WO2020218657A1 - 표적 특이적 crispr 변이체 - Google Patents

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정민희
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Definitions

  • the present invention relates to an artificially engineered CRISPR-Cas9 system. More specifically, the manipulation or modification of the genome and/or epigenome using the artificially engineered CRISPR enzyme with improved target specificity and the artificially engineered CRISPR-Cas9 system comprising the same, genome targeting, genome correction and in vitro diagnosis And the like.
  • the CRISPR-Cas9 system consists of a guide RNA (gRNA) having a sequence complementary to a target gene or nucleic acid and a CRISPR enzyme, a nuclease capable of cleaving the target gene or nucleic acid, and the gRNA and CRISPR enzyme form a CRISPR complex. And, by the formed CRISPR complex, the target gene or nucleic acid is cleaved or modified.
  • gRNA guide RNA
  • CRISPR enzyme a nuclease capable of cleaving the target gene or nucleic acid
  • the non-target gene or nucleic acid is a gene location having a sequence that is partially complementary to the gRNA, and may form a partial complementary bond with the gRNA, and this partial complementary bond is the CRISPR complex at the corresponding gene location, i.e., modified Non-target genes or nucleic acids that are not the target of may be cleaved or modified.
  • CRISPR-Cas9 in order to increase the efficiency of specifically modifying a target gene or nucleic acid using the CRISPR-Cas9 system, or to solve problems such as genetic binding that may be caused by modification of a non-target gene or nucleic acid, CRISPR- It is important to increase the target specificity of the Cas9 system.
  • various studies have been attempted, such as selecting gRNA with few non-target gene candidates and controlling the activity and/or specificity of the CRISPR enzyme.
  • Patent Document 001 WO 2019-009682
  • Patent Document 002 WO 2017-217768
  • Non-Patent Document 0001 Kim, D. et al. Nat Methods 12, 237-243, 231 p following 243 (2015)
  • Non-Patent Document 0003 Kim, S., Kim, D., Cho, S.W., Kim, J. & Kim, J.S. Genome Res 24, 1012-1019 (2014)
  • Non-Patent Document 0004 Cho, S.W. et al. Genome Res 24, 132-141 (2014)
  • Non-Patent Document 0005 Mali, P. et al. Nat Biotechnol 31, 833-838 (2013)
  • Non-Patent Document 0006 Ran, F.A. et al. Cell 154, 1380-1389 (2013)
  • Non-Patent Document 0007 Fu, Y., Sander, J.D., Reyon, D., Cascio, V.M. & Joung, J.K. Nat Biotechnol 32, 279-284 (2014)
  • Non-patent document 0008 Nishimasu, H. et al. Cell 156, 935-949 (2014)
  • Non-Patent Document 0009 Kleinstiver, B.P. et al. Nature 529, 490-495 (2016)
  • Non-Patent Document 0010 Slaymaker, I.M. et al. Science 351, 84-88 (2016)
  • Non-Patent Document 0011 Chen, J.S. et al. Nature (2017)
  • Non-Patent Document 0012 Kleinstiver, B.P. et al. Nat Biotechnol 33, 1293-1298 (2015)
  • Non-Patent Document 0013 Kleinstiver, B.P. et al. Nature 523, 481-485 (2015)
  • Non-Patent Document 0014 Chen, Z. & Zhao, H. Nucleic Acids Res 33, e154 (2005)
  • Non-Patent Document 0016 McKenzie, G.J. & Craig, N.L. BMC Microbiol 6, 39 (2006)
  • Non-Patent Document 001-7 Kulcsar, P.I. et al. Genome Biol 18, 190 (2017)
  • Non-Patent Document 00178 Zhang, D. et al. Genome Biol 18, 191 (2017)
  • Non-Patent Document 0019 Komor, A.C., Kim, Y.B., Packer, M.S., Zuris, J.A. & Liu, D.R. Nature 533, 420-424 (2016)
  • Non-Patent Document 0020 Kim, D., Kim, S., Park, J. & Kim, J.S. Genome Res 26, 406-415 (2016)
  • the present invention relates to an artificially engineered CRISPR enzyme to solve the above problems. More specifically, it relates to Cas9 with improved target specificity for a target gene or nucleic acid and a CRISPR-Cas9 system using the same.
  • the present invention provides an artificially engineered CRISPR enzyme for a specific purpose.
  • the artificially engineered CRISPR enzyme is a SpCas9 variant comprising an artificial manipulation
  • the artificial manipulation is present in the end-capping loop of Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9). It may include artificial manipulation of one or more amino acids.
  • the artificially engineered CRISPR enzyme may be a SpCas9 variant with improved target specificity.
  • the end-capping loop may be a region that interacts with a protospacer adjacent motif (PAM) and a distal end (PAM) of a gRNA-target sequence heteroduplex.
  • PAM protospacer adjacent motif
  • PAM distal end
  • the end-capping loop may be a region composed of an amino acid sequence from the 1001 th tyrosine (Y1001) to the 1030 th glycine (G1030) of SpCas9.
  • the end-capping loop is Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017 of SpCas9. It may include V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029 and G1030.
  • One or more amino acids present in the end-capping loop of SpCas9 are Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014 of SpCas9.
  • V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029 and G1030 It may be one or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the one or more amino acids present in the end-capping loop of SpCas9 may be E1007 of SpCas9.
  • the artificial manipulation may be the deletion of one or more amino acids present in the end-capping loop of SpCas9.
  • the artificial manipulation may be a substitution of one or more amino acids present in the end-capping loop of SpCas9 with another amino acid.
  • the other amino acid may be an amino acid having a relatively small size of a functional group compared to one or more amino acids present in an end-capping loop of SpCas9.
  • the “functional group” is an element constituting an amino acid together with amine (-NH2) and carboxy (-COOH), and the properties of the amino acid may vary depending on the type and position of the functional group.
  • Functional groups are also called side chains or side chains.
  • the other amino acid may be an amino acid having a relatively large size of a functional group compared to one or more amino acids present in an end-capping loop of SpCas9.
  • the other amino acid may be an amino acid having a relatively large hydropathy index compared to one or more amino acids present in an end-capping loop of SpCas9.
  • the other amino acid may be an amino acid having a relatively small hydropathy index compared to one or more amino acids present in an end-capping loop of SpCas9.
  • the other amino acid may be an amino acid whose charge of a functional group is a neutral charge at a physiological pH (pH 7.4).
  • the SpCas9 variant may further include artificial modification of one or more amino acids selected from the group consisting of A203, N277, G366, F539, I601, M763, K890, D965, F1038, T1102 and D1127.
  • the SpCas9 variant may further include artificial modifications of F539, M763 and K890.
  • the SpCas9 variant may be a target specific SpCas9 (TS-SpCas9) variant comprising artificial manipulation of the 1007th glutamic acid of SpCas9.
  • TS-SpCas9 target specific SpCas9
  • the artificial manipulation may be the removal of glutamic acid at position 1007 of SpCas9 or substitution with another amino acid.
  • the other amino acid may be an amino acid having a relatively large or small functional group size compared to the 1007th glutamic acid of SpCas9.
  • the other amino acid may be an amino acid having a relatively large or small hydrophobicity index compared to the 1007th glutamic acid of SpCas9.
  • the other amino acid may be an amino acid having a neutral charge at a physiological pH (pH 7.4).
  • the other amino acid may be leucine or proline.
  • the TS-SpCas9 variant may further include artificial modification of one or more amino acids selected from the group consisting of A203, N277, G366, F539, I601, M763, K890, D965, F1038, T1102 and D1127.
  • the TS-SpCas9 variant may further include artificial modifications of F539, M763 and K890.
  • the artificially engineered CRISPR enzyme may be a fusion protein comprising the TS-SpCas9 variant.
  • the fusion protein may include one or more functional domains.
  • the functional domain is methylase activity, dimethylase activity, transcription activation activity, transcription repression activity, transcription release factor activity , A domain having histone modification activity, RNA cleavage activity or nucleic acid binding activity; A tag or reporter gene for separation and purification of proteins (including peptides); Nuclear localization sequence or signal (NLS) or nuclear export sequence or signal (NES); And it may be at least one selected from the group consisting of deaminase.
  • the artificially engineered CRISPR enzyme may be in the form of a nucleic acid encoding the SpCas9 variant, the TS-SpCas9 variant and/or the fusion protein.
  • the nucleic acid may be included in a vector.
  • the nucleic acid encoding the SpCas9 variant, the TS-SpCas9 variant and/or the fusion protein may be introduced into a cell.
  • a vector containing a nucleic acid encoding the SpCas9 variant, the TS-SpCas9 variant and/or the fusion protein may be introduced into a cell.
  • the SpCas9 variant, TS-SpCas9 variant and/or fusion protein can be used with gRNA to artificially manipulate the genome of a cell.
  • the gRNA may be a nucleic acid comprising a nucleotide sequence complementary to a target sequence of a target gene present in the genome of the cell.
  • the CRISPR-Cas system with improved target specificity through an artificially engineered CRISPR enzyme can be used for manipulation or modification of genome and/or epigenome, genome targeting, genome editing, and in vitro diagnosis.
  • 1 is a graph showing the screening results of the Cas9 variant library.
  • 2 is a table listing Cas9 variants obtained after screening of the Cas9 variant library.
  • 3 is a graph showing indels (%) for on-target and off-target of the EMX1 gene of each variant.
  • 5 is a graph showing indels (%) for the on-target and off-target of the DMD gene using the Cas9 variant in which E1007 is substituted with various amino acids.
  • FIG. 6 is a graph showing indels (%) for the on-target and off-target of the EMX1 gene using the Cas9 variant in which E1007 is substituted with alanine, arginine, leucine, proline, serine or tyrosine.
  • FIG. 7 is a graph showing the indel (%) for the on-target and off-target of the FANCF02 gene using the Cas9 variant in which E1007 is substituted with alanine, arginine, leucine, proline, serine or tyrosine.
  • FIG. 9 is a graph showing the indel (%) for the on-target and off-target of the RUNX1 gene using the Cas9 variant in which E1007 is substituted with alanine, arginine, leucine, proline, serine or tyrosine.
  • 10 is a graph showing indels (%) for the on-target and off-target of the DMD gene using the Cas9 variant in which E1007 is substituted with alanine, arginine, leucine, proline, serine or tyrosine.
  • 11 is a graph showing indels (%) for the on-target and off-target of the HBB02 gene using the Cas9 variant in which E1007 is substituted with alanine, arginine, leucine, proline, serine or tyrosine.
  • FIG. 12 is a graph showing indels (%) for the on-target and off-target of the HBB03 gene using the Cas9 variant in which E1007 is substituted with alanine, arginine, leucine, proline, serine or tyrosine.
  • FIG. 13 is a graph showing indels (%) for the on-target and off-target of the HBB04 gene using the Cas9 variant in which E1007 is substituted with alanine, arginine, leucine, proline, serine or tyrosine.
  • One aspect of the subject matter disclosed herein relates to the CRISPR enzyme.
  • CRISPR enzyme is a major protein component of CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)-Cas (CRISPR-associated protein) system, and forms a CRISPR-Cas system by forming a complex with guide RNA (gRNA).
  • CRISPR Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
  • gRNA guide RNA
  • the “gRNA” refers to an RNA capable of specifically targeting a gRNA-CRISPR enzyme complex, that is, a CRISPR complex for a target gene or nucleic acid
  • gRNA is a specific RNA for a target sequence, which binds to the CRISPR enzyme to produce a CRISPR enzyme. It can be directed to a target gene or nucleic acid.
  • the “target sequence” is a nucleotide sequence present in the target gene or nucleic acid, and specifically, is a partial nucleotide sequence of the target region in the target gene or nucleic acid
  • the “target region” is a guide nucleic acid-editor in the target gene or nucleic acid. It is a site that can be modified by proteins.
  • the gRNA may contain multiple domains. Each domain enables intra-strand or inter-strand interaction of the three-dimensional form or the active form of gRNA.
  • gRNA is single-stranded gRNA (single RNA molecule; single gRNA; sgRNA); Or as double gRNA (comprising more than one, typically two separate RNA molecules).
  • the single-stranded gRNA may include a guide domain in a direction from 5′ to 3′, that is, a domain including a guide sequence capable of complementary binding to a target gene or nucleic acid; A first complementary domain; Linking domain; A second complementary domain, a domain capable of forming a double-stranded nucleic acid with the first complementary domain because it has a sequence complementary to the first complementary domain sequence; Proximal domain; And optionally a tail domain.
  • the double gRNA comprises a guide domain, that is, a domain including a guide sequence capable of complementary binding to a target gene or nucleic acid, and a first complementary domain in the 5'to 3'direction.
