 원하지 않는 현상들을 피할 수가 있으며, 수선 템플릿 (repair template) 또는 공여자 DNA(donor DNA) 없이 효율적으로 한 개의 염기 치환(single nucleotide converstion)을 촉매할 수 있다. 그러나 CBE나 ABE는 Cas9 니케이즈 변이체들을 포함하기 때문에 DNA 한 쪽 가닥을 잘라 닉 (nick) 또는 단일 가닥 절단 (single-strand break)을 일으켜 여전히 유전자 표적부위에서 원하지 않는 삽입-결실(indel)이 일어난다.
이는 세포안에서 핵 DNA와 미토콘드리아 DNA의 C를 T로 염기 치환을 촉매할 수 있다. 맞춤형(custom-designed) DdCBE를 사용하여 쥐의 미토콘드리아 DNA 교정과 식물에서 엽록체 DNA 교정을 보여주었다. 사람 세포와 다른 진핵세포에서 인델 (indel)이 없고, 정확한 염기 교정을 하는 징크 핑거 탈아미노효소(ZFD)를 분할된 DddAtox를 맞춤형 설계된 징크 핑거 단백질에 연결해서 만들었다. 징크 핑거 어레이 (Zinc finger array: 2 x 0.3~0.6 k base pair)는 TALE 어레이 (2 x 1.7~2k base pair)나 S.pyogenes Cas9(4.1 k base pair)와 비교해서 크기가 작기 때문에, 생체 내 연구 및 유전자 치료 응용을 위해 ZFD가 인코딩된 유전자는 쉽게 바이러스 제한된 탑재 공간(cargo space)를 가진 바이러스 벡터 예를 들면 AAV에 탑재할 수 있다. Tale 어레이와는 달리, 징크 핑거 어레이는 C말단이나 N 말단 부분에 부피가 큰 도메인을 가지고 있지 않으므로 엔지니어링 친화적이다. 분할된 DddAtox 절반은 징크 핑거 단백질의 C 말단 부분 이나 N 말단 부분에 융합될 수 있다. 또한, 징크 핑거 단백질은 고유한 세포 투과 능력이 있다. 이는 사람 세포에 핵산 없이(nucleic acid-free) 유전자 교정을 할 수 있게 한다. 이러한 특성들은 징크 핑거 단백질로 하여금 DNA 결합 모듈로써 핵이나 다른 세포 소기관의 염기를 교정하는 이상적인 플랫폼이 되도록 한다.
1-1. 재료 및 방법
플라스미드 제작
포유류에서 발현을 위한 p3s-ZFD 플라스미드는 p3s-ABE7.10 플라스미드(addgene, #113128)를 HindIII 및 XhoI(NEB) 효소로 자른 후 변형하여 만들었다. 효소에 의해 잘려진 p3s 플라스미드와 합성된 삽입 DNA는 HiFi DNA 조립 키트(NEB)를 사용하여 조립되었다. MTS-, ZFP(Toolgen, Sangamo 및 Barbas 모듈)-, split DddA- 또는 UGI를 인코딩하는 모든 삽입 DNA는 IDT에 의해 합성되었다. pTarget 플라스미드는 ZFD 활성을 위한 스페이서 서열의 최적 길이를 결정하기 위해 설계되었다. 여러 길이의 스페이서와 2개의 ZFP 결합 부위를 포함하는 각 pTarget 플라스미드는 2개의 효소(EcoRI 및 BamHI, NEB)로 분해된 pRGS-CCR5-NHEJ 리포터 플라스미드에 ZFP 결합 서열과 스페이서 서열을 삽입하여 구성되었다. 대장균에서 단백질 생산을 위한 pET-ZFD 플라스미드는 pET-Hisx6-rAPOBEC1-XTEN-nCas9-UGI-NLS 플라스미드(addgene, #89508)를 NcoI 및 XhoI(NEB)로 자른 후 변형하여 생성되었다. ZFD 서열은 PCR을 이용하여 p3s-ZFD 플라스미드로부터 증폭되었고, Hisx6 태그 및 GST 태그 서열은 올리고뉴클레오티드(Macrogen)로 합성되었다. 단백질 정제를 위한 모든 플라스미드는 ZFD 및 태그를 인코딩하는 서열을 효소로 잘려진 pET 플라스미드에 HiFi DNA 어셈블리 키트(NEB)를 사용하여 삽입하여 제작하였다. 화학적으로 수용가능한 DH5α 대장균 세포에 플라스미드 형질전환 하고, 플라스미드를 제조사의 프로토콜에 따라 AccuPrep Plasmid Mini Extraction Kit(Bioneer)로 정제했다. Sanger sequencing으로 전체 서열을 확인한 후 원하는 플라스미드를 선택하였다.
HEK293T 세포 배양 및 트랜스펙션
HEK 293T 세포(ATCC CRL-11268)를 10% 소태아혈청(Welgene)과 1% 항생제-항진균 용액(Welgene)이 첨가된 Dulbecco의 Modified Eagle Medium(Welgene)에서 배양했다. HEK 293T 세포(7.5×10⁴)를 48-웰 플레이트에 시딩(seeding)해주었다. 18-24시간 후, 세포가 70~80% 정도로 자라게 되면 왼쪽 및 오른쪽 ZFD를 인코딩하고 있는 플라스미드(각 500ng)를 Lipofectamine 2000 (1.5 μL, Invitrogen)을 이용해서 트렌스펙션을 해주거나, pTarget 플라스미드(10ng)와 함께 트렌스펙션해 주었다. 세포를 트랜스펙션 처리 후 96시간에 harvest한 후 세포 용해 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 8.0(Sigma-Aldrich), 1 mM EDTA(Sigma-Aldrich), 0.005% 나트륨 도데실 설페이트(Sigma-Aldrich)), 5 μL의 프로테이나제 K(Qiagen) 100μL 을 넣어준 뒤 55°C에서 1시간, 95°C에서 10분 동안 인큐베이션 해 주었다. 전체 mtDNA 시퀀싱을 하기 위해 HEK 293T 세포에 ND1 또는 ND2 타겟 mitoZFD 쌍을 인코딩하는 플라스미드 또는 mRNA를 연속적으로 희석한 농도로 트랜스팩션하였다. 구조체의 양(ng)은 7.5×10⁴당 전달된 것이다. mtDNA는 트랜스펙션 후 96시간에 세포로부터 추출되었다.
K562 세포 배양 및 트랜스펙션
K562 세포는 10% 소 태아 혈청(Welgene) 및 1% 항생제-항진균 용액(Welgene)이 첨가된 RPMI 1640 배양액에서 배양되었다. 전기천공 (electroporation)에 의한 K562 세포로의 ZFD 전달을 위해 프로그램 FF-120(Lonza)이 있는 Amaxa 4D-Nucleofector™ X Unit 시스템을 사용했다. 16-well Nucleocuvette™ Strip을 사용할 때 각 샘플에 첨가된 기질 용액의 최대 부피는 2 μL였다. 단백질 같은 경우 왼쪽 및 오른쪽 ZFD 각각 220 pmol(최대 용량의 경우) 또는 110 pmol(최대 용량의 절반)를, 플라스미드의 경우 왼쪽 및 오른쪽 ZFD를 인코딩하는 플라스미드 500ng을 K562 세포(1x105)에 트랜스펙션하였다. 처리 후 96시간에, 세포를 100g에서 5분 동안 원심분리하여 수집하고 100μL의 세포 용해 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 8.0(Sigma-Aldrich), 1 M EDTA(Sigma-Aldrich), 0.005% 나트륨 도데실 설페이트(Sigma-Aldrich)), 5 μL의 프로테이나제 K(Qiagen)를 첨가하여 55°C에서 1시간, 95°C에서 10분 동안 인큐베이션 하였다. ZFD 또는 ZFD 인코딩 플라스미드를 K562 세포로 직접 전달하기 위해 이전에 ZFN의 직접 전달에 사용된 방법을 참조했다. 왼쪽 및 오른쪽 ZFD 단백질의 혼합물(최종 농도 50μM) 또는 왼쪽 및 오른쪽 ZFD를 인코딩하는 플라스미드의 혼합물(각각 500ng)을 100mM L-아르기닌 및 90μM ZnCl2를 함유하는 pH 7.4의 무혈청 배지로 희석하였고 최종 부피를 20μL로 해주었다. K562 세포(1×105)를 100g에서 5분간 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 그런 다음 세포를 희석된 ZFD 용액에 풀어주고 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 세포를 100g에서 5분 동안 원심분리한 다음, 새로운 배양 배지를 넣어주었다. 세포를 30°C(일시적인 저체온 조건) 또는 37°C에서 18시간 동안 유지한 다음 37°C에서 이틀 더 키워줬다. 일부 세포는 위의 과정에 따라 2번 처리되었다. 세포를 처리 96시간 후에 분석하였다.
ZFD 단백질 발현 및 정제
각각 C-말단 GST 태그가 있는 ZFD 각 쌍을 인코딩하는 플라스미드를 Rosetta(DE3) 컴피턴트 세포로 형질전환시킨 다음, 이를 카나마이신을 함유하는 LB-한천 플레이트에서 배양하였다. 밤새 배양한 후, 단일 콜로니를 선택하고 37°C에서 50μg/ml 카나마이신 및 100μM ZnCl2를 함유하는 액체 배지에서 밤새(전배양) 배양하였다 다음날, 전배양의 일부를 다량의 액체 배지에 옮기고, 흡광도 A600 nm, = ~0.5-0.70이 될 때까지 37 °C에서 배양했다. 배양물을 약 1시간 동안 얼음 위에 두었고, 그 후 0.5mM의 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG; GoldBio)를 첨가하여 ZFD 단백질 발현을 유도하고 배양물을 18°C에서 14시간 동안 인큐베이션했다.
단백질 정제 과정으로는, 용해 욕액(50 mM Tris-HCl(Sigma-Aldrich), 500 mM NaCl(Sigma-Aldrich), 1 mM MgCl2(Sigma-Aldrich), 10 mM 1,4-dithiothreitol(DTT; GoldBio), 1% Triton X-10 Sigma-Aldrich), 10% 글리세롤, 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(Sigma-Aldrich), 1 mg/ml 닭고기 달걀 흰자위에서 추출한 라이소자임(Sigma-Aldrich), 100μM ZnCl2(Sigma-Aldrich), 100mM Sigma-Aldrich), pH 8.0).으로 세포를 용해시키고, 세포를 더 용해시키기 위해서 초음파 처리(3 min total, 5 s on, 10 s off)를 해줬다. 이것들을 해준 뒤 용액은 원심분리(13,000 rpm)하여 상층액만 추출하였다. 상층액은 Glutathione Sepharose 4B (GE healthcare)를 첨가하여 1시간 동안 인큐베이션 해주었다. 인큐베이션 후, resin-lysate 혼합물은 컬럼에 부어줬고, 세척 완충액(50mM Tris-HCl (Sigma-Aldrich), 500mM NaCl (Sigma-Aldrich), 10mM DTT (GoldBio), 1 mM MgCl2 (Sigma-Aldrich), 100μM ZnCl2 (Sigma-Aldrich), 10% glycerol, 100 mM arginine (Sigma-Aldrich), pH 8.0)으로 3번 씻어줬다. 레진 (resin)에 붙어 있는 단백질은 용출버퍼(50mM Tris-HCl (Sigma-Aldrich), 500mM NaCl (Sigma-Aldrich), 1mM MgCl2 (Sigma-Aldrich), 40 mM glutathione (Sigma-Aldrich), 10% glycerol, 1mM DTT (GoldBio), 100μM ZnCl2 (Sigma-Aldrich), 100 mM arginine (Sigma-Aldrich), pH 8.0)로 resin으로부터 분리해주었다. 마지막으로, 추출된 단백질은 ~15 ng/μL(200-240 pmol/μL, 단백질 크기에 따라서)의 농도로 농축되었다.
ZFD에 의한 PCR 앰플리콘의 시험관내 탈아미노화
TRAC 부위를 포함하는 앰플리콘은 PCR을 사용하여 제조되었다. 8 μg의 앰플리콘을 37 °C에서 1-2시간 동안 100 μM ZnCl2를 포함하는 NEB3.1 완충액에서 2 μg의 각 ZFD 단백질(Left-G1397N 및 Right-G1397C)과 함께 인큐베이션 했다. 반응 후, 4 μL의 Proteinase K 용액(Qiagen)을 넣고 55°C에서 30분 동안 인큐베이션 하여 ZFD를 제거하였고, 앰플리콘은 PCR 정제 키트(MGmed)를 사용하여 정제되었다. 1 μg의 정제된 앰플리콘을 37°C에서 1시간 동안 2개의 USER 효소(NEB)와 함께 인큐베이션했다. 그런 다음, 앰플리콘을 4 μL의 프로테이나제 K 용액(Qiagen)과 함께 인큐베이션하고 PCR 정제 키트(MGmed)를 사용하여 다시 정제하였다. 정제된 PCR을 아가로스 겔에서 전기영동하고 이미지화하였다.
표적 딥 시퀀싱.
표적 및 오프타겟 부위의 염기교정 비율 분석을 위해 표적 부위는 중첩된 1차 PCR, 2차 PCR 증폭 및 TruSeq HT Dual 인덱스 함유 프라이머를 사용한 3차 PCR을 PrimeSTAR® GXL DNA 중합효소(TAKARA)를 사용하여 딥 시퀀싱 라이브러리를 생성했다. 라이브러리는 Illumina MiniSeq를 사용하여 paired-end 시퀀싱 하였다.
mRNA 준비
ZFD 서열의 업스트림에 T7 RNA 중합효소 프로모터를 포함하는 DNA 주형은 정방향 및 역방향 프라이머(정방향: 5'-CATCAATGGGCGTGGATAG-3' SEQ ID No: 116, 역방향: 5'-CATCAATGGGCGTGGATAG-3' SEQ ID No: 117, 역방향: 5'-GACACCTACTCAGACAATGC-3' SEQ ID No: 118)에 의해서 PCR 제작되었다. mRNA는 mMESSAGE mMACHINE™ T7 ULTRA 전사 키트(Thermo Fisher)를 사용하여 시험관 내에서 합성되었다. 시험관 내 전사된 mRNA는 제조사의 프로토콜에 따라 MEGAclear™ Transcription Clean-Up Kit(Thermo Fisher)를 사용하여 정제되었다.
전체 미토콘드리아 게놈 시퀀싱
전체 미토콘드리아 게놈 시퀀싱의 경우 세 단계가 필요하다. 1. 분리된 미토콘드리아에서 mtDNA 추출: 먼저, 3×105 HEK293T 세포를 트립신 처리하고 ND1 또는 ND2 표적 mitoZFD 쌍으로 트랜스펙션 후 96시간 후에 원심분리(500g, 4분, 4℃)에 의해 수집하였다. 그 다음, 세포를 인산염 완충 식염수(Welgene)로 세척하고 원심분리하여 다시 수집하였다. 상층액을 제거하고 제조사의 프로토콜에 따라 Mitochondria Isolation Kit for Cultured Cells(Thermo Fisher)의 시약 기반 방법을 사용하여 배양된 세포에서 미토콘드리아를 분리했다. mtDNA는 DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen)를 사용하여 분리된 미토콘드리아에서 추출되었다. 2.NGS 라이브러리 생성: 추출된 mtDNA에서 NGS 라이브러리를 생성하기 위해 Nextera™ DNA CD Indexes(Illumina)가 포함된 Illumina DNA Prep 키트를 사용했다. 3. NGS: 라이브러리를 풀링하고 MiniSeq 시퀀서(Illumina)에 로드했다. 평균 시퀀싱 depth는 50보다 컸다.
미토콘드리아 게놈 전체 DNA 교정 분석
전체 미토콘드리아 게놈 시퀀싱의 NGS 데이터를 분석하기 위해 BWA를 사용하여 Fastq 파일을 GRCh38.p13(릴리스 v102) 참조 게놈에 정렬하고 읽기 페어링 정보 및 플래그를 수정하여 SAMtools(v.1.9)로 BAM 파일을 생성했다. 그런 다음 REDItools(v.1.2.1)의 REDItoolDenovo.py 스크립트를 사용하여 미토콘드리아 게놈의 모든 시토신 및 구아닌 중에서 염기 교정율이 1% 이상인 위치를 식별했다. 세포주의 염기 교정율이 50% 이상인 위치를 단일 뉴클레오티드 변이로 간주하여 모든 샘플에서 제외했다. off-target 분석을 위해서 각 ZFD의 표적 부위를 제외했다. 교정 빈도가 ≥ 1%인 나머지 위치를 off-target으로 간주하고 교정된 C/G 뉴클레오타이드의 수를 계산했다. 미토콘드리아 게놈의 offtarget의 평균 C/G에서 T/A 염기 교정 빈도를 계산하기 모든 C/G에 대해서 평균화했다. 특이성 비율은 on-target 평균 수치를 off-target 평균 수치로 나눠서 계산하였다. 미토콘드리아 게놈 전체 그래프는 표적 및 표적을 벗어난 위치에서 염기 교정율 표시하여 생성되었다.
1-2. ZFD 구조의 최적화
인간 및 다른 진핵세포에서 염기 교정을 하기 위한 ZFD를 개발하기 위해서, 먼저 반쪽 DddAtox에 붙는 징크 핑거 단백질(ZFP)의 아미노산 링커와 스페이서(spacer) 의 길이를 최적화 시키려고 했다. 왼쪽과 오른쪽 ZFP가 붙는 곳 사이인 스페이서에서 C에서 T로의 염기 전환이 일어난다. 잘 특성화된 인간 CCR5 유전자를 타겟하는 ZFN 쌍을 골랐다. 이를 이용해서 2, 5, 10, 16, 24 및 32의 여러 가지 아미노산 링커를 갖는 ZFD를 만들었고, ZFD의 왼쪽과 오른쪽 ZFP 결합부위가 있고 반복되는 TC서열이 존재하는 1부터 24 base pair의 길이를 갖는 다양한 스페이서가 있는 일련의 타겟 플라스미드를 만들었다(도 1a, b 및 표1.).
Figure PCTKR2021012872-appb-img-000011
DddAtox는 두 위치(G1333 및 G1397)에서 분할될 수 있으며 각 절반은 왼쪽 또는 오른쪽 ZFP에 융합될 수 있다. 생성된 24개 (=6개 linker x 2개 분할위치x ZFP 융합위치(왼쪽 또는 오른쪽)) ZFD 구성의 염기 교정 효율을 각 24개의 스페이서를 갖는 타켓 플라스미드 대해서 측정했다. Hek293T 세포에서 형질감염 (transfection) 4일차에 딥 시퀀싱 (deep sequencing)을 통해서 측정했다.
