KR20200125191A - 표적 특이적 crispr 변이체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인위적으로 조작된 CRISPR/Cas9 시스템에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 표적 특이성이 향상된 인위적으로 조작된 CRISPR 효소 및 이를 포함하는 인위적으로 조작된 CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 게놈 및/또는 후생유전자(epigenome)의 조작 또는 변형, 게놈 표적화, 게놈 교정 및 체외 진단 등의 용도에 관한 것이다.

Description

표적 특이적 CRISPR 변이체{Target Specific CRISPR variants}
본 발명은 인위적으로 조작된 CRISPR-Cas9 시스템에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 표적 특이성이 향상된 인위적으로 조작된 CRISPR 효소 및 이를 포함하는 인위적으로 조작된 CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 게놈 및/또는 후생유전자(epigenome)의 조작 또는 변형, 게놈 표적화, 게놈 교정 및 체외 진단 등의 용도에 관한 것이다.
CRISPR-Cas9 시스템은 표적하는 유전자 또는 핵산에 상보적인 서열을 가지는 guide RNA(gRNA)와 표적하는 유전자 또는 핵산을 절단할 수 있는 뉴클레아제인 CRISPR 효소로 구성되며, gRNA와 CRISPR 효소는 CRISPR 복합체를 형성하고, 형성된 CRISPR 복합체에 의해 표적하는 유전자 또는 핵산을 절단 또는 변형시킨다.
하지만 상기와 같은 표적하는 유전자 또는 핵산을 변형시키는 효과와 더불어 원하지 않는 비표적 유전자 또는 핵산을 변형시키는 문제가 아직까지 해결되지 않고 있다. 상기 비표적 유전자 또는 핵산은 gRNA와 일부 상보적인 서열을 가지는 유전자 위치로서, 상기 gRNA와 부분적인 상보적 결합을 형성할 수 있으며, 이러한 부분적인 상보적 결합은 CRISPR 복합체가 해당 유전자 위치, 즉, 변형의 대상이 아닌 비표적 유전자 또는 핵산을 절단 또는 변형시킬 수 있다.
그러므로, CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 표적하는 유전자 또는 핵산을 특이적으로 변형시키는 효율을 증대하기 위해, 또는 비표적 유전자 또는 핵산의 변형으로 초래될 수 있는 유전적 결합 등의 문제점을 해결하기 위해 CRISPR-Cas9 시스템의 표적 특이성을 증가시키는 것이 중요하다. 이러한 CRISPR-Cas9 시스템의 표적 특이성을 증가시키기 위해서, 비표적 유전자 후보가 적은 gRNA 선정과 함께 CRISPR 효소의 활성 및/또는 특이성을 조절하는 등의 다양한 연구가 시도되고 있다.
WO 2019-009682 WO 2017-217768
Kim, D. et al. Nat Methods 12, 237-243, 231 p following 243 (2015) Tsai, S.Q. et al. Nat Biotechnol 33, 187-197 (2015) Kim, S., Kim, D., Cho, S.W., Kim, J. & Kim, J.S. Genome Res 24, 1012-1019 (2014) Cho, S.W. et al. Genome Res 24, 132-141 (2014) Mali, P. et al. Nat Biotechnol 31, 833-838 (2013) Ran, F.A. et al. Cell 154, 1380-1389 (2013) Fu, Y., Sander, J.D., Reyon, D., Cascio, V.M. & Joung, J.K. Nat Biotechnol 32, 279-284 (2014) Nishimasu, H. et al. Cell 156, 935-949 (2014) Kleinstiver, B.P. et al. Nature 529, 490-495 (2016) Slaymaker, I.M. et al. Science 351, 84-88 (2016) Chen, J.S. et al. Nature (2017) Kleinstiver, B.P. et al. Nat Biotechnol 33, 1293-1298 (2015) Kleinstiver, B.P. et al. Nature 523, 481-485 (2015) Chen, Z. & Zhao, H. Nucleic Acids Res 33, e154 (2005) Hsu, P.D. et al. Nat Biotechnol 31, 827-832 (2013) McKenzie, G.J. & Craig, N.L. BMC Microbiol 6, 39 (2006) Kulcsar, P.I. et al. Genome Biol 18, 190 (2017) Zhang, D. et al. Genome Biol 18, 191 (2017) Komor, A.C., Kim, Y.B., Packer, M.S., Zuris, J.A. & Liu, D.R. Nature 533, 420-424 (2016) Kim, D., Kim, S., Park, J. & Kim, J.S. Genome Res 26, 406-415 (2016) Geissmann, Q. PLoS One 8, e54072
본 발명의 일 구체예로서 표적 특이성이 향상된 인위적으로 조작된 CRISPR 효소를 제공하고자 한다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위한 인위적으로 조작된 CRISPR 효소에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 표적 유전자 또는 핵산에 대한 표적 특이성이 향상된 Cas9 및 이를 이용한 CRISPR-Cas9 시스템에 관한 것이다.
본 발명은 특정 목적을 위해 인위적으로 조작된 CRISPR 효소를 제공한다.
구현예에서, 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 인위적인 조작을 포함하는 SpCas9 변이체로서, 상기 인위적인 조작은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9(SpCas9)의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop) 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 인위적인 조작을 포함하는 것일 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 표적 특이성이 향상된 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)는 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM(Protospacer adjacent motif)과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용하는 영역일 수 있다.
상기 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)는 SpCas9의 1001번째 타이로신(Y1001)부터 1030번째 글리신(G1030)까지의 아미노산 서열로 구성된 영역일 수 있다.
이때, 상기 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)는 SpCas9의 Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029 및 G1030을 포함하는 것일 수 있다.
상기 SpCas9의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop) 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산은 SpCas9의 Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029 및 G1030으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산인 것일 수 있다.
이때, 상기 SpCas9의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop) 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산은 SpCas9의 E1007인 것일 수 있다.
상기 인위적인 조작은 SpCas9의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop) 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 제거(deletion)일 수 있다.
상기 인위적인 조작은 SpCas9의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop) 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
이때, 상기 다른 아미노산은 SpCas9의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop) 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산에 비해 상대적으로 기능기(functional group)의 크기가 작은 아미노산일 수 있다.
상기 “기능기(functional group)”는 아민(-NH2) 및 카르복시(-COOH)와 함께 아미노산을 구성하는 요소로, 기능기의 종류 및 위치에 따라 아미노산의 특성이 달라질 수 있다. 기능기는 사이드 체인(side chain) 또는 측쇄로도 불린다.
이때, 상기 다른 아미노산은 SpCas9의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop) 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산에 비해 상대적으로 기능기(functional group)의 크기가 큰 아미노산일 수 있다.
이때, 상기 다른 아미노산은 SpCas9의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop) 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산에 비해 상대적으로 소수성 지표(hydropathy index)가 큰 아미노산일 수 있다.
상기 다른 아미노산은 SpCas9의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop) 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산에 비해 상대적으로 소수성 지표(hydropathy index)가 작은 아미노산일 수 있다.
이때, 상기 다른 아미노산은 생리학적 pH(pH7.4)에서 기능기의 전하(charge)가 중성(neutral) 전하인 아미노산일 수 있다.
상기 SpCas9 변이체는 A203, N277, G366, F539, I601, M763, K890, D965, F1038, T1102 및 D1127으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 인위적인 변형을 추가로 더 포함할 수 있다.
이때, 상기 SpCas9 변이체는 F539, M763 및 K890의 인위적인 변형을 추가로 더 포함할 수 있다.
구현예에서, 상기 SpCas9 변이체는 SpCas9의 1007번째 글루탐산의 인위적인 조작을 포함하는 표적 특이적 SpCas9(Target specific SpCas9; TS-SpCas9) 변이체일 수 있다.
상기 인위적인 조작은 SpCas9의 1007번째 글루탐산의 제거 또는 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
이때, 상기 다른 아미노산은 SpCas9의 1007번째 글루탐산에 비해 상대적으로 기능기의 크기가 크거나 또는 작은 아미노산일 수 있다.
이때, 상기 다른 아미노산은 SpCas9의 1007번째 글루탐산에 비해 상대적으로 소수성 지표가 크거나 또는 작은 아미노산일 수 있다.
이때, 상기 다른 아미노산은 생리학적 pH(pH7.4)에서 중성 전하(neutral charge)를 가지는 아미노산일 수 있다.
이때, 상기 다른 아미노산은 류신 또는 프롤린일 수 있다.
상기 TS-SpCas9 변이체는 A203, N277, G366, F539, I601, M763, K890, D965, F1038, T1102 및 D1127으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 인위적인 변형을 추가로 더 포함할 수 있다.
이때, 상기 TS-SpCas9 변이체는 F539, M763 및 K890의 인위적인 변형을 추가로 더 포함할 수 있다.
구현예에서, 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 상기 TS-SpCas9 변이체를 포함하는 융합 단백질일 수 있다.
상기 융합 단백질은 하나 이상의 기능적(functional) 도메인을 포함할 수 있다.
이때, 상기 기능적(functional) 도메인은 메틸라아제(methylase) 활성, 디메틸라아제(demethylase) 활성, 전사촉진(transcription activation) 활성, 전사 저해(transcription repression) 활성, 전사 방출 인자(transcription release factor) 활성, 히스톤 변형(histone modification) 활성, RNA 절단(cleavage) 활성 또는 핵산 결합(nucleic acid binding) 활성을 가지는 도메인; 단백질(펩타이드 포함)의 분리정제를 위한 태그(tag) 또는 리포터 유전자; NLS(nuclear localization sequence or signal) 또는 NES(nuclear export sequence or signal); 및 디아미네이즈(deaminase)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
구현예에서, 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 상기 SpCas9 변이체, TS-SpCas9 변이체 및/또는 융합 단백질을 암호화하는 핵산의 형태일 수 있다.
구현예에서, 상기 핵산은 벡터에 포함될 수 있다.
구현예에서, 상기 SpCas9 변이체, TS-SpCas9 변이체 및/또는 융합 단백질을 암호화하는 핵산은 세포에 도입될 수 있다.
구현예에서, 상기 SpCas9 변이체, TS-SpCas9 변이체 및/또는 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터는 세포에 도입될 수 있다.
구현예에서, 상기 SpCas9 변이체, TS-SpCas9 변이체 및/또는 융합 단백질은 gRNA와 함께 사용하여 세포의 게놈을 인위적으로 조작할 수 있다.
상기 gRNA는 상기 세포의 게놈 내에 존재하는 표적 유전자의 표적 서열에 상보적 결합을 하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산일 수 있다.
본 발명은 인위적으로 조작된 CRISPR 효소를 통해 표적 특이성이 향상된 CRISPR-Cas 시스템을 게놈 및/또는 후생유전자(epigenome)의 조작 또는 변형, 게놈 표적화, 게놈 교정 및 체외 진단 등에 이용할 수 있다.
도 1은 Cas9 변이체 라이브러리의 스크리닝 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 Cas9 변이체 라이브러리의 스크리닝 후 얻은 Cas9 변이체를 정리한 표이다.
도 3은 각 변이체의 EMX1 유전자의 온-타겟 및 오프-타겟에 대한 indel(%)을 나타낸 그래프이다.
도 4는 E1007을 다양한 아미노산으로 치환한 Cas9 변이체를 이용한 EMX1 유전자의 온-타겟 및 오프-타겟에 대한 indel(%)을 나타낸 그래프이다.
도 5는 E1007을 다양한 아미노산으로 치환한 Cas9 변이체를 이용한 DMD 유전자의 온-타겟 및 오프-타겟에 대한 indel(%)을 나타낸 그래프이다.
도 6은 E1007을 알라닌, 아르기닌, 류신, 프롤린, 세린 또는 타이로신으로 치환한 Cas9 변이체를 이용한 EMX1 유전자의 온-타겟 및 오프-타겟에 대한 indel(%)을 나타낸 그래프이다.
도 7은 E1007을 알라닌, 아르기닌, 류신, 프롤린, 세린 또는 타이로신으로 치환한 Cas9 변이체를 이용한 FANCF02 유전자의 온-타겟 및 오프-타겟에 대한 indel(%)을 나타낸 그래프이다.
도 8은 E1007을 알라닌, 아르기닌, 류신, 프롤린, 세린 또는 타이로신으로 치환한 Cas9 변이체를 이용한 ZSCAN2 유전자의 온-타겟 및 오프-타겟에 대한 indel(%)을 나타낸 그래프이다.
도 9는 E1007을 알라닌, 아르기닌, 류신, 프롤린, 세린 또는 타이로신으로 치환한 Cas9 변이체를 이용한 RUNX1 유전자의 온-타겟 및 오프-타겟에 대한 indel(%)을 나타낸 그래프이다.
도 10은 E1007을 알라닌, 아르기닌, 류신, 프롤린, 세린 또는 타이로신으로 치환한 Cas9 변이체를 이용한 DMD 유전자의 온-타겟 및 오프-타겟에 대한 indel(%)을 나타낸 그래프이다.
도 11은 E1007을 알라닌, 아르기닌, 류신, 프롤린, 세린 또는 타이로신으로 치환한 Cas9 변이체를 이용한 HBB02 유전자의 온-타겟 및 오프-타겟에 대한 indel(%)을 나타낸 그래프이다.
도 12는 E1007을 알라닌, 아르기닌, 류신, 프롤린, 세린 또는 타이로신으로 치환한 Cas9 변이체를 이용한 HBB03 유전자의 온-타겟 및 오프-타겟에 대한 indel(%)을 나타낸 그래프이다.
도 13은 E1007을 알라닌, 아르기닌, 류신, 프롤린, 세린 또는 타이로신으로 치환한 Cas9 변이체를 이용한 HBB04 유전자의 온-타겟 및 오프-타겟에 대한 indel(%)을 나타낸 그래프이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사 또는 동일한 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 이하에 기재된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 다른 참고문헌은 전체가 참고로 포함된다. 추가로, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 태양은 CRISPR 효소에 관한 것이다.
“CRISPR 효소”는 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)-Cas(CRISPR-associated protein) 시스템의 주요 단백질 구성 요소로, guide RNA(gRNA)와 복합체를 형성하여 CRISPR-Cas 시스템을 형성한다.
상기 “gRNA”는 표적 유전자 또는 핵산에 대한 gRNA-CRISPR 효소 복합체, 즉, CRISPR 복합체를 특이적 표적화할 수 있는 RNA를 지칭하며, gRNA는 표적서열에 대한 특이적 RNA로서 CRISPR 효소과 결합하여 CRISPR 효소를 표적 유전자 또는 핵산으로 인도할 수 있다. 이때, 상기 “표적서열”은 표적 유전자 또는 핵산 내에 존재하는 뉴클레오타이드 서열로, 구체적으로는 표적 유전자 또는 핵산 내에 표적 영역의 일부 뉴클레오타이드 서열이며, 이때 “표적 영역”은 표적 유전자 또는 핵산 내에 가이드핵산-에디터단백질에 의해 변형될 수 있는 부위이다.
상기 gRNA는 다수의 도메인을 포함할 수 있다. 각각의 도메인에 의해 3차원 형태 또는 gRNA의 활성 형태의 가닥내 또는 가닥간 상호작용을 할 수 있다.
gRNA는 단일가닥 gRNA(단일 RNA 분자; single gRNA; sgRNA); 또는 이중 gRNA(하나 초과의 통상적으로 2개의 별개의 RNA 분자를 포함함)로서 지칭될 수 있다.
일 구체예에서, 단일가닥 gRNA는 5’으로부터 3’ 방향으로 가이드 도메인, 즉 표적 유전자 또는 핵산에 상보적인 결합을 할 수 있는 가이드 서열(guide sequence)를 포함하는 도메인; 제 1 상보적 도메인; 연결 도메인; 제 2 상보적 도메인, 상기 제 1 상보적 도메인 서열에 상보적인 서열을 가지므로 제 1 상보적 도메인과 이중가닥 핵산을 형성할 수 있는 도메인; 근위 도메인(proximal domain); 및 선택적으로 꼬리 도메인을 포함할 수 있다.
다른 일 구체예로서, 이중 gRNA는 5’으로부터 3’ 방향으로 가이드 도메인, 즉 표적 유전자 또는 핵산에 상보적인 결합을 할 수 있는 가이드 서열(guide sequence)를 포함하는 도메인 및 제 1 상보적 도메인을 포함하는 제 1가닥; 및 제 2 상보적 도메인, 상기 제 1 상보적 도메인 서열에 상보적인 서열을 가지므로 제 1 상보적 도메인과 이중가닥 핵산을 형성할 수 있는 도메인, 근위 도메인(proximal domain); 및 선택적으로 꼬리 도메인을 포함하는 제 2 가닥을 포함할 수 있다.
이때, 상기 제 1가닥은 crRNA라고 지칭될 수 있고, 상기 제 2가닥은 tracrRNA로 지칭될 수 있다. 상기 crRNA는 가이드 도메인과 제 1 상보적 도메인을 포함할 수 있으며, 상기 tracrRNA는 제 2 상보적 도메인, 근위 도메인 및 선택적으로 꼬리 도메인을 포함할 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 단일가닥 gRNA는 3’으로부터 5’ 방향으로 가이드 도메인, 즉 표적 유전자 또는 핵산에 상보적인 결합을 할 수 있는 가이드 서열(guide sequence)를 포함하는 도메인; 제 1 상보적 도메인; 및 제 2 상보적 도메인, 상기 제 1 상보적 도메인 서열에 상보적인 서열을 가지므로 제 1 상보적 도메인과 이중가닥 핵산을 형성할 수 있는 도메인을 포함할 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 CRISPR 효소를 암호화하는 서열을 가지는 핵산 또는 폴리펩타이드(또는 단백질)일 수 있으며, 대표적으로 Type II CRISPR 효소 또는 Type V CRISPR 효소가 많이 사용된다.
상기 CRISPR 효소는 Type II CRISPR 효소일 수 있다.
상기 Type II CRISPR 효소는 Cas9일 수 있다.
이때, 상기 Cas9은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 스타필로코커스 아우레스(Staphylococcus aureus), 노카르디옵시스 다손빌레이(Nocardiopsis dassonvillei), 스트렙토마이세스 프리스티네스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 알리사이클로바클루스 아시도칼다리우스(AlicyclobacHlus acidocaldarius), 바실러스 슈도마이코이데스(Bacillus pseudomycoides), 바실러스 셀레니티레두센스(Bacillus selenitireducens), 엑시구오박테리움 시비리쿰(Exiguobacterium sibiricum), 락토바실러스 델브루에키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 미크로스 킬라 마리나(Microscilla marina), 부르크홀데리아레스 박테리움(Burkholderiales bacterium), 폴라로모나스 나프탈레니보란스(Polaromonas naphthalenivorans), 폴라로모나스 속(Polaromonas sp.), 크로코스파에라 와트소니이(Crocosphaera watsonii), 시아노테세 속(Cyanothece sp.), 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa), 시네코코커스 속(Synechococcus sp.), 아세토할로비움 아라바티쿰(Acetohalobium arabaticum), 암모니펙스 데겐시이(Ammonifex degensii), 칼디셀룰로시럽토 베시이(Caldicelulosiruptor bescii), 칸디다투스 데술포루디스(Candidatus Desulforudis), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile), 피네골디아 마그나(Finegoldia magna), 나트라나에로비우스 써모필러스 (Natranaerobius thermophilus), 펠로토마쿨럼 써모프로피오니쿰(Pelotomaculum thermopropionicum), 아시디티오바실러스 칼두스(Acidithiobacillus caldus), 아시디티오바실러스 페로옥시단스(Acidithiobacillus ferrooxidans), 알로크로마티움 비노숨(Allochromatium vinosum), 마리노박터 속(Marinobacter sp.), 니트로소코커스 할로필러스(Nitrosococcus halophilus), 니트로소코커스 와트소니(Nitrosococcus watsoni), 슈도알테로 모나스 할로플란크티스(Pseudoalteromonas haloplanktis), 크테도노박테르 라세미페르(Ktedonobacter racemifer), 메타노할로비움 에베스티가툼(Methanohalobium evestigatum), 아나베나 바리아빌리스(Anabaena variabilis), 노둘라리아 스푸미게나(Nodularia spumigena), 노스톡 속(Nostoc sp.), 아르트로스피라 맥시마(Arthrospira maxima), 아르트로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 아르트로스피라 속(Arthrospira sp.), 링비아속(Lyngbya sp.), 마이크로콜레우스 크토노플라스테스(Microcoleus chthonoplastes), 오실라토리아 속(Oscillatoria sp.), 페트로토가 모빌리스(Petrotoga mobilis), 써모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus) 또는 아카리오클로리스 마리나(Acaryochloris marina) 등 다양한 미생물 유래의 Cas9일 수 있다.
이때, 상기 Cas9은 자연상태에서 존재하는 미생물에서 분리된 것 또는 재조합적 방법 또는 합성적 방법을 통해 비자연적으로 생산된 것일 수 있다.
Type II CRISPR 효소의 결정 구조는 2종 이상의 자연유래 미생물 Type II CRISPR 효소 분자에 대한 연구(Jinek et al., Science, 343(6176):1247997, 2014) 및 gRNA와 함께 복합체를 이루는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9(SpCas9)에 대한 연구(Nishimasu et al., Cell, 156:935-949, 2014; 및 Anders et al., Nature, 2014, doi: 10.1038/nature13579)를 통해 결정되었다.
상기 Type II CRISPR 효소는 2개의 로브, 즉, 인식(REC) 및 뉴클레아제(NUC) 로브를 포함하며, 각각의 로브는 여러 개의 도메인을 포함한다.
상기 REC 로브는 아르기닌-풍부 브릿지 나선(BH), REC1 도메인 및 REC2 도메인을 포함한다.
이때, 상기 BH 도메인은 긴 α-나선 및 아르기닌 풍부 영역이며, 상기 REC1 및 REC2 도메인은 gRNA 내의 형성되는 이중가닥의, 예를 들어, 단일가닥 gRNA, 이중 gRNA 또는 tracrRNA의 인식에 중요한 역할을 한다.
상기 NUC 로브는 RuvC 도메인, HNH 도메인 및 PAM-상호작용(PI) 도메인을 포함한다. 이때, 상기 RuvC 도메인은 RuvC-유사 도메인을 포괄하는 의미로 사용되고, 또한 상기 HNH 도메인은 HNH-유사 도메인을 포괄하는 의미로 사용된다.
이때, 상기 RuvC 도메인은 Type II CRISPR 효소를 포함하는 자연상태에 존재하는 미생물의 구성원에 대해 구조적으로 유사성을 공유하며, 단일가닥, 예를 들어 표적 유전자 또는 핵산의 비상보성 가닥, 즉, gRNA와 상보적인 결합을 하지 않는 가닥을 절단한다. 상기 RuvC 도메인은 종종 당업계에서 RuvCI 도메인, RuvCII 도메인 및 RuvCIII 도메인으로서, 통상적으로 RuvC I, RuvCII 및 RuvCIII로 지칭된다.
상기 HNH 도메인은 HNH 엔도뉴클레아제와 구조적 유사성을 공유하며, 단일 가닥, 예를 들어 표적 핵산 분자의 상보성 가닥, 즉, gRNA와 상보적인 결합을 하는 가닥을 절단한다. HNH 도메인은 RuvC II와 III 모티프 사이에 위치한다.
상기 PI 도메인은 표적 유전자 또는 핵산 내의 특정 뉴클레오타이드서열, 즉, PAM(Protospacer adjacent motif)을 인식하거나 또는 PAM과 상호작용한다. 이때, 상기 PAM은 Type II CRISPR 효소의 유래(origin)에 따라 다를 수 있다. 예를 들어, CRISPR 효소가 SpCas9 인 경우 PAM은 5'-NGG-3'일 수 있고, 스트렙토코커스 써모필러스 Cas9(StCas9)인 경우 PAM은 5'-NNAGAAW-3'(W = A or T)일 수 있고, 스타필로코커스 아우레스 Cas9(SaCas9)인 경우 PAM은 5’-NNGRR-3’(R = A or G)일 수 있고, 네이세리아 메닝기디티스 Cas9(NmCas9)인 경우 PAM은 5'-NNNNGATT-3'일 수 있고, 캄필로박터 제주니 Cas9(CjCas9)의 경우 PAM은 5'-NNNVRYAC-3' (V = G or C or A, R = A or G, Y = C or T)일 수 있으며, 이때 상기 N은 A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C일 수 있다. 다만, 전술한 효소의 유래에 따라 PAM이 결정되는 것으로 일반적으로 이해되고 있으나, 해당 유래의 효소의 돌연변이(mutant)에 대한 연구가 진행됨에 따라, 상기 PAM은 달라질 수도 있다.
상기 CRISPR 효소는 표적 유전자 또는 핵산의 이중가닥을 절단하는 기능을 가지는 뉴클레아제 또는 제한효소일 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 완전 활성 CRISPR 효소일 수 있다.
"완전 활성"는 야생형(wild type) CRISPR 효소의 기능과 동일한 기능을 가지고 있는 상태를 의미하며, 이러한 상태의 CRISPR 효소를 완전 활성 CRISPR 효소로 명칭한다. 이때, “야생형(wild type) CRISPR 효소의 기능”은 DNA의 이중 가닥을 절단하는 기능, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 제2 기능을 모두 가지는 상태를 말한다.
상기 완전 활성 CRISPR 효소는 DNA의 이중 가닥을 절단하는 야생형 CRISPR 효소일 수 있다.
상기 완전 활성 CRISPR 효소는 DNA의 이중 가닥을 절단하는 야생형 CRISPR 효소를 변형 또는 조작시킨 CRISPR 효소 변이체일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되거나 또는 하나 이상의 아미노산이 제거된 효소일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산이 부가된 효소일 수 있다. 이때, 부가되는 아미노산의 위치는 야생형 효소의 N 말단, C 말단 또는 아미노산 서열 내일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소보다 기능이 향상된 완전 활성 효소일 수 있다.
예를 들면, 야생형 CRISPR 효소의 특정 변형 또는 조작된 형태, 즉, CRISPR 효소 변이체는 절단해야 하는 DNA 이중 가닥과 결합하지 않거나 또는 일정한 거리 간격을 유지한 상태에서 DNA 이중 가닥을 절단할 수 있다. 이러한 경우, 상기 변형 또는 조작된 형태는 야생형 CRISPR 효소보다 기능 활성이 향상된 완전 활성 CRISPR 효소일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소보다 기능이 감소된 완전 활성 CRISPR 효소일 수 있다.
예를 들면, 야생형 CRISPR 효소의 특정 변형 또는 조작된 형태, 즉, CRISPR 효소 변이체는 절단해야 하는 DNA 이중 가닥과 일정 거리이상으로 근접한 상태 또는 특정 결합이 형성된 상태에서 DNA 이중 가닥을 절단할 수 있다. 이때, 특정 결합은, 예를 들어, 효소의 특정 위치의 아미노산과 절단 위치의 DNA 뉴클레오타이드 서열과의 결합일 수 있다. 이러한 경우, 상기 변형 또는 조작된 형태는 야생형 CRISPR 효소보다 기능 활성이 감소된 완전 활성 CRISPR 효소일 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 불완전 또는 부분 활성 CRISPR 효소일 수 있다.
“불완전 또는 부분 활성”은 야생형 CRISPR 효소의 기능, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 제2 기능 중 선택된 하나의 기능을 가지는 상태를 의미한다. 이러한 상태의 CRISPR 효소는 불완전 또는 부분 활성 CRISPR 효소로 명칭한다. 또한 상기 불완전 또는 부분 활성 CRISPR 효소는 니카아제(nickase)로 지칭될 수 있다.
“니카아제(nickase)”는 표적 유전자 또는 핵산의 이중가닥 중 한 가닥만 절단되도록 조작 또는 변형된 CRISPR 효소를 의미하며, 상기 니카아제는 단일가닥, 예를 들어, 표적 유전자 또는 핵산의 gRNA와 비상보성 가닥 또는 상보성 가닥을 절단하는 뉴클레아제 활성을 가진다. 따라서, 이중가닥을 절단하기 위해서는 2개의 니카아제의 뉴클레아제 활성이 필요하다.
상기 니카아제는 CRISPR 효소의 RuvC 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 가질 수 있다. 즉, 상기 니카아제는 CRISPR 효소의 HNH 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 포함하지 않을 수 있으며, 이를 위해 HNH 도메인은 조작 또는 변경될 수 있다.
일 예로, 상기 CRISPR 효소가 Type II CRISPR 효소일 때, 상기 니카아제는 변형된 HNH 도메인을 포함하는 Type II CRISPR 효소일 수 있다.
예를 들어, 상기 Type II CRISPR 효소가 야생형 SpCas9의 경우, 상기 니카아제는 야생형 SpCas9의 아미노산 서열 840번 히스티딘을 알라닌으로 변이(mutation)시켜 HNH 도메인의 뉴클레아제 활성이 불활성화된 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때 생성된 니카아제, 즉, SpCas9 변이체는 RuvC 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 가지므로, 표적 유전자 또는 핵산의 비상보성 가닥, 즉, gRNA와 상보적인 결합을 하지 않는 가닥을 절단할 수 있다.
또 다른 예를 들어, 상기 Type II CRISPR 효소가 야생형 CjCas9의 경우, 상기 니카아제는 야생형 CjCas9의 아미노산 서열 559번 히스티딘을 알라닌으로 변이(mutation)시켜 HNH 도메인의 뉴클레아제 활성이 불활성화된 CjCas9 변이체일 수 있다. 이때 생성된 니카아제, 즉, CjCas9 변이체는 RuvC 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 가지므로, 표적 유전자 또는 핵산의 비상보성 가닥, 즉, gRNA와 상보적인 결합을 하지 않는 가닥을 절단할 수 있다.
또한, 상기 니카아제는 CRISPR 효소의 HNH 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 가질 수 있다. 즉, 상기 니카아제는 CRISPR 효소의 RuvC 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 포함하지 않을 수 있으며, 이를 위해 RuvC 도메인은 조작 또는 변경될 수 있다.
일 예로, 상기 CRISPR 효소가 Type II CRISPR 효소일 때, 상기 니카아제는 변형된 RuvC 도메인을 포함하는 Type II CRISPR 효소일 수 있다.
예를 들어, 상기 Type II CRISPR 효소가 야생형 SpCas9의 경우, 상기 니카아제는 야생형 SpCas9의 아미노산 서열 10번 아스파르트산을 알라닌으로 변이(mutation)시켜 RuvC 도메인의 뉴클레아제 활성이 불활성화된 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때 생성된 니카아제, 즉, SpCas9 변이체는 HNH 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 가지므로, 표적 유전자 또는 핵산의 상보성 가닥, 즉, gRNA와 상보적인 결합을 하는 가닥을 절단할 수 있다.
또 다른 예를 들어, 상기 Type II CRISPR 효소가 야생형 CjCas9의 경우, 상기 니카아제는 야생형 CjCas9의 아미노산 서열 8번 아스파르트산을 알라닌으로 변이(mutation)시켜 RuvC 도메인의 뉴클레아제 활성이 불활성화된 CjCas9 변이체일 수 있다. 이때 생성된 니카아제, 즉, CjCas9 변이체는 HNH 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 가지므로, 표적 유전자 또는 핵산의 상보성 가닥, 즉, gRNA와 상보적인 결합을 하는 가닥을 절단할 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 불활성 CRISPR 효소일 수 있다.
“불활성”은 야생형 CRISPR 효소의 기능, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 제2 기능이 모두 상실된 상태를 의미한다. 이러한 상태의 CRISPR 효소는 불활성 CRISPR 효소로 명칭한다.
상기 불활성 CRISPR 효소는 야생형 CRISPR 효소의 뉴클레아제 활성을 가지는 도메인에 변이로 인한 뉴클레아제 불활성을 가질 수 있다.
상기 불활성 CRISPR 효소는 RuvC 도메인 및 HNH 도메인에 변이로 인한 뉴클레아제 불화성을 가질 수 있다. 즉, 상기 불활성 CRISPR 효소는 CRISPR 효소의 RuvC 도메인 및 HNH 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 포함하지 않을 수 있으며, 이를 위해 RuvC 도메인 및 HNH 도메인은 조작 또는 변경될 수 있다.
일 예로, 상기 CRISPR 효소가 Type II CRISPR 효소일 때, 상기 불활성 CRISPR 효소는 변형된 RuvC 도메인 및 HNH 도메인을 포함하는 Type II CRISPR 효소일 수 있다.