  • the first strand and a second complementary domain, a domain capable of forming a double-stranded nucleic acid with the first complementary domain because it has a sequence complementary to the first complementary domain sequence, a proximal domain.
  • a second strand comprising a tail domain.
  • the first strand may be referred to as crRNA
  • the second strand may be referred to as tracrRNA.
  • the crRNA may include a guide domain and a first complementary domain
  • the tracrRNA may include a second complementary domain, a proximal domain, and optionally a tail domain.
  • the single-stranded gRNA may include a guide domain in a direction from 3′ to 5′, that is, a domain including a guide sequence capable of complementary binding to a target gene or nucleic acid; A first complementary domain; And a second complementary domain and a domain capable of forming a double-stranded nucleic acid with the first complementary domain since it has a sequence complementary to the first complementary domain sequence.
  • the CRISPR enzyme may be a nucleic acid or a polypeptide (or protein) having a sequence encoding a CRISPR enzyme, and typically, a Type II CRISPR enzyme or a Type V CRISPR enzyme is widely used.
  • the CRISPR enzyme may be a Type II CRISPR enzyme.
  • the Type II CRISPR enzyme may be Cas9.
  • the Cas9 is Streptococcus pyogenes, Streptococcus thermophilus, Streptococcus sp., Staphylococcus aureus, Nocardiopsis Dasonvillei (Nocardiopsis rougevillei), Streptomyces pristinaespiralis, Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces viridochromogenes (Streptosporangium roseum), Streptosporangium roseum, AlicyclobacHlus acidocaldarius, Bacillus pseudomycoides, Bacillus selenitiredusense Exiguobacterium sibiricum, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus salivarius, Microscilla marina, Burkholderiales bacterium, Burkholderiales bacterium Lomonas naphthalenivor
  • Lyngbya sp. Microcoleus chthonoplastes, Oscillatoria sp., Petrotoga mobilis (P etrotoga mobilis), Thermosipho africanus (Thermosipho africanus), or Acaryochloris marina (Acaryochloris marina) may be Cas9 derived from various microorganisms.
  • the Cas9 may be isolated from a microorganism existing in a natural state or may be produced unnaturally through a recombinant method or a synthetic method.
  • Type II CRISPR enzyme The crystal structure of Type II CRISPR enzyme was studied on two or more naturally-derived microbial Type II CRISPR enzyme molecules (Jinek et al., Science, 343(6176):1247997, 2014) and Streptococcus pyogen, which forms a complex with gRNA.
  • Ness Cas9 was determined through a study (Nishimasu et al., Cell, 156:935-949, 2014; Anders et al., Nature, 2014, doi: 10.1038/nature13579).
  • the Type II CRISPR enzyme contains two lobes, namely, recognition (REC) and nuclease (NUC) lobes, each lobe containing several domains.
  • the REC lobe contains an arginine-rich bridge helix (BH), a REC1 domain and a REC2 domain.
  • BH arginine-rich bridge helix
  • the BH domain is a long ⁇ -helix and arginine-rich region, and the REC1 and REC2 domains play an important role in the recognition of double-stranded gRNA, for example, single-stranded gRNA, double gRNA, or tracrRNA.
  • the NUC lobe contains a RuvC domain, an HNH domain and a PAM-interacting (PI) domain.
  • the RuvC domain is used in a sense encompassing a RuvC-like domain
  • the HNH domain is used in a sense encompassing an HNH-like domain.
  • the RuvC domain shares structural similarity with the members of the microorganism existing in the natural state including the Type II CRISPR enzyme, and a single strand, for example, a non-complementary strand of a target gene or nucleic acid, that is, complementary to gRNA Cut the strands that do not form a bond.
  • the RuvC domains are often referred to in the art as RuvCI domains, RuvCII domains and RuvCIII domains, commonly referred to as RuvC I, RuvCII and RuvCIII.
  • the HNH domain shares structural similarity with the HNH endonuclease, and cleaves a single strand, for example, a complementary strand of a target nucleic acid molecule, that is, a strand complementary to a gRNA.
  • the HNH domain is located between the RuvC II and III motifs.
  • the PI domain recognizes a specific nucleotide sequence in a target gene or nucleic acid, that is, a Protospacer adjacent motif (PAM) or interacts with PAM.
  • PAM Protospacer adjacent motif
  • the PAM may be different depending on the origin of the Type II CRISPR enzyme.
  • the CRISPR enzyme may be a nuclease or restriction enzyme having a function of cleaving a double strand of a target gene or nucleic acid.
  • the CRISPR enzyme may be a fully active CRISPR enzyme.
  • “Fully active” refers to a state that has the same function as that of a wild type CRISPR enzyme, and the CRISPR enzyme in this state is referred to as a fully active CRISPR enzyme.
  • “the function of the wild type CRISPR enzyme” refers to the function of cutting the double strand of DNA, that is, the first function of cutting the first strand of the double strand of DNA and the second of the double strand of DNA. It refers to a state that has all of the second functions to perform.
  • the fully active CRISPR enzyme may be a wild-type CRISPR enzyme that cleaves double strands of DNA.
  • the fully active CRISPR enzyme may be a CRISPR enzyme variant obtained by modifying or engineering a wild-type CRISPR enzyme that cleaves double strands of DNA.
  • the CRISPR enzyme variant may be an enzyme in which at least one amino acid in the amino acid sequence of the wild-type CRISPR enzyme is substituted with another amino acid or at least one amino acid is removed.
  • the CRISPR enzyme variant may be an enzyme in which one or more amino acids are added to the amino acid sequence of a wild-type CRISPR enzyme. At this time, the position of the added amino acid may be within the N-terminal, C-terminal or amino acid sequence of the wild-type enzyme.
  • the CRISPR enzyme variant may be a fully active enzyme with improved function than a wild-type CRISPR enzyme.
  • modified or engineered forms of the wild-type CRISPR enzyme i.e., CRISPR enzyme variants
  • CRISPR enzyme variants are capable of cleaving DNA double strands without binding to the DNA double strand to be cleaved or maintaining a constant distance apart.
  • the modified or engineered form may be a fully active CRISPR enzyme with improved functional activity than a wild-type CRISPR enzyme.
  • the CRISPR enzyme variant may be a fully active CRISPR enzyme having a reduced function than a wild-type CRISPR enzyme.
  • a specific modified or engineered form of a wild-type CRISPR enzyme that is, a CRISPR enzyme variant, can cleave a double strand of DNA in a state that is close to a DNA double strand to be cleaved by a certain distance or more or a specific bond is formed.
  • the specific binding may be, for example, binding of an amino acid at a specific position of an enzyme and a DNA nucleotide sequence at a cutting position.
  • the modified or engineered form may be a fully active CRISPR enzyme having a reduced functional activity than a wild-type CRISPR enzyme.
  • the CRISPR enzyme may be an incomplete or partially active CRISPR enzyme.
  • “Incomplete or partial activity” refers to the function of the wild-type CRISPR enzyme, ie, a function selected from the first function of cutting the first strand of DNA and the second function of cutting the second strand of DNA. Eggplant means state. CRISPR enzymes in this state are termed incomplete or partially active CRISPR enzymes. In addition, the incomplete or partially active CRISPR enzyme may be referred to as a nickase.
  • “Nickase” refers to a CRISPR enzyme that has been engineered or modified to cut only one of the double strands of a target gene or nucleic acid, and the nickase is a single strand, for example, a target gene or nucleic acid gRNA and It has a nuclease activity that cleaves the complementary strand or the complementary strand. Therefore, in order to cut the double strand, the nuclease activity of two nickases is required.
  • the nickase may have nuclease activity by the RuvC domain of the CRISPR enzyme. That is, the nickase may not contain nuclease activity by the HNH domain of the CRISPR enzyme, and the HNH domain may be manipulated or altered for this purpose.
  • the nickase may be a Type II CRISPR enzyme containing a modified HNH domain.
  • the nickase may be a SpCas9 mutant in which the nuclease activity of the HNH domain is inactivated by mutating histidine at amino acid sequence 840 of wild-type SpCas9 to alanine. have. Since the generated nickase, that is, the SpCas9 variant, has a nuclease activity by the RuvC domain, a non-complementary strand of a target gene or nucleic acid, that is, a strand that does not complementarily bind to a gRNA can be cleaved.
  • the nickase mutates histidine at amino acid sequence 559 of wild-type CjCas9 to alanine, thereby inactivating the nuclease activity of the HNH domain CjCas9 mutant
  • the generated nickase that is, the CjCas9 variant
  • has a nuclease activity by the RuvC domain a non-complementary strand of a target gene or nucleic acid, that is, a strand that does not complementarily bind to a gRNA can be cut.
  • the nickase may have nuclease activity by the HNH domain of the CRISPR enzyme. That is, the nickase may not contain nuclease activity by the RuvC domain of the CRISPR enzyme, and for this purpose, the RuvC domain may be manipulated or altered.
  • the nickase may be a Type II CRISPR enzyme comprising a modified RuvC domain.
  • the nickase is a SpCas9 mutant in which the nuclease activity of the RuvC domain is inactivated by mutating aspartic acid of amino acid sequence No. 10 of wild-type SpCas9 to alanine.
  • the generated nickase that is, the SpCas9 variant, has a nuclease activity by the HNH domain, the complementary strand of the target gene or nucleic acid, that is, the strand complementary to the gRNA can be cleaved.
  • the Type II CRISPR enzyme is wild-type CjCas9
  • the nicaase is CjCas9 in which the nuclease activity of the RuvC domain is inactivated by mutating aspartic acid at amino acid sequence No. 8 of wild-type CjCas9 into alanine. It can be a variant. Since the generated nickase, that is, the CjCas9 variant, has nuclease activity by the HNH domain, the complementary strand of the target gene or nucleic acid, that is, the strand complementary to the gRNA can be cleaved.
  • the CRISPR enzyme may be an inactive CRISPR enzyme.
  • “Inactive” refers to a state in which both the function of the wild-type CRISPR enzyme, that is, the first function of cutting the first strand of DNA and the second function of cutting the second strand of DNA, are all lost.
  • the CRISPR enzyme in this state is called the inactive CRISPR enzyme.
  • the inactive CRISPR enzyme may have nuclease inactivation due to mutation in a domain having nuclease activity of wild-type CRISPR enzyme.
  • the inactive CRISPR enzyme may have nuclease incompatibility due to mutations in the RuvC domain and the HNH domain. That is, the inactive CRISPR enzyme may not contain nuclease activity by the RuvC domain and HNH domain of the CRISPR enzyme, and for this purpose, the RuvC domain and the HNH domain may be manipulated or altered.
  • the inactive CRISPR enzyme may be a Type II CRISPR enzyme containing a modified RuvC domain and an HNH domain.
  • the inactive CRISPR enzyme when the Type II CRISPR enzyme is wild-type SpCas9, the inactive CRISPR enzyme mutates both aspartic acid 10 and histidine 840 of the wild-type SpCas9 amino acid sequence to alanine, thereby nuclease of RuvC domain and HNH domain. It may be an active inactivated SpCas9 variant.
  • the generated inactive CRISPR enzyme that is, the SpCas9 variant, has inactive nuclease activity of the RuvC domain and the HNH domain, and thus cannot cut all the double strands of the target gene or nucleic acid.
  • the inactive CRISPR enzyme when the Type II CRISPR enzyme is wild-type CjCas9, the inactive CRISPR enzyme mutates both aspartic acid No. 8 and histidine No. 559 of the wild-type CjCas9 amino acid sequence to alanine. It may be a CjCas9 variant with inactivated clease activity.
  • the inactive CRISPR enzyme that is, the CjCas9 variant, has the nuclease activity of the RuvC domain and the HNH domain inactive, so it cannot cut all the double strands of the target gene or nucleic acid.
  • the CRISPR enzyme may have a helicase activity, that is, a function of releasing a helical structure of a double-stranded nucleic acid.
  • the CRISPR enzyme may modify the CRISPR enzyme to be fully active, incomplete or partially active, or inactive with respect to the helicase activity of the CRISPR enzyme.
  • the CRISPR enzyme may be an artificially engineered CRISPR enzyme.
  • artificially modified or engineered or artificially engineered refers to a state created by artificially transforming, not as it is, occurring in a natural state.
  • the artificial modification may occur in the nucleic acid and/or protein encoding the CRISPR enzyme, and the artificial modification is a process in which the protein is produced by the nucleic acid encoding the CRISPR enzyme, i.e., transcription, post-transcriptional modification, translation And all modifications that can be manipulated artificially that may occur in the entire process, such as transformation after transformation.
  • the non-naturally engineered or modified CRISPR enzyme may be used interchangeably with the term artificial CRISPR enzyme or CRISPR enzyme variant.