[구조]
* Left-ZFD: SV40 NLS-ZFP(S162-left)-linker-DddAtox half-4aa linker-UGI
* Right-ZFD: SV40 NLS-ZFP(S162-right)-linker-DddAtox half-4aa linker-UGI
- SV40 NLS:
PKKKRKV (SEQ ID No: 478)
- ZFP(S162-left)
GIHGVPAAMAERPFQCRICMRNFSDRSNLSRHIRTHTGEKPFACDICGRKFAISSNLNSHTKIHTGSQKPFQCRICMRNFSRSDNLARHIRTHTGEKPFACDICGRKFATSGNLTRHTKIHLR (SEQ ID NO: 2)
- ZFP(S162-right)
GIHGVPAAMAERPFQCRICMRNFSRSDNLSVHIRTHTGEKPFACDICGRKFAQKINLQVHTKIHTGEKPFQCRICMRNFSRSDVLSEHIRTHTGEKPFACDICGRKFAQRNHRTTHTKIHLR (SEQ ID NO: 3)
- 징크 핑거 단백질과 DddAtox half 사이의 링커:
- 2aa: GS
- 5aa: TGEKP (SEQ ID No: 479)
- 10aa: SGAQGSTLDF (SEQ ID No: 9)
- 16aa: SGSETPGTSESATPES (SEQ ID No: 10)
- 24aa: SGTPHEVGVYTLSGTPHEVGVYTL (SEQ ID No: 115)
- 32aa: GSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS (SEQ ID No: 11)
- Split-DddAtox G1333-N
GSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGG (SEQ ID No: 27)
- Split-DddAtox G1333-C
PTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDNGISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEGAIPV KRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGC (SEQ ID No: 272)
- Split-DddAtox G1397-N
GSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGPTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDN GISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEG (SEQ ID No: 273)
- Split-DddAtox G1397-C
AIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGC (SEQ ID No: 26)
- 4aa linker
SGGS (SEQ ID NO: 480)
- UGI
TNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWA LVIQDSNGENKIKML (SEQ ID NO: 481)
짧은 링커를 갖는 ZFD(2 및 5 아미노산(AA) 링커)는 효율이 낮거나 없다. 반면에 10AA 이상의 링커를 갖는 ZFD에서는 4 base pair 이상의 스페이서에서 C에서 T로의 염기 교정 효율이 1%~24% 범위로 나왔다(도 1c 와 도 2a,c). ZFD쌍 중 24AA 링커를 가지는 것이 가장 높은 교정 효율을 보여주었다. 가장 좋은 링커 조합을 찾기 위해, ZFD쌍의 왼쪽 ZFD에 24AA 링커를 고정하고, 오른쪽을 다양한 링커 길이를 가지는 ZFD로 조합을 하여 염기 교정 효율을 보았고, 똑같이 반대로도 해봤다(도 1d 및 도 3). 양쪽 모두 24AA 링커를 가지는 것이 가장 효율이 좋다는 것을 알 수 있었다. 또한 DddAtox가 G1397부분에서 분할되었을 때가 G1333 부분에서 분할되었을 때보다 더 좋은 효율을 가진다는 것을 발견하였다(도 1c와 도 2a,b). 이러한 가장 높은 효율을 가지는 ZFD쌍은 7~21bp의 스페이서에서 >6.7%의 높은 효율로 사이토신을 교정한다(도 1c 및 도 2a, c).
1-3. 생체 내 핵 DNA 타켓에서 염기 교정
다음으로 사람 세포에서 24AA 링커를 갖는 ZFD가 생체내 염색체 타켓 위치에서도 C 에서 T로의 염기 교정을 촉매할 수 있는지 조사하였다. 총 8개 유전자 안에 있는 11곳(2개 ZFD쌍이 한 곳)을 타켓하는 22쌍의 ZFD가 제작되었다(도 4). 그 중에서, 14쌍의 ZFD는 공개적으로 사용가능한 징크 핑거 리소스로부터 가져다 사용하였다. 이전에 특성화된(previously-characterized) ZFN (CCR5 및 TRAC에 특정한)을 개조하여 다른 8쌍의 ZFD를 만들었다. 이유는 ZFN 같은 경우는 스페이서 길이가 5~7bp에서 타켓 DNA를 자르는 반면에 ZFD는 최소 7 이상인 스페이서 작동하기 때문에, 이러한 ZFN쌍에서 하나 또는 두 개의 징크 핑거를 떼고 붙이며 작동할 수 있는 ZFD들을 만들었다. FokI 뉴클레아제는 부분은 ZFP에 N-말단 이나 C-말단 부분에 융합될 수 있어 4개의 다른 구성을 가지는 ZFN을 만들 수 있기 때문에, 또한 다른 구성을 가지는 2쌍의 ZFD (도 4b에서 Trac-NC) 만들어 분할된 DddAtox 반쪽들도 기존의 ZFP C-말단뿐만 아니라 ZFP의 N-말단 부분에도 융합될 수 있는지 테스트하였다(NC 구성은 도 4a 및 도 5에 도시).
[구조]
* C type: SV40 NLS-Zinc finger protein-24aa linker-DddAtox half-4aa linker-UGI
* N type: SV40 NLS-DddAtox half-24aa linker-Zinc finger protein-4aa linker-UGI
- SV40 NLS
PKKKRKV (SEQ ID No: 478)
- 24aa linker
SGTPHEVGVYTLSGTPHEVGVYTL
- Split-DddAtox G1397-N
GSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGPTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDN GISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEG
- Split-DddAtox G1397-C
AIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGC
- 4aa linker
SGGS
- UGI
TNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWA LVIQDSNGENKIKML
- ZFP
CCR5-1 Left (C type) [S162 ZFN-Left]
GIHGVPAAMAERPFQCRICMRNFSDRSNLSRHIRTHTGEKPFACDICGRKFAISSNLNSHTKIHTGSQKPFQCRICMRNFSRSDNLARHIRTHTGEKPFACDICGRKFATSGNLTRHTKIHLR
CCR5-1 Right (C type) [S162 ZFN-Right]
GIHGVPAAMAERPFQCRICMRNFSRSDNLSVHIRTHTGEKPFACDICGRKFAQKINLQVHTKIHTGEKPFQCRICMRNFSRSDVLSEHIRTHTGEKPFACDICGRKFAQRNHRTTHTKIHLR
CCR5-2 Left (C type) [S162 ZFN-Left]
GIHGVPAAMAERPFQCRICMRNFSDRSNLSRHIRTHTGEKPFACDICGRKFAISSNLNSHTKIHTGSQKPFQCRICMRNFSRSDNLARHIRTHTGEKPFACDICGRKFATSGNLTRHTKIHLR (SEQ ID NO: 2)
CCR5-2 Right (C type) [Modifying S162 ZFN-Right with additional ZF using the Barbas set of zinc finger modules]
GIHGVPAAMAERPFQCRICMRNFSQSGDLRRHIRTHTGEKPFACDICGRKFARSDNLSVHTKIHTGSQKPFQCRICMRNFSQKINLQVHIRTHTGEKPFACDICGRKFARSDVLSEHTKIHLR (SEQ ID NO: 482)
TRAC-Left (C type) [Adapted from Paschon, D.E. et al., 2019]
GIHGVPAAMAERPFQCRICMRNFSDQSNLRAHIRTHTGEKPFACDICGRKFATSSNRKTHTKIHTGSQKPFQCRICMRNFSLQQTLADHIRTHTGEKPFACDICGRKFAQSGNLARHTKIHLR (SEQ ID NO: 483)
TRAC-Left (N type) [Adapted from Paschon, D.E. et al., 2019]
FQCRICMRKFATSGSLTRHTKIHTGEKPFQCRICMRNFSRSDHLSTHIRTHTGEKPFACDICGRKFATSSNRTKHTKIHTHPRAPIPKPFQCRICMRNFSRSDNLSEHIRTHTGEKPFACDICGRKFAWHSSLRVHTKIHLR (SEQ ID NO: 484)
TRAC-Right (C type) [From Paschon, D.E. et al., 2019]
GIHGVPAAMAERPFQCRICMRNFSRSDHLSTHIRTHTGEKPFACDICGRKFADRSHLARHTKIHTGSQKPFQCRICMRKFALKQHLNEHTKIHTGEKPFQCRICMRNFSQSGNLARHIRTHTGEKPFACDICGRKFAHNSSLKDHTKIHLR (SEQ ID NO: 485)
MFAP1 Left (C type) [De novo designed using the Toolgen set of zinc finger modules]
GIRIPGEKPYSCGICGKSFSDSSAKRRHCILHTGEKPYTCSDCGKAFRDKSCLNRHRRTHTGEKPYKCMECGKAFNRRSHLTRHQRIHTGEKPYECNYCGKTFSVSSTLIRHQRIHLR (SEQ ID NO: 486)
MFAP1 Right (C type) [Modifying S162 ZFN-Right with additional ZF using the Barbas set of zinc finger modules]
GIRERPYACPVESCDRRFSTSGSLVRHIRIHTGQKPFQCRICMRNFSRSDELTRHIRTHTGEKPFACDICGRKFARSDHLTTHTKIHTGEKPFQCRICMRKFAQSSNLVRHTKIHLR (SEQ ID NO: 487)
CCDC28B Left (C type) [Modifying S162 ZFN-Right with additional ZF using the Barbas set of zinc finger modules]
GIRERPYACPVESCDRRFSDPGHLVRHIRIHTGQKPFQCRICMRNFSRSDELTRHIRTHTGEKPFACDICGRKFARSDHLTTHTKIHTGEKPFQCRICMRKFARSDKLVRHTKIHLR (SEQ ID NO: 488)
CCDC28B Right (C type) [De novo designed using the Toolgen set of zinc finger modules]
GIRIPGEKPYECNYCGKTFSVSSTLIRHQRIHTGEKPYHCDWDGCGWKFARSDELTRHYRKHTGEKPFECKDCGKAFIQKSNLIRHQRTHTGEKPYHCDWDGCGWKFARSDELTRHYRKHLR (SEQ ID NO: 489)
KDM4B Left (C type) [Modifying S162 ZFN-Right with additional ZF using the Barbas set of zinc finger modules]
GIRERPYACPVESCDRRFSDCRDLARHIRIHTGQKPFQCRICMRNFSRSDELTRHIRTHTGEKPFACDICGRKFARSDHLTTHTKIHTGEKPFQCRICMRKFARSDKLVRHTKIHLR (SEQ ID NO: 490)
KDM4B Right (C type) [De novo designed using the Toolgen set of zinc finger modules]
GIRIPGEKPFECKDCGKAFIQKSNLIRHQRTHTGEKPYRCEECGKAFRWPSNLTRHKRIHTGEKPYRCEECGKAFRWPSNLTRHKRIHTGEKPYSCGICGKSFSDSSAKRRHCILHLR (SEQ ID NO: 491)
NUMBL Left (C type) [Modifying S162 ZFN-Right with additional ZF using the Barbas set of zinc finger modules]
GIRERPYACPVESCDRRFSDCRDLARHIRIHTGQKPFQCRICMRNFSRSDELTRHIRTHTGEKPFACDICGRKFARSDHLTTHTKIHTGEKPFQCRICMRKFARSDKLVRHTKIHLR (SEQ ID NO: 492)
NUMBL Right (C type) [De novo designed using the Toolgen set of zinc finger modules]
GIRIPGEKPYTCSDCGKAFRDKSCLNRHRRTHTGEKPYKCGQCGKFYSQVSHLTRHQKIHTGEKPFECKDCGKAFIQKSNLIRHQRTHTGEKPYHCDWDGCGWKFARSDELTRHYRKHLR (SEQ ID NO: 493)
INPP5D-1 Left (C type) [Modifying S162 ZFN-Right with additional ZF using the Barbas set of zinc finger modules]
GIRERPYACPVESCDRRFSRSDKLVRHIRIHTGQKPFQCRICMRNFSRSDELTRHIRTHTGEKPFACDICGRKFARSDHLTTHTKIHTGEKPFQCRICMRKFARSDKLVRHTKIHLR (SEQ ID NO: 494)
INPP5D-1 Right (C type) [De novo designed using the Toolgen set of zinc finger modules]
GIRIPGEKPYTCSDCGKAFRDKSCLNRHRRTHTGEKPYECNYCGKTFSVSSTLIRHQRIHTGEKPYTCSDCGKAFRDKSCLNRHRRTHTGEKPYTCSDCGKAFRDKSCLNRHRRTHLR (SEQ ID NO: 495)
INPP5D-2 Left (C type) [Modifying S162 ZFN-Right with additional ZF using the Barbas set of zinc finger modules]
GIRERPYACPVESCDRRFSRSDKLVRHIRIHTGQKPFQCRICMRNFSRSDELTRHIRTHTGEKPFACDICGRKFARSDHLTTHTKIHTGEKPFQCRICMRKFARSDKLVRHTKIHLR (SEQ ID NO: 496)
INPP5D-2 Right (C type) [De novo designed using the Toolgen set of zinc finger modules]
GIRIPGEKPYECNYCGKTFSVSSTLIRHQRIHTGEKPYTCSDCGKAFRDKSCLNRHRRTHTGEKPYTCSDCGKAFRDKSCLNRHRRTHTGEKPYHCDWDGCGWKFARSDELTRHYRKH (SEQ ID NO: 497)
DVL3 Left (C type) [De novo designed using Barbas zinc finger modules]
GIHGVPAAMAERPFQCRICMRNFSTSGHLVRHIRTHTGEKPFACDICGRKFATSGHLVRHTKIHTGEKPFQCRICMRNFSTSGELVRHIRTHTGEKPFACDICGRKFAQSSNLVRHTKIHLR (SEQ ID NO: 498)
DVL3 Right (C type) [S162 ZFN-left]
GIHGVPAAMAERPFQCRICMRNFSDRSNLSRHIRTHTGEKPFACDICGRKFAISSNLNSHTKIHTGSQKPFQCRICMRNFSRSDNLARHIRTHTGEKPFACDICGRKFATSGNLTRHTKIHLR (SEQ ID NO: 499)
Hek 293T 세포에서, NC 구성을 가지는 ZFD를 포함해서 ZFD의 C에서 T로의 염기 교정 효율은 1.0%~60%를 보인다. 반면에, 삽입-결실(indel)은 <0.4% 정도로 거의 일어나지 않았다(도 4b와 도6). 위에서 설명한 플라스미드 기반으로 한 실험에서 봤듯이, 스페이서 5bp를 가지는 CCR5타켓하는 ZFD는 효율이 굉장히 떨어졌다. 스페이서 길이가 최소 7이상인 타켓에서 다른 20개의 ZFD쌍은 평균 교정 효율이 12.0±3.4%을 보였으며, 이는 평균 8.3±2.2%을 보이는 cas9 기반 염기 교정 유전자 (cas9-derived Base Editor2)와 견줄 만하다. 추가로 C에서 T로의 염기교정은 TC conxtext뿐만 아니라 AC나 GCC에서도 일어났다(도 4c~f). AC는NUMBL의 C6에서, GCC는 INPP5D-2의 C7에서 각각 C염기 교정 효율이 4.58% 와 1.85%까지 나타났다.
Figure PCTKR2021012872-appb-img-000012
1-4. 정제된 ZFD 단백질을 인간 세포에 직접 전달
유전자 교정 단백질을 인코딩하고 있는 플라스미드 DNA를 전달하는 것 대신에 정제된 유전자 교정 단백질 자체를 세포에 전달하는 것이 오프-타겟 (off-target) 영향을 줄이고, 외부 DNA에 의한 선천적 면역 반응(innate immune response)피하며, 외부 플라스미드 DNA의 생체 내 게놈에 삽입해 들어가는 것을 방지할 수 있다. 다른 그룹은 in vitro 및 in vivo에서 ZFP가 포유동물 세포를 자발적으로 통과해 들어갈 수 있다는 것을 보였다. ZFD의 단백질 매개 염기 교정을 증명하기 위해, 효율이 높았던 TRAC 유전자를 타겟하는 ZFD 쌍을 고르고, 1개 또는 4개의 NLS (nuclear localization signal)가 달린 ZFD 재조합 단백질을 대장균에서부터 정제하였다. 첫째로 ZFD 단백질의 염기 교정 효율을 TRAC site를 가지고 있는 PCR 앰플리콘 (amplicon)을 사용해서 in vitro에서 실험을 하였고, 효율이 굉장히 높다는 것을 확인하였다. 효율은 Uracil DNA glycosylase 와 DNA glycosylase-lyase Endonuclease VIII의 혼합물인 우라실 특이적 절단 시약(USER)을 통해서 유전자가 잘리는 것을 통해 확인할 수 있었다(도 7). 형질감염하기 어려운 세포인 인간 백혈병 세포 K562 세포에 TRAC-NC ZFD 단백질을 두 가지 방식, electroporation 또는 electroporation 없이 직접전달(direct delivery)으로 전달하였다. ZFD 단백질은 굉장히 효율적이었다. C에서 T로의 염기 교정을 26.5%(electroporation) 및 17%(direct delivery)을 보였다(도 4g). 종합해보면, 이러한 결과들은 ZFD를 인코딩하는 플라스미드 또는 정제된 재조합 ZFD 단백질이 사람 세포의 핵 DNA를 염기 교정하는데 사용될 수 있다는 것을 보여준다.
1-5. ZFD의 미토콘드리아 DNA 염기교정
크리스퍼 기반 시스템과는 달리, 맞춤 설계된 (custom-designed) DNA 결합 단백질에 분할 DddAtox를 융합한 시스템의 큰 이점은 이런 프로그램 가능한 염기 교정 가위가 미토콘드리아 DNA와 같은 세포 소기관 DNA를 교정하는데 이용될 수 있다는 것이다. ZFD를 미토콘드리아에 전달하기 위해, MTS (mitochondrial targeting signal)과 NES (nuclear export signal)를 미토콘드리아 유전자를 타겟하도록 설계된 9개의 ZFD들 N말단 부분에 연결하여 mitoZFD들을 제작하였다(도 8). ZFD의 ZFP부분은 공개적으로 사용가능한 zinc finger 리소스에서 가져왔다. ZFD는 스페이서 길이를 7~15bp 가질 수 있도록 제작하였고, DNA 결합부위는 왼쪽과 오른쪽 모두 12bp가 되도록 하였다.
[구조]
* C type: MTS-FLAG tag-NES-Zinc finger protein-24aa linker-DddAtox half-4aa linker-UGI
* N type: MTS-HA tag-NES-DddAtox half-24aa linker-Zinc finger protein-4aa linker-UGI
- MTS (Mitochondrial Targeting Sequence of human mitochondrial ATP synthase F1β subunit)
MLGFVGRVAAAPASGALRRLTPSASLPPAQLLLRAAPTAVHPVRDYAAQ (SEQ ID No:274)
- FLAG tag (C type)
DYKDDDDK (SEQ ID No:275)
- HA tag (N type)
YPYDVPDYA (SEQ ID No:276)
- NES (Nuclear export signal)
VDEMTKKF (Minute virus if mice; MVM NES)
- Split-DddAtox G1397-N
GSYALGPYQISAPQLPAYNGQTVGTFYYVNDAGGLESKVFSSGGPTPYPNYANAGHVEGQSALFMRDN GISEGLVFHNNPEGTCGFCVNMTETLLPENAKMTVVPPEG
- Split-DddAtox G1397-C
AIPVKRGATGETKVFTGNSNSPKSPTKGGC
- 4aa linker
SGGS
- UGI
TNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWA LVIQDSNGENKIKML
- ZFP
* 징크핑거들은TGEKP 링커들로 연결되어 있다. (ZF1-linker-ZF2-linker-ZF3-linker-ZF4).
* ND2-타겟 mitoZFD는 QQ 변이체를 가지고 있다. 이 변이체는 R또는 K 아미노산을 Q로 치환한 것이다. 빨간 글자로 표시되어 있다.
Figure PCTKR2021012872-appb-img-000013
Figure PCTKR2021012872-appb-img-000014
HEK293T세포에서 mitoZFD에 의한 미토콘드리아 DNA 염기 교정 효율은 2.6%~30%(평균14±3% )이다(도 9a). NC 구성을 가지는 mitoZFD(16±4.5%, n=6)는 CC구성(8.3±2.7%, n=3)을 가지는 것만큼 효율이 나왔다. 스페이서 부분에서 TC context 를 가지는 대부분의 사이토신은 다양한 효율로 염기 교정되었다(도 9b~g). 추가로, ND2 부위에 있는 ACC (C8 및 C9) context를 가지는 사이토신도 각각 7.4% and 19.9% 정도되는 효율을 보였다(도 9b). 이것은 ZFD를 매개로하는 C에서 T로의 염기 교정이 TC motif에 국한되지 않는다는 것을 보여준다.
