WO2019009682A2 - 표적 특이적 crispr 변이체 - Google Patents

표적 특이적 crispr 변이체 Download PDF

Info

Publication number
WO2019009682A2
WO2019009682A2 PCT/KR2018/007731 KR2018007731W WO2019009682A2 WO 2019009682 A2 WO2019009682 A2 WO 2019009682A2 KR 2018007731 W KR2018007731 W KR 2018007731W WO 2019009682 A2 WO2019009682 A2 WO 2019009682A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
region
spcas9
wild
amino acid
type
Prior art date
Application number
PCT/KR2018/007731
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2019009682A3 (ko
Inventor
김영훈
정민희
이준선
신은지
이강인
김석중
이정준
Original Assignee
주식회사 툴젠
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to CA3069296A priority Critical patent/CA3069296A1/en
Priority to EP18829020.9A priority patent/EP3650540A4/en
Priority to AU2018295992A priority patent/AU2018295992B2/en
Priority to RU2020105703A priority patent/RU2020105703A/ru
Priority to SG11201913852RA priority patent/SG11201913852RA/en
Priority to US16/628,199 priority patent/US11441135B2/en
Priority to CN201880058272.3A priority patent/CN111094561B/zh
Priority to JP2020500033A priority patent/JP2020530279A/ja
Application filed by 주식회사 툴젠 filed Critical 주식회사 툴젠
Priority to BR112020000310-7A priority patent/BR112020000310A2/pt
Publication of WO2019009682A2 publication Critical patent/WO2019009682A2/ko
Publication of WO2019009682A3 publication Critical patent/WO2019009682A3/ko
Priority to AU2022200262A priority patent/AU2022200262B2/en
Priority to US17/880,160 priority patent/US20230130858A1/en
Priority to JP2022181946A priority patent/JP2023025045A/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/09—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a nuclear localisation signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]