  • the artificially engineered CRISPR enzyme modifies the function of the wild-type CRISPR enzyme, that is, the first function of cutting the first strand of the double strand of DNA and/or the second function of cutting the second strand of the double strand of DNA. It may be a CRISPR enzyme variant.
  • the CRISPR enzyme variant may be a form in which the first function of the wild-type CRISPR enzyme is lost.
  • the CRISPR enzyme variant may have an improved first function among the functions of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the CRISPR enzyme variant may be a form in which the second function of the wild-type CRISPR enzyme is lost.
  • the CRISPR enzyme variant may have an improved second function among the functions of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the CRISPR enzyme variant may be a form in which the function of the wild-type CRISPR enzyme, that is, both the first function and the second function, is lost.
  • the CRISPR enzyme variant may have an improved function of the wild-type CRISPR enzyme, that is, both the first function and the second function.
  • the CRISPR enzyme variant may have a function of a wild-type CRISPR enzyme, that is, a first function is lost and a second function is improved.
  • the CRISPR enzyme variant may have a function of a wild-type CRISPR enzyme, that is, a first function is improved and a second function is lost.
  • the artificially engineered CRISPR enzyme can form a gRNA-CRISPR enzyme complex through interaction with gRNA.
  • the artificially engineered CRISPR enzyme may be a CRISPR enzyme variant in which the function of interacting with the gRNA of the wild-type CRISPR enzyme is modified.
  • the CRISPR enzyme variant may be in a form in which the interaction with gRNA is reduced compared to the wild-type CRISPR enzyme.
  • the CRISPR enzyme variant may have an increased gRNA interaction compared to the wild-type CRISPR enzyme.
  • the CRISPR enzyme variant may have a first function of a wild-type CRISPR enzyme and a reduced interaction with gRNA.
  • the CRISPR enzyme variant may have the first function of the wild-type CRISPR enzyme and have an increased interaction with gRNA.
  • the CRISPR enzyme variant may have a second function of a wild-type CRISPR enzyme and a reduced interaction with gRNA.
  • the CRISPR enzyme variant may have a second function of the wild-type CRISPR enzyme and have an increased interaction with gRNA.
  • the CRISPR enzyme variant may not have the first function and the second function of the wild-type CRISPR enzyme and may have a reduced interaction with gRNA.
  • the CRISPR enzyme variant may have an increased interaction with a gRNA without having the first and second functions of the wild-type CRISPR enzyme.
  • various gRNA-CRISPR enzyme complexes may be formed according to the strength of the interaction between the gRNA and the CRISPR enzyme variant, and the function of accessing or cutting the target sequence may differ depending on the CRISPR enzyme variant.
  • a gRNA-CRISPR enzyme complex formed by a CRISPR enzyme variant with reduced interaction with gRNA can only form double or single strands of the target sequence when it is close to or localized to the target sequence that is fully complementary to the gRNA. Can be cut.
  • the artificially engineered CRISPR enzyme disclosed by the present specification may be a CRISPR enzyme variant obtained by modifying at least one or more amino acids of the amino acid sequence of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the CRISPR enzyme variant may be a form obtained by removing at least one amino acid from the amino acid sequence of a wild-type CRISPR enzyme.
  • the CRISPR enzyme variant may be in a form obtained by removing one or more amino acids from amino acids having a positive charge of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the CRISPR enzyme variant may be a form obtained by removing one or more amino acids from amino acids having a negative charge of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the CRISPR enzyme variant may be a form obtained by removing one or more amino acids among amino acids that do not have a charge of a wild-type CRISPR enzyme.
  • the CRISPR enzyme variant may be in a form obtained by removing one or more of amino acids having a positive charge, amino acids having a negative charge, and amino acids having no charge of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the CRISPR enzyme variant may be a form obtained by substituting at least one amino acid selected from the amino acid sequence of the wild-type CRISPR enzyme with another amino acid.
  • the other amino acids are alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glutamine, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine. And it may be one amino acid selected from valine.
  • the alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glutamine, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine and valine are each amino acid and All chemically modified forms such as methylation, acetylation, phosphorylation, etc., which may be additionally modified, may be included.
  • the CRISPR enzyme variant may be a form obtained by substituting one or more amino acids from amino acids having a positive charge of wild-type CRISPR enzyme with another amino acid.
  • the other amino acid may be one or more amino acids selected from stereoisomers of the selected one or more amino acids, other amino acids having a positive charge, amino acids having a negative charge, and amino acids having no charge.
  • the CRISPR enzyme variant may be a form obtained by substituting one or more amino acids from amino acids having a negative charge of the wild-type CRISPR enzyme with another amino acid.
  • the other amino acid may be one or more amino acids selected from stereoisomers of the selected one or more amino acids, other amino acids having a negative charge, amino acids having a positive charge, and amino acids having no charge.
  • the CRISPR enzyme variant may be in a form obtained by substituting one or more amino acids from amino acids that do not have a charge of the wild-type CRISPR enzyme with another amino acid.
  • the other amino acid may be one or more amino acids selected from stereoisomers of the selected one or more amino acids, other amino acids that do not have a charge, amino acids having a positive charge, and amino acids having a negative charge.
  • the CRISPR enzyme variant may be in a form in which at least one amino acid among amino acids having a positive charge, amino acids having a negative charge, and amino acids having no charge of the wild-type CRISPR enzyme is substituted with another amino acid.
  • the other amino acid may be one or more amino acids selected from stereoisomers of the selected one or more amino acids, amino acids having a positive charge, amino acids having a negative charge, and amino acids having no charge.
  • the CRISPR enzyme variant may be in a form obtained by substituting and/or removing at least one amino acid from the amino acid sequence of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the artificially engineered CRISPR enzyme disclosed by the present specification may be a CRISPR enzyme variant in which at least one amino acid is added to the amino acid sequence of a wild-type CRISPR enzyme.
  • the CRISPR enzyme variant may be in a form in which at least one amino acid is added compared to the amino acid sequence of a wild-type CRISPR enzyme.
  • the CRISPR enzyme variant may be a form in which at least one or more functional domains are added to the amino acid sequence of a wild-type CRISPR enzyme.
  • the functional domain is composed of one or more amino acids, and may be a peptide or a polypeptide.
  • the functional domain has an additional function in addition to the original function of the wild-type CRISPR enzyme, that is, the first function of cutting the first strand of the double strand of DNA and the second function of cutting the second strand of the double strand of DNA. It can be a domain.
  • the functional domain has a function similar to the original function of the wild-type CRISPR enzyme, that is, the first function of cutting the first strand of the double strand of DNA and/or the second function of cutting the second strand of the double strand of DNA. It can be a domain.
  • the functional domain is methylase activity, dimethylase activity, transcription activation activity, transcription repression activity, transcription release factor activity, histone It may be a domain having a histone modification activity, an RNA cleavage activity, or a nucleic acid binding activity.
  • the functional domain may be a tag or reporter gene for separation and purification of proteins (including peptides).
  • the tag includes a histidine (His) tag, a V5 tag, a FLAG tag, an influenza hemagglutinin (HA) tag, a Myc tag, a VSV-G tag, and a thioredoxin (Trx) tag, and the reporter gene Glutathione-S-transferase (GST), horseradish peroxidase (HRP), chloramphenicol acetyltransferase (CAT) beta-galactosidase, beta-glucuronidase, luciferase, green Autofluorescent proteins including, but not limited to, fluorescent protein (GFP), HcRed, DsRed, cyan fluorescent protein (CFP), yellow fluorescent protein (YFP), and blue fluorescent protein (BFP).
  • GFP fluorescent protein
  • HcRed HcRed
  • DsRed cyan fluorescent protein
  • the functional domain may be deaminase.
  • the incomplete or partial CRISPR enzyme may further include cytidine deaminase as a functional domain.
  • an incomplete or partial CRISPR enzyme may further include adenine deaminase as a functional domain.
  • the functional domain may be a nuclear localization sequence or signal (NLS) or a nuclear export sequence or signal (NES).
  • NLS nuclear localization sequence or signal
  • NES nuclear export sequence or signal
  • the CRISPR enzyme may comprise one or more NLS.
  • the NLS is at or near the amino terminal of the CRISPR enzyme; At or near the carboxy terminus; Alternatively, one or more NLSs may be included in a combination thereof.
  • the NLS may be an NLS sequence derived from, but is not limited to: the NLS of the SV40 virus large T-antigen having the amino acid sequence PKKKRKV (SEQ ID NO: 1); NLS from nucleoplasmin (eg, nucleoplasmin bipartite NLS with sequence KRPAATKKAGQAKKKK (SEQ ID NO: 2)); C-myc NLS with amino acid sequence PAAKRVKLD (SEQ ID NO: 3) or RQRRNELKRSP (SEQ ID NO: 4); HRNPA1 M9 NLS with sequence NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY (SEQ ID NO: 5); Sequence of the IBB domain from impotin-alpha RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV (SEQ ID NO: 6); Sequences VSRKRPRP (SEQ ID NO: 7) and PPKKARED (SEQ ID NO: 8) of my
  • the artificially engineered CRISPR enzyme may be a CRISPR enzyme variant obtained by modifying at least one amino acid of an amino acid sequence within a specific region of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the artificially engineered CRISPR enzyme may be a CRISPR enzyme variant in which one or more amino acids are added in a specific region of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the specific region of the wild-type CRISPR enzyme may be one or more regions selected from a first region, a second region, a third region, and a fourth region.
  • the first region may be a portion of a wild-type CRISPR enzyme that interacts with gRNA.
  • the first region may be a part of a wild-type CRISPR enzyme that interacts with the target sequence.
  • the first region may be a part of a wild-type CRISPR enzyme that interacts with a gRNA-target sequence heteroduplex.
  • the first region may be a part of a wild-type CRISPR enzyme that interacts with the PAM distal end of the gRNA-target sequence heteroduplex.
  • the PAM distal end of the gRNA-target sequence heteroduplex is 6 to 10 base pairs of the end of the gRNA-target sequence heteroduplex located far from the PAM position, that is, , It may mean 6 to 10 nucleotide sequences of the gRNA and 6 to 10 nucleotide sequences of the target sequence complementary binding thereto.
  • the first region may be a region located in the REC lobe of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the first region may be all or part of the REC domain of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the second region may be a part of a wild-type CRISPR enzyme that performs the first function or the second function of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the second region may be part of a wild-type CRISPR enzyme that interacts with gRNA.
  • the second region may be a part of a wild-type CRISPR enzyme that interacts with the target sequence.
  • the second region may be a part of a wild-type CRISPR enzyme that interacts with a gRNA-target sequence heteroduplex.
  • the second region may be a portion of a wild-type CRISPR enzyme that interacts with the PAM distal end of the gRNA-target sequence heteroduplex.
  • the PAM distal end of the gRNA-target sequence heteroduplex is 6 to 10 base pairs of the end of the gRNA-target sequence heteroduplex located far from the PAM position, that is, , It may mean 6 to 10 nucleotide sequences of the gRNA and 6 to 10 nucleotide sequences of the target sequence complementary binding thereto.
  • the second region may be a region located in the NUC lobe of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the second region may be a region including an end-capping loop of the NUC lobe of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the end-capping loop may be a region that interacts with a protospacer adjacent motif (PAM) and a distal end (PAM) of the gRNA-target sequence heteroduplex.
  • PAM protospacer adjacent motif
  • PAM distal end
  • the second region may be all or part of the RuvC domain of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the second region may be a part of the RuvC domain including a metal dependent nucleic acid cleaving region of the RuvC domain of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the metal-dependent nucleic acid cleavage site of the RuvC domain may mean a region capable of cleaving the binding between nucleic acids at the target site by interaction with the metal in the RuvC domain.
  • the metal-dependent nucleic acid cleavage site may be composed of a portion interacting with the metal and a portion that cleaves the binding between the nucleic acid at the target site.
  • the third region may be a part of a wild-type CRISPR enzyme that performs the first or second function of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the third region may be a portion of a wild-type CRISPR enzyme that interacts with gRNA.
  • the third region may be a part of a wild-type CRISPR enzyme that interacts with the target sequence.
  • the third region may be a portion of a wild-type CRISPR enzyme that interacts with a gRNA-target sequence heteroduplex.
  • the third region may be a portion of a wild-type CRISPR enzyme that interacts with the PAM distal end of the gRNA-target sequence heteroduplex.
  • the PAM distal end of the gRNA-target sequence heteroduplex is 6 to 10 base pairs of the end of the gRNA-target sequence heteroduplex located far from the PAM position, that is, , It may mean 6 to 10 nucleotide sequences of the gRNA and 6 to 10 nucleotide sequences of the target sequence complementary binding thereto.