다음으로 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 변이 세포에서 단세포 유래 클론집단(single-cell derived clonal populations)을 분리해 mitoZFD가 독성이 있지 않고, 변이 mtDNA가 클론집단에서도 유지된다는 것을 증명하려고 했다. ND1-specific mitoZFD을 처리한 HEK293T 세포에서 분리한 단세포 유래 30개의 클론 집단 중, 5개는 ND1 유전자의 염기 교정 효율이 35%에서 98%로 나왔다(도 10a). 마찬가지로, ND2-specific mitoZFD를 처리한 HEK293T 세포에서 분리한 단세포 유래 36개 클론 집단 중, 7개는 ND2 유전자의 염기 교정 효율이 26%에서 76%로 나왔다(도 10b). 다른 모든 클론집단에 대해서는 0.4%-1.0%로 낮은 효율을 보였고, 대부분은 시퀀싱 에러처럼 보인다. ZFD를 처리하지 않은 세포에서도 비슷한 효율이 나왔다(도 10c). 이러한 결과는 mitoZFD가 heteroplasmic한 변이를 세포 개체에서 고르게 일으키지 않는다는 것을 보여준다. ZFD를 처리한 세포에서 대부분은 wild-type이고, 반면에 heteroplasmic 변이를 가지는 것은 98%까지의 변이율을 가진다. 이러한 변이는 clonal expansion을 해도 계속 유지된다(도 11 및 도 12).
1-6. mitoZFDs 및 TALE-기반 DdCBEs
제작한 ND1-specific mitoZFD가 동일한 유전자를 타겟하는 TALE 기반 DdCBE와 변이 패턴이 다른 것을 알 수 있었다(도 9f-h). 2개의 mitoZFD 같은 경우 C5 또는 C8 위치의 사이토신을 C에서 T로의 염기교정을 하는 반면(도 9f), DdCBE는 C8, C9, 및 C11 부위를 염기 교정을 한다(도 9g). 결과적으로, mitoZFD에 의한 아미노산 변화는 완전하게 DdCBE에 의한 아미노산 변화와 다르다(도 9h). mitoZFD가 붙는 왼쪽과 오른쪽 부분이 스페이서 8-bp 길이로 나눠진 반면, DdCBE 같은 경우 스페이서 길이 16-bp 길이로 나눠져 있기 때문에 이러한 차이로 인해 다른 변이 패턴을 가질 수 있다. 이러한 결과는 미토콘드리아 DNA에서 mizoZFD와 DdCBE가 서로 보완적으로 다양한 변이를 만들어 낼 수 있다는 것을 보여준다.
변이 패턴을 더 많이 만들기 위해, ZFD 단일체와 DdCBE의 단일체가 혼합되어 혼합쌍(hybrid pair)으로 사용될 수 있는지 테스트하였다. ND1 유전자를 타겟하는 10개의 혼합쌍은 HEK293T 세포에서 평균 17±3.4%의 염기 교정 효율로 좋은 활성을 보였다(도 13). 실제로, 혼합쌍 중 하나(TALE-L/ZFD-R1)는 두개의 DdCBE쌍 및 10개의 같은 곳을 타겟하는 ZFD 쌍보다 더 좋은 효율을 보였으며 가장 높은 41%의 염기 교정 효율을 보였다(도 13b). 더욱이, 혼합쌍은 DdCBE 및 mitoZFD와는 다른 변이 패턴을 보였다(도 13c). 몇 개(예를 들어, ZFD-L1/TALE-R 및 ZFD-L2/TALE-R)는 다른 부수적인 변이 없이 한 곳에서만 C에서 T로의 변이를 일으켰다. 대조적으로, 대부분의 mitoZFD쌍과 DdCBE쌍은 스페이서 내 여러 곳에서 C에서 T로의 변이를 일으킨다. 이러한 결과는 ZFD/DdCBE 혼합쌍이 특이적인 변이 패턴을 만들 수 있고, ZFD쌍이나 DdCBE쌍으로는 만들 수 없는 특정한 변이를 만들어 낼 수 있다는 것을 보여준다.
1-7. mitoZFD의 미토콘드리아 genome-wide 타겟 특이성
mitoZFD가 미토콘드리아 DNA에서 off-target을 일으키는지 확인하기 위해서 ND1 또는 ND2 유전자를 타겟하는 두 쌍의 mitoZFD을 처리한 세포에서 유전자를 추출하고 미토콘드리아 전체 유전자 시퀀싱(whole mitochondrial genome sequencing)을 하였다. 다양한 양(5~500ng)의 mitoZFD 쌍을 인코딩하는 mRNA 또는 plasmid을 HEK293T 세포에 형질감염 하였다. 예측한대로, on-target 효율은 양에 의존적이였다(dose dependent). 높은 농도(100, 200 및 500ng)의 mRNA 또는 plasmid는 on-target에서 >30%의 효율을 보였지만, 수백개의 1%가 넘는 off-target도 일으켰다(도 14-17). 낮은 농도(5 및 10ng)에서는 이러한 off-target들이 거의 없어졌지만, on-target에서의 효율 역시 확연히 낮아졌다. 중간 농도인 50ng양의 mRNA가 가장 적절하였다. 수백개의 off-target을 일으키지 않으면서, 높은 on-target 효율을 유지하였다. 좀 더 남은 off-target을 없애기 위해, R(-5)Q 변이를 각 zinc finger 부분에 도입해서 비 특이적 DNA 접촉을 없애고자 하였다. 제작된 ZFD 변이체 (도 18에서 QQ로 나타냄)는 높은 on-target 활성은 유지하면서 off-target이 ZFD를 처리하지 않은 세포의 mtDNA에 비교해서 거의 없는 정교한 특이성을 가졌다 (도 18 a 및 b).
염기 교정은 DNA 두 가닥 절단을 일으키지 않고 DNA 수선 템플릿 없이 타겟 염기를 교정할 수 있는 비교적 새로운 기술이다. 염기교정은 세포,동물 및 식물에서 C에서 T로의 또는 A에서 G로의 염기 교정을 일으켜 단일 염기 변이(SNP)의 기능적 영향을 연구할 수 있고, 치료 어플리케이션으로 질병을 일으키는 point mutation을 고치는 것을 할 수 있다. 두가지 종류의 염기 교정 기술이 개발되었다. CRISPR 기반인 아데닌 및 사이토신 염기 교정 가위와 DddA 기반의 염기 교정 기술이다. CRISPR 기반의 염기 교정 가위는 DNA 결합 유닛으로 catalytically-impaired Cas9 또는 Cas12a를 구성하고 있고, deaminase는 rat 또는 E.coli 유래의 단일 나선 DNA 특이적인(single-strand DNA specific) 것을 가지고 있다. 반면에, DdCBE 같은 경우 TALE DNA 결합 array와 이중 나선 DNA 특이적인(double-strand DNA specific) DddAtox를 구성하고 있다.
DdCBE와 비교해서 ZFD는 크기가 더 작다. 왜냐하면 ZFD에 포함된 zinc finger 단백질의 크기가 작은데 반해 DdCBE에 포함된 TALE array는 크기가 크기 때문이다. 결과적으로, 작은 탑재 공간을 가지고 있는 AAV 벡터에 ZFD 쌍을 인코딩하고 있는 유전자는 쉽게 탑재할 수 있는 반면에 DdCBE 쌍을 인코딩하는 유전자는 그렇지 못하다. 추가로, 간소한 ZFP 특성으로 인해 엔지니어링 하기가 쉽다. 반쪽 DddAtox를 ZFP의 N-말단 또는 C-말단 부분에 융합할 수 있기 때문에 ZFP 결합 부위의 상류 또는 하류에 작동하도록 만들 수 있다. 더욱이, ZFD 재조합 단백질은 전기천공이나 리포펙션 없이 자발적으로 사람 세포에 관통해서 들어갈 수 있다. 이는 gene-free 유전자 치료를 가능할 수 있게 한다. ZFD 쌍 또는 ZFD/DdCBE 혼합쌍은 고유한 변이 패턴을 만들 수 있다. 이는 DdCBE만 사용해서는 얻을 수 없는 패턴이었다. 이러한 특성들은 ZFD가 미토콘드리아 질병의 모델링 및 치료에 새로운 강력한 플랫폼이 되도록 한다.
실시예 2. TALE-DdCBE 식물 엽록체, 미토콘드리아 유전자 교정
미토콘드리아와 엽록체를 포함하는 식물 소기관에는 각각 호흡과 광합성을 위한 필수적인 많은 유전자를 암호화하는 자체 게놈이 있다. 식물 유전학과 생명공학에 대한 충족되지 않은 조건인 식물 소기관 유전자 교정은 이러한 세포 기관의 DNA를 표적화하기 위한 적절한 도구의 부족으로 인해 제한되어 왔다. DddA-유래 시토신 염기 교정 플라스미드 (DdCBE)를 조립하기 위해 16개의 발현 플라스미드 (생성 단백질을 미토콘드리아 전달하기 위한 8개, 및 엽록체로 전달하기 위한 다른 8개)와 424개의 TALE 서브 어레이 플라스미드로 구성된 골든 게이트 클로닝 시스템을 개발했고, 미토콘드리아와 엽록체에 효율적으로 증진된 점 돌연변이를 만들기 위해 완성된 DdCBE 플라스미드를 사용하였다. DdCBE 염기 교정은 상추 또는 유채의 칼리에서 최대 25% (미토콘드리아)와 38% (엽록체)의 효율을 유도하였다. DdCBE를 암호화하는 플라스미드에서 원인이 되는 비표적변이를 피하고자 DdCBE 메신저 RNA를 상추 원형질체에 전달하여 DNA 없이 염기교정을 엽록체에서 보여줬다. 게다가, 엽록체 16S rRNA 유전자의 점돌연변이를 도입하여 스트렙토마이신 또는 스펙티노마이신에 저항성이 있는 최대 99%의 교정 효율을 가지는 상추 칼리와 유식물체를 만들었다.
DdCBEs는 박테리아 시토신 디아미나아제 독성 물질 DddAtox에서 유래된 분리된 비독성 도메인과 특정 위치에 맞게 디자인된 TALE array 및 UGI로 구성되어 헤테로다이머로 타겟 DNA의 TALE 단백질 결합 위치 사이 스페이서 공간에서 시토신을 티민으로 치환하는 시토신 디아미네이션 반응을 일으키는 기능을 한다. 미토콘드리아와 엽록체로 발현하는 DdCBE 플라스미드의 결합을 빠르고 편리하게 나타내며 높고 효율적인 식물에서의 소기관 염기교정을 입증하는 것을 DdCBEs 결과로 사용하였다.
2-1. 방법
식물 원형질체에서의 발현 플라스미드 제작
DdCBE 골든 게이트 데스티네이션 벡터는 깁슨 어셈블리 방법을 이용하여 제작되었다. TAL N-터미널 도메인, HA tag, FLAG tag, TAL C-터미널 도메인, 분할 DddAtox, 및 UGI를 인코딩 하는 서열은 쌍자엽식물 (애기장대) 발현에 코돈 최적화하였고, Integrated DNA Technology를 통해 합성되었다. AtinfA 와 AtRbcS로부터의 CTP와 ATPase 델타 서브유닛과 ATPase 감마 서브유닛으로 부터의 MTS를 인코딩하는 서열은 애기장대 cDNA로부터 증폭되었다. 식물 발현을 위해 백본 플라스미드에서 포유류 CMV 프로모터를 PcUbi 프로모터와 pea3A 터미네이터로 대체하여 사용하였다. 기내 DdCBE mRNA 전사를 위해 벡터 제작에는, T7 프로모터 카세트가 DdCBE 골든 게이트 데스티네이션 벡터에서 PcUbi 프로모터와 DdCBE 인코딩 지역 사이에 도입되었다.
TALE 어레이 유전자는 단일 골든 게이트 어셈블리를 이용하여 제작되었다. DdCBE 발현 플라스미드는 424개의 TALE 어레이 플라스미드와 데스티네이션 벡터를 이용하여 BsaⅠ 분해와 T4 라이게이션의 골든 게이트 어셈블리로 제작되었다. 단일 골든 게이트 클로닝은 다음과 같이 수행되었다. 20 반복의 37℃와 50℃ 각 5분, 최종 50℃ 15분 반응 후 80℃ 5분. 모든 식물 원형질체 형질주입 벡터는 플라스미드 플러스 미디프랩 키트 (퀴아젠)을 이용하여 정제되었다. 벡터의 DNA와 아미노산 서열은 다음과 같다.
Figure PCTKR2021012872-appb-img-000015
DdCBE의 구성에 대한 구체적 아미노산 서열 및 TALE repeat에 대한 구체적 아미노산 서열은 다음과 같다.
Figure PCTKR2021012872-appb-img-000016
Figure PCTKR2021012872-appb-img-000017
Figure PCTKR2021012872-appb-img-000018
Figure PCTKR2021012872-appb-img-000019
Figure PCTKR2021012872-appb-img-000020
Figure PCTKR2021012872-appb-img-000021
mRNA 기내 전사
DdCBE DNA 템플릿은 퓨전 DNA 폴리머라아제를 이용한 PCR에 의해 준비되었다 (서모 피셔). DdCBE mRNA는 기내 mRNA 합성 키트를 이용하여 합성 정제하였다 (엔지노믹스).
원형질체 추출과 형질도입
상추 종자를 70% 에탄올에 30초 및 0.4% 락스 용액에 15분 표면 살균 후 멸균증류수로 3번 헹군다. 상추 종자는 0.5배 MS 배지와 2% 수크로스가 포함된 배지에 16시간 명조건 8시간 암조건에 25℃에서 파종한다. 유채 종자는 70% 에탄올 3분 및 1.0% 락스 용액에 30분 표면 살균 후 멸균증류수로 3번 헹군다. 유채 종자는 1배 MS 배지와 3% 수크로스가 포함된 배지에 16시간 명조건 8시간 암조건에 25℃에서 파종한다.
원형질체 추출과 형질도입은 이전 연구를 따라 수행한다. 7일된 상추와 14일된 유채의 떡잎을 효소 용액에 흔들리는 (40rpm) 암조건에서 3시간 처리한다. 원형질체-효소 혼합물은 동일양의 W5 용액을 이용하여 워시 후, 온전한 원형질체를 80g 7분 원심분리를 하여 수크로스 용액으로부터 얻는다. 원형질체는 W5 용액에서 4℃ 1시간 처리 후 폴리에틸렌 글라이콜을 이용한 형질도입을 한다.
상추 원형질체와 유채 원형질체는 MMG 용액에 재현탁 후 플라스미드 또는 mRNA를 PEG를 이용한 형질도입을 진행하고 20분간 상온에서 배양한다. PEG-원형질체 혼합물은 동일양의 W5 용액을 이용하여 3번 헹구는데 매번 천천히 뒤집으면서 그 이후 10분간 배양한다. 원형질체는 그 이후 100g 5분간 원심분리하여 펠렛형태로 만든다.
원형질체 배양
상추 원형질체는 DdCBE를 인코딩하는 플라스미드가 도입된 후 상추 원형질체 배양 배지 (LPCM)에 의해 재부유하였다. 배지를 포함한 원형질체는 배지와 로우멜팅아가로스 2.4%가 포함된 배지와 1:1로 섞은 다음 즉시 6웰 접시에 올린다. 이후 혼합물은 고체화되면, 임베딩된 원형질체 위로 1ml의 액체배지를 올린 뒤 25℃ 암조건에서 1주 동안 배양한다. 초기 배양 이후, 위에 올려진 액체배지를 신선한 배지로 매주 갈아주고, 임베딩된 원형질체는 16시간 약한 명조건 8시간 암조건에서 1주일 배양한 뒤 16시간 명조건 8시간 암조건에서 2주간 배양한다. 원형질체로부터 유도된 작은 캘러스는 재분화배지에 4주간 25℃ 16시간 명조건 8시간 암조건에서 배양한다. 염기 교정 효율의 분석을 준비할 때는, 원형질체는 임베딩 없이 액체배지에서 25℃에 암조건에서 1주간 배양했다. 항생제 저항성을 실험하기 위해, 한달 임베딩 된 작은 캘러스는 50mg/L 농도의 스트렙토마이신 또는 50mg/L 농도의 스펙티노마이신이 포함된 재분화배지에서 25℃ 16시간 명조건 8시간 암조건에서 4주간 배양했다. 4주 뒤, 항생제 저항성 녹색 캘러스나 부정지는 200mg/L 농도의 스트렙토마이신 또는 50mg/L 농도의 스펙티노마이신이 포함된 새로운 재분화 배지로 옮겼다.
DdCBE 인코딩 플라스미드가 도입된 유채 원형질체는 유채 배양 배지에 재부유하였다. 원형질체-배지 혼합물은 6 웰 접시에 옮긴 뒤 25℃ 암조건에서 2주 동안 배양한다. 2주 뒤, 원형질체는 16시간 약한 명조건 8시간 암조건에서 3주 배양했다. 배지는 매우 신선한 배지로 교체하였다.
DNA와 RNA 추출
액체 배지에서 배양된 세포나 형질전환 된 캘러스의 총 DNA 또는 RNA는 디엔이지 식물 미니 키트 또는 알엔이지 식물 미니 키트를 이용하여 추출하였다. 배양된 세포나 캘러스는 10,000rpm에서 1분간 원심분리하여 수확하였다. 총 RNA로부터의 cDNA는 RNA to cDNA EcoDry Premix (타카라)를 이용하여 역전사되었다.
딥시퀀싱
타겟 지역은 퓨전 효소와 적절한 프라이머를 이용하여 증폭하였다 (서플 테이블 1). DNA 서열 분석 라이브러리를 만들기 위해 세 라운드의 PCR (첫째, nested PCR, 둘째, PCR, 셋째, 인덱싱 PCR)을 수행하였다. 동일 양의 DNA를 모은 뒤 MiniSeq (일루미나) 장비를 이용하여 서열분석하였다. 페어 인드 시퀀싱 파일은 Cas-analyzer와 컴퓨터 프로그램 소스코드에 의해 분석되었다.
2-2. 결과
엽록체를 타겟으로 하는 DdCBE (cp-DdCBE)와 미토콘드리아 타겟으로 하는 DdCBE (mt-DdCBE)를 만들기 위해 골든 게이트 어셈블리 시스템을 개발하였다 (도 19). 발현 플라스미드는 결합된 단백질로 엽록체 전달 펩타이드 또는 미토콘드리아 타겟팅 서열, TALE의 N- 또는 C- 터미널 도메인, 분할 DddAtox (G1333N, G1333C, G1397N, 및 G1397C)와 UGI를 암호화하며 이것은 쌍떡잎 식물의 발현에 최적화되어 있으며, 그것은 파슬리 유비퀴틴 (PcUbi) 프로모터와 pea3A 터미네이터로 조절된다. 커스텀 디자인된 TALE DNA 결합 서열과 DdCBE 플라스미드는 발현용 벡터와 여섯 개의 TALE 서브어레이 플라스미드를 E-tube에 섞어 단일 서브클로닝 단계로 만들 수 있다. 총 424 개의 (6X64 3 서열을 인식 + 2X16 2 서열을 인식 + 2 X 4 1 서열을 인식) 모듈형 TALE 서브어레이 플라스미드들은 5’ 끝에 보존된 T 를 포함하여 16-20 염기서열 길이를 인식하는 cp-DdCBE와 mt-DdCBE를 만들 수 있다. 결과적으로, 기능적으로 DdCBE 헤테로다이머는 32에서 40 bp DNA 염기서열을 인식한다.
DdCBEs가 엽록체 염기교정에 촉진이 가능한지 알기 위해, 30S 리보솜 서브유닛의 RNA 화합물의 암호화 하는 엽록체 16S rRNA 유전자에 알맞은 cp-DdCBEs 플라스미드 4쌍을 제작하였고, 상추와 유채 원형질체에 각각의 쌍을 같이 형질주입한 뒤, 7일 후 딥시퀀싱을 통해 염기 교정 효율을 측정하였다 (도 20a, b). 가장 높은 효율을 보인 cp-DdCBE 쌍은 (Left-G1397-N+Right-G1397-C) 두 개의 TALE 결합 부위 사이의 15bp의 스페이서 지역에 상추 원형질체에서는 30%, 유채 원형질체에서는 15%의 효율로 C*G를 T*A로 치환을 유도하였다 (도 20b). 이전 포유류 세포와 생쥐의 결과와 마찬가지로, cp-DdCBE에 의해 5’-TC 모티프인 시토신 (C9, C13)은 티민으로 우선적으로 치환되었다. 흥미롭게, 5’-AC 모티프인 시토신 (C7)은 상추 원형질체에서 다른 cp-DdCBE (Left-G1333-N+Right-G1333-C)에 의해 4.2%의 효율로 티민으로 교체되었다. 또한, 상추 원형질체에서 cp-DdCBE에 의한 염기교정의 14일 배양과정에서 지속됨을 조사하였다 (도 24). 교정 효율은 최대 10일까지 지속적으로 증가되었고 배양 기간 내내 유지되었다.