예를 들어, 상기 Type II CRISPR 효소가 야생형 SpCas9의 경우, 상기 불활성 CRISPR 효소는 야생형 SpCas9의 아미노산 서열 10번 아스파르트산과 840번 히스티딘을 모두 알라닌으로 변이(mutation)시켜 RuvC 도메인 및 HNH 도메인의 뉴클레아제 활성이 불활성화된 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때 생성된 불활성 CRISPR 효소, 즉, SpCas9 변이체는 RuvC 도메인 및 HNH 도메인의 뉴클레아제 활성이 불활성 되므로, 표적 유전자 또는 핵산의 이중가닥을 모두 절단할 수 없다.
또 다른 예를 들어, 상기 Type II CRISPR 효소가 야생형 CjCas9의 경우, 상기 불활성 CRISPR 효소는 야생형 CjCas9의 아미노산 서열 8번 아스파르트산과 559번 히스티딘을 모두 알라닌으로 변이(mutation)시켜 RuvC 도메인 및 HNH 도메인의 뉴클레아제 활성이 불활성화된 CjCas9 변이체일 수 있다. 이때 생성된 불활성 CRISPR 효소, 즉, CjCas9 변이체는 RuvC 도메인 및 HNH 도메인의 뉴클레아제 활성이 불활성 되므로, 표적 유전자 또는 핵산의 이중가닥을 모두 절단할 수 없다.
상기 CRISPR 효소는 상기 기재된 뉴클레아제 활성 외에도 헬리카제 활성, 즉, 이중가닥 핵산의 나선 구조를 푸는 기능을 가질 수 있다.
또한, 상기 CRISPR 효소는 CRISPR 효소의 헬리카제 활성에 대해 완전 활성, 불완전 또는 부분 활성, 또는 불활성이 되도록 CRISPR 효소를 변형시킬 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 구체예로서, CRISPR 효소는 인위적으로 조작된 CRISPR 효소일 수 있다.
“인위적으로 조작된(artificially modified or engineered or artificially engineered)”이라는 용어는 자연상태에서 일어나는 존재 그대로의 상태가 아닌, 인위적인 변형을 가하여 생성된 상태를 의미한다. 이때, 상기 인위적인 변형은 CRISPR 효소를 암호화하는 핵산 및/또는 단백질에서 발생될 수 있고, 또한 상기 인위적인 변형은 CRISPR 효소를 암호화하는 핵산에 의해 단백질이 생성되는 과정, 즉, 전사, 전사 후 변형, 변역 및 변역 후 변형 등의 전체 과정에서 발생 가능한 인위적으로 조작할 수 있는 모든 변형을 포함한다. 이하에서, 비자연적인 인위적으로 조작된 또는 변형된 CRISPR 효소는 인위적인 CRISPR 효소 또는 CRISPR 효소 변이체라는 용어와 혼용되어 사용할 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 야생형 CRISPR 효소의 기능, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및/또는 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 제2 기능을 변형시킨 CRISPR 효소 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 기능 중 제1 기능이 상실된 형태일 수 있다.
또는 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 기능 중 제1 기능이 향상된 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 기능 중 제2 기능이 상실된 형태일 수 있다.
또는 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 기능 중 제2 기능이 향상된 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 기능, 즉, 제1 기능 및 제2 기능이 모두 상실된 형태일 수 있다.
또는 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 기능, 즉, 제1 기능 및 제2 기능이 모두 향상된 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 기능, 즉, 제1 기능은 상실되고 제2 기능은 향상된 형태일 수 있다.
또는 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 기능, 즉, 제1 기능은 향상되고 제2 기능은 상실된 형태일 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 gRNA와 상호작용을 통한 gRNA-CRISPR 효소 복합체 형성할 수 있다.
이때, 상기 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 야생형 CRISPR 효소의 gRNA와 상호작용하는 기능을 변형시킨 CRISPR 효소 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소에 비해 gRNA와의 상호작용이 감소된 형태일 수 있다.
또는 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소에 비해 gRNA의 상호작용이 증가된 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제1 기능을 가지면서 gRNA와의 상호작용이 감소된 형태일 수 있다.
또는 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제1 기능을 가지면서 gRNA와의 상호작용이 증가된 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제2 기능을 가지면서 gRNA와의 상호작용이 감소된 형태일 수 있다.
또는 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제2 기능을 가지면서 gRNA와의 상호작용이 증가된 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제1 기능 및 제2 기능을 가지지 않으면서 gRNA와의 상호작용이 감소된 형태일 수 있다.
또는 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제1 기능 및 제2 기능을 가지지 않으면서 gRNA와의 상호작용이 증가된 형태일 수 있다.
이때, gRNA와 CRISPR 효소 변이체의 상호작용 세기에 따라 다양한 gRNA-CRISPR 효소 복합체가 형성될 수 있고, CRISPR 효소 변이체에 따라 표적 서열에 접근 또는 절단하는 기능에 차이가 생길 수 있다.
예를 들어, gRNA와의 상호작용이 감소된 CRISPR 효소 변이체에 의해 형성된 gRNA-CRISPR 효소 복합체는 gRNA와 완전히 상보적 결합을 하는 표적 서열에 근접 또는 국소화되는 경우에만 오직 표적 서열의 이중가닥 또는 단일가닥을 절단할 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 상기 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 야생형 CRISPR 효소의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 CRISPR 효소 변이체일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 제거시킨 형태일 수 있다.
일 예로, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 양전하를 가지는 아미노산들 중 하나 이상의 아미노산을 제거시킨 형태일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 음전하를 가지는 아미노산들 중 하나 이상의 아미노산을 제거시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 예로, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 전하를 가지지 않는 아미노산들 중 하나 이상의 아미노산을 제거시킨 형태일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 양전하를 가지는 아미노산들, 음전하를 가지는 아미노산들 및 전하를 가지지 않는 아미노산들 중 하나 이상의 아미노산을 제거시킨 형태일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 아미노산 서열 중 선택된 적어도 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시킨 형태일 수 있다.
이때, 상기 다른 아미노산, 즉 치환시킨 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린 중 선택된 하나의 아미노산일 수 있다.
이때, 상기 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린은 각각의 아미노산 및 이에 부가적으로 변형될 수 있는 메틸화(methylation), 아세틸화(acetylation), 인산화(phosphorylation) 등의 화학적으로 변형된 형태를 모두 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 양전하를 가지는 아미노산들 중 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시킨 형태일 수 있다. 이때, 다른 아미노산은 상기 선택된 하나 이상의 아미노산의 입체 이성질체, 양전하를 가지는 다른 아미노산들, 음전하를 가지는 아미노산들 및 전하를 가지지 않는 아미노산들 중 선택된 하나 이상의 아미노산일 수 있다.
다른 일로, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 음전하를 가지는 아미노산들 중 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시킨 형태일 수 있다. 이때, 다른 아미노산은 상기 선택된 하나 이상의 아미노산의 입체 이성질체, 음전하를 가지는 다른 아미노산들, 양전하를 가지는 아미노산들 및 전하를 가지지 않는 아미노산들 중 선택된 하나 이상의 아미노산일 수 있다.
또 다른 일 예로, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 전하를 가지지 않는 아미노산들 중 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시킨 형태일 수 있다. 이때, 다른 아미노산은 상기 선택된 하나 이상의 아미노산의 입체 이성질체, 전하를 가지지 않는 다른 아미노산들, 양전하를 가지는 아미노산들 및 음전하를 가지는 아미노산들 중 선택된 하나 이상의 아미노산일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 양전하를 가지는 아미노산들, 음전하를 가지는 아미노산들 및 전하를 가지지 않는 아미노산들 중 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시킨 형태일 수 있다. 이때, 다른 아미노산은 상기 선택된 하나 이상의 아미노산의 입체 이성질체, 양전하를 가지는 아미노산들, 음전하를 가지는 아미노산들 및 전하를 가지지 않는 아미노산들 중 선택된 하나 이상의 아미노산일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 치환 및/또는 제거시킨 형태일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 상기 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 야생형 CRISPR 효소의 아미노산 서열 내에 적어도 하나 이상의 아미노산이 부가된 CRISPR 효소 변이체일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 아미노산 서열과 비교하여 적어도 하나 이상의 아미노산을 부가시킨 형태일 수 있다.
또는 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 아미노산 서열 내에 적어도 하나 이상의 기능적(functional) 도메인을 부가시킨 형태일 수 있다.
이때, 상기 기능적 도메인은 하나 이상의 아미노산으로 구성되며, 펩타이드 또는 폴리펩타이드일 수 있다.
이때, 상기 기능적 도메인은 야생형 CRISPR 효소의 원래 기능, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 제2 기능 이외에 부가적인 기능을 가지는 도메인일 수 있다.
또는 상기 기능적 도메인은 야생형 CRISPR 효소의 원래 기능, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및/또는 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 제2 기능과 유사한 기능을 가지는 도메인일 수 있다.
일 예로, 상기 기능적 도메인은 메틸라아제(methylase) 활성, 디메틸라아제(demethylase) 활성, 전사촉진(transcription activation) 활성, 전사 저해(transcription repression) 활성, 전사 방출 인자(transcription release factor) 활성, 히스톤 변형(histone modification) 활성, RNA 절단(cleavage) 활성 또는 핵산 결합(nucleic acid binding) 활성을 가지는 도메인일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 기능적 도메인은 단백질(펩타이드 포함)의 분리정제를 위한 태그(tag) 또는 리포터 유전자일 수 있다. 이때, 상기 태그는 히스티딘(His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그 및 티오레독신(Trx) 태그 등을 포함하며, 상기 리포터 유전자는 글루타티온-S-트랜스 퍼라제(GST), 호스라디시(horseradish) 과산화효소(HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질(GFP), HcRed, DsRed, 청록색 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP) 및 청색 형광 단백질(BFP)을 포함하는 자가형광 단백질을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.
또 다른 일 예로, 상기 기능적 도메인은 디아미네이즈(deaminase)일 수 있다.
예를 들어, 불완전 또는 부분 CRISPR 효소에 시티딘 디아미네이즈(cytidine deaminase)를 기능적 도메인으로 추가로 포함할 수 있다. 또는 불완전 또는 부분 CRISPR 효소에 아데닌 디아미네이즈(adenine deaminase)를 기능적 도메인으로 추가로 포함할 수 있다.
다른 일 예로, 상기 기능적 도메인은 NLS(nuclear localization sequence or signal) 또는 NES(nuclear export sequence or signal)일 수 있다.
예를 들어, CRISPR 효소는 하나 이상의 NLS를 포함할 수 있다. 이때, 상기 NLS는 CRISPR 효소의 아미노 말단 또는 그 근처; 카르복시 말단 또는 그 근처; 또는 이들의 조합에 하나 이상의 NLS를 포함할 수 있다. 상기 NLS는 하기로부터 유래된 NLS 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다: 아미노산 서열 PKKKRKV(서열번호 1)를 갖는 SV40 바이러스 대형 T-항원의 NLS; 뉴클레오플라스민(nucleoplasmin)으로부터의 NLS(예를 들어, 서열 KRPAATKKAGQAKKKK(서열번호 2)를 갖는 뉴클레오플라스민 이분(bipartite) NLS); 아미노산 서열 PAAKRVKLD(서열번호 3) 또는 RQRRNELKRSP(서열번호 4)를 갖는 c-myc NLS; 서열 NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY(서열번호 5)를 갖는 hRNPA1 M9 NLS; 임포틴-알파로부터의 IBB 도메인의 서열 RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV(서열번호 6); 마이오마(myoma) T 단백질의 서열 VSRKRPRP(서열번호 7) 및 PPKKARED(서열번호 8); 인간 p53의 서열 POPKKKPL(서열번호 9); 마우스 c-abl IV의 서열 SALIKKKKKMAP(서열번호 10); 인플루엔자 바이러스 NS1의 서열 DRLRR(서열번호 11) 및 PKQKKRK(서열번호 12); 간염 바이러스 델타 항원의 서열 RKLKKKIKKL(서열번호 13); 마우스 Mx1 단백질의 서열 REKKKFLKRR(서열번호 14); 인간 폴리(ADP-리보스) 중합효소의 서열 KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(서열번호 15); 및 스테로이드 호르몬 수용체(인간) 글루코코르티코이드의 서열 RKCLQAGMNLEARKTKK(서열번호 16).
상기 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 야생형 CRISPR 효소의 특정 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 CRISPR 효소 변이체일 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 야생형 CRISPR 효소의 특정 영역 내에 하나 이상의 아미노산이 부가된 CRISPR 효소 변이체일 수 있다.
이때, 상기 야생형 CRISPR 효소의 특정 영역은 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 선택된 하나 이상의 영역일 수 있다.
상기 제 1 영역은 gRNA와 상호작용하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
상기 제 1 영역은 표적서열과 상호작용하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
상기 제 1 영역은 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)과 상호작용하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
상기 제 1 영역은 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
이때, 상기 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM과 먼 말단 부위(PAM distal end)는 PAM 위치에서 멀리 위치한 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 말단의 6 내지 10개의 염기쌍, 즉, gRNA의 6 내지 10개 염기서열과 이와 상보적인 결합을 하는 표적서열의 6 내지 10개 염기서열을 의미할 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 CRISPR 효소의 REC 로브(lobe)에 위치한 영역일 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 CRISPR 효소의 REC 도메인 전체 또는 일부 일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 CRISPR 효소의 제1 기능 또는 제2 기능을 수행하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
상기 제 2 영역은 gRNA와 상호작용하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
상기 제 2 영역은 표적서열과 상호작용하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
상기 제 2 영역은 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)과 상호작용하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
상기 제 2 영역은 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
이때, 상기 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM과 먼 말단 부위(PAM distal end)는 PAM 위치에서 멀리 위치한 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 말단의 6 내지 10개의 염기쌍, 즉, gRNA의 6 내지 10개 염기서열과 이와 상보적인 결합을 하는 표적서열의 6 내지 10개 염기서열을 의미할 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 CRISPR 효소의 NUC 로브(lobe)에 위치한 영역일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 CRISPR 효소의 NUC 로브(lobe)의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)를 포함하는 영역일 수 있다.
이때, 상기 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)는 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM(Protospacer adjacent motif)과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용하는 영역일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 CRISPR 효소의 RuvC 도메인 전체 또는 일부일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 CRISPR 효소의 RuvC 도메인의 메탈 의존적 핵산 절단 부위(metal dependent nucleic acid cleaving region)를 포함하는 RuvC 도메인 일부 일 수 있다.
이때, 상기 RuvC 도메인의 메탈 의존적 핵산 절단 부위는 RuvC 도메인에서 메탈과 상호작용에 의해 표적 위치의 핵산간의 결합을 절단할 수 있는 영역을 의미할 수 있다.
상기 메탈 의존적 핵산 절단 부위는 메탈과 상호작용하는 부분과 표적 위치의 핵산간의 결합을 절단하는 부분으로 구성될 수 있다.
상기 제 3 영역은 야생형 CRISPR 효소의 제1 기능 또는 제2 기능을 수행하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
상기 제 3 영역은 gRNA와 상호작용하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
상기 제 3 영역은 표적서열과 상호작용하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
상기 제 3 영역은 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)과 상호작용하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
상기 제 3 영역은 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
이때, 상기 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM과 먼 말단 부위(PAM distal end)는 PAM 위치에서 멀리 위치한 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 말단의 6 내지 10개의 염기쌍, 즉, gRNA의 6 내지 10개 염기서열과 이와 상보적인 결합을 하는 표적서열의 6 내지 10개 염기서열을 의미할 수 있다.
상기 제 3 영역은 야생형 CRISPR 효소의 NUC 로브(lobe)에 위치한 영역일 수 있다.
상기 제 3 영역은 야생형 CRISPR 효소의 HNH 도메인 전체 또는 일부일 수 있다.
상기 제 3 영역은 야생형 CRISPR 효소의 HNH 도메인의 메탈 의존적 핵산 절단 부위(metal dependent nucleic acid cleaving region)를 포함하는 HNH 도메인 일부 일 수 있다.
이때, 상기 HNH 도메인의 메탈 의존적 핵산 절단 부위는 HNH 도메인에서 메탈과 상호작용에 의해 표적 위치의 핵산간의 결합을 절단할 수 있는 영역을 의미할 수 있다.
상기 제 4 영역은 표적 유전자 또는 핵산 내의 특정 뉴클레오타이드서열, 즉, PAM(Protospacer adjacent motif)을 인식할 수 있는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
상기 제 4 영역은 표적 유전자 또는 핵산 내의 특정 뉴클레오타이드서열, 즉, PAM(Protospacer adjacent motif)과 상호작용하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
상기 제 4 영역은 gRNA의 일부 뉴클레오타이드 서열과 상호작용하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
상기 제 4 영역은 야생형 CRISPR 효소의 NUC 로브(lobe)에 위치한 영역일 수 있다.
상기 제 4 영역은 야생형 CRISPR 효소의 PI 도메인 전체 또는 일부 일 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 선택된 하나 이상의 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 CRISPR 효소 변이체일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역 및 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 1 영역 및 제 2 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 1 영역 및 제 3 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 1 영역 및 제 4 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 2 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 2 영역 및 제 3 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 2 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 2 영역 및 제 4 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 3 영역 및 제 4 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역, 제 2 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 1 영역, 제 2 영역 및 제 3 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역, 제 2 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 1 영역, 제 2 영역 및 제 4 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 1 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 넷 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 상기 하나 이상의 영역에서 선택된 적어도 하나 이상의 아미노산의 변형을 포함할 수 있다.
이때, 상기 변형은 상기 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
이때, 상기 변형은 상기 선택된 하나 이상의 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
일 예로, 상기 다른 아미노산은 상기 선택된 아미노산의 입체 이성질체일 수 있다.
예를 들면, 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역 내에 위치한 L-글루타민을 D-글루타민으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 다른 아미노산은 상기 선택된 아미노산의 소수성 지표(hydropathy index)보다 작은 소수성 지표를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 2 영역 내에 위치한 페닐알라닌(소수성 지표: 2.8)을 소수정 지표가 더 작은 글리신(소수성 지표: -0.4)으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 예로, 상기 다른 아미노산은 상기 선택된 아미노산의 소수성 지표(hydropathy index)보다 큰 소수성 지표를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역 내에 위치한 세린(소수성 지표: -0.8)을 소수정 지표가 더 큰 류신(소수성 지표: 3.8)으로 치환시키는 것일 수 있다.
일 예로, 상기 다른 아미노산은 상기 선택된 아미노산의 기능기(functional group)보다 크기가 작은 기능기를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 3 영역 내에 위치한 발린을 발린의 기능기보다 작은 기능기를 가지는 알라닌으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 다른 아미노산은 상기 선택된 아미노산의 기능기(functional group)보다 크기가 큰 기능기를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 2 영역 내에 위치한 글리신을 글리신의 기능기보다 큰 기능기를 가지는 히스티딘으로 치환시키는 것일 수 있다.
일 예로, 상기 다른 아미노산은 상기 선택된 아미노산의 소수성(hydrophobicity)보다 소수성이 증가된 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역 내에 위치한 아스파라긴(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5)을 트레오닌(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -0.7)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 다른 아미노산은 상기 선택된 아미노산의 소수성(hydrophobicity)보다 소수성이 감소된 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 4 영역 내에 위치한 시스테인(Kyte-Doolittle hydrophobicity: 2.5)을 프롤린(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -1.6)으로 치환시키는 것일 수 있다.
일 예로, 상기 다른 아미노산은 상기 선택된 아미노산보다 크기가 큰 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 3 영역 내에 위치한 라이신(분자량: 146.189)을 트립토판(분자량: 204.228)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 다른 아미노산은 상기 선택된 아미노산보다 크기가 작은 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 2 영역 내에 위치한 페닐알라닌(분자량: 165.192)을 글루탐산(분자량: 147.131)으로 치환시키는 것일 수 있다.
일 예로, 상기 다른 아미노산은 상기 선택된 아미노산과 다른 전하를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 2 영역 내에 위치한 글루탐산(음전하)을 류신(중성전하)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 다른 아미노산은 상기 선택된 아미노산과 다른 분류(class)의 기능기를 가지는 아미노산일 수 있다. 이때, 상기 분류는 지방족(aliphatic), 방향족(aromatic), 비고리형(acyclic), 고리형(cyclic), 황 함유형(sulfur-containing) 및 수산기 함유형(hydroxyl-containing) 중 선택된 하나일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 3 영역 내에 위치한 페닐알라닌(방향족)을 발린(지방족)으로 치환시키는 것일 수 있다.
상기 변형은 상기 선택된 하나 이상의 아미노산이 동일한 개수의 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역 내에 위치한 하나의 알라닌을 하나의 글리신으로 치환시키는 것일 수 있다. 또는 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역 내에 위치한 하나의 아르기닌과 제 4 영역 내에 위치한 하나의 히스티딘을 하나의 류신(제 1 영역)과 하나의 세린(제 4 영역)으로 각각 치환시키는 것일 수 있다. 또는 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 2 영역 내에 위치한 하나의 아르기닌과 하나의 발린 및 제 3 영역 내에 위치한 하나의 류신을 각각 하나의 페닐알라닌, 즉 총 세 개의 페닐알라닌으로 치환시키는 것일 수 있다.
상기 변형은 상기 선택된 하나 이상의 아미노산이 동일하지 않은 개수의 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 2 영역 내에 위치한 하나의 류신을 시스테인-알라닌-알라닌, 즉, 총 세 개의 아미노산들로 치환시키는 것일 수 있다. 또는 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역 내에 위치한 하나의 히스티딘과 제 3 영역에 위치한 연속된 두 개의 아미노산인 알라닌-글루타민을 각각 메티오닌-발린(제 1 영역) 및 프롤린(제 3 영역)으로 치환시키는 것일 수 있다. 또는 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역 내에 위치한 하나의 글루탐산, 제 2 영역 내에 위치한 연속된 세 개의 아미노산인 알라닌-류신-히스티딘 및 제 3 영역 내에 위치한 연속된 두 개의 아미노산인 트립토판-세린을 각각 알라닌(제 1 영역), 메티오닌-프롤린(제 2 영역) 및 시스테인-알라닌-트레오닌-발린(제 3 영역)으로 치환시키는 것일 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 선택된 하나 이상의 영역 내에 적어도 하나 이상의 아미노산을 부가시킨 CRISPR 효소 변이체일 수 있다.
이때, 상기 부가는 상기 선택된 하나 이상의 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 하나 이상의 아미노산의 부가일 수 있다.
일 예로, 상기 부가는 상기 선택된 하나 이상의 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 하나 이상의 양전하를 가지는 아미노산의 부가일 수 있다.
예를 들어, 상기 부가는 제 1 영역 내에 위치한 선택된 하나의 알라닌의 C-말단에 하나의 아르기닌을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 제 3 영역 내에 위치한 선택된 글루탐산의 N-말단에 두 개의 아미노산들인 히스티딘-라이신을 부가시킨 것일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 부가는 상기 선택된 하나 이상의 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 하나 이상의 음전하를 가지는 아미노산의 부가일 수 있다.
예를 들어, 상기 부가는 제 2 영역 내에 위치한 선택된 하나의 트레오닌의 N-말단에 하나의 아스파르트산을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 제 4 영역 내에 위치한 선택된 히스티딘의 C-말단에 세 개의 아미노산들인 글루탐산-아스파르트산-글루탐산을 부가시킨 것일 수 있다.
또 다른 일 예로, 상기 부가는 상기 선택된 하나 이상의 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 하나 이상의 전하를 가지지 않는 아미노산의 부가일 수 있다.
예를 들어, 상기 부가는 제 2 영역 내에 위치한 선택된 하나의 시스테인의 C-말단에 두 개의 아미노산들인 세린-발린을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 제 3 영역 내에 위치한 선택된 라이신의 N-말단에 다섯 개의 아미노산들인 글리신-프롤린-글루타민-페닐알라닌-류신을 부가시킨 것일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 부가는 상기 선택된 하나 이상의 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 양전하를 가지는 아미노산들, 음전하를 가지는 아미노산들 및 전하를 가지지 않는 아미노산들 중 선택된 하나 이상의 아미노산의 부가일 수 있다.
예를 들어, 상기 부가는 제 1 영역 내에 위치한 선택된 하나의 아르기닌의 C-말단에 여섯 개의 아미노산들인 히스티딘-아르기닌-글리신-세린-알라닌-글루탐산을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 제 4 영역 내에 위치한 선택된 하나의 글리신의 N-말단에 열 개의 아미노산들인 라이신-라이신-알라닌-페닐알라닌-글루타민-트레오닌-메티오닌-시스테인-아스파르트산-세린을 부가시킨 것일 수 있다.
상기 부가는 상기 선택된 하나 이상의 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 하나 이상의 기능적(functional) 도메인의 부가일 수 있다.
이때, 상기 기능적 도메인은 야생형 CRISPR 효소의 원래 기능, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 제2 기능 이외에 부가적인 기능을 가지는 도메인일 수 있다.
또는 상기 기능적 도메인은 야생형 CRISPR 효소의 원래 기능, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및/또는 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 제2 기능과 유사한 기능을 가지는 도메인일 수 있다.
일 예로, 상기 기능적 도메인은 메틸라아제(methylase) 활성, 디메틸라아제(demethylase) 활성, 전사촉진(transcription activation) 활성, 전사 저해(transcription repression) 활성, 전사 방출 인자(transcription release factor) 활성, 히스톤 변형(histone modification) 활성, RNA 절단(cleavage) 활성 또는 핵산 결합(nucleic acid binding) 활성을 가지는 도메인일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 기능적 도메인은 단백질(펩타이드 포함)의 분리정제를 위한 태그(tag) 또는 리포터 유전자일 수 있다. 이때, 상기 태그는 히스티딘(His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그 및 티오레독신(Trx) 태그 등을 포함하며, 상기 리포터 유전자는 글루타티온-S-트랜스 퍼라제(GST), 호스라디시(horseradish) 과산화효소(HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질(GFP), HcRed, DsRed, 청록색 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP) 및 청색 형광 단백질(BFP)을 포함하는 자가형광 단백질을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.
또 다른 일 예로, 상기 기능적 도메인은 디아미네이즈(deaminase)일 수 있다. 이때, 상기 디아미네이즈는 아데닌 디아미네이즈(adenine deaminase) 및/또는 시티딘 디아미네이즈(cytidine deaminase)일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 기능적 도메인은 NLS(nuclear localization sequence or signal) 또는 NES(nuclear export sequence or signal)일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 구현예에서, 상기 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 인위적으로 조작된 Cas9일 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 Cas9은 야생형 Cas9의 특정 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 Cas9 변이체일 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 Cas9은 야생형 Cas9의 특정 영역 내에 적어도 하나 이상의 아미노산을 부가시킨 Cas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 야생형 Cas9의 특정 영역은 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 선택된 하나 이상의 영역일 수 있다.
상기 제 1 영역은 gRNA와 상호작용하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
상기 제 1 영역은 표적서열과 상호작용하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
상기 제 1 영역은 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)과 상호작용하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
상기 제 1 영역은 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
이때, 상기 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM과 먼 말단 부위(PAM distal end)는 PAM 위치에서 멀리 위치한 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 말단의 6 내지 10개의 염기쌍, 즉, gRNA의 6 내지 10개 염기서열과 이와 상보적인 결합을 하는 표적서열의 6 내지 10개 염기서열을 의미할 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 Cas9의 REC 로브(lobe)에 위치한 영역일 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 Cas9의 REC 도메인 전체 또는 일부 일 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 Cas9의 REC 도메인의 C 말단의 300개의 아미노산으로 이루어진 영역일 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 Cas9의 REC 도메인의 N 말단의 220개의 아미노산으로 이루어진 영역일 수 있다.
일 예로, 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9(서열번호 17)의 경우,
상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 94번째 아스파르트산(D94)부터 717번째 글리신(G717)까지의 아미노산 서열 전체 또는 일부일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 196번째 페닐알라닌(F196)부터 282번째 아이소류신(I282)까지의 아미노산 서열(제 1-1 영역, 서열번호 18)일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 316번째 프롤린(P316)부터 394번째 아스파라긴(N394)까지의 아미노산 서열(제 1-2 영역, 서열번호 19)일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 510번째 라이신(K510)부터 612번째 아스파라긴(N612)까지의 아미노산 서열(제 1-3 영역, 서열번호 20)일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 678번째 트레오닌(T678)부터 698번째 히스티딘(H698)까지의 아미노산 서열(제 1-4 영역, 서열번호 21)일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 196번째 페닐알라닌(F196)부터 282번째 아이소류신(I282)까지의 아미노산 서열(제 1-1 영역), 316번째 프롤린(P316)부터 394번째 아스파라긴(N394)까지의 아미노산 서열(제 1-2 영역), 510번째 라이신(K510)부터 612번째 아스파라긴(N612)까지의 아미노산 서열(제 1-3 영역) 및 678번째 트레오닌(T678)부터 698번째 히스티딘(H698)까지의 아미노산 서열(제 1-4 영역) 중 선택된 두 개의 영역일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 196번째 페닐알라닌(F196)부터 282번째 아이소류신(I282)까지의 아미노산 서열(제 1-1 영역), 316번째 프롤린(P316)부터 394번째 아스파라긴(N394)까지의 아미노산 서열(제 1-2 영역), 510번째 라이신(K510)부터 612번째 아스파라긴(N612)까지의 아미노산 서열(제 1-3 영역) 및 678번째 트레오닌(T678)부터 698번째 히스티딘(H698)까지의 아미노산 서열(제 1-4 영역) 중 선택된 세 개의 영역일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 196번째 페닐알라닌(F196)부터 282번째 아이소류신(I282)까지의 아미노산 서열(제 1-1 영역), 316번째 프롤린(P316)부터 394번째 아스파라긴(N394)까지의 아미노산 서열(제 1-2 영역), 510번째 라이신(K510)부터 612번째 아스파라긴(N612)까지의 아미노산 서열(제 1-3 영역) 및 678번째 트레오닌(T678)부터 698번째 히스티딘(H698)까지의 아미노산 서열(제 1-4 영역)일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 야생형 Cas9이 야생형 SaCas9의 경우,
상기 제 1 영역은 야생형 SaCas9의 75번째 아스파라긴(N75)부터 426번째 라이신(K426)까지의 아미노산 서열 전체 또는 일부일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 1 영역은 야생형 SaCas9의 207번째 트레오닌(T207)부터 426번째 라이신(K426)까지의 아미노산 서열일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 Cas9의 제1 기능 또는 제2 기능을 수행하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
상기 제 2 영역은 gRNA와 상호작용하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
상기 제 2 영역은 표적서열과 상호작용하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
상기 제 2 영역은 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)과 상호작용하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
상기 제 2 영역은 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
이때, 상기 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM과 먼 말단 부위(PAM distal end)는 PAM 위치에서 멀리 위치한 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 말단의 6 내지 10개의 염기쌍, 즉, gRNA의 6 내지 10개 염기서열과 이와 상보적인 결합을 하는 표적서열의 6 내지 10개 염기서열을 의미할 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 Cas9의 NUC 로브(lobe)에 위치한 영역일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 Cas9의 NUC 로브(lobe)의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)를 포함하는 영역일 수 있다.
이때, 상기 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)는 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM(Protospacer adjacent motif)과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용하는 영역일 수 있다.
예를 들어, 야생형 SpCas9의 경우, 상기 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)는 야생형 SpCas9의 1001번째 타이로신(Y1001)부터 1030번째 글리신(G1030)까지의 영역일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 Cas9의 RuvC 도메인 전체 또는 일부일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 Cas9의 RuvC 도메인의 메탈 의존적 핵산 절단 부위(metal dependent nucleic acid cleaving region)를 포함하는 RuvC 도메인 일부 일 수 있다.
이때, 상기 RuvC 도메인의 메탈 의존적 핵산 절단 부위는 RuvC 도메인에서 메탈과 상호작용에 의해 표적 위치의 핵산간의 결합을 절단할 수 있는 영역을 의미할 수 있다.
상기 메탈 의존적 핵산 절단 부위는 메탈과 상호작용하는 부분과 표적 위치의 핵산간의 결합을 절단하는 부분으로 구성될 수 있다.
