別段に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または同一の方法および物質が本発明の実施または試験において使用されることができるが、適合した方法および物質が以下に記載される。本明細書に言及されたすべての刊行物、特許出願、特許およびその他の参考文献は、全体が参考により組み込まれる。さらに、物質、方法および実施例は単に例示的であり、制限することを意図していない。
本明細書によって開示される内容の一態様は、CRISPR酵素に関する。
「CRISPR酵素」は、CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)-Cas(CRISPR-associated protein)システムの主な蛋白質成分であり、guide RNA(gRNA)と複合体を形成してCRISPR-Casシステムを形成する。
上記「gRNA」は、標的遺伝子または核酸に対するgRNA-CRISPR酵素複合体、すなわち、CRISPR複合体を特異的標的化できるRNAを指し、gRNAは、標的配列に対する特異的RNAとしてCRISPR酵素と結合してCRISPR酵素を標的遺伝子または核酸に導くことができる。この時、上記「標的配列」は、標的遺伝子または核酸内に存在するヌクレオチド配列であり、具体的には、標的遺伝子または核酸内の標的領域の一部のヌクレオチド配列であり、ここで「標的領域」は標的遺伝子または核酸内のガイド核酸-エディター蛋白質によって変形され得る部位である。
上記gRNAは、多数のドメインを含むことができる。それぞれのドメインによって3次元形態またはgRNAの活性形態の鎖内または鎖間で相互に作用することができる。
gRNAは、一本鎖gRNA(単一RNA分子、single gRNA、sgRNA)または二本鎖gRNA(一つを超える通常的に2個の別個のRNA分子を含む)と呼ぶことができる。
一実施形態では、一本鎖gRNAは、5’から3’方向へのガイドドメイン、すなわち標的遺伝子または核酸に相補的に結合することができるガイド配列(guide sequence)を含むドメイン、第1相補的ドメイン、連結ドメイン、第2相補的ドメイン、上記第1相補的ドメインの配列に相補的な配列を有するので第1相補的ドメインと二本鎖核酸を形成できるドメイン、近位ドメイン(proximal domain)、および選択的に尾部ドメインを含むことができる。
別の一実施形態として、二本鎖gRNAは、5’から3’方向へのガイドドメイン、すなわち標的遺伝子または核酸に相補的に結合することができるガイド配列(guide sequence)を含むドメインおよび第1相補的ドメインを含む第1鎖、および第2相補的ドメイン、上記第1相補的ドメインの配列に相補的な配列を有するので第1相補的ドメインと二本鎖核酸を形成できるドメイン、近位ドメイン(proximal domain)および選択的に尾部ドメインを含む第2鎖を含むことができる。
この時、上記第1鎖をcrRNAと呼び、上記第2鎖をtracrRNAと呼ぶことができる。上記crRNAは、ガイドドメインと第1相補的ドメインを含むことができ、上記tracrRNAは、第2相補的ドメイン、近位ドメイン、および選択的に尾部ドメインを含むことができる。
また、他の一実施形態として、一本鎖gRNAは、3’から5’方向へのガイドドメイン、すなわち標的遺伝子または核酸に相補的に結合することができるガイド配列(guide sequence)を含むドメイン、第1相補的ドメイン、および第2相補的ドメイン、上記第1相補的ドメインの配列に相補的な配列を有するので第1相補的ドメインと二本鎖核酸を形成できるドメインを含むことができる。
上記CRISPR酵素は、CRISPR酵素をコードする配列を有する核酸またはポリペプチド(または、蛋白質)であり得、代表的にはType II CRISPR酵素またはType V CRISPR酵素がよく使用される。
上記CRISPR酵素は、Type II CRISPR酵素であり得る。
上記Type II CRISPR酵素は、Cas9であり得る。
この時、上記Cas9は、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)、連鎖球菌属(Streptococcus sp.)、スターピロコッカス・アウレス(Staphylococcus aureus)、ノカルディオプシス・ダソンヴィレイ(Nocardiopsis dassonvillei)、ストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス(Streptomyces pristinaespiralis)、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス(Streptomyces viridochromogenes)、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス(Streptomyces viridochromogenes)、ストレプトスポランギウム・ロセウム(Streptosporangium roseum)、ストレプトスポランギウム・ロセウム(Streptosporangium roseum)、アリシクロバチルス・アシドカルダリウス(AlicyclobacHlus acidocaldarius)、バチルス・シュドマイコイデス(Bacillus pseudomycoides)、バチルス・セレニティレドセンス(Bacillus selenitireducens)、エクシグオバクテリウム・シビリクム(Exiguobacterium sibiricum)、ラクトバチルス・デルブリッキー(Lactobacillus delbrueckii)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ミクロスキラマリーナ(Microscilla marina)、ブルクホルデリアレス・バクテリウム(Burkholderiales bacterium)、ポラロモナス・ナフタレニボランス(Polaromonas naphthalenivorans)、ポラロモナス属(Polaromonas sp.)、クロコスフェラ・ワツゥオニ(Crocosphaera watsonii)、シアノセイス属(Cyanothece sp.)、マイクロシスティス・アエルギノサ(Microcystis aeruginosa)、シネココッカス属(Synechococcus sp.)、アセトハロビウム・アラバチクム(Acetohalobium arabaticum)、アンモニフェックス・デゲンシイ(Ammonifex degensii)、カルジセルロシロプト・ベシイ(Caldicelulosiruptor bescii)、カンジダ・デスルフォルディス(Candidatus Desulforudis)、ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)、フィネゴルディア・マグナ(Finegoldia magna)、ナトロアナエロビウス・サーモフィルス(Natranaerobius thermophilus)、ペロトマキュラム・サーモプロピオニカム(Pelotomaculum thermopropionicum)、アシドチオバシラス・カルダス(Acidithiobacillus caldus)、アシドチオバシラス・フェロオキシダン(Acidithiobacillus ferrooxidans)、アロクロマチウム・ビノスム(Allochromatium vinosum)、マリノバクター属(Marinobacter sp.)、ニトロソコッカス・ハロフィルス(Nitrosococcus halophilus)、ニトロソコッカス・ワツゥオニ(Nitrosococcus watsoni)、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス(Pseudoalteromonas haloplanktis)、クテドノバクテル・ラセミペル(Ktedonobacter racemifer)、メタノハロビウム・エベスティガトゥム(Methanohalobium evestigatum)、アナベナ・バリアビリス(Anabaena variabilis)、ノドラリア・スプミゲナ(Nodularia spumigena)、ノストック属(Nostoc sp.)、アルトロスピラマキシマ(Arthrospira maxima)、アルトロスピラプラテンシス(Arthrospira platensis)、アルトロスピラ属(Arthrospira sp.)、リンビア属(Lyngbya sp.)、マイクロコレ ウスクトノプラステス(Microcoleus chthonoplastes)、オシラトリア属(Oscillatoria sp.)、ペトロトガモビリス(Petrotoga mobilis)、サーモシフォ・アフリカヌス(Thermosipho africanus)、またはアカリオクロリスマリーナ(Acaryochloris marina)等、様々な微生物由来のCas9であり得る。
この時、上記Cas9は、自然状態で存在する微生物から単離されたもの、または組換え的方法または合成的方法によって非自然的に生産されたものであり得る。
Type II CRISPR酵素の結晶構造は、2種以上の自然由来微生物Type II CRISPR酵素分子に対する研究(Jinek et al.,Science、343(6176):1247997,2014)およびgRNAとともに複合体を形成するストレプトコッカス・ピオゲネスCas9(SpCas9)に対する研究(Nishimasu et al.,Cell、156:935-949,2014、およびAnders et al.,Nature、2014,doi:10.1038/nature13579)によって決定された。
上記Type II CRISPR酵素は、2個のローブ、すなわち、認識(REC)およびヌクレアーゼ(NUC)ローブを含み、それぞれのローブはいくつかのドメインを含む。
上記RECローブは、アルギニンに富むブリッジヘリックス(BH)、REC1ドメイン、およびREC2ドメインを含む。
この時、上記BHドメインは、長いα-ヘリックスおよびアルギニンに富む領域であり、上記REC1およびREC2ドメインは、gRNA内で形成される二本鎖の、例えば、一本鎖gRNA、二本鎖gRNA、またはtracrRNAの認識に重要な役割を果たす。
上記NUCローブは、RuvCドメイン、HNHドメインおよびPAM-相互作用(PI)ドメインを含む。この時、上記RuvCドメインは、RuvC様ドメインを包含する意味で使用され、また上記HNHドメインは、HNH様ドメインを包含する意味で使用される。
この時、上記RuvCドメインは、Type II CRISPR酵素を含む自然状態に存在する微生物のメンバーに対して構造的に類似性を共有し、一本鎖、例えば、標的遺伝子または核酸の非相補的鎖、すなわち、gRNAと相補的な結合を形成していない鎖を切断する。上記RuvCドメインは、しばしば当業界でRuvCIドメイン、RuvCIIドメインおよびRuvCIIIドメインとして、通常RuvC I、RuvCIIおよびRuvCIIIと呼ばれる。
上記HNHドメインは、HNHエンドヌクレアーゼと構造的類似性を共有し、一本鎖、例えば、標的核酸分子の相補的鎖、すなわち、gRNAと相補的に結合する鎖を切断する。HNHドメインは、RuvC IIとIIIモチーフとの間に位置する。
上記PIドメインは、標的遺伝子または核酸内の特定のヌクレオチド配列、すなわち、PAM(Protospacer adjacent motif)を認識するか、またはPAMと相互作用する。この時、上記PAMは、Type II CRISPR酵素の由来(origin)によって異なる場合がある。例えば、CRISPR酵素がSpCas9の場合、PAMは5'-NGG-3'であり、ストレプトコッカス・サーモフィルスCas9(StCas9)の場合、PAMは5'-NNAGAAW-3'(W = A or T)であり、スターピロコッカス・アウレスCas9(SaCas9)の場合、PAMは5’-NNGRR-3’(R=A or G)であり、髄膜炎菌(Neisseria meningitides)Cas9(NmCas9)の場合、PAMは5'-NNNNGATT-3'であり、カンピロバクター・ジェジュニCas9(CjCas9)の場合、PAMは5'-NNNVRYAC-3'(V=G or C or A、R=A or G、Y=C or T)であり得る。ここで、上記Nは、A、T、GまたはC、またはA、U、GまたはCであり得る。ただし、前述した酵素の由来によってPAMが決定されると一般に理解されているが、当該由来の酵素の突然変異(mutant)に対する研究が進行されるにつれて、上記PAMは異なる場合もある。
上記CRISPR酵素は、標的遺伝子または核酸の二本鎖を切断する機能を有するヌクレアーゼまたは制限酵素であり得る。
上記CRISPR酵素は、完全活性CRISPR酵素であり得る。
「完全活性」とは、野生型(wild type)CRISPR酵素の機能と同じ機能を有している状態を意味し、このような状態のCRISPR酵素を完全活性CRISPR酵素と称する。この時、「野生型(wild type)CRISPR酵素の機能」は、DNAの二本鎖を切断する機能、すなわち、DNAの二本鎖のうち第1鎖を切断する第1機能およびDNAの二本鎖のうち第2鎖を切断する第2機能をすべて持つ状態をいう。
上記完全活性CRISPR酵素は、DNAの二本鎖を切断する野生型CRISPR酵素であり得る。
上記完全活性CRISPR酵素は、DNAの二本鎖を切断する野生型CRISPR酵素を変形または操作させたCRISPR酵素変異体であり得る。
上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素のアミノ酸配列の中の1つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されるか、または、1つ以上のアミノ酸が除去された酵素であり得る。
上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素のアミノ酸配列に1つ以上のアミノ酸が付加された酵素であり得る。この時、付加されるアミノ酸の位置は、野生型酵素のN末端、C末端、またはアミノ酸配列内であり得る。
上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素よりも機能が向上した完全活性酵素であり得る。
例えば、野生型CRISPR酵素の特定の変形または操作された形態、すなわち、CRISPR酵素変異体は、切断すべきDNA二本鎖と結合しないか、または一定の間隔を維持したままDNA二本鎖を切断することができる。このような場合、上記変形または操作された形態は、野生型CRISPR酵素よりも機能活性が向上した完全活性CRISPR酵素であり得る。
上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素よりも機能が低下した完全活性CRISPR酵素であり得る。
例えば、野生型CRISPR酵素の特定の変形または操作された形態、すなわち、CRISPR酵素変異体は、切断すべきDNA二本鎖と一定の距離以上で近接した状態または特定の結合が形成された状態でDNA二本鎖を切断することができる。この時、特定の結合は、例えば、酵素の特定の位置のアミノ酸と切断位置のDNAヌクレオチド配列との結合であり得る。このような場合、上記変形または操作された形態は野生型CRISPR酵素よりも機能活性が低下した完全活性CRISPR酵素であり得る。
上記CRISPR酵素は、不完全または部分的活性CRISPR酵素であり得る。
「不完全または部分的活性」とは、野生型CRISPR酵素の機能、すなわち、DNAの二本鎖のうち第1鎖を切断する第1機能およびDNAの二本鎖のうち第2鎖を切断する第2機能から選択される1つの機能を有する状態を意味する。このような状態のCRISPR酵素は、不完全または部分的活性CRISPR酵素と呼ばれる。また、上記不完全または部分的活性CRISPR酵素は、ニッカーゼ(nickase)と呼ぶことができる。
「ニッカーゼ(nickase)」とは、標的遺伝子または核酸の二本鎖のうち1本のみが切断されるように操作または変形されたCRISPR酵素を意味し、上記ニッカーゼは、一本鎖、例えば、標的遺伝子または核酸のgRNAと非相補的鎖または相補的鎖を切断するヌクレアーゼ活性を有する。したがって、二本鎖を切断するためには2つのニッカーゼのヌクレアーゼ活性が必要である。
上記ニッカーゼは、CRISPR酵素のRuvCドメインによるヌクレアーゼ活性を有し得る。すなわち、上記ニッカーゼは、CRISPR酵素のHNHドメインによるヌクレアーゼ活性を含まなくてもよく、そのためにHNHドメインを操作または変更することができる。
一例として、上記CRISPR酵素がType II CRISPR酵素である場合、上記ニッカーゼは変形されたHNHドメインを含むType II CRISPR酵素であり得る。
例えば、上記Type II CRISPR酵素が野生型SpCas9の場合、上記ニッカーゼは、野生型SpCas9のアミノ酸配列の840番ヒスチジンをアラニンに変異(mutation)させ、HNHドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化されたSpCas9変異体であり得る。この時、生成されたニッカーゼ、すなわち、SpCas9変異体は、RuvCドメインによるヌクレアーゼ活性を有するので、標的遺伝子または核酸の非相補的鎖、すなわち、gRNAと相補的に結合しない鎖を切断することができる。
別の例として、上記Type II CRISPR酵素が野生型CjCas9の場合、上記ニッカーゼは、野生型CjCas9のアミノ酸配列の559番ヒスチジンをアラニンに変異(mutation)させ、HNHドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化されたCjCas9変異体であり得る。この時、生成されたニッカーゼ、すなわち、CjCas9変異体は、RuvCドメインによるヌクレアーゼ活性を有するので、標的遺伝子または核酸の非相補的鎖、すなわち、gRNAと相補的に結合しない鎖を切断することができる。
また、上記ニッカーゼは、CRISPR酵素のHNHドメインによるヌクレアーゼ活性を有し得る。すなわち、上記ニッカーゼは、CRISPR酵素のRuvCドメインによるヌクレアーゼ活性を含まなくてもよく、そのためにRuvCドメインを操作または変更することができる。
一例として、上記CRISPR酵素がType II CRISPR酵素である場合、上記ニッカーゼは、変形されたRuvCドメインを含むType II CRISPR酵素であり得る。
例えば、上記Type II CRISPR酵素が野生型SpCas9の場合、上記ニッカーゼは、野生型SpCas9のアミノ酸配列の10番アスパラギン酸をアラニンに変異(mutation)させ、RuvCドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化されたSpCas9変異体であり得る。この時、生成されたニッカーゼ、すなわち、SpCas9変異体は、HNHドメインによるヌクレアーゼ活性を有するので、標的遺伝子または核酸の相補的鎖、すなわち、gRNAと相補的に結合する鎖を切断することができる。
別の例として、上記Type II CRISPR酵素が野生型CjCas9の場合、上記ニッカーゼは、野生型CjCas9のアミノ酸配列の8番アスパラギン酸をアラニンに変異(mutation)させ、RuvCドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化されたCjCas9変異体であり得る。この時、生成されたニッカーゼ、すなわち、CjCas9変異体は、HNHドメインによるヌクレアーゼ活性を有するので、標的遺伝子または核酸の相補的鎖、すなわち、gRNAと相補的に結合する鎖を切断することができる。
上記CRISPR酵素は、不活性CRISPR酵素であり得る。
「不活性」とは、野生型CRISPR酵素の機能、すなわち、DNAの二本鎖のうち第1鎖を切断する第1機能およびDNAの二本鎖のうち第2鎖を切断する第2機能の両方が失われた状態を意味する。このような状態のCRISPR酵素は不活性CRISPR酵素と呼ばれる。
上記不活性CRISPR酵素は、野生型CRISPR酵素のヌクレアーゼ活性を有するドメインに変異によるヌクレアーゼ不活性を有し得る。
上記不活性CRISPR酵素は、RuvCドメインおよびHNHドメインに変異によるヌクレアーゼ不活性を有し得る。すなわち、上記不活性CRISPR酵素は、CRISPR酵素のRuvCドメインおよびHNHドメインによるヌクレアーゼ活性を含まなくてもよく、そのためにRuvCドメインおよびHNHドメインを操作または変更することができる。
一例として、上記CRISPR酵素がType II CRISPR酵素である場合、上記不活性CRISPR酵素は、変形されたRuvCドメインおよびHNHドメインを含むType II CRISPR酵素であり得る。
例えば、上記Type II CRISPR酵素が野生型SpCas9の場合、上記不活性CRISPR酵素は、野生型SpCas9のアミノ酸配列の10番アスパラギン酸と840番ヒスチジンの両方をアラニンに変異(mutation)させ、RuvCドメインおよびHNHドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化されたSpCas9変異体であり得る。この時、生成された不活性CRISPR酵素、すなわち、SpCas9変異体は、RuvCドメインおよびHNHドメインのヌクレアーゼ活性が不活性であるため、標的遺伝子または核酸の二本鎖をすべて切断できない。
別の例として、上記Type II CRISPR酵素が野生型CjCas9の場合、上記不活性CRISPR酵素は、野生型CjCas9のアミノ酸配列の8番アスパラギン酸と559番ヒスチジンの両方をアラニンに変異(mutation)させ、RuvCドメインおよびHNHドメインのヌクレアーゼ活性が不活性化されたCjCas9変異体であり得る。この時、生成された不活性CRISPR酵素、すなわち、CjCas9変異体は、RuvCドメインおよびHNHドメインのヌクレアーゼ活性が不活性であるため、標的遺伝子または核酸の二本鎖をすべて切断できない。
上記CRISPR酵素は、上記の記載されたヌクレアーゼ活性に加えて、ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のヘリックス構造を解く機能を有し得る。
また、上記CRISPR酵素は、CRISPR酵素のヘリカーゼ活性に対して完全活性、不完全もしくは部分活性、または不活性となるようにCRISPR酵素を変形させることができる。
本明細書によって開示される内容の具体的な一例として、CRISPR酵素は人為的に操作されたCRISPR酵素であり得る。
「人為的に操作された(artificially modified or engineered or artificially engineered)」という用語は、自然状態で起こる存在そのままの状態ではなく、人為的な変形を加えて生成された状態を意味する。この時、上記人為的な変形は、CRISPR酵素をコードする核酸および/または蛋白質で発生することができ、また、上記人為的な変形は、CRISPR酵素をコードする核酸によって蛋白質が生成される過程、すなわち、転写、転写後の変形、翻訳および翻訳後の変形などの全過程で発生可能な人為的に操作できるすべての変形を含む。以下では、非自然的な人為的に操作された、または変形されたCRISPR酵素は、人為的なCRISPR酵素またはCRISPR酵素変異体という用語と組み合わせて使用することができる。
上記人為的に操作されたCRISPR酵素は、野生型CRISPR酵素の機能、すなわち、DNAの二本鎖のうち第1鎖を切断する第1機能および/またはDNAの二本鎖のうち第2鎖を切断する第2機能を変形させたCRISPR酵素変異体であり得る。
例えば、上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素の機能のうちの第1機能が失われた形態であり得る。
または、上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素の機能のうちの第1機能が向上した形態であり得る。
例えば、上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素の機能のうちの第2機能が失われた形態であり得る。
または、上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素の機能のうちの第2機能が向上した形態であり得る。
例えば、上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素の機能、すなわち、第1機能および第2機能の両方が失われた形態であり得る。
または、上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素の機能、すなわち、第1機能および第2機能の両方が向上した形態であり得る。
例えば、上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素の機能、すなわち、第1機能が失われ、第2機能が向上した形態であり得る。
または、上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素の機能、すなわち、第1機能が向上し、第2機能が失われた形態であり得る。
上記人為的に操作されたCRISPR酵素は、gRNAとの相互作用によってgRNA-CRISPR酵素複合体を形成することができる。
この時、上記人為的に操作されたCRISPR酵素は、野生型CRISPR酵素のgRNAと相互作用する機能を変形させたCRISPR酵素変異体であり得る。
例えば、上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素に比べてgRNAとの相互作用が低下した形態であり得る。
または、上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素に比べてgRNAの相互作用が増加した形態であり得る。
例えば、上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素の第1機能を有し、gRNAとの相互作用が低下した形態であり得る。
または、上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素の第1機能を有し、gRNAとの相互作用が増加した形態であり得る。
例えば、上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素の第2機能を有し、gRNAとの相互作用が低下した形態であり得る。
または、上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素の第2機能を有し、gRNAとの相互作用が増加した形態であり得る。
例えば、上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素の第1機能および第2機能を有しなく、gRNAとの相互作用が低下した形態であり得る。
または、上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素の第1機能および第2機能を有しなく、gRNAとの相互作用が増加した形態であり得る。
この時、gRNAとCRISPR酵素変異体の相互作用の強さによって様々なgRNA-CRISPR酵素複合体が形成されることができ、CRISPR酵素変異体によって標的配列にアクセスまたは切断する機能に差が生じることがある。
例えば、gRNAとの相互作用が低下したCRISPR酵素変異体によって形成されたgRNA-CRISPR酵素複合体は、gRNAと完全に相補的に結合する標的配列に近接または局在化される場合にのみ、標的配列の二本鎖または一本鎖を切断することができる。
本明細書によって開示される上記人為的に操作されたCRISPR酵素は、野生型CRISPR酵素のアミノ酸配列のうち少なくとも1つ以上のアミノ酸を変形させたCRISPR酵素変異体であり得る。
上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素のアミノ酸配列のうち少なくとも1つ以上のアミノ酸を除去させた形態であり得る。
一例として、上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素の正電荷を有するアミノ酸のうちの1つ以上のアミノ酸を除去させた形態であり得る。
別の例として、上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素の負電荷を有するアミノ酸のうちの1つ以上のアミノ酸を除去させた形態であり得る。
また、他の一例として、上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素の電荷を有さないアミノ酸のうちの1つ以上のアミノ酸を除去させた形態であり得る。
別の例として、上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素の正電荷を有するアミノ酸、負電荷を有するアミノ酸、および電荷を有さないアミノ酸のうちの1つ以上のアミノ酸を除去させた形態であり得る。
上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素のアミノ酸配列のうち選択された少なくとも1つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸で置換した形態であり得る。
この時、上記他のアミノ酸、すなわち置換したアミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンの中から選択された1つのアミノ酸であり得る。
この時、上記アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンはそれぞれのアミノ酸およびこれに対し付加的に変形されることができるメチル化(methylation)、アセチル化(acetylation)、リン酸化(phosphorylation)等の化学的に変形された形態をすべて含むことができる。
一例として、上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素の正電荷を有するアミノ酸のうちの1つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸で置換した形態であり得る。この時、他のアミノ酸は、上記選択された1つ以上のアミノ酸の立体異性体、正電荷を有する他のアミノ酸、負電荷を有するアミノ酸、および電荷を有さないアミノ酸の中から選択された1つ以上のアミノ酸であり得る。
他の一例として、上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素の負電荷を有するアミノ酸のうちの1つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸で置換した形態であり得る。この時、他のアミノ酸は、上記選択された1つ以上のアミノ酸の立体異性体、負電荷を有する他のアミノ酸、正電荷を有するアミノ酸、および電荷を有さないアミノ酸の中から選択された1つ以上のアミノ酸であり得る。
また、他の一例として、上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素の電荷を有さないアミノ酸のうちの1つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸で置換した形態であり得る。この時、他のアミノ酸は、上記選択された1つ以上のアミノ酸の立体異性体、電荷を有さない他のアミノ酸、正電荷を有するアミノ酸、および負電荷を有するアミノ酸の中から選択された1つ以上のアミノ酸であり得る。
別の例として、上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素の正電荷を有するアミノ酸、負電荷を有するアミノ酸、および電荷を有さないアミノ酸のうちの1つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸で置換した形態であり得る。この時、他のアミノ酸は、上記選択された1つ以上のアミノ酸の立体異性体、正電荷を有するアミノ酸、負電荷を有するアミノ酸、および電荷を有さないアミノ酸の中から選択された1つ以上のアミノ酸であり得る。
上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素のアミノ酸配列のうち少なくとも1つ以上のアミノ酸を置換および/または除去させた形態であり得る。
本明細書によって開示される上記人為的に操作されたCRISPR酵素は、野生型CRISPR酵素のアミノ酸配列内に少なくとも1つ以上のアミノ酸が付加されたCRISPR酵素変異体であり得る。
上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素のアミノ酸配列と比較して、少なくとも1つ以上のアミノ酸を付加させた形態であり得る。
または、上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素のアミノ酸配列内に少なくとも1つ以上の機能的(functional)ドメインを付加させた形態であり得る。
この時、上記機能的ドメインは、1つ以上のアミノ酸で構成され、ペプチドまたはポリペプチドであり得る。
この時、上記機能的ドメインは、野生型CRISPR酵素の本来の機能、すなわち、DNAの二本鎖のうち第1鎖を切断する第1機能およびDNAの二本鎖のうち第2鎖を切断する第2機能以外に付加的な機能を有するドメインであり得る。
または、上記機能的ドメインは、野生型CRISPR酵素の本来の機能、すなわち、DNAの二本鎖のうち第1鎖を切断する第1機能および/またはDNAの二本鎖のうち第2鎖を切断する第2機能と類似の機能を有するドメインであり得る。
一例として、上記機能的ドメインは、メチラーゼ(methylase)活性、ジメチラーゼ(demethylase)活性、転写促進(transcription activation)活性、転写阻害(transcription repression)活性、転写放出因子(transcription release factor)活性、ヒストン変形(histone modification)活性、RNA切断(cleavage)活性、または核酸結合(nucleic acid binding)活性を有するドメインであり得る。
別の例として、上記機能的ドメインは、蛋白質(ペプチド含む)の単離精製のためのタグ(tag)またはレポーター遺伝子であり得る。この時、上記タグは、ヒスチジン(His)タグ、V5タグ、FLAGタグ、インフルエンザ血球凝集素(HA)タグ、Mycタグ、VSV-Gタグ、およびチオレドキシン(Trx)タグなどを含み、上記レポーター遺伝子は、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、ホスラディッシュ(horseradish)過酸化酵素(HRP)、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ(CAT)、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光蛋白質(GFP)、HcRed、DsRed、青緑色蛍光蛋白質(CFP)、黄色蛍光蛋白質(YFP)、および青色蛍光蛋白質(BFP)を含む自己蛍光蛋白質を含むが、これらに限定されない。
また、他の一例として、上記機能的ドメインは、デアミナーゼ(deaminase)であり得る。
例えば、不完全または部分的CRISPR酵素にシチジンデアミナーゼ(cytidine deaminase)を機能的ドメインとしてさらに含むことができる。または、不完全または部分的CRISPR酵素にアデニンデアミナーゼ(adenine deaminase)を機能的ドメインとしてさらに含むことができる。
別の例として、上記機能的ドメインは、核局在化配列またはシグナル(nuclear localization sequence or signal、NLS)または核外輸送配列またはシグナル(nuclear export sequence or signal、NES)であり得る。
例えば、CRISPR酵素は、1つ以上のNLSを含むことができる。この時、上記NLSは、CRISPR酵素のアミノ末端またはその近傍、カルボキシ末端またはその近傍、またはこれらの組み合わせに1つ以上のNLSを含むことができる。上記NLSは、アミノ酸配列PKKKRKV(配列番号1)を有するSV40ウイルス大型T-抗原のNLS、ヌクレオプラスミン(nucleoplasmin)からのNLS(例えば、配列KRPAATKKAGQAKKKK(配列番号2)を有するヌクレオプラスミン二分割(bipartite)NLS)、アミノ酸配列PAAKRVKLD(配列番号3)またはRQRRNELKRSP(配列番号4)を有するc-myc NLS、配列NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY(配列番号5)を有するhRNPA1 M9 NLS、インポーチン-αからのIBBドメインの配列RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV(配列番号6)、マイオマ(myoma)T蛋白質の配列VSRKRPRP(配列番号7)およびPPKKARED(配列番号8)、ヒトp53の配列POPKKKPL(配列番号9)、マウスc-abl IVの配列SALIKKKKKMAP(配列番号10)、インフルエンザウイルスNS1の配列DRLRR(配列番号11)およびPKQKKRK(配列番号12)、肝炎ウイルスデルタ抗原の配列RKLKKKIKKL(配列番号13)、マウスMx1蛋白質の配列REKKKFLKRR(配列番号14)、ヒトポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼの配列KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(配列番号15)、およびステロイドホルモン受容体(ヒト)グルココルチコイドの配列RKCLQAGMNLEARKTKK(配列番号16))に由来するNLS配列であり得るが、これらに制限されない。
上記人為的に操作されたCRISPR酵素は、野生型CRISPR酵素の特定の領域内のアミノ酸配列のうち少なくとも1つ以上のアミノ酸を変形させたCRISPR酵素変異体であり得る。
上記人為的に操作されたCRISPR酵素は、野生型CRISPR酵素の特定の領域内に1つ以上のアミノ酸が付加されたCRISPR酵素変異体であり得る。
この時、上記野生型CRISPR酵素の特定の領域は、第1領域、第2領域、第3領域、および第4領域のうち選択された1つ以上の領域であり得る。
上記第1領域は、gRNAと相互作用する野生型CRISPR酵素の一部であり得る。
上記第1領域は、標的配列と相互作用する野生型CRISPR酵素の一部であり得る。
上記第1領域は、gRNA-標的配列ヘテロ二本鎖(heteroduplex)と相互作用する野生型CRISPR酵素の一部であり得る。
上記第1領域は、gRNA-標的配列ヘテロ二本鎖(heteroduplex)のPAMと遠位端部位(PAM distal end)と相互作用する野生型CRISPR酵素の一部であり得る。
この時、上記gRNA-標的配列ヘテロ二本鎖(heteroduplex)のPAMと遠位端部位(PAM distal end)は、PAM位置から離れて位置するgRNA-標的配列ヘテロ二本鎖(heteroduplex)の末端の6~10個の塩基対、すなわち、gRNAの6~10個の塩基配列とこれと相補的に結合する標的配列の6~10個の塩基配列を意味することになる。
上記第1領域は、野生型CRISPR酵素のRECローブ(lobe)に位置した領域であり得る。
上記第1領域は、野生型CRISPR酵素のRECドメインの全部または一部であり得る。
上記第2領域は、野生型CRISPR酵素の第1機能または第2機能を果たす野生型CRISPR酵素の一部であり得る。
上記第2領域は、gRNAと相互作用する野生型CRISPR酵素の一部であり得る。
上記第2領域は、標的配列と相互作用する野生型CRISPR酵素の一部であり得る。
上記第2領域は、gRNA-標的配列ヘテロ二本鎖(heteroduplex)と相互作用する野生型CRISPR酵素の一部であり得る。
上記第2領域は、gRNA-標的配列ヘテロ二本鎖(heteroduplex)のPAMと遠位端部位(PAM distal end)と相互作用する野生型CRISPR酵素の一部であり得る。
この時、上記gRNA-標的配列ヘテロ二本鎖(heteroduplex)のPAMと遠位端部位(PAM distal end)は、PAM位置から離れて位置するgRNA-標的配列ヘテロ二本鎖(heteroduplex)の末端の6~10個の塩基対、すなわち、gRNAの6~10個の塩基配列とこれと相補的に結合する標的配列の6~10個の塩基配列を意味することになる。
上記第2領域は、野生型CRISPR酵素のNUCローブ(lobe)に位置した領域であり得る。
上記第2領域は、野生型CRISPR酵素のNUCローブ(lobe)のエンドキャッピングループ(end-capping loop)を含む領域であり得る。
この時、上記エンドキャッピングループ(end-capping loop)は、gRNA-標的配列ヘテロ二本鎖(heteroduplex)のPAM(Protospacer adjacent motif)と遠位端部位(PAM distal end)と相互作用する領域であり得る。
上記第2領域は、野生型CRISPR酵素のRuvCドメインの全部または一部であり得る。
上記第2領域は、野生型CRISPR酵素のRuvCドメインの金属依存性核酸切断部位(metal dependent nucleic acid cleaving region)を含むRuvCドメインの一部であり得る。
この時、上記RuvCドメインの金属依存性核酸切断部位は、RuvCドメインで金属と相互作用によって標的位置の核酸間の結合を切断できる領域を意味することになる。
上記金属依存性核酸切断部位は、金属と相互作用する部分と、標的位置の核酸間の結合を切断する部分とからなり得る。
上記第3領域は、野生型CRISPR酵素の第1機能または第2機能を果たす野生型CRISPR酵素の一部であり得る。
上記第3領域は、gRNAと相互作用する野生型CRISPR酵素の一部であり得る。
上記第3領域は、標的配列と相互作用する野生型CRISPR酵素の一部であり得る。
上記第3領域は、gRNA-標的配列ヘテロ二本鎖(heteroduplex)と相互作用する野生型CRISPR酵素の一部であり得る。
上記第3領域は、gRNA-標的配列ヘテロ二本鎖(heteroduplex)のPAMと遠位端部位(PAM distal end)と相互作用する野生型CRISPR酵素の一部であり得る。
この時、上記gRNA-標的配列ヘテロ二本鎖(heteroduplex)のPAMと遠位端部位(PAM distal end)は、PAM位置から離れて位置するgRNA-標的配列ヘテロ二本鎖(heteroduplex)の末端の6~10個の塩基対、すなわち、gRNAの6~10個の塩基配列とこれと相補的に結合する標的配列の6~10個の塩基配列を意味することになる。
上記第3領域は、野生型CRISPR酵素のNUCローブ(lobe)に位置した領域であり得る。
上記第3領域は、野生型CRISPR酵素のHNHドメインの全部または一部であり得る。
上記第3領域は、野生型CRISPR酵素のHNHドメインの金属依存性核酸切断部位(metal dependent nucleic acid cleaving region)を含むHNHドメインの一部であり得る。
この時、上記HNHドメインの金属依存性核酸切断部位は、HNHドメインで金属と相互作用によって標的位置の核酸間の結合を切断できる領域を意味することになる。
上記第4領域は、標的遺伝子または核酸内の特定のヌクレオチド配列、すなわち、PAM(Protospacer adjacent motif)を認識できる野生型CRISPR酵素の一部であり得る。
上記第4領域は、標的遺伝子または核酸内の特定のヌクレオチド配列、すなわち、PAM(Protospacer adjacent motif)と相互作用する野生型CRISPR酵素の一部であり得る。
上記第4領域は、gRNAのヌクレオチド配列の一部と相互作用する野生型CRISPR酵素の一部であり得る。
上記第4領域は、野生型CRISPR酵素のNUCローブ(lobe)に位置した領域であり得る。
上記第4領域は、野生型CRISPR酵素のPIドメインの全部または一部であり得る。
上記人為的に操作されたCRISPR酵素は、野生型CRISPR酵素の第1領域、第2領域、第3領域、および第4領域のうち選択された1つ以上の領域内のアミノ酸配列のうち少なくとも1つ以上のアミノ酸を変形させたCRISPR酵素変異体であり得る。
上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素の第1領域内のアミノ酸配列のうち少なくとも1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素の第2領域内のアミノ酸配列のうち少なくとも1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素の第3領域内のアミノ酸配列のうち少なくとも1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素の第4領域内のアミノ酸配列のうち少なくとも1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素の第1領域および第2領域内のアミノ酸配列のうち少なくとも2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、上記第1領域および第2領域は、それぞれ少なくとも1つ以上の変形されたアミノ酸を含むことができる。
上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素の第1領域および第3領域内のアミノ酸配列のうち少なくとも2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、上記第1領域および第3領域は、それぞれ少なくとも1つ以上の変形されたアミノ酸を含むことができる。
上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素の第1領域および第4領域内のアミノ酸配列のうち少なくとも2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、上記第1領域および第4領域は、それぞれ少なくとも1つ以上の変形されたアミノ酸を含むことができる。
上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素の第2領域および第3領域内のアミノ酸配列のうち少なくとも2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、上記第2領域および第3領域は、それぞれ少なくとも1つ以上の変形されたアミノ酸を含むことができる。
上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素の第2領域および第4領域内のアミノ酸配列のうち少なくとも2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、上記第2領域および第4領域は、それぞれ少なくとも1つ以上の変形されたアミノ酸を含むことができる。
上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素の第3領域および第4領域内のアミノ酸配列のうち少なくとも2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、上記第3領域および第4領域は、それぞれ少なくとも1つ以上の変形されたアミノ酸を含むことができる。
上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素の第1領域、第2領域、および第3領域内のアミノ酸配列のうち少なくとも3つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、上記第1領域、第2領域および第3領域は、それぞれ少なくとも1つ以上の変形されたアミノ酸を含むことができる。
上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素の第1領域、第2領域、および第4領域内のアミノ酸配列のうち少なくとも3つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、上記第1領域、第2領域および第4領域は、それぞれ少なくとも1つ以上の変形されたアミノ酸を含むことができる。
上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素の第1領域、第3領域、および第4領域内のアミノ酸配列のうち少なくとも3つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、上記第1領域、第3領域および第4領域は、それぞれ少なくとも1つ以上の変形されたアミノ酸を含むことができる。
上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素の第2領域、第3領域、および第4領域内のアミノ酸配列のうち少なくとも3つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、上記第2領域、第3領域および第4領域は、それぞれ少なくとも1つ以上の変形されたアミノ酸を含むことができる。
上記CRISPR酵素変異体は、野生型CRISPR酵素の第1領域、第2領域、第3領域、および第4領域内のアミノ酸配列のうち少なくとも4つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、上記第1領域、第2領域、第3領域および第4領域は、それぞれ少なくとも1つ以上の変形されたアミノ酸を含むことができる。
上記CRISPR酵素変異体は、上記1つ以上の領域から選択された少なくとも1つ以上のアミノ酸の変形を含むことができる。
この時、上記変形は、上記選択された1つ以上のアミノ酸の除去であり得る。
この時、上記変形は、上記選択された1つ以上のアミノ酸の他のアミノ酸への置換であり得る。
一例として、上記他のアミノ酸は、上記選択されたアミノ酸の立体異性体であり得る。
例えば、上記変形は、野生型CRISPR酵素の第1領域内に位置したL-グルタミンをD-グルタミンで置換することであり得る。
別の例として、上記他のアミノ酸は、上記選択されたアミノ酸の疏水性指標(hydropathy index)より小さい疏水性指標を有するアミノ酸であり得る。
例えば、上記変形は、野生型CRISPR酵素の第2領域内に位置したフェニルアラニン(疏水性指標:2.8)を疏水性指標がより小さいグリシン(疏水性指標:-0.4)で置換することであり得る。
また、他の一例として、上記他のアミノ酸は、上記選択されたアミノ酸の疏水性指標(hydropathy index)より大きい疏水性指標を有するアミノ酸であり得る。
例えば、上記変形は、野生型CRISPR酵素の第1領域内に位置したセリン(疏水性指標:-0.8)を疏水性指標がより大きいロイシン(疏水性指標:3.8)で置換することであり得る。
一例として、上記他のアミノ酸は、上記選択されたアミノ酸の官能基(functional group)より大きさが小さい官能基を有するアミノ酸であり得る。
例えば、上記変形は、野生型CRISPR酵素の第3領域内に位置したバリンをバリンの官能基より小さい官能基を有するアラニンで置換することであり得る。
別の例として、上記他のアミノ酸は、上記選択されたアミノ酸の官能基(functional group)より大きさが大きい官能基を有するアミノ酸であり得る。
例えば、上記変形は、野生型CRISPR酵素の第2領域内に位置したグリシンをグリシンの官能基より大きい官能基を有するヒスチジンで置換することであり得る。
一例として、上記他のアミノ酸は、上記選択されたアミノ酸の疏水性(hydrophobicity)より疏水性が増加したアミノ酸であり得る。
例えば、上記変形は、野生型CRISPR酵素の第1領域内に位置したアスパラギン(Kyte-Doolittle hydrophobicity:-3.5)をトレオニン(Kyte-Doolittle hydrophobicity:-0.7)で置換することであり得る。
別の例として、上記他のアミノ酸は、上記選択されたアミノ酸の疏水性(hydrophobicity)より疏水性が低下したアミノ酸であり得る。
例えば、上記変形は、野生型CRISPR酵素の第4領域内に位置したシステイン(Kyte-Doolittle hydrophobicity:2.5)をプロリン(Kyte-Doolittle hydrophobicity:-1.6)で置換することであり得る。
一例として、上記他のアミノ酸は、上記選択されたアミノ酸より大きさが大きいアミノ酸であり得る。
例えば、上記変形は、野生型CRISPR酵素の第3領域内に位置したリジン(分子量:146.189)をトリプトファン(分子量:204.228)で置換することであり得る。
別の例として、上記他のアミノ酸は、上記選択されたアミノ酸より大きさが小さいアミノ酸であり得る。
例えば、上記変形は、野生型CRISPR酵素の第2領域内に位置したフェニルアラニン(分子量:165.192)をグルタミン酸(分子量:147.131)で置換することであり得る。
一例として、上記他のアミノ酸は、上記選択されたアミノ酸とは異なる電荷を有するアミノ酸であり得る。
例えば、上記変形は、野生型CRISPR酵素の第2領域内に位置したグルタミン酸(負電荷)をロイシン(中性電荷)で置換することであり得る。
別の例として、上記他のアミノ酸は、上記選択されたアミノ酸と異なる分類(class)の官能基を有するアミノ酸であり得る。この時、上記分類は、脂肪族(aliphatic)、芳香族(aromatic)、非環状(acyclic)、環状(cyclic)、硫黄含有型(sulfur-containing)、およびヒドロキシル含有型(hydroxyl-containing)の中から選択される一つであり得る。
例えば、上記変形は、野生型CRISPR酵素の第3領域内に位置したフェニルアラニン(芳香族)をバリン(脂肪族)で置換することであり得る。
上記変形は、上記選択された1つ以上のアミノ酸が同じ数の他のアミノ酸への置換であり得る。
例えば、上記変形は、野生型CRISPR酵素の第1領域内に位置した1つのアラニンを1つのグリシンで置換することであり得る。または、上記変形は、野生型CRISPR酵素の第1領域内に位置した1つのアルギニンと第4領域内に位置した1つのヒスチジンを1つのロイシン(第1領域)と1つのセリン(第4領域)でそれぞれ置換することであり得る。または、上記変形は、野生型CRISPR酵素の第2領域内に位置した1つのアルギニンと1つのバリンおよび第3領域内に位置した1つのロイシンをそれぞれ1つのフェニルアラニン、すなわち合計3つのフェニルアラニンで置換することであり得る。
上記変形は、上記選択された1つ以上のアミノ酸が同一でない数の他のアミノ酸への置換であり得る。
例えば、上記変形は、野生型CRISPR酵素の第2領域内に位置した1つのロイシンをシステイン-アラニン-アラニン、すなわち、合計3つのアミノ酸で置換することであり得る。または、上記変形は、野生型CRISPR酵素の第1領域内に位置した1つのヒスチジンと第3領域に位置する連続した2つのアミノ酸であるアラニン-グルタミンをそれぞれメチオニン-バリン(第1領域)およびプロリン(第3領域)で置換することであり得る。または、上記変形は、野生型CRISPR酵素の第1領域内に位置した1つのグルタミン酸、第2領域内に位置する連続した3つのアミノ酸であるアラニン-ロイシン-ヒスチジンおよび第3領域内に位置する連続した2つのアミノ酸であるトリプトファン-セリンをそれぞれアラニン(第1領域)、メチオニン-プロリン(第2領域)、およびシステイン-アラニン-トレオニン-バリン(第3領域)で置換することであり得る。
上記人為的に操作されたCRISPR酵素は、野生型CRISPR酵素の第1領域、第2領域、第3領域、および第4領域のうち選択された1つ以上の領域内に少なくとも1つ以上のアミノ酸を付加させたCRISPR酵素変異体であり得る。
この時、上記付加は、上記選択された1つ以上の領域内に存在する1つ以上のアミノ酸のN-末端および/またはC-末端の位置に1つ以上のアミノ酸の付加であり得る。
一例として、上記付加は、上記選択された1つ以上の領域内に存在する1つ以上のアミノ酸のN-末端および/またはC-末端の位置に1つ以上の正電荷を有するアミノ酸の付加であり得る。
例えば、上記付加は、第1領域内に位置する選択された1つのアラニンのC-末端に1つのアルギニンを付加させたことであり得る。または、上記付加は、第3領域内に位置する選択されたグルタミン酸のN-末端に2つのアミノ酸であるヒスチジン-リジンを付加させたことであり得る。
別の例として、上記付加は、上記選択された1つ以上の領域内に存在する1つ以上のアミノ酸のN-末端および/またはC-末端の位置に1つ以上の負電荷を有するアミノ酸の付加であり得る。
例えば、上記付加は、第2領域内に位置する選択された1つのトレオニンのN-末端に1つのアスパラギン酸を付加させたことであり得る。または、第4領域内に位置する選択されたヒスチジンのC-末端に3つのアミノ酸であるグルタミン酸-アスパラギン酸-グルタミン酸を付加させたことであり得る。
また、他の一例として、上記付加は、上記選択された1つ以上の領域内に存在する1つ以上のアミノ酸のN-末端および/またはC-末端の位置に1つ以上の電荷を有さないアミノ酸の付加であり得る。
例えば、上記付加は、第2領域内に位置する選択された1つのシステインのC-末端に2つのアミノ酸であるセリン-バリンを付加させたことであり得る。または、上記付加は、第3領域内に位置する選択されたリジンのN-末端に5つのアミノ酸であるグリシン-プロリン-グルタミン-フェニルアラニン-ロイシンを付加させたことであり得る。
別の例として、上記付加は、上記選択された1つ以上の領域内に存在する1つ以上のアミノ酸のN-末端および/またはC-末端の位置に正電荷を有するアミノ酸、負電荷を有するアミノ酸、および電荷を有さないアミノ酸の中から選択された1つ以上のアミノ酸の付加であり得る。
例えば、上記付加は、第1領域内に位置する選択された1つのアルギニンのC-末端に6個のアミノ酸であるヒスチジン-アルギニン-グリシン-セリン-アラニン-グルタミン酸を付加させたことであり得る。または、上記付加は、第4領域内に位置する選択された1つのグリシンのN-末端に10個のアミノ酸であるリジン-リジン-アラニン-フェニルアラニン-グルタミン-トレオニン-メチオニン-システイン-アスパラギン酸-セリンを付加させたことであり得る。
上記付加は、上記選択された1つ以上の領域内に存在する1つ以上のアミノ酸のN-末端および/またはC-末端の位置に1つ以上の機能的(functional)ドメインの付加であり得る。
この時、上記機能的ドメインは、野生型CRISPR酵素の本来の機能、すなわち、DNAの二本鎖のうち第1鎖を切断する第1機能およびDNAの二本鎖のうち第2鎖を切断する第2機能以外に付加的な機能を有するドメインであり得る。
または、上記機能的ドメインは、野生型CRISPR酵素の本来の機能、すなわち、DNAの二本鎖のうち第1鎖を切断する第1機能および/またはDNAの二本鎖のうち第2鎖を切断する第2機能と類似の機能を有するドメインであり得る。
一例として、上記機能的ドメインは、メチラーゼ(methylase)活性、ジメチラーゼ(demethylase)活性、転写促進(transcription activation)活性、転写阻害(transcription repression)活性、転写放出因子(transcription release factor)活性、ヒストン変形(histone modification)活性、RNA切断(cleavage)活性、または核酸結合(nucleic acid binding)活性を有するドメインであり得る。
別の例として、上記機能的ドメインは、蛋白質(ペプチド含む)の単離精製のためのタグ(tag)またはレポーター遺伝子であり得る。この時、上記タグは、ヒスチジン(His)タグ、V5タグ、FLAGタグ、インフルエンザ血球凝集素(HA)タグ、Mycタグ、VSV-Gタグ、およびチオレドキシン(Trx)タグなどを含み、上記レポーター遺伝子は、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)、ホスラディッシュ(horseradish)過酸化酵素(HRP)、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ(CAT)、β-ガラクトシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光蛋白質(GFP)、HcRed、DsRed、青緑色蛍光蛋白質(CFP)、黄色蛍光蛋白質(YFP)、および青色蛍光蛋白質(BFP)を含む自己蛍光蛋白質を含むが、これらに限定されない。
また、他の一例として、上記機能的ドメインは、デアミナーゼ(deaminase)であり得る。この時、上記デアミナーゼは、アデニンデアミナーゼ(adenine deaminase)および/またはシチジンデアミナーゼ(cytidine deaminase)であり得る。
別の例として、上記機能的ドメインは、NLS(nuclear localization sequence or signal)またはNES(nuclear export sequence or signal)であり得る。
本明細書によって開示される内容の一実施例では、上記人為的に操作されたCRISPR酵素は人為的に操作されたCas9であり得る。
上記人為的に操作されたCas9は、野生型Cas9の特定の領域内のアミノ酸配列のうち少なくとも1つ以上のアミノ酸を変形させたCas9変異体であり得る。
上記人為的に操作されたCas9は、野生型Cas9の特定の領域内に少なくとも1つ以上のアミノ酸を付加させたCas9変異体であり得る。
この時、上記野生型Cas9の特定の領域は、第1領域、第2領域、第3領域、および第4領域のうち選択された1つ以上の領域であり得る。
上記第1領域は、gRNAと相互作用する野生型Cas9の一部であり得る。
上記第1領域は、標的配列と相互作用する野生型Cas9の一部であり得る。
上記第1領域は、gRNA-標的配列ヘテロ二本鎖(heteroduplex)と相互作用する野生型Cas9の一部であり得る。
上記第1領域は、gRNA-標的配列ヘテロ二本鎖(heteroduplex)のPAMと遠位端部位(PAM distal end)と相互作用する野生型Cas9の一部であり得る。
この時、上記gRNA-標的配列ヘテロ二本鎖(heteroduplex)のPAMと遠位端部位(PAM distal end)は、PAM位置から離れて位置するgRNA-標的配列ヘテロ二本鎖(heteroduplex)の末端の6~10個の塩基対、すなわち、gRNAの6~10個の塩基配列とこれと相補的に結合する標的配列の6~10個の塩基配列を意味することになる。
上記第1領域は、野生型Cas9のRECローブ(lobe)に位置した領域であり得る。
上記第1領域は、野生型Cas9のRECドメインの全部または一部であり得る。
上記第1領域は、野生型Cas9のRECドメインのC末端の300個のアミノ酸からなる領域であり得る。
上記第1領域は、野生型Cas9のRECドメインのN末端の220個のアミノ酸からなる領域であり得る。
一例として、上記野生型Cas9が野生型SpCas9(配列番号17)の場合、上記第1領域は野生型SpCas9の94番目のアスパラギン酸(D94)から717番目のグリシン(G717)までのアミノ酸配列の全部または一部であり得る。
一実施形態として、上記第1領域は、野生型SpCas9の196番目のフェニルアラニン(F196)から282番目のイソロイシン(I282)までのアミノ酸配列(第1-1領域、配列番号18)であり得る。
別の一実施形態として、上記第1領域は、野生型SpCas9の316番目のプロリン(P316)から394番目のアスパラギン(N394)までのアミノ酸配列(第1-2領域、配列番号19)であり得る。
また、他の一実施形態として、上記第1領域は、野生型SpCas9の510番目のリジン(K510)から612番目のアスパラギン(N612)までのアミノ酸配列(第1-3領域、配列番号20)であり得る。
別の一実施形態として、上記第1領域は、野生型SpCas9の678番目のトレオニン(T678)から698番目のヒスチジン(H698)までのアミノ酸配列(第1-4領域、配列番号21)であり得る。
一実施形態として、上記第1領域は、野生型SpCas9の196番目のフェニルアラニン(F196)から282番目のイソロイシン(I282)までのアミノ酸配列(第1-1領域)、316番目のプロリン(P316)から394番目のアスパラギン(N394)までのアミノ酸配列(第1-2領域)、510番目のリジン(K510)から612番目のアスパラギン(N612)までのアミノ酸配列(第1-3領域)、および678番目のトレオニン(T678)から698番目のヒスチジン(H698)までのアミノ酸配列(第1-4領域)の中から選択された2つの領域であり得る。
別の一実施形態として、上記第1領域は、野生型SpCas9の196番目のフェニルアラニン(F196)から282番目のイソロイシン(I282)までのアミノ酸配列(第1-1領域)、316番目のプロリン(P316)から394番目のアスパラギン(N394)までのアミノ酸配列(第1-2領域)、510番目のリジン(K510)から612番目のアスパラギン(N612)までのアミノ酸配列(第1-3領域)、および678番目のトレオニン(T678)から698番目のヒスチジン(H698)までのアミノ酸配列(第1-4領域)の中から選択された3つの領域であり得る。
また、他の一実施形態として、上記第1領域は、野生型SpCas9の196番目のフェニルアラニン(F196)から282番目のイソロイシン(I282)までのアミノ酸配列(第1-1領域)、316番目のプロリン(P316)から394番目のアスパラギン(N394)までのアミノ酸配列(第1-2領域)、510番目のリジン(K510)から612番目のアスパラギン(N612)までのアミノ酸配列(第1-3領域)、および678番目のトレオニン(T678)から698番目のヒスチジン(H698)までのアミノ酸配列(第1-4領域)であり得る。
別の例として、上記野生型Cas9が野生型SaCas9の場合、上記第1領域は、野生型SaCas9の75番目のアスパラギン(N75)から426番目のリジン(K426)までのアミノ酸配列の全部または一部であり得る。
一実施形態として、上記第1領域は、野生型SaCas9の207番目のトレオニン(T207)から426番目のリジン(K426)までのアミノ酸配列であり得る。
上記第2領域は、野生型Cas9の第1機能または第2機能を果たす野生型Cas9の一部であり得る。
上記第2領域は、gRNAと相互作用する野生型Cas9の一部であり得る。
上記第2領域は、標的配列と相互作用する野生型Cas9の一部であり得る。
上記第2領域は、gRNA-標的配列ヘテロ二本鎖(heteroduplex)と相互作用する野生型Cas9の一部であり得る。
上記第2領域は、gRNA-標的配列ヘテロ二本鎖(heteroduplex)のPAMと遠位端部位(PAM distal end)と相互作用する野生型Cas9の一部であり得る。
この時、上記gRNA-標的配列ヘテロ二本鎖(heteroduplex)のPAMと遠位端部位(PAM distal end)は、PAM位置から離れて位置するgRNA-標的配列ヘテロ二本鎖(heteroduplex)の末端の6~10個の塩基対、すなわち、gRNAの6~10個の塩基配列とこれと相補的に結合する標的配列の6~10個の塩基配列を意味することになる。
上記第2領域は、野生型Cas9のNUCローブ(lobe)に位置した領域であり得る。
上記第2領域は、野生型Cas9のNUCローブ(lobe)のエンドキャッピングループ(end-capping loop)を含む領域であり得る。
この時、上記エンドキャッピングループ(end-capping loop)は、gRNA-標的配列ヘテロ二本鎖(heteroduplex)のPAM(Protospacer adjacent motif)と遠位端部位(PAM distal end)と相互作用する領域であり得る。
例えば、野生型SpCas9の場合、上記エンドキャッピングループ(end-capping loop)は、野生型SpCas9の1001番目のチロシン(Y1001)から1030番目のグリシン(G1030)までの領域であり得る。
上記第2領域は、野生型Cas9のRuvCドメインの全部または一部であり得る。
上記第2領域は、野生型Cas9のRuvCドメインの金属依存性核酸切断部位(metal dependent nucleic acid cleaving region)を含むRuvCドメインの一部であり得る。
この時、上記RuvCドメインの金属依存性核酸切断部位は、RuvCドメインで金属と相互作用によって標的位置の核酸間の結合を切断できる領域を意味することになる。
上記金属依存性核酸切断部位は、金属と相互作用する部分と標的位置の核酸間の結合を切断する部分とからなり得る。
一例として、上記野生型Cas9が野生型SpCas9の場合、上記第2領域は、野生型SpCas9の1番目のメチオニン(M1)から59番目のアラニン(A59)までのアミノ酸配列(RuvC I領域)の全部または一部であり得る。
上記第2領域は、野生型SpCas9の718番目のアスパラギン酸(D718)から774番目のグルタミン(Q774)までのアミノ酸配列(RuvC II領域)の全部または一部であり得る。
上記第2領域は、野生型SpCas9の909番目のセリン(S909)から1098番目のトレオニン(T1098)までのアミノ酸配列(RuvC III領域)の全部または一部であり得る。
上記第2領域は、野生型SpCas9のRuvC I領域、RuvC II領域および/またはRuvC III領域であり得る。
一実施形態として、上記第2領域は、野生型SpCas9の1番目のメチオニン(M1)から22番目のトレオニン(T22)までのアミノ酸配列(第2-1領域、配列番号22)であり得る。
別の一実施形態として、上記第2領域は、野生型SpCas9の731番目のプロリン(P731)から770番目のトレオニン(T770)までのアミノ酸配列(第2-2領域、配列番号23)であり得る。
また、他の一実施形態として、上記第2領域は、野生型SpCas9の926番目のグルタミン(Q926)から1000番目のリジン(K1000)までのアミノ酸配列(第2-3領域、配列番号24)であり得る。
別の一実施形態として、上記第2領域は、野生型SpCas9の1001番目のチロシン(Y1001)から1040番目のセリン(S1040)までのアミノ酸配列(第2-4領域、配列番号25)であり得る。
一実施形態として、上記第2領域は、野生型SpCas9の1番目のメチオニン(M1)から22番目のトレオニン(T22)までのアミノ酸配列(第2-1領域)および731番目のプロリン(P731)から770番目のトレオニン(T770)までのアミノ酸配列(第2-2領域)であり得る。
別の一実施形態として、上記第2領域は、野生型SpCas9の1番目のメチオニン(M1)から22番目のトレオニン(T22)までのアミノ酸配列(第2-1領域)および926番目のグルタミン(Q926)から1000番目のリジン(K1000)までのアミノ酸配列(第2-3領域)であり得る。
また、他の一実施形態として、上記第2領域は、野生型SpCas9の1番目のメチオニン(M1)から22番目のトレオニン(T22)までのアミノ酸配列(第2-1領域)および1001番目のチロシン(Y1001)から1040番目のセリン(S1040)までのアミノ酸配列(第2-4領域)であり得る。
一実施形態として、上記第2領域は、野生型SpCas9の731番目のプロリン(P731)から770番目のトレオニン(T770)までのアミノ酸配列(第2-2領域)および926番目のグルタミン(Q926)から1000番目のリジン(K1000)までのアミノ酸配列(第2-3領域)であり得る。
別の一実施形態として、上記第2領域は、野生型SpCas9の731番目のプロリン(P731)から770番目のトレオニン(T770)までのアミノ酸配列(第2-2領域)および1001番目のチロシン(Y1001)から1040番目のセリン(S1040)までのアミノ酸配列(第2-4領域)であり得る。
また、他の一実施形態として、上記第2領域は、野生型SpCas9の926番目のグルタミン(Q926)から1000番目のリジン(K1000)までのアミノ酸配列(第2-3領域)および1001番目のチロシン(Y1001)から1040番目のセリン(S1040)までのアミノ酸配列(第2-4領域)であり得る。
一実施形態として、上記第2領域は、野生型SpCas9の1番目のメチオニン(M1)から22番目のトレオニン(T22)までのアミノ酸配列(第2-1領域)、731番目のプロリン(P731)から770番目のトレオニン(T770)までのアミノ酸配列(第2-2領域)および926番目のグルタミン(Q926)から1000番目のリジン(K1000)までのアミノ酸配列(第2-3領域)であり得る。
別の一実施形態として、上記第2領域は、野生型SpCas9の1番目のメチオニン(M1)から22番目のトレオニン(T22)までのアミノ酸配列(第2-1領域)、731番目のプロリン(P731)から770番目のトレオニン(T770)までのアミノ酸配列(第2-2領域)、および1001番目のチロシン(Y1001)から1040番目のセリン(S1040)までのアミノ酸配列(第2-4領域)であり得る。
また、他の一実施形態として、上記第2領域は、野生型SpCas9の731番目のプロリン(P731)から770番目のトレオニン(T770)までのアミノ酸配列(第2-2領域)、926番目のグルタミン(Q926)から1000番目のリジン(K1000)までのアミノ酸配列(第2-3領域)、および1001番目のチロシン(Y1001)から1040番目のセリン(S1040)までのアミノ酸配列(第2-4領域)であり得る。
別の一実施形態として、上記第2領域は、野生型SpCas9の1番目のメチオニン(M1)から22番目のトレオニン(T22)までのアミノ酸配列(第2-1領域)、731番目のプロリン(P731)から770番目のトレオニン(T770)までのアミノ酸配列(第2-2領域)、926番目のグルタミン(Q926)から1000番目のリジン(K1000)までのアミノ酸配列(第2-3領域)、および1001番目のチロシン(Y1001)から1040番目のセリン(S1040)までのアミノ酸配列(第2-4領域)であり得る。
別の例として、上記野生型Cas9が野生型SaCas9の場合、上記第2領域は、野生型SaCas9の1番目のメチオニン(M1)から41番目のバリン(V41)までのアミノ酸配列(RuvC I領域)の全部または一部であり得る。
上記第2領域は、野生型SaCas9の436番目のイソロイシン(I436)から481番目のグルタミン酸(E481)までのアミノ酸配列(RuvC II領域)の全部または一部であり得る。
上記第2領域は、野生型SaCas9の651番目のチロシン(Y651)から775番目のバリン(V775)までのアミノ酸配列(RuvC III領域)の全部または一部であり得る。
上記第2領域は、野生型SaCas9のRuvC I領域、RuvC II領域および/またはRuvC III領域であり得る。
一実施形態として、上記第2領域は、野生型SaCas9の1番目のメチオニン(M1)から25番目のトレオニン(T25)までのアミノ酸配列(第2-1領域)であり得る。
別の一実施形態として、上記第2領域は、野生型SaCas9の471番目のプロリン(P471)から481番目のグルタミン酸(E481)までのアミノ酸配列(第2-2領域)であり得る。
また、他の一実施形態として、上記第2領域は、野生型SaCas9の667番目のアスパラギン(N667)から740番目のセリン(S740)までのアミノ酸配列(第2-3領域)であり得る。
上記第3領域は、野生型Cas9の第1機能または第2機能を果たす野生型Cas9の一部であり得る。
上記第3領域は、gRNAと相互作用する野生型Cas9の一部であり得る。
上記第3領域は、標的配列と相互作用する野生型Cas9の一部であり得る。
上記第3領域は、gRNA-標的配列ヘテロ二本鎖(heteroduplex)と相互作用する野生型Cas9の一部であり得る。
上記第3領域は、gRNA-標的配列ヘテロ二本鎖(heteroduplex)のPAMと遠位端部位(PAM distal end)と相互作用する野生型Cas9の一部であり得る。
この時、上記gRNA-標的配列ヘテロ二本鎖(heteroduplex)のPAMと遠位端部位(PAM distal end)は、PAM位置から離れて位置するgRNA-標的配列ヘテロ二本鎖(heteroduplex)の末端の6~10個の塩基対、すなわち、gRNAの6~10個の塩基配列とこれと相補的に結合する標的配列の6~10個の塩基配列を意味することになる。
上記第3領域は、野生型Cas9のNUCローブ(lobe)に位置した領域であり得る。
上記第3領域は、野生型Cas9のHNHドメインの全部または一部であり得る。
上記第3領域は、野生型Cas9のHNHドメインの金属依存性核酸切断部位(metal dependent nucleic acid cleaving region)を含むHNHドメインの一部であり得る。
この時、上記HNHドメインの金属依存性核酸切断部位は、HNHドメインで金属と相互作用によって標的位置の核酸間の結合を切断できる領域を意味することになる。
一例として、上記野生型Cas9が野生型SpCas9の場合、上記第3領域は、野生型SpCas9の775番目のリジン(K775)から908番目のロイシン(L908)までのアミノ酸配列の全部または一部であり得る。
一実施形態として、上記第3領域は、野生型SpCas9の775番目のリジン(K775)から900番目のロイシン(L900)までのアミノ酸配列(第3-1領域、配列番号26)であり得る。
別の例として、上記野生型Cas9が野生型SaCas9の場合、上記第3領域は、野生型SaCas9の521番目のイソロイシン(I521)から629番目のグルタミン酸(E629)までのアミノ酸配列の全部または一部であり得る。
一実施形態として、上記第3領域は、野生型SaCas9の523番目のリジン(K523)から627番目のロイシン(L627)までのアミノ酸配列(第3-1領域)であり得る。
上記第4領域は、標的遺伝子または核酸内の特定のヌクレオチド配列、すなわち、PAM(Protospacer adjacent motif)を認識できる野生型Cas9の一部であり得る。
上記第4領域は、標的遺伝子または核酸内の特定のヌクレオチド配列、すなわち、PAM(Protospacer adjacent motif)と相互作用する野生型Cas9の一部であり得る。
上記第4領域は、gRNAのヌクレオチド配列の一部と相互作用する野生型Cas9の一部であり得る。
上記第4領域は、野生型Cas9のNUCローブ(lobe)に位置した領域であり得る。
上記第4領域は、野生型Cas9のPIドメインの全部または一部であり得る。
一例として、上記野生型Cas9が野生型SpCas9の場合、上記第4領域は、野生型SpCas9の1099番目のグルタミン酸(E1099)から1368番目のアスパラギン酸(D1368)までのアミノ酸配列の全部または一部であり得る。
一実施形態として、上記第4領域は、野生型SpCas9の1099番目のグルタミン酸(E1099)から1139番目のバリン(V1139)までのアミノ酸配列(第4-1領域、配列番号27)であり得る。
別の例として、上記野生型Cas9が野生型SaCas9の場合、上記第4領域は、野生型SaCas9の910番目のリジン(K910)から1053番目のグリシン(G1053)までのアミノ酸配列の全部または一部であり得る。
一実施形態として、上記第4領域は、野生型SaCas9の910番目のリジン(K910)から970番目のアスパラギン酸(D970)までのアミノ酸配列(第4-1領域)であり得る。
上記人為的に操作されたCas9は、野生型Cas9の第1領域、第2領域、第3領域、および第4領域のうち選択された1つ以上の領域内のアミノ酸配列のうち少なくとも1つ以上のアミノ酸を変形させたCas9変異体であり得る。
上記Cas9変異体は、野生型Cas9の第1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
一例として、上記野生型Cas9が野生型SpCas9の場合、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-1領域のうち脂肪族(aliphatic)またはアマイド(amide)系の官能基を有するアミノ酸、すなわち、N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281およびI282の中から選択された1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
別の一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-2領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-2領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391およびL393からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-3領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-3領域のうちK510,Y515,F539,G582,V583,E584,D585,N588およびI601からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-3領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606およびL607からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
別の一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-4領域のうちN692,M694,Q695およびH698からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-4領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696およびI697からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