Definitions

  • the present invention relates to an artificially manipulated CRISPR / Cas9 system. More specifically, manipulation or modification of the genome and / or epigenome using an artificially engineered CRISPR enzyme with enhanced target specificity and an artificially engineered CRISPR / Cas9 system containing it, genomic targeting, genomic correction and in vitro diagnosis And the like.
  • the CRISPR-Cas system consists of a guide RNA (gRNA) having a complementary sequence to the target gene or nucleic acid, and a CRISPR enzyme, which is a nuclease capable of cleaving the target gene or nucleic acid.
  • gRNA guide RNA
  • CRISPR enzyme which is a nuclease capable of cleaving the target gene or nucleic acid.
  • the gRNA and CRISPR enzyme form a CRISPR complex And cleaves or transforms the gene or nucleic acid targeted by the CRISPR complex formed.
  • the non-target gene or nucleic acid is a gene position having a partial sequence complementary to the gRNA, and may form a partial complementary bond with the gRNA. Such partial complementary binding may be achieved when the CRISPR complex has a corresponding gene position, Target gene or nucleic acid that is not a target of the target gene.
  • CRISPR-Cas system in order to increase the efficiency of specifically transforming the target gene or nucleic acid using the CRISPR-Cas system, or to solve the problems such as genetic coupling that can be caused by modification of the non-target gene or nucleic acid, CRISPR- It is important to increase the target specificity of the Cas system.
  • various studies such as selection of gRNA with fewer non-target gene candidates and controlling the activity and / or specificity of CRISPR enzyme have been attempted.
  • Non-Patent Document 0001 Kim, D. et al. Nat Methods 12, 237-243, 231 p following 243 (2015)
  • Non-Patent Document 0002 Tsai, S.Q. et al. Nat Biotechnol 33, 187-197 (2015)
  • Non-Patent Document 3 Kim, S., Kim, D., Cho, S.W., Kim, J. & Kim, J.S. Genome Res 24, 1012-1019 (2014)
  • Non-Patent Document 0004 Cho, S.W. et al. Genome Res 24, 132-141 (2014)
  • Non-Patent Document 0005 Mali, P. et al. Nat Biotechnol 31, 833-838 (2013)
  • Non-Patent Document 0006 Ran, F.A. et al. Cell 154, 1380-1389 (2013)
  • Non-Patent Document 0007 Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V.M. & Joung, J.K. Nat Biotechnol 32, 279-284 (2014)
  • Non-Patent Document 0008 Nishimasu, H. et al. Cell 156, 935-949 (2014)
  • Non-Patent Document 0009 Kleinstiver, B.P. et al. Nature 529, 490-495 (2016)
  • Non-Patent Document 0010 Slaymaker, I.M. et al. Science 351, 84-88 (2016)
  • Non-Patent Document 0011 Chen, J.S. et al. Nature (2017)
  • Non-Patent Document 0012 Kleinstiver, B.P. et al. Nat Biotechnol 33,1293-1298 (2015)
  • Non-Patent Document 0013 Kleinstiver, B.P. et al. Nature 523, 481-485 (2015)
  • Non-Patent Document 0014 Chen, Z. & Zhao, H. Nucleic Acids Res 33, e154 (2005)
  • Non-Patent Document 0016 McKenzie, G.J. & Craig, N.L. BMC Microbiol 6, 39 (2006)
  • Non-Patent Document 001-7 Kulcsar, P.I. et al. Genome Biol 18, 190 (2017)
  • Non-Patent Document 00178 Zhang, D. et al. Genome Biol 18, 191 (2017)
  • Non-Patent Document 0019 Komor, A. C., Kim, Y.B., Packer, M. S., Zuris, J.A. &Amp; Liu, D.R. Nature 533, 420-424 (2016)
  • Non-Patent Document 0020 Kim, D., Kim, S., Park, J. & Kim, J.S. Genome Res 26, 406-415 (2016)
  • Non-Patent Document 0021 Geissmann, Q. PLoS One 8, e54072
  • an artificially engineered CRISPR enzyme with improved target specificity is provided.
  • the present invention relates to an artificially engineered CRISPR enzyme to solve the above problems. More specifically, the present invention relates to Cas9 having improved target specificity for a target gene or nucleic acid, and a CRISPR / Cas9 system using the same.
  • the present invention provides artificially engineered CRISPR enzymes for specific purposes.
  • an artificially engineered CRISPR enzyme is an SpCas9 variant comprising an artificial manipulation
  • the artificial manipulation may include manipulation of one or more amino acids present in one or more of the first, second, third and fourth regions of the wildtype Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) And may be a SpCas9 variant with improved target specificity.
  • SpCas9 wildtype Streptococcus pyogenes Cas9
  • the first region of the wildtype SpCas9 is a portion of the wild-type SpCas9 that interacts with the guide RNA (gRNA); A portion of the wild-type SpCas9 that interacts with the target sequence; gRNA-a portion of the wild-type SpCas9 interacting with the target sequence heterozygous heteroduplex; And a portion of the wild-type SpCas9 which interacts with the PAM (Protospacer adjacent motif) and the PAM distal end of the gRNA-target sequence heteroduplex.
  • gRNA guide RNA
  • PAM Protospacer adjacent motif
  • the PAM distal end of the gRNA-target sequence heteroduplex may be 6 to 10 base pairs of the terminal end of the gRNA-target sequence heteroduplex located far away from the PAM position have.
  • the PAM may be 5'-NGG-3 '.
  • the second region of the wildtype SpCas9 may be part of the wild-type SpCas9 which performs the nucleic acid cleavage function of the wild-type SpCas9.
  • the third region of the wildtype SpCas9 may be part of the wild type SpCas9 that performs the nucleic acid cleavage function of wild type SpCas9.
  • the fourth region of the wildtype SpCas9 is a portion of the wild-type SpCas9 that can recognize or interact with the PAM sequence in the target gene or nucleic acid; And a portion of wild-type SpCas9 that interacts with some nucleotide sequences of the gRNA.
  • the first region of the wildtype SpCas9 is located in the REC lobe of the wild-type SpCas9; REC domain entirely of wild-type SpCas9; And a portion of the REC domain of wild-type SpCas9.
  • the second region of the wildtype SpCas9 is located in the NUC lobe of the wild-type SpCas9;
  • the metal-dependent nucleic acid cleavage site of the RuvC domain may be a region capable of cleaving the bond between nucleic acids at the target site by interaction with metal in the RuvC domain.
  • the third region of the wildtype SpCas9 is located in the NUC lobe of the wild-type SpCas9; The entire HNH domain of wild-type SpCas9; A portion of the HNH domain of wild-type SpCas9; And a metal-dependent nucleic acid cleavage region of the HNH domain of wild-type SpCas9.
  • the metal-dependent nucleic acid cleavage site of the HNH domain may be a region capable of cleaving the bond between the nucleic acid at the target site by interaction with the metal in the HNH domain.
  • the fourth region of the wildtype SpCas9 is located in the NUC lobe of wild-type SpCas9; The entire PI domain of wild-type SpCas9; And a portion of the PI domain of wild-type SpCas9.
  • the first region comprises a 1-1 region consisting of the amino acid sequence from 196th phenylalanine (F196) to 282th isoleucine (I282) of wild-type SpCas9; A first 1-2 region consisting of the amino acid sequence from the 316th proline (P316) to the 394th asparagine (N394); A 1-3 region consisting of the amino acid sequence from the 510th lysine (K510) to the 612th asparagine (N612); And a 1-4 region consisting of an amino acid sequence from 678th threonine (T678) to 698th histidine (H698).
  • F196 phenylalanine
  • I282 isoleucine
  • the first region comprises at least one of N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, L272, L237, L237, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, L237, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, I362, L333, L334, L333, L333, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, L540, L514, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A53
  • the second region comprises a second-1 region consisting of an amino acid sequence from the first methionine (M1) to the 22nd threonine (T22) of wild-type SpCas9; A 2-2 region consisting of the amino acid sequence from the 731st proline (P731) to the 770th threonine (T770); And a 2-3 region consisting of amino acid sequence from 926th glutamine (Q926) to 1040th serine (S1040).
  • the second region is selected from the group consisting of I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, I996, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I
  • the third region may include a 3-1 region consisting of amino acid sequence from 775th lysine (K775) to 900th leucine (L900) of wild-type SpCas9.
  • the third region is a region of the wild-type SpCas9 which is represented by K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, V838, D839, H840, K848, D849, D850, D853, N854, K855, R859, D861, K862, N863, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, A889, K890, L891, R895, K896, and D898.
  • the fourth region may include a 4-1 region consisting of amino acid sequence from 1099th glutamic acid (E1099) to 1139th valine (V1139) of wild-type SpCas9.
  • the fourth region may include T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 and T1138 of wild-type SpCas9.
  • At least one amino acid selected from one or more of the first region, the second region, the third region and the fourth region of the wildtype SpCas9 is selected from the group consisting of I7, G8, L9, I11, G12, V22, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, L249, L246, L244, L246, L246, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376,
  • At least one amino acid selected from one or more regions of the first, second, third and fourth regions of the wildtype SpCas9 is selected from the group consisting of A203, N277, G366, F539, I601, M763, K890, D965, F1038, T1102 and D1127.
  • the artificial manipulation may be deletion of one or more amino acids selected from one or more regions of a first region, a second region, a third region and a fourth region of wildtype SpCas9.
  • the artificial manipulation may be the substitution of one or more amino acids selected from one or more of the first region, the second region, the third region and the fourth region of the wildtype SpCas9 with another amino acid.
  • the other amino acid is relatively small in the size of the functional group as compared with one or more amino acids selected from one or more regions of the first region, the second region, the third region and the fourth region of the wildtype SpCas9 Amino acid.
  • the other amino acid may be an amino acid having a relatively large functional group size as compared with one or more amino acids selected from one or more regions of the first region, the second region, the third region, and the fourth region of the wildtype SpCas9 .
  • the other amino acid is an amino acid having a relatively large hydrophobic index compared to one or more amino acids selected from one or more regions of the first region, the second region, the third region, and the fourth region of the wildtype SpCas9. .
  • the other amino acid may be an amino acid having a relatively small hydrophobic index as compared to one or more amino acids selected from one or more regions of the first region, the second region, the third region and the fourth region of the wildtype SpCas9.
  • the SpCas9 mutant is selected from the group consisting of a target specific SpCas9 comprising an artificial manipulation of one or more amino acids selected from the group consisting of A203, N277, G366, F539, I601, M763, K890, D965, F1038, T1102 and D1127 of wild- (Target specific SpCas9; TS-SpCas9) variant.
  • the artificial manipulation may be the removal of one or more amino acids selected from the group consisting of A203, N277, G366, F539, I601, M763, K890, D965, F1038, T1102 and D1127 of wild-type SpCas9 or substitution with another amino acid.
  • the other amino acid is relatively larger in size of at least one amino acid selected from the group consisting of A203, N277, G366, F539, I601, M763, K890, D965, F1038, T1102 and D1127 of wild type SpCas9, It may be a small amino acid.
  • the other amino acid may have a hydrophobic index larger or smaller than that of at least one amino acid selected from the group consisting of A203, N277, G366, F539, I601, M763, K890, D965, F1038, T1102 and D1127 of wild-type SpCas9. Lt; / RTI >
  • the TS-SpCas9 variant may comprise an artificial manipulation of F539 of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 variant may comprise an artificial manipulation of M763 of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 variant may comprise an artificial manipulation of K890 of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 mutants are F539 and M763 (F539 / M763) of wild-type SpCas9; F539 / K890; Or an artificial manipulation of the M763 / K890.
  • the TS-SpCas9 variant may comprise an artificial manipulation of wild-type SpCas9 F539, M763 and K890.
  • an artificially engineered CRISPR enzyme may be a fusion protein comprising said TS-SpCas9 variant.
  • the fusion protein may comprise one or more functional domains.
  • the functional domain may have a methylase activity, a demethylase activity, a transcription activation activity, a transcription repression activity, a transcription release factor activity
  • NLS nuclear localization sequence or signal
  • NES nuclear export sequence or signal
  • deaminase The term " deaminase "
  • an artificially engineered CRISPR enzyme may be in the form of a nucleic acid encoding said SpCas9 variant, TS-SpCas9 variant and / or fusion protein.
  • the nucleic acid can be included in a vector.
  • the nucleic acid encoding the SpCas9 variant, the TS-SpCas9 variant and / or the fusion protein and / or the vector may be introduced into the cell.
  • the SpCas9 variant, TS-SpCas9 variant and / or fusion protein can be used in conjunction with gRNA to artificially engineer the genome of the cell.
  • the gRNA may be a nucleic acid comprising a nucleotide sequence that is complementary to a target sequence of a target gene present in the genome of the cell.
  • the present invention can be used for manipulation or modification of genomes and / or epigenomes, genome targeting, genomic correction and in vitro diagnosis of CRISPR-Cas systems with enhanced target specificity through artificially engineered CRISPR enzymes.
  • Fig. 1 is a graph showing the indel (insertion and deletion)% of the target gene (DMD gene) manipulated by the first region variant of SpCas9.
  • 2 is a graph showing the indel% of the manipulation effect of the target gene (EMX gene) by the first region variant of SpCas9.
  • Fig. 3 is a graph showing the manipulated effect indel% of the target gene (VEGFA gene) by the first region variant of SpCas9.
  • Fig. 4 and Fig. 5 are graphs showing indel% of the manipulation effect of the target gene (DMD gene) by the second region variant of SpCas9.
  • 6 and 7 are graphs showing the indel% of the manipulated effect of the target gene (EMX gene) by the second region variant of SpCas9.
  • FIG. 8 is a graph showing the manipulated effect indel% of the target gene (VEGFA gene) by the second region variant of SpCas9.
  • FIG. 9 is a graph showing the manipulated effect indel% of the target gene (HBB03 gene) by the second region variant of SpCas9.
  • FIG. 10 is a graph showing the indel% of the manipulated effect of the target gene (HBB04 gene) by the second region variant of SpCas9.
  • 11 is a graph showing the indel% of the manipulated effect of the target gene (DMD gene) by the third region variant of SpCas9.
  • FIG. 12 is a graph showing the indel% of the manipulated effect of the target gene (DMD gene) by the fourth region variant of SpCas9.
  • Fig. 13 is a graph showing the manipulated effect indel% of the target gene (EMX gene) by the fourth region variant of SpCas9.
  • FIG. 14 is a graph showing the indel% of manipulation effect of a target gene (DMD gene) by a SpCas9 mutant having a mutation in two regions among four regions of SpCas9 of SpCas9.
  • 15 is a graph showing the indel% of manipulation effect of a target gene (EMX gene) by a SpCas9 mutant having a mutation in two regions out of the four regions of SpCas9 of SpCas9.
  • EMX gene target gene
  • 16 is a graph showing the indel% of the manipulation effect of the target gene (VEGFA gene) by the SpCas9 mutant having the mutation in two regions among the four regions of SpCas9 of SpCas9.
  • 17 is a graph showing the indel% of the manipulation effect of the target gene (HBB03 gene) by the SpCas9 mutant having the mutation in two regions out of the four regions of SpCas9 of SpCas9.
  • FIG. 18 is a graph showing the indel% of the manipulation effect of the target gene (HBB04 gene) by the SpCas9 mutant having the mutation in the two regions out of the four regions of SpCas9 of SpCas9.
  • FIG. 19 is a graph showing the indel% of manipulation effect of a target gene (DMD gene) by a SpCas9 mutant having a mutation in three or more regions among four regions of SpCas9 of SpCas9.
  • FIG. 20 is a graph showing the indel% of the manipulation effect of the target gene (VEGFA gene) by the SpCas9 mutant having a mutation in three or more regions among the four regions of SpCas9 of SpCas9.
  • 21 is a graph showing the indel% of the manipulation effect of the target gene (HBB03 gene) by the SpCas9 mutant having a mutation in three or more regions among the four regions of SpCas9 of SpCas9.
  • FIG. 22 is a graph showing the manipulated effect indel% of the target gene (HBB04 gene) by the SpCas9 mutant having a mutation in three or more regions among the four regions of SpCas9 of SpCas9.
  • FIG. 23 is a graph showing the indel% of the manipulation effect of the target gene (DMD gene) by the SpCas9 mutant having the mutation in three or more regions among the four regions of SpCas9 of SpCas9.
  • One aspect of the disclosure taught herein relates to CRISPR enzymes.
  • CRISPR enzyme is a major protein component of the CRISPR-associated short-palindromic repeats (CRISPR) -cas system and forms a CRISPR-Cas system by complexing with guide RNA (gRNA).
  • CRISPR CRISPR-associated short-palindromic repeats
  • the "gRNA” refers to a gRNA-CRISPR enzyme complex for the target gene or nucleic acid, that is, an RNA capable of specifically targeting the CRISPR complex.
  • the gRNA is a specific RNA for the target sequence, which binds with the CRISPR enzyme to produce the CRISPR enzyme Target genes or nucleic acids.
  • the term " target sequence &quot refers to a nucleotide sequence existing in a target gene or nucleic acid, specifically, a nucleotide sequence of a target gene or a nucleotide sequence of a target region within a nucleic acid. It is a site that can be modified by proteins.
  • the gRNA may comprise a plurality of domains. Each domain can interact within the strand or between strands of the three-dimensional behavior or the active form of the gRNA.
  • gRNA is a single stranded gRNA (single RNA molecule; single gRNA; sgRNA); Or a double gRNA (including more than one and typically two separate RNA molecules).
  • the single stranded gRNA comprises a guide domain in the 5 'to 3' direction, a domain comprising a guide sequence capable of binding complementary to a target gene or nucleic acid; A first complementary domain; Connection domain; A second complementary domain, a domain capable of forming a double-stranded nucleic acid with a first complementary domain since the first complementary domain has a sequence complementary to the first complementary domain sequence; Proximal domain; And optionally a tail domain.
  • the double gRNA comprises a guide domain in the 5 'to 3' direction, a domain comprising a guide sequence capable of a complementary binding to a target gene or nucleic acid, and a first complementary domain ≪ / RTI > And a second complementary domain; a domain capable of forming a double-stranded nucleic acid with a first complementary domain having a sequence complementary to the first complementary domain sequence; a proximal domain; And optionally a second strand comprising a tail domain.
  • first strand may be referred to as a crRNA and the second strand may be referred to as a tracrRNA.
  • the crRNA may comprise a guiding domain and a first complementary domain, wherein the tracrRNA may comprise a second complementary domain, a proximal domain and optionally a tail domain.
  • the single stranded gRNA comprises a guide domain in the 3 'to 5' direction, a domain comprising a guide sequence capable of binding complementary to the target gene or nucleic acid; A first complementary domain; And a second complementary domain, a domain complementary to the first complementary domain sequence, and a domain capable of forming a double-stranded nucleic acid with the first complementary domain.
  • the CRISPR enzyme may be a nucleic acid having a sequence encoding the CRISPR enzyme, or a polypeptide (or protein). Typically, a Type II CRISPR enzyme or a Type V CRISPR enzyme is used.
  • the CRISPR enzyme may be a Type II CRISPR enzyme.
  • the Type II CRISPR enzyme may be Cas9.
  • the Cas9 may be selected from the group consisting of Streptococcus pyogenes, Streptococcus thermophilus, Streptococcus sp., Staphylococcus aureus, Nocardiopsis rougei, Streptomyces pristinaespiralis, Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces viridochromogenes, Streptosporangium roseum, Streptosporangium roseum, Alicyclobac Hlus acidocaldarius, Bacillus pseudomycoides, Bacillus selenitireducens, Exiguobacterium sibiricum, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus salivarius, Microscilla marina, Burkholderiales bacterium, Polaromonas naphthalenivorans (Lactobacillus delbrueckii), Lactobacillus
  • Cas9 may be isolated from microorganisms existing in a natural state or produced naturally by a recombinant method or a synthetic method.
  • the crystal structure of the Type II CRISPR enzyme is similar to that of two or more naturally occurring microorganisms Type II CRISPR enzyme molecules (Jinek et al., Science, 343 (6176): 1247997, 2014), and a complex of Streptococcus pyogenes (Nishimasu et al., Cell, 156: 935-949, 2014; and Anders et al., Nature, 2014, doi: 10.1038 / nature13579).
  • the Type II CRISPR enzyme comprises two lobes, Recognition (REC) and Nucleic Acid (NUC) lobes, each lobe comprising several domains.
  • the REC lobe comprises an arginine-rich bridge spiral (BH), a REC1 domain and a REC2 domain.
  • BH arginine-rich bridge spiral
  • the BH domain is a long? -Helical and arginine rich region, and the REC1 and REC2 domains play an important role in the recognition of the double strand formed in the gRNA, for example, single strand gRNA, double gRNA or tracrRNA.
  • the NUC lobe comprises the RuvC domain, the HNH domain and the PAM-interacting (PI) domain.
  • the RuvC domain is used to mean the RuvC-like domain
  • the HNH domain is used to mean the HNH-like domain.
  • the RuvC domain shares structural similarity with members of a microorganism existing in a natural state including a Type II CRISPR enzyme, and has a single strand, for example, a complementary strand of a target gene or a nucleic acid, The strands that do not bind are cleaved.
  • the RuvC domain is often referred to in the art as the RuvCI domain, the RuvCII domain, and the RuvCIII domain, typically RuvC I, RuvCII, and RuvCIII.
  • the HNH domain shares structural similarity with the HNH endonuclease and cleaves a single strand, for example, a complementary strand of the target nucleic acid molecule, i. E., A strand that makes a complementary binding to the gRNA.
  • the HNH domain is located between the RuvC II and III motifs.
  • the PI domain recognizes a specific nucleotide sequence in the target gene or nucleic acid, that is, PAM (Protospacer adjacent motif) or interacts with PAM.
  • PAM Protospacer adjacent motif
  • the PAM may be different depending on the origin of the Type II CRISPR enzyme.
  • PAM is determined depending on the origin of the above-mentioned enzymes.
  • the PAM may be
  • the CRISPR enzyme may be a nuclease or a restriction enzyme having a function of cleaving a target gene or a double strand of nucleic acid.
  • the CRISPR enzyme may be a fully active CRISPR enzyme.
  • Fully active means a state having the same function as that of a wild-type CRISPR enzyme, and the CRISPR enzyme in this state is referred to as a fully active CRISPR enzyme.
  • the "wild type CRISPR enzyme function” refers to a function of cleaving a double strand of DNA, that is, a first function of cutting a first strand of a double strand of DNA and a second function of cutting a second strand of DNA And a second function of performing the second function.
  • the fully active CRISPR enzyme may be a wild type CRISPR enzyme that cleaves double strands of DNA.
  • the fully active CRISPR enzyme may be a CRISPR enzyme variant that has modified or manipulated a wild type CRISPR enzyme that cleaves double strands of DNA.
  • the CRISPR enzyme mutant may be an enzyme in which at least one amino acid of the amino acid sequence of the wild-type CRISPR enzyme is replaced with another amino acid or at least one amino acid has been removed.
  • the CRISPR enzyme mutant may be an enzyme having one or more amino acids added to the amino acid sequence of wild-type CRISPR enzyme. At this time, the position of the added amino acid may be within the N-terminus, C-terminus or amino acid sequence of the wild-type enzyme.
  • the CRISPR enzyme mutant may be a completely active enzyme having improved function than the wild-type CRISPR enzyme.
  • modified or engineered forms of wild-type CRISPR enzymes i.e., CRISPR enzyme variants
  • CRISPR enzyme variants can not cut DNA double strands that are to be cleaved or can cut DNA double strands while maintaining constant distance spacing.
  • the modified or engineered form may be a fully active CRISPR enzyme with enhanced functional activity over wild-type CRISPR enzymes.
  • the CRISPR enzyme variant may be a fully active CRISPR enzyme with reduced function than the wild type CRISPR enzyme.
  • a particular modified or engineered form of the wild-type CRISPR enzyme can cut double strands of DNA in a state in which the DNA double strand to be cleaved is in close proximity or a specific bond is formed.
  • the specific binding may be, for example, a combination of an amino acid at a specific position of the enzyme and a DNA nucleotide sequence at a cleavage site.
  • the modified or engineered form may be a fully active CRISPR enzyme with reduced functional activity than the wild-type CRISPR enzyme.
  • the CRISPR enzyme may be an incomplete or partially active CRISPR enzyme.
  • Incomplete or partially active &quot refers to a function of the wild-type CRISPR enzyme, i.e., a function selected from among a first function of cleaving a first strand of a double strand of DNA and a second function of severing a second strand of a double strand of DNA It means the state of having.
  • the CRISPR enzyme in this state is termed an incomplete or partially active CRISPR enzyme.
  • the incomplete or partially active CRISPR enzyme may also be referred to as a nickase.
  • the nicarase may have nuclease activity by the RuvC domain of the CRISPR enzyme. That is, the nicarase may not contain nuclease activity by the HNH domain of the CRISPR enzyme, for which the HNH domain may be manipulated or altered.
  • the nicarase may be a Type II CRISPR enzyme comprising a modified HNH domain.
  • the Type II CRISPR enzyme is a wild-type SpCas9
  • the nicarase can mutate histone of amino acid sequence 840 of wild-type SpCas9 to alanine to be an SpCas9 mutant in which the nuclease activity of the HNH domain is inactivated have.
  • the produced niacase, that is, the SpCas9 mutant has nuclease activity by the RuvC domain, so that it can cleave the target gene or the non-complementary strand of the nucleic acid, that is, the strand that does not bind complementary to the gRNA.
  • the Type II CRISPR enzyme is a wild-type CjCas9
  • the nicarase mutates histidine of amino acid sequence 559 of wild-type CjCas9 to alanine to generate a CjCas9 mutant in which the nuclease activity of the HNH domain is inactivated Lt; / RTI >
  • the produced niacase, that is, the CjCas9 mutant has nuclease activity by the RuvC domain, so that it is possible to cleave the target gene or the non-complementary strand of the nucleic acid, that is, the strand which is not complementary to the gRNA.
  • the nicarase may have nuclease activity by the HNH domain of the CRISPR enzyme. That is, the nicacase may not contain nuclease activity by the RuvC domain of the CRISPR enzyme, and the RuvC domain may be manipulated or altered for this purpose.
  • the nicarase may be a Type II CRISPR enzyme comprising a modified RuvC domain.
  • the Type II CRISPR enzyme is wild-type SpCas9
  • the nicacase mutant s the amino acid sequence 10 aspartic acid of wild-type SpCas9 to alanine to generate a SpCas9 mutant in which the nuclease activity of the RuvC domain is inactivated .
  • the produced niacase that is, the SpCas9 mutant has nuclease activity by the HNH domain, so that the complementary strand of the target gene or the nucleic acid, that is, the strand that makes a complementary bond to the gRNA, can be cleaved.
  • the niacase mutates the aspartate acid at amino acid sequence 8 of wild-type CjCas9 to alanine to generate CjCas9 in which the nuclease activity of the RuvC domain is inactivated Lt; / RTI >
  • the produced niacase, that is, the CjCas9 mutant has nuclease activity by the HNH domain, so that the complementary strand of the target gene or the nucleic acid, that is, the strand that makes a complementary bond to the gRNA, can be cleaved.
  • the CRISPR enzyme may be an inactive CRISPR enzyme.
  • Inactive &quot means a state in which both the function of the wild-type CRISPR enzyme, i.e., the first function of cleaving the first strand of the double strand of DNA and the second function of severing the second strand of the double strand of DNA, are lost.
  • the CRISPR enzyme in this state is termed an inactive CRISPR enzyme.
  • the inactive CRISPR enzyme may have nuclease inactivation due to mutation in the domain having nuclease activity of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the inactive CRISPR enzyme may have nuclease abilities due to mutations in the RuvC domain and the HNH domain. That is, the inactive CRISPR enzyme may not contain nuclease activity by the RuvC domain and the HNH domain of the CRISPR enzyme, and the RuvC domain and the HNH domain may be manipulated or modified for this purpose.
  • the inactive CRISPR enzyme may be a Type II CRISPR enzyme comprising a modified RuvC domain and an HNH domain.
  • the inactive CRISPR enzyme mutates allantoin 10-aspartic acid and 840-histidine of wild-type SpCas9 into alanine to form a nucleucase of RuvC domain and HNH domain Activity may be an inactivated SpCas9 mutant.
  • the generated inactive CRISPR enzyme that is, the SpCas9 mutant, can not cleave the double strand of the target gene or the nucleic acid because the nuclease activity of the RuvC domain and the HNH domain is inactivated.
  • the generated inactive CRISPR enzyme that is, the CjCas9 mutant, can not cleave the double strand of the target gene or the nucleic acid because the nuclease activity of the RuvC domain and the HNH domain is inactivated.
  • the CRISPR enzyme may have a helicase activity, i.e., the ability to resolve the helical structure of the double-stranded nucleic acid.
  • the CRISPR enzyme can modify the CRISPR enzyme to be fully active, incomplete or partially active, or inert to the helicase activity of the CRISPR enzyme.
  • the CRISPR enzyme may be an artificially engineered CRISPR enzyme.
  • the term " artificially modified or engineered or artificially engineered " means a state created by an artificial transformation, not a state of being as it exists in nature.
  • the artificial mutation can be generated in a nucleic acid and / or protein encoding the CRISPR enzyme, and the artificial mutation is a process in which a protein is generated by a nucleic acid encoding a CRISPR enzyme, that is, a transcription, And post-translational deformation, and the like.
  • an unnatural artificially engineered or modified CRISPR enzyme can be used interchangeably with the term artificial CRISPR enzyme or CRISPR enzyme variant.
  • the artificially engineered CRISPR enzyme can be obtained by modifying the function of the wild-type CRISPR enzyme, i.e., the first function of cleaving the first strand of the double strand of DNA and / or the second function of truncating the second strand of DNA CRISPR < / RTI > enzyme variants.
  • the CRISPR enzyme mutant may be one in which the first function of the wild-type CRISPR enzyme is lost.
  • the CRISPR enzyme mutant may be one in which the first function of the wild-type CRISPR enzyme is enhanced.
  • the CRISPR enzyme mutant may be a form in which the function of the wild-type CRISPR enzyme is lost.
  • the CRISPR enzyme mutant may be a form in which the second function of the function of the wild-type CRISPR enzyme is improved.
  • the CRISPR enzyme mutant may be a form in which the function of the wild-type CRISPR enzyme, i.e., the first function and the second function, is lost.
  • the CRISPR enzyme mutant may be a form in which the function of the wild-type CRISPR enzyme, i.e., the first function and the second function are all improved.
  • the CRISPR enzyme mutant may have the function of the wild-type CRISPR enzyme, i.e., the first function is lost and the second function is improved.
  • the CRISPR enzyme mutant may have a function of a wild-type CRISPR enzyme, i.e., a first function is improved and a second function is lost.
  • the artificially engineered CRISPR enzyme can form a gRNA-CRISPR enzyme complex through interaction with gRNA.
  • the artificially engineered CRISPR enzyme may be a CRISPR enzyme mutant that modifies the function of interacting with the gRNA of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the CRISPR enzyme variant may be in a reduced form of interaction with the gRNA relative to the wild-type CRISPR enzyme.
  • the CRISPR enzyme mutant may be in an increased form of interaction with the gRNA relative to the wild-type CRISPR enzyme.
  • the CRISPR enzyme mutant may have a first function of the wild-type CRISPR enzyme and a reduced interaction with the gRNA.
  • the CRISPR enzyme mutant may have a first function of the wild-type CRISPR enzyme and an increased interaction with the gRNA.
  • the CRISPR enzyme mutant may have a second function of the wild-type CRISPR enzyme and a reduced interaction with the gRNA.
  • the CRISPR enzyme mutant may have a second function of the wild-type CRISPR enzyme and an increased interaction with the gRNA.
  • the CRISPR enzyme mutant may be a form in which the interaction with the gRNA is reduced without having the first function and the second function of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the CRISPR enzyme mutant may be one in which the interaction with the gRNA is increased without having the first function and the second function of the wild-type CRISPR enzyme.
  • various gRNA-CRISPR enzyme complexes may be formed depending on the intensity of interaction between the gRNA and the CRISPR enzyme mutant, and the function of accessing or cleaving the target sequence may be different depending on the CRISPR enzyme mutant.
  • a gRNA-CRISPR enzyme complex formed by a CRISPR enzyme variant with reduced interaction with a gRNA will only bind double or single strands of the target sequence if it is proximate or localized to a target sequence that is fully complementary to the gRNA Can be cut.
  • the artificially engineered CRISPR enzyme disclosed herein may be a CRISPR enzyme variant that has modified at least one amino acid in the amino acid sequence of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the CRISPR enzyme mutant may be a form obtained by removing at least one amino acid from the amino acid sequence of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the CRISPR enzyme mutant may be a form in which one or more amino acids of the positively charged amino acids of the wild-type CRISPR enzyme are removed.
  • the CRISPR enzyme variant may be in the form of one or more amino acids of the negatively charged amino acids of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the CRISPR enzyme mutant may be a form in which at least one amino acid of the wild type CRISPR enzyme has no charge.
  • the CRISPR enzyme mutant may be in the form of removing one or more amino acids of the positively charged amino acids of the wild-type CRISPR enzyme, the negatively charged amino acids and the non-charged amino acids.
  • the CRISPR enzyme mutant may be a form in which at least one amino acid selected from the amino acid sequence of the wild-type CRISPR enzyme is substituted with another amino acid.
  • the other amino acid that is, the substituted amino acid may be alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glutamine, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine And valine. ≪ / RTI >
  • the CRISPR enzyme mutant may be a form in which one or more amino acids having a positive charge of the wild-type CRISPR enzyme are substituted with another amino acid.
  • the other amino acid may be at least one selected from the group consisting of a stereoisomer of the selected one or more amino acids, other amino acids having positive charge, amino acids having negative charge, and amino acids having no charge.
  • the CRISPR enzyme mutant may be a form in which one or more amino acids of the negatively charged amino acids of the wild type CRISPR enzyme are replaced with another amino acid.
  • the other amino acid may be one or more amino acids selected from a stereoisomer of the selected one or more amino acids, other amino acids having a negative charge, amino acids having a positive charge, and amino acids having no charge.
  • the CRISPR enzyme mutant may be a form in which one or more of the amino acids having no charge of the wild-type CRISPR enzyme is substituted with another amino acid.
  • the other amino acid may be at least one selected from the group consisting of a stereoisomer of the selected one or more amino acids, other amino acids having no charge, amino acids having a positive charge and amino acids having a negative charge.
  • the CRISPR enzyme mutant may be a form in which one or more of amino acids having a positive charge of a wild-type CRISPR enzyme, amino acids having a negative charge and amino acids having no charge are replaced with another amino acid.
  • the other amino acid may be at least one selected from the group consisting of a stereoisomer of the selected one or more amino acids, an amino acid having a positive charge, an amino acid having a negative charge, and an amino acid having no charge.
  • the CRISPR enzyme mutant may be a form in which at least one amino acid in the amino acid sequence of the wild-type CRISPR enzyme is substituted and removed.
  • the artificially engineered CRISPR enzyme disclosed herein may be a CRISPR enzyme variant in which at least one amino acid is added within the amino acid sequence of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the CRISPR enzyme mutant may be a form in which at least one amino acid is added in comparison with the amino acid sequence of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the CRISPR enzyme mutant may be a form in which at least one functional domain is added to the amino acid sequence of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the functional domain is composed of at least one amino acid and may be a peptide or a polypeptide.
  • the functional domain has an original function of the wild-type CRISPR enzyme, that is, a first function of cutting the first strand of the double strand of DNA and a second function of cutting the second strand of DNA, Domain.
  • the functional domain has a function similar to the original function of the wild-type CRISPR enzyme, i.e., the first function of cleaving the first strand of the double strand of DNA and / or the second function of trimming the second strand of the double strand of DNA Domain.
  • the functional domain may be selected from the group consisting of methylase activity, demethylase activity, transcription activation activity, transcription repression activity, transcription release factor activity, histone A domain having histone modification activity, cleavage activity, or nucleic acid binding activity.
  • the functional domain may be a tag or reporter gene for the separation and purification of proteins (including peptides).
  • the tag may include a histidine tag, a V5 tag, a FLAG tag, an influenza hemagglutinin (HA) tag, a Myc tag, a VSV-G tag and a thioredoxin (Trx) tag, (GST), horseradish peroxidase (HRP), chloramphenicol acetyltransferase (CAT) beta-galactosidase, beta-glucuronidase, luciferase, green But are not limited to, autophosphor proteins including fluorescent proteins (GFP), HcRed, DsRed, Cyan fluorescent protein (CFP), yellow fluorescent protein (YFP) and blue fluorescent protein (BFP).
  • the functional domain may be deaminase.
  • an incomplete or partial CRISPR enzyme may additionally include cytidine deaminase as a functional domain.
  • an adenine deaminase to the incomplete or partial CRISPR enzyme as a functional domain.
  • the functional domain may be a nuclear localization sequence or signal (NLS) or a nuclear export sequence or signal (NES).
  • NLS nuclear localization sequence or signal
  • NES nuclear export sequence or signal
  • a CRISPR enzyme may comprise more than one NLS.
  • the NLS is at or near the amino terminus of the CRISPR enzyme; Carboxy terminus or vicinal thereof; Or a combination thereof.
  • the NLS can be, but is not limited to, the NLS sequence derived from: the NLS of the SV40 virus large T-antigen with the amino acid sequence PKKKRKV; NLS from nucleoplasmin (e.
  • the artificially engineered CRISPR enzyme may be a CRISPR enzyme variant that modifies at least one amino acid in the amino acid sequence within a particular region of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the artificially engineered CRISPR enzyme may be a CRISPR enzyme variant in which one or more amino acids are added within a specific region of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the specific region of the wild-type CRISPR enzyme may be at least one selected from the first region, the second region, the third region and the fourth region.
  • the first region may be part of a wild-type CRISPR enzyme that interacts with gRNA.
  • the first region may be part of a wild-type CRISPR enzyme that interacts with the target sequence.
  • the first region may be a portion of a wild-type CRISPR enzyme that interacts with a gRNA-target sequence heterodimer.
  • the first region may be part of a wild-type CRISPR enzyme that interacts with the PAM distal end of the gRNA-target sequence heteroduplex.
  • the PAM and the PAM distal end of the gRNA-target sequence heteroduplex have 6 to 10 base pairs of the terminal of the gRNA-target sequence heteroduplex located far away from the PAM position, that is, , 6 to 10 nucleotide sequences of a target sequence that make a complementary bond with 6 to 10 nucleotide sequences of a gRNA.
  • the first region may be a region located in a REC lobe of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the first region may be all or part of the REC domain of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the second region may be part of a wild-type CRISPR enzyme that performs a first function or a second function of a wild-type CRISPR enzyme.
  • the second region may be a region located in the NUC lobe of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the second region may be all or part of the RuvC domain of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the second region may be part of a RuvC domain comprising a metal-dependent nucleic acid cleavage region of the RuvC domain of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the metal-dependent nucleic acid cleavage site of the RuvC domain may mean a region capable of cleaving the bond between the nucleic acids at the target site by interaction with the metal in the RuvC domain.
  • the metal-dependent nucleic acid cleavage site may consist of a moiety that cleaves the bond between the moiety that interacts with the metal and the nucleic acid at the target site.
  • the third region may be a part of a wild-type CRISPR enzyme that performs a first function or a second function of a wild-type CRISPR enzyme.
  • the third region may be a region located in the NUC lobe of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the third region may be all or a portion of the HNH domain of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the third region may be a portion of the HNH domain comprising a metal-dependent nucleic acid cleavage region of the HNH domain of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the metal-dependent nucleic acid cleavage site of the HNH domain may mean a region capable of cleaving the bond between the nucleic acid at the target site by interaction with the metal in the HNH domain.
  • the fourth region may be a part of a wild-type CRISPR enzyme capable of recognizing a specific nucleotide sequence in the target gene or nucleic acid, i.e., PAM (Protospacer adjacent motif).
  • PAM Protospacer adjacent motif
  • the fourth region may be a portion of a wild-type CRISPR enzyme that interacts with a specific nucleotide sequence in the target gene or nucleic acid, i. E., PAM (Protospacer adjacent motif).
  • PAM Protospacer adjacent motif
  • the fourth region may be part of a wild-type CRISPR enzyme that interacts with a portion of the nucleotide sequence of the gRNA.
  • the fourth region may be a region located in the NUC lobe of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the fourth region may be all or a portion of the PI domain of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the artificially engineered CRISPR enzyme may be a CRISPR enzyme variant that modifies at least one amino acid in the amino acid sequence in at least one selected from the first region, the second region, the third region and the fourth region of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the CRISPR enzyme mutant may be a modified form of at least one amino acid of the amino acid sequence in the first region of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the CRISPR enzyme mutant may be a modified form of at least one amino acid in the amino acid sequence in the second region of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the CRISPR enzyme mutant may be a modified form of at least one amino acid in the amino acid sequence in the third region of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the CRISPR enzyme mutant may be a modified form of at least one amino acid of the amino acid sequence in the fourth region of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the CRISPR enzyme mutant may be a modified form of at least two amino acids of the amino acid sequence in the first region and the second region of the wild-type CRISPR enzyme. At this time, two or more amino acids may be present in different regions.
  • the CRISPR enzyme mutant may be a modified version of at least two of the amino acids in the first region and the third region of the wild-type CRISPR enzyme. At this time, two or more amino acids may be present in different regions.
  • the CRISPR enzyme mutant may be a modified form of at least two amino acids of the amino acid sequence in the first region and the fourth region of the wild-type CRISPR enzyme. At this time, two or more amino acids may be present in different regions.
  • the CRISPR enzyme mutant may be a modified form of at least two amino acids in the second region of the wild-type CRISPR enzyme and the amino acid sequence in the third region. At this time, two or more amino acids may be present in different regions.
  • the CRISPR enzyme mutant may be a modified form of at least two amino acids in the second region of the wild-type CRISPR enzyme and the amino acid sequence in the fourth region. At this time, two or more amino acids may be present in different regions.
  • the CRISPR enzyme mutant may be a modified form of at least two amino acids among the third region of the wild type CRISPR enzyme and the amino acid sequence within the fourth region. At this time, two or more amino acids may be present in different regions.
  • the CRISPR enzyme mutant may be a modified version of at least three amino acids of the amino acid sequence in the first region, the second region and the third region of the wild-type CRISPR enzyme. At this time, three or more amino acids may exist in different regions.
  • the CRISPR enzyme mutant may be a modified form of at least three amino acids of the amino acid sequence in the first region, the second region and the fourth region of the wild-type CRISPR enzyme. At this time, three or more amino acids may exist in different regions.
  • the CRISPR enzyme mutant may be a modified form of at least three amino acids of the amino acid sequence in the first region, the third region and the fourth region of the wild-type CRISPR enzyme. At this time, three or more amino acids may exist in different regions.
  • the CRISPR enzyme mutant may be a modified form of at least three amino acids in the amino acid sequence in the second, third and fourth regions of the wild-type CRISPR enzyme. At this time, three or more amino acids may exist in different regions.
  • the CRISPR enzyme mutant may be a modified version of at least four amino acids in the first, second, third and fourth regions of the wild-type CRISPR enzyme. At this time, more than four amino acids may exist in different regions.
  • the CRISPR enzyme mutant may comprise a modification of at least one amino acid selected from the one or more regions.
  • the modification may be the removal of the selected one or more amino acids.
  • the modification may be substitution of the selected one or more amino acids with another amino acid.
  • the other amino acid may be a stereoisomer of the selected amino acid.
  • the modification may be to replace L-glutamine, which is located within the first region of the wild-type CRISPR enzyme, with D-glutamine.
  • the other amino acid may be an amino acid having a hydrophobic index smaller than a hydropathy index of the selected amino acid.
  • the modification may be to replace phenylalanine (hydrophobic index: 2.8) located within the second region of the wild-type CRISPR enzyme with glycine (hydrophobic index: -0.4) that is less amorphous.
  • the other amino acid may be an amino acid having a hydrophobic index greater than a hydropathy index of the selected amino acid.
  • the modification may be to substitute serine (hydrophobic index: -0.8) located within the first region of the wild-type CRISPR enzyme with leucine (hydrophobic index: 3.8), the more amorphous index.
  • the other amino acid may be an amino acid having a functional group smaller than a functional group of the selected amino acid.
  • the modification may be to replace valine located within the third region of the wild-type CRISPR enzyme with alanine having a functional group smaller than that of valine.
  • the other amino acid may be an amino acid having a functional group larger than a functional group of the selected amino acid.
  • the modification may be to replace glycine located within the second region of the wild-type CRISPR enzyme with histidine having a functional group greater than that of glycine.
  • the other amino acid may be an amino acid having increased hydrophobicity than the hydrophobicity of the selected amino acid.
  • the modification may be to replace the aspartic acid (Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5) located in the first region of the wild-type CRISPR enzyme with threonine (Kyte-Doolittle hydrophobicity: -0.7).
  • the other amino acid may be an amino acid having a reduced hydrophobicity than the hydrophobicity of the selected amino acid.
  • the modification may be to replace the cysteine (Kyte-Doolittle hydrophobicity: 2.5) located within the fourth region of the wild type CRISPR enzyme with Kyte-Doolittle hydrophobicity (-1.6).
  • the other amino acid may be an amino acid having a larger size than the selected amino acid.
  • the modification may be to replace the lysine (Molecular Weight: 146.189) located in the third region of the wild type CRISPR enzyme with tryptophan (Molecular Weight: 204.228).
  • the other amino acid may be an amino acid having a small size of the selected amino acid sequence.
  • the modification may be to replace phenylalanine (MW: 165.192) located in the second region of the wild-type CRISPR enzyme with glutamic acid (MW: 147.131).
  • the modification may be that the selected one or more amino acids are replaced by the same number of different amino acids.
  • the modification may be to replace one alanine in the first region of the wild-type CRISPR enzyme with one glycine.
  • the modification may be to replace one arginine located within the first region of the wild-type CRISPR enzyme and one histidine located within the fourth region into one leucine (first region) and one serine (fourth region), respectively .
  • the modification may be to replace one arginine, one valine, and one leucine located in the third region of the wild type CRISPR enzyme, respectively, with one phenylalanine, i.e., a total of three phenylalanines.
  • the modification may be a substitution of the selected one or more amino acids with an unequal number of other amino acids.
  • the variant may be to replace one leucine located in the second region of the wild-type CRISPR enzyme with cysteine-alanine-alanine, i.e., a total of three amino acids.
  • the mutation may be accomplished by substituting one histidine located in the first region of the wild-type CRISPR enzyme and two consecutive amino acids, alanine-glutamine, located in the third region, respectively, with methionine-valine (first region) and proline It can be done.
  • the mutation may comprise one glutamic acid located within the first region of wild-type CRISPR enzyme, three consecutive amino acids alanine-leucine-histidine located within the second region, and two consecutive amino acids, tryptophan-serine, located within the third region Alanine (first region), methionine-proline (second region) and cysteine-alanine-threonine-valine (third region).
  • the artificially engineered CRISPR enzyme may be a CRISPR enzyme variant in which at least one amino acid has been added to at least one selected region of the first region, the second region, the third region and the fourth region of the wild-type CRISPR enzyme.
  • addition may be the addition of one or more amino acids at the N-terminal and / or C-terminal positions of one or more amino acids present in the selected one or more regions.
  • the addition may be the addition of an amino acid having one or more positively charged N-terminal and / or C-terminal positions of one or more amino acids present in the selected one or more regions.
  • the attachment may be one arginine added to the C-terminus of the selected one alanine located within the first region.
  • the addition may be the addition of two amino acids histidine-lysine to the N-terminus of the selected glutamic acid located in the third region.
  • the addition may be the addition of an amino acid having one or more negative charges at the N-terminal and / or C-terminal positions of one or more amino acids present in the selected one or more regions.
  • the addition may be the addition of one aspartic acid to the N-terminus of the selected one threonine located within the second region.
  • glutamic acid-aspartic acid-glutamic acid which is three amino acids, at the C-terminal of the selected histidine located in the fourth region.
  • the addition may be the addition of an amino acid that does not have one or more charges at the N-terminal and / or C-terminal positions of one or more amino acids present in the selected one or more regions.
  • the attachment may be the addition of two amino acids, serine-valine, to the C-terminus of the selected one cysteine located within the second region.
  • the attachment may be the addition of five amino acids, glycine-proline-glutamine-phenylalanine-leucine, to the N-terminus of the selected lysine located within the third region.
  • the addition is selected from the group consisting of amino acids having a positive charge at the N-terminal and / or C-terminal positions of one or more amino acids present in the selected one or more regions, amino acids having negative charges and amino acids having no charge And may be the addition of one or more selected amino acids.
  • the attachment may be the addition of six amino acids histidine-arginine-glycine-serine-alanine-glutamic acid to the C-terminus of one selected arginine located within the first region.
  • the addition may be the addition of lysine-lysine-alanine-phenylalanine-glutamine-threonine-methionine-cysteine-aspartic acid-serine to the N-terminus of the selected one glycine located within the fourth region.
  • the addition may be the addition of one or more functional domains to the N-terminal and / or C-terminal positions of one or more amino acids present in the selected one or more regions.
  • the functional domain has an original function of the wild-type CRISPR enzyme, that is, a first function of cutting the first strand of the double strand of DNA and a second function of cutting the second strand of DNA, Domain.
  • the functional domain has a function similar to the original function of the wild-type CRISPR enzyme, i.e., the first function of cleaving the first strand of the double strand of DNA and / or the second function of trimming the second strand of the double strand of DNA Domain.
  • the functional domain may be selected from the group consisting of methylase activity, demethylase activity, transcription activation activity, transcription repression activity, transcription release factor activity, histone A domain having histone modification activity, cleavage activity, or nucleic acid binding activity.
  • the functional domain may be a tag or reporter gene for the separation and purification of proteins (including peptides).
  • the tag may include a histidine tag, a V5 tag, a FLAG tag, an influenza hemagglutinin (HA) tag, a Myc tag, a VSV-G tag and a thioredoxin (Trx) tag, (GST), horseradish peroxidase (HRP), chloramphenicol acetyltransferase (CAT) beta-galactosidase, beta-glucuronidase, luciferase, green But are not limited to, autophosphor proteins including fluorescent proteins (GFP), HcRed, DsRed, Cyan fluorescent protein (CFP), yellow fluorescent protein (YFP) and blue fluorescent protein (BFP).
  • the functional domain may be deaminase.
  • the diamine may be adenine deaminase and / or cytidine deaminase.
  • the functional domain may be a nuclear localization sequence or signal (NLS) or a nuclear export sequence or signal (NES).
  • NLS nuclear localization sequence or signal
  • NES nuclear export sequence or signal
  • the artificially engineered CRISPR enzyme may be an artificially engineered Cas9.
  • the artificially engineered Cas9 may be a Cas9 mutant that has modified at least one amino acid in the amino acid sequence within a specific region of the wild-type Cas9.
  • the artificially manipulated Cas9 may be a Cas9 mutant in which at least one amino acid is added in a specific region of the wild-type Cas9.
  • the specific region of the wild type Cas 9 may be at least one selected from the first region, the second region, the third region and the fourth region.
  • the first region may be part of a wild-type Cas9 that interacts with gRNA.
  • the first region may be part of a wild-type Cas9 that interacts with the target sequence.
  • the first region may be a portion of a wild-type Cas9 that interacts with a gRNA-target sequence heteroduplex.
  • the first region may be a portion of a wild-type Cas9 that interacts with the PAM distal end of the heteroduplex of gRNA-target sequence heterodimers.
  • the PAM and the PAM distal end of the gRNA-target sequence heteroduplex have 6 to 10 base pairs of the terminal of the gRNA-target sequence heteroduplex located far away from the PAM position, that is, , 6 to 10 nucleotide sequences of a target sequence that make a complementary bond with 6 to 10 nucleotide sequences of a gRNA.
  • the first region may be a region located in a REC lobe of wild-type Cas9.
  • the first region may be all or part of the REC domain of wild-type Cas9.
  • the first region may be a region consisting of 300 amino acids at the C-terminus of the REC domain of wild-type Cas9.
  • the first region may be a region consisting of 220 amino acids at the N-terminus of the REC domain of wild-type Cas9.
  • wild-type Cas9 is wild-type SpCas9 (SEQ ID NO: 1)
  • the first region may be all or a part of the amino acid sequence from the 94th aspartic acid (D94) of the wild-type SpCas9 to the 717th glycine (G717).
  • the first region may be an amino acid sequence (1-1 region, SEQ ID NO: 2) from 196th phenylalanine (F196) to 282nd isoleucine (I282) of wild-type SpCas9.
  • the first region may be an amino acid sequence from the 316th proline (P316) to 394th asparagine (N394) of the wild-type SpCas9 (1-2 region, SEQ ID NO: 3).
  • the first region may be an amino acid sequence from the 510th lysine (K510) to the 612th asparagine (N612) of the wild-type SpCas9 (region 1-3, SEQ ID NO: 4).
  • the first region may be an amino acid sequence (region 1-4, SEQ ID NO: 5) from 678th threonine (T678) to 698th histidine (H698) of wild-type SpCas9.
  • the first region comprises the amino acid sequence (1-1 region) from the 196th phenylalanine (F196) to the 282nd isoleucine (I282) of the wild-type SpCas9, the amino acid sequence from the 316th proline (P316) to the 394th asparagine N394), the amino acid sequence from the 510th lysine (K510) to the 612th asparagine (N612) (region 1-3), and the 678th threonine (T678) to the 698th histidine H698) (1-4 regions).
  • the first region comprises the amino acid sequence (1-1 region) from the 196th phenylalanine (F196) to the 282nd isoleucine (I282) of the wild-type SpCas9, the amino acid sequence from the 316th proline (P316) to the 394th asparagine (First to third regions) from the 510th lysine (K510) to the 612th asparagine (N612) and the 678th threonine (T678) to the 698th amino acid sequence (N394) And the amino acid sequence from the amino acid sequence (H698) (1-4 region).
  • the first region is an amino acid sequence (1-1 region) from 196th phenylalanine (F196) to 282th isoleucine (I282) of wild-type SpCas9, Amino acid sequence from aspartic acid (N394) (1-2 region), amino acid sequence from 510th lysine (K510) to 612th asparagine (N612) and 678th threonine (T678) to 698th And histidine (H698) (1-4 region).
  • 1-1 region from 196th phenylalanine (F196) to 282th isoleucine (I282) of wild-type SpCas9
  • Amino acid sequence from aspartic acid (N394) 1-2 region
  • amino acid sequence from 510th lysine (K510) to 612th asparagine (N612) and 678th threonine (T678) to 698th And histidine (H698) 1-4 region.
  • the first region may be all or a part of the amino acid sequence from the 75th asparagine (N75) to the 426th lysine (K426) of the wild-type SaCas9.
  • the first region may be an amino acid sequence from the 207th threonine (T207) to the 426th lysine (K426) of the wild-type SaCas9.
  • the second region may be a part of wild-type Cas9 that performs a first function or a second function of wild-type Cas9.
  • the second region may be a region located in the NUC lobe of wild-type Cas9.
  • the second region may be all or part of the RuvC domain of wild-type Cas9.
  • the second region may be a part of the RuvC domain comprising a metal-dependent nucleic acid cleavage region of the RuvC domain of wild-type Cas9.
  • the metal-dependent nucleic acid cleavage site of the RuvC domain may mean a region capable of cleaving the bond between the nucleic acids at the target site by interaction with the metal in the RuvC domain.
  • the metal-dependent nucleic acid cleavage site may consist of a moiety that cleaves the bond between the moiety that interacts with the metal and the nucleic acid at the target site.
  • the second region may be all or a part of the amino acid sequence (RuvC I region) from the first methionine (M1) to the 59th alanine (A59) of wild-type SpCas9.
  • the second region may be all or part of the amino acid sequence (RuvC II region) from the 718th aspartic acid (D718) to 774th glutamine (Q774) of wild-type SpCas9.
  • the second region may be all or part of the amino acid sequence (RuvC III region) from the 909th serine (S909) to the 1098th threonine (T1098) of wild-type SpCas9.
  • the second region may be a RuvC I region, a RuvC II region and / or a RuvC III region of wild-type SpCas9.
  • the second region may be an amino acid sequence from the first methionine (M1) to the 22nd threonine (T22) of the wild-type SpCas9 (region 2-1, SEQ ID NO: 6).
  • the second region may be an amino acid sequence (region 2-2, SEQ ID NO: 7) from the 731st proline (P731) to the 770th threonine (T770) of wild-type SpCas9.
  • the second region may be an amino acid sequence from the 926th glutamine (Q926) to the 1040th serine (S1040) of the wild-type SpCas9 (region 2-3, SEQ ID NO: 8).
  • the second region comprises an amino acid sequence from the first methionine (M1) to the 22nd threonine (T22) of the wild-type SpCas9 (region 2-1) and a region from the 731st proline (P731) to the 770th threonine ) (Region 2-2).
  • the second region comprises an amino acid sequence from the first methionine (M1) to the 22nd threonine (T22) of the wild-type SpCas9 (region 2-1) and a region from the 926th glutamine (Q926) S1040) (2-3 region).
  • the second region is selected from the group consisting of the amino acid sequence (region 2-2) from the 731st proline (P731) to the 770th threonine (T770) of the wild-type SpCas9 and the amino acid sequence from the 926th glutamine (Region 2-3) from the amino acid sequence up to step S1040.
  • the second region comprises an amino acid sequence from the first methionine (M1) to the 22nd threonine (T22) of the wild-type SpCas9 (region 2-1), 731 th proline (P731) to 770 th threonine T770) and an amino acid sequence (region 2-3) from 926th glutamine (Q926) to 1040th serine (S1040).
  • the second region may be all or a part of the amino acid sequence (RuvC I region) from the first methionine (M1) to the 41st valine (V41) of the wild-type SaCas9.
  • the second region may be all or a part of the amino acid sequence (RuvC II region) from 436th isoleucine (I436) to 481st glutamic acid (E481) of wild-type SaCas9.
  • the second region may be all or part of the amino acid sequence (RuvC III region) from the 651st tyrosine (Y651) to the 775th valine (V775) of the wild-type SaCas9.
  • the second region may be a RuvC I region, a RuvC II region and / or a RuvC III region of wild-type SaCas9.
  • the second region may be an amino acid sequence (region 2-1) from the first methionine (M1) to the 25th threonine (T25) of the wild-type SaCas9.
  • the second region may be an amino acid sequence (region 2-2) from 471th proline (P471) to 481st glutamic acid (E481) of wild-type SaCas9.
  • the second region may be an amino acid sequence (region 2-3) from 667th asparagine (N667) to 740th serine (S740) of wild-type SaCas9.
  • the third region may be a part of wild-type Cas9 that performs the first function or the second function of wild-type Cas9.
  • the third region may be a region located in a NUC lobe of wild-type Cas9.
  • the third region may be all or a part of the HNH domain of wild-type Cas9.
  • the third region may be a portion of the HNH domain comprising a metal-dependent nucleic acid cleavage region of the HNH domain of wild-type Cas9.
  • the metal-dependent nucleic acid cleavage site of the HNH domain may mean a region capable of cleaving the bond between the nucleic acid at the target site by interaction with the metal in the HNH domain.
  • the third region may be all or a part of the amino acid sequence from the 775th lysine (K775) to the 908th leucine (L908) of wild-type SpCas9.
  • the third region may be an amino acid sequence from the 775th lysine (K775) to the 900th leucine (L900) of the wild-type SpCas9 (region 3-1, SEQ ID NO: 9).
  • the third region may be all or a part of the amino acid sequence from the 521st isoleucine (I521) to the 629th glutamic acid (E629) of wild-type SaCas9.
  • the third region may be an amino acid sequence (region 3-1) from the 523rd lysine (K523) to the 627th leucocyte (L627) of the wild-type SaCas9.
  • the fourth region may be a portion of a wild-type Cas9 capable of recognizing a specific nucleotide sequence in the target gene or nucleic acid, i.e., PAM (Protospacer adjacent motif).
  • PAM Protospacer adjacent motif
  • the fourth region may be a portion of a wild-type Cas9 that interacts with a specific nucleotide sequence in the target gene or nucleic acid, i. E., PAM (Protospacer adjacent motif).
  • PAM Protospacer adjacent motif
  • the fourth region may be part of a wild-type Cas9 that interacts with a portion of the nucleotide sequence of the gRNA.
  • the fourth region may be a region located in a NUC lobe of wild-type Cas9.
  • the fourth region may be all or a part of the PI domain of the wild-type Cas9.
  • the fourth region may be all or a part of the amino acid sequence from 1099th glutamic acid (E1099) to 1368th aspartic acid (D1368) of wild-type SpCas9.
  • the fourth region may be an amino acid sequence (4-1 region, SEQ ID NO: 10) from 1099th glutamic acid (E1099) to 1139th valine (V1139) of wild-type SpCas9.
  • the fourth region may be all or a part of the amino acid sequence from the 910th lysine (K910) to the 1053th glycine (G1053) of the wild-type SaCas9.
  • the fourth region may be an amino acid sequence (region 4-1) from the 910th lysine (K910) to the 970th aspartic acid (D970) of the wild-type SaCas9.
  • the artificially manipulated Cas9 may be a Cas9 mutant in which at least one amino acid in the amino acid sequence in the selected one of the first region, the second region, the third region and the fourth region of the wild-type Cas9 is modified.
  • the Cas9 mutant may be a modified version of one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the first region of the wild-type Cas9.
  • wild-type Cas9 is wild-type SpCas9
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of one or more amino acids selected from the amino acid sequences in the first region of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant may be in the form of a modified version of one or more amino acids selected from the amino acid sequences within the 1-1 region of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant may be an amino acid having an aliphatic or amide functional group among the 1-1 region of wild-type SpCas9, i.e., N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, L244, L246, G247, L248, L248, L248, L248, L248, L246, L246, L246, One or more amino acids selected from N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281 and I282.
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of one or more amino acids selected from the amino acid sequence within the 1-2 region of the wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the non-polar amino acids of the 1-2 region of wild-type SpCas9, i.e., P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, Selected from the group consisting of P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391 and L393 Or may be in a modified form of one or more amino acids.
  • the SpCas9 mutant may be in the form of a modified version of one or more amino acids selected from the amino acid sequences within the 1-3 region of the wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of one or more amino acids selected from the group consisting of K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588 and I601 among the first to third regions of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the non-polar amino acids 1-3 of the wild-type SpCas9, i.e., L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, I600, I601, F606, and L607.
  • the non-polar amino acids 1-3 of the wild-type SpCas9 i.e., L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F55
  • the SpCas9 mutant may be a modified form of one or more amino acids selected from the amino acid sequence within the 1-4 region of the wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant may be a variant of one or more amino acids selected from the group consisting of N692, M694, Q695 and H698 of the 1-4 region of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant is a modified form of two or more amino acids selected from the amino acid sequences in the 1-1 region, 1-2 region, 1-3 region and 1-4 region of wild-type SpCas9. .
  • two or more selected amino acids may be located in different regions. Or two or more selected amino acids may be located in the same region.
  • the SpCas9 mutant is selected from the group consisting of N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210 of the 1-1 region, 1-2 region, 1-3 region and 1-4 region of the wild-type SpCas9 , I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251 , N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, , L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G36, I
  • the SpCas9 mutant is selected from the group consisting of the 1-1 region, the 1-2 region, the 1-3 region and the 1-4 region of the wild-type SpCas9, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583 , E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 and H698.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the non-polar amino acids such as L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, May be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 and I697 .
  • non-polar amino acids such as L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537,
  • the SpCas9 mutant may be a variant of a selected three or more amino acids in the amino acid sequence in the 1-1 region, 1-2 region, 1-3 region and 1-4 region of wild-type SpCas9 have.
  • the selected three or more amino acids may be located in different regions.
  • three or more selected amino acids may be located within the same region.
  • three or more selected amino acids may be located in the same or different regions, respectively.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the group consisting of N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231 , N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, , Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367 , F372, F375, I376, P378, I379, L380
  • the SpCas9 mutant is selected from the group consisting of the 1-1 region, the 1-2 region, the 1-3 region and the 1-4 region of the wild-type SpCas9, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583 , E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 and H698.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the group consisting of A203, N277, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601 of the 1-1 region, the 1-3 region and the 1-4 region of the wild-type SpCas9 , N692, M694, Q695, and H698.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the group consisting of G126, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692 , M694, Q695, and H698.
  • the Cas9 mutant may be a modified version of one or more amino acids selected from the amino acid sequences in the second region of the wild-type Cas9.
  • wild-type Cas9 is wild-type SpCas9
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of one or more amino acids selected from the amino acid sequences in the second region of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant may be in the form of a modified version of one or more amino acids selected from the amino acid sequence within the 2-1 region of the wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant may have a modified form of at least one amino acid selected from the group consisting of I7, G8, L9, D10, I11 and G12 of the wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant may be in the form of a modified version of one or more amino acids selected from the amino acid sequence within the region 2-2 of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of one or more amino acids selected from the group consisting of I761, E762, M763, R765, E766, and N767 of the second-2 region of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the non-polar amino acids of region 2-2 of wild-type SpCas9, i.e., P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763 and A764.
  • the SpCas9 variant may be a variant of one or more amino acids selected from the amino acid sequences within the 2-3 region of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant may comprise one or more amino acids selected from the group consisting of D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038 and Y1039 of the 2-3 region of wild type SpCas9 As shown in FIG.
  • the SpCas9 variant may comprise amino acids that do not have polarity, i.e., I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 and F1038.
  • polarity i.e., I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequences in the 2-1 region and the 2-2 region of the wild-type SpCas9. At this time, the two or more amino acids selected may be located in the 2-1 region and the 2-2 region, respectively.
  • the SpCas9 mutant is selected from the group consisting of I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766 and N767 of the 2-1 region and the 2-2 region of wild-type SpCas9 And may be a modified form of two or more selected amino acids.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the group consisting of amino acids having no polarity, i.e., I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, At least two selected from the group consisting of V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763 and A764 It may be a modified form of amino acid.
  • amino acids having no polarity i.e., I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequences in the 2-1 region and the 2-3 region of the wild-type SpCas9. At this time, the two or more amino acids selected may be located in the 2-1 region and the 2-3 region, respectively.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the group consisting of I7, G8, L9, D10, I11, G12, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987 , Y988, Y1036, F1037, F1038, and Y1039.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the non-polar amino acids, i.e., I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V920, I921, I937, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, Two or more selected from the group consisting of V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037, It may be a modified form of amino acid.
  • non-polar amino acids i.e., I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequences within the 2-2 region and the 2-3 region of the wild-type SpCas9. At this time, the two or more amino acids selected may be located in the 2-2 region and the 2-3 region, respectively.
  • the SpCas9 mutant is selected from the group consisting of the 2-2 region and the 2-3 region of the wild-type SpCas9, including I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987 , Y988, Y1036, F1037, F1038, and Y1039.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the non-polar amino acids such as P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, Or a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 and F1038.
  • non-polar amino acids such as P731, A732,
  • the SpCas9 mutant may be a modified form of at least three selected amino acids among the amino acid sequences within the 2-1 region, the 2-2 region and the 2-3 region of the wild-type SpCas9. At this time, the selected three or more amino acids may be located in the 2-1 region, the 2-2 region, and the 2-3 region, respectively.
  • the SpCas9 mutant is selected from the group consisting of I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, and E766 of the 2-1 region, the 2-2 region, At least three amino acids selected from the group consisting of N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038 and Y1039.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the non-polar amino acids such as I7, G8, L9, I11, G12, V16, and V16 of the wild type SpCas9, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, V931, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, Wherein at least three amino acids selected from the group consisting of G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M
  • the Cas9 mutant may have a modified form of at least one amino acid in the amino acid sequence in the third region of the wild-type Cas9.
  • wild-type Cas9 is wild-type SpCas9
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the third region of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant may be in the form of a modified version of one or more amino acids selected from the amino acid sequences within the 3-1 region of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant may be modified to include one or more of the amino acids selected from the group consisting of V318, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 and L891 of the 3-1 region of wild type SpCas9 Lt; / RTI >
  • the SpCas9 mutant may be selected from the group consisting of amino acids having a charge among the 3-1 region of the wild-type SpCas9, namely, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E898, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 and D898.
  • amino acids having a charge among the 3-1 region of the wild-type SpCas9 namely, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K
  • the Cas9 mutant may be a modified version of one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the fourth region of the wild-type Cas9.
  • wild-type Cas9 is wild-type SpCas9
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the fourth region of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant may be a modified form of one or more amino acids selected from the amino acid sequence within the 4-1 region of the wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant may be a variant of one or more amino acids selected from the group consisting of T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 and T1138 of the 4-1 region of wild type SpCas9 have.
  • the Cas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequence in the first region and the second region of the wild-type Cas9. At this time, two or more amino acids may be present in different regions.
  • wild-type Cas9 is wild-type SpCas9
  • the SpCas9 mutant may be a modified form of two or more amino acids selected from the amino acid sequences in the first region and the second region of wild-type SpCas9. At this time, two or more amino acids may be present in different regions.
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequences in the 1-1 and 2-1 regions of the wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the group consisting of I-1, I-2, , I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251 , At least two amino acids selected from the group consisting of N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281 and I282.
  • the SpCas9 mutant may be a modified form of two or more amino acids selected from the amino acid sequences within the 1-1 and 2-2 regions of the wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant is selected from the group consisting of N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224 , L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, , At least two amino acids selected from the group consisting of L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, I761, E762, M763, R765, E766 and N767.
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequences within the 1-1 and 2-3 regions of the wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant is selected from the group consisting of N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224 , L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, , At least two amino acids selected from the group consisting of L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038, As shown in FIG.
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequences within the 1-2 region and the 2-1 region of the wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the group consisting of I < 7 >, G8, L9, D10, I11, G12, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335 , A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390 , V391, and L393.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the non-polar amino acids such as I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, A367, A367, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, Two or more amino acids selected from the group consisting of F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391 and L393 may be modified.
  • non-polar amino acids such as I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, A367, A367, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, Two or more amino acids selected
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequences within the 1-2 region and the 2-2 region of the wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant is selected from the group consisting of P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350 , F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, I761, E762, M763, , E766, and N767.
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequences within the 1-2 and 2-3 regions of the wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant is selected from the group consisting of P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350 , F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, D965, Y981, , A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038 and Y1039.
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequences within the 1-3 region and the 2-1 region of the wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant is selected from the group consisting of I7, G8, L9, D10, I11, G12, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588 And I601 may be modified to have two or more amino acids.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the non-polar amino acids I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V520, L564, V520, V520, L564, V520, V520, L564, V520, V520, L564, V520, V520, V520, V520, I548, Two or more amino acids selected from the group consisting of F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606 and L607 .
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequences in the 1-3 region and the 2-2 region of the wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the group consisting of K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, I761, E762, M763, R765, E766 And N767. ≪ / RTI >
  • the SpCas9 mutant may be selected from the non-polar amino acids, i.e., L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G792, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, L797, L598, I600, I601, F606, L607, P731, A732, I733, M763 and A764. ≪ / RTI >
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequences in the 1-3 region and the 2-3 region of the wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the group consisting of K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, D965, Y981, H982, H983, A984 , H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038, and Y1039 in a modified form of two or more amino acids.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the non-polar amino acids, i.e., L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, L997, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, I960, I900, U998, A1007, A1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, A994, A987, L989, G
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequence within the 1-4 region and the 2-1 region of the wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant may comprise two or more amino acids selected from the group consisting of I7, G8, L9, D10, I11, G12, N692, M694, Q695 and H698 of the 1-4 region and the 2-1 region of wild type SpCas9 As shown in FIG.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the non-polar amino acids, i.e., I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, Or a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of V20, I21, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 and I697.
  • the non-polar amino acids i.e., I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19
  • a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of V20, I21, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 and I697.
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequences within the 1-4 region and the 2-2 region of the wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant may comprise at least two amino acids selected from the group consisting of N492, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, and N767 of the 1-4 region and the 2-2 region of wild type SpCas9 As shown in FIG.
  • the SpCas9 variant may comprise amino acids that do not have a polarity, i.e., I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, Two or more selected from the group consisting of L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763 and A764 It may be a modified form of amino acid.
  • a polarity i.e., I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, Two or more selected from the group consisting of L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequence within the 1-4 region and the 2-3 region of the wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant is selected from the group consisting of N492, M694, Q695, H698, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036 , F1037, F1038, and Y1039 in the form of a modified version of two or more amino acids.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the non-polar amino acids among the 1-4 region and the 2-3 region of wild-type SpCas9, i.e., I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L969, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, Two or more selected from the group consisting of V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037, It may be a modified form of amino acid.
  • the SpCas9 mutant may be a modified form of two or more amino acids selected from the amino acid sequences in the first region and the second region of the wild-type SpCas9.
  • the first region may be a 1-1 region, a 1-2 region, a 1-3 region, and a 1-4 region.
  • the second area may be a second-1 area, a second-2 area, and a 2-3 area.
  • the SpCas9 mutant is selected from the group consisting of I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205 L226, A227, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246 , G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335 , A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, I
  • the Cas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequences in the first region and the third region of the wild-type Cas9. At this time, two or more amino acids may be present in different regions.
  • wild-type Cas9 is wild-type SpCas9
  • the SpCas9 mutant may be a modified form of two or more amino acids selected from the amino acid sequences in the first region and the third region of wild-type SpCas9. At this time, two or more amino acids may be present in different regions.
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequences in the 1-1 and 3-1 regions of the wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant is selected from the group consisting of N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224 , L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, , At least two amino acids selected from the group consisting of L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 and L891 Lt; / RTI >
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequences within the 1-2 region and the 3-1 region of the wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the non-polar amino acids of the 1-2 region of wild-type SpCas9, i.e., P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391 and L393; And amino acids having charge in the 3-1 region, that is, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821 , D825, E827, D829, R832, D835, D837
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequence within the 1-3 region and the 3-1 region of the wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant is selected from the group consisting of K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, V838, D839, H840, D853, N854 , K855, K862, N863, R864, A889, K890 and L891.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the non-polar amino acids 1-3 of the wild-type SpCas9, i.e., L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, I600, I601, F606 and L607; And amino acids having charge in the 3-1 region, that is, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821 , D825, E827, D
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequence within the 1-4 region and the 3-1 region of the wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant is selected from the group consisting of N492, M694, Q695, H698, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889 , K890, and L891. ≪ / RTI >
  • the SpCas9 mutant may be selected from the non-polar amino acids 1-4 of the wild-type SpCas9, i.e., I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 and I697; And amino acids having charge in the 3-1 region, that is, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821 , D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884 , K890, R895, K896, and D898;
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequences in the first and third regions of wild-type SpCas9.
  • the first region may be a 1-1 region, a 1-2 region, a 1-3 region, and a 1-4 region.
  • the third area may be a third area.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the group consisting of A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, , V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 and L891.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the group consisting of N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226 , A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, , N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361 , I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I350,
  • the Cas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequences in the first region and the fourth region of the wild-type Cas9. At this time, two or more amino acids may be present in different regions.
  • wild-type Cas9 is wild-type SpCas9
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequences in the first region and the fourth region of wild-type SpCas9. At this time, two or more amino acids may be present in different regions.
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequences within the 1-1 and 4-1 regions of the wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant is selected from the group consisting of N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224 , L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, , At least two amino acids selected from the group consisting of L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 and T1138 have.
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequence within the 1-2 region and the 4-1 region of the wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the group consisting of P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350 , F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, T1102, S1106, E1108, , D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 and T1138.
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequence within the 1-3 region and the 4-1 region of the wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant is selected from the group consisting of K110, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117 , D1125, D1127, D1135, S1136, and T1138.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the non-polar amino acids 1-3 of the wild-type SpCas9, i.e., L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, I600, I601, F606 and L607; And at least two amino acids selected from the group consisting of T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 and T1138 among the 4-1 region.
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequence within the 1-4 region and the 4-1 region of the wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the non-polar amino acids 1-4 of the wild-type SpCas9, i.e., I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 and I697; And at least two amino acids selected from the group consisting of T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 and T1138 among the 4-1 region.
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequences in the first and fourth regions of wild-type SpCas9.
  • the first region may be a 1-1 region, a 1-2 region, a 1-3 region, and a 1-4 region.
  • the fourth area may be a 4-1 area.
  • the SpCas9 mutant is selected from the group consisting of A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, , Or at least two amino acids selected from the group consisting of T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 and T1138.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the group consisting of N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, , A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, , N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361 , I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379,
  • the Cas9 mutant may be a modified form of two or more amino acids selected from the amino acid sequence in the second region and the third region of the wild-type Cas9. At this time, two or more amino acids may be present in different regions.
  • wild-type Cas9 is wild-type SpCas9
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequence in the second region and the third region of wild-type SpCas9. At this time, two or more amino acids may be present in different regions.
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequences within the 2-1 region and the 3-1 region of the wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the group consisting of I7, G8, L9, D10, I11, G12, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863 , R864, A889, K890 and L891.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the non-polar amino acids, i.e., I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20 and I21 of the second-1 region of wild-type SpCas9; And amino acids having charge in the 3-1 region, that is, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821 , D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884 , K890, R895, K896, and D898.
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequences within the 2-2 region and the 3-1 region of the wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant is selected from the group consisting of the 2-2 region and the 3-1 region of the wild-type SpCas9, including I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863 , R864, A889, K890 and L891.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the non-polar amino acids of region 2-2 of wild-type SpCas9, i.e., P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763 and A764; And amino acids having charge in the 3-1 region, that is, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821 , D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877,
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequence within the 2-3 region and the 3-1 region of the wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant is selected from the group consisting of V238, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981 , H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038 and Y1039.
  • the SpCas9 variant may comprise amino acids that do not have polarity, i.e., I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037, and F1038; And amino acids having charge in the 3-1 region, that is, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821 , D825, E810,
  • the SpCas9 mutant may be a modified form of two or more amino acids selected from the amino acid sequences in the second region and the third region of the wild-type SpCas9.
  • the second area may be a second-1 area, a second-2 area, and a 2-3 area.
  • the third area may be a third area.
  • the SpCas9 mutant is selected from the group consisting of I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853 , At least two amino acids selected from the group consisting of N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, Y981, H982, H983, A984, H985, D965, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038, As shown in FIG.
  • the SpCas9 mutant is selected from the group consisting of I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737 , L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790 , K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864 , K866, D868, E873, E874, K877, K878, K
  • the Cas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequence in the second region and the fourth region of the wild-type Cas9. At this time, two or more amino acids may be present in different regions.
  • wild-type Cas9 is wild-type SpCas9
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequence in the second region and the fourth region of wild-type SpCas9. At this time, two or more amino acids may be present in different regions.
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequences in the 2-1 region and the 4-1 region of the wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant is selected from the group consisting of I2, I4, G8, L9, D10, I11, G12, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135 , S1136, and T1138 of the present invention.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the non-polar amino acids, i.e., I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20 and I21 of the second-1 region of wild-type SpCas9; And at least two amino acids selected from the group consisting of T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 and T1138 among the 4-1 region.
  • the non-polar amino acids i.e., I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20 and I21 of the second-1 region of wild-type SpCas9
  • at least two amino acids selected from the group consisting of T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 and T1138 among the 4-1 region.
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequence within the 2-2 region and the 4-1 region of the wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the group consisting of the 2-2 region and the 4-1 region of wild-type SpCas9, including I761, E762, M763, R765, E766, N767, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, , S1136, and T1138 of the present invention.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the non-polar amino acids of region 2-2 of wild-type SpCas9, i.e., P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763 and A764; And at least two amino acids selected from the group consisting of T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 and T1138 among the 4-1 region.
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequence within the 2-3 region and the 4-1 region of the wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the group consisting of D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 , S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 and T1138.
  • the SpCas9 variant may comprise amino acids that do not have polarity, i.e., I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037, and F1038; And at least two amino acids selected from the group consisting of T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 and T1138 among the 4-1 region.
  • polarity i.e., I927, V931, A932, I934, L935, M939, L
  • the SpCas9 mutant may be a modified form of two or more amino acids selected from the amino acid sequences in the second region and the fourth region of wild-type SpCas9.