광계 Ⅱ 에서 각각 D1와 CP-47 광합성 단백질 암호화하는 엽록체 유전자인 psbA와 psbB를 두 개의 추가적으로 실험하였다 (도 20c, d 및 도 25). Psb 유전자를 타겟으로 하는 cp-DdCBE 중에, 가장 효율이 높은 것은 (Left-G1397-C+Right-G1397-N) 상추 원형질체에서 C*G를 T*A로 치환을 최대 25%까지 유도 가능하였다 (도 20d). 이 염기교정 가위에 의해 오직 5’-TCC 두 개의 시토신 (C11, C12)만 효율적으로 티민으로 치환되었다. 이것은 5’-TCC가 처음 5’-TTC로 치환되었다가 그 다음 5’-TTT 될 가능성이 있다. 유채 원형질체에서, 다른 조합 (Left-G1333-N+Right-G1333-C)가 네 개의 시토신 위치 (C3, C4, C11, C12) 에서 가장 높은 효율을 보였고 최대 3.5% (C3)까지 효율을 보였다. 유채의 유전자에는 C3와 C4는 5’-TCC 서열이지만, 상추에서는 상대적으로 단일 염기 다형성 때문에 5’-ACC 서열을 가지고 있어 DdCBE에 의해 유채 유전자에서는 두 개의 시토신 (C3, C4)에서 효율적인 교정 효율의 원인이 되지만 상추 유전자에서는 그렇지 못하다. 또한, 유채 원형질체의 psbB 유전자를 타겟으로하는 cp-DdCBE 조합은 TCC 서열이 있는 두 개의 시토신을 0.36%에서 4.1%의 효율로 치환하였다 (도 25). 종합해보면, 이러한 결과는 DddAtox 나눠진 위치 (G1333 vs. G1397)과 방향 (Left-G1333-N vs. Left-G1333-C)을 포함하는 시토신 위치와 서열에 따라 교정 효율이 결정되며 cp-DdCBE는 식물의 엽록체 유전자에 효율적인 염기 교정이 가능한 것을 입증하였다.
다음으로, 맞춤 설계된 mt-DdCBE를 이용하여 식물의 미토콘드리아 DNA의 염기 교정을 달성하려고 하였다. 이를 위해 상추와 유채의 atp6 유전자를 타겟으로 하고 유채의 rps14 유전자를 타겟으로 하는 mt-DdCBE를 인코딩하는 플라스미드 (골든 게이트 클로닝 시스템을 이용)를 제작하고 플라스미드를 상추와 유채의 원형질체에 도입시킨 다음, 도입 7일 후 딥시퀀싱을 통해 염기 교정 효율을 측정했다 (도 20e, f, 도 26). 가장 효율이 높은 mt-DdCBE 조합은 (상추에서 Left-G1397-N+Right-G1397-C, 유채에서 Left-G1397-C+Right-G1397-N) atp6 유전자 타겟위치에서 상추 원형질체는 23%, 유채 원형질체는 23%의 C*G를 T*A로 치환을 변화하였다 (도 20). 또한, mt-DdCBE 조합은 rps14 타겟위치에서 유채 원형질체로부터 11%의 C*G를 T*A로 치환을 유도하였다. 이러한 결과들은 mt-DdCBE가 식물 미토콘드리아 DNA에 염기 교정이 잘 이루어진다고 보여진다.
DdCBE에 의한 cpDNA와 mtDNA의 교정이 재분화 과정 중에 유지되는지 조사하기 위해, 주입 후 4주가 지나 DdCBE가 처리된 원형질체로부터 재분화된 상추와 유채 캘러스를 수집하여 (도 21a), 딥시퀀싱과 생거시퀀싱을 이용하여 각각의 캘러스의 염기교정 효율을 측정하였다 (도 21b, 도 27). DdCBE에 의해 염기 교정이 유도된 엽록체 또는 미토콘드리아의 유전자는 26개 중 22개의 상추 캘러스와 14개 중 7개의 유채 캘러스가 각각 최대 38%와 25%의 효율로 측정되었다 (도 21c). 또한 엽록체 psbA 유전자의 염기 교정은 상추 캘러스에서 최대 3.9%의 효율을 보였다 (도 27). 또한, 유채 캘러스에서 미토콘드리아 염기 교정은 atp6와 rps14에서 각각 최대 25%와 1.9%로 측정되었다 (도 27). 이러한 결과는 식물 원형질체에서 DdCBE의 발현을 견딜 수 있으며 원형질체에 재분화 과정에서 DdCBE에 의해 소기관 염기 교정을 유도하였다.
다음으로 플라스미드가 아닌 기내 전사된 cp-DdCBE mRNA를 이용하여 소기관에서 DNA-free 염기교정을 입증하려고 하였다. 상추에서 16S rRNA 유전자를 타겟으로 하는 cp-DdCBE를 인코딩하는 기내 전사물을 원형질체에 주입한 뒤 타겟 위치의 염기 교정 효율을 분석하였다 (도 21a). 원형질체에서 C-to-T 변이는 최대 25%까지 측정되었다 (도 21d, 도 28). 예상대로 DdCBE mRNA와 DNA 서열을 원형질체 도입 7일 후 사라졌다 (도 29). 이 방법은 호스트 지놈에 플라스미드 DNA 일부분이 잠재적으로 통합되는 것을 피할 수 있을 것이다.
원형질체로부터 재분화된 캘러스에서 소기관 교정이 안정적으로 유지되는 것에 힘 입어, 엽록체 DNA에서 16S rRNA 유전자의 교정을 통해 16S rRNA에 비가역적으로 결합하여 단백질 합성을 저해하는 스트렙토마이신과 스펙티노마이신 항생제의 저항성을 조사하였다. 16S rRNA 유전자의 몇 군데 단일 염기 다형성은 원핵생물과 진핵생물에서 스트렙토마이신 저항성을 일반적으로 관찰되며 특히, 16S rRNA C860T (대장균은 C912 위치)의 돌연변이는 담배에서 스트렙토마이신 저항성을 가지게 한다. 담배의 C860T 점 돌연변이는 상추에서 C9 위치와 동일하다 (도 20a, 21b, 22b, 22d). DdCBE가 처리된 원형질체로부터 재분화하여 얻어진 상추 캘러스를 스트렙토마이신과 스펙티노마이신이 첨가된 배지에 옮겼다. Mock 처리군은 항생제에 노출되었을 때 하얗게 변화였고, 이는 캘러스의 원형질체 기능장애를 나타낸다. 반면에, DdCBE 처리된 캘러스는 녹색을 유지하였고 이러한 항생제에 저항성을 보여준다. 저항성을 가지는 상추 챌리와 유식물체에서 DdCBE에 의한 교정효율을 분석하였다. C860T 변이와 같은, C9 위치의 C에서 T 치환은 약물 처리로부터 얻어진 캘러스와 슈트 (shoot)에서 최대 98.6% 관찰되었다 (도 21e,f). 흥미롭게도, 근처의 C13위치의 C에서 T 교정이 스펙니오마이신의 없을 경우 최대 20%의 효율을 보였지만 항생제가 있을 경우 보이지 않았는데, 약물 처리에 따라 이 변이가 선발된 것을 입증한다. 종합하였을 때, 이러한 결과는 원형질체에서 DdCBE에 의해 식물 소기관 변이가 유도된 것은, 세포 분열과 식물 발달 뒤에도 유지될 수 있으며, 엽록체 교정이 약물 선발로 호모플라스미를 이룰 수 있을 것이다.
또한 16S rRNA 위치를 타겟으로 하는 TALE 디아미나아제의 오프타겟을 원형질체, 캘러스, 슈트에서 분석하였다. 단일세포에서 유래되어 항생제 저항성을 가지는 캘러스와 슈트에서 타겟사이트의 타겟주변 (양쪽 50 염기쌍) (도 31) 또는 엽록체 유전자에서 서열을 유사함을 기본으로 하여 선택한 5개의 잠재적 오프타겟 위치 (도 32) 오프타겟이 보이지 않는 것이 측정되었다. 반면에 DdCBE를 인코딩하는 플라스미드를 원형질체에 도입하였을 때, TC가 TT로 변하는 오프타겟이 5개의 잠재적 오프 타겟 중 3 군데에서 1.2%에서 4.1%의 낮은 효율로 유도되었다. TALE 디아미나아제를 인코딩하는 플라스미드 대신 기내 전사물 (mRNA)을 사용하였을 때 원형질체에서 오프 타겟의 효율이 크게 감소하였다 (도 22). 이러한 결과로 보면 과발현되거나 장기적인 플라스미드 유래 DdCBE의 발현은 오프타겟의 변이를 증가시킬 수 있고 일시적인, mRNA를 사용하는 mRNA 유래 발현은 오프타겟 염기 교정을 피하는데 바람직하다.
요약하면, 424 TALE 서브어레이 플라스미드와 16개의 발현 플라스미드를 사용하는 골든 게이트 클로닝 시스템을 개발하여 식물에서 소기관 염기교정을 하기 위해 DdCBE를 인코딩하는 플라스미드를 조립할 수 있다. 엽록체 DNA의 3 유전자, 미토콘드리아 DNA 2 유전자를 타겟하는 맞춤 디자인 된 DdCBE는 상추와 유채 원형질체에서 높은 효율의 C에서 T 치환을 이루었다. 특히나, 식물의 소기관 교정을 세포분열과 식물 발달에서 유지가 교정이 유지가 되었다. 게다가, 엽록체 16S rRNA 유전자의 변이를 통해 거의 호모플라스미 (99%) 한 항생제 저항성 상추 캘러스와 식물체를 확보하였다. 항생제 선발 없이는, 미토콘드리아에서 25%, 엽록체에서 38%의 교정 효율을 보였다. 골든 게이트 클로닝 시스템이 식물의 소기관 DNA 교정에 가치있는 자원이 될 것이라 기대한다.
실시예 3. TALE-DdCBE 동물 DNA 교정
분할된 박테리아 독소 DddAtox, DNA에 결합할 수 있도록 고안된 TALE (transcription activator-like effector) 및 우라실 글리코실레이즈 억제제 (UGI)를 포함하는 DddA-유래 시토신 염기 교정기 (DdCBEs)는 목표한 시토신-티민 염기 변형을 미토콘드리아 DNA에서 가능하게 하였다. 생쥐 배아에서 높은 효율의 미토콘드리아 DNA 교정이 가능함을 보여주었다. 미토콘드리아 유전자 중 NADH 탈수 및 유비퀴논으로의 전자전달을 촉매하는 NADH 탈수소화 효소의 서브유닛을 코딩하는 MT-ND5(ND5)를 목표로 하였는데, 이는 m.G12918A와 같이 사람의 미토콘드리아 질병과 관련 된 돌연변이와 m.C12336T와 같이 이른 종결코돈을 만드는 돌연변이를 포함하였다. 이를 통해 미토콘드리아 질병 모델을 생쥐에서 제작할 수 있었고, 미토콘드리아 질병을 치료할 수 있는 가능성을 제시하였다.
3-1. 방법
플라스미드 조립. TALEN (transcription activator-like effector nucleases) 시스템을 DddA 반체가 포함된 발현 플라스미드 및 최종 TALE-DddAtox 구조를 만들기 위해 차용하였다. TALEN 시스템의 발현 플라스미드에서, 핵내 수송 신호와 FokI 이량체 중 단량체를 미토콘드리아 전달 신호(MTS), DddA 탈아미노화 효소 반체 및 우라실 글리코실레이즈 억제제(UGI)로 치환하였다. MTS, DddA, 및 UGI를 인코딩하는 서열은 IDT에서 합성하였다. 발현 벡터를 제작하기 위해, Gibson assembly에 필요한 DNA 조각을 Q5 DNA 중합효소(NEB)를 이용해 증폭하였고, 이후 정제하였다. 정제된 유전자 조각은 HiFi DNA assembly kit(NEB)를 이용해 조립하였으며, E coli DH5a(Enzynomics)에 화학적 형질전환 시킨 후 생거 서열분석법으로 확인하였다. 따라서, 8개의 각기 다른 발현 플라스미드를 얻었는데, 여기에는 Golden-gate 클로닝을 위한 BsaI 제한효소 자리가 N 말단 도메인과 C 말단 도메인을 인코딩하는 서열 사이에 있다. DdCBE 플라스미드 조립을 위해, 발현 플라스미드에 모듈 벡터(각각은 TALE 서열을 코딩함), BsaI-HFv2 (10 U), T4 DNA ligase (200 U) 및 반응 버퍼를 한 튜브에 담았다. 이후 제한 효소 및 라이게이즈 반응은 서모싸이클러에서 37℃ 5분, 50℃ 5분의 20 반복 후 50℃를 15분, 80℃를 5분동안 처리하였다. 접합된 플라스미드는 화학적 형질전환을 통해 E coli DH5α에 도입되었고, 최종 구조체는 생거 서열분석법으로 확인되었다. 세포주 도입을 위해 플라스미드는 미디프렙 하였다.
포유류 세포주 배양 및 형질 감염. NIH3T3 (CRL-1658, American Type Culture Collection (ATCC)) 세포주는 37℃의 5 % CO2 환경에서 배양되었다. 세포주는 10 % (v/v) 우아 혈청 보강한 DMEM (Gibco)의 배지에서 항생제 없이 생장하였고 마이코플라즈마 테스트는 하지 않았다. Lipofection을 위해 세포는 12-well cell culture plates (SPL, Seoul, Korea)에 1.5 ×104 세포 밀도로 형질 감염 18-24 시간 전 생장을 시작하였다. Lipofectamine 3000 (Invitrogen)을 이용하여 각각의 DdCBE 분할체를 500 ng 사용하여 총 1,000 ng 의 플라스미드 DNA를 도입하였다. 세포는 형질 감염 4일 후 회수되었다.
mRNA 제작. mRNA의 주형은 Q5 DNA 중합효소(NEB)를 이용해 PCR 증폭하였고, 다음 프라이머를 사용하였다 (F: 5′-CATCAA TGGGCGTGGATAG-3′SEQ ID No. 268, R: 5′-GACACCTACTCAGACAATGC-3 SEQ ID No. 269). DdCBE mRNA는 in vitro RNA transcription kit (mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra kit, Ambion)를 사용하여 합성한 후 MEGAclear kit(Ambion)을 이용해 정제하였다.
동물. 쥐를 포함한 실험은 모두 기초과학연구원의 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받고 진행하였다. 과배란된 C57BL/6J 암컷을 C57BL/6J 수컷과 교배시켰고, ICR strain 암컷을 대리모로 사용하였다. 생쥐는 특정 병원체가 없는 시설에서 12 시간의 낮-밤 사이클을 지키는 조건 및 항온 및 항습 조건에서 사육되었다(20-26 °C, 40-60%).
생쥐 접합체에 미세주입. 미세주입 직전의 과정인 과배란 및 배아 채집, 미세주입은 지난 논문에 기재된 대로 진행하였다. 미세주입을 위해서, left DdCBE mRNA (300 ng/μl) 및 right DdCBE mRNA (300 ng/μl)가 포함된 혼합물은 DEPC처리 된 주입 버퍼 (0.25 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 7.4)에 묽혔으며, 접합체 세포질에 Nikon ECLIPSE Ti micromanipulator와 a FemtoJet 4i microinjector (Eppendorf)를 이용하여 주입되었다. 미제주입 후, 배아는 KSOM + AA (Millipore) 마이크로 드롭에 넣어져 37 ˚C, 5% CO2 조건에서 4일동안 배양되었다. 2세포기의 배아는 0.5-d.p.c. pseudo-pregnant 대리모의 난관에 이식되었다.
유전형 분석. 배반포 단계의 배아 및 조직은 분해 버퍼 (25 mM NaOH, 0.2 mM EDTA, pH 10)에 넣고 95°C 에서 20 분 동안 배양 후, HEPES(free acids, pH 조절 안함)를 이용해 최종 농도가 50 mM이 되도록 pH를 7.4로 조절하였다. 생쥐 새끼의 유전체 DNA 분리를 위해서는 DNeasy Blood & Tissue Kits (Qiagen)를 이용하였고, 생거 서열 분석법 및 targeted deep sequencing으로 분석하였다.
고처리 서열 분석을 위한 미토콘드리아 DNA 분리. 12-well plate에 배양 된 NIH3T3세포의 미토콘드리아를 분리하기 위해, 세포 배양 배지를 제거한 후200 μl의 Mitochondrial isolation buffer A (ScienCell)를 배양 플레이트에 넣었다. 세포를 cell lifter를 이용해 긁은 후 마이크로튜브에 담고 일회용 막자를 이용해 세포를 갈아주었다. 15회의 분쇄 후 잘 갈린 균질액은 1,000×g, 4˚C에서 5분동안 원심분리 되었다. 상층액을 새로운 마이크로튜브에 담고 10,000×g, 4˚C에서 20분동안 원심분리하였다. 침전물을 20 μl 의 용해액(25 mM NaOH, 0.2 mM EDTA, pH 10)에 풀어준 후 95˚C에서 20분간 끓여주었다. pH를 낮추기 위해 2 μl의 1 M HEPES (free acids, without pH adjustment)를 미토콘드리아 용해액에 추가하였다. 이와같이 준비 된 용액의 1 μl를 고처리 서열 분석을 위한 PCR 주형 가닥으로 사용하였다.
고처리 서열 분석. 딥 시퀀싱 라이브러리를 제작하기 위해 Q5 DNA Polymerase를 사용하여 nested 1차 PCR 및 2차 PCR을 진행하였고, 최종 인덱스 서열을 추가하였다. 라이브러리는 MiniSeq (Illumina)를 이용해 페어드 엔드 리드 서열 분석에 사용하였다. 전 미토콘드리아 유전체 분석을 위해서는 분리된 미토콘드리아 DNA를 tagmentation DNA prep kit (Illumina)을 이용하여 제조사 프로토콜을 따라 준비하였다. 모든 분석에서 페어드 엔드 서열분석 결과는 하나의 fastqjoin 파일을 이용해서 합쳐졌으며 CRISPR RGEN Tools (http://www.rgenome.net/)을 이용해 분석하였다.
데이터 분석 및 표시. 마이크로소프트 엑셀 (2019) 및 파워포인트 (2019)는 그림, 그래프, 및 표 제작에 사용되었다. 유전체 서열 정렬, 프라이머 제작 및 클로닝 고안에는 Geneious (version 2021.0.1) 및 Snapgene 5.2.3을 사용하였고, 기준 서열로 NC_005089를 사용하였다.
3-2. 결과
DdCBE 플라스미드 조립. DdCBE에서 맞춤 설계된 TALE 서열의 조립을 보다 쉽게 하기 위해, 분할된 DddAtox 반쪽을 코딩하는 발현 플라스미드를 구성하고, 총 424개(6×64개의 3개 서열 인식 + 2×16개의 2개 서열 인식 + 2×4개의 1개 서열 인식)를 사용하는 Golden-Gate 클로닝 시스템을 사용하였다 (도 33a). 다음 표 4와 같이 6개의 TALE 플라스미드와 발현 플라스미드를 같은 튜브에 섞어서 바로 사용할 수 있는 DdCBE 플라스미드를 제작하였고, 15.5-18.5개의 repeat variable diresidue 서열을 갖도록 하였다(도 38).