また、他の一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域、および第1-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、選択された2つ以上のアミノ酸は、それぞれ異なる領域内に位置することができる。または、選択された2つ以上のアミノ酸は同じ領域内に位置することができる。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域、および第1-4領域のうち、N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696およびI697からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域、および第1-4領域のうち、A203,N277,G366,K510,Y515,F539,G582,V583,E584,D585,N588,I601,N692,M694,Q695およびH698からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-3領域および第1-4領域のうち、K510,Y515,F539,G582,V583,E584,D585,N588,I601,N692,M694,Q695およびH698からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-3領域および第1-4領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696およびI697からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
別の一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域、および第1-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された3つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、選択された3つ以上のアミノ酸は、それぞれ異なる領域内に位置することができる。または、選択された3つ以上のアミノ酸は同じ領域内に位置することができる。または、選択された3つ以上のアミノ酸は、それぞれ同じ領域または異なる領域内に位置することができる。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9のN199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696およびI697からなる群より選択される3つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域、および第1-4領域のうち、A203,N277,G366,K510,Y515,F539,G582,V583,E584,D585,N588,I601,N692,M694,Q695およびH698からなる群より選択される3つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-3領域、および第1-4領域のうち、A203,N277,K510,Y515,F539,G582,V583,E584,D585,N588,I601,N692,M694,Q695およびH698からなる群より選択される3つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-2領域、第1-3領域、および第1-4領域のうち、G366,K510,Y515,F539,G582,V583,E584,D585,N588,I601,N692,M694,Q695およびH698からなる群より選択される3つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
上記Cas9変異体は、野生型Cas9の第2領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
一例として、上記野生型Cas9が野生型SpCas9の場合、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-1領域のうち、I7,G8,L9,D10,I11およびG12からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-1領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、I7,G8,L9,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20およびI21からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
別の一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-2領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-2領域のうち、I761,E762,M763,R765,E766およびN767からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-2領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,M763およびA764からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
また、他の一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-3領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-3領域のうち、D965,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987およびY988からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-3領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,F966,F970,F972,V975,U978,A984,A987,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997およびI998からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
別の一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-4領域のうち、Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,Y1036,F1037,F1038およびY1039からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-4領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、P1002,L1004,F1008,V1009,G1011,V1015,V1018,M1021,I1022,A1023,I1029,G1030,A1032,A1034,F1037およびF1038からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-1領域および第2-2領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、選択された2つ以上のアミノ酸は、それぞれ第2-1領域および第2-2領域内に位置することができる。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-1領域および第2-2領域のうち、I7,G8,L9,D10,I11,G12,I761,E762,M763,R765,E766およびN767からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-1領域および第2-2領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、I7,G8,L9,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,M763およびA764からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
別の一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-1領域および第2-3領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、選択された2つ以上のアミノ酸は、それぞれ第2-1領域および第2-3領域内に位置することができる。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-1領域および第2-3領域のうち、I7,G8,L9,D10,I11,G12,D965,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987およびY988からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-1領域および第2-3領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、I7,G8,L9,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,F966,F970,F972,V975,U978,A984,A987,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997およびI998からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
また、他の一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-1領域および第2-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、選択された2つ以上のアミノ酸は、それぞれ第2-1領域および第2-4領域内に位置することができる。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-1領域および第2-4領域のうち、I7,G8,L9,D10,I11,G12,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,Y1036,F1037,F1038およびY1039からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-1領域および第2-4領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、I7,G8,L9,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,P1002,L1004,F1008,V1009,G1011,V1015,V1018,M1021,I1022,A1023,I1029,G1030,A1032,A1034,F1037およびF1038からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-2領域および第2-3領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、選択された2つ以上のアミノ酸は、それぞれ第2-2領域および第2-3領域内に位置することができる。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-2領域および第2-3領域のうち、I761,E762,M763,R765,E766,N767,D965,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987およびY988からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-2領域および第2-3領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,M763,A764,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,F966,F970,F972,V975,U978,A984,A987,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997およびI998からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
別の一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-2領域および第2-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、選択された2つ以上のアミノ酸は、それぞれ第2-2領域および第2-4領域内に位置することができる。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-2領域および第2-4領域のうち、I761,E762,M763,R765,E766,N767,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,Y1036,F1037,F1038およびY1039からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-2領域および第2-4領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,M763,A764,P1002,L1004,F1008,V1009,G1011,V1015,V1018,M1021,I1022,A1023,I1029,G1030,A1032,A1034,F1037およびF1038からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
また、他の一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-3領域および第2-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、選択された2つ以上のアミノ酸は、それぞれ第2-3領域および第2-4領域内に位置することができる。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-3領域および第2-4領域のうち、D965,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987,Y988,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,Y1036,F1037,F1038およびY1039からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-3領域および第2-4領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,F966,F970,F972,V975,U978,A984,A987,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997,I998,P1002,L1004,F1008,V1009,G1011,V1015,V1018,M1021,I1022,A1023,I1029,G1030,A1032,A1034,F1037およびF1038からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-1領域、第2-2領域、および第2-3領域内のアミノ酸配列のうち選択された3つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、選択された3つ以上のアミノ酸は、それぞれ第2-1領域、第2-2領域、および第2-3領域内に位置することができる。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-1領域、第2-2領域、および第2-3領域のうち、I7,G8,L9,D10,I11,G12,I761,E762,M763,R765,E766,N767,D965,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987およびY988からなる群より選択される3つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-1領域、第2-2領域、および第2-3領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、I7,G8,L9,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,M763,A764,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,F966,F970,F972,V975,U978,A984,A987,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997およびI998からなる群より選択される3つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
別の一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-1領域、第2-2領域、および第2-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された3つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、選択された3つ以上のアミノ酸は、それぞれ第2-1領域、第2-2領域、および第2-4領域内に位置することができる。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-1領域、第2-2領域、および第2-4領域のうち、I7,G8,L9,D10,I11,G12,I761,E762,M763,R765,E766,N767,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,Y1036,F1037,F1038およびY1039からなる群より選択される3つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-1領域、第2-2領域、および第2-4領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、I7,G8,L9,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,M763,A764,P1002,L1004,F1008,V1009,G1011,V1015,V1018,M1021,I1022,A1023,I1029,G1030,A1032,A1034,F1037およびF1038からなる群より選択される3つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
また、他の一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-2領域、第2-3領域、および第2-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された3つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、選択された3つ以上のアミノ酸は、それぞれ第2-2領域、第2-3領域、および第2-4領域内に位置することができる。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-2領域、第2-3領域、および第2-4領域のうち、I761,E762,M763,R765,E766,N767,D965,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987,Y988,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,Y1036,F1037,F1038およびY1039からなる群より選択される3つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-2領域、第2-3領域、および第2-4領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,M763,A764,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,F966,F970,F972,V975,U978,A984,A987,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997,I998,P1002,L1004,F1008,V1009,G1011,V1015,V1018,M1021,I1022,A1023,I1029,G1030,A1032,A1034,F1037およびF1038からなる群より選択される3つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
また、他の一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域、および第2-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された3つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、選択された3つ以上のアミノ酸は、それぞれ第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域、および第2-4領域内に位置することができる。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域、および第2-4領域のうち、I7,G8,L9,D10,I11,G12,I761,E762,M763,R765,E766,N767,D965,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987,Y988,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,Y1036,F1037,F1038およびY1039からなる群より選択される3つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域、および第2-4領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、I7,G8,L9,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,M763,A764,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,F966,F970,F972,V975,U978,A984,A987,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997,I998,P1002,L1004,F1008,V1009,G1011,V1015,V1018,M1021,I1022,A1023,I1029,G1030,A1032,A1034,F1037およびF1038からなる群より選択される3つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
上記Cas9変異体は、野生型Cas9の第3領域内のアミノ酸配列のうち少なくとも1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
一例として、上記野生型Cas9が野生型SpCas9の場合、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第3領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第3-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第3-1領域のうち、V838,D839,H840,D853,N854,K855,K862,N863,R864,A889,K890およびL891からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第3-1領域のうち電荷(charge)を有するアミノ酸、すなわち、K775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,D839,H840,K848,D849,D850,D853,K855,R859,D861,K862,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,K890,R895,K896およびD898からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
上記Cas9変異体は、野生型Cas9の第4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
一例として、上記野生型Cas9が野生型SpCas9の場合、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第4-1領域のうち、T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
上記Cas9変異体は、野生型Cas9の第1領域および第2領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、上記第1領域および第2領域は、それぞれ少なくとも1つ以上の変形されたアミノ酸を含むことができる。
一例として、上記野生型Cas9が野生型SpCas9の場合、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1領域および第2領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、上記第1領域および第2領域は、それぞれ少なくとも1つ以上の変形されたアミノ酸を含むことができる。
一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-1領域および第2-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-1領域および第2-1領域のうち、I7,G8,L9,D10,I11,G12,N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281およびI282からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
別の一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-1領域および第2-2領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-1領域および第2-2領域のうち、N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,I761,E762,M763,R765,E766およびN767からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
また、他の一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-1領域および第2-3領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-1領域および第2-3領域のうち、N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,D965,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987およびY988からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
別の一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-1領域および第2-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-1領域および第2-4領域のうち、N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038およびY1039からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-2領域および第2-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-2領域および第2-1領域のうち、I7,G8,L9,D10,I11,G12,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391およびL393からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-2領域および第2-1領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、I7,G8,L9,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391およびL393からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
別の一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-2領域および第2-2領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-2領域および第2-2領域のうち、P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,I761,E762,M763,R765,E766およびN767からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
また、他の一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-2領域および第2-3領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-2領域および第2-3領域のうち、P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,D965,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987およびY988からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
別の一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-2領域および第2-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-2領域および第2-4領域のうち、P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038およびY1039からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-3領域および第2-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-3領域および第2-1領域のうち、I7,G8,L9,D10,I11,G12,K510,Y515,F539,G582,V583,E584,D585,N588およびI601からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-3領域および第2-1領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、I7,G8,L9,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606およびL607からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
別の一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-3領域および第2-2領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-3領域および第2-2領域のうち、K510,Y515,F539,G582,V583,E584,D585,N588,I601,I761,E762,M763,R765,E766およびN767からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-3領域および第2-2領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,M763およびA764からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
また、他の一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-3領域および第2-3領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-3領域および第2-3領域のうち、K510,Y515,F539,G582,V583,E584,D585,N588,I601,D965,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987およびY988からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-3領域および第2-3領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,F966,F970,F972,V975,U978,A984,A987,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997およびI998からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
別の一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-3領域および第2-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-3領域および第2-4領域のうち、K510,Y515,F539,G582,V583,E584,D585,N588,I601,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038およびY1039からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-3領域および第2-4領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,P1002,L1004,F1008,V1009,G1011,V1015,V1018,M1021,I1022,A1023,I1029,G1030,A1032,A1034,F1037およびF1038からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-4領域および第2-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-4領域および第2-1領域のうち、I7,G8,L9,D10,I11,G12,N692,M694,Q695およびH698からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-4領域および第2-1領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、I7,G8,L9,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696およびI697からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
別の一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-4領域および第2-2領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-4領域および第2-2領域のうち、N692,M694,Q695,H698,I761,E762,M763,R765,E766およびN767からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-4領域および第2-2領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696,I697,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,M763およびA764からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
また、他の一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-4領域および第2-3領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-4領域および第2-3領域のうち、N692,M694,Q695,H698,D965,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987およびY988からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-4領域および第2-3領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696,I697,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,F966,F970,F972,V975,U978,A984,A987,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997およびI998からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
別の一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-4領域および第2-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-4領域および第2-4領域のうち、N692,M694,Q695,H698,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038およびY1039からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-4領域および第2-4領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696,I697,P1002,L1004,F1008,V1009,G1011,V1015,V1018,M1021,I1022,A1023,I1029,G1030,A1032,A1034,F1037およびF1038からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1領域および第2領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
この時、上記第1領域は、第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域、および第1-4領域であり得る。
この時、上記第2領域は、第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域、および第2-4領域であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1領域および第2領域のうち、I7,G8,L9,D10,I11,G12,A203,N277,G366,K510,Y515,F539,G582,V583,E584,D585,N588,I601,N692,M694,Q695,H698,I761,E762,M763,R765,E766,N767,D965,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987,Y988,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038およびY1039からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1領域および第2領域のうち、I7,G8,L9,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696,I697,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,M763,A764,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,D965,F966,F970,F972,V975,U978,A984,A987,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997,I998,P1002,L1004,F1008,V1009,G1011,V1015,V1018,M1021,I1022,A1023,I1029,G1030,A1032,A1034,F1037およびF1038からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
上記Cas9変異体は、野生型Cas9の第1領域および第3領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、上記第1領域および第3領域は、それぞれ少なくとも1つ以上の変形されたアミノ酸を含むことができる。
一例として、上記野生型Cas9が野生型SpCas9の場合、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1領域および第3領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、上記第1領域および第3領域は、それぞれ少なくとも1つ以上の変形されたアミノ酸を含むことができる。
一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-1領域および第3-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-1領域および第3-1領域のうち、N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,V838,D839,H840,D853,N854,K855,K862,N863,R864,A889,K890およびL891からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-2領域および第3-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-2領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391およびL393、および第3-1領域のうち電荷を有するアミノ酸、すなわち、K775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,D839,H840,K848,D849,D850,D853,K855,R859,D861,K862,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,K890,R895,K896およびD898からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-3領域および第3-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-3領域および第3-1領域のうち、K510,Y515,F539,G582,V583,E584,D585,N588,I601,V838,D839,H840,D853,N854,K855,K862,N863,R864,A889,K890およびL891からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-3領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606およびL607、および第3-1領域のうち電荷を有するアミノ酸、すなわち、K775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,D839,H840,K848,D849,D850,D853,K855,R859,D861,K862,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,K890,R895,K896およびD898からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
別の一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-4領域および第3-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-4領域および第3-1領域のうち、N692,M694,Q695,H698,V838,D839,H840,D853,N854,K855,K862,N863,R864,A889,K890およびL891からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-4領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696およびI697、および第3-1領域のうち電荷を有するアミノ酸、すなわち、K775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,D839,H840,K848,D849,D850,D853,K855,R859,D861,K862,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,K890,R895,K896およびD898からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1領域および第3領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
この時、上記第1領域は、第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域、および第1-4領域であり得る。
この時、上記第3領域は、第3-1領域であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1領域および第3領域のうち、A203,N277,G366,K510,Y515,F539,G582,V583,E584,D585,N588,I601,N692,M694,Q695,H698,V838,D839,H840,D853,N854,K855,K862,N863,R864,A889,K890およびL891からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1領域および第3領域のうち、N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696,I697,K775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,D839,H840,K848,D849,D850,D853,K855,R859,D861,K862,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,K890,R895,K896およびD898からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
上記Cas9変異体は、野生型Cas9の第1領域および第4領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、上記第1領域および第4領域は、それぞれ少なくとも1つ以上の変形されたアミノ酸を含むことができる。
一例として、上記野生型Cas9が野生型SpCas9の場合、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1領域および第4領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、上記第1領域および第4領域は、それぞれ少なくとも1つ以上の変形されたアミノ酸を含むことができる。
一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-1領域および第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-1領域および第3-1領域のうち、N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-2領域および第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-2領域および第4-1領域のうち、P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-3領域および第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-3領域および第4-1領域のうち、K510,Y515,F539,G582,V583,E584,D585,N588,I601,T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-3領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606およびL607、および第4-1領域のうちT1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
別の一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-4領域および第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-4領域および第4-1領域のうち、N692,M694,Q695,H698,T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1-4領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696およびI697、および第4-1領域のうちT1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1領域および第4領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
この時、上記第1領域は、第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域、および第1-4領域であり得る。
この時、上記第4領域は、第4-1領域であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1領域および第4領域のうち、A203,N277,G366,K510,Y515,F539,G582,V583,E584,D585,N588,I601,N692,M694,Q695,H698,T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1領域および第4領域のうち、N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696,I697,T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
上記Cas9変異体は、野生型Cas9の第2領域および第3領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、上記第2領域および第3領域は、それぞれ少なくとも1つ以上の変形されたアミノ酸を含むことができる。
一例として、上記野生型Cas9が野生型SpCas9の場合、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2領域および第3領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、上記第2領域および第3領域は、それぞれ少なくとも1つ以上の変形されたアミノ酸を含むことができる。
一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-1領域および第3-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-1領域および第3-1領域のうち、I7,G8,L9,D10,I11,G12,V838,D839,H840,D853,N854,K855,K862,N863,R864,A889,K890およびL891からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-1領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、I7,G8,L9,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20およびI21、および第3-1領域のうち電荷を有するアミノ酸、すなわち、K775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,D839,H840,K848,D849,D850,D853,K855,R859,D861,K862,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,K890,R895,K896およびD898からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
別の一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-2領域および第3-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-2領域および第3-1領域のうち、I761,E762,M763,R765,E766,N767,V838,D839,H840,D853,N854,K855,K862,N863,R864,A889,K890およびL891からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-2領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,M763およびA764、および第3-1領域のうち電荷を有するアミノ酸、すなわち、K775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,D839,H840,K848,D849,D850,D853,K855,R859,D861,K862,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,K890,R895,K896およびD898からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
また、他の一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-3領域および第3-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-3領域および第3-1領域のうち、V838,D839,H840,D853,N854,K855,K862,N863,R864,A889,K890,L891,D965,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987およびY988からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-3領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,F966,F970,F972,V975,U978,A984,A987,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997およびI998、および第3-1領域のうち電荷を有するアミノ酸、すなわち、K775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,D839,H840,K848,D849,D850,D853,K855,R859,D861,K862,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,K890,R895,K896およびD898からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
別の一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-4領域および第3-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-4領域および第3-1領域のうち、V838,D839,H840,D853,N854,K855,K862,N863,R864,A889,K890,L891,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038およびY1039からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-4領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、P1002,L1004,F1008,V1009,G1011,V1015,V1018,M1021,I1022,A1023,I1029,G1030,A1032,A1034,F1037およびF1038、および第3-1領域のうち電荷を有するアミノ酸、すなわち、K775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,D839,H840,K848,D849,D850,D853,K855,R859,D861,K862,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,K890,R895,K896およびD898からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2領域および第3領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
この時、上記第2領域は、第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域、および第2-4領域であり得る。
この時、上記第3領域は、第3-1領域であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2領域および第3領域のうち、I7,G8,L9,D10,I11,G12,I761,E762,M763,R765,E766,N767,V838,D839,H840,D853,N854,K855,K862,N863,R864,A889,K890,L891,Y981,H982,H983,A984,H985,D965,D986,A987,Y988,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038およびY1039からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2領域および第3領域のうち、I7,G8,L9,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,M763,A764,K775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,D839,H840,K848,D849,D850,D853,K855,R859,D861,K862,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,K890,R895,K896,D898,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,D965,F966,F970,F972,V975,U978,A984,A987,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997,I998,P1002,L1004,F1008,V1009,G1011,V1015,V1018,M1021,I1022,A1023,I1029,G1030,A1032,A1034,F1037およびF1038からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
上記Cas9変異体は、野生型Cas9の第2領域および第4領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、上記第2領域および第4領域は、それぞれ少なくとも1つ以上の変形されたアミノ酸を含むことができる。
一例として、上記野生型Cas9が野生型SpCas9の場合、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2領域および第4領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、上記第2領域および第4領域は、それぞれ少なくとも1つ以上の変形されたアミノ酸を含むことができる。
一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-1領域および第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-1領域および第4-1領域のうち、I7,G8,L9,D10,I11,G12,T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-1領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、I7,G8,L9,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20およびI21、および第4-1領域のうち、T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
別の一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-2領域および第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-2領域および第4-1領域のうち、I761,E762,M763,R765,E766,N767,T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-2領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,M763およびA764、および第4-1領域のうち、T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
また、他の一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-3領域および第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-3領域および第4-1領域のうち、D965,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987,Y988,T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-3領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,F966,F970,F972,V975,U978,A984,A987,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997およびI998、および第4-1領域のうちT1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
別の一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-4領域および第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-4領域および第4-1領域のうち、Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038,Y1039,T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2-4領域のうち極性を有さないアミノ酸、すなわち、P1002,L1004,F1008,V1009,G1011,V1015,V1018,M1021,I1022,A1023,I1029,G1030,A1032,A1034,F1037およびF1038、および第4-1領域のうちT1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2領域および第4領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
この時、上記第2領域は、第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域、および第2-4領域であり得る。
この時、上記第4領域は、第4-1領域であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2領域および第4領域のうち、I7,G8,L9,D10,I11,G12,I761,E762,M763,R765,E766,N767,D965,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987,Y988,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038,Y1039,T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2領域および第4領域のうち、I7,G8,L9,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,M763,A764,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,D965,F966,F970,F972,V975,U978,A984,A987,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997,I998,P1002,L1004,F1008,V1009,G1011,V1015,V1018,M1021,I1022,A1023,I1029,G1030,A1032,A1034,F1038,Y1039,T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
上記Cas9変異体は、野生型Cas9の第3領域および第4領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、上記第3領域および第4領域は、それぞれ少なくとも1つ以上の変形されたアミノ酸を含むことができる。
一例として、上記野生型Cas9が野生型SpCas9の場合、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第3領域および第4領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、上記第3領域および第4領域は、それぞれ少なくとも1つ以上の変形されたアミノ酸を含むことができる。
一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第3-1領域および第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第3-1領域および第4-1領域のうち、V838,D839,H840,D853,N854,K855,K862,N863,R864,A889,K890,L891,T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第3-1領域のうち電荷を有するアミノ酸、すなわち、K775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,D839,H840,K848,D849,D850,D853,K855,R859,D861,K862,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,K890,R895,K896およびD898、および第4-1領域のうち、T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
上記Cas9変異体は、野生型Cas9の第1領域、第2領域、第3領域および/または第4領域内のアミノ酸配列のうち選択された3つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、3つ以上のアミノ酸は、少なくとも2つ以上の領域に存在することができる。
一例として、上記野生型Cas9が野生型SpCas9の場合、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1領域、第2領域、第3領域および/または、第4領域内のアミノ酸配列のうち選択された3つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、3つ以上のアミノ酸は少なくとも2つ以上の領域に存在することができる。
一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1領域、第2領域、および第3領域内のアミノ酸配列のうち選択された3つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
この時、上記第1領域は、第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域、および第1-4領域であり得る。
この時、上記第2領域は、第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域、および第2-4領域であり得る。
この時、上記第3領域は、第3-1領域であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1領域、第2領域、および第3領域のうち、I7,G8,L9,D10,I11,G12,A203,N277,G366,K510,Y515,F539,G582,V583,E584,D585,N588,I601,N692,M694,Q695,H698,I761,E762,M763,R765,E766,N767,V838,D839,H840,D853,N854,K855,K862,N863,R864,A889,K890,L891,D965,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987,Y988,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038およびY1039からなる群より選択される3つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1領域、第2領域、および第3領域のうち、I7,G8,L9,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696,I697,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,M763,A764,K775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,D839,H840,K848,D849,D850,D853,K855,R859,D861,K862,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,K890,R895,K896,D898,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,D965,F966,F970,F972,V975,U978,A984,A987,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997,I998,P1002,L1004,F1008,V1009,G1011,V1015,V1018,M1021,I1022,A1023,I1029,G1030,A1032,A1034,F1037およびF1038からなる群より選択される3つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
別の一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1領域、第2領域、および第4領域内のアミノ酸配列のうち選択された3つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
この時、上記第1領域は、第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域、および第1-4領域であり得る。
この時、上記第2領域は、第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域、および第2-4領域であり得る。
この時、上記第4領域は、第4-1領域であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1領域、第2領域、および第4領域のうち、I7,G8,L9,D10,I11,G12,A203,N277,G366,K510,Y515,F539,G582,V583,E584,D585,N588,I601,N692,M694,Q695,H698,I761,E762,M763,R765,E766,N767,D965,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987,Y988,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038,Y1039,T1102およびD1127からなる群より選択される3つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1領域、第2領域、および第4領域のうち、I7,G8,L9,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696,I697,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,M763,A764,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,D965,F966,F970,F972,V975,U978,A984,A987,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997,I998,P1002,L1004,F1008,V1009,G1011,V1015,V1018,M1021,I1022,A1023,I1029,G1030,A1032,A1034,F1037,F1038,T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される3つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
また、他の一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1領域、第3領域、および第4領域内のアミノ酸配列のうち選択された3つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
この時、上記第1領域は、第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域、および第1-4領域であり得る。
この時、上記第3領域は、第3-1領域であり得る。
この時、上記第4領域は第4-1、領域であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1領域、第3領域、および第4領域のうち、A203,N277,G366,K510,Y515,F539,G582,V583,E584,D585,N588,I601,N692,M694,Q695,H698,V838,D839,H840,D853,N854,K855,K862,N863,R864,A889,K890,L891,T1102およびD1127からなる群より選択される3つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1領域、第3領域、および第4領域のうち、N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696,I697,K775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,D839,H840,K848,D849,D850,D853,K855,R859,D861,K862,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,K890,R895,K896,D898,T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される3つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
別の一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2領域、第3領域、および第4領域内のアミノ酸配列のうち選択された3つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
この時、上記第2領域は、第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域、および第2-4領域であり得る。
この時、上記第3領域は、第3-1領域であり得る。
この時、上記第4領域は、第4-1領域であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2領域、第3領域、および第4領域のうち、I7,G8,L9,D10,I11,G12,I761,E762,M763,R765,E766,N767,V838,D839,H840,D853,N854,K855,K862,N863,R864,A889,K890,L891,D965,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987,Y988,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038,Y1039,T1102およびD1127からなる群より選択される3つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第2領域、第3領域、および第4領域のうち、I7,G8,L9,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,M763,A764,K775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,D839,H840,K848,D849,D850,D853,K855,R859,D861,K862,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,K890,R895,K896,D898,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,D965,F966,F970,F972,V975,U978,A984,A987,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997,I998,P1002,L1004,F1008,V1009,G1011,V1015,V1018,M1021,I1022,A1023,I1029,G1030,A1032,A1034,F1037,F1038,T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される3つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