일 예로, 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 59번째 알라닌(A59)까지의 아미노산 서열(RuvC I 영역)의 전체 또는 일부일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 718번째 아스파르트산(D718)부터 774번째 글루타민(Q774)까지의 아미노산 서열(RuvC II 영역)의 전체 또는 일부일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 909번째 세린(S909)부터 1098번째 트레오닌(T1098)까지의 아미노산 서열(RuvC III 영역)의 전체 또는 일부일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 RuvC I 영역, RuvC II 영역 및/또는 RuvC III 영역 일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역, 서열번호 22)일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역, 서열번호 23)일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 926번째 글루타민(Q926)부터 1000번째 라이신(K1000)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역, 서열번호 24)일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1001번째 타이로신(Y1001)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-4 영역, 서열번호 25)일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역) 및 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역)일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역) 및 926번째 글루타민(Q926)부터 1000번째 라이신(K1000)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역)일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역) 및 1001번째 타이로신(Y1001)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-4 영역)일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역) 및 926번째 글루타민(Q926)부터 1000번째 라이신(K1000)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역)일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역) 및 1001번째 타이로신(Y1001)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-4 영역)일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 926번째 글루타민(Q926)부터 1000번째 라이신(K1000)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역) 및 1001번째 타이로신(Y1001)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-4 영역)일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역), 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역) 및 926번째 글루타민(Q926)부터 1000번째 라이신(K1000)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역)일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역), 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역) 및 1001번째 타이로신(Y1001)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-4 영역)일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역), 926번째 글루타민(Q926)부터 1000번째 라이신(K1000)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역) 및 1001번째 타이로신(Y1001)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-4 영역)일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역), 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역), 926번째 글루타민(Q926)부터 1000번째 라이신(K1000)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역) 및 1001번째 타이로신(Y1001)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-4 영역)일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 야생형 Cas9이 야생형 SaCas9의 경우,
상기 제 2 영역은 야생형 SaCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 41번째 발린(V41)까지의 아미노산 서열(RuvC I 영역)의 전체 또는 일부일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SaCas9의 436번째 아이소류신(I436)부터 481번째 글루탐산(E481)까지의 아미노산 서열(RuvC II 영역)의 전체 또는 일부일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SaCas9의 651번째 타이로신(Y651)부터 775번째 발린(V775)까지의 아미노산 서열(RuvC III 영역)의 전체 또는 일부일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SaCas9의 RuvC I 영역, RuvC II 영역 및/또는 RuvC III 영역 일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SaCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 25번째 트레오닌(T25)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역)일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SaCas9의 471번째 프롤린(P471)부터 481번째 글루탐산(E481)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역)일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SaCas9의 667번째 아스파라긴(N667)부터 740번째 세린(S740)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역)일 수 있다.
상기 제 3 영역은 야생형 Cas9의 제1 기능 또는 제2 기능을 수행하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
상기 제 3 영역은 gRNA와 상호작용하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
상기 제 3 영역은 표적서열과 상호작용하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
상기 제 3 영역은 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)과 상호작용하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
상기 제 3 영역은 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
이때, 상기 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM과 먼 말단 부위(PAM distal end)는 PAM 위치에서 멀리 위치한 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 말단의 6 내지 10개의 염기쌍, 즉, gRNA의 6 내지 10개 염기서열과 이와 상보적인 결합을 하는 표적서열의 6 내지 10개 염기서열을 의미할 수 있다.
상기 제 3 영역은 야생형 Cas9의 NUC 로브(lobe)에 위치한 영역일 수 있다.
상기 제 3 영역은 야생형 Cas9의 HNH 도메인 전체 또는 일부일 수 있다.
상기 제 3 영역은 야생형 Cas9의 HNH 도메인의 메탈 의존적 핵산 절단 부위(metal dependent nucleic acid cleaving region)를 포함하는 HNH 도메인 일부 일 수 있다.
이때, 상기 HNH 도메인의 메탈 의존적 핵산 절단 부위는 HNH 도메인에서 메탈과 상호작용에 의해 표적 위치의 핵산간의 결합을 절단할 수 있는 영역을 의미할 수 있다.
일 예로, 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 제 3 영역은 야생형 SpCas9의 775번째 라이신(K775)부터 908번째 류신(L908)까지의 아미노산 서열의 전체 또는 일부일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 3 영역은 야생형 SpCas9의 775번째 라이신(K775)부터 900번째 류신(L900)까지의 아미노산 서열(제 3-1 영역, 서열번호 26)일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 야생형 Cas9이 야생형 SaCas9의 경우,
상기 제 3 영역은 야생형 SaCas9의 521번째 아이소류신(I521)부터 629번째 글루탐산(E629)까지의 아미노산 서열의 전체 또는 일부일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 3 영역은 야생형 SaCas9의 523번째 라이신(K523)부터 627번째 류신(L627)까지의 아미노산 서열(제 3-1 영역)일 수 있다.
상기 제 4 영역은 표적 유전자 또는 핵산 내의 특정 뉴클레오타이드서열, 즉, PAM(Protospacer adjacent motif)을 인식할 수 있는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
상기 제 4 영역은 표적 유전자 또는 핵산 내의 특정 뉴클레오타이드서열, 즉, PAM(Protospacer adjacent motif)과 상호작용하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
상기 제 4 영역은 gRNA의 일부 뉴클레오타이드 서열과 상호작용하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
상기 제 4 영역은 야생형 Cas9의 NUC 로브(lobe)에 위치한 영역일 수 있다.
상기 제 4 영역은 야생형 Cas9의 PI 도메인 전체 또는 일부 일 수 있다.
일 예로, 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 제 4 영역은 야생형 SpCas9의 1099번째 글루탐산(E1099)부터 1368번째 아스파르트산(D1368)까지의 아미노산 서열의 전체 또는 일부일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 4 영역은 야생형 SpCas9의 1099번째 글루탐산(E1099)부터 1139번째 발린(V1139)까지의 아미노산 서열(제 4-1 영역, 서열번호 27)일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 야생형 Cas9이 야생형 SaCas9의 경우,
상기 제 4 영역은 야생형 SaCas9의 910번째 라이신(K910)부터 1053번째 글리신(G1053)까지의 아미노산 서열의 전체 또는 일부일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 4 영역은 야생형 SaCas9의 910번째 라이신(K910)부터 970번째 아스파르트산(D970)까지의 아미노산 서열(제 4-1 영역)일 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 Cas9은 야생형 Cas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 선택된 하나 이상의 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 Cas9 변이체일 수 있다.
상기 Cas9 변이체는 야생형 Cas9의 제 1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 지방족(aliphatic) 또는 아마이드(amide) 계열의 기능기를 가지는 아미노산들, 즉, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281 및 I282 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391 및 L393로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588 및 I601으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606 및 L607로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 중 N692, M694, Q695 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 선택된 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역 내에 위치할 수 있다. 또는 선택된 둘 이상의 아미노산은 같은 영역 내에 위치할 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 중 A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 중 K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 선택된 셋 이상의 아미노산은 각각 다른 영역 내에 위치할 수 있다. 또는 선택된 셋 이상의 아미노산은 같은 영역 내에 위치할 수 있다. 또는 선택된 셋 이상의 아미노산은 각각 같거나 다른 영역 내에 위치할 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 중 A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 중 A203, N277, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 중 G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 Cas9 변이체는 야생형 Cas9의 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11 및 G12로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20 및 I21로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 I761, E762, M763, R765, E766 및 N767로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763 및 A764로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 중 D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987 및 Y988로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997 및 I998로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-4 영역 중 Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-4 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 2-2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 선택된 둘 이상의 아미노산은 각각 제 2-1 영역 및 제 2-2 영역 내에 위치할 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 2-2 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766 및 N767로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 2-2 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763 및 A764로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 선택된 둘 이상의 아미노산은 각각 제 2-1 영역 및 제 2-3 영역 내에 위치할 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 2-3 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987 및 Y988로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 2-3 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997 및 I998로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 선택된 둘 이상의 아미노산은 각각 제 2-1 영역 및 제 2-4 영역 내에 위치할 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 2-4 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 2-4 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 및 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 선택된 둘 이상의 아미노산은 각각 제 2-2 영역 및 제 2-3 영역 내에 위치할 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 및 제 2-3 영역 중 I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987 및 Y988로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 및 제 2-3 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997 및 I998로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 및 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 선택된 둘 이상의 아미노산은 각각 제 2-2 영역 및 제 2-4 영역 내에 위치할 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 및 제 2-4 영역 중 I761, E762, M763, R765, E766, N767, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 및 제 2-4 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 선택된 둘 이상의 아미노산은 각각 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역 내에 위치할 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역 중 D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 선택된 셋 이상의 아미노산은 각각 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및 제 2-3 영역 내에 위치할 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및 제 2-3 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987 및 Y988로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및 제 2-3 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997 및 I998로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 선택된 셋 이상의 아미노산은 각각 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및 제 2-4 영역 내에 위치할 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및 제 2-4 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및 제 2-4 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 선택된 셋 이상의 아미노산은 각각 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역 내에 위치할 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역 중 I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 선택된 셋 이상의 아미노산은 각각 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역 내에 위치할 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 Cas9 변이체는 야생형 Cas9의 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 및 L891로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 전하(charge)를 가지는 아미노산들, 즉, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 Cas9 변이체는 야생형 Cas9의 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 Cas9 변이체는 야생형 Cas9의 제 1 영역 및 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 1 영역 및 제 2 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 1 영역 및 제 2 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 및 제 2-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 및 제 2-1 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281 및 I282로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 및 제 2-2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 및 제 2-2 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, I761, E762, M763, R765, E766 및 N767로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 및 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1영역 및 제 2-3 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987 및 Y988로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 및 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1영역 및 제 2-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 및 제 2-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 및 제 2-1 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391 및 L393로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 및 제 2-1 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391 및 L393로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 및 제 2-2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 및 제 2-2 영역 중 P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, I761, E762, M763, R765, E766 및 N767로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 및 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2영역 및 제 2-3 영역 중 P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987 및 Y988로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 및 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2영역 및 제 2-4 영역 중 P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 2-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 2-1 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588 및 I601로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 2-1 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606 및 L607로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 2-2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 2-2 영역 중 K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, I761, E762, M763, R765, E766 및 N767로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 2-2 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763 및 A764으로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 2-3 영역 중 K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987 및 Y988로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 2-3 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997 및 I998로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 2-4 영역 중 K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 2-4 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 2-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 2-1 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, N692, M694, Q695 및 H698로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 2-1 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 2-2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 2-2 영역 중 N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766 및 N767로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 2-2 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763 및 A764으로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 2-3 영역 중 N692, M694, Q695, H698, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987 및 Y988로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 2-3 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997 및 I998로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 2-4 영역 중 N692, M694, Q695, H698, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 2-4 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
이때, 상기 제 1 영역은 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 2 영역은 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 2 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 2 영역 중 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 Cas9 변이체는 야생형 Cas9의 제 1 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 1 영역 및 제 3 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 1 영역 및 제 3 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 및 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 및 제 3-1 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 및 L891로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 및 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391 및 L393; 및 제 3-1 영역 중 전하를 가지는 아미노산들, 즉, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 3-1 영역 중 K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 및 L891로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606 및 L607; 및 제 3-1 영역 중 전하를 가지는 아미노산들, 즉, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 3-1 영역 중 N692, M694, Q695, H698, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 및 L891로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697; 및 제 3-1 영역 중 전하를 가지는 아미노산들, 즉, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
이때, 상기 제 1 영역은 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 3 영역은 제 3-1 영역일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 3 영역 중 A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 및 L891로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 3 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 Cas9 변이체는 야생형 Cas9의 제 1 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 1 영역 및 제 4 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 1 영역 및 제 4 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 및 제 3-1 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 및 제 4-1 영역 중 P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 4-1 영역 중 K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606 및 L607; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 4-1 영역 중 N692, M694, Q695, H698, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
이때, 상기 제 1 영역은 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 4 영역은 제 4-1 영역일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 4 영역 중 A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 Cas9 변이체는 야생형 Cas9의 제 2 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 2 영역 및 제 3 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 2 영역 및 제 3 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 3-1 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 및 L891로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20 및 I21; 및 제 3-1 영역 중 전하를 가지는 아미노산들, 즉, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 및 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 및 제 3-1 영역 중 I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 및 L891로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763 및 A764; 및 제 3-1 영역 중 전하를 가지는 아미노산들, 즉, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 및 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 및 제 3-1 영역 중 V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987 및 Y988로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997 및 I998; 및 제 3-1 영역 중 전하를 가지는 아미노산들, 즉, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-4 영역 및 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-4 영역 및 제 3-1 영역 중 V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-4 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038; 및 제 3-1 영역 중 전하를 가지는 아미노산들, 즉, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
이때, 상기 제 2 영역은 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 3 영역은 제 3-1 영역일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2 영역 및 제 3 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, Y981, H982, H983, A984, H985, D965, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2 영역 및 제 3 영역 중 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 Cas9 변이체는 야생형 Cas9의 제 2 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 2 영역 및 제 4 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 2 영역 및 제 4 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 4-1 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20 및 I21; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 및 제 4-1 영역 중 I761, E762, M763, R765, E766, N767, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763 및 A764; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 및 제 4-1 영역 중 D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997 및 I998; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-4 영역 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-4 영역 및 제 4-1 영역 중 Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-4 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
이때, 상기 제 2 영역은 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 4 영역은 제 4-1 영역일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2 영역 및 제 4 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2 영역 및 제 4 영역 중 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1038, Y1039, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 Cas9 변이체는 야생형 Cas9의 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 3 영역 및 제 4 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 3 영역 및 제 4 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 및 제 4-1 영역 중 V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 전하를 가지는 아미노산들, 즉, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 Cas9 변이체는 야생형 Cas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 셋 이상의 아미노산은 적어도 둘 이상의 영역에 존재할 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 셋 이상의 아미노산은 적어도 둘 이상의 영역에 존재할 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
이때, 상기 제 1 영역은 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 2 영역은 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 3 영역은 제 3-1 영역일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역 및 제 3 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역 및 제 3 영역 중 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
이때, 상기 제 1 영역은 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 2 영역은 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 4 영역은 제 4-1 영역일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역 및 제 4 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 및 D1127로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역 및 제 4 영역 중 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037, F1038, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
이때, 상기 제 1 영역은 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 3 영역은 제 3-1 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 4 영역은 제 4-1 영역일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, T1102 및 D1127로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
이때, 상기 제 2 영역은 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 3 영역은 제 3-1 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 4 영역은 제 4-1 영역일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 및 D1127로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037, F1038, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 넷 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 넷 이상의 아미노산은 적어도 둘 이상의 영역에 존재할 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 넷 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
이때, 상기 제 1 영역은 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 2 영역은 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 3 영역은 제 3-1 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 4 영역은 제 4-1 영역일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 및 D1127로 구성된 군에서 선택된 넷 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037, F1038, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 넷 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 Cas9 변이체는 상기 하나 이상의 영역에서 선택된 적어도 하나 이상의 아미노산의 변형을 포함할 수 있다.
이때, 상기 변형은 상기 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역, 제 1-4 영역 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역, 제 2-4 영역, 제 3-1 영역 및/또는 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
이때, 상기 변형은 상기 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
일 예로, 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 입체 이성질체로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 입체 이성질체로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 야생형 SpCas9의 510번째 라이신(K510)이 L-라이신인 경우, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 510번째 라이신(K510)을 D-라이신으로 치환시키는 것일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 539번째 페닐알라닌(F539, 소수성 지표: 2.8)을 상대적으로 소수성 지표가 더 작은 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환시키는 것일 수 있다. 또는 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 601번째 아이소류신(I601, 소수성 지표: 4.5)을 상대적으로 소수성 지표가 더 작은 아스파라긴(소수성 지표: -3.5)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 277번째 아스파라긴(N277, 소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 더 큰 히스티딘(소수성 지표: -3.2)으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 크거나 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 작은 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 작은 기능기를 가지는 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 539번째 페닐알라닌(F539)을 상대적으로 크기가 작은 기능기를 가지는 세린으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 203번째 알라닌(A203)을 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 아스파르트산으로 치환시키는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 366번째 글리신(G366)을 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 세린으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 크거나 작은 기능기를 가지는 아미노산일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성(hydrophobicity)이 감소된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 감소된 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 539번째 페닐알라닌(F539, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 2.8) 및 601번째 아이소류신(I601, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 4.5)을 각각 상대적으로 소수성이 더 감소된 세린(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -0.8) 및 아스파라긴(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 277번째 아스파라긴(N277, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5) 및 682번째 페닐알라닌(F682, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 2.8)을 각각 상대적으로 소수성이 증가된 히스티딘(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.2) 및 발린(Kyte-Doolittle hydrophobicity: 4.2)으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 감소하거나 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 입체 이성질체로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 입체 이성질체로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 야생형 SpCas9의 12번째 글리신(G12)이 L-글리신인 경우, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 12번째 글리신(G12)을 D-글리신으로 치환시키는 것일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 1038번째 페닐알라닌(F1038, 소수성 지표: 2.8)을 상대적으로 소수성 지표가 더 작은 타이로신(소수성 지표: -1.3)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 763번째 메티오닌(M763, 소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 더 큰 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시키는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 965번째 아스파르트산(D965, 소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 더 큰 타이로신(소수성 지표: -1.3)으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 크거나 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 작은 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 작은 기능기를 가지는 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 763번째 메티오닌(M763)을 상대적으로 크기가 작은 기능기를 가지는 아이소류신으로 치환시키는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 1007번째 글루탐산(E1007)을 상대적으로 크기가 작은 기능기를 가지는 류신으로 치환시키는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 763번째 메티오닌(M763) 및 1007번째 글루탐산(E1007)을 상대적으로 크기가 작은 기능기를 가지는 아이소류신 및 류신으로 각각 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 큰 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 1038번째 페닐알라닌(F1038)을 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 타이로신으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 크거나 작은 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 감소된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 감소된 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 761번째 아이소류신(I761, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 4.5) 및 1038번째 페닐알라닌(F1038, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 2.8)을 각각 상대적으로 소수성이 감소된 메티오닌(Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.9) 및 타이로신(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -1.3)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 763번째 메티오닌(M763, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.9) 및 932번째 알라닌(A932, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.8)을 각각 상대적으로 소수성이 증가된 아이소류신(Kyte-Doolittle hydrophobicity: 4.5) 및 시스테인(Kyte-Doolittle hydrophobicity: 2.5)으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 감소되거나 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 입체 이성질체로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 및 L891로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 입체 이성질체로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 야생형 SpCas9의 853번째 아스파르트산(D853)이 L-아스파르트산인 경우, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 853번째 아스파르트산(D853)을 D-아스파르트산으로 치환시키는 것일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 및 L891로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 862번째 라이신(K862, 소수성 지표: -3.9)을 상대적으로 소수성 지표가 더 작은 아르기닌(소수성 지표: -4.5)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 및 L891로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 890번째 라이신(K890, 소수성 지표: -3.9)을 상대적으로 소수성 지표가 더 큰 아스파라긴(소수성 지표: -3.5)으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 크거나 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 작은 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 및 L891로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 작은 기능기를 가지는 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 890번째 라이신(K890)을 상대적으로 크기가 작은 기능기를 가지는 아스파라긴으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 큰 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 및 L891로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 863번째 아스파라긴(N863)을 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 아르기닌으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 크거나 작은 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 감소된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 감소된 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 779번째 글루탐산(E779, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5) 및 862번째 라이신(K862, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.9)을 각각 상대적으로 소수성이 감소된 라이신(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.9) 및 아르기닌(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -4.5)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 827번째 글루탐산(E827, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5) 및 890번째 라이신(K890, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.9)을 각각 상대적으로 소수성이 증가된 메티오닌(Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.9) 및 아스파라긴(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5)으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 감소되거나 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 입체 이성질체로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 입체 이성질체로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 야생형 SpCas9의 1127번째 아스파르트산(D1127)이 L-아스파르트산인 경우, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 1127번째 아스파르트산(D1127)을 D-아스파르트산으로 치환시키는 것일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 1102번째 트레오닌(T1102, 소수성 지표: -0.7)을 상대적으로 소수성 지표가 더 작은 프롤린(소수성 지표: -1.6)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 1106번째 세린(S1106, 소수성 지표: -0.8)을 상대적으로 소수성 지표가 더 큰 글리신(소수성 지표: -0.4)으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 크거나 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 작은 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 작은 기능기를 가지는 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 1102번째 트레오닌(T1102)을 상대적으로 크기가 작은 기능기를 가지는 프롤린으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 큰 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 1127번째 아스파르트산(D1127)을 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 글루탐산으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 크거나 작은 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 감소된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 감소된 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 1102번째 글루트레오닌(T1102, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -0.7)을 상대적으로 소수성이 감소된 프롤린(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -1.6)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 1108번째 글루탐산(E1108, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5)을 상대적으로 소수성이 증가된 메티오닌(Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.9)으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 감소되거나 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역, 제 1-4 영역 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역, 제 2-4 영역, 제 3-1 영역 및/또는 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각의 입체 이성질체로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 및 D1127로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각의 입체 이성질체로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 야생형 SpCas9의 8번째 글리신(G8)이 L-글리신이고 767번째 아스파라긴(N767)이 L-아스파라긴인 경우, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 8번째 글리신(G8) 및 767번째 아스파라긴(N767)을 각각 D-글리신 및 D-아스파라긴으로 치환시키는 것일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역, 제 1-4 영역 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역, 제 2-4 영역, 제 3-1 영역 및/또는 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 및 D1127로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 203번째 알라닌(A203, 소수성 지표: 1.8) 및 539번째 페닐알라닌(F539, 소수성 지표: 2.8)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 더 작은 아스파르트산(소수성 지표: -3.5) 및 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환시키는 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 601번째 아이소류신(I601, 소수성 지표: 4.5) 및 1102번째 트레오닌(T1102, 소수성 지표: -0.7)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 더 작은 아스파라긴(소수성 지표: -3.5) 및 프롤린(소수성 지표: -1.6)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역, 제 1-4 영역 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역, 제 2-4 영역, 제 3-1 영역 및/또는 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 및 D1127로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 840번째 히스티딘(H840, 소수성 지표: -3.2) 및 1007번째 글루탐산(E1007, 소수성 지표: -3.5)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 더 큰 알라닌(소수성 지표: 1.8) 및 류신(소수성 지표: 3.8)으로 치환시키는 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 763번째 메티오닌(M763, 소수성 지표: 1.9) 및 1007번째 글루탐산(E1007, 소수성 지표: -3.5)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 더 큰 아이소류신(소수성 지표: 4.5) 및 류신(소수성 지표: 3.8)으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역, 제 1-4 영역 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역, 제 2-4 영역, 제 3-1 영역 및/또는 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성 지표가 크거나 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 및 D1127로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성 지표가 크거나 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 10번째 아스파르트산(D10, 소수성 지표: -3.5) 및 840번째 히스티딘(H840, 소수성 지표: -3.2)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 더 큰 알라닌(소수성 지표: 1.8)으로 치환시키고, 또한 야생형 SpCas9의 539번째 페닐알라닌(F539, 소수성 지표: 2.8)을 상대적으로 소수성 지표가 더 작은 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환시키는 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성 지표가 크거나 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 763번째 메티오닌(M763, 소수성 지표: 1.9), 890번째 라이신(K890, 소수성 지표: -3.9) 및 1007번째 글루탐산(E1007, 소수성 지표: -3.5)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 더 큰 아이소류신(소수성 지표: 4.5), 아스파라긴(소수성 지표: -3.5) 및 류신(소수성 지표: 3.8)으로 치환시키고, 또한 야생형 SpCas9의 539번째 페닐알라닌(F539, 소수성 지표: 2.8)을 상대적으로 소수성 지표가 더 작은 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환시키는 것일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역, 제 1-4 영역 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역, 제 2-4 영역, 제 3-1 영역 및/또는 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 크기가 작은 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 및 D1127로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 크기가 작은 기능기를 가지는 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 539번째 페닐알라닌(F539), 763번째 메티오닌(M763), 890번째 라이신(K890) 및 1007번째 글루탐산(E1007)을 각각 상대적으로 크기가 작은 기능기를 가지는 세린, 아이소류신, 아스파라긴 및 류신으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역, 제 1-4 영역 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역, 제 2-4 영역, 제 3-1 영역 및/또는 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 크기가 큰 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 601번째 아이소류신(I601), 1038번째 페닐알라닌(F1038) 및 1127번째 아스파르트산(D1127)을 각각 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 아스파라긴, 타이로신 및 글루탐산으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역, 제 1-4 영역 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역, 제 2-4 영역, 제 3-1 영역 및/또는 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 크기가 크거나 작은 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 크기가 크거나 작은 기능기를 가지는 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 539번째 페닐알라닌(F539), 763번째 메티오닌(M763), 890번째 라이신(K890) 및 1007번째 글루탐산(E1007)을 각각 상대적으로 크기가 작은 기능기를 가지는 세린, 아이소류신, 아스파라긴 및 류신으로 치환시키고, 또한 601번째 아이소류신(I601) 및 1038번째 페닐알라닌(F1038)을 각각 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 아스파라긴 및 타이로신으로 치환시키는 것일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역, 제 1-4 영역 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역, 제 2-4 영역, 제 3-1 영역 및/또는 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성이 감소된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성이 감소된 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 539번째 페닐알라닌(F539, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 2.8), 601번째 아이소류신(I601, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 4.5) 및 1102번째 트레오닌(T1102, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -0.7)을 각각 상대적으로 소수성이 감소된 세린(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -0.8), 아스파라긴(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5) 및 프롤린(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -1.6)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역, 제 1-4 영역 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역, 제 2-4 영역, 제 3-1 영역 및/또는 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성이 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성이 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 10번째 아스파르트산(D10, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5), 763번째 메티오닌(M763, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.9), 840번째 히스티딘(H840, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.2) 및 890번째 라이신(K890, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.9)을 각각 상대적으로 소수성이 증가된 알라닌(Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.8), 아이소류신(Kyte-Doolittle hydrophobicity: 4.5), 알라닌(Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.8) 및 아스파라긴(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5)으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역, 제 1-4 영역 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역, 제 2-4 영역, 제 3-1 영역 및/또는 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성이 감소되거나 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성이 감소되거나 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 763번째 메티오닌(M763, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.9), 890번째 라이신(K890, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.9) 및 1007번째 글루탐산(E1007, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5)을 각각 상대적으로 소수성이 증가된 아이소류신(Kyte-Doolittle hydrophobicity: 4.5), 아스파라긴(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5) 및 류신(Kyte-Doolittle hydrophobicity: 3.8)으로 치환시키고, 또한 야생형 SpCas9의 539번째 페닐알라닌(F539, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 2.8)을 상대적으로 소수성이 감소된 세린(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -0.8)으로 치환시키는 것일 수 있다.
상기 변형은 상기 선택된 하나 이상의 아미노산이 동일한 개수의 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내에 위치한 하나의 아이소류신을 하나의 아스파라긴으로 치환시키는 것일 수 있다. 또는 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내에 위치한 하나의 페닐알라닌과 제 3 영역 내에 위치한 하나의 라이신을 하나의 세린(제 1 영역)과 하나의 아스파라긴(제 3 영역)으로 각각 치환시키는 것일 수 있다. 또는 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2 영역 내에 위치한 하나의 메티오닌과 하나의 글루탐산 및 제 3 영역 내에 위치한 하나의 라이신을 각각 하나의 아이소류신, 하나의 류신(제 2 영역) 및 하나의 아스파라긴(제 3 영역)으로 치환시키는 것일 수 있다.
상기 변형은 상기 선택된 하나 이상의 아미노산이 동일하지 않은 개수의 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2 영역 내에 위치한 하나의 트레오닌을 시스테인-알라닌-알라닌, 즉, 총 세 개의 아미노산들로 치환시키는 것일 수 있다. 또는 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내에 위치한 하나의 글루타민과 제 3 영역에 위치한 연속된 두 개의 아미노산인 글리신-세린을 각각 메티오닌-발린(제 1 영역) 및 프롤린(제 3 영역)으로 치환시키는 것일 수 있다. 또는 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내에 위치한 하나의 세린, 제 2 영역 내에 위치한 연속된 세 개의 아미노산인 라이신-라이신-타이로신 및 제 3 영역 내에 위치한 연속된 두 개의 아미노산인 세린-아이소류신을 각각 알라닌(제 1 영역), 메티오닌-프롤린(제 2 영역) 및 시스테인-알라닌-트레오닌-발린(제 3 영역)으로 치환시키는 것일 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 Cas9은 야생형 Cas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 선택된 하나 이상의 영역 내에 적어도 하나 이상의 아미노산을 부가시킨 Cas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 부가는 상기 선택된 하나 이상의 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 하나 이상의 아미노산의 부가일 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 하나 이상의 아미노산의 부가일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 하나 이상의 양전하를 가지는 아미노산의 부가일 수 있다.
예를 들어, 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 내에 위치한 선택된 하나의 알라닌의 C-말단에 하나의 아르기닌을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 내에 위치한 선택된 글루탐산의 N-말단에 두 개의 아미노산들인 아르기닌-라이신을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내에 위치한 선택된 류신의 N-말단에 두 개의 아미노산들인 아르기닌-히스티딘을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내에 위치한 선택된 류신의 C-말단에 두 개의 아미노산들인 라이신-히스티딘을 부가시키고, 또한 제 4-1 영역 내에 위치한 선택된 타이로신의 C-말단에 하나의 라이신을 부가시킨 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 하나 이상의 음전하를 가지는 아미노산의 부가일 수 있다.
예를 들어, 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 내에 위치한 선택된 하나의 글리신의 N-말단에 하나의 아스파르트산을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 내에 위치한 선택된 메티오닌의 C-말단에 세 개의 아미노산들인 글루탐산-아스파르트산-글루탐산을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내에 위치한 선택된 아이소류신의 N-말단에 두 개의 아미노산들인 글루탐산-글루탐산을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 내에 위치한 선택된 페닐알라닌의 C-말단에 두 개의 아미노산들인 글루탐산-아스파르트산을 부가시키고, 또한 제 2-1 영역 내에 위치한 선택된 글루타민의 N-말단에 하나의 아스파르트산을 부가시킨 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 하나 이상의 전하를 가지지 않는 아미노산의 부가일 수 있다.
예를 들어, 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 내에 위치한 선택된 하나의 페닐알라닌의 C-말단에 두 개의 아미노산들인 세린-발린을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 내에 위치한 선택된 히스티딘의 N-말단에 다섯 개의 아미노산들인 글리신-프롤린-글루타민-페닐알라닌-류신을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내에 위치한 선택된 아스파라긴의 N-말단에 두 개의 아미노산들인 알라닌-알라닌을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 내에 위치한 선택된 아스파르트산의 C-말단에 두 개의 아미노산들인 페닐알라닌-류신을 부가시키고, 또한 제 1-2 영역 내에 위치한 선택된 글루타민의 N-말단에 하나의 세린을 부가시킨 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 양전하를 가지는 아미노산들, 음전하를 가지는 아미노산들 및 전하를 가지지 않는 아미노산들 중 선택된 하나 이상의 아미노산의 부가일 수 있다.
예를 들어, 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 내에 위치한 선택된 하나의 아르기닌의 C-말단에 여섯 개의 아미노산들인 히스티딘-아르기닌-글리신-세린-알라닌-글루탐산을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내에 위치한 선택된 하나의 글리신의 N-말단에 열 개의 아미노산들인 라이신-라이신-알라닌-페닐알라닌-글루타민-트레오닌-메티오닌-시스테인-아스파르트산-세린을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 내에 위치한 선택된 메티오닌의 C-말단에 두 개의 아미노산들인 페닐알라닌-히스티딘을 부가시키고, 또한 제 2-3 영역 내에 위치한 선택된 글루타민의 N-말단에 하나의 라이신을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 내에 위치한 선택된 라이신의 C-말단에 두 개의 아미노산들인 아스파르트산-세린을 부가시키고, 제 2-4 영역 내에 위치한 선택된 발린의 N-말단에 여섯 개의 아미노산들인 글루타민-트레오닌-메티오닌-시스테인-아스파르트산-라이신을 부가시키고, 또한 제 4-1 영역 내에 위치한 선택된 글루타민의 C-말단에 두 개의 아미노산들인 아르기닌-글리신을 부가시킨 것일 수 있다.
이때, 상기 부가는 상기 선택된 하나 이상의 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 하나 이상의 기능적(functional) 도메인의 부가일 수 있다.
상기 기능적 도메인은 야생형 Cas9의 원래 기능, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 제2 기능 이외에 부가적인 기능을 가지는 도메인일 수 있다.
또는 상기 기능적 도메인은 야생형 Cas9의 원래 기능, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및/또는 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 제2 기능과 유사한 기능을 가지는 도메인일 수 있다.
상기 기능적 도메인 관련 설명은 상기 기술한 바와 같다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 하나 이상의 기능적 도메인의 부가일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 구체예에서, 상기 인위적으로 조작된 Cas9은 표적 특이적 Cas9일 수 있다.
“표적 특이적 Cas9(Target specific Cas9; TS-Cas9)”은 Cas9 변이체로, 야생형 Cas9에 비해 상대적으로 표적 특이성(specificity)이 증가하도록 인위적으로 조작하여 생성된 Cas9 변이체를 의미한다.