  • the second area may be a second-1 area, a second-2 area, and a 2-3 area.
  • the fourth area may be a 4-1 area.
  • the SpCas9 mutant is selected from the group consisting of I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983 , At least two amino acids selected from the group consisting of A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 and T1138 Lt; / RTI >
  • the SpCas9 mutant is selected from the group consisting of I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737 , L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955 , I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011 , At least two amino acids selected from the group consisting of V1015, V1018, M1021, I1021, I
  • the Cas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequence in the third region and the fourth region of the wild-type Cas9. At this time, two or more amino acids may be present in different regions.
  • wild-type Cas9 is wild-type SpCas9
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequence in the third region and the fourth region of wild-type SpCas9. At this time, two or more amino acids may be present in different regions.
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of two or more amino acids selected from the amino acid sequence within the 3-1 region and the 4-1 region of the wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant is selected from the group consisting of V318, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, T1102, S1106 , E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 and T1138.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the group consisting of amino acids having charge among the 3-1 region of the wild-type SpCas9, namely, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, , E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873 , E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 and D898; And at least two amino acids selected from the group consisting of T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 and T1138 among the 4-1 region
  • the Cas9 mutant may be a modified version of three or more amino acids selected from the amino acid sequences in the first region, the second region, the third region and / or the fourth region of the wild-type Cas9. At this time, three or more amino acids may exist in different regions.
  • wild-type Cas9 is wild-type SpCas9
  • the SpCas9 mutant may be a modified form of at least three selected amino acids among the amino acid sequences in the first region, the second region, the third region and / or the fourth region of the wild-type SpCas9. At this time, three or more amino acids may exist in different regions.
  • the SpCas9 mutant may be a modified form of at least three selected amino acids among the amino acid sequences in the first region, the second region and the third region of the wild-type SpCas9.
  • the first region may be a 1-1 region, a 1-2 region, a 1-3 region, and a 1-4 region.
  • the second area may be a second-1 area, a second-2 area, and a 2-3 area.
  • the third area may be a third area.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the group consisting of I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583 , E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 Or at least three amino acids selected from the group consisting of L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038 and Y1039.
  • the SpCas9 mutant is selected from the group consisting of I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202 of the first region, the second region and the third region of wild- , A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243 , L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332 , L334, L335, A337, L338, V339,
  • the SpCas9 mutant may be a modified form of at least three selected amino acids among the amino acid sequences in the first region, the second region and the fourth region of the wild-type SpCas9.
  • the first region may be a 1-1 region, a 1-2 region, a 1-3 region, and a 1-4 region.
  • the second area may be a second-1 area, a second-2 area, and a 2-3 area.
  • the fourth area may be a 4-1 area.
  • the SpCas9 mutant is selected from the group consisting of I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583 , E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037 , F1038, Y1039, T1102, and D1127.
  • the SpCas9 mutant is selected from the group consisting of I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202 of the first region, the second region and the fourth region of wild type SpCas9 , A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243 , L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332 , L334, L335, A337, L33, A
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of a selected three or more amino acids among the amino acid sequences in the first region, the third region and the fourth region of the wild-type SpCas9.
  • the first region may be a 1-1 region, a 1-2 region, a 1-3 region, and a 1-4 region.
  • the third area may be a third area.
  • the fourth area may be a 4-1 area.
  • the SpCas9 mutant is selected from the group consisting of A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694 of the first region, the third region and the fourth region of the wild type SpCas9 Or at least three amino acids selected from the group consisting of Q695, H698, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, T1102 and D1127.
  • the SpCas9 mutant may be selected from the group consisting of N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224 , L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, , L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358 , A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L, L
  • the SpCas9 mutant may be a modified form of at least three selected amino acids among the amino acid sequences in the second region, the third region and the fourth region of the wild-type SpCas9.
  • the second area may be a second-1 area, a second-2 area, and a 2-3 area.
  • the third area may be a third area.
  • the fourth area may be a 4-1 area.
  • the SpCas9 mutant is selected from the group consisting of I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733 , G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786 , K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861 , K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K87
  • the Cas9 mutant may be a modified version of four or more amino acids selected from the amino acid sequences in the first region, the second region, the third region and the fourth region of the wild-type Cas9. At this time, more than four amino acids may exist in different regions.
  • wild-type Cas9 is wild-type SpCas9
  • the SpCas9 mutant may be a modified version of at least four selected amino acids from among the first, second, third and fourth regions of the wild-type SpCas9. At this time, more than four amino acids may exist in different regions.
  • the SpCas9 mutant may be a modified form of at least three selected amino acids among the amino acid sequences in the first region, the second region, the third region, and the fourth region of the wild-type SpCas9.
  • the first region may be a 1-1 region, a 1-2 region, a 1-3 region, and a 1-4 region.
  • the second area may be a second-1 area, a second-2 area, and a 2-3 area.
  • the third area may be a third area.
  • the fourth area may be a 4-1 area.
  • the SpCas9 mutant is selected from the group consisting of I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539 of the first region, the second region, the third region, , G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864 , At least three amino acids selected from the group consisting of A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 and D1127 have.
  • the SpCas9 mutant is selected from the group consisting of I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199 of the first region, the second region, the third region and the fourth region of the wild type SpCas9 L202, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241 , I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321 , I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352,
  • the Cas9 variant may comprise a modification of at least one amino acid selected from the one or more regions.
  • the modification may be the removal of the selected one or more amino acids.
  • wild-type Cas9 is wild-type SpCas9
  • the modification may be the removal of one or more selected amino acids of the amino acid sequence in the first region of wild-type SpCas9.
  • the modification may be the removal of one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the 1-1 region, 1-2 region, 1-3 region and / or 1-4 region of wild-type SpCas9.
  • the variants may be selected from the group consisting of N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, A367, A367, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, L540, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, L540, L59
  • the modification may be the removal of one or more selected amino acids of the amino acid sequence within the second region of wild-type SpCas9.
  • the modification may be the removal of one or more amino acids selected from the amino acid sequences within the 2-1 region, the 2-2 region and / or the 2-3 region of the wild-type SpCas9.
  • the variant may be selected from the group consisting of I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, The removal of one or more amino acids selected from the group consisting of A1023, I1029, G1030,
  • the modification may be the removal of one or more selected amino acids of the amino acid sequence within the third region of wild-type SpCas9.
  • the modification may be the removal of one or more amino acids selected from the amino acid sequence within the 3-1 region of wild-type SpCas9.
  • the modification may be the removal of one or more selected amino acids from the amino acid sequence within the fourth region of wild-type SpCas9.
  • the modification may be the removal of one or more amino acids selected from the amino acid sequence within the 4-1 region of wild-type SpCas9.
  • the modification may be the removal of one or more amino acids selected from the group consisting of T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 and T1138 of the 4-1 region of wild type SpCas9.
  • the modification may be the removal of two or more amino acids selected from the amino acid sequences in the first, second, third and / or fourth regions of wild-type SpCas9.
  • the modification comprises a first 1-1 region, a 1-2 region, a 1-3 region, a 1-4 region 2-1 region, a 2-2 region, a 2-3 region of wild-type SpCas9, Region, the 3-1 region, and / or the 4-1 region.
  • the variant may be selected from the group consisting of I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, L244, L246, G247, L248, N251, L224, L224, L224, L224, L224, L224, L224, L224, L222, L224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L338, V339, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L343, P344, I350
  • the modification may be a substitution of the selected one or more amino acids with another amino acid.
  • the modification may be a substitution of one or more selected amino acids of the amino acid sequence in the first region of wild-type SpCas9 with another amino acid.
  • the modification comprises substituting at least one amino acid selected from the amino acid sequences in the 1-1 region, 1-2 region, 1-3 region and / or 1-4 region of wild-type SpCas9 with a stereoisomer Lt; / RTI >
  • the modification may be to replace the 510th lysine (K510) of wild-type SpCas9 with D-lysine.
  • the variant comprises at least one amino acid selected from the amino acid sequences in the 1-1 region, 1-2 region, 1-3 region and / or 1-4 region of wild-type SpCas9 as relatively hydrophobic indicators It may be a substitution with a small amino acid.
  • the variants may be selected from the group consisting of N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, A367, A367, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, L540, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, L540, L59
  • the modification may be to replace the 539th phenylalanine of wild-type SpCas9 (F539, hydrophobic index: 2.8) with a relatively hydrophobic index serine (hydrophobic index: -0.8).
  • the modification may be to replace the 601st isoleucine (I601, hydrophobic index: 4.5) of wild-type SpCas9 with a relatively hydrophobic asparagine (hydrophobic index: -3.5).
  • the variant is a variant in which the variant comprises at least one amino acid selected from the amino acid sequence within the 1-1 region, 1-2 region, 1-3 region and / or 1-4 region of wild-type SpCas9 relative to
  • the hydrophobic indicator may be a substitution with a larger amino acid.
  • the variant may comprise one or more amino acids selected from the group consisting of A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 and H698 of wild type SpCas9
  • Relatively hydrophobic indicators may be substitutions with large amino acids.
  • the modification may be to replace the 277th asparagine of wild-type SpCas9 (N277, hydrophobic index: -3.5) with a relatively hydrophobic indicator of histidine (hydrophobic index: -3.2).
  • the variant is a variant wherein the variant is selected from the group consisting of relative one or more amino acids selected from the amino acid sequences within the 1-1, 1-2, 1-3 and / or 1-4 regions of wild-type SpCas9 May be a substitution of a hydrophobic index with a larger or smaller amino acid.
  • the variant is a variant wherein the variant comprises at least one amino acid selected from the amino acid sequence within the 1-1 region, 1-2 region, 1-3 region and / or 1-4 region of the wild-type SpCas9 relative to It may be an amino acid having a small functional group.
  • the variant may comprise one or more amino acids selected from the group consisting of A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 and H698 of wild type SpCas9 It may be a substitution with an amino acid having a relatively small functional group.
  • the modification may be to replace the 539th phenylalanine (F539) of wild-type SpCas9 with a serine having a relatively small functional group.
  • the variant is a variant wherein the variant is selected from the group consisting of relative one or more amino acids selected from the amino acid sequences in the 1-1 region, 1-2 region, 1-3 region and / or 1-4 region of the wild-type SpCas9 May be an amino acid having a large functional group.
  • the variants may be selected from the group consisting of N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, A367, A367, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, L540, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, L540, L59
  • the modification may be to replace the 203th alanine (A203) of wild-type SpCas9 with an aspartic acid having a relatively large functional group.
  • the modification may be to replace the 366th glycine (G366) of wild-type SpCas9 with a serine having a relatively large functional group.
  • the variant is a variant wherein the variant comprises at least one amino acid selected from the amino acid sequence within the 1-1 region, 1-2 region, 1-3 region and / or 1-4 region of wild-type SpCas9 It may be an amino acid having a relatively large or small functional group.
  • the variant comprises at least one amino acid selected from the amino acid sequences in the 1-1, 1-2, 1-3 and / or 1-4 regions of wild-type SpCas9 with relatively hydrophobicity ) May be a substitution with a reduced amino acid.
  • the variants may be selected from the group consisting of N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, A367, A367, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, L540, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, L540, L59
  • the mutation may be modified to include the 539th phenylalanine (F539, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 2.8) and the 601th Kyot-Doolittle hydrophobicity (4.51) of wild-type SpCas9, respectively, -Doolittle hydrophobicity: -0.8) and asparagine (Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5).
  • the variant is one wherein at least one amino acid selected from the amino acid sequence within the 1-1 region, 1-2 region, 1-3 region and / or 1-4 region of wild-type SpCas9 is relatively hydrophobic Lt; / RTI > amino acid.
  • the variants may be selected from the group consisting of N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, A367, A367, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, L540, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, L540, L59
  • the mutation may be referred to as the relative hydrophobicity increased histidine (Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5) and the 682th phenylalanine (F682, Kyte-Doolittle hydrophobicity: Doolittle hydrophobicity: -3.2) and valine (Kyte-Doolittle hydrophobicity: 4.2).
  • the variant comprises at least one amino acid selected from the amino acid sequences in the 1-1, 1-2, 1-3 and / or 1-4 regions of wild-type SpCas9 to a relatively hydrophobic May be reduced or replaced by an increased amino acid.
  • the modification may be a substitution of one or more selected amino acids of the amino acid sequence in the second region of wild-type SpCas9 with another amino acid.
  • the modification may be a substitution of a selected one or more amino acids of the amino acid sequence within the 2-1 region, the 2-2 region and / or the 2-3 region of the wild-type SpCas9 into a stereoisomer.
  • the variant may be selected from the group consisting of I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038, and Y1039 may be substitution with a stereoisomer.
  • the modification may be to replace the 12th glycine (G12) of wild-type SpCas9 with D-glycine.
  • the modification comprises substituting at least one amino acid selected from the amino acid sequences in the 2-1 region, the 2-2 region and / or the 2-3 region of the wild-type SpCas9 with the amino acid substitution relative to the amino acid having a relatively small hydrophobic index .
  • the variant may be selected from the group consisting of I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, One or more amino acids selected from the group consisting of A1023, I1029, G1030, A1032,
  • the modification may be to replace the 1038th phenylalanine of wild-type SpCas9 (F1038, hydrophobic index: 2.8) with a relatively hydrophobic indicator tyrosine (hydrophobic index: -1.3).
  • the modification comprises substituting at least one amino acid selected from the amino acid sequences in the 2-1 region, the 2-2 region and / or the 2-3 region of the wild-type SpCas9 with an amino acid having a relatively large hydrophobic index Lt; / RTI >
  • the variant may be selected from the group consisting of I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, One or more amino acids selected from the group consisting of A1023, I1029, G1030, A1032,
  • the modification may be to replace the 763th methionine of wild-type SpCas9 (M763, hydrophobic indicator: 1.9) with a relatively hydrophobic indicator isoleucine (hydrophobic indicator: 4.5).
  • the modification may be to replace the 965th aspartic acid (D965, hydrophobic index: -3.5) of wild-type SpCas9 with a relatively hydrophobic indicator tyrosine (hydrophobic index: -1.3).
  • the modification is a modification of the amino acid sequence selected from the amino acid sequences in the 2-1 region, the 2-2 region, and / or the 2-3 region of the wild-type SpCas9 with an amino acid having a relatively large or small hydrophobic index ≪ / RTI >
  • the modification is such that the variant comprises at least one amino acid selected from the amino acid sequences in the 2-1 region, the 2-2 region and / or the 2-3 region of the wild-type SpCas9 to a relatively small functional group functional group).
  • the variant may be selected from the group consisting of I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038, and Y1039 may be substituted with an amino acid having a functional group having a relatively small size.
  • the modification may be to replace 763th methionine (M763) of wild-type SpCas9 with isoleucine having a relatively small functional group.
  • the variant is a variant wherein the variant comprises at least one amino acid selected from the amino acid sequences within the second-1 region, the second -2 region and / or the 2-3 region of the wild-type SpCas9, or an amino acid having a functional group.
  • the variant may be selected from the group consisting of I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038, and Y1039 may be substituted with an amino acid having a functional group having a relatively large size.
  • the modification may be to replace the 1038th phenylalanine (F1038) of wild-type SpCas9 with a tyrosine having a relatively large functional group.
  • the variant is a variant wherein the variant is selected such that the selected one or more amino acids of the amino acid sequence in the 2-1 region, the 2-2 region and / or the 2-3 region of the wild-type SpCas9 are relatively large It may be an amino acid having a small functional group.
  • the mutation is a substitution of at least one amino acid selected from the amino acid sequences within the 2-1 region, the 2-2 region and / or the 2-3 region of the wild-type SpCas9 with a relatively hydrophobic amino acid .
  • the modification may be performed using a relatively hydrophobic methionine (Kyte-Doolittle hydrophobicity: I761, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 4.58) and 1038th phenylalanine (F1038, Kyte- Doolittle hydrophobicity: 1.9) and tyrosine (Kyte-Doolittle hydrophobicity: -1.3).
  • the modification comprises substituting at least one amino acid selected from the amino acid sequences within the 2-1 region, the 2-2 region and / or the 2-3 region of the wild-type SpCas9 with a relatively hydrophobic amino acid Lt; / RTI >
  • the variant may be selected from the group consisting of I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, One or more amino acids selected from the group consisting of A1023, I1029, G1030, A1032,
  • the mutation may result in relatively hydrophobic increased iso-leucine (Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.9) and 932th alanine (A932, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.8) Doolittle hydrophobicity: 4.5) and cysteine (Kyte-Doolittle hydrophobicity: 2.5).
  • the variant comprises at least one amino acid selected from the amino acid sequences within the 2-1 region, the 2-2 region and / or the 2-3 region of the wild-type SpCas9 with a relatively hydrophobic reduced or increased amino acid ≪ / RTI >
  • the modification may be a substitution of one or more selected amino acids among the amino acid sequences in the third region of wild-type SpCas9 with another amino acid.
  • the variant may be a substitution of one or more selected amino acids of the amino acid sequence within the 3-1 region of wild-type SpCas9 into a stereoisomer.
  • the modifications may be substitution of one or more amino acids selected from the group consisting of V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 and L891 of wild-type SpCas9 into a stereoisomer .
  • the 853rd aspartic acid (D853) of wild-type SpCas9 is L-aspartic acid
  • the modification may be to replace 853th aspartic acid (D853) of wild-type SpCas9 with D-aspartic acid.
  • the variant may be a substitution of at least one amino acid selected from the amino acid sequence within the 3-1 region of the wild-type SpCas9 with an amino acid having a relatively small hydrophobic index.
  • the variant may include one or more amino acids selected from the group consisting of V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 and L891 of wild-type SpCas9 as relatively small hydrophobic amino acids Lt; / RTI >
  • the modification may be to replace the 862th lysine of wild-type SpCas9 (K862, hydrophobic index: -3.9) with a relatively hydrophobic indicator arginine (hydrophobic index: -4.5).
  • the variant may be a substitution of at least one amino acid selected from the amino acid sequence within the 3-1 region of the wild-type SpCas9 with an amino acid having a relatively hydrophobic indicator.
  • the variants may include one or more amino acids selected from the group consisting of V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 and L891 of wild-type SpCas9 as relatively hydrophobic, Lt; / RTI >
  • the modification may be to replace the 890th lysine (K890, hydrophobic index: -3.9) of wild-type SpCas9 with a relatively hydrophobic asparagine (hydrophobic index: -3.5).
  • the variant may be a substitution of one or more amino acids selected from the amino acid sequence within the 3-1 region of wild-type SpCas9 with an amino acid having a relatively large or small hydrophobicity index.
  • the modification may be an amino acid having a relatively small functional group of at least one amino acid selected from the amino acid sequence in the 3-1 region of the wild-type SpCas9.
  • the variant may comprise one or more amino acids selected from the group consisting of V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 and L891 of wild-type SpCas9, Amino acid. ≪ / RTI >
  • the modification may be to replace the 890th lysine (K890) of wild-type SpCas9 with an asparagine having a relatively small functional group.
  • the modification may be an amino acid having a functional group having a relatively large size of at least one amino acid selected from the amino acid sequence within the 3-1 region of the wild-type SpCas9.
  • the variant may comprise one or more amino acids selected from the group consisting of V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 and L891 of wild-type SpCas9 with relatively large functional groups Amino acid. ≪ / RTI >
  • the modification may be to replace the 863rd asparagine (N863) of wild-type SpCas9 with an arginine having a relatively large functional group.
  • the modification may be an amino acid having a relatively large or small functional group of at least one amino acid selected from the amino acid sequence within the 3-1 region of the wild-type SpCas9.
  • the variant may be a substitution of one or more selected amino acids of the amino acid sequence within the 3-1 region of wild-type SpCas9 with a relatively hydrophobically reduced amino acid.
  • the variant may be a wild-type SpCas9 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, and D898 with a relatively hydrophobically reduced amino acid.
  • the modification may be performed using a relatively hydrophobic lysine (Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5) and a 862th lysine (K862, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.9) of wild-type SpCas9 -Doolittle hydrophobicity: -3.9) and arginine (Kyte-Doolittle hydrophobicity: -4.5).
  • the variant may be a substitution of one or more of the selected amino acids in the amino acid sequence within the 3-1 region of wild-type SpCas9 with an amino acid having a relatively increased hydrophobicity.
  • the modification may be modified to include relatively hydrophobic increased methionine (Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5) and 890th lysine (K890, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -Doolittle hydrophobicity: 1.9) and asparagine (Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5).
  • the variant may be a substitution of one or more selected amino acids of the amino acid sequence within the 3-1 region of wild-type SpCas9 with a relatively hydrophobic reduced or increased amino acid.
  • the modification may be a substitution of one or more selected amino acids among the amino acid sequences in the fourth region of wild-type SpCas9 with another amino acid.
  • the variant may be a substitution of a selected one or more amino acids of the amino acid sequence within the 4-1 region of wild-type SpCas9 into a stereoisomer.
  • the variant may be a stereoisomeric substitution of one or more amino acids selected from the group consisting of T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 and T1138 of wild-type SpCas9.
  • the modification may be to replace the 1127th aspartic acid (D1127) of wild-type SpCas9 with D-aspartic acid.
  • the variant may be a substitution of one or more selected amino acids of the amino acid sequence within the 4-1 region of wild-type SpCas9 with an amino acid having a relatively small hydrophobic index.
  • the variants may include one or more amino acids selected from the group consisting of T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 and T1138 of wild-type SpCas9 as substitution sites for amino acids with relatively small hydrophobic indices have.
  • the modification may be to replace the 1102 th threonine of wild type SpCas9 (T1102, hydrophobic index: -0.7) with a relatively hydrophobic indicator proline (hydrophobic index: -1.6).
  • the variant may be a substitution of at least one amino acid selected from the amino acid sequence within the 4-1 region of wild-type SpCas9 with an amino acid having a relatively large hydrophobic index.
  • the variants may include one or more amino acids selected from the group consisting of T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 and T1138 of wild-type SpCas9 as substitution sites for relatively hydrophobic indicators have.
  • the modification may be to replace 1106th serine (S1106, hydrophobic index: -0.8) of wild-type SpCas9 with relatively relatively hydrophobic index glycine (hydrophobic index: -0.4).
  • the variant may be a substitution of one or more amino acids selected from the amino acid sequence within the 4-1 region of wild-type SpCas9 with an amino acid having a relatively large or small hydrophobicity index.
  • the modification may be an amino acid having a relatively small functional group of at least one amino acid selected from the amino acid sequence within the 4-1 region of wild-type SpCas9.
  • the modification may include substitution of at least one amino acid selected from the group consisting of T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 and T1138 of wild-type SpCas9 with an amino acid having a relatively small- Lt; / RTI >
  • the modification may be to replace 1102 th threonine (T1102) of wild-type SpCas9 with proline having a relatively small functional group.
  • the modification may be an amino acid having a relatively large functional group of at least one amino acid selected from the amino acid sequence within the 4-1 region of wild-type SpCas9.
  • the modification may include substitution of at least one amino acid selected from the group consisting of T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 and T1138 of wild-type SpCas9 with an amino acid having a relatively large functional group Lt; / RTI >
  • the modification may be to replace the 1127th aspartic acid (D1127) of wild-type SpCas9 with glutamic acid having a relatively large functional group.
  • the modification may be an amino acid having a relatively large or small functional group of at least one amino acid selected from the amino acid sequence within the 4-1 region of wild-type SpCas9.
  • the variant may be a substitution of one or more selected amino acids of the amino acid sequence within the 4-1 region of wild-type SpCas9 with a relatively hydrophobically reduced amino acid.
  • the modifications may include substitution of at least one amino acid selected from the group consisting of T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 and T1138 of wild-type SpCas9 with a relatively hydrophobic amino acid have.
  • the modification may be to replace the 1102-th glutreonine (T1102, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -0.7) of the wild-type SpCas9 with a relatively hydrophobic hydrophobicity (-1.6).
  • the variant may be a substitution of one or more of the selected amino acids in the amino acid sequence within the 4-1 region of wild-type SpCas9 with an amino acid with increased hydrophobicity.
  • the variants may include one or more amino acids selected from the group consisting of T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 and T1138 of wild-type SpCas9 as substitution sites for relatively hydrophobic amino acids have.
  • the modification may be to substitute the relative hydrophobic increased methionine (Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.9) of wild-type SpCas9 with 1108th glutamate (E1108, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5).
  • the variant may be a substitution of one or more selected amino acids of the amino acid sequence within the 4-1 region of wild-type SpCas9 with a relatively hydrophobic reduced or increased amino acid.
  • the modification may be a substitution of two or more amino acids selected from the amino acid sequences in the first region, the second region, the third region and / or the fourth region of the wild-type SpCas9 with another amino acid.
  • the modification comprises a first 1-1 region, a 1-2 region, a 1-3 region, a 1-4 region 2-1 region, a 2-2 region, a 2-3 region of wild-type SpCas9, Region, the 3-1 region and / or the 4-1 region may be substituted with respective stereoisomers.
  • the variant may be a wild-type SpCas9 I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, Two or more amino acids selected from the group consisting of H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 and D1127 may be substituted into respective stereoisomers.
  • the eighth glycine (G8) of wild-type SpCas9 is L-glycine and the 767th asparagine (N767) is L-asparagine
  • the modification is the eighth glycine (G8) and 767th asparagine (N767) May be replaced with D-glycine and D-asparagine, respectively.
  • the modification comprises a first 1-1 region, a 1-2 region, a 1-3 region, a 1-4 region 2-1 region, a 2-2 region, a 2-3 region of wild-type SpCas9, Region, the 3-1 region, and / or the 4-1 region, respectively, may be substituted with an amino acid having a relatively small hydrophobicity index.
  • the variant may be a wild-type SpCas9 I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, Two or more amino acids selected from the group consisting of H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 and D1127 may be substitute
  • the mutation may be referred to as a relatively hydrophobic aspartic acid (hydrophobic index: -3.5 (hydrophobicity index: 1.8) and 539th phenylalanine (F539, hydrophobic index: 2.8) ) And serine (hydrophobic index: -0.8).
  • the variant may be selected from the group consisting of I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, L338, L338, A337, L338, V339, L343, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L378, L372, L373, L373, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374,
  • the variant is a relatively hydrophobic asparagine (hydrophobic index: -60) of 601st isoleucine (I601, hydrophobic index: 4.5) and 1102th threonine (T1102, hydrophobic index: -0.7) of wild-type SpCas9, 3.5) and proline (hydrophobic index: -1.6).
  • the modification comprises a first 1-1 region, a 1-2 region, a 1-3 region, a 1-4 region, a 2-1 region, a 2-2 region, a 2- 3 region, the 3-1 region, and / or the 4-1 region, respectively, may be substituted with amino acids having a relatively large hydrophobicity index.
  • the variant may be a wild-type SpCas9 I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, Two or more amino acids selected from the group consisting of H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 and D1127 may be replaced
  • the variant may be a histidine (hydrophobic index: -) having a relatively higher hydrophobic index, such as 277th asparagine (N277, hydrophobic index: -3.5) and 840th histidine (H840, hydrophobic index: -3.2) 3.2) and alanine (hydrophobic index: 1.8).
  • a histidine hydrophobic index: -
  • a relatively higher hydrophobic index such as 277th asparagine (N277, hydrophobic index: -3.5) and 840th histidine (H840, hydrophobic index: -3.2) 3.2) and alanine (hydrophobic index: 1.8).
  • the variant may be selected from the group consisting of I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, L338, L338, A337, L338, V339, L343, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L378, L372, L373, L373, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374,
  • the variants may be compared with wild type SpCas9, 763th methionine (M763, hydrophobic index: 1.9) and 890th lysine (K890, hydrophobic index: -3.9) ) And asparagine (hydrophobic index: -3.5).
  • the modification comprises the first 1-1 region, the 1-2 region, the 1-3 region, the 1-4 region, the 2-1 region, the 2-2 region, the 2 nd region, 3 amino acid residues in the amino acid sequence within the 3-1 region, the 3-1 region and / or the 4-1 region may be replaced with an amino acid having a relatively large or small hydrophobic index, respectively.
  • the variant may be a wild-type SpCas9 I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, Two or more amino acids selected from the group consisting of H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 and D1127 may be substitute
  • the variant is a relatively hydrophobic indicator alanine (hydrophobic index: -3.5) and the 10th aspartic acid (D10, hydrophobic index: -3.5) and 840th histidine (H840, hydrophobic index: -3.2) of wild-type SpCas9, 1.8), and the 539th phenylalanine of wild-type SpCas9 (F539, hydrophobic index: 2.8) was replaced with a relatively smaller hydrophobic index serine (hydrophobic index: -0.8).
  • the variant may be selected from the group consisting of I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, L338, L338, A337, L338, V339, L343, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L378, L372, L373, L373, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374,
  • the variants may be compared with wild type SpCas9, 763th methionine (M763, hydrophobic index: 1.9) and 890th lysine (K890, hydrophobic index: -3.9) ) And asparagine (hydrophobic index: -3.5), and the 539th phenylalanine of wild-type SpCas9 (F539, hydrophobic index: 2.8) was replaced with a relatively hydrophobic index of serine (hydrophobic index: -0.8) have.
  • the modification is characterized in that the modification is selected from the group consisting of a 1-1 region, a 1-2 region, a 1-3 region, a 1-4 region, a 2-1 region, a 2-2 region, 2, 3-1 and / or 4-1 region of the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1, 2 and 3, respectively.
  • the variant may be a wild-type SpCas9 I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, H982, H983, A984, Two or more amino acids selected from the group consisting of H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 and D1127 may be substitute
  • the modification is to replace the 539th phenylalanine (F539), 763th methionine (M763) and 1102th threonine (T1102) of wild-type SpCas9 with serine, isoleucine and proline, respectively, .
  • the modification is such that the strain is selected from the group consisting of a 1-1 region, a 1-2 region, a 1-3 region, a 1-4 region, a 2-1 region, a 2-2 region,
  • the amino acid sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 3-1, 3-1 and / or 4-1 region may be an amino acid having a relatively large functional group.
  • the variant may be selected from the group consisting of I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, L338, L338, A337, L338, V339, L343, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L378, L372, L373, L373, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374,
  • the modification may be performed by replacing 601st isoleucine (I601), 1038th phenylalanine (F1038) and 1127th aspartic acid (D1127) of wild-type SpCas9 with asparagine, tyrosine and glutamic acid, respectively, Lt; / RTI >
  • the modification is such that the strain is selected from the group consisting of a 1-1 region, a 1-2 region, a 1-3 region, a 1-4 region, a 2-1 region, ,
  • the amino acid sequence in the 2-3 region, the 3-1 region and / or the 4-1 region may be an amino acid having a functional group having a relatively large or small size, respectively.
  • the variant may be selected from the group consisting of I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, L338, L338, A337, L338, V339, L343, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L378, L372, L373, L373, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374,
  • the modification may be performed by replacing 539th phenylalanine (F539), 763th methionine (M763), and 890th lysine (K890) of wild-type SpCas9 with serine, isoleucine and asparagine having relatively small- It is also possible to substitute the 601th isoleucine (I601) and the 1038th phenylalanine (F1038) with asparagine and tyrosine having relatively large functional groups, respectively.
  • the modification comprises a first 1-1 region, a 1-2 region, a 1-3 region, a 1-4 region 2-1 region, a 2-2 region, a 2-3 region of wild-type SpCas9, Region, the 3-1 region, and / or the 4-1 region, respectively, with amino acids having relatively reduced hydrophobicity.
  • the variant may be selected from the group consisting of I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, L338, L338, A337, L338, V339, L343, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L378, L372, L373, L373, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374,
  • the modifications include the 539th phenylalanine of wild-type SpCas9 (F539, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 2.8), the 601th Kyot-Doolittle hydrophobicity (4.51) and the 1102th threonine (T1102, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -0.7) can be replaced with relative hydrophobic hydrophobicity (Kyte-Doolittle hydrophobicity: -0.8), asparagine (Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5) and proline (Kyte-Doolittle hydrophobicity: -1.6).
  • the modification comprises a first 1-1 region, a 1-2 region, a 1-3 region, a 1-4 region, a 2-1 region, a 2-2 region, a 2- 3 region, the 3-1 region, and / or the 4-1 region may be substituted with amino acids having relatively increased hydrophobicity, respectively.
  • the variant may be selected from the group consisting of I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, L338, L338, A337, L338, V339, L343, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L378, L372, L373, L373, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374,
  • the modifications include the 10th aspartic acid (D10, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5), the 763th methionine (M763, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.9), the 840th histidine (H840, Kyte-Doolittle hydrophobicity (Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.8), alanine (Kyte-Doolittle hydrophobicity: 4.5), and alanine Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.8) and asparagine (Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5).
  • the modification comprises the first 1-1 region, the 1-2 region, the 1-3 region, the 1-4 region, the 2-1 region, the 2-2 region, the 2 nd region, 3 amino acid residues in the 3-1 region, the 3-1 region and / or the 4-1 region, respectively, may be replaced with amino acids whose hydrophobicity is reduced or increased, respectively.
  • the variant may be selected from the group consisting of I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, L338, L338, A337, L338, V339, L343, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L378, L372, L373, L373, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374, L374,
  • the mutation may be referred to as the relative hydrophobic increase of isoleucine (Kyte) in the wild type SpCas9 (M763, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.9) and the 890th lysine (K890, Kyte-Doolittle hydrophobicity: Doolittle hydrophobicity: 4.5) and asparagine (Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5), and the 539th phenylalanine (F539, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 2.8) of wild-type SpCas9 was replaced with a relatively hydrophobic serine hydrophobicity: -0.8).
  • Kyte isoleucine
  • the modification may be that the selected one or more amino acids are replaced by the same number of different amino acids.
  • the modification may be to replace one isoleucine located in the first region of wild-type SpCas9 with one asparagine.
  • the modification may be to substitute one phenylalanine located in the first region of the wild-type SpCas9 and one lysine located in the third region into one serine (first region) and one asparagine (third region), respectively.
  • said variant comprises one methionine and one phenylalanine located in a second region of wild-type SpCas9, and one lysine located in a third region, respectively, one isoleucine, one tyrosine (second region) and one asparagine Region).
  • the modification may be a substitution of the selected one or more amino acids with an unequal number of other amino acids.
  • the modification may be to replace one threonine located within the second region of wild-type SpCas9 with cysteine-alanine-alanine, i.e., a total of three amino acids.
  • said variant comprises substituting one glutamine located in the first region of wild-type SpCas9 and two consecutive amino acids, glycine-serine, located in the third region, with methionine-valine (first region) and proline (third region) Lt; / RTI >
  • said variant comprises one serine located in a first region of wild-type SpCas9, three consecutive amino acids lysine-lysine-tyrosine located in a second region, and two consecutive amino acids serine-isoleucine located in a third region Alanine (first region), methionine-proline (second region) and cysteine-alanine-threonine-valine (third region).
  • the artificially manipulated Cas9 may be a Cas9 mutant in which at least one amino acid is added in at least one region selected from the first region, the second region, the third region and the fourth region of the wild-type Cas9.
  • addition may be the addition of one or more amino acids at the N-terminal and / or C-terminal positions of one or more amino acids present in the selected one or more regions.
  • wild-type Cas9 is wild-type SpCas9
  • the addition may be the addition of one or more amino acids at the N-terminal and / or C-terminal positions of one or more amino acids present in the first, second, third and / or fourth regions of wild-type SpCas9 .
  • the attachment is one or more positively charged at the N-terminus and / or C-terminus of one or more amino acids present in the first, second, third and / or fourth region of wild-type SpCas9 ≪ / RTI >
  • the addition may be the addition of one arginine to the C-terminus of the selected one alanine located within the 1-1 region of the wild-type SpCas9.
  • the addition may be the addition of arginine-lysine, which is two amino acids at the N-terminus of the selected glutamic acid located within the region 2-2 of wild-type SpCas9.
  • the attachment may be the addition of two amino acids, arginine-histidine, to the N-terminus of the selected leucine located within the 3-1 region of the wild-type SpCas9.
  • lysine-histidine which is two amino acids, to the C-terminus of the selected leucine located within the 3-1 region of the wild-type SpCas9, and also adds one lysine to the C- terminus of the selected tyrosine located within the 4-1 region .
  • lysine-histidine which is two amino acids
  • the addition is at one or more of the N-terminal and / or C-terminal positions of one or more amino acids present in the first region, the second region, the third region and / or the fourth region of wild-type SpCas9. It may be the addition of an amino acid having a negative charge.
  • the addition may be the addition of one aspartic acid to the N-terminus of a selected one glycine located within the 1-2 region of wild-type SpCas9.
  • the addition may be the addition of glutamic acid-aspartic acid-glutamic acid, which is three amino acids at the C-terminus of the selected methionine located within the 2-3 region of wild-type SpCas9.
  • the addition may be the addition of glutamic acid-glutamic acid, which is two amino acids, to the N-terminus of the selected isoleucine located in the 3-1 region of the wild-type SpCas9.
  • the addition may be accomplished by adding glutamic acid-aspartic acid, which is two amino acids, to the C-terminus of the selected phenylalanine located within the 1-1 region of the wild-type SpCas9, Aspartic acid may be added.
  • the moiety is one at the N-terminal and / or C-terminal positions of one or more amino acids present in the first, second, third and / or fourth regions of wild-type SpCas9 Or more of the amino acid.
  • the attachment may be the addition of two amino acids, serine-valine, to the C-terminus of a selected phenylalanine located within the 1-1 region of the wild-type SpCas9.
  • the addition may be the addition of five amino acids, glycine-proline-glutamine-phenylalanine-leucine, to the N-terminus of the selected histidine located within the 2-1 region of the wild-type SpCas9.
  • the addition may be the addition of two amino acids, alanine-alanine, to the N-terminus of the selected asparagine located within the 3-1 region of the wild-type SpCas9.
  • the attachment may be accomplished by adding phenylalanine-leucine, which is two amino acids at the C-terminus of the selected aspartic acid located within the 1-1 region of the wild-type SpCas9, and adding one phenylalanine-leucine to the N-terminus of the selected glutamine located within the 1-2 region Serine may be added.
  • phenylalanine-leucine which is two amino acids at the C-terminus of the selected aspartic acid located within the 1-1 region of the wild-type SpCas9
  • the moiety is capable of forming a positive charge at the N-terminus and / or C-terminus of one or more amino acids present in the first, second, third and / or fourth regions of wild-type SpCas9 May be the addition of one or more amino acids selected from among amino acids, negatively charged amino acids and non-charged amino acids.
  • the addition may be the addition of six amino acids histidine-arginine-glycine-serine-alanine-glutamic acid to the C-terminus of a selected arginine located within the 1-2 region of wild-type SpCas9.
  • the attachment can be accomplished by adding lysine-lysine-alanine-phenylalanine-glutamine-threonine-methionine-cysteine-aspartic acid-serine, which is ten amino acids at the N-terminus of the selected one glycine located within the 3-1 region of the wild-type SpCas9 Lt; / RTI > Or the addition comprises the addition of two amino acids, phenylalanine-histidine, to the C-terminus of the selected methionine located within the 2-1 region of the wild-type SpCas9, and addition of one lysine at the N-terminus of the selected glutamine located in the 2-3 region .
  • the addition comprises adding aspartic acid-serine, which is two amino acids at the C-terminus of the selected lysine located within the 1-1 region of the wild-type SpCas9, and adding six amino acids at the N-terminus of the selected threonine located within the 2- Cysteine-aspartic acid-lysine, which is the first glutamine-threonine-methionine-cystein-aspartic acid-lysine, and addition of two amino acids, arginine-glycine, to the C-terminal of the selected glutamine located in the 4-1 region.
  • addition may be the addition of one or more functional domains to the N-terminal and / or C-terminal positions of one or more amino acids present in the selected one or more regions.
  • the functional domain may be a domain having an additional function in addition to the original function of the wild-type Cas9, i.e., a first function of cleaving the first strand of the double strand of DNA and a second function of cutting the second strand of the double strand of DNA have.
  • the functional domain is a domain having a function similar to the original function of wild-type Cas9, i.e., a first function of cleaving a first strand of a double strand of DNA and / or a second function of severing a second strand of a double strand of DNA Lt; / RTI >
  • wild-type Cas9 is wild-type SpCas9
  • the addition may be the addition of one or more functional domains at the N-terminal and / or C-terminal positions of one or more amino acids present in the first, second, third and / or fourth regions of wild-type SpCas9 have.
  • the artificially engineered Cas9 may be a target specific Cas9.
  • Target specific Cas9 (TS-Cas9) " is a Cas9 mutant, which refers to Cas9 mutants produced by artificially manipulating to increase target specificity relative to wild type Cas9.
  • target specificity refers to the fact that Cas9 forms a gRNA-Cas9 complex through interaction with gRNA, and when the target gene or nucleic acid, that is, Cas9 is used to close or localize to a target (nucleic acid) Which means that Cas9 can specifically act on the target sequence that makes an antigen-binding.
  • target sequence which is completely complementary (100%) binding to the gRNA is referred to as on-target and includes an incomplete complementary bond (less than 100%) with the gRNA, i.e., Target sequence is referred to as an off-target.
  • the target specificity may vary depending on the degree of complementary binding between the gRNA and the target sequence.
  • the target specificity may be the highest when the target sequence that is complementary to the gRNA is an on-target, i.e., the complementary binding between the gRNA and the target sequence is complete complementarity (100%).
  • the target sequence that undergoes complementary binding to the gRNA is off-target, i.e., the complementarity between the gRNA and the target sequence comprises less than 100% of one or more non-epitope binding
  • the target specificity may be on- , And the target specificity can be further reduced as the number of the non-complementary binding increases.
  • the target specificity may be 95%.
  • the target specificity is 80% when four complementary bonds between the gRNA and the target sequence are involved, i.e., the complementary binding between the gRNA and the target sequence is incomplete complementary (80%).
  • the target sequence that is complementary to the gRNA is off-target, i.e., the complementary binding between the gRNA and the target sequence is less than 100%, i.e., comprises more than one non-epitope binding, It may be different depending on the position of the non-complementary bodily connection.
  • the target specificity may be lower than in the case of off-location.
  • the target specificity may vary depending on the degree of interaction of cas9 with a gRNA complementary to the target sequence.
  • the target specificity may increase as the number of non-complementary binding between the gRNA and the target sequence decreases.
  • the target specificity when containing one non-complementary binding compared to when the gRNA includes three non-complementary binding between the target sequence Can be relatively increased.
  • the target specificity can be obtained only when the complementary binding between the gRNA and the target sequence is completely complementary (100%).
  • the target sequence when the interaction of Cas9 with a gRNA complementary to a target sequence is reduced, the target sequence may have target specificity only when the target sequence is on-target.
  • the target specificity may vary depending on the degree of interaction of Cas9 with a target sequence that has a complementary binding to gRNA.
  • the target specificity may increase as the number of non-complementary binding between the gRNA and the target sequence decreases.
  • the target specificity can be relatively increased.
  • the target specificity can be obtained only when the complementarity between the gRNA and the target sequence is completely complementary (100%).
  • the target sequence when the interaction of Cas9 with a target sequence that has a complementary binding to a gRNA is decreased, the target sequence may have target specificity only when the target sequence is on-target.
  • the target specific Cas9 may be a Cas9 variant that manipulates the on-target.
  • the manipulation may involve deleting the nucleotide sequence of the on-target using the Cas9 variant or modifying the nucleotide sequence of the on-target such that one or more nucleotides in the on-target nucleotide sequence may be deleted and / or inserted .
  • the target specific Cas9 may be a Cas9 mutant whose target specificity for the on-target is equal to or increased than that of the wild-type Cas9.
  • the target specific Cas9 may be a Cas9 variant that does not manipulate an off-target.
  • the manipulation may be to truncate the off-target nucleotide sequence using the Cas9 variant, or to modify the off-target nucleotide sequence so that one or more nucleotides in the off-target nucleotide sequence can be deleted and / or inserted .
  • the target specific Cas9 may be a Cas9 variant with reduced target specificity for off-target compared to wild type Cas9.
  • the target-specific Cas9 has the same target specificity as the wild-type Cas9 for the on-target, and the target specificity for the off-target may be the Cas9 variant reduced compared to the wild-type Cas9.
  • the target specificity for the off-target is the same as for the wild-type Cas9, and the target specificity for the on-target may be an increased Cas9 variant relative to the wild-type Cas9.
  • the target specific Cas9 has increased target specificity for the on-target relative to the wild-type Cas9 and the target specificity for the off-target may be a reduced Cas9 variant relative to the wild-type Cas9.
  • the target specific Cas9 may be a Cas9 variant with a reduced target specificity for the on-target relative to the wild-type Cas9 and a target specificity for the off-target relative to the wild-type Cas9.
  • the target specific Cas9 may be a target specific SpCas9.
  • Target specific SpCas9 (TS-SpCas9) " is a SpCas9 variant and refers to a SpCas9 variant produced by artificially manipulating to increase target specificity relative to wild type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 may be an SpCas9 variant that manipulates the on-target.
  • the manipulation may be to truncate the nucleotide sequence of the on-target using a SpCas9 variant or to modify the nucleotide sequence of the on-target such that one or more nucleotides in the on-target nucleotide sequence may be deleted and / or inserted .
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant whose target specificity for the on-target is equal to or increased as the wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 mutant that does not manipulate off-target.
  • the manipulation may be to truncate the off-target nucleotide sequence using the SpCas9 variant or to modify the off-target nucleotide sequence so that one or more nucleotides in the off-target nucleotide sequence may be deleted and / or inserted .
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant with reduced target specificity for off-target compared to wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 has the same target specificity for the on-target as the wild-type SpCas9, and the target specificity for the off-target may be a reduced SpCas9 variant relative to the wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 has the same target specificity for the off-target as the wild-type SpCas9, and the target specificity for the on-target may be an increased SpCas9 variant relative to the wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 increases the target specificity for the on-target relative to the wild-type SpCas9, and the target specificity for the off-target may be a reduced SpCas9 variant relative to the wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 has a reduced target specificity for the on-target compared to the wild-type SpCas9, and the target specificity for the off-target may be a reduced SpCas9 variant relative to the wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant in which at least one amino acid in the amino acid sequence in the selected one of the first region, the second region, the third region and the fourth region of the wild-type SpCas9 is modified.
  • the first region may be an amino acid sequence (1-1 region) from 196th phenylalanine (F196) to 282th isoleucine (I282) of wild-type SpCas9.
  • the first region may be an amino acid sequence (1-2 region) from 316th proline (P316) to 394th asparagine (N394) of wild-type SpCas9.
  • the first region may be an amino acid sequence from the 510th lysine (K510) of the wild-type SpCas9 to the 612th asparagine (N612) (region 1-3).
  • the first region may be an amino acid sequence (region 1-4) from 678th threonine (T678) to 698th histidine (H698) of wild-type SpCas9.
  • the first region is an amino acid sequence (1-1 region) from 196th phenylalanine (F196) of wild-type SpCas9 to 282nd isoleucine (I282), an amino acid sequence from 316th proline (P316) to 394th asparagine (N394) Amino acid sequence from the 510th lysine (K510) to the 612th asparagine (N612) (the 1-3 region) and the 678th threonine (T678) to the 698th histidine (H698) And two regions selected from the sequence (regions 1-4).
  • the first region is an amino acid sequence (1-1 region) from 196th phenylalanine (F196) of wild-type SpCas9 to 282nd isoleucine (I282), an amino acid sequence from 316th proline (P316) to 394th asparagine (N394) Amino acid sequence from the 510th lysine (K510) to the 612th asparagine (N612) (the 1-3 region) and the 678th threonine (T678) to the 698th histidine (H698) And three regions selected from the sequence (regions 1-4).
  • the first region is an amino acid sequence (1-1 region) from 196th phenylalanine (F196) of wild-type SpCas9 to 282nd isoleucine (I282), an amino acid sequence from 316th proline (P316) to 394th asparagine (N394) Amino acid sequence from the 510th lysine (K510) to the 612th asparagine (N612) (the 1-3 region) and the 678th threonine (T678) to the 698th histidine (H698) (Regions 1-4).
  • the second region may be an amino acid sequence (region 2-1) from the first methionine (M1) to the 22nd threonine (T22) of wild-type SpCas9.
  • the second region may be an amino acid sequence (region 2-2) from the 731st proline (P731) to the 770th threonine (T770) of wild-type SpCas9.
  • the second region may be an amino acid sequence (region 2-3) from 926th glutamine (Q926) to 1040th serine (S1040) of wild-type SpCas9.
  • the second region comprises an amino acid sequence from the first methionine (M1) to the 22nd threonine (T22) of the wild-type SpCas9 (region 2-1) and the amino acid sequence from the 731st proline (P731) to the 770th threonine (T770) (Region 2-2).
  • the second region comprises an amino acid sequence from the first methionine (M1) to the 22nd threonine (T22) of the wild-type SpCas9 (region 2-1) and the amino acid sequence from 926th glutamine (Q926) to 1040th serine (S1040) (Region 2-3).
  • the second region comprises the amino acid sequence from the 731st proline (P731) to the 770th threonine (T770) of the wild-type SpCas9 and the amino acid sequence from the 926th glutamine (Q926) to the 1040th serine (S1040) (Region 2-3).
  • the second region comprises an amino acid sequence from the first methionine (M1) to the 22nd threonine (T22) of the wild-type SpCas9 (region 2-1), an amino acid sequence from the 731st proline (P731) to the 770th threonine (T770) (Region 2-2) and amino acid sequence (region 2-3) from 926th glutamine (Q926) to 1040th serine (S1040).
  • the third region may be an amino acid sequence (region 3-1) from 775th lysine (K775) to 900th leucine (L900) of wild-type SpCas9.
  • the fourth region may be an amino acid sequence (region 4-1) from 1099th glutamic acid (E1099) to 1139th valine (V1139) of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 mutant that has modified at least one amino acid selected from the amino acid sequence in the first region of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 mutant that has modified at least one amino acid selected from the amino acid sequence within the 1-1 region of the wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 is selected from the group consisting of N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, L279, A280, Q281, and I282. ≪ / RTI >
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant that has modified at least one amino acid selected from the amino acid sequence within the 1-2 region of the wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 is selected from the group consisting of P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, Or a SpCas9 mutant that has modified at least one amino acid selected from the group consisting of G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391 and L393.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 mutant that has modified at least one amino acid selected from the amino acid sequence within the 1-3 region of the wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 mutant that has modified at least one amino acid selected from the amino acid sequence within the 1-4 region of the wild-type SpCas9.
  • TS-SpCas9 comprises at least one amino acid selected from the group consisting of I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, N692, F693, M694, Q695, L696, I697 and H698 of the 1-4 region of wild type SpCas9 Modified SpCas9 variant.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant in which two or more amino acids selected from the amino acid sequences in the 1-1 and 1-2 regions of the wild-type SpCas9 are modified.
  • the TS-SpCas9 comprises N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L244, L246, A243, L244, L246, G247, L248, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, Or a SpCas9 variant in which two or more amino acids selected from the group consisting of G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 mutant in which two or more amino acids selected from the amino acid sequences in the 1-1 and 1-3 regions of wild-type SpCas9 are modified.
  • the TS-SpCas9 comprises N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L244, L246, A243, L244, L246, G247, L248, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, K510, L513, L514, Y515, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, E584, D585, F587, N588, A589, L591,
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 mutant in which two or more amino acids selected from the amino acid sequences in the 1-1 and 1-4 regions of the wild-type SpCas9 are modified.
  • the TS-SpCas9 comprises a first region 1 and a fourth region 1 of the wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 comprises N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L244, L246, A243, L244, L246, G247, L248, Two or more amino acids selected from the group consisting of L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, N692, F693, M694, Q695, L696, I697 and H698 Modified SpCas9 variant.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 mutant in which two or more amino acids selected from the amino acid sequences in the 1-2 region and the 1-3 region of the wild-type SpCas9 are modified.
  • the TS-SpCas9 comprises a first region 1-2 of the wild-type SpCas9 and a third region 1-3 of the wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 is selected from the group consisting of P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, L369, L369, L363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, K510, L513, L514, Y515, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F5
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 mutant in which two or more amino acids selected from the amino acid sequences in the 1-2 and 1-4 regions of the wild-type SpCas9 are modified.
  • the TS-SpCas9 is selected from the group consisting of P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, L369, L369, L369, L672, L369, L683, G687, L369, L369, L369, L369, L369, L369, L369, Or a SpCas9 variant in which two or more amino acids selected from the group consisting of F688, A689, N692, F693, M694, Q695, L696, I697 and H698 are modified.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 mutant in which two or more amino acids selected from the amino acid sequences in the 1-3 region and the 1-4 region of the wild-type SpCas9 are modified.
  • the TS-SpCas9 is a fragment of the wild-type SpCas9 which is selected from the group consisting of K510, L513, L514, Y515, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, E584, D585, F587, N588, A589, Wherein at least two amino acids selected from the group consisting of L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, N692, F693, M694, Q695, L696, I697 and H698 Lt; / RTI > variant.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant in which at least three selected amino acids of the amino acid sequence in the 1-1, 1-2 and 1-3 regions of the wild-type SpCas9 are modified.
  • the TS-SpCas9 comprises N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, L369, L369, L363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L3
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 mutant in which at least three selected amino acids of the amino acid sequences in the 1-1, 1-2 and 1-4 regions of the wild-type SpCas9 have been modified.
  • the TS-SpCas9 comprises N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, L369, L369, L369, L369, L672, L369, L683, G687, L369, L369, L369, L369, L369, L3
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 mutant that has modified three or more selected amino acids among the amino acid sequences in the 1-1, 1-3 and 1-4 regions of the wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 comprises N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, K510, L513, L514, Y515, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant in which at least three selected amino acids in the amino acid sequence in the 1-2 region, the 1-3 region and the 1-4 region of the wild-type SpCas9 have been modified.
  • the TS-SpCas9 is selected from the group consisting of P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, L383, L389, L389, L389, L389, L384, L383, G365, G366, A367, F372, F376, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L514, Y515, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, L683, L689, L689, L689, L689, L689, L689, L689, L689, L659, L658, I600, I601, F606, L60
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 mutant in which at least four selected amino acids among the amino acid sequences in the 1-1 region, the 1-2 region, the 1-3 region and the 1-4 region of the wild-type SpCas9 are modified.
  • the TS-SpCas9 comprises N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, L338, L338, L338, A337, L338, V339, L343, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L383, L389, L389, L389, L389, L384, L383, G365, G366, A367, F372, F376, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L514, Y515, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F5
  • the TS-SpCas9 is A203 of wild-type SpCas9; N277; G366; F539; Or I601 modified SpCas9 variants.
  • the TS-SpCas9 is A203 / N277 (A203 and N277) of wild-type SpCas9; A203 / G366; A203 / F539; Or a SpCas9 variant that modified A203 / I601.
  • the TS-SpCas9 is selected from the group consisting of N277 / G366 of wild-type SpCas9; N277 / F539; Or SpCas9 modified N277 / I601.
  • said TS-SpCas9 is G366 / F539 of wild-type SpCas9; G366 / I601; Or SpCas9 modified F539 / I601.
  • the TS-SpCas9 is A203 / N277 / G366 of wild-type SpCas9; A203 / N277 / F539; A203 / N277 / I601; A203 / G366 / F539; A203 / G366 / I601; A203 / F539 / I601; N277 / G366 / F539; N277 / G366 / I601; Or SpCas9 modified G366 / F539 / I601.
  • the TS-SpCas9 is A203 / N277 / G366 / F539 of wild-type SpCas9; A203 / N277 / G366 / I601; A203 / N277 / F539 / I601; A203 / G366 / F539 / I601; Or SpCas9 modified N277 / G366 / F539 / I601.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant that modified A203 / N277 / G366 / F539 / I601 of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 mutant in which one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the second region of the wild-type SpCas9 are modified.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 mutant that has modified at least one amino acid selected from the amino acid sequence within the 2-1 region of the wild-type SpCas9.
  • TS-SpCas9 is a SpCas9 variant having modified at least one amino acid selected from the group consisting of I2, 7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20 and I21 of the 2-1 region of wild type SpCas9 Lt; / RTI >
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant that has modified at least one amino acid selected from the amino acid sequence within the region 2-2 of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 is a region of the wild-type SpCas9 of P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, and N767.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 mutant that has modified at least one amino acid selected from the amino acid sequence within the 2-3 region of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 is a region of the wild-type SpCas9 of I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, Or a SpCas9 variant in which one or more amino acids selected from the group consisting of M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 and Y1039 are modified.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 mutant in which two or more amino acids selected from the amino acid sequences in the 2-1 region and the 2-2 region of the wild-type SpCas9 are modified.
  • the TS-SpCas9 is a fragment of the wild-type SpCas9 which is selected from the group consisting of I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, Two or more amino acids selected from the group consisting of G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766 and N767 Modified SpCas9 variant.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 mutant in which two or more amino acids selected from the amino acid sequences in the 2-1 region and the 2-3 region of the wild-type SpCas9 are modified.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 mutant in which two or more amino acids selected from the amino acid sequences in the 2-2 region and the 2-3 region of the wild-type SpCas9 are modified.
  • the TS-SpCas9 is selected from the group consisting of P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I975, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F990, F992, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, Or a SpCas9 variant in which two or more amino acids selected from the group consisting of V1015, V1018, M1021, I1022,
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 mutant in which at least three selected amino acids of the amino acid sequence in the 2-1 region, the 2-2 region and the 2-3 region of the wild-type SpCas9 are modified.
  • the TS-SpCas9 is selected from the group consisting of I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V
  • the TS-SpCas9 is selected from the group consisting of M763 of wild-type SpCas9; D965; Or a SpCas9 variant that has modified F1038.
  • the TS-SpCas9 is selected from the group consisting of M763 / D965 of wild-type SpCas9; M763 / F1038; Or a SpCas9 variant that modified D965 / F1038.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant that modified M763 / D965 / F1038 of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant that has modified at least one amino acid selected from the amino acid sequence in the third region of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 mutant that has modified at least one amino acid selected from the amino acid sequence within the 3-1 region of the wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 may be selected from the group consisting of K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, V838, D839, H840, K848, D849, D850, D853, N854, K855, R859, D861, K862, N863, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, A889, K890, L891, R895, K896 and D898.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant that has modified K890 of the wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 mutant that has modified at least one amino acid selected from the amino acid sequence in the fourth region of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant that has modified at least one amino acid selected from the amino acid sequence within the 4-1 region of the wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant that has modified at least one amino acid selected from the group consisting of T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 and T1138 among the 4-1 region of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant that modified T1102 or D1127 of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant that modified T1102 / D1127 of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 mutant in which two or more amino acids selected from the amino acid sequences in the first region and the second region of the wild-type SpCas9 are modified. At this time, two or more amino acids may be present in different regions.
  • the TS-SpCas9 comprises at least one amino acid selected from the amino acid sequences in the 1-1 region, the 1-2 region, the 1-3 region and / or the 1-4 region of the wild-type SpCas9; And at least one amino acid selected from the amino acid sequences in the 2-1 region, the 2-2 region, and / or the 2-3 region, respectively.
  • the TS-SpCas9 comprises N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, L244, L246, G247, L248, N251, L224, L224, L224, L224, L224, L224, L222, L224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L338, V339, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376,
  • the TS-SpCas9 is A203 / M763 of wild type SpCas9; A203 / D965; A203 / F1038; A203 / M763 / D965; A203 / M763 / F1038; A203 / D965 / F1038; A203 / M763 / D965 / F1038; N277 / M763; N277 / D965; N277 / F1038; N277 / M763 / D965; N277 / M763 / F1038; N277 / D965 / F1038; N277 / M763 / D965 / F1038; N277 / M763 / D965 / F1038; G366 / M763; G366 / D965; G366 / F1038; G366 / M763 / D965; G366 / M
  • the TS-SpCas9 is A203 / N277 / M763 of wild-type SpCas9; A203 / N277 / D965; A203 / N277 / F1038; A203 / N277 / M763 / D965; A203 / N277 / M763 / F1038; A203 / N277 / D965 / F1038; A203 / N277 / M763 / D965 / F1038; A203 / G366 / M763; A203 / G366 / D965; A203 / G366 / F1038; A203 / G366 / M763 / D965; A203 / G366 / M763 / D965; A203 / G366 / M763 / F1038; A203 / G366 / M763 / D965; A203 / G366
  • the TS-SpCas9 is A203 / N277 / G366 / M763 of wild-type SpCas9; A203 / N277 / G366 / D965; A203 / N277 / G366 / F1038; A203 / N277 / G366 / M763 / D965; A203 / N277 / G366 / M763 / F1038; A203 / N277 / G366 / D965 / F1038; A203 / N277 / G366 / M763 / D965 / F1038; A203 / N277 / F539 / M763; A203 / N277 / F539 / M763; A203 / N277 / F539 / D965; A203 / N277 / F539 / F1038; A203 / N277 / F5
  • the TS-SpCas9 is A203 / N277 / G366 / F539 / M763 of wild-type SpCas9; A203 / N277 / G366 / F539 / D965; A203 / N277 / G366 / F539 / F1038; A203 / N277 / G366 / F539 / M763 / D965; A203 / N277 / G366 / F539 / M763 / F1038; A203 / N277 / G366 / F539 / D965 / F1038; A203 / N277 / G366 / F539 / M763 / D965 / F1038; A203 / N277 / G366 / F539 / M763 / D965 / F1038; A203 / N277 / G366 / F
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 mutant in which two or more amino acids selected from the amino acid sequences in the first region and the third region of the wild-type SpCas9 are modified. At this time, two or more amino acids may be present in different regions.
  • the TS-SpCas9 comprises at least one amino acid selected from the amino acid sequence of the 1-1 region of the wild-type SpCas9, the 1-1 region, the 1-2 region, the 1-3 region and / or the 1-4 region; And at least one amino acid selected from the amino acid sequence within the 3-1 region, respectively.
  • the TS-SpCas9 comprises N199, I201, N202, A203, G205, V206 among the 1-1 region 1-1 region, the 1-2 region, the 1-3 region and / or the 1-4 region of the wild-type SpCas9 , A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247 , L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, , L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361,
  • the TS-SpCas9 is A203 / K890 of wild type SpCas9; N277 / K890; G366 / K890; F539 / K890; Or a SpCas9 variant that modified I601 / K890.
  • the TS-SpCas9 is A203 / N277 / K890 of wild-type SpCas9; A203 / G366 / K890; A203 / F539 / K890; A203 / I601 / K890; N277 / G366 / K890; N277 / F539 / K890; N277 / I601 / K890; G366 / F539 / K890; G366 / I601 / K890; Or a SpCas9 variant that modified F539 / I601 / K890.
  • the TS-SpCas9 is A203 / N277 / G366 / K890 of wild-type SpCas9; A203 / N277 / F539 / K890; A203 / N277 / I601 / K890; A203 / G366 / F539 / K890; A203 / G366 / I601 / K890; A203 / F539 / I601 / K890; N277 / G366 / F539 / K890; N277 / G366 / I601 / K890; Or a SpCas9 variant that modified G366 / F539 / I601 / K890.
  • said TS-SpCas9 is A203 / N277 / G366 / F539 / K890 of wild-type SpCas9; A203 / N277 / G366 / I601 / K890; Or a SpCas9 variant that modified N277 / G366 / F539 / I601 / K890.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant that modified A203 / N277 / G366 / F539 / I601 / K890 of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 mutant in which two or more amino acids selected from the amino acid sequences in the first region and the fourth region of the wild-type SpCas9 are modified. At this time, two or more amino acids may be present in different regions.
  • the TS-SpCas9 comprises at least one amino acid selected from the amino acid sequence of the 1-1 region of the wild-type SpCas9, the 1-1 region, the 1-2 region, the 1-3 region and / or the 1-4 region; And at least one amino acid selected from the amino acid sequence within the 4-1 region, respectively.
  • the TS-SpCas9 comprises N199, I201, N202, A203, G205, V206 among the 1-1 region 1-1 region, the 1-2 region, the 1-3 region and / or the 1-4 region of the wild-type SpCas9 , A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247 , L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, , L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361,
  • the TS-SpCas9 is selected from the group consisting of A203 / T1102 of wild-type SpCas9; N277 / T1102; G366 / T1102; F539 / T1102; I601 / T1102; A203 / D1127; N277 / D1127; G366 / D1127; F539 / D1127; I601 / D1127; A203 / T1102 / D1127; N277 / T1102 / D1127; G366 / T1102 / D1127; F539 / T1102 / D1127; Or I601 / T1102 / D1127 modified SpCas9 variants.
  • the TS-SpCas9 is a wild-type SpCas9
  • the TS-SpCas9 is A203 / N277 / T1102 of wild-type SpCas9; A203 / G366 / T1102; A203 / F539 / T1102; A203 / I601 / T1102; N277 / G366 / T1102; N277 / F539 / T1102; N277 / I601 / T1102; G366 / F539 / T1102; G366 / I601 / T1102; F539 / I601 / T1102; A203 / N277 / D1127; A203 / G366 / D1127; A203 / F539 / D1127; A203 / I601 / D1127; N277 / G366 / D1127; N277 / F539 / D1127; N277 / I601 / D1127; G
  • the TS-SpCas9 is A203 / N277 / G366 / T1102 of wild-type SpCas9; A203 / N277 / F539 / T1102; A203 / N277 / I601 / T1102; A203 / G366 / F539 / T1102; A203 / G366 / I601 / T1102; A203 / F539 / I601 / T1102; N277 / G366 / F539 / T1102; N277 / G366 / I601 / T1102; G366 / F539 / I601 / T1102; A203 / N277 / G366 / D1127; A203 / N277 / F539 / D1127; A203 / N277 / I601 / D1127; A203 / G366 / F539
  • the TS-SpCas9 is A203 / N277 / G366 / F539 / T1102 of wild-type SpCas9; A203 / N277 / G366 / I601 / T1102; N277 / G366 / F539 / I601 / T1102; A203 / N277 / G366 / F539 / D1127; A203 / N277 / G366 / I601 / D1127; N277 / G366 / F539 / I601 / D1127; A203 / N277 / G366 / F539 / T1102 / D1127; A203 / N277 / G366 / I601 / T1102 / D1127; A203 / N277 / G366 / I601 / T1102 / D1127; A203 / N277 / G
  • the TS-SpCas9 is A203 / N277 / G366 / F539 / I601 / T1102 of wild-type SpCas9; A203 / N277 / G366 / F539 / I601 / D1127; Or A203 / N277 / G366 / F539 / I601 / T1102 / D1127.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 mutant in which two or more amino acids selected from the amino acid sequence in the second region and the third region of the wild-type SpCas9 are modified. At this time, two or more amino acids may be present in different regions.
  • the TS-SpCas9 comprises at least one amino acid selected from the amino acid sequences within the 2-1 region, the 2-2 region and / or the 2-3 region of the wild-type SpCas9; And at least one amino acid selected from the amino acid sequence within the 3-1 region, respectively.
  • the TS-SpCas9 is selected from the group consisting of I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, I987, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015
  • the TS-SpCas9 is selected from the group consisting of M763 / K890 of wild type SpCas9; K890 / D965; Or a SpCas9 variant that has modified K890 / F1038.
  • the TS-SpCas9 is selected from the group consisting of M763 / K890 / D965 of wild type SpCas9; M763 / K890 / F1038; Or a SpCas9 variant that has modified K890 / D965 / F1038.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant that has modified M763 / K890 / D965 / F1038 of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 mutant in which two or more amino acids selected from the amino acid sequences in the second region and the fourth region of the wild-type SpCas9 are modified. At this time, two or more amino acids may be present in different regions.
  • the TS-SpCas9 comprises at least one amino acid selected from the amino acid sequences within the 2-1 region, the 2-2 region and / or the 2-3 region of the wild-type SpCas9; And at least one amino acid selected from the amino acid sequence within the 4-1 region, respectively.
  • the TS-SpCas9 is selected from the group consisting of I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, I987, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015
  • the TS-SpCas9 is selected from the group consisting of M763 / T1102 of wild-type SpCas9; D965 / T1102; F1038 / T1102; M763 / D1127; D965 / D1127; F1038 / D1127; M763 / T1102 / D1127; D965 / T1102 / D1127; Or a SpCas9 variant that has modified F1038 / T1102 / D1127.
  • the TS-SpCas9 is selected from the group consisting of M763 / D965 / T1102 of wild-type SpCas9; M763 / F1038 / T1102; D965 / F1038 / T1102; M763 / D965 / D1127; M763 / F1038 / D1127; D965 / F1038 / D1127; M763 / D965 / T1102 / D1127; M763 / F1038 / T1102 / D1127; Or a SpCas9 variant that modified D965 / F1038 / T1102 / D1127.
  • the TS-SpCas9 is selected from the group consisting of M763 / D965 / F1038 / T1102 of wild-type SpCas9; M763 / D965 / F1038 / D1127; Or a SpCas9 variant that has modified M763 / D965 / F1038 / T1102 / D1127.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 mutant in which two or more amino acids selected from the amino acid sequence in the third region and the fourth region of the wild-type SpCas9 are modified. At this time, two or more amino acids may be present in different regions.
  • said TS-SpCas9 comprises at least one amino acid selected from the amino acid sequence within the 3-1 region of wild-type SpCas9; And at least one amino acid selected from the amino acid sequence within the 4-1 region, respectively.
  • the TS-SpCas9 may be selected from the group consisting of K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, One or more amino acids selected from the group consisting of K890, R895, K896 and D898; And at least one amino acid selected from the group consisting of T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 and T1138 among the 4-1 region.
  • the TS-SpCas9 is selected from the group consisting of K890 / T1102 of wild-type SpCas9; K890 / D1127; Or a SpCas9 variant that has modified K890 / T1102 / D1127.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 mutant in which at least three selected amino acids of the amino acid sequence in the first region, the second region and the third region of the wild-type SpCas9 are modified. At this time, three or more amino acids may exist in different regions.
  • the TS-SpCas9 comprises at least one amino acid selected from the amino acid sequences in the 1-1 region, the 1-2 region, the 1-3 region and / or the 1-4 region of the wild-type SpCas9; One or more amino acids selected from the amino acid sequences within the 2-1 region, the 2-2 region and / or the 2-3 region; And at least one amino acid selected from the amino acid sequence within the 3-1 region, respectively.
  • the TS-SpCas9 comprises N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, L244, L246, G247, L248, N251, L224, L224, L224, L224, L224, L224, L222, L224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L338, V339, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376,
  • the TS-SpCas9 is A203 / M763 / K890 of wild type SpCas9; A203 / K890 / D965; A203 / K890 / F1038; A203 / M763 / K890 / D965; A203 / M763 / K890 / F1038; A203 / K890 / D965 / F1038; A203 / M763 / K890 / D965 / F1038; N277 / M763 / K890; N277 / K890 / D965; N277 / K890 / F1038; N277 / M763 / K890 / D965; N277 / M763 / K890 / D965; N277 / M763 / K890 / D965; N277 / M763 / K890 / D965; N
  • the TS-SpCas9 is A203 / N277 / M763 / K890 of wild type SpCas9; A203 / N277 / K890 / D965; A203 / N277 / K890 / F1038; A203 / N277 / M763 / K890 / D965; A203 / N277 / M763 / K890 / F1038; A203 / N277 / K890 / D965 / F1038; A203 / N277 / M763 / K890 / D965 / F1038; A203 / G366 / M763 / K890; A203 / G366 / K890 / D965; A203 / G366 / K890 / F1038; A203 / G366 / M763 / K890 / D965; A203 / G366
  • the TS-SpCas9 is A203 / N277 / G366 / M763 / K890 of wild type SpCas9; A203 / N277 / G366 / K890 / D965; A203 / N277 / G366 / K890 / F1038; A203 / N277 / G366 / M763 / K890 / D965; A203 / N277 / G366 / M763 / K890 / F1038; A203 / N277 / G366 / K890 / D965 / F1038; A203 / N277 / G366 / M763 / K890 / D965 / F1038; A203 / N277 / G366 / M763 / K890 / D965 / F1038; A203 / N277 / G366 / M76
  • the TS-SpCas9 is A203 / N277 / G366 / F539 / M763 / K890 of wild-type SpCas9; A203 / N277 / G366 / F539 / K890 / D965; A203 / N277 / G366 / F539 / K890 / F1038; A203 / N277 / G366 / F539 / M763 / K890 / D965; A203 / N277 / G366 / F539 / M763 / K890 / F1038; A203 / N277 / G366 / F539 / K890 / D965 / F1038; A203 / N277 / G366 / F539 / K890 / D965 / F1038; A203 / N277 / G366 / F539
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant in which at least three selected amino acids of the amino acid sequence in the first region, the second region and the fourth region of the wild-type SpCas9 are modified. At this time, three or more amino acids may exist in different regions.
  • the TS-SpCas9 comprises at least one amino acid selected from the amino acid sequences in the 1-1 region, the 1-2 region, the 1-3 region and / or the 1-4 region of the wild-type SpCas9; One or more amino acids selected from the amino acid sequences within the 2-1 region, the 2-2 region and / or the 2-3 region; And at least one amino acid selected from the amino acid sequence within the 4-1 region, respectively.
  • the TS-SpCas9 comprises N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, L244, L246, G247, L248, N251, L224, L224, L224, L224, L224, L224, L222, L224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L338, V339, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376,
  • the TS-SpCas9 is A203 / M763 / T1102 of wild-type SpCas9; A203 // D965T1102; A203 // F1038T1102; A203 / M763 / D965 / T1102; A203 / M763 / F1038 / T1102; A203 / D965 / F1038 / T1102; A203 / M763 / D965 / F1038 / T1102; N277 / M763 / T1102; N277 / D965 / T1102; N277 / F1038 / T1102; N277 / M763 / D965 / T1102; N277 / M763 / D965 / T1102; N277 / M763 / D965 / T1102; N277 / M763 / D965 / T1102; N277 / M
  • the TS-SpCas9 is A203 / M763 / T1102 / D1127 of wild-type SpCas9; A203 / D965 / T1102 / D1127; A203 / F1038 / T1102 / D1127; A203 / M763 / D965 / T1102 / D1127; A203 / M763 / F1038 / T1102 / D1127; A203 / D965 / F1038 / T1102 / D1127; A203 / M763 / D965 / F1038 / T1102 / D1127; N277 / M763 / T1102 / D1127; N277 / D965 / T1102 / D1127; N277 / F1038 / T1102 / D1127; N277 / M763 / D965 / T1102 / D1127; N2
  • the TS-SpCas9 is A203 / N277 / M763 / T1102 of wild-type SpCas9; A203 / N277 / D965 / T1102; A203 / N277 / F1038 / T1102; A203 / N277 / M763 / D965 / T1102; A203 / N277 / M763 / F1038 / T1102; A203 / N277 / D965 / F1038 / T1102; A203 / N277 / M763 / D965 / F1038 / T1102; A203 / G366 / M763 / T1102; A203 / G366 / D965 / T1102; A203 / G366 / F1038 / T1102; A203 / G366 / M763 / D965 / T1102; A203 / G3
  • the TS-SpCas9 is A203 / N277 / M763 / T1102 / D1127 of wild-type SpCas9; A203 / N277 / D965 / T1102 / D1127; A203 / N277 / F1038 / T1102 / D1127; A203 / N277 / M763 / D965 / T1102 / D1127; A203 / N277 / M763 / F1038 / T1102 / D1127; A203 / N277 / D965 / F1038 / T1102 / D1127; A203 / N277 / M763 / D965 / F1038 / T1102 / D1127; A203 / N277 / M763 / D965 / F1038 / T1102 / D1127; A203 / G366 / M763 / T
  • the TS-SpCas9 is A203 / N277 / G366 / M763 / T1102 of wild-type SpCas9; A203 / N277 / G366 / D965 / T1102; A203 / N277 / G366 / F1038 / T1102; A203 / N277 / G366 / M763 / D965 / T1102; A203 / N277 / G366 / M763 / F1038 / T1102; A203 / N277 / G366 / D965 / F1038 / T1102; A203 / N277 / G366 / D965 / F1038 / T1102; A203 / N277 / G366 / M763 / D965 / F1038 / T1102; A203 / N277 / G366 / M763 / D
  • the TS-SpCas9 is A203 / N277 / G366 / M763 / T1102 / D1127 of wild-type SpCas9; A203 / N277 / G366 / D965 / T1102 / D1127; A203 / N277 / G366 / F1038 / T1102 / D1127; A203 / N277 / G366 / M763 / D965 / T1102 / D1127; A203 / N277 / G366 / M763 / F1038 / T1102 / D1127; A203 / N277 / G366 / D965 / F1038 / T1102 / D1127; A203 / N277 / G366 / D965 / F1038 / T1102 / D1127; A203 / N277 / G366 / D965
  • the TS-SpCas9 is A203 / N277 / G366 / F539 / M763 / T1102 of wild-type SpCas9; A203 / N277 / G366 / F539 / D965 / T1102; A203 / N277 / G366 / F539 / F1038 / T1102; A203 / N277 / G366 / F539 / M763 / D965 / T1102; A203 / N277 / G366 / F539 / M763 / F1038 / T1102; A203 / N277 / G366 / F539 / D965 / F1038 / T1102; A203 / N277 / G366 / F539 / D965 / F1038 / T1102; A203 / N277 / G366 / F539
  • the TS-SpCas9 is A203 / N277 / G366 / F539 / M763 / T1102 / D1127 of wild-type SpCas9; A203 / N277 / G366 / F539 / D965 / T1102 / D1127; A203 / N277 / G366 / F539 / F1038 / T1102 / D1127; A203 / N277 / G366 / F539 / M763 / D965 / T1102 / D1127; A203 / N277 / G366 / F539 / M763 / F1038 / T1102 / D1127; A203 / N277 / G366 / F539 / M763 / F1038 / T1102 / D1127; A203 / N277 / G366 / F539 / M76
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 mutant that has modified three or more selected amino acids among the amino acid sequences in the second, third and fourth regions of wild-type SpCas9. At this time, three or more amino acids may exist in different regions.
  • the TS-SpCas9 comprises at least one amino acid selected from the amino acid sequences within the 2-1 region, the 2-2 region and / or the 2-3 region of the wild-type SpCas9; One or more amino acids selected from the amino acid sequences within the 3-1 region; And at least one amino acid selected from the amino acid sequence within the 4-1 region, respectively.
  • the TS-SpCas9 is selected from the group consisting of I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, I987, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015
  • the TS-SpCas9 is selected from the group consisting of M763 / K890 / T1102 of wild-type SpCas9; K890 / D965 / T1102; K890 / F1038 / T1102; M763 / K890 / D1127; K890 / D965 / D1127; K890 / F1038 / D1127; M763 / K890 / T1102 / D1127; K890 / D965 / T1102 / D1127; Or a SpCas9 variant that has modified K890 / F1038 / T1102 / D1127.
  • the TS-SpCas9 is selected from the group consisting of M763 / K890 / D965 / T1102 of wild-type SpCas9; M763 / K890 / F1038 / T1102; K890 / D965 / F1038 / T1102; M763 / K890 / D965 / D1127; M763 / K890 / F1038 / D1127; K890 / D965 / F1038 / D1127; M763 / K890 / D965 / T1102 / D1127; M763 / K890 / F1038 / T1102 / D1127; Or a SpCas9 variant that has modified K890 / D965 / F1038 / T1102 / D1127.
  • the TS-SpCas9 is selected from the group consisting of M763 / K890 / D965 / F1038 / T1102 of wild-type SpCas9; M763 / K890 / D965 / F1038 / D1127 or M763 / K890 / D965 / F1038 / T1102 / D1127.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant in which at least three selected amino acids in the first, second, third and fourth regions of wild-type SpCas9 are modified. At this time, three or more amino acids may exist in different regions.
  • the TS-SpCas9 comprises at least one amino acid selected from the amino acid sequences within the 2-1 region, the 2-2 region and / or the 2-3 region of the wild-type SpCas9; One or more amino acids selected from the amino acid sequences within the 3-1 region; And at least one amino acid selected from the amino acid sequence within the 4-1 region, respectively.
  • the TS-SpCas9 comprises N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, L244, L246, G247, L248, N251, L224, L224, L224, L224, L224, L224, L222, L224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L338, V339, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376,
  • the TS-SpCas9 is A203 / M763 / K890 / T1102 of wild-type SpCas9; A203 / K890 / D965 / T1102; A203 / K890 / F1038 / T1102; A203 / M763 / K890 / D965 / T1102; A203 / M763 / K890 / F1038 / T1102; A203 / K890 / D965 / F1038 / T1102; A203 / M763 / K890 / D965 / F1038 / T1102; N277 / M763 / K890 / T1102; N277 / K890 / D965 / T1102; N277 / K890 / F1038 / T1102; N277 / K890 / F1038 / T1102; N277 / M76
  • the TS-SpCas9 is A203 / M763 / K890 / T1102 / D1127 of wild-type SpCas9; A203 / K890 / D965 / T1102 / D1127; A203 / K890 / F1038 / T1102 / D1127; A203 / M763 / K890 / D965 / T1102 / D1127; A203 / M763 / K890 / F1038 / T1102 / D1127; A203 / K890 / D965 / F1038 / T1102 / D1127; A203 / M763 / K890 / D965 / F1038 / T1102 / D1127; A203 / M763 / K890 / D965 / F1038 / T1102 / D1127; N277 / M763 / K890 /
  • the TS-SpCas9 is A203 / N277 / M763 / K890 / T1102 of wild-type SpCas9; A203 / N277 / K890 / D965 / T1102; A203 / N277 / K890 / F1038 / T1102; A203 / N277 / M763 / K890 / D965 / T1102; A203 / N277 / M763 / K890 / F1038 / T1102; A203 / N277 / K890 / D965 / F1038 / T1102; A203 / N277 / M763 / K890 / D965 / F1038 / T1102; A203 / N277 / M763 / K890 / D965 / F1038 / T1102; A203 / G366 / M763 / K
  • the TS-SpCas9 is A203 / N277 / M763 / K890 / T1102 / D1127 of wild-type SpCas9; A203 / N277 / K890 / D965 / T1102 / D1127; A203 / N277 / K890 / F1038 / T1102 / D1127; A203 / N277 / M763 / K890 / D965 / T1102 / D1127; A203 / N277 / M763 / K890 / F1038 / T1102 / D1127; A203 / N277 / K890 / D965 / F1038 / T1102 / D1127; A203 / N277 / K890 / D965 / F1038 / T1102 / D1127; A203 / N277 / M763 / K890
  • the TS-SpCas9 is A203 / N277 / G366 / M763 / K890 / T1102 of wild-type SpCas9; A203 / N277 / G366 / K890 / D965 / T1102; A203 / N277 / G366 / K890 / F1038 / T1102; A203 / N277 / G366 / M763 / K890 / D965 / T1102; A203 / N277 / G366 / M763 / K890 / F1038 / T1102; A203 / N277 / G366 / K890 / D965 / F1038 / T1102; A203 / N277 / G366 / K890 / D965 / F1038 / T1102; A203 / N277 / G366 / K890
  • the TS-SpCas9 is A203 / N277 / G366 / M763 / K890 / T1102 / D1127 of wild-type SpCas9; A203 / N277 / G366 / K890 / D965 / T1102 / D1127; A203 / N277 / G366 / K890 / F1038 / T1102 / D1127; A203 / N277 / G366 / M763 / K890 / D965 / T1102 / D1127; A203 / N277 / G366 / M763 / K890 / F1038 / T1102 / D1127; A203 / N277 / G366 / M763 / K890 / F1038 / T1102 / D1127; A203 / N277 / G366 / K890 / D96
  • the TS-SpCas9 is A203 / N277 / G366 / F539 / M763 / K890 / T1102 of wild-type SpCas9; A203 / N277 / G366 / F539 / K890 / D965 / T1102; A203 / N277 / G366 / F539 / K890 / F1038 / T1102; A203 / N277 / G366 / F539 / M763 / K890 / D965 / T1102; A203 / N277 / G366 / F539 / M763 / K890 / F1038 / T1102; A203 / N277 / G366 / F539 / M763 / K890 / F1038 / T1102; A203 / N277 / G366 / F539 / K8
  • the TS-SpCas9 is A203 / N277 / G366 / F539 / M763 / K890 / T1102 / D1127 of wild-type SpCas9; A203 / N277 / G366 / F539 / K890 / D965 / T1102 / D1127; A203 / N277 / G366 / F539 / K890 / F1038 / T1102 / D1127; A203 / N277 / G366 / F539 / M763 / K890 / D965 / T1102 / D1127; A203 / N277 / G366 / F539 / M763 / K890 / F1038 / T1102 / D1127; A203 / N277 / G366 / F539 / M763 / K890 / F1038 /
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 mutant in which one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the first region, the second region, the third region and / or the fourth region of the wild-type SpCas9 have been removed.
  • the TS-SpCas9 comprises a first region of the wild-type SpCas9 which is selected from the group consisting of N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, L249, L246, L244, L246, L246, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 mutant in which one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the first region, the second region, the third region and / or the fourth region of the wild-type SpCas9 are substituted with another amino acid.
  • the TS-SpCas9 may be a substituted SpCas9 mutant in which one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the first region of the wild-type SpCas9 are substituted with another amino acid.
  • the TS-SpCas9 comprises N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, L244, L246, G247, L248, N251, L224, L224, L224, L224, L224, L224, L222, L224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L338, V339, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376,
  • the TS-SpCas9 is selected from the group consisting of arginine, asparagine, aspartic acid, glutamic acid, glutamine, glycine, histidine, Lysine, proline, serine, threonine, tryptophan, and tyrosine.
  • TS-SpCas9 can be a SpCas9 variant in which A203 (hydrophobic index: 1.8) of the 1-1 region of wild-type SpCas9 is replaced with aspartic acid (hydrophobic index: -3.5), which is a relatively small hydrophobic indicator have.
  • the TS-SpCas9 is selected from the group consisting of arginine, asparagine, aspartic acid, glutamic acid, glutamine, histidine, glutamic acid and glutamic acid, which are relatively small hydrophobic indicators of G366 (hydrophobic index: -0.4) Lysine, proline, serine, threonine, tryptophan, and tyrosine.
  • TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant in which G366 (hydrophobic index: -0.4) of the 1-2 region of wild-type SpCas9 is substituted with serine (hydrophobic index: -0.8), which is a relatively small hydrophobic indicator amino acid have.
  • the TS-SpCas9 is selected from the group consisting of alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glutamine, glutamic acid, and glutamine, which are relatively small hydrophobic indicators of F539 (hydrophobic index: 2.8)
  • TS-SpCas9 may be a SpCas9 mutant in which F539 (hydrophobic index: 2.8) among the first to third regions of wild-type SpCas9 is substituted with serine (hydrophobic index: -0.8), which is a relatively small hydrophobic indicator .
  • the TS-SpCas9 is selected from the group consisting of alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glutamine, glutamic acid, , A glycine, a histidine, a leucine, a lysine, a methionine, a phenylalanine, a proline, a serine, a threonine, a tryptophan, a tyrosine and a valine.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant in which I601 (hydrophobic index: 4.5) of the 1-3 region of the wild-type SpCas9 is replaced with asparagine (hydrophobic index: -3.5), which is a relatively small hydrophobic indicator amino acid .
  • the TS-SpCas9 is selected from the group consisting of A203 (hydrophobic index: 1.8), G366 (hydrophobicity indicator) of the 1-1 region, 1-2 region, 1-3 region and / (Hydrophobic index: -0.4), F539 (hydrophobic index: 2.8), and I601 (hydrophobic index: 4.5) are each substituted with a relatively small hydrophobic index amino acid.
  • the TS-SpCas9 comprises N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, L244, L246, G247, L248, N251, L224, L224, L224, L224, L224, L224, L222, L224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L338, V339, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L338, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376,