  • the third region may be a region located in the NUC lobe of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the third region may be all or part of the HNH domain of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the third region may be a portion of the HNH domain including a metal dependent nucleic acid cleaving region of the HNH domain of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the metal-dependent nucleic acid cleavage site of the HNH domain may mean a region capable of cleaving the binding between nucleic acids at the target site by interaction with the metal in the HNH domain.
  • the fourth region may be a portion of a wild-type CRISPR enzyme capable of recognizing a specific nucleotide sequence in a target gene or nucleic acid, that is, a Protospacer adjacent motif (PAM).
  • PAM Protospacer adjacent motif
  • the fourth region may be a portion of a wild-type CRISPR enzyme that interacts with a target gene or a specific nucleotide sequence in a nucleic acid, that is, a Protospacer adjacent motif (PAM).
  • PAM Protospacer adjacent motif
  • the fourth region may be a portion of a wild-type CRISPR enzyme that interacts with some nucleotide sequences of gRNA.
  • the fourth region may be a region located in the NUC lobe of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the fourth region may be all or part of the PI domain of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the artificially engineered CRISPR enzyme may be a CRISPR enzyme variant obtained by modifying at least one amino acid sequence in one or more regions selected from the first region, the second region, the third region, and the fourth region of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the CRISPR enzyme variant may be a form obtained by modifying at least one or more amino acids of the amino acid sequence in the first region of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the CRISPR enzyme variant may be a form obtained by modifying at least one or more amino acids of the amino acid sequence in the second region of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the CRISPR enzyme variant may be a form obtained by modifying at least one or more amino acids of the amino acid sequence in the third region of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the CRISPR enzyme variant may be a form obtained by modifying at least one amino acid of the amino acid sequence in the fourth region of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the CRISPR enzyme variant may be in a form obtained by modifying at least two or more amino acids among the amino acid sequences in the first region and the second region of the wild-type CRISPR enzyme.
  • each of the first region and the second region may include at least one modified amino acid.
  • the CRISPR enzyme variant may be a form obtained by modifying at least two or more amino acids of the amino acid sequence in the first region and the third region of the wild-type CRISPR enzyme.
  • each of the first region and the third region may include at least one modified amino acid.
  • the CRISPR enzyme variant may be in a form obtained by modifying at least two or more amino acids of the amino acid sequences in the first region and the fourth region of the wild-type CRISPR enzyme.
  • each of the first and fourth regions may include at least one modified amino acid.
  • the CRISPR enzyme variant may be in a form obtained by modifying at least two or more amino acids of the amino acid sequence in the second region and the third region of the wild-type CRISPR enzyme.
  • each of the second region and the third region may include at least one modified amino acid.
  • the CRISPR enzyme variant may be a form obtained by modifying at least two or more amino acids of the amino acid sequence in the second region and the fourth region of the wild-type CRISPR enzyme.
  • each of the second region and the fourth region may include at least one modified amino acid.
  • the CRISPR enzyme variant may be in a form obtained by modifying at least two or more amino acids of the amino acid sequence in the third region and the fourth region of the wild-type CRISPR enzyme.
  • each of the third region and the fourth region may include at least one modified amino acid.
  • the CRISPR enzyme variant may be in a form obtained by modifying at least three or more amino acids among amino acid sequences in the first region, the second region, and the third region of the wild-type CRISPR enzyme.
  • each of the first region, the second region, and the third region may include at least one modified amino acid.
  • the CRISPR enzyme variant may be in a form obtained by modifying at least three or more amino acids among amino acid sequences in the first region, the second region, and the fourth region of the wild-type CRISPR enzyme.
  • each of the first region, the second region, and the fourth region may include at least one modified amino acid.
  • the CRISPR enzyme variant may be in a form obtained by modifying at least three or more amino acids among amino acid sequences in the first region, the third region, and the fourth region of the wild-type CRISPR enzyme.
  • each of the first region, the third region and the fourth region may include at least one modified amino acid.
  • the CRISPR enzyme variant may be in a form obtained by modifying at least three or more amino acids among amino acid sequences in the second region, the third region, and the fourth region of the wild-type CRISPR enzyme.
  • each of the second region, the third region, and the fourth region may include at least one modified amino acid.
  • the CRISPR enzyme variant may be a form obtained by modifying at least four or more amino acids among amino acid sequences in the first region, the second region, the third region, and the fourth region of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the first region, the second region, the third region, and the fourth region may each include at least one modified amino acid.
  • the CRISPR enzyme variant may include modification of at least one amino acid selected from the one or more regions.
  • the modification may be the removal of the selected one or more amino acids.
  • the modification may be a substitution of the selected one or more amino acids with other amino acids.
  • the other amino acid may be a stereoisomer of the selected amino acid.
  • the modification may be to replace L-glutamine located in the first region of the wild-type CRISPR enzyme with D-glutamine.
  • the other amino acid may be an amino acid having a hydrophobicity index smaller than a hydropathy index of the selected amino acid.
  • the modification may be to replace phenylalanine (hydrophobicity index: 2.8) located in the second region of the wild-type CRISPR enzyme with glycine (hydrophobicity index: -0.4) having a smaller hydrophobicity index.
  • the other amino acid may be an amino acid having a hydrophobicity index greater than a hydropathy index of the selected amino acid.
  • the modification may be to replace serine (hydrophobicity index: -0.8) located in the first region of the wild-type CRISPR enzyme with leucine (hydrophobicity index: 3.8) having a larger hydrophobicity index.
  • the other amino acid may be an amino acid having a functional group smaller in size than the functional group of the selected amino acid.
  • the modification may be to replace valine located in the third region of the wild-type CRISPR enzyme with alanine having a functional group smaller than that of valine.
  • the other amino acid may be an amino acid having a functional group larger in size than the functional group of the selected amino acid.
  • the modification may be to replace glycine located in the second region of the wild-type CRISPR enzyme with histidine having a functional group larger than that of glycine.
  • the other amino acid may be an amino acid having increased hydrophobicity than the hydrophobicity of the selected amino acid.
  • the modification may be to replace asparagine (Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5) located in the first region of the wild-type CRISPR enzyme with threonine (Kyte-Doolittle hydrophobicity: -0.7).
  • the other amino acid may be an amino acid having a reduced hydrophobicity than the hydrophobicity of the selected amino acid.
  • the modification may be to replace cysteine (Kyte-Doolittle hydrophobicity: 2.5) located in the fourth region of the wild-type CRISPR enzyme with proline (Kyte-Doolittle hydrophobicity: -1.6).
  • the other amino acid may be an amino acid having a size larger than that of the selected amino acid.
  • the modification may be to substitute tryptophan (molecular weight: 204.228) for lysine (molecular weight: 146.189) located in the third region of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the other amino acid may be an amino acid having a size smaller than that of the selected amino acid.
  • the modification may be to replace phenylalanine (molecular weight: 165.192) located in the second region of the wild-type CRISPR enzyme with glutamic acid (molecular weight: 147.131).
  • the other amino acid may be an amino acid having a different charge than the selected amino acid.
  • the modification may be to replace glutamic acid (negative charge) located in the second region of the wild-type CRISPR enzyme with leucine (neutral charge).
  • the other amino acid may be an amino acid having a functional group of a different class from the selected amino acid.
  • the classification may be one selected from aliphatic, aromatic, acyclic, cyclic, sulfur-containing, and hydroxyl-containing. .
  • the modification may be to substitute valine (aliphatic) for phenylalanine (aromatic) located in the third region of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the modification may be a substitution of the selected one or more amino acids with the same number of other amino acids.
  • the modification may be to replace one alanine located in the first region of the wild-type CRISPR enzyme with one glycine.
  • the modification may be to substitute one arginine located in the first region of the wild-type CRISPR enzyme and one histidine located in the fourth region with one leucine (first region) and one serine (fourth region), respectively.
  • the modification may be to replace one arginine located in the second region of the wild-type CRISPR enzyme, one valine, and one leucine located in the third region with one phenylalanine, that is, a total of three phenylalanines.
  • the modification may be a substitution of the selected one or more amino acids with an unequal number of other amino acids.
  • the modification may be to replace one leucine located in the second region of the wild-type CRISPR enzyme with cysteine-alanine-alanine, that is, a total of three amino acids.
  • the modification is a substitution of one histidine located in the first region of the wild-type CRISPR enzyme and alanine-glutamine, two consecutive amino acids located in the third region, with methionine-valine (first region) and proline (third region), respectively. It may be to let you do.
  • the modification may include one glutamic acid located in the first region of the wild-type CRISPR enzyme, alanine-leucine-histidine, which is three consecutive amino acids located in the second region, and tryptophan-serine, which is two consecutive amino acids located in the third region. It may be substituted with alanine (first region), methionine-proline (second region), and cysteine-alanine-threonine-valine (third region).
  • the artificially engineered CRISPR enzyme may be a CRISPR enzyme variant in which at least one amino acid is added to at least one selected from a first region, a second region, a third region, and a fourth region of the wild-type CRISPR enzyme.
  • the addition may be the addition of one or more amino acids to the N-terminal and/or C-terminal positions of one or more amino acids present in the selected one or more regions.
  • the addition may be the addition of an amino acid having one or more positive charges at the N-terminal and/or C-terminal positions of one or more amino acids present in the selected one or more regions.
  • the addition may be the addition of one arginine to the C-terminus of one selected alanine located in the first region.
  • the addition may be obtained by adding two amino acids, histidine-lysine, to the N-terminus of the selected glutamic acid located in the third region.
  • the addition may be the addition of an amino acid having one or more negative charges at the N-terminal and/or C-terminal positions of one or more amino acids present in the selected one or more regions.
  • the addition may be the addition of one aspartic acid to the N-terminus of one selected threonine located in the second region.
  • three amino acids, glutamic acid-aspartic acid-glutamic acid may be added to the C-terminus of the selected histidine located in the fourth region.
  • the addition may be the addition of one or more amino acids having no charge at the N-terminal and/or C-terminal positions of one or more amino acids present in the selected one or more regions.
  • the addition may be obtained by adding two amino acids, serine-valine, to the C-terminus of one selected cysteine located in the second region.
  • the addition may be obtained by adding five amino acids, glycine-proline-glutamine-phenylalanine-leucine, to the N-terminus of the selected lysine located in the third region.
  • the addition is among amino acids having a positive charge, amino acids having a negative charge, and amino acids having no charge at the N-terminal and/or C-terminal positions of one or more amino acids present in the selected one or more regions. It may be the addition of one or more selected amino acids.
  • the addition may be the addition of six amino acids, histidine-arginine-glycine-serine-alanine-glutamic acid, to the C-terminus of one selected arginine located in the first region.
  • the addition may be by adding ten amino acids, lysine-lysine-alanine-phenylalanine-glutamine-threonine-methionine-cysteine-aspartic acid-serine, to the N-terminus of one selected glycine located in the fourth region.
  • the addition may be the addition of one or more functional domains to the N-terminal and/or C-terminal positions of one or more amino acids present in the selected one or more regions.
  • the functional domain has an additional function in addition to the original function of the wild-type CRISPR enzyme, that is, the first function of cutting the first strand of the double strand of DNA and the second function of cutting the second strand of the double strand of DNA. It can be a domain.
  • the functional domain has a function similar to the original function of the wild-type CRISPR enzyme, that is, the first function of cutting the first strand of the double strand of DNA and/or the second function of cutting the second strand of the double strand of DNA. It can be a domain.
  • the functional domain is methylase activity, dimethylase activity, transcription activation activity, transcription repression activity, transcription release factor activity, histone It may be a domain having a histone modification activity, an RNA cleavage activity, or a nucleic acid binding activity.
  • the functional domain may be a tag or reporter gene for separation and purification of proteins (including peptides).
  • the tag includes a histidine (His) tag, a V5 tag, a FLAG tag, an influenza hemagglutinin (HA) tag, a Myc tag, a VSV-G tag, and a thioredoxin (Trx) tag, and the reporter gene Glutathione-S-transferase (GST), horseradish peroxidase (HRP), chloramphenicol acetyltransferase (CAT) beta-galactosidase, beta-glucuronidase, luciferase, green Autofluorescent proteins including, but not limited to, fluorescent protein (GFP), HcRed, DsRed, cyan fluorescent protein (CFP), yellow fluorescent protein (YFP), and blue fluorescent protein (BFP).
  • GFP fluorescent protein
  • HcRed HcRed
  • DsRed cyan fluorescent protein
  • the functional domain may be deaminase.
  • the deaminase may be adenine deaminase and/or cytidine deaminase.