Figure PCTKR2021012872-appb-img-000022
DdCBE 구성에 대한 서열은 다음 표 5와 같다. 결과적으로 DdCBE는 5’ 말단의 보존된 티민 서열을 포함하여 17-20개의 DNA 서열을 인식한다. 따라서 기능이 갖춰진 DdCBE 쌍은 총 32개에서 40개의 DNA 염기 서열을 인식한다.
Figure PCTKR2021012872-appb-img-000023
Figure PCTKR2021012872-appb-img-000024
Figure PCTKR2021012872-appb-img-000025
생체 외에서의 미토콘드리아 염기 교정. Golden-Gate 클로닝 시스템을 이용하여 생체 내 미토콘드리아 DNA 교정을 시도하기 위해 Mus musculus 미토콘드리아 NADH-유비퀴논 산화환원효소 사슬 5 단백질을 인코딩하는 ND5 유전자를 선정하였다. ND5 단백질은 NADH 탈수소효소 (유비퀴논)의 핵심 서브유닛으로, NADH에서 호흡 사슬로 전자를 전달하는 것을 촉매한다. 인간에서 ND5 유전자의 돌연변이는 MELAS(mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes)와 연관이 있다고 알려져 있으며, Leigh 증후군 또는 LHON(Leber’s hereditary optic neuropathy)의 일부 증상과도 연관이 있는 것으로 알려져 있다. 인간에서 기능 부전을 모사할 수 있도록 미토콘드리아 유전자에 유전적 변형이 있는 생쥐 모델을 만들고자 하였다.
첫번째로, 몇 종류의 DdCBE 플라스미드를 조립하였는데, 이것은 두 가지의 침묵 돌연변이인 m.C12539T와 m.G12542A를 일으키도록 고안되었다. 이러한 플라스미드를 NIH3T3 생쥐 세포주에 형질감염 시키고 3일 후 염기 교정 빈도를 측정하였다. 예상한 것과 같이, 목표 범위의 시토신 염기는 최대 19%의 효율로 티민으로 교정되었다 (도 34a). DddAtox는 “TC” 서열의 시토신만을 배타적으로 탈아미노화 하는 것으로 기존에 보고되었는데, 실험 결과에서도 TC 맥락의 두개의 시토신만이 교정되었다. 인델이나 다른 종류의 점돌연변이는 교정 목표 범위에서 유의미하게 생성되지 않았다.
생체 내에서의 미토콘드리아 염기 교정. 가장 효능이 뛰어난 DdCBE 쌍(left-G1397-N 및 right-G1397-C)를 생체 외 실험에 사용하였다. 이 DdCBE 쌍을 인코딩하는 생체 외 전사체를 C57BL6/J 배아의 1세포기에 미세주입한 4일 후, 총 32개의 배아 중 9개의 교정 성공된 배아를 얻을 수 있었다 (28%, 표 6).
Figure PCTKR2021012872-appb-img-000026
TALE-DddAtox 탈아미노화 효소는 C * G 에서 T * A의 염기 전위를 효율적으로 생성하였는데, m.C12539에서는 2.2 에서 25%의 효율로, m.G12542에서는 0.63에서 5.8%로 그 효율이 나타났다. 이후 DdCBE가 주입된 배아를 대리모에 이식하여 m.C12539T와 m.G12542T를 가진 자손을 얻었다 (도 39). 4마리의 새끼(F0) 중 3마리가 C * G 에서 T * A 교정이 되었고 그 범위는 1에서 27% 까지였다(도 34c). 두 마리의 새끼는 발가락과 꼬리에서 비슷한 돌연변이 수치를 보였고, 태어난지 14일 후에도 그 효율을 유지하고 있었다. 또한, 이러한 미토콘드리아 DNA 돌연변이가 생후 50일이 지난 성체 F0 생쥐의 다양한 조직에서 검출되었다(도 34d). 이러한 결과는 1 세포기 접합체에서 DdCBE로 인해 생긴 미토콘드리아 DNA의 헤테로플라스미가 발달과 분화 과정동안 유지되는 것을 시사한다.
DdCBE로 인해 생긴 돌연변이가 다음세대로 전달되는지 확인하기 위해, 암컷 F0 생쥐와 야생형 C57BL6/J 수컷을 교배시켜 F1 자손을 만들었다. m.C12539T와 m.G12542T 돌연변이는 두 마리의 새끼에서 6-26% 효율로 관찰되었다. 또한 이러한 미토콘드리아 교정이 11개의 각기 다른 조직에서 비슷한 수치로 관찰되었다(도 35b).
DdCBE로 매개 된 MT-ND5 G12918A 돌연변이. 다음으로, m.G12918A 돌연변이를 제작하고자 했는데, 이 돌연변이는 사람에게서 미토콘드리아 질병을 일으키기도 한다. 주목할 점은 이 돌연변이는 여러 미토콘드리아 질병, 예를들어 Leigh 증후군, MELAS 증후군, 및 LHON 증후군 등을 일으킨다. 이 위치의 시토신 염기는 옆에 티민이 있기 때문에 DdCBE를 이용한 염기 교정이 가능하다 (도 36a). 4쌍의 DdCBE를 조립하고 NIH3T3에서 최대 6.4%까지 교정이 가능함을 확인하였다(도 36b). 이후 가장 효율이 좋은 DdCBE조합을 생쥐 접합체에 미세주입하여 그 효율을 배반포에서 관찰하였다. 44개 중 11개(25%)의 배아가 m.G12918A 돌연변이를 가지고 있었으며 그 효율은 0.25에서 23%까지 였다(도 36c). 다음으로, DdCBE가 미세주입 된 배아를 대리모에 이식하여 G12918A 돌연변이를 가진 자손을 얻었다 (도 39b). 11 마리의 새로 태어난 생쥐 중 4마리가 이 돌연변이를 3.9-31.6% 정도 가진것을 확인하였다 (도 36d). 태어난 직후 보여지는 표현형은 없었지만, 아마도 새끼가 매우 어리고 또한 정상 미토콘드리아 DNA와 돌연변이 DNA가 이형 상태로 존재하기 때문에, 이러한 결과는 DdCBE가 미토콘드리아 질병을 가진 동물 모델을 만들 수 있음을 시사한다.
MT-ND5 넌센스 돌연변이. 마지막으로, ND5의 기능 상실 돌연변이가 생쥐에서 유지가 가능한지 유전자에 넌센스 돌연변이를 만들어 확인하였다. m.C12336을 목표 시토신으로 하여 이른 종결 코돈을 ND5 단백질의 199번째 위치에 도입하였다(Q199*; 도 37a). 우선 4개의 DdCBE 조합을 NIH3T3 세포주에 형질 감염시켜 염기 교정 효율을 확인하였고, 가장 효과적인 DdCBE 쌍이 넌센스 돌연변이를 약 5.7% 효율로 일으키는 것을 확인하였다 (도 37b). 이 DdCBE는 시토신-티민 교정을 일으키고, 약간 효율이 낮지만 m.G12341A인 침묵 돌연변이를 생성하는 돌연변이 (Q200Q) 역시 목표 범위에서 교정되는 것을 확인하였다. 37개 중 19개 (=51%)의 생쥐 배아에서 역시 m.C12336T 와 m.G12341A 돌연변이를 순서대로 모두 32 % 및 23%의 효율로 확인하였다 (도 37c).
이 결과를 바탕으로, 생쥐 배아를 대리모에 이식하고, m.C12336T 와 m.G12341A 돌연변이를 갖는 후손을 얻을 수 있었다(도 39c). 총 27개 중 9마리의 F0 생쥐(23%)가 C * G to T * A 교정을 보였으며 그 효율 범위는 0.22에서 57% 인데(도 37d,e), 이를 통해 ND5의 넌센스 돌연변이가 배아 도태를 일으키지 않음을 알 수 있다.
실시예 4. 동물 미토콘드리아 DNA 교정
4-1. 핵외 수송 신호가 결합 된 동물 미토콘드리아 염기 교정용 발현 벡터 제작
TALE-DdCBE에 핵외 수송 신호가 결합 된 단백질을 동물 세포에서 발현시킬 수 있도록 하는 벡터(도 40)를 제작하였다. 벡터에는 사이토메갈로바이러스 프로모터(CMV promoter)를 사용하였다. N 말단부터 미토콘드리아 전달 신호, 단백질 정제/검출 태그, TALE array N 말단 도메인, 반복 부위, C 말단 도메인, DddA 시토신 탈아미노화 효소 반체(split half), 우라실 글리코실레이즈 억제제 및 핵외수송신호를 포함한다(도 40a). 핵외수송신호는 예를 들어 MVM (Mirute virus of mice)의 NS2 단백질 유래를 사용할 수 있으나 다른 서열도 가능할 것이다. 이를 통해 발현 된 단백질은 핵 외부로 방출되며, 미토콘드리아로 전달되어 염기 교정을 하게 된다. 이때 사용된 타겟 DNA는 미토콘드리아 ND5 유전자-4번 염색체 ND5-like 유전자, 미토콘드리아 TrnA-5번 염색체, 미토콘드리아 Rnr2-6번 염색체이다(도 40b).
4-2. 동물 세포주에서의 DdCBE-NES
NIH3T3 세포주 (ATCC CRL-1658)를 transfection 하루 전날 오후 1.5x10^4/well 로 1 ml의 세포 생장 배지(DMEM + 10% Bovine Calf Serum)가 담긴 12-well plate 에 분주하였다. 다음날 아침 DNA를 처리하지 않은 Mock, DdCBE, DdCBE-MVM NES 플라스미드 투입 실험군을 Lipofectamine 3000의 제조사 프로토콜에 따라 세포에 Transfection 하였다. 이후 3일간 이산화탄소 배양기(37˚C, 5 % CO2)에서 배양 후 세포를 걷어서 Qiagen Blood & Tissue Kit을 이용해 전체 DNA를 정제하였다. 이후 미토콘드리아 유전자 특이적인 PCR 프라이머를 이용해 증폭하고, 일루미나 Miniseq 장비를 이용하여 차세대 서열 분석(Next-generation Sequencing)을 수행한 다음 결과를 Cas-analyzer (www.rgenome.net)를 이용하여 염기교정 효율을 확인하였다.
도 40c,d,e는 DdCBE-NES를 NIH3T3 mouse 세포주에 Transfection 하여 생쥐 미토콘드리아 유전자인 ND5, TrnA, Rnr2에 돌연변이를 만든 것이다. DdCBE의 조합 별로 효율이 달라짐을 알 수 있다.
4-3. 동물 세포주에서의 mitoTALEN
도 40f에 표시된 서열을 인식하는 TALEN을 제작하였고, 이 구조체에 MTS를 연결하여 미토콘드리아에 DdCBE와 함께 도입하였다. 실험방법은 실시예 4-2와 같다. TALE 인식부위에 의도적으로 미스매치를 주어 야생형 mtDNA와는 1개의 미스매치로, 돌연변이 mtDNA와는 2개의 미스매치가 일어나도록 하였다. TALE은 1개의 서열 미스매치는 인식하지 못하는 경우가 있기 때문이다. 그 결과 DdCBE만 처리한 것에 비해 TALEN과 같이 처리한 경우 +2 미스매치 실험군에서 효율이 조금 더 상승하는 것을 확인하였다.
4-4. 동물 배아에서의 DdCBE-NES
DdCBE 발현 벡터와 DdCBE-NES 발현 벡터를 주형으로 PCR 기법을 통해 T7 promoter와 DdCBE 또는 DdCBE-NES 발현 부분을 증폭시킨 DNA를 확보한다. 이 DNA를 주형으로 T7 polymerase를 이용하여 mRNA를 합성한다.
한쌍의 DdCBE mRNA 또는 한쌍의 DdCBE-NES mRNA를 미세주입용 용액에 섞어 생쥐 수정란에 미세주입한다.
4일 배양한 수정란은 배반포상태가 되고 이 배반포를 용해한다. 이를 주형으로 사용하여 미토콘드리아 DNA에서 핵 DNA와는 구분되는 표적 위치 부분을 PCR을 이용하여 증폭한 다음 추가적으로 인덱스와 시퀀싱 어댑터를 추가적인 PCR을 통해 증폭하였다. 일루미나 Miniseq 장비를 이용하여 고처리량 시퀀싱 (high-throughput sequencing)을 수행한 다음 결과를 Cas-analyzer (www.rgenome.net)를 이용하여 염기교정 효율을 확인하였다. 또한 미토콘드리아 표적부분가 유사한 서열을 가진 핵 속 DNA 를 PCR을 이용하여 증폭, sequencing을 수행하였다.
그 결과 DdCBE는 미토콘드리아 DNA뿐만 아니라 핵속의 유사 DNA 서열에서도 변이를 유발하였다. (미토콘드리아 : 13.1 %, 핵 : 3.2 %) DdCBE-NES 의 경우 미토콘드리아 표적의 변이 효율을 18.2 % 로 높임과 동시에 핵 DNA 변이 효율을 0.2 %로 낮추었다. (도 41a). 다른 타겟인 TrnA 또는 Rnr2의 경우 핵 DNA 돌연변이는 일어나지 않았으나, 미토콘드리아 DNA의 경우 통계적으로 유의미하게 염기 교정 효율이 증가함을 알 수 있었다. (*p<0.05, **p<0.01, n.s. 통계적으로 유의미하지 않음)
4-5: 동물 배아에서의 DdCBE 및 mitoTALEN
DdCBE를 이용한 ND5 유전자 위치에 C to T conversion 이후 교정된 미토콘드리아 DNA가 세포내 차지하는 비중을 높이기 위하여 교정되지 않은 미토콘드리아 DNA 서열을 자르는 TALEN을 함께 주입하였다. 미세주입 방법과 sequencing 서열 확인 방법은 실시예 4-2 및 4-4와 동일하다. DdCBE를 단독으로 미세주입한 그룹은 11 % 의 교정 효율이 보였고, mitoTALEN과 동시에 처리한 경우 33.3%로 상승하여 통계적으로 유의미한 교정 효율의 상승을 얻었다. 또한 DdCBE-NES를 단독으로 미세주입한 그룹은 20.5%의 교정 효율을 보였고, mitoTALEN과 동시에 처리한 경우 36.8%의 효율을 관찰하였다. 이 또한 통계적으로 유의미하였다(도 41b).
미세주입된 수정란을 대리모에 이식하여 새로 태어난 생쥐 새끼에서도 마찬가지로 DdCBE는 10.9%의 교정 효율을 보였으나 DdCBE-NES 및 mitoTALEN을 같이 처리한 경우 23.4%의 효율을 얻을 수 있었다 (도 41c).
동물 미토콘드리아 유전자 교정시에 핵외 수송 서열을 염기 교정 단백질에 부착한 경우 보다 높은 효율로 염기가 교정되며, 동물 배아에서는 특히 핵내 유사 서열의 비특이적 염기 교정 역시 억제되는 것으로 나타났다. 또한 미토콘드리아 서열 절단 단백질을 동시에 이용하는 경우에도 보다 높은 효율의 미토콘드리아 염기 교정을 기대할 수 있다.
실시예 5. 분할 DddAtox 탈아미노화 효소 변이체
DdCBE의 비표적 효과를 줄일 수 있는 고정밀의 DddA 유래 시토신 염기 편집기를 제시한다. 이러한 비표적 염기 편집 효과는 TALE과 DNA 사이의 상호작용과 무관하게 DddAtox 탈아미노화 효소 분할체의 자발적인 결합으로 야기되는 현상이다. 따라서 DddAtox 분할체 간의 표면에 위치한 아미노산 잔기를 알라닌으로 치환하여 HF-DdCBE를 제작하였으며, HF-DdCBE는 TALE에 연결 된 두개의 탈아미노화 효소 쌍이 DNA에 결합하지 못할 경우 제대로 된 기능을 하지 못하도록 하였다. 전 미토콘드리아 유전체 분석을 통해, 사람의 미토콘드리아 DNA에서 수많은 원치않는 비표적 C-to-T 전환을 일으키는 기존 DdCBE와는 달리, HF-DdCBE는 매우 효율적이고 정밀하다는 것을 확인하였다.
5-1. 방법
플라스미드 제작. DdCBE 발현 플라스미드에 점돌연변이를 도입하였다. 플라스미드를 Q5 Site-Directed Mutagenesis (NEB)용 돌연변이 제작 프라이머 (표 7)를 이용해 증폭하였고, 결과는 생거 서열분석법으로 확인하였다.
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결합 표면 돌연변이의 조립을 위해 미니프렙 된 돌연변이 발현 플라스미드에 모듈 벡터(각각은 TALE 배열을 코딩함), BsaI-HFv2 (10 U), T4 DNA ligase (200 U) 및 반응 버퍼를 한 튜브에 담았다. 이후 제한 효소 및 라이게이즈 반응은 서모싸이클러에서 37˚C 5분, 50˚C 5분의 20 반복 후 50˚C를 15분, 80˚C를 5분동안 처리하였다. 접합 된 플라스미드는 화학적 형질전환을 통해 E coli DH5α에 도입되었고, 최종 구조체는 생거 서열분석법으로 확인되었다. 세포주 도입을 위해 플라스미드는 미디프렙 하였다.
포유류 세포주 배양 및 형질 감염. HEK 293T/17 (CRL-11268, American Type Culture Collection (ATCC)) 세포주는 37 °C의 5 % CO2 환경에서 배양되었다. 세포주는 DMEM supplemented with 10 % (v/v) fetal bovine serum (Gibco)의 배지에서 항생제 없이 생장하였고 마이코플라즈마 테스트는 하지 않았다. Lipofection을 위해 세포는 24-well cell culture plates (SPL, Seoul, Korea)에1 Х105 세포 밀도로 형질 감염 18-24 시간 전 생장을 시작하였다. Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 이용하여 각각의 DdCBE 분할체를 500 ng 사용하여 총 1,000 ng 의 플라스미드 DNA를 도입하였다. 세포는 형질감염 4일 후 회수되었다.
고처리 서열 분석을 위한 유전체 및 미토콘드리아 DNA 분리. 유전체 DNA를 분리하기 위해 세포 배양 배지를 제거한 후, DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen)의 Proteinase K가 첨가된 lysis buffer를 세포를 바닥에서 분리하기 위해 세포 배양 플레이트에 넣어주었다. 이후 제조사의 프로토콜을 따라 유전체 DNA를 분리하였다. 전 미토콘드리아 유전체 서열 분석을 위해서는 200 μl의 Mitochondrial isolation buffer A (ScienCell)를 세포 배양 배지가 제거 된 배양 플레이트에 넣었다. 세포를 cell lifter를 이용해 긁은 후 마이크로튜브에 담고 일회용 막자를 이용해 세포를 갈아주었다. 20회의 분쇄 후 잘 갈린 균질액은 1,000×g, 4˚C에서 5분동안 원심분리 되었다. 상층액을 새로운 마이크로튜브에 담고 10,000×g, 4˚C에서 20분동안 원심분리하였다. 침전물을 10 μl 의 용해액(25 mM NaOH, 0.2 mM EDTA, pH 10)에 풀어준 후 95˚C에서 20분간 끓여주었다. pH를 낮추기 위해 1 μl의 1 M HEPES (free acids, without pH adjustment)를 미토콘드리아 용해액에 추가하였다. 이와 같이 준비된 용액의 1 μl를 고처리 서열 분석을 위한 PCR 주형 가닥으로 사용하였다.
고처리 서열 분석. 딥 시퀀싱 라이브러리를 제작하기 위해 Q5 DNA Polymerase를 사용하여 nested 1차 PCR 및 2차 PCR을 진행하였고, 최종 인덱스 서열을 추가하였다. 라이브러리는 MiniSeq (Illumina)를 이용해 페어드 엔드 리드 서열 분석에 사용하였다. 전 미토콘드리아 유전체 분석을 위해서는 분리된 미토콘드리아 DNA를 tagmentation DNA prep kit (Illumina)을 이용하여 제조사 프로토콜을 따라 준비하였다. 모든 분석에서 페어드 엔드 서열분석 결과는 하나의 fastqjoin 파일을 이용해서 합쳐졌으며 CRISPR RGEN Tools (http://www.rgenome.net/)을 이용해 분석하였다.