一例として、上記野生型Cas9が野生型SpCas9の場合、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1領域、第2領域、第3領域、および第4領域内のアミノ酸配列のうち選択された4つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。この時、4つ以上のアミノ酸は、少なくとも2つ以上の領域に存在することができる。
一実施形態として、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1領域、第2領域、第3領域、および第4領域内のアミノ酸配列のうち選択された4つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
この時、上記第1領域は、第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域、および第1-4領域であり得る。
この時、上記第2領域は、第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域、および第2-4領域であり得る。
この時、上記第3領域は、第3-1領域であり得る。
この時、上記第4領域は、第4-1領域であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1領域、第2領域、第3領域、および第4領域のうち、I7,G8,L9,D10,I11,G12,A203,N277,G366,K510,Y515,F539,G582,V583,E584,D585,N588,I601,N692,M694,Q695,H698,I761,E762,M763,R765,E766,N767,V838,D839,H840,D853,N854,K855,K862,N863,R864,A889,K890,L891,D965,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987,Y988,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038,Y1039,T1102およびD1127からなる群より選択される4つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
例えば、上記SpCas9変異体は、野生型SpCas9の第1領域、第2領域、第3領域、および第4領域のうち、I7,G8,L9,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696,I697,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,M763,A764,K775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,D839,H840,K848,D849,D850,D853,K855,R859,D861,K862,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,K890,R895,K896,D898,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,D965,F966,F970,F972,V975,U978,A984,A987,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997,I998,P1002,L1004,F1008,V1009,G1011,V1015,V1018,M1021,I1022,A1023,I1029,G1030,A1032,A1034,F1037,F1038,T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される4つ以上のアミノ酸を変形させた形態であり得る。
上記Cas9変異体は、上記1つ以上の領域で選択された少なくとも1つ以上のアミノ酸の変形を含むことができる。
この時、上記変形は、上記選択された1つ以上のアミノ酸の除去であり得る。
一例として、上記野生型Cas9が野生型SpCas9の場合、上記変形は、野生型SpCas9の第1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸の除去であり得る。
一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域および/または第1-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸の除去であり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のN199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696およびI697からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸の除去であり得る。
上記変形は、野生型SpCas9の第2領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸の除去であり得る。
一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域および/または第2-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸の除去であり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のI7,G8,L9,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,M763,A764,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,D965,F966,F970,F972,V975,U978,A984,A987,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997,I998,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038およびY1039からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸の除去であり得る。
上記変形は、野生型SpCas9の第3領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸の除去であり得る。
一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第3-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸の除去であり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のK775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,D839,H840,K848,D849,D850,D853,K855,R859,D861,K862,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,K890,R895,K896およびD898からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸の除去であり得る。
上記変形は、野生型SpCas9の第4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸の除去であり得る。
一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸の除去であり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9の第4-1領域のうち、T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸の除去であり得る。
上記変形は、野生型SpCas9の第1領域、第2領域、第3領域および/または第4領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸の除去であり得る。
一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域、第1-4領域、第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域、第2-4領域、第3-1領域および/または第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸の除去であり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のI7,G8,L9,D10,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696,I697,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,M763,A764,K775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,D839,H840,K848,D849,D850,D853,K855,R859,D861,K862,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,K890,R895,K896,D898,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,D965,F966,F970,F972,V975,U978,A984,A987,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997,I998,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038,Y1039,T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸の除去であり得る。
この時、上記変形は、上記選択された1つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換することであり得る。
一例として、上記野生型Cas9が野生型SpCas9の場合、上記変形は、野生型SpCas9の第1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換することであり得る。
一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域および/または第1-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を立体異性体に置換することであり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のA203,N277,G366,K510,Y515,F539,G582,V583,E584,D585,N588,I601,N692,M694,Q695およびH698からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を立体異性体に置換することであり得る。例えば、野生型SpCas9の510番目のリジン(K510)がL-リジンである場合、上記変形は、野生型SpCas9の510番目のリジン(K510)をD-リジンで置換することであり得る。
一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域および/または第1-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸に置換することであり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のN199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696およびI697からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸に置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の539番目のフェニルアラニン(F539,疏水性指標:2.8)を疏水性指標が相対的に小さいセリン(疏水性指標:-0.8)で置換することであり得る。または、例えば、上記変形は、野生型SpCas9の601番目のイソロイシン(I601,疏水性指標:4.5)を疏水性指標が相対的に小さいアスパラギン(疏水性指標:-3.5)で置換することであり得る。
他の実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域および/または第1-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸に置換することであり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のA203,N277,G366,K510,Y515,F539,G582,V583,E584,D585,N588,I601,N692,M694,Q695およびH698からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸に置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の277番目のアスパラギン(N277,疏水性指標:-3.5)を疏水性指標が相対的に大きいヒスチジン(疏水性指標:-3.2)で置換することであり得る。
また、他の実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域および/または第1-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を疏水性指標が相対的に大きいか、または小さいアミノ酸に置換することであり得る。
一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域および/または第1-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を大きさが相対的に小さい官能基(functional group)を有するアミノ酸であり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のA203,N277,G366,K510,Y515,F539,G582,V583,E584,D585,N588,I601,N692,M694,Q695およびH698からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を大きさが相対的に小さい官能基を有するアミノ酸に置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の539番目のフェニルアラニン(F539)を大きさが相対的に小さい官能基を有するセリンで置換することであり得る。
別の一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域および/または第1-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を大きさが相対的に大きい官能基を有するアミノ酸であり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のN199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696およびI697からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を大きさが相対的に大きい官能基を有するアミノ酸に置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の203番目のアラニン(A203)を大きさが相対的に大きい官能基を有するアスパラギン酸で置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の366番目のグリシン(G366)を大きさが相対的に大きい官能基を有するセリンで置換することであり得る。
また、他の一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域および/または第1-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を大きさが相対的に大きいか、または小さい官能基を有するアミノ酸であり得る。
一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域および/または第1-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を疏水性(hydrophobicity)が相対的に低下したアミノ酸に置換することであり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のN199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696およびI697からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を疏水性が相対的に低下したアミノ酸に置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の539番目のフェニルアラニン(F539,Kyte-Doolittle hydrophobicity:2.8)および601番目のイソロイシン(I601,Kyte-Doolittle hydrophobicity:4.5)をそれぞれ疏水性が相対的に低下したセリン(Kyte-Doolittle hydrophobicity:-0.8)およびアスパラギン(Kyte-Doolittle hydrophobicity:-3.5)で置換することであり得る。
別の一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域および/または第1-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を疏水性が相対的に増加したアミノ酸に置換することであり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のN199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696およびI697からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を疏水性が相対的に増加したアミノ酸に置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の277番目のアスパラギン(N277,Kyte-Doolittle hydrophobicity:-3.5)および682番目のフェニルアラニン(F682,Kyte-Doolittle hydrophobicity:2.8)をそれぞれ疏水性が相対的に増加したヒスチジン(Kyte-Doolittle hydrophobicity:-3.2)およびバリン(Kyte-Doolittle hydrophobicity:4.2)で置換することであり得る。
また、他の一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域および/または第1-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を疏水性が相対的に低下したか、または増加したアミノ酸に置換することであり得る。
上記変形は、野生型SpCas9の第2領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換することであり得る。
一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域および/または第2-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を立体異性体に置換することであり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のI7,G8,L9,D10,I11,G12,I761,E762,M763,R765,E766,N767,D965,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987,Y988,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038およびY1039からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を立体異性体に置換することであり得る。例えば、野生型SpCas9の12番目のグリシン(G12)がL-グリシンである場合、上記変形は、野生型SpCas9の12番目のグリシン(G12)をD-グリシンで置換することであり得る。
一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域および/または第2-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸に置換することであり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のI7,G8,L9,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,M763,A764,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,D965,F966,F970,F972,V975,U978,A984,A987,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997,I998,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038およびY1039からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸に置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の1038番目のフェニルアラニン(F1038,疏水性指標:2.8)を疏水性指標が相対的に小さいチロシン(疏水性指標:-1.3)で置換することであり得る。
別の一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域および/または第2-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸に置換することであり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のI7,G8,L9,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,M763,A764,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,D965,F966,F970,F972,V975,U978,A984,A987,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997,I998,P1002,L1004,F1008,V1009,G1011,V1015,V1018,M1021,I1022,A1023,I1029,G1030,A1032,A1034,F1037およびF1038からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸に置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の763番目のメチオニン(M763,疏水性指標:1.9)を疏水性指標が相対的に大きいイソロイシン(疏水性指標:4.5)で置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の965番目のアスパラギン酸(D965,疏水性指標:-3.5)を疏水性指標が相対的に大きいチロシン(疏水性指標:-1.3)で置換することであり得る。
また、他の一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域および/または第2-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を疏水性指標が相対的に大きいか、または小さいアミノ酸に置換することであり得る。
一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域および/または第2-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を大きさが相対的に小さい官能基(functional group)を有するアミノ酸であり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のI7,G8,L9,D10,I11,G12,I761,E762,M763,R765,E766,N767,D965,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987,Y988,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038およびY1039からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を大きさが相対的に小さい官能基を有するアミノ酸に置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の763番目のメチオニン(M763)を大きさが相対的に小さい官能基を有するイソロイシンで置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の1007番目のグルタミン酸(E1007)を大きさが相対的に小さい官能基を有するロイシンで置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の763番目のメチオニン(M763)および1007番目のグルタミン酸(E1007)を大きさが相対的に小さい官能基を有するイソロイシンおよびロイシンでそれぞれ置換することであり得る。
別の一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域および/または第2-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を大きさが相対的に大きい官能基(functional group)を有するアミノ酸であり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のI7,G8,L9,D10,I11,G12,I761,E762,M763,R765,E766,N767,D965,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987,Y988,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038およびY1039からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を大きさが相対的に大きい官能基を有するアミノ酸に置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の1038番目のフェニルアラニン(F1038)を大きさが相対的に大きい官能基を有するチロシンで置換することであり得る。
また、他の一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域および/または第2-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を大きさが相対的に大きいか、または小さい官能基(functional group)を有するアミノ酸であり得る。
一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域および/または第2-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を疏水性が相対的に低下したアミノ酸に置換することであり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のI7,G8,L9,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,M763,A764,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,D965,F966,F970,F972,V975,U978,A984,A987,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997,I998,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038およびY1039からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を疏水性が相対的に低下したアミノ酸に置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の761番目のイソロイシン(I761,Kyte-Doolittle hydrophobicity:4.5)および1038番目のフェニルアラニン(F1038,Kyte-Doolittle hydrophobicity:2.8)をそれぞれ疏水性が相対的に低下したメチオニン(Kyte-Doolittle hydrophobicity:1.9)およびチロシン(Kyte-Doolittle hydrophobicity:-1.3)で置換することであり得る。
別の一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域および/または第2-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を疏水性が相対的に増加したアミノ酸に置換することであり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のI7,G8,L9,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,M763,A764,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,D965,F966,F970,F972,V975,U978,A984,A987,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997,I998,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038およびY1039からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を疏水性が相対的に増加したアミノ酸に置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の763番目のメチオニン(M763,Kyte-Doolittle hydrophobicity:1.9)および932番目のアラニン(A932,Kyte-Doolittle hydrophobicity:1.8)をそれぞれ疏水性が相対的に増加したイソロイシン(Kyte-Doolittle hydrophobicity:4.5)およびシステイン(Kyte-Doolittle hydrophobicity:2.5)で置換することであり得る。
また、他の一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域および/または第2-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を疏水性が相対的に低下したか、または増加したアミノ酸に置換することであり得る。
上記変形は、野生型SpCas9の第3領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換することであり得る。
一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第3-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を立体異性体に置換することであり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のV838,D839,H840,D853,N854,K855,K862,N863,R864,A889,K890およびL891からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を立体異性体に置換することであり得る。例えば、野生型SpCas9の853番目のアスパラギン酸(D853)がL-アスパラギン酸である場合、上記変形は、野生型SpCas9の853番目のアスパラギン酸(D853)をD-アスパラギン酸で置換することであり得る。
一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第3-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸に置換することであり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のV838,D839,H840,D853,N854,K855,K862,N863,R864,A889,K890およびL891からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸に置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の862番目のリジン(K862,疏水性指標:-3.9)を疏水性指標が相対的に小さいアルギニン(疏水性指標:-4.5)で置換することであり得る。
別の一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第3-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸に置換することであり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のV838,D839,H840,D853,N854,K855,K862,N863,R864,A889,K890およびL891からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸に置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の890番目のリジン(K890,疏水性指標:-3.9)を疏水性指標が相対的に大きいアスパラギン(疏水性指標:-3.5)で置換することであり得る。
また、他の一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第3-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を疏水性指標が相対的に大きいか、または小さいアミノ酸に置換することであり得る。
一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第3-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を大きさが相対的に小さい官能基(functional group)を有するアミノ酸であり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のV838,D839,H840,D853,N854,K855,K862,N863,R864,A889,K890およびL891からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を大きさが相対的に小さい官能基を有するアミノ酸に置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の890番目のリジン(K890)を大きさが相対的に小さい官能基を有するアスパラギンで置換することであり得る。
別の一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第3-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を大きさが相対的に大きい官能基(functional group)を有するアミノ酸であり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のV838,D839,H840,D853,N854,K855,K862,N863,R864,A889,K890およびL891からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を大きさが相対的に大きい官能基を有するアミノ酸に置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の863番目のアスパラギン(N863)を大きさが相対的に大きい官能基を有するアルギニンで置換することであり得る。
また、他の一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第3-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を大きさが相対的に大きいか、または小さい官能基(functional group)を有するアミノ酸であり得る。
一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第3-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を疏水性が相対的に低下したアミノ酸に置換することであり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のK775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,D839,H840,K848,D849,D850,D853,K855,R859,D861,K862,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,K890,R895,K896およびD898からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を疏水性が相対的に低下したアミノ酸に置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の779番目のグルタミン酸(E779,Kyte-Doolittle hydrophobicity:-3.5)および862番目のリジン(K862,Kyte-Doolittle hydrophobicity:-3.9)をそれぞれ疏水性が相対的に低下したリジン(Kyte-Doolittle hydrophobicity:-3.9)およびアルギニン(Kyte-Doolittle hydrophobicity:-4.5)で置換することであり得る。
別の一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第3-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を疏水性が相対的に増加したアミノ酸に置換することであり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のK775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,D839,H840,K848,D849,D850,D853,K855,R859,D861,K862,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,K890,R895,K896およびD898からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を疏水性が相対的に増加したアミノ酸に置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の827番目のグルタミン酸(E827,Kyte-Doolittle hydrophobicity:-3.5)および890番目のリジン(K890,Kyte-Doolittle hydrophobicity:-3.9)をそれぞれ疏水性が相対的に増加したメチオニン(Kyte-Doolittle hydrophobicity:1.9)およびアスパラギン(Kyte-Doolittle hydrophobicity:-3.5)で置換することであり得る。
また、他の一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第3-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を疏水性が相対的に低下したか、または増加したアミノ酸に置換することであり得る。
上記変形は、野生型SpCas9の第4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換することであり得る。
一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を立体異性体に置換することであり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のT1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を立体異性体に置換することであり得る。例えば、野生型SpCas9の1127番目のアスパラギン酸(D1127)がL-アスパラギン酸である場合、上記変形は、野生型SpCas9の1127番目のアスパラギン酸(D1127)をD-アスパラギン酸で置換することであり得る。
一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸に置換することであり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のT1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸に置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の1102番目のトレオニン(T1102,疏水性指標:-0.7)を疏水性指標が相対的に小さいプロリン(疏水性指標:-1.6)で置換することであり得る。
別の一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸に置換することであり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のT1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸に置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の1106番目のセリン(S1106,疏水性指標:-0.8)を疏水性指標が相対的に大きいグリシン(疏水性指標:-0.4)で置換することであり得る。
また、他の一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を疏水性指標が相対的に大きいか、または小さいアミノ酸に置換することであり得る。
一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を大きさが相対的に小さい官能基(functional group)を有するアミノ酸であり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のT1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を大きさが相対的に小さい官能基を有するアミノ酸に置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の1102番目のトレオニン(T1102)を大きさが相対的に小さい官能基を有するプロリンで置換することであり得る。
別の一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を大きさが相対的に大きい官能基(functional group)を有するアミノ酸であり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のT1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を大きさが相対的に大きい官能基を有するアミノ酸に置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の1127番目のアスパラギン酸(D1127)を大きさが相対的に大きい官能基を有するグルタミン酸で置換することであり得る。
また、他の一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を大きさが相対的に大きいか、または小さい官能基(functional group)を有するアミノ酸であり得る。
一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を疏水性が相対的に低下したアミノ酸に置換することであり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のT1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を疏水性が相対的に低下したアミノ酸に置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の1102番目のグルトレオニン(T1102,Kyte-Doolittle hydrophobicity:-0.7)を疏水性が相対的に低下したプロリン(Kyte-Doolittle hydrophobicity:-1.6)で置換することであり得る。
別の一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を疏水性が相対的に増加したアミノ酸に置換することであり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のT1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を疏水性が相対的に増加したアミノ酸に置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の1108番目のグルタミン酸(E1108,Kyte-Doolittle hydrophobicity:-3.5)を疏水性が相対的に増加したメチオニン(Kyte-Doolittle hydrophobicity:1.9)で置換することであり得る。
また、他の一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を疏水性が相対的に低下したか、または増加したアミノ酸に置換することであり得る。
上記変形は、野生型SpCas9の第1領域、第2領域、第3領域および/または第4領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換することであり得る。
一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域、第1-4領域第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域、第2-4領域、第3-1領域および/または第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸をそれぞれの立体異性体に置換することであり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のI7,G8,L9,D10,I11,G12,A203,N277,G366,K510,Y515,F539,G582,V583,E584,D585,N588,I601,N692,M694,Q695,H698,I761,E762,M763,R765,E766,N767,V838,D839,H840,D853,N854,K855,K862,N863,R864,A889,K890,L891,D965,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987,Y988,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038,Y1039,T1102およびD1127からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸をそれぞれの立体異性体に置換することであり得る。例えば、野生型SpCas9の8番目のグリシン(G8)がL-グリシンであり、767番目のアスパラギン(N767)がL-アスパラギンである場合、上記変形は、野生型SpCas9の8番目のグリシン(G8)および767番目のアスパラギン(N767)をそれぞれD-グリシンおよびD-アスパラギンで置換することであり得る。
一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域、第1-4領域第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域、第2-4領域、第3-1領域および/または第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸をそれぞれ疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸に置換することであり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のI7,G8,L9,D10,I11,G12,A203,N277,G366,K510,Y515,F539,G582,V583,E584,D585,N588,I601,N692,M694,Q695,H698,I761,E762,M763,R765,E766,N767,V838,D839,H840,D853,N854,K855,K862,N863,R864,A889,K890,L891,D965,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987,Y988,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038,Y1039,T1102およびD1127からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸をそれぞれ疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸に置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の203番目のアラニン(A203,疏水性指標:1.8)および539番目のフェニルアラニン(F539,疏水性指標:2.8)をそれぞれ疏水性指標が相対的に小さいアスパラギン酸(疏水性指標:-3.5)およびセリン(疏水性指標:-0.8)で置換することであり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のI7,G8,L9,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696,I697,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,M763,A764,K775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,D839,H840,K848,D849,D850,D853,K855,R859,D861,K862,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,K890,R895,K896,D898,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,D965,F966,F970,F972,V975,U978,A984,A987,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997,I998,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038,Y1039,T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸をそれぞれ疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸に置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の601番目のイソロイシン(I601,疏水性指標:4.5)および1102番目のトレオニン(T1102,疏水性指標:-0.7)をそれぞれ疏水性指標が相対的に小さいアスパラギン(疏水性指標:-3.5)およびプロリン(疏水性指標:-1.6)で置換することであり得る。
別の一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域、第1-4領域第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域、第2-4領域、第3-1領域および/または第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸をそれぞれ疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸に置換することであり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のI7,G8,L9,D10,I11,G12,A203,N277,G366,K510,Y515,F539,G582,V583,E584,D585,N588,I601,N692,M694,Q695,H698,I761,E762,M763,R765,E766,N767,V838,D839,H840,D853,N854,K855,K862,N863,R864,A889,K890,L891,D965,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987,Y988,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038,Y1039,T1102およびD1127からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸をそれぞれ疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸に置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の840番目のヒスチジン(H840,疏水性指標:-3.2)および1007番目のグルタミン酸(E1007,疏水性指標:-3.5)をそれぞれ疏水性指標が相対的に大きいアラニン(疏水性指標:1.8)およびロイシン(疏水性指標:3.8)で置換することであり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のI7,G8,L9,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696,I697,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,M763,A764,K775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,D839,H840,K848,D849,D850,D853,K855,R859,D861,K862,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,K890,R895,K896,D898,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,D965,F966,F970,F972,V975,U978,A984,A987,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997,I998,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038,Y1039,T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸をそれぞれ疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸に置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の763番目のメチオニン(M763,疏水性指標:1.9)および1007番目のグルタミン酸(E1007,疏水性指標:-3.5)をそれぞれ疏水性指標が相対的に大きいイソロイシン(疏水性指標:4.5)およびロイシン(疏水性指標:3.8)で置換することであり得る。
また、他の一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域、第1-4領域第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域、第2-4領域、第3-1領域および/または第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸をそれぞれ疏水性指標が相対的に大きいか、または小さいアミノ酸に置換することであり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のI7,G8,L9,D10,I11,G12,A203,N277,G366,K510,Y515,F539,G582,V583,E584,D585,N588,I601,N692,M694,Q695,H698,I761,E762,M763,R765,E766,N767,V838,D839,H840,D853,N854,K855,K862,N863,R864,A889,K890,L891,D965,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987,Y988,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038,Y1039,T1102およびD1127からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸をそれぞれ疏水性指標が相対的に大きいか、または小さいアミノ酸に置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の10番目のアスパラギン酸(D10,疏水性指標:-3.5)および840番目のヒスチジン(H840,疏水性指標:-3.2)をそれぞれ疏水性指標が相対的に大きいアラニン(疏水性指標:1.8)で置換し、また、野生型SpCas9の539番目のフェニルアラニン(F539,疏水性指標:2.8)を疏水性指標が相対的に小さいセリン(疏水性指標:-0.8)で置換することであり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のI7,G8,L9,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696,I697,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,M763,A764,K775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,D839,H840,K848,D849,D850,D853,K855,R859,D861,K862,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,K890,R895,K896,D898,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,D965,F966,F970,F972,V975,U978,A984,A987,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997,I998,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038,Y1039,T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸をそれぞれ疏水性指標が相対的に大きいか、または小さいアミノ酸に置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の763番目のメチオニン(M763,疏水性指標:1.9)、890番目のリジン(K890,疏水性指標:-3.9)および1007番目のグルタミン酸(E1007,疏水性指標:-3.5)をそれぞれ疏水性指標が相対的に大きいイソロイシン(疏水性指標:4.5)、アスパラギン(疏水性指標:-3.5)およびロイシン(疏水性指標:3.8)で置換し、また、野生型SpCas9の539番目のフェニルアラニン(F539,疏水性指標:2.8)を疏水性指標が相対的に小さいセリン(疏水性指標:-0.8)で置換することであり得る。
一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域、第1-4領域第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域、第2-4領域、第3-1領域および/または第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸をそれぞれ大きさが相対的に小さい官能基(functional group)を有するアミノ酸であり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のI7,G8,L9,D10,I11,G12,A203,N277,G366,K510,Y515,F539,G582,V583,E584,D585,N588,I601,N692,M694,Q695,H698,I761,E762,M763,R765,E766,N767,V838,D839,H840,D853,N854,K855,K862,N863,R864,A889,K890,L891,D965,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987,Y988,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038,Y1039,T1102およびD1127からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸をそれぞれ大きさが相対的に小さい官能基を有するアミノ酸に置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の539番目のフェニルアラニン(F539)、763番目のメチオニン(M763)、890番目のリジン(K890)および1007番目のグルタミン酸(E1007)をそれぞれ大きさが相対的に小さい官能基を有するセリン、イソロイシン、アスパラギンおよびロイシンで置換することであり得る。
別の一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域、第1-4領域第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域、第2-4領域、第3-1領域および/または第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸をそれぞれ大きさが相対的に大きい官能基(functional group)を有するアミノ酸であり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のI7,G8,L9,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696,I697,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,M763,A764,K775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,D839,H840,K848,D849,D850,D853,K855,R859,D861,K862,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,K890,R895,K896,D898,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,D965,F966,F970,F972,V975,U978,A984,A987,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997,I998,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038,Y1039,T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸をそれぞれ大きさが相対的に大きい官能基を有するアミノ酸に置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の601番目のイソロイシン(I601)、1038番目のフェニルアラニン(F1038)および1127番目のアスパラギン酸(D1127)をそれぞれ大きさが相対的に大きい官能基を有するアスパラギン、チロシンおよびグルタミン酸で置換することであり得る。
また、他の一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域、第1-4領域第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域、第2-4領域、第3-1領域および/または第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸をそれぞれ大きさが相対的に大きいか、または小さい官能基(functional group)を有するアミノ酸であり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のI7,G8,L9,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696,I697,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,M763,A764,K775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,D839,H840,K848,D849,D850,D853,K855,R859,D861,K862,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,K890,R895,K896,D898,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,D965,F966,F970,F972,V975,U978,A984,A987,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997,I998,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038,Y1039,T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸をそれぞれ大きさが相対的に大きいか、または小さい官能基を有するアミノ酸に置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の539番目のフェニルアラニン(F539)、763番目のメチオニン(M763)、890番目のリジン(K890)および1007番目のグルタミン酸(E1007)をそれぞれ大きさが相対的に小さい官能基を有するセリン、イソロイシン、アスパラギンおよびロイシンで置換し、また、601番目のイソロイシン(I601)および1038番目のフェニルアラニン(F1038)をそれぞれ大きさが相対的に大きい官能基を有するアスパラギンおよびチロシンで置換することであり得る。
一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域、第1-4領域第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域、第2-4領域、第3-1領域および/または第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸をそれぞれ疏水性が相対的に低下したアミノ酸に置換することであり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のI7,G8,L9,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696,I697,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,M763,A764,K775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,D839,H840,K848,D849,D850,D853,K855,R859,D861,K862,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,K890,R895,K896,D898,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,D965,F966,F970,F972,V975,U978,A984,A987,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997,I998,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038,Y1039,T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸をそれぞれ疏水性が相対的に低下したアミノ酸に置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の539番目のフェニルアラニン(F539,Kyte-Doolittle hydrophobicity:2.8)、601番目のイソロイシン(I601,Kyte-Doolittle hydrophobicity:4.5)および1102番目のトレオニン(T1102,Kyte-Doolittle hydrophobicity:-0.7)をそれぞれ疏水性が相対的に低下したセリン(Kyte-Doolittle hydrophobicity:-0.8)、アスパラギン(Kyte-Doolittle hydrophobicity:-3.5)およびプロリン(Kyte-Doolittle hydrophobicity:-1.6)で置換することであり得る。
別の一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域、第1-4領域第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域、第2-4領域、第3-1領域および/または第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸をそれぞれ疏水性が相対的に増加したアミノ酸に置換することであり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のI7,G8,L9,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696,I697,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,M763,A764,K775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,D839,H840,K848,D849,D850,D853,K855,R859,D861,K862,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,K890,R895,K896,D898,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,D965,F966,F970,F972,V975,U978,A984,A987,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997,I998,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038,Y1039,T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸をそれぞれ疏水性が相対的に増加したアミノ酸に置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の10番目のアスパラギン酸(D10,Kyte-Doolittle hydrophobicity:-3.5)、763番目のメチオニン(M763,Kyte-Doolittle hydrophobicity:1.9)、840番目のヒスチジン(H840,Kyte-Doolittle hydrophobicity:-3.2)および890番目のリジン(K890,Kyte-Doolittle hydrophobicity:-3.9)をそれぞれ疏水性が相対的に増加したアラニン(Kyte-Doolittle hydrophobicity:1.8)、イソロイシン(Kyte-Doolittle hydrophobicity:4.5)、アラニン(Kyte-Doolittle hydrophobicity:1.8)およびアスパラギン(Kyte-Doolittle hydrophobicity:-3.5)で置換することであり得る。
また、他の一実施形態として、上記変形は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域、第1-4領域第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域、第2-4領域、第3-1領域および/または第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸をそれぞれ疏水性が相対的に低下したか、または増加したアミノ酸に置換することであり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9のI7,G8,L9,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696,I697,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,M763,A764,K775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,D839,H840,K848,D849,D850,D853,K855,R859,D861,K862,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,K890,R895,K896,D898,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,D965,F966,F970,F972,V975,U978,A984,A987,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997,I998,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038,Y1039,T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸をそれぞれ疏水性が相対的に低下したか、または増加したアミノ酸に置換することであり得る。例えば、上記変形は、野生型SpCas9の763番目のメチオニン(M763,Kyte-Doolittle hydrophobicity:1.9)、890番目のリジン(K890,Kyte-Doolittle hydrophobicity:-3.9)および1007番目のグルタミン酸(E1007,Kyte-Doolittle hydrophobicity:-3.5)をそれぞれ疏水性が相対的に増加したイソロイシン(Kyte-Doolittle hydrophobicity:4.5)、アスパラギン(Kyte-Doolittle hydrophobicity:-3.5)およびロイシン(Kyte-Doolittle hydrophobicity:3.8)で置換し、また、野生型SpCas9の539番目のフェニルアラニン(F539,Kyte-Doolittle hydrophobicity:2.8)を相対的に疏水性が低下したセリン(Kyte-Doolittle hydrophobicity:-0.8)で置換することであり得る。
上記変形は、上記選択された1つ以上のアミノ酸が同じ数の他のアミノ酸に置換することであり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9の第1領域内に位置した1つのイソロイシンを1つのアスパラギンで置換することであり得る。または、上記変形は、野生型SpCas9の第1領域内に位置した1つのフェニルアラニンと第3領域内に位置した1つのリジンを1つのセリン(第1領域)と1つのアスパラギン(第3領域)でそれぞれ置換することであり得る。または、上記変形は、野生型SpCas9の第2領域内に位置した1つのメチオニンと1つのグルタミン酸および第3領域内に位置した1つのリジンをそれぞれ1つのイソロイシン、1つのロイシン(第2領域)および1つのアスパラギン(第3領域)で置換することであり得る。
上記変形は、上記選択された1つ以上のアミノ酸が同一でない数の他のアミノ酸に置換することであり得る。
例えば、上記変形は、野生型SpCas9の第2領域内に位置した1つのトレオニンをシステイン-アラニン-アラニン、すなわち、合計3つのアミノ酸で置換することであり得る。または、上記変形は、野生型SpCas9の第1領域内に位置した1つのグルタミンと第3領域に位置する連続した2つのアミノ酸であるグリシン-セリンをそれぞれメチオニン-バリン(第1領域)およびプロリン(第3領域)で置換することであり得る。または、上記変形は、野生型SpCas9の第1領域内に位置した1つのセリン、第2領域内に位置する連続した3つのアミノ酸であるリジン-リジン-チロシンおよび第3領域内に位置する連続した2つのアミノ酸であるセリン-イソロイシンをそれぞれアラニン(第1領域)、メチオニン-プロリン(第2領域)およびシステイン-アラニン-トレオニン-バリン(第3領域)で置換することであり得る。
上記人為的に操作されたCas9は、野生型Cas9の第1領域、第2領域、第3領域、および第4領域のうち選択された1つ以上の領域内に少なくとも1つ以上のアミノ酸を付加させたCas9変異体であり得る。
この時、上記付加は、上記選択された1つ以上の領域内に存在する1つ以上のアミノ酸のN-末端および/またはC-末端の位置に1つ以上のアミノ酸の付加であり得る。
一例として、上記野生型Cas9が野生型SpCas9の場合、上記付加は、野生型SpCas9の第1領域、第2領域、第3領域および/または第4領域内に存在する1つ以上のアミノ酸のN-末端および/またはC-末端の位置に1つ以上のアミノ酸の付加であり得る。
一実施形態として、上記付加は、野生型SpCas9の第1領域、第2領域、第3領域および/または第4領域内に存在する1つ以上のアミノ酸のN-末端および/またはC-末端の位置に1つ以上の正電荷を有するアミノ酸の付加であり得る。
例えば、上記付加は、野生型SpCas9の第1-1領域内に位置する選択された1つのアラニンのC-末端に1つのアルギニンを付加させたことであり得る。または、上記付加は、野生型SpCas9の第2-2領域内に位置する選択されたグルタミン酸のN-末端に2つのアミノ酸であるアルギニン-リジンを付加させたことであり得る。または、上記付加は、野生型SpCas9の第3-1領域内に位置する選択されたロイシンのN-末端に2つのアミノ酸であるアルギニン-ヒスチジンを付加させたことであり得る。または、上記付加は、野生型SpCas9の第3-1領域内に位置する選択されたロイシンのC-末端に2つのアミノ酸であるリジン-ヒスチジンを付加させ、また、第4-1領域内に位置する選択されたチロシンのC-末端に1つのリジンを付加させたことであり得る。
別の一実施形態として、上記付加は、野生型SpCas9の第1領域、第2領域、第3領域および/または第4領域内に存在する1つ以上のアミノ酸のN-末端および/またはC-末端の位置に1つ以上の負電荷を有するアミノ酸の付加であり得る。