  • the functional domain may be a nuclear localization sequence or signal (NLS) or a nuclear export sequence or signal (NES).
  • NLS nuclear localization sequence or signal
  • NES nuclear export sequence or signal
  • the artificially engineered CRISPR enzyme may be an artificially engineered Cas9.
  • the artificially engineered Cas9 may be a Cas9 variant obtained by modifying at least one amino acid of an amino acid sequence within a specific region of wild-type Cas9.
  • the artificially engineered Cas9 may be a Cas9 variant in which at least one amino acid is added to a specific region of wild-type Cas9.
  • the specific region of the wild-type Cas9 may be at least one region selected from a first region, a second region, a third region, and a fourth region.
  • the first region may be a portion of wild-type Cas9 that interacts with gRNA.
  • the first region may be a portion of wild-type Cas9 that interacts with the target sequence.
  • the first region may be a portion of a wild-type Cas9 that interacts with a gRNA-target sequence heteroduplex.
  • the first region may be a portion of a wild-type Cas9 interacting with the PAM distal end of the gRNA-target sequence heteroduplex.
  • the PAM distal end of the gRNA-target sequence heteroduplex is 6 to 10 base pairs of the end of the gRNA-target sequence heteroduplex located far from the PAM position, that is, , It may mean 6 to 10 nucleotide sequences of the gRNA and 6 to 10 nucleotide sequences of the target sequence complementary binding thereto.
  • the first region may be a region located in a REC lobe of wild-type Cas9.
  • the first region may be all or part of the REC domain of wild-type Cas9.
  • the first region may be a region consisting of 300 amino acids at the C-terminus of the REC domain of wild-type Cas9.
  • the first region may be a region consisting of 220 amino acids at the N-terminus of the REC domain of wild-type Cas9.
  • the first region may be all or part of the amino acid sequence from the 94th aspartic acid (D94) to the 717th glycine (G717) of wild-type SpCas9.
  • the first region may be an amino acid sequence (region 1-1, SEQ ID NO: 18) from the 196th phenylalanine (F196) of the wild-type SpCas9 to the 282th isoleucine (I282).
  • the first region may be an amino acid sequence (region 1-2, SEQ ID NO: 19) from 316 th proline (P316) to 394 th asparagine (N394) of wild-type SpCas9.
  • the first region may be an amino acid sequence (region 1-3, SEQ ID NO: 20) from 510th lysine (K510) to 612th asparagine (N612) of wild-type SpCas9.
  • the first region may be an amino acid sequence (region 1-4, SEQ ID NO: 21) from 678 th threonine (T678) to 698 th histidine (H698) of wild-type SpCas9.
  • the first region is the amino acid sequence from the 196th phenylalanine (F196) to the 282th isoleucine (I282) of the wild-type SpCas9 (region 1-1), the 316th proline (P316) to the 394th asparagine ( N394) amino acid sequence (region 1-2), 510 lysine (K510) to 612 asparagine (N612) amino acid sequence (region 1-3) and 678 threonine (T678) to histidine 698 ( H698) may be two selected regions of the amino acid sequence (regions 1-4).
  • the first region is the amino acid sequence from the 196th phenylalanine (F196) to the 282th isoleucine (I282) of the wild-type SpCas9 (region 1-1), the 316th proline (P316) to the 394th asparagine (N394) amino acid sequence (region 1-2), 510 lysine (K510) to 612 asparagine (N612) amino acid sequence (region 1-3) and 678 threonine (T678) to histidine 698 It may be three regions selected from the amino acid sequence up to (H698) (regions 1-4).
  • the first region is the amino acid sequence (region 1-1) from the 196th phenylalanine (F196) to the 282th isoleucine (I282) of the wild-type SpCas9 (region 1-1), the 394th from the 316th proline (P316) Amino acid sequence to asparagine (N394) (region 1-2), amino acid sequence from 510th lysine (K510) to 612 asparagine (N612) (region 1-3) and 678th threonine (T678) to 698th It may be an amino acid sequence (regions 1-4) up to histidine (H698).
  • the first region may be all or part of the amino acid sequence from the 75th asparagine (N75) to the 426th lysine (K426) of wild-type SaCas9.
  • the first region may be an amino acid sequence from 207 th threonine (T207) to 426 th lysine (K426) of wild-type SaCas9.
  • the second region may be a portion of a wild-type Cas9 that performs a first function or a second function of the wild-type Cas9.
  • the second region may be a part of wild-type Cas9 that interacts with gRNA.
  • the second region may be a part of wild-type Cas9 that interacts with the target sequence.
  • the second region may be a part of wild-type Cas9 that interacts with the gRNA-target sequence heteroduplex.
  • the second region may be a portion of a wild-type Cas9 that interacts with the PAM distal end of the gRNA-target sequence heteroduplex.
  • the PAM distal end of the gRNA-target sequence heteroduplex is 6 to 10 base pairs of the end of the gRNA-target sequence heteroduplex located far from the PAM position, that is, , It may mean 6 to 10 nucleotide sequences of the gRNA and 6 to 10 nucleotide sequences of the target sequence complementary binding thereto.
  • the second region may be a region located in a NUC lobe of wild-type Cas9.
  • the second region may be a region including an end-capping loop of the NUC lobe of the wild-type Cas9.
  • the end-capping loop may be a region that interacts with a protospacer adjacent motif (PAM) and a distal end (PAM) of the gRNA-target sequence heteroduplex.
  • PAM protospacer adjacent motif
  • PAM distal end
  • the end-capping loop may be a region from the 1001 th tyrosine (Y1001) to the 1030 th glycine (G1030) of the wild-type SpCas9.
  • the second region may be all or part of the RuvC domain of wild-type Cas9.
  • the second region may be a portion of the RuvC domain including a metal dependent nucleic acid cleaving region of the RuvC domain of wild-type Cas9.
  • the metal-dependent nucleic acid cleavage site of the RuvC domain may mean a region capable of cleaving the binding between nucleic acids at the target site by interaction with the metal in the RuvC domain.
  • the metal-dependent nucleic acid cleavage site may be composed of a portion interacting with the metal and a portion that cleaves the binding between the nucleic acid at the target site.
  • the second region may be all or part of the amino acid sequence (RuvC I region) from the first methionine (M1) to the 59th alanine (A59) of wild-type SpCas9.
  • the second region may be all or part of an amino acid sequence (RuvC II region) from 718 aspartic acid (D718) to 774 glutamine (Q774) of wild-type SpCas9.
  • the second region may be all or part of an amino acid sequence (RuvC III region) from 909 th serine (S909) to 1098 th threonine (T1098) of wild-type SpCas9.
  • the second region may be a RuvC I region, a RuvC II region, and/or a RuvC III region of wild-type SpCas9.
  • the second region may be an amino acid sequence from the first methionine (M1) to the 22nd threonine (T22) of wild-type SpCas9 (region 2-1, SEQ ID NO: 22).
  • the second region may be an amino acid sequence (region 2-2, SEQ ID NO: 23) from 731 proline (P731) to 770 threonine (T770) of wild-type SpCas9.
  • the second region may be an amino acid sequence (region 2-3, SEQ ID NO: 24) from 926 glutamine (Q926) to 1000 lysine (K1000) of wild-type SpCas9.
  • the second region may be an amino acid sequence from the 1001 th tyrosine (Y1001) to the 1040 th serine (S1040) of wild-type SpCas9 (region 2-4, SEQ ID NO: 25).
  • the second region is the amino acid sequence (region 2-1) from the first methionine (M1) to the 22nd threonine (T22) of wild-type SpCas9 and the 731st proline (P731) to the 770th threonine (T770 ) To the amino acid sequence (region 2-2).
  • the second region is the amino acid sequence (region 2-1) from the first methionine (M1) to the 22nd threonine (T22) of wild-type SpCas9 and the 926 glutamine (Q926) to the 1000 lysine ( K1000) up to the amino acid sequence (region 2-3).
  • the second region is the amino acid sequence (region 2-1) from the first methionine (M1) to the 22nd threonine (T22) of the wild-type SpCas9 and the 1040 serine from the 1001 tyrosine (Y1001). It may be the amino acid sequence (region 2-4) up to (S1040).
  • the second region is the amino acid sequence from the 731 proline (P731) to the 770 th threonine (T770) of wild-type SpCas9 (region 2-2) and the 926 glutamine (Q926) to the 1000 lysine (K1000 ) To the amino acid sequence (region 2-3).
  • the second region is the amino acid sequence from the 731 th proline (P731) to the 770 th threonine (T770) of the wild-type SpCas9 (region 2-2) and the 1001 th tyrosine (Y1001) to the 1040 th serine ( S1040) up to the amino acid sequence (region 2-4).
  • the second region is the amino acid sequence (region 2-3) from the 926 glutamine (Q926) to the 1000 lysine (K1000) of wild-type SpCas9 and the 1040 serine from the 1001 tyrosine (Y1001) It may be the amino acid sequence (region 2-4) up to (S1040).
  • the second region is the amino acid sequence from the first methionine (M1) to the 22nd threonine (T22) of wild-type SpCas9 (region 2-1), the 731st proline (P731) to the 770th threonine (T770 ) To the amino acid sequence (region 2-2) and the amino acid sequence from glutamine at position 926 (Q926) to lysine at position 1000 (K1000) (region 2-3).
  • the second region is the amino acid sequence from the first methionine (M1) to the 22nd threonine (T22) of the wild-type SpCas9 (region 2-1), the 731st proline (P731) to the 770th threonine ( T770) and the amino acid sequence from the 1001 th tyrosine (Y1001) to the 1040 th serine (S1040) (region 2-4).
  • the second region is the amino acid sequence from the 731 th proline (P731) to the 770 th threonine (T770) of the wild-type SpCas9 (region 2-2), the 926 th glutamine (Q926) to the 1000 th lysine It may be an amino acid sequence up to (K1000) (region 2-3) and an amino acid sequence from 1001 th tyrosine (Y1001) to 1040 th serine (S1040) (region 2-4).
  • the second region is the amino acid sequence from the first methionine (M1) to the 22nd threonine (T22) of the wild-type SpCas9 (region 2-1), the 731st proline (P731) to the 770th threonine ( T770) amino acid sequence (region 2-2), 926 glutamine (Q926) to 1000 lysine (K1000) amino acid sequence (region 2-3) and 1001 tyrosine (Y1001) to 1040 serine ( S1040) up to the amino acid sequence (region 2-4).
  • the second region may be all or part of the amino acid sequence (RuvC I region) from the first methionine (M1) to the 41st valine (V41) of wild-type SaCas9.
  • the second region may be all or part of an amino acid sequence (RuvC II region) from the 436 th isoleucine (I436) to the 481 th glutamic acid (E481) of wild-type SaCas9.
  • RuvC II region an amino acid sequence from the 436 th isoleucine (I436) to the 481 th glutamic acid (E481) of wild-type SaCas9.
  • the second region may be all or part of the amino acid sequence (RuvC III region) from 651 th tyrosine (Y651) to 775 th valine (V775) of wild-type SaCas9.
  • the second region may be a RuvC I region, a RuvC II region, and/or a RuvC III region of wild-type SaCas9.
  • the second region may be an amino acid sequence (region 2-1) from the first methionine (M1) to the 25th threonine (T25) of wild-type SaCas9.
  • the second region may be an amino acid sequence (region 2-2) from the 471 th proline (P471) to the 481 th glutamic acid (E481) of wild-type SaCas9.
  • the second region may be an amino acid sequence (region 2-3) from the 667th asparagine (N667) to the 740th serine (S740) of wild-type SaCas9.
  • the third region may be a portion of a wild-type Cas9 that performs the first function or the second function of the wild-type Cas9.
  • the third region may be a portion of wild-type Cas9 that interacts with gRNA.
  • the third region may be a part of wild-type Cas9 that interacts with the target sequence.
  • the third region may be a part of wild-type Cas9 that interacts with the gRNA-target sequence heteroduplex.
  • the third region may be a portion of wild-type Cas9 that interacts with the PAM distal end of the gRNA-target sequence heteroduplex.
  • the PAM distal end of the gRNA-target sequence heteroduplex is 6 to 10 base pairs of the end of the gRNA-target sequence heteroduplex located far from the PAM position, that is, , It may mean 6 to 10 nucleotide sequences of the gRNA and 6 to 10 nucleotide sequences of the target sequence complementary binding thereto.
  • the third region may be a region located in a NUC lobe of wild-type Cas9.
  • the third region may be all or part of the HNH domain of wild-type Cas9.
  • the third region may be a portion of the HNH domain including a metal dependent nucleic acid cleaving region of the HNH domain of wild-type Cas9.