5-2. 결과
식물체 안에서 엽록체 교정을 시도할 경우 비표적 염기 돌연변이가 엽록체 유전체 상에서 나타나게 되었고, 따라서 DdCBE의 정확성에 대한 의문을 제기하게 되었다. DdCBE의 비표적 염기 교정에 대해 두 가지 이유를 생각해 보았다. 첫번째로는 TALE 단백질과 DNA 사이의 비특이적인 결합이고, 다른 하나는 자연적이며 의도치 않게 일어나는 DddAtox 반체끼리의 결합이다 (도 42a). 본 연구에서는 DddAtox 분할 반체에 초점을 맞추고, 분할된 두 개의 단백질의 결합 표면을 개선하여 원치 않는 DddAtox 반체의 결합을 방지하도록 하였다.
첫번째로, 미토콘드리아의 ND1 (mtND1) 유전자를 대상으로 각각의 서브유닛(Left-TALE 혹은 Right-TALE)이 각각 혼자서도 DNA에 결합, TALE이 없는 TALE-free DddAtox 또는 결합 서열이 없는 TALE-DddAtox의 다른 반체와 상호작용하여 시토신-티민 염기 교정을 일으키는지 확인해 보고자하였다. 인간 신장 배아 세포주 (HEK293T)에서 인간 미토콘드리아 ND1 (mtND1) 유전자를 목표 서열로 하는 DdCBE 쌍 (Left-TALE:G1397N (N-말단 쪽 G1397 DddAtox 반체로 TALE 배열의 C 말단에 결합하여 전체 인식 서열 중 왼쪽 부위를 맡는 구조) + Right-TALE:G1397C (C 말단 쪽 G1397 DddAtox 반체로 TALE 배열의 C 말단에 결합하여 전체 인식 서열 중 오른쪽 부위를 맡는 구조))은 60.7 %의 효율로 표적 서열의 C11을 효과적으로 시토신에서 티민으로 교정하였다(도 43a). 또한, 각각의 서브유닛과 쌍을 이룰 수 있는 TALE-free DddAtox 반체와 함께 처리하였을 때, 비록 원래의 DdCBE 쌍보다는 못하지만 염기 교정이 일어나는 것을 관찰하였다. 따라서, Left-TALE과 Right-TALE 각각은 목표 ND1 서열에 결합하여 31% 혹은 8.1%의 효율로 염기를 교정함을 알 수 있었다(도 43). 다시 말하면, 두 TALE 단백질과 각각 융합된 DdCBE 쌍은 한쪽의 TALE과만 결합하였을 때보다 2.0 배 (= 60.7%/31%) 또는 7.5 배 (= 60.7%/8.1%) 효율이 높음을 할 수 있다. 명백하게도 TALE과 결합 된 DddAtox의 N 말단 반체는 TALE 서열이 없는 DddAtox의 C 말단 반체와 결합하여 탈아미노화 반응할 수 있도록 하며, 반대의 경우도 마찬가지였다.
DddAtox는 두 위치(G1333 및 G1397)에서 나누어져 반체를 형성하므로, G1333 위치에서 mtND1 유전자를 목표로 하는 DdCBE 쌍을 제작(Left-TALE:G1333-N 및 Right-TALE:G1333-C) 하였고, Left-TALE:G1333-N 및 Right-TALE:G1333-C 구조체를 쌍을 이루는 TALE-free DddAtox 반체와 결합하도록 각각 독립적으로 이용하여 시토신-티민 교정을 일으키는지 확인하였다. 예상했던 바와 같이 각각의 TALE 융합 DdCBE는 C8 위치에서 32.7 %(왼쪽 TALE 결합체) 또는 18.1%(오른쪽 TALE 결합체)의 염기 교정 효율을 보였고, 이는 원래의 DdCBE 쌍이 보여준 56.1%와 비교할 수 있다. 따라서 TALE이 결합된 DdCBE 쌍은 각각 따로 작용할 때에 비해 1.7배 (=56.1%/32.7%) 혹은 3.1배(=56.1%/18.1%)의 효율로 작용한다는 것을 알 수 있었다. 종합하자면 이러한 결과는 DdCBE는 한쪽 TALE 배열만 결합하는 위치에서도 원치 않는 비표적 염기 교정을 일으킨다는 사실을 제시한다. TALE 단백질은 몇개 가량의 불일치 서열이 있어도 DNA와 결합하기 때문에 DdCBE는 세포 소기관 또는 핵 내 유전자에 비표적 염기 교정을 일으킬 수 있는 가능성이 존재한다.
분할된 DddAtox 반체가 서로 결합함으로 생기는 비표적 염기 교정을 줄이고자 고정밀의 DdCBE를 개발하고자 하였다. 분할 이합체의 결합 표면 부위를 개량한다면 자가 결합을 방지하거나 저해할 수 있을 것이라 생각하였다. 따라서 PyMOL 소프트웨어에서 파이썬 코드(InterfaceResidues.py)를 이용하여 1 평방 옹스트롬의 범위 안에서 두 분할체 DddAtox (분할 위치 G1333 및 G1397)에서 결합 표면의 아미노산 잔기를 발견하였다. 그 결과 G1397-N(G1397위치에서 분할한 N 말단 DddAtox 반체)에서 9개의 아미노산 잔기를, G1397-C(G1397위치에서 분할한 C 말단 DddAtox 반체)에서 4개의 잔기를, G1333-N(G1333위치에서 분할한 N 말단 DddAtox 반체)에서 14개의 아미노산을, G1333-C(G1333위치에서 분할한 C 말단 DddAtox 반체)에서 15개의 아미노산 잔기를 찾을 수 있었다(도 42b 및 42c).
이후 찾은 아미노산 잔기를 알라닌으로 치환한 여러개의 돌연변이 DddAtox 반체를 제작하고, 이러한 결합 표면 돌연변이 DdCBE를 각각 야생형 DdCBE 짝 혹은 TALE이 없는 DddAtox 짝과 함께 HEK293T 세포주에 처리하여 염기 교정 효율을 관찰하였다. G1397 분할의 여러 결합 표면 돌연변이, C1376A, M1390A 및 F1412A를 포함하는, 에서는 TALE-free DddAtox 뿐만 아니라 야생형과 짝지었을때에도 시토신-티민 교정 효율을 목표 위치에서 관찰할 수 없었는데, 이는 이러한 돌연변이들은 다른 DddAtox 반체와 가까이 위치하여도 상호작용하지 못한다는 것을 의미한다. 몇몇의 돌연변이들, 예를 들어 E1381A 및 V1377A, 의 경우 TALE-free 반체와 결합하여 높은 효율의 염기 교정을 보였는데, 이는 이러한 돌연변이는 이합체의 상호작용과는 무관한 변화임을 보여준다.
중요하게도 몇몇 돌연변이, 예를 들어 K1389A, K1410A, 및 T1413A의 경우 야생형의 DdCBE 짝과 결합 시에는 높은 활성을 보였지만 TALE-free 짝과 사용 시에는 활성이 낮았다. 일례로 K1410A 돌연변이는 53.2%의 효율을 보여 야생형 DdCBE 짝(60.7%)에 비해 비슷한 결과를 얻었으나, TALE-free 와 함께 사용시에는 0.9%의 효율을 보여주어 59.1배의 차이(= 53.2%/0.9%)를 나타내었다. 상기했던 것과 같이 야생형의 경우 7.5 배 (= 60.7%/8.1%)의 차이를 보인다. 또한, 이런 돌연변이들은 야생형의 DdCBE보다 선택적으로 염기를 교정하였다. 변이체는 교정 범위 내에서 C8, C9, 또는 C13 보다 C11에 대해 강한 선택성을 보여줬는데, 이는 야생형에서 4개의 시토신을 고르게 6.7% 이상으로 모두 교정한 것과 비교될 수 있다(도 43b).
또한 G1333에서 29개의 돌연변이(14 개 G1333N 및 15 개의 G1333C)를 스크리닝 하여 몇몇의 적합한 결합 표면 돌연변이를 얻을 수 있었다(도 44). 다수의 돌연변이들은 야생형과 짝지어졌을 때 효율이 저조하거나(I1299A, Y1316A, Y1317A, 및 F1329A), TALE-free와 짝지어졌을 때 효율이 증가한 것들(S1300A 및 T1314A) 이었다. 하지만 주목할만한 점은 K1389A, T1391A, 및 V1393A와 같은 돌연변이는 야생형과의 결합에서는 염기 교정이 잘 일어나며, TALE-free와는 저조한 효율을 나타내었다. 일례로 K1389A의 경우 38배의 차이(= 45.4%/1.2%)를 나타내는 반면 야생형 DdCBE 쌍은 약 3.1배의 차이(= 56.1%/18.1%)에 불과하다. 또한 K1389A의 경우 야생형보다 효율이 좋은 것처럼 관찰되기도 하였다. 또한 이 돌연변이들은 C11이나 C13이 아닌 C8 위치에 교정 효율이 집중되는 것으로 관찰되었는데, 이는 야생형 DdCBE의 19% 이상의 모든 시토신 위치에 교정 효율이 올라가는 것과 비교할 수 있다. 또한 주목해야 할 점은 G1397-C의 K1410A는 C8을 우선적으로 교정하는 반면에 G1333-C의 K1389A의 경우 C11을 선택적으로 더 고효율로 교정하는 것을 알 수 있다. 반면에 야생형의 DdCBE 쌍들(G1333 또는 G1397 DddAtox 분할)은 모두 이러한 선택성이 저조함을 알 수 있다. 이러한 결과는 위에 기재된 결합 표면 돌연변이들은 DdCBE에서 표적 부위 내 여러 염기에 원치 않는 교정을 일으키는 효과를 줄일 수 있는 가능성을 보여준다.
실시예 6. 전장 탈아미노화 효소
분할된 세균 독소 DddAtox, TALE array, 우라실 글리코실라제 억제제(UGI)를 포함하는 DddA 유래 시토신 염기교정효소(DdCBE)는 진핵세포의 핵, 미토콘드리아 DNA(mtDNA), 식물의 엽록체 DNA의 표적 시토신을 티민으로 변환 가능하게 한다. 박테리아에 독성을 유발하는 DddAtox는 Burkholderia cenocepacia에서 유래했으며, 효소로 이중 가닥 DNA(double-strand DNA) 내에서 시토신을 탈아미노화한다. 숙주 세포의 독성을 피하기 위해 DddAtox는 비활성을 가지는 반으로 나누어, 각각 TALE DNA 결합 단백질에 결합하여 DdCBE를 만든다. TALE array에 결합된 두 개의 비활성 형태는 TALE에 의해 표적 DNA에 근처에서 결합될 때에 기능을 가진다. 시토신에서 티민으로 염기 변환은 두 TALE 결합 부위 사이의 14~18개 염기 사이의 영역에서 유도된다.
DdCBE는 세포 소기관 DNA를 교정하지 못하는 CRISPR 유래 염기 교정기와 달리 핵 및 세포 소기관 DNA 모두에서 표적 화된 염기 교정을 가능하게 하지만, 이를 유도하기 위해 하나가 아닌 두 개의 TALE 구성이 필요하다는 단점이 있다. 첫번째 단점은, TALE이 5' 말단과 3' 말단 모두에서 티민으로 표적 DNA 부위에 결합해야 하기 때문에 두 개의 TALE array를 사용하면 표적 가능한 부위가 제한된다. 둘째, 하나가 아닌 두 개의 TALE 구성을 전달하는 것은 종종 비효율적이고 도전적이다. 유전자 치료에 널리 사용되는 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터(용량, ~4.7kbps)와 같이 용량이 제한된 바이러스 벡터는 이량체 DdCBE의 조합이 너무 커(2 X 4.1kbps, 프로모터 및 polyA 신호 포함) 두 개의 DdCBE 인코딩 서열을 수용할 수 없다. 더 큰 용량의 단일 벡터에 두 개의 TALE array DNA를 클로닝하는 것은 두 개의 TALE array 서열의 높은 유사성으로 인해 어려울 수 있다. 마지막으로 하나가 아닌 두 개의 TALE array를 사용하면 오프타겟 효과가 악화될 수 있다. 분할 DddAtox가 있는 이량체 DdCBE의 이러한 한계를 극복하기 위해서 무독성 전장 DddAtox 형태의 mDdCBE(단량체 DdCBE)를 핵 및 소기관의 표적 DNA에서 시토신을 티민으로 변환을 유도하는 DdCBE를 제시한다.
6-1. 방법
플라스미드 제작. DddA 변이체는 합성된 전장 DddAtox(gBlock, IDT)를 주형으로 사용하고 표 8의 프라이머 및 Q5 DNA 중합효소(NEB)를 사용하여 PCR 증폭 하였다. 이러한 PCR 산물은 Apobec1이 BamHI과 Sma I(NEB)로 절단된 p3s-BE3 부위에서 Gibson 어셈블리(NEB)를 사용하여 클로닝 하였다. TALE-DddAtox(Addgene #158093, #158095, #157842, #157841)는 플라스미드를 BamHI과 Sma I로 절단하고 DddA 변이체를 표 8의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하고 Gibson 어셈블리를 사용하여 클로닝했다. 확보한 플라스미드를 화학적 방법으로 제조된 E. coli DH5α에 열 충격 방법으로 형질전환하고, 살아남은 콜로니의 플라즈미드 염기서열을 Sanger 염기서열분석법으로 분석하였다. 최종 플라스미드는 세포 형질감염을 위해 midi-prepped(Macherey-Nagel) 하였다.
Figure PCTKR2021012872-appb-img-000030
무작위 돌연변이 유발. GeneMorph ii Random mutagenesis kit (Agilent)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 합성된 전체 길이 DddAtox (gBlock, IDT)를 주형으로 하여 오류가 발생하기 쉬운 PCR을 하였다. 요약하면, DddAtox DNA 1ng, 100ng, 700ng을 주형으로 사용하여 각각 0~16 mutations/kb의 무작위 변이를 도입하였다. 전체 길이 DddAtox gBlock은 표 8의 프라이머를 사용하여 사전에 PCR 증폭 하였다. 전체 PCR 결과물을 합하여 Sma1 및 Xho1으로 절단된 p3s-UGI-Cas9(H840A)에 Gibson 어셈블리 (NEB)를 사용하여 클로닝하였다. 화학적 방법으로 제조된 E. coli DH5α에 열 충격 방법으로 세포에 플라스미드를 형질전환하고, 생존 한 콜로니가 가지고 있는 플라즈미드 염기서열을 Sanger 염기서열분석법으로 분석하였다. 분석한 플라즈미드 중 코딩 프레임을 가지는 p3s-UGI-nCas9(H840A)-DddAtox 플라스미드를 sgRNA와 함께 HEK293T 세포에 형질감염 후 표적 딥 시퀀싱을 통한 교정 활성 확인하였다.
포유류 세포 배양 및 형질감염. HEK293T(ATCC, CRL-11268) 세포 및 HeLa(ATCC, CCL-2) 세포를 5% CO2에서 37°C로 유지하여 배양하였다. 세포를 10%(v/v) 태아 소 혈청(Welgene) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Welgene)이 보충된 DMEM에서 배양하였다. 세포를 형질감염 24시간 전에 3X105 세포(HEK293T) 및 4x104 세포(HeLa)의 밀도로 48웰 플레이트(Corning)에 시딩하고 Lipofectamine 2000(Invitrogen) 및 Cas9 융합 DddA 플라스미드(750ng)와 sgRNA(250ng)로 형질감염 하였다. TALE-DddA는 200ng 플라스미드와 Lipofectamine 2000을 사용하여 HEK293T 세포에 형질감염 하였다. sgRNA 서열은 표 9에 나타내었다.
Figure PCTKR2021012872-appb-img-000031
게놈 및 미토콘드리아 DNA 준비. Cas9 융합 DddA 변이체에 형질감염된 세포를 형질감염 2일 후에 수확하고, TALE-DddA에 형질감염된 세포를 3일 후에 수확하였다. 게놈 및 미토콘드리아 DNA는 DNeasy 혈액 및 조직 키트(Qiagen)를 사용하여 분리하였다. 대규모 분석을 위해 5 μL의 프로테이나제 K(Qiagen)가 포함된 100 μL의 세포 용해 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 8.0(Sigma-Aldrich), 1 mM EDTA(Sigma-Aldrich), 0.005% sodium dodecyl sulfate(Sigma-Aldrich))을 사용하여 DNA를 추출했다. 용해물을 55°C에서 1시간 반응 후, 95°C에서 10분 동안 반응하였다.
6-2. 결과
Wild type과 신규 전장 DddA의 아미노산 염기서열을 비교하고 도 45에 변경된 아미노산을 회색 박스로 표시하였다.
도 46과 같이, DddA를 Cas9의 N-말단 앞에 16개의 아미노산으로 이루어진 linker를 이용하여 연결하였고, C-말단에는 UGI (uracil glycosylase inhibitor)와 NLS (nuclear localization signal)을 4개의 아미노산으로 이루어진 linker을 이용하여 연결하였다. 반대로 DddA를 Cas9의 C-말단 뒤에 16개의 아미노산으로 이루어진 linker를 이용하여 연결하였고, N-말단에는 UGI와 NLS를 4개의 아미노산으로 이루어진 linker를 이용하여 연결하였다.
본 발명에서는 DddA-Cas9(D10A, D10A and H840A)-UGI를 사용하여 실험하였다. DddA를 DNA 결합 단백질인 Zinc finger protein, TALE 모듈에 결합하여 하나의 모듈 만으로 시토신을 티민으로 치환할 수 있다. 기존의 split은 두개의 모듈이 있어야 하지만, full length DddA는 한 개의 모듈만 있어도 가능하다. 이 두 DNA 결합 단백질은 NLS (nuclear localization signal), MTS (mitochondrial targeting sequence), CTP (chloroplast transit peptide)를 연결하여 genome region 뿐만 아니라, Cas9으로는 불가능한 mitochondria와 식물의 chloroplast의 시토신을 티민으로 치환할 수 있다. 도 47에 나타낸 바와 같이, human cell genomic context ROR1 site (a), HEK3 site (b), TYRO3 site (c)에서 TC motif의 cytosine이 thymine으로 치환되는 활성을 확인하였다. Target 위치에서 25bp 떨어진 TC motif의 cytosine이 thymine으로 치환되는 활성을 확인하였다 (a). A1341D KRKKA는 CC motif의 두 번째 cytosine이 thymine으로 치환하는 활성을 확인하였다 (a, b). Catalytic mutant인 E1347A도 TC motif의 cytosine이 thymine으로 치환되는 활성을 확인함(a, b, c). 빨간색 밑줄은 Cas9이 binding하는 부위를 나타내었다. 효율은 전체 sequencing read중 indel이 없는 read 중에서 시토신이 티민으로 치환된 비율을 퍼센트로 나타내었다. 또한 전체 sequencing read들 중 indel의 비율을 퍼센트로 나타내었다.
도 48에 나타낸 바와 같이, 빨간 네모 박스는 split해서 DddAtox의 활성을 확인한 부분을 나타낸 것이고, 같은 부분을 full length DddA를 이용하여 3개의 target site로 나눠서 활성을 측정하였다. Split은 PAM이 다른 orthogonal Cas9을 사용하여 두 Cas9 사이에 있는 시토신을 티민으로 치환하는데 이 경우 원하는 시토신을 티민으로 정확하게 치환하기 힘들다. 하지만 Full length DddA는 같은 target sit에 Cas9이 binding 하는 부분을 3개로 나눠 target 할 수 있어 원하는 시토신을 티민으로 정교하게 치환 할 수 있다. 효율은 전체 sequencing read중 indel이 없는 reads 중에서 시토신이 티민으로 치환된 비율을 퍼센트로 나타내었다. 또한 전체 sequencing read들 중 indel의 비율을 퍼센트로 나타내었다.