例えば、上記付加は、野生型SpCas9の第1-2領域内に位置する選択された1つのグリシンのN-末端に1つのアスパラギン酸を付加させたことであり得る。または、上記付加は、野生型SpCas9の第2-3領域内に位置する選択されたメチオニンのC-末端に3つのアミノ酸であるグルタミン酸-アスパラギン酸-グルタミン酸を付加させたことであり得る。または、上記付加は、野生型SpCas9の第3-1領域内に位置する選択されたイソロイシンのN-末端に2つのアミノ酸であるグルタミン酸-グルタミン酸を付加させたことであり得る。または、上記付加は、野生型SpCas9の第1-1領域内に位置する選択されたフェニルアラニンのC-末端に2つのアミノ酸であるグルタミン酸-アスパラギン酸を付加させ、また、第2-1領域内に位置する選択されたグルタミンのN-末端に1つのアスパラギン酸を付加させたことであり得る。
また、他の一実施形態として、上記付加は、野生型SpCas9の第1領域、第2領域、第3領域および/または第4領域内に存在する1つ以上のアミノ酸のN-末端および/またはC-末端の位置に1つ以上の電荷を有さないアミノ酸の付加であり得る。
例えば、上記付加は、野生型SpCas9の第1-1領域内に位置する選択された1つのフェニルアラニンのC-末端に2つのアミノ酸であるセリン-バリンを付加させたことであり得る。または、上記付加は、野生型SpCas9の第2-1領域内に位置する選択されたヒスチジンのN-末端に5つのアミノ酸であるグリシン-プロリン-グルタミン-フェニルアラニン-ロイシンを付加させたことであり得る。または、上記付加は、野生型SpCas9の第3-1領域内に位置する選択されたアスパラギンのN-末端に2つのアミノ酸であるアラニン-アラニンを付加させたことであり得る。または、上記付加は、野生型SpCas9の第1-1領域内に位置する選択されたアスパラギン酸のC-末端に2つのアミノ酸であるフェニルアラニン-ロイシンを付加させ、また、第1-2領域内に位置する選択されたグルタミンのN-末端に1つのセリンを付加させたことであり得る。
別の一実施形態として、上記付加は、野生型SpCas9の第1領域、第2領域、第3領域および/または第4領域内に存在する1つ以上のアミノ酸のN-末端および/またはC-末端の位置に正電荷を有するアミノ酸、負電荷を有するアミノ酸、および電荷を有さないアミノ酸の中から選択された1つ以上のアミノ酸の付加であり得る。
例えば、上記付加は、野生型SpCas9の第1-2領域内に位置する選択された1つのアルギニンのC-末端に6個のアミノ酸であるヒスチジン-アルギニン-グリシン-セリン-アラニン-グルタミン酸を付加させたことであり得る。または、上記付加は、野生型SpCas9の第3-1領域内に位置する選択された1つのグリシンのN-末端に10個のアミノ酸であるリジン-リジン-アラニン-フェニルアラニン-グルタミン-トレオニン-メチオニン-システイン-アスパラギン酸-セリンを付加させたことであり得る。または、上記付加は、野生型SpCas9の第2-1領域内に位置する選択されたメチオニンのC-末端に2つのアミノ酸であるフェニルアラニン-ヒスチジンを付加させ、また、第2-3領域内に位置する選択されたグルタミンのN-末端に1つのリジンを付加させたことであり得る。または、上記付加は、野生型SpCas9の第1-1領域内に位置する選択されたリジンのC-末端に2つのアミノ酸であるアスパラギン酸-セリンを付加させ、第2-4領域内に位置する選択されたバリンのN-末端に6個のアミノ酸であるグルタミン-トレオニン-メチオニン-システイン-アスパラギン酸-リジンを付加させ、また、第4-1領域内に位置する選択されたグルタミンのC-末端に2つのアミノ酸であるアルギニン-グリシンを付加させたことであり得る。
この時、上記付加は、上記選択された1つ以上の領域内に存在する1つ以上のアミノ酸のN-末端および/またはC-末端の位置に1つ以上の機能的(functional)ドメインの付加であり得る。
上記機能的ドメインは、野生型Cas9の本来の機能、すなわち、DNAの二本鎖のうち第1鎖を切断する第1機能およびDNAの二本鎖のうち第2鎖を切断する第2機能以外に付加的な機能を有するドメインであり得る。
または、上記機能的ドメインは野生型Cas9の本来の機能、すなわち、DNAの二本鎖のうち第1鎖を切断する第1機能および/またはDNAの二本鎖のうち第2鎖を切断する第2機能と類似の機能を有するドメインであり得る。
上記機能的ドメインの関連説明は上記の通りである。
一例として、上記野生型Cas9が野生型SpCas9の場合、上記付加は、野生型SpCas9の第1領域、第2領域、第3領域および/または第4領域内に存在する1つ以上のアミノ酸のN-末端および/またはC-末端の位置に1つ以上の機能的ドメインの付加であり得る。
本明細書によって開示される内容の具体的な一例では、上記人為的に操作されたCas9は、標的特異的Cas9であり得る。
「標的特異的Cas9(Target specific Cas9、TS-Cas9)」は、Cas9変異体であり、野生型Cas9に比べて標的特異性(specificity)が相対的に増加するように人為的に操作して生成されたCas9変異体を意味する。
この時、上記「標的特異性」は、Cas9がgRNAとの相互作用を通じてgRNA-Cas9複合体を形成して標的遺伝子または核酸、すなわち、Cas9を利用して操作しようとする対象(核酸)に近接または局在化される時、gRNAと相補的結合する標的配列に特異的にCas9が作用することができるようにするのを意味する。この時、gRNAと完全な相補的結合(100%)という標的配列はオンターゲット(on-target)と称し、gRNAと不完全な相補的結合(100%未満)する、すなわち、1つ以上の非相補的結合を含む標的配列はオフターゲット(off-target)と称する。
上記標的特異性は、gRNAと標的配列との間の相補的結合の程度に応じて変わり得る。
一例として、gRNAと相補的結合する標的配列がオンターゲット、すなわち、gRNAと標的配列との間の相補的結合が完全な相補的結合(100%)である場合、標的特異性が最も高い状態であり得る。
別の例として、gRNAと相補的結合する標的配列がオフターゲット、すなわち、gRNAと標的配列との間の相補的結合が100%未満で1つ以上の非相補的結合を含む場合、標的特異性はオンターゲットよりも低下した状態であり得、上記非相補的結合の数が増加するにつれて、上記標的特異性はさらに減少することができる。
例えば、gRNAと標的配列との間の相補的結合が完全な相補的結合(100%)である場合、上記標的特異性を100%とすると、gRNAと標的配列との間の1つの非相補的結合が含まれた場合、すなわち、gRNAと標的配列との間の相補的結合が不完全な相補的結合(95%)である場合、上記標的特異性は95%であり得る。または、gRNAと標的配列との間の4つの非相補的結合が含まれた場合、すなわち、gRNAと標的配列との間の相補的結合が不完全な相補的結合(80%)である場合、上記標的特異性は80%であり得る。
また、他の一例として、gRNAと相補的結合する標的配列がオフターゲット、すなわち、gRNAと標的配列との間の相補的結合が100%未満、すなわち、1つ以上の非相補的結合を含む場合、標的特異性は上記非相補的結合の位置によって異なり得る。
例えば、上記gRNAと標的配列との間の1つの非相補的結合を含む時、上記非相補的結合の位置が標的配列に隣接したPAMに近接するように位置した場合、標的特異性は、非相補的結合の位置がPAMから遠く離れて位置した場合よりも標的特異性が低いことがある。
上記標的特異性は、標的配列と相補的結合したgRNAとCas9の相互作用の程度に応じて変わり得る。
一例として、標的配列と相補的結合したgRNAとCas9の相互作用が低下した場合、上記gRNAと標的配列との間に非相補的結合の数が減少するほど、標的特異性は増加し得る。
例えば、標的配列と相補的結合したgRNAとCas9の相互作用が低下した場合、上記gRNAと標的配列との間に3つの非相補的結合を含む場合よりも1つの非相補的結合を含む場合の標的特異性が相対的に増加し得る。
別の例として、標的配列と相補的結合したgRNAとCas9の相互作用が低下した場合、上記gRNAと標的配列との間の相補的結合が完全な相補的結合(100%)である場合にのみ標的特異性を有することができる。
例えば、標的配列と相補的結合したgRNAとCas9の相互作用が低下した場合、上記標的配列がオンターゲットである場合にのみ標的特異性を有することができる。
上記標的特異性は、gRNAと相補的結合した標的配列とCas9の相互作用の程度に応じて変わり得る。
一例として、gRNAと相補的結合した標的配列とCas9の相互作用が低下した場合、上記gRNAと標的配列との間に非相補的結合の数が減少するほど、標的特異性は増加し得る。
例えば、gRNAと相補的結合した標的配列とCas9の相互作用が低下した場合、上記gRNAと標的配列との間に4つの非相補的結合を含む場合よりも2つの非相補的結合を含む場合の標的特異性が相対的に増加し得る。
別の例として、gRNAと相補的結合した標的配列とCas9の相互作用が低下した場合、上記gRNAと標的配列との間の相補的結合が完全な相補的結合(100%)である場合にのみ標的特異性を有することができる。
例えば、gRNAと相補的結合した標的配列とCas9の相互作用が低下した場合、上記標的配列がオンターゲットである場合にのみ標的特異性を有することができる。
上記標的特異的Cas9は、オンターゲットを操作するCas9変異体であり得る。
この時、上記操作は、Cas9変異体を利用したオンターゲットのヌクレオチド配列を切断するか、またはオンターゲットのヌクレオチド配列内で1つ以上のヌクレオチドを除去および/または挿入することができるようにオンターゲットのヌクレオチド配列を変形させることであり得る。
上記標的特異的Cas9は、オンターゲットに対する標的特異性が野生型Cas9と同じであるか、または増加したCas9変異体であり得る。
上記標的特異的Cas9は、オフターゲットを操作しないCas9変異体であり得る。
この時、上記操作は、Cas9変異体を利用してオフターゲットのヌクレオチド配列を切断するか、またはオフターゲットのヌクレオチド配列内で1つ以上のヌクレオチドを除去および/または挿入することができるようにオフターゲットのヌクレオチド配列を変形させることであり得る。
上記標的特異的Cas9は、野生型Cas9よりもオフターゲットに対する標的特異性が低下したCas9変異体であり得る。
上記標的特異的Cas9は、オンターゲットに対する標的特異性が野生型Cas9と同一で、オフターゲットに対する標的特異性は野生型Cas9よりも低下したCas9変異体であり得る。
上記標的特異的Cas9は、オフターゲットに対する標的特異性が野生型Cas9と同一で、オンターゲットに対する標的特異性は野生型Cas9よりも増加したCas9変異体であり得る。
上記標的特異的Cas9は、オンターゲットに対する標的特異性が野生型Cas9よりも増加し、オフターゲットに対する標的特異性は野生型Cas9よりも低下したCas9変異体であり得る。
上記標的特異的Cas9は、オンターゲットに対する標的特異性が野生型Cas9よりも低下し、オフターゲットに対する標的特異性は野生型Cas9よりも低下したCas9変異体であり得る。
本明細書によって開示される内容の一実施例では、上記標的特異的Cas9は、標的特異的SpCas9であり得る。
「標的特異的SpCas9(Target specific SpCas9、TS-SpCas9)」は、SpCas9変異体であり、野生型SpCas9に比べて標的特異性(specificity)が相対的に増加するように人為的に操作して生成されたSpCas9変異体を意味する。
上記TS-SpCas9は、オンターゲットを操作するSpCas9変異体であり得る。
この時、上記操作は、SpCas9変異体を利用してオンターゲットのヌクレオチド配列を切断するか、またはオンターゲットのヌクレオチド配列内で1つ以上のヌクレオチドを除去および/または挿入することができるようにオンターゲットのヌクレオチド配列を変形させることであり得る。
上記TS-SpCas9は、オンターゲットに対する標的特異性が野生型SpCas9と同じであるか、または増加したSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、オフターゲットを操作しないSpCas9変異体であり得る。
この時、上記操作は、SpCas9変異体を利用してオフターゲットのヌクレオチド配列を切断するか、またはオフターゲットのヌクレオチド配列内に1つ以上のヌクレオチドを除去および/または挿入することができるようにオフターゲットのヌクレオチド配列を変形させることであり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9よりもオフターゲットに対する標的特異性が低下したSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、オンターゲットに対する標的特異性が野生型SpCas9と同一で、オフターゲットに対する標的特異性は野生型SpCas9よりも低下したSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、オフターゲットに対する標的特異性が野生型SpCas9と同一で、オンターゲットに対する標的特異性は野生型SpCas9よりも増加したSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、オンターゲットに対する標的特異性が野生型SpCas9よりも増加し、オフターゲットに対する標的特異性は野生型SpCas9よりも低下したSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、オンターゲットに対する標的特異性が野生型SpCas9よりも低下し、オフターゲットに対する標的特異性は野生型SpCas9よりも低下したSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1領域、第2領域、第3領域、および第4領域のうち選択された1つ以上の領域内のアミノ酸配列のうち少なくとも1つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記第1領域は、野生型SpCas9の196番目のフェニルアラニン(F196)から282番目のイソロイシン(I282)までのアミノ酸配列(第1-1領域)であり得る。
上記第1領域は、野生型SpCas9の316番目のプロリン(P316)から394番目のアスパラギン(N394)までのアミノ酸配列(第1-2領域)であり得る。
上記第1領域は、野生型SpCas9の510番目のリジン(K510)から612番目のアスパラギン(N612)までのアミノ酸配列(第1-3領域)であり得る。
上記第1領域は、野生型SpCas9の678番目のトレオニン(T678)から698番目のヒスチジン(H698)までのアミノ酸配列(第1-4領域)であり得る。
上記第1領域は、野生型SpCas9の196番目のフェニルアラニン(F196)から282番目のイソロイシン(I282)までのアミノ酸配列(第1-1領域)、316番目のプロリン(P316)から394番目のアスパラギン(N394)までのアミノ酸配列(第1-2領域)、510番目のリジン(K510)から612番目のアスパラギン(N612)までのアミノ酸配列(第1-3領域)、および678番目のトレオニン(T678)から698番目のヒスチジン(H698)までのアミノ酸配列(第1-4領域)の中から選択された2つの領域であり得る。
上記第1領域は、野生型SpCas9の196番目のフェニルアラニン(F196)から282番目のイソロイシン(I282)までのアミノ酸配列(第1-1領域)、316番目のプロリン(P316)から394番目のアスパラギン(N394)までのアミノ酸配列(第1-2領域)、510番目のリジン(K510)から612番目のアスパラギン(N612)までのアミノ酸配列(第1-3領域)、および678番目のトレオニン(T678)から698番目のヒスチジン(H698)までのアミノ酸配列(第1-4領域)の中から選択された3つの領域であり得る。
上記第1領域は、野生型SpCas9の196番目のフェニルアラニン(F196)から282番目のイソロイシン(I282)までのアミノ酸配列(第1-1領域)、316番目のプロリン(P316)から394番目のアスパラギン(N394)までのアミノ酸配列(第1-2領域)、510番目のリジン(K510)から612番目のアスパラギン(N612)までのアミノ酸配列(第1-3領域)、および678番目のトレオニン(T678)から698番目のヒスチジン(H698)までのアミノ酸配列(第1-4領域)であり得る。
上記第2領域は、野生型SpCas9の1番目のメチオニン(M1)から22番目のトレオニン(T22)までのアミノ酸配列(第2-1領域)であり得る。
上記第2領域は、野生型SpCas9の731番目のプロリン(P731)から770番目のトレオニン(T770)までのアミノ酸配列(第2-2領域)であり得る。
上記第2領域は、野生型SpCas9の926番目のグルタミン(Q926)から1000番目のリジン(K1000)までのアミノ酸配列(第2-3領域)であり得る。
上記第2領域は、野生型SpCas9の1001番目のチロシン(Y1001)から1040番目のセリン(S1040)までのアミノ酸配列(第2-4領域)であり得る。
上記第2領域は、野生型SpCas9の1番目のメチオニン(M1)から22番目のトレオニン(T22)までのアミノ酸配列(第2-1領域)および731番目のプロリン(P731)から770番目のトレオニン(T770)までのアミノ酸配列(第2-2領域)であり得る。
上記第2領域は、野生型SpCas9の1番目のメチオニン(M1)から22番目のトレオニン(T22)までのアミノ酸配列(第2-1領域)および926番目のグルタミン(Q926)から1000番目のリジン(K1000)までのアミノ酸配列(第2-3領域)であり得る。
上記第2領域は、野生型SpCas9の1番目のメチオニン(M1)から22番目のトレオニン(T22)までのアミノ酸配列(第2-1領域)および1001番目のチロシン(Y1001)から1040番目のセリン(S1040)までのアミノ酸配列(第2-4領域)であり得る。
上記第2領域は、野生型SpCas9の731番目のプロリン(P731)から770番目のトレオニン(T770)までのアミノ酸配列(第2-2領域)および926番目のグルタミン(Q926)から1000番目のリジン(K1000)までのアミノ酸配列(第2-3領域)であり得る。
上記第2領域は、野生型SpCas9の731番目のプロリン(P731)から770番目のトレオニン(T770)までのアミノ酸配列(第2-2領域)および1001番目のチロシン(Y1001)から1040番目のセリン(S1040)までのアミノ酸配列(第2-4領域)であり得る。
上記第2領域は、野生型SpCas9の926番目のグルタミン(Q926)から1000番目のリジン(K1000)までのアミノ酸配列(第2-3領域)および1001番目のチロシン(Y1001)から1040番目のセリン(S1040)までのアミノ酸配列(第2-4領域)であり得る。
上記第2領域は、野生型SpCas9の1番目のメチオニン(M1)から22番目のトレオニン(T22)までのアミノ酸配列(第2-1領域)、731番目のプロリン(P731)から770番目のトレオニン(T770)までのアミノ酸配列(第2-2領域)、および926番目のグルタミン(Q926)から1000番目のリジン(K1000)までのアミノ酸配列(第2-3領域)であり得る。
上記第2領域は、野生型SpCas9の1番目のメチオニン(M1)から22番目のトレオニン(T22)までのアミノ酸配列(第2-1領域)、731番目のプロリン(P731)から770番目のトレオニン(T770)までのアミノ酸配列(第2-2領域)、および1001番目のチロシン(Y1001)から1040番目のセリン(S1040)までのアミノ酸配列(第2-4領域)であり得る。
上記第2領域は、野生型SpCas9の1番目のメチオニン(M1)から22番目のトレオニン(T22)までのアミノ酸配列(第2-1領域)、926番目のグルタミン(Q926)から1000番目のリジン(K1000)までのアミノ酸配列(第2-3領域)、および1001番目のチロシン(Y1001)から1040番目のセリン(S1040)までのアミノ酸配列(第2-4領域)であり得る。
上記第2領域は、野生型SpCas9の731番目のプロリン(P731)から770番目のトレオニン(T770)までのアミノ酸配列(第2-2領域)、926番目のグルタミン(Q926)から1000番目のリジン(K1000)までのアミノ酸配列(第2-3領域)、および1001番目のチロシン(Y1001)から1040番目のセリン(S1040)までのアミノ酸配列(第2-4領域)であり得る。
上記第2領域は、野生型SpCas9の1番目のメチオニン(M1)から22番目のトレオニン(T22)までのアミノ酸配列(第2-1領域)、731番目のプロリン(P731)から770番目のトレオニン(T770)までのアミノ酸配列(第2-2領域)、926番目のグルタミン(Q926)から1000番目のリジン(K1000)までのアミノ酸配列(第2-3領域)、および1001番目のチロシン(Y1001)から1040番目のセリン(S1040)までのアミノ酸配列(第2-4領域)であり得る。
上記第3領域は、野生型SpCas9の775番目のリジン(K775)から900番目のロイシン(L900)までのアミノ酸配列(第3-1領域)であり得る。
上記第4領域は、野生型SpCas9の1099番目のグルタミン酸(E1099)から1139番目のバリン(V1139)までのアミノ酸配列(第4-1領域)であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域のうち、N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281およびI282からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-2領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-2領域のうち、P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391およびL393からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-3領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-3領域のうち、K510,L513,L514,Y515,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,E584,D585,F587,N588,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606およびL607からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-4領域のうち、I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,N692,F693,M694,Q695,L696,I697およびH698からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域、および第1-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域、および第1-4領域のうち、N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,K510,L513,L514,Y515,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,E584,D585,F587,N588,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,N692,F693,M694,Q695,L696,I697およびH698からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。
一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203、N277、G366、F539、またはI601を変形させたSpCas9変異体であり得る。
他の一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/N277(A203とN277)、A203/G366、A203/F539、またはA203/I601を変形させたSpCas9変異体であり得る。
また、他の一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のN277/G366、N277/F539、またはN277/I601を変形させたSpCas9であり得る。
一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のG366/F539、G366/I601、またはF539/I601を変形させたSpCas9であり得る。
他の一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/N277/G366、A203/N277/F539、A203/N277/I601、A203/G366/F539、A203/G366/I601、A203/F539/I601、N277/G366/F539、N277/G366/I601、またはG366/F539/I601を変形させたSpCas9であり得る。
また、他の一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/N277/G366/F539、A203/N277/G366/I601、A203/N277/F539/I601、A203/G366/F539/I601、またはN277/G366/F539/I601を変形させたSpCas9であり得る。
他の一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/N277/G366/F539/I601を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-1領域のうち、I7,G8,L9,D10,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20およびI21からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-2領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-2領域のうち、P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,E762,M763,A764,R765,E766およびN767からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-3領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-3領域のうち、I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,D965,F966,F970,F972,V975,U978,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987,Y988,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997およびI998からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-4領域のうち、Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038およびY1039からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域、および第2-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-1領域、第2-2領域および第2-3領域のうち、I7,G8,L9,D10,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,E762,M763,A764,R765,E766,N767,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,D965,F966,F970,F972,V975,U978,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987,Y988,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997,I998,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038およびY1039からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。
一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のY1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,またはG1030を変形させたSpCas9変異体であり得る。
一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のM763、D965、E1007、またはF1038を変形させたSpCas9変異体であり得る。
他の一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のM763/D965、M763/E1007、M763/F1038、D965/E1007、E1007/F1038、またはD965/F1038を変形させたSpCas9変異体であり得る。
また、他の一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のM763/D965/E1007、M763/D965/F1038、M763/E1007/F1038、またはD965/E1007/F1038を変形させたSpCas9変異体であり得る。
他の一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のM763/D965/E1007/F1038を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第3領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第3-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第3-1領域のうち、K775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,V838,D839,H840,K848,D849,D850,D853,N854,K855,R859,D861,K862,N863,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,A889,K890,L891,R895,K896およびD898からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。
一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のK890を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第4-1領域のうち、T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。
一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のT1102またはD1127を変形させたSpCas9変異体であり得る。
他の一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のT1102/D1127を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1領域および第2領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。この時、上記第1領域および第2領域は、それぞれ少なくとも1つ以上の変形されたアミノ酸を含むことができる。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域および/または第1-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸、および第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域および/または第2-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸をそれぞれ変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域および/または第1-4領域のうち、N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696およびI697からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸、および第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域および/または第2-4領域のうち、I7,G8,L9,D10,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,E762,M763,A764,R765,E766,N767,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,D965,F966,F970,F972,V975,U978,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987,Y988,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997,I998,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038およびY1039からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸をそれぞれ変形させたSpCas9変異体であり得る。
一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/M763、A203/D965、A203/E1007、A203/F1038、A203/M763/D965、A203/M763/E1007、A203/M763/F1038、A203/D965/E1007、A203/D965/F1038、D965/E1007/F1038、A203/M763/D965/E1007、A203/M763/D965/F1038、A203/M763/E1007/F1038、A203/D965/E1007/F1038、A203/M763/D965/E1007/F1038、N277/M763、N277/D965、N277/E1007、N277/F1038、N277/M763/D965、N277/M763/E1007、N277/M763/F1038、N277/D965/E1007、N277/D965/F1038、N277/E1007/F1038、N277/M763/D965/E1007、N277/M763/D965/F1038、N277/M763/E1007/F1038、N277/D965/E1007/F1038、N277/M763/D965/E1007/F1038、G366/M763、G366/D965、G366/E1007、G366/F1038、G366/M763/D965、G366/M763/E1007、G366/M763/F1038、G366/D965/E1007、G366/D965/F1038、G366/E1007/F1038、G366/M763/D965/E1007、G366/M763/D965/F1038、G366/M763/E1007/F1038、G366/D965/E1007/F1038、G366/M763/D965/E1007/F1038、F539/M763、F539/D965、F539/E1007、F539/F1038、F539/M763/D965、F539/M763/E1007、F539/M763/F1038、F539/D965/E1007、F539/D965/F1038、F539/E1007/F1038、F539/M763/D965/E1007、F539/M763/D965/F1038、F539/M763/E1007/F1038、F539/D965/E1007/F1038、F539/M763/D965/E1007/F1038、I601/M763、I601/D965、I601/E1007、I601/F1038、I601/M763/D965、I601/M763/E1007、I601/M763/F1038、I601/D965/E1007、I601/D965/F1038、I601/E1007/F1038、I601/M763/D965/E1007、I601/M763/D965/F1038、I601/M763/E1007/F1038、I601/D965/E1007/F1038、またはI601/M763/D965/E1007/F1038を変形させたSpCas9変異体であり得る。
他の一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/N277/M763、A203/N277/D965、A203/N277/E1007、A203/N277/F1038、A203/N277/M763/D965、A203/N277/M763/E1007、A203/N277/M763/F1038、A203/N277/D965/E1007、A203/N277/D965/F1038、A203/N277/E1007/F1038、A203/N277/M763/D965/E1007、A203/N277/M763/D965/F1038、A203/N277/M763/E1007/F1038、A203/N277/D965/E1007/F1038、A203/N277/M763/D965/E1007/F1038、A203/G366/M763、A203/G366/D965、A203/G366/E1007、A203/G366/F1038、A203/G366/M763/D965、A203/G366/M763/E1007、A203/G366/M763/F1038、A203/G366/D965/E1007、A203/G366/D965/F1038、A203/G366/E1007/F1038、A203/G366/M763/D965/E1007、A203/G366/M763/D965/F1038、A203/G366/M763/E1007/F1038、A203/G366/D965/E1007/F1038、A203/G366/M763/D965/E1007/F1038、A203/F539/M763、A203/F539/D965、A203/F539/E1007、A203/F539/F1038、A203/F539/M763/D965、A203/F539/M763/E1007、A203/F539/M763/F1038、A203/F539/D965/E1007、A203/F539/D965/F1038、A203/F539/E1007/F1038、A203/F539/M763/D965/E1007、A203/F539/M763/D965/F1038、A203/F539/M763/E1007/F1038、A203/F539/D965/E1007/F1038、A203/F539/M763/D965/E1007/F1038、A203/I601/M763、A203/I601/D965、A203/I601/E1007、A203/I601/F1038、A203/I601/M763/D965、A203/I601/M763/E1007、A203/I601/M763/F1038、A203/I601/D965/E1007、A203/I601/D965/F1038、A203/I601/E1007/F1038、A203/I601/M763/D965/E1007、A203/I601/M763/D965/F1038、A203/I601/M763/E1007/F1038、A203/I601/D965/E1007/F1038、A203/I601/M763/D965/E1007/F1038、N277/G366/M763、N277/G366/D965、N277/G366/E1007、N277/G366/F1038、N277/G366/M763/D965、N277/G366/M763/E1007、N277/G366/M763/F1038、N277/G366/D965/E1007、N277/G366/D965/F1038、N277/G366/E1007/F1038、N277/G366/M763/D965/E1007、N277/G366/M763/D965/F1038、N277/G366/M763/E1007/F1038、N277/G366/D965/E1007/F1038、N277/G366/M763/D965/E1007/F1038、N277/F539/M763、N277/F539/D965、N277/F539/E1007、N277/F539/F1038、N277/F539/M763/D965、N277/F539/M763/E1007、N277/F539/M763/F1038、N277/F539/D965/E1007、N277/F539/D965/F1038、N277/F539/E1007/F1038、N277/F539/M763/D965/E1007、N277/F539/M763/D965/F1038、N277/F539/M763/E1007/F1038、N277/F539/D965/E1007/F1038、N277/F539/M763/D965/E1007/F1038、N277/I601/M763、N277/I601/D965、N277/I601/E1007、N277/I601/F1038、N277/I601/M763/D965、N277/I601/M763/E1007、N277/I601/M763/F1038、N277/I601/D965/E1007、N277/I601/D965/F1038、N277/I601/E1007/F1038、N277/I601/M763/D965/E1007、N277/I601/M763/D965/F1038、N277/I601/M763/E1007/F1038、N277/I601/D965/E1007/F1038、N277/I601/M763/D965/E1007/F1038、G366/F539/M763、G366/F539/D965、G366/F539/E1007、G366/F539/F1038、G366/F539/M763/D965、G366/F539/M763/E1007、G366/F539/M763/F1038、G366/F539/D965/E1007、G366/F539/D965/F1038、G366/F539/E1007/F1038、G366/F539/M763/D965/E1007、G366/F539/M763/D965/F1038、G366/F539/M763/E1007/F1038、G366/F539/D965/E1007/F1038、G366/F539/M763/D965/E1007/F1038、G366/I601/M763、G366/I601/D965、G366/I601/E1007、G366/I601/F1038、G366/I601/M763/D965、G366/I601/M763/E1007、G366/I601/M763/F1038、G366/I601/D965/E1007、G366/I601/D965/F1038、G366/I601/E1007/F1038、G366/I601/M763/D965/E1007、G366/I601/M763/D965/F1038、G366/I601/M763/E1007/F1038、G366/I601/D965/E1007/F1038、G366/I601/M763/D965/E1007/F1038、F539/I601/M763、F539/I601/D965、F539/I601/E1007、F539/I601/F1038、F539/I601/M763/D965、F539/I601/M763/E1007、F539/I601/M763/F1038、F539/I601/D965/E1007、F539/I601/D965/F1038、F539/I601/E1007/F1038、F539/I601/M763/D965/E1007、F539/I601/M763/D965/F1038、F539/I601/M763/E1007/F1038、F539/I601/D965/E1007/F1038、またはF539/I601/M763/D965/E1007/F1038を変形させたSpCas9変異体であり得る。
また、他の一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/N277/G366/M763、A203/N277/G366/D965、A203/N277/G366/E1007、A203/N277/G366/F1038、A203/N277/G366/M763/D965、A203/N277/G366/M763/E1007、A203/N277/G366/M763/F1038、A203/N277/G366/D965/E1007、A203/N277/G366/D965/F1038、A203/N277/G366/E1007/F1038、A203/N277/G366/M763/D965/E1007、A203/N277/G366/M763/D965/F1038、A203/N277/G366/M763/E1007/F1038、A203/N277/G366/D965/E1007/F1038、A203/N277/G366/M763/D965/E1007/F1038、A203/N277/F539/M763、A203/N277/F539/D965、A203/N277/F539/E1007、A203/N277/F539/F1038、A203/N277/F539/M763/D965、A203/N277/F539/M763/E1007、A203/N277/F539/M763/F1038、A203/N277/F539/D965/E1007、A203/N277/F539/D965/F1038、A203/N277/F539/E1007/F1038、A203/N277/F539/M763/D965/E1007、A203/N277/F539/M763/D965/F1038、A203/N277/F539/M763/E1007/F1038、A203/N277/F539/D965/E1007/F1038、A203/N277/F539/M763/D965/E1007/F1038、A203/N277/I601/M763、A203/N277/I601/D965、A203/N277/I601/E1007、A203/N277/I601/F1038、A203/N277/I601/M763/D965、A203/N277/I601/M763/E1007、A203/N277/I601/M763/F1038、A203/N277/I601/D965/E1007、A203/N277/I601/D965/F1038、A203/N277/I601/E1007/F1038、A203/N277/I601/M763/D965/E1007、A203/N277/I601/M763/D965/F1038、A203/N277/I601/M763/E1007/F1038、A203/N277/I601/D965/E1007/F1038、A203/N277/I601/M763/D965/E1007/F1038、A203/G366/F539/M763、A203/G366/F539/D965、A203/G366/F539/E1007、A203/G366/F539/F1038、A203/G366/F539/M763/D965、A203/G366/F539/M763/E1007、A203/G366/F539/M763/F1038、A203/G366/F539/D965/E1007、A203/G366/F539/D965/F1038、A203/G366/F539/E1007/F1038、A203/G366/F539/M763/D965/E1007、A203/G366/F539/M763/D965/F1038、A203/G366/F539/M763/E1007/F1038、A203/G366/F539/D965/E1007/F1038、A203/G366/F539/M763/D965/E1007/F1038、A203/G366/I601/M763、A203/G366/I601/D965、A203/G366/I601/E1007、A203/G366/I601/F1038、A203/G366/I601/M763/D965、A203/G366/I601/M763/E1007、A203/G366/I601/M763/F1038、A203/G366/I601/D965/E1007、A203/G366/I601/D965/F1038、A203/G366/I601/E1007/F1038、A203/G366/I601/M763/D965/E1007、A203/G366/I601/M763/D965/F1038、A203/G366/I601/M763/E1007/F1038、A203/G366/I601/D965/E1007/F1038、A203/G366/I601/M763/D965/E1007/F1038、A203/F539/I601/M763、A203/F539/I601/D965、A203/F539/I601/E1007、A203/F539/I601/F1038、A203/F539/I601/M763/D965、A203/F539/I601/M763/E1007、A203/F539/I601/M763/F1038、A203/F539/I601/D965/E1007、A203/F539/I601/D965/F1038、A203/F539/I601/E1007/F1038、A203/F539/I601/M763/D965/E1007、A203/F539/I601/M763/D965/F1038、A203/F539/I601/M763/E1007/F1038、A203/F539/I601/D965/E1007/F1038、A203/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038、N277/G366/F539/M763、N277/G366/F539/D965、N277/G366/F539/E1007、N277/G366/F539/F1038、N277/G366/F539/M763/D965、N277/G366/F539/M763/E1007、N277/G366/F539/M763/F1038、N277/G366/F539/D965/E1007、N277/G366/F539/D965/F1038、N277/G366/F539/E1007/F1038、N277/G366/F539/M763/D965/E1007、N277/G366/F539/M763/D965/F1038、N277/G366/F539/M763/E1007/F1038、N277/G366/F539/D965/E1007/F1038、N277/G366/F539/M763/D965/E1007/F1038、N277/G366/I601/M763、N277/G366/I601/D965、N277/G366/I601/E1007、N277/G366/I601/F1038、N277/G366/I601/M763/D965、N277/G366/I601/M763/E1007、N277/G366/I601/M763/F1038、N277/G366/I601/D965/E1007、N277/G366/I601/D965/F1038、N277/G366/I601/E1007/F1038、N277/G366/I601/M763/D965/E1007、N277/G366/I601/M763/D965/F1038、N277/G366/I601/M763/E1007/F1038、N277/G366/I601/D965/E1007/F1038、N277/G366/I601/M763/D965/E1007/F1038、G366/F539/I601/M763、G366/F539/I601/D965、G366/F539/I601/E1007、G366/F539/I601/F1038、G366/F539I601/M763/D965、G366/F539/I601/M763/E1007、G366/F539/I601/M763/F1038、G366/F539/I601/D965/E1007、G366/F539/I601/D965/F1038、G366/F539/I601/E1007/F1038、G366/F539/I601/M763/D965/E1007、G366/F539/I601/M763/D965/F1038、G366/F539/I601/M763/E1007/F1038、G366/F539/I601/D965/E1007/F1038、またはG366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038を変形させたSpCas9変異体であり得る。
一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/N277/G366/F539/M763、A203/N277/G366/F539/D965、A203/N277/G366/F539/E1007、A203/N277/G366/F539/F1038、A203/N277/G366/F539/M763/D965、A203/N277/G366/F539/M763/E1007、A203/N277/G366/F539/M763/F1038、A203/N277/G366/F539/D965/E1007、A203/N277/G366/F539/D965/F1038、A203/N277/G366/F539/E1007/F1038、A203/N277/G366/F539/M763/D965/E1007、A203/N277/G366/F539/M763/D965/F1038、A203/N277/G366/F539/M763/E1007/F1038、A203/N277/G366/F539/D965/E1007/F1038、A203/N277/G366/F539/M763/D965/E1007/F1038、A203/N277/G366/I601/M763、A203/N277/G366/I601/D965、A203/N277/G366/I601/E1007、A203/N277/G366/I601/F1038、A203/N277/G366/I601/M763/D965、A203/N277/G366/I601/M763/E1007、A203/N277/G366/I601/M763/F1038、A203/N277/G366/I601/D965/E1007、A203/N277/G366/I601/D965/F1038、A203/N277/G366/I601/E1007/F1038、A203/N277/G366/I601/M763/D965/E1007、A203/N277/G366/I601/M763/D965/F1038、A203/N277/G366/I601/M763/E1007/F1038、A203/N277/G366/I601/D965/E1007/F1038、A203/N277/G366/I601/M763/D965/E1007/F1038、N277/G366/F539/I601/M763、N277/G366/F539/I601/D965、N277/G366/F539/I601/E1007、N277/G366/F539/I601/F1038、N277/G366/F539/I601/M763/D965、N277/G366/F539/I601/M763/E1007、N277/G366/F539/I601/M763/F1038、N277/G366/F539/I601/D965/E1007、N277/G366/F539/I601/D965/F1038、N277/G366/F539/I601/E1007/F1038、N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007、N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038、N277/G366/F539/I601/M763/E1007/F1038、N277/G366/F539/I601/D965/E1007/F1038、N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038、A203/N277/G366/F539/I601/M763、A203/N277/G366/F539/I601/D965、A203/N277/G366/F539/I601/E1007、A203/N277/G366/F539/I601/F1038、A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965、A203/N277/G366/F539/I601/M763/E1007、A203/N277/G366/F539/I601/M763/F1038、A203/N277/G366/F539/I601/D965/E1007、A203/N277/G366/F539/I601/D965/F1038、A203/N277/G366/F539/I601/E1007/F1038、A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007、A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038、A203/N277/G366/F539/I601/M763/E1007/F1038、A203/N277/G366/F539/I601/D965/E1007/F1038、またはA203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1領域および第3領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。この時、2つ以上のアミノ酸はそれぞれ異なる領域に存在することができる。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域および/または第1-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸、および第3-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸をそれぞれ変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域および/または第1-4領域のうち、N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696およびI697からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸、および第3-1領域のうち、K775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,V838,D839,H840,K848,D849,D850,D853,N854,K855,R859,D861,K862,N863,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,A889,K890,L891,R895,K896およびD898からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸をそれぞれ変形させたSpCas9変異体であり得る。
一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/K890、N277/K890、G366/K890、F539/K890、またはI601/K890を変形させたSpCas9変異体であり得る。
他の一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/N277/K890、A203/G366/K890、A203/F539/K890、A203/I601/K890、N277/G366/K890、N277/F539/K890、N277/I601/K890、G366/F539/K890、G366/I601/K890、またはF539/I601/K890を変形させたSpCas9変異体であり得る。
また、他の一実施例で、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/N277/G366/K890、A203/N277/F539/K890、A203/N277/I601/K890、A203/G366/F539/K890、A203/G366/I601/K890、A203/F539/I601/K890、N277/G366/F539/K890、N277/G366/I601/K890、または、G366/F539/I601/K890を変形させたSpCas9変異体であり得る。
一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/N277/G366/F539/K890、A203/N277/G366/I601/K890、またはN277/G366/F539/I601/K890を変形させたSpCas9変異体であり得る。
他の一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/N277/G366/F539/I601/K890を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1領域および第4領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。この時、2つ以上のアミノ酸は、それぞれ異なる領域に存在することができる。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域および/または第1-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸、および第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸をそれぞれ変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域および/または第1-4領域のうち、N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696およびI697からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸、および第4-1領域のうち、T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸をそれぞれ変形させたSpCas9変異体であり得る。
一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/T1102、N277/T1102、G366/T1102、F539/T1102、I601/T1102、A203/D1127、N277/D1127、G366/D1127、F539/D1127、I601/D1127、A203/T1102/D1127、N277/T1102/D1127、G366/T1102/D1127、F539/T1102/D1127、またはI601/T1102/D1127を変形させたSpCas9変異体であり得る。
他の一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/N277/T1102、A203/G366/T1102、A203/F539/T1102、A203/I601/T1102、N277/G366/T1102、N277/F539/T1102、N277/I601/T1102、G366/F539/T1102、G366/I601/T1102、F539/I601/T1102、A203/N277/D1127、A203/G366/D1127、A203/F539/D1127、A203/I601/D1127、N277/G366/D1127、N277/F539/D1127、N277/I601/D1127、G366/F539/D1127、G366/I601/D1127、F539/I601/D1127、A203/N277/T1102/D1127、A203/G366/T1102/D1127、A203/F539/T1102/D1127、A203/I601/T1102/D1127、N277/G366/T1102/D1127、N277/F539/T1102/D1127、N277/I601/T1102/D1127、G366/F539/T1102/D1127、G366/I601/T1102/D1127、またはF539/I601/T1102/D1127を変形させたSpCas9変異体であり得る。
また、他の一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/N277/G366/T1102、A203/N277/F539/T1102、A203/N277/I601/T1102、A203/G366/F539/T1102、A203/G366/I601/T1102、A203/F539/I601/T1102、N277/G366/F539/T1102、N277/G366/I601/T1102、G366/F539/I601/T1102、A203/N277/G366/D1127、A203/N277/F539/D1127、A203/N277/I601/D1127、A203/G366/F539/D1127、A203/G366/I601/D1127、A203/F539/I601/D1127、N277/G366/F539/D1127、N277/G366/I601/D1127、G366/F539/I601/D1127、A203/N277/G366/T1102/D1127、A203/N277/F539/T1102/D1127、A203/N277/I601/T1102/D1127、A203/G366/F539/T1102/D1127、A203/G366/I601/T1102/D1127、A203/F539/I601/T1102/D1127、N277/G366/F539/T1102/D1127、N277/G366/I601/T1102/D1127、またはG366/F539/I601/T1102/D1127を変形させたSpCas9変異体であり得る。
一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/N277/G366/F539/T1102、A203/N277/G366/I601/T1102、N277/G366/F539/I601/T1102、A203/N277/G366/F539/D1127、A203/N277/G366/I601/D1127、N277/G366/F539/I601/D1127、A203/N277/G366/F539/T1102/D1127、A203/N277/G366/I601/T1102/D1127、またはN277/G366/F539/I601/T1102/D1127を変形させたSpCas9変異体であり得る。
他の一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/N277/G366/F539/I601/T1102、A203/N277/G366/F539/I601/D1127、またはA203/N277/G366/F539/I601/T1102/D1127を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2領域および第3領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。この時、2つ以上のアミノ酸は、それぞれ異なる領域に存在することができる。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域および/または第2-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸、および第3-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸をそれぞれ変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域および/または第2-4領域のうち、I7,G8,L9,D10,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,E762,M763,A764,R765,E766,N767,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,D965,F966,F970,F972,V975,U978,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987,Y988,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997,I998,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038およびY1039からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸、および第3-1領域のうち、K775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,V838,D839,H840,K848,D849,D850,D853,N854,K855,R859,D861,K862,N863,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,A889,K890,L891,R895,K896およびD898からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸をそれぞれ変形させたSpCas9変異体であり得る。
一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のM763/K890、K890/D965、K890/E1007、またはK890/F1038を変形させたSpCas9変異体であり得る。
他の一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のM763/K890/D965、M763/K890/E1007、M763/K890/F1038、K890/D965/E1007、またはK890/E1007/F1038を変形させたSpCas9変異体であり得る。
また、他の一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のM763/K890/D965/E1007、M763/K890/D965/F1038、M763/K890/E1007/F1038、K890/D965/E1007/F1038、またはM763/K890/D965/E1007/F1038を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2領域および第4領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。この時、2つ以上のアミノ酸は、それぞれ異なる領域に存在することができる。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域および/または第2-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸、および第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸をそれぞれ変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域および/または第2-4領域のうち、I7,G8,L9,D10,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,E762,M763,A764,R765,E766,N767,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,D965,F966,F970,F972,V975,U978,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987,Y988,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997,I998,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038およびY1039からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸、および第4-1領域のうち、T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸をそれぞれ変形させたSpCas9変異体であり得る。
一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のM763/T1102、D965/T1102、E1007/T1102、F1038/T1102、M763/D1127、D965/D1127、E1007/D1127、F1038/D1127、M763/T1102/D1127、D965/T1102/D1127、E1007/T1102/D1127、またはF1038/T1102/D1127を変形させたSpCas9変異体であり得る。
他の一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のM763/D965/T1102、M763/E1007/T1102、M763/F1038/T1102、D965/E1007/T1102、D965/F1038/T1102、E1007/F1038/T1102、M763/D965/D1127、M763/E1007/D1127、M763/F1038/D1127、D965/E1007/D1127、D965/F1038/D1127、E1007/F1038/D1127、M763/D965/T1102/D1127、M763/E1007/T1102/D1127、M763/F1038/T1102/D1127、D965/E1007/T1102/D1127、D965/F1038/T1102/D1127、またはE1007/F1038/T1102/D1127を変形させたSpCas9変異体であり得る。
また、他の一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のM763/D965/E1007/T1102、M763/D965/F1038/T1102、M763/E1007/F1038/T1102、D965/E1007/F1038/T1102、M763/D965/E1007/F1038/T1102、M763/D965/E1007/D1127、M763/D965/F1038/D1127、M763/E1007/F1038/D1127、D965/E1007/F1038/D1127、M763/D965/E1007/F1038/D1127、M763/D965/E1007/T1102/D1127、M763/D965/F1038/T1102/D1127、M763/E1007/F1038/T1102/D1127、D965/E1007/F1038/T1102/D1127、またはM763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第3領域および第4領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。この時、2つ以上のアミノ酸は、それぞれ異なる領域に存在することができる。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第3-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸、および第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸をそれぞれ変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第3-1領域のうち、K775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,D839,H840,K848,D849,D850,D853,K855,R859,D861,K862,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,K890,R895,K896およびD898からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸、および第4-1領域のうち、T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸をそれぞれ変形させたSpCas9変異体であり得る。
一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のK890/T1102、K890/D1127、またはK890/T1102/D1127を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1領域、第2領域、および第3領域内のアミノ酸配列のうち選択された3つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。この時、3つ以上のアミノ酸は、それぞれ異なる領域に存在することができる。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域および/または第1-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸、第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域および/または第2-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸、および第3-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸をそれぞれ変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域および/または第1-4領域のうち、N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696およびI697からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸、第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域および/または第2-4領域のうち、I7,G8,L9,D10,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,E762,M763,A764,R765,E766,N767,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,D965,F966,F970,F972,V975,U978,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987,Y988,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997,I998,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038およびY1039からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸、および第3-1領域のうち、K775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,V838,D839,H840,K848,D849,D850,D853,N854,K855,R859,D861,K862,N863,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,A889,K890,L891,R895,K896およびD898からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸をそれぞれ変形させたSpCas9変異体であり得る。
一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/M763/K890、A203/K890/D965、A203/K890/E1007、A203/K890/F1038、A203/M763/K890/D965、A203/M763/K890/E1007、A203/M763/K890/F1038、A203/K890/D965/E1007、A203/K890/D965/F1038、A203/K890/E1007/F1038、A203/M763/K890/D965/E1007、A203/M763/K890/D965/F1038、A203/M763/K890/E1007/F1038、A203/K890/D965/E1007/F1038、A203/M763/K890/D965/E1007/F1038、N277/M763/K890、N277/K890/D965、N277/K890/E1007、N277/K890/F1038、N277/M763/K890/D965、N277/M763/K890/E1007、N277/M763/K890/F1038、N277/K890/D965/E1007、N277/K890/D965/F1038、N277/K890/E1007/F1038、N277/M763/K890/D965/E1007、N277/M763/K890/D965/F1038、N277/M763/K890/E1007/F1038、N277/K890/D965/E1007/F1038、N277/M763/K890/D965/E1007/F1038、G366/M763/K890、G366/K890/D965、G366/K890/E1007、G366/K890/F1038、G366/M763/K890/D965、G366/M763/K890/E1007、G366/M763/K890/F1038、G366/K890/D965/E1007、G366/K890/D965/F1038、G366/K890/E1007/F1038、G366/M763/K890/D965/E1007、G366/M763/K890/D965/F1038、G366/M763/K890/E1007/F1038、G366/K890/D965/E1007/F1038、G366/M763/K890/D965/E1007/F1038、F539/M763/K890、F539/K890/D965、F539/K890/E1007、F539/K890/F1038、F539/M763/K890/D965、F539/M763/K890/E1007、F539/M763/K890/F1038、F539/K890/D965/E1007、F539/K890/D965/F1038、F539/K890/E1007/F1038、F539/M763/K890/D965/E1007、F539/M763/K890/D965/F1038、F539/M763/K890/E1007/F1038、F539/K890/D965/E1007/F1038、F539/M763/K890/D965/E1007/F1038、I601/M763/K890、I601/K890/D965、I601/K890/E1007、I601/K890/F1038、I601/M763/K890/D965、I601/M763/K890/E1007、I601/M763/K890/F1038、I601/K890/D965/E1007、I601/K890/D965/F1038、I601/K890/E1007/F1038、I601/M763/K890/D965/E1007、I601/M763/K890/D965/F1038、I601/M763/K890/E1007/F1038、I601/K890/D965/E1007/F1038、またはI601/M763/K890/D965/E1007/F1038を変形させたSpCas9変異体であり得る。