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 인위적으로 조작된 CRISPR/Cas9 시스템에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 표적 특이성이 향상된 인위적으로 조작된 CRISPR 효소 및 이를 포함하는 인위적으로 조작된 CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 게놈 및/또는 후생유전자(epigenome)의 조작 또는 변형, 게놈 표적화, 게놈 교정 및 체외 진단 등의 용도에 관한 것이다.

Description

표적 특이적 CRISPR 변이체
본 발명은 인위적으로 조작된 CRISPR/Cas9 시스템에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 표적 특이성이 향상된 인위적으로 조작된 CRISPR 효소 및 이를 포함하는 인위적으로 조작된 CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 게놈 및/또는 후생유전자(epigenome)의 조작 또는 변형, 게놈 표적화, 게놈 교정 및 체외 진단 등의 용도에 관한 것이다.
CRISPR-Cas 시스템은 표적하는 유전자 또는 핵산에 상보적인 서열을 가지는 guide RNA(gRNA)와 표적하는 유전자 또는 핵산을 절단할 수 있는 뉴클레아제인 CRISPR 효소로 구성되며, gRNA와 CRISPR 효소는 CRISPR 복합체를 형성하고, 형성된 CRISPR 복합체에 의해 표적하는 유전자 또는 핵산을 절단 또는 변형시킨다.
하지만 상기와 같은 표적하는 유전자 또는 핵산을 변형시키는 효과와 더불어 원하지 않는 비표적 유전자 또는 핵산을 변형시키는 문제가 아직까지 해결되지 않고 있다. 상기 비표적 유전자 또는 핵산은 gRNA와 일부 상보적인 서열을 가지는 유전자 위치로서, 상기 gRNA와 부분적인 상보적 결합을 형성할 수 있으며, 이러한 부분적인 상보적 결합은 CRISPR 복합체가 해당 유전자 위치, 즉, 변형의 대상이 아닌 비표적 유전자 또는 핵산을 절단 또는 변형시킬 수 있다.
그러므로, CRISPR-Cas 시스템을 이용한 표적하는 유전자 또는 핵산을 특이적으로 변형시키는 효율을 증대하기 위해, 또는 비표적 유전자 또는 핵산의 변형으로 초래될 수 있는 유전적 결합 등의 문제점을 해결하기 위해 CRISPR-Cas 시스템의 표적 특이성을 증가시키는 것이 중요하다. 이러한 CRISPR-Cas 시스템의 표적 특이성을 증가시키기 위해서, 비표적 유전자 후보가 적은 gRNA 선정 및 CRISPR 효소의 활성 및/또는 특이성을 조절하는 등의 다양한 연구가 시도되고 있다.
선행문헌
비특허문헌
(비특허문헌 0001) Kim, D. et al. Nat Methods 12, 237-243, 231 p following 243 (2015)
(비특허문헌 0002) Tsai, S.Q. et al. Nat Biotechnol 33, 187-197 (2015)
(비특허문헌 0003) Kim, S., Kim, D., Cho, S.W., Kim, J. & Kim, J.S. Genome Res 24, 1012-1019 (2014)
(비특허문헌 0004) Cho, S.W. et al. Genome Res 24, 132-141 (2014)
(비특허문헌 0005) Mali, P. et al. Nat Biotechnol 31, 833-838 (2013)
(비특허문헌 0006) Ran, F.A. et al. Cell 154, 1380-1389 (2013)
(비특허문헌 0007) Fu, Y., Sander, J.D., Reyon, D., Cascio, V.M. & Joung, J.K. Nat Biotechnol 32, 279-284 (2014)
(비특허문헌 0008) Nishimasu, H. et al. Cell 156, 935-949 (2014)
(비특허문헌 0009) Kleinstiver, B.P. et al. Nature 529, 490-495 (2016)
(비특허문헌 0010) Slaymaker, I.M. et al. Science 351, 84-88 (2016)
(비특허문헌 0011) Chen, J.S. et al. Nature (2017)
(비특허문헌 0012) Kleinstiver, B.P. et al. Nat Biotechnol 33, 1293-1298 (2015)
(비특허문헌 0013) Kleinstiver, B.P. et al. Nature 523, 481-485 (2015)
(비특허문헌 0014) Chen, Z. & Zhao, H. Nucleic Acids Res 33, e154 (2005)
(비특허문헌 0015) Hsu, P.D. et al. Nat Biotechnol 31, 827-832 (2013)
(비특허문헌 0016) McKenzie, G.J. & Craig, N.L. BMC Microbiol 6, 39 (2006)
(비특허문헌 0017) Kulcsar, P.I. et al. Genome Biol 18, 190 (2017)
(비특허문헌 0018) Zhang, D. et al. Genome Biol 18, 191 (2017)
(비특허문헌 0019) Komor, A.C., Kim, Y.B., Packer, M.S., Zuris, J.A. & Liu, D.R. Nature 533, 420-424 (2016)
(비특허문헌 0020) Kim, D., Kim, S., Park, J. & Kim, J.S. Genome Res 26, 406-415 (2016)
(비특허문헌 0021) Geissmann, Q. PLoS One 8, e54072
본 발명의 일 구체예로서 표적 특이성을 향상된 인위적으로 조작된 CRISPR 효소를 제공하고자 한다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위한 인위적으로 조작된 CRISPR 효소에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 표적 유전자 또는 핵산에 대한 표적 특이성이 향상된 Cas9 및 이를 이용한 CRISPR/Cas9 시스템에 관한 것이다.
본 발명은 특정 목적을 위해 인위적으로 조작된 CRISPR 효소를 제공한다.
구현예에서, 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 인위적인 조작을 포함하는 SpCas9 변이체로서,
상기 인위적인 조작은 야생형(wildtype) 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9(SpCas9)의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 하나 이상의 영역에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 인위적인 조작을 포함하고, 표적 특이성이 향상된 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 야생형(wildtype) SpCas9의 제 1 영역은 가이드 RNA(gRNA)와 상호작용하는 야생형 SpCas9의 일부분; 표적서열과 상호작용하는 야생형 SpCas9의 일부분; gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)과 상호작용하는 야생형 SpCas9의 일부분; 및 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM(Protospacer adjacent motif)과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용하는 야생형 SpCas9의 일부분 중 선택된 하나 이상일 수 있다.
이때, 상기 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM과 먼 말단 부위(PAM distal end)는 PAM 위치에서 멀리 위치한 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 말단의 6 내지 10개의 염기쌍일 수 있다.
이때, 상기 PAM은 5'-NGG-3' 일 수 있다.
상기 야생형(wildtype) SpCas9의 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 핵산 절단 기능을 수행하는 야생형 SpCas9의 일부분일 수 있다.
상기 야생형(wildtype) SpCas9의 제 3 영역은 야생형 SpCas9의 핵산 절단 기능을 수행하는 야생형 SpCas9의 일부분일 수 있다.
상기 야생형(wildtype) SpCas9의 제 4 영역은 표적 유전자 또는 핵산 내의 PAM 서열을 인식하거나 상호작용할 수 있는 야생형 SpCas9의 일부분; 및 gRNA의 일부 뉴클레오타이드 서열과 상호작용하는 야생형 SpCas9의 일부분 중 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 야생형(wildtype) SpCas9의 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 REC 로브(lobe)에 위치한 영역; 야생형 SpCas9의 REC 도메인 전체; 및 야생형 SpCas9의 REC 도메인 일부 중 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 야생형(wildtype) SpCas9의 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 NUC 로브(lobe)에 위치한 영역;
야생형 SpCas9의 RuvC 도메인 전체; 야생형 SpCas9의 RuvC 도메인 일부; 및 야생형 SpCas9의 RuvC 도메인의 메탈 의존적 핵산 절단 부위(metal dependent nucleic acid cleaving region)를 포함하는 RuvC 도메인 일부 중 선택된 하나 이상일 수 있다.
이때, 상기 RuvC 도메인의 메탈 의존적 핵산 절단 부위는 RuvC 도메인에서 메탈과 상호작용에 의해 표적 위치의 핵산간의 결합을 절단할 수 있는 영역일 수 있다.
상기 야생형(wildtype) SpCas9의 제 3 영역은 야생형 SpCas9의 NUC 로브(lobe)에 위치한 영역; 야생형 SpCas9의 HNH 도메인 전체; 야생형 SpCas9의 HNH 도메인 일부; 및 야생형 SpCas9의 HNH 도메인의 메탈 의존적 핵산 절단 부위(metal dependent nucleic acid cleaving region)를 포함하는 HNH 도메인 일부 중 선택된 하나 이상일 수 있다.
이때, 상기 HNH 도메인의 메탈 의존적 핵산 절단 부위는 HNH 도메인에서 메탈과 상호작용에 의해 표적 위치의 핵산간의 결합을 절단할 수 있는 영역일 수 있다.
상기 야생형(wildtype) SpCas9의 제 4 영역은 야생형 SpCas9의 NUC 로브(lobe)에 위치한 영역; 야생형 SpCas9의 PI 도메인 전체; 및 야생형 SpCas9의 PI 도메인 일부 중 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 196번째 페닐알라닌(F196)부터 282번째 아이소류신(I282)까지의 아미노산 서열로 구성된 제 1-1 영역; 316번째 프롤린(P316)부터 394번째 아스파라긴(N394)까지의 아미노산 서열로 구성된 제 1-2 영역; 510번째 라이신(K510)부터 612번째 아스파라긴(N612)까지의 아미노산 서열로 구성된 제 1-3 영역; 및 678번째 트레오닌(T678)부터 698번째 히스티딘(H698)까지의 아미노산 서열로 구성된 제 1-4 영역 중 선택된 하나 이상의 영역을 포함할 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697를 포함할 수 있다.
이때, 상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열로 구성된 제 2-1 영역; 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열로 구성된 제 2-2 영역; 및 926번째 글루타민(Q926)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열로 구성된 제 2-3 영역 중 선택된 하나 이상의 영역을 포함할 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039를 포함할 수 있다.
이때, 상기 제 3 영역은 야생형 SpCas9의 775번째 라이신(K775)부터 900번째 류신(L900)까지의 아미노산 서열로 구성된 제 3-1 영역을 포함할 수 있다.
상기 제 3 영역은 야생형 SpCas9의 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, V838, D839, H840, K848, D849, D850, D853, N854, K855, R859, D861, K862, N863, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, A889, K890, L891, R895, K896 및 D898을 포함할 수 있다.
이때, 상기 제 4 영역은 야생형 SpCas9의 1099번째 글루타민산(E1099)부터 1139번째 발린(V1139)까지의 아미노산 서열로 구성된 제 4-1 영역을 포함할 수 있다.
상기 제 4 영역은 야생형 SpCas9의 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138을 포함할 수 있다.
일 구체예로서, 상기 야생형(wildtype) SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 하나 이상의 영역에서 선택된 하나 이상의 아미노산은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037, F1038, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 야생형(wildtype) SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 하나 이상의 영역에서 선택된 하나 이상의 아미노산은 야생형 SpCas9의 A203, N277, G366, F539, I601, M763, K890, D965, F1038, T1102 및 D1127로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산일 수 있다.
상기 인위적인 조작은 야생형(wildtype) SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 하나 이상의 영역에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거(deletion)일 수 있다.
상기 인위적인 조작은 야생형(wildtype) SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 하나 이상의 영역에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
이때, 상기 다른 아미노산은 야생형(wildtype) SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 하나 이상의 영역에서 선택된 하나 이상의 아미노산에 비해 상대적으로 기능기(functional group)의 크기가 작은 아미노산일 수 있다.
이때, 상기 다른 아미노산은 야생형(wildtype) SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 하나 이상의 영역에서 선택된 하나 이상의 아미노산에 비해 상대적으로 기능기의 크기가 큰 아미노산일 수 있다.
이때, 상기 다른 아미노산은 야생형(wildtype) SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 하나 이상의 영역에서 선택된 하나 이상의 아미노산에 비해 상대적으로 소수성 지표(hydropathy index)가 큰 아미노산일 수 있다.
이때, 상기 다른 아미노산은 야생형(wildtype) SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 하나 이상의 영역에서 선택된 하나 이상의 아미노산에 비해 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산일 수 있다.
구현예에서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 A203, N277, G366, F539, I601, M763, K890, D965, F1038, T1102 및 D1127으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 인위적인 조작을 포함하는 표적 특이적 SpCas9(Target specific SpCas9; TS-SpCas9) 변이체일 수 있다.
상기 인위적인 조작은 야생형 SpCas9의 A203, N277, G366, F539, I601, M763, K890, D965, F1038, T1102 및 D1127으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거 또는 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
이때, 상기 다른 아미노산은 야생형 SpCas9의 A203, N277, G366, F539, I601, M763, K890, D965, F1038, T1102 및 D1127으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산에 비해 상대적으로 기능기의 크기가 크거나 또는 작은 아미노산일 수 있다.
이때, 상기 다른 아미노산은 야생형 SpCas9의 A203, N277, G366, F539, I601, M763, K890, D965, F1038, T1102 및 D1127으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산에 비해 상대적으로 소수성 지표가 크거나 또는 작은 아미노산일 수 있다.
상기 TS-SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 F539의 인위적인 조작을 포함할 수 있다.
상기 TS-SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 M763의 인위적인 조작을 포함할 수 있다.
상기 TS-SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 K890의 인위적인 조작을 포함할 수 있다.
상기 TS-SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 F539과 M763(F539/M763); F539/K890; 또는 M763/K890의 인위적인 조작을 포함할 수 있다.
상기 TS-SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 F539, M763 및 K890의 인위적인 조작을 포함할 수 있다.
구현예에서, 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 상기 TS-SpCas9 변이체를 포함하는 융합 단백질일 수 있다.
상기 융합 단백질은 하나 이상의 기능적(functional) 도메인을 포함할 수 있다.
이때, 상기 기능적(functional) 도메인은 메틸라아제(methylase) 활성, 디메틸라아제(demethylase) 활성, 전사촉진(transcription activation) 활성, 전사 저해(transcription repression) 활성, 전사 방출 인자(transcription release factor) 활성, 히스톤 변형(histone modification) 활성, RNA 절단(cleavage) 활성 또는 핵산 결합(nucleic acid binding) 활성을 가지는 도메인; 단백질(펩타이드 포함)의 분리정제를 위한 태그(tag) 또는 리포터 유전자; NLS(nuclear localization sequence or signal) 또는 NES(nuclear export sequence or signal); 및 디아미네이즈(deaminase)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
구현예에서, 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 상기 SpCas9 변이체, TS-SpCas9 변이체 및/또는 융합 단백질을 암호화하는 핵산의 형태일 수 있다.
구현예에서, 상기 핵산은 벡터에 포함될 수 있다.
구현예에서, 상기 SpCas9 변이체, TS-SpCas9 변이체 및/또는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 및/또는 상기 벡터는 세포에 도입될 수 있다.
구현예에서, 상기 SpCas9 변이체, TS-SpCas9 변이체 및/또는 융합 단백질은 gRNA와 함께 사용하여 세포의 게놈을 인위적으로 조작할 수 있다.
상기 gRNA는 상기 세포의 게놈 내에 존재하는 표적 유전자의 표적 서열에 상보적 결합을 하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산일 수 있다.
본 발명은 인위적으로 조작된 CRISPR 효소를 통해 표적 특이성이 향상된 CRISPR-Cas 시스템을 게놈 및/또는 후생유전자(epigenome)의 조작 또는 변형, 게놈 표적화, 게놈 교정 및 체외 진단 등에 이용할 수 있다.
도 1은 SpCas9의 제 1 영역 변이체에 의한 표적 유전자(DMD 유전자)의 조작 효과 indel(insertion and deletion) %를 나타낸 그래프이다.
도 2는 SpCas9의 제 1 영역 변이체에 의한 표적 유전자(EMX 유전자)의 조작 효과 indel %를 나타낸 그래프이다.
도 3은 SpCas9의 제 1 영역 변이체에 의한 표적 유전자(VEGFA 유전자)의 조작 효과 indel %를 나타낸 그래프이다.
도 4 및 도 5는 SpCas9의 제 2 영역 변이체에 의한 표적 유전자(DMD 유전자)의 조작 효과 indel %를 나타낸 그래프이다.
도 6 및 7은 SpCas9의 제 2 영역 변이체에 의한 표적 유전자(EMX 유전자)의 조작 효과 indel %를 나타낸 그래프이다.
도 8은 SpCas9의 제 2 영역 변이체에 의한 표적 유전자(VEGFA 유전자)의 조작 효과 indel %를 나타낸 그래프이다.
도 9은 SpCas9의 제 2 영역 변이체에 의한 표적 유전자(HBB03 유전자)의 조작 효과 indel %를 나타낸 그래프이다.
도 10은 SpCas9의 제 2 영역 변이체에 의한 표적 유전자(HBB04 유전자)의 조작 효과 indel %를 나타낸 그래프이다.
도 11은 SpCas9의 제 3 영역 변이체에 의한 표적 유전자(DMD 유전자)의 조작 효과 indel %를 나타낸 그래프이다.
도 12은 SpCas9의 제 4 영역 변이체에 의한 표적 유전자(DMD 유전자)의 조작 효과 indel %를 나타낸 그래프이다.
도 13은 SpCas9의 제 4 영역 변이체에 의한 표적 유전자(EMX 유전자)의 조작 효과 indel %를 나타낸 그래프이다.
도 14는 SpCas9의 SpCas9의 4개의 영역 중 2개의 영역에 변이를 가지는 SpCas9 변이체에 의한 표적 유전자(DMD 유전자)의 조작 효과 indel %를 나타낸 그래프이다.
도 15는 SpCas9의 SpCas9의 4개의 영역 중 2개의 영역에 변이를 가지는 SpCas9 변이체에 의한 표적 유전자(EMX 유전자)의 조작 효과 indel %를 나타낸 그래프이다.
도 16은 SpCas9의 SpCas9의 4개의 영역 중 2개의 영역에 변이를 가지는 SpCas9 변이체에 의한 표적 유전자(VEGFA 유전자)의 조작 효과 indel %를 나타낸 그래프이다.
도 17은 SpCas9의 SpCas9의 4개의 영역 중 2개의 영역에 변이를 가지는 SpCas9 변이체에 의한 표적 유전자(HBB03 유전자)의 조작 효과 indel %를 나타낸 그래프이다.
도 18은 SpCas9의 SpCas9의 4개의 영역 중 2개의 영역에 변이를 가지는 SpCas9 변이체에 의한 표적 유전자(HBB04 유전자)의 조작 효과 indel %를 나타낸 그래프이다.
도 19는 SpCas9의 SpCas9의 4개의 영역 중 3개 이상의 영역에 변이를 가지는 SpCas9 변이체에 의한 표적 유전자(DMD 유전자)의 조작 효과 indel %를 나타낸 그래프이다.
도 20는 SpCas9의 SpCas9의 4개의 영역 중 3개 이상의 영역에 변이를 가지는 SpCas9 변이체에 의한 표적 유전자(VEGFA 유전자)의 조작 효과 indel %를 나타낸 그래프이다.
도 21은 SpCas9의 SpCas9의 4개의 영역 중 3개 이상의 영역에 변이를 가지는 SpCas9 변이체에 의한 표적 유전자(HBB03 유전자)의 조작 효과 indel %를 나타낸 그래프이다.
도 22는 SpCas9의 SpCas9의 4개의 영역 중 3개 이상의 영역에 변이를 가지는 SpCas9 변이체에 의한 표적 유전자(HBB04 유전자)의 조작 효과 indel %를 나타낸 그래프이다.
도 23는 SpCas9의 SpCas9의 4개의 영역 중 3개 이상의 영역에 변이를 가지는 SpCas9 변이체에 의한 표적 유전자(DMD 유전자)의 조작 효과 indel %를 나타낸 그래프이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사 또는 동일한 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 이하에 기재된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 다른 참고문헌은 전체가 참고로 포함된다. 추가로, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 태양은 CRISPR 효소에 관한 것이다.
“CRISPR 효소”는 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)-Cas(CRISPR-associated protein) 시스템의 주요 단백질 구성 요소로, guide RNA(gRNA)와 복합체를 형성하여 CRISPR-Cas 시스템을 형성한다.
상기 “gRNA”는 표적 유전자 또는 핵산에 대한 gRNA-CRISPR 효소 복합체, 즉, CRISPR 복합체를 특이적 표적화할 수 있는 RNA를 지칭하며, gRNA는 표적서열에 대한 특이적 RNA로서 CRISPR 효소과 결합하여 CRISPR 효소를 표적 유전자 또는 핵산으로 인도할 수 있다. 이때, 상기 “표적서열”은 표적 유전자 또는 핵산 내에 존재하는 뉴클레오타이드 서열로, 구체적으로는 표적 유전자 또는 핵산 내에 표적 영역의 일부 뉴클레오타이드 서열이며, 이때 “표적 영역”은 표적 유전자 또는 핵산 내에 가이드핵산-에디터단백질에 의해 변형될 수 있는 부위이다.
상기 gRNA는 다수의 도메인을 포함할 수 있다. 각각의 도메인에 의해 3차원 행태 또는 gRNA의 활성 형태의 가닥내 또는 가닥간 상호작용을 할 수 있다.
gRNA는 단일가닥 gRNA(단일 RNA 분자; single gRNA; sgRNA); 또는 이중 gRNA(하나 초과의 통상적으로 2개의 별개의 RNA 분자를 포함함)로서 지칭될 수 있다.
일 구체예에서, 단일가닥 gRNA는 5'으로부터 3' 방향으로 가이드 도메인, 즉 표적 유전자 또는 핵산에 상보적인 결합을 할 수 있는 가이드 서열(guide sequence)를 포함하는 도메인; 제 1 상보적 도메인; 연결 도메인; 제 2 상보적 도메인, 상기 제 1 상보적 도메인 서열에 상보적인 서열을 가지므로 제 1 상보적 도메인과 이중가닥 핵산을 형성할 수 있는 도메인; 근위 도메인(proximal domain); 및 선택적으로 꼬리 도메인을 포함할 수 있다.
다른 일 구체예로서, 이중 gRNA는 5'으로부터 3' 방향으로 가이드 도메인, 즉 표적 유전자 또는 핵산에 상보적인 결합을 할 수 있는 가이드 서열(guide sequence)를 포함하는 도메인 및 제 1 상보적 도메인을 포함하는 제 1가닥; 및 제 2 상보적 도메인, 상기 제 1 상보적 도메인 서열에 상보적인 서열을 가지므로 제 1 상보적 도메인과 이중가닥 핵산을 형성할 수 있는 도메인, 근위 도메인(proximal domain); 및 선택적으로 꼬리 도메인을 포함하는 제 2 가닥을 포함할 수 있다.
이때, 상기 제 1가닥은 crRNA라고 지칭될 수 있고, 상기 제 2가닥은 tracrRNA로 지칭될 수 있다. 상기 crRNA는 가이드 도메인과 제 1 상보적 도메인을 포함할 수 있으며, 상기 tracrRNA는 제 2 상보적 도메인, 근위 도메인 및 선택적으로 꼬리 도메인을 포함할 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 단일가닥 gRNA는 3'으로부터 5' 방향으로 가이드 도메인, 즉 표적 유전자 또는 핵산에 상보적인 결합을 할 수 있는 가이드 서열(guide sequence)를 포함하는 도메인; 제 1 상보적 도메인; 및 제 2 상보적 도메인, 상기 제 1 상보적 도메인 서열에 상보적인 서열을 가지므로 제 1 상보적 도메인과 이중가닥 핵산을 형성할 수 있는 도메인을 포함할 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 CRISPR 효소를 암호화하는 서열을 가지는 핵산 또는 폴리펩타이드(또는 단백질)일 수 있으며, 대표적으로 Type II CRISPR 효소 또는 Type V CRISPR 효소가 많이 사용된다.
상기 CRISPR 효소는 Type II CRISPR 효소일 수 있다.
상기 Type II CRISPR 효소는 Cas9일 수 있다.
이때, 상기 Cas9은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 스타필로코커스 아우레스(Staphylococcus aureus), 노카르디옵시스 다손빌레이(Nocardiopsis dassonvillei), 스트렙토마이세스 프리스티네스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 알리사이클로바클루스 아시도칼다리우스(AlicyclobacHlus acidocaldarius), 바실러스 슈도마이코이데스(Bacillus pseudomycoides), 바실러스 셀레니티레두센스(Bacillus selenitireducens), 엑시구오박테리움 시비리쿰(Exiguobacterium sibiricum), 락토바실러스 델브루에키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 미크로스 킬라 마리나(Microscilla marina), 부르크홀데리아레스 박테리움(Burkholderiales bacterium), 폴라로모나스 나프탈레니보란스(Polaromonas naphthalenivorans), 폴라로모나스 속(Polaromonas sp.), 크로코스파에라 와트소니이(Crocosphaera watsonii), 시아노테세 속(Cyanothece sp.), 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa), 시네코코커스 속(Synechococcus sp.), 아세토할로비움 아라바티쿰(Acetohalobium arabaticum), 암모니펙스 데겐시이(Ammonifex degensii), 칼디셀룰로시럽토 베시이(Caldicelulosiruptor bescii), 칸디다투스 데술포루디스(Candidatus Desulforudis), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile), 피네골디아 마그나(Finegoldia magna), 나트라나에로비우스 써모필러스 (Natranaerobius thermophilus), 펠로토마쿨럼 써모프로피오니쿰(Pelotomaculum thermopropionicum), 아시디티오바실러스 칼두스(Acidithiobacillus caldus), 아시디티오바실러스 페로옥시단스(Acidithiobacillus ferrooxidans), 알로크로마티움 비노숨(Allochromatium vinosum), 마리노박터 속(Marinobacter sp.), 니트로소코커스 할로필러스(Nitrosococcus halophilus), 니트로소코커스 와트소니(Nitrosococcus watsoni), 슈도알테로 모나스 할로플란크티스(Pseudoalteromonas haloplanktis), 크테도노박테르 라세미페르(Ktedonobacter racemifer), 메타노할로비움 에베스티가툼(Methanohalobium evestigatum), 아나베나 바리아빌리스(Anabaena variabilis), 노둘라리아 스푸미게나(Nodularia spumigena), 노스톡 속(Nostoc sp.), 아르트로스피라 맥시마(Arthrospira maxima), 아르트로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 아르트로스피라 속(Arthrospira sp.), 링비아속(Lyngbya sp.), 마이크로콜레우스 크토노플라스테스(Microcoleus chthonoplastes), 오실라토리아 속(Oscillatoria sp.), 페트로토가 모빌리스(Petrotoga mobilis), 써모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus) 또는 아카리오클로리스 마리나(Acaryochloris marina) 등 다양한 미생물 유래의 Cas9일 수 있다.
이때, 상기 Cas9은 자연상태에서 존재하는 미생물에서 분리된 것 또는 재조합적 방법 또는 합성적 방법을 통해 비자연적으로 생산된 것일 수 있다.
Type II CRISPR 효소의 결정 구조는 2종 이상의 자연유래 미생물 Type II CRISPR 효소 분자에 대한 연구(Jinek et al., Science, 343(6176):1247997, 2014) 및 gRNA와 함께 복합체를 이루는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9(SpCas9)에 대한 연구(Nishimasu et al., Cell, 156:935-949, 2014; 및 Anders et al., Nature, 2014, doi: 10.1038/nature13579)를 통해 결정되었다.
상기 Type II CRISPR 효소는 2개의 로브, 즉, 인식(REC) 및 뉴클레아제(NUC) 로브를 포함하며, 각각의 로브는 여러 개의 도메인을 포함한다.
상기 REC 로브는 아르기닌-풍부 브릿지 나선(BH), REC1 도메인 및 REC2 도메인을 포함한다.
이때, 상기 BH 도메인은 긴 α-나선 및 아르기닌 풍부 영역이며, 상기 REC1 및 REC2 도메인은 gRNA 내의 형성되는 이중가닥의, 예를 들어, 단일가닥 gRNA, 이중 gRNA 또는 tracrRNA의 인식에 중요한 역할을 한다.
상기 NUC 로브는 RuvC 도메인, HNH 도메인 및 PAM-상호작용(PI) 도메인을 포함한다. 이때, 상기 RuvC 도메인은 RuvC-유사 도메인을 포괄하는 의미로 사용되고, 또한 상기 HNH 도메인은 HNH-유사 도메인을 포괄하는 의미로 사용된다.
이때, 상기 RuvC 도메인은 Type II CRISPR 효소를 포함하는 자연상태에 존재하는 미생물의 구성원에 대해 구조적으로 유사성을 공유하며, 단일가닥, 예를 들어 표적 유전자 또는 핵산의 비상보성 가닥, 즉, gRNA와 상보적인 결합을 하지 않는 가닥을 절단한다. 상기 RuvC 도메인은 종종 당업계에서 RuvCI 도메인, RuvCII 도메인 및 RuvCIII 도메인으로서, 통상적으로 RuvC I, RuvCII 및 RuvCIII로 지칭된다.
상기 HNH 도메인은 HNH 엔도뉴클레아제와 구조적 유사성을 공유하며, 단일 가닥, 예를 들어 표적 핵산 분자의 상보성 가닥, 즉, gRNA와 상보적인 결합을 하는 가닥을 절단한다. HNH 도메인은 RuvC II와 III 모티프 사이에 위치한다.
상기 PI 도메인은 표적 유전자 또는 핵산 내의 특정 뉴클레오타이드서열, 즉, PAM(Protospacer adjacent motif)을 인식하거나 또는 PAM과 상호작용한다. 이때, 상기 PAM은 Type II CRISPR 효소의 유래(origin)에 따라 다를 수 있다. 예를 들어, CRISPR 효소가 SpCas9 인 경우 PAM은 5'-NGG-3'일 수 있고, 스트렙토코커스 써모필러스 Cas9(StCas9)인 경우 PAM은 5'-NNAGAAW-3'(W = A or T)일 수 있고, 스타필로코커스 아우레스 Cas9(SaCas9)인 경우 PAM은 5'-NNGRR-3'(R = A or G)일 수 있고, 네이세리아 메닝기디티스 Cas9(NmCas9)인 경우 PAM은 5'-NNNNGATT-3'일 수 있고, 캄필로박터 제주니 Cas9(CjCas9)의 경우 PAM은 5'-NNNVRYAC-3' (V = G or C or A, R = A or G, Y = C or T)일 수 있으며, 이때 상기 N은 A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C일 수 있다. 다만, 전술한 효소의 유래에 따라 PAM이 결정되는 것으로 일반적으로 이해되고 있으나, 해당 유래의 효소의 돌연변이(mutant)에 대한 연구가 진행됨에 따라, 상기 PAM은 달라질 수도 있다.
상기 CRISPR 효소는 표적 유전자 또는 핵산의 이중가닥을 절단하는 기능을 가지는 뉴클레아제 또는 제한효소일 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 완전 활성 CRISPR 효소일 수 있다.
"완전 활성"는 야생형(wild type) CRISPR 효소의 기능과 동일한 기능을 가지고 있는 상태를 의미하며, 이러한 상태의 CRISPR 효소를 완전 활성 CRISPR 효소로 명칭한다. 이때, “야생형(wild type) CRISPR 효소의 기능”은 DNA의 이중 가닥을 절단하는 기능, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 제2 기능을 모두 가지는 상태를 말한다.
상기 완전 활성 CRISPR 효소는 DNA의 이중 가닥을 절단하는 야생형 CRISPR 효소일 수 있다.
상기 완전 활성 CRISPR 효소는 DNA의 이중 가닥을 절단하는 야생형 CRISPR 효소를 변형 또는 조작시킨 CRISPR 효소 변이체일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되거나 또는 하나 이상의 아미노산이 제거된 효소일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산이 부가된 효소일 수 있다. 이때, 부가되는 아미노산의 위치는 야생형 효소의 N 말단, C 말단 또는 아미노산 서열 내일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소보다 기능이 향상된 완전 활성 효소일 수 있다.
예를 들면, 야생형 CRISPR 효소의 특정 변형 또는 조작된 형태, 즉, CRISPR 효소 변이체는 절단해야 하는 DNA 이중 가닥과 결합하지 않거나 또는 일정한 거리 간격을 유지한 상태에서 DNA 이중 가닥을 절단할 수 있다. 이러한 경우, 상기 변형 또는 조작된 형태는 야생형 CRISPR 효소보다 기능 활성이 향상된 완전 활성 CRISPR 효소일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소보다 기능이 감소된 완전 활성 CRISPR 효소일 수 있다.
예를 들면, 야생형 CRISPR 효소의 특정 변형 또는 조작된 형태, 즉, CRISPR 효소 변이체는 절단해야 하는 DNA 이중 가닥과 일정 거리이상으로 근접한 상태 또는 특정 결합이 형성된 상태에서 DNA 이중 가닥을 절단할 수 있다. 이때, 특정 결합은, 예를 들어, 효소의 특정 위치의 아미노산과 절단 위치의 DNA 뉴클레오타이드 서열과의 결합일 수 있다. 이러한 경우, 상기 변형 또는 조작된 형태는 야생형 CRISPR 효소보다 기능 활성이 감소된 완전 활성 CRISPR 효소일 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 불완전 또는 부분 활성 CRISPR 효소일 수 있다.
“불완전 또는 부분 활성”은 야생형 CRISPR 효소의 기능, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 제2 기능 중 선택된 하나의 기능을 가지는 상태를 의미한다. 이러한 상태의 CRISPR 효소는 불완전 또는 부분 활성 CRISPR 효소로 명칭한다. 또한 상기 불완전 또는 부분 활성 CRISPR 효소는 니카아제(nickase)로 지칭될 수 있다.
“니카아제(nickase)”는 표적 유전자 또는 핵산의 이중가닥 중 한 가닥만 절단되도록 조작 또는 변형된 CRISPR 효소를 의미하며, 상기 니카아제는 단일가닥, 예를 들어, 표적 유전자 또는 핵산의 gRNA와 비상보성 가닥 또는 상보성 가닥을 절단하는 뉴클레아제 활성을 가진다. 따라서, 이중가닥을 절단하기 위해서는 2개의 니카아제의 뉴클레아제 활성이 필요하다.
상기 니카아제는 CRISPR 효소의 RuvC 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 가질 수 있다. 즉, 상기 니카아제는 CRISPR 효소의 HNH 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 포함하지 않을 수 있으며, 이를 위해 HNH 도메인은 조작 또는 변경될 수 있다.
일 예로, 상기 CRISPR 효소가 Type II CRISPR 효소일 때, 상기 니카아제는 변형된 HNH 도메인을 포함하는 Type II CRISPR 효소일 수 있다.
예를 들어, 상기 Type II CRISPR 효소가 야생형 SpCas9의 경우, 상기 니카아제는 야생형 SpCas9의 아미노산 서열 840번 히스티딘을 알라닌으로 변이(mutation)시켜 HNH 도메인의 뉴클레아제 활성이 불활성화된 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때 생성된 니카아제, 즉, SpCas9 변이체는 RuvC 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 가지므로, 표적 유전자 또는 핵산의 비상보성 가닥, 즉, gRNA와 상보적인 결합을 하지 않는 가닥을 절단할 수 있다.
또 다른 예를 들어, 상기 Type II CRISPR 효소가 야생형 CjCas9의 경우, 상기 니카아제는 야생형 CjCas9의 아미노산 서열 559번 히스티딘을 알라닌으로 변이(mutation)시켜 HNH 도메인의 뉴클레아제 활성이 불활성화된 CjCas9 변이체일 수 있다. 이때 생성된 니카아제, 즉, CjCas9 변이체는 RuvC 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 가지므로, 표적 유전자 또는 핵산의 비상보성 가닥, 즉, gRNA와 상보적인 결합을 하지 않는 가닥을 절단할 수 있다.
또한, 상기 니카아제는 CRISPR 효소의 HNH 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 가질 수 있다. 즉, 상기 니카아제는 CRISPR 효소의 RuvC 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 포함하지 않을 수 있으며, 이를 위해 RuvC 도메인은 조작 또는 변경될 수 있다.
일 예로, 상기 CRISPR 효소가 Type II CRISPR 효소일 때, 상기 니카아제는 변형된 RuvC 도메인을 포함하는 Type II CRISPR 효소일 수 있다.
예를 들어, 상기 Type II CRISPR 효소가 야생형 SpCas9의 경우, 상기 니카아제는 야생형 SpCas9의 아미노산 서열 10번 아스파르트산을 알라닌으로 변이(mutation)시켜 RuvC 도메인의 뉴클레아제 활성이 불활성화된 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때 생성된 니카아제, 즉, SpCas9 변이체는 HNH 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 가지므로, 표적 유전자 또는 핵산의 상보성 가닥, 즉, gRNA와 상보적인 결합을 하는 가닥을 절단할 수 있다.
또 다른 예를 들어, 상기 Type II CRISPR 효소가 야생형 CjCas9의 경우, 상기 니카아제는 야생형 CjCas9의 아미노산 서열 8번 아스파르트산을 알라닌으로 변이(mutation)시켜 RuvC 도메인의 뉴클레아제 활성이 불활성화된 CjCas9 변이체일 수 있다. 이때 생성된 니카아제, 즉, CjCas9 변이체는 HNH 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 가지므로, 표적 유전자 또는 핵산의 상보성 가닥, 즉, gRNA와 상보적인 결합을 하는 가닥을 절단할 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 불활성 CRISPR 효소일 수 있다.
“불활성”은 야생형 CRISPR 효소의 기능, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 제2 기능이 모두 상실된 상태를 의미한다. 이러한 상태의 CRISPR 효소는 불활성 CRISPR 효소로 명칭한다.
상기 불활성 CRISPR 효소는 야생형 CRISPR 효소의 뉴클레아제 활성을 가지는 도메인에 변이로 인한 뉴클레아제 불활성을 가질 수 있다.
상기 불활성 CRISPR 효소는 RuvC 도메인 및 HNH 도메인에 변이로 인한 뉴클레아제 불화성을 가질 수 있다. 즉, 상기 불활성 CRISPR 효소는 CRISPR 효소의 RuvC 도메인 및 HNH 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 포함하지 않을 수 있으며, 이를 위해 RuvC 도메인 및 HNH 도메인은 조작 또는 변경될 수 있다.
일 예로, 상기 CRISPR 효소가 Type II CRISPR 효소일 때, 상기 불활성 CRISPR 효소는 변형된 RuvC 도메인 및 HNH 도메인을 포함하는 Type II CRISPR 효소일 수 있다.
예를 들어, 상기 Type II CRISPR 효소가 야생형 SpCas9의 경우, 상기 불활성 CRISPR 효소는 야생형 SpCas9의 아미노산 서열 10번 아스파르트산과 840번 히스티딘을 모두 알라닌으로 변이(mutation)시켜 RuvC 도메인 및 HNH 도메인의 뉴클레아제 활성이 불활성화된 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때 생성된 불활성 CRISPR 효소, 즉, SpCas9 변이체는 RuvC 도메인 및 HNH 도메인의 뉴클레아제 활성이 불활성 되므로, 표적 유전자 또는 핵산의 이중가닥을 모두 절단할 수 없다.
또 다른 예를 들어, 상기 Type II CRISPR 효소가 야생형 CjCas9의 경우, 상기 불활성 CRISPR 효소는 야생형 CjCas9의 아미노산 서열 8번 아스파르트산과 559번 히스티딘을 모두 알라닌으로 변이(mutation)시켜 RuvC 도메인 및 HNH 도메인의 뉴클레아제 활성이 불활성화된 CjCas9 변이체일 수 있다. 이때 생성된 불활성 CRISPR 효소, 즉, CjCas9 변이체는 RuvC 도메인 및 HNH 도메인의 뉴클레아제 활성이 불활성 되므로, 표적 유전자 또는 핵산의 이중가닥을 모두 절단할 수 없다.
상기 CRISPR 효소는 상기 기재된 뉴클레아제 활성 외에도 헬리카제 활성, 즉, 이중가닥 핵산의 나선 구조를 푸는 기능을 가질 수 있다.
또한, 상기 CRISPR 효소는 CRISPR 효소의 헬리카제 활성에 대해 완전 활성, 불완전 또는 부분 활성, 또는 불활성이 되도록 CRISPR 효소를 변형시킬 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 구체예로서, CRISPR 효소는 인위적으로 조작된 CRISPR 효소일 수 있다.
“인위적으로 조작된(artificially modified or engineered or artificially engineered)”이라는 용어는 자연상태에서 일어나는 존재 그대로의 상태가 아닌, 인위적인 변형을 가하여 생성된 상태를 의미한다. 이때, 상기 인위적인 변형은 CRISPR 효소를 암호화하는 핵산 및/또는 단백질에서 발생될 수 있고, 또한 상기 인위적인 변형은 CRISPR 효소를 암호화하는 핵산에 의해 단백질이 생성되는 과정, 즉, 전사, 전사 후 변형, 변역 및 변역 후 변형 등의 전체 과정에서 발생 가능한 인위적으로 조작할 수 있는 모든 변형을 포함한다. 이하에서, 비자연적인 인위적으로 조작된 또는 변형된 CRISPR 효소는 인위적인 CRISPR 효소 또는 CRISPR 효소 변이체라는 용어와 혼용되어 사용할 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 야생형 CRISPR 효소의 기능, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및/또는 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 제2 기능을 변형시킨 CRISPR 효소 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 기능 중 제1 기능이 상실된 형태일 수 있다.
또는 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 기능 중 제1 기능이 향상된 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 기능 중 제2 기능이 상실된 형태일 수 있다.
또는 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 기능 중 제2 기능이 향상된 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 기능, 즉, 제1 기능 및 제2 기능이 모두 상실된 형태일 수 있다.
또는 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 기능, 즉, 제1 기능 및 제2 기능이 모두 향상된 형태일 수 있다.
또는 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 기능, 즉, 제1 기능은 상실되고 제2 기능은 향상된 형태일 수 있다.
또는 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 기능, 즉, 제1 기능은 향상되고 제2 기능은 상실된 형태일 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 gRNA와 상호작용을 통한 gRNA-CRISPR 효소 복합체 형성할 수 있다.
이때, 상기 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 야생형 CRISPR 효소의 gRNA와 상호작용하는 기능을 변형시킨 CRISPR 효소 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소에 비해 gRNA와의 상호작용이 감소된 형태일 수 있다.
또는 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소에 비해 gRNA의 상호작용이 증가된 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제1 기능을 가지면서 gRNA와의 상호작용이 감소된 형태일 수 있다.
또는 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제1 기능을 가지면서 gRNA와의 상호작용이 증가된 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제2 기능을 가지면서 gRNA와의 상호작용이 감소된 형태일 수 있다.
또는 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제2 기능을 가지면서 gRNA와의 상호작용이 증가된 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제1 기능 및 제2 기능을 가지지 않으면서 gRNA와의 상호작용이 감소된 형태일 수 있다.
또는 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제1 기능 및 제2 기능을 가지지 않으면서 gRNA와의 상호작용이 증가된 형태일 수 있다.
이때, gRNA와 CRISPR 효소 변이체의 상호작용 세기에 따라 다양한 gRNA-CRISPR 효소 복합체가 형성될 수 있고, CRISPR 효소 변이체에 따라 표적 서열에 접근 또는 절단하는 기능에 차이가 생길 수 있다.
예를 들어, gRNA와의 상호작용이 감소된 CRISPR 효소 변이체에 의해 형성된 gRNA-CRISPR 효소 복합체는 gRNA와 완전히 상보적 결합을 하는 표적 서열에 근접 또는 국소화되는 경우에만 오직 표적 서열의 이중가닥 또는 단일가닥을 절단할 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 상기 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 야생형 CRISPR 효소의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 CRISPR 효소 변이체일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 제거시킨 형태일 수 있다.
일 예로, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 양전하를 가지는 아미노산들 중 하나 이상의 아미노산을 제거시킨 형태일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 음전하를 가지는 아미노산들 중 하나 이상의 아미노산을 제거시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 예로, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 전하를 가지지 않는 아미노산들 중 하나 이상의 아미노산을 제거시킨 형태일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 양전하를 가지는 아미노산들, 음전하를 가지는 아미노산들 및 전하를 가지지 않는 아미노산들 중 하나 이상의 아미노산을 제거시킨 형태일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 아미노산 서열 중 선택된 적어도 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시킨 형태일 수 있다.
이때, 상기 다른 아미노산, 즉 치환시킨 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린 중 선택된 하나의 아미노산일 수 있다.
이때, 상기 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린은 각각의 아미노산 및 이에 부가적으로 변형될 수 있는 메틸화(methylation), 아세틸화(acetylation), 인산화(phosphorylation) 등의 화학적으로 변형된 형태를 모두 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 양전하를 가지는 아미노산들 중 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시킨 형태일 수 있다. 이때, 다른 아미노산은 상기 선택된 하나 이상의 아미노산의 입체 이성질체, 양전하를 가지는 다른 아미노산들, 음전하를 가지는 아미노산들 및 전하를 가지지 않는 아미노산들 중 선택된 하나 이상의 아미노산일 수 있다.
다른 일로, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 음전하를 가지는 아미노산들 중 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시킨 형태일 수 있다. 이때, 다른 아미노산은 상기 선택된 하나 이상의 아미노산의 입체 이성질체, 음전하를 가지는 다른 아미노산들, 양전하를 가지는 아미노산들 및 전하를 가지지 않는 아미노산들 중 선택된 하나 이상의 아미노산일 수 있다.
또 다른 일 예로, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 전하를 가지지 않는 아미노산들 중 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시킨 형태일 수 있다. 이때, 다른 아미노산은 상기 선택된 하나 이상의 아미노산의 입체 이성질체, 전하를 가지지 않는 다른 아미노산들, 양전하를 가지는 아미노산들 및 음전하를 가지는 아미노산들 중 선택된 하나 이상의 아미노산일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 양전하를 가지는 아미노산들, 음전하를 가지는 아미노산들 및 전하를 가지지 않는 아미노산들 중 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시킨 형태일 수 있다. 이때, 다른 아미노산은 상기 선택된 하나 이상의 아미노산의 입체 이성질체, 양전하를 가지는 아미노산들, 음전하를 가지는 아미노산들 및 전하를 가지지 않는 아미노산들 중 선택된 하나 이상의 아미노산일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 치환 및 제거시킨 형태일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 상기 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 야생형 CRISPR 효소의 아미노산 서열 내에 적어도 하나 이상의 아미노산이 부가시킨 CRISPR 효소 변이체일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 아미노산 서열과 비교하여 적어도 하나 이상의 아미노산을 부가시킨 형태일 수 있다.
또는 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 아미노산 서열 내에 적어도 하나 이상의 기능적(functional) 도메인을 부가시킨 형태일 수 있다.
이때, 상기 기능적 도메인은 하나 이상이 아미노산으로 구성되며, 펩타이드 또는 폴리펩타이드일 수 있다.
이때, 상기 기능적 도메인은 야생형 CRISPR 효소의 원래 기능, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 제2 기능 이외에 부가적인 기능을 가지는 도메인일 수 있다.
또는 상기 기능적 도메인은 야생형 CRISPR 효소의 원래 기능, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및/또는 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 제2 기능과 유사한 기능을 가지는 도메인일 수 있다.
일 예로, 상기 기능적 도메인은 메틸라아제(methylase) 활성, 디메틸라아제(demethylase) 활성, 전사촉진(transcription activation) 활성, 전사 저해(transcription repression) 활성, 전사 방출 인자(transcription release factor) 활성, 히스톤 변형(histone modification) 활성, RNA 절단(cleavage) 활성 또는 핵산 결합(nucleic acid binding) 활성을 가지는 도메인일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 기능적 도메인은 단백질(펩타이드 포함)의 분리정제를 위한 태그(tag) 또는 리포터 유전자일 수 있다. 이때, 상기 태그는 히스티딘(His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그 및 티오레독신(Trx) 태그 등을 포함하며, 상기 리포터 유전자는 글루타티온-S-트랜스 퍼라제(GST), 호스라디시(horseradish) 과산화효소(HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질(GFP), HcRed, DsRed, 청록색 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP) 및 청색 형광 단백질(BFP)을 포함하는 자가형광 단백질을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.
또 다른 일 예로, 상기 기능적 도메인은 디아미네이즈(deaminase)일 수 있다.
예를 들어, 불완전 또는 부분 CRISPR 효소에 시티딘 디아미네이즈(cytidine deaminase)를 기능적 도메인으로 추가로 포함할 수 있다. 또는 불완전 또는 부분 CRISPR 효소에 아데닌 디아미네이즈(adenine deaminase)를 기능적 도메인으로 추가로 포함할 수 있다.
다른 일 예로, 상기 기능적 도메인은 NLS(nuclear localization sequence or signal) 또는 NES(nuclear export sequence or signal)일 수 있다.
예를 들어, CRISPR 효소는 하나 이상의 NLS를 포함할 수 있다. 이때, 상기 NLS는 CRISPR 효소의 아미노 말단 또는 그 근처; 카르복시 말단 또는 그 근처; 또는 이들의 조합에 하나 이상의 NLS를 포함할 수 있다. 상기 NLS는 하기로부터 유래된 NLS 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다: 아미노산 서열 PKKKRKV를 갖는 SV40 바이러스 대형 T-항원의 NLS; 뉴클레오플라스민(nucleoplasmin)으로부터의 NLS(예를 들어, 서열 KRPAATKKAGQAKKKK를 갖는 뉴클레오플라스민 이분(bipartite) NLS); 아미노산 서열 PAAKRVKLD 또는 RQRRNELKRSP를 갖는 c-myc NLS; 서열 NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY를 갖는 hRNPA1 M9 NLS; 임포틴-알파로부터의 IBB 도메인의 서열 RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV; 마이오마(myoma) T 단백질의 서열 VSRKRPRP 및 PPKKARED; 인간 p53의 서열 POPKKKPL; 마우스 c-abl IV의 서열 SALIKKKKKMAP; 인플루엔자 바이러스 NS1의 서열 DRLRR 및 PKQKKRK; 간염 바이러스 델타 항원의 서열 RKLKKKIKKL; 마우스 Mx1 단백질의 서열 REKKKFLKRR; 인간 폴리(ADP-리보스) 중합효소의 서열 KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK; 및 스테로이드 호르몬 수용체(인간) 글루코코르티코이드의 서열 RKCLQAGMNLEARKTKK.
상기 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 야생형 CRISPR 효소의 특정 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 CRISPR 효소 변이체일 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 야생형 CRISPR 효소의 특정 영역 내에 하나 이상의 아미노산이 부가시킨 CRISPR 효소 변이체일 수 있다.
이때, 상기 야생형 CRISPR 효소의 특정 영역은 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 선택된 하나 이상의 영역일 수 있다.
상기 제 1 영역은 gRNA와 상호작용하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
상기 제 1 영역은 표적서열과 상호작용하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
상기 제 1 영역은 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)과 상호작용하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
상기 제 1 영역은 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
이때, 상기 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM과 먼 말단 부위(PAM distal end)는 PAM 위치에서 멀리 위치한 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 말단의 6 내지 10개의 염기쌍, 즉, gRNA의 6 내지 10개 염기서열과 이와 상보적인 결합을 하는 표적서열의 6 내지 10개 염기서열을 의미할 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 CRISPR 효소의 REC 로브(lobe)에 위치한 영역일 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 CRISPR 효소의 REC 도메인 전체 또는 일부 일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 CRISPR 효소의 제1 기능 또는 제2 기능을 수행하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 CRISPR 효소의 NUC 로브(lobe)에 위치한 영역일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 CRISPR 효소의 RuvC 도메인 전체 또는 일부일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 CRISPR 효소의 RuvC 도메인의 메탈 의존적 핵산 절단 부위(metal dependent nucleic acid cleaving region)를 포함하는 RuvC 도메인 일부 일 수 있다.
이때, 상기 RuvC 도메인의 메탈 의존적 핵산 절단 부위는 RuvC 도메인에서 메탈과 상호작용에 의해 표적 위치의 핵산간의 결합을 절단할 수 있는 영역을 의미할 수 있다.
상기 메탈 의존적 핵산 절단 부위는 메탈과 상호작용하는 부분과 표적 위치의 핵산간의 결합을 절단하는 부분으로 구성될 수 있다.
상기 제 3 영역은 야생형 CRISPR 효소의 제1 기능 또는 제2 기능을 수행하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
상기 제 3 영역은 야생형 CRISPR 효소의 NUC 로브(lobe)에 위치한 영역일 수 있다.
상기 제 3 영역은 야생형 CRISPR 효소의 HNH 도메인 전체 또는 일부일 수 있다.
상기 제 3 영역은 야생형 CRISPR 효소의 HNH 도메인의 메탈 의존적 핵산 절단 부위(metal dependent nucleic acid cleaving region)를 포함하는 HNH 도메인 일부 일 수 있다.
이때, 상기 HNH 도메인의 메탈 의존적 핵산 절단 부위는 HNH 도메인에서 메탈과 상호작용에 의해 표적 위치의 핵산간의 결합을 절단할 수 있는 영역을 의미할 수 있다.
상기 제 4 영역은 표적 유전자 또는 핵산 내의 특정 뉴클레오타이드서열, 즉, PAM(Protospacer adjacent motif)을 인식할 수 있는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
상기 제 4 영역은 표적 유전자 또는 핵산 내의 특정 뉴클레오타이드서열, 즉, PAM(Protospacer adjacent motif)과 상호작용하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
상기 제 4 영역은 gRNA의 일부 뉴클레오타이드 서열과 상호작용하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
상기 제 4 영역은 야생형 CRISPR 효소의 NUC 로브(lobe)에 위치한 영역일 수 있다.
상기 제 4 영역은 야생형 CRISPR 효소의 PI 도메인 전체 또는 일부일 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 선택된 하나 이상의 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 CRISPR 효소 변이체일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역 및 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 2 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 2 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역, 제 2 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 셋 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역, 제 2 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 셋 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 셋 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 셋 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 넷 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 넷 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 상기 하나 이상의 영역에서 선택된 적어도 하나 이상의 아미노산의 변형을 포함할 수 있다.
이때, 상기 변형은 상기 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
이때, 상기 변형은 상기 선택된 하나 이상의 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
일 예로, 상기 다른 아미노산은 상기 선택된 아미노산의 입체 이성질체일 수 있다.
예를 들면, 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역 내에 위치한 L-글루타민을 D-글루타민으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 다른 아미노산은 상기 선택된 아미노산의 소수성 지표(hydropathy index)보다 작은 소수성 지표를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 2 영역 내에 위치한 페닐알라닌(소수성 지표: 2.8)을 소수정 지표가 더 작은 글리신(소수성 지표: -0.4)으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 예로, 상기 다른 아미노산은 상기 선택된 아미노산의 소수성 지표(hydropathy index)보다 큰 소수성 지표를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역 내에 위치한 세린(소수성 지표: -0.8)을 소수정 지표가 더 큰 류신(소수성 지표: 3.8)으로 치환시키는 것일 수 있다.
일 예로, 상기 다른 아미노산은 상기 선택된 아미노산의 기능기(functional group)보다 크기가 작은 기능기를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 3 영역 내에 위치한 발린을 발린의 기능기보다 작은 기능기를 가지는 알라닌으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 다른 아미노산은 상기 선택된 아미노산의 기능기(functional group)보다 크기가 큰 기능기를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 2 영역 내에 위치한 글리신을 글리신의 기능기보다 큰 기능기를 가지는 히스티딘으로 치환시키는 것일 수 있다.
일 예로, 상기 다른 아미노산은 상기 선택된 아미노산의 소수성(hydrophobicity)보다 소수성이 증가된 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역 내에 위치한 아스파라긴(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5)을 트레오닌(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -0.7)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 다른 아미노산은 상기 선택된 아미노산의 소수성(hydrophobicity)보다 소수성이 감소된 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 4 영역 내에 위치한 시스테인(Kyte-Doolittle hydrophobicity: 2.5)을 프롤린(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -1.6)으로 치환시키는 것일 수 있다.
일 예로, 상기 다른 아미노산은 상기 선택된 아미노산보다 크기가 큰 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 3 영역 내에 위치한 라이신(분자량: 146.189)을 트립토판(분자량: 204.228)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 다른 아미노산은 상기 선택된 아미노산보가 크기가 작은 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 2 영역 내에 위치한 페닐알라닌(분자량: 165.192)을 글루타민산(분자량: 147.131)으로 치환시키는 것일 수 있다.
상기 변형은 상기 선택된 하나 이상의 아미노산이 동일한 개수의 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역 내에 위치한 하나의 알라닌을 하나의 글리신으로 치환시키는 것일 수 있다. 또는 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역 내에 위치한 하나의 아르기닌과 제 4 영역 내에 위치한 하나의 히스티딘을 하나의 류신(제 1 영역)과 하나의 세린(제 4 영역)으로 각각 치환시키는 것일 수 있다. 또는 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 2 영역 내에 위치한 하나의 아르기닌과 하나의 발린 및 제 3 영역 내에 위치한 하나의 류신을 각각 하나의 페닐알라닌, 즉 총 세 개의 페닐알라닌으로 치환시키는 것일 수 있다.
상기 변형은 상기 선택된 하나 이상의 아미노산이 동일하지 않은 개수의 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 2 영역 내에 위치한 하나의 류신을 시스테인-알라닌-알라닌, 즉, 총 세 개의 아미노산들로 치환시키는 것일 수 있다. 또는 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역 내에 위치한 하나의 히스티딘과 제 3 영역에 위치한 연속된 두 개의 아미노산인 알라닌-글루타민을 각각 메티오닌-발린(제 1 영역) 및 프롤린(제 3 영역)으로 치환시키는 것일 수 있다. 또는 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역 내에 위치한 하나의 글루타민산, 제 2 영역 내에 위치한 연속된 세 개의 아미노산인 알라닌-류신-히스티딘 및 제 3 영역 내에 위치한 연속된 두 개의 아미노산인 트립토판-세린을 각각 알라닌(제 1 영역), 메티오닌-프롤린(제 2 영역) 및 시스테인-알라닌-트레오닌-발린(제 3 영역)으로 치환시키는 것일 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 선택된 하나 이상의 영역 내에 적어도 하나 이상의 아미노산을 부가시킨 CRISPR 효소 변이체일 수 있다.
이때, 상기 부가는 상기 선택된 하나 이상의 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 하나 이상의 아미노산의 부가일 수 있다.
일 예로, 상기 부가는 상기 선택된 하나 이상의 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 하나 이상의 양전하를 가지는 아미노산의 부가일 수 있다.
예를 들어, 상기 부가는 제 1 영역 내에 위치한 선택된 하나의 알라닌의 C-말단에 하나의 아르기닌을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 제 3 영역 내에 위치한 선택된 글루타민산의 N-말단에 두 개의 아미노산들인 히스티딘-라이신을 부가시킨 것일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 부가는 상기 선택된 하나 이상의 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 하나 이상의 음전하를 가지는 아미노산의 부가일 수 있다.
예를 들어, 상기 부가는 제 2 영역 내에 위치한 선택된 하나의 트레오닌의 N-말단에 하나의 아스파르트산을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 제 4 영역 내에 위치한 선택된 히스티딘의 C-말단에 세 개의 아미노산들인 글루타민산-아스파르트산-글루타민산을 부가시킨 것일 수 있다.
또 다른 일 예로, 상기 부가는 상기 선택된 하나 이상의 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 하나 이상의 전하를 가지지 않는 아미노산의 부가일 수 있다.
예를 들어, 상기 부가는 제 2 영역 내에 위치한 선택된 하나의 시스테인의 C-말단에 두 개의 아미노산들인 세린-발린을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 제 3 영역 내에 위치한 선택된 라이신의 N-말단에 다섯 개의 아미노산들인 글리신-프롤린-글루타민-페닐알라닌-류신을 부가시킨 것일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 부가는 상기 선택된 하나 이상의 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 양전하를 가지는 아미노산들, 음전하를 가지는 아미노산들 및 전하를 가지지 않는 아미노산들 중 선택된 하나 이상의 아미노산의 부가일 수 있다.
예를 들어, 상기 부가는 제 1 영역 내에 위치한 선택된 하나의 아르기닌의 C-말단에 여섯 개의 아미노산들인 히스티딘-아르기닌-글리신-세린-알라닌-글루타민산을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 제 4 영역 내에 위치한 선택된 하나의 글리신의 N-말단에 열 개의 아미노산들인 라이신-라이신-알라닌-페닐알라닌-글루타민-트레오닌-메티오닌-시스테인-아스파르트산-세린을 부가시킨 것일 수 있다.
상기 부가는 상기 선택된 하나 이상의 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 하나 이상의 기능적(functional) 도메인의 부가일 수 있다.
이때, 상기 기능적 도메인은 야생형 CRISPR 효소의 원래 기능, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 제2 기능 이외에 부가적인 기능을 가지는 도메인일 수 있다.
또는 상기 기능적 도메인은 야생형 CRISPR 효소의 원래 기능, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및/또는 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 제2 기능과 유사한 기능을 가지는 도메인일 수 있다.
일 예로, 상기 기능적 도메인은 메틸라아제(methylase) 활성, 디메틸라아제(demethylase) 활성, 전사촉진(transcription activation) 활성, 전사 저해(transcription repression) 활성, 전사 방출 인자(transcription release factor) 활성, 히스톤 변형(histone modification) 활성, RNA 절단(cleavage) 활성 또는 핵산 결합(nucleic acid binding) 활성을 가지는 도메인일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 기능적 도메인은 단백질(펩타이드 포함)의 분리정제를 위한 태그(tag) 또는 리포터 유전자일 수 있다. 이때, 상기 태그는 히스티딘(His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그 및 티오레독신(Trx) 태그 등을 포함하며, 상기 리포터 유전자는 글루타티온-S-트랜스 퍼라제(GST), 호스라디시(horseradish) 과산화효소(HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질(GFP), HcRed, DsRed, 청록색 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP) 및 청색 형광 단백질(BFP)을 포함하는 자가형광 단백질을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.
또 다른 일 예로, 상기 기능적 도메인은 디아미네이즈(deaminase)일 수 있다. 이때, 상기 디아미네이즈는 아데닌 디아미네이즈(adenine deaminase) 및/또는 시티딘 디아미네이즈(cytidine deaminase)일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 기능적 도메인은 NLS(nuclear localization sequence or signal) 또는 NES(nuclear export sequence or signal)일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 구현예에서, 상기 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 인위적으로 조작된 Cas9일 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 Cas9은 야생형 Cas9의 특정 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 Cas9 변이체일 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 Cas9은 야생형 Cas9의 특정 영역 내에 적어도 하나 이상의 아미노산을 부가시킨 Cas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 야생형 Cas9의 특정 영역은 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 선택된 하나 이상의 영역일 수 있다.
상기 제 1 영역은 gRNA와 상호작용하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
상기 제 1 영역은 표적서열과 상호작용하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
상기 제 1 영역은 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)과 상호작용하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
상기 제 1 영역은 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
이때, 상기 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM과 먼 말단 부위(PAM distal end)는 PAM 위치에서 멀리 위치한 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 말단의 6 내지 10개의 염기쌍, 즉, gRNA의 6 내지 10개 염기서열과 이와 상보적인 결합을 하는 표적서열의 6 내지 10개 염기서열을 의미할 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 Cas9의 REC 로브(lobe)에 위치한 영역일 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 Cas9의 REC 도메인 전체 또는 일부 일 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 Cas9의 REC 도메인의 C 말단의 300개의 아미노산으로 이루어진 영역일 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 Cas9의 REC 도메인의 N 말단의 220개의 아미노산으로 이루어진 영역일 수 있다.
일 예로, 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9(서열번호 1)의 경우,
상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 94번째 아스파르트산(D94)부터 717번째 글리신(G717)까지의 아미노산 서열 전체 또는 일부일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 196번째 페닐알라닌(F196)부터 282번째 아이소류신(I282)까지의 아미노산 서열(제 1-1 영역, 서열번호 2)일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 316번째 프롤린(P316)부터 394번째 아스파라긴(N394)까지의 아미노산 서열(제 1-2 영역, 서열번호 3)일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 510번째 라이신(K510)부터 612번째 아스파라긴(N612)까지의 아미노산 서열(제 1-3 영역, 서열번호 4)일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 678번째 트레오닌(T678)부터 698번째 히스티딘(H698)까지의 아미노산 서열(제 1-4 영역, 서열번호 5)일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 196번째 페닐알라닌(F196)부터 282번째 아이소류신(I282)까지의 아미노산 서열(제 1-1 영역), 316번째 프롤린(P316)부터 394번째 아스파라긴(N394)까지의 아미노산 서열(제 1-2 영역), 510번째 라이신(K510)부터 612번째 아스파라긴(N612)까지의 아미노산 서열(제 1-3 영역) 및 678번째 트레오닌(T678)부터 698번째 히스티딘(H698)까지의 아미노산 서열(제 1-4 영역) 중 선택된 두 개의 영역일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 196번째 페닐알라닌(F196)부터 282번째 아이소류신(I282)까지의 아미노산 서열(제 1-1 영역), 316번째 프롤린(P316)부터 394번째 아스파라긴(N394)까지의 아미노산 서열(제 1-2 영역), 510번째 라이신(K510)부터 612번째 아스파라긴(N612)까지의 아미노산 서열(제 1-3 영역) 및 678번째 트레오닌(T678)부터 698번째 히스티딘(H698)까지의 아미노산 서열(제 1-4 영역) 중 선택된 세 개의 영역일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 196번째 페닐알라닌(F196)부터 282번째 아이소류신(I282)까지의 아미노산 서열(제 1-1 영역), 316번째 프롤린(P316)부터 394번째 아스파라긴(N394)까지의 아미노산 서열(제 1-2 영역), 510번째 라이신(K510)부터 612번째 아스파라긴(N612)까지의 아미노산 서열(제 1-3 영역) 및 678번째 트레오닌(T678)부터 698번째 히스티딘(H698)까지의 아미노산 서열(제 1-4 영역)일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 야생형 Cas9이 야생형 SaCas9의 경우,
상기 제 1 영역은 야생형 SaCas9의 75번째 아스파라긴(N75)부터 426번째 라이신(K426)까지의 아미노산 서열 전체 또는 일부일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 1 영역은 야생형 SaCas9의 207번째 트레오닌(T207)부터 426번째 라이신(K426)까지의 아미노산 서열일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 Cas9의 제1 기능 또는 제2 기능을 수행하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 Cas9의 NUC 로브(lobe)에 위치한 영역일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 Cas9의 RuvC 도메인 전체 또는 일부일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 Cas9의 RuvC 도메인의 메탈 의존적 핵산 절단 부위(metal dependent nucleic acid cleaving region)를 포함하는 RuvC 도메인 일부 일 수 있다.
이때, 상기 RuvC 도메인의 메탈 의존적 핵산 절단 부위는 RuvC 도메인에서 메탈과 상호작용에 의해 표적 위치의 핵산간의 결합을 절단할 수 있는 영역을 의미할 수 있다.
상기 메탈 의존적 핵산 절단 부위는 메탈과 상호작용하는 부분과 표적 위치의 핵산간의 결합을 절단하는 부분으로 구성될 수 있다.
일 예로, 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 59번째 알라닌(A59)까지의 아미노산 서열(RuvC I 영역)의 전체 또는 일부일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 718번째 아스파르트산(D718)부터 774번째 글루타민(Q774)까지의 아미노산 서열(RuvC II 영역)의 전체 또는 일부일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 909번째 세린(S909)부터 1098번째 트레오닌(T1098)까지의 아미노산 서열(RuvC III 영역)의 전체 또는 일부일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 RuvC I 영역, RuvC II 영역 및/또는 RuvC III 영역 일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역, 서열번호 6)일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역, 서열번호 7)일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 926번째 글루타민(Q926)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역, 서열번호 8)일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역) 및 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역)일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역) 및 926번째 글루타민(Q926)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역)일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역) 및 926번째 글루타민(Q926)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역)일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역), 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역) 및 926번째 글루타민(Q926)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역)일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 야생형 Cas9이 야생형 SaCas9의 경우,
상기 제 2 영역은 야생형 SaCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 41번째 발린(V41)까지의 아미노산 서열(RuvC I 영역)의 전체 또는 일부일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SaCas9의 436번째 아이소류신(I436)부터 481번째 글루타민산(E481)까지의 아미노산 서열(RuvC II 영역)의 전체 또는 일부일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SaCas9의 651번째 타이로신(Y651)부터 775번째 발린(V775)까지의 아미노산 서열(RuvC III 영역)의 전체 또는 일부일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SaCas9의 RuvC I 영역, RuvC II 영역 및/또는 RuvC III 영역 일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SaCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 25번째 트레오닌(T25)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역)일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SaCas9의 471번째 프롤린(P471)부터 481번째 글루타민산(E481)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역)일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SaCas9의 667번째 아스파라긴(N667)부터 740번째 세린(S740)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역)일 수 있다.