도 49에 나타낸 바와 같이, Human cell genomic context TRAC site1 (a), TRAC site 2 (b), FANCF (c), HBB (d)에서 full length DddA의 활성을 측정하였다. 빨간색 밑줄은 Cas9이 binding하는 부위를 나타내었다. 효율은 전체 sequencing read중 indel이 없는 reads 중에서 시토신이 티민으로 치환된 비율을 퍼센트로 나타내었다. 또한 전체 sequencing read들 중 indel의 비율을 퍼센트로 나타내었다.
도 50에 나타낸 바와 같이, DddA-dCas9(D10A, H840A)-UGI를 이용한 Human cell genomic context TYRO3 (a), ROR1 (b), HEK3 (c), EMX1 site 2 (d), TRAC site 1 (e), HBB (f)에서 DddA의 활성을 측정하였다. 효율은 전체 sequencing read중 시토신이 티민으로 치환된 비율을 퍼센트로 나타내었다. Indels은 관찰되지 않았다.
염기 교정에 유용한 무독성 전장 DddAtox 변이체를 얻기 위해 구조 기반 특정 부위 변이, 무작위 돌연변이 두 가지 방식을 취했다. 첫 번째 접근 방식에서는 DNA 결합이 감소하거나 촉매 활성이 감소된 DddAtox 변이체를 활성이 없는 CRISPR-Cas9(dCas9) 또는 nickase(nCas9) 변이체에 융합하여 사람 유래의 세포에서 표적 시토신이 티민으로 치환되는 새로운 염기 교정기를 개발했다. 이를 위해 DddAtox의 양전하를 따는 아미노산을 알라닌으로 치환하여 발현 벡터에 서브클로닝 하려고 했다 (도 51a). 이러한 변이체가 음전하를 띠는 dsDNA에 결합하는 것을 약화 하여 잠재적으로 독성을 피할 수 있다고 추론했다. 대부분의 알라닌 치환 변이체는 E. coli 형질전환체를 형성하지 못했다 (도 51b). 생성된 형질전환체로부터 분리된 플라스미드 DNA 염기분석결과 단백질을 형성하는 영역에서 다양한 프레임변이 돌연변이가 유도되었다. 이러한 전장 DddAtox 변이체는 포유류발현 프로모터의 조절하에 있지만 E. coli에서 약하게 발현되어 세포 사멸을 초래했다. 다행히도 프레임 시프트 돌연변이가 없는 여러 개의 삼중 또는 사중 또는 오중("AAAAA"라고 함) 알라닌 치환 변이체를 얻을 수 있었다. 또한 활성 부위 돌연변이 E1347A도 성공적으로 클로닝되었다.
다음으로 D10A nCas9 또는 dCas9 및 UGI에 융합된 AAAAA 변이체가 인간 배아 신장 293T(HEK293T) 세포에서 염기 편집을 유도할 수 있는지 여부를 조사했다(도 51c, d). 랫 APBEC1 탈아미노효소, 우라실 글리코실라제 억제제(UGI)와 dCas9(또는 D10A nCas9)로 구성된 염기교정기 2(또는 3)은 proto-spacer 영역 내의 좁은 영역에서 활성을 가지지만, AAAAA 변이체는 proto-spacer 영역의 바로 5`위쪽에서 시토신을 티민으로 최대 43%의 치환을 유도했다. 예상외로 E1347A 돌연변이는 37%(nCas9 융합) 또는 16%(dCas9 융합)의 빈도로 동일한 C-3 위치에서 염기 교정을 유도했으며(도 51c), 이는 E1347A 돌연변이가 DddAtox의 완전한 탈아미노 불활성화를 유도하지 않고, 인간 유래 세포에서 염기 교정을 달성하기에 충분히 높은 탈아미노 활성이 있는 것을 확인하였다. 그러나 5중 AAAAAA 돌연변이와 결합된 E1347A 변이체는 염기 교정을 유도하지 못했다. 또한 dCas9 또는 nCas9 및 UGI에 융합된 프레임 이동 돌연변이가 없는 E1347A, AAAAA 및 알라닌으로 치환된 다른 변이체 (도 53)가 proto-spacer 영역의 위쪽으로 최대 25에 베이스 떨어진 곳에서 교정이 일어나는 것을 확인했고, 다른 여러 사이트에서는 최대 26% 교정 효율이 있는 것을 확인하였다 (도 54). 또한, 최대 60%의 교정 빈도로 HeLa 세포에서 매우 효율적이었다(도 55). 이러한 융합단백질에 의해 유도된 염기 교정은 최대 21일 동안 세포에서 유지되었으며, 이는 이러한 염기 교정이 세포 독성이 없음을 시사한다(도 56).
시토신 염기교정기의 교정 윈도우 변경을 위해, 알라닌으로 치환된 변이체들을 H840A nCas9의 C 터미널에 융합하려고 했다. 예기치 않게, 프레임시프트 돌연변이가 없는 손상되지 않은 구성물을 얻는 데 실패했다. 따라서 오류가 발생하기 쉬운 PCR을 수행하여 DddAtox 코딩 서열에 무작위 돌연변이를 도입했으며 4가지 점 돌연변이 S1326G, G1348S, A1398V, S1418G("GSVG"라고 함)가 있는 무독성 전장 DddAtox 변이체를 얻을 수 있었다 (S1326G, G1348S, A1398V, S1418G 각각 서열번호 269의 아미노산 서열 중 37 위치의 S가 G로 치환; 59번 위치의 G가 S로 치환; 109번 위치의 A가 V로 치환; 및 129번 위치의 S가 G로 치환을 포함하는, 서열번호 276의 서열을 포함, 도 52a). 또한 이 변이체는 dCas9, D10A nCas9 및 Cas9의 C 말단과 dCas9, nCas9 및 Cas9의 N 말단에 융합되었다. 인간 유래 세포에서 야생형 Cas9을 제외한 이러한 융합 단백질은 최대 38%의 효율로 다양한 부위에서 시토신에서 티민으로의 전환을 유도했다(도 52b, 57, 58). 흥미롭게도, dCas9, D10A nCas9 및 H840A nCas9의 C 말단에 융합된 GSVG 변이체를 포함하는 융합 단백질은 proto-spacer 인접 모티브 (PAM)의 3` 다운스트림에서 시토신 염기 교정을 나타내는 반면, N 말단에 융합된 동일한 변이체를 포함하는 융합 단백질인 dCas9 및 nCas9는 proto-spacer의 5` 업스트림에서 염기 교정을 유도했다(도 52c). 예상대로 Cas9를 포함하는 융합 단백질은 염기 치환보다는 삽입결실을 유도했다.
어떤 돌연변이가 GSVG 변이체에서 중요한지를 찾아내기 위해, SSVG, GGVG, GSAG 및 GSVS의 4가지 복귀체를 사이트 지정 돌연변이 유발을 통해 만들려고 시도했다. SSVG, GSAG 및 GSVS 복귀체를 얻을 수 있었지만 nCas9의 C 말단에 융합된 GGVG 변이체를 얻지 못했다. G1348은 촉매 부위의 핵심 부위인 E1347 바로 옆에 있다. G1348S 돌연변이는 촉매 활성을 감소시켜 대장균의 세포독성을 피할 수 있었을 것이다. 최대 21일 동안 형질감염된 세포의 2개 표적 부위에서 3개의 복귀체와 GSVG 변이체의 교정 빈도를 측정했다. GSAG 및 GSVS에 의해 유도된 시토신에서 티민 교정의 빈도는 형질감염 후 3일부터 21일까지 점차적으로 ~2배 감소하여 이 두 복귀체가 다소 세포독성이 있는 반면 GSVG 및 SSVG은 유지되었다(도 59). 이러한 결과는 GSVG 변이체에서 G1348S가 필수적이며 S1326G가 중성인 반면 A1398V 및 S1418G는 세포독성을 감소시킨다는 것을 시사한다.
종합하면, 위 결과는 dsDNA에 대한 친화도 감소 (AAAAA) 또는 약화된 탈아미노활성(E1347A 및 가능하게는 GSVG) 또는 감소된 세포독성(GSVG)을 갖는 무독성, 전장 DddAtox 변이체가 dCas9 또는 nCas9에 융합되어 새로 변경된 교정 윈도우를 가지는 염기 교정기를 발명하였다. 이러한 염기교정기 이하 dCas9-mDdBE(dCas9의 C 말단에 융합된 전체 길이의 단량체 DddAtox 변이체로 구성된 DddA 파생 염기 교정기), nCas9-mDdBE, mDdCE-dCas9 및 mDdCE-nCas9로 명명될 수 있고, BE2 또는 BE3에서 도달할 수 없는 proto-spacer의 업스트림 또는 다운스트림 위치에서 염기 교정에 사용되는 BE2 또는 BE3 이후의 염기교정기이다.
또한, 무독성 전장 DddAtox 변이체가 미토콘드리아 DNA 교정에 사용될 수 있는지 여부를 조사했다. 여러 변이체 중에서 GSVG 및 E1347A 변이체 2개만 미토콘드리아 유전자, ND4 및 ND6에 결합하도록 설계된 TALE array의 C 말단에 성공적으로 융합되었다. GSVG 변이체를 포함하는 단량체 DdCBE(mDdCBE)는 원래 분할된 DdCBE 쌍과 동등한 최대 31% (ND4) (도 60a) 및 27% (ND6) (도 60b)의 표적 뉴클레오티드 위치에서 염기 교정을 달성했다. E1347A를 포함하는 mDdCBE도 최대 7.2%(ND4)와 8.9%(ND6)의 교정 비율로 효율성은 떨어지지만 목표 시토신을 티민으로 변환 하였다. 흥미롭게도 ND4 유전자에 특화된 원래의 DdCBE 쌍(G1333 분할)은 C4 위치에서 교정 효율이 0.8%인 반면, GSVG를 포함하는 2개의 mDdCBE는 26%와 31%의 높은 교정 효율을 나타내었다. 이 결과는 분할 이량체 DdCBE와 mDdCBE가 다른 돌연변이 패턴을 가질 수 있음을 보여주고 mDdCBE가 이량체 DdCBE와 상보적일 수 있어 주어진 표적 부위에서 다양한 돌연변이를 유도할 수 있음을 시사한다.
분할 이량체 DdCBE에 비해 mDdCBE의 한 가지 잠재적인 이점은 비특이적 TALE-DNA 상호작용으로 인한 오프타겟 효과가 이량체 DdCBE에 비해 절반인 것이다. 분할 DddAtox가 있는 이량체 DdCBE는 하나의 서브유닛만 결합할 수 있는 절반 부위에서 작동할 수 있으며, 이는 원치 않는 오프타겟 돌연변이를 발생시킨다. DdCBE 쌍의 비활성 DddAtox 절반은 다른 비활성 절반을 모집하여 기능적 탈아미노효소를 형성할 수 있다. 이 가설을 확인하기 위해 이량체 DdCBE의 한 서브유닛을 인코딩하는 플라스미드와 TALE이 없는 DddAtox 절반을 인코딩하는 플라스미드를 HEK293T 세포에 공동 형질감염 시키고 두 미토콘드리아 표적 부위에서 교정 빈도를 측정했다. 예상대로 시토신에서 티민으로의 교정은 0.7에서 3.6% 빈도로 대상 사이트에서 관찰되었다(도 60c~f). 이 결과는 DdCBE 쌍에서 분할된 DddAtox 반쪽이 절반 부위에서 서로 상호작용하여 원치 않는 오프타겟 돌연변이를 일으킬 수 있으며 mDdCBE가 이량체 DdCBE에 의해 유도된 오프타겟 돌연변이의 절반을 피할 수 있음을 시사한다.
실시예 7. DdABE를 이용한 사람 세포에서 높은 효율의A-to-G 염기 교정
DddA 유래 시토신 염기 교정(DdCBE)에 의한 미토콘드리아 DNA 염기 교정은 여러가지 세포주(cell line)와 동물들의 질병 모델을 만들 수 있게 하였고, 미토콘드리아 유전병을 치료할 수 있는 새로운 길을 열었다. 하지만, DdCBE는 거의 TC-toTT 염기 교정만 한정적으로 일으키기 때문에 모든 경우의 수에서 1/8정도만 커버를 할 수 있다. 여기에, TALE (transcription activator-like effector)에 두 종류의 탈아미노효소를 연결한 TALED를 개발하였다. 여기에 TALE은 원하는 DNA 부분에 결합할 수 있도록 맞춤 설계(custom-designed) 하였고, 촉매 능력을 상실한 DddAtox 시토신 탈아미노효소 변이체 및 E.coli 유래의 DNA 아데닌 탈아미노효소인 TadA 단백질을 포함하고 있다. TALED는 사람 미토콘드리아에서 기존의 TC context에 관해서만 시토신 염기교정이 가능했던 이전 염기 교정 기술과 달리 모든 A-to-G에 대한 염기 교정이 가능하게 해준다. 실제로 맞춤 제작한 TALED는 사람 세포 여러 target에서 높은 효율(50% 정도까지)로 아데닌 염기 교정을 일으킬 수 있었다.
기존에는 없던 새로운 염기 교정 기술을 개발하기 위해, 여러 TadA 변이체 중에서 ABE8e의 TadA 변이체(TadA*)를 선택하였다. 이는 높은 효율로 아데닌 교정을 할 수 있을 뿐만 아니라 여러가지 다양한 DNA 결합 단백질과 호환될 수 있게 개량된 것이기 때문에 실제 TALE 또는 ZFP(zinc finger protein)에도 호환이 잘 될 수 있기 때문이다.
처음으로 ND1 또는 ND4를 표적할 수 있게 맞춤 제작된 TALE에 TadA*와 MTS (mitochondria target sequence)를 융합하였고, 실제로 미토콘드리아 DNA에 염기교정을 일으킬 수 있는지 실험하였다. 표적 서열 심층 분석 (targeted deep sequencing) 결과 융합단백질의 아데노신 염기 교정 효율이 굉장히 낮지만 나오는 것을 볼 수 있었다. ND1 site에서는 최대 1.2% 효율(도 67a)로, ND4 site에서는 0.6% 효율(도 67b)로 아데닌 염기 교정을 일으켰다. 비록 굉장히 낮은 효율이지만, TadA*가 DNA 단일 가닥만 특이적으로 작동하는 것으로 알려진 것에 비해 TALE에 융합되어 있으면 이중가닥 표적DNA에서도 염기교정을 일으키는 것을 알 수 있었다.
미토콘드리아 DNA에서 아데닌 염기교정이 일어날 수 있다는 결과와 함께, 이러한 효율을 더 올리기 위해서 이미 알려져있는 DddAtox 단백질을 융합하는 것을 생각하였다. DddAtox 단백질은 시토신 탈아민을 하는 단백질로 Burkholderia cenocepacia 유래 interbacterial toxin이다. 이 단백질은 DNA 이중가닥에 작동하는 단백질이기 때문에 이 단백질을 사용하게 되면 TadA*아데닌 탈아미노효소가 타겟 DNA에 더 잘 접근할 수 있도록 도와줄 것이기 때문이다. 기존의 DddAtox를 사용하는 DdCBE같은 경우 DddAtox 단백질을 반으로 나누어서 왼쪽 DNA부분에 붙는 TALE(Left-TALE (L-TALE)과 오른쪽 DNA부분에 붙는 Right-TALE (R-TALE))에 각각 나눠져서 split 형태로 융합되고, 시토신 염기 효율을 올려주는 uracil glycosylase inhibitor(UGI)까지 융합(TALE-split DddAtox-UGI)되어 있다. 이렇게 DddAtox를 분할해서 사용하는 이유는 전장의 단백질을 사용하게 되면 세포 독성이 발생하기 때문이다. 먼저 ND1 site를 타겟하는 DdCBE의 한쪽 부분에 UGI 대신에 TadA*를 달아서 L-TALE-split DddAtox- TadA*, R-TALE-1397C- TadA* 형태로 각각 만들어서 실험해보았다. 신기하게도, 한쪽 부분에는 TadA*가 있는 것을 다른 한쪽에는 1397N과 UGI가 있는 것을 쌍으로 해서 사람 세포에 전달해주었을 때 A-to-G와 C-to-T 염기 교정이 모두 일어나는 것을 확인할 수 있었다(도 62c). 기존의 DdCBE같은 경우 약 20% 시토신 염기 교정이 일어나고, 아데닌 염기교정은 전혀 일어나지 않는 반면 한쪽 부분에 TadA*가 있는 경우 시토신 염기 교정이 절반 수준으로 줄어들게 되고, 아데닌 염기 교정이 약 10%정도 일어나는 것을 확인하였다(도 62c). 아데닌 염기 교정과 시토신 염기 교정 효율이 비슷하게 일어났다(도 62c).
물론 시토신 염기교정과 아데닌 염기교정이 모두 일어나는 것은 무작위로 돌연변이를 일으키는 것에는 유용할 지 몰라도, 질병을 치료하는 것에 있어서, 특히 C-to-T 돌연변이로 발생하는 LOHN 및 MEALS 같은 미토콘드리아 유전병을 치료하기 위해서는 아데닌만을 염기교정을 일으키는 것이 바람직하다. 따라서 이러한 동시에 발생하는 시토신 염기교정을 없애기 위해서 UGI를 없앴다. DdCBE에서, UGI의 경우 시토신 탈아미노효소 DddAtox가 C를 U로 탈아민화시키면 DNA 수선 과정 중 세포내 있는 복구 (repair) 단백질인 우라실 글리코실라제 (uracil glycosylase)에 의해 U가 다시 수선되는 것을 방지하고자 우라실 글리코실라제를 억제하기 위한 저해제 용도로 융합된 것이다. 따라서 이러한 UGI를 제거해주면, 아데닌 염기교정 효율은 유지하고, 시토신 염기교정을 억제 할 수 있을 것이라고 생각하였다. 놀랍게도, UGI가 없는 ND1표적 TALE 탈아미노효소 쌍은 시토신 염기교정을 거의 일으키지 않고(<0.5%) 높은 효율로 아데닌 염기 교정(약 50%)만을 일으키는 것을 확인하였다(도 63a,c). 이는 UGI가 있는 것보다도 훨씬 높은 효율이다. 더 나아가 ND4를 표적하는 TALE 탈아미노효소 쌍에서도 확인하였고, ND1 표적하는 것처럼 높은 효율(약 35%)로 아데닌 염기만을 교정하는 것을 확인하였다(도 63b,d). 이처럼 DddAtox시스템과 TadA*를 융합한 DNA 이중가닥에서 작동하는 새로운 아데닌deaminase인 TALED를 개발하였고, 세계 최초로 사람 미토콘드리아에서 아데닌 염기교정을 할 수 있었다. 또한 처음 TALE에 TadA*만을 달았던 것보다 최종적으로 50배 정도 높게 아데닌 염기를 교정할 수 있었다.
다음으로 더 나아가서 촉매 활성을 없앤 전장 E1347A DddAtox 변이체 또는 개발한 촉매활성은 유지하고 세포독성은 없앤 변이체(AAAAA와GSVG)를 활용하여 아데닌 염기교정을 일으키려고 했다. 시토신 염기교정을 일으키는 것이 목적이 아니고, DNA 이중가닥에서 아데닌 염기 교정을 일으키는 것이 목적이기 때문에 시토신 염기 교정 활성이 없어진 전장 E1347A DddAtox변이체를 사용하여도 되었고, UGI가 없으면 시토신 염기교정이 효율이 없어지는 것을 확인하였기 때문에 동시에 세포독성만을 없앤 변이체도 이용할 수 있었다. 전장 변이체 포함하는 TALED를 두가지 타입으로 만들었다(도 64a). 첫번째는 하나의 TALE에 TadA*(AD)와 전장 DddAtox변이체를 모두 포함하는 것(mTALED), 두번째는 각각의 TALE에 TadA*(AD)와 전장 DddAtox변이체를 각각 따로 융합하는 것(dTALED), 두 가지 타입을 만들어서 테스트해보았다(도 64a). 놀랍게도, ND1을 표적하는 두가지 타입의 TALED 모두 높은 효율로 아데닌 염기교정을 일으키는 것을 확인하였다(도 64b). mTALED 경우 최대 약 45% 효율을 보여줬으며, dTALED 역시 약 50%정도의 아데닌 염기 교정 효율을 보여줬다(도 64b). ND1 site 뿐만 아니라 ND4 site에서도 마찬가지로 실험을 하였고, 비슷하게 높은 효율로 아데닌 염기교정을 일으켰다(도 64c). 또한 시토신 염기 교정 활성이 없어진 전장 E1347A DddAtox변이체를 사용했을 때도 높은 효율의 아데닌 염기 교정을 일으키는 것을 볼 수 있었다(도 64b,c). 이는 시토신 탈 아민 능력이 상실 되었음에도 충분히 TadA*를 DNA 이중가닥에 접근하도록 돕는 역할은 유지되는 것으로 보여진다. 위의 결과들을 자세하게 단일 염기 수준으로 봤을 때(도 65, 66), TALE이 DNA에 결합하는 바로 근처에서 아데닌 염기 교정이 일어나는 것을 볼 수 있다. 또한 두개의 TALE이 이용하는 경우 그 사이(Spacer)에서만 염기교정이 일어나게 되는데, 신기하게도 하나의 TALE이 이용하는 mTALED에서도 비슷한 타겟 길이를 가지는 것을 볼 수 있었다(도 65, 66).