이때, 상기 “표적 특이성”은 Cas9이 gRNA와의 상호작용을 통해 gRNA-Cas9 복합체를 형성하여 표적 유전자 또는 핵산, 즉, Cas9을 이용해 조작하고자 하는 대상(핵산)에 근접 또는 국소화될 때, gRNA와 상보적 결합을 하는 표적 서열에 특이적으로 Cas9이 작용할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 이때, gRNA와 완전한 상보적 결합(100%)하는 표적 서열은 온-타겟(on-target)으로 명명하며, gRNA와 불완전한 상보적 결합(100% 미만)하는, 즉, 하나 이상의 비상보적 결합을 포함하는 표적 서열은 오프-타겟(off-target)으로 명명한다.
상기 표적 특이성은 gRNA와 표적 서열간의 상보적 결합 정도에 따라 변할 수 있다.
일 예로, gRNA와 상보적 결합을 하는 표적 서열이 온-타겟, 즉, gRNA와 표적 서열간의 상보적 결합이 완전한 상보적 결합(100%)인 경우, 표적 특이성이 가장 높은 상태일 수 있다.
다른 일 예로, gRNA와 상보적 결합을 하는 표적 서열이 오프-타겟, 즉, gRNA와 표적 서열간의 상보적 결합이 100% 미만으로 하나 이상의 비상보적 결합을 포함하는 경우, 표적 특이성은 온-타겟에 비해 감소된 상태일 수 있으며, 상기 비상보적 결합의 개수가 증가함에 따라 상기 표적 특이성은 더 감소할 수 있다.
예를 들어, gRNA와 표적 서열간의 상보적 결합이 완전한 상보적 결합(100%)인 경우, 상기 표적 특이성을 100%라면, gRNA와 표적 서열간의 하나의 비상보적 결합이 포함된 경우, 즉, gRNA와 표적 서열간의 상보적 결합이 불완전한 상보적 결합(95%)인 경우, 상기 표적 특이성은 95%일 수 있다. 또는 gRNA와 표적 서열간의 네 개의 비상보적 결합이 포함된 경우, 즉, gRNA와 표적 서열간의 상보적 결합이 불완전한 상보적 결합(80%)인 경우, 상기 표적 특이성은 80%일 수 있다.
또 다른 일 예로, gRNA와 상보적 결합을 하는 표적 서열이 오프-타겟, 즉, gRNA와 표적 서열간의 상보적 결합이 100% 미만, 즉, 하나 이상의 비상보적 결합을 포함하는 경우, 표적 특이성은 상기 비상보적 결합의 위치에 따라 다를 수 있다.
예를 들어, 상기 gRNA와 표적 서열간의 하나의 비상보적 결합을 포함할 때, 상기 비상보적 결합의 위치가 표적 서열에 인접한 PAM에 근접하게 위치한 경우, 표적 특이성은 비상보적 결합의 위치가 PAM에 멀리 떨어져 위치한 경우에 비해 표적 특이성이 낮을 수 있다.
상기 표적 특이성은 표적 서열과 상보적 결합을 한 gRNA와 Cas9의 상호작용 정도에 따라 변할 수 있다.
일 예로, 표적 서열과 상보적 결합을 한 gRNA와 Cas9의 상호작용이 감소된 경우, 상기 gRNA와 표적 서열 간에 비상보적 결합의 수가 감소할수록 표적 특이성은 증가할 수 있다.
예를 들어, 표적 서열과 상보적 결합을 한 gRNA와 Cas9의 상호작용이 감소된 경우, 상기 gRNA와 표적 서열 간에 세 개의 비상보적 결합을 포함할 때에 비해 하나의 비상보적 결합을 포함할 때 표적 특이성이 상대적으로 증가할 수 있다.
다른 일 예로, 표적 서열과 상보적 결합을 한 gRNA와 Cas9의 상호작용이 감소된 경우, 상기 gRNA와 표적 서열간의 상보적 결합이 완전한 상보적 결합(100%)일 때만 표적 특이성을 가질 수 있다.
예를 들어, 표적 서열과 상보적 결합을 한 gRNA와 Cas9의 상호작용이 감소된 경우, 상기 표적 서열이 온-타겟일 때만 표적 특이성을 가질 수 있다.
상기 표적 특이성은 gRNA와 상보적 결합을 한 표적 서열과 Cas9의 상호작용 정도에 따라 변할 수 있다.
일 예로, gRNA와 상보적 결합을 한 표적 서열과 Cas9의 상호작용이 감소된 경우, 상기 gRNA와 표적 서열 간에 비상보적 결합의 수가 감소할수록 표적 특이성은 증가할 수 있다.
예를 들어, gRNA와 상보적 결합을 한 표적 서열과 Cas9의 상호작용이 감소된 경우, 상기 gRNA와 표적 서열 간에 네 개의 비상보적 결합을 포함할 때에 비해 두 개의 비상보적 결합을 포함할 때 표적 특이성이 상대적으로 증가할 수 있다.
다른 일 예로, gRNA와 상보적 결합을 한 표적 서열과 Cas9의 상호작용이 감소된 경우, 상기 gRNA와 표적 서열간의 상보적 결합이 완전한 상보적 결합(100%)일 때만 표적 특이성을 가질 수 있다.
예를 들어, gRNA와 상보적 결합을 한 표적 서열과 Cas9의 상호작용이 감소된 경우, 상기 표적 서열이 온-타겟일 때만 표적 특이성을 가질 수 있다.
상기 표적 특이적 Cas9은 온-타겟을 조작하는 Cas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 조작은 Cas9 변이체를 이용해 온-타겟의 뉴클레오타이드 서열을 절단하거나, 온-타겟의 뉴클레오타이드 서열 내에 하나 이상의 뉴클레오타이드를 삭제 및/또는 삽입할 수 있도록 온-타겟의 뉴클레오타이드 서열을 변형시키는 것일 수 있다.
상기 표적 특이적 Cas9은 온-타겟에 대한 표적 특이성이 야생형 Cas9과 동일하거나 증가된 Cas9 변이체일 수 있다.
상기 표적 특이적 Cas9은 오프-타겟을 조작하지 않는 Cas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 조작은 Cas9 변이체를 이용해 오프-타겟의 뉴클레오타이드 서열을 절단하거나, 오프-타겟의 뉴클레오타이드 서열 내에 하나 이상의 뉴클레오타이드를 삭제 및/또는 삽입할 수 있도록 오프-타겟의 뉴클레오타이드 서열을 변형시키는 것일 수 있다.
상기 표적 특이적 Cas9은 야생형 Cas9에 비해 오프-타겟에 대한 표적 특이성이 감소된 Cas9 변이체일 수 있다.
상기 표적 특이적 Cas9은 온-타겟에 대한 표적 특이성이 야생형 Cas9과 동일하며, 오프-타겟에 대한 표적 특이성은 야생형 Cas9에 비해 감소된 Cas9 변이체일 수 있다.
상기 표적 특이적 Cas9은 오프-타겟에 대한 표적 특이성이 야생형 Cas9과 동일하며, 온-타겟에 대한 표적 특이성은 야생형 Cas9에 비해 증가된 Cas9 변이체일 수 있다.
상기 표적 특이적 Cas9은 온-타겟에 대한 표적 특이성이 야생형 Cas9에 비해 증가하며, 오프-타겟에 대한 표적 특이성은 야생형 Cas9에 비해 감소된 Cas9 변이체일 수 있다.
상기 표적 특이적 Cas9은 온-타겟에 대한 표적 특이성이 야생형 Cas9에 비해 감소하며, 오프-타겟에 대한 표적 특이성은 야생형 Cas9에 비해 감소된 Cas9 변이체일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 실시예에서, 상기 표적 특이적 Cas9은 표적 특이적 SpCas9일 수 있다.
“표적 특이적 SpCas9(Target specific SpCas9; TS-SpCas9)”은 SpCas9 변이체로, 야생형 SpCas9에 비해 상대적으로 표적 특이성(specificity)이 증가하도록 인위적으로 조작하여 생성된 SpCas9 변이체를 의미한다.
상기 TS-SpCas9은 온-타겟을 조작하는 SpCas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 조작은 SpCas9 변이체를 이용해 온-타겟의 뉴클레오타이드 서열을 절단하거나, 온-타겟의 뉴클레오타이드 서열 내에 하나 이상의 뉴클레오타이드를 삭제 및/또는 삽입할 수 있도록 온-타겟의 뉴클레오타이드 서열을 변형시키는 것일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 온-타겟에 대한 표적 특이성이 야생형 SpCas9과 동일하거나 증가된 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 오프-타겟을 조작하지 않는 SpCas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 조작은 SpCas9 변이체를 이용해 오프-타겟의 뉴클레오타이드 서열을 절단하거나, 오프-타겟의 뉴클레오타이드 서열 내에 하나 이상의 뉴클레오타이드를 삭제 및/또는 삽입할 수 있도록 오프-타겟의 뉴클레오타이드 서열을 변형시키는 것일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9에 비해 오프-타겟에 대한 표적 특이성이 감소된 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 온-타겟에 대한 표적 특이성이 야생형 SpCas9과 동일하며, 오프-타겟에 대한 표적 특이성은 야생형 SpCas9에 비해 감소된 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 오프-타겟에 대한 표적 특이성이 야생형 SpCas9과 동일하며, 온-타겟에 대한 표적 특이성은 야생형 SpCas9에 비해 증가된 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 온-타겟에 대한 표적 특이성이 야생형 SpCas9에 비해 증가하며, 오프-타겟에 대한 표적 특이성은 야생형 SpCas9에 비해 감소된 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 온-타겟에 대한 표적 특이성이 야생형 SpCas9에 비해 감소하며, 오프-타겟에 대한 표적 특이성은 야생형 SpCas9에 비해 감소된 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 선택된 하나 이상의 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 196번째 페닐알라닌(F196)부터 282번째 아이소류신(I282)까지의 아미노산 서열(제 1-1 영역)일 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 316번째 프롤린(P316)부터 394번째 아스파라긴(N394)까지의 아미노산 서열(제 1-2 영역)일 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 510번째 라이신(K510)부터 612번째 아스파라긴(N612)까지의 아미노산 서열(제 1-3 영역)일 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 678번째 트레오닌(T678)부터 698번째 히스티딘(H698)까지의 아미노산 서열(제 1-4 영역)일 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 196번째 페닐알라닌(F196)부터 282번째 아이소류신(I282)까지의 아미노산 서열(제 1-1 영역), 316번째 프롤린(P316)부터 394번째 아스파라긴(N394)까지의 아미노산 서열(제 1-2 영역), 510번째 라이신(K510)부터 612번째 아스파라긴(N612)까지의 아미노산 서열(제 1-3 영역) 및 678번째 트레오닌(T678)부터 698번째 히스티딘(H698)까지의 아미노산 서열(제 1-4 영역) 중 선택된 두 개의 영역일 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 196번째 페닐알라닌(F196)부터 282번째 아이소류신(I282)까지의 아미노산 서열(제 1-1 영역), 316번째 프롤린(P316)부터 394번째 아스파라긴(N394)까지의 아미노산 서열(제 1-2 영역), 510번째 라이신(K510)부터 612번째 아스파라긴(N612)까지의 아미노산 서열(제 1-3 영역) 및 678번째 트레오닌(T678)부터 698번째 히스티딘(H698)까지의 아미노산 서열(제 1-4 영역) 중 선택된 세 개의 영역일 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 196번째 페닐알라닌(F196)부터 282번째 아이소류신(I282)까지의 아미노산 서열(제 1-1 영역), 316번째 프롤린(P316)부터 394번째 아스파라긴(N394)까지의 아미노산 서열(제 1-2 영역), 510번째 라이신(K510)부터 612번째 아스파라긴(N612)까지의 아미노산 서열(제 1-3 영역) 및 678번째 트레오닌(T678)부터 698번째 히스티딘(H698)까지의 아미노산 서열(제 1-4 영역)일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역)일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역)일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 926번째 글루타민(Q926)부터 1000번째 라이신(K1000)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역)일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1001번째 타이로신(Y1001)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-4 영역)일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역) 및 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역)일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역) 및 926번째 글루타민(Q926)부터 1000번째 라이신(K1000)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역)일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역) 및 1001번째 타이로신(Y1001)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-4 영역)일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역) 및 926번째 글루타민(Q926)부터 1000번째 라이신(K1000)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역)일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역) 및 1001번째 타이로신(Y1001)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-4 영역)일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 926번째 글루타민(Q926)부터 1000번째 라이신(K1000)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역) 및 1001번째 타이로신(Y1001)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-4 영역)일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역), 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역) 및 926번째 글루타민(Q926)부터 1000번째 라이신(K1000)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역)일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역), 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역) 및 1001번째 타이로신(Y1001)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-4 영역)일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역), 926번째 글루타민(Q926)부터 1000번째 라이신(K1000)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역) 및 1001번째 타이로신(Y1001)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-4 영역)일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역), 926번째 글루타민(Q926)부터 1000번째 라이신(K1000)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역) 및 1001번째 타이로신(Y1001)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-4 영역)일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역), 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역), 926번째 글루타민(Q926)부터 1000번째 라이신(K1000)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역) 및 1001번째 타이로신(Y1001)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-4 영역)일 수 있다.
상기 제 3 영역은 야생형 SpCas9의 775번째 라이신(K775)부터 900번째 류신(L900)까지의 아미노산 서열(제 3-1 영역)일 수 있다.
상기 제 4 영역은 야생형 SpCas9의 1099번째 글루탐산(E1099)부터 1139번째 발린(V1139)까지의 아미노산 서열(제 4-1 영역)일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281 및 I282로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 중 P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391 및 L393로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 K510, L513, L514, Y515, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, E584, D585, F587, N588, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606 및 L607으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 중 I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, N692, F693, M694, Q695, L696, I697 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, K510, L513, L514, Y515, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, E584, D585, F587, N588, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, N692, F693, M694, Q695, L696, I697 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203; N277; G366; F539; 또는 I601을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277(A203과 N277); A203/G366; A203/F539; 또는 A203/I601을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 N277/G366; N277/F539; 또는 N277/I601을 변형시킨 SpCas9일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 G366/F539; G366/I601; 또는 F539/I601을 변형시킨 SpCas9일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366; A203/N277/F539; A203/N277/I601; A203/G366/F539; A203/G366/I601; A203/F539/I601; N277/G366/F539; N277/G366/I601; 또는 G366/F539/I601을 변형시킨 SpCas9일 수 있다.
또 다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539; A203/N277/G366/I601; A203/N277/F539/I601; A203/G366/F539/I601; 또는 N277/G366/F539/I601을 변형시킨 SpCas9일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539/I601를 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20 및 I21로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766 및 N767로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 중 I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997 및 I998로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-4 영역 중 Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및 제 2-3 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예세서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 Y1001; P1002; K1003; L1004; E1005; S1006; E1007; F1008; V1009; Y1010; G1011; D1012; Y1013; K1014; V1015; Y1016; D1017; V1018; R1019; K1020; M1021; I1022; A1023; K1024; S1025; E1026; Q1027; E1028; I1029; 또는 G1030을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763; D965; E1007 또는 F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763/D965; M763/E1007; M763/F1038; D965/E1007; E1007/F1038 또는 D965/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763/D965/E1007; M763/D965/F1038; M763/E1007/F1038; 또는 D965/E1007/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763/D965/E1007/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, V838, D839, H840, K848, D849, D850, D853, N854, K855, R859, D861, K862, N863, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, A889, K890, L891, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 K890을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 T1102 또는 D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 상기 제 1 영역 및 제 2 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/M763; A203/D965; A203/E1007; A203/F1038; A203/M763/D965; A203/M763/E1007; A203/M763/F1038; A203/D965/E1007; A203/D965/F1038; D965/E1007/F1038; A203/M763/D965/E1007; A203/M763/D965/F1038; A203/M763/E1007/F1038; A203/D965/E1007/F1038; A203/M763/D965/E1007/F1038; N277/M763; N277/D965; N277/E1007; N277/F1038; N277/M763/D965; N277/M763/E1007; N277/M763/F1038; N277/D965/E1007; N277/D965/F1038; N277/E1007/F1038; N277/M763/D965/E1007; N277/M763/D965/F1038; N277/M763/E1007/F1038; N277/D965/E1007/F1038; N277/M763/D965/E1007/F1038; G366/M763; G366/D965; G366/E1007; G366/F1038; G366/M763/D965; G366/M763/E1007; G366/M763/F1038; G366/D965/E1007; G366/D965/F1038; G366/E1007/F1038; G366/M763/D965/E1007; G366/M763/D965/F1038; G366/M763/E1007/F1038; G366/D965/E1007/F1038; G366/M763/D965/E1007/F1038; F539/M763; F539/D965; F539/E1007; F539/F1038; F539/M763/D965; F539/M763/E1007; F539/M763/F1038; F539/D965/E1007; F539/D965/F1038; F539/E1007/F1038; F539/M763/D965/E1007; F539/M763/D965/F1038; F539/M763/E1007/F1038; F539/D965/E1007/F1038; F539/M763/D965/E1007/F1038; I601/M763; I601/D965; I601/E1007; I601/F1038; I601/M763/D965; I601/M763/E1007; I601/M763/F1038; I601/D965/E1007; I601/D965/F1038; I601/E1007/F1038; I601/M763/D965/E1007; I601/M763/D965/F1038; I601/M763/E1007/F1038; I601/D965/E1007/F1038; 또는 I601/M763/D965/E1007/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/M763; A203/N277/D965; A203/N277/E1007; A203/N277/F1038; A203/N277/M763/D965; A203/N277/M763/E1007; A203/N277/M763/F1038; A203/N277/D965/E1007; A203/N277/D965/F1038; A203/N277/E1007/F1038; A203/N277/M763/D965/E1007; A203/N277/M763/D965/F1038; A203/N277/M763/E1007/F1038; A203/N277/D965/E1007/F1038; A203/N277/M763/D965/E1007/F1038; A203/G366/M763; A203/G366/D965; A203/G366/E1007; A203/G366/F1038; A203/G366/M763/D965; A203/G366/M763/E1007; A203/G366/M763/F1038; A203/G366/D965/E1007; A203/G366/D965/F1038; A203/G366/E1007/F1038; A203/G366/M763/D965/E1007; A203/G366/M763/D965/F1038; A203/G366/M763/E1007/F1038; A203/G366/D965/E1007/F1038; A203/G366/M763/D965/E1007/F1038; A203/F539/M763; A203/F539/D965; A203/F539/E1007; A203/F539/F1038; A203/F539/M763/D965; A203/F539/M763/E1007; A203/F539/M763/F1038; A203/F539/D965/E1007; A203/F539/D965/F1038; A203/F539/E1007/F1038; A203/F539/M763/D965/E1007; A203/F539/M763/D965/F1038; A203/F539/M763/E1007/F1038; A203/F539/D965/E1007/F1038; A203/F539/M763/D965/E1007/F1038; A203/I601/M763; A203/I601/D965; A203/I601/E1007; A203/I601/F1038; A203/I601/M763/D965; A203/I601/M763/E1007; A203/I601/M763/F1038; A203/I601/D965/E1007; A203/I601/D965/F1038; A203/I601/E1007/F1038; A203/I601/M763/D965/E1007; A203/I601/M763/D965/F1038; A203/I601/M763/E1007/F1038; A203/I601/D965/E1007/F1038; A203/I601/M763/D965/E1007/F1038; N277/G366/M763; N277/G366/D965; N277/G366/E1007; N277/G366/F1038; N277/G366/M763/D965; N277/G366/M763/E1007; N277/G366/M763/F1038; N277/G366/D965/E1007; N277/G366/D965/F1038; N277/G366/E1007/F1038; N277/G366/M763/D965/E1007; N277/G366/M763/D965/F1038; N277/G366/M763/E1007/F1038; N277/G366/D965/E1007/F1038; N277/G366/M763/D965/E1007/F1038; N277/F539/M763; N277/F539/D965; N277/F539/E1007; N277/F539/F1038; N277/F539/M763/D965; N277/F539/M763/E1007; N277/F539/M763/F1038; N277/F539/D965/E1007; N277/F539/D965/F1038; N277/F539/E1007/F1038; N277/F539/M763/D965/E1007; N277/F539/M763/D965/F1038; N277/F539/M763/E1007/F1038; N277/F539/D965/E1007/F1038; N277/F539/M763/D965/E1007/F1038; N277/I601/M763; N277/I601/D965; N277/I601/E1007; N277/I601/F1038; N277/I601/M763/D965; N277/I601/M763/E1007; N277/I601/M763/F1038; N277/I601/D965/E1007; N277/I601/D965/F1038; N277/I601/E1007/F1038; N277/I601/M763/D965/E1007; N277/I601/M763/D965/F1038; N277/I601/M763/E1007/F1038; N277/I601/D965/E1007/F1038; N277/I601/M763/D965/E1007/F1038; G366/F539/M763; G366/F539/D965; G366/F539/E1007; G366/F539/F1038; G366/F539/M763/D965; G366/F539/M763/E1007; G366/F539/M763/F1038; G366/F539/D965/E1007; G366/F539/D965/F1038; G366/F539/E1007/F1038; G366/F539/M763/D965/E1007; G366/F539/M763/D965/F1038; G366/F539/M763/E1007/F1038; G366/F539/D965/E1007/F1038; G366/F539/M763/D965/E1007/F1038; G366/I601/M763; G366/I601/D965; G366/I601/E1007; G366/I601/F1038; G366/I601/M763/D965; G366/I601/M763/E1007; G366/I601/M763/F1038; G366/I601/D965/E1007; G366/I601/D965/F1038; G366/I601/E1007/F1038; G366/I601/M763/D965/E1007; G366/I601/M763/D965/F1038; G366/I601/M763/E1007/F1038; G366/I601/D965/E1007/F1038; G366/I601/M763/D965/E1007/F1038; F539/I601/M763; F539/I601/D965; F539/I601/E1007; F539/I601/F1038; F539/I601/M763/D965; F539/I601/M763/E1007; F539/I601/M763/F1038; F539/I601/D965/E1007; F539/I601/D965/F1038; F539/I601/E1007/F1038; F539/I601/M763/D965/E1007; F539/I601/M763/D965/F1038; F539/I601/M763/E1007/F1038; F539/I601/D965/E1007/F1038 또는 F539/I601/M763/D965/E1007/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/M763; A203/N277/G366/D965; A203/N277/G366/E1007; A203/N277/G366/F1038; A203/N277/G366/M763/D965; A203/N277/G366/M763/E1007; A203/N277/G366/M763/F1038; A203/N277/G366/D965/E1007; A203/N277/G366/D965/F1038; A203/N277/G366/E1007/F1038; A203/N277/G366/M763/D965/E1007; A203/N277/G366/M763/D965/F1038; A203/N277/G366/M763/E1007/F1038; A203/N277/G366/D965/E1007/F1038; A203/N277/G366/M763/D965/E1007/F1038; A203/N277/F539/M763; A203/N277/F539/D965; A203/N277/F539/E1007; A203/N277/F539/F1038; A203/N277/F539/M763/D965; A203/N277/F539/M763/E1007; A203/N277/F539/M763/F1038; A203/N277/F539/D965/E1007; A203/N277/F539/D965/F1038; A203/N277/F539/E1007/F1038; A203/N277/F539/M763/D965/E1007; A203/N277/F539/M763/D965/F1038; A203/N277/F539/M763/E1007/F1038; A203/N277/F539/D965/E1007/F1038; A203/N277/F539/M763/D965/E1007/F1038; A203/N277/I601/M763; A203/N277/I601/D965; A203/N277/I601/E1007; A203/N277/I601/F1038; A203/N277/I601/M763/D965; A203/N277/I601/M763/E1007; A203/N277/I601/M763/F1038; A203/N277/I601/D965/E1007; A203/N277/I601/D965/F1038; A203/N277/I601/E1007/F1038; A203/N277/I601/M763/D965/E1007; A203/N277/I601/M763/D965/F1038; A203/N277/I601/M763/E1007/F1038; A203/N277/I601/D965/E1007/F1038; A203/N277/I601/M763/D965/E1007/F1038; A203/G366/F539/M763; A203/G366/F539/D965; A203/G366/F539/E1007; A203/G366/F539/F1038; A203/G366/F539/M763/D965; A203/G366/F539/M763/E1007; A203/G366/F539/M763/F1038; A203/G366/F539/D965/E1007; A203/G366/F539/D965/F1038; A203/G366/F539/E1007/F1038; A203/G366/F539/M763/D965/E1007; A203/G366/F539/M763/D965/F1038; A203/G366/F539/M763/E1007/F1038; A203/G366/F539/D965/E1007/F1038; A203/G366/F539/M763/D965/E1007/F1038; A203/G366/I601/M763; A203/G366/I601/D965; A203/G366/I601/E1007; A203/G366/I601/F1038; A203/G366/I601/M763/D965; A203/G366/I601/M763/E1007; A203/G366/I601/M763/F1038; A203/G366/I601/D965/E1007; A203/G366/I601/D965/F1038; A203/G366/I601/E1007/F1038; A203/G366/I601/M763/D965/E1007; A203/G366/I601/M763/D965/F1038; A203/G366/I601/M763/E1007/F1038; A203/G366/I601/D965/E1007/F1038; A203/G366/I601/M763/D965/E1007/F1038; A203/F539/I601/M763; A203/F539/I601/D965; A203/F539/I601/E1007; A203/F539/I601/F1038; A203/F539/I601/M763/D965; A203/F539/I601/M763/E1007; A203/F539/I601/M763/F1038; A203/F539/I601/D965/E1007; A203/F539/I601/D965/F1038; A203/F539/I601/E1007/F1038; A203/F539/I601/M763/D965/E1007; A203/F539/I601/M763/D965/F1038; A203/F539/I601/M763/E1007/F1038; A203/F539/I601/D965/E1007/F1038; A203/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038; N277/G366/F539/M763; N277/G366/F539/D965; N277/G366/F539/E1007; N277/G366/F539/F1038; N277/G366/F539/M763/D965; N277/G366/F539/M763/E1007; N277/G366/F539/M763/F1038; N277/G366/F539/D965/E1007; N277/G366/F539/D965/F1038; N277/G366/F539/E1007/F1038; N277/G366/F539/M763/D965/E1007; N277/G366/F539/M763/D965/F1038; N277/G366/F539/M763/E1007/F1038; N277/G366/F539/D965/E1007/F1038; N277/G366/F539/M763/D965/E1007/F1038; N277/G366/I601/M763; N277/G366/I601/D965; N277/G366/I601/E1007; N277/G366/I601/F1038; N277/G366/I601/M763/D965; N277/G366/I601/M763/E1007; N277/G366/I601/M763/F1038; N277/G366/I601/D965/E1007; N277/G366/I601/D965/F1038; N277/G366/I601/E1007/F1038; N277/G366/I601/M763/D965/E1007; N277/G366/I601/M763/D965/F1038; N277/G366/I601/M763/E1007/F1038; N277/G366/I601/D965/E1007/F1038; N277/G366/I601/M763/D965/E1007/F1038; G366/F539/I601/M763; G366/F539/I601/D965; G366/F539/I601/E1007; G366/F539/I601/F1038; G366/F539/I601/M763/D965; G366/F539/I601/M763/E1007; G366/F539/I601/M763/F1038; G366/F539/I601/D965/E1007; G366/F539/I601/D965/F1038; G366/F539/I601/E1007/F1038; G366/F539/I601/M763/D965/E1007; G366/F539/I601/M763/D965/F1038; G366/F539/I601/M763/E1007/F1038; G366/F539/I601/D965/E1007/F1038; 또는G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539/M763; A203/N277/G366/F539/D965; A203/N277/G366/F539/E1007; A203/N277/G366/F539/F1038; A203/N277/G366/F539/M763/D965; A203/N277/G366/F539/M763/E1007; A203/N277/G366/F539/M763/F1038; A203/N277/G366/F539/D965/E1007; A203/N277/G366/F539/D965/F1038; A203/N277/G366/F539/E1007/F1038; A203/N277/G366/F539/M763/D965/E1007; A203/N277/G366/F539/M763/D965/F1038; A203/N277/G366/F539/M763/E1007/F1038; A203/N277/G366/F539/D965/E1007/F1038; A203/N277/G366/F539/M763/D965/E1007/F1038; A203/N277/G366/I601/M763; A203/N277/G366/I601/D965; A203/N277/G366/I601/E1007; A203/N277/G366/I601/F1038; A203/N277/G366/I601/M763/D965; A203/N277/G366/I601/M763/E1007; A203/N277/G366/I601/M763/F1038; A203/N277/G366/I601/D965/E1007; A203/N277/G366/I601/D965/F1038; A203/N277/G366/I601/E1007/F1038; A203/N277/G366/I601/M763/D965/E1007; A203/N277/G366/I601/M763/D965/F1038; A203/N277/G366/I601/M763/E1007/F1038; A203/N277/G366/I601/D965/E1007/F1038; A203/N277/G366/I601/M763/D965/E1007/F1038; N277/G366/F539/I601/M763; N277/G366/F539/I601/D965; N277/G366/F539/I601/E1007; N277/G366/F539/I601/F1038; N277/G366/F539/I601/M763/D965; N277/G366/F539/I601/M763/E1007; N277/G366/F539/I601/M763/F1038; N277/G366/F539/I601/D965/E1007; N277/G366/F539/I601/D965/F1038; N277/G366/F539/I601/E1007/F1038; N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007; N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038; N277/G366/F539/I601/M763/E1007/F1038; N277/G366/F539/I601/D965/E1007/F1038; N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/M763; A203/N277/G366/F539/I601/D965; A203/N277/G366/F539/I601/E1007; A203/N277/G366/F539/I601/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965; A203/N277/G366/F539/I601/M763/E1007; A203/N277/G366/F539/I601/M763/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/D965/E1007; A203/N277/G366/F539/I601/D965/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/E1007/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007; A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/M763/E1007/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/D965/E1007/F1038; 또는 A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 3-1 영역 중 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, V838, D839, H840, K848, D849, D850, D853, N854, K855, R859, D861, K862, N863, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, A889, K890, L891, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/K890; N277/K890; G366/K890; F539/K890; 또는 I601/K890을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/K890; A203/G366/K890; A203/F539/K890; A203/I601/K890; N277/G366/K890; N277/F539/K890; N277/I601/K890; G366/F539/K890; G366/I601/K890; 또는 F539/I601/K890을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/K890; A203/N277/F539/K890; A203/N277/I601/K890; A203/G366/F539/K890; A203/G366/I601/K890; A203/F539/I601/K890; N277/G366/F539/K890; N277/G366/I601/K890; 또는 G366/F539/I601/K890을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539/K890; A203/N277/G366/I601/K890; 또는 N277/G366/F539/I601/K890을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539/I601/K890을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/T1102; N277/T1102; G366/T1102; F539/T1102; I601/T1102; A203/D1127; N277/D1127; G366/D1127; F539/D1127; I601/D1127; A203/T1102/D1127; N277/T1102/D1127; G366/T1102/D1127; F539/T1102/D1127; 또는I601/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/T1102; A203/G366/T1102; A203/F539/T1102; A203/I601/T1102; N277/G366/T1102; N277/F539/T1102; N277/I601/T1102; G366/F539/T1102; G366/I601/T1102; F539/I601/T1102; A203/N277/D1127; A203/G366/D1127; A203/F539/D1127; A203/I601/D1127; N277/G366/D1127; N277/F539/D1127; N277/I601/D1127; G366/F539/D1127; G366/I601/D1127; F539/I601/D1127; A203/N277/T1102/D1127; A203/G366/T1102/D1127; A203/F539/T1102/D1127; A203/I601/T1102/D1127; N277/G366/T1102/D1127; N277/F539/T1102/D1127; N277/I601/T1102/D1127; G366/F539/T1102/D1127; G366/I601/T1102/D1127; 또는 F539/I601/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/T1102; A203/N277/F539/T1102; A203/N277/I601/T1102; A203/G366/F539/T1102; A203/G366/I601/T1102; A203/F539/I601/T1102; N277/G366/F539/T1102; N277/G366/I601/T1102; G366/F539/I601/T1102; A203/N277/G366/D1127; A203/N277/F539/D1127; A203/N277/I601/D1127; A203/G366/F539/D1127; A203/G366/I601/D1127; A203/F539/I601/D1127; N277/G366/F539/D1127; N277/G366/I601/D1127; G366/F539/I601/D1127; A203/N277/G366/T1102/D1127; A203/N277/F539/T1102/D1127; A203/N277/I601/T1102/D1127; A203/G366/F539/T1102/D1127; A203/G366/I601/T1102/D1127; A203/F539/I601/T1102/D1127; N277/G366/F539/T1102/D1127; N277/G366/I601/T1102/D1127; 또는 G366/F539/I601/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539/T1102; A203/N277/G366/I601/T1102; N277/G366/F539/I601/T1102; A203/N277/G366/F539/D1127; A203/N277/G366/I601/D1127; N277/G366/F539/I601/D1127; A203/N277/G366/F539/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/T1102/D1127; 또는 N277/G366/F539/I601/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539/I601/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/D1127; 또는 A203/N277/G366/F539/I601/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 3-1 영역 중 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, V838, D839, H840, K848, D849, D850, D853, N854, K855, R859, D861, K862, N863, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, A889, K890, L891, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763/K890; K890/D965; K890/E1007; 또는 K890/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763/K890/D965; M763/K890/E1007; M763/K890/F1038; K890/D965/E1007; 또는 K890/E1007/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763/K890/D965/E1007; M763/K890/D965/F1038; M763/K890/E1007/F1038; K890/D965/E1007/F1038; 또는 M763/K890/D965/E1007/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763/T1102; D965/T1102; E1007/T1102; F1038/T1102; M763/D1127; D965/D1127; E1007/D1127; F1038/D1127; M763/T1102/D1127; D965/T1102/D1127; E1007/T1102/D1127; 또는 F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763/D965/T1102; M763/E1007/T1102; M763/F1038/T1102; D965/E1007/T1102; D965/F1038/T1102; E1007/F1038/T1102; M763/D965/D1127; M763/E1007/D1127; M763/F1038/D1127; D965/E1007/D1127; D965/F1038/D1127; E1007/F1038/D1127; M763/D965/T1102/D1127; M763/E1007/T1102/D1127; M763/F1038/T1102/D1127; D965/E1007/T1102/D1127; D965/F1038/T1102/D1127; 또는 E1007/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763/D965/E1007/T1102; M763/D965/F1038/T1102; M763/E1007/F1038/T1102; D965/E1007/F1038/T1102; M763/D965/E1007/F1038/T1102; M763/D965/E1007/D1127; M763/D965/F1038/D1127; M763/E1007/F1038/D1127; D965/E1007/F1038/D1127; M763/D965/E1007/F1038/D1127; M763/D965/E1007/T1102/D1127; M763/D965/F1038/T1102/D1127; M763/E1007/F1038/T1102/D1127; D965/E1007/F1038/T1102/D1127; 또는 M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 K890/T1102; K890/D1127; 또는 K890/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 셋 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 3-1 영역 중 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, V838, D839, H840, K848, D849, D850, D853, N854, K855, R859, D861, K862, N863, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, A889, K890, L891, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/M763/K890; A203/K890/D965; A203/K890/E1007; A203/K890/F1038; A203/M763/K890/D965; A203/M763/K890/E1007; A203/M763/K890/F1038; A203/K890/D965/E1007; A203/K890/D965/F1038; A203/K890/E1007/F1038; A203/M763/K890/D965/E1007; A203/M763/K890/D965/F1038; A203/M763/K890/E1007/F1038; A203/K890/D965/E1007/F1038; A203/M763/K890/D965/E1007/F1038; N277/M763/K890; N277/K890/D965; N277/K890/E1007; N277/K890/F1038; N277/M763/K890/D965; N277/M763/K890/E1007; N277/M763/K890/F1038; N277/K890/D965/E1007; N277/K890/D965/F1038; N277/K890/E1007/F1038; N277/M763/K890/D965/E1007; N277/M763/K890/D965/F1038; N277/M763/K890/E1007/F1038; N277/K890/D965/E1007/F1038; N277/M763/K890/D965/E1007/F1038; G366/M763/K890; G366/K890/D965; G366/K890/E1007; G366/K890/F1038; G366/M763/K890/D965; G366/M763/K890/E1007; G366/M763/K890/F1038; G366/K890/D965/E1007; G366/K890/D965/F1038; G366/K890/E1007/F1038; G366/M763/K890/D965/E1007; G366/M763/K890/D965/F1038; G366/M763/K890/E1007/F1038; G366/K890/D965/E1007/F1038; G366/M763/K890/D965/E1007/F1038; F539/M763/K890; F539/K890/D965; F539/K890/E1007; F539/K890/F1038; F539/M763/K890/D965; F539/M763/K890/E1007; F539/M763/K890/F1038; F539/K890/D965/E1007; F539/K890/D965/F1038; F539/K890/E1007/F1038; F539/M763/K890/D965/E1007; F539/M763/K890/D965/F1038; F539/M763/K890/E1007/F1038; F539/K890/D965/E1007/F1038; F539/M763/K890/D965/E1007/F1038; I601/M763/K890; I601/K890/D965; I601/K890/E1007; I601/K890/F1038; I601/M763/K890/D965; I601/M763/K890/E1007; I601/M763/K890/F1038; I601/K890/D965/E1007; I601/K890/D965/F1038; I601/K890/E1007/F1038; I601/M763/K890/D965/E1007; I601/M763/K890/D965/F1038; I601/M763/K890/E1007/F1038; I601/K890/D965/E1007/F1038; 또는 I601/M763/K890/D965/E1007/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/M763/K890; A203/N277/K890/D965; A203/N277/K890/E1007; A203/N277/K890/F1038; A203/N277/M763/K890/D965; A203/N277/M763/K890/E1007; A203/N277/M763/K890/F1038; A203/N277/K890/D965/E1007; A203/N277/K890/D965/F1038; A203/N277/K890/E1007/F1038; A203/N277/M763/K890/D965/E1007; A203/N277/M763/K890/D965/F1038; A203/N277/M763/K890/E1007/F1038; A203/N277/K890/D965/E1007/F1038; A203/N277/M763/K890/D965/E1007/F1038; A203/G366/M763/K890; A203/G366/K890/D965; A203/G366/K890/E1007; A203/G366/K890/F1038; A203/G366/M763/K890/D965; A203/G366/M763/K890/E1007; A203/G366/M763/K890/F1038; A203/G366/K890/D965/E1007; A203/G366/K890/D965/F1038; A203/G366/K890/E1007/F1038; A203/G366/M763/K890/D965/E1007; A203/G366/M763/K890/D965/F1038; A203/G366/M763/K890/E1007/F1038; A203/G366/K890/D965/E1007/F1038; A203/G366/M763/K890/D965/E1007/F1038; A203/F539/M763/K890; A203/F539/K890/D965; A203/F539/K890/E1007; A203/F539/K890/F1038; A203/F539/M763/K890/D965; A203/F539/M763/K890/E1007; A203/F539/M763/K890/F1038; A203/F539/K890/D965/E1007; A203/F539/K890/D965/F1038; A203/F539/K890/E1007/F1038; A203/F539/M763/K890/D965/E1007; A203/F539/M763/K890/D965/F1038; A203/F539/M763/K890/E1007/F1038; A203/F539/K890/D965/E1007/F1038; A203/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038; A203/I601/M763/K890; A203/I601/K890/D965; A203/I601/K890/E1007; A203/I601/K890/F1038; A203/I601/M763/K890/D965; A203/I601/M763/K890/E1007; A203/I601/M763/K890/F1038; A203/I601/K890/D965/E1007; A203/I601/K890/D965/F1038; A203/I601/K890/E1007/F1038; A203/I601/M763/K890/D965/E1007; A203/I601/M763/K890/D965/F1038; A203/I601/M763/K890/E1007/F1038; A203/I601/K890/D965/E1007/F1038; A203/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038; N277/G366/M763/K890; N277/G366/K890/D965; N277/G366/K890/E1007; N277/G366/K890/F1038; N277/G366/M763/K890/D965; N277/G366/M763/K890/E1007; N277/G366/M763/K890/F1038; N277/G366/K890/D965/E1007; N277/G366/K890/D965/F1038; N277/G366/K890/E1007/F1038; N277/G366/M763/K890/D965/E1007; N277/G366/M763/K890/D965/F1038; N277/G366/M763/K890/E1007/F1038; N277/G366/K890/D965/E1007/F1038; N277/G366/M763/K890/D965/E1007/F1038; N277/F539/M763/K890; N277/F539/K890/D965; N277/F539/K890/E1007; N277/F539/K890/F1038; N277/F539/M763/K890/D965; N277/F539/M763/K890/E1007; N277/F539/M763/K890/F1038; N277/F539/K890/D965/E1007; N277/F539/K890/D965/F1038; N277/F539/K890/E1007/F1038; N277/F539/M763/K890/D965/E1007; N277/F539/M763/K890/D965/F1038; N277/F539/M763/K890/E1007/F1038; N277/F539/K890/D965/E1007/F1038; N277/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038; N277/I601/M763/K890; N277/I601/K890/D965; N277/I601/K890/E1007; N277/I601/K890/F1038; N277/I601/M763/K890/D965; N277/I601/M763/K890/E1007; N277/I601/M763/K890/F1038; N277/I601/K890/D965/E1007; N277/I601/K890/D965/F1038; N277/I601/K890/E1007/F1038; N277/I601/M763/K890/D965/E1007; N277/I601/M763/K890/D965/F1038; N277/I601/M763/K890/E1007/F1038; N277/I601/K890/D965/E1007/F1038; N277/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038; G366/F539/M763/K890; G366/F539/K890/D965; G366/F539/K890/E1007; G366/F539/K890/F1038; G366/F539/M763/K890/D965; G366/F539/M763/K890/E1007; G366/F539/M763/K890/F1038; G366/F539/K890/D965/E1007; G366/F539/K890/D965/F1038; G366/F539/K890/E1007/F1038; G366/F539/M763/K890/D965/E1007; G366/F539/M763/K890/D965/F1038; G366/F539/M763/K890/E1007/F1038; G366/F539/K890/D965/E1007/F1038; G366/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038; G366/I601/M763/K890; G366/I601/K890/D965; G366/I601/K890/E1007; G366/I601/K890/F1038; G366/I601/M763/K890/D965; G366/I601/M763/K890/E1007; G366/I601/M763/K890/F1038; G366/I601/K890/D965/E1007; G366/I601/K890/D965/F1038; G366/I601/K890/E1007/F1038; G366/I601/M763/K890/D965/E1007; G366/I601/M763/K890/D965/F1038; G366/I601/M763/K890/E1007/F1038; G366/I601/K890/D965/E1007/F1038; G366/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038; F539/I601/M763/K890; F539/I601/K890/D965; F539/I601/K890/E1007; F539/I601/K890/F1038; F539/I601/M763/K890/D965; F539/I601/M763/K890/E1007; F539/I601/M763/K890/F1038; F539/I601/K890/D965/E1007; F539/I601/K890/D965/F1038; F539/I601/K890/E1007/F1038; F539/I601/M763/K890/D965/E1007; F539/I601/M763/K890/D965/F1038; F539/I601/M763/K890/E1007/F1038; F539/I601/K890/D965/E1007/F1038; 