상기 제 3 영역은 야생형 Cas9의 제1 기능 또는 제2 기능을 수행하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
상기 제 3 영역은 야생형 Cas9의 NUC 로브(lobe)에 위치한 영역일 수 있다.
상기 제 3 영역은 야생형 Cas9의 HNH 도메인 전체 또는 일부일 수 있다.
상기 제 3 영역은 야생형 Cas9의 HNH 도메인의 메탈 의존적 핵산 절단 부위(metal dependent nucleic acid cleaving region)를 포함하는 HNH 도메인 일부 일 수 있다.
이때, 상기 HNH 도메인의 메탈 의존적 핵산 절단 부위는 HNH 도메인에서 메탈과 상호작용에 의해 표적 위치의 핵산간의 결합을 절단할 수 있는 영역을 의미할 수 있다.
일 예로, 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 제 3 영역은 야생형 SpCas9의 775번째 라이신(K775)부터 908번째 류신(L908)까지의 아미노산 서열의 전체 또는 일부일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 3 영역은 야생형 SpCas9의 775번째 라이신(K775)부터 900번째 류신(L900)까지의 아미노산 서열(제 3-1 영역, 서열번호 9)일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 야생형 Cas9이 야생형 SaCas9의 경우,
상기 제 3 영역은 야생형 SaCas9의 521번째 아이소류신(I521)부터 629번째 글루타민산(E629)까지의 아미노산 서열의 전체 또는 일부일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 3 영역은 야생형 SaCas9의 523번째 라이신(K523)부터 627번째 류신(L627)까지의 아미노산 서열(제 3-1 영역)일 수 있다.
상기 제 4 영역은 표적 유전자 또는 핵산 내의 특정 뉴클레오타이드서열, 즉, PAM(Protospacer adjacent motif)을 인식할 수 있는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
상기 제 4 영역은 표적 유전자 또는 핵산 내의 특정 뉴클레오타이드서열, 즉, PAM(Protospacer adjacent motif)과 상호작용하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
상기 제 4 영역은 gRNA의 일부 뉴클레오타이드 서열과 상호작용하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
상기 제 4 영역은 야생형 Cas9의 NUC 로브(lobe)에 위치한 영역일 수 있다.
상기 제 4 영역은 야생형 Cas9의 PI 도메인 전체 또는 일부 일 수 있다.
일 예로, 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 제 4 영역은 야생형 SpCas9의 1099번째 글루타민산(E1099)부터 1368번째 아스파르트산(D1368)까지의 아미노산 서열의 전체 또는 일부일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 4 영역은 야생형 SpCas9의 1099번째 글루타민산(E1099)부터 1139번째 발린(V1139)까지의 아미노산 서열(제 4-1 영역, 서열번호 10)일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 야생형 Cas9이 야생형 SaCas9의 경우,
상기 제 4 영역은 야생형 SaCas9의 910번째 라이신(K910)부터 1053번째 글리신(G1053)까지의 아미노산 서열의 전체 또는 일부일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 4 영역은 야생형 SaCas9의 910번째 라이신(K910)부터 970번째 아스파르트산(D970)까지의 아미노산 서열(제 4-1 영역)일 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 Cas9은 야생형 Cas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 선택된 하나 이상의 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 Cas9 변이체일 수 있다.
상기 Cas9 변이체는 야생형 Cas9의 제 1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 지방족(aliphatic) 또는 아마이드(amide) 계열의 기능기를 가지는 아미노산들, 즉, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281 및 I282 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391 및 L393로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588 및 I601으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606 및 L607로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 중 N692, M694, Q695 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 선택된 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역 내에 위치할 수 있다. 또는 선택된 둘 이상의 아미노산은 같은 영역 내에 위치할 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 중 A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 중 K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 선택된 셋 이상의 아미노산은 각각 다른 영역 내에 위치할 수 있다. 또는 선택된 셋 이상의 아미노산은 같은 영역 내에 위치할 수 있다. 또는 선택된 셋 이상의 아미노산은 각각 같거나 다른 영역 내에 위치할 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 중 A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 중 A203, N277, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 중 G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 Cas9 변이체는 야생형 Cas9의 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11 및 G12로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20 및 I21로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 I761, E762, M763, R765, E766 및 N767로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763 및 A764로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 중 D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 2-2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 선택된 둘 이상의 아미노산은 각각 제 2-1 영역 및 제 2-2 영역 내에 위치할 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 2-2 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766 및 N767로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 2-2 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763 및 A764로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 선택된 둘 이상의 아미노산은 각각 제 2-1 영역 및 제 2-3 영역 내에 위치할 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 2-3 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 2-3 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 및 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 선택된 둘 이상의 아미노산은 각각 제 2-2 영역 및 제 2-3 영역 내에 위치할 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 및 제 2-3 영역 중 I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 및 제 2-3 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038으로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 선택된 셋 이상의 아미노산은 각각 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및 제 2-3 영역 내에 위치할 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및 제 2-3 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및 제 2-3 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 Cas9 변이체는 야생형 Cas9의 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 및 L891로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 전하(charge)를 가지는 아미노산들, 즉, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 Cas9 변이체는 야생형 Cas9의 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 Cas9 변이체는 야생형 Cas9의 제 1 영역 및 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 및 제 2-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 및 제 2-1 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281 및 I282로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 및 제 2-2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 및 제 2-2 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, I761, E762, M763, R765, E766 및 N767로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 및 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1영역 및 제 2-3 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 및 제 2-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 및 제 2-1 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391 및 L393로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 및 제 2-1 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391 및 L393로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 및 제 2-2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 및 제 2-2 영역 중 P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, I761, E762, M763, R765, E766 및 N767로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 및 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2영역 및 제 2-3 영역 중 P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 2-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 2-1 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588 및 I601로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 2-1 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606 및 L607로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 2-2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 2-2 영역 중 K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, I761, E762, M763, R765, E766 및 N767로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 2-2 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763 및 A764으로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 2-3 영역 중 K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 2-3 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 2-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 2-1 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, N692, M694, Q695 및 H698로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 2-1 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 2-2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 2-2 영역 중 N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766 및 N767로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 2-2 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763 및 A764으로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 2-3 영역 중 N692, M694, Q695, H698, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 2-3 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
이때, 상기 제 1 영역은 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 2 영역은 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및 제 2-3 영역일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 2 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 2 영역 중 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 Cas9 변이체는 야생형 Cas9의 제 1 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 및 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 및 제 3-1 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 및 L891로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 및 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391 및 L393; 및 제 3-1 영역 중 전하를 가지는 아미노산들, 즉, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 3-1 영역 중 K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 및 L891로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606 및 L607; 및 제 3-1 영역 중 전하를 가지는 아미노산들, 즉, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 3-1 영역 중 N692, M694, Q695, H698, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 및 L891로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697; 및 제 3-1 영역 중 전하를 가지는 아미노산들, 즉, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
이때, 상기 제 1 영역은 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 3 영역은 제 3-1 영역일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 3 영역 중 A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 및 L891로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 3 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 Cas9 변이체는 야생형 Cas9의 제 1 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 및 제 3-1 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 및 제 4-1 영역 중 P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 4-1 영역 중 K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606 및 L607; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 4-1 영역 중 N692, M694, Q695, H698, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
이때, 상기 제 1 영역은 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 4 영역은 제 4-1 영역일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 4 영역 중 A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 Cas9 변이체는 야생형 Cas9의 제 2 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 3-1 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 및 L891로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20 및 I21; 및 제 3-1 영역 중 전하를 가지는 아미노산들, 즉, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 및 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 및 제 3-1 영역 중 I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 및 L891로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763 및 A764; 및 제 3-1 영역 중 전하를 가지는 아미노산들, 즉, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 및 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 및 제 3-1 영역 중 V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038; 및 제 3-1 영역 중 전하를 가지는 아미노산들, 즉, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
이때, 상기 제 2 영역은 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및 제 2-3 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 3 영역은 제 3-1 영역일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2 영역 및 제 3 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, Y981, H982, H983, A984, H985, D965, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2 영역 및 제 3 영역 중 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 Cas9 변이체는 야생형 Cas9의 제 2 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 4-1 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20 및 I21; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 및 제 4-1 영역 중 I761, E762, M763, R765, E766, N767, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763 및 A764; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 및 제 4-1 영역 중 D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
이때, 상기 제 2 영역은 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및 제 2-3 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 4 영역은 제 4-1 영역일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2 영역 및 제 4 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2 영역 및 제 4 영역 중 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1038, Y1039, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 Cas9 변이체는 야생형 Cas9의 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 및 제 4-1 영역 중 V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 전하를 가지는 아미노산들, 즉, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 Cas9 변이체는 야생형 Cas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 셋 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 셋 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
이때, 상기 제 1 영역은 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 2 영역은 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및 제 2-3 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 3 영역은 제 3-1 영역일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역 및 제 3 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역 및 제 3 영역 중 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
이때, 상기 제 1 영역은 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 2 영역은 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및 제 2-3 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 4 영역은 제 4-1 영역일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역 및 제 4 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 및 D1127로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역 및 제 4 영역 중 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037, F1038, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
이때, 상기 제 1 영역은 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 3 영역은 제 3-1 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 4 영역은 제 4-1 영역일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, T1102 및 D1127로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
이때, 상기 제 2 영역은 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및 제 2-3 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 3 영역은 제 3-1 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 4 영역은 제 4-1 영역일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 및 D1127로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037, F1038, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 Cas9 변이체는 야생형 Cas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 넷 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 넷 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 넷 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 넷 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
이때, 상기 제 1 영역은 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 2 영역은 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및 제 2-3 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 3 영역은 제 3-1 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 4 영역은 제 4-1 영역일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 및 D1127로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037, F1038, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 Cas9 변이체는 상기 하나 이상의 영역에서 선택된 적어도 하나 이상의 아미노산의 변형을 포함할 수 있다.
이때, 상기 변형은 상기 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및/또는 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역, 제 1-4 영역 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역, 제 3-1 영역 및/또는 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037, F1038, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
이때, 상기 변형은 상기 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
일 예로, 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 입체 이성질체로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 입체 이성질체로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 야생형 SpCas9의 510번째 라이신(K510)이 L-라이신인 경우, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 510번째 라이신(K510)을 D-라이신으로 치환시키는 것일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 539번째 페닐알라닌(F539, 소수성 지표: 2.8)을 상대적으로 소수성 지표가 더 작은 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환시키는 것일 수 있다. 또는 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 601번째 아이소류신(I601, 소수성 지표: 4.5)을 상대적으로 소수성 지표가 더 작은 아스파라긴(소수성 지표: -3.5)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 277번째 아스파라긴(N277, 소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 더 큰 히스티딘(소수성 지표: -3.2)으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 크거나 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 작은 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 작은 기능기를 가지는 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 539번째 페닐알라닌(F539)을 상대적으로 크기가 작은 기능기를 가지는 세린으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 203번째 알라닌(A203)을 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 아스파르트산으로 치환시키는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 366번째 글리신(G366)을 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 세린으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 크거나 작은 기능기를 가지는 아미노산일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성(hydrophobicity)이 감소된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 감소된 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 539번째 페닐알라닌(F539, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 2.8) 및 601번째 아이소류신(I601, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 4.5)을 각각 상대적으로 소수성이 더 감소된 세린(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -0.8) 및 아스파라긴(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 277번째 아스파라긴(N277, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5) 및 682번째 페닐알라닌(F682, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 2.8)을 각각 상대적으로 소수성이 증가된 히스티딘(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.2) 및 발린(Kyte-Doolittle hydrophobicity: 4.2)으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 감소하거나 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및/또는 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 입체 이성질체로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 입체 이성질체로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 야생형 SpCas9의 12번째 글리신(G12)이 L-글리신인 경우, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 12번째 글리신(G12)을 D-글리신으로 치환시키는 것일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및/또는 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 1038번째 페닐알라닌(F1038, 소수성 지표: 2.8)을 상대적으로 소수성 지표가 더 작은 타이로신(소수성 지표: -1.3)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및/또는 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 763번째 메티오닌(M763, 소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 더 큰 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시키는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 965번째 아스파르트산(D965, 소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 더 큰 타이로신(소수성 지표: -1.3)으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및/또는 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 크거나 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및/또는 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 작은 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 작은 기능기를 가지는 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 763번째 메티오닌(M763)을 상대적으로 크기가 작은 기능기를 가지는 아이소류신으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및/또는 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 큰 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 1038번째 페닐알라닌(F1038)을 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 타이로신으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및/또는 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 크거나 작은 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및/또는 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 감소된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 감소된 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 761번째 아이소류신(I761, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 4.5) 및 1038번째 페닐알라닌(F1038, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 2.8)을 각각 상대적으로 소수성이 감소된 메티오닌(Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.9) 및 타이로신(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -1.3)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및/또는 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 763번째 메티오닌(M763, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.9) 및 932번째 알라닌(A932, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.8)을 각각 상대적으로 소수성이 증가된 아이소류신(Kyte-Doolittle hydrophobicity: 4.5) 및 시스테인(Kyte-Doolittle hydrophobicity: 2.5)으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및/또는 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 감소되거나 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 입체 이성질체로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 및 L891로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 입체 이성질체로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 야생형 SpCas9의 853번째 아스파르트산(D853)이 L-아스파르트산인 경우, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 853번째 아스파르트산(D853)을 D-아스파르트산으로 치환시키는 것일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 및 L891로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 862번째 라이신(K862, 소수성 지표: -3.9)을 상대적으로 소수성 지표가 더 작은 아르기닌(소수성 지표: -4.5)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 및 L891로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 890번째 라이신(K890, 소수성 지표: -3.9)을 상대적으로 소수성 지표가 더 큰 아스파라긴(소수성 지표: -3.5)으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 크거나 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 작은 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 및 L891로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 작은 기능기를 가지는 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 890번째 라이신(K890)을 상대적으로 크기가 작은 기능기를 가지는 아스파라긴으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 큰 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 및 L891로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 863번째 아스파라긴(N863)을 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 아르기닌으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 크거나 작은 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 감소된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 감소된 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 779번째 글루타민산(E779, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5) 및 862번째 라이신(K862, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.9)을 각각 상대적으로 소수성이 감소된 라이신(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.9) 및 아르기닌(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -4.5)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 827번째 글루타민산(E827, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5) 및 890번째 라이신(K890, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.9)을 각각 상대적으로 소수성이 증가된 메티오닌(Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.9) 및 아스파라긴(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5)으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 감소되거나 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 입체 이성질체로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 입체 이성질체로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 야생형 SpCas9의 1127번째 아스파르트산(D1127)이 L-아스파르트산인 경우, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 1127번째 아스파르트산(D1127)을 D-아스파르트산으로 치환시키는 것일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 1102번째 트레오닌(T1102, 소수성 지표: -0.7)을 상대적으로 소수성 지표가 더 작은 프롤린(소수성 지표: -1.6)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 1106번째 세린(S1106, 소수성 지표: -0.8)을 상대적으로 소수성 지표가 더 큰 글리신(소수성 지표: -0.4)으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 크거나 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 작은 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 작은 기능기를 가지는 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 1102번째 트레오닌(T1102)을 상대적으로 크기가 작은 기능기를 가지는 프롤린으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 큰 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 1127번째 아스파르트산(D1127)을 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 글루타민산으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 크거나 작은 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 감소된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 감소된 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 1102번째 글루트레오닌(T1102, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -0.7)을 상대적으로 소수성이 감소된 프롤린(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -1.6)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 1108번째 글루타민산(E1108, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5)을 상대적으로 소수성이 증가된 메티오닌(Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.9)으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 감소되거나 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역, 제 1-4 영역 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역, 제 3-1 영역 및/또는 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각의 입체 이성질체로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 및 D1127로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각의 입체 이성질체로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 야생형 SpCas9의 8번째 글리신(G8)이 L-글리신이고 767번째 아스파라긴(N767)이 L-아스파라긴인 경우, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 8번째 글리신(G8) 및 767번째 아스파라긴(N767)을 각각 D-글리신 및 D-아스파라긴으로 치환시키는 것일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역, 제 1-4 영역 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역, 제 3-1 영역 및/또는 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 및 D1127로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 203번째 알라닌(A203, 소수성 지표: 1.8) 및 539번째 페닐알라닌(F539, 소수성 지표: 2.8)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 더 작은 아스파르트산(소수성 지표: -3.5) 및 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환시키는 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037, F1038, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 601번째 아이소류신(I601, 소수성 지표: 4.5) 및 1102번째 트레오닌(T1102, 소수성 지표: -0.7)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 더 작은 아스파라긴(소수성 지표: -3.5) 및 프롤린(소수성 지표: -1.6)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역, 제 1-4 영역 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역, 제 3-1 영역 및/또는 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 및 D1127로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 277번째 아스파라긴(N277, 소수성 지표: -3.5) 및 840번째 히스티딘(H840, 소수성 지표: -3.2)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 더 큰 히스티딘(소수성 지표: -3.2) 및 알라닌(소수성 지표: 1.8)으로 치환시키는 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037, F1038, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 763번째 메티오닌(M763, 소수성 지표: 1.9) 및 890번째 라이신(K890, 소수성 지표: -3.9)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 더 큰 아이소류신(소수성 지표: 4.5) 및 아스파라긴(소수성 지표: -3.5)으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역, 제 1-4 영역 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역, 제 3-1 영역 및/또는 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성 지표가 크거나 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 및 D1127로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성 지표가 크거나 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 10번째 아스파르트산(D10, 소수성 지표: -3.5) 및 840번째 히스티딘(H840, 소수성 지표: -3.2)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 더 큰 알라닌(소수성 지표: 1.8)으로 치환시키고, 또한 야생형 SpCas9의 539번째 페닐알라닌(F539, 소수성 지표: 2.8)을 상대적으로 소수성 지표가 더 작은 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환시키는 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037, F1038, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성 지표가 크거나 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 763번째 메티오닌(M763, 소수성 지표: 1.9) 및 890번째 라이신(K890, 소수성 지표: -3.9)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 더 큰 아이소류신(소수성 지표: 4.5) 및 아스파라긴(소수성 지표: -3.5)으로 치환시키고, 또한 야생형 SpCas9의 539번째 페닐알라닌(F539, 소수성 지표: 2.8)을 상대적으로 소수성 지표가 더 작은 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환시키는 것일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역, 제 1-4 영역 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역, 제 3-1 영역 및/또는 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 크기가 작은 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 및 D1127로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 크기가 작은 기능기를 가지는 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 539번째 페닐알라닌(F539), 763번째 메티오닌(M763) 및 1102번째 트레오닌(T1102)을 각각 상대적으로 크기가 작은 기능기를 가지는 세린, 아이소류신 및 프롤린으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역, 제 1-4 영역 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역, 제 3-1 영역 및/또는 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 크기가 큰 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037, F1038, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 601번째 아이소류신(I601), 1038번째 페닐알라닌(F1038) 및 1127번째 아스파르트산(D1127)을 각각 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 아스파라긴, 타이로신 및 글루타민산으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역, 제 1-4 영역 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역, 제 3-1 영역 및/또는 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 크기가 크거나 작은 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037, F1038, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 크기가 크거나 작은 기능기를 가지는 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 539번째 페닐알라닌(F539), 763번째 메티오닌(M763) 및 890번째 라이신(K890)을 각각 상대적으로 크기가 작은 기능기를 가지는 세린, 아이소류신 및 아스파라긴으로 치환시키고, 또한 601번째 아이소류신(I601) 및 1038번째 페닐알라닌(F1038)을 각각 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 아스파라긴 및 타이로신으로 치환시키는 것일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역, 제 1-4 영역 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역, 제 3-1 영역 및/또는 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성이 감소된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037, F1038, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성이 감소된 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 539번째 페닐알라닌(F539, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 2.8), 601번째 아이소류신(I601, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 4.5) 및 1102번째 트레오닌(T1102, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -0.7)을 각각 상대적으로 소수성이 감소된 세린(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -0.8), 아스파라긴(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5) 및 프롤린(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -1.6)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역, 제 1-4 영역 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역, 제 3-1 영역 및/또는 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성이 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037, F1038, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성이 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 10번째 아스파르트산(D10, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5), 763번째 메티오닌(M763, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.9), 840번째 히스티딘(H840, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.2) 및 890번째 라이신(K890, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.9)을 각각 상대적으로 소수성이 증가된 알라닌(Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.8), 아이소류신(Kyte-Doolittle hydrophobicity: 4.5), 알라닌(Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.8) 및 아스파라긴(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5)으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역, 제 1-4 영역 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역, 제 3-1 영역 및/또는 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성이 감소되거나 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037, F1038, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성이 감소되거나 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 763번째 메티오닌(M763, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.9) 및 890번째 라이신(K890, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.9)을 각각 상대적으로 소수성이 증가된 아이소류신(Kyte-Doolittle hydrophobicity: 4.5) 및 아스파라긴(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5)으로 치환시키고, 또한 야생형 SpCas9의 539번째 페닐알라닌(F539, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 2.8)을 상대적으로 소수성이 감소된 세린(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -0.8)으로 치환시키는 것일 수 있다.
상기 변형은 상기 선택된 하나 이상의 아미노산이 동일한 개수의 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내에 위치한 하나의 아이소류신을 하나의 아스파라긴으로 치환시키는 것일 수 있다. 또는 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내에 위치한 하나의 페닐알라닌과 제 3 영역 내에 위치한 하나의 라이신을 하나의 세린(제 1 영역)과 하나의 아스파라긴(제 3 영역)으로 각각 치환시키는 것일 수 있다. 또는 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2 영역 내에 위치한 하나의 메티오닌과 하나의 페닐알라닌 및 제 3 영역 내에 위치한 하나의 라이신을 각각 하나의 아이소류신, 하나의 타이로신(제 2 영역) 및 하나의 아스파라긴(제 3 영역)으로 치환시키는 것일 수 있다.
상기 변형은 상기 선택된 하나 이상의 아미노산이 동일하지 않은 개수의 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2 영역 내에 위치한 하나의 트레오닌을 시스테인-알라닌-알라닌, 즉, 총 세 개의 아미노산들로 치환시키는 것일 수 있다. 또는 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내에 위치한 하나의 글루타민과 제 3 영역에 위치한 연속된 두 개의 아미노산인 글리신-세린을 각각 메티오닌-발린(제 1 영역) 및 프롤린(제 3 영역)으로 치환시키는 것일 수 있다. 또는 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내에 위치한 하나의 세린, 제 2 영역 내에 위치한 연속된 세 개의 아미노산인 라이신-라이신-타이로신 및 제 3 영역 내에 위치한 연속된 두 개의 아미노산인 세린-아이소류신을 각각 알라닌(제 1 영역), 메티오닌-프롤린(제 2 영역) 및 시스테인-알라닌-트레오닌-발린(제 3 영역)으로 치환시키는 것일 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 Cas9은 야생형 Cas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 선택된 하나 이상의 영역 내에 적어도 하나 이상의 아미노산이 부가시킨 Cas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 부가는 상기 선택된 하나 이상의 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 하나 이상의 아미노산의 부가일 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 하나 이상의 아미노산의 부가일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 하나 이상의 양전하를 가지는 아미노산의 부가일 수 있다.
예를 들어, 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 내에 위치한 선택된 하나의 알라닌의 C-말단에 하나의 아르기닌을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 내에 위치한 선택된 글루타민산의 N-말단에 두 개의 아미노산들인 아르기닌-라이신을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내에 위치한 선택된 류신의 N-말단에 두 개의 아미노산들인 아르기닌-히스티딘을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내에 위치한 선택된 류신의 C-말단에 두 개의 아미노산들인 라이신-히스티딘을 부가시키고, 또한 제 4-1 영역 내에 위치한 선택된 타이로신의 C-말단에 하나의 라이신을 부가시킨 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 하나 이상의 음전하를 가지는 아미노산의 부가일 수 있다.
예를 들어, 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 내에 위치한 선택된 하나의 글리신의 N-말단에 하나의 아스파르트산을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 내에 위치한 선택된 메티오닌의 C-말단에 세 개의 아미노산들인 글루타민산-아스파르트산-글루타민산을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내에 위치한 선택된 아이소류신의 N-말단에 두 개의 아미노산들인 글루타민산-글루타민산을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 내에 위치한 선택된 페닐알라닌의 C-말단에 두 개의 아미노산들인 글루타민산-아스파르트산을 부가시키고, 또한 제 2-1 영역 내에 위치한 선택된 글루타민의 N-말단에 하나의 아스파르트산을 부가시킨 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 하나 이상의 전하를 가지지 않는 아미노산의 부가일 수 있다.
예를 들어, 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 내에 위치한 선택된 하나의 페닐알라닌의 C-말단에 두 개의 아미노산들인 세린-발린을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 내에 위치한 선택된 히스티딘의 N-말단에 다섯 개의 아미노산들인 글리신-프롤린-글루타민-페닐알라닌-류신을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내에 위치한 선택된 아스파라긴의 N-말단에 두 개의 아미노산들인 알라닌-알라닌을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 내에 위치한 선택된 아스파르트산의 C-말단에 두 개의 아미노산들인 페닐알라닌-류신을 부가시키고, 또한 제 1-2 영역 내에 위치한 선택된 글루타민의 N-말단에 하나의 세린을 부가시킨 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 양전하를 가지는 아미노산들, 음전하를 가지는 아미노산들 및 전하를 가지지 않는 아미노산들 중 선택된 하나 이상의 아미노산의 부가일 수 있다.
예를 들어, 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 내에 위치한 선택된 하나의 아르기닌의 C-말단에 여섯 개의 아미노산들인 히스티딘-아르기닌-글리신-세린-알라닌-글루타민산을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내에 위치한 선택된 하나의 글리신의 N-말단에 열 개의 아미노산들인 라이신-라이신-알라닌-페닐알라닌-글루타민-트레오닌-메티오닌-시스테인-아스파르트산-세린을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 내에 위치한 선택된 메티오닌의 C-말단에 두 개의 아미노산들인 페닐알라닌-히스티딘을 부가시키고, 또한 제 2-3 영역 내에 위치한 선택된 글루타민의 N-말단에 하나의 라이신을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 내에 위치한 선택된 라이신의 C-말단에 두 개의 아미노산들인 아스파르트산-세린을 부가시키고, 제 2-2 영역 내에 위치한 선택된 트레오닌의 N-말단에 여섯 개의 아미노산들인 글루타민-트레오닌-메티오닌-시스테인-아스파르트산-라이신을 부가시키고, 또한 제 4-1 영역 내에 위치한 선택된 글루타민의 C-말단에 두 개의 아미노산들인 아르기닌-글리신을 부가시킨 것일 수 있다.
이때, 상기 부가는 상기 선택된 하나 이상의 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 하나 이상의 기능적(functional) 도메인의 부가일 수 있다.
상기 기능적 도메인은 야생형 Cas9의 원래 기능, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 제2 기능 이외에 부가적인 기능을 가지는 도메인일 수 있다.
또는 상기 기능적 도메인은 야생형 Cas9의 원래 기능, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및/또는 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 제2 기능과 유사한 기능을 가지는 도메인일 수 있다.
상기 기능적 도메인 관련 설명은 상기 기술한 바와 같다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 하나 이상의 기능적 도메인의 부가일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 구체예에서, 상기 인위적으로 조작된 Cas9은 표적 특이적 Cas9일 수 있다.
“표적 특이적 Cas9(Target specific Cas9; TS-Cas9)”은 Cas9 변이체로, 야생형 Cas9에 비해 상대적으로 표적 특이성(specificity)이 증가하도록 인위적으로 조작하여 생성된 Cas9 변이체를 의미한다.
이때, 상기 “표적 특이성”은 Cas9이 gRNA와의 상호작용을 통해 gRNA-Cas9 복합체를 형성하여 표적 유전자 또는 핵산, 즉, Cas9을 이용해 조작하고자 하는 대상(핵산)에 근접 또는 국소화될 때, gRNA와 상보적 결합을 하는 표적 서열에 특이적으로 Cas9이 작용할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 이때, gRNA와 완전한 상보적 결합(100%)하는 표적 서열은 온-타겟(on-target)으로 명명하며, gRNA와 불완전한 상보적 결합(100% 미만)하는, 즉, 하나 이상의 비상보적 결합을 포함하는 표적 서열은 오프-타겟(off-target)으로 명명한다.
상기 표적 특이성은 gRNA와 표적 서열간의 상보적 결합 정도에 따라 변할 수 있다.
일 예로, gRNA와 상보적 결합을 하는 표적 서열이 온-타겟, 즉, gRNA와 표적 서열간의 상보적 결합이 완전한 상보적 결합(100%)인 경우, 표적 특이성이 가장 높은 상태일 수 있다.
다른 일 예로, gRNA와 상보적 결합을 하는 표적 서열이 오프-타겟, 즉, gRNA와 표적 서열간의 상보적 결합이 100% 미만으로 하나 이상의 비상보적 결합을 포함하는 경우, 표적 특이성은 온-타겟에 비해 감소된 상태일 수 있으며, 상기 비상보적 결합의 개수가 증가함에 따라 상기 표적 특이성은 더 감소할 수 있다.
예를 들어, gRNA와 표적 서열간의 상보적 결합이 완전한 상보적 결합(100%)인 경우, 상기 표적 특이성을 100%라면, gRNA와 표적 서열간의 하나의 비상보적 결합이 포함된 경우, 즉, gRNA와 표적 서열간의 상보적 결합이 불완전한 상보적 결합(95%)인 경우, 상기 표적 특이성은 95%일 수 있다. 또는 gRNA와 표적 서열간의 네 개의 비상보적 결합이 포함된 경우, 즉, gRNA와 표적 서열간의 상보적 결합이 불완전한 상보적 결합(80%)인 경우, 상기 표적 특이성은 80%일 수 있다.
또 다른 일 예로, gRNA와 상보적 결합을 하는 표적 서열이 오프-타겟, 즉, gRNA와 표적 서열간의 상보적 결합이 100% 미만, 즉, 하나 이상의 비상보적 결합을 포함하는 경우, 표적 특이성은 상기 비상보적 결합의 위치에 따라 다를 수 있다.
예를 들어, 상기 gRNA와 표적 서열간의 하나의 비상보적 결합을 포함할 때, 상기 비상보적 결합의 위치가 표적 서열에 인접한 PAM에 근접하게 위치한 경우, 표적 특이성은 비상보적 결합의 위치가 PAM에 멀리 떨어져 위치한 경우에 비해 표적 특이성이 낮을 수 있다.
상기 표적 특이성은 표적 서열과 상보적 결합을 한 gRNA와 Cas9의 상호작용 정도에 따라 변할 수 있다.
일 예로, 표적 서열과 상보적 결합을 한 gRNA와 Cas9의 상호작용이 감소된 경우, 상기 gRNA와 표적 서열 간에 비상보적 결합의 수가 감소할수록 표적 특이성은 증가할 수 있다.
예를 들어, 표적 서열과 상보적 결합을 한 gRNA와 Cas9의 상호작용이 감소된 경우, 상기 gRNA와 표적 서열 간에 세 개의 비상보적 결합을 포함할 때에 비해 하나의 비상보적 결합을 포함할 때 표적 특이성이 상대적으로 증가할 수 있다.
다른 일 예로, 표적 서열과 상보적 결합을 한 gRNA와 Cas9의 상호작용이 감소된 경우, 상기 gRNA와 표적 서열간의 상보적 결합이 완전한 상보적 결합(100%)일 때만 표적 특이성을 가질 수 있다.
예를 들어, 표적 서열과 상보적 결합을 한 gRNA와 Cas9의 상호작용이 감소된 경우, 상기 표적 서열이 온-타겟일 때만 표적 특이성을 가질 수 있다.
상기 표적 특이성은 gRNA와 상보적 결합을 한 표적 서열과 Cas9의 상호작용 정도에 따라 변할 수 있다.
일 예로, gRNA와 상보적 결합을 한 표적 서열과 Cas9의 상호작용이 감소된 경우, 상기 gRNA와 표적 서열 간에 비상보적 결합의 수가 감소할수록 표적 특이성은 증가할 수 있다.
예를 들어, gRNA와 상보적 결합을 한 표적 서열과 Cas9의 상호작용이 감소된 경우, 상기 gRNA와 표적 서열 간에 네 개의 비상보적 결합을 포함할 때에 비해 두 개의 비상보적 결합을 포함할 때 표적 특이성이 상대적으로 증가할 수 있다.
다른 일 예로, gRNA와 상보적 결합을 한 표적 서열과 Cas9의 상호작용이 감소된 경우, 상기 gRNA와 표적 서열간의 상보적 결합이 완전한 상보적 결합(100%)일 때만 표적 특이성을 가질 수 있다.
예를 들어, gRNA와 상보적 결합을 한 표적 서열과 Cas9의 상호작용이 감소된 경우, 상기 표적 서열이 온-타겟일 때만 표적 특이성을 가질 수 있다.
상기 표적 특이적 Cas9은 온-타겟을 조작하는 Cas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 조작은 Cas9 변이체를 이용해 온-타겟의 뉴클레오타이드 서열을 절단하거나, 온-타겟의 뉴클레오타이드 서열 내에 하나 이상의 뉴클레오타이드를 삭제 및/또는 삽입할 수 있도록 온-타겟의 뉴클레오타이드 서열을 변형시키는 것일 수 있다.
상기 표적 특이적 Cas9은 온-타겟에 대한 표적 특이성이 야생형 Cas9과 동일하거나 증가된 Cas9 변이체일 수 있다.
상기 표적 특이적 Cas9은 오프-타겟을 조작하지 않는 Cas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 조작은 Cas9 변이체를 이용해 오프-타겟의 뉴클레오타이드 서열을 절단하거나, 오프-타겟의 뉴클레오타이드 서열 내에 하나 이상의 뉴클레오타이드를 삭제 및/또는 삽입할 수 있도록 오프-타겟의 뉴클레오타이드 서열을 변형시키는 것일 수 있다.
상기 표적 특이적 Cas9은 야생형 Cas9에 비해 오프-타겟에 대한 표적 특이성이 감소된 Cas9 변이체일 수 있다.
상기 표적 특이적 Cas9은 온-타겟에 대한 표적 특이성이 야생형 Cas9과 동일하며, 오프-타겟에 대한 표적 특이성은 야생형 Cas9에 비해 감소된 Cas9 변이체일 수 있다.
상기 표적 특이적 Cas9은 오프-타겟에 대한 표적 특이성이 야생형 Cas9과 동일하며, 온-타겟에 대한 표적 특이성은 야생형 Cas9에 비해 증가된 Cas9 변이체일 수 있다.
상기 표적 특이적 Cas9은 온-타겟에 대한 표적 특이성이 야생형 Cas9에 비해 증가하며, 오프-타겟에 대한 표적 특이성은 야생형 Cas9에 비해 감소된 Cas9 변이체일 수 있다.
상기 표적 특이적 Cas9은 온-타겟에 대한 표적 특이성이 야생형 Cas9에 비해 감소하며, 오프-타겟에 대한 표적 특이성은 야생형 Cas9에 비해 감소된 Cas9 변이체일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 실시예에서, 상기 표적 특이적 Cas9은 표적 특이적 SpCas9일 수 있다.
“표적 특이적 SpCas9(Target specific SpCas9; TS-SpCas9)”은 SpCas9 변이체로, 야생형 SpCas9에 비해 상대적으로 표적 특이성(specificity)이 증가하도록 인위적으로 조작하여 생성된 SpCas9 변이체를 의미한다.
상기 TS-SpCas9은 온-타겟을 조작하는 SpCas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 조작은 SpCas9 변이체를 이용해 온-타겟의 뉴클레오타이드 서열을 절단하거나, 온-타겟의 뉴클레오타이드 서열 내에 하나 이상의 뉴클레오타이드를 삭제 및/또는 삽입할 수 있도록 온-타겟의 뉴클레오타이드 서열을 변형시키는 것일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 온-타겟에 대한 표적 특이성이 야생형 SpCas9과 동일하거나 증가된 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 오프-타겟을 조작하지 않는 SpCas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 조작은 SpCas9 변이체를 이용해 오프-타겟의 뉴클레오타이드 서열을 절단하거나, 오프-타겟의 뉴클레오타이드 서열 내에 하나 이상의 뉴클레오타이드를 삭제 및/또는 삽입할 수 있도록 오프-타겟의 뉴클레오타이드 서열을 변형시키는 것일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9에 비해 오프-타겟에 대한 표적 특이성이 감소된 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 온-타겟에 대한 표적 특이성이 야생형 SpCas9과 동일하며, 오프-타겟에 대한 표적 특이성은 야생형 SpCas9에 비해 감소된 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 오프-타겟에 대한 표적 특이성이 야생형 SpCas9과 동일하며, 온-타겟에 대한 표적 특이성은 야생형 SpCas9에 비해 증가된 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 온-타겟에 대한 표적 특이성이 야생형 SpCas9에 비해 증가하며, 오프-타겟에 대한 표적 특이성은 야생형 SpCas9에 비해 감소된 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 온-타겟에 대한 표적 특이성이 야생형 SpCas9에 비해 감소하며, 오프-타겟에 대한 표적 특이성은 야생형 SpCas9에 비해 감소된 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 선택된 하나 이상의 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 196번째 페닐알라닌(F196)부터 282번째 아이소류신(I282)까지의 아미노산 서열(제 1-1 영역)일 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 316번째 프롤린(P316)부터 394번째 아스파라긴(N394)까지의 아미노산 서열(제 1-2 영역)일 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 510번째 라이신(K510)부터 612번째 아스파라긴(N612)까지의 아미노산 서열(제 1-3 영역)일 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 678번째 트레오닌(T678)부터 698번째 히스티딘(H698)까지의 아미노산 서열(제 1-4 영역)일 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 196번째 페닐알라닌(F196)부터 282번째 아이소류신(I282)까지의 아미노산 서열(제 1-1 영역), 316번째 프롤린(P316)부터 394번째 아스파라긴(N394)까지의 아미노산 서열(제 1-2 영역), 510번째 라이신(K510)부터 612번째 아스파라긴(N612)까지의 아미노산 서열(제 1-3 영역) 및 678번째 트레오닌(T678)부터 698번째 히스티딘(H698)까지의 아미노산 서열(제 1-4 영역) 중 선택된 두 개의 영역일 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 196번째 페닐알라닌(F196)부터 282번째 아이소류신(I282)까지의 아미노산 서열(제 1-1 영역), 316번째 프롤린(P316)부터 394번째 아스파라긴(N394)까지의 아미노산 서열(제 1-2 영역), 510번째 라이신(K510)부터 612번째 아스파라긴(N612)까지의 아미노산 서열(제 1-3 영역) 및 678번째 트레오닌(T678)부터 698번째 히스티딘(H698)까지의 아미노산 서열(제 1-4 영역) 중 선택된 세 개의 영역일 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 196번째 페닐알라닌(F196)부터 282번째 아이소류신(I282)까지의 아미노산 서열(제 1-1 영역), 316번째 프롤린(P316)부터 394번째 아스파라긴(N394)까지의 아미노산 서열(제 1-2 영역), 510번째 라이신(K510)부터 612번째 아스파라긴(N612)까지의 아미노산 서열(제 1-3 영역) 및 678번째 트레오닌(T678)부터 698번째 히스티딘(H698)까지의 아미노산 서열(제 1-4 영역)일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역)일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역)일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 926번째 글루타민(Q926)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역)일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역) 및 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역)일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역) 및 926번째 글루타민(Q926)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역)일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역) 및 926번째 글루타민(Q926)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역)일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역), 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역) 및 926번째 글루타민(Q926)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역)일 수 있다.
상기 제 3 영역은 야생형 SpCas9의 775번째 라이신(K775)부터 900번째 류신(L900)까지의 아미노산 서열(제 3-1 영역)일 수 있다.
상기 제 4 영역은 야생형 SpCas9의 1099번째 글루타민산(E1099)부터 1139번째 발린(V1139)까지의 아미노산 서열(제 4-1 영역)일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281 및 I282로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 중 P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391 및 L393로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 K510, L513, L514, Y515, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, E584, D585, F587, N588, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606 및 L607으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 중 I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, N692, F693, M694, Q695, L696, I697 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 및 제 1-2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 및 제 1-2 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391 및 L393으로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 및 제 1-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 및 제 1-3 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, K510, L513, L514, Y515, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, E584, D585, F587, N588, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606 및 L607으로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 및 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 및 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, N692, F693, M694, Q695, L696, I697 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 및 제 1-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 및 제 1-3 영역 중 P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, K510, L513, L514, Y515, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, E584, D585, F587, N588, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606 및 L607으로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 및 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 및 제 1-4 영역 중 P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, N692, F693, M694, Q695, L696, I697 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 중 K510, L513, L514, Y515, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, E584, D585, F587, N588, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, N692, F693, M694, Q695, L696, I697 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역 및 제 1-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역 및 제 1-3 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, K510, L513, L514, Y515, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, E584, D585, F587, N588, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606 및 L607으로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역 및 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역 및 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, N692, F693, M694, Q695, L696, I697 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, K510, L513, L514, Y515, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, E584, D585, F587, N588, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, N692, F693, M694, Q695, L696, I697 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 중 P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, K510, L513, L514, Y515, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, E584, D585, F587, N588, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, N692, F693, M694, Q695, L696, I697 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 넷 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, K510, L513, L514, Y515, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, E584, D585, F587, N588, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, N692, F693, M694, Q695, L696, I697 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 넷 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203; N277; G366; F539; 또는 I601을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277(A203과 N277); A203/G366; A203/F539; 또는 A203/I601을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 N277/G366; N277/F539; 또는 N277/I601을 변형시킨 SpCas9일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 G366/F539; G366/I601; 또는 F539/I601을 변형시킨 SpCas9일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366; A203/N277/F539; A203/N277/I601; A203/G366/F539; A203/G366/I601; A203/F539/I601; N277/G366/F539; N277/G366/I601; 또는 G366/F539/I601을 변형시킨 SpCas9일 수 있다.