  • the metal-dependent nucleic acid cleavage site of the HNH domain may mean a region capable of cleaving the binding between nucleic acids at the target site by interaction with the metal in the HNH domain.
  • the third region may be all or part of the amino acid sequence from the 775th lysine (K775) to the 908th leucine (L908) of wild-type SpCas9.
  • the third region may be an amino acid sequence (region 3-1, SEQ ID NO: 26) from 775th lysine (K775) to 900th leucine (L900) of wild-type SpCas9.
  • the third region may be all or part of the amino acid sequence from the 521 th isoleucine (I521) to the 629 th glutamic acid (E629) of wild-type SaCas9.
  • the third region may be an amino acid sequence (region 3-1) from the 523th lysine (K523) to the 627th leucine (L627) of wild-type SaCas9.
  • the fourth region may be a portion of a wild-type Cas9 capable of recognizing a specific nucleotide sequence in a target gene or nucleic acid, that is, a Protospacer adjacent motif (PAM).
  • PAM Protospacer adjacent motif
  • the fourth region may be a portion of a wild-type Cas9 that interacts with a specific nucleotide sequence in a target gene or nucleic acid, that is, a Protospacer adjacent motif (PAM).
  • PAM Protospacer adjacent motif
  • the fourth region may be a portion of a wild-type Cas9 that interacts with some nucleotide sequences of gRNA.
  • the fourth region may be a region located in a NUC lobe of wild-type Cas9.
  • the fourth region may be all or part of the PI domain of wild-type Cas9.
  • the fourth region may be all or part of an amino acid sequence from glutamic acid at 1099 (E1099) to aspartic acid at 1368 (D1368) of wild-type SpCas9.
  • the fourth region may be an amino acid sequence (region 4-1, SEQ ID NO: 27) from glutamic acid at 1099 (E1099) to valine at 1139 (V1139) of wild-type SpCas9.
  • the fourth region may be all or part of an amino acid sequence from the 910 th lysine (K910) to the 1053 th glycine (G1053) of wild-type SaCas9.
  • the fourth region may be an amino acid sequence (region 4-1) from the 910th lysine (K910) to the 970th aspartic acid (D970) of wild-type SaCas9.
  • the artificially engineered Cas9 may be a Cas9 variant obtained by modifying at least one amino acid sequence in one or more regions selected from the first region, the second region, the third region, and the fourth region of the wild-type Cas9.
  • the Cas9 variant may be a form obtained by modifying one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the first region of wild-type Cas9.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the first region of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant may be in a form obtained by modifying one or more amino acids selected from amino acid sequences in region 1-1 of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant is amino acids having an aliphatic or amide-based functional group in the 1-1 region of wild-type SpCas9, that is, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281 and I282 may be in a modified form.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying one or more amino acids selected from amino acid sequences in the 1-2 region of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant is amino acids that do not have polarity among the 1-2 regions of wild-type SpCas9, that is, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, Selected from the group consisting of P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391 and L393 It may be in the form of modified one or more amino acids.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying one or more amino acids selected from amino acid sequences in the 1-3 region of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying one or more amino acids selected from the group consisting of K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, and I601 among the 1-3 regions of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant is amino acids that do not have polarity among the 1-3 regions of wild-type SpCas9, that is, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, It may be a modified form of one or more amino acids selected from the group consisting of I600, I601, F606 and L607.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying one or more amino acids selected from amino acid sequences in regions 1-4 of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant may be in a form obtained by modifying one or more amino acids selected from the group consisting of N692, M694, Q695, and H698 among regions 1-4 of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant is a group consisting of amino acids that do not have polarity among the 1-4 regions of wild-type SpCas9, that is, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 and I697. It may be in the form of modified one or more amino acids selected from.
  • the SpCas9 variant is a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in the 1-1 region, the 1-2 region, the 1-3 region, and the 1-4 region of wild-type SpCas9. I can. At this time, the selected two or more amino acids may be located in different regions, respectively. Alternatively, two or more selected amino acids may be located within the same region.
  • the SpCas9 mutant is N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210 among regions 1-1, 1-2, 1-3, and 1-4 of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant is A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583 among wild-type SpCas9 regions 1-1, 1-2, 1-3, and 1-4.
  • E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 and H698 may be in the form of modified two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant is composed of K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, and H698 among the 1-3 regions and 1-4 regions of wild-type SpCas9. It may be a modified form of two or more amino acids selected from the group.
  • the SpCas9 variant is amino acids having no polarity among the 1-3 regions and 1-4 regions of wild-type SpCas9, that is, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, and I697 may be in a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of. .
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying three or more amino acids selected from amino acid sequences in the 1-1 region, the 1-2 region, the 1-3 region, and the 1-4 region of the wild-type SpCas9. have.
  • the selected three or more amino acids may be located in different regions, respectively.
  • three or more selected amino acids may be located in the same region.
  • the selected three or more amino acids may each be located in the same or different regions.
  • the SpCas9 variant is N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231 of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant is A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583 among wild-type SpCas9 regions 1-1, 1-2, 1-3, and 1-4.
  • E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 and H698 may be in a modified form of three or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 mutant is A203, N277, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601 among regions 1-1, 1-3, and 1-4 of wild-type SpCas9.
  • N692, M694, Q695 and H698 may be a modified form of three or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 mutant is G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692 among wild-type SpCas9 regions 1-2, 1-3, and 1-4.
  • M694, Q695 and H698 may be a modified form of three or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the Cas9 variant may be a form obtained by modifying one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the second region of wild-type Cas9.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the second region of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant may be in a form obtained by modifying one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the region 2-1 of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying one or more amino acids selected from the group consisting of I7, G8, L9, D10, I11, and G12 among the 2-1 region of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant is a group consisting of amino acids that do not have polarity among the 2-1 region of wild-type SpCas9, that is, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, and I21. It may be in the form of modified one or more amino acids selected from.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the 2-2 region of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying one or more amino acids selected from the group consisting of I761, E762, M763, R765, E766, and N767 among the 2-2 regions of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant is amino acids that do not have polarity in the 2-2 region of wild-type SpCas9, that is, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763 and A764 may be a modified form of one or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying one or more amino acids selected from amino acid sequences in the 2-3rd region of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying one or more amino acids selected from the group consisting of D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987 and Y988 among the 2-3rd regions of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant is amino acids that do not have polarity among the 2-3 regions of wild-type SpCas9, that is, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997 and I998 may be in the form of modified one or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying one or more amino acids selected from amino acid sequences in regions 2-4 of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant is Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017 among the 2-4 regions of wild-type SpCas9.
  • V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, Y1036, F1037, F1038 and Y1039 It may be in the form of modified one or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variants are amino acids that do not have polarity among the 2-4 regions of wild-type SpCas9, that is, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, It may be a modified form of one or more amino acids selected from the group consisting of A1032, A1034, F1037 and F1038.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in the 2-1 region and the 2-2 region of wild-type SpCas9. At this time, the selected two or more amino acids may be located in regions 2-1 and 2-2, respectively.
  • the SpCas9 variant is in the group consisting of I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766 and N767 among the 2-1 and 2-2 regions of wild-type SpCas9. It may be a modified form of two or more selected amino acids.
  • the SpCas9 variant is amino acids that do not have polarity among the 2-1 and 2-2 regions of wild-type SpCas9, that is, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, Two or more selected from the group consisting of V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763 and A764 It may be in the form of a modified amino acid.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in the 2-1 region and the 2-3 region of wild-type SpCas9.
  • the selected two or more amino acids may be located in regions 2-1 and 2-3, respectively.
  • the SpCas9 mutant is I7, G8, L9, D10, 11, G12, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987 among the 2-1 and 2-3 regions of wild-type SpCas9.
  • Y988 may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant is amino acids that do not have polarity among the 2-1 and 2-3 regions of wild-type SpCas9, that is, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, It may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of V992, V993, G994, A996, L997, and I998.
  • the SpCas9 variant may be in a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in regions 2-1 and 2-4 of wild-type SpCas9. At this time, the selected two or more amino acids may be located in regions 2-1 and 2-4, respectively.
  • the SpCas9 mutant is I7, G8, L9, D10, I11, G12, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008 among the 2-1 and 2-4 regions of wild-type SpCas9.
  • V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, Y1036, F1037, F1037 And Y1039 may be in the form of modified two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant is amino acids that do not have polarity among the 2-1 and 2-4 regions of wild-type SpCas9, that is, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 and F1038 It may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of .
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in the 2-2 region and the 2-3 region of the wild-type SpCas9. At this time, the selected two or more amino acids may be located in regions 2-2 and 2-3, respectively.
  • the SpCas9 variant is I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987 among the 2-2 and 2-3 regions of wild-type SpCas9.
  • Y988 may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant is amino acids that do not have polarity among the 2-2 and 2-3 regions of wild-type SpCas9, that is, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, and I998 may be in a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in regions 2-2 and 2-4 of wild-type SpCas9.
  • the selected two or more amino acids may be located in regions 2-2 and 2-4, respectively.
  • the SpCas9 mutant is I761, E762, M763, R765, E766, N767, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008 among the 2-2 and 2-4 regions of wild-type SpCas9.
  • V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, Y1036, F1037, F1037 And Y1039 may be in the form of modified two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant is amino acids that do not have polarity among the 2-2 and 2-4 regions of wild-type SpCas9, that is, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, It may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of F1037 and F1038.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in regions 2-3 and 2-4 of wild-type SpCas9. At this time, the selected two or more amino acids may be located in regions 2-3 and 2-4, respectively.
  • the SpCas9 mutant is D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005 among the 2-3 regions and 2-4 regions of wild-type SpCas9.
  • S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029 , Y1036, F1037, F1038 and Y1039 may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant is amino acids that do not have polarity among the 2-3rd and 2-4th regions of wild-type SpCas9, that is, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037, and F1038 may be in a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying three or more amino acids selected from amino acid sequences in the 2-1 region, the 2-2 region, and the 2-3 region of the wild-type SpCas9. At this time, the selected three or more amino acids may be located in regions 2-1, 2-2, and 2-3, respectively.
  • the SpCas9 mutant is I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766 among the 2-1, 2-2, and 2-3 regions of wild-type SpCas9.
  • N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987 and Y988 may be in a modified form of three or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant is amino acids having no polarity among the 2-1, 2-2, and 2-3 regions of wild-type SpCas9, i.e., I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, It may be a modified form of three or more amino acids selected from the group consisting of G994, A996, L997, and I998.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying three or more amino acids selected from amino acid sequences in the 2-1 region, the 2-2 region, and the 2-4 region of the wild-type SpCas9. At this time, the selected three or more amino acids may be located in regions 2-1, 2-2, and 2-4, respectively.
  • the SpCas9 mutant is I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766 among regions 2-1, 2-2, and 2-4 of wild-type SpCas9.
  • N767, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, A1023 , S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, Y1036, F1037, F1038, and Y1039 may be a modified form of three or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant is amino acids that do not have polarity among the 2-1, 2-2, and 2-4 regions of wild-type SpCas9, ie, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 and F1038 It may be a modified form of three or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant may be in a form obtained by modifying three or more amino acids selected from amino acid sequences in regions 2-2, 2-3, and 2-4 of wild-type SpCas9.
  • the selected three or more amino acids may be located in regions 2-2, 2-3, and 2-4, respectively.
  • the SpCas9 variant is I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984 among the 2-2, 2-3, and 2-4 regions of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant is a form obtained by modifying three or more amino acids selected from amino acid sequences in the 2-1 region, the 2-2 region, the 2-3 region, and the 2-4 region of wild-type SpCas9. I can. At this time, the selected three or more amino acids may be located in regions 2-1, 2-2, 2-3, and 2-4, respectively.
  • the SpCas9 mutant is I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762 of the 2-1, 2-2, 2-3, and 2-4 regions of wild-type SpCas9.
  • the above amino acids may be modified.
  • the SpCas9 mutant is amino acids that do not have polarity among the 2-1, 2-2, 2-3, and 2-4 regions of wild-type SpCas9, i.e., I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, Selected from the group consisting of A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008,
  • the Cas9 variant may be a form obtained by modifying at least one amino acid of the amino acid sequence in the third region of wild-type Cas9.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the third region of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the 3-1 region of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant modifies one or more amino acids selected from the group consisting of V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, and L891 of the 3-1 region of wild-type SpCas9. It may be in the form that was ordered.
  • the Cas9 variant may be a form obtained by modifying one or more amino acids selected from amino acid sequences in the fourth region of wild-type Cas9.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the fourth region of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the 4-1 region of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying one or more amino acids selected from the group consisting of T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136, and T1138 of the 4-1 region of wild-type SpCas9. have.