他の一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/N277/M763/K890、A203/N277/K890/D965、A203/N277/K890/E1007、A203/N277/K890/F1038、A203/N277/M763/K890/D965、A203/N277/M763/K890/E1007、A203/N277/M763/K890/F1038、A203/N277/K890/D965/E1007、A203/N277/K890/D965/F1038、A203/N277/K890/E1007/F1038、A203/N277/M763/K890/D965/E1007、A203/N277/M763/K890/D965/F1038、A203/N277/M763/K890/E1007/F1038、A203/N277/K890/D965/E1007/F1038、A203/N277/M763/K890/D965/E1007/F1038、A203/G366/M763/K890、A203/G366/K890/D965、A203/G366/K890/E1007、A203/G366/K890/F1038、A203/G366/M763/K890/D965、A203/G366/M763/K890/E1007、A203/G366/M763/K890/F1038、A203/G366/K890/D965/E1007、A203/G366/K890/D965/F1038、A203/G366/K890/E1007/F1038、A203/G366/M763/K890/D965/E1007、A203/G366/M763/K890/D965/F1038、A203/G366/M763/K890/E1007/F1038、A203/G366/K890/D965/E1007/F1038、A203/G366/M763/K890/D965/E1007/F1038、A203/F539/M763/K890、A203/F539/K890/D965、A203/F539/K890/E1007、A203/F539/K890/F1038、A203/F539/M763/K890/D965、A203/F539/M763/K890/E1007、A203/F539/M763/K890/F1038、A203/F539/K890/D965/E1007、A203/F539/K890/D965/F1038、A203/F539/K890/E1007/F1038、A203/F539/M763/K890/D965/E1007、A203/F539/M763/K890/D965/F1038、A203/F539/M763/K890/E1007/F1038、A203/F539/K890/D965/E1007/F1038、A203/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038、A203/I601/M763/K890、A203/I601/K890/D965、A203/I601/K890/E1007、A203/I601/K890/F1038、A203/I601/M763/K890/D965、A203/I601/M763/K890/E1007、A203/I601/M763/K890/F1038、A203/I601/K890/D965/E1007、A203/I601/K890/D965/F1038、A203/I601/K890/E1007/F1038、A203/I601/M763/K890/D965/E1007、A203/I601/M763/K890/D965/F1038、A203/I601/M763/K890/E1007/F1038、A203/I601/K890/D965/E1007/F1038、A203/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038、N277/G366/M763/K890、N277/G366/K890/D965、N277/G366/K890/E1007、N277/G366/K890/F1038、N277/G366/M763/K890/D965、N277/G366/M763/K890/E1007、N277/G366/M763/K890/F1038、N277/G366/K890/D965/E1007、N277/G366/K890/D965/F1038、N277/G366/K890/E1007/F1038、N277/G366/M763/K890/D965/E1007、N277/G366/M763/K890/D965/F1038、N277/G366/M763/K890/E1007/F1038、N277/G366/K890/D965/E1007/F1038、N277/G366/M763/K890/D965/E1007/F1038、N277/F539/M763/K890、N277/F539/K890/D965、N277/F539/K890/E1007、N277/F539/K890/F1038、N277/F539/M763/K890/D965、N277/F539/M763/K890/E1007、N277/F539/M763/K890/F1038、N277/F539/K890/D965/E1007、N277/F539/K890/D965/F1038、N277/F539/K890/E1007/F1038、N277/F539/M763/K890/D965/E1007、N277/F539/M763/K890/D965/F1038、N277/F539/M763/K890/E1007/F1038、N277/F539/K890/D965/E1007/F1038、N277/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038、N277/I601/M763/K890、N277/I601/K890/D965、N277/I601/K890/E1007、N277/I601/K890/F1038、N277/I601/M763/K890/D965、N277/I601/M763/K890/E1007、N277/I601/M763/K890/F1038、N277/I601/K890/D965/E1007、N277/I601/K890/D965/F1038、N277/I601/K890/E1007/F1038、N277/I601/M763/K890/D965/E1007、N277/I601/M763/K890/D965/F1038、N277/I601/M763/K890/E1007/F1038、N277/I601/K890/D965/E1007/F1038、N277/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038、G366/F539/M763/K890、G366/F539/K890/D965、G366/F539/K890/E1007、G366/F539/K890/F1038、G366/F539/M763/K890/D965、G366/F539/M763/K890/E1007、G366/F539/M763/K890/F1038、G366/F539/K890/D965/E1007、G366/F539/K890/D965/F1038、G366/F539/K890/E1007/F1038、G366/F539/M763/K890/D965/E1007、G366/F539/M763/K890/D965/F1038、G366/F539/M763/K890/E1007/F1038、G366/F539/K890/D965/E1007/F1038、G366/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038、G366/I601/M763/K890、G366/I601/K890/D965、G366/I601/K890/E1007、G366/I601/K890/F1038、G366/I601M763/K890/D965、G366/I601/M763/K890/E1007、G366/I601/M763/K890/F1038、G366/I601/K890/D965/E1007、G366/I601/K890/D965/F1038、G366/I601/K890/E1007/F1038、G366/I601/M763/K890/D965/E1007、G366/I601/M763/K890/D965/F1038、G366/I601/M763/K890/E1007/F1038、G366/I601/K890/D965/E1007/F1038、G366/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038、F539/I601/M763/K890、F539/I601/K890/D965、F539/I601/K890/E1007、F539/I601/K890/F1038、F539/I601/M763/K890/D965、F539/I601/M763/K890/E1007、F539/I601/M763/K890/F1038、F539/I601/K890/D965/E1007、F539/I601/K890/D965/F1038、F539/I601/K890/E1007/F1038、F539/I601/M763/K890/D965/E1007、F539/I601/M763/K890/D965/F1038、F539/I601/M763/K890/E1007/F1038、F539/I601/K890/D965/E1007/F1038、またはF539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038を変形させたSpCas9変異体であり得る。
また、他の一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/N277/G366/M763/K890、A203/N277/G366/K890/D965、A203/N277/G366/K890/E1007、A203/N277/G366/K890/F1038、A203/N277/G366/M763/K890/D965、A203/N277/G366/M763/K890/E1007、A203/N277/G366/M763/K890/F1038、A203/N277/G366/K890/D965/E1007、A203/N277/G366/K890/D965/F1038、A203/N277/G366/K890/E1007/F1038、A203/N277/G366/M763/K890/D965/E1007、A203/N277/G366/M763/K890/D965/F1038、A203/N277/G366/M763/K890/E1007/F1038、A203/N277/G366/K890/D965/E1007/F1038、A203/N277/G366/M763/K890/D965/E1007/F1038、A203/N277/F539/M763/K890、A203/N277/F539/K890/D965、A203/N277/F539/K890/E1007、A203/N277/F539/K890/F1038、A203/N277/F539/M763/K890/D965、A203/N277/F539/M763/K890/E1007、A203/N277/F539/M763/K890/F1038、A203/N277/F539/K890/D965/E1007、A203/N277/F539/K890/D965/F1038、A203/N277/F539/K890/E1007/F1038、A203/N277/F539/M763/K890/D965/E1007、A203/N277/F539/M763/K890/D965/F1038、A203/N277/F539/M763/K890/E1007/F1038、A203/N277/F539/K890/D965/E1007/F1038、A203/N277/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038、A203/N277/I601/M763/K890、A203/N277/I601/K890/D965、A203/N277/I601/K890/E1007、A203/N277/I601/K890/F1038、A203/N277/I601/M763/K890/D965、A203/N277/I601/M763/K890/E1007、A203/N277/I601/M763/K890/F1038、A203/N277/I601/K890/D965/E1007、A203/N277/I601/K890/D965/F1038、A203/N277/I601/K890/E1007/F1038、A203/N277/I601/M763/K890/D965/E1007、A203/N277/I601/M763/K890/D965/F1038、A203/N277/I601/M763/K890/E1007/F1038、A203/N277/I601/K890/D965/E1007/F1038、A203/N277/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038、A203/G366/F539/M763/K890、A203/G366/F539/K890/D965、A203/G366/F539/K890/E1007、A203/G366/F539/K890/F1038、A203/G366/F539/M763/K890/D965、A203/G366/F539/M763/K890/E1007、A203/G366/F539/M763/K890/F1038、A203/G366/F539/K890/D965/E1007、A203/G366/F539/K890/D965/F1038、A203/G366/F539/K890/E1007/F1038、A203/G366/F539/M763/K890/D965/E1007、A203/G366/F539/M763/K890/D965/F1038、A203/G366/F539/M763/K890/E1007/F1038、A203/G366/F539/K890/D965/E1007/F1038、A203/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038、A203/G366/I601/M763/K890、A203/G366/I601/K890/D965、A203/G366/I601/K890/E1007、A203/G366/I601/K890/F1038、A203/G366/I601/M763/K890/D965、A203/G366/I601/M763/K890/E1007、A203/G366/I601/M763/K890/F1038、A203/G366/I601/K890/D965/E1007、A203/G366/I601/K890/D965/F1038、A203/G366/I601/K890/E1007/F1038、A203/G366/I601/M763/K890/D965/E1007、A203/G366/I601/M763/K890/D965/F1038、A203/G366/I601/M763/K890/E1007/F1038、A203/G366/I601/K890/D965/E1007/F1038、A203/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038、A203/F539/I601/M763/K890、A203/F539/I601/K890/D965、A203/F539/I601/K890/E1007、A203/F539/I601/K890/F1038、A203/F539/I601/M763/K890/D965、A203/F539/I601/M763/K890/E1007、A203/F539/I601/M763/K890/F1038、A203/F539/I601/K890/D965/E1007、A203/F539/I601/K890/D965/F1038、A203/F539/I601/K890/E1007/F1038、A203/F539/I601/M763/K890/D965/E1007、A203/F539/I601/M763/K890/D965/F1038、A203/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038、A203/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038、A203/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038、N277/G366/F539/M763/K890、N277/G366/F539/K890/D965、N277/G366/F539/K890/E1007、N277/G366/F539/K890/F1038、N277/G366/F539/M763/K890/D965、N277/G366/F539/M763/K890/E1007、N277/G366/F539/M763/K890/F1038、N277/G366/F539/K890/D965/E1007、N277/G366/F539/K890/D965/F1038、N277/G366/F539/K890/E1007/F1038、N277/G366/F539/M763/K890/D965/E1007、N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038、N277/G366/F539/M763/K890/E1007/F1038、N277/G366/F539/K890/D965/E1007/F1038、N277/G366/F539/M763/K/D965/E1007/F1038、N277/G366/I601/M763/K890、N277/G366/I601/K890/D965、N277/G366/I601/K890/E1007、N277/G366/I601/K890/F1038、N277/G366/I601/M763/K890/D965、N277/G366/I601/M763/K890/E1007、N277/G366/I601/M763/K890/F1038、N277/G366/I601/K890/D965/E1007、N277/G366/I601/K890/D965/F1038、N277/G366/I601/K890/E1007/F1038、N277/G366/I601/M763/K890/D965/E1007、N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038、N277/G366/I601/M763/K890/E1007/F1038、N277/G366/I601/K890/D965/E1007/F1038、N277/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038、G366/F539/I601/M763/K890、G366/F539/I601/K890/D965、G366/F539/I601/K890/E1007、G366/F539/I601/K890/F1038、G366/F539/I601/M763/K890/D965、G366/F539/I601/M763/K890/E1007、G366/F539/I601/M763/K890/F1038、G366/F539/I601/K890/D965/E1007、G366/F539/I601/K890/D965/F1038、G366/F539/I601/K890/E1007/F1038、G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007、G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038、G366/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038、G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038、またはG366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038を変形させたSpCas9変異体であり得る。
一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/N277/G366/F539/M763/K890、A203/N277/G366/F539/K890/D965、A203/N277/G366/F539/K890/E1007、A203/N277/G366/F539/K890/F1038、A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965、A203/N277/G366/F539/M763/K890/E1007、A203/N277/G366/F539/M763/K890/F1038、A203/N277/G366/F539/K890/D965/E1007、A203/N277/G366/F539/K890/D965/F1038、A203/N277/G366/F539/K890/E1007/F1038、A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/E1007、A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038、A203/N277/G366/F539/M763/K890/E1007/F1038、A203/N277/G366/F539/K890/D965/E1007/F1038、A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038、A203/N277/G366/I601/M763/K890、A203/N277/G366/I601/K890/D965、A203/N277/G366/I601/K890/E1007、A203/N277/G366/I601/K890/F1038、A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965、A203/N277/G366/I601/M763/K890/E1007、A203/N277/G366/I601/M763/K890/F1038、A203/N277/G366/I601/K890/D965/E1007、A203/N277/G366/I601/K890/D965/F1038、A203/N277/G366/I601/K890/E1007/F1038、A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/E1007、A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038、A203/N277/G366/I601/M763/K890/E1007/F1038、A203/N277/G366/I601/K890/D965/E1007/F1038、A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038、N277/G366/F539/I601/M763/K890、N277/G366/F539/I601/K890/D965、N277/G366/F539/I601/K890/E1007、N277/G366/F539/I601/K890/F1038、N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965、N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007、N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038、N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007、N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038、N277/G366/F539/I601/K890/E1007/F1038、N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007、N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038、N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038、N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038、N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038、A203/G366/F539/I601/M763/K890、A203/G366/F539/I601/K890/D965、A203/G366/F539/I601/K890/E1007、A203/G366/F539/I601/K890/F1038、A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965、A203/G366/F539/I601/M763/K890/E1007、A203/G366/F539/I601/M763/K890/F1038、A203/G366/F539/I601/K890/D965/E1007、A203/G366/F539/I601/K890/D965/F1038、A203/G366/F539/I601/K890/E1007/F1038、A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007、A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038、A203/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038、A203/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038、A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038、A203/N277/F539/I601/M763/K890、A203/N277/F539/I601/K890/D965、A203/N277/F539/I601/K890/E1007、A203/N277/F539/I601/K890/F1038、A203/N277/F539/I601/M763/K890/D965、A203/N277/F539/I601/M763/K890/E1007、A203/N277/F539/I601/M763/K890/F1038、A203/N277/F539/I601/K890/D965/E1007、A203/N277/F539/I601/K890/D965/F1038、A203/N277/F539/I601/K890/E1007/F1038、A203/N277/F539/I601/M763/K890/D965/E1007、A203/N277/F539/I601/M763/K890/D965/F1038、A203/N277/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038、A203/N277/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038、A203/N277/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038、A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890、A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965、A203/N277/G366/F539/I601/K890/E1007、A203/N277/G366/F539/I601/K890/F1038、A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965、A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007、A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038、A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007、A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038、A203/N277/G366/F539/I601/K890/E1007/F1038、A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007、A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038、A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038、A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038、またはA203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1領域、第2領域、および第4領域内のアミノ酸配列のうち選択された3つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。この時、3つ以上のアミノ酸は、それぞれ異なる領域に存在することができる。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域および/または第1-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸、第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域および/または第2-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸、および第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸をそれぞれ変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域および/または第1-4領域のうち、N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696およびI697からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸、第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域および/または第2-4領域のうち、I7,G8,L9,D10,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,E762,M763,A764,R765,E766,N767,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,D965,F966,F970,F972,V975,U978,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987,Y988,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997,I998,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038およびY1039からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸、および第4-1領域のうち、T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸をそれぞれ変形させたSpCas9変異体であり得る。
一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/M763/T1102、A203/D965/T1102、A203/E1007/T1102、A203/F1038/T1102、A203/M763/D965/T1102、A203/M763/E1007/T1102、A203/M763/F1038/T1102、A203/D965/E1007/T1102、A203/D965/F1038/T1102、A203/E1007/F1038/T1102、A203/M763/D965/E1007/T1102、A203/M763/D965/F1038/T1102、A203/M763/E1007/F1038/T1102、A203/D965/E1007/F1038/T1102、A203/M763/D965/E1007/F1038/T1102、N277/M763/T1102、N277/D965/T1102、N277/E1007/T1102、N277/F1038/T1102、N277/M763/D965/T1102、N277/M763/E1007/T1102、N277/M763/F1038/T1102、N277/D965/E1007/T1102、N277/D965/F1038/T1102、N277/E1007/F1038/T1102、N277/M763/D965/E1007/T1102、N277/M763/D965/F1038/T1102、N277/M763/E1007/F1038/T1102、N277/D965/E1007/F1038/T1102、N277/M763/D965/E1007/F1038/T1102、G366/M763/T1102、G366/D965/T1102、G366/E1007/T1102、G366/F1038/T1102、G366/M763/D965/T1102、G366/M763/E1007/T1102、G366/M763/F1038/T1102、G366/D965/E1007/T1102、G366/D965/F1038/T1102、G366/E1007/F1038/T1102、G366/M763/D965/E1007/T1102、G366/M763/D965/F1038/T1102、G366/M763/E1007/F1038/T1102、G366/D965/E1007/F1038/T1102、G366/M763/D965/E1007/F1038/T1102、F539/M763/T1102、F539/D965/T1102、F539/E1007/T1102、F539/F1038/T1102、F539/M763/D965/T1102、F539/M763/E1007/T1102、F539/M763/F1038/T1102、F539/D965/E1007/T1102、F539/D965/F1038/T1102、F539/E1007/F1038/T1102、F539/M763/D965/E1007/T1102、F539/M763/D965/F1038/T1102、F539/M763/E1007/F1038/T1102、F539/D965/E1007/F1038/T1102、F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102、I601/M763/T1102、I601/D965/T1102、I601/E1007/T1102、I601/F1038/T1102、I601/M763/D965/T1102、I601/M763/E1007/T1102、I601/M763/F1038/T1102、I601/D965/E1007/T1102、I601/D965/F1038/T1102、I601/E1007/F1038/T1102、I601/M763/D965/E1007/T1102、I601/M763/D965/F1038/T1102、I601/M763/E1007/F1038/T1102、I601/D965/E1007/F1038/T1102、I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102、A203/M763/D1127、A203/D965/D1127、A203/E1007/D1127、A203/F1038/D1127、A203/M763/D965/D1127、A203/M763/E1007/D1127、A203/M763/F1038/D1127、A203/D965/E1007/D1127、A203/D965/F1038/D1127、A203/E1007/F1038/D1127、A203/M763/D965/E1007/D1127、A203/M763/D965/F1038/D1127、A203/M763/E1007/F1038/D1127、A203/D965/E1007/F1038/D1127、A203/M763/D965/E1007/F1038/D1127、N277/M763/D1127、N277/D965/D1127、N277/E1007/D1127、N277/F1038/D1127、N277/M763/D965/D1127、N277/M763/E1007/D1127、N277/M763/F1038/D1127、N277/D965/E1007/D1127、N277/D965/F1038/D1127、N277/E1007/F1038/D1127、N277/M763/D965/E1007/D1127、N277/M763/D965/F1038/D1127、N277/M763/E1007/F1038/D1127、N277/D965/E1007/F1038/D1127、N277/M763/D965/E1007/F1038/D1127、G366/M763/D1127、G366/D965/D1127、G366/E1007/D1127、G366/F1038/D1127、G366/M763/D965/D1127、G366/M763/E1007/D1127、G366/M763/F1038/D1127、G366/D965/E1007/D1127、G366/D965/F1038/D1127、G366/E1007/F1038/D1127、G366/M763/D965/E1007/D1127、G366/M763/D965/F1038/D1127、G366/M763/E1007/F1038/D1127、G366/D965/E1007/F1038/D1127、G366/M763/D965/E1007/F1038/D1127、F539/M763/D1127、F539/D965/D1127、F539/E1007/D1127、F539/F1038/D1127、F539/M763/D965/D1127、F539/M763/E1007/D1127、F539/M763/F1038/D1127、F539/D965/E1007/D1127、F539/D965/F1038/D1127、F539/E1007/F1038/D1127、F539/M763/D965/E1007/D1127、F539/M763/D965/F1038/D1127、F539/M763/E1007/F1038/D1127、F539/D965/E1007/F1038/D1127、F539/M763/D965/E1007/F1038/D1127、I601/M763/D1127、I601/D965/D1127、I601/E1007/D1127、I601/F1038/D1127、I601/M763/D965/D1127、I601/M763/E1007/D1127、I601/M763/F1038/D1127、I601/D965/E1007/D1127、I601/D965/F1038/D1127、I601/E1007/F1038/D1127、I601/M763/D965/E1007/D1127、I601/M763/D965/F1038/D1127、I601/M763/E1007/F1038/D1127、I601/D965/E1007/F1038/D1127、またはI601/M763/D965/E1007/F1038/D1127を変形させたSpCas9変異体であり得る。
他の一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/M763/T1102/D1127、A203/D965/T1102/D1127、A203/E1007/T1102/D1127、A203/F1038/T1102/D1127、A203/M763/D965/T1102/D1127、A203/M763/E1007/T1102/D1127、A203/M763/F1038/T1102/D1127、A203/D965/E1007/T1102/D1127、A203/D965/F1038/T1102/D1127、A203/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/M763/D965/E1007/T1102/D1127、A203/M763/D965/F1038/T1102/D1127、A203/M763/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/M763/T1102/D1127、N277/D965/T1102/D1127、N277/E1007/T1102/D1127、N277/F1038/T1102/D1127、N277/M763/D965/T1102/D1127、N277/M763/E1007/T1102/D1127、N277/M763/F1038/T1102/D1127、N277/D965/E1007/T1102/D1127、N277/D965/F1038/T1102/D1127、N277/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/M763/D965/E1007/T1102/D1127、N277/M763/D965/F1038/T1102/D1127、N277/M763/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、G366/M763/T1102/D1127、G366/D965/T1102/D1127、G366/E1007/T1102/D1127、G366/F1038/T1102/D1127、G366/M763/D965/T1102/D1127、G366/M763/E1007/T1102/D1127、G366/M763/F1038/T1102/D1127、G366/D965/E1007/T1102/D1127、G366/D965/F1038/T1102/D1127、G366/E1007/F1038/T1102/D1127、G366/M763/D965/E1007/T1102/D1127、G366/M763/D965/F1038/T1102/D1127、G366/M763/E1007/F1038/T1102/D1127、G366/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、G366/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、F539/M763/T1102/D1127、F539/D965/T1102/D1127、F539/E1007/T1102/D1127、F539/F1038/T1102/D1127、F539/M763/D965/T1102/D1127、F539/M763/E1007/T1102/D1127、F539/M763/F1038/T1102/D1127、F539/D965/E1007/T1102/D1127、F539/D965/F1038/T1102/D1127、F539/E1007/F1038/T1102/D1127、F539/M763/D965/E1007/T1102/D1127、F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127、F539/M763/E1007/F1038/T1102/D1127、F539/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、I601/M763/T1102/D1127、I601/D965/T1102/D1127、I601/E1007/T1102/D1127、I601/F1038/T1102/D1127、I601/M763/D965/T1102/D1127、I601/M763/E1007/T1102/D1127、I601/M763/F1038/T1102/D1127、I601/D965/E1007/T1102/D1127、I601/D965/F1038/T1102/D1127、I601/E1007/F1038/T1102/D1127、I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127、I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127、I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127、I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、またはI601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127を変形させたSpCas9変異体であり得る。
一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/N277/M763/T1102、A203/N277/D965/T1102、A203/N277/E1007/T1102、A203/N277/F1038/T1102、A203/N277/M763/D965/T1102、A203/N277/M763/E1007/T1102、A203/N277/M763/F1038/T1102、A203/N277/D965/E1007/T1102、A203/N277/D965/F1038/T1102、A203/N277/E1007/F1038/T1102、A203/N277/M763/D965/E1007/T1102、A203/N277/M763/D965/F1038/T1102、A203/N277/M763/E1007/F1038/T1102、A203/N277/D965/E1007/F1038/T1102、A203/N277/M763/D965/E1007/F1038/T1102、A203/G366/M763/T1102、A203/G366/D965/T1102、A203/G366/E1007/T1102、A203/G366/F1038/T1102、A203/G366/M763/D965/T1102、A203/G366/M763/E1007/T1102、A203/G366/M763/F1038/T1102、A203/G366/D965/E1007/T1102、A203/G366/D965/F1038/T1102、A203/G366/E1007/F1038/T1102、A203/G366/M763/D965/E1007/T1102、A203/G366/M763/D965/F1038/T1102、A203/G366/M763/E1007/F1038/T1102、A203/G366/D965/E1007/F1038/T1102、A203/G366/M763/D965/E1007/F1038/T1102、A203/F539/M763/T1102、A203/F539/D965/T1102、A203/F539/E1007/T1102、A203/F539/F1038/T1102、A203/F539/M763/D965/T1102、A203/F539/M763/E1007/T1102、A203/F539/M763/F1038/T1102、A203/F539/D965/E1007/T1102、A203/F539/D965/F1038/T1102、A203/F539/E1007/F1038/T1102、A203/F539/M763/D965/E1007/T1102、A203/F539/M763/D965/F1038/T1102、A203/F539/M763/E1007/F1038/T1102、A203/F539/D965/E1007/F1038/T1102、A203/F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102、A203/I601/M763/T1102、A203/I601/D965/T1102、A203/I601/E1007/T1102、A203/I601/F1038/T1102、A203/I601/M763/D965/T1102、A203/I601/M763/E1007/T1102、A203/I601/M763/F1038/T1102、A203/I601/D965/E1007/T1102、A203/I601/D965/F1038/T1102、A203/I601/E1007/F1038/T1102、A203/I601/M763/D965/E1007/T1102、A203/I601/M763/D965/F1038/T1102、A203/I601/M763/E1007/F1038/T1102、A203/I601/D965/E1007/F1038/T1102、A203/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102、N277/G366/M763/T1102、N277/G366/D965/T1102、N277/G366/E1007/T1102、N277/G366/F1038/T1102、N277/G366/M763/D965/T1102、N277/G366/M763/E1007/T1102、N277/G366/M763/F1038/T1102、N277/G366/D965/E1007/T1102、N277/G366/D965/F1038/T1102、N277/G366/E1007/F1038/T1102、N277/G366/M763/D965/E1007/T1102、N277/G366/M763/D965/F1038/T1102、N277/G366/M763/E1007/F1038/T1102、N277/G366/D965/E1007/F1038/T1102、N277/G366/M763/D965/E1007/F1038/T1102、N277/F539/M763/T1102、N277/F539/D965/T1102、N277/F539/E1007/T1102、N277/F539/F1038/T1102、N277/F539/M763/D965/T1102、N277/F539/M763/E1007/T1102、N277/F539/M763/F1038/T1102、N277/F539/D965/E1007/T1102、N277/F539/D965/F1038/T1102、N277/F539/E1007/F1038/T1102、N277/F539/M763/D965/E1007/T1102、N277/F539/M763/D965/F1038/T1102、N277/F539/M763/E1007/F1038/T1102、N277/F539/D965/E1007/F1038/T1102、N277/F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102、N277/I601/M763/T1102、N277/I601/D965/T1102、N277/I601/E1007/T1102、N277/I601/F1038/T1102、N277/I601/M763/D965/T1102、N277/I601/M763/E1007/T1102、N277/I601/M763/F1038/T1102、N277/I601/D965/E1007/T1102、N277/I601/D965/F1038/T1102、N277/I601/E1007/F1038/T1102、N277/I601/M763/D965/E1007/T1102、N277/I601/M763/D965/F1038/T1102、N277/I601/M763/E1007/F1038/T1102、N277/I601/D965/E1007/F1038/T1102、N277/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102、G366/F539/M763/T1102、G366/F539/D965/T1102、G366/F539/E1007/T1102、G366/F539/F1038/T1102、G366/F539/M763/D965/T1102、G366/F539/M763/E1007/T1102、G366/F539/M763/F1038/T1102、G366/F539/D965/E1007/T1102、G366/F539/D965/F1038/T1102、G366/F539/E1007/F1038/T1102、G366/F539/M763/D965/E1007/T1102、G366/F539/M763/D965/F1038/T1102、G366/F539/M763/E1007/F1038/T1102、G366/F539/D965/E1007/F1038/T1102、G366/F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102、G366/I601/M763/T1102、G366/I601/D965/T1102、G366/I601/E1007/T1102、G366/I601/F1038/T1102、G366/I601/M/D965/T1102、G366/I601/M763/E1007/T1102、G366/I601/M763/F1038/T1102、G366/I601/D965/E1007/T1102、G366/I601/D965/F1038/T1102、G366/I601/E1007/F1038/T1102、G366/I601/M763/D965/E1007/T1102、G366/I601/M763/D965/F1038/T1102、G366/I601/M763/E1007/F1038/T1102、G366/I601/D965/E1007/F1038/T1102、G366/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102、F539/I601/M763/T1102、F539/I601/D965/T1102、F539/I601/E1007/T1102、F539/I601/F1038/T1102、F539/I601/M763/D965/T1102、F539/I601/M763/E1007/T1102、F539/I601/M763/F1038/T1102、F539/I601/D965/E1007/T1102、F539/I601/D965/F1038/T1102、F539/I601/E1007/F1038/T1102、F539/I601/M763/D965/E1007/T1102、F539/I601/M763/D965/F1038/T1102、F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102、F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102、F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102、A203/N277/M763/D1127、A203/N277/D965/D1127、A203/N277/E1007/D1127、A203/N277/F1038/D1127、A203/N277/M763/D965/D1127、A203/N277/M763/E1007/D1127、A203/N277/M763/F1038/D1127、A203/N277/D965/E1007/D1127、A203/N277/D965/F1038/D1127、A203/N277/E1007/F1038/D1127、A203/N277/M763/D965/E1007/D1127、A203/N277/M763/D965/F1038/D1127、A203/N277/M763/E1007/F1038/D1127、A203/N277/D965/E1007/F1038/D1127、A203/N277/M763/D965/E1007/F1038/D1127、A203/G366/M763/D1127、A203/G366/D965/D1127、A203/G366/E1007/D1127、A203/G366/F1038/D1127、A203/G366/M763/D965/D1127、A203/G366/M763/E1007/D1127、A203/G366/M763/F1038/D1127、A203/G366/D965/E1007/D1127、A203/G366/D965/F1038/D1127、A203/G366/E1007/F1038/D1127、A203/G366/M763/D965/E1007/D1127、A203/G366/M763/D965/F1038/D1127、A203/G366/M763/E1007/F1038/D1127、A203/G366/D965/E1007/F1038/D1127、A203/G366/M763/D965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他の一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/N277/M763/T1102/D1127、A203/N277/D965/T1102/D1127、A203/N277/E1007/T1102/D1127、A203/N277/F1038/T1102/D1127、A203/N277/M763/D965/T1102/D1127、A203/N277/M763/E1007/T1102/D1127、A203/N277/M763/F1038/T1102/D1127、A203/N277/D965/E1007/T1102/D1127、A203/N277/D965/F1038/T1102/D1127、A203/N277/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/M763/D965/E1007/T1102/D1127、A203/N277/M763/D965/F1038/T1102/D1127、A203/N277/M763/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/G366/M763/T1102/D1127、A203/G366/D965/T1102/D1127、A203/G366/E1007/T1102/D1127、A203/G366/F1038/T1102/D1127、A203/G366/M763/D965/T1102/D1127、A203/G366/M763/E1007/T1102/D1127、A203/G366/M763/F1038/T1102/D1127、A203/G366/D965/E1007/T1102/D1127、A203/G366/D965/F1038/T1102/D1127、A203/G366/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/G366/M763/D965/E1007/T1102/D1127、A203/G366/M763/D965/F1038/T1102/D1127、A203/G366/M763/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/G366/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/G366/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/F539/M763/T1102/D1127、A203/F539/D965/T1102/D1127、A203/F539/E1007/T1102/D1127、A203/F539/F1038/T1102/D1127、A203/F539/M763/D965/T1102/D1127、A203/F539/M763/E1007/T1102/D1127、A203/F539/M763/F1038/T1102/D1127、A203/F539/D965/E1007/T1102/D1127、A203/F539/D965/F1038/T1102/D1127、A203/F539/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/F539/M763/D965/E1007/T1102/D1127、A203/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127、A203/F539/M763/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/F539/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/I601/M763/T1102/D1127、A203/I601/D965/T1102/D1127、A203/I601/E1007/T1102/D1127、A203/I601/F1038/T1102/D1127、A203/I601/M763/D965/T1102/D1127、A203/I601/M763/E1007/T1102/D1127、A203/I601/M763/F1038/T1102/D1127、A203/I601/D965/E1007/T1102/D1127、A203/I601/D965/F1038/T1102/D1127、A203/I601/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127、A203/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127、A203/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/G366/M763/T1102/D1127、N277/G366/D965/T1102/D1127、N277/G366/E1007/T1102/D1127、N277/G366/F1038/T1102/D1127、N277/G366/M763/D965/T1102/D1127、N277/G366/M763/E1007/T1102/D1127、N277/G366/M763/F1038/T1102/D1127、N277/G366/D965/E1007/T1102/D1127、N277/G366/D965/F1038/T1102/D1127、N277/G366/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/G366/M763/D965/E1007/T1102/D1127、N277/G366/M763/D965/F1038/T1102/D1127、N277/G366/M763/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/G366/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/G366/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/F539/M763/T1102/D1127、N277/F539/D965/T1102/D1127、N277/F539/E1007/T1102/D1127、N277/F539/F1038/T1102/D1127、N277/F539/M763/D965/T1102/D1127、N277/F539/M763/E1007/T1102/D1127、N277/F539/M763/F1038/T1102/D1127、N277/F539/D965/E1007/T1102/D1127、N277/F539/D965/F1038/T1102/D1127、N277/F539/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/F539/M763/D965/E1007/T1102/D1127、N277/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127、N277/F539/M763/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/F539/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/I601/M763/T1102/D1127、N277/I601/D965/T1102/D1127、N277/I601/E1007/T1102/D1127、N277/I601/F1038/T1102/D1127、N277/I601/M763/D965/T1102/D1127、N277/I601/M763/E1007/T1102/D1127、N277/I601/M763/F1038/T1102/D1127、N277/I601/D965/E1007/T1102/D1127、N277/I601/D965/F1038/T1102/D1127、N277/I601/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127、N277/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127、N277/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/I601/M763/D965/E/F1038/T1102/D1127、G366/F539/M763/T1102/D1127、G366/F539/D965/T1102/D1127、G366/F539/E1007/T1102/D1127、G366/F539/F1038/T1102/D1127、G366/F539/M763/D965/T1102/D1127、G366/F539/M763/E1007/T1102/D1127、G366/F539/M763/F1038/T1102/D1127、G366/F539/D965/E1007/T1102/D1127、G366/F539/D965/F1038/T1102/D1127、G366/F539/E1007/F1038/T1102/D1127、G366/F539/M763/D965/E1007/T1102/D1127、G366/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127、G366/F539/M763/E1007/F1038/T1102/D1127、G366/F539/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、G366/F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、G366/I601/M763/T1102/D1127、G366/I601/D965/T1102/D1127、G366/I601/E1007/T1102/D1127、G366/I601/F1038/T1102/D1127、G366/I601/M763/D965/T1102/D1127、G366/I601/M763/E1007/T1102/D1127、G366/I601/M763/F1038/T1102/D1127、G366/I601/D965/E1007/T1102/D1127、G366/I601/D965/F1038/T1102/D1127、G366/I601/E1007/F1038/T1102/D1127、G366/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127、G366/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127、G366/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127、G366/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、G366/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、F539/I601/M763/T1102/D1127、F539/I601/D965/T1102/D1127、F539/I601/E1007/T1102/D1127、F539/I601/F1038/T1102/D1127、F539/I601/M763/D965/T1102/D1127、F539/I601/M763/E1007/T1102/D1127、F539/I601/M763/F1038/T1102/D1127、F539/I601/D965/E1007/T1102/D1127、F539/I601/D965/F1038/T1102/D1127、F539/I601/E1007/F1038/T1102/D1127、F539/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127、F539/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127、F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127、F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、またはF539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127を変形させたSpCas9変異体であり得る。