또 다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539; A203/N277/G366/I601; A203/N277/F539/I601; A203/G366/F539/I601; 또는 N277/G366/F539/I601을 변형시킨 SpCas9일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539/I601를 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20 및 I21로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766 및 N767로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 중 I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 2-2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 2-2 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766 및 N767로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 2-3 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 및 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 및 제 2-3 영역 중 P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및 제 2-3 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763; D965; 또는 F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763/D965; M763/F1038; 또는 D965/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763/D965/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, V838, D839, H840, K848, D849, D850, D853, N854, K855, R859, D861, K862, N863, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, A889, K890, L891, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 K890을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 T1102 또는 D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및/또는 제 2-3영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 또는 제 2-3영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/M763; A203/D965; A203/F1038; A203/M763/D965; A203/M763/F1038; A203/D965/F1038; A203/M763/D965/F1038; N277/M763; N277/D965; N277/F1038; N277/M763/D965; N277/M763/F1038; N277/D965/F1038; N277/M763/D965/F1038; G366/M763; G366/D965; G366/F1038; G366/M763/D965; G366/M763/F1038; G366/D965/F1038; G366/M763/D965/F1038; F539/M763; F539/D965; F539/F1038; F539/M763/D965; F539/M763/F1038; F539/D965/F1038; F539/M763/D965/F1038; I601/M763; I601/D965; I601/F1038; I601/M763/D965; I601/M763/F1038; I601/D965/F1038; 또는 I601/M763/D965/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/M763; A203/N277/D965; A203/N277/F1038; A203/N277/M763/D965; A203/N277/M763/F1038; A203/N277/D965/F1038; A203/N277/M763/D965/F1038; A203/G366/M763; A203/G366/D965; A203/G366/F1038; A203/G366/M763/D965; A203/G366/M763/F1038; A203/G366/D965/F1038; A203/G366/M763/D965/F1038; A203/F539/M763; A203/F539/D965; A203/F539/F1038; A203/F539/M763/D965; A203/F539/M763/F1038; A203/F539/D965/F1038; A203/F539/M763/D965/F1038; A203/I601/M763; A203/I601/D965; A203/I601/F1038; A203/I601/M763/D965; A203/I601/M763/F1038; A203/I601/D965/F1038; A203/I601/M763/D965/F1038; N277/G366/M763; N277/G366/D965; N277/G366/F1038; N277/G366/M763/D965; N277/G366/M763/F1038; N277/G366/D965/F1038; N277/G366/M763/D965/F1038; N277/F539/M763; N277/F539/D965; N277/F539/F1038; N277/F539/M763/D965; N277/F539/M763/F1038; N277/F539/D965/F1038; N277/F539/M763/D965/F1038; N277/I601/M763; N277/I601/D965; N277/I601/F1038; N277/I601/M763/D965; N277/I601/M763/F1038; N277/I601/D965/F1038; N277/I601/M763/D965/F1038; G366/F539/M763; G366/F539/D965; G366/F539/F1038; G366/F539/M763/D965; G366/F539/M763/F1038; G366/F539/D965/F1038; G366/F539/M763/D965/F1038; G366/I601/M763; G366/I601/D965; G366/I601/F1038; G366/I601/M763/D965; G366/I601/M763/F1038; G366/I601/D965/F1038; G366/I601/M763/D965/F1038; F539/I601/M763; F539/I601/D965; F539/I601/F1038; F539/I601/M763/D965; F539/I601/M763/F1038; F539/I601/D965/F1038; 또는 F539/I601/M763/D965/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/M763; A203/N277/G366/D965; A203/N277/G366/F1038; A203/N277/G366/M763/D965; A203/N277/G366/M763/F1038; A203/N277/G366/D965/F1038; A203/N277/G366/M763/D965/F1038; A203/N277/F539/M763; A203/N277/F539/D965; A203/N277/F539/F1038; A203/N277/F539/M763/D965; A203/N277/F539/M763/F1038; A203/N277/F539/D965/F1038; A203/N277/F539/M763/D965/F1038; A203/N277/I601/M763; A203/N277/I601/D965; A203/N277/I601/F1038; A203/N277/I601/M763/D965; A203/N277/I601/M763/F1038; A203/N277/I601/D965/F1038; A203/N277/I601/M763/D965/F1038; A203/G366/F539/M763; A203/G366/F539/D965; A203/G366/F539/F1038; A203/G366/F539/M763/D965; A203/G366/F539/M763/F1038; A203/G366/F539/D965/F1038; A203/G366/F539/M763/D965/F1038; A203/G366/I601/M763; A203/G366/I601/D965; A203/G366/I601/F1038; A203/G366/I601/M763/D965; A203/G366/I601/M763/F1038; A203/G366/I601/D965/F1038; A203/G366/I601/M763/D965/F1038; A203/F539/I601/M763; A203/F539/I601/D965; A203/F539/I601/F1038; A203/F539/I601/M763/D965; A203/F539/I601/M763/F1038; A203/F539/I601/D965/F1038; A203/F539/I601/M763/D965/F1038; N277/G366/F539/M763; N277/G366/F539/D965; N277/G366/F539/F1038; N277/G366/F539/M763/D965; N277/G366/F539/M763/F1038; N277/G366/F539/D965/F1038; N277/G366/F539/M763/D965/F1038; N277/G366/I601/M763; N277/G366/I601/D965; N277/G366/I601/F1038; N277/G366/I601/M763/D965; N277/G366/I601/M763/F1038; N277/G366/I601/D965/F1038; N277/G366/I601/M763/D965/F1038; G366/F539/I601/M763; G366/F539/I601/D965; G366/F539/I601/F1038; G366/F539/I601/M763/D965; G366/F539/I601/M763/F1038; G366/F539/I601/D965/F1038; 또는 G366/F539/I601/M763/D965/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539/M763; A203/N277/G366/F539/D965; A203/N277/G366/F539/F1038; A203/N277/G366/F539/M763/D965; A203/N277/G366/F539/M763/F1038; A203/N277/G366/F539/D965/F1038; A203/N277/G366/F539/M763/D965/F1038; A203/N277/G366/I601/M763; A203/N277/G366/I601/D965; A203/N277/G366/I601/F1038; A203/N277/G366/I601/M763/D965; A203/N277/G366/I601/M763/F1038; A203/N277/G366/I601/D965/F1038; A203/N277/G366/I601/M763/D965/F1038; N277/G366/F539/I601/M763; N277/G366/F539/I601/D965; N277/G366/F539/I601/F1038; N277/G366/F539/I601/M763/D965; N277/G366/F539/I601/M763/F1038; N277/G366/F539/I601/D965/F1038; N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/M763; A203/N277/G366/F539/I601/D965; A203/N277/G366/F539/I601/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965; A203/N277/G366/F539/I601/M763/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/D965/F1038; 또는 A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 3-1 영역 중 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, V838, D839, H840, K848, D849, D850, D853, N854, K855, R859, D861, K862, N863, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, A889, K890, L891, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/K890; N277/K890; G366/K890; F539/K890; 또는 I601/K890을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/K890; A203/G366/K890; A203/F539/K890; A203/I601/K890; N277/G366/K890; N277/F539/K890; N277/I601/K890; G366/F539/K890; G366/I601/K890; 또는 F539/I601/K890을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/K890; A203/N277/F539/K890; A203/N277/I601/K890; A203/G366/F539/K890; A203/G366/I601/K890; A203/F539/I601/K890; N277/G366/F539/K890; N277/G366/I601/K890; 또는 G366/F539/I601/K890을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539/K890; A203/N277/G366/I601/K890; 또는 N277/G366/F539/I601/K890을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539/I601/K890을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/T1102; N277/T1102; G366/T1102; F539/T1102; I601/T1102; A203/D1127; N277/D1127; G366/D1127; F539/D1127; I601/D1127; A203/T1102/D1127; N277/T1102/D1127; G366/T1102/D1127; F539/T1102/D1127; 또는I601/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/T1102; A203/G366/T1102; A203/F539/T1102; A203/I601/T1102; N277/G366/T1102; N277/F539/T1102; N277/I601/T1102; G366/F539/T1102; G366/I601/T1102; F539/I601/T1102; A203/N277/D1127; A203/G366/D1127; A203/F539/D1127; A203/I601/D1127; N277/G366/D1127; N277/F539/D1127; N277/I601/D1127; G366/F539/D1127; G366/I601/D1127; F539/I601/D1127; A203/N277/T1102/D1127; A203/G366/T1102/D1127; A203/F539/T1102/D1127; A203/I601/T1102/D1127; N277/G366/T1102/D1127; N277/F539/T1102/D1127; N277/I601/T1102/D1127; G366/F539/T1102/D1127; G366/I601/T1102/D1127; 또는 F539/I601/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/T1102; A203/N277/F539/T1102; A203/N277/I601/T1102; A203/G366/F539/T1102; A203/G366/I601/T1102; A203/F539/I601/T1102; N277/G366/F539/T1102; N277/G366/I601/T1102; G366/F539/I601/T1102; A203/N277/G366/D1127; A203/N277/F539/D1127; A203/N277/I601/D1127; A203/G366/F539/D1127; A203/G366/I601/D1127; A203/F539/I601/D1127; N277/G366/F539/D1127; N277/G366/I601/D1127; G366/F539/I601/D1127; A203/N277/G366/T1102/D1127; A203/N277/F539/T1102/D1127; A203/N277/I601/T1102/D1127; A203/G366/F539/T1102/D1127; A203/G366/I601/T1102/D1127; A203/F539/I601/T1102/D1127; N277/G366/F539/T1102/D1127; N277/G366/I601/T1102/D1127; 또는 G366/F539/I601/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539/T1102; A203/N277/G366/I601/T1102; N277/G366/F539/I601/T1102; A203/N277/G366/F539/D1127; A203/N277/G366/I601/D1127; N277/G366/F539/I601/D1127; A203/N277/G366/F539/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/T1102/D1127; 또는 N277/G366/F539/I601/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539/I601/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/D1127; 또는 A203/N277/G366/F539/I601/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및/또는 제 2-3영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및/또는 제 2-3영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 3-1 영역 중 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, V838, D839, H840, K848, D849, D850, D853, N854, K855, R859, D861, K862, N863, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, A889, K890, L891, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763/K890; K890/D965; 또는 K890/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763/K890/D965; M763/K890/F1038; 또는 K890/D965/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763/K890/D965/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및/또는 제 2-3영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및/또는 제 2-3영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763/T1102; D965/T1102; F1038/T1102; M763/D1127; D965/D1127; F1038/D1127; M763/T1102/D1127; D965/T1102/D1127; 또는 F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763/D965/T1102; M763/F1038/T1102; D965/F1038/T1102; M763/D965/D1127; M763/F1038/D1127; D965/F1038/D1127; M763/D965/T1102/D1127; M763/F1038/T1102/D1127; 또는 D965/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763/D965/F1038/T1102; M763/D965/F1038/D1127; 또는 M763/D965/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 K890/T1102; K890/D1127; 또는 K890/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 셋 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및/또는 제 2-3영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및/또는 제 2-3영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 3-1 영역 중 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, V838, D839, H840, K848, D849, D850, D853, N854, K855, R859, D861, K862, N863, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, A889, K890, L891, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/M763/K890; A203/K890/D965; A203/K890/F1038; A203/M763/K890/D965; A203/M763/K890/F1038; A203/K890/D965/F1038; A203/M763/K890/D965/F1038; N277/M763/K890; N277/K890/D965; N277/K890/F1038; N277/M763/K890/D965; N277/M763/K890/F1038; N277/K890/D965/F1038; N277/M763//K890D965/F1038; G366/M763/K890; G366/K890/D965; G366/K890/F1038; G366/M763/K890/D965; G366/M763/K890/F1038; G366/K890/D965/F1038; G366/M763/K890/D965/F1038; F539/M763/K890; F539/K890/D965; F539/K890/F1038; F539/M763/K890/D965; F539/M763/K890/F1038; F539/K890/D965/F1038; F539/M763/K890/D965/F1038; I601/M763/K890; I601/K890/D965; I601/K890/F1038; I601/M763/K890/D965; I601/M763/K890/F1038; I601/K890/D965/F1038; 또는 I601/M763/K890/D965/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/M763/K890; A203/N277/K890/D965; A203/N277/K890/F1038; A203/N277/M763/K890/D965; A203/N277/M763/K890/F1038; A203/N277/K890/D965/F1038; A203/N277/M763/K890/D965/F1038; A203/G366/M763/K890; A203/G366/K890/D965; A203/G366/K890/F1038; A203/G366/M763/K890/D965; A203/G366/M763/K890/F1038; A203/G366/K890/D965/F1038; A203/G366/M763/K890/D965/F1038; A203/F539/M763/K890; A203/F539/K890/D965; A203/F539/K890/F1038; A203/F539/M763/K890/D965; A203/F539/M763/K890/F1038; A203/F539/K890/D965/F1038; A203/F539/M763/K890/D965/F1038; A203/I601/M763/K890; A203/I601/K890/D965; A203/I601/K890/F1038; A203/I601/M763/K890/D965; A203/I601/M763/K890/F1038; A203/I601/K890/D965/F1038; A203/I601/M763/K890/D965/F1038; N277/G366/M763/K890; N277/G366/K890/D965; N277/G366/K890/F1038; N277/G366/M763/K890/D965; N277/G366/M763/K890/F1038; N277/G366/K890/D965/F1038; N277/G366/M763/K890/D965/F1038; N277/F539/M763/K890; N277/F539/K890/D965; N277/F539/K890/F1038; N277/F539/M763/K890/D965; N277/F539/M763/K890/F1038; N277/F539/K890/D965/F1038; N277/F539/M763/K890/D965/F1038; N277/I601/M763/K890; N277/I601/K890/D965; N277/I601/K890/F1038; N277/I601/M763/K890/D965; N277/I601/M763/K890/F1038; N277/I601/K890/D965/F1038; N277/I601/M763/K890/D965/F1038; G366/F539/M763/K890; G366/F539/K890/D965; G366/F539/K890/F1038; G366/F539/M763/K890/D965; G366/F539/M763/K890/F1038; G366/F539/K890/D965/F1038; G366/F539/M763/K890/D965/F1038; G366/I601/M763/K890; G366/I601/K890/D965; G366/I601/K890/F1038; G366/I601/M763/K890/D965; G366/I601/M763/K890/F1038; G366/I601/K890/D965/F1038; G366/I601/M763/K890/D965/F1038; F539/I601/M763/K890; F539/I601/K890/D965; F539/I601/K890/F1038; F539/I601/M763/K890/D965; F539/I601/M763/K890/F1038; F539/I601/K890/D965/F1038; 또는 F539/I601/M763/K890/D965/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/M763/K890; A203/N277/G366/K890/D965; A203/N277/G366/K890/F1038; A203/N277/G366/M763/K890/D965; A203/N277/G366/M763/K890/F1038; A203/N277/G366/K890/D965/F1038; A203/N277/G366/M763/K890/D965/F1038; A203/N277/F539/M763/K890; A203/N277/F539/K890/D965; A203/N277/F539/K890/F1038; A203/N277/F539/M763/K890/D965; A203/N277/F539/M763/K890/F1038; A203/N277/F539/K890/D965/F1038; A203/N277/F539/M763/K890/D965/F1038; A203/N277/I601/M763/K890; A203/N277/I601/K890/D965; A203/N277/I601/K890/F1038; A203/N277/I601/M763/K890/D965; A203/N277/I601/M763/K890/F1038; A203/N277/I601/K890/D965/F1038; A203/N277/I601/M763/K890/D965/F1038; A203/G366/F539/M763/K890; A203/G366/F539/K890/D965; A203/G366/F539/K890/F1038; A203/G366/F539/M763/K890/D965; A203/G366/F539/M763/K890/F1038; A203/G366/F539/K890/D965/F1038; A203/G366/F539/M763/K890/D965/F1038; A203/G366/I601/M763/K890; A203/G366/I601/K890/D965; A203/G366/I601/K890/F1038; A203/G366/I601/M763/K890/D965; A203/G366/I601/M763/K890/F1038; A203/G366/I601/K890/D965/F1038; A203/G366/I601/M763/K890/D965/F1038; A203/F539/I601/M763/K890; A203/F539/I601/K890/D965; A203/F539/I601/K890/F1038; A203/F539/I601/M763/K890/D965; A203/F539/I601/M763/K890/F1038; A203/F539/I601/K890/D965/F1038; A203/F539/I601/M763/K890/D965/F1038; N277/G366/F539/M763/K890; N277/G366/F539/K890/D965; N277/G366/F539/K890/F1038; N277/G366/F539/M763/K890/D965; N277/G366/F539/M763/K890/F1038; N277/G366/F539/K890/D965/F1038; N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038; N277/G366/I601/M763/K890; N277/G366/I601/K890/D965; N277/G366/I601/K890/F1038; N277/G366/I601/M763/K890/D965; N277/G366/I601/M763/K890/F1038; N277/G366/I601/K890/D965/F1038; N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038; G366/F539/I601/M763/K890; G366/F539/I601/K890/D965; G366/F539/I601/K890/F1038; G366/F539/I601/M763/K890/D965; G366/F539/I601/M763/K890/F1038; G366/F539/I601/K890/D965/F1038; 또는 G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539/M763/K890; A203/N277/G366/F539/K890/D965; A203/N277/G366/F539/K890/F1038; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965; A203/N277/G366/F539/M763/K890/F1038; A203/N277/G366/F539/K890/D965/F1038; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038; A203/N277/G366/I601/M763/K890; A203/N277/G366/I601/K890/D965; A203/N277/G366/I601/K890/F1038; A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965; A203/N277/G366/I601/M763/K890/F1038; A203/N277/G366/I601/K890/D965/F1038; A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038; N277/G366/F539/I601/M763/K890; N277/G366/F539/I601/K890/D965; N277/G366/F539/I601/K890/F1038; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965; N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038; N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965; A203/N277/G366/F539/I601/K890/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038; 또는 A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 셋 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및/또는 제 2-3영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및/또는 제 2-3영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/M763/T1102; A203//D965T1102; A203//F1038T1102; A203/M763/D965/T1102; A203/M763/F1038/T1102; A203/D965/F1038/T1102; A203/M763/D965/F1038/T1102; N277/M763/T1102; N277/D965/T1102; N277/F1038/T1102; N277/M763/D965/T1102; N277/M763/F1038/T1102; N277/D965/F1038/T1102; N277/M763/D965/F1038/T1102; G366/M763/T1102; G366/D965/T1102; G366/F1038/T1102; G366/M763/D965/T1102; G366/M763/F1038/T1102; G366/D965/F1038/T1102; G366/M763/D965/F1038/T1102; F539/M763/T1102; F539/D965/T1102; F539/F1038/T1102; F539/M763/D965/T1102; F539/M763/F1038/T1102; F539/D965/F1038/T1102; F539/M763/D965/F1038/T1102; I601/M763/T1102; I601/D965/T1102; I601/F1038/T1102; I601/M763/D965/T1102; I601/M763/F1038/T1102; I601/D965/F1038/T1102; I601/M763/D965/F1038/T1102; A203/M763/D1127; A203/D965/D1127; A203/F1038/D1127; A203/M763/D965/D1127; A203/M763/F1038/D1127; A203/D965/F1038/D1127; A203/M763/D965/F1038/D1127; N277/M763/D1127; N277/D965/D1127; N277/F1038/D1127; N277/M763/D965/D1127; N277/M763/F1038/D1127; N277/D965/F1038/D1127; N277/M763/D965/F1038/D1127; G366/M763/D1127; G366/D965/D1127; G366/F1038/D1127; G366/M763/D965/D1127; G366/M763/F1038/D1127; G366/D965/F1038/D1127; G366/M763/D965/F1038/D1127; F539/M763/D1127; F539/D965/D1127; F539/F1038/D1127; F539/M763/D965/D1127; F539/M763/F1038/D1127; F539/D965/F1038/D1127; F539/M763/D965/F1038/D1127; I601/M763/D1127; I601/D965/D1127; I601/F1038/D1127; I601/M763/D965/D1127; I601/M763/F1038D1127; I601/D965/F1038/D1127; 또는 I601/M763/D965/F1038/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/M763/T1102/D1127; A203/D965/T1102/D1127; A203/F1038/T1102/D1127; A203/M763/D965/T1102/D1127; A203/M763/F1038/T1102/D1127; A203/D965/F1038/T1102/D1127; A203/M763/D965/F1038/T1102/D1127; N277/M763/T1102/D1127; N277/D965/T1102/D1127; N277/F1038/T1102/D1127; N277/M763/D965/T1102/D1127; N277/M763/F1038/T1102/D1127; N277/D965/F1038/T1102/D1127; N277/M763/D965/F1038/T1102/D1127; G366/M763/T1102/D1127; G366/D965/T1102/D1127; G366/F1038/T1102/D1127; G366/M763/D965/T1102/D1127; G366/M763/F1038/T1102/D1127; G366/D965/F1038/T1102/D1127; G366/M763/D965/F1038/T1102/D1127; F539/M763/T1102/D1127; F539/D965/T1102/D1127; F539/F1038/T1102/D1127; F539/M763/D965/T1102/D1127; F539/M763/F1038/T1102/D1127; F539/D965/F1038/T1102/D1127; F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127; I601/M763/T1102/D1127; I601/D965/T1102/D1127; I601/F1038/T1102/D1127; I601/M763/D965/T1102/D1127; I601/M763/F1038T1102/D1127; I601/D965/F1038/T1102/D1127; 또는 I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/M763/T1102; A203/N277/D965/T1102; A203/N277/F1038/T1102; A203/N277/M763/D965/T1102; A203/N277/M763/F1038/T1102; A203/N277/D965/F1038/T1102; A203/N277/M763/D965/F1038/T1102; A203/G366/M763/T1102; A203/G366/D965/T1102; A203/G366/F1038/T1102; A203/G366/M763/D965/T1102; A203/G366/M763/F1038/T1102; A203/G366/D965/F1038/T1102; A203/G366/M763/D965/F1038/T1102; A203/F539/M763/T1102; A203/F539/D965/T1102; A203/F539/F1038/T1102; A203/F539/M763/D965/T1102; A203/F539/M763/F1038/T1102; A203/F539/D965/F1038/T1102; A203/F539/M763/D965/F1038/T1102; A203/I601/M763/T1102; A203/I601/D965/T1102; A203/I601/F1038/T1102; A203/I601/M763/D965/T1102; A203/I601/M763/F1038/T1102; A203/I601/D965/F1038/T1102; A203/I601/M763/D965/F1038/T1102; N277/G366/M763/T1102; N277/G366/D965/T1102; N277/G366/F1038/T1102; N277/G366/M763/D965/T1102; N277/G366/M763/F1038/T1102; N277/G366/D965/F1038/T1102; N277/G366/M763/D965/F1038/T1102; N277/F539/M763/T1102; N277/F539/D965/T1102; N277/F539/F1038/T1102; N277/F539/M763/D965/T1102; N277/F539/M763/F1038/T1102; N277/F539/D965/F1038/T1102; N277/F539/M763/D965/F1038/T1102; N277/I601/M763/T1102; N277/I601/D965/T1102; N277/I601/F1038/T1102; N277/I601/M763/D965/T1102; N277/I601/M763/F1038/T1102; N277/I601/D965/F1038/T1102; N277/I601/M763/D965/F1038/T1102; G366/F539/M763/T1102; G366/F539/D965/T1102; G366/F539/F1038/T1102; G366/F539/M763/D965/T1102; G366/F539/M763/F1038/T1102; G366/F539/D965/F1038/T1102; G366/F539/M763/D965/F1038/T1102; G366/I601/M763/T1102; G366/I601/D965/T1102; G366/I601/F1038/T1102; G366/I601/M763/D965/T1102; G366/I601/M763/F1038/T1102; G366/I601/D965/F1038/T1102; G366/I601/M763/D965/F1038/T1102; F539/I601/M763/T1102; F539/I601/D965/T1102; F539/I601/F1038/T1102; F539/I601/M763/D965/T1102; F539/I601/M763/F1038/T1102; F539/I601/D965/F1038/T1102; F539/I601/M763/D965/F1038/T1102; A203/N277/M763/D1127; A203/N277/D965/D1127; A203/N277/F1038/D1127; A203/N277/M763/D965/D1127; A203/N277/M763/F1038/D1127; A203/N277/D965/F1038/D1127; A203/N277/M763/D965/F1038/D1127; A203/G366/M763/D1127; A203/G366/D965/D1127; A203/G366/F1038/D1127; A203/G366/M763/D965/D1127; A203/G366/M763/F1038/D1127; A203/G366/D965/F1038/D1127; A203/G366/M763/D965/F1038/D1127; A203/F539/M763/D1127; A203/F539/D965/D1127; A203/F539/F1038/D1127; A203/F539/M763/D965/D1127; A203/F539/M763/F1038/D1127; A203/F539/D965/F1038/D1127; A203/F539/M763/D965/F1038/D1127; A203/I601/M763/D1127; A203/I601/D965/D1127; A203/I601/F1038/D1127; A203/I601/M763/D965/D1127; A203/I601/M763/F1038/D1127; A203/I601/D965/F1038/D1127; A203/I601/M763/D965/F1038/D1127; N277/G366/M763/D1127; N277/G366/D965/D1127; N277/G366/F1038/D1127; N277/G366/M763/D965/D1127; N277/G366/M763/F1038/D1127; N277/G366/D965/F1038/D1127; N277/G366/M763/D965/F1038/D1127; N277/F539/M763/D1127; N277/F539/D965/D1127; N277/F539/F1038/D1127; N277/F539/M763/D965/D1127; N277/F539/M763/F1038/D1127; N277/F539/D965/F1038/D1127; N277/F539/M763/D965/F1038/D1127; N277/I601/M763/D1127; N277/I601/D965/D1127; N277/I601/F1038/D1127; N277/I601/M763/D965/D1127; N277/I601/M763/F1038/D1127; N277/I601/D965/F1038/D1127; N277/I601/M763/D965/F1038/D1127; G366/F539/M763/D1127; G366/F539/D965/D1127; G366/F539/F1038/D1127; G366/F539/M763/D965/D1127; G366/F539/M763/F1038/D1127; G366/F539/D965/F1038/D1127; G366/F539/M763/D965/F1038/D1127; G366/I601/M763/D1127; G366/I601/D965/D1127; G366/I601/F1038/D1127; G366/I601/M763/D965/D1127; G366/I601/M763/F1038/D1127; G366/I601/D965/F1038/D1127; G366/I601/M763/D965/F1038/D1127; F539/I601/M763/D1127; F539/I601/D965/D1127; F539/I601/F1038/D1127; F539/I601/M763/D965/D1127; F539/I601/M763/F1038/D1127; F539/I601/D965/F1038/D1127; 또는 F539/I601/M763/D965/F1038/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/M763/T1102/D1127; A203/N277/D965/T1102/D1127; A203/N277/F1038/T1102/D1127; A203/N277/M763/D965/T1102/D1127; A203/N277/M763/F1038/T1102/D1127; A203/N277/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/M763/T1102/D1127; A203/G366/D965/T1102/D1127; A203/G366/F1038/T1102/D1127; A203/G366/M763/D965/T1102/D1127; A203/G366/M763/F1038/T1102/D1127; A203/G366/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/F539/M763/T1102/D1127; A203/F539/D965/T1102/D1127; A203/F539/F1038/T1102/D1127; A203/F539/M763/D965/T1102/D1127; A203/F539/M763/F1038/T1102/D1127; A203/F539/D965/F1038/T1102/D1127; A203/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/I601/M763/T1102/D1127; A203/I601/D965/T1102/D1127; A203/I601/F1038/T1102/D1127; A203/I601/M763/D965/T1102/D1127; A203/I601/M763/F1038/T1102/D1127; A203/I601/D965/F1038/T1102/D1127; A203/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/M763/T1102/D1127; N277/G366/D965/T1102/D1127; N277/G366/F1038/T1102/D1127; N277/G366/M763/D965/T1102/D1127; N277/G366/M763/F1038/T1102/D1127; N277/G366/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/M763/D965/F1038/T1102/D1127; N277/F539/M763/T1102/D1127; N277/F539/D965/T1102/D1127; N277/F539/F1038/T1102/D1127; N277/F539/M763/D965/T1102/D1127; N277/F539/M763/F1038/T1102/D1127; N277/F539/D965/F1038/T1102/D1127; N277/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127; N277/I601/M763/T1102/D1127; N277/I601/D965/T1102/D1127; N277/I601/F1038/T1102/D1127; N277/I601/M763/D965/T1102/D1127; N277/I601/M763/F1038/T1102/D1127; N277/I601/D965/F1038/T1102/D1127; N277/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; G366/F539/M763/T1102/D1127; G366/F539/D965/T1102/D1127; G366/F539/F1038/T1102/D1127; G366/F539/M763/D965/T1102/D1127; G366/F539/M763/F1038/T1102/D1127; G366/F539/D965/F1038/T1102/D1127; G366/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127; G366/I601/M763/T1102/D1127; G366/I601/D965/T1102/D1127; G366/I601/F1038/T1102/D1127; G366/I601/M763/D965/T1102/D1127; G366/I601/M763/F1038/T1102/D1127; G366/I601/D965/F1038/T1102/D1127; G366/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; F539/I601/M763/T1102/D1127; F539/I601/D965/T1102/D1127; F539/I601/F1038/T1102/D1127; F539/I601/M763/D965/T1102/D1127; F539/I601/M763/F1038/T1102/D1127; F539/I601/D965/F1038/T1102/D1127; 또는 F539/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/M763/T1102; A203/N277/G366/D965/T1102; A203/N277/G366/F1038/T1102; A203/N277/G366/M763/D965/T1102; A203/N277/G366/M763/F1038/T1102; A203/N277/G366/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/M763/D965/F1038/T1102; A203/N277/F539/M763/T1102; A203/N277/F539/D965/T1102; A203/N277/F539/F1038/T1102; A203/N277/F539/M763/D965/T1102; A203/N277/F539/M763/F1038/T1102; A203/N277/F539/D965/F1038/T1102; A203/N277/F539/M763/D965/F1038/T1102; A203/N277/I601/M763/T1102; A203/N277/I601/D965/T1102; A203/N277/I601/F1038/T1102; A203/N277/I601/M763/D965/T1102; A203/N277/I601/M763/F1038/T1102; A203/N277/I601/D965/F1038/T1102; A203/N277/I601/M763/D965/F1038/T1102; A203/G366/F539/M763/T1102; A203/G366/F539/D965/T1102; A203/G366/F539/F1038/T1102; A203/G366/F539/M763/D965/T1102; A203/G366/F539/M763/F1038/T1102; A203/G366/F539/D965/F1038/T1102; A203/G366/F539/M763/D965/F1038/T1102; A203/G366/I601/M763/T1102; A203/G366/I601/D965/T1102; A203/G366/I601/F1038/T1102; A203/G366/I601/M763/D965/T1102; A203/G366/I601/M763/F1038/T1102; A203/G366/I601/D965/F1038/T1102; A203/G366/I601/M763/D965/F1038/T1102; A203/F539/I601/M763/T1102; A203/F539/I601/D965/T1102; A203/F539/I601/F1038/T1102; A203/F539/I601/M763/D965/T1102; A203/F539/I601/M763/F1038/T1102; A203/F539/I601/D965/F1038/T1102; A203/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102; N277/G366/F539/M763/T1102; N277/G366/F539/D965/T1102; N277/G366/F539/F1038/T1102; N277/G366/F539/M763/D965/T1102; N277/G366/F539/M763/F1038/T1102; N277/G366/F539/D965/F1038/T1102; N277/G366/F539/M763/D965/F1038/T1102; N277/G366/I601/M763/T1102; N277/G366/I601/D965/T1102; N277/G366/I601/F1038/T1102; N277/G366/I601/M763/D965/T1102; N277/G366/I601/M763/F1038/T1102; N277/G366/I601/D965/F1038/T1102; N277/G366/I601/M763/D965/F1038/T1102; G366/F539/I601/M763/T1102; G366/F539/I601/D965/T1102; G366/F539/I601/F1038/T1102; G366/F539/I601/M763/D965/T1102; G366/F539/I601/M763/F1038/T1102; G366/F539/I601/D965/F1038/T1102; G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/M763/D1127; A203/N277/G366/D965/D1127; A203/N277/G366/F1038/D1127; A203/N277/G366/M763/D965/D1127; A203/N277/G366/M763/F1038/D1127; A203/N277/G366/D965/F1038/D1127; A203/N277/G366/M763/D965/F1038/D1127; A203/N277/F539/M763/D1127; A203/N277/F539/D965/D1127; A203/N277/F539/F1038/D1127; A203/N277/F539/M763/D965/D1127; A203/N277/F539/M763/F1038/D1127; A203/N277/F539/D965/F1038/D1127; A203/N277/F539/M763/D965/F1038/D1127; A203/N277/I601/M763/D1127; A203/N277/I601/D965/D1127; A203/N277/I601/F1038/D1127; A203/N277/I601/M763/D965/D1127; A203/N277/I601/M763/F1038/D1127; A203/N277/I601/D965/F1038/D1127; A203/N277/I601/M763/D965/F1038/D1127; A203/G366/F539/M763/D1127; A203/G366/F539/D965/D1127; A203/G366/F539/F1038/D1127; A203/G366/F539/M763/D965/D1127; A203/G366/F539/M763/F1038/D1127; A203/G366/F539/D965/F1038/D1127; A203/G366/F539/M763/D965/F1038/D1127; A203/G366/I601/M763/D1127; A203/G366/I601/D965/D1127; A203/G366/I601/F1038/D1127; A203/G366/I601/M763/D965/D1127; A203/G366/I601/M763/F1038/D1127; A203/G366/I601/D965/F1038/D1127; A203/G366/I601/M763/D965/F1038/D1127; A203/F539/I601/M763/D1127; A203/F539/I601/D965/D1127; A203/F539/I601/F1038/D1127; A203/F539/I601/M763/D965/D1127; A203/F539/I601/M763/F1038/D1127; A203/F539/I601/D965/F1038/D1127; A203/F539/I601/M763/D965/F1038/D1127; N277/G366/F539/M763/D1127; N277/G366/F539/D965/D1127; N277/G366/F539/F1038/D1127; N277/G366/F539/M763/D965/D1127; N277/G366/F539/M763/F1038/D1127; N277/G366/F539/D965/F1038/D1127; N277/G366/F539/M763/D965/F1038/D1127; N277/G366/I601/M763/D1127; N277/G366/I601/D965/D1127; N277/G366/I601/F1038/D1127; N277/G366/I601/M763/D965/D1127; N277/G366/I601/M763/F1038/D1127; N277/G366/I601/D965/F1038/D1127; N277/G366/I601/M763/D965/F1038/D1127; G366/F539/I601/M763/D1127; G366/F539/I601/D965/D1127; G366/F539/I601/F1038/D1127; G366/F539/I601/M763/D965/D1127; G366/F539/I601/M763/F1038/D1127; G366/F539/I601/D965/F1038/D1127; 또는 G366/F539/I601/M763/D965/F1038/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/M763/T1102/D1127; A203/N277/G366/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/M763/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/M763/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/T1102/D1127; A203/N277/F539/D965/T1102/D1127; A203/N277/F539/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/D965/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/T1102/D1127; A203/N277/I601/D965/T1102/D1127; A203/N277/I601/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/D965/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/T1102/D1127; A203/G366/F539/D965/T1102/D1127; A203/G366/F539/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/D965/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/T1102/D1127; A203/G366/I601/D965/T1102/D1127; A203/G366/I601/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/D965/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/T1102/D1127; A203/F539/I601/D965/T1102/D1127; A203/F539/I601/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/D965/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/D965/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/T1102/D1127; N277/G366/F539/D965/T1102/D1127; N277/G366/F539/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/D965/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/T1102/D1127; N277/G366/I601/D965/T1102/D1127; N277/G366/I601/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/D965/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/T1102/D1127; G366/F539/I601/D965/T1102/D1127; G366/F539/I601/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/D965/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/D965/F1038/T1102/D1127; 또는 G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539/M763/T1102; A203/N277/G366/F539/D965/T1102; A203/N277/G366/F539/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/D965/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/T1102; A203/N277/G366/I601/D965/T1102; A203/N277/G366/I601/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/D965/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/D965/F1038/T1102; N277/G366/F539/I601/M763/T1102; N277/G366/F539/I601/D965/T1102; N277/G366/F539/I601/F1038/T1102; N277/G366/F539/I601/M763/D965/T1102; N277/G366/F539/I601/M763/F1038/T1102; N277/G366/F539/I601/D965/F1038/T1102; N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/M763/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/D965/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/M763/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/D1127; A203/N277/G366/F539/D965/D1127; A203/N277/G366/F539/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/D965/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/D965/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/D965/F1038/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/D1127; A203/N277/G366/I601/D965/D1127; A203/N277/G366/I601/F1038/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/D965/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/F1038/D1127; A203/N277/G366/I601/D965/F1038/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/D965/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/D1127; N277/G366/F539/I601/D965/D1127; N277/G366/F539/I601/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/D965/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/D965/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/D965/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/D965/F1038/D1127; 또는 A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539/M763/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/D965/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/D965/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/D965/F1038/T1102/D1127; 또는 A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 셋 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및/또는 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및/또는 제 2-3영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 제 3-1 영역 중 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763/K890/T1102; K890/D965/T1102; K890/F1038/T1102; M763/K890/D1127; K890/D965/D1127; K890/F1038/D1127; M763/K890/T1102/D1127; K890/D965/T1102/D1127; 또는 K890/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763/K890/D965/T1102; M763/K890/F1038/T1102; K890/D965/F1038/T1102; M763/K890/D965/D1127; M763/K890/F1038/D1127; K890/D965/F1038/D1127; M763/K890/D965/T1102/D1127; M763/K890/F1038/T1102/D1127; 또는 K890/D965/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763/K890/D965/F1038/T1102; M763/K890/D965/F1038/D1127 또는 M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 셋 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및/또는 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및/또는 제 2-3영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 제 3-1 영역 중 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/M763/K890/T1102; A203/K890/D965/T1102; A203/K890/F1038/T1102; A203/M763/K890/D965/T1102; A203/M763/K890/F1038/T1102; A203/K890/D965/F1038/T1102; A203/M763/K890/D965/F1038/T1102; N277/M763/K890/T1102; N277/K890/D965/T1102; N277/K890/F1038/T1102; N277/M763/K890/D965/T1102; N277/M763/K890/F1038/T1102; N277/K890/D965/F1038/T1102; N277/M763//K890D965/F1038/T1102; G366/M763/K890/T1102; G366/K890/D965/T1102; G366/K890/F1038/T1102; G366/M763/K890/D965/T1102; G366/M763/K890/F1038/T1102; G366/K890/D965/F1038/T1102; G366/M763/K890/D965/F1038/T1102; F539/M763/K890/T1102; F539/K890/D965/T1102; F539/K890/F1038/T1102; F539/M763/K890/D965/T1102; F539/M763/K890/F1038/T1102; F539/K890/D965/F1038/T1102; F539/M763/K890/D965/F1038/T1102; I601/M763/K890/T1102; I601/K890/D965/T1102; I601/K890/F1038/T1102; I601/M763/K890/D965/T1102; I601/M763/K890/F1038/T1102; I601/K890/D965/F1038/T1102; I601/M763/K890/D965/F1038/T1102; A203/M763/K890/D1127; A203/K890/D965/D1127; A203/K890/F1038/D1127; A203/M763/K890/D965/D1127; A203/M763/K890/F1038/D1127; A203/K890/D965/F1038/D1127; A203/M763/K890/D965/F1038/D1127; N277/M763/K890/D1127; N277/K890/D965/D1127; N277/K890/F1038/D1127; N277/M763/K890/D965/D1127; N277/M763/K890/F1038/D1127; N277/K890/D965/F1038/D1127; N277/M763//K890D965/F1038/D1127; G366/M763/K890/D1127; G366/K890/D965/D1127; G366/K890/F1038/D1127; G366/M763/K890/D965/D1127; G366/M763/K890/F1038/D1127; G366/K890/D965/F1038/D1127; G366/M763/K890/D965/F1038/D1127; F539/M763/K890/D1127; F539/K890/D965/D1127; F539/K890/F1038/D1127; F539/M763/K890/D965/D1127; F539/M763/K890/F1038/D1127; F539/K890/D965/F1038/D1127; F539/M763/K890/D965/F1038/D1127; I601/M763/K890/D1127; I601/K890/D965/D1127; I601/K890/F1038/D1127; I601/M763/K890/D965/D1127; I601/M763/K890/F1038/D1127; I601/K890/D965/F1038/D1127; 또는 I601/M763/K890/D965/F1038/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/M763/K890/T1102/D1127; A203/K890/D965/T1102/D1127; A203/K890/F1038/T1102/D1127; A203/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/M763/K890/T1102/D1127; N277/K890/D965/T1102/D1127; N277/K890/F1038/T1102/D1127; N277/M763/K890/D965/T1102/D1127; N277/M763/K890/F1038/T1102/D1127; N277/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/M763//K890D965/F1038/T1102/D1127; G366/M763/K890/T1102/D1127; G366/K890/D965/T1102/D1127; G366/K890/F1038/T1102/D1127; G366/M763/K890/D965/T1102/D1127; G366/M763/K890/F1038/T1102/D1127; G366/K890/D965/F1038/T1102/D1127; G366/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; F539/M763/K890/T1102/D1127; F539/K890/D965/T1102/D1127; F539/K890/F1038/T1102/D1127; F539/M763/K890/D965/T1102/D1127; F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127; F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127; F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; I601/M763/K890/T1102/D1127; I601/K890/D965/T1102/D1127; I601/K890/F1038/T1102/D1127; I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; 또는 I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/M763/K890/T1102; A203/N277/K890/D965/T1102; A203/N277/K890/F1038/T1102; A203/N277/M763/K890/D965/T1102; A203/N277/M763/K890/F1038/T1102; A203/N277/K890/D965/F1038/T1102; A203/N277/M763/K890/D965/F1038/T1102; A203/G366/M763/K890/T1102; A203/G366/K890/D965/T1102; A203/G366/K890/F1038/T1102; A203/G366/M763/K890/D965/T1102; A203/G366/M763/K890/F1038/T1102; A203/G366/K890/D965/F1038/T1102; A203/G366/M763/K890/D965/F1038/T1102; A203/F539/M763/K890/T1102; A203/F539/K890/D965/T1102; A203/F539/K890/F1038/T1102; A203/F539/M763/K890/D965/T1102; A203/F539/M763/K890/F1038/T1102; A203/F539/K890/D965/F1038/T1102; A203/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102; A203/I601/M763/K890/T1102; A203/I601/K890/D965/T1102; A203/I601/K890/F1038/T1102; A203/I601/M763/K890/D965/T1102; A203/I601/M763/K890/F1038/T1102; A203/I601/K890/D965/F1038/T1102; A203/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102; N277/G366/M763/K890/T1102; N277/G366/K890/D965/T1102; N277/G366/K890/F1038/T1102; N277/G366/M763/K890/D965/T1102; N277/G366/M763/K890/F1038/T1102; N277/G366/K890/D965/F1038/T1102; N277/G366/M763/K890/D965/F1038/T1102; N277/F539/M763/K890/T1102; N277/F539/K890/D965/T1102; N277/F539/K890/F1038/T1102; N277/F539/M763/K890/D965/T1102; N277/F539/M763/K890/F1038/T1102; N277/F539/K890/D965/F1038/T1102; N277/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102; N277/I601/M763/K890/T1102; N277/I601/K890/D965/T1102; N277/I601/K890/F1038/T1102; N277/I601/M763/K890/D965/T1102; N277/I601/M763/K890/F1038/T1102; N277/I601/K890/D965/F1038/T1102; N277/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102; G366/F539/M763/K890/T1102; G366/F539/K890/D965/T1102; G366/F539/K890/F1038/T1102; G366/F539/M763/K890/D965/T1102; G366/F539/M763/K890/F1038/T1102; G366/F539/K890/D965/F1038/T1102; G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102; G366/I601/M763/K890/T1102; G366/I601/K890/D965/T1102; G366/I601/K890/F1038/T1102; G366/I601/M763/K890/D965/T1102; G366/I601/M763/K890/F1038/T1102; G366/I601/K890/D965/F1038/T1102; G366/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102; F539/I601/M763/K890/T1102; F539/I601/K890/D965/T1102; F539/I601/K890/F1038/T1102; F539/I601/M763/K890/D965/T1102; F539/I601/M763/K890/F1038/T1102; F539/I601/K890/D965/F1038/T1102; F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102; A203/N277/M763/K890/D1127; A203/N277/K890/D965/D1127; A203/N277/K890/F1038/D1127; A203/N277/M763/K890/D965/D1127; A203/N277/M763/K890/F1038/D1127; A203/N277/K890/D965/F1038/D1127; A203/N277/M763/K890/D965/F1038/D1127; A203/G366/M763/K890/D1127; A203/G366/K890/D965/D1127; A203/G366/K890/F1038/D1127; A203/G366/M763/K890/D965/D1127; A203/G366/M763/K890/F1038/D1127; A203/G366/K890/D965/F1038/D1127; A203/G366/M763/K890/D965/F1038/D1127; A203/F539/M763/K890/D1127; A203/F539/K890/D965/D1127; A203/F539/K890/F1038/D1127; A203/F539/M763/K890/D965/D1127; A203/F539/M763/K890/F1038/D1127; A203/F539/K890/D965/F1038/D1127; A203/F539/M763/K890/D965/F1038/D1127; A203/I601/M763/K890/D1127; A203/I601/K890/D965/D1127; A203/I601/K890/F1038/D1127; A203/I601/M763/K890/D965/D1127; A203/I601/M763/K890/F1038/D1127; A203/I601/K890/D965/F1038/D1127; A203/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127; N277/G366/M763/K890/D1127; N277/G366/K890/D965/D1127; N277/G366/K890/F1038/D1127; N277/G366/M763/K890/D965/D1127; N277/G366/M763/K890/F1038/D1127; N277/G366/K890/D965/F1038/D1127; N277/G366/M763/K890/D965/F1038/D1127; N277/F539/M763/K890/D1127; N277/F539/K890/D965/D1127; N277/F539/K890/F1038/D1127; N277/F539/M763/K890/D965/D1127; N277/F539/M763/K890/F1038/D1127; N277/F539/K890/D965/F1038/D1127; N277/F539/M763/K890/D965/F1038/D1127; N277/I601/M763/K890/D1127; N277/I601/K890/D965/D1127; N277/I601/K890/F1038/D1127; N277/I601/M763/K890/D965/D1127; N277/I601/M763/K890/F1038/D1127; N277/I601/K890/D965/F1038/D1127; N277/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127; G366/F539/M763/K890/D1127; G366/F539/K890/D965/D1127; G366/F539/K890/F1038/D1127; G366/F539/M763/K890/D965/D1127; G366/F539/M763/K890/F1038/D1127; G366/F539/K890/D965/F1038/D1127; G366/F539/M763/K890/D965/F1038/D1127; G366/I601/M763/K890/D1127; G366/I601/K890/D965/D1127; G366/I601/K890/F1038/D1127; G366/I601/M763/K890/D965/D1127; G366/I601/M763/K890/F1038/D1127; G366/I601/K890/D965/F1038/D1127; G366/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127; F539/I601/M763/K890/D1127; F539/I601/K890/D965/D1127; F539/I601/K890/F1038/D1127; F539/I601/M763/K890/D965/D1127; F539/I601/M763/K890/F1038/D1127; F539/I601/K890/D965/F1038/D1127; 또는 F539/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/M763/K890/T1102/D1127; A203/N277/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/M763/K890/T1102/D1127; A203/G366/K890/D965/T1102/D1127; A203/G366/K890/F1038/T1102/D1127; A203/G366/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/G366/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/G366/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/F539/M763/K890/T1102/D1127; A203/F539/K890/D965/T1102/D1127; A203/F539/K890/F1038/T1102/D1127; A203/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/I601/M763/K890/T1102/D1127; A203/I601/K890/D965/T1102/D1127; A203/I601/K890/F1038/T1102/D1127; A203/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/M763/K890/T1102/D1127; N277/G366/K890/D965/T1102/D1127; N277/G366/K890/F1038/T1102/D1127; N277/G366/M763/K890/D965/T1102/D1127; N277/G366/M763/K890/F1038/T1102/D1127; N277/G366/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/F539/M763/K890/T1102/D1127; N277/F539/K890/D965/T1102/D1127; N277/F539/K890/F1038/T1102/D1127; N277/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127; N277/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127; N277/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/I601/M763/K890/T1102/D1127; N277/I601/K890/D965/T1102/D1127; N277/I601/K890/F1038/T1102/D1127; N277/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; N277/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; N277/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; G366/F539/M763/K890/T1102/D1127; G366/F539/K890/D965/T1102/D1127; G366/F539/K890/F1038/T1102/D1127; G366/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127; G366/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127; G366/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127; G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; G366/I601/M763/K890/T1102/D1127; G366/I601/K890/D965/T1102/D1127; G366/I601/K890/F1038/T1102/D1127; G366/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; G366/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; G366/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; G366/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; F539/I601/M763/K890/T1102/D1127; F539/I601/K890/D965/T1102/D1127; F539/I601/K890/F1038/T1102/D1127; F539/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; F539/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; F539/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; 또는 F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/M763/K890/T1102; A203/N277/G366/K890/D965/T1102; A203/N277/G366/K890/F1038/T1102; A203/N277/G366/M763/K890/D965/T1102; A203/N277/G366/M763/K890/F1038/T1102; A203/N277/G366/K890/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/M763/K890/D965/F1038/T1102; A203/N277/F539/M763/K890/T1102; A203/N277/F539/K890/D965/T1102; A203/N277/F539/K890/F1038/T1102; A203/N277/F539/M763/K890/D965/T1102; A203/N277/F539/M763/K890/F1038/T1102; A203/N277/F539/K890/D965/F1038/T1102; A203/N277/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102; A203/N277/I601/M763/K890/T1102; A203/N277/I601/K890/D965/T1102; A203/N277/I601/K890/F1038/T1102; A203/N277/I601/M763/K890/D965/T1102; A203/N277/I601/M763/K890/F1038/T1102; A203/N277/I601/K890/D965/F1038/T1102; A203/N277/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102; A203/G366/F539/M763/K890/T1102; A203/G366/F539/K890/D965/T1102; A203/G366/F539/K890/F1038/T1102; A203/G366/F539/M763/K890/D965/T1102; A203/G366/F539/M763/K890/F1038/T1102; A203/G366/F539/K890/D965/F1038/T1102; A203/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102; A203/G366/I601/M763/K890/T1102; A203/G366/I601/K890/D965/T1102; A203/G366/I601/K890/F1038/T1102; A203/G366/I601/M763/K890/D965/T1102; A203/G366/I601/M763/K890/F1038/T1102; A203/G366/I601/K890/D965/F1038/T1102; A203/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102; A203/F539/I601/M763/K890/T1102; A203/F539/I601/K890/D965/T1102; A203/F539/I601/K890/F1038/T1102; A203/F539/I601/M763/K890/D965/T1102; A203/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102; A203/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102; A203/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102; N277/G366/F539/M763/K890/T1102; N277/G366/F539/K890/D965/T1102; N277/G366/F539/K890/F1038/T1102; N277/G366/F539/M763/K890/D965/T1102; N277/G366/F539/M763/K890/F1038/T1102; N277/G366/F539/K890/D965/F1038/T1102; N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102; N277/G366/I601/M763/K890/T1102; N277/G366/I601/K890/D965/T1102; N277/G366/I601/K890/F1038/T1102; N277/G366/I601/M763/K890/D965/T1102; N277/G366/I601/M763/K890/F1038/T1102; N277/G366/I601/K890/D965/F1038/T1102; N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102; G366/F539/I601/M763/K890/T1102; G366/F539/I601/K890/D965/T1102; G366/F539/I601/K890/F1038/T1102; G366/F539/I601/M763/K890/D965/T1102; G366/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102; G366/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102; G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102 또는 