또는 F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/M763/K890; A203/N277/G366/K890/D965; A203/N277/G366/K890/E1007; A203/N277/G366/K890/F1038; A203/N277/G366/M763/K890/D965; A203/N277/G366/M763/K890/E1007; A203/N277/G366/M763/K890/F1038; A203/N277/G366/K890/D965/E1007; A203/N277/G366/K890/D965/F1038; A203/N277/G366/K890/E1007/F1038; A203/N277/G366/M763/K890/D965/E1007; A203/N277/G366/M763/K890/D965/F1038; A203/N277/G366/M763/K890/E1007/F1038; A203/N277/G366/K890/D965/E1007/F1038; A203/N277/G366/M763/K890/D965/E1007/F1038; A203/N277/F539/M763/K890; A203/N277/F539/K890/D965; A203/N277/F539/K890/E1007; A203/N277/F539/K890/F1038; A203/N277/F539/M763/K890/D965; A203/N277/F539/M763/K890/E1007; A203/N277/F539/M763/K890/F1038; A203/N277/F539/K890/D965/E1007; A203/N277/F539/K890/D965/F1038; A203/N277/F539/K890/E1007/F1038; A203/N277/F539/M763/K890/D965/E1007; A203/N277/F539/M763/K890/D965/F1038; A203/N277/F539/M763/K890/E1007/F1038; A203/N277/F539/K890/D965/E1007/F1038; A203/N277/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038; A203/N277/I601/M763/K890; A203/N277/I601/K890/D965; A203/N277/I601/K890/E1007; A203/N277/I601/K890/F1038; A203/N277/I601/M763/K890/D965; A203/N277/I601/M763/K890/E1007; A203/N277/I601/M763/K890/F1038; A203/N277/I601/K890/D965/E1007; A203/N277/I601/K890/D965/F1038; A203/N277/I601/K890/E1007/F1038; A203/N277/I601/M763/K890/D965/E1007; A203/N277/I601/M763/K890/D965/F1038; A203/N277/I601/M763/K890/E1007/F1038; A203/N277/I601/K890/D965/E1007/F1038; A203/N277/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038; A203/G366/F539/M763/K890; A203/G366/F539/K890/D965; A203/G366/F539/K890/E1007; A203/G366/F539/K890/F1038; A203/G366/F539/M763/K890/D965; A203/G366/F539/M763/K890/E1007; A203/G366/F539/M763/K890/F1038; A203/G366/F539/K890/D965/E1007; A203/G366/F539/K890/D965/F1038; A203/G366/F539/K890/E1007/F1038; A203/G366/F539/M763/K890/D965/E1007; A203/G366/F539/M763/K890/D965/F1038; A203/G366/F539/M763/K890/E1007/F1038; A203/G366/F539/K890/D965/E1007/F1038; A203/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038; A203/G366/I601/M763/K890; A203/G366/I601/K890/D965; A203/G366/I601/K890/E1007; A203/G366/I601/K890/F1038; A203/G366/I601/M763/K890/D965; A203/G366/I601/M763/K890/E1007; A203/G366/I601/M763/K890/F1038; A203/G366/I601/K890/D965/E1007; A203/G366/I601/K890/D965/F1038; A203/G366/I601/K890/E1007/F1038; A203/G366/I601/M763/K890/D965/E1007; A203/G366/I601/M763/K890/D965/F1038; A203/G366/I601/M763/K890/E1007/F1038; A203/G366/I601/K890/D965/E1007/F1038; A203/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038; A203/F539/I601/M763/K890; A203/F539/I601/K890/D965; A203/F539/I601/K890/E1007; A203/F539/I601/K890/F1038; A203/F539/I601/M763/K890/D965; A203/F539/I601/M763/K890/E1007; A203/F539/I601/M763/K890/F1038; A203/F539/I601/K890/D965/E1007; A203/F539/I601/K890/D965/F1038; A203/F539/I601/K890/E1007/F1038; A203/F539/I601/M763/K890/D965/E1007; A203/F539/I601/M763/K890/D965/F1038; A203/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038; A203/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038; A203/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038; N277/G366/F539/M763/K890; N277/G366/F539/K890/D965; N277/G366/F539/K890/E1007; N277/G366/F539/K890/F1038; N277/G366/F539/M763/K890/D965; N277/G366/F539/M763/K890/E1007; N277/G366/F539/M763/K890/F1038; N277/G366/F539/K890/D965/E1007; N277/G366/F539/K890/D965/F1038; N277/G366/F539/K890/E1007/F1038; N277/G366/F539/M763/K890/D965/E1007; N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038; N277/G366/F539/M763/K890/E1007/F1038; N277/G366/F539/K890/D965/E1007/F1038; N277/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038; N277/G366/I601/M763/K890; N277/G366/I601/K890/D965; N277/G366/I601/K890/E1007; N277/G366/I601/K890/F1038; N277/G366/I601/M763/K890/D965; N277/G366/I601/M763/K890/E1007; N277/G366/I601/M763/K890/F1038; N277/G366/I601/K890/D965/E1007; N277/G366/I601/K890/D965/F1038; N277/G366/I601/K890/E1007/F1038; N277/G366/I601/M763/K890/D965/E1007; N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038; N277/G366/I601/M763/K890/E1007/F1038; N277/G366/I601/K890/D965/E1007/F1038; N277/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038; G366/F539/I601/M763/K890; G366/F539/I601/K890/D965; G366/F539/I601/K890/E1007; G366/F539/I601/K890/F1038; G366/F539/I601/M763/K890/D965; G366/F539/I601/M763/K890/E1007; G366/F539/I601/M763/K890/F1038; G366/F539/I601/K890/D965/E1007; G366/F539/I601/K890/D965/F1038; G366/F539/I601/K890/E1007/F1038; G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007; G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038; G366/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038; G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038; 또는 G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539/M763/K890; A203/N277/G366/F539/K890/D965; A203/N277/G366/F539/K890/E1007; A203/N277/G366/F539/K890/F1038; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965; A203/N277/G366/F539/M763/K890/E1007; A203/N277/G366/F539/M763/K890/F1038; A203/N277/G366/F539/K890/D965/E1007; A203/N277/G366/F539/K890/D965/F1038; A203/N277/G366/F539/K890/E1007/F1038; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/E1007; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038; A203/N277/G366/F539/M763/K890/E1007/F1038; A203/N277/G366/F539/K890/D965/E1007/F1038; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038; A203/N277/G366/I601/M763/K890; A203/N277/G366/I601/K890/D965; A203/N277/G366/I601/K890/E1007; A203/N277/G366/I601/K890/F1038; A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965; A203/N277/G366/I601/M763/K890/E1007; A203/N277/G366/I601/M763/K890/F1038; A203/N277/G366/I601/K890/D965/E1007; A203/N277/G366/I601/K890/D965/F1038; A203/N277/G366/I601/K890/E1007/F1038; A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/E1007; A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038; A203/N277/G366/I601/M763/K890/E1007/F1038; A203/N277/G366/I601/K890/D965/E1007/F1038; A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038; N277/G366/F539/I601/M763/K890; N277/G366/F539/I601/K890/D965; N277/G366/F539/I601/K890/E1007; N277/G366/F539/I601/K890/F1038; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965; N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007; N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038; N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007; N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038; N277/G366/F539/I601/K890/E1007/F1038; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038; N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038; N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038; A203/G366/F539/I601/M763/K890; A203/G366/F539/I601/K890/D965; A203/G366/F539/I601/K890/E1007; A203/G366/F539/I601/K890/F1038; A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965; A203/G366/F539/I601/M763/K890/E1007; A203/G366/F539/I601/M763/K890/F1038; A203/G366/F539/I601/K890/D965/E1007; A203/G366/F539/I601/K890/D965/F1038; A203/G366/F539/I601/K890/E1007/F1038; A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007; A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038; A203/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038; A203/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038; A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038; A203/N277/F539/I601/M763/K890; A203/N277/F539/I601/K890/D965; A203/N277/F539/I601/K890/E1007; A203/N277/F539/I601/K890/F1038; A203/N277/F539/I601/M763/K890/D965; A203/N277/F539/I601/M763/K890/E1007; A203/N277/F539/I601/M763/K890/F1038; A203/N277/F539/I601/K890/D965/E1007; A203/N277/F539/I601/K890/D965/F1038; A203/N277/F539/I601/K890/E1007/F1038; A203/N277/F539/I601/M763/K890/D965/E1007; A203/N277/F539/I601/M763/K890/D965/F1038; A203/N277/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038; A203/N277/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038; A203/N277/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965; A203/N277/G366/F539/I601/K890/E1007; A203/N277/G366/F539/I601/K890/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/K890/E1007/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038; 또는 A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 셋 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/M763/T1102; A203/D965/T1102; A203/E1007/T1102; A203/F1038/T1102; A203/M763/D965/T1102; A203/M763/E1007/T1102; A203/M763/F1038/T1102; A203/D965/E1007/T1102; A203/D965/F1038/T1102; A203/E1007/F1038/T1102; A203/M763/D965/E1007/T1102; A203/M763/D965/F1038/T1102; A203/M763/E1007/F1038/T1102; A203/D965/E1007/F1038/T1102; A203/M763/D965/E1007/F1038/T1102; N277/M763/T1102; N277/D965/T1102; N277/E1007/T1102; N277/F1038/T1102; N277/M763/D965/T1102; N277/M763/E1007/T1102; N277/M763/F1038/T1102; N277/D965/E1007/T1102; N277/D965/F1038/T1102; N277/E1007/F1038/T1102; N277/M763/D965/E1007/T1102; N277/M763/D965/F1038/T1102; N277/M763/E1007/F1038/T1102; N277/D965/E1007/F1038/T1102; N277/M763/D965/E1007/F1038/T1102; G366/M763/T1102; G366/D965/T1102; G366/E1007/T1102; G366/F1038/T1102; G366/M763/D965/T1102; G366/M763/E1007/T1102; G366/M763/F1038/T1102; G366/D965/E1007/T1102; G366/D965/F1038/T1102; G366/E1007/F1038/T1102; G366/M763/D965/E1007/T1102; G366/M763/D965/F1038/T1102; G366/M763/E1007/F1038/T1102; G366/D965/E1007/F1038/T1102; G366/M763/D965/E1007/F1038/T1102; F539/M763/T1102; F539/D965/T1102; F539/E1007/T1102; F539/F1038/T1102; F539/M763/D965/T1102; F539/M763/E1007/T1102; F539/M763/F1038/T1102; F539/D965/E1007/T1102; F539/D965/F1038/T1102; F539/E1007/F1038/T1102; F539/M763/D965/E1007/T1102; F539/M763/D965/F1038/T1102; F539/M763/E1007/F1038/T1102; F539/D965/E1007/F1038/T1102; F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102; I601/M763/T1102; I601/D965/T1102; I601/E1007/T1102; I601/F1038/T1102; I601/M763/D965/T1102; I601/M763/E1007/T1102; I601/M763/F1038/T1102; I601/D965/E1007/T1102; I601/D965/F1038/T1102; I601/E1007/F1038/T1102; I601/M763/D965/E1007/T1102; I601/M763/D965/F1038/T1102; I601/M763/E1007/F1038/T1102; I601/D965/E1007/F1038/T1102; I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102; A203/M763/D1127; A203/D965/D1127; A203/E1007/D1127; A203/F1038/D1127; A203/M763/D965/D1127; A203/M763/E1007/D1127; A203/M763/F1038/D1127; A203/D965/E1007/D1127; A203/D965/F1038/D1127; A203/E1007/F1038/D1127; A203/M763/D965/E1007/D1127; A203/M763/D965/F1038/D1127; A203/M763/E1007/F1038/D1127; A203/D965/E1007/F1038/D1127; A203/M763/D965/E1007/F1038/D1127; N277/M763/D1127; N277/D965/D1127; N277/E1007/D1127; N277/F1038/D1127; N277/M763/D965/D1127; N277/M763/E1007/D1127; N277/M763/F1038/D1127; N277/D965/E1007/D1127; N277/D965/F1038/D1127; N277/E1007/F1038/D1127; N277/M763/D965/E1007/D1127; N277/M763/D965/F1038/D1127; N277/M763/E1007/F1038/D1127; N277/D965/E1007/F1038/D1127; N277/M763/D965/E1007/F1038/D1127; G366/M763/D1127; G366/D965/D1127; G366/E1007/D1127; G366/F1038/D1127; G366/M763/D965/D1127; G366/M763/E1007/D1127; G366/M763/F1038/D1127; G366/D965/E1007/D1127; G366/D965/F1038/D1127; G366/E1007/F1038/D1127; G366/M763/D965/E1007/D1127; G366/M763/D965/F1038/D1127; G366/M763/E1007/F1038/D1127; G366/D965/E1007/F1038/D1127; G366/M763/D965/E1007/F1038/D1127; F539/M763/D1127; F539/D965/D1127; F539/E1007/D1127; F539/F1038/D1127; F539/M763/D965/D1127; F539/M763/E1007/D1127; F539/M763/F1038/D1127; F539/D965/E1007/D1127; F539/D965/F1038/D1127; F539/E1007/F1038/D1127; F539/M763/D965/E1007/D1127; F539/M763/D965/F1038/D1127; F539/M763/E1007/F1038/D1127; F539/D965/E1007/F1038/D1127; F539/M763/D965/E1007/F1038/D1127; I601/M763/D1127; I601/D965/D1127; I601/E1007/D1127; I601/F1038/D1127; I601/M763/D965/D1127; I601/M763/E1007/D1127; I601/M763/F1038/D1127; I601/D965/E1007/D1127; I601/D965/F1038/D1127; I601/E1007/F1038/D1127; I601/M763/D965/E1007/D1127; I601/M763/D965/F1038/D1127; I601/M763/E1007/F1038/D1127; I601/D965/E1007/F1038/D1127; 또는 I601/M763/D965/E1007/F1038/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/M763/T1102/D1127; A203/D965/T1102/D1127; A203/E1007/T1102/D1127; A203/F1038/T1102/D1127; A203/M763/D965/T1102/D1127; A203/M763/E1007/T1102/D1127; A203/M763/F1038/T1102/D1127; A203/D965/E1007/T1102/D1127; A203/D965/F1038/T1102/D1127; A203/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/M763/D965/E1007/T1102/D1127; A203/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/M763/T1102/D1127; N277/D965/T1102/D1127; N277/E1007/T1102/D1127; N277/F1038/T1102/D1127; N277/M763/D965/T1102/D1127; N277/M763/E1007/T1102/D1127; N277/M763/F1038/T1102/D1127; N277/D965/E1007/T1102/D1127; N277/D965/F1038/T1102/D1127; N277/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/M763/D965/E1007/T1102/D1127; N277/M763/D965/F1038/T1102/D1127; N277/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/M763/T1102/D1127; G366/D965/T1102/D1127; G366/E1007/T1102/D1127; G366/F1038/T1102/D1127; G366/M763/D965/T1102/D1127; G366/M763/E1007/T1102/D1127; G366/M763/F1038/T1102/D1127; G366/D965/E1007/T1102/D1127; G366/D965/F1038/T1102/D1127; G366/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/M763/D965/E1007/T1102/D1127; G366/M763/D965/F1038/T1102/D1127; G366/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; F539/M763/T1102/D1127; F539/D965/T1102/D1127; F539/E1007/T1102/D1127; F539/F1038/T1102/D1127; F539/M763/D965/T1102/D1127; F539/M763/E1007/T1102/D1127; F539/M763/F1038/T1102/D1127; F539/D965/E1007/T1102/D1127; F539/D965/F1038/T1102/D1127; F539/E1007/F1038/T1102/D1127; F539/M763/D965/E1007/T1102/D1127; F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127; F539/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; F539/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; I601/M763/T1102/D1127; I601/D965/T1102/D1127; I601/E1007/T1102/D1127; I601/F1038/T1102/D1127; I601/M763/D965/T1102/D1127; I601/M763/E1007/T1102/D1127; I601/M763/F1038/T1102/D1127; I601/D965/E1007/T1102/D1127; I601/D965/F1038/T1102/D1127; I601/E1007/F1038/T1102/D1127; I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127; I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; 또는 I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/M763/T1102; A203/N277/D965/T1102; A203/N277/E1007/T1102; A203/N277/F1038/T1102; A203/N277/M763/D965/T1102; A203/N277/M763/E1007/T1102; A203/N277/M763/F1038/T1102; A203/N277/D965/E1007/T1102; A203/N277/D965/F1038/T1102; A203/N277/E1007/F1038/T1102; A203/N277/M763/D965/E1007/T1102; A203/N277/M763/D965/F1038/T1102; A203/N277/M763/E1007/F1038/T1102; A203/N277/D965/E1007/F1038/T1102; A203/N277/M763/D965/E1007/F1038/T1102; A203/G366/M763/T1102; A203/G366/D965/T1102; A203/G366/E1007/T1102; A203/G366/F1038/T1102; A203/G366/M763/D965/T1102; A203/G366/M763/E1007/T1102; A203/G366/M763/F1038/T1102; A203/G366/D965/E1007/T1102; A203/G366/D965/F1038/T1102; A203/G366/E1007/F1038/T1102; A203/G366/M763/D965/E1007/T1102; A203/G366/M763/D965/F1038/T1102; A203/G366/M763/E1007/F1038/T1102; A203/G366/D965/E1007/F1038/T1102; A203/G366/M763/D965/E1007/F1038/T1102; A203/F539/M763/T1102; A203/F539/D965/T1102; A203/F539/E1007/T1102; A203/F539/F1038/T1102; A203/F539/M763/D965/T1102; A203/F539/M763/E1007/T1102; A203/F539/M763/F1038/T1102; A203/F539/D965/E1007/T1102; A203/F539/D965/F1038/T1102; A203/F539/E1007/F1038/T1102; A203/F539/M763/D965/E1007/T1102; A203/F539/M763/D965/F1038/T1102; A203/F539/M763/E1007/F1038/T1102; A203/F539/D965/E1007/F1038/T1102; A203/F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102; A203/I601/M763/T1102; A203/I601/D965/T1102; A203/I601/E1007/T1102; A203/I601/F1038/T1102; A203/I601/M763/D965/T1102; A203/I601/M763/E1007/T1102; A203/I601/M763/F1038/T1102; A203/I601/D965/E1007/T1102; A203/I601/D965/F1038/T1102; A203/I601/E1007/F1038/T1102; A203/I601/M763/D965/E1007/T1102; A203/I601/M763/D965/F1038/T1102; A203/I601/M763/E1007/F1038/T1102; A203/I601/D965/E1007/F1038/T1102; A203/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102; N277/G366/M763/T1102; N277/G366/D965/T1102; N277/G366/E1007/T1102; N277/G366/F1038/T1102; N277/G366/M763/D965/T1102; N277/G366/M763/E1007/T1102; N277/G366/M763/F1038/T1102; N277/G366/D965/E1007/T1102; N277/G366/D965/F1038/T1102; N277/G366/E1007/F1038/T1102; 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G366/I601/M763/D965/F1038/D1127; G366/I601/M763/E1007/F1038/D1127; G366/I601/D965/E1007/F1038/D1127; G366/I601/M763/D965/E1007/F1038/D1127; F539/I601/M763/D1127; F539/I601/D965/D1127; F539/I601/E1007/D1127; F539/I601/F1038/D1127; F539/I601/M763/D965/D1127; F539/I601/M763/E1007/D1127; F539/I601/M763/F1038/D1127; F539/I601/D965/E1007/D1127; F539/I601/D965/F1038/D1127; F539/I601/E1007/F1038/D1127; F539/I601/M763/D965/E1007/D1127; F539/I601/M763/D965/F1038/D1127; F539/I601/M763/E1007/F1038/D1127; F539/I601/D965/E1007/F1038/D1127; 또는 F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/M763/T1102/D1127; A203/N277/D965/T1102/D1127; A203/N277/E1007/T1102/D1127; A203/N277/F1038/T1102/D1127; A203/N277/M763/D965/T1102/D1127; A203/N277/M763/E1007/T1102/D1127; A203/N277/M763/F1038/T1102/D1127; A203/N277/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/M763/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/M763/T1102/D1127; A203/G366/D965/T1102/D1127; A203/G366/E1007/T1102/D1127; A203/G366/F1038/T1102/D1127; A203/G366/M763/D965/T1102/D1127; A203/G366/M763/E1007/T1102/D1127; A203/G366/M763/F1038/T1102/D1127; A203/G366/D965/E1007/T1102/D1127; A203/G366/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/M763/D965/E1007/T1102/D1127; A203/G366/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/F539/M763/T1102/D1127; A203/F539/D965/T1102/D1127; A203/F539/E1007/T1102/D1127; A203/F539/F1038/T1102/D1127; A203/F539/M763/D965/T1102/D1127; A203/F539/M763/E1007/T1102/D1127; A203/F539/M763/F1038/T1102/D1127; A203/F539/D965/E1007/T1102/D1127; A203/F539/D965/F1038/T1102/D1127; A203/F539/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/F539/M763/D965/E1007/T1102/D1127; A203/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/F539/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/F539/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/I601/M763/T1102/D1127; A203/I601/D965/T1102/D1127; A203/I601/E1007/T1102/D1127; A203/I601/F1038/T1102/D1127; A203/I601/M763/D965/T1102/D1127; A203/I601/M763/E1007/T1102/D1127; A203/I601/M763/F1038/T1102/D1127; A203/I601/D965/E1007/T1102/D1127; A203/I601/D965/F1038/T1102/D1127; A203/I601/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127; A203/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/M763/T1102/D1127; N277/G366/D965/T1102/D1127; N277/G366/E1007/T1102/D1127; N277/G366/F1038/T1102/D1127; N277/G366/M763/D965/T1102/D1127; N277/G366/M763/E1007/T1102/D1127; N277/G366/M763/F1038/T1102/D1127; N277/G366/D965/E1007/T1102/D1127; N277/G366/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/M763/D965/E1007/T1102/D1127; N277/G366/M763/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/F539/M763/T1102/D1127; N277/F539/D965/T1102/D1127; N277/F539/E1007/T1102/D1127; N277/F539/F1038/T1102/D1127; N277/F539/M763/D965/T1102/D1127; N277/F539/M763/E1007/T1102/D1127; N277/F539/M763/F1038/T1102/D1127; N277/F539/D965/E1007/T1102/D1127; N277/F539/D965/F1038/T1102/D1127; N277/F539/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/F539/M763/D965/E1007/T1102/D1127; N277/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127; N277/F539/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/F539/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/I601/M763/T1102/D1127; N277/I601/D965/T1102/D1127; N277/I601/E1007/T1102/D1127; N277/I601/F1038/T1102/D1127; N277/I601/M763/D965/T1102/D1127; N277/I601/M763/E1007/T1102/D1127; N277/I601/M763/F1038/T1102/D1127; N277/I601/D965/E1007/T1102/D1127; N277/I601/D965/F1038/T1102/D1127; N277/I601/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127; N277/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; N277/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/F539/M763/T1102/D1127; G366/F539/D965/T1102/D1127; G366/F539/E1007/T1102/D1127; G366/F539/F1038/T1102/D1127; G366/F539/M763/D965/T1102/D1127; G366/F539/M763/E1007/T1102/D1127; G366/F539/M763/F1038/T1102/D1127; G366/F539/D965/E1007/T1102/D1127; G366/F539/D965/F1038/T1102/D1127; G366/F539/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/F539/M763/D965/E1007/T1102/D1127; G366/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127; G366/F539/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/F539/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/I601/M763/T1102/D1127; G366/I601/D965/T1102/D1127; G366/I601/E1007/T1102/D1127; G366/I601/F1038/T1102/D1127; G366/I601/M763/D965/T1102/D1127; G366/I601/M763/E1007/T1102/D1127; G366/I601/M763/F1038/T1102/D1127; G366/I601/D965/E1007/T1102/D1127; G366/I601/D965/F1038/T1102/D1127; G366/I601/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127; G366/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; G366/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; F539/I601/M763/T1102/D1127; F539/I601/D965/T1102/D1127; F539/I601/E1007/T1102/D1127; F539/I601/F1038/T1102/D1127; F539/I601/M763/D965/T1102/D1127; F539/I601/M763/E1007/T1102/D1127; F539/I601/M763/F1038/T1102/D1127; F539/I601/D965/E1007/T1102/D1127; F539/I601/D965/F1038/T1102/D1127; F539/I601/E1007/F1038/T1102/D1127; F539/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127; F539/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; 또는 F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/M763/T1102; A203/N277/G366/D965/T1102; A203/N277/G366/E1007/T1102; A203/N277/G366/F1038/T1102; A203/N277/G366/M763/D965/T1102; A203/N277/G366/M763/E1007/T1102; A203/N277/G366/M763/F1038/T1102; A203/N277/G366/D965/E1007/T1102; A203/N277/G366/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/M763/D965/E1007/T1102; A203/N277/G366/M763/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/M763/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/D965/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/M763/D965/E1007/F1038/T1102; A203/N277/F539/M763/T1102; A203/N277/F539/D965/T1102; A203/N277/F539/E1007/T1102; A203/N277/F539/F1038/T1102; A203/N277/F539/M763/D965/T1102; A203/N277/F539/M763/E1007/T1102; A203/N277/F539/M763/F1038/T1102; A203/N277/F539/D965/E1007/T1102; A203/N277/F539/D965/F1038/T1102; A203/N277/F539/E1007/F1038/T1102; A203/N277/F539/M763/D965/E1007/T1102; A203/N277/F539/M763/D965/F1038/T1102; A203/N277/F539/M763/E1007/F1038/T1102; A203/N277/F539/D965/E1007/F1038/T1102; A203/N277/F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102; A203/N277/I601/M763/T1102; A203/N277/I601/D965/T1102; A203/N277/I601/E1007/T1102; A203/N277/I601/F1038/T1102; A203/N277/I601/M763/D965/T1102; A203/N277/I601/M763/E1007/T1102; A203/N277/I601/M763/F1038/T1102; A203/N277/I601/D965/E1007/T1102; A203/N277/I601/D965/F1038/T1102; A203/N277/I601/E1007/F1038/T1102; A203/N277/I601/M763/D965/E1007/T1102; A203/N277/I601/M763/D965/F1038/T1102; A203/N277/I601/M763/E1007/F1038/T1102; A203/N277/I601/D965/E1007/F1038/T1102; A203/N277/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102; A203/G366/F539/M763/T1102; A203/G366/F539/D965/T1102; A203/G366/F539/E1007/T1102; A203/G366/F539/F1038/T1102; A203/G366/F539/M763/D965/T1102; A203/G366/F539/M763/E1007/T1102; A203/G366/F539/M763/F1038/T1102; A203/G366/F539/D965/E1007/T1102; A203/G366/F539/D965/F1038/T1102; A203/G366/F539/E1007/F1038/T1102; A203/G366/F539/M763/D965/E1007/T1102; A203/G366/F539/M763/D965/F1038/T1102; A203/G366/F539/M763/E1007/F1038/T1102; A203/G366/F539/D965/E1007/F1038/T1102; A203/G366/F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102; A203/G366/I601/M763/T1102; A203/G366/I601/D965/T1102; A203/G366/I601/E1007/T1102; A203/G366/I601/F1038/T1102; A203/G366/I601/M763/D965/T1102; A203/G366/I601/M763/E1007/T1102; A203/G366/I601/M763/F1038/T1102; A203/G366/I601/D965/E1007/T1102; A203/G366/I601/D965/F1038/T1102; A203/G366/I601/E1007/F1038/T1102; A203/G366/I601/M763/D965/E1007/T1102; A203/G366/I601/M763/D965/F1038/T1102; A203/G366/I601/M763/E1007/F1038/T1102; A203/G366/I601/D965/E1007/F1038/T1102; A203/G366/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102; A203/F539/I601/M763/T1102; A203/F539/I601/D965/T1102; A203/F539/I601/E1007/T1102; A203/F539/I601/F1038/T1102; A203/F539/I601/M763/D965/T1102; A203/F539/I601/M763/E1007/T1102; A203/F539/I601/M763/F1038/T1102; A203/F539/I601/D965/E1007/T1102; A203/F539/I601/D965/F1038/T1102; A203/F539/I601/E1007/F1038/T1102; A203/F539/I601/M763/D965/E1007/T1102; A203/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102; A203/F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102; A203/F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102; A203/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102; N277/G366/F539/M763/T1102; N277/G366/F539/D965/T1102; N277/G366/F539/E1007/T1102; N277/G366/F539/F1038/T1102; N277/G366/F539/M763/D965/T1102; N277/G366/F539/M763/E1007/T1102; N277/G366/F539/M763/F1038/T1102; N277/G366/F539/D965/E1007/T1102; N277/G366/F539/D965/F1038/T1102; N277/G366/F539/E1007/F1038/T1102; N277/G366/F539/M763/D965/E1007/T1102; N277/G366/F539/M763/D965/F1038/T1102; N277/G366/F539/M763/E1007/F1038/T1102; N277/G366/F539/D965/E1007/F1038/T1102; N277/G366/F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102; N277/G366/I601/M763/T1102; N277/G366/I601/D965/T1102; N277/G366/I601/E1007/T1102; N277/G366/I601/F1038/T1102; N277/G366/I601/M763/D965/T1102; N277/G366/I601/M763/E1007/T1102; N277/G366/I601/M763/F1038/T1102; N277/G366/I601/D965/E1007/T1102; N277/G366/I601/D965/F1038/T1102; N277/G366/I601/E1007/F1038/T1102; N277/G366/I601/M763/D965/E1007/T1102; N277/G366/I601/M763/D965/F1038/T1102; N277/G366/I601/M763/E1007/F1038/T1102; N277/G366/I601/D965/E1007/F1038/T1102; N277/G366/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102; G366/F539/I601/M763/T1102; G366/F539/I601/D965/T1102; G366/F539/I601/E1007/T1102; G366/F539/I601/F1038/T1102; G366/F539/I601/M763/D965/T1102; G366/F539/I601/M763/E1007/T1102; G366/F539/I601/M763/F1038/T1102; G366/F539/I601/D965/E1007/T1102; G366/F539/I601/D965/F1038/T1102; G366/F539/I601/E1007/F1038/T1102; G366/F539/I601/M763/D965/E1007/T1102; G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102; G366/F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102; G366/F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102; G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/M763/D1127; A203/N277/G366/D965/D1127; A203/N277/G366/E1007/D1127; A203/N277/G366/F1038/D1127; A203/N277/G366/M763/D965/D1127; A203/N277/G366/M763/E1007/D1127; A203/N277/G366/M763/F1038/D1127; A203/N277/G366/D965/E1007/D1127; A203/N277/G366/D965/F1038/D1127; A203/N277/G366/E1007/F1038/D1127; A203/N277/G366/M763/D965/E1007/D1127; A203/N277/G366/M763/D965/F1038/D1127; A203/N277/G366/M763/E1007/F1038/D1127; A203/N277/G366/D965/E1007/F1038/D1127; A203/N277/G366/M763/D965/E1007/F1038/D1127; A203/N277/F539/M763/D1127; A203/N277/F539/D965/D1127; A203/N277/F539/E1007/D1127; A203/N277/F539/F1038/D1127; A203/N277/F539/M763/D965/D1127; A203/N277/F539/M763/E1007/D1127; A203/N277/F539/M763/F1038/D1127; A203/N277/F539/D965/E1007/D1127; A203/N277/F539/D965/F1038/D1127; A203/N277/F539/E1007/F1038/D1127; A203/N277/F539/M763/D965/E1007/D1127; A203/N277/F539/M763/D965/F1038/D1127; A203/N277/F539/M763/E1007/F1038/D1127; A203/N277/F539/D965/E1007/F1038/D1127; A203/N277/F539/M763/D965/E1007/F1038/D1127; A203/N277/I601/M763/D1127; A203/N277/I601/D965/D1127; A203/N277/I601/E1007/D1127; A203/N277/I601/F1038/D1127; A203/N277/I601/M763/D965/D1127; A203/N277/I601/M763/E1007/D1127; A203/N277/I601/M763/F1038/D1127; A203/N277/I601/D965/E1007/D1127; A203/N277/I601/D965/F1038/D1127; A203/N277/I601/E1007/F1038/D1127; A203/N277/I601/M763/D965/E1007/D1127; A203/N277/I601/M763/D965/F1038/D1127; A203/N277/I601/M763/E1007/F1038/D1127; A203/N277/I601/D965/E1007/F1038/D1127; A203/N277/I601/M763/D965/E1007/F1038/D1127; A203/G366/F539/M763/D1127; A203/G366/F539/D965/D1127; A203/G366/F539/E1007/D1127; A203/G366/F539/F1038/D1127; A203/G366/F539/M763/D965/D1127; A203/G366/F539/M763/E1007/D1127; A203/G366/F539/M763/F1038/D1127; A203/G366/F539/D965/E1007/D1127; A203/G366/F539/D965/F1038/D1127; A203/G366/F539/E1007/F1038/D1127; A203/G366/F539/M763/D965/E1007/D1127; A203/G366/F539/M763/D965/F1038/D1127; A203/G366/F539/M763/E1007/F1038/D1127; A203/G366/F539/D965/E1007/F1038/D1127; A203/G366/F539/M763/D965/E1007/F1038/D1127; A203/G366/I601/M763/D1127; A203/G366/I601/D965/D1127; A203/G366/I601/E1007/D1127; A203/G366/I601/F1038/D1127; A203/G366/I601/M763/D965/D1127; A203/G366/I601/M763/E1007/D1127; A203/G366/I601/M763/F1038/D1127; A203/G366/I601/D965/E1007/D1127; A203/G366/I601/D965/F1038/D1127; A203/G366/I601/E1007/F1038/D1127; A203/G366/I601/M763/D965/E1007/D1127; A203/G366/I601/M763/D965/F1038/D1127; A203/G366/I601/M763/E1007/F1038/D1127; A203/G366/I601/D965/E1007/F1038/D1127; A203/G366/I601/M763/D965/E1007/F1038/D1127; A203/F539/I601/M763/D1127; A203/F539/I601/D965/D1127; A203/F539/I601/E1007/D1127; A203/F539/I601/F1038/D1127; A203/F539/I601/M763/D965/D1127; A203/F539/I601/M763/E1007/D1127; A203/F539/I601/M763/F1038/D1127; A203/F539/I601/D965/E1007/D1127; A203/F539/I601/D965/F1038/D1127; A203/F539/I601/E1007/F1038/D1127; A203/F539/I601/M763/D965/E1007/D1127; A203/F539/I601/M763/D965/F1038/D1127; A203/F539/I601/M763/E1007/F1038/D1127; A203/F539/I601/D965/E1007/F1038/D1127; A203/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/D1127; N277/G366/F539/M763/D1127; N277/G366/F539/D965/D1127; N277/G366/F539/E1007/D1127; N277/G366/F539/F1038/D1127; N277/G366/F539/M763/D965/D1127; N277/G366/F539/M763/E1007/D1127; N277/G366/F539/M763/F1038/D1127; N277/G366/F539/D965/E1007/D1127; N277/G366/F539/D965/F1038/D1127; N277/G366/F539/E1007/F1038/D1127; N277/G366/F539/M763/D965/E1007/D1127; N277/G366/F539/M763/D965/F1038/D1127; N277/G366/F539/M763/E1007/F1038/D1127; N277/G366/F539/D965/E1007/F1038/D1127; N277/G366/F539/M763/D965/E1007/F1038/D1127; N277/G366/I601/M763/D1127; N277/G366/I601/D965/D1127; N277/G366/I601/E1007/D1127; N277/G366/I601/F1038/D1127; N277/G366/I601/M763/D965/D1127; N277/G366/I601/M763/E1007/D1127; N277/G366/I601/M763/F1038/D1127; N277/G366/I601/D965/E1007/D1127; N277/G366/I601/D965/F1038/D1127; N277/G366/I601/E1007/F1038/D1127; N277/G366/I601/M763/D965/E1007/D1127; N277/G366/I601/M763/D965/F1038/D1127; N277/G366/I601/M763/E1007/F1038/D1127; N277/G366/I601/D965/E1007/F1038/D1127; N277/G366/I601/M763/D965/E1007/F1038/D1127; G366/F539/I601/M763/D1127; G366/F539/I601/D965/D1127; G366/F539/I601/E1007/D1127; G366/F539/I601/F1038/D1127; G366/F539/I601/M763/D965/D1127; G366/F539/I601/M763/E1007/D1127; G366/F539/I601/M763/F1038/D1127; G366/F539/I601/D965/E1007/D1127; G366/F539/I601/D965/F1038/D1127; G366/F539/I601/E1007/F1038/D1127; G366/F539/I601/M763/D965/E1007/D1127; G366/F539/I601/M763/D965/F1038/D1127; G366/F539/I601/M763/E1007/F1038/D1127; G366/F539/I601/D965/E1007/F1038/D1127; 