  • the Cas9 variant may be a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in the first region and the second region of wild-type Cas9.
  • each of the first region and the second region may include at least one modified amino acid.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in the first region and the second region of wild-type SpCas9.
  • each of the first region and the second region may include at least one modified amino acid.
  • the SpCas9 variant may be in a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in the 1-1 region and the 2-1 region of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant is I7, G8, L9, D10, I11, G12, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210 among the 1-1 and 2-1 regions of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in the 1-1 region and the 2-2 region of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant is N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224 among regions 1-1 and 2-2 of wild-type SpCas9.
  • L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265 , L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, I761, E762, M763, R765, E766 and N767 may be in the form of modified two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant may be in a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in regions 1-1 and 2-3 of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant is N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224 among the 1-1 and 2-3 regions of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant may be in a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in regions 1-1 and 2-4 of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant is N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224 among regions 1-1 and 2-4 of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant may be in a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in the 1-2 region and the region 2-1 of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant is I7, G8, L9, D10, I11, G12, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335 among the 1-2-1 regions of wild-type SpCas9.
  • V391 and L393 may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant is amino acids that do not have polarity among the 1-2 and 2-1 regions of wild-type SpCas9, that is, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391 and L393 may be in a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant may be in a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in the 1-2 region and the 2-2 region of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant is P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350 among the 1-2 and 2-2 regions of wild-type SpCas9.
  • F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, I761, E762, M763, R765 , E766 and N767 may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences within the 1-2 region and the 2-3 region of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant is P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350 among the 1-2 and 2-3 regions of wild-type SpCas9.
  • F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, D965, Y981, H982, H983 , A984, H985, D986, A987, and Y988 may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant may be in a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in regions 1-2 and 2-4 of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant is P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350 among regions 1-2 and 2-4 of wild-type SpCas9.
  • F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, Y1001, P1002, K1003, L1004 , E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028 , G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, and Y1039 may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in regions 1-3 and 2-1 of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant is I7, G8, L9, D10, I11, G12, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588 among regions 1-3 and 2-1 of wild-type SpCas9.
  • I601 may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant is amino acids that do not have polarity among the 1-3 regions and 2-1 regions of wild-type SpCas9, i.e., I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606 and L607 It may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of. .
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in regions 1-3 and 2-2 of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant is K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, I761, E762, M763, R765, E766 among regions 1-3 and 2-2 of wild-type SpCas9.
  • N767 may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant is amino acids that do not have polarity among the 1-3 regions and 2-2 regions of wild-type SpCas9, that is, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, It may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of M761,
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in regions 1-3 and 2-3 of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant is K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, D965, Y981, H982, H983, A984 among regions 1-3 and 2-3 of wild-type SpCas9.
  • H985, D986, A987 and Y988 may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant is amino acids having no polarity among the 1-3 regions and 2-3 regions of wild-type SpCas9, that is, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, It may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of U978,
  • the SpCas9 variant may be in a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in regions 1-3 and 2-4 of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant is K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, among regions 1-3 and 2-4 of wild-type SpCas9.
  • S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029 , A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, and Y1039 may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant is amino acids that do not have polarity among the 1-3 regions and 2-4 regions of wild-type SpCas9, that is, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, Selected from the group consisting of G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 and F1038 It may be in the form of modified two or more amino acids.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in regions 1-4 and 2-1 of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant is two or more amino acids selected from the group consisting of I7, G8, L9, D10, 11, G12, N692, M694, Q695, and H698 of the 1-4 and 2-1 regions of wild-type SpCas9. It may be a modified form.
  • the SpCas9 variant is amino acids that do not have polarity among the 1-4 and 2-1 regions of wild-type SpCas9, that is, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 and I697 may be in a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in regions 1-4 and 2-2 of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant is two or more amino acids selected from the group consisting of N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, and N767 of the 1-4 and 2-2 regions of wild-type SpCas9. It may be a modified form.
  • the SpCas9 variant is amino acids that do not have polarity among the 1-4 and 2-2 regions of wild-type SpCas9, i.e., I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, Two or more selected from the group consisting of L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763 and A764 It may be in the form of a modified amino acid.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in regions 1-4 and 2-3 of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant is composed of N692, M694, Q695, H698, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987 and Y988 among the 1-4 and 2-3 regions of wild-type SpCas9. It may be a modified form of two or more amino acids selected from the group.
  • the SpCas9 variant is amino acids having no polarity among the 1-4 and 2-3 regions of wild-type SpCas9, i.e., I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, It may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of V992, V993, G994, A996, L997, and I998.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in regions 1-4 and 2-4 of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variants are N692, M694, Q695, H698, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010 among wild-type SpCas9 regions 1-4 and 2-4.
  • G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037 And Y1039 may be in the form of modified two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variants are amino acids that do not have polarity among the 1-4 and 2-4 regions of wild-type SpCas9, i.e., I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 and F1038 It may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of .
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in the first region and the second region of wild-type SpCas9.
  • the first area may be a 1-1 area, a 1-2 area, a 1-3 area, and a 1-4 area.
  • the second area may be a 2-1 area, a 2-2 area, a 2-3 area, and a 2-4 area.
  • the SpCas9 variant is I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585 among the first and second regions of wild-type SpCas9.
  • N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004 , E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028 , G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, and Y1039 may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variants are I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205 among the first and second regions of wild-type SpCas9.
  • the Cas9 variant may be a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in the first region and the third region of wild-type Cas9.
  • each of the first region and the third region may include at least one modified amino acid.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in the first region and the third region of wild-type SpCas9.
  • each of the first region and the third region may include at least one modified amino acid.
  • the SpCas9 variant may be in a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in the 1-1 region and the 3-1 region of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant is N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224 among the 1-1 and 3-1 regions of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in the 1-2 region and the 3-1 region of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant is amino acids that do not have polarity among the 1-2 regions of wild-type SpCas9, that is, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391 and L393; And amino acids having a charge in region 3-1, that is, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821.
  • K896 and D898 may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant may be in a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in regions 1-3 and 3-1 of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant is K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, V838, D839, H840, D853, N854 among regions 1-3 and 3-1 of wild-type SpCas9.
  • K855, K862, N863, R864, A889, K890, and L891 may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant is amino acids that do not have polarity among the 1-3 regions of wild-type SpCas9, that is, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606 and L607; And amino acids having a charge in region 3-1, that is, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821.
  • K896 and D898 may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in regions 1-4 and 3-1 of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant is N692, M694, Q695, H698, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889 of wild-type SpCas9 regions 1-4 and 3-1.
  • K890 and L891 may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant may include amino acids that do not have polarity among the 1-4 regions of wild-type SpCas9, ie, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 and I697; And amino acids having a charge in region 3-1, that is, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821.
  • K896 and D898 may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in the first region and the third region of wild-type SpCas9.
  • the first area may be a 1-1 area, a 1-2 area, a 1-3 area, and a 1-4 area.
  • the third area may be a 3-1 area.
  • the SpCas9 variants are A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698 among the first and third regions of wild-type SpCas9.
  • V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, and L891 may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variants are N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226 among the first and third regions of wild-type SpCas9.
  • the Cas9 variant may be a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in the first region and the fourth region of wild-type Cas9.
  • each of the first and fourth regions may include at least one modified amino acid.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in the first region and the fourth region of wild-type SpCas9.
  • each of the first and fourth regions may include at least one modified amino acid.
  • the SpCas9 variant may be in a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in region 1-1 and region 4-1 of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant is N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224 among the 1-1 and 3-1 regions of wild-type SpCas9.
  • L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265 , L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136, and T1138 may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of have.
  • the SpCas9 variant may be in a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in the 1-2 region and the 4-1 region of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant is P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350 among the 1-2 and 4-1 regions of wild-type SpCas9.
  • F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, T1102, S1106, E1108, S1116 , D1117, D1125, D1127, D1135, S1136, and T1138 may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in regions 1-3 and 4-1 of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant is K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117 among regions 1-3 and 4-1 of wild-type SpCas9.
  • D1125, D1127, D1135, S1136, and T1138 may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant is amino acids that do not have polarity among the 1-3 regions of wild-type SpCas9, that is, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606 and L607; And T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136, and T1138 among the 4-1 region.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in regions 1-4 and 4-1 of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variants are N692, M694, Q695, H698, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136, and T1138 of wild-type SpCas9 regions 1-4 and 4-1. It may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant may include amino acids that do not have polarity among the 1-4 regions of wild-type SpCas9, ie, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 and I697; And T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136, and T1138 among the 4-1 region.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in the first region and the fourth region of wild-type SpCas9.
  • the first area may be a 1-1 area, a 1-2 area, a 1-3 area, and a 1-4 area.
  • the fourth area may be a 4-1 area.
  • the SpCas9 variant is A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698 among the first and fourth regions of wild-type SpCas9.
  • T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136, and T1138 may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variants are N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226 among the first and fourth regions of wild-type SpCas9.
  • the Cas9 variant may be a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in the second region and the third region of wild-type Cas9.
  • each of the second region and the third region may include at least one modified amino acid.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in the second region and the third region of wild-type SpCas9.
  • each of the second region and the third region may include at least one modified amino acid.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in the 2-1 region and the 3-1 region of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant is I7, G8, L9, D10, I11, G12, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863 among the 2-1 and 3-1 regions of wild-type SpCas9.
  • R864, A889, K890 and L891 may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant may include amino acids that do not have polarity among the 2-1 region of wild-type SpCas9, ie, I7, G8, L9, 11, G12, V16, G17, W18, A19, V20 and I21; And amino acids having a charge in region 3-1, that is, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821.
  • K896 and D898 may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant may be in a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in the 2-2 region and the 3-1 region of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant is I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863 among the 2-2 and 3-1 regions of wild-type SpCas9.
  • R864, A889, K890 and L891 may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant is amino acids that do not have polarity in the 2-2 region of wild-type SpCas9, that is, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763 and A764; And amino acids having a charge in region 3-1, that is, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821.
  • K896 and D898 may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in the 2-3rd region and the 3-1st region of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant is V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981 among the 2-3-1 regions of wild-type SpCas9.
  • H982, H983, A984, H985, D986, A987 and Y988 may be in a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant is amino acids that do not have polarity among the 2-3 regions of wild-type SpCas9, that is, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997 and I998; And amino acids having a charge in region 3-1, that is, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821.
  • K896 and D898 may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant may be in a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in regions 2-4 and 3-1 of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant is V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, Y1001, P1002 among the 2-4 and 3-1 regions of wild-type SpCas9.
  • K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1026 , E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, and Y1039 may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variants are amino acids that do not have polarity among the 2-4 regions of wild-type SpCas9, that is, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 and F1038; And amino acids having a charge in region 3-1, that is, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821.
  • K896 and D898 may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in the second and third regions of wild-type SpCas9.
  • the second area may be a 2-1 area, a 2-2 area, a 2-3 area, and a 2-4 area.
  • the third area may be a 3-1 area.
  • the SpCas9 variant is I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853 among the second and third regions of wild-type SpCas9.
  • N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, Y981, H982, H983, A984, H985, D965, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008 , V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034 , F1037, F1038 and Y1039 may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variants are I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737 among the second and third regions of wild-type SpCas9.
  • the Cas9 variant may be a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in the second and fourth regions of wild-type Cas9.
  • each of the second region and the fourth region may include at least one modified amino acid.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in the second and fourth regions of wild-type SpCas9.
  • each of the second region and the fourth region may include at least one modified amino acid.
  • the SpCas9 variant may be in a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in region 2-1 and region 4-1 of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variants are I7, G8, L9, D10, I11, G12, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135 among the 2-1 and 4-1 regions of wild-type SpCas9.
  • S1136 and T1138 may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant may include amino acids that do not have polarity among the 2-1 region of wild-type SpCas9, ie, I7, G8, L9, 11, G12, V16, G17, W18, A19, V20 and I21; And T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136, and T1138 among the 4-1 region.
  • the SpCas9 variant may be in a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in the 2-2 region and the 4-1 region of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variants are I761, E762, M763, R765, E766, N767, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135 among the 2-2 and 4-1 regions of wild-type SpCas9.
  • S1136 and T1138 may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant is amino acids that do not have polarity in the 2-2 region of wild-type SpCas9, that is, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763 and A764; And T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136, and T1138 among the 4-1 region.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in the 2-3rd region and the 4-1st region of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant is D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117 among regions 2-3 and 4-1 of wild-type SpCas9.