一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/N277/G366/M763/T1102、A203/N277/G366/D965/T1102、A203/N277/G366/E1007/T1102、A203/N277/G366/F1038/T1102、A203/N277/G366/M763/D965/T1102、A203/N277/G366/M763/E1007/T1102、A203/N277/G366/M763/F1038/T1102、A203/N277/G366/D965/E1007/T1102、A203/N277/G366/D965/F1038/T1102、A203/N277/G366/E1007/F1038/T1102、A203/N277/G366/M763/D965/E1007/T1102、A203/N277/G366/M763/D965/F1038/T1102、A203/N277/G366/M763/E1007/F1038/T1102、A203/N277/G366/D965/E1007/F1038/T1102、A203/N277/G366/M763/D965/E1007/F1038/T1102、A203/N277/F539/M763/T1102、A203/N277/F539/D965/T1102、A203/N277/F539/E1007/T1102、A203/N277/F539/F1038/T1102、A203/N277/F539/M763/D965/T1102、A203/N277/F539/M763/E1007/T1102、A203/N277/F539/M763/F1038/T1102、A203/N277/F539/D965/E1007/T1102、A203/N277/F539/D965/F1038/T1102、A203/N277/F539/E1007/F1038/T1102、A203/N277/F539/M763/D965/E1007/T1102、A203/N277/F539/M763/D965/F1038/T1102、A203/N277/F539/M763/E1007/F1038/T1102、A203/N277/F539/D965/E1007/F1038/T1102、A203/N277/F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102、A203/N277/I601/M763/T1102、A203/N277/I601/D965/T1102、A203/N277/I601/E1007/T1102、A203/N277/I601/F1038/T1102、A203/N277/I601/M763/D965/T1102、A203/N277/I601/M763/E1007/T1102、A203/N277/I601/M763/F1038/T1102、A203/N277/I601/D965/E1007/T1102、A203/N277/I601/D965/F1038/T1102、A203/N277/I601/E1007/F1038/T1102、A203/N277/I601/M763/D965/E1007/T1102、A203/N277/I601/M763/D965/F1038/T1102、A203/N277/I601/M763/E1007/F1038/T1102、A203/N277/I601/D965/E1007/F1038/T1102、A203/N277/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102、A203/G366/F539/M763/T1102、A203/G366/F539/D965/T1102、A203/G366/F539/E1007/T1102、A203/G366/F539/F1038/T1102、A203/G366/F539/M763/D965/T1102、A203/G366/F539/M763/E1007/T1102、A203/G366/F539/M763/F1038/T1102、A203/G366/F539/D965/E1007/T1102、A203/G366/F539/D965/F1038/T1102、A203/G366/F539/E1007/F1038/T1102、A203/G366/F539/M763/D965/E1007/T1102、A203/G366/F539/M763/D965/F1038/T1102、A203/G366/F539/M763/E1007/F1038/T1102、A203/G366/F539/D965/E1007/F1038/T1102、A203/G366/F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102、A203/G366/I601/M763/T1102、A203/G366/I601/D965/T1102、A203/G366/I601/E1007/T1102、A203/G366/I601/F1038/T1102、A203/G366/I601/M763/D965/T1102、A203/G366/I601/M763/E1007/T1102、A203/G366/I601/M763/F1038/T1102、A203/G366/I601/D965/E1007/T1102、A203/G366/I601/D965/F1038/T1102、A203/G366/I601/E1007/F1038/T1102、A203/G366/I601/M763/D965/E1007/T1102、A203/G366/I601/M763/D965/F1038/T1102、A203/G366/I601/M763/E1007/F1038/T1102、A203/G366/I601/D965/E1007/F1038/T1102、A203/G366/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102、A203/F539/I601/M763/T1102、A203/F539/I601/D965/T1102、A203/F539/I601/E1007/T1102、A203/F539/I601/F1038/T1102、A203/F539/I601/M763/D965/T1102、A203/F539/I601/M763/E1007/T1102、A203/F539/I601/M763/F1038/T1102、A203/F539/I601/D965/E1007/T1102、A203/F539/I601/D965/F1038/T1102、A203/F539/I601/E1007/F1038/T1102、A203/F539/I601/M763/D965/E1007/T1102、A203/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102、A203/F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102、A203/F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102、A203/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102、N277/G366/F539/M763/T1102、N277/G366/F539/D965/T1102、N277/G366/F539/E1007/T1102、N277/G366/F539/F1038/T1102、N277/G366/F539/M763/D965/T1102、N277/G366/F539/M763/E1007/T1102、N277/G366/F539/M763/F1038/T1102、N277/G366/F539/D965/E1007/T1102、N277/G366/F539/D965/F1038/T1102、N277/G366/F539/E1007/F1038/T1102、N277/G366/F539/M763/D965/E1007/T1102、N277/G366/F539/M763/D965/F1038/T1102、N277/G366/F539/M763/E1007/F1038/T1102、N277/G366/F539/D965/E1007/F1038/T1102、N277/G366/F539/M763/D965/1007/F1038/T1102、N277/G366/I601/M763/T1102、N277/G366/I601/D965/T1102、N277/G366/I601/E1007/T1102、N277/G366/I601/F1038/T1102、N277/G366/I601/M763/D965/T1102、N277/G366/I601/M763/E1007/T1102、N277/G366/I601/M763/F1038/T1102、N277/G366/I601/D965/E1007/T1102、N277/G366/I601/D965/F1038/T1102、N277/G366/I601/E1007/F1038/T1102、N277/G366/I601/M763/D965/E1007/T1102、N277/G366/I601/M763/D965/F1038/T1102、N277/G366/I601/M763/E1007/F1038/T1102、N277/G366/I601/D965/E1007/F1038/T1102、N277/G366/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102、G366/F539/I601/M763/T1102、G366/F539/I601/D965/T1102、G366/F539/I601/E1007/T1102、G366/F539/I601/F1038/T1102、G366/F539/I601/M763/D965/T1102、G366/F539/I601/M763/E1007/T1102、G366/F539/I601/M763/F1038/T1102、G366/F539/I601/D965/E1007/T1102、G366/F539/I601/D965/F1038/T1102、G366/F539/I601/E1007/F1038/T1102、G366/F539/I601/M763/D965/E1007/T1102、G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102、G366/F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102、G366/F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102、G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102、A203/N277/G366/M763/D1127、A203/N277/G366/D965/D1127、A203/N277/G366/E1007/D1127、A203/N277/G366/F1038/D1127、A203/N277/G366/M763/D965/D1127、A203/N277/G366/M763/E1007/D1127、A203/N277/G366/M763/F1038/D1127、A203/N277/G366/D965/E1007/D1127、A203/N277/G366/D965/F1038/D1127、A203/N277/G366/E1007/F1038/D1127、A203/N277/G366/M763/D965/E1007/D1127、A203/N277/G366/M763/D965/F1038/D1127、A203/N277/G366/M763/E1007/F1038/D1127、A203/N277/G366/D965/E1007/F1038/D1127、A203/N277/G366/M763/D965/E1007/F1038/D1127、A203/N277/F539/M763/D1127、A203/N277/F539/D965/D1127、A203/N277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他の一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/N277/G366/M763/T1102/D1127、A203/N277/G366/D965/T1102/D1127、A203/N277/G366/E1007/T1102/D1127、A203/N277/G366/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/M763/D965/T1102/D1127、A203/N277/G366/M763/E1007/T1102/D1127、A203/N277/G366/M763/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/D965/E1007/T1102/D1127、A203/N277/G366/D965/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/M763/D965/E1007/T1102/D1127、A203/N277/G366/M763/D965/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/M763/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/F539/M763/T1102/D1127、A203/N277/F539/D965/T1102/D1127、A203/N277/F539/E1007/T1102/D1127、A203/N277/F539/F1038/T1102/D1127、A203/N277/F539/M763/D965/T1102/D1127、A203/N277/F539/M763/E1007/T1102/D1127、A203/N277/F539/M763/F1038/T1102/D1127、A203/N277/F539/D965/E1007/T1102/D1127、A203/N277/F539/D965/F1038/T1102/D1127、A203/N277/F539/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/F539/M763/D965/E1007/T1102/D1127、A203/N277/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127、A203/N277/F539/M763/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/F539/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/I601/M763/T1102/D1127、A203/N277/I601/D965/T1102/D1127、A203/N277/I601/E1007/T1102/D1127、A203/N277/I601/F1038/T1102/D1127、A203/N277/I601/M763/D965/T1102/D1127、A203/N277/I601/M763/E1007/T1102/D1127、A203/N277/I601/M763/F1038/T1102/D1127、A203/N277/I601/D965/E1007/T1102/D1127、A203/N277/I601/D965/F1038/T1102/D1127、A203/N277/I601/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127、A203/N277/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127、A203/N277/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/G366/F539/M763/T1102/D1127、A203/G366/F539/D965/T1102/D1127、A203/G366/F539/E1007/T1102/D1127、A203/G366/F539/F1038/T1102/D1127、A203/G366/F539/M763/D965/T1102/D1127、A203/G366/F539/M763/E1007/T1102/D1127、A203/G366/F539/M763/F1038/T1102/D1127、A203/G366/F539/D965/E1007/T1102/D1127、A203/G366/F539/D965/F1038/T1102/D1127、A203/G366/F539/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/G366/F539/M763/D965/E1007/T1102/D1127、A203/G366/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127、A203/G366/F539/M763/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/G366/F539/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/G366/F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/G366/I601/M763/T1102/D1127、A203/G366/I601/D965/T1102/D1127、A203/G366/I601/E1007/T1102/D1127、A203/G366/I601/F1038/T1102/D1127、A203/G366/I601/M763/D965/T1102/D1127、A203/G366/I601/M763/E1007/T1102/D1127、A203/G366/I601/M763/F1038/T1102/D1127、A203/G366/I601/D965/E1007/T1102/D1127、A203/G366/I601/D965/F1038/T1102/D1127、A203/G366/I601/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/G366/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127、A203/G366/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127、A203/G366/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/G366/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/G366/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/F539/I601/M763/T1102/D1127、A203/F539/I601/D965/T1102/D1127、A203/F539/I601/E1007/T1102/D1127、A203/F539/I601/F1038/T1102/D1127、A203/F539/I601/M763/D965/T1102/D1127、A203/F539/I601/M763/E1007/T1102/D1127、A203/F539/I601/M763/F1038/T1102/D1127、A203/F539/I601/D965/E1007/T1102/D1127、A203/F539/I601/D965/F1038/T1102/D1127、A203/F539/I601/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/F539/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127、A203/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127、A203/F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/G366/F539/763/T1102/D1127、N277/G366/F539/D965/T1102/D1127、N277/G366/F539/E1007/T1102/D1127、N277/G366/F539/F1038/T1102/D1127、N277/G366/F539/M763/D965/T1102/D1127、N277/G366/F539/M763/E1007/T1102/D1127、N277/G366/F539/M763/F1038/T1102/D1127、N277/G366/F539/D965/E1007/T1102/D1127、N277/G366/F539/D965/F1038/T1102/D1127、N277/G366/F539/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/G366/F539/M763/D965/E1007/T1102/D1127、N277/G366/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127、N277/G366/F539/M763/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/G366/F539/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/G366/F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/G366/I601/M763/T1102/D1127、N277/G366/I601/D965/T1102/D1127、N277/G366/I601/E1007/T1102/D1127、N277/G366/I601/F1038/T1102/D1127、N277/G366/I601/M763/D965/T1102/D1127、N277/G366/I601/M763/E1007/T1102/D1127、N277/G366/I601/M763/F1038/T1102/D1127、N277/G366/I601/D965/E1007/T1102/D1127、N277/G366/I601/D965/F1038/T1102/D1127、N277/G366/I601/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/G366/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127、N277/G366/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127、N277/G366/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/G366/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/G366/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、G366/F539/I601/M763/T1102/D1127、G366/F539/I601/D965/T1102/D1127、G366/F539/I601/E1007/T1102/D1127、G366/F539/I601/F1038/T1102/D1127、G366/F539/I601/M763/D965/T1102/D1127、G366/F539/I601/M763/E1007/T1102/D1127、G366/F539/I601/M763/F1038/T1102/D1127、G366/F539/I601/D965/E1007/T1102/D1127、G366/F539/I601/D965/F1038/T1102/D1127、G366/F539/I601/E1007/F1038/T1102/D1127、G366/F539/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127、G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102/D11
27、G366/F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127、G366/F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、またはG366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127を変形させたSpCas9変異体であり得る。
一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/N277/G366/F539/M763/T1102、A203/N277/G366/F539/D965/T1102、A203/N277/G366/F539/E1007/T1102、A203/N277/G366/F539/F1038/T1102、A203/N277/G366/F539/M763/D965/T1102、A203/N277/G366/F539/M763/E1007/T1102、A203/N277/G366/F539/M763/F1038/T1102、A203/N277/G366/F539/D965/E1007/T1102、A203/N277/G366/F539/D965/F1038/T1102、A203/N277/G366/F539/E1007/F1038/T1102、A203/N277/G366/F539/M763/D965/E1007/T1102、A203/N277/G366/F539/M763/D965/F1038/T1102、A203/N277/G366/F539/M763/E1007/F1038/T1102、A203/N277/G366/F539/D965/E1007/F1038/T1102、A203/N277/G366/F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102、A203/N277/G366/I601/M763/T1102、A203/N277/G366/I601/D965/T1102、A203/N277/G366/I601/E1007/T1102、A203/N277/G366/I601/F1038/T1102、A203/N277/G366/I601/M763/D965/T1102、A203/N277/G366/I601/M763/E1007/T1102、A203/N277/G366/I601/M763/F1038/T1102、A203/N277/G366/I601/D965/E1007/T1102、A203/N277/G366/I601/D965/F1038/T1102、A203/N277/G366/I601/E1007/F1038/T1102、A203/N277/G366/I601/M763/D965/E1007/T1102、A203/N277/G366/I601/M763/D965/F1038/T1102、A203/N277/G366/I601/M763/E1007/F1038/T1102、A203/N277/G366/I601/D965/E1007/F1038/T1102、A203/N277/G366/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102、N277/G366/F539/I601/M763/T1102、N277/G366/F539/I601/D965/T1102、N277/G366/F539/I601/E1007/T1102、N277/G366/F539/I601/F1038/T1102、N277/G366/F539/I601/M763/D965/T1102、N277/G366/F539/I601/M763/E1007/T1102、N277/G366/F539/I601/M763/F1038/T1102、N277/G366/F539/I601/D965/E1007/T1102、N277/G366/F539/I601/D965/F1038/T1102、N277/G366/F539/I601/E1007/F1038/T1102、N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/T1102、N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102、N277/G366/F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102、N277/G366/F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102、N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102、A203/G366/F539/I601/M763/T1102、A203/G366/F539/I601/D965/T1102、A203/G366/F539/I601/E1007/T1102、A203/G366/F539/I601/F1038/T1102、A203/G366/F539/I601/M763/D965/T1102、A203/G366/F539/I601/M763/E1007/T1102、A203/G366/F539/I601/M763/F1038/T1102、A203/G366/F539/I601/D965/E1007/T1102、A203/G366/F539/I601/D965/F1038/T1102、A203/G366/F539/I601/E1007/F1038/T1102、A203/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/T1102、A203/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102、A203/G366/F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102、A203/G366/F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102、A203/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102、A203/N277/F539/I601/M763/T1102、A203/N277/F539/I601/D965/T1102、A203/N277/F539/I601/E1007/T1102、A203/N277/F539/I601/F1038/T1102、A203/N277/F539/I601/M763/D965/T1102、A203/N277/F539/I601/M763/E1007/T1102、A203/N277/F539/I601/M763/F1038/T1102、A203/N277/F539/I601/D965/E1007/T1102、A203/N277/F539/I601/D965/F1038/T1102、A203/N277/F539/I601/E1007/F1038/T1102、A203/N277/F539/I601/M763/D965/E1007/T1102、A203/N277/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102、A203/N277/F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102、A203/N277/F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102、A203/N277/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102、A203/N277/G366/F539/I601/M763/T1102、A203/N277/G366/F539/I601/D965/T1102、A203/N277/G366/F539/I601/E1007/T1102、A203/N277/G366/F539/I601/F1038/T1102、A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/T1102、A203/N277/G366/F539/I601/M763/E1007/T1102、A203/N277/G366/F539/I601/M763/F1038/T1102、A203/N277/G366/F539/I601/D965/E1007/T1102、A203/N277/G366/F539/I601/D965/F1038/T1102、A203/N277/G366/F539/I601/E1007/F1038/T1102、A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/T1102、A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102、A203/N277/G366/F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102、A203/N277/G366/F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102、またはA203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102を変形させたSpCas9変異体であり得る。
他の一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/N277/G366/F539/M763/D1127、A203/N277/G366/F539/D965/D1127、A203/N277/G366/F539/E1007/D1127、A203/N277/G366/F539/F1038/D1127、A203/N277/G366/F539/M763/D965/D1127、A203/N277/G366/F539/M763/E1007/D1127、A203/N277/G366/F539/M763/F1038/D1127、A203/N277/G366/F539/D965/E1007/D1127、A203/N277/G366/F539/D965/F1038/D1127、A203/N277/G366/F539/E1007/F1038/D1127、A203/N277/G366/F539/M763/D965/E1007/D1127、A203/N277/G366/F539/M763/D965/F1038/D1127、A203/N277/G366/F539/M763/E1007/F1038/D1127、A203/N277/G366/F539/D965/E1007/F1038/D1127、A203/N277/G366/F539/M763/D965/E1007/F1038/D1127、A203/N277/G366/I601/M763/D1127、A203/N277/G366/I601/D965/D1127、A203/N277/G366/I601/E1007/D1127、A203/N277/G366/I601/F1038/D1127、A203/N277/G366/I601/M763/D965/D1127、A203/N277/G366/I601/M763/E1007/D1127、A203/N277/G366/I601/M763/F1038/D1127、A203/N277/G366/I601/D965/E1007/D1127、A203/N277/G366/I601/D965/F1038/D1127、A203/N277/G366/I601/E1007/F1038/D1127、A203/N277/G366/I601/M763/D965/E1007/D1127、A203/N277/G366/I601/M763/D965/F1038/D1127、A203/N277/G366/I601/M763/E1007/F1038/D1127、A203/N277/G366/I601/D965/E1007/F1038/D1127、A203/N277/G366/I601/M763/D965/E1007/F1038/D1127、N277/G366/F539/I601/M763/D1127、N277/G366/F539/I601/D965/D1127、N277/G366/F539/I601/E1007/D1127、N277/G366/F539/I601/F1038/D1127、N277/G366/F539/I601/M763/D965/D1127、N277/G366/F539/I601/M763/E1007/D1127、N277/G366/F539/I601/M763/F1038/D1127、N277/G366/F539/I601/D965/E1007/D1127、N277/G366/F539/I601/D965/F1038/D1127、N277/G366/F539/I601/E1007/F1038/D1127、N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/D1127、N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/D1127、N277/G366/F539/I601/M763/E1007/F1038/D1127、N277/G366/F539/I601/D965/E1007/F1038/D1127、N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/D1127、A203/G366/F539/I601/M763/D1127、A203/G366/F539/I601/D965/D1127、A203/G366/F539/I601/E1007/D1127、A203/G366/F539/I601/F1038/D1127、A203/G366/F539/I601/M763/D965/D1127、A203/G366/F539/I601/M763/E1007/D1127、A203/G366/F539/I601/M763/F1038/D1127、A203/G366/F539/I601/D965/E1007/D1127、A203/G366/F539/I601/D965/F1038/D1127、A203/G366/F539/I601/E1007/F1038/D1127、A203/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/D1127、A203/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/D1127、A203/G366/F539/I601/M763/E1007/F1038/D1127、A203/G366/F539/I601/D965/E1007/F1038/D1127、A203/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/D1127、A203/N277/F539/I601/M763/D1127、A203/N277/F539/I601/D965/D1127、A203/N277/F539/I601/E1007/D1127、A203/N277/F539/I601/F1038/D1127、A203/N277/F539/I601/M763/D965/D1127、A203/N277/F539/I601/M763/E1007/D1127、A203/N277/F539/I601/M763/F1038/D1127、A203/N277/F539/I601/D965/E1007/D1127、A203/N277/F539/I601/D965/F1038/D1127、A203/N277/F539/I601/E1007/F1038/D1127、A203/N277/F539/I601/M763/D965/E1007/D1127、A203/N277/F539/I601/M763/D965/F1038/D1127、A203/N277/F539/I601/M763/E1007/F1038/D1127、A203/N277/F539/I601/D965/E1007/F1038/D1127、A203/N277/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/M763/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/D965/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/E1007/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/F1038/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/M763/E1007/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/M763/F1038/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/D965/E1007/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/D965/F1038/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/E1007/F1038/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/M763/E1007/F1038/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/D965/E1007/F1038/D1127、またはA203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/D1127を変形させたSpCas9変異体であり得る。
また、他の一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/N277/G366/F539/M763/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/D965/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/E1007/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/M763/D965/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/M763/E1007/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/M763/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/D965/E1007/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/D965/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/M763/D965/E1007/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/M763/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/I601/M763/T1102/D1127、A203/N277/G366/I601/D965/T1102/D1127、A203/N277/G366/I601/E1007/T1102/D1127、A203/N277/G366/I601/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/I601/M763/D965/T1102/D1127、A203/N277/G366/I601/M763/E1007/T1102/D1127、A203/N277/G366/I601/M763/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/I601/D965/E1007/T1102/D1127、A203/N277/G366/I601/D965/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/I601/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127、A203/N277/G366/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/G366/F539/I601/M763/T1102/D1127、N277/G366/F539/I601/D965/T1102/D1127、N277/G366/F539/I601/E1007/T1102/D1127、N277/G366/F539/I601/F1038/T1102/D1127、N277/G366/F539/I601/M763/D965/T1102/D1127、N277/G366/F539/I601/M763/E1007/T1102/D1127、N277/G366/F539/I601/M763/F1038/T1102/D1127、N277/G366/F539/I601/D965/E1007/T1102/D1127、N277/G366/F539/I601/D965/F1038/T1102/D1127、N277/G366/F539/I601/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127、N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127、N277/G366/F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/G366/F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/G366/F539/I601/M763/T1102/D1127、A203/G366/F539/I601/D965/T1102/D1127、A203/G366/F539/I601/E1007/T1102/D1127、A203/G366/F539/I601/F1038/T1102/D1127、A203/G366/F539/I601/M763/D965/T1102/D1127、A203/G366/F539/I601/M763/E1007/T1102/D1127、A203/G366/F539/I601/M763/F1038/T1102/D1127、A203/G366/F539/I601/D965/E1007/T1102/D1127、A203/G366/F539/I601/D965/F1038/T1102/D1127、A203/G366/F539/I601/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127、A203/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127、A203/G366/F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/G366/F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/F539/I601/M763/T1102/D1127、A203/N277/F539/I601/D965/T1102/D1127、A203/N277/F539/I601/E1007/T1102/D1127、A203/N277/F539/I601/F1038/T1102/D1127、A203/N277/F539/I601/M763/D965/T1102/D1127、A203/N277/F539/I601/M763/E1007/T1102/D1127、A203/N277/F539/I601/M763/F1038/T1102/D1127、A203/N277/F539/I601/D965/E1007/T1102/D1127、A203/N277/F539/I601/D965/F1038/T1102/D1127、A203/N277/F539/I601/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/F539/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127、A203/N277/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127、A203/N277/F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/M763/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/D965/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/E1007/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/M763/E1007/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/M763/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/D965/E1007/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/D965/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、またはA203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2領域、第3領域、および第4領域内のアミノ酸配列のうち選択された3つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。この時、3つ以上のアミノ酸は、それぞれ異なる領域に存在することができる。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域および/または第2-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸、第3-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸、および第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸をそれぞれ変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域および/または第2-4領域のうち、I7,G8,L9,D10,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,E762,M763,A764,R765,E766,N767,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,D965,F966,F970,F972,V975,U978,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987,Y988,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997,I998,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038およびY1039からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸、第3-1領域のうち、K775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,D839,H840,K848,D849,D850,D853,K855,R859,D861,K862,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,K890,R895,K896およびD898からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸、および第4-1領域のうち、T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸をそれぞれ変形させたSpCas9変異体であり得る。
一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のM763/K890/T1102、K890/D965/T1102、K890/E1007/T1102、K890/F1038/T1102、M763/K890/D1127、K890/D965/D1127、K890/E1007/D1127、K890/F1038/D1127、M763/K890/T1102/D1127、K890/D965/T1102/D1127、K890/E1007/T1102/D1127、またはK890/F1038/T1102/D1127を変形させたSpCas9変異体であり得る。
他の一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のM763/K890/D965/T1102、M763/K890/E1007/T1102、M763/K890/F1038/T1102、K890/D965/E1007/T1102、K890/D965/F1038/T1102、K890/E1007/F1038/T1102、M763/K890/D965/D1127、M763/K890/E1007/D1127、M763/K890/F1038/D1127、K890/D965/E1007/D1127、K890/D965/F1038/D1127、K890/E1007/F1038/D1127、M763/K890/D965/T1102/D1127、M763/K890/E1007/T1102/D1127、M763/K890/F1038/T1102/D1127、K890/D965/E1007/T1102/D1127、K890/D965/F1038/T1102/D1127、またはK890/E1007/F1038/T1102/D1127を変形させたSpCas9変異体であり得る。
また、他の一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のM763/K890/D965/E1007/T1102、M763/K890/D965/F1038/T1102、M763/K890/E1007/F1038/T1102、K890/D965/E1007/F1038/T1102、M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102、M763/K890/D965/E1007/D1127、M763/K890/D965/F1038/D1127、M763/K890/E1007/F1038/D1127、K890/D965/E1007/F1038/D1127、M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127、M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127、M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127、M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、またはM763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1領域、第2領域、第3領域、および第4領域内のアミノ酸配列のうち選択された4つ以上のアミノ酸を変形させたSpCas9変異体であり得る。この時、4つ以上のアミノ酸は、それぞれ異なる領域に存在することができる。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域および/または第1-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸、第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域および/または第2-4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸、第3-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸、および第4-1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸をそれぞれ変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域および/または第1-4領域のうち、N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696およびI697からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸、第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域および/または第2-4領域のうち、I7,G8,L9,D10,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,E762,M763,A764,R765,E766,N767,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,D965,F966,F970,F972,V975,U978,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987,Y988,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997,I998,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038およびY1039からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸、第3-1領域のうち、K775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,D839,H840,K848,D849,D850,D853,K855,R859,D861,K862,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,K890,R895,K896およびD898からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸、および第4-1領域のうち、T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸をそれぞれ変形させたSpCas9変異体であり得る。
一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/M763/K890/T1102、A203/K890/D965/T1102、A203/K890/E1007/T1102、A203/K890/F1038/T1102、A203/M763/K890/D965/T1102、A203/M763/K890/E1007/T1102、A203/M763/K890/F1038/T1102、A203/K890/D965/E1007/T1102、A203/K890/D965/F1038/T1102、A203/K890/E1007/F1038/T1102、A203/M763/K890/D965/E1007/T1102、A203/M763/K890/D965/F1038/T1102、A203/M763/K890/E1007/F1038/T1102、A203/K890/D965/E1007/F1038/T1102、A203/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102、N277/M763/K890/T1102、N277/K890/D965/T1102、N277/K890/E1007/T1102、N277/K890/F1038/T1102、N277/M763/K890/D965/T1102、N277/M763/K890/E1007/T1102、N277/M763/K890/F1038/T1102、N277/K890/D965/E1007/T1102、N277/K890/D965/F1038/T1102、N277/K890/E1007/F1038/T1102、N277/M763/K890/D965/E1007/T1102、N277/M763/K890/D965/F1038/T1102、N277/M763/K890/E1007/F1038/T1102、N277/K890/D965/E1007/F1038/T1102、N277/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102、G366/M763/K890/T1102、G366/K890/D965/T1102、G366/K890/E1007/T1102、G366/K890/F1038/T1102、G366/M763/K890/D965/T1102、G366/M763/K890/E1007/T1102、G366/M763/K890/F1038/T1102、G366/K890/D965/E1007/T1102、G366/K890/D965/F1038/T1102、G366/K890/E1007/F1038/T1102、G366/M763/K890/D965/E1007/T1102、G366/M763/K890/D965/F1038/T1102、G366/M763/K890/E1007/F1038/T1102、G366/K890/D965/E1007/F1038/T1102、G366/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102、F539/M763/K890/T1102、F539/K890/D965/T1102、F539/K890/E1007/T1102、F539/K890/F1038/T1102、F539/M763/K890/D965/T1102、F539/M763/K890/E1007/T1102、F539/M763/K890/F1038/T1102、F539/K890/D965/E1007/T1102、F539/K890/D965/F1038/T1102、F539/K890/E1007/F1038/T1102、F539/M763/K890/D965/E1007/T1102、F539/M763/K890/D965/F1038/T1102、F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102、F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102、F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102、I601/M763/K890/T1102、I601/K890/D965/T1102、I601/K890/E1007/T1102、I601/K890/F1038/T1102、I601/M763/K890/D965/T1102、I601/M763/K890/E1007/T1102、I601/M763/K890/F1038/T1102、I601/K890/D965/E1007/T1102、I601/K890/D965/F1038/T1102、I601/K890/E1007/F1038/T1102、I601/M763/K890/D965/E1007/T1102、I601/M763/K890/D965/F1038/T1102、I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102、I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102、I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102、A203/M763/K890/D1127、A203/K890/D965/D1127、A203/K890/E1007/D1127、A203/K890/F1038/D1127、A203/M763/K890/D965/D1127、A203/M763/K890/E1007/D1127、A203/M763/K890/F1038/D1127、A203/K890/D965/E1007/D1127、A203/K890/D965/F1038/D1127、A203/K890/E1007/F1038/D1127、A203/M763/K890/D965/E1007/D1127、A203/M763/K890/D965/F1038/D1127、A203/M763/K890/E1007/F1038/D1127、A203/K890/D965/E1007/F1038/D1127、A203/M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127、N277/M763/K890/D1127、N277/K890/D965/D1127、N277/K890/E1007/D1127、N277/K890/F1038/D1127、N277/M763/K890/D965/D1127、N277/M763/K890/E1007/D1127、N277/M763/K890/F1038/D1127、N277/K890/D965/E1007/D1127、N277/K890/D965/F1038/D1127、N277/K890/E1007/F1038/D1127、N277/M763/K890/D965/E1007/D1127、N277/M763/K890/D965/F1038/D1127、N277/M763/K890/E1007/F1038/D1127、N277/K890/D965/E1007/F1038/D1127、N277/M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127、G366/M763/K890/D1127、G366/K890/D965/D1127、G366/K890/E1007/D1127、G366/K890/F1038/D1127、G366/M763/K890/D965/D1127、G366/M763/K890/E1007/D1127、G366/M763/K890/F1038/D1127、G366/K890/D965/E1007/D1127、G366/K890/D965/F1038/D1127、G366/K890/E1007/F1038/D1127、G366/M763/K890/D965/E1007/D1127、G366/M763/K890/D965/F1038/D1127、G366/M763/K890/E1007/F1038/D1127、G366/K890/D965/E1007/F1038/D1127、G366/M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127、F539/M763/K890/D1127、F539/K890/D965/D1127、F539/K890/E1007/D1127、F539/K890/F1038/D1127、F539/M763/K/D965/D1127、F539/M763/K890/E1007/D1127、F539/M763/K890/F1038/D1127、F539/K890/D965/E1007/D1127、F539/K890/D965/F1038/D1127、F539/K890/E1007/F1038/D1127、F539/M763/K890/D965/E1007/D1127、F539/M763/K890/D965/F1038/D1127、F539/M763/K890/E1007/F1038/D1127、F539/K890/D965/E1007/F1038/D1127、F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127、I601/M763/K890/D1127、I601/K890/D965/D1127、I601/K890/E1007/D1127、I601/K890/F1038/D1127、I601/M763/K890/D965/D1127、I601/M763/K890/E1007/D1127、I601/M763/K890/F1038/D1127、I601/K890/D965/E1007/D1127、I601/K890/D965/F1038/D1127、I601/K890/E1007/F1038/D1127、I601/M763/K890/D965/E1007/D1127、I601/M763/K890/D965/F1038/D1127、I601/M763/K890/E1007/F1038/D1127、I601/K890/D965/E1007/F1038/D1127、またはI601/M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127を変形させたSpCas9変異体であり得る。
他の一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/M763/K890/T1102/D1127、A203/K890/D965/T1102/D1127、A203/K890/E1007/T1102/D1127、A203/K890/F1038/T1102/D1127、A203/M763/K890/D965/T1102/D1127、A203/M763/K890/E1007/T1102/D1127、A203/M763/K890/F1038/T1102/D1127、A203/K890/D965/E1007/T1102/D1127、A203/K890/D965/F1038/T1102/D1127、A203/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127、A203/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127、A203/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/M763/K890/T1102/D1127、N277/K890/D965/T1102/D1127、N277/K890/E1007/T1102/D1127、N277/K890/F1038/T1102/D1127、N277/M763/K890/D965/T1102/D1127、N277/M763/K890/E1007/T1102/D1127、N277/M763/K890/F1038/T1102/D1127、N277/K890/D965/E1007/T1102/D1127、N277/K890/D965/F1038/T1102/D1127、N277/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127、N277/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127、N277/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、G366/M763/K890/T1102/D1127、G366/K890/D965/T1102/D1127、G366/K890/E1007/T1102/D1127、G366/K890/F1038/T1102/D1127、G366/M763/K890/D965/T1102/D1127、G366/M763/K890/E1007/T1102/D1127、G366/M763/K890/F1038/T1102/D1127、G366/K890/D965/E1007/T1102/D1127、G366/K890/D965/F1038/T1102/D1127、G366/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、G366/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127、G366/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127、G366/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、G366/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、G366/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、F539/M763/K890/T1102/D1127、F539/K890/D965/T1102/D1127、F539/K890/E1007/T1102/D1127、F539/K890/F1038/T1102/D1127、F539/M763/K890/D965/T1102/D1127、F539/M763/K890/E1007/T1102/D1127、F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127、F539/K890/D965/E1007/T1102/D1127、F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127、F539/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、F539/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127、F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127、F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、I601/M763/K890/T1102/D1127、I601/K890/D965/T1102/D1127、I601/K890/E1007/T1102/D1127、I601/K890/F1038/T1102/D1127、I601/M763/K890/D965/T1102/D1127、I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127、I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127、I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127、I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127、I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127、I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127、I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、またはI601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127を変形させたSpCas9変異体であり得る。
一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/N277/M763/K890/T1102、A203/N277/K890/D965/T1102、A203/N277/K890/E1007/T1102、A203/N277/K890/F1038/T1102、A203/N277/M763/K890/D965/T1102、A203/N277/M763/K890/E1007/T1102、A203/N277/M763/K890/F1038/T1102、A203/N277/K890/D965/E1007/T1102、A203/N277/K890/D965/F1038/T1102、A203/N277/K890/E1007/F1038/T1102、A203/N277/M763/K890/D965/E1007/T1102、A203/N277/M763/K890/D965/F1038/T1102、A203/N277/M763/K890/E1007/F1038/T1102、A203/N277/K890/D965/E1007/F1038/T1102、A203/N277/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102、A203/G366/M763/K890/T1102、A203/G366/K890/D965/T1102、A203/G366/K890/E1007/T1102、A203/G366/K890/F1038/T1102、A203/G366/M763/K890/D965/T1102、A203/G366/M763/K890/E1007/T1102、A203/G366/M763/K890/F1038/T1102、A203/G366/K890/D965/E1007/T1102、A203/G366/K890/D965/F1038/T1102、A203/G366/K890/E1007/F1038/T1102、A203/G366/M763/K890/D965/E1007/T1102、A203/G366/M763/K890/D965/F1038/T1102、A203/G366/M763/K890/E1007/F1038/T1102、A203/G366/K890/D965/E1007/F1038/T1102、A203/G366/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102、A203/F539/M763/K890/T1102、A203/F539/K890/D965/T1102、A203/F539/K890/E1007/T1102、A203/F539/K890/F1038/T1102、A203/F539/M763/K890/D965/T1102、A203/F539/M763/K890/E1007/T1102、A203/F539/M763/K890/F1038/T1102、A203/F539/K890/D965/E1007/T1102、A203/F539/K890/D965/F1038/T1102、A203/F539/K890/E1007/F1038/T1102、A203/F539/M763/K890/D965/E1007/T1102、A203/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102、A203/F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102、A203/F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102、A203/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102、A203/I601/M763/K890/T1102、A203/I601/K890/D965/T1102、A203/I601/K890/E1007/T1102、A203/I601/K890/F1038/T1102、A203/I601/M763/K890/D965/T1102、A203/I601/M763/K890/E1007/T1102、A203/I601/M763/K890/F1038/T1102、A203/I601/K890/D965/E1007/T1102、A203/I601/K890/D965/F1038/T1102、A203/I601/K890/E1007/F1038/T1102、A203/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102、A203/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102、A203/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102、A203/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102、A203/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102、N277/G366/M763/K890/T1102、N277/G366/K890/D965/T1102、N277/G366/K890/E1007/T1102、N277/G366/K890/F1038/T1102、N277/G366/M763/K890/D965/T1102、N277/G366/M763/K890/E1007/T1102、N277/G366/M763/K890/F1038/T1102、N277/G366/K890/D965/E1007/T1102、N277/G366/K890/D965/F1038/T1102、N277/G366/K890/E1007/F1038/T1102、N277/G366/M763/K890/D965/E1007/T1102、N277/G366/M763/K890/D965/F1038/T1102、N277/G366/M763/K890/E1007/F1038/T1102、N277/G366/K890/D965/E1007/F1038/T1102、N277/G366/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102、N277/F539/M763/K890/T1102、N277/F539/K890/D965/T1102、N277/F539/K890/E1007/T1102、N277/F539/K890/F1038/T1102、N277/F539/M763/K890/D965/T1102、N277/F539/M763/K890/E1007/T1102、N277/F539/M763/K890/F1038/T1102、N277/F539/K890/D965/E1007/T1102、N277/F539/K890/D965/F1038/T1102、N277/F539/K890/E1007/F1038/T1102、N277/F539/M763/K890/D965/E1007/T1102、N277/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102、N277/F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102、N277/F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102、N277/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102、N277/I601/M763/K890/T1102、N277/I601/K890/D965/T1102、N277/I601/K890/E1007/T1102、N277/I601/K890/F1038/T1102、N277/I601/M763/K890/D965/T1102、N277/I601/M763/K890/E1007/T1102、N277/I601/M763/K890/F1038/T1102、N277/I601/K890/D965/E1007/T1102、N277/I601/K890/D965/F1038/T1102、N277/I601/K890/E1007/F1038/T1102、N277/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102、N277/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102、N277/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102、N277/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102、N277/I601/M763/K890/D965/1007/F1038/T1102、G366/F539/M763/K890/T1102、G366/F539/K890/D965/T1102、G366/F539/K890/E1007/T1102、G366/F539/K890/F1038/T1102、G366/F539/M763/K890/D965/T1102、G366/F539/M763/K890/E1007/T1102、G366/F539/M763/K890/F1038/T1102、G366/F539/K890/D965/E1007/T1102、G366/F539/K890/D965/F1038/T1102、G366/F539/K890/E1007/F1038/T1102、G366/F539/M763/K890/D965/E1007/T1102、G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102、G366/F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102、G366/F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102、G366/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102、G366/I601/M763/K890/T1102、G366/I601/K890/D965/T1102、G366/I601/K890/E1007/T1102、G366/I601/K890/F1038/T1102、G366/I601/M763/K890/D965/T1102、G366/I601/M763/K890/E1007/T1102、G366/I601/M763/K890/F1038/T1102、G366/I601/K890/D965/E1007/T1102、G366/I601/K890/D965/F1038/T1102、G366/I601/K890/E1007/F1038/T1102、G366/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102、G366/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102、G366/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102、G366/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102、G366/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102、F539/I601/M763/K890/T1102、F539/I601/K890/D965/T1102、F539/I601/K890/E1007/T1102、F539/I601/K890/F1038/T1102、F539/I601/M763/K890/D965/T1102、F539/I601/M763/K890/E1007/T1102、F539/I601/M763/K890/F1038/T1102、F539/I601/K890/D965/E1007/T1102、F539/I601/K890/D965/F1038/T1102、F539/I601/K890/E1007/F1038/T1102、F539/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102、F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102、F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102、F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102、F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102、A203/N277/M763/K890/D1127、A203/N277/K890/D965/D1127、A203/N277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他の一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/N277/M763/K890/T1102/D1127、A203/N277/K890/D965/T1102/D1127、A203/N277/K890/E1007/T1102/D1127、A203/N277/K890/F1038/T1102/D1127、A203/N277/M763/K890/D965/T1102/D1127、A203/N277/M763/K890/E1007/T1102/D1127、A203/N277/M763/K890/F1038/T1102/D1127、A203/N277/K890/D965/E1007/T1102/D1127、A203/N277/K890/D965/F1038/T1102/D1127、A203/N277/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127、A203/N277/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127、A203/N277/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/G366/M763/K890/T1102/D1127、A203/G366/K890/D965/T1102/D1127、A203/G366/K890/E1007/T1102/D1127、A203/G366/K890/F1038/T1102/D1127、A203/G366/M763/K890/D965/T1102/D1127、A203/G366/M763/K890/E1007/T1102/D1127、A203/G366/M763/K890/F1038/T1102/D1127、A203/G366/K890/D965/E1007/T1102/D1127、A203/G366/K890/D965/F1038/T1102/D1127、A203/G366/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/G366/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127、A203/G366/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127、A203/G366/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/G366/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/G366/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/F539/M763/K890/T1102/D1127、A203/F539/K890/D965/T1102/D1127、A203/F539/K890/E1007/T1102/D1127、A203/F539/K890/F1038/T1102/D1127、A203/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127、A203/F539/M763/K890/E1007/T1102/D1127、A203/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127、A203/F539/K890/D965/E1007/T1102/D1127、A203/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127、A203/F539/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/F539/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127、A203/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127、A203/F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/I601/M763/K890/T1102/D1127、A203/I601/K890/D965/T1102/D1127、A203/I601/K890/E1007/T1102/D1127、A203/I601/K890/F1038/T1102/D1127、A203/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127、A203/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127、A203/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127、A203/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127、A203/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127、A203/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127、A203/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127、A203/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/G366/M763/K890/T1102/D1127、N277/G366/K890/D965/T1102/D1127、N277/G366/K890/E1007/T1102/D1127、N277/G366/K890/F1038/T1102/D1127、N277/G366/M763/K890/D965/T1102/D1127、N277/G366/M763/K890/E1007/T1102/D1127、N277/G366/M763/K890/F1038/T1102/D1127、N277/G366/K890/D965/E1007/T1102/D1127、N277/G366/K890/D965/F1038/T1102/D1127、N277/G366/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/G366/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127、N277/G366/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127、N277/G366/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/G366/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/G366/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/F539/M763/K890/T1102/D1127、N277/F539/K890/D965/T1102/D1127、N277/F539/K890/E1007/T1102/D1127、N277/F539/K890/F1038/T1102/D1127、N277/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127、N277/F539/M763/K890/E1007/T1102/D1127、N277/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127、N277/F539/K890/D965/E1007/T1102/D1127、N277/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127、N277/F539/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/F539/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127、N277/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127、N277/F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/I601/M763/890/T1102/D1127、N277/I601/K890/D965/T1102/D1127、N277/I601/K890/E1007/T1102/D1127、N277/I601/K890/F1038/T1102/D1127、N277/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127、N277/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127、N277/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127、N277/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127、N277/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127、N277/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127、N277/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127、N277/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、G366/F539/M763/K890/T1102/D1127、G366/F539/K890/D965/T1102/D1127、G366/F539/K890/E1007/T1102/D1127、G366/F539/K890/F1038/T1102/D1127、G366/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127、G366/F539/M763/K890/E1007/T1102/D1127、G366/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127、G366/F539/K890/D965/E1007/T1102/D1127、G366/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127、G366/F539/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、G366/F539/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127、G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127、G366/F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、G366/F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、G366/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、G366/I601/M763/K890/T1102/D1127、G366/I601/K890/D965/T1102/D1127、G366/I601/K890/E1007/T1102/D1127、G366/I601/K890/F1038/T1102/D1127、G366/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127、G366/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127、G366/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127、G366/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127、G366/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127、G3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27、G366/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、G366/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、G366/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、F539/I601/M763/K890/T1102/D1127、F539/I601/K890/D965/T1102/D1127、F539/I601/K890/E1007/T1102/D1127、F539/I601/K890/F1038/T1102/D1127、F539/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127、F539/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127、F539/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127、F539/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127、F539/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127、F539/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、F539/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127、F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127、F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、またはF539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127を変形させたSpCas9変異体であり得る。