또는 G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/M763/T1102/D1127; A203/N277/G366/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/M763/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/M763/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/M763/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/M763/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/T1102/D1127; A203/N277/F539/D965/T1102/D1127; A203/N277/F539/E1007/T1102/D1127; A203/N277/F539/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/D965/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/E1007/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/F539/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/T1102/D1127; A203/N277/I601/D965/T1102/D1127; A203/N277/I601/E1007/T1102/D1127; A203/N277/I601/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/D965/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/E1007/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/I601/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/T1102/D1127; A203/G366/F539/D965/T1102/D1127; A203/G366/F539/E1007/T1102/D1127; A203/G366/F539/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/D965/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/E1007/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/D965/E1007/T1102/D1127; A203/G366/F539/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/D965/E1007/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/T1102/D1127; A203/G366/I601/D965/T1102/D1127; A203/G366/I601/E1007/T1102/D1127; A203/G366/I601/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/D965/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/E1007/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/D965/E1007/T1102/D1127; A203/G366/I601/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/T1102/D1127; A203/F539/I601/D965/T1102/D1127; A203/F539/I601/E1007/T1102/D1127; A203/F539/I601/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/D965/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/E1007/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/D965/E1007/T1102/D1127; A203/F539/I601/D965/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/T1102/D1127; N277/G366/F539/D965/T1102/D1127; N277/G366/F539/E1007/T1102/D1127; N277/G366/F539/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/D965/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/E1007/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/D965/E1007/T1102/D1127; N277/G366/F539/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/D965/E1007/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/T1102/D1127; N277/G366/I601/D965/T1102/D1127; N277/G366/I601/E1007/T1102/D1127; N277/G366/I601/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/D965/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/E1007/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/D965/E1007/T1102/D1127; N277/G366/I601/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/T1102/D1127; G366/F539/I601/D965/T1102/D1127; G366/F539/I601/E1007/T1102/D1127; G366/F539/I601/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/D965/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/E1007/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/D965/E1007/T1102/D1127; G366/F539/I601/D965/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; 또는 G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539/M763/T1102; A203/N277/G366/F539/D965/T1102; A203/N277/G366/F539/E1007/T1102; A203/N277/G366/F539/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/D965/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/E1007/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/D965/E1007/T1102; A203/N277/G366/F539/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/D965/E1007/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/D965/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/T1102; A203/N277/G366/I601/D965/T1102; A203/N277/G366/I601/E1007/T1102; A203/N277/G366/I601/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/D965/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/E1007/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/D965/E1007/T1102; A203/N277/G366/I601/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/D965/E1007/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/D965/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102; N277/G366/F539/I601/M763/T1102; N277/G366/F539/I601/D965/T1102; N277/G366/F539/I601/E1007/T1102; N277/G366/F539/I601/F1038/T1102; N277/G366/F539/I601/M763/D965/T1102; N277/G366/F539/I601/M763/E1007/T1102; N277/G366/F539/I601/M763/F1038/T1102; N277/G366/F539/I601/D965/E1007/T1102; N277/G366/F539/I601/D965/F1038/T1102; N277/G366/F539/I601/E1007/F1038/T1102; N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/T1102; N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102; N277/G366/F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102; N277/G366/F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102; N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102; A203/G366/F539/I601/M763/T1102; A203/G366/F539/I601/D965/T1102; A203/G366/F539/I601/E1007/T1102; A203/G366/F539/I601/F1038/T1102; A203/G366/F539/I601/M763/D965/T1102; A203/G366/F539/I601/M763/E1007/T1102; A203/G366/F539/I601/M763/F1038/T1102; A203/G366/F539/I601/D965/E1007/T1102; A203/G366/F539/I601/D965/F1038/T1102; A203/G366/F539/I601/E1007/F1038/T1102; A203/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/T1102; A203/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102; A203/G366/F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102; A203/G366/F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102; A203/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102; A203/N277/F539/I601/M763/T1102; A203/N277/F539/I601/D965/T1102; A203/N277/F539/I601/E1007/T1102; A203/N277/F539/I601/F1038/T1102; A203/N277/F539/I601/M763/D965/T1102; A203/N277/F539/I601/M763/E1007/T1102; A203/N277/F539/I601/M763/F1038/T1102; A203/N277/F539/I601/D965/E1007/T1102; A203/N277/F539/I601/D965/F1038/T1102; A203/N277/F539/I601/E1007/F1038/T1102; A203/N277/F539/I601/M763/D965/E1007/T1102; A203/N277/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102; A203/N277/F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102; A203/N277/F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102; A203/N277/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/M763/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/D965/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/E1007/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/M763/E1007/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/M763/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/D965/E1007/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102; 또는 A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539/M763/D1127; A203/N277/G366/F539/D965/D1127; A203/N277/G366/F539/E1007/D1127; A203/N277/G366/F539/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/D965/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/E1007/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/D965/E1007/D1127; A203/N277/G366/F539/D965/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/E1007/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/D965/E1007/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/D965/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/E1007/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/D965/E1007/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/D965/E1007/F1038/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/D1127; A203/N277/G366/I601/D965/D1127; A203/N277/G366/I601/E1007/D1127; A203/N277/G366/I601/F1038/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/D965/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/E1007/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/F1038/D1127; A203/N277/G366/I601/D965/E1007/D1127; A203/N277/G366/I601/D965/F1038/D1127; A203/N277/G366/I601/E1007/F1038/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/D965/E1007/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/D965/F1038/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/E1007/F1038/D1127; A203/N277/G366/I601/D965/E1007/F1038/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/D965/E1007/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/D1127; N277/G366/F539/I601/D965/D1127; N277/G366/F539/I601/E1007/D1127; N277/G366/F539/I601/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/D965/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/E1007/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/D965/E1007/D1127; N277/G366/F539/I601/D965/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/E1007/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/E1007/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/D965/E1007/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/D1127; A203/G366/F539/I601/D965/D1127; A203/G366/F539/I601/E1007/D1127; A203/G366/F539/I601/F1038/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/D965/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/E1007/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/F1038/D1127; A203/G366/F539/I601/D965/E1007/D1127; A203/G366/F539/I601/D965/F1038/D1127; A203/G366/F539/I601/E1007/F1038/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/E1007/F1038/D1127; A203/G366/F539/I601/D965/E1007/F1038/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/D1127; A203/N277/F539/I601/D965/D1127; A203/N277/F539/I601/E1007/D1127; A203/N277/F539/I601/F1038/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/D965/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/E1007/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/F1038/D1127; A203/N277/F539/I601/D965/E1007/D1127; A203/N277/F539/I601/D965/F1038/D1127; A203/N277/F539/I601/E1007/F1038/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/D965/E1007/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/D965/F1038/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/E1007/F1038/D1127; A203/N277/F539/I601/D965/E1007/F1038/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/D965/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/E1007/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/E1007/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/D965/E1007/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/D965/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/E1007/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/E1007/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/D965/E1007/F1038/D1127; 또는 A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539/M763/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/D965/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/E1007/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/D965/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/E1007/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/D965/E1007/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/D965/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/E1007/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/D965/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/E1007/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/D965/E1007/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/D965/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/E1007/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/D965/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/E1007/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; 또는 A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 셋 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 제 3-1 영역 중 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763/K890/T1102; K890/D965/T1102; K890/E1007/T1102; K890/F1038/T1102; M763/K890/D1127; K890/D965/D1127; K890/E1007/D1127; K890/F1038/D1127; M763/K890/T1102/D1127; K890/D965/T1102/D1127; K890/E1007/T1102/D1127; 또는 K890/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763/K890/D965/T1102; M763/K890/E1007/T1102; M763/K890/F1038/T1102; K890/D965/E1007/T1102; K890/D965/F1038/T1102; K890/E1007/F1038/T1102; M763/K890/D965/D1127; M763/K890/E1007/D1127; M763/K890/F1038/D1127; K890/D965/E1007/D1127; K890/D965/F1038/D1127; K890/E1007/F1038/D1127; M763/K890/D965/T1102/D1127; M763/K890/E1007/T1102/D1127; M763/K890/F1038/T1102/D1127; K890/D965/E1007/T1102/D1127; K890/D965/F1038/T1102/D1127; 또는 K890/E1007/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763/K890/D965/E1007/T1102; M763/K890/D965/F1038/T1102; M763/K890/E1007/F1038/T1102; K890/D965/E1007/F1038/T1102; M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102; M763/K890/D965/E1007/D1127; M763/K890/D965/F1038/D1127; M763/K890/E1007/F1038/D1127; K890/D965/E1007/F1038/D1127; M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127; M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; 또는 M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 넷 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 넷 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 제 3-1 영역 중 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/M763/K890/T1102; A203/K890/D965/T1102; A203/K890/E1007/T1102; A203/K890/F1038/T1102; A203/M763/K890/D965/T1102; A203/M763/K890/E1007/T1102; A203/M763/K890/F1038/T1102; A203/K890/D965/E1007/T1102; A203/K890/D965/F1038/T1102; A203/K890/E1007/F1038/T1102; A203/M763/K890/D965/E1007/T1102; A203/M763/K890/D965/F1038/T1102; A203/M763/K890/E1007/F1038/T1102; A203/K890/D965/E1007/F1038/T1102; A203/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102; N277/M763/K890/T1102; N277/K890/D965/T1102; N277/K890/E1007/T1102; N277/K890/F1038/T1102; N277/M763/K890/D965/T1102; N277/M763/K890/E1007/T1102; N277/M763/K890/F1038/T1102; N277/K890/D965/E1007/T1102; N277/K890/D965/F1038/T1102; N277/K890/E1007/F1038/T1102; N277/M763/K890/D965/E1007/T1102; N277/M763/K890/D965/F1038/T1102; N277/M763/K890/E1007/F1038/T1102; N277/K890/D965/E1007/F1038/T1102; N277/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102; G366/M763/K890/T1102; G366/K890/D965/T1102; G366/K890/E1007/T1102; G366/K890/F1038/T1102; G366/M763/K890/D965/T1102; G366/M763/K890/E1007/T1102; G366/M763/K890/F1038/T1102; G366/K890/D965/E1007/T1102; G366/K890/D965/F1038/T1102; G366/K890/E1007/F1038/T1102; G366/M763/K890/D965/E1007/T1102; G366/M763/K890/D965/F1038/T1102; G366/M763/K890/E1007/F1038/T1102; G366/K890/D965/E1007/F1038/T1102; G366/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102; F539/M763/K890/T1102; F539/K890/D965/T1102; F539/K890/E1007/T1102; F539/K890/F1038/T1102; F539/M763/K890/D965/T1102; F539/M763/K890/E1007/T1102; F539/M763/K890/F1038/T1102; F539/K890/D965/E1007/T1102; F539/K890/D965/F1038/T1102; F539/K890/E1007/F1038/T1102; F539/M763/K890/D965/E1007/T1102; F539/M763/K890/D965/F1038/T1102; F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102; F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102; F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102; I601/M763/K890/T1102; I601/K890/D965/T1102; I601/K890/E1007/T1102; I601/K890/F1038/T1102; I601/M763/K890/D965/T1102; I601/M763/K890/E1007/T1102; I601/M763/K890/F1038/T1102; I601/K890/D965/E1007/T1102; I601/K890/D965/F1038/T1102; I601/K890/E1007/F1038/T1102; I601/M763/K890/D965/E1007/T1102; I601/M763/K890/D965/F1038/T1102; I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102; I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102; I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102; A203/M763/K890/D1127; A203/K890/D965/D1127; A203/K890/E1007/D1127; A203/K890/F1038/D1127; A203/M763/K890/D965/D1127; A203/M763/K890/E1007/D1127; A203/M763/K890/F1038/D1127; A203/K890/D965/E1007/D1127; A203/K890/D965/F1038/D1127; A203/K890/E1007/F1038/D1127; A203/M763/K890/D965/E1007/D1127; A203/M763/K890/D965/F1038/D1127; A203/M763/K890/E1007/F1038/D1127; A203/K890/D965/E1007/F1038/D1127; A203/M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127; N277/M763/K890/D1127; N277/K890/D965/D1127; N277/K890/E1007/D1127; N277/K890/F1038/D1127; N277/M763/K890/D965/D1127; N277/M763/K890/E1007/D1127; N277/M763/K890/F1038/D1127; N277/K890/D965/E1007/D1127; N277/K890/D965/F1038/D1127; N277/K890/E1007/F1038/D1127; N277/M763/K890/D965/E1007/D1127; N277/M763/K890/D965/F1038/D1127; N277/M763/K890/E1007/F1038/D1127; N277/K890/D965/E1007/F1038/D1127; N277/M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127; G366/M763/K890/D1127; G366/K890/D965/D1127; G366/K890/E1007/D1127; G366/K890/F1038/D1127; G366/M763/K890/D965/D1127; G366/M763/K890/E1007/D1127; G366/M763/K890/F1038/D1127; G366/K890/D965/E1007/D1127; G366/K890/D965/F1038/D1127; G366/K890/E1007/F1038/D1127; G366/M763/K890/D965/E1007/D1127; G366/M763/K890/D965/F1038/D1127; G366/M763/K890/E1007/F1038/D1127; G366/K890/D965/E1007/F1038/D1127; G366/M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127; F539/M763/K890/D1127; F539/K890/D965/D1127; F539/K890/E1007/D1127; F539/K890/F1038/D1127; F539/M763/K890/D965/D1127; F539/M763/K890/E1007/D1127; F539/M763/K890/F1038/D1127; F539/K890/D965/E1007/D1127; F539/K890/D965/F1038/D1127; F539/K890/E1007/F1038/D1127; F539/M763/K890/D965/E1007/D1127; F539/M763/K890/D965/F1038/D1127; F539/M763/K890/E1007/F1038/D1127; F539/K890/D965/E1007/F1038/D1127; F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127; I601/M763/K890/D1127; I601/K890/D965/D1127; I601/K890/E1007/D1127; I601/K890/F1038/D1127; I601/M763/K890/D965/D1127; I601/M763/K890/E1007/D1127; I601/M763/K890/F1038/D1127; I601/K890/D965/E1007/D1127; I601/K890/D965/F1038/D1127; I601/K890/E1007/F1038/D1127; I601/M763/K890/D965/E1007/D1127; I601/M763/K890/D965/F1038/D1127; I601/M763/K890/E1007/F1038/D1127; I601/K890/D965/E1007/F1038/D1127; 또는 I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/M763/K890/T1102/D1127; A203/K890/D965/T1102/D1127; A203/K890/E1007/T1102/D1127; A203/K890/F1038/T1102/D1127; A203/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/M763/K890/E1007/T1102/D1127; A203/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/M763/K890/T1102/D1127; N277/K890/D965/T1102/D1127; N277/K890/E1007/T1102/D1127; N277/K890/F1038/T1102/D1127; N277/M763/K890/D965/T1102/D1127; N277/M763/K890/E1007/T1102/D1127; N277/M763/K890/F1038/T1102/D1127; N277/K890/D965/E1007/T1102/D1127; N277/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; N277/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/M763/K890/T1102/D1127; G366/K890/D965/T1102/D1127; G366/K890/E1007/T1102/D1127; G366/K890/F1038/T1102/D1127; G366/M763/K890/D965/T1102/D1127; G366/M763/K890/E1007/T1102/D1127; G366/M763/K890/F1038/T1102/D1127; G366/K890/D965/E1007/T1102/D1127; G366/K890/D965/F1038/T1102/D1127; G366/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; G366/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; G366/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; F539/M763/K890/T1102/D1127; F539/K890/D965/T1102/D1127; F539/K890/E1007/T1102/D1127; F539/K890/F1038/T1102/D1127; F539/M763/K890/D965/T1102/D1127; F539/M763/K890/E1007/T1102/D1127; F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127; F539/K890/D965/E1007/T1102/D1127; F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127; F539/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; F539/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; I601/M763/K890/T1102/D1127; I601/K890/D965/T1102/D1127; I601/K890/E1007/T1102/D1127; I601/K890/F1038/T1102/D1127; I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127; I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127; I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; 또는 I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/M763/K890/T1102; A203/N277/K890/D965/T1102; A203/N277/K890/E1007/T1102; A203/N277/K890/F1038/T1102; A203/N277/M763/K890/D965/T1102; A203/N277/M763/K890/E1007/T1102; A203/N277/M763/K890/F1038/T1102; A203/N277/K890/D965/E1007/T1102; A203/N277/K890/D965/F1038/T1102; A203/N277/K890/E1007/F1038/T1102; A203/N277/M763/K890/D965/E1007/T1102; A203/N277/M763/K890/D965/F1038/T1102; A203/N277/M763/K890/E1007/F1038/T1102; A203/N277/K890/D965/E1007/F1038/T1102; A203/N277/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102; A203/G366/M763/K890/T1102; A203/G366/K890/D965/T1102; A203/G366/K890/E1007/T1102; A203/G366/K890/F1038/T1102; A203/G366/M763/K890/D965/T1102; A203/G366/M763/K890/E1007/T1102; A203/G366/M763/K890/F1038/T1102; A203/G366/K890/D965/E1007/T1102; A203/G366/K890/D965/F1038/T1102; A203/G366/K890/E1007/F1038/T1102; A203/G366/M763/K890/D965/E1007/T1102; A203/G366/M763/K890/D965/F1038/T1102; A203/G366/M763/K890/E1007/F1038/T1102; A203/G366/K890/D965/E1007/F1038/T1102; A203/G366/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102; A203/F539/M763/K890/T1102; A203/F539/K890/D965/T1102; A203/F539/K890/E1007/T1102; A203/F539/K890/F1038/T1102; A203/F539/M763/K890/D965/T1102; A203/F539/M763/K890/E1007/T1102; A203/F539/M763/K890/F1038/T1102; A203/F539/K890/D965/E1007/T1102; A203/F539/K890/D965/F1038/T1102; A203/F539/K890/E1007/F1038/T1102; A203/F539/M763/K890/D965/E1007/T1102; A203/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102; A203/F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102; A203/F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102; A203/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102; A203/I601/M763/K890/T1102; A203/I601/K890/D965/T1102; A203/I601/K890/E1007/T1102; A203/I601/K890/F1038/T1102; A203/I601/M763/K890/D965/T1102; A203/I601/M763/K890/E1007/T1102; A203/I601/M763/K890/F1038/T1102; A203/I601/K890/D965/E1007/T1102; A203/I601/K890/D965/F1038/T1102; A203/I601/K890/E1007/F1038/T1102; A203/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102; A203/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102; A203/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102; A203/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102; A203/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102; N277/G366/M763/K890/T1102; N277/G366/K890/D965/T1102; N277/G366/K890/E1007/T1102; N277/G366/K890/F1038/T1102; N277/G366/M763/K890/D965/T1102; N277/G366/M763/K890/E1007/T1102; N277/G366/M763/K890/F1038/T1102; N277/G366/K890/D965/E1007/T1102; N277/G366/K890/D965/F1038/T1102; N277/G366/K890/E1007/F1038/T1102; N277/G366/M763/K890/D965/E1007/T1102; N277/G366/M763/K890/D965/F1038/T1102; N277/G366/M763/K890/E1007/F1038/T1102; N277/G366/K890/D965/E1007/F1038/T1102; N277/G366/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102; N277/F539/M763/K890/T1102; N277/F539/K890/D965/T1102; N277/F539/K890/E1007/T1102; N277/F539/K890/F1038/T1102; N277/F539/M763/K890/D965/T1102; N277/F539/M763/K890/E1007/T1102; N277/F539/M763/K890/F1038/T1102; N277/F539/K890/D965/E1007/T1102; N277/F539/K890/D965/F1038/T1102; N277/F539/K890/E1007/F1038/T1102; N277/F539/M763/K890/D965/E1007/T1102; N277/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102; N277/F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102; N277/F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102; 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또는 F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/M763/K890/T1102/D1127; A203/N277/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/K890/E1007/T1102/D1127; A203/N277/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/M763/K890/E1007/T1102/D1127; A203/N277/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/M763/K890/T1102/D1127; A203/G366/K890/D965/T1102/D1127; A203/G366/K890/E1007/T1102/D1127; A203/G366/K890/F1038/T1102/D1127; A203/G366/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/G366/M763/K890/E1007/T1102/D1127; A203/G366/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/G366/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/G366/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/G366/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/F539/M763/K890/T1102/D1127; A203/F539/K890/D965/T1102/D1127; A203/F539/K890/E1007/T1102/D1127; A203/F539/K890/F1038/T1102/D1127; A203/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/F539/M763/K890/E1007/T1102/D1127; A203/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/F539/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/F539/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/F539/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/I601/M763/K890/T1102/D1127; A203/I601/K890/D965/T1102/D1127; A203/I601/K890/E1007/T1102/D1127; A203/I601/K890/F1038/T1102/D1127; A203/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127; A203/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/M763/K890/T1102/D1127; N277/G366/K890/D965/T1102/D1127; N277/G366/K890/E1007/T1102/D1127; N277/G366/K890/F1038/T1102/D1127; N277/G366/M763/K890/D965/T1102/D1127; N277/G366/M763/K890/E1007/T1102/D1127; N277/G366/M763/K890/F1038/T1102/D1127; N277/G366/K890/D965/E1007/T1102/D1127; N277/G366/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; N277/G366/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/F539/M763/K890/T1102/D1127; N277/F539/K890/D965/T1102/D1127; N277/F539/K890/E1007/T1102/D1127; N277/F539/K890/F1038/T1102/D1127; N277/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127; N277/F539/M763/K890/E1007/T1102/D1127; N277/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127; N277/F539/K890/D965/E1007/T1102/D1127; N277/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/F539/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/F539/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; N277/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/I601/M763/K890/T1102/D1127; N277/I601/K890/D965/T1102/D1127; N277/I601/K890/E1007/T1102/D1127; N277/I601/K890/F1038/T1102/D1127; N277/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; N277/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127; N277/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; N277/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127; N277/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; N277/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; 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G366/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; G366/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; G366/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; G366/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; F539/I601/M763/K890/T1102/D1127; F539/I601/K890/D965/T1102/D1127; F539/I601/K890/E1007/T1102/D1127; F539/I601/K890/F1038/T1102/D1127; F539/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; F539/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127; F539/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; F539/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127; F539/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; F539/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; F539/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; 또는 F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/M763/K890/T1102; A203/N277/G366/K890/D965/T1102; A203/N277/G366/K890/E1007/T1102; A203/N277/G366/K890/F1038/T1102; A203/N277/G366/M763/K890/D965/T1102; A203/N277/G366/M763/K890/E1007/T1102; A203/N277/G366/M763/K890/F1038/T1102; A203/N277/G366/K890/D965/E1007/T1102; A203/N277/G366/K890/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/K890/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/M763/K890/D965/E1007/T1102; A203/N277/G366/M763/K890/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/M763/K890/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/K890/D965/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102; A203/N277/F539/M763/K890/T1102; A203/N277/F539/K890/D965/T1102; A203/N277/F539/K890/E1007/T1102; A203/N277/F539/K890/F1038/T1102; A203/N277/F539/M763/K890/D965/T1102; A203/N277/F539/M763/K890/E1007/T1102; A203/N277/F539/M763/K890/F1038/T1102; A203/N277/F539/K890/D965/E1007/T1102; A203/N277/F539/K890/D965/F1038/T1102; A203/N277/F539/K890/E1007/F1038/T1102; A203/N277/F539/M763/K890/D965/E1007/T1102; 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A203/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/D1127; A203/F539/I601/K890/D965/D1127; A203/F539/I601/K890/E1007/D1127; A203/F539/I601/K890/F1038/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/D965/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/E1007/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/F1038/D1127; A203/F539/I601/K890/D965/E1007/D1127; A203/F539/I601/K890/D965/F1038/D1127; A203/F539/I601/K890/E1007/F1038/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/D1127; A203/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/D1127; N277/G366/F539/K890/D965/D1127; N277/G366/F539/K890/E1007/D1127; N277/G366/F539/K890/F1038/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/D965/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/E1007/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/F1038/D1127; N277/G366/F539/K890/D965/E1007/D1127; N277/G366/F539/K890/D965/F1038/D1127; N277/G366/F539/K890/E1007/F1038/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/E1007/F1038/D1127; N277/G366/F539/K890/D965/E1007/F1038/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/D1127; N277/G366/I601/K890/D965/D1127; N277/G366/I601/K890/E1007/D1127; N277/G366/I601/K890/F1038/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/D965/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/E1007/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/F1038/D1127; N277/G366/I601/K890/D965/E1007/D1127; N277/G366/I601/K890/D965/F1038/D1127; N277/G366/I601/K890/E1007/F1038/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/E1007/F1038/D1127; N277/G366/I601/K890/D965/E1007/F1038/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/D1127; G366/F539/I601/K890/D965/D1127; G366/F539/I601/K890/E1007/D1127; G366/F539/I601/K890/F1038/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/D965/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/E1007/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/F1038/D1127; G366/F539/I601/K890/D965/E1007/D1127; G366/F539/I601/K890/D965/F1038/D1127; G366/F539/I601/K890/E1007/F1038/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/D1127; G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/D1127; 또는 G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/M763/K890/T1102/D1127; A203/N277/G366/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/K890/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/M763/K890/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/K890/T1102/D1127; A203/N277/F539/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/F539/K890/E1007/T1102/D1127; A203/N277/F539/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/K890/E1007/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/K890/T1102/D1127; A203/N277/I601/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/I601/K890/E1007/T1102/D1127; A203/N277/I601/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/K890/T1102/D1127; A203/G366/F539/K890/D965/T1102/D1127; A203/G366/F539/K890/E1007/T1102/D1127; A203/G366/F539/K890/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/K890/E1007/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/G366/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/K890/T1102/D1127; A203/G366/I601/K890/D965/T1102/D1127; A203/G366/I601/K890/E1007/T1102/D1127; A203/G366/I601/K890/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/G366/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/T1102/D1127; A203/F539/I601/K890/D965/T1102/D1127; A203/F539/I601/K890/E1007/T1102/D1127; A203/F539/I601/K890/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/T1102/D1127; N277/G366/F539/K890/D965/T1102/D1127; N277/G366/F539/K890/E1007/T1102/D1127; N277/G366/F539/K890/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/E1007/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/K890/D965/E1007/T1102/D1127; N277/G366/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/T1102/D1127; N277/G366/I601/K890/D965/T1102/D1127; N277/G366/I601/K890/E1007/T1102/D1127; N277/G366/I601/K890/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127; N277/G366/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/T1102/D1127; G366/F539/I601/K890/D965/T1102/D1127; G366/F539/I601/K890/E1007/T1102/D1127; G366/F539/I601/K890/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127; G366/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; 