  • D1125, D1127, D1135, S1136, and T1138 may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant is amino acids that do not have polarity among the 2-3 regions of wild-type SpCas9, that is, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997 and I998; And T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136, and T1138 among the 4-1 region.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in regions 2-4 and 4-1 of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant is Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014 among wild-type SpCas9 regions 2-4 and 4-1.
  • S1106 S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136, and T1138 may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variants are amino acids that do not have polarity among the 2-4 regions of wild-type SpCas9, that is, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 and F1038; And T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136, and T1138 among the 4-1 region.
  • the SpCas9 variant may be in a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in the second and fourth regions of wild-type SpCas9.
  • the second area may be a 2-1 area, a 2-2 area, a 2-3 area, and a 2-4 area.
  • the fourth area may be a 4-1 area.
  • the SpCas9 variant is I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983 among the second and fourth regions of wild-type SpCas9.
  • A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020 , M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, S1127, D1135 And T1138 may be in the form of modified two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variants are I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737 among the second and fourth regions of wild-type SpCas9.
  • the Cas9 variant may be a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in the third and fourth regions of wild-type Cas9.
  • each of the third region and the fourth region may include at least one modified amino acid.
  • the SpCas9 variant may be in a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in the third and fourth regions of wild-type SpCas9.
  • each of the third region and the fourth region may include at least one modified amino acid.
  • the SpCas9 variant may be in a form obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in region 3-1 and region 4-1 of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant is V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, T1102, S1106 among wild-type SpCas9 regions 3-1 and 4-1.
  • E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136, and T1138 may be a modified form of two or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant is amino acids having a charge in the 3-1 region of wild-type SpCas9, that is, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799 , E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873 , E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 and D898; And T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136, and T1138 among the 4-1 region.
  • the Cas9 variant may be a form obtained by modifying three or more amino acids selected from amino acid sequences in the first region, the second region, the third region, and/or the fourth region of the wild-type Cas9. At this time, three or more amino acids may exist in at least two or more regions.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying three or more amino acids selected from amino acid sequences in the first region, the second region, the third region, and/or the fourth region of the wild-type SpCas9. At this time, three or more amino acids may exist in at least two or more regions.
  • the SpCas9 variant may be in a form obtained by modifying three or more amino acids selected from amino acid sequences in the first region, the second region, and the third region of wild-type SpCas9.
  • the first area may be a 1-1 area, a 1-2 area, a 1-3 area, and a 1-4 area.
  • the second area may be a 2-1 area, a 2-2 area, a 2-3 area, and a 2-4 area.
  • the third area may be a 3-1 area.
  • the SpCas9 variant is I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583 among the first, second and third regions of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant is I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202 among the first, second, and third regions of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying three or more amino acids selected from amino acid sequences in the first region, the second region, and the fourth region of wild-type SpCas9.
  • the first area may be a 1-1 area, a 1-2 area, a 1-3 area, and a 1-4 area.
  • the second area may be a 2-1 area, a 2-2 area, a 2-3 area, and a 2-4 area.
  • the fourth area may be a 4-1 area.
  • the SpCas9 variant is I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583 among the first, second and fourth regions of wild-type SpCas9.
  • E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002 , K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1026 , E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 and D1127 may be in a modified form of three or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant is I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202 among the first, second and fourth regions of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying three or more amino acids selected from amino acid sequences in the first region, the third region, and the fourth region of wild-type SpCas9.
  • the first area may be a 1-1 area, a 1-2 area, a 1-3 area, and a 1-4 area.
  • the third area may be a 3-1 area.
  • the fourth area may be a 4-1 area.
  • the SpCas9 variants are A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694 among the first, third and fourth regions of wild-type SpCas9.
  • Q695, H698, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, T1102 and D1127 It may be a modified form of three or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the SpCas9 variant is N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224 among the first, third and fourth regions of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying three or more amino acids selected from amino acid sequences in the second region, third region, and fourth region of wild-type SpCas9.
  • the second area may be a 2-1 area, a 2-2 area, a 2-3 area, and a 2-4 area.
  • the third area may be a 3-1 area.
  • the fourth area may be a 4-1 area.
  • the SpCas9 variant is I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839 among the second, third, and fourth regions of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant is I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733 among the second, third and fourth regions of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 variant may be in a form obtained by modifying four or more amino acids selected from amino acid sequences in the first region, the second region, the third region, and the fourth region of wild-type SpCas9. At this time, four or more amino acids may exist in at least two or more regions.
  • the SpCas9 variant may be a form obtained by modifying four or more amino acids selected from amino acid sequences in the first region, the second region, the third region, and the fourth region of wild-type SpCas9.
  • the first area may be a 1-1 area, a 1-2 area, a 1-3 area, and a 1-4 area.
  • the second area may be a 2-1 area, a 2-2 area, a 2-3 area, and a 2-4 area.
  • the third area may be a 3-1 area.
  • the fourth area may be a 4-1 area.
  • the SpCas9 variant is I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539 among the first, second, third and fourth regions of wild-type SpCas9.
  • the SpCas9 mutant is I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199 among the first, second, third, and fourth regions of wild-type SpCas9.
  • the Cas9 variant may include modification of at least one amino acid selected from the one or more regions.
  • the modification may be the removal of the selected one or more amino acids.
  • the modification may be the removal of one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the first region of wild-type SpCas9.
  • the modification may be the removal of one or more amino acids selected from amino acid sequences within the 1-1 region, the 1-2 region, the region 1-3, and/or the region 1-4 of the wild-type SpCas9.
  • the modification of wild-type SpCas9 is N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L
  • the modification may be the removal of one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the second region of wild-type SpCas9.
  • the modification may be the removal of one or more amino acids selected from amino acid sequences in the 2-1 region, the 2-2 region, the 2-3 region, and/or the region 2-4 of the wild-type SpCas9.
  • the modification may be the removal of one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the third region of wild-type SpCas9.
  • the modification may be the removal of one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the 3-1 region of wild-type SpCas9.
  • the modification of wild-type SpCas9 is K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, It may be the removal of one or more amino acids selected from the group consisting of K896 and D898.
  • the modification may be the removal of one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the fourth region of wild-type SpCas9.
  • the modification may be the removal of one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the 4-1 region of wild-type SpCas9.
  • the modification may be the removal of one or more amino acids selected from the group consisting of T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136, and T1138 in the 4-1 region of wild-type SpCas9.
  • the modification may be the removal of two or more amino acids selected from amino acid sequences in the first region, the second region, the third region and/or the fourth region of the wild-type SpCas9.
  • the modification is a wild-type SpCas9 region 1-1, region 1-2, region 1-3, region 1-4, region 2-1, region 2-2, region 2-3 It may be the removal of two or more amino acids selected from the amino acid sequence in the region, the 2-4 region, the 3-1 region, and/or the 4-1 region.
  • the modification may be a substitution of the selected one or more amino acids with other amino acids.
  • the modification may be a substitution of one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the first region of wild-type SpCas9 with another amino acid.
  • the modification is a substitution of at least one amino acid selected from the amino acid sequence in the region 1-1, region 1-2, region 1-3 and/or region 1-4 of wild-type SpCas9 with stereoisomers.
  • the modification is one or more amino acids selected from the group consisting of wild-type SpCas9 A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 and H698. It may be a substitution with a stereoisomer.
  • the modification may be to replace the 510th lysine (K510) of wild-type SpCas9 with D-lysine.
  • the modification is a relatively hydrophobicity index of at least one amino acid selected from the amino acid sequence in the 1-1 region, the 1-2 region, the 1-3 region, and/or the region 1-4 of the wild-type SpCas9. It may be a substitution with a small amino acid.
  • the modification of wild-type SpCas9 is N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L
  • the modification may be to replace the 539 th phenylalanine (F539, hydrophobicity index: 2.8) of wild-type SpCas9 with serine having a relatively smaller hydrophobicity index (hydrophobicity index: -0.8).
  • the modification may be to replace the 601 th isoleucine (I601, hydrophobicity index: 4.5) of wild-type SpCas9 with asparagine (hydrophobicity index: -3.5) having a relatively smaller hydrophobicity index.
  • the modification is a relative to one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the 1-1 region, the 1-2 region, the 1-3 region and/or the 1-4 region of wild-type SpCas9. It may be a substitution with an amino acid having a large hydrophobicity index.
  • the modification is one or more amino acids selected from the group consisting of wild-type SpCas9 A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 and H698. It may be a substitution with an amino acid having a relatively large hydrophobicity index.
  • the modification may be to replace the 277th asparagine (N277, hydrophobicity index: -3.5) of wild-type SpCas9 with histidine (hydrophobicity index: -3.2) having a relatively larger hydrophobicity index.
  • the modification is relative to one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the 1-1 region, the 1-2 region, the 1-3 region, and/or the region 1-4 of the wild-type SpCas9.
  • a hydrophobicity index may be a substitution with a large or small amino acid.
  • the modification is a relative to one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the 1-1 region, the 1-2 region, the 1-3 region and/or the 1-4 region of wild-type SpCas9. It may be an amino acid having a small functional group.
  • the modification is one or more amino acids selected from the group consisting of wild-type SpCas9 A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 and H698. It may be a substitution with an amino acid having a relatively small functional group.
  • the modification may be to replace the 539th phenylalanine (F539) of wild-type SpCas9 with serine having a relatively small functional group.
  • the modification is relative to one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the 1-1 region, the 1-2 region, the 1-3 region and/or the 1-4 region of the wild-type SpCas9. It may be an amino acid having a large functional group.
  • the modification of wild-type SpCas9 is N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L
  • the modification may be to replace the 203 th alanine (A203) of wild-type SpCas9 with aspartic acid having a relatively large functional group.
  • the modification may be to replace the 366th glycine (G366) of wild-type SpCas9 with serine having a relatively large functional group.
  • the modification is one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the 1-1 region, the 1-2 region, the 1-3 region and/or the 1-4 region of wild-type SpCas9. It may be an amino acid having a relatively large or small functional group.
  • the modification is a relatively hydrophobicity (hydrophobicity) of at least one amino acid selected from the amino acid sequence in the region 1-1, region 1-2, region 1-3 and/or region 1-4 of wild-type SpCas9. ) May be a substitution with a reduced amino acid.
  • the modification of wild-type SpCas9 is N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L
  • the modification is phenylalanine at position 539 (F539, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 2.8) and isoleucine at position 601 (I601, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 4.5) of wild-type SpCas9, respectively.
  • asparagine Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5
  • the modification is a relatively hydrophobic amino acid selected from the amino acid sequence in the 1-1 region, the 1-2 region, the 1-3 region and/or the 1-4 region of wild-type SpCas9. It may be a substitution with an increased amino acid.
  • the modification of wild-type SpCas9 is N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L
  • the modification includes asparagine at position 277 (N277, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5) and phenylalanine at position 682 (F682, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 2.8) of wild-type SpCas9, respectively, and histidine (Kyte- Doolittle hydrophobicity: -3.2) and valine (Kyte-Doolittle hydrophobicity: 4.2) may be substituted.
  • the modification is relatively hydrophobic at least one amino acid selected from the amino acid sequence in the 1-1 region, the 1-2 region, the 1-3 region and/or the region 1-4 of the wild-type SpCas9. This may be a reduced or increased substitution with an amino acid.
  • the modification may be a substitution of one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the second region of wild-type SpCas9 with another amino acid.
  • the modification is a substitution of at least one amino acid selected from the amino acid sequence in the region 2-1, region 2-2, region 2-3 and/or region 2-4 of wild-type SpCas9 with stereoisomers.
  • the modification of wild-type SpCas9 is I7, G8, L9, D10, 11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 and Y1039 It may be a substitution of one or more amino acids selected from the group consisting of stereoisomers.
  • the modification may be to replace the 12th glycine (G12) of wild-type SpCas9 with D-glycine.
  • the modification is a relatively hydrophobic index of at least one amino acid selected from the amino acid sequence in the 2-1 region, the 2-2 region, the 2-3 region, and/or the region 2-4 of the wild-type SpCas9. It may be a substitution with a small amino acid.
  • the modification may be to replace the 1038 th phenylalanine (F1038, hydrophobicity index: 2.8) of wild-type SpCas9 with tyrosine (hydrophobicity index: -1.3) having a relatively smaller hydrophobicity index.
  • the modification is a relatively hydrophobicity index of at least one amino acid selected from the amino acid sequence in the 2-1 region, the 2-2 region, the 2-3 region, and/or the region 2-4 of the wild-type SpCas9. May be a substitution with a large amino acid.
  • the modification may be to replace the 763th methionine of wild-type SpCas9 (M763, hydrophobicity index: 1.9) with isoleucine (hydrophobicity index: 4.5) having a relatively larger hydrophobicity index.
  • the modification may be to replace the 