一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/N277/G366/M763/K890/T1102、A203/N277/G366/K890/D965/T1102、A203/N277/G366/K890/E1007/T1102、A203/N277/G366/K890/F1038/T1102、A203/N277/G366/M763/K890/D965/T1102、A203/N277/G366/M763/K890/E1007/T1102、A203/N277/G366/M763/K890/F1038/T1102、A203/N277/G366/K890/D965/E1007/T1102、A203/N277/G366/K890/D965/F1038/T1102、A203/N277/G366/K890/E1007/F1038/T1102、A203/N277/G366/M763/K890/D965/E1007/T1102、A203/N277/G366/M763/K890/D965/F1038/T1102、A203/N277/G366/M763/K890/E1007/F1038/T1102、A203/N277/G366/K890/D965/E1007/F1038/T1102、A203/N277/G366/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102、A203/N277/F539/M763/K890/T1102、A203/N277/F539/K890/D965/T1102、A203/N277/F539/K890/E1007/T1102、A203/N277/F539/K890/F1038/T1102、A203/N277/F539/M763/K890/D965/T1102、A203/N277/F539/M763/K890/E1007/T1102、A203/N277/F539/M763/K890/F1038/T1102、A203/N277/F539/K890/D965/E1007/T1102、A203/N277/F539/K890/D965/F1038/T1102、A203/N277/F539/K890/E1007/F1038/T1102、A203/N277/F539/M763/K890/D965/E1007/T1102、A203/N277/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102、A203/N277/F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102、A203/N277/F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102、A203/N277/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102、A203/N277/I601/M763/K890/T1102、A203/N277/I601/K890/D965/T1102、A203/N277/I601/K890/E1007/T1102、A203/N277/I601/K890/F1038/T1102、A203/N277/I601/M763/K890/D965/T1102、A203/N277/I601/M763/K890/E1007/T1102、A203/N277/I601/M763/K890/F1038/T1102、A203/N277/I601/K890/D965/E1007/T1102、A203/N277/I601/K890/D965/F1038/T1102、A203/N277/I601/K890/E1007/F1038/T1102、A203/N277/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102、A203/N277/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102、A203/N277/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102、A203/N277/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102、A203/N277/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102、A203/G366/F539/M763/K890/T1102、A203/G366/F539/K890/D965/T1102、A203/G366/F539/K890/E1007/T1102、A203/G366/F539/K890/F1038/T1102、A203/G366/F539/M763/K890/D965/T1102、A203/G366/F539/M763/K890/E1007/T1102、A203/G366/F539/M763/K890/F1038/T1102、A203/G366/F539/K890/D965/E1007/T1102、A203/G366/F539/K890/D965/F1038/T1102、A203/G366/F539/K890/E1007/F1038/T1102、A203/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/T1102、A203/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102、A203/G366/F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102、A203/G366/F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102、A203/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102、A203/G366/I601/M763/K890/T1102、A203/G366/I601/K890/D965/T1102、A203/G366/I601/K890/E1007/T1102、A203/G366/I601/K890/F1038/T1102、A203/G366/I601/M763/K890/D965/T1102、A203/G366/I601/M763/K890/E1007/T1102、A203/G366/I601/M763/K890/F1038/T1102、A203/G366/I601/K890/D965/E1007/T1102、A203/G366/I601/K890/D965/F1038/T1102、A203/G366/I601/K890/E1007/F1038/T1102、A203/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102、A203/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102、A203/G366/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102、A203/G366/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102、A203/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102、A203/F539/I601/M763/K890/T1102、A203/F539/I601/K890/D965/T1102、A203/F539/I601/K890/E1007/T1102、A203/F539/I601/K890/F1038/T1102、A203/F539/I601/M763/K890/D965/T1102、A203/F539/I601/M763/K890/E1007/T1102、A203/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102、A203/F539/I601/K890/D965/E1007/T1102、A203/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102、A203/F539/I601/K890/E1007/F1038/T1102、A203/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102、A203/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102、A203/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102、A203/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102、A203/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102、N277/G366/F539/M763K890/T1102、N277/G366/F539/K890/D965/T1102、N277/G366/F539/K890/E1007/T1102、N277/G366/F539/K890/F1038/T1102、N277/G366/F539/M763/K890/D965/T1102、N277/G366/F539/M763/K890/E1007/T1102、N277/G366/F539/M763/K890/F1038/T1102、N277/G366/F539/K890/D965/E1007/T1102、N277/G366/F539/K890/D965/F1038/T1102、N277/G366/F539/K890/E1007/F1038/T1102、N277/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/T1102、N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102、N277/G366/F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102、N277/G366/F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102、N277/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102、N277/G366/I601/M763/K890/T1102、N277/G366/I601/K890/D965/T1102、N277/G366/I601/K890/E1007/T1102、N277/G366/I601/K890/F1038/T1102、N277/G366/I601/M763/K890/D965/T1102、N277/G366/I601/M763/K890/E1007/T1102、N277/G366/I601/M763/K890/F1038/T1102、N277/G366/I601/K890/D965/E1007/T1102、N277/G366/I601/K890/D965/F1038/T1102、N277/G366/I601/K890/E1007/F1038/T1102、N277/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102、N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102、N277/G366/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102、N277/G366/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102、N277/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102、G366/F539/I601/M763/K890/T1102、G366/F539/I601/K890/D965/T1102、G366/F539/I601/K890/E1007/T1102、G366/F539/I601/K890/F1038/T1102、G366/F539/I601/M763/K890/D965/T1102、G366/F539/I601/M763/K890/E1007/T1102、G366/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102、G366/F539/I601/K890/D965/E1007/T1102、G366/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102、G366/F539/I601/K890/E1007/F1038/T1102、G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102、G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102、G366/F539/I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1127、G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/D1127、またはG366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127を変形させたSpCas9変異体であり得る。
他の一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/N277/G366/M763/K890/T1102/D1127、A203/N277/G366/K890/D965/T1102/D1127、A203/N277/G366/K890/E1007/T1102/D1127、A203/N277/G366/K890/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/M763/K890/D965/T1102/D1127、A203/N277/G366/M763/K890/E1007/T1102/D1127、A203/N277/G366/M763/K890/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/K890/D965/E1007/T1102/D1127、A203/N277/G366/K890/D965/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127、A203/N277/G366/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/F539/M763/K890/T1102/D1127、A203/N277/F539/K890/D965/T1102/D1127、A203/N277/F539/K890/E1007/T1102/D1127、A203/N277/F539/K890/F1038/T1102/D1127、A203/N277/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127、A203/N277/F539/M763/K890/E1007/T1102/D1127、A203/N277/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127、A203/N277/F539/K890/D965/E1007/T1102/D1127、A203/N277/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127、A203/N277/F539/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/F539/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127、A203/N277/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127、A203/N277/F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/I601/M763/K890/T1102/D1127、A203/N277/I601/K890/D965/T1102/D1127、A203/N277/I601/K890/E1007/T1102/D1127、A203/N277/I601/K890/F1038/T1102/D1127、A203/N277/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127、A203/N277/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127、A203/N277/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127、A203/N277/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127、A203/N277/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127、A203/N277/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127、A203/N277/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127、A203/N277/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/G366/F539/M763/K890/T1102/D1127、A203/G366/F539/K890/D965/T1102/D1127、A203/G366/F539/K890/E1007/T1102/D1127、A203/G366/F539/K890/F1038/T1102/D1127、A203/G366/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127、A203/G366/F539/M763/K890/E1007/T1102/D1127、A203/G366/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127、A203/G366/F539/K890/D965/E1007/T1102/D1127、A203/G366/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127、A203/G366/F539/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127、A203/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127、A203/G366/F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/G366/F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/G366/I601/M763/K890/T1102/D1127、A203/G366/I601/K890/D965/T1102/D1127、A203/G366/I601/K890/E1007/T1102/D1127、A203/G366/I601/K890/F1038/T1102/D1127、A203/G366/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127、A203/G366/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127、A203/G366/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127、A203/G366/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127、A203/G366/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127、A203/G366/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127、A203/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127、A203/G366/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/G366/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/F539/I601/M763/K890/T1102/D1127、A203/F539/I601/K890/D965/T1102/D1127、A203/F539/I601/K890/E1007/T1102/D1127、A203/F539/I601/K890/F1038/T1102/D1127、A203/F539/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127、A203/F539/I/M763/K890/E1007/T1102/D1127、A203/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127、A203/F539/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127、A203/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127、A203/F539/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127、A203/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127、A203/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/G366/F539/M763/K890/T1102/D1127、N277/G366/F539/K890/D965/T1102/D1127、N277/G366/F539/K890/E1007/T1102/D1127、N277/G366/F539/K890/F1038/T1102/D1127、N277/G366/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127、N277/G366/F539/M763/K890/E1007/T1102/D1127、N277/G366/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127、N277/G366/F539/K890/D965/E1007/T1102/D1127、N277/G366/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127、N277/G366/F539/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127、N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127、N277/G366/F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/G366/F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/G366/I601/M763/K890/T1102/D1127、N277/G366/I601/K890/D965/T1102/D1127、N277/G366/I601/K890/E1007/T1102/D1127、N277/G366/I601/K890/F1038/T1102/D1127、N277/G366/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127、N277/G366/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127、N277/G366/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127、N277/G366/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127、N277/G366/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127、N277/G366/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127、N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D
1127、N277/G366/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/G366/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、G366/F539/I601/M763/K890/T1102/D1127、G366/F539/I601/K890/D965/T1102/D1127、G366/F539/I601/K890/E1007/T1102/D1127、G366/F539/I601/K890/F1038/T1102/D1127、G366/F539/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127、G366/F539/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127、G366/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127、G366/F539/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127、G366/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127、G366/F539/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127、G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127、G366/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、またはG366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127を変形させたSpCas9変異体であり得る。
一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/N277/G366/F539/M763/K890/T1102、A203/N277/G366/F539/K890/D965/T1102、A203/N277/G366/F539/K890/E1007/T1102、A203/N277/G366/F539/K890/F1038/T1102、A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/T1102、A203/N277/G366/F539/M763/K890/E1007/T1102、A203/N277/G366/F539/M763/K890/F1038/T1102、A203/N277/G366/F539/K890/D965/E1007/T1102、A203/N277/G366/F539/K890/D965/F1038/T1102、A203/N277/G366/F539/K890/E1007/F1038/T1102、A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/T1102、A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102、A203/N277/G366/F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102、A203/N277/G366/F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102、A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102、A203/N277/G366/I601/M763/K890/T1102、A203/N277/G366/I601/K890/D965/T1102、A203/N277/G366/I601/K890/E1007/T1102、A203/N277/G366/I601/K890/F1038/T1102、A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/T1102、A203/N277/G366/I601/M763/K890/E1007/T1102、A203/N277/G366/I601/M763/K890/F1038/T1102、A203/N277/G366/I601/K890/D965/E1007/T1102、A203/N277/G366/I601/K890/D965/F1038/T1102、A203/N277/G366/I601/K890/E1007/F1038/T1102、A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102、A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102、A203/N277/G366/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102、A203/N277/G366/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102、A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102、A203/N277/F539/I601/M763/K890/T1102、A203/N277/F539/I601/K890/D965/T1102、A203/N277/F539/I601/K890/E1007/T1102、A203/N277/F539/I601/K890/F1038/T1102、A203/N277/F539/I601/M763/K890/D965/T1102、A203/N277/F539/I601/M763/K890/E1007/T1102、A203/N277/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102、A203/N277/F539/I601/K890/D965/E1007/T1102、A203/N277/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102、A203/N277/F539/I601/K890/E1007/F1038/T1102、A203/N277/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102、A203/N277/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102、A203/N277/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102、A203/N277/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102、A203/N277/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102、A203/G366/F539/I601/M763/K890/T1102、A203/G366/F539/I601/K890/D965/T1102、A203/G366/F539/I601/K890/E1007/T1102、A203/G366/F539/I601/K890/F1038/T1102、A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/T1102、A203/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/T1102、A203/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102、A203/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/T1102、A203/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102、A203/G366/F539/I601/K890/E1007/F1038/T1102、A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102、A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102、A203/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102、A203/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102、A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102、N277/G366/F539/I601/M763/K890/T1102、N277/G366/F539/I601/K890/D965/T1102、N277/G366/F539/I601/K890/E1007/T1102、N277/G366/F539/I601/K890/F1038/T1102、N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/T1102、N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/T1102、N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102、N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/T1102、N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102、N277/G366/F539/I601/K890/E1007/F1038/T1102、N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102、N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102、N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102、N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102、N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102、A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/T1102、A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/T1102、A203/N277/G366/F539/I601/K890/E1007/T1102、A203/N277/G366/F539/I601/K890/F1038/T1102、A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D/T1102、A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/T1102、A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102、A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/T1102、A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102、A203/N277/G366/F539/I601/K890/E1007/F1038/T1102、A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102、A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102、A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102、A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102、A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102、A203/N277/G366/F539/M763/K890/D1127、A203/N277/G366/F539/K890/D965/D1127、A203/N277/G366/F539/K890/E1007/D1127、A203/N277/G366/F539/K890/F1038/D1127、A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/D1127、A203/N277/G366/F539/M763/K890/E1007/D1127、A203/N277/G366/F539/M763/K890/F1038/D1127、A203/N277/G366/F539/K890/D965/E1007/D1127、A203/N277/G366/F539/K890/D965/F1038/D1127、A203/N277/G366/F539/K890/E1007/F1038/D1127、A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/D1127、A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/D1127、A203/N277/G366/F539/M763/K890/E1007/F1038/D1127、A203/N277/G366/F539/K890/D965/E1007/F1038/D1127、A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127、A203/N277/G366/I601/M763/K890/D1127、A203/N277/G366/I601/K890/D965/D1127、A203/N277/G366/I601/K890/E1007/D1127、A203/N277/G366/I601/K890/F1038/D1127、A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/D1127、A203/N277/G366/I601/M763/K890/E1007/D1127、A203/N277/G366/I601/M763/K890/F1038/D1127、A203/N277/G366/I601/K890/D965/E1007/D1127、A203/N277/G366/I601/K890/D965/F1038/D1127、A203/N277/G366/I601/K890/E1007/F1038/D1127、A203/N277/G36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他の一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のA203/N277/G366/F539/M763/K890/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/K890/D965/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/K890/E1007/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/K890/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/M763/K890/E1007/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/K890/D965/E1007/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/I601/M763/K890/T1102/D1127、A203/N277/G366/I601/K890/D965/T1102/D1127、A203/N277/G366/I601/K890/E1007/T1102/D1127、A203/N277/G366/I601/K890/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127、A203/N277/G366/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127、A203/N277/G366/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127、A203/N277/G366/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127、A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/F539/I601/M763/K890/T1102/D1127、A203/N277/F539/I601/K890/D965/T1102/D1127、A203/N277/F539/I601/K890/E1007/T1102/D1127、A203/N277/F539/I601/K890/F1038/T1102/D1127、A203/N277/F539/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127、A203/N277/F539/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127、A203/N277/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127、A203/N277/F539/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127、A203/N277/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127、A203/N277/F539/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127、A203/N277/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127、A203/N277/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/G366/F539/I601/M763/K890/T1102/D1127、A203/G366/F539/I601/K890/D965/T1102/D1127、A203/G366/F539/I601/K890/E1007/T1102/D1127、A203/G366/F539/I601/K890/F1038/T1102/D1127、A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127、A203/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127、A203/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127、A203/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127、A203/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127、A203/G366/F539/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127、A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127、A203/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/G366/F539/I601/M763/K890/T1102/D1127、N277/G366/F539/I601/K890/D965/T1102/D1127、N277/G366/F539/I601/K890/E1007/T1102/D1127、N277/G366/F539/I601/K890/F1038/T1102/D1127、N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127、N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127、N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127、N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127、N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127、N277/G366/F539/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127、N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F/T1102/D1127、N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/K890/E1007/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/K890/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127、A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127、またはA203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127を変形させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1領域、第2領域、第3領域および/または第4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を除去させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1領域のうち、N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696およびI697、第2領域のうち、I7,G8,L9,D10,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,E762,M763,A764,R765,E766,N767,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,D965,F966,F970,F972,V975,U978,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987,Y988,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997,I998,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038およびY1039、第3領域のうち、K775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,V838,D839,H840,K848,D849,D850,D853,N854,K855,R859,D861,K862,N863,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,A889,K890,L891,R895,K896およびD898、および/または第4領域のうち、T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を除去させたSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1領域、第2領域、第3領域および/または第4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域および/または第1-4領域のうち、N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696およびI697からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域のうちA203(疏水性指標:1.8)を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、およびチロシンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域のうちA203(疏水性指標:1.8)を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるアスパラギン酸(疏水性指標:-3.5)で置換したSpCas9変異体であり得る。
他の一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-2領域のうちG366(疏水性指標:-0.4)を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、リジン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、およびチロシンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-2領域のうちG366(疏水性指標:-0.4)を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるセリン(疏水性指標:-0.8)で置換したSpCas9変異体であり得る。
一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-3領域のうちF539(疏水性指標:2.8)を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、およびチロシンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-3領域のうちF539(疏水性指標:2.8)を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるセリン(疏水性指標:-0.8)で置換したSpCas9変異体であり得る。
他の一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-3領域のうちI601(疏水性指標:4.5)を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-3領域のうちI601(疏水性指標:4.5)を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるアスパラギン(疏水性指標:-3.5)で置換したSpCas9変異体であり得る。
また、他の一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域および/または第1-4領域のうちA203(疏水性指標:1.8)、G366(疏水性指標:-0.4)、F539(疏水性指標:2.8)、およびI601(疏水性指標:4.5)をそれぞれ疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域のうちA203(疏水性指標:1.8)を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるアスパラギン酸(疏水性指標:-3.5)で置換し、第1-2領域のうちG366(疏水性指標:-0.4)を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるセリン(疏水性指標:-0.8)で置換し、第1-3領域のうちF539(疏水性指標:2.8)を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるセリン(疏水性指標:-0.8)で置換し、第1-3領域のうちI601(疏水性指標:4.5)を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるアスパラギン(疏水性指標:-3.5)で置換したSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域および/または第1-4領域のうち、N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696およびI697からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
一実施例では、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域のうちN277(疏水性指標:-3.5)を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるアラニン、システイン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域のうちN277(疏水性指標:-3.5)を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるヒスチジン(疏水性指標:-3.2)で置換したSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域および/または第1-4領域のうち、N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696およびI697からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を疏水性指標が相対的に小さいか、または大きいアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域第1-3領域および/または第1-4領域のうちA203(疏水性指標:1.8)、N277(疏水性指標:-3.5)、G366(疏水性指標:-0.4)、F539(疏水性指標:2.8)、およびI601(疏水性指標:4.5)をそれぞれ疏水性指標が相対的に小さいか、または大きいアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域のうちA203(疏水性指標:1.8)を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるアスパラギン酸(疏水性指標:-3.5)で置換し、第1-1領域のうちN277(疏水性指標:-3.5)を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるヒスチジン(疏水性指標:-3.2)で置換し、第1-2領域のうちG366(疏水性指標:-0.4)を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるセリン(疏水性指標:-0.8)で置換し、第1-3領域のうちF539(疏水性指標:2.8)を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるセリン(疏水性指標:-0.8)で置換し、第1-3領域のうちI601(疏水性指標:4.5)を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるアスパラギン(疏水性指標:-3.5)で置換したSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域および/または第1-4領域のうち、N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696およびI697からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を相対的に小さい官能基を有するアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-3領域のうちF539を相対的に小さい官能基を有するアミノ酸であるアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、およびバリンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-3領域のうちF539を相対的に小さい官能基を有するアミノ酸であるアスパラギンで置換したSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域および/または第1-4領域のうち、N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696およびI697からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を相対的に大きい官能基を有するアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域のうちA203を相対的に大きい官能基を有するアミノ酸であるアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域のうちA203を相対的に大きい官能基を有するアミノ酸であるアスパラギン酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域、第1-3領域および/または第1-4領域のうち、N199,I201,N202,A203,G205,V206,A208,A210,I211,L212,A214,L216,L222,N224,L225,I226,A227,Q228,L229,G231,N235,G236,L237,G239,N240,L241,I242,A243,L244,L246,G247,L248,N251,N255,L258,A259,A262,L264,Q265,L266,L275,N277,L278,L279,A280,Q281,I282,P316,L317,A319,M321,I322,L332,L334,L335,A337,L338,V339,L343,P344,I350,F351,F352,G358,A360,G361,I363,G365,G366,A367,F372,F375,I376,P378,I379,L380,M383,G385,L389,L390,V391,L393,L513,L514,F518,V520,L524,V527,V530,G533,M534,P537,A538,F539,L540,G542,A547,I548,V549,L551,L552,F553,V559,V561,L564,F569,I572,C574,F575,V578,I580,G582,V583,F587,A589,L591,G592,L597,L598,I600,I601,F606,L607,I679,L680,F682,L683,G687,F688,A689,F693,M694,L696およびI697からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を相対的に小さいか、または大きい官能基を有するアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域、第1-2領域第1-3領域および/または第1-4領域のうちA203、N277、G366、F539、およびI601をそれぞれ相対的に小さいか、または大きい官能基を有するアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域のうちA203およびN277、第1-2領域のうちG366、第1-3領域のうちI601をそれぞれ相対的に大きい官能基を有するアミノ酸であるアスパラギン酸、ヒスチジン、セリン、アスパラギンで置換し、第1-3領域のうちF539を相対的に小さい官能基を有するセリンで置換したSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域および/または第2-4領域のうち、I7,G8,L9,D10,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,E762,M763,A764,R765,E766,N767,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,D965,F966,F970,F972,V975,U978,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987,Y988,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997,I998,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038およびY1039からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-2領域のうちM763(疏水性指標:1.9)を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるシステイン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、およびバリンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-2領域のうちM763(疏水性指標:1.9)を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるイソロイシン(疏水性指標:4.5)で置換したSpCas9変異体であり得る。
他の一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-3領域のうちD965(疏水性指標:-3.5)を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるアラニン、システイン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-3領域のうちD965(疏水性指標:-3.5)を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるチロシン(疏水性指標:-1.3)で置換したSpCas9変異体であり得る。
また、他の一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-4領域のうちE1007(疏水性指標:-3.5)を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるアラニン、システイン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-4領域のうちE1007(疏水性指標:-3.5)を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるロイシン(疏水性指標:3.8)で置換したSpCas9変異体であり得る。
他の一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-2領域および第2-4領域のうちM763(疏水性指標:1.9)およびE1007(疏水性指標:-3.5)を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-2領域のうちM763(疏水性指標:1.9)を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるイソロイシン(疏水性指標:4.5)で置換し、第2-4領域のうちE1007(疏水性指標:-3.5)を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるロイシン(疏水性指標:3.8)で置換したSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域および/または第2-4領域のうち、I7,G8,L9,D10,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,E762,M763,A764,R765,E766,N767,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,D965,F966,F970,F972,V975,U978,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987,Y988,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997,I998,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038およびY1039からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-4領域のうちF1037および/またはF1038をそれぞれ疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、およびチロシンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-4領域のうちF1038(疏水性指標:2.8)を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるチロシン(疏水性指標:-1.3)で置換したSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域および/または第2-4領域のうち、I7,G8,L9,D10,I11,G12,V16,G17,W18,A19,V20,I21,P731,A732,I733,G736,I737,L738,V741,V743,V744,L747,V748,V750,M751,G752,P756,I759,V760,I761,E762,M763,A764,R765,E766,N767,I927,V931,A932,I934,L935,M939,L949,I950,V953,V955,I956,L958,L962,V963,D965,F966,F970,F972,V975,U978,Y981,H982,H983,A984,H985,D986,A987,Y988,L989,A991,V992,V993,G994,A996,L997,I998,Y1001,P1002,K1003,L1004,E1005,S1006,E1007,F1008,V1009,Y1010,G1011,D1012,Y1013,K1014,V1015,Y1016,D1017,V1018,R1019,K1020,M1021,I1022,A1023,K1024,S1025,E1026,Q1027,E1028,I1029,G1030,A1032,A1034,Y1036,F1037,F1038およびY1039からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を疏水性指標が小さいか、または大きいアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-1領域、第2-2領域、第2-3領域および/または第2-4領域のうちM763(疏水性指標:1.9)、D965(疏水性指標:-3.5)およびF1038(疏水性指標:2.8)を疏水性指標が相対的に小さいか、または大きいアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-2領域のうちM763(疏水性指標:1.9)を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるイソロイシン(疏水性指標:4.5)で置換し、第2-3領域のうちD965(疏水性指標:-3.5)を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるチロシン(疏水性指標:-1.3)で置換し、第2-4領域のうちF1038(疏水性指標:2.8)を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるチロシン(疏水性指標:-1.3)で置換したSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第3領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第3-1領域のうち、K775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,V838,D839,H840,K848,D849,D850,D853,N854,K855,R859,D861,K862,N863,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,A889,K890,L891,R895,K896およびD898からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第3-1領域のうちK890(疏水性指標:-3.9)を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第3-1領域のうちK890(疏水性指標:-3.9)を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるアスパラギン(疏水性指標:-3.5)で置換したSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第3-1領域のうち、K775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,V838,D839,H840,K848,D849,D850,D853,N854,K855,R859,D861,K862,N863,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,A889,K890,L891,R895,K896およびD898からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を、電荷を有さないアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第3-1領域のうちK890を、電荷を有さないアミノ酸であるアラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第3-1領域のうちK890を、電荷を有さないアミノ酸であるグルタミンで置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第3-1領域のうちK890を、電荷を有さないアミノ酸であるアスパラギンで置換したSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第3-1領域のうち、K775,R778,E779,R780,K782,R783,E785,E786,K789,E790,K797,E798,H799,E802,E809,K810,R820,D821,D825,E827,D829,R832,D835,D837,V838,D839,H840,K848,D849,D850,D853,N854,K855,R859,D861,K862,N863,R864,K866,D868,E873,E874,K877,K878,K880,R884,A889,K890,L891,R895,K896およびD898からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を相対的に小さい官能基を有するアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第3-1領域のうちK890および/またはK896をそれぞれ相対的に小さい官能基を有するアミノ酸であるアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、セリン、トレオニン、およびバリンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第3-1領域のうちK890を相対的に小さい官能基を有するアミノ酸であるアスパラギン酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第3-1領域のうちK896を相対的に小さい官能基を有するアミノ酸であるアスパラギンで置換したSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第4-1領域のうち、T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第4-1領域のうちT1102を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、リジン、プロリン、セリン、トリプトファン、およびチロシンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第4-1領域のうちT1102(疏水性指標:-0.7)を疏水性指標が相対的に小さいプロリン(疏水性指標:-1.6)で置換したSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第4-1領域のうち、T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第4-1領域のうちS1106を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるアラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、およびバリンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第4-1領域のうちS1106(疏水性指標:-0.8)を疏水性指標が相対的に大きいグリシン(疏水性指標:-0.4)で置換したSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第4-1領域のうち、T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を疏水性指標が相対的に小さいか、または大きいアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第4-1領域のうちT1102およびS1136をそれぞれ疏水性指標が相対的に小さいか、または大きいアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第4-1領域のうちT1102(疏水性指標:-0.7)を疏水性指標が相対的に小さいプロリン(疏水性指標:-1.6)で置換し、S1106(疏水性指標:-0.8)を疏水性指標が相対的に大きいグリシン(疏水性指標:-0.4)で置換したSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第4-1領域のうち、T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を相対的に小さい官能基を有するアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第4-1領域のうちT1102を相対的に小さい官能基を有するアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第4-1領域のうちT1102を相対的に小さい官能基を有するプロリンで置換したSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第4-1領域のうち、T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を相対的に大きい官能基を有するアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第4-1領域のうちD1127を相対的に大きい官能基を有するアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第4-1領域のうちD1127を相対的に大きい官能基を有するグルタミン酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第4-1領域のうち、T1102,S1106,E1108,S1116,D1117,D1125,D1127,D1135,S1136およびT1138からなる群より選択される2つ以上のアミノ酸を相対的に小さいか、または大きい官能基を有するアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第4-1領域のうちT1102およびD1127を相対的に小さいか、または大きい官能基を有するアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第4-1領域のうちT1102を相対的に小さい官能基を有するプロリンで置換し、D1127を相対的に大きい官能基を有するグルタミン酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1領域、第2領域第3領域および/または第4領域内のアミノ酸配列のうち選択された2つ以上のアミノ酸を他のアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。この時、2つ以上のアミノ酸は、それぞれ異なる領域に存在することができる。