또는 G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539/M763/K890/T1102; A203/N277/G366/F539/K890/D965/T1102; A203/N277/G366/F539/K890/E1007/T1102; A203/N277/G366/F539/K890/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/K890/E1007/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/K890/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/K890/D965/E1007/T1102; A203/N277/G366/F539/K890/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/K890/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/K890/T1102; A203/N277/G366/I601/K890/D965/T1102; A203/N277/G366/I601/K890/E1007/T1102; A203/N277/G366/I601/K890/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/K890/E1007/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/K890/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/K890/D965/E1007/T1102; 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A203/G366/F539/I601/K890/D965/T1102; A203/G366/F539/I601/K890/E1007/T1102; A203/G366/F539/I601/K890/F1038/T1102; A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/T1102; A203/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/T1102; A203/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102; A203/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/T1102; A203/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102; A203/G366/F539/I601/K890/E1007/F1038/T1102; A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102; A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102; A203/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102; A203/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102; A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102; N277/G366/F539/I601/M763/K890/T1102; N277/G366/F539/I601/K890/D965/T1102; N277/G366/F539/I601/K890/E1007/T1102; N277/G366/F539/I601/K890/F1038/T1102; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/T1102; N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/T1102; N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102; N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/T1102; N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102; N277/G366/F539/I601/K890/E1007/F1038/T1102; 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A203/G366/F539/I601/K890/F1038/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/D1127; A203/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/D1127; A203/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/D1127; A203/G366/F539/I601/K890/E1007/F1038/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/D1127; A203/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/D965/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/E1007/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/E1007/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/E1007/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/E1007/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/D1127; 또는 A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539/M763/K890/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/K890/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/K890/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/K890/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/K890/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/K890/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/K890/E1007/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/K890/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/K890/D965/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/K890/E1007/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/K890/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/D965/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/E1007/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; 또는 A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 제거시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697; 제 2 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039; 제 3 영역 중 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, V838, D839, H840, K848, D849, D850, D853, N854, K855, R859, D861, K862, N863, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, A889, K890, L891, R895, K896 및 D898; 및/또는 제 4 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 제거시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시킨 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203(소수성 지표: 1.8)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203(소수성 지표: 1.8)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아스파르트산(소수성 지표: -3.5)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 중 G366(소수성 지표: -0.4)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘, 라이신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 중 G366(소수성 지표: -0.4)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 I601(소수성 지표: 4.5)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 I601(소수성 지표: 4.5)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아스파라긴(소수성 지표: -3.5)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 A203(소수성 지표: 1.8), G366(소수성 지표: -0.4), F539(소수성 지표: 2.8) 및 I601(소수성 지표: 4.5)를 각각 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203(소수성 지표: 1.8)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아스파르트산(소수성 지표: -3.5)으로 치환하고, 제 1-2 영역 중 G366(소수성 지표: -0.4)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환하고, 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환하고, 제 1-3 영역 중 I601(소수성 지표: 4.5)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아스파라긴(소수성 지표: -3.5)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 N277(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 알라닌, 시스테인, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 N277(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 히스티딘(소수성 지표: -3.2)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작거나 큰 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 A203(소수성 지표: 1.8), N277(소수성 지표: -3.5), G366(소수성 지표: -0.4), F539(소수성 지표: 2.8) 및 I601(소수성 지표: 4.5)를 각각 상대적으로 소수성 지표가 작거나 큰 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203(소수성 지표: 1.8)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아스파르트산(소수성 지표: -3.5)으로 치환하고, 제 1-1 영역 중 N277(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 히스티딘(소수성 지표: -3.2)으로 치환하고, 제 1-2 영역 중 G366(소수성 지표: -0.4)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환하고, 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환하고, 제 1-3 영역 중 I601(소수성 지표: 4.5)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아스파라긴(소수성 지표: -3.5)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539를 상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539를 상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산인 아스파르트산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 상대적으로 작거나 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 A203, N277, G366, F539 및 I601를 각각 상대적으로 작거나 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203 및 N277, 제 1-2 영역 중 G366, 제 1-3 영역 중 I601을 각각 상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산인 아스파르트산, 히스티딘, 세린, 아스파라긴으로 치환시키고, 제 1-3 영역 중 F539를 상대적으로 작은 기능기를 가지는 세린으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 시스테인, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 중 D965(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 알라닌, 시스테인, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 중 D965(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 타이로신(소수성 지표: -1.3)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-4 영역 중 E1007(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 알라닌, 시스테인, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-4 영역 중 E1007(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 류신(소수성 지표: 3.8)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 및 제 2-4 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9) 및 E1007(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시키고, 제 2-4 영역 중 E1007(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 류신(소수성 지표: 3.8)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-4 영역 중 F1037 및/또는 F1038을 각각 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-4 영역 중 F1038(소수성 지표: 2.8)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 타이로신(소수성 지표: -1.3)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 소수성 지표가 작거나 큰 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9), D965(소수성 지표: -3.5) 및 F1038(소수성 지표: 2.8)을 상대적으로 소수성 지표가 작거나 큰 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시키고, 제 2-3 영역 중 D965(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 타이로신(소수성 지표: -1.3)으로 치환시키고, 제 2-4 영역 중 F1038(소수성 지표: 2.8)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 타이로신(소수성 지표: -1.3)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, V838, D839, H840, K848, D849, D850, D853, N854, K855, R859, D861, K862, N863, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, A889, K890, L891, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K890(소수성 지표: -3.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K890(소수성 지표: -3.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아스파라긴(소수성 지표: -3.5)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, V838, D839, H840, K848, D849, D850, D853, N854, K855, R859, D861, K862, N863, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, A889, K890, L891, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 전하를 가지지 않는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 글루타민으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, V838, D839, H840, K848, D849, D850, D853, N854, K855, R859, D861, K862, N863, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, A889, K890, L891, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K890 및/또는 K896을 각각 상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글리신, 아이소류신, 류신, 프롤린, 세린, 트레오닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K890을 상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산인 아스파르트산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K896을 상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 라이신, 프롤린, 세린, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102(소수성 지표: -0.7)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 프롤린(소수성 지표: -1.6)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 S1106을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 알라닌, 시스테인, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 S1106(소수성 지표: -0.8)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 글리신(소수성 지표: -0.4)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작거나 큰 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102 및 S1136을 각각 상대적으로 소수성 지표가 작거나 큰 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102(소수성 지표: -0.7)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 프롤린(소수성 지표: -1.6)으로 치환시키고, S1106(소수성 지표: -0.8)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 글리신(소수성 지표: -0.4)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102을 상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102을 상대적으로 작은 기능기를 가지는 프롤린으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 D1127을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 D1127을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 글루탐산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 상대적으로 작거나 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102 및 D1127을 상대적으로 작거나 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102을 상대적으로 작은 기능기를 가지는 프롤린으로 치환시키고, D1127을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 글루탐산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
이때, 각 영역에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 치환 관련 설명은 상기 기술한 바와 같다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9) 및/또는 A764(소수성 지표: 1.8)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 시스테인, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환시키고, 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 I601(소수성 지표: 4.5)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 2-3 영역 중 D965(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 알라닌, 시스테인, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 I601(소수성 지표: 4.5)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아스파라긴(소수성 지표: -3.5)으로 치환시키고, 제 2-3 영역 중 D965(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 타이로신(소수성 지표: -1.3)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9) 및/또는 A764(소수성 지표: 1.8)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 시스테인, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키며; 제 2-4 영역 중 E1107(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 알라닌, 시스테인, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환시키고, 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시키며, 제 2-4 영역 중 E1007(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 류신(소수성 지표: 3.8)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환시키고, 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539 및/또는 I601을 각각 극성을 가지는 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘, 라이신, 세린, 트레오닌 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 3-1 영역 중 K890(소수성 지표: -3.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539 및 I601을 각각 극성을 가지는 아미노산인 트레오닌 및 글루탐산으로 치환시키고, 제 3-1 영역 중 K890(소수성 지표: -3.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아스파라긴(소수성 지표: -3.5)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203(소수성 지표: 1.8)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 4-1 영역 중 T1102을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 라이신, 프롤린, 세린, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203(소수성 지표: 1.8)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아스파르트산(소수성 지표: -3.5)으로 치환시키고, 제 4-1 영역 중 T1102(소수성 지표: -0.7)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 프롤린(소수성 지표: -1.6)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 4-1 영역 중 D1127을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환시키고, 제 4-1 영역 중 D1127을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 글루탐산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9) 및/또는 A764(소수성 지표: 1.8)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 시스테인, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시키고, 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-4 영역 중 E1007 및 제 3-1 영역 중 K890을 각각 전하를 가지지 않는 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 E1007을 전하를 가지지 않는 아미노산인 프롤린으로 치환시키고, 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9) 및/또는 제 2-4 영역 중 E1007(소수성 지표: -3.5)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 시스테인, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 및 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시키고, 제 2-4 영역 중 E1007을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 류신(소수성 지표: 3.8)으로 치환시키고, 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9) 및/또는 A764(소수성 지표: 1.8)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 시스테인, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 4-1 영역 중 T1102을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 라이신, 프롤린, 세린, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시키고, 제 4-1 영역 중 T1102(소수성 지표: -0.7)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 프롤린(소수성 지표: -1.6)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-4 영역 중 F1037 및/또는 F1038을 각각 극성을 가지는 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘, 라이신, 세린, 트레오닌 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 4-1 영역 중 D1127을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-4 영역 중 F1038을 극성을 가지는 아미노산인 타이로신으로 치환시키고, 제 4-1 영역 중 D1127을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 글루탐산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 4-1 영역 중 T1102을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 라이신, 프롤린, 세린, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시키고, 제 4-1 영역 중 T1102(소수성 지표: -0.7)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 프롤린(소수성 지표: -1.6)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K890(소수성 지표: -3.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 4-1 영역 중 D1127을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K890(소수성 지표: -3.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아스파라긴(소수성 지표: -3.5)으로 치환시키고, 제 4-1 영역 중 D1127을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 글루탐산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 제 3 영역; 및/또는 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9) 및/또는 제 2-4 영역 중 E1007(소수성 지표: -3.5)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 시스테인, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 및 제 3-1 영역 중 K890(소수성 지표: -3.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환시키고, 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9) 및 제 2-4 영역 중 E1007(소수성 지표: -3.5)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5) 및 류신(소수성 지표: 3.8)으로 치환시키고, 및 제 3-1 영역 중 K890(소수성 지표: -3.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아스파라긴(소수성 지표: -3.5)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539 및/또는 I601; 및 제 2-4 영역 중 F1037 및/또는 F1038을 각각 극성을 가지는 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘, 라이신, 세린, 트레오닌 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 및 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 4-1 영역 중 T1102을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 라이신, 프롤린, 세린, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539를 극성을 가지는 아미노산인 세린으로 치환시키고, 제 2-4 영역 중 F1038을 극성을 가지는 아미노산인 타이로신으로 치환시키고, 및 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시키고, 제 4-1 영역 중 T1102을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 프롤린(소수성 지표: -1.6)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 I601을 극성을 가지는 아미노산인 글루탐산으로 치환시키고, 제 2-4 영역 중 F1038을 극성을 가지는 아미노산인 타이로신으로 치환시키고, 및 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시키고, 제 4-1 영역 중 T1102을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 프롤린(소수성 지표: -1.6)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539 및 중 I601을 각각 극성을 가지는 아미노산인 세린 및 아스파라긴으로 치환시키고, 제 2-4 영역 중 F1038을 극성을 가지는 아미노산인 타이로신으로 치환시키고, 및 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시키고, 제 4-1 영역 중 T1102을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 프롤린(소수성 지표: -1.6)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539 및/또는 I601을 각각 극성을 가지는 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘, 라이신, 세린, 트레오닌 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9) 및/또는 제 2-4 영역 중 E1007(소수성 지표: -3.5)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 시스테인, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 및 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 I601을 극성을 가지는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시키고, 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시키고, 및 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539 및 중 I601을 각각 극성을 가지는 아미노산인 세린 및 아스파라긴으로 치환시키고, 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9) 및 제 2-4 영역 중 E1007(소수성 지표: -3.5)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5) 및 류신(소수성 지표: 3.8)으로 치환시키고, 및 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203(소수성 지표: 1.8)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9) 및/또는 A764(소수성 지표: 1.8)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 시스테인, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 및 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203(소수성 지표: 1.8)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아스파르트산(소수성 지표: -3.5)으로 치환시키고, 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시키고, 제 2-4 영역 중 F1038을 극성을 가지는 아미노산인 타이로신으로 치환시키고, 및 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 I601(소수성 지표: 4.5)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 2-3 영역 중 D965(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 알라닌, 시스테인, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 및 제 4-1 영역 중 T1102을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 라이신, 프롤린, 세린, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 I601(소수성 지표: 4.5)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아스파라긴(소수성 지표: -3.5)으로 치환시키고, 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시키고, 제 2-3 영역 중 D965(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 타이로신(소수성 지표: -1.3)으로 치환시키고, 및 제 4-1 영역 중 T1102(소수성 지표: -0.7)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 프롤린(소수성 지표: -1.6)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203, N277; 제 1-2 영역 중 G366; 및 제 1-3 영역 중 F539, I601로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 작거나 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시키고; 제 2-2 영역 중 M763 및 제 2-4 영역 중 E1007, F1038로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 상대적으로 작거나 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시키고; 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않은 아미노산으로 치환시키고, 제 4-1 영역 중 T1102 및 D1127로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 작거나 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 G366 및 제 1-3 영역 중 F539, I601을 각각 세린(상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산), 세린(상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산) 및 아스파라긴(상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산)으로 치환시키고, 제 2-2 영역 중 M763 및 제 2-4 영역 중 E1007을 각각 아이소류신(상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산) 및 류신(상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산)으로 치환시키고, 제 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않은 아스파라긴으로 치환시키고, 제 4-1 영역 중 D1127을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 글루탐산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203, N277, 제 1-3 영역 중 G366 및 제 1-3 영역 중 F539, I601을 각각 아스파르트산(상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산), 히스티딘(상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산), 세린(상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산), 세린(상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산) 및 아스파라긴(상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산)으로 치환시키고, 제 2-2 영역 중 M763 및 제 2-4 영역 중 E1007, F1038을 각각 아이소류신(상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산), 류신(상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산) 및 타이로신(상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산)으로 치환시키고, 제 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않은 아스파라긴으로 치환시키고, 제 4-1 영역 중 T1102 및 D1127을 각각 프롤린(상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산) 및 글루탐산(상댁적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 TS-SpCas9의 일 실시예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539, M763, K890 및/또는 E1007을 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539을 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539을 세린으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 상기 F539을 세린으로 치환시킨 TS-SpCas9(F539S)는 야생형 SpCas9와 비교하여 SpCas9(F539S)의 REC 도메인과 표적 서열 및/또는 gRNA의 PAM distal end와의 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763을 시스테인, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763을 아이소류신으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 상기 M763을 아이소류신으로 치환시킨 TS-SpCas9(M763I)는 야생형 SpCas9과 비교하여 SpCas9(M763I)의 RuvC 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 K890을 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 K890을 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 상기 K890을 아스파라긴으로 치환시킨 TS-SpCas9(K890N)는 야생형 SpCas9과 비교하여 SpCas9(K890N)의 HNH 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 E1007을 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 E1007을 류신으로 치환시킨 SpCas9 변이체(서열번호 28)일 수 있다. 이때, 상기 E1007을 류신으로 치환시킨 TS-SpCas9(E1007L)은 야생형 SpCas9과 비교하여 SpCas9(E1007L)의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)와 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM(Protospacer adjacent motif)과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체이다.
예를 들어, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 E1007을 프롤린으로 치환시킨 SpCas9 변이체(서열번호 29)일 수 있다. 이때, 상기 E1007을 프롤린으로 치환시킨 TS-SpCas9(E1007P)은 야생형 SpCas9과 비교하여 SpCas9(E1007P)의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)와 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM(Protospacer adjacent motif)과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체이다.
다른 일 구현예로서, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539 및 M763을 각각 원래의 아미노산과다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539 및 M763을 각각 세린 및 아이소류신으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 상기 F539 및 M763을 각각 세린 및 아이소류신으로 치환시킨 TS-SpCas9(F539S, M763I)는 야생형 SpCas9와 비교하여 SpCas9(F539S, M763I)의 REC 도메인과 표적 서열 및/또는 gRNA의 PAM distal end와의 상호작용이 변화되고, SpCas9(F539S, M763I)의 RuvC 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예로서, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539 및 K890을 각각 원래의 아미노산과다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539 및 K890을 각각 세린 및 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 상기 F539 및 K890을 각각 세린 및 아스파라긴으로 치환시킨 TS-SpCas9(F539S, K890N)는 야생형 SpCas9와 비교하여 SpCas9(F539S, K890N)의 REC 도메인과 표적 서열 및/또는 gRNA의 PAM distal end와의 상호작용이 변화되고, SpCas9(F539S, K890N)의 HNH 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예로서, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539 및 E1007을 각각 원래의 아미노산과다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539 및 E1007을 각각 세린 및 류신으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 상기 F539 및 E1007을 각각 세린 및 류신으로 치환시킨 TS-SpCas9(F539S, E1007L)는 야생형 SpCas9와 비교하여 SpCas9(F539S, E1007L)의 REC 도메인과 표적 서열 및/또는 gRNA의 PAM distal end와의 상호작용이 변화되고, SpCas9(F539S, E1007L)의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)와 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM(Protospacer adjacent motif)과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체이다.
다른 일 구현예로서, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763 및 K890을 각각 원래의 아미노산과다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산은 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763 및 K890을 각각 아이소류신 및 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 상기 M763 및 K890을 각각 아이소류신 및 아스파라긴으로 치환시킨 TS-SpCas9(M763I, K890N)는 야생형 SpCas9와 비교하여 SpCas9(M763I, K890N)의 RuvC 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화되고, SpCas9(M763I, K890N)의 HNH 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예로서, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763 및 E1007을 각각 원래의 아미노산과다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산은 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763 및 E1007을 각각 아이소류신 및 류신으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 상기 M763 및 E1007을 각각 아이소류신 및 류신으로 치환시킨 TS-SpCas9(M763I, E1007L)는 야생형 SpCas9와 비교하여 SpCas9(M763I, E1007L)의 RuvC 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화되고, SpCas9(M763I, E1007L)의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)와 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM(Protospacer adjacent motif)과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체이다.
또 다른 일 구현예로서, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 K890 및 E1007을 각각 원래의 아미노산과다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산은 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 K890 및 E1007을 각각 아스파라긴 및 류신으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 상기 K890 및 E1007을 각각 아스파라긴 및 류신으로 치환시킨 TS-SpCas9(K890N, E1007L)는 야생형 SpCas9와 비교하여 SpCas9(K890N, E1007L)의 HNH 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화되고, SpCas9(K890N, E1007L)의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)와 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM(Protospacer adjacent motif)과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체이다.
일 구현예로서, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539, M763 및 K890을 각각 원래의 아미노산과다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 아미노산일 수 있다.)
예를 들어, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539, M763 및 K890을 각각 세린, 아이소류신 및 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체(서열번호 30)일 수 있다. 이때, 상기 F539, M763 및 K890을 각각 세린, 아이소류신 및 아스파라긴으로 치환시킨 TS-SpCas9(F539S, M763I, K890N)는 야생형 SpCas9와 비교하여 SpCas9(F539S, M763I, K890N)의 REC 도메인과 표적 서열 및/또는 gRNA의 PAM distal end와의 상호작용이 변화되고, SpCas9(F539S, M763I, K890N)의 RuvC 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화되고, SpCas9(F539S, M763I, K890N)의 HNH 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539, M763 및 E1007을 각각 원래의 아미노산과다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 아미노산일 수 있다.)
예를 들어, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539, M763 및 E1007을 각각 세린, 아이소류신 및 류신으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 상기 F539, M763 및 E1007을 각각 세린, 아이소류신 및 류신으로 치환시킨 TS-SpCas9(F539S, M763I, E1007L)는 야생형 SpCas9와 비교하여 SpCas9(F539S, M763I, E1007L)의 REC 도메인과 표적 서열 및/또는 gRNA의 PAM distal end와의 상호작용이 변화되고, SpCas9(F539S, M763I, E1007L)의 RuvC 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화되고, SpCas9(F539S, M763I, E1007L)의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)와 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM(Protospacer adjacent motif)과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체이다.
다른 일 구현예로서, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763, K890 및 E1007을 각각 원래의 아미노산과다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 아미노산일 수 있다.)
예를 들어, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763, K890 및 E1007을 각각 아이소류신, 아스파라긴 및 류신으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 상기 M763, K890 및 E1007을 각각 아스파라긴, 아이소류신 및 류신으로 치환시킨 TS-SpCas9(M763I, K890N, E1007L)는 야생형 SpCas9와 비교하여 SpCas9(M763I, K890N, E1007L)의 RuvC 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화되고, SpCas9(M763I, K890N, E1007L)의 HNH 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화되고, SpCas9(M763I, K890N, E1007L)의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)와 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM(Protospacer adjacent motif)과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체이다.
또 다른 일 구현예로서, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539, K890 및 E1007을 각각 원래의 아미노산과다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 아미노산일 수 있다.)
예를 들어, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539, K890 및 E1007을 각각 세린, 아스파라긴 및 류신으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 상기 F539, K890 및 E1007을 각각 세린, 아스파라긴 및 류신으로 치환시킨 TS-SpCas9(F539S, K890N, E1007L)는 야생형 SpCas9와 비교하여 SpCas9(F539S, K890N, E1007L)의 REC 도메인과 표적 서열 및/또는 gRNA의 PAM distal end와의 상호작용이 변화되고, SpCas9(F539S, K890N, E1007L)의 HNH 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화되고, SpCas9(F539S, K890N, E1007L)의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)와 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM(Protospacer adjacent motif)과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체이다.
다른 일 구현예로서, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539, M763, K890 및 E1007을 각각 원래의 아미노산과다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 아미노산일 수 있다.)
예를 들어, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539, M763, K890 및 E1007을 각각 세린, 아이소류신, 아스파라긴 및 류신으로 치환시킨 SpCas9 변이체(서열번호 31)일 수 있다. 이때, 상기 F539, M763, K890 및 E1007을 각각 세린, 아스파라긴, 아이소류신 및 류신으로 치환시킨 TS-SpCas9(F539S, M763I, K890N, E1007L)는 야생형 SpCas9와 비교하여 SpCas9(F539S, M763I, K890N, E1007L)의 REC 도메인과 표적 서열 및/또는 gRNA의 PAM distal end와의 상호작용이 변화되고, SpCas9(F539S, M763I, K890N, E1007L)의 RuvC 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화되고, SpCas9(F539S, M763I, K890N, E1007L)의 HNH 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화되고, SpCas9(F539S, M763I, K890N, E1007L)의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)와 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM(Protospacer adjacent motif)과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체이다.
예를 들어, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539, M763, K890 및 E1007을 각각 세린, 아이소류신, 아스파라긴 및 프롤린으로 치환시킨 SpCas9 변이체(서열번호 32)일 수 있다. 이때, 상기 F539, M763, K890 및 E1007을 각각 세린, 아스파라긴, 아이소류신 및 프롤린으로 치환시킨 TS-SpCas9(F539S, M763I, K890N, E1007P)는 야생형 SpCas9와 비교하여 SpCas9(F539S, M763I, K890N, E1007P)의 REC 도메인과 표적 서열 및/또는 gRNA의 PAM distal end와의 상호작용이 변화되고, SpCas9(F539S, M763I, K890N, E1007P)의 RuvC 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화되고, SpCas9(F539S, M763I, K890N, E1007P)의 HNH 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화되고, SpCas9(F539S, M763I, K890N, E1007P)의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)와 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM(Protospacer adjacent motif)과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체이다.