A203/N277/G366/M763/K890/D1127; A203/N277/G366/K890/D965/D1127; A203/N277/G366/K890/F1038/D1127; A203/N277/G366/M763/K890/D965/D1127; A203/N277/G366/M763/K890/F1038/D1127; A203/N277/G366/K890/D965/F1038/D1127; A203/N277/G366/M763/K890/D965/F1038/D1127; A203/N277/F539/M763/K890/D1127; A203/N277/F539/K890/D965/D1127; A203/N277/F539/K890/F1038/D1127; A203/N277/F539/M763/K890/D965/D1127; A203/N277/F539/M763/K890/F1038/D1127; A203/N277/F539/K890/D965/F1038/D1127; A203/N277/F539/M763/K890/D965/F1038/D1127; A203/N277/I601/M763/K890/D1127; A203/N277/I601/K890/D965/D1127; A203/N277/I601/K890/F1038/D1127; A203/N277/I601/M763/K890/D965/D1127; A203/N277/I601/M763/K890/F1038/D1127; A203/N277/I601/K890/D965/F1038/D1127; A203/N277/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127; A203/G366/F539/M763/K890/D1127; A203/G366/F539/K890/D965/D1127; A203/G366/F539/K890/F1038/D1127; A203/G366/F539/M763/K890/D965/D1127; A203/G366/F539/M763/K890/F1038/D1127; A203/G366/F539/K890/D965/F1038/D1127; A203/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/D1127; A203/G366/I601/M763/K890/D1127; A203/G366/I601/K890/D965/D1127; A203/G366/I601/K890/F1038/D1127; A203/G366/I601/M763/K890/D965/D1127; A203/G366/I601/M763/K890/F1038/D1127; A203/G366/I601/K890/D965/F1038/D1127; A203/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/D1127; A203/F539/I601/K890/D965/D1127; A203/F539/I601/K890/F1038/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/D965/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/F1038/D1127; A203/F539/I601/K890/D965/F1038/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/D1127; N277/G366/F539/K890/D965/D1127; N277/G366/F539/K890/F1038/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/D965/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/F1038/D1127; N277/G366/F539/K890/D965/F1038/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/D1127; N277/G366/I601/K890/D965/D1127; N277/G366/I601/K890/F1038/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/D965/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/F1038/D1127; N277/G366/I601/K890/D965/F1038/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/D1127; G366/F539/I601/K890/D965/D1127; G366/F539/I601/K890/F1038/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/D965/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/F1038/D1127; G366/F539/I601/K890/D965/F1038/D1127; 또는 G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/M763/K890/T1102/D1127; A203/N277/G366/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/K890/T1102/D1127; A203/N277/F539/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/F539/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/K890/T1102/D1127; A203/N277/I601/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/I601/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/K890/T1102/D1127; A203/G366/F539/K890/D965/T1102/D1127; A203/G366/F539/K890/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/K890/T1102/D1127; A203/G366/I601/K890/D965/T1102/D1127; A203/G366/I601/K890/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/T1102/D1127; A203/F539/I601/K890/D965/T1102/D1127; A203/F539/I601/K890/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/T1102/D1127; N277/G366/F539/K890/D965/T1102/D1127; N277/G366/F539/K890/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/T1102/D1127; N277/G366/I601/K890/D965/T1102/D1127; N277/G366/I601/K890/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/T1102/D1127; G366/F539/I601/K890/D965/T1102/D1127; G366/F539/I601/K890/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; 또는 G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539/M763/K890/T1102; A203/N277/G366/F539/K890/D965/T1102; A203/N277/G366/F539/K890/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/K890/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/K890/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/K890/T1102; A203/N277/G366/I601/K890/D965/T1102; A203/N277/G366/I601/K890/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/K890/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/K890/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102; N277/G366/F539/I601/M763/K890/T1102; N277/G366/F539/I601/K890/D965/T1102; N277/G366/F539/I601/K890/F1038/T1102; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/T1102; N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102; N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/K890/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D1127; A203/N277/G366/F539/K890/D965/D1127; A203/N277/G366/F539/K890/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/K890/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/K890/D965/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/K890/D1127; A203/N277/G366/I601/K890/D965/D1127; A203/N277/G366/I601/K890/F1038/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/K890/F1038/D1127; A203/N277/G366/I601/K890/D965/F1038/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/D965/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/D1127; 또는 A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539/M763/K890/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/K890/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/D965/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; 또는 A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 제거시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697; 제 2 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039; 제 3 영역 중 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, V838, D839, H840, K848, D849, D850, D853, N854, K855, R859, D861, K862, N863, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, A889, K890, L891, R895, K896 및 D898; 및/또는 제 4 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 제거시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시킨 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203(소수성 지표: 1.8)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203(소수성 지표: 1.8)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아스파르트산(소수성 지표: -3.5)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 중 G366(소수성 지표: -0.4)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민산, 글루타민, 히스티딘, 라이신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 중 G366(소수성 지표: -0.4)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 I601(소수성 지표: 4.5)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 I601(소수성 지표: 4.5)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아스파라긴(소수성 지표: -3.5)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 A203(소수성 지표: 1.8), G366(소수성 지표: -0.4), F539(소수성 지표: 2.8) 및 I601(소수성 지표: 4.5)를 각각 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203(소수성 지표: 1.8)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아스파르트산(소수성 지표: -3.5)으로 치환하고, 제 1-2 영역 중 G366(소수성 지표: -0.4)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환하고, 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환하고, 제 1-3 영역 중 I601(소수성 지표: 4.5)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아스파라긴(소수성 지표: -3.5)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 N277(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 알라닌, 시스테인, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 N277(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 히스티딘(소수성 지표: -3.2)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작거나 큰 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 A203(소수성 지표: 1.8), N277(소수성 지표: -3.5), G366(소수성 지표: -0.4), F539(소수성 지표: 2.8) 및 I601(소수성 지표: 4.5)를 각각 상대적으로 소수성 지표가 작거나 큰 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203(소수성 지표: 1.8)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아스파르트산(소수성 지표: -3.5)으로 치환하고, 제 1-1 영역 중 N277(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 히스티딘(소수성 지표: -3.2)으로 치환하고, 제 1-2 영역 중 G366(소수성 지표: -0.4)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환하고, 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환하고, 제 1-3 영역 중 I601(소수성 지표: 4.5)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아스파라긴(소수성 지표: -3.5)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539를 상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539를 상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민산, 글루타민, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산인 아스파르트산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 상대적으로 작거나 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 A203, N277, G366, F539 및 I601를 각각 상대적으로 작거나 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203 및 N277, 제 1-2 영역 중 G366, 제 1-3 영역 중 I601을 각각 상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산인 아스파르트산, 히스티딘, 세린, 아스파라긴으로 치환시키고, 제 1-3 영역 중 F539를 상대적으로 작은 기능기를 가지는 세린으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및/또는 제 2-3 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 시스테인, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 중 D965(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 알라닌, 시스테인, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 중 D965(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 타이로신(소수성 지표: -1.3)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및/또는 제 2-3 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9) 및 D965(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시키고, 제 2-3 영역 중 D965(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 타이로신(소수성 지표: -1.3)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및/또는 제 2-3 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 중 F1037 및/또는 F1038을 각각 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 중 F1038(소수성 지표: 2.8)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 타이로신(소수성 지표: -1.3)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 중 F1037(소수성 지표: 2.8)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아르기닌(소수성 지표: -4.5)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및/또는 제 2-3 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작거나 큰 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및/또는 제 2-3 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9), D965(소수성 지표: -3.5) 및 F1038(소수성 지표: 2.8)을 상대적으로 소수성 지표가 작거나 큰 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시키고, 제 2-3 영역 중 D965(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 타이로신(소수성 지표: -1.3)으로 치환시키고, 제 2-3 영역 중 F1038(소수성 지표: 2.8)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 타이로신(소수성 지표: -1.3)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, V838, D839, H840, K848, D849, D850, D853, N854, K855, R859, D861, K862, N863, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, A889, K890, L891, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K890(소수성 지표: -3.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K890(소수성 지표: -3.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아스파라긴(소수성 지표: -3.5)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, V838, D839, H840, K848, D849, D850, D853, N854, K855, R859, D861, K862, N863, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, A889, K890, L891, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 전하를 가지지 않는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 글루타민으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, V838, D839, H840, K848, D849, D850, D853, N854, K855, R859, D861, K862, N863, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, A889, K890, L891, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K890 및/또는 K896을 각각 상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글리신, 아이소류신, 류신, 프롤린, 세린, 트레오닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K890을 상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산인 아스파르트산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K896을 상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민산, 글루타민, 라이신, 프롤린, 세린, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102(소수성 지표: -0.7)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 프롤린(소수성 지표: -1.6)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 S1106을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 알라닌, 시스테인, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 S1106(소수성 지표: -0.8)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 글리신(소수성 지표: -0.4)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작거나 큰 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102 및 S1136을 각각 상대적으로 소수성 지표가 작거나 큰 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102(소수성 지표: -0.7)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 프롤린(소수성 지표: -1.6)으로 치환시키고, S1106(소수성 지표: -0.8)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 글리신(소수성 지표: -0.4)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102을 상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102을 상대적으로 작은 기능기를 가지는 프롤린으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 D1127을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 D1127을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 글루타민산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 상대적으로 작거나 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102 및 D1127을 상대적으로 작거나 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102을 상대적으로 작은 기능기를 가지는 프롤린으로 치환시키고, D1127을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 글루타민산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
이때, 각 영역에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 치환 관련 설명은 상기 기술한 바와 같다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9) 및/또는 A764(소수성 지표: 1.8)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 시스테인, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환시키고, 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 I601(소수성 지표: 4.5)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 2-3 영역 중 D965(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 알라닌, 시스테인, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 I601(소수성 지표: 4.5)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아스파라긴(소수성 지표: -3.5)으로 치환시키고, 제 2-3 영역 중 D965(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 타이로신(소수성 지표: -1.3)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203(소수성 지표: 1.8)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9) 및/또는 A764(소수성 지표: 1.8)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 시스테인, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203(소수성 지표: 1.8)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아스파르트산(소수성 지표: -3.5)으로 치환시키고, 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환시키고, 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539 및/또는 I601을 각각 극성을 가지는 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민산, 글루타민, 히스티딘, 라이신, 세린, 트레오닌 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 3-1 영역 중 K890(소수성 지표: -3.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539 및 I601을 각각 극성을 가지는 아미노산인 트레오닌 및 글루타민산으로 치환시키고, 제 3-1 영역 중 K890(소수성 지표: -3.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아스파라긴(소수성 지표: -3.5)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203(소수성 지표: 1.8)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 4-1 영역 중 T1102을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민산, 글루타민, 라이신, 프롤린, 세린, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203(소수성 지표: 1.8)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아스파르트산(소수성 지표: -3.5)으로 치환시키고, 제 4-1 영역 중 T1102(소수성 지표: -0.7)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 프롤린(소수성 지표: -1.6)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 4-1 영역 중 D1127을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환시키고, 제 4-1 영역 중 D1127을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 글루타민산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9) 및/또는 A764(소수성 지표: 1.8)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 시스테인, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시키고, 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 중 F1037 및/또는 F1038을 각각 극성을 가지는 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민산, 글루타민, 히스티딘, 라이신, 세린, 트레오닌 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 3-1 영역 중 K890(소수성 지표: -3.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 중 F1038을 극성을 가지는 아미노산인 타이로신으로 치환시키고, 제 3-1 영역 중 K890(소수성 지표: -3.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아스파라긴(소수성 지표: -3.5)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9) 및/또는 A764(소수성 지표: 1.8)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 시스테인, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 2-3 영역 중 F1037 및/또는 F1038을 각각 극성을 가지는 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민산, 글루타민, 히스티딘, 라이신, 세린, 트레오닌 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 및 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시키고, 제 2-3 영역 중 F1038을 극성을 가지는 아미노산인 타이로신으로 치환시키고, 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9) 및/또는 A764(소수성 지표: 1.8)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 시스테인, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 4-1 영역 중 T1102을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민산, 글루타민, 라이신, 프롤린, 세린, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시키고, 제 4-1 영역 중 T1102(소수성 지표: -0.7)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 프롤린(소수성 지표: -1.6)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 중 F1037 및/또는 F1038을 각각 극성을 가지는 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민산, 글루타민, 히스티딘, 라이신, 세린, 트레오닌 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 4-1 영역 중 D1127을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 중 F1038을 극성을 가지는 아미노산인 타이로신으로 치환시키고, 제 4-1 영역 중 D1127을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 글루타민산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 4-1 영역 중 T1102을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민산, 글루타민, 라이신, 프롤린, 세린, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시키고, 제 4-1 영역 중 T1102(소수성 지표: -0.7)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 프롤린(소수성 지표: -1.6)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K890(소수성 지표: -3.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 4-1 영역 중 D1127을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K890(소수성 지표: -3.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아스파라긴(소수성 지표: -3.5)으로 치환시키고, 제 4-1 영역 중 D1127을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 글루타민산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 제 3 영역 ; 및/또는 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9) 및/또는 A764(소수성 지표: 1.8)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 시스테인, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 및 제 3-1 영역 중 K890(소수성 지표: -3.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환시키고, 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시키고, 및 제 3-1 영역 중 K890(소수성 지표: -3.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아스파라긴(소수성 지표: -3.5)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539 및/또는 I601;및 제 2-3 영역 중 F1037 및/또는 F1038을 각각 극성을 가지는 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민산, 글루타민, 히스티딘, 라이신, 세린, 트레오닌 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 및 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 4-1 영역 중 T1102을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민산, 글루타민, 라이신, 프롤린, 세린, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539를 극성을 가지는 아미노산인 세린으로 치환시키고, 제 2-3 영역 중 F1038을 극성을 가지는 아미노산인 타이로신으로 치환시키고, 및 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시키고, 제 4-1 영역 중 T1102을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 프롤린(소수성 지표: -1.6)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 I601을 극성을 가지는 아미노산인 글루타민산으로 치환시키고, 제 2-3 영역 중 F1038을 극성을 가지는 아미노산인 타이로신으로 치환시키고, 및 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시키고, 제 4-1 영역 중 T1102을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 프롤린(소수성 지표: -1.6)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539 및 중 I601을 각각 극성을 가지는 아미노산인 세린 및 아스파라긴으로 치환시키고, 제 2-3 영역 중 F1038을 극성을 가지는 아미노산인 타이로신으로 치환시키고, 및 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시키고, 제 4-1 영역 중 T1102을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 프롤린(소수성 지표: -1.6)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539 및/또는 I601을 각각 극성을 가지는 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민산, 글루타민, 히스티딘, 라이신, 세린, 트레오닌 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9) 및/또는 A764(소수성 지표: 1.8)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 시스테인, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 및 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 I601을 극성을 가지는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시키고, 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시키고, 및 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539 및 중 I601을 각각 극성을 가지는 아미노산인 세린 및 아스파라긴으로 치환시키고, 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시키고, 및 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203(소수성 지표: 1.8)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9) 및/또는 A764(소수성 지표: 1.8)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 시스테인, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 및 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203(소수성 지표: 1.8)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아스파르트산(소수성 지표: -3.5)으로 치환시키고, 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시키고, 제 2-3 영역 중 F1038을 극성을 가지는 아미노산인 타이로신으로 치환시키고, 및 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 I601(소수성 지표: 4.5)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 2-3 영역 중 D965(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 알라닌, 시스테인, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 및 제 4-1 영역 중 T1102을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민산, 글루타민, 라이신, 프롤린, 세린, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 I601(소수성 지표: 4.5)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아스파라긴(소수성 지표: -3.5)으로 치환시키고, 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시키고, 제 2-3 영역 중 D965(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 타이로신(소수성 지표: -1.3)으로 치환시키고, 및 제 4-1 영역 중 T1102(소수성 지표: -0.7)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 프롤린(소수성 지표: -1.6)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203, N277; 제 1-2 영역 중 G366; 및 제 1-3 영역 중 F539, I601로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 작거나 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시키고; 제 2-2 영역 중 M763 및 제 2-3 영역 중 D956, F1038로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 상대적으로 작거나 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시키고; 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않은 아미노산으로 치환시키고, 제 4-1 영역 중 T1102 및 D1127로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 작거나 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 G366 및 제 1-3 영역 중 F539, I601을 각각 세린(상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산), 세린(상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산) 및 아스파라긴(상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산)으로 치환시키고, 제 2-2 영역 중 M763 및 제 2-3 영역 중 F1038을 각각 아이소류신(상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산) 및 타이로신(상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산)으로 치환시키고, 제 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않은 아스파라긴으로 치환시키고, 제 4-1 영역 중 D1127을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 글루타민산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203, N277, 제 1-3 영역 중 G366 및 제 1-3 영역 중 F539, I601을 각각 아스파르트산(상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산), 히스티딘(상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산), 세린(상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산), 세린(상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산) 및 아스파라긴(상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산)으로 치환시키고, 제 2-2 영역 중 M763 및 제 2-3 영역 중 D956, F1038을 각각 아이소류신(상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산), 타이로신(상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산) 및 타이로신(상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산)으로 치환시키고, 제 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않은 아스파라긴으로 치환시키고, 제 4-1 영역 중 T1102 및 D1127을 각각 프롤린(상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산) 및 글루타민산(상댁적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 TS-SpCas9의 일 실시예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539, M763 및/또는 K890을 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539을 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539을 세린으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 상기 F539을 세린으로 치환시킨 TS-SpCas9(F539S)는 야생형 SpCas9와 비교하여 SpCas9(F539S)의 REC 도메인과 표적 서열 및/또는 gRNA의 PAM distal end와의 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763을 시스테인, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763을 아이소류신으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 상기 M763을 아이소류신으로 치환시킨 TS-SpCas9(M763I)는 야생형 SpCas9과 비교하여 SpCas9(M763I)의 RuvC 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 K890을 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 K890을 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 상기 K890을 아스파라긴으로 치환시킨 TS-SpCas9(K890N)는 야생형 SpCas9과 비교하여 SpCas9(K890N)의 HNH 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539 및 M763을 각각 원래의 아미노산과다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539 및 M763을 각각 세린 및 아이소류신으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 상기 F539 및 M763을 각각 세린 및 아이소류신으로 치환시킨 TS-SpCas9(F539S, M763I)는 야생형 SpCas9와 비교하여 SpCas9(F539S, M763I)의 REC 도메인과 표적 서열 및/또는 gRNA의 PAM distal end와의 상호작용이 변화되고, SpCas9(F539S, M763I)의 RuvC 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예로서, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539 및 K890을 각각 원래의 아미노산과다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539 및 K890을 각각 세린 및 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 상기 F539 및 K890을 각각 세린 및 아스파라긴으로 치환시킨 TS-SpCas9(F539S, K890N)는 야생형 SpCas9와 비교하여 SpCas9(F539S, K890N)의 REC 도메인과 표적 서열 및/또는 gRNA의 PAM distal end와의 상호작용이 변화되고, SpCas9(F539S, K890N)의 HNH 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763 및 K890을 각각 원래의 아미노산과다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산은 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763 및 K890을 각각 아이소류신 및 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 상기 M763 및 K890을 각각 아이소류신 및 아스파라긴으로 치환시킨 TS-SpCas9(M763I, K890N)는 야생형 SpCas9와 비교하여 SpCas9(M763I, K890N)의 RuvC 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화되고, SpCas9(M763I, K890N)의 HNH 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539, M763 및 K890을 각각 원래의 아미노산과다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 아미노산일 수 있다.)
예를 들어, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539, M763 및 K890을 각각 세린, 아이소류신 및 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체(서열번호 11)일 수 있다. 이때, 상기 F539, M763 및 K890을 각각 세린, 아이소류신 및 아스파라긴으로 치환시킨 TS-SpCas9(F539S, M763I, K890N)는 야생형 SpCas9와 비교하여 SpCas9(F539S, M763I, K890N)의 REC 도메인과 표적 서열 및/또는 gRNA의 PAM distal end와의 상호작용이 변화되고, SpCas9(F539S, M763I, K890N)의 RuvC 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화되고, SpCas9(F539S, M763I, K890N)의 HNH 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 구현예에서, 상기 인위적으로 조작된 Cas9은 융합 단백질일 수 있다.
상기 융합 단백질(fusion protein)은 표적 특이적 Cas9과 하나 이상의 기능적 도메인을 포함하는 인위적으로 생산된 하나의 단백질일 수 있다.
상기 표적 특이적 Cas9 관련 설명은 상기 기술한 바와 같다.
상기 기능적 도메인 관련 설명은 상기 기술한 바와 같다.
예를 들어, 상기 융합 단백질은 TS-SpCas9과 디아미네이즈(deaminase)를 포함하는 인위적으로 생산된 하나의 단백질일 수 있다.
이때, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 D10, F539, M763 및 K890을 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또는 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539, M763, H840 및 K890을 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또는 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 D10, F539, M763, H840 및 K890을 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 디아미네이즈는 아데닌 디아미네이즈(adenine deaminase) 및/또는 시티딘 디아미네이즈(cytidine deaminase)일 수 있다.
이때, 상기 융합 단백질은 TS-SpCas9의 N 말단에 디아미네이즈가 융합된 형태의 인위적으로 생산된 하나의 단백질일 수 있다.
또는 상기 융합 단백질은 TS-SpCas9의 C 말단에 디아미네이즈가 융합된 형태의 인위적으로 생산된 하나의 단백질일 수 있다.
또는 상기 융합 단백질은 TS-SpCas9의 N 말단 및 C 말단에 각각 동일하거나 다른 디아미네이즈가 융합된 형태의 인위적으로 생산된 하나의 단백질일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 CRISPR 효소, 인위적으로 조작된 CRISPR 효소, CRISPR 효소 변이체, Cas9, 인위적으로 조작된 Cas9, Cas9 변이체 또는 표적 특이적 Cas9은 폴리펩타이드 또는 단백질일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 CRISPR 효소, 인위적으로 조작된 CRISPR 효소, CRISPR 효소 변이체, Cas9, 인위적으로 조작된 Cas9, Cas9 변이체 또는 표적 특이적 Cas9은 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산일 수 있다.
상기 CRISPR 효소, 인위적으로 조작된 CRISPR 효소, CRISPR 효소 변이체, Cas9, 인위적으로 조작된 Cas9, Cas9 변이체 또는 표적 특이적 Cas9을 도입하고자 하는 대상에 맞추어 코돈 최적화(codon optimization)된 것일 수 있다.
“코돈 최적화”는 고유 서열의 적어도 하나의 코돈을 숙주 세포의 유전자에 더욱 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체하면서, 고유 아미노상 서열을 유지함으로써 관심 숙주 세포에서의 발현의 증진을 위해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 의미한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대한 특정 편향을 가지며, 코돈 편향(유기체 간의 코돈 사용의 차이)은 종종 mRNA의 번역의 효율과 상호관련 되며, 이는 번역되는 코돈의 특성 및 특정 tRNA 분자의 이용가능성에 의해 좌우되는 것을 여겨진다. 세포에서 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩타이드 합성에 가장 빈번하게 사용되는 코돈을 반영한 것이다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화에 기초하여 주어진 유기체에서 최적의 유전자 발현을 위해 맞춤화될 수 있다.
상기 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산은 비벡터 형태일 수 있다.
상기 비벡터는 네이키드 DNA, DNA 복합체 또는 mRNA일 수 있다.
상기 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산은 벡터에 포함될 수 있다.
이때, 상기 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산은 하나의 벡터에 포함되거나 또는 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산이 분할되어 여러 개의 벡터에 포함될 수 있다.
상기 벡터는 플라스미드일 수 있다.
상기 벡터는 바이러스 또는 비바이러스 벡터일 수 있다.
상기 벡터는 하나 이상의 조절/제어 구성요소를 포함할 수 있다.
이때, 상기 조절/제어 구성요소는 포로모터, 인핸서, 인트론, 폴리아데닐화 신호, 코작 공통(Kozak consensus) 서열, 내부 리보솜 유입 부위(internal ribosome entry site, IRES), 스플라이스 억셉터 및/또는 2A 서열을 포함할 수 있다.
상기 프로모터는 RNA 중합효소 II에 의해 인식되는 프로모터일 수 있다.
상기 프로모터는 RNA 중합효소 III에 의해 인식되는 프로모터일 수 있다.
상기 프로모터는 유도성 프로모터일 수 있다.
상기 프로모터는 대상 특이적 프로모터일 수 있다.
상기 프로모터는 바이러스 또는 비바이러스 프로모터일 수 있다.
상기 프로모터는 제어 영역(폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 핵산)에 따라 적합한 프로모터를 이용할 수 있다.
예를 들어, CRISPR 효소를 위해 유용한 프로모터는 CMV, EF-1a, EFS, MSCV, PGK 또는 CAG 프로모터일 수 있다.
벡터는 바이러스 벡터 또는 재조합 바이러스 벡터일 수 있다.
상기 바이러스는 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스일 수 있다.
이때, 상기 DNA 바이러스는 이중가닥 DNA(dsDNA) 바이러스 또는 단일가닥 DNA(ssDNA) 바이러스 일 수 있다.
이때, 상기 RNA 바이러스는 단일가닥 RNA(ssRNA) 바이러스일 수 있다.
상기 바이러스는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 백시니아바이러스, 폭스바이러스 또는 단순포진 바이러스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일반적으로 바이러스는 숙주(예를 들면, 세포)를 감염시켜, 숙주 내에 바이러스의 유전정보를 암호화하는 핵산을 도입시키거나 숙주의 게놈 내로 유전정보를 암호화하는 핵산을 삽입시킬 수 있다. 이러한 특징을 가지는 바이러스를 이용하여 대상 내로 가이드핵산 및/또는 에디터단백질을 도입시킬 수 있다. 바이러스를 이용하여 도입된 CRISPR 효소는 대상(예를 들면, 세포)에서 일시적으로 발현될 수 있다. 또는 바이러스를 이용하여 도입된 CRISPR 효소는 대상(예를 들면, 세포)에서 장기간(예를 들면, 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 6개월, 9개월, 1년, 2년 또는 영구적) 지속적으로 발현될 수 있다.
바이러스의 패키징 능력은 적어도 2kb 내지 50kb로 바이러스 종류에 따라 다를 수 있다. 이러한 패키징 능력에 따라 CRISPR 효소를 단독으로 포함하는 바이러스 벡터를 설계하거나 CRISPR 효소 및 추가로 gRNA를 포함하는 바이러스 벡터를 설계할 수 있다. 또는 CRISPR 효소, gRNA 및 추가 구성요소를 포함하는 바이러스 벡터를 설계할 수 있다.
일 예로, CRISPR 효소를 암호화하는 핵산은 재조합 렌티바이러스 벡터에 포함될 수 있다.
다른 일 예로, CRISPR 효소를 암호화하는 핵산은 재조합 아데노바이러스 벡터에 포함될 수 있다.
또 다른 일 예로, CRISPR 효소를 암호화하는 핵산은 재조합 AAV 벡터에 포함될 수 있다.
다른 일 예로, CRISPR 효소를 암호화하는 핵산은 혼성 바이러스, 예를 들어 본 명세서에 기재한 바이러스 중 하나 이상의 혼성체 벡터에 포함될 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 일 구현예에서, CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체를 사용하기 위해, 이를 코딩하는 핵산으로부터 그를 발현시킬 수 있다. 이는 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체를 코딩하는 핵산을 복제 및/또는 발현을 위한 원핵 또는 진핵 세포로 형질전환시키기 위해 중간체 벡터로 클로닝할 수 있다. CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체를 생산하기 위해 CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체를 코딩하는 핵산을 저장 또는 조작하기 위하여 중간체 벡터는 전형적으로 원핵생물 벡터, 예를 들어 플라스미드, 또는 셔틀 벡터, 또는 곤충 벡터이다. CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체를 코딩하는 핵산을 또한 식물 세포, 동물 세포, 바람직하게는 포유동물 세포 또는 인간 세포, 진균 세포, 박테리아 세포, 또는 원생동물 세포에 투여하기 위해 발현 벡터로 클로닝할 수 있다.
발현을 달성하기 위해, 전형적으로 CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체를 코딩하는 서열을 전사를 지시하는 프로모터를 함유하는 발현 벡터로 서브클로닝한다. 조작된 단백질을 발현시키기 위한 박테리아 발현 시스템은 예를 들어 대장균(E. coli), 바실러스(Bacillus) 종, 및 살모넬라(Salmonella)에서 얻을 수 있다. 이러한 발현 시스템을 위한 키트는 상업적으로 입수가능하다. 포유동물 세포, 효모, 및 곤충 세포를 위한 진핵세포 발현 시스템은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 또한 상업적으로 입수가능하다.
핵산 발현을 지시하는데 사용되는 프로모터는 특정한 적용에 따라 좌우된다. 예를 들어, 전형적으로 강력한 구성 프로모터는 융합 단백질의 발현 및 증식을 위해 사용된다. 대조적으로, CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체를 유전자 조절을 위해 생체내로 투여하는 경우에는, CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체의 특정한 용도에 따라 구성 또는 유도 프로모터가 사용될 수 있다. 또한, CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체의 투여에 바람직한 프로모터는 약한 프로모터, 예컨대 HSV TK 또는 유사한 활성을 갖는 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한 전사활성화에 반응성인 요소, 예를 들어 저산소증 반응 요소, Gal4 반응 요소, lac 저해인자 반응 요소, 및 소분자 제어 시스템, 예컨대 테트라시클린-조절된 시스템 및 RU-486 시스템을 포함할 수 있다.
프로모터 이외에도, 전형적으로 발현 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포인 숙주 세포에서 핵산 발현을 위해 필요한 모든 추가의 요소를 함유하는 전사 유닛 또는 발현 카세트를 함유한다. 따라서, 전형적인 발현 카세트는 예를 들어 CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터, 및 예를 들어 전사체의 효율적인 폴리아데닐화, 전사 종결, 리보솜 결합 부위, 또는 번역 종결을 위해 필요한 임의의 신호를 함유한다. 카세트의 추가의 요소에는 예를 들어 인핸서 및 슬라이싱된 이종의 인트론 신호가 포함될 수 있다.
유전자 정보를 세포에 전달하기 위한 특정한 발현 벡터는 CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체의 의도된 용도, 예를 들어 식물, 동물, 박테리아, 진균, 원생동물 등에서의 발현과 관련하여 선택된다. 표준 박테리아 발현 벡터에는 플라스미드, 예컨대 pBR322 기재 플라스미드, pSKF, pET23D, 및 상업적으로 입수가능한 태그-융합 발현 시스템, 예컨대 GST 및 LacZ가 포함된다.
진핵세포 바이러스로부터의 조절 요소를 함유하는 발현 벡터는 종종 진핵세포 발현 벡터, 예를 들어 SV40 벡터, 유두종 바이러스 벡터, 및 엡스테인-바르(Epstein-Barr) 바이러스로부터 유래된 벡터에서 사용된다. 다른 예시적인 진핵세포 벡터에는 pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, 바쿨로바이러스 pDSVE, 및 SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 쥐 유방 종양 바이러스 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, 또는 진핵 세포에서의 발현에 효과적인 것으로 제시된 프로모터의 지시 하에 단백질 발현을 허용하는 임의의 다른 벡터가 포함된다.
CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체를 발현하기 위한 벡터는 가이드 RNA의 발현을 유도하기 위한 RNA Pol III 프로모터, 예를 들어 H1, U6 또는 7SK 프로모터를 포함할 수 있다. 이들 인간 프로모터는 플라스미드 형질감염 이후 포유동물 세포에서 CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체의 발현을 허용한다.
일부 발현 시스템은 안정하게 형질감염된 세포주의 선택을 위한 마커, 예컨대 티미딘 키나제, 히그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제, 및 디히드로폴레이트 리덕타제를 갖는다. 폴리헤드린 프로모터 또는 다른 강력한 바쿨로 바이러스 프로모터의 지시 하에 gRNA 코딩 서열과 함께 곤충 세포에서 바쿨로바이러스 벡터를 사용하는 것과 같은 고수율 발현 시스템 또한 적합하다.
발현 벡터에 전형적으로 포함되는 요소에는 또한 E. coli에서 기능하는 레플리콘, 재조합 플라스미드를 보유하는 박테리아의 선택을 허용하기 위해 항생제 내성을 코딩하는 유전자, 및 재조합 서열의 삽입을 허용하기 위해 플라스미드의 비필수 영역에서의 독특한 제한 부위를 포함한다.
표준 형질감염 방법을 이용하여 다량의 단백질을 발현하는 박테리아, 포유동물, 효모 또는 곤충 세포주를 생성한 다음, 표준 기술을 이용하여 정제한다 (예를 들어, Colley et al., 1989, J. Biol. Chem., 264:17619-22; Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990) 참고). 진핵 및 원핵 세포의 형질전환은 표준 기술에 따라 수행한다 (예를 들어, Morrison, 1977, J. Bacteriol. 132:349-351; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds, 1983) 참고).
외래 뉴클레오티드 서열을 숙주 세포에 도입하는 임의의 공지된 절차를 이용할 수 있다. 이들 절차는 인산칼슘 형질감염, 폴리브렌, 원형질체 융합, 전기천공, 뉴클레오펙션, 리포좀, 현미주사, 네이키드 DNA, 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 에피좀형 및 편입형 둘 다, 및 클로닝된 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 또는 다른 외래 유전자 물질을 숙주 세포에 도입하기 위한 다른 널리 공지된 방법의 이용을 포함한다. 이용된 특정한 유전자 조작 절차는 CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체를 발현할 수 있는 숙주 세포에 적어도 하나의 유전자를 성공적으로 도입할 수 있어야만 한다.
본 명세서에 의해 개시되는 일 구현예에서, CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체를 발현할 수 있는 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 세포를 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시옐는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들의 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어 자명할 것이다.
실시예 1. Cas9 변이체
1. Cas9 변이체 라이브러리
SpCas9 변이체 라이브러리는 3가지의 독립적인 프로토콜을 사용하여 제작하였다. 첫번째 라이브러리의 경우, Cas9 라이브러리 플라스미드를 XL1-red competent cells(Agilent)로 형질 도입시키고, 판매자의 매뉴얼에 따라 세포를 배양하였다. 두번째, 세번째 라이브러리의 경우, Gibson Assembly로 설계된 프라이머를 사용하여 낮은 오류율(0-5 mutations/kb) 조건에서 Genemorph II(Agilent) 및 Diversify PCR 무작위 돌연변이 유발 키트(Clontech)를 사용하여 Cas9 라이브러리 플라스미드 서열의 전체 WT-SpCas9에서 Error-prone PCR을 수행하였다. 이어서 PCR 생성물을 겔 정제 하였다. 정제된 무작위 돌연변이된 라이브러리 및 Cas9 라이브러리 플라스미드의 백본을 Gibson 조립하였다. 조립된 라이브러리는 EnduraTM electrocompetent cells (Lucigen)로 형질도입시키고 chloramphenicol LB plates (12.5μg/mL)에서 37℃에서 밤새 배양하였다. 형질 도입된 세포가 배양 후, 각 라이브러리는 midi prep kit (NucleoBond Xtra Midi EF, Macherey-Nagel)를 이용하여 분리정제 하였다. 수득한 라이브러리는 다중 타겟 시스템을 이용한 표적 특이적 Cas9 스크리닝 방법(WO 2017217768)을 이용하여 표적 특이적 Cas9 변이체를 선별하였다.
2-1. 표적 특이적 Cas9 변이체를 암호화하는 플라스미드
야생형 SpCas9이 암호화되어 있는 플라스미드(p3s-Cas9HC; Addgene plasmid #43945)를 구매하여 표적 특이적 SpCas9 변이체를 생성을 위해 이용하였다. 표적 특이적 SpCas9 변이체를 위한 construct는 p3s-Cas9HC 플라스미드를 백본과 원하는 위치에 돌연변이를 포함하는 핵산 서열과의 Gibson 조립에 의해 생성하였다. 모든 contructs는 Sanger sequencing로 확인하였다.
2-2. 표적 특이적 Cas9 변이체를 암호화하는 플라스미드
야생형 SpCas9이 암호화되어 있는 플라스미드(예를 들어, p3s-Cas9HC; Addgene plasmid #43945)를 구매하여 표적 특이적 SpCas9 변이체를 생성을 위해 이용하였다. 표적 특이적 SpCas9 변이체를 생성을 위해, 야생형 SpCas9이 암호화되어 있는 플라스미드에 Site-directed mutagenesis 키트를 이용하여 원하는 위치에 돌연변이를 포함하는 contruct를 생성하였다. 모든 contructs는 Sanger sequencing로 확인하였다.
실시예 2. Cas9 변이체의 표적 유전자 조작 효과
실험 방법
1. Cell culture and transfection conditions
HEK293T 세포(ATCC, CRL-11268)를 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% 항생제가 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. Cas9 변이체에 의한 게놈 조작을 위해, 형질 도입을 전에 HEK293T 세포를 48-well plate에 70-80% confluency가 되도록 접종하였다. Cas9 변이체 발현 플라스미드 250ng 및 sgRNA 발현 플라스미드 250ng을 lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 사용하여 세포에 형질 도입하였다. 형질 도입 72시간 후에 DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen)을 이용하여 genomic DNA를 분리추출하였다.
2. in-vitro cleavage of genomic DNA
HEK293T 세포로부터 DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen)을 이용하여 genomic DNA를 분리추출하였다. Genomic DNA (10 μg)을 버퍼(100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 100 μg/mL BSA, at pH 7.9)에서 야생형 Cas9 또는 Cas9 변이체 (100nM) 및 sgRNA(75nM)와 37℃에서 8시간 동안 인큐베이션하였다. sgRNA을 제거하기 위해 분해된 genomic DNA(digested genomic DNA)에 RNase A (50 μg/mL)를 처리하였고, DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen)를 이용해 다시 분리추출하였다.
3. Whole genome and digenome sequencing
Genomic DNA (1 μg)은 Covaris system (Life Technologies)을 이용해 400bp 내지 500bp 범위의 크기로 분해하고, End Repair Mix (Thermo Fischer)를 이용해 분해된 조각의 양 말단을 blunt-end로 만들었다. 라이브러리를 만들기 위해, 분해된 DNA 조각에 어댑터를 연결하였고, 마크로젠에서 HiSeq X Ten Sequencer (Illumina)을 이용하여 전체 게놈 시퀀싱을 수행하였다. 전체 게놈 시퀀싱은 30-40ס¿의 시퀀싱 뎁스(depth)에서 수행되었다. DNA 절단 위치는 Digenome 1.0 programs을 이용하여 확인하였다.
4. Targeted deep sequencing
표적 위치 및 잠재적 오프-타겟 위치는 표적된 딥 시퀀싱(targeted deep sequencing)에 의해 분석되었다. 딥 시퀀싱 라이브러리는 PCR에 의해 생성되었다. TruSeq HT Dual Index 프라이머를 각 시료에 라벨을 붙이기 위해 사용하였다. 풀 라이브러리(pooled libraries)를 MiniSeq을 사용하여 paired-end sequencing을 수행하였다.
실험 결과
본 실시예에서 SpCas9 변이체의 표적 유전자 조작 효과를 확인하기 위해 다양한 유전자를 표적으로하여 각각 표적 유전자에 따른 SpCas9 변이체의 indel(%) 효과를 확인하였다. 이때, SpCas9 변이체는 각 영역 별로 그 효과를 확인하였다.
1. SpCas9의 제 1 영역 변이체
SpCas9의 제 1 영역 중 A203, N277, G366, F539 및 I601을 각각 다른 아미노산으로 치환시킨 총5개의 SpCas9 변이체(A203D, N277H, G366S, F539S 및 I601N)를 실험에 사용하였다.
그 결과, DMD 유전자를 표적 유전자(표적 서열: CTTTCTACCTACTGAGTCTG / 비표적 서열: CTTTCTACCTACcGAGTCTG, 표적 서열과 차이가 있는 서열을 소문자로 표시)로 한 경우, 각각의 SpCas9 변이체는 모두 야생형 SpCas9과 비교하여 온-타겟에서의 indel이 증가하거나, 오프-타겟에서의 indel이 감소하거나 또는 온-타겟 대비 오프-타겟에서의 indel이 감소하였다(도 1). 특히 A203D, F539S 및 I601N은 온-타겟에서의 indel은 야생형 SpCas9과 유사한 수준을 보이나, 오프-타겟에서의 indel은 야생형 SpCas9에 비해 일정 수준 이하로 감소하는 것을 확인하였다.
또한, EMX 유전자를 표적 유전자(표적 서열: GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA / 비표적 서열: GAGTtaGAGCAGAAGAAGAA)로 한 경우, 각각의 SpCas9 변이체는 모두 야생형 SpCas9과 비교하여 온-타겟에서의 indel이 증가하거나, 오프-타겟에서의 indel이 감소하거나 또는 온-타겟 대비 오프-타겟에서의 indel이 감소하였다(도 2). 특히 G366S에 경우 오프-타겟에서의 indel은 야생형 SpCas9과 유사하나, 온-타겟에서의 indel은 야생형 SpCas9에 비해 증가하였음을 확인하였다. 또한, F539S 및 I601N은 오프-타겟에서의 indel은 야생형 SpCas9에 비해 거의 없거나 절반 이하로 감소하는 것을 확인하였다.
VEGFA 유전자를 표적 유전자(표적 서열: GGTGAGTGAGTGTGTGCGTG / 비표적 서열: GGTGAGTGAGTGTGTGtGTG)로 한 경우, 각각의 SpCas9 변이체는 모두 야생형 SpCas9과 비교하여 온-타겟에서의 indel이 증가하거나, 야생형 SpCas9과 비슷한 수준의 효과를 나타났다(도 3). 특히 F539S에 경우 오프-타겟에서의 indel은 야생형 SpCas9과 유사하나, 온-타겟에서의 indel은 야생형 SpCas9에 비해 10% 이상 증가하였음을 확인하였다.
이러한 결과를 통해, SpCas9의 제 1 영역 중 A203, N277, G366, F539 및 I601을 각각 다른 아미노산으로 치환시킨 총 5개의 SpCas9 변이체는 모두 야생형 SpCas9과 비교하여 표적 특이성이 향상되었음을 확인할 수 있다.
2. SpCas9의 제 2 영역 변이체
SpCas9의 제 2 영역 중 M763, D965 및 F1038을 각각 다른 아미노산으로 치환시킨 3개의 SpCas9 변이체(M763I, D965Y 및 F1038Y) 및 SpCas9의 제 2 영역 중 M763/F1038 및 D965/F1038을 각각 다른 아미노산으로 치환시킨 2개의 SpCas9 변이체(M763I/F1038Y 및 D965Y/F1038Y)를 실험에 사용하였다.
그 결과, DMD 유전자를 표적 유전자(표적 서열: CTTTCTACCTACTGAGTCTG / 비표적 서열: CTTTCTACCTACcGAGTCTG)로 한 경우, 각각의 SpCas9 변이체는 모두 야생형 SpCas9과 비교하여 온-타겟에서의 indel이 증가하거나, 오프-타겟에서의 indel이 감소하거나 또는 온-타겟 대비 오프-타겟에서의 indel이 감소하였다(도 4). 특히 M763I에 경우 오프-타겟에서의 indel은 야생형 SpCas9과 유사하나, 온-타겟에서의 indel은 야생형 SpCas9에 비해 증가하였음을 확인하였다. 또한, M763I/F1038Y 및 D965Y/F1038Y는 야생형 SpCas9에 비해 온-타겟에서의 indel은 약간 감소하였으나, 오프-타겟에서의 indel이 거의 보이지 않아 야생형 SpCas9에 비해 온-타겟 대비 오프-타겟에서의 indel이 감소하여 야생형 SpCas9에 비해 표적 특이성을 가짐을 확인하였다(도 5).
또한, EMX 유전자를 표적 유전자(표적 서열: GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA / 비표적 서열: GAGTtaGAGCAGAAGAAGAA)로 한 경우, M763I는 야생형 SpCas9에 비해 온-타겟에서의 indel은 약간 감소하였으나, 오프-타겟에서의 indel이 거의 보이지 않아 야생형 SpCas9에 비해 온-타겟 대비 오프-타겟에서의 indel이 감소하여 야생형 SpCas9에 비해 표적 특이성을 가짐을 확인하였다(도 6). 또한, M763I/F1038Y 및 D965Y/F1038Y는 야생형 SpCas9에 비해 오프-타겟에서의 indel이 거의 보이지 않고, 온-타겟에서의 indel은 유사하거나 현저하게 증가하는 것을 확인하였다(도 7).
VEGFA 유전자를 표적 유전자(표적 서열: GGTGAGTGAGTGTGTGCGTG / 비표적 서열: GGTGAGTGAGTGTGTGtGTG)로 한 경우, M763I는 야생형 SpCas9에 비해 온-타겟에서의 indel은 유사하나, 오프-타겟에서의 indel이 거의 보이지 않아 야생형 SpCas9에 비해 온-타겟 대비 오프-타겟에서의 indel이 감소하여 야생형 SpCas9에 비해 표적 특이성을 가짐을 확인하였다(도 8).
HBB03 유전자를 표적 유전자(표적 서열: CACGTTCACCTTGCCCCACA / 비표적 서열: CACGTTCACtTTGCCCCACA)로 한 경우, M763I/F1038Y 및 D965Y/F1038Y는 야생형 SpCas9에 비해 오프-타겟에서의 indel이 절반 이하로 현저히 감소한 반면, 온-타겟에서의 indel은 증가하거나 약간 감소하는 것을 확인하였다(도 9).
HBB04 유전자를 표적 유전자(표적 서열: CCACGTTCACCTTGCCCCAC / 비표적 서열: CCACaTTCACCTTGCCCCAC)로 한 경우, M763I/F1038Y 및 D965Y/F1038Y는 야생형 SpCas9에 비해 오프-타겟에서의 indel이 거의 없으면서 온-타겟에서의 indel은 증가하거나 비슷한 것을 확인하였다(도 10).
이러한 결과를 통해, SpCas9의 제 2 영역 중 M763, D965 및 F1038을 각각 다른 아미노산으로 치환시킨 3개의 SpCas9 변이체(M763I, D965Y 및 F1038Y) 및 SpCas9의 제 2 영역 중 M763/F1038 및 D965/F1038을 각각 다른 아미노산으로 치환시킨 2개의 SpCas9 변이체(M763I/F1038Y 및 D965Y/F1038Y)는 모두 야생형 SpCas9과 비교하여 표적 특이성이 향상되었음을 확인할 수 있다.
3. SpCas9의 제 3 영역 변이체
SpCas9의 제 3 영역 중 K890을 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체(K890N)를 실험에 사용하였다.
그 결과, DMD 유전자를 표적 유전자(표적 서열: CTTTCTACCTACTGAGTCTG / 비표적 서열: CTTTCTACCTACcGAGTCTG)로 한 경우, K890N은 야생형 SpCas9에 비해 온-타겟에서의 indel은 유사하나, 오프-타겟에서의 indel이 약간 감소하는 것을 확인하였다(도 11).
이러한 결과를 통해, SpCas9의 제 3 영역 중 K890을 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체(K890N)는 야생형 SpCas9과 비교하여 유사하거나 약간 표적 특이성이 향상되었음을 확인할 수 있다.
4. SpCas9의 제 4 영역 변이체
SpCas9의 제 4 영역 중 T1102 및 D1127을 각각 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체(T1102P 및 D1127E)를 실험에 사용하였다.
그 결과, DMD 유전자를 표적 유전자(표적 서열: CTTTCTACCTACTGAGTCTG / 비표적 서열: CTTTCTACCTACcGAGTCTG)로 한 경우, T1102P는 야생형 SpCas9에 비해 오프-타겟에서의 indel이 거의 없음을 확인하였고, D1127E는 야생형 SpCas9에 비해 온-타겟에서의 indel은 유사하나, 오프-타겟에서의 indel이 감소하는 것을 확인하였다(도 12).
또한, EMX 유전자를 표적 유전자(표적 서열: GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA / 비표적 서열: GAGTtaGAGCAGAAGAAGAA)로 한 경우, T1102 및 D1127 모두 야생형 SpCas9에 비해 온-타겟에서의 indel은 유사하나, 오프-타겟에서의 indel이 거의 없는 것을 확인하였다(도 13).
이러한 결과를 통해, SpCas9의 제 4 영역 중 T1102 및 D1127을 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체(T1102P 및 D1127E)는 야생형 SpCas9과 비교하여 유사하거나 약간 표적 특이성이 향상되었음을 확인할 수 있다.
5. 두 개의 영역에 변이를 가지는 SpCas9 변이체
SpCas9의 4개의 영역 중 2개의 영역에 변이를 가지는 SpCas9 변이체를 실험에 이용하였다. 이때, 제 1 영역 및 제 2 영역에 변이를 가지는 F539S/F1038Y, F539S/M763I, I601N/D965Y 및 F539S/M763I/F1038Y; 제 1 영역 및 제 3 영역에 변이를 가지는 F539S/K890N; 제 2 영역 및 제 3 영역에 변이를 가지는 M763I/K890N를 SpCas9 변이체로 이용하였다.
그 결과, DMD 유전자를 표적 유전자(표적 서열: CTTTCTACCTACTGAGTCTG / 비표적 서열: CTTTCTACCTACcGAGTCTG)로 한 경우, F539S/F1038Y 및 F539S/M763I/F1038Y은 야생형 SpCas9에 비해 온-타겟에서의 indel은 감소하였으나, 오프-타겟에서의 indel이 약 70~80% 정도 감소하였으므로, 야생형 SpCas9에 비해 온-타겟 대비 오프-타겟에서의 indel이 감소하여 야생형 SpCas9에 비해 표적 특이성을 가짐을 확인하였다(도 14).
또한, EMX 유전자를 표적 유전자(표적 서열: GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA / 비표적 서열: GAGTtaGAGCAGAAGAAGAA)로 한 경우, F539S/F1038Y는 야생형 SpCas9에 비해 온-타겟에서의 indel은 약간 감소하였으나, 오프-타겟에서의 indel이 거의 없으므로, 야생형 SpCas9에 비해 온-타겟 대비 오프-타겟에서의 indel이 감소하여 야생형 SpCas9에 비해 표적 특이성을 가짐을 확인하였다(도 15).
VEGFA 유전자를 표적 유전자(표적 서열: GGTGAGTGAGTGTGTGCGTG / 비표적 서열: GGTGAGTGAGTGTGTGtGTG)로 한 경우, F539S/M763I는 야생형 SpCas9에 비해 오프-타겟에서의 indel은 유사하나, 온-타겟에서의 indel이 현저히 증가하거는 것을 확인하였다(도 16).
HBB03 유전자를 표적 유전자(표적 서열: CACGTTCACCTTGCCCCACA / 비표적 서열: CACGTTCACtTTGCCCCACA)로 한 경우, F539S/K890N 및 F539S/M763I/F1038Y은 야생형 SpCas9에 비해 온-타겟에서의 indel은 약간 감소하였으나, 오프-타겟에서의 indel이 70% 이상 감소하였므로, 야생형 SpCas9에 비해 온-타겟 대비 오프-타겟에서의 indel이 감소하여 야생형 SpCas9에 비해 표적 특이성을 가짐을 확인하였다(도 17). 또한, M763I/K890N은 야생형 SpCas9에 비해 오프-타겟에서의 indel은 약간 증가하였으나, 오프-타겟에서의 indel이 약 30~40% 정도 증가하였므로, 야생형 SpCas9에 비해 온-타겟 대비 오프-타겟에서의 indel이 감소하여 야생형 SpCas9에 비해 표적 특이성을 가짐을 확인하였다(도 17).
HBB04 유전자를 표적 유전자(표적 서열: CCACGTTCACCTTGCCCCAC / 비표적 서열: CCACaTTCACCTTGCCCCAC)로 한 경우, F539S/K890N 및 F539S/F1038Y는 야생형 SpCas9에 비해 온-타겟에서의 indel은 유사하거나 증가하였고, 오프-타겟에서의 indel은 거의 나타나지 않는 것을 확인하였다(도 18). 또한, M763I/K890N은 야생형 야생형 SpCas9에 비해 온-타겟에서의 indel은 약간 증가하였고, 오프-타겟에서의 indel은 약 30% 정도 감소하는 것을 확인하였다(도18).
이러한 결과를 통해, SpCas9의 4개의 영역 중 2개의 영역에 변이를 가지는 SpCas9 변이체(F539S/K890N, F539S/F1038Y, F539S/M763I, I601N/D965Y, M763I/K890N 및 F539S/M763I/F1038Y)가 야생형 SpCas9과 비교하여 표적 특이성이 향상되었음을 확인할 수 있다.
6. 세 개 이상의 영역에 변이를 가지는 SpCas9 변이체
SpCas9의 4개의 영역 중 3개 이상의 영역에 변이를 가지는 SpCas9 변이체를 실험에 이용하였다. 이때, 제 1 영역, 제 2 영역 및 제 3 영역에 변이를 가지는 F539S/M763I/K890, F539S/M763I/D965Y/K890 및 F539S/M763I/K890/F1038Y; 제 1 영역, 제 2 영역 및 제 4 영역에 변이를 가지는 A203D/N277H/G366S/M763I/F1038Y/T1102P/D1127E를 SpCas9 변이체로 이용하였다.
그 결과, DMD 유전자(표적 서열: CTTTCTACCTACTGAGTCTG / 비표적 서열: CTTTCTACCTACcGAGTCTG)를 표적 유전자로 한 경우, F539S/M763I/K890 및 F539S/M763I/K890/F1038Y는 야생형 SpCas9에 비해 온-타겟에서의 indel은 약간 감소하였으나, 오프-타겟에서의 indel이 절반 이하로 감소하였므로, 야생형 SpCas9에 비해 온-타겟 대비 오프-타겟에서의 indel이 감소하여 야생형 SpCas9에 비해 표적 특이성을 가짐을 확인하였다(도 19). 또한, A203D/N277H/G366S/M763I/F1038Y/T1102P/D1127E도 야생형 SpCas9에 비해 온-타겟에서의 indel은 약간 감소하였으나, 오프-타겟에서의 indel이 약 60~70%로 감소하였므로, 야생형 SpCas9에 비해 온-타겟 대비 오프-타겟에서의 indel이 감소하여 야생형 SpCas9에 비해 표적 특이성을 가짐을 확인하였다(도 23).
VEGFA 유전자를 표적 유전자(표적 서열: GGTGAGTGAGTGTGTGCGTG / 비표적 서열: GGTGAGTGAGTGTGTGtGTG)로 한 경우, F539S/M763I/K890는 야생형 SpCas9에 비해 온-타겟에서의 indel은 약간 감소하였으나, 오프-타겟에서의 indel이 절반 정도 감소하였므로, 야생형 SpCas9에 비해 온-타겟 대비 오프-타겟에서의 indel이 감소하여 야생형 SpCas9에 비해 표적 특이성을 가짐을 확인하였다(도 20).
HBB03 유전자를 표적 유전자(표적 서열: CACGTTCACCTTGCCCCACA / 비표적 서열: CACGTTCACtTTGCCCCACA)로 한 경우, F539S/M763I/K890은 야생형 SpCas9에 비해 온-타겟에서의 indel은 증가하면서 오프-타겟에서의 indel은 감소하였고, F539S/M763I/K890/F1038Y는 야생형 SpCas9에 비해 온-타겟에서의 indel은 약간 감소하였으나, 오프-타겟에서의 indel이 약 70% 이상 감소하였므로, 야생형 SpCas9에 비해 온-타겟 대비 오프-타겟에서의 indel이 감소하여 야생형 SpCas9에 비해 표적 특이성을 가짐을 확인하였다(도 21). 또한 F539S/M763I/D965Y/K890은 오프-타겟에서의 indel은 약간 증가하였으나, 오프-타겟에서의 indel이 약 10~20% 정도 증가하였므로, 야생형 SpCas9에 비해 온-타겟 대비 오프-타겟에서의 indel이 감소하여 야생형 SpCas9에 비해 표적 특이성을 가짐을 확인하였다(도 21).
HBB04 유전자를 표적 유전자(표적 서열: CCACGTTCACCTTGCCCCAC / 비표적 서열: CCACaTTCACCTTGCCCCAC)로 한 경우, F539S/M763I/K890은 야생형 SpCas9에 비해 온-타겟에서의 indel은 증가하면서 오프-타겟에서의 indel은 현저하게 감소하였고, F539S/M763I/D965Y/K890은 온-타겟에서의 indel이 야생형 SpCas9과 유사하나, 오프-타겟에서의 indel은 약 10~20% 정도 감소한 것을 확인하였다(도 22). 또한, F539S/M763I/K890/F1038Y는 야생형 SpCas9에 비해 온-타겟에서의 indel은 약 40% 정도 감소하였으나, 오프-타겟에서의 indel이 거의 나타나지 않았으므로, 야생형 SpCas9에 비해 온-타겟 대비 오프-타겟에서의 indel이 감소하여 야생형 SpCas9에 비해 표적 특이성을 가짐을 확인하였다(도 22).
이러한 결과를 통해, SpCas9의 4개의 영역 중 3개 이상의 영역에 변이를 가지는 SpCas9 변이체(F539S/M763I/K890, F539S/M763I/D965Y/K890, F539S/M763I/K890/F1038Y 및 A203D/N277H/G366S/M763I/F1038Y/T1102P/D1127E)가 야생형 SpCas9과 비교하여 표적 특이성이 향상되었음을 확인할 수 있다.
상기의 결과를 통해, SpCas9의 4개의 영역에서 선택된 하나 이상의 아미노산이 변이된 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9에 비해 표적 특이성이 향상됨을 확인할 수 있었다.
본 발명은 인위적으로 조작된 CRISPR 효소를 통해 표적 특이성이 향상된 CRISPR-Cas 시스템을 게놈 및/또는 후생유전자(epigenome)의 조작 또는 변형, 게놈 표적화, 게놈 교정 및 체외 진단 등에 이용할 수 있다.
야생형 SpCas9의 아미노산 서열, 각 영역의 아미노산 서열 및 일 구현예의 표적 특이적 SpCas9 변이체의 아미노산 서열