この時、各領域で選択された1つ以上のアミノ酸の置換に関する説明は、上記の通りである。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸、および第2領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸をそれぞれ他のアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-3領域のうちF539(疏水性指標:2.8)を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファンおよびチロシンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換し、第2-2領域のうちM763(疏水性指標:1.9)および/またはA764(疏水性指標:1.8)をそれぞれ疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるシステイン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、およびバリンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-3領域のうちF539(疏水性指標:2.8)を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるセリン(疏水性指標:-0.8)で置換し、第2-2領域のうちM763(疏水性指標:1.9)を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるイソロイシン(疏水性指標:4.5)で置換したSpCas9変異体であり得る。
他の一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-3領域のうちI601(疏水性指標:4.5)を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換し、第2-3領域のうちD965(疏水性指標:-3.5)を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるアラニン、システイン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-3領域のうちI601(疏水性指標:4.5)を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるアスパラギン(疏水性指標:-3.5)で置換し、第2-3領域のうちD965(疏水性指標:-3.5)を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるチロシン(疏水性指標:-1.3)で置換したSpCas9変異体であり得る。
また、他の一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-3領域のうちF539(疏水性指標:2.8)を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、およびチロシンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換し、第2-2領域のうちM763(疏水性指標:1.9)および/またはA764(疏水性指標:1.8)をそれぞれ疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるシステイン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、およびバリンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換し、第2-4領域のうちE1107(疏水性指標:-3.5)を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるアラニン、システイン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-3領域のうちF539(疏水性指標:2.8)を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるセリン(疏水性指標:-0.8)で置換し、第2-2領域のうちM763(疏水性指標:1.9)を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるイソロイシン(疏水性指標:4.5)で置換し、第2-4領域のうちE1007(疏水性指標:-3.5)を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるロイシン(疏水性指標:3.8)で置換したSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸、および第3領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸をそれぞれ他のアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-3領域のうちF539(疏水性指標:2.8)を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、およびチロシンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換し、第3-1領域のうちK890を、電荷を有さないアミノ酸であるアラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-3領域のうちF539(疏水性指標:2.8)を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるセリン(疏水性指標:-0.8)で置換し、第3-1領域のうちK890を、電荷を有さないアミノ酸であるアスパラギンで置換したSpCas9変異体であり得る。
他の一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-3領域のうちF539および/またはI601をそれぞれ極性を有するアミノ酸であるアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、リジン、セリン、トレオニン、およびチロシンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換し、第3-1領域のうちK890(疏水性指標:-3.9)を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-3領域のうちF539およびI601をそれぞれ極性を有するアミノ酸であるトレオニンおよびグルタミン酸で置換し、第3-1領域のうちK890(疏水性指標:-3.9)を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるアスパラギン(疏水性指標:-3.5)で置換したSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸、および第4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸をそれぞれ他のアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域のうちA203(疏水性指標:1.8)を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、およびチロシンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換し、第4-1領域のうちT1102を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、リジン、プロリン、セリン、トリプトファンおよびチロシンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域のうちA203(疏水性指標:1.8)を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるアスパラギン酸(疏水性指標:-3.5)で置換し、第4-1領域のうちT1102(疏水性指標:-0.7)を疏水性指標が相対的に小さいプロリン(疏水性指標:-1.6)で置換したSpCas9変異体であり得る。
一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-3領域のうちF539(疏水性指標:2.8)を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、およびチロシンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換し、第4-1領域のうちD1127を相対的に大きい官能基を有するアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-3領域のうちF539(疏水性指標:2.8)を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるセリン(疏水性指標:-0.8)で置換し、第4-1領域のうちD1127を相対的に大きい官能基を有するグルタミン酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸、および第3領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸をそれぞれ他のアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-2領域のうちM763(疏水性指標:1.9)および/またはA764(疏水性指標:1.8)をそれぞれ疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるシステイン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニンおよびバリンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換し、第3-1領域のうちK890を、電荷を有さないアミノ酸であるアラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-2領域のうちM763(疏水性指標:1.9)を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるイソロイシン(疏水性指標:4.5)で置換し、第3-1領域のうちK890を、電荷を有さないアミノ酸であるアスパラギンで置換したSpCas9変異体であり得る。
他の一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-4領域のうちE1007および第3-1領域のうちK890をそれぞれ電荷を有さないアミノ酸であるアラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-2領域のうちE1007を、電荷を有さないアミノ酸であるプロリンで置換し、第3-1領域のうちK890を、電荷を有さないアミノ酸であるアスパラギンで置換したSpCas9変異体であり得る。
他の一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-2領域のうちM763(疏水性指標:1.9)および/または第2-4領域のうちE1007(疏水性指標:-3.5)をそれぞれ疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるシステイン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、およびバリンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換し、および第3-1領域のうちK890を、電荷を有さないアミノ酸であるアラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-2領域のうちM763(疏水性指標:1.9)を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるイソロイシン(疏水性指標:4.5)で置換し、第2-4領域のうちE1007を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるロイシン(疏水性指標:3.8)で置換し、第3-1領域のうちK890を、電荷を有さないアミノ酸であるアスパラギンで置換したSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸、および第4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸をそれぞれ他のアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-2領域のうちM763(疏水性指標:1.9)および/またはA764(疏水性指標:1.8)をそれぞれ疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるシステイン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、およびバリンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換し、第4-1領域のうちT1102を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、リジン、プロリン、セリン、トリプトファン、およびチロシンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-2領域のうちM763(疏水性指標:1.9)を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるイソロイシン(疏水性指標:4.5)で置換し、第4-1領域のうちT1102(疏水性指標:-0.7)を疏水性指標が相対的に小さいプロリン(疏水性指標:-1.6)で置換したSpCas9変異体であり得る。
他の一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-4領域のうちF1037および/またはF1038をそれぞれ極性を有するアミノ酸であるアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、リジン、セリン、トレオニン、およびチロシンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換し、第4-1領域のうちD1127を相対的に大きい官能基を有するアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第2-4領域のうちF1038を、極性を有するアミノ酸であるチロシンで置換し、第4-1領域のうちD1127を相対的に大きい官能基を有するグルタミン酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第3領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸、および第4領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸をそれぞれ他のアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第3-1領域のうちK890を、電荷を有さないアミノ酸であるアラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換し、第4-1領域のうちT1102を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、リジン、プロリン、セリン、トリプトファン、およびチロシンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第3-1領域のうちK890を、電荷を有さないアミノ酸であるアスパラギンで置換し、第4-1領域のうちT1102(疏水性指標:-0.7)を疏水性指標が相対的に小さいプロリン(疏水性指標:-1.6)で置換したSpCas9変異体であり得る。
他の一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第3-1領域のうちK890(疏水性指標:-3.9)を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換し、第4-1領域のうちD1127を相対的に大きい官能基を有するアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第3-1領域のうちK890(疏水性指標:-3.9)を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるアスパラギン(疏水性指標:-3.5)で置換し、第4-1領域のうちD1127を相対的に大きい官能基を有するグルタミン酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸、第2領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸、および/または第3領域内のアミノ酸配列のうち選択された1つ以上のアミノ酸をそれぞれ他のアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-3領域のうちF539(疏水性指標:2.8)を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、およびチロシンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換し、第2-2領域のうちM763(疏水性指標:1.9)および/または第2-4領域のうちE1007(疏水性指標:-3.5)をそれぞれ疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるシステイン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、およびバリンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換し、および第3-1領域のうちK890(疏水性指標:-3.9)を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-3領域のうちF539(疏水性指標:2.8)を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるセリン(疏水性指標:-0.8)で置換し、第2-2領域のうちM763(疏水性指標:1.9)および第2-4領域のうちE1007(疏水性指標:-3.5)をそれぞれ疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるイソロイシン(疏水性指標:4.5)およびロイシン(疏水性指標:3.8)で置換し、および第3-1領域のうちK890(疏水性指標:-3.9)を疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるアスパラギン(疏水性指標:-3.5)で置換したSpCas9変異体であり得る。
他の一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-3領域のうちF539および/またはI601、および第2-4領域のうちF1037および/またはF1038をそれぞれ極性を有するアミノ酸であるアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、リジン、セリン、トレオニン、およびチロシンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換し、および第3-1領域のうちK890を、電荷を有さないアミノ酸であるアラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換し、第4-1領域のうちT1102を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、リジン、プロリン、セリン、トリプトファン、およびチロシンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-3領域のうちF539を、極性を有するアミノ酸であるセリンで置換し、第2-4領域のうちF1038を、極性を有するアミノ酸であるチロシンで置換し、および第3-1領域のうちK890を、電荷を有さないアミノ酸であるアスパラギンで置換し、第4-1領域のうちT1102を疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるプロリン(疏水性指標:-1.6)で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-3領域のうちI601を、極性を有するアミノ酸であるグルタミン酸で置換し、第2-4領域のうちF1038を、極性を有するアミノ酸であるチロシンで置換し、および第3-1領域のうちK890を、電荷を有さないアミノ酸であるアスパラギンで置換し、第4-1領域のうちT1102を、疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるプロリン(疏水性指標:-1.6)で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-3領域のうちF539および中I601を、それぞれ極性を有するアミノ酸であるセリンおよびアスパラギンで置換し、第2-4領域のうちF1038を、極性を有するアミノ酸であるチロシンで置換し、および第3-1領域のうちK890を、電荷を有さないアミノ酸であるアスパラギンで置換し、第4-1領域のうちT1102を、疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるプロリン(疏水性指標:-1.6)で置換したSpCas9変異体であり得る。
また、他の一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-3領域のうちF539および/またはI601を、それぞれ極性を有するアミノ酸であるアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、リジン、セリン、トレオニン、およびチロシンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換し、第2-2領域のうちM763(疏水性指標:1.9)および/または第2-4領域のうちE1007(疏水性指標:-3.5)を、それぞれ疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるシステイン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、およびバリンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換し、および第3-1領域のうちK890を、電荷を有さないアミノ酸であるアラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-3領域のうちI601を、極性を有するアミノ酸であるアスパラギンで置換し、第2-2領域のうちM763(疏水性指標:1.9)を、疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるイソロイシン(疏水性指標:4.5)で置換し、および第3-1領域のうちK890を、電荷を有さないアミノ酸であるアスパラギンで置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-3領域のうちF539および中I601を、それぞれ極性を有するアミノ酸であるセリンおよびアスパラギンで置換し、第2-2領域のうちM763(疏水性指標:1.9)および第2-4領域のうちE1007(疏水性指標:-3.5)を、それぞれ疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるイソロイシン(疏水性指標:4.5)およびロイシン(疏水性指標:3.8)で置換し、および第3-1領域のうちK890を、電荷を有さないアミノ酸であるアスパラギンで置換したSpCas9変異体であり得る。
他の一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域のうちA203(疏水性指標:1.8)を、疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、およびチロシンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換し、第2-2領域のうちM763(疏水性指標:1.9)および/またはA764(疏水性指標:1.8)を、それぞれ疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるシステイン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、およびバリンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換し、および第3-1領域のうちK890を、電荷を有さないアミノ酸であるアラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域のうちA203(疏水性指標:1.8)を、疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるアスパラギン酸(疏水性指標:-3.5)で置換し、第2-2領域のうちM763(疏水性指標:1.9)を、疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるイソロイシン(疏水性指標:4.5)で置換し、第2-4領域のうちF1038を、極性を有するアミノ酸であるチロシンで置換し、および第3-1領域のうちK890を、電荷を有さないアミノ酸であるアスパラギンで置換したSpCas9変異体であり得る。
また、他の一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-3領域のうちI601(疏水性指標:4.5)を、疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換し、第2-3領域のうちD965(疏水性指標:-3.5)を、疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるアラニン、システイン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換し、および第4-1領域のうちT1102を、疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、リジン、プロリン、セリン、トリプトファンおよびチロシンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-3領域のうちI601(疏水性指標:4.5)を、疏水性指標が相対的に小さいアミノ酸であるアスパラギン(疏水性指標:-3.5)で置換し、第2-2領域のうちM763(疏水性指標:1.9)を、疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるイソロイシン(疏水性指標:4.5)で置換し、第2-3領域のうちD965(疏水性指標:-3.5)を、疏水性指標が相対的に大きいアミノ酸であるチロシン(疏水性指標:-1.3)で置換し、および第4-1領域のうちT1102(疏水性指標:-0.7)を、疏水性指標が相対的に小さいプロリン(疏水性指標:-1.6)で置換したSpCas9変異体であり得る。
一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域のうちA203、N277、第1-2領域のうちG366、および第1-3領域のうちF539、I601からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を相対的に小さいか、または大きい官能基を有するアミノ酸で置換し、第2-2領域のうちM763および第2-4領域のうちE1007,F1038からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を、相対的に小さいか、または大きい官能基を有するアミノ酸で置換し、第3-1領域のうちK890を、電荷を有さないアミノ酸で置換し、第4-1領域のうちT1102およびD1127からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を、相対的に小さいか、または大きい官能基を有するアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-3領域のうちG366および第1-3領域のうちF539、I601を、それぞれセリン(相対的に大きい官能基を有するアミノ酸)、セリン(相対的に小さい官能基を有するアミノ酸)、およびアスパラギン(相対的に大きい官能基を有するアミノ酸)で置換し、第2-2領域のうちM763および第2-4領域のうちE1007を、それぞれイソロイシン(相対的に小さい官能基を有するアミノ酸)およびロイシン(相対的に小さい官能基を有するアミノ酸)で置換し、第3-1領域のうちK890を、電荷を有さないアスパラギンで置換し、第4-1領域のうちD1127を、相対的に大きい官能基を有するグルタミン酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9の第1-1領域のうちA203、N277、第1-3領域のうちG366、および第1-3領域のうちF539、I601を、それぞれアスパラギン酸(相対的に大きい官能基を有するアミノ酸)、ヒスチジン(相対的に大きい官能基を有するアミノ酸)、セリン(相対的に大きい官能基を有するアミノ酸)、セリン(相対的に小さい官能基を有するアミノ酸)、およびアスパラギン(相対的に大きい官能基を有するアミノ酸)で置換し、第2-2領域のうちM763および第2-4領域のうちE1007、F1038を、それぞれイソロイシン(相対的に小さい官能基を有するアミノ酸)、ロイシン(相対的に小さい官能基を有するアミノ酸)、およびチロシン(相対的に大きい官能基を有するアミノ酸)で置換し、第3-1領域のうちK890を、電荷を有さないアスパラギンで置換し、第4-1領域のうちT1102およびD1127を、それぞれプロリン(相対的に小さい官能基を有するアミノ酸)およびグルタミン酸(相対的に大きい官能基を有するアミノ酸)で置換したSpCas9変異体であり得る。
本明細書によって開示されるTS-SpCas9の一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のF539、M763、K890および/またはE1007を他のアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のF539をアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、およびチロシンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のF539をセリンで置換したSpCas9変異体であり得る。この時、上記F539をセリンで置換したTS-SpCas9(F539S)は、野生型SpCas9と比較してSpCas9(F539S)のRECドメインと標的配列および/またはgRNAのPAM distal endとの相互作用が変化したSpCas9変異体であり得る。
一実施例として、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のM763をシステイン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、およびバリンからなる群より選択される1つのアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のM763をイソロイシンで置換したSpCas9変異体であり得る。この時、上記M763をイソロイシンで置換したTS-SpCas9(M763I)は、野生型SpCas9と比較してSpCas9(M763I)のRuvCドメインと金属との相互作用が変化したSpCas9変異体であり得る。
一実施例として、上記SpCas9は、野生型SpCas9のK890をアラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンで置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記SpCas9は、野生型SpCas9のK890をアスパラギンで置換したSpCas9変異体であり得る。この時、上記K890をアスパラギンで置換したTS-SpCas9(K890N)は、野生型SpCas9と比較してSpCas9(K890N)のHNHドメインと金属との相互作用が変化したSpCas9変異体であり得る。
一実施例として、上記SpCas9は、野生型SpCas9のE1007をアラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンで置換したSpCas9変異体であり得る。
例えば、上記SpCas9は、野生型SpCas9のE1007をロイシンで置換したSpCas9変異体(配列番号28)であり得る。この時、上記E1007をロイシンで置換したTS-SpCas9(E1007L)は、野生型SpCas9と比較してSpCas9(E1007L)のエンドキャッピングループ(end-capping loop)とgRNA-標的配列ヘテロ二本鎖(heteroduplex)のPAM(Protospacer adjacent motif)と遠位端部位(PAM distal end)と相互作用が変化したSpCas9変異体である。
例えば、上記SpCas9は、野生型SpCas9のE1007をプロリンで置換したSpCas9変異体(配列番号29)であり得る。この時、上記E1007をプロリンで置換したTS-SpCas9(E1007P)は、野生型SpCas9と比較してSpCas9(E1007P)のエンドキャッピングループ(end-capping loop)とgRNA-標的配列ヘテロ二本鎖(heteroduplex)のPAM(Protospacer adjacent motif)と遠位端部位(PAM distal end)と相互作用が変化したSpCas9変異体である。
他の一実施例として、上記SpCas9は、野生型SpCas9のF539およびM763をそれぞれ本来のアミノ酸と異なるアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
この時、上記のそれぞれ本来のアミノ酸と異なるアミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸であり得る。
例えば、上記SpCas9は、野生型SpCas9のF539およびM763をそれぞれセリンおよびイソロイシンで置換したSpCas9変異体であり得る。この時、上記F539およびM763をそれぞれセリンおよびイソロイシンで置換したTS-SpCas9(F539S、M763I)は、野生型SpCas9と比較してSpCas9(F539S、M763I)のRECドメインと標的配列および/またはgRNAのPAM distal endとの相互作用が変化し、SpCas9(F539S、M763I)のRuvCドメインと金属との相互作用が変化したSpCas9変異体であり得る。
また、他の一実施例として、上記SpCas9は、野生型SpCas9のF539およびK890をそれぞれ本来のアミノ酸と異なるアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
この時、上記のそれぞれ本来のアミノ酸と異なるアミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸であり得る。
例えば、上記SpCas9は、野生型SpCas9のF539およびK890をそれぞれセリンおよびアスパラギンで置換したSpCas9変異体であり得る。この時、上記F539およびK890をそれぞれセリンおよびアスパラギンで置換したTS-SpCas9(F539S、K890N)は、野生型SpCas9と比較してSpCas9(F539S、K890N)のRECドメインと標的配列および/またはgRNAのPAM distal endとの相互作用が変化し、SpCas9(F539S、K890N)のHNHドメインと金属との相互作用が変化したSpCas9変異体であり得る。
また、他の一実施例として、上記SpCas9は、野生型SpCas9のF539およびE1007をそれぞれ本来のアミノ酸と異なるアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
この時、上記のそれぞれ本来のアミノ酸と異なるアミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸であり得る。
例えば、上記SpCas9は、野生型SpCas9のF539およびE1007をそれぞれセリンおよびロイシンで置換したSpCas9変異体であり得る。この時、上記F539およびE1007をそれぞれセリンおよびロイシンで置換したTS-SpCas9(F539S、E1007L)は、野生型SpCas9と比較してSpCas9(F539S、E1007L)のRECドメインと標的配列および/またはgRNAのPAM distal endとの相互作用が変化し、SpCas9(F539S、E1007L)のエンドキャッピングループ(end-capping loop)とgRNA-標的配列ヘテロ二本鎖(heteroduplex)のPAM(Protospacer adjacent motif)と遠位端部位(PAM distal end)と相互作用が変化したSpCas9変異体である。
他の一実施例として、上記SpCas9は、野生型SpCas9のM763およびK890をそれぞれ本来のアミノ酸と異なるアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
この時、上記のそれぞれ本来のアミノ酸と異なるアミノ酸は、アラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸であり得る。
例えば、上記SpCas9は、野生型SpCas9のM763およびK890をそれぞれイソロイシンおよびアスパラギンで置換したSpCas9変異体であり得る。この時、上記M763およびK890をそれぞれイソロイシンおよびアスパラギンで置換したTS-SpCas9(M763I、K890N)は、野生型SpCas9と比較してSpCas9(M763I、K890N)のRuvCドメインと金属との相互作用が変化し、SpCas9(M763I、K890N)のHNHドメインと金属との相互作用が変化したSpCas9変異体であり得る。
また、他の一実施例として、上記SpCas9は、野生型SpCas9のM763およびE1007をそれぞれ本来のアミノ酸と異なるアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
この時、上記のそれぞれ本来のアミノ酸と異なるアミノ酸は、アラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸であり得る。
例えば、上記SpCas9は、野生型SpCas9のM763およびE1007をそれぞれイソロイシンおよびロイシンで置換したSpCas9変異体であり得る。この時、上記M763およびE1007をそれぞれイソロイシンおよびロイシンで置換したTS-SpCas9(M763I、E1007L)は、野生型SpCas9と比較してSpCas9(M763I、E1007L)のRuvCドメインと金属との相互作用が変化し、SpCas9(M763I、E1007L)のエンドキャッピングループ(end-capping loop)とgRNA-標的配列ヘテロ二本鎖(heteroduplex)のPAM(Protospacer adjacent motif)と遠位端部位(PAM distal end)と相互作用が変化したSpCas9変異体である。
また、他の一実施例として、上記SpCas9は、野生型SpCas9のK890およびE1007をそれぞれ本来のアミノ酸と異なるアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
この時、上記のそれぞれ本来のアミノ酸と異なるアミノ酸は、アラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸であり得る。
例えば、上記SpCas9は、野生型SpCas9のK890およびE1007をそれぞれアスパラギンおよびロイシンで置換したSpCas9変異体であり得る。この時、上記K890およびE1007をそれぞれアスパラギンおよびロイシンで置換したTS-SpCas9(K890N、E1007L)は、野生型SpCas9と比較してSpCas9(K890N、E1007L)のHNHドメインと金属との相互作用が変化し、SpCas9(K890N、E1007L)のエンドキャッピングループ(end-capping loop)とgRNA-標的配列ヘテロ二本鎖(heteroduplex)のPAM(Protospacer adjacent motif)と遠位端部位(PAM distal end)と相互作用が変化したSpCas9変異体である。
一実施例として、上記SpCas9は、野生型SpCas9のF539、M763およびK890をそれぞれ本来のアミノ酸と異なるアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
この時、上記のそれぞれ本来のアミノ酸と異なるアミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸であり得る。
例えば、上記SpCas9は、野生型SpCas9のF539、M763およびK890をそれぞれセリン、イソロイシンおよびアスパラギンで置換したSpCas9変異体(配列番号30)であり得る。この時、上記F539、M763およびK890をそれぞれセリン、イソロイシンおよびアスパラギンで置換したTS-SpCas9(F539S、M763I、K890N)は、野生型SpCas9と比較してSpCas9(F539S、M763I、K890N)のRECドメインと標的配列および/またはgRNAのPAM distal endとの相互作用が変化し、SpCas9(F539S、M763I、K890N)のRuvCドメインと金属との相互作用が変化し、SpCas9(F539S、M763I、K890N)のHNHドメインと金属との相互作用が変化したSpCas9変異体であり得る。
他の一実施例として、上記SpCas9は、野生型SpCas9のF539、M763およびE1007をそれぞれ本来のアミノ酸と異なるアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
この時、上記のそれぞれ本来のアミノ酸と異なるアミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸であり得る。
例えば、上記SpCas9は、野生型SpCas9のF539、M763およびE1007をそれぞれセリン、イソロイシンおよびロイシンで置換したSpCas9変異体であり得る。この時、上記F539、M763およびE1007をそれぞれセリン、イソロイシンおよびロイシンで置換したTS-SpCas9(F539S、M763I、E1007L)は、野生型SpCas9と比較してSpCas9(F539S、M763I、E1007L)のRECドメインと標的配列および/またはgRNAのPAM distal endとの相互作用が変化し、SpCas9(F539S、M763I、E1007L)のRuvCドメインと金属との相互作用が変化し、SpCas9(F539S、M763I、E1007L)のエンドキャッピングループ(end-capping loop)とgRNA-標的配列ヘテロ二本鎖(heteroduplex)のPAM(Protospacer adjacent motif)と遠位端部位(PAM distal end)と相互作用が変化したSpCas9変異体である。
他の一実施例として、上記SpCas9は、野生型SpCas9のM763、K890およびE1007をそれぞれ本来のアミノ酸と異なるアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
この時、上記のそれぞれ本来のアミノ酸と異なるアミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸であり得る。
例えば、上記SpCas9は、野生型SpCas9のM763、K890およびE1007をそれぞれイソロイシン、アスパラギンおよびロイシンで置換したSpCas9変異体であり得る。この時、上記M763、K890およびE1007をそれぞれアスパラギン、イソロイシンおよびロイシンで置換したTS-SpCas9(M763I、K890N、E1007L)は、野生型SpCas9と比較してSpCas9(M763I、K890N、E1007L)のRuvCドメインと金属との相互作用が変化し、SpCas9(M763I、K890N、E1007L)のHNHドメインと金属との相互作用が変化し、SpCas9(M763I、K890N、E1007L)のエンドキャッピングループ(end-capping loop)とgRNA-標的配列ヘテロ二本鎖(heteroduplex)のPAM(Protospacer adjacent motif)と遠位端部位(PAM distal end)と相互作用が変化したSpCas9変異体である。
また、他の一実施例として、上記SpCas9は、野生型SpCas9のF539、K890およびE1007をそれぞれ本来のアミノ酸と異なるアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
この時、上記のそれぞれ本来のアミノ酸と異なるアミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸であり得る。
例えば、上記SpCas9は、野生型SpCas9のF539、K890およびE1007をそれぞれセリン、アスパラギンおよびロイシンで置換したSpCas9変異体であり得る。この時、上記F539、K890およびE1007をそれぞれセリン、アスパラギンおよびロイシンで置換したTS-SpCas9(F539S、K890N、E1007L)は、野生型SpCas9と比較してSpCas9(F539S、K890N、E1007L)のRECドメインと標的配列および/またはgRNAのPAM distal endとの相互作用が変化し、SpCas9(F539S、K890N、E1007L)のHNHドメインと金属との相互作用が変化し、SpCas9(F539S、K890N、E1007L)のエンドキャッピングループ(end-capping loop)とgRNA-標的配列ヘテロ二本鎖(heteroduplex)のPAM(Protospacer adjacent motif)と遠位端部位(PAM distal end)と相互作用が変化したSpCas9変異体である。
他の一実施例として、上記SpCas9は、野生型SpCas9のF539、M763、K890、およびE1007をそれぞれ本来のアミノ酸と異なるアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
この時、上記のそれぞれ本来のアミノ酸と異なるアミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸であり得る。
例えば、上記SpCas9は、野生型SpCas9のF539、M763、K890、およびE1007をそれぞれセリン、イソロイシン、アスパラギンおよびロイシンで置換したSpCas9変異体(配列番号31)であり得る。この時、上記F539、M763、K890、およびE1007をそれぞれセリン、イソロイシン、アスパラギンおよびロイシンで置換したTS-SpCas9(F539S、M763I、K890N、E1007L)は、野生型SpCas9と比較してSpCas9(F539S、M763I、K890N、E1007L)のRECドメインと標的配列および/またはgRNAのPAM distal endとの相互作用が変化し、SpCas9(F539S、M763I、K890N、E1007L)のRuvCドメインと金属との相互作用が変化し、SpCas9(F539S、M763I、K890N、E1007L)のHNHドメインと金属との相互作用が変化し、SpCas9(F539S、M763I、K890N、E1007L)のエンドキャッピングループ(end-capping loop)とgRNA-標的配列ヘテロ二本鎖(heteroduplex)のPAM(Protospacer adjacent motif)と遠位端部位(PAM distal end)と相互作用が変化したSpCas9変異体である。
例えば、上記SpCas9は、野生型SpCas9のF539、M763、K890、およびE1007をそれぞれセリン、イソロイシン、アスパラギンおよびプロリンで置換したSpCas9変異体(配列番号32)であり得る。この時、上記F539、M763、K890、およびE1007をそれぞれセリン、イソロイシン、アスパラギンおよびプロリンで置換したTS-SpCas9(F539S、M763I、K890N、E1007P)は、野生型SpCas9と比較してSpCas9(F539S、M763I、K890N、E1007P)のRECドメインと標的配列および/またはgRNAのPAM distal endとの相互作用が変化し、SpCas9(F539S、M763I、K890N、E1007P)のRuvCドメインと金属との相互作用が変化し、SpCas9(F539S、M763I、K890N、E1007P)のHNHドメインと金属との相互作用が変化し、SpCas9(F539S、M763I、K890N、E1007P)のエンドキャッピングループ(end-capping loop)とgRNA-標的配列ヘテロ二本鎖(heteroduplex)のPAM(Protospacer adjacent motif)と遠位端部位(PAM distal end)と相互作用が変化したSpCas9変異体である。
本明細書によって開示される内容の一実施例では、上記人為的に操作されたCas9は融合蛋白質であり得る。
上記融合蛋白質(fusion protein)は、標的特異的Cas9と1つ以上の機能的ドメインを含む人為的に生産された蛋白質であり得る。
上記標的特異的Cas9に関する説明は、上記の通りである。
上記機能的ドメインに関する説明は、上記の通りである。
例えば、上記融合蛋白質は、TS-SpCas9とデアミナーゼ(deaminase)を含む人為的に生産された蛋白質であり得る。
この時、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のD10およびE1007をそれぞれ本来のアミノ酸と異なるアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
または、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のD10、F539、M763、K890、およびE1007をそれぞれ本来のアミノ酸と異なるアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
または、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のH840およびE1007をそれぞれ本来のアミノ酸と異なるアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
または、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のF539、M763、H840、K890、およびE1007をそれぞれ本来のアミノ酸と異なるアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
または、上記TS-SpCas9は、野生型SpCas9のD10、F539、M763、H840、K890、およびE1007をそれぞれ本来のアミノ酸と異なるアミノ酸で置換したSpCas9変異体であり得る。
この時、上記デアミナーゼは、アデニンデアミナーゼ(adenine deaminase)および/またはシチジンデアミナーゼ(cytidine deaminase)であり得る。
この時、上記融合蛋白質は、TS-SpCas9のN末端にデアミナーゼが融合した形態の人為的に生産された蛋白質であり得る。
または、上記融合蛋白質は、TS-SpCas9のC末端にデアミナーゼが融合した形態の人為的に生産された蛋白質であり得る。
または、上記融合蛋白質は、TS-SpCas9のN末端およびC末端にそれぞれ同じであるか、または異なるデアミナーゼが融合した形態の人為的に生産された蛋白質であり得る。
本明細書によって開示されるCRISPR酵素、人為的に操作されたCRISPR酵素、CRISPR酵素変異体、Cas9、人為的に操作されたCas9、Cas9変異体、または標的特異的Cas9は、ポリペプチドまたは蛋白質であり得る。
本明細書によって開示されるCRISPR酵素、人為的に操作されたCRISPR酵素、CRISPR酵素変異体、Cas9、人為的に操作されたCas9、Cas9変異体、または標的特異的Cas9は、ポリペプチドまたは蛋白質をコードしたヌクレオチド配列を有する核酸であり得る。
上記CRISPR酵素、人為的に操作されたCRISPR酵素、CRISPR酵素変異体、Cas9、人為的に操作されたCas9、Cas9変異体、または標的特異的Cas9を導入しようとする対象に合わせてコドン最適化(codon optimization)されてもよい。
「コドン最適化」とは、固有の配列の少なくとも1つのコドンを、宿主細胞の遺伝子においてより頻繁または最も頻繁に使用されるコドンに置き換えながら、固有のアミノ酸配列を維持することによって関心宿主細胞での発現の増強のために核酸配列を変形させる過程を意味する。様々な種は特定のアミノ酸の特定のコドンに対する特定のバイアスを有し、コドンバイアス(有機体間のコドン使用の差)はしばしばmRNAの翻訳の効率と相関し、これは翻訳されるコドンの特性および特定のtRNA分子の利用可能性によって左右されると考えられる。細胞から選択されるtRNAの優勢は、一般に、ペプチド合成に最も頻繁に使用されるコドンを反映している。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて所与の有機体における最適な遺伝子発現のためにカスタマイズすることができる。
上記ポリペプチドまたは蛋白質をコードしたヌクレオチド配列を有する核酸は、非ベクターの形態であり得る。
上記非ベクターは、naked DNA、DNA複合体、またはmRNAであり得る。
上記ポリペプチドまたは蛋白質をコードしたヌクレオチド配列を有する核酸は、ベクターに含まれてもよい。
この時、上記ポリペプチドまたは蛋白質をコードしたヌクレオチド配列を有する核酸は、1つのベクターに含まれてもよい。または、ポリペプチドまたは蛋白質をコードしたヌクレオチド配列を有する核酸が分割されていくつかのベクターに含まれてもよい。
上記ベクターは、プラスミドであり得る。
上記ベクターは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターであり得る。
上記ベクターは、1つ以上の調節/制御成分を含むことができる。
この時、上記調節/制御成分は、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化信号、コザック共通(Kozak consensus)配列、内部リボソーム侵入部位(internal ribosome entry site,IRES)、スプルライスアクセプタおよび/または2A配列を含むことができる。
上記プロモーターは、RNAポリメラーゼIIによって認識されるプロモーターであり得る。
上記プロモーターは、RNAポリメラーゼIIIによって認識されるプロモーターであり得る。
上記プロモーターは、誘導性プロモーターであり得る。
上記プロモーターは、対象特異的プロモーターであり得る。
上記プロモーターは、ウイルスプロモーターまたは非ウイルスプロモーターであり得る。
上記プロモーターは、制御領域(ポリペプチドまたは蛋白質をコードする核酸)に従って適切なプロモーターを利用することができる。
例えば、CRISPR酵素のために有用なプロモーターは、CMV、EF-1a、EFS、MSCV、PGK、またはCAGプロモーターであり得る。
ベクターは、ウイルスベクターまたは再組合ウイルスベクターであり得る。
上記ウイルスは、DNAウイルスまたはRNAウイルスであり得る。
この時、上記DNAウイルスは、二本鎖DNA(dsDNA)ウイルスまたは一本鎖DNA(ssDNA)ウイルスであり得る。
この時、上記RNAウイルスは、一本鎖RNA(ssRNA)ウイルスであり得る。
上記ウイルスは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、または単純ヘルペスウイルスであり得るが、これらに限定されない。
一般に、ウイルスは、宿主(例えば、細胞)を感染させて、宿主内にウイルスの遺伝情報をコードする核酸を導入するか、または宿主のゲノム内に遺伝情報をコードする核酸を挿入させることができる。このような特徴を有するウイルスを利用して対象内にガイド核酸および/またはエディター蛋白質を導入させることができる。ウイルスを利用して導入されたCRISPR酵素は、対象(例えば、細胞)において一時的に発現され得る。または、ウイルスを利用して導入されたCRISPR酵素は、対象(例えば、細胞)において長期間(例えば、1週間、2週間、3週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、9ヶ月、1年、2年、または永久的)持続的に発現され得る。
ウイルスのパッケージング能力は、少なくとも2kbないし50kbで、ウイルスの種類によって異なり得る。このようなパッケージング能力に応じて、CRISPR酵素を単独で含むウイルスベクターを設計するか、またはCRISPR酵素および追加的にgRNAを含むウイルスベクターを設計することができる。または、CRISPR酵素、gRNA、および追加成分を含むウイルスベクターを設計することができる。
一例として、CRISPR酵素をコードする核酸は、再組合レンチウイルスベクターに含まれ得る。
別の例として、CRISPR酵素をコードする核酸は、再組合アデノウイルスベクターに含まれ得る。
また、他の一例として、CRISPR酵素をコードする核酸は、再組合AAVベクターに含まれ得る。
別の例として、CRISPR酵素をコードする核酸は、ハイブリッドウイルス、例えば、本明細書に記載したウイルスの中の1つ以上のハイブリッドベクターに含まれ得る。
本明細書によって開示される一実施例では、CRISPR酵素変異体および/またはCas9変異体を使用するために、これをコーディングする核酸からそれを発現させることができる。これは様々な方式で実行されることができる。例えば、CRISPR酵素変異体および/またはCas9変異体をコーディングする核酸を、複製および/または発現のための原核または真核細胞に形質転換させるために中間体ベクターでクローニングすることができる。CRISPR酵素変異体および/またはCas9変異体を生産するために、CRISPR酵素変異体および/またはCas9変異体をコーディングする核酸を保存または操作するために、中間体ベクターは、典型的に原核生物ベクター、例えばプラスミド、またはシャトルベクター、または昆虫ベクターである。CRISPR酵素変異体および/またはCas9変異体をコーディングする核酸をまた植物細胞、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞またはヒト細胞、真菌細胞、細菌細胞、または原生動物細胞に投与するために発現ベクターでクローニングすることができる。
発現を達成するために、典型的にCRISPR酵素変異体および/またはCas9変異体をコーディングする配列を、転写を指示するプロモーターを含む発現ベクターにサブクローニングする。操作された蛋白質を発現させるための細菌発現システムは、例えば、大腸菌(E.coli)、バチルス(Bacillus)種、およびサルモネラ(Salmonella)から得ることができる。このような発現システムのためのキットは市販されている。哺乳動物細胞、酵母、および昆虫細胞のための真核細胞発現システムは、関連技術分野で周知されており、また市販されている。
核酸発現を指示するために使用されるプロモーターは、特定の適用に依存する。例えば、典型的に強力な構成プロモーターは、融合蛋白質の発現および増殖のために使用される。対照的に、CRISPR酵素変異体および/またはCas9変異体を遺伝子調節のために生体内に投与する場合には、CRISPR酵素変異体および/またはCas9変異体の特定の用途に応じて構成または誘導プロモーターが使用され得る。また、CRISPR酵素変異体および/またはCas9変異体の投与に好ましいプロモーターは、弱いプロモーター、例えばHSV TKまたは類似の活性を有するプロモーターであり得る。プロモーターは、また転写活性化に反応性である要素、例えば低酸素症反応要素、Gal4反応要素、lac阻害因子反応要素、および小分子制御システム、例えばテトラサイクリン調節システムおよびRU-486システムを含むことができる。
プロモーターに加えて、典型的に発現ベクターは原核細胞または真核細胞である宿主細胞で核酸発現に必要なすべての追加の要素を含む転写ユニットまたは発現カセットを含む。したがって、典型的な発現カセットは、例えばCRISPR酵素変異体および/またはCas9変異体をコーディングする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター、および例えば転写体の効率的なポリアデニル化、転写終結、リボソーム結合部位、または翻訳終結に必要な任意の信号を含む。カセットの追加の要素には、例えばエンハンサーおよびスプライシングされた異種のイントロン信号が含まれ得る。
遺伝子情報を細胞に伝達するための特定の発現ベクターは、CRISPR酵素変異体および/またはCas9変異体の意図的用途、例えば植物、動物、細菌、真菌、原生動物などでの発現と関連して選択される。標準細菌発現ベクターには、プラスミド、例えばpBR322ベースのプラスミド、pSKF、pET23D、および市販のタグ-融合発現システム、例えばGSTおよびLacZが含まれる。
真核細胞ウイルスからの調節要素を含む発現ベクターは、真核細胞発現ベクター、例えばSV40ベクター、乳頭腫ウイルスベクター、およびエプスタインバー(Epstein-Barr)ウイルスから由来したベクターにおいてしばしば使用される。他の例示的な真核細胞ベクターには、pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、バキュロウイルスpDSVE、およびSV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞での発現に有効であると提示されたプロモーターの指示の下で蛋白質発現を許容する任意の他のベクターが含まれる。
CRISPR酵素変異体および/またはCas9変異体を発現するためのベクターは、ガイドRNAの発現を誘導するためのRNA Pol IIIプロモーター、例えばH1、U6または7SKプロモーターを含むことができる。これらのヒトプロモーターは、プラスミドトランスフェクション後の哺乳動物細胞におけるCRISPR酵素変異体および/またはCas9変異体の発現を許容する。
一部の発現システムは、安定にトランスフェクトされた細胞株の選択のためのマーカー、例えばチミジンキナーゼ、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、およびジヒドロ葉酸レダクターゼを有する。ポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモーターの指示の下でgRNAコーディング配列と共に昆虫細胞でバキュロウイルスベクターを使用するような高収率発現システムもまた適切である。
発現ベクターに典型的に含まれる要素には、またE.coliで機能するレプリコン、再組合プラスミドを保有する細菌の選択を許容するために抗生物質耐性をコーディングする遺伝子、および再組合配列の挿入を許容するためにプラスミドの非必須領域にある独特の制限部位を含む。
標準トランスフェクション法を利用して大量の蛋白質を発現する細菌、哺乳動物、酵母または昆虫細胞株を生成し、次に標準技術を利用して精製する(例えば、Colley et al.,1989,J.Biol.Chem.,264:17619-22;Guide to Protein Purification,in Methods in Enzymology,vol.182 (Deutscher,ed.,1990)参考)。真核細胞および原核細胞の形質転換は、標準技術により行われる(例えば、Morrison、1977,J.Bacteriol.132:349-351;Clark-Curtiss & Curtiss,Methods in Enzymology 101:347-362(Wu et al.,eds、1983)参考)。
外来ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入する任意の既知の手順を利用することができる。これらの手順は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リポソーム、マイクロインジェクション、naked DNA、プラスミドベクター、ウイルスベクター、エピソームおよび編入型ベクター、およびクローン化ゲノムDNA、cDNA、合成DNAまたは他の外来遺伝子物質を宿主細胞に導入するための他の広く知られている方法の利用を含む。利用される特定の遺伝子操作手順は、CRISPR酵素変異体および/またはCas9変異体を発現できる宿主細胞に少なくとも1つの遺伝子を首尾よく導入できなければならない。
本明細書によって開示される一実施例では、CRISPR酵素変異体および/またはCas9変異体を発現できるベクターおよび上記ベクターを含む細胞を含むことができる。
(発明を実施するための形態)
以下、実施例により本発明を詳細に説明する。
これらの実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないということは当業者にとって自明であろう。
実施例1.Sniper Cas9変異体
Sniper Cas9は、SpCas9のF539、M763およびK890が変形されたSpCas9変異体(配列番号30)であり(WO2019-009682参考)、下記の実施例は上記Sniper Cas9の標的特異性を向上させるためにSniper Cas9の変異体の開発に関する。
1.Sniper Cas9変異体ライブラリー
Sniper Cas9変異体ライブラリーは、3つの独立的なプロトコルを使用して構築した。1番目のライブラリーの場合、Sniper Cas9プラスミドをXL1-red competent cells (Agilent)に形質導入させ、販売者のマニュアルに従って細胞を培養した。2番目、3番目のライブラリーの場合、Gibson Assemblyで設計されたプリマーを使用して低いエラー率(0~5 mutations/kb)条件下でGenemorph II(Agilent)およびDiversify PCRランダム突然変異誘発キット(Clontech)を使用してSniper Cas9プラスミド配列の全体Original Sniper Cas9でError-prone PCRを実行した。続いて、PCR生成物をゲル精製した。精製されたランダム突然変異されたライブラリーおよびSniper Cas9プラスミドのバックボーンをGibson組み立てた。組み立てられたライブラリーは、EnduraTM electrocompetent cells (Lucigen)に形質導入させ、chloramphenicol LB plates (12.5μg/mL)で37℃で一晩培養した。形質導入された細胞の培養後に、各ライブラリーは、midi prep kit (NucleoBond Xtra Midi EF,Macherey-Nagel)を利用して単離精製した。得られたライブラリーは、マルチターゲットシステムを利用した標的特異的Cas9スクリーニング方法(WO2017-217768参考)を利用して標的特異的Sniper Cas9変異体を選別した。合計4回のスクリーニングのうち、最初のスクリーニングでは、gDNAにtarget insertionがないスクリーニング細胞を利用してon-target activityがあるvariantをselectionし、その後、完全なスクリーニング方法を3回繰り返した(図1)。(inducer条件:10ng/mL anhydroustetracyclin during recovery、0ng/mL during plating)
2.位置飽和突然変異(site-saturation mutagenesis)よって20個のアミノ酸のvariant構築
pBLC-Sniper Cas9プラスミドを鋳型として位置飽和突然変異方法でPCRを実行した後、Forward primer:agtaccccaagctggagagcnnkttcgtgtacggcgactacaagg(配列番号33)、Reverse primer:tcttgatcagggcggtgcc(配列番号34)、DpnI(Enzynomics)、T4 PNK(Enzynomics)、およびT4 Ligase(Enzynomics)を共に処理してconstructを生成した後、DH5alpha大腸菌に形質転換した。100個のcolonyをランダムでSanger sequencingして20個のアミノ酸変異体をそれぞれ得た。
3.標的特異的Cas9変異体をコードしたプラスミド
野生型SpCas9がコードされているプラスミド(p3s-Cas9HC、Addgene plasmid #43945)を購入して標的特異的SpCas9変異体を生成のために利用した。標的特異的SpCas9変異体のためのconstructは、p3s-Cas9HCプラスミドをバックボーンと望む位置に突然変異を含む核酸配列とのGibson組み立てによって生成した。すべてのcontructsは、Sanger sequencingで確認した。このように作られたp3s-Sniper Cas9 plasmidとselectedされたpBLC-Sniper 2.0候補らをPmlI(Enzynomics)とXhoI(Enzynomics)制限酵素処理してp3s-SniperバックボーンとSniper 2.0 insertをそれぞれゲル精製した。精製されたDNAをT4 ligase(Enzynomics)処理してp3s-Sniper 2.0 constructsを生成した。すべてのconstructsはSanger sequencingで確認した。
実施例2.Sniper Cas9変異体の標的遺伝子操作効果
実験方法
1.Cell culture and transfection conditions
1-1.Sniper Cas9変異体およびsgRNA発現プラスミド
HEK293T細胞(ATCC,CRL-11268)を10% FBS(fetal bovine serum)および1%抗生剤が添加されたDMEM培地で培養した。Sniper Cas9変異体によるゲノム操作のために、形質導入を前にHEK293T細胞を24-well plateに70-80% confluencyになるように接種した。500ngのSniper Cas9変異体発現プラスミドおよび500ngのsgRNA発現プラスミドを、lipofectamine 2000(Invitrogen)を使用して細胞に形質導入した。形質導入の72時間後にExgene Cell SV mini(GeneAll)を利用してgenomic DNAを単離抽出した。
1-2.Sniper Cas9変異体およびgRNA (ribonucleoprotein、RNP)
HEK293T細胞(ATCC,CRL-11268)を10% FBS(fetal bovine serum)および1%抗生剤が添加されたDMEM培地で培養した。Sniper Cas9変異体によるゲノム操作のために、形質導入を前にHEK293T細胞を24-well plateに70-80% confluencyになるように接種した。4μgのSniper Cas9変異体および4μgのsgRNAを細胞に導入した。導入後でExgene Cell SV mini(GeneAll)を利用してgenomic DNAを単離抽出した。
2.Targeted deep sequencing
標的位置および潜在的オフターゲット位置は、標的されたディップシークエンシング(targeted deep sequencing)により分析された。ディップシークエンシングライブラリーはPCRによって生成された。TruSeq HT Dual Indexプリマーを各試料にラベルを付けるために使用した。プールライブラリー(pooled libraries)は、MiSeqを使用してpaired-end sequencingを実行した。
実験結果
本実施例において、Sniper Cas9変異体の標的遺伝子操作効果を確認するために様々な遺伝子を標的としてそれぞれ標的遺伝子によるSniper Cas9変異体のindel(%)効果を確認した。
1.Sniper Cas9変異体
上記実施例1の「1.Sniper Cas9変異体ライブラリー」を3回スクリーニングした後に得たそれぞれライブラリーの100個のrandom colonyをSanger sequenceしてAgilent libraryで1個、Clontech libraryで5個、Mutator libraryで2個の変異体を得た(図2)。Agilent libraryでK4、K112、I492、R671およびK735が変異されたSniper Cas9変異体(Ag1)を確認し、Clontech libraryでI350、E1007およびM1021が変異されたSniper Cas9変異体(Cl1)、S1277が変異されたSniper Cas9変異体(Cl2)、E1007がそれぞれ他のアミノ酸に変異された2個のSniper Cas9変異体(Cl3,Cl4)、E1007およびK1192が変異されたSniper Cas9変異体(Cl5)、合計5個のSniper Cas9変異体が確認された。また、Mutator libraryでA889が変異されたSniper Cas9変異体(Mu1)、およびK1191が変異されたSniper Cas9変異体(Mu2)が確認された。それぞれのSniper Cas9変異体を細胞に処理してオンターゲットおよびオフターゲットでのindelを確認した。
その結果、EMX遺伝子を標的遺伝子とした場合、Cl1、Cl3およびCl4 Sniper Cas9変異体がSniper Cas9に比べてオンターゲットでのindelは増加し、オフターゲットでのindelは低下したのを確認した(図3)。上記3つのSniper Cas9変異体は、いずれもE1007の変異を含んでおり、したがって、E1007がCas9の標的特異的活性を高める重要な位置であると判断した。
2.E1007が変異されたSniper Cas9変異体
Sniper Cas9の1007番目のグルタミン酸をどのアミノ酸で置換した場合、Sniper Cas9変異体の標的特異的活性が増加するかを様々なアミノ酸置換により確認した。
その結果、EMX遺伝子(図4)およびDMD遺伝子(図5)を標的遺伝子としてオンターゲットおよびオフターゲットでのindelを確認し、これによってアラニン、アルギニン、ロイシン、プロリン、セリンおよびチロシンを置換アミノ酸候補群に選定した。
E1007をそれぞれのアミノ酸候補群に置換し、matching GX19標的遺伝子(EMX1,FANCF02,ZSCAN2,RUNX1)とmismatching gX19標的遺伝子(DMD,HBB02,HBB03,HBB04)からオンターゲットおよびオフターゲットでのindelを確認した(図6~13)。その結果、E1007がロイシンに置換されたSniper Cas9変異体(配列番号31)またはE1007がプロリンに置換されたSniper Cas9変異体(配列番号32)がオンターゲットでのindelは増加し、オフターゲットでのindelは減少して標的特異性が増加するのを確認した。
また、Sniper Cas9変異体(E1007LまたはE1007P)とsgRNAをRNPで細胞に処理して確認した結果、野生型SpCas9と比較してオンターゲットのindelは増加してオフターゲットのindelは減少して標的特異性が増加したのを確認した(表1).
上記の結果から、Sniper Cas9の1007番目のグルタミン酸が他のアミノ酸で置換されたSniper Cas9変異体がSniper Cas9よりも標的特異性が向上することを確認することができる。
産業上の利用可能性
本発明は、人為的に操作されたCRISPR酵素によって標的特異性が向上したCRISPR-Casシステムをゲノムおよび/またはエピゲノム(epigenome)の操作または変形、ゲノム標的化、ゲノム校正および体外診断などに利用することができる。
配列リストFree Text
野生型SpCas9のアミノ酸配列、各領域のアミノ酸配列、および一実施例の標的特異的SpCas9変異体のアミノ酸配列