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 구현예에서, 상기 인위적으로 조작된 Cas9은 융합 단백질일 수 있다.
상기 융합 단백질(fusion protein)은 표적 특이적 Cas9과 하나 이상의 기능적 도메인을 포함하는 인위적으로 생산된 하나의 단백질일 수 있다.
상기 표적 특이적 Cas9 관련 설명은 상기 기술한 바와 같다.
상기 기능적 도메인 관련 설명은 상기 기술한 바와 같다.
예를 들어, 상기 융합 단백질은 TS-SpCas9과 디아미네이즈(deaminase)를 포함하는 인위적으로 생산된 하나의 단백질일 수 있다.
이때, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 D10 및 E1007을 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또는 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 D10, F539, M763, K890 및 E1007을 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또는 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 H840 및 E1007을 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또는 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539, M763, H840, K890 및 E1007을 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또는 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 D10, F539, M763, H840, K890 및 E1007을 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 디아미네이즈는 아데닌 디아미네이즈(adenine deaminase) 및/또는 시티딘 디아미네이즈(cytidine deaminase)일 수 있다.
이때, 상기 융합 단백질은 TS-SpCas9의 N 말단에 디아미네이즈가 융합된 형태의 인위적으로 생산된 하나의 단백질일 수 있다.
또는 상기 융합 단백질은 TS-SpCas9의 C 말단에 디아미네이즈가 융합된 형태의 인위적으로 생산된 하나의 단백질일 수 있다.
또는 상기 융합 단백질은 TS-SpCas9의 N 말단 및 C 말단에 각각 동일하거나 다른 디아미네이즈가 융합된 형태의 인위적으로 생산된 하나의 단백질일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 CRISPR 효소, 인위적으로 조작된 CRISPR 효소, CRISPR 효소 변이체, Cas9, 인위적으로 조작된 Cas9, Cas9 변이체 또는 표적 특이적 Cas9은 폴리펩타이드 또는 단백질일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 CRISPR 효소, 인위적으로 조작된 CRISPR 효소, CRISPR 효소 변이체, Cas9, 인위적으로 조작된 Cas9, Cas9 변이체 또는 표적 특이적 Cas9은 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산일 수 있다.
상기 CRISPR 효소, 인위적으로 조작된 CRISPR 효소, CRISPR 효소 변이체, Cas9, 인위적으로 조작된 Cas9, Cas9 변이체 또는 표적 특이적 Cas9을 도입하고자 하는 대상에 맞추어 코돈 최적화(codon optimization)된 것일 수 있다.
“코돈 최적화”는 고유 서열의 적어도 하나의 코돈을 숙주 세포의 유전자에 더욱 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체하면서, 고유 아미노상 서열을 유지함으로써 관심 숙주 세포에서의 발현의 증진을 위해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 의미한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대한 특정 편향을 가지며, 코돈 편향(유기체 간의 코돈 사용의 차이)은 종종 mRNA의 번역의 효율과 상호관련 되며, 이는 번역되는 코돈의 특성 및 특정 tRNA 분자의 이용가능성에 의해 좌우되는 것을 여겨진다. 세포에서 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩타이드 합성에 가장 빈번하게 사용되는 코돈을 반영한 것이다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화에 기초하여 주어진 유기체에서 최적의 유전자 발현을 위해 맞춤화될 수 있다.
상기 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산은 비벡터 형태일 수 있다.
상기 비벡터는 네이키드 DNA, DNA 복합체 또는 mRNA일 수 있다.
상기 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산은 벡터에 포함될 수 있다.
이때, 상기 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산은 하나의 벡터에 포함되거나 또는 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산이 분할되어 여러 개의 벡터에 포함될 수 있다.
상기 벡터는 플라스미드일 수 있다.
상기 벡터는 바이러스 또는 비바이러스 벡터일 수 있다.
상기 벡터는 하나 이상의 조절/제어 구성요소를 포함할 수 있다.
이때, 상기 조절/제어 구성요소는 포로모터, 인핸서, 인트론, 폴리아데닐화 신호, 코작 공통(Kozak consensus) 서열, 내부 리보솜 유입 부위(internal ribosome entry site, IRES), 스플라이스 억셉터 및/또는 2A 서열을 포함할 수 있다.
상기 프로모터는 RNA 중합효소 II에 의해 인식되는 프로모터일 수 있다.
상기 프로모터는 RNA 중합효소 III에 의해 인식되는 프로모터일 수 있다.
상기 프로모터는 유도성 프로모터일 수 있다.
상기 프로모터는 대상 특이적 프로모터일 수 있다.
상기 프로모터는 바이러스 또는 비바이러스 프로모터일 수 있다.
상기 프로모터는 제어 영역(폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 핵산)에 따라 적합한 프로모터를 이용할 수 있다.
예를 들어, CRISPR 효소를 위해 유용한 프로모터는 CMV, EF-1a, EFS, MSCV, PGK 또는 CAG 프로모터일 수 있다.
벡터는 바이러스 벡터 또는 재조합 바이러스 벡터일 수 있다.
상기 바이러스는 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스일 수 있다.
이때, 상기 DNA 바이러스는 이중가닥 DNA(dsDNA) 바이러스 또는 단일가닥 DNA(ssDNA) 바이러스 일 수 있다.
이때, 상기 RNA 바이러스는 단일가닥 RNA(ssRNA) 바이러스일 수 있다.
상기 바이러스는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 백시니아바이러스, 폭스바이러스 또는 단순포진 바이러스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일반적으로 바이러스는 숙주(예를 들면, 세포)를 감염시켜, 숙주 내에 바이러스의 유전정보를 암호화하는 핵산을 도입시키거나 숙주의 게놈 내로 유전정보를 암호화하는 핵산을 삽입시킬 수 있다. 이러한 특징을 가지는 바이러스를 이용하여 대상 내로 가이드핵산 및/또는 에디터단백질을 도입시킬 수 있다. 바이러스를 이용하여 도입된 CRISPR 효소는 대상(예를 들면, 세포)에서 일시적으로 발현될 수 있다. 또는 바이러스를 이용하여 도입된 CRISPR 효소는 대상(예를 들면, 세포)에서 장기간(예를 들면, 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 6개월, 9개월, 1년, 2년 또는 영구적) 지속적으로 발현될 수 있다.
바이러스의 패키징 능력은 적어도 2kb 내지 50kb로 바이러스 종류에 따라 다를 수 있다. 이러한 패키징 능력에 따라 CRISPR 효소를 단독으로 포함하는 바이러스 벡터를 설계하거나 CRISPR 효소 및 추가로 gRNA를 포함하는 바이러스 벡터를 설계할 수 있다. 또는 CRISPR 효소, gRNA 및 추가 구성요소를 포함하는 바이러스 벡터를 설계할 수 있다.
일 예로, CRISPR 효소를 암호화하는 핵산은 재조합 렌티바이러스 벡터에 포함될 수 있다.
다른 일 예로, CRISPR 효소를 암호화하는 핵산은 재조합 아데노바이러스 벡터에 포함될 수 있다.
또 다른 일 예로, CRISPR 효소를 암호화하는 핵산은 재조합 AAV 벡터에 포함될 수 있다.
다른 일 예로, CRISPR 효소를 암호화하는 핵산은 혼성 바이러스, 예를 들어 본 명세서에 기재한 바이러스 중 하나 이상의 혼성체 벡터에 포함될 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 일 구현예에서, CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체를 사용하기 위해, 이를 코딩하는 핵산으로부터 그를 발현시킬 수 있다. 이는 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체를 코딩하는 핵산을 복제 및/또는 발현을 위한 원핵 또는 진핵 세포로 형질전환시키기 위해 중간체 벡터로 클로닝할 수 있다. CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체를 생산하기 위해 CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체를 코딩하는 핵산을 저장 또는 조작하기 위하여 중간체 벡터는 전형적으로 원핵생물 벡터, 예를 들어 플라스미드, 또는 셔틀 벡터, 또는 곤충 벡터이다. CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체를 코딩하는 핵산을 또한 식물 세포, 동물 세포, 바람직하게는 포유동물 세포 또는 인간 세포, 진균 세포, 박테리아 세포, 또는 원생동물 세포에 투여하기 위해 발현 벡터로 클로닝할 수 있다.
발현을 달성하기 위해, 전형적으로 CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체를 코딩하는 서열을 전사를 지시하는 프로모터를 함유하는 발현 벡터로 서브클로닝한다. 조작된 단백질을 발현시키기 위한 박테리아 발현 시스템은 예를 들어 대장균(E. coli), 바실러스(Bacillus) 종, 및 살모넬라(Salmonella)에서 얻을 수 있다. 이러한 발현 시스템을 위한 키트는 상업적으로 입수가능하다. 포유동물 세포, 효모, 및 곤충 세포를 위한 진핵세포 발현 시스템은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 또한 상업적으로 입수가능하다.
핵산 발현을 지시하는데 사용되는 프로모터는 특정한 적용에 따라 좌우된다. 예를 들어, 전형적으로 강력한 구성 프로모터는 융합 단백질의 발현 및 증식을 위해 사용된다. 대조적으로, CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체를 유전자 조절을 위해 생체내로 투여하는 경우에는, CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체의 특정한 용도에 따라 구성 또는 유도 프로모터가 사용될 수 있다. 또한, CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체의 투여에 바람직한 프로모터는 약한 프로모터, 예컨대 HSV TK 또는 유사한 활성을 갖는 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한 전사활성화에 반응성인 요소, 예를 들어 저산소증 반응 요소, Gal4 반응 요소, lac 저해인자 반응 요소, 및 소분자 제어 시스템, 예컨대 테트라시클린-조절된 시스템 및 RU-486 시스템을 포함할 수 있다.
프로모터 이외에도, 전형적으로 발현 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포인 숙주 세포에서 핵산 발현을 위해 필요한 모든 추가의 요소를 함유하는 전사 유닛 또는 발현 카세트를 함유한다. 따라서, 전형적인 발현 카세트는 예를 들어 CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터, 및 예를 들어 전사체의 효율적인 폴리아데닐화, 전사 종결, 리보솜 결합 부위, 또는 번역 종결을 위해 필요한 임의의 신호를 함유한다. 카세트의 추가의 요소에는 예를 들어 인핸서 및 슬라이싱된 이종의 인트론 신호가 포함될 수 있다.
유전자 정보를 세포에 전달하기 위한 특정한 발현 벡터는 CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체의 의도된 용도, 예를 들어 식물, 동물, 박테리아, 진균, 원생동물 등에서의 발현과 관련하여 선택된다. 표준 박테리아 발현 벡터에는 플라스미드, 예컨대 pBR322 기재 플라스미드, pSKF, pET23D, 및 상업적으로 입수가능한 태그-융합 발현 시스템, 예컨대 GST 및 LacZ가 포함된다.
진핵세포 바이러스로부터의 조절 요소를 함유하는 발현 벡터는 종종 진핵세포 발현 벡터, 예를 들어 SV40 벡터, 유두종 바이러스 벡터, 및 엡스테인-바르(Epstein-Barr) 바이러스로부터 유래된 벡터에서 사용된다. 다른 예시적인 진핵세포 벡터에는 pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, 바쿨로바이러스 pDSVE, 및 SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 쥐 유방 종양 바이러스 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, 또는 진핵 세포에서의 발현에 효과적인 것으로 제시된 프로모터의 지시 하에 단백질 발현을 허용하는 임의의 다른 벡터가 포함된다.
CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체를 발현하기 위한 벡터는 가이드 RNA의 발현을 유도하기 위한 RNA Pol III 프로모터, 예를 들어 H1, U6 또는 7SK 프로모터를 포함할 수 있다. 이들 인간 프로모터는 플라스미드 형질감염 이후 포유동물 세포에서 CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체의 발현을 허용한다.
일부 발현 시스템은 안정하게 형질감염된 세포주의 선택을 위한 마커, 예컨대 티미딘 키나제, 히그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제, 및 디히드로폴레이트 리덕타제를 갖는다. 폴리헤드린 프로모터 또는 다른 강력한 바쿨로 바이러스 프로모터의 지시 하에 gRNA 코딩 서열과 함께 곤충 세포에서 바쿨로바이러스 벡터를 사용하는 것과 같은 고수율 발현 시스템 또한 적합하다.
발현 벡터에 전형적으로 포함되는 요소에는 또한 E. coli에서 기능하는 레플리콘, 재조합 플라스미드를 보유하는 박테리아의 선택을 허용하기 위해 항생제 내성을 코딩하는 유전자, 및 재조합 서열의 삽입을 허용하기 위해 플라스미드의 비필수 영역에서의 독특한 제한 부위를 포함한다.
표준 형질감염 방법을 이용하여 다량의 단백질을 발현하는 박테리아, 포유동물, 효모 또는 곤충 세포주를 생성한 다음, 표준 기술을 이용하여 정제한다 (예를 들어, Colley et al., 1989, J. Biol. Chem., 264:17619-22; Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990) 참고). 진핵 및 원핵 세포의 형질전환은 표준 기술에 따라 수행한다 (예를 들어, Morrison, 1977, J. Bacteriol. 132:349-351; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds, 1983) 참고).
외래 뉴클레오티드 서열을 숙주 세포에 도입하는 임의의 공지된 절차를 이용할 수 있다. 이들 절차는 인산칼슘 형질감염, 폴리브렌, 원형질체 융합, 전기천공, 뉴클레오펙션, 리포좀, 현미주사, 네이키드 DNA, 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 에피좀형 및 편입형 둘 다, 및 클로닝된 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 또는 다른 외래 유전자 물질을 숙주 세포에 도입하기 위한 다른 널리 공지된 방법의 이용을 포함한다. 이용된 특정한 유전자 조작 절차는 CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체를 발현할 수 있는 숙주 세포에 적어도 하나의 유전자를 성공적으로 도입할 수 있어야만 한다.
본 명세서에 의해 개시되는 일 구현예에서, CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체를 발현할 수 있는 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 세포를 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시옐는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들의 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어 자명할 것이다.
실시예 1. Sniper Cas9 변이체
Sniper Cas9은 SpCas9의 F539, M763 및 K890이 변형된 SpCas9 변이체(서열번호 30)이며(WO 2019-009682 참고), 하기의 실시예는 상기 Sniper Cas9의 표적 특이성을 향상시키기 위해 Sniper Cas9의 변이체를 개발에 관한 것이다.
1. Sniper Cas9 변이체 라이브러리
Sniper Cas9 변이체 라이브러리는 3가지의 독립적인 프로토콜을 사용하여 제작하였다. 첫번째 라이브러리의 경우, Sniper Cas9 플라스미드를 XL1-red competent cells (Agilent)로 형질 도입시키고, 판매자의 매뉴얼에 따라 세포를 배양하였다. 두번째, 세번째 라이브러리의 경우, Gibson Assembly로 설계된 프라이머를 사용하여 낮은 오류율(0-5 mutations/kb) 조건에서 Genemorph II(Agilent) 및 Diversify PCR 무작위 돌연변이 유발 키트(Clontech)를 사용하여 Sniper Cas9 플라스미드 서열의 전체 Original Sniper Cas9에서 Error-prone PCR을 수행하였다. 이어서 PCR 생성물을 겔 정제 하였다. 정제된 무작위 돌연변이된 라이브러리 및 Sniper Cas9 플라스미드의 백본을 Gibson 조립하였다. 조립된 라이브러리는 EnduraTM electrocompetent cells (Lucigen)로 형질도입시키고 chloramphenicol LB plates (12.5μg/mL)에서 37℃에서 밤새 배양하였다. 형질 도입된 세포가 배양 후, 각 라이브러리는 midi prep kit (NucleoBond Xtra Midi EF, Macherey-Nagel)를 이용하여 분리정제 하였다. 수득한 라이브러리는 다중 타겟 시스템을 이용한 표적 특이적 Cas9 스크리닝 방법(WO 2017-217768 참고)을 이용하여 표적 특이적 Sniper Cas9 변이체를 선별하였다. 총 네 번의 스크리닝 중 첫 스크리닝은 gDNA에 target insertion이 없는 스크리닝 세포를 이용하여 on-target activity가 있는 variant 들을 selection 하고 후에 온전한 스크리닝 방법을 세 번 반복하였다(도 1). (inducer 조건: 10ng/mL anhydroustetracyclin during recovery, 0ng/mL during plating)
2. 위치포화돌연변이 (site-saturation mutagenesis)를 통한 20개 아미노산의 variant 구축
pBLC-Sniper Cas9 플라스미드를 주형으로 위치포화돌연변이 방법으로 PCR을 수행한 후 Forward primer: agtaccccaagctggagagcnnkttcgtgtacggcgactacaagg(서열번호 33); Reverse primer: tcttgatcagggcggtgcc(서열번호 34); DpnI (Enzynomics); T4 PNK (Enzynomics); 및 T4 Ligase (Enzynomics)를 함께 처리하여 construct를 생성한 후 DH5alpha 대장균에 형질전환 하였다. 100개의 colony를 무작위로 Sanger sequencing 하여 20개의 아미노산 변이체를 각각 얻었다.
3. 표적 특이적 Cas9 변이체를 암호화하는 플라스미드
야생형 SpCas9이 암호화되어 있는 플라스미드(p3s-Cas9HC; Addgene plasmid #43945)를 구매하여 표적 특이적 SpCas9 변이체를 생성을 위해 이용하였다. 표적 특이적 SpCas9 변이체를 위한 construct는 p3s-Cas9HC 플라스미드를 백본과 원하는 위치에 돌연변이를 포함하는 핵산 서열과의 Gibson 조립에 의해 생성하였다. 모든 contructs는 Sanger sequencing로 확인하였다. 이렇게 만들어진 p3s-Sniper Cas9 plasmid와 selected 된 pBLC-Sniper 2.0 후보들을 PmlI (Enzynomics) 과 XhoI (Enzynomics) 제한효소 처리하여 p3s-Sniper 백본과 Sniper 2.0 insert를 각각 겔 정제하였다. 정제된 DNA를 T4 ligase (Enzynomics) 처리하여 p3s-Sniper 2.0 constructs를 생성하였다. 모든 constructs는 Sanger sequencing으로 확인하였다.
실시예 2. Sniper Cas9 변이체의 표적 유전자 조작 효과
실험 방법
1. Cell culture and transfection conditions
1-1. Sniper Cas9 변이체 및 sgRNA 발현 플라스미드
HEK293T 세포(ATCC, CRL-11268)를 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% 항생제가 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. Sniper Cas9 변이체에 의한 게놈 조작을 위해, 형질 도입을 전에 HEK293T 세포를 24-well plate에 70-80% confluency가 되도록 접종하였다. Sniper Cas9 변이체 발현 플라스미드 500ng 및 sgRNA 발현 플라스미드 500ng을 lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 사용하여 세포에 형질 도입하였다. 형질 도입 72시간 후에 Exgene Cell SV mini (GeneAll)을 이용하여 genomic DNA를 분리추출하였다.
1-2. Sniper Cas9 변이체 및 gRNA (ribonucleoprotein; RNP)
HEK293T 세포(ATCC, CRL-11268)를 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% 항생제가 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. Sniper Cas9 변이체에 의한 게놈 조작을 위해, 형질 도입을 전에 HEK293T 세포를 24-well plate에 70-80% confluency가 되도록 접종하였다. Sniper Cas9 변이체 4μg 및 sgRNA 4μg을 세포에 도입하였다. 도입 후에 Exgene Cell SV mini (GeneAll)을 이용하여 genomic DNA를 분리추출하였다.
2. Targeted deep sequencing
표적 위치 및 잠재적 오프-타겟 위치는 표적된 딥 시퀀싱(targeted deep sequencing)에 의해 분석되었다. 딥 시퀀싱 라이브러리는 PCR에 의해 생성되었다. TruSeq HT Dual Index 프라이머를 각 시료에 라벨을 붙이기 위해 사용하였다. 풀 라이브러리(pooled libraries)를 MiSeq을 사용하여 paired-end sequencing을 수행하였다.
실험 결과
본 실시예에서 Sniper Cas9 변이체의 표적 유전자 조작 효과를 확인하기 위해 다양한 유전자를 표적으로하여 각각 표적 유전자에 따른 Sniper Cas9 변이체의 indel(%) 효과를 확인하였다.
1. Sniper Cas9 변이체
상기 실시예 1의 “1. Sniper Cas9 변이체 라이브러리“를 3차 스크리닝한 후 얻은 각각 라이브러리의 100개의 random colony를 Sanger sequence 하여 Agilent library에서 1개, Clontech library에서 5개, Mutator library에서 2개의 변이체를 얻었다(도 2). Agilent library에서 K4, K112, I492, R671 및 K735가 변이된 Sniper Cas9 변이체(Ag1)를 확인하였고, Clontech library에서 I350, E1007 및 M1021이 변이된 Sniper Cas9 변이체(Cl1); S1277이 변이된 Sniper Cas9 변이체(Cl2); E1007이 각각 다른 아미노산으로 변이된 2개의 Sniper Cas9 변이체(Cl3, Cl4); E1007 및 K1192가 변이된 Sniper Cas9 변이체(Cl5), 총 5개의 Sniper Cas9 변이체가 확인되었다. 또한 Mutator library에서 A889가 변이된 Sniper Cas9 변이체(Mu1); 및 K1191이 변이된 Sniper Cas9 변이체(Mu2)가 확인되었다. 각각의 Sniper Cas9 변이체를 세포에 처리하여 온-타겟 및 오프-타겟에서의 indel를 확인하였다.
그 결과, EMX 유전자를 표적 유전자로 한 경우, Cl1, Cl3 및 Cl4 Sniper Cas9 변이체가 Sniper Cas9에 비해 온-타겟에서의 indel은 증가하면서 오프-타겟에서의 indel은 감소한 것을 확인하였다(도 3). 상기 세개의 Sniper Cas9 변이체는 모두 E1007의 변이를 포함하고 있으며, 따라서, E1007가 Cas9의 표적 특이적 활성을 높이는 중요한 위치로 판단하였다.
2. E1007이 변이된 Sniper Cas9 변이체
Sniper Cas9의 1007번째 글루탐산을 어떤 아미노산으로 치환하였을 때 Sniper Cas9 변이체의 표적 특이적 활성이 증가하는지 다양한 아미노산 치환을 통해 확인하였다.
그 결과, EMX 유전자(도 4) 및 DMD 유전자(도 5)를 표적 유전자로 하여 온-타겟 및 오프-타겟에서의 indel를 확인하였고, 이를 통해 알라닌, 아르기닌, 류신, 프롤린, 세린 및 타이로신을 치환 아미노산 후보군으로 선정하였다.
E1007을 각각의 아미노산 후보군으로 치환하여 matching GX19 표적 유전자들(EMX1, FANCF02, ZSCAN2, RUNX1)과 mismatching gX19 표적 유전자들 (DMD, HBB02, HBB03, HBB04)에서 온-타겟 및 오프-타겟에서의 indel를 확인하였다(도 6-13). 그 결과, E1007이 류신으로 치환된 Sniper Cas9 변이체(서열번호 31) 또는 E1007이 프롤린으로 치환된 Sniper Cas9 변이체(서열번호 32)가 온-타겟에서의 indel은 증가하면서, 오프-타겟에서의 indel은 감소하여 표적 특이성이 증가하는 것을 확인하였다.
또한, Sniper Cas9 변이체(E1007L 또는 E1007P)와 sgRNA을 RNP로 세포에 처리하여 확인한 결과, 야생형 SpCas9과 비교하여 온-타겟의 indel은 증가하면서 오프-타겟의 indel은 감소하여 표적 특이성이 증가한 것을 확인하였다(표 1).
RNP (Sniper Cas9 변이체 및 sgRNA)에 의한 표적별 indel(%) 확인
CAS9 Conc. 4㎍ sgRNA Conc. 4㎍ Inde(%)
On-target Off-target
WT SpCas9 5mg/ml 0.8 ZSCAN 3292 1.22 4.5 0.3
5mg/ml 0.8 HBB03 2996 1.34 22.1 3.9
5mg/ml 0.8 HBB04 2528 1.58 5.3 4.8
Sniper Cas9 variant
E1007L		 5mg/ml 0.8 ZSCAN 3292 1.22 11.6 0 NaN
5mg/ml 0.8 HBB03 2996 1.34 22.8 0.8
5mg/ml 0.8 HBB04 2528 1.58 4.7 0.1
Sniper Cas9 variant
E1007P		 5mg/ml 0.8 ZSCAN 3292 1.22 9.3 0.1
5mg/ml 0.8 HBB03 2996 1.34 29.3 4.7
5mg/ml 0.8 HBB04 2528 1.58 8.4 0.8
상기의 결과를 통해, Sniper Cas9의 1007번째 글루탐산이 다른 아미노산으로 치환된 Sniper Cas9 변이체가 Sniper Cas9에 비해 표적 특이성이 향상됨을 확인할 수 있다.
<110> ToolGen Incorporated <120> Target Specific CRISPR variants <130> OPP19-039-PCT <160> 34 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nuclear localization sequence <400> 1 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nuclear localization sequence <400> 2 Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys 1 5 10 15 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nuclear localization sequence <400> 3 Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nuclear localization sequence <400> 4 Arg Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Pro 1 5 10 <210> 5 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> nuclear localization sequence <400> 5 Asn Gln Ser Ser Asn Phe Gly Pro Met Lys Gly Gly Asn Phe Gly Gly 1 5 10 15 Arg Ser Ser Gly Pro Tyr Gly Gly Gly Gly Gln Tyr Phe Ala Lys Pro 20 25 30 Arg Asn Gln Gly Gly Tyr 35 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Pro Ser Lys Lys Phe 20 25 30 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 35 40 45 Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 50 55 60 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 85 90 95 Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 100 105 110 His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 115 120 125 His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp 130 135 140 Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His 145 150 155 160 Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro 165 170 175 Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr 180 185 190 Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala 195 200 205 Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn 210 215 220 Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn 225 230 235 240 Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe 245 250 255 Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp 260 265 270 Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp 275 280 285 Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp 290 295 300 Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser 305 310 315 320 Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys 325 330 335 Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe 340 345 350 Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser 355 360 365 Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp 370 375 380 Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg 385 390 395 400 Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu 405 410 415 Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe 420 425 430 Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile 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645 650 655 Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp 660 665 670 Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe 675 680 685 Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe 690 695 700 Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu 705 710 715 720 His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly 725 730 735 Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly 740 745 750 Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln 755 760 765 Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile 770 775 780 Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro 785 790 795 800 Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu 805 810 815 Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg 820 825 830 Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys 835 840 845 Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg 850 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Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg 965 970 975 Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val 980 985 990 Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Leu Phe 995 1000 1005 Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys 1010 1015 1020 Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser 1025 1030 1035 1040 Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu 1045 1050 1055 Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile 1060 1065 1070 Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser 1075 1080 1085 Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly 1090 1095 1100 Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile 1105 1110 1115 1120 Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser 1125 1130 1135 Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly 1140 1145 1150 Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile 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Gln Leu Gly Gly Asp 1365 <210> 32 <211> 1368 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Streptococcus pyogenes Cas9 variant <400> 32 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 20 25 30 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 35 40 45 Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 50 55 60 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 85 90 95 Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 100 105 110 His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 115 120 125 His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp 130 135 140 Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His 145 150 155 160 Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro 165 170 175 Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe 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tcttgatcag ggcggtgcc 19

Claims (30)

  1. 인위적인 조작을 포함하는 SpCas9 변이체로서,
    상기 인위적인 조작은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9(SpCas9)의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop) 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 인위적인 조작을 포함하고,
    표적 특이성이 향상된 SpCas9 변이체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)는 SpCas9의 1001번째 타이로신(Y1001)부터 1030번째 글리신(G1030)까지의 아미노산 서열로 구성된 영역인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)는 SpCas9의 Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029 및 G1030을 포함하는 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 SpCas9의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop) 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산은 SpCas9의 Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029 및 G1030으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 SpCas9의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop) 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산은 SpCas9의 E1007인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 인위적인 조작은 SpCas9의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop) 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 제거(deletion)인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 인위적인 조작은 SpCas9의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop) 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로의 치환인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 다른 아미노산은 SpCas9의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop) 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산에 비해 상대적으로 기능기(functional group)의 크기가 작은 아미노산인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 다른 아미노산은 SpCas9의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop) 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산에 비해 상대적으로 기능기(functional group)의 크기가 큰 아미노산인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 다른 아미노산은 SpCas9의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop) 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산에 비해 상대적으로 소수성 지표(hydropathy index)가 큰 아미노산인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  11. 제7항에 있어서,
    상기 다른 아미노산은 SpCas9의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop) 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산에 비해 상대적으로 소수성 지표(hydropathy index)가 작은 아미노산인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  12. 제7항에 있어서,
    상기 다른 아미노산은 생리학적 pH(pH7.4)에서 중성 전하(neutral charge)를 가지는 아미노산인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 SpCas9 변이체는 A203, N277, G366, F539, I601, M763, K890, D965, F1038, T1102 및 D1127으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 인위적인 변형을 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 SpCas9 변이체는 F539, M763 및 K890의 인위적인 변형을 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  15. 제1항의 SpCas9 변이체는 SpCas9의 1007번째 글루탐산의 인위적인 조작을 포함하는 표적 특이적 SpCas9(Target specific SpCas9; TS-SpCas9) 변이체.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 인위적인 조작은 SpCas9의 1007번째 글루탐산의 제거 또는 다른 아미노산으로의 치환인 것을 특징으로 하는 표적 특이적 SpCas9(Target specific SpCas9; TS-SpCas9) 변이체.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 다른 아미노산은 SpCas9의 1007번째 글루탐산에 비해 상대적으로 기능기의 크기가 크거나 또는 작은 아미노산인 것을 특징으로 하는 표적 특이적 SpCas9(Target specific SpCas9; TS-SpCas9) 변이체.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 다른 아미노산은 SpCas9의 1007번째 글루탐산에 비해 상대적으로 소수성 지표가 크거나 또는 작은 아미노산인 것을 특징으로 하는 표적 특이적 SpCas9(Target specific SpCas9; TS-SpCas9) 변이체.
  19. 제16항에 있어서,
    상기 다른 아미노산은 생리학적 pH(pH7.4)에서 중성 전하(neutral charge)를 가지는 아미노산인 것을 특징으로 하는 표적 특이적 SpCas9(Target specific SpCas9; TS-SpCas9) 변이체.
  20. 제16항에 있어서,
    상기 다른 아미노산은 류신 또는 프롤린인 것을 특징으로 하는 표적 특이적 SpCas9(Target specific SpCas9; TS-SpCas9) 변이체.
  21. 제15항에 있어서,
    상기 표적 특이적 SpCas9(Target specific SpCas9; TS-SpCas9) 변이체는 A203, N277, G366, F539, I601, M763, K890, D965, F1038, T1102 및 D1127으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 인위적인 변형을 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 특이적 SpCas9(Target specific SpCas9; TS-SpCas9) 변이체.
  22. 제15항에 있어서,
    상기 표적 특이적 SpCas9(Target specific SpCas9; TS-SpCas9) 변이체는 F539, M763 및 K890의 인위적인 변형을 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 특이적 SpCas9(Target specific SpCas9; TS-SpCas9) 변이체.
  23. 제15항의 TS-SpCas9 변이체를 포함하는 융합 단백질.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 하나 이상의 기능적(functional) 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 기능적(functional) 도메인은 메틸라아제(methylase) 활성, 디메틸라아제(demethylase) 활성, 전사촉진(transcription activation) 활성, 전사 저해(transcription repression) 활성, 전사 방출 인자(transcription release factor) 활성, 히스톤 변형(histone modification) 활성, RNA 절단(cleavage) 활성 또는 핵산 결합(nucleic acid binding) 활성을 가지는 도메인; 단백질(펩타이드 포함)의 분리정제를 위한 태그(tag) 또는 리포터 유전자; NLS(nuclear localization sequence or signal) 또는 NES(nuclear export sequence or signal); 및 디아미네이즈(deaminase)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  26. 제1항이 SpCas9 변이체, 제15항의 TS-SpCas9 변이체 또는 제23항의 융합 단백질을 암호화하는 핵산.
  27. 제26항의 핵산을 포함하는 벡터.
  28. 제26항의 핵산 또는 제27항의 벡터를 포함하는 세포.
  29. 제1항이 SpCas9 변이체, 제15항의 TS-SpCas9 변이체 또는 제23항의 융합 단백질과 gRNA를 세포에 도입하는 단계를 포함하는 세포의 게놈을 인위적으로 조작하는 방법.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 gRNA는 상기 세포의 게놈 내에 존재하는 표적 유전자의 표적 서열에 상보적 결합을 하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산인 것을 특징으로 하는 세포의 게놈을 인위적으로 조작하는 방법.
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