Claims (45)

  1. 인위적인 조작을 포함하는 SpCas9 변이체로서,
    상기 인위적인 조작은 야생형(wildtype) 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9(SpCas9)의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 하나 이상의 영역에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 인위적인 조작을 포함하고,
    표적 특이성이 향상된 SpCas9 변이체.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 야생형(wildtype) SpCas9의 제 1 영역은
    가이드 RNA(gRNA)와 상호작용하는 야생형 SpCas9의 일부분;
    표적서열과 상호작용하는 야생형 SpCas9의 일부분;
    gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)과 상호작용하는 야생형 SpCas9의 일부분; 및
    gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM(Protospacer adjacent motif)과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용하는 야생형 SpCas9의 일부분
    중 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM과 먼 말단 부위(PAM distal end)는 PAM 위치에서 멀리 위치한 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 말단의 6 내지 10개의 염기쌍인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 PAM은 5'-NGG-3'인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 야생형(wildtype) SpCas9의 제 2 영역 및 제 3 영역은 야생형 SpCas9의 핵산 절단 기능을 수행하는 야생형 SpCas9의 일부분인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 야생형(wildtype) SpCas9의 제 4 영역은
    표적 유전자 또는 핵산 내의 PAM 서열을 인식하거나 상호작용할 수 있는 야생형 SpCas9의 일부분; 및
    gRNA의 일부 뉴클레오타이드 서열과 상호작용하는 야생형 SpCas9의 일부분
    중 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 야생형(wildtype) SpCas9의 제 1 영역은
    야생형 SpCas9의 REC 로브(lobe)에 위치한 영역;
    야생형 SpCas9의 REC 도메인 전체; 및
    야생형 SpCas9의 REC 도메인 일부
    중 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 야생형(wildtype) SpCas9의 제 2 영역은
    야생형 SpCas9의 NUC 로브(lobe)에 위치한 영역;
    야생형 SpCas9의 RuvC 도메인 전체;
    야생형 SpCas9의 RuvC 도메인 일부; 및
    야생형 SpCas9의 RuvC 도메인의 메탈 의존적 핵산 절단 부위(metal dependent nucleic acid cleaving region)를 포함하는 RuvC 도메인 일부
    중 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 RuvC 도메인의 메탈 의존적 핵산 절단 부위는 RuvC 도메인에서 메탈과 상호작용에 의해 표적 위치의 핵산간의 결합을 절단할 수 있는 영역인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 야생형(wildtype) SpCas9의 제 3 영역은
    야생형 SpCas9의 NUC 로브(lobe)에 위치한 영역;
    야생형 SpCas9의 HNH 도메인 전체;
    야생형 SpCas9의 HNH 도메인 일부; 및
    야생형 SpCas9의 HNH 도메인의 메탈 의존적 핵산 절단 부위(metal dependent nucleic acid cleaving region)를 포함하는 HNH 도메인 일부
    중 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 HNH 도메인의 메탈 의존적 핵산 절단 부위는 HNH 도메인에서 메탈과 상호작용에 의해 표적 위치의 핵산간의 결합을 절단할 수 있는 영역인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  12. 제 1항에 있어서,
    상기 야생형(wildtype) SpCas9의 제 4 영역은
    야생형 SpCas9의 NUC 로브(lobe)에 위치한 영역;
    야생형 SpCas9의 PI 도메인 전체; 및
    야생형 SpCas9의 PI 도메인 일부
    중 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  13. 제 1항에 있어서,
    상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의
    196번째 페닐알라닌(F196)부터 282번째 아이소류신(I282)까지의 아미노산 서열로 구성된 제 1-1 영역;
    316번째 프롤린(P316)부터 394번째 아스파라긴(N394)까지의 아미노산 서열로 구성된 제 1-2 영역;
    510번째 라이신(K510)부터 612번째 아스파라긴(N612)까지의 아미노산 서열로 구성된 제 1-3 영역 및
    678번째 트레오닌(T678)부터 698번째 히스티딘(H698)까지의 아미노산 서열로 구성된 제 1-4 영역중 선택된 하나 이상의 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  14. 제 1항에 있어서,
    상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697를 포함하는 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  15. 제 1항에 있어서,
    상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의
    1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열로 구성된 제 2-1 영역;
    731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열로 구성된 제 2-2 영역 및
    926번째 글루타민(Q926)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열로 구성된 제 2-3 영역 중 선택된 하나 이상의 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  16. 제 1항에 있어서,
    상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039를 포함하는 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  17. 제 1항에 있어서,
    상기 제 3 영역은 야생형 SpCas9의
    775번째 라이신(K775)부터 900번째 류신(L900)까지의 아미노산 서열로 구성된 제 3-1 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  18. 제 1항에 있어서,
    상기 제 3 영역은 야생형 SpCas9의 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, V838, D839, H840, K848, D849, D850, D853, N854, K855, R859, D861, K862, N863, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, A889, K890, L891, R895, K896 및 D898을 포함하는 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  19. 제 1항에 있어서,
    상기 제 4 영역은 야생형 SpCas9의
    1099번째 글루타민산(E1099)부터 1139번째 발린(V1139)까지의 아미노산 서열로 구성된 제 4-1 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  20. 제 1항에 있어서,
    상기 제 4 영역은 야생형 SpCas9의 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138을 포함하는 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  21. 제 1항에 있어서,
    상기 야생형(wildtype) SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 하나 이상의 영역에 존재하는 하나 이상의 아미노산은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037, F1038, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  22. 제 1항에 있어서,
    상기 야생형(wildtype) SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 하나 이상의 영역에 존재하는 하나 이상의 아미노산은 야생형 SpCas9의 A203, N277, G366, F539, I601, M763, K890, D965, F1038, T1102 및 D1127로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  23. 제 1항에 있어서,
    상기 인위적인 조작은 야생형(wildtype) SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 하나 이상의 영역에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 제거(deletion)인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  24. 제 1항에 있어서,
    상기 인위적인 조작은 야생형(wildtype) SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 하나 이상의 영역에 존재하는 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로의 치환인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  25. 제 24항에 있어서,
    상기 다른 아미노산은 야생형(wildtype) SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 하나 이상의 영역에 존재하는 하나 이상의 아미노산에 비해 상대적으로 기능기(functional group)의 크기가 작은 아미노산인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  26. 제 24항에 있어서,
    상기 다른 아미노산은 야생형(wildtype) SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 하나 이상의 영역에 존재하는 하나 이상의 아미노산에 비해 상대적으로 기능기의 크기가 큰 아미노산인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  27. 제 24항에 있어서,
    상기 다른 아미노산은 야생형(wildtype) SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 하나 이상의 영역에 존재하는 하나 이상의 아미노산에 비해 상대적으로 소수성 지표(hydropathy index)가 큰 아미노산인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  28. 제 24항에 있어서,
    상기 다른 아미노산은 야생형(wildtype) SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 하나 이상의 영역에 존재하는 하나 이상의 아미노산에 비해 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  29. 제 1항의 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 A203, N277, G366, F539, I601, M763, K890, D965, F1038, T1102 및 D1127으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 인위적인 조작을 포함하는 표적 특이적 SpCas9(Target specific SpCas9; TS-SpCas9) 변이체.
  30. 제 29항에 있어서,
    상기 인위적인 조작은 야생형 SpCas9의 A203, N277, G366, F539, I601, M763, K890, D965, F1038, T1102 및 D1127으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거 또는 다른 아미노산으로의 치환인 것을 특징으로 하는 표적 특이적 SpCas9(Target specific SpCas9; TS-SpCas9) 변이체.
  31. 제 30항에 있어서,
    상기 다른 아미노산은 야생형 SpCas9의 A203, N277, G366, F539, I601, M763, K890, D965, F1038, T1102 및 D1127으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산에 비해 상대적으로 기능기의 크기가 크거나 또는 작은 아미노산인 것을 특징으로 하는 표적 특이적 SpCas9(Target specific SpCas9; TS-SpCas9) 변이체.
  32. 제 30항에 있어서,
    상기 다른 아미노산은 야생형 SpCas9의 A203, N277, G366, F539, I601, M763, K890, D965, F1038, T1102 및 D1127으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산에 비해 상대적으로 소수성 지표가 크거나 또는 작은 아미노산인 것을 특징으로 하는 표적 특이적 SpCas9(Target specific SpCas9; TS-SpCas9) 변이체.
  33. 제 29항에 있어서,
    상기 TS-SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 F539의 인위적인 조작을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 특이적 SpCas9(Target specific SpCas9; TS-SpCas9) 변이체.
  34. 제 29항에 있어서,
    상기 TS-SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 M763의 인위적인 조작을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 특이적 SpCas9(Target specific SpCas9; TS-SpCas9) 변이체.
  35. 제 29항에 있어서,
    상기 TS-SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 K890의 인위적인 조작을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 특이적 SpCas9(Target specific SpCas9; TS-SpCas9) 변이체.
  36. 제 29항에 있어서,
    상기 TS-SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 F539과 M763(F539/M763); F539/K890; 또는 M763/K890의 인위적인 조작을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 특이적 SpCas9(Target specific SpCas9; TS-SpCas9) 변이체.
  37. 제 29항에 있어서,
    상기 TS-SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 F539, M763 및 K890의 인위적인 조작을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 특이적 SpCas9(Target specific SpCas9; TS-SpCas9) 변이체.
  38. 제 29항의 TS-SpCas9 변이체를 포함하는 융합 단백질.
  39. 제 38항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 하나 이상의 기능적(functional) 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  40. 제 38항에 있어서,
    상기 기능적(functional) 도메인은 메틸라아제(methylase) 활성, 디메틸라아제(demethylase) 활성, 전사촉진(transcription activation) 활성, 전사 저해(transcription repression) 활성, 전사 방출 인자(transcription release factor) 활성, 히스톤 변형(histone modification) 활성, RNA 절단(cleavage) 활성 또는 핵산 결합(nucleic acid binding) 활성을 가지는 도메인; 단백질(펩타이드 포함)의 분리정제를 위한 태그(tag) 또는 리포터 유전자; NLS(nuclear localization sequence or signal) 또는 NES(nuclear export sequence or signal); 및 디아미네이즈(deaminase)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  41. 제 1항의 SpCas9 변이체, 제 29항의 TS-SpCas9 변이체 또는 제 38항의 융합 단백질을 암호화하는 핵산.
  42. 제 41항의 핵산을 포함하는 벡터.
  43. 제 41항의 핵산 또는 제 42항의 벡터를 포함하는 세포.
  44. 제 1항의 SpCas9 변이체, 제 29항의 TS-SpCas9 변이체 또는 제 38항의 융합 단백질과 gRNA를 이용한 세포의 게놈을 인위적으로 조작하는 방법.
  45. 제 44항에 있어서,
    상기 gRNA는 상기 세포의 게놈 내에 존재하는 표적 유전자의 표적 서열에 상보적 결합을 하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산인 것을 특징으로 하는 세포의 게놈을 인위적으로 조작하는 방법.
PCT/KR2018/007731 2017-07-07 2018-07-06 표적 특이적 crispr 변이체 WO2019009682A2 (ko)

Priority Applications (12)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201880058272.3A CN111094561B (zh) 2017-07-07 2018-07-06 靶特异性crispr变体
AU2018295992A AU2018295992B2 (en) 2017-07-07 2018-07-06 Target-specific CRISPR mutant
RU2020105703A RU2020105703A (ru) 2017-07-07 2018-07-06 Специфические для мишени варианты, связанные с crispr
SG11201913852RA SG11201913852RA (en) 2017-07-07 2018-07-06 Target-specific crispr mutant
US16/628,199 US11441135B2 (en) 2017-07-07 2018-07-06 Target-specific CRISPR mutant
CA3069296A CA3069296A1 (en) 2017-07-07 2018-07-06 Target-specific crispr mutant
JP2020500033A JP2020530279A (ja) 2017-07-07 2018-07-06 標的特異的なｃｒｉｓｐｒバリアント
EP18829020.9A EP3650540A4 (en) 2017-07-07 2018-07-06 TARGET-SPECIFIC CRISPR MUTANT
BR112020000310-7A BR112020000310A2 (pt) 2017-07-07 2018-07-06 variantes de crispr alvo específicas
AU2022200262A AU2022200262B2 (en) 2017-07-07 2022-01-17 Target-specific CRISPR mutant
US17/880,160 US20230130858A1 (en) 2017-07-07 2022-08-03 Target-specific crispr mutant
JP2022181946A JP2023025045A (ja) 2017-07-07 2022-11-14 標的特異的なｃｒｉｓｐｒバリアント

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762529601P 2017-07-07 2017-07-07
US62/529,601 2017-07-07
US201762608722P 2017-12-21 2017-12-21
US62/608,722 2017-12-21

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US16/628,199 A-371-Of-International US11441135B2 (en) 2017-07-07 2018-07-06 Target-specific CRISPR mutant
US17/880,160 Continuation US20230130858A1 (en) 2017-07-07 2022-08-03 Target-specific crispr mutant

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2019009682A2 true WO2019009682A2 (ko) 2019-01-10
WO2019009682A3 WO2019009682A3 (ko) 2019-03-28

Family

ID=64950230

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2018/007731 WO2019009682A2 (ko) 2017-07-07 2018-07-06 표적 특이적 crispr 변이체

Country Status (10)

Country Link
US (2) US11441135B2 (ko)
EP (1) EP3650540A4 (ko)
JP (2) JP2020530279A (ko)
CN (1) CN111094561B (ko)
AU (2) AU2018295992B2 (ko)
BR (1) BR112020000310A2 (ko)
CA (1) CA3069296A1 (ko)
RU (1) RU2020105703A (ko)
SG (1) SG11201913852RA (ko)
WO (1) WO2019009682A2 (ko)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020218657A1 (ko) 2019-04-26 2020-10-29 주식회사 툴젠 표적 특이적 crispr 변이체
KR20200125191A (ko) 2019-04-26 2020-11-04 주식회사 툴젠 표적 특이적 crispr 변이체
US11098297B2 (en) 2017-06-09 2021-08-24 Editas Medicine, Inc. Engineered Cas9 nucleases
US11499151B2 (en) 2017-04-28 2022-11-15 Editas Medicine, Inc. Methods and systems for analyzing guide RNA molecules
US11866726B2 (en) 2017-07-14 2024-01-09 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for targeted integration and genome editing and detection thereof using integrated priming sites
EP4093863A4 (en) * 2020-01-24 2024-04-10 The General Hospital Corporation CRISPR-CAS ENZYMES WITH IMPROVED ON-TARGET ACTIVITY

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019009682A2 (ko) * 2017-07-07 2019-01-10 주식회사 툴젠 표적 특이적 crispr 변이체
WO2019051419A1 (en) * 2017-09-08 2019-03-14 University Of North Texas Health Science Center MODIFIED CASE VARIANTS9
AU2021225399A1 (en) * 2020-02-25 2022-06-23 Biospirál-2006 Fejlesztő És Tanácsadó Kft. Variant Cas9
CN112430613A (zh) * 2020-12-08 2021-03-02 安徽省农业科学院水稻研究所 一种宽编辑范围的SpG基因及其应用
US20240043820A1 (en) * 2020-12-11 2024-02-08 The University Of Western Australia Enzyme variants
CN112538471B (zh) * 2020-12-28 2023-12-12 南方医科大学 一种CRISPR SpCas9(K510A)突变体及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017217768A1 (ko) 2016-06-15 2017-12-21 주식회사 툴젠 온타겟 및 오프타겟의 다중 타겟 시스템을 이용하는, 표적 특이적 유전자 가위 스크리닝 방법 및 이의 용도

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111454951A (zh) * 2013-03-14 2020-07-28 卡里布生物科学公司 以核酸为靶的核酸的组合物和方法
WO2015052231A2 (en) 2013-10-08 2015-04-16 Technical University Of Denmark Multiplex editing system
WO2015089277A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for modifying a single stranded target nucleic acid
JP2017503485A (ja) * 2013-12-12 2017-02-02 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 遺伝子産物の発現、構造情報、及び誘導性モジュラーｃａｓ酵素を変更するためのｃｒｉｓｐｒ−ｃａｓ系並びに方法
MA41349A (fr) * 2015-01-14 2017-11-21 Univ Temple Éradication de l'herpès simplex de type i et d'autres virus de l'herpès associés guidée par arn
US9944912B2 (en) * 2015-03-03 2018-04-17 The General Hospital Corporation Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificity
WO2016161207A1 (en) * 2015-03-31 2016-10-06 Exeligen Scientific, Inc. Cas 9 retroviral integrase and cas 9 recombinase systems for targeted incorporation of a dna sequence into a genome of a cell or organism
AU2016276702B2 (en) 2015-06-09 2022-07-28 Editas Medicine, Inc. CRISPR/CAS-related methods and compositions for improving transplantation
TW202400626A (zh) 2015-06-18 2024-01-01 美商博得學院股份有限公司 降低脫靶效應的ｃｒｉｓｐｒ酶突變
CA2996888A1 (en) 2015-08-28 2017-03-09 The General Hospital Corporation Engineered crispr-cas9 nucleases
WO2017048969A1 (en) 2015-09-17 2017-03-23 The Regents Of The University Of California Variant cas9 polypeptides comprising internal insertions
EP3498846A4 (en) * 2016-08-12 2020-03-11 Toolgen Incorporated MANIPULATED IMMUNEGULATORY ELEMENT AND CHANGED IMMUNITY
EP4012032A1 (en) 2016-08-19 2022-06-15 Toolgen Incorporated Artificially engineered angiogenesis regulatory system
WO2019009682A2 (ko) * 2017-07-07 2019-01-10 주식회사 툴젠 표적 특이적 crispr 변이체

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017217768A1 (ko) 2016-06-15 2017-12-21 주식회사 툴젠 온타겟 및 오프타겟의 다중 타겟 시스템을 이용하는, 표적 특이적 유전자 가위 스크리닝 방법 및 이의 용도

Non-Patent Citations (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDERS ET AL., NATURE, 2014
CHEN, J.S. ET AL., NATURE, 2017
CHEN, Z.ZHAO, H., NUCLEIC ACIDS RES, vol. 33, 2005, pages e154
CLARK-CURTISSCURTISS ET AL.: "Methods in Enzymology", vol. 101, 1983, pages: 347 - 362
COLLEY ET AL., J. BIOL. CHEM., vol. 264, 1989, pages 17619 - 22
FU, Y.SANDER, J.D.REYON, D.CASCIO, V.M.JOUNG, J.K., NAT BIOTECHNOL, vol. 32, 2014, pages 279 - 284
GEISSMANN, Q., PLOS ONE, vol. 8, pages e54072
GUIDE: "Protein Purification, in Methods in Enzymology", vol. 182, 1990
HSU, P.D. ET AL., NAT BIOTECHNOL, vol. 31, 2013, pages 827 - 832
JINEK ET AL., SCIENCE, vol. 343, no. 6176, 2014, pages 1247997
KIM, D. ET AL., NAT METHODS, vol. 12, 2015, pages 237 - 243,231
KIM, D.KIM, S.PARK, J.KIM, J.S., GENOME RES, vol. 26, 2016, pages 406 - 415
KIM, S.KIM, D.CHO, S.W.KIM, J.KIM, J.S., GENOME RES, vol. 24, 2014, pages 1012 - 1019
KLEINSTIVER, B.P. ET AL., NAT BIOTECHNOL, vol. 33, 2015, pages 1293 - 1298
KLEINSTIVER, B.P. ET AL., NATURE, vol. 523, 2015, pages 481 - 485
KOMOR, A.C.KIM, Y.B.PACKER, M.S.ZURIS, J.A.LIU, D.R., NATURE, vol. 533, 2016, pages 420 - 424
KULCSAR, P.I. ET AL., GENOME BIOL, vol. 18, 2017, pages 191
MCKENZIE, G.J.CRAIG, N.L., BMC MICROBIOL, vol. 6, 2006, pages 39
MORRISON, J. BACTERIOL., vol. 132, 1977, pages 349 - 351
NISHIMASU, H. ET AL., CELL, vol. 156, 2014, pages 935 - 949
RAN, F.A. ET AL., CELL, vol. 154, 2013, pages 1380 - 1389
SLAYMAKER, I.M. ET AL., SCIENCE, vol. 351, 2016, pages 84 - 88

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11499151B2 (en) 2017-04-28 2022-11-15 Editas Medicine, Inc. Methods and systems for analyzing guide RNA molecules
US11098297B2 (en) 2017-06-09 2021-08-24 Editas Medicine, Inc. Engineered Cas9 nucleases
US11866726B2 (en) 2017-07-14 2024-01-09 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for targeted integration and genome editing and detection thereof using integrated priming sites
WO2020218657A1 (ko) 2019-04-26 2020-10-29 주식회사 툴젠 표적 특이적 crispr 변이체
KR20200125191A (ko) 2019-04-26 2020-11-04 주식회사 툴젠 표적 특이적 crispr 변이체
JP2022539286A (ja) * 2019-04-26 2022-09-08 ツールゲン インコーポレイテッド 標的特異的ｃｒｉｓｐｒ変異体
JP7345563B2 (ja) 2019-04-26 2023-09-15 ツールゲン インコーポレイテッド 標的特異的ｃｒｉｓｐｒ変異体
EP4093863A4 (en) * 2020-01-24 2024-04-10 The General Hospital Corporation CRISPR-CAS ENZYMES WITH IMPROVED ON-TARGET ACTIVITY

Also Published As

Publication number Publication date
AU2022200262B2 (en) 2024-01-04
US20230130858A1 (en) 2023-04-27
CN111094561A (zh) 2020-05-01
JP2023025045A (ja) 2023-02-21
AU2018295992A1 (en) 2020-01-30
BR112020000310A2 (pt) 2020-07-14
JP2020530279A (ja) 2020-10-22
RU2020105703A (ru) 2021-08-09
AU2022200262A1 (en) 2022-02-10
US11441135B2 (en) 2022-09-13
CN111094561B (zh) 2024-03-12
WO2019009682A3 (ko) 2019-03-28
EP3650540A4 (en) 2021-03-31
SG11201913852RA (en) 2020-01-30
CA3069296A1 (en) 2019-01-10
US20200149022A1 (en) 2020-05-14
AU2018295992B2 (en) 2021-10-21
EP3650540A2 (en) 2020-05-13
KR20190005801A (ko) 2019-01-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2019009682A2 (ko) 표적 특이적 crispr 변이체
WO2021086083A2 (ko) CRISPR/Cas12f1 시스템 효율화를 위한 엔지니어링 된 가이드 RNA 및 그 용도
WO2017217768A1 (ko) 온타겟 및 오프타겟의 다중 타겟 시스템을 이용하는, 표적 특이적 유전자 가위 스크리닝 방법 및 이의 용도
WO2016021973A1 (ko) 캄필로박터 제주니 crispr/cas 시스템 유래 rgen을 이용한 유전체 교정
AU2013335451C1 (en) Composition for cleaving a target DNA comprising a guide RNA specific for the target DNA and Cas protein-encoding nucleic acid or Cas protein, and use thereof
CN101310015A (zh) 在两个功能性亚结构域中具有突变的laglidadg归巢核酸内切酶变体及其用途
WO2022060185A1 (ko) 표적화된 탈아미노효소 및 이를 이용한 염기 교정
WO2018062866A2 (en) CELL-PERMEABLE (CP)-Cas9 RECOMBINANT PROTEIN AND USES THEREOF
WO2022075813A1 (ko) Crispr/cas12f1 시스템 효율화를 위한 엔지니어링 된 가이드 rna 및 그 용도
WO2017188797A1 (ko) In vivo에서 rna-가이드 뉴클레아제의 활성을 고처리량 방식으로 평가하는 방법
WO2020235974A2 (ko) 단일염기 치환 단백질 및 이를 포함하는 조성물
WO2019103442A2 (ko) CRISPR/Cpf1 시스템을 이용한 유전체 편집용 조성물 및 이의 용도
WO2022075816A1 (ko) Crispr/cas12f1(cas14a1) 시스템 효율화를 위한 엔지니어링 된 가이드 rna 및 이의 용도
WO2018231018A2 (ko) 간에서 목적하는 단백질 발현하기 위한 플랫폼
WO2018088694A2 (ko) 인위적으로 조작된 sc 기능 조절 시스템
WO2022075808A1 (ko) Crispr/cas12f1 시스템 효율화를 위한 u-rich tail을 포함하는 엔지니어링 된 가이드 rna 및 그 용도
WO2015199387A2 (ko) 가용성 단백질 발현량 및 활성이 증대된 헬리코박터 파일로리 유래 α-1,3 푸코실 전달효소의 유전자와 단백질 및 α-1,3 푸코실올리고당 생산에의 응용
WO2019066549A2 (ko) 망막 기능장애 질환 치료를 위한 유전자 조작
CN1330666C (zh) 低氧－诱导因子1αHIF－1α变体和鉴定HIF－1α调节剂的方法
WO2020218657A1 (ko) 표적 특이적 crispr 변이체
WO2023059115A1 (ko) 유전자 편집을 위한 target 시스템 및 이의 용도
WO2018182361A1 (ko) CRISPR/Cas 시스템과 재조합 효소 및 단일가닥 올리고디옥시리보핵산을 이용한 코리네박테리움 변이균주 제조방법
WO2020022803A1 (ko) 항응고 인자들의 유전자 에디팅
WO2023153845A2 (ko) 상동지정복구를 위한 target 시스템 및 이를 이용한 유전자 편집 방법
WO2020022802A1 (ko) 인위적인 유전자 조작을 통한 자가면역질환 치료

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18829020

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020500033

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 3069296

Country of ref document: CA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112020000310

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018295992

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20180706

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018829020

Country of ref document: EP

Effective date: 20200207

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112020000310

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20200107