또한 시스템이 zinc finger protein(ZFP) system에서도 작동이 되는지, 핵 DNA에서도 작동하는 지 궁금하였다. 따라서 핵 DNA를 타겟하는 NC 형태의 ZFP만들었고, 여기에 분할된 DddAtox와 TadA*를 융합하였다(도 61a). 이 때 ZFP에 여러가지 위치에 TadA*를 융합해주었다(도 61b). 여러가지 형태 중 핵 DNA에서 최대 10%정도 아데닌 염기를 교정하는 개체를 만들 수 있었다(도 61d). UGI가 한 쪽에 존재하기에 시토신 염기 교정 효율도 높은 효율로 존재하는 것을 볼 수 있었다(도 61c). 사람 세포 핵 DNA에서 ZFP-DddAtox-TadA* system이 작동하는 것을 볼 수 있었고, 더 나아가서 미토콘드리아에서도 작동하는 지 실험하였다. 이 때 핵 DNA에서 가장 높은 효율로 작동했던 구조를 참고하였다. 핵 DNA로 전달하게 하는 Nuclear Localization Signal(NLS) 대신 미토콘드리아로 향하게 하는 Mitochondrial Targeting Sequence(MTS)를 달아주고, ND1 site을 타겟하는 ZFP(NC타입)에 왼쪽 ZFP에는 1397N이, 오른쪽 ZFP에는 1397C와 더불어 TadA*가 융합된 형태로 실험을 하였다. 결과적으로 약 3% 효율로 아데닌 염기 교정이 일어나는 것을 볼 수 있었다(도 61.g). 비록 TALED 보다 아데닌 염기 교정 효율이 낮았지만, 단백질 사이를 연결해주는 linker등 여러가지 조건을 최적화 시켜준다면 이 ZFP system을 이용해서도 좋은 효율의 아데닌 염기 교정을 일으킬 수 있을 것이다.
현재까지 유전자 교정 기술은 눈부신 발전을 해왔다. CRISPR 기반의 유전자 가위(CRISPR Cas9, base editor, prime editor 등)는 off-target을 개선하고, 효율을 높이며 다양하게 발전해왔다. 하지만 이러한 많은 발전에도 미토콘드리아 유전병에 대한 치료 방법은 한계가 있었다. 이유는 CRISPR 기반의 기술은 실제로 촉매하는 단백질과 표적으로 가이드 역할을 해주는 gRNA로 구성되어 있다. 하지만, 단백질과는 달리 gRNA를 미토콘드리아로 보내주는 방법의 부재로 아직까지 미토콘드리아 유전자를 다루는 기술은 DNA를 절단을 일으켜 미토콘드리아 DNA를 없애는 것 말고는 존재하지 않았다. 하지만, 미국의 David R. Liu 그룹에서 처음으로 미토콘드리아에서 염기교정을 일으킬 수 있는 DdCBE 선보였다. DdCBE는 DNA 이중가닥에서 작동하는 시토신 탈아미노효소 DddAtox를 포함하고 있기 때문에 DNA 결합 단백질 TALE에 융합하여 단백질만을 보내 염기 교정을 일으킬 수 있었다. 하지만, 이러한 DdCBE는 시토신 중에서도 TC 형태의 시토신에서만 제한적으로 염기교정을 일으키기 때문에 실제로 질병모델 제작 또는 유전병 치료에 있어서 한계점이 많았다. 이에 세계 최초로 미토콘드리아에서 아데닌 염기 교정을 일으킬 수 있는 TALED를 만들었고, TALED는 최대 50%정도의 높은 효율을 가지고 있으며, 주변 타겟 부분에서 다양한 종류의 아데닌에서 염기교정을 일으켰다. 또한 UGI가 있을 경우에는 시토신과 아데닌 염기를 동시에 교정을 할 수 있기 때문에 무작위적 변이를 일으킬 때 유용하게 사용할 수 있는 반면, UGI가 없을 경우에는 시토신 염기교정은 안 일어나고, 아데닌 염기교정만을 일으키기 때문에 특이적인 아데닌 염기 교정 기술로 이용될 수 있다. 또한 ZFP 시스템에서도 적용이 되며, 핵 DNA 관해서도 아데닌 염기교정이 가능함을 보였다. 이러한 TALED의 개발은 많은 미토콘드리아 유전병에 해결책을 제시해주며 그에 해당하는 질병 모델을 만들수 있게 해주고, 아직까지 개척되지 않은 많은 미토콘드리아 유전자 관련 연구들을 하는데 유용한 도구가 될 것이다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따르면, 유전자 교정시에 시토신 탈아미노효소 분할 형태 (split) 결합 표면의 특정 아미노산 잔기를 치환함으로써, 원하지 않는 시토신 탈아미노효소의 비선택성을 줄일 수 있다.
전장 시토신 탈아미노효소와 관련하여, 기존에 사용되는 시토신 염기 교정 (cytosine base editor)로 교정 (editing)이 어려운 부분의 교정이 가능하다. 기존의 시토신 염기 교정 수단 중 탈아미노효소 (deaminase)로 사용하는 Apobec1은 암 유발 유전자로 알려져 있어서 치료목적으로 사용에 제약이 따르지만, 이번에 개발된 전장 탈아미노효소는 이러한 문제점이 없을 것으로 판단된다.
DNA 결합 단백질을 포함해서 2.5Kb 정도로 작아 AAV 벡터를 이용한 유전자 치료에 사용 가능하고, mRNA, RNP 전달이 용이하며, 원핵생물을 이용한 유용 물질 생산 등에 사용 가능하다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (54)

  1. (i) DNA 결합 단백질; 및
    (ii) 시토신 탈아미노효소 (deaminase) 또는 이의 변이체 유래인 제1분할체 및 제2분할체를 포함하는 융합단백질로,
    상기 제1분할체 및 제2분할체는 각각 상기 DNA 결합 단백질에 결합되는 형태인 융합단백질.
  2. (i) DNA 결합 단백질; 및
    (ii) 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체 유래 비독성 전장 시토신 탈아미노효소를 포함하는 융합단백질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제1분할체와 제2분할체 각각은 시토신 탈아미노효소 활성이 없는 것을 특징으로 하는, 융합단백질.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제1분할체는 서열번호 1의 서열 중 N 말단에서 G33, G44, A54, N68, G82, N98, G108로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상까지의 서열을 포함하는 융합단백질.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서 상기 시토신 탈아미노효소는 이중 가닥 DNA에 작용하는 탈아미노효소 (DddA) 또는 이의 오솔로그 (orthologue)에서 유래한 것을 특징으로 하는 융합단백질.
  6. 제1항에 있어서, 상기 제2분할체는 서열번호 1의 서열 중 G34, P45, G55, N69, T83, A99, A109로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상에서 C-말단까지의 서열을 포함하는 융합단백질.
  7. 제1항에 있어서, 상기 시토신 탈아미노효소의 변이체는 서열번호 1의 서열 중 N 말단에서 G44까지의 서열을 포함하는 제1분할체 중 3, 5, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 28, 30 및 31번 위치로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 융합단백질.
  8. 제1항에 있어서, 상기 시토신 탈아미노효소의 변이체는 서열번호 1의 서열 중 P45에서 C-말단까지의 서열을 포함하는 제2분할체 중 13, 16, 17, 20, 21, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 56, 57, 58 및 60번 위치로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 융합단백질.
  9. 제1항에 있어서, 상기 시토신 탈아미노효소의 변이체는 서열번호 1의 서열 중 N 말단에서 G108까지의 서열을 포함하는 제1분할체 중 87, 88, 91, 92, 95, 100, 101, 102 및 103번 위치로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 융합단백질.
  10. 제1항에 있어서, 상기 시토신 탈아미노효소의 변이체는 서열번호 1의 서열 중 A109에서 C-말단까지의 서열을 포함하는 제2분할체 중 13, 14, 15 및 16번 위치로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 융합단백질.
  11. 제2항에 있어서, 상기 비독성 전장 시토신 탈아미노효소는 서열번호 1의 야생형 시토신 탈아미노효소 중 37, 59, 109, 129로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 융합단백질.
  12. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다른 아미노산은 알라닌인 융합단백질.
  13. 제2항에 있어서, 상기 비독성 전장 시토신 탈아미노효소는 서열번호 12 내지 22로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 융합단백질.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 DNA 결합 단백질은 징크 핑커 단백질 (zinc finger protein), TALE 단백질 또는 CRISPR 연관 뉴클레아제인 융합단백질.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 DNA 결합 단백질은 2 내지 40개 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드 링커를 통해 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체와 연결되는 것을 특징으로 하는 융합단백질.
  16. 제15항에 있어서, 상기 링커는 다음을 포함하는 융합단백질:
    2a.a 링커: GS
    5a.a 링커: TGEKQ (서열번호 8)
    10a.a 링커: SGAQGSTLDF (서열번호 9)
    16a.a 링커: SGSETPGTSESATPES (서열번호 10);
    24 a.a 링커: SGTPHEVGVYTLSGTPHEVGVYTL (서열번호 115); 또는
    32a.a 링커: GSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS (서열번호 11).
  17. 제1항에 있어서, 상기 제1분할체 및 제2분할체 각각은 징크 핑거 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 결합된 융합단백질.
  18. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 시토신 탈아미노효소에 단일 TALE 어레이 (array) 또는 제 1 TALE 어레이 및 제 2 TALE 어레이가 각각 결합하는 융합단백질.
  19. 제1항 또는 제2항에 있어서, (iii) 아데닌 탈아미노효소를 추가로 포함하는 융합단백질.
  20. 제19항에 있어서, 상기 아데닌 탈아미노효소는 대장균 TadA의 변이체로서 디옥시-아데닌 탈아미노효소 (deoxy-adenine deaminase)인, 융합단백질.
  21. 제19항에 있어서, 상기 아데닌 탈아미노효소는 DNA 결합 단백질 또는 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체의 N 또는 C 말단에 결합된 융합단백질.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 융합단백질을 코딩하는 핵산.
  23. 제22항에 있어서, 리보핵산 또는 DNA인 핵산.
  24. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 융합단백질 또는 제22항의 핵산을 포함하는 염기 교정용 조성물.
  25. 제24항에 있어서, UGI (uracil glycosylase inhibitor)를 추가로 포함하는 조성물.
  26. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 융합단백질 또는 제22항의 핵산을 포함하는 진핵세포 염기 교정용 조성물.
  27. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 융합단백질 또는 제22항의 핵산; 및
    NLS (nuclear localization signal) 펩타이드 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 식물세포 염기 교정용 조성물.
  28. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 융합단백질 또는 제22항의 핵산; 및
    엽록체 전달 펩타이드(chloroplast transit peptide) 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 식물세포 염기 교정용 조성물.
  29. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 융합단백질 또는 제22항의 핵산; 및
    미토콘드리아 전달 단백질 (Mitochondrial Targeting Signal, MTS) 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 식물세포 염기 교정용 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 핵외 수송 신호 (Nuclear Export Signal, NES) 또는 이를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는, 조성물.
  31. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합단백질은 다음을 통해 식물세포에 전달되는 것을 특징으로 하는 조성물:
    Gene gun을 이용한 주입 (Bombardment);
    PEG-매개 원형질체 형질감염 (Protoplast transfection, PEG-mediated);
    전기천공에 의한 원형질체 형질감염 (Protoplast transfection, electroporation); 또는
    미세주사에 의한 원형질체 주사 (Protoplast injection, microinjection).
  32. 제31항에 있어서, 상기 핵산은 다음을 통해 식물세포에 전달되는 것을 특징으로 하는 조성물:
    Agrobacterium 예를 들어 Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogene 등을 이용한 형질전환;
    바이러스 형질감염;
    Gene gun을 이용한 주입 (Bombardment);
    PEG-매개 원형질체 형질감염 (Protoplast transfection, PEG-mediated);
    전기천공에 의한 원형질체 형질감염 (Protoplast transfection, electroporation); 또는
    미세주사에 의한 원형질체 주사 (Protoplast injection, microinjection).
  33. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물의 미토콘드리아, 엽록체 또는 색소체 (plastid: 백색체, 유색체)의 염기 교정용 조성물.
  34. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 DNA 염기서열을 자르지만 교정된 염기서열은 자르지 못하는 TAL (Transcription Activator-Like) 이펙터 (TALE); 및 FokI 핵산 가수분해효소(FokI Nuclease) 또는 이를 코딩하는 핵산 또는 ZFN(zinc finger nuclease) 또는 이를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 조성물.
  35. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항의 조성물을 처리하는 단계를 포함하는 진핵세포의 핵, 미토콘드리아, 또는 색소체 DNA의 염기를 교정하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 야생형 DNA 염기서열을 자르지만 교정된 염기서열은 자르지 못하는 TALEN 또는 ZFN 또는 이를 코딩하는 핵산을 추가로 포함해 염기교정의 효율을 높이는 방법.
  37. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항의 조성물을 식물세포에 처리하는 단계를 포함하는 식물세포 염기 교정방법.
  38. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 융합단백질 또는 제22항의 핵산; 및
    NLS (nuclear localization signal) 펩타이드 또는 이를 코딩하는 핵산을 식물세포에 처리하는 단계를 포함하는 식물세포 염기 교정방법.
  39. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 융합단백질 또는 제22항의 핵산; 및
    엽록체 전달 펩타이드(chloroplast transit peptide) 또는 이를 코딩하는 핵산을 식물세포에 처리하는 단계를 포함하는 식물세포 염기 교정방법.
  40. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 융합단백질 또는 제22항의 핵산; 및
    미토콘드리아 전달 단백질 (Mitochondrial Targeting Signal, MTS) 또는 이를 코딩하는 핵산을 식물세포에 처리하는 단계를 포함하는 식물세포 염기 교정방법.
  41. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 융합단백질 또는 제22항의 핵산; 및
    NLS (nuclear localization signal) 펩타이드 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 동물세포 염기 교정용 조성물
  42. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 융합단백질 또는 제22항의 핵산; 및
    미토콘드리아 전달 단백질 (Mitochondrial Targeting Signal, MTS) 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는, 동물세포 염기 교정용 조성물.
  43. 제42항에 있어서, 핵외 수송 신호 (Nuclelar Export Signal) 또는 이를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 조성물.
  44. 제42항에 있어서, 야생형 DNA 염기서열을 자르지만 교정된 염기서열은 자르지 못하는 TAL (Transcription Activator-Like) 이펙터 (TALE); 및 FokI 핵산 가수분해효소(FokI Nuclease) 또는 이를 코딩하는 핵산 또는 ZFN 또는 이를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 조성물.
  45. 제41항 또는 제42항의 조성물을 동물세포에 처리하는 단계를 포함하는 동물세포의 염기 교정방법.
  46. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 융합단백질 또는 제22항의 핵산; 및
    NLS (nuclear localization signal) 펩타이드 또는 이를 코딩하는 핵산을 동물세포에 처리하는 단계를 포함하는 동물세포의 염기 교정방법.
  47. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 융합단백질 또는 제22항의 핵산; 및 미토콘드리아 전달 단백질 (Mitochondrial Targeting Signal, MTS) 또는 이를 코딩하는 핵산을 동물세포에 처리하는 단계를 포함하는 동물세포의 염기 교정방법.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 야생형 DNA 염기서열을 자르지만 교정된 염기서열은 자르지 못하는 TALEN 또는 ZFN 또는 이를 코딩하는 핵산을 추가로 포함해 염기교정의 효율을 높이는 방법.
  49. 제19항의 융합단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 원핵세포 또는 진핵세포에서의 A-to-G 염기 교정용 조성물로, 상기 DNA 결합 단백질은 징크 핑커 단백질 (zinc finger protein), TALE 단백질 또는 CRISPR 연관 뉴클레아제이고, 상기 융합단백질의 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체는 박테리아 유래이고, 이중 가닥 DNA 특이적인 것을 특징으로 하는 조성물.
  50. 제19항의 융합단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 원핵세포 또는 진핵세포에서의 A-to-G 염기 교정용 조성물로, 상기 DNA 결합 단백질은 징크 핑커 단백질 (zinc finger protein), TALE 단백질 또는 CRISPR 연관 뉴클레아제이고,
    상기 융합단백질의 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체는 박테리아 유래이고, 이중 가닥 DNA 특이적인 것이며,
    상기 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체의 N 말단에 DNA 결합 단백질이 결합되어 있고, 상기 융합단백질의 아데닌 탈아미노효소의 C 말단에 DNA 결합 단백질이 결합되어 있는, 조성물.
  51. 제19항의 융합단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 및 UGI (uracil glycosylase inhibitor)를 포함하는 원핵세포 또는 진핵세포에서의 C-to-T 염기 교정용 조성물로, 상기 DNA 결합 단백질은 징크 핑커 단백질 (zinc finger protein), TALE 단백질 또는 CRISPR 연관 뉴클레아제이고, 상기 융합단백질의 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체는 박테리아 유래이고, 이중 가닥 DNA 특이적인 것을 특징으로 하는 조성물.
  52. 제19항의 융합단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 원핵세포 또는 진핵세포에 처리하는 단계를 포함하는 원핵세포 또는 진핵세포에서의 A-to-G 염기 교정 방법으로, 상기 DNA 결합 단백질은 징크 핑커 단백질 (zinc finger protein), TALE 단백질 또는 CRISPR 연관 뉴클레아제이고, 상기 융합단백질의 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체는 박테리아 유래이고, 이중 가닥 DNA 특이적인 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제19항의 융합단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 원핵세포 또는 진핵세포에 처리하는 단계를 포함하는 원핵세포 또는 진핵세포에서의 A-to-G 염기 교정 방법으로, 상기 DNA 결합 단백질은 징크 핑커 단백질 (zinc finger protein), TALE 단백질 또는 CRISPR 연관 뉴클레아제이고,
    상기 융합단백질의 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체는 박테리아 유래이고, 이중 가닥 DNA 특이적인 것이며,
    상기 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체의 N 말단에 DNA 결합 단백질이 결합되어 있고, 상기 융합단백질의 아데닌 탈아미노효소의 C 말단에 DNA 결합 단백질이 결합되어 있는, 방법.
  54. 제19항의 융합단백질 또는 이를 코딩하는 핵산 및 UGI (uracil glycosylase inhibitor)를 원핵세포 또는 진핵세포에 처리하는 단계를 포함하는 원핵세포 또는 진핵세포에서의 C-to-T 염기 교정 방법으로, 상기 DNA 결합 단백질은 징크 핑커 단백질 (zinc finger protein), TALE 단백질 또는 CRISPR 연관 뉴클레아제이고, 상기 융합단백질의 시토신 탈아미노효소 또는 이의 변이체는 박테리아 유래이고, 이중 가닥 DNA 특이적인 것을 특징으로 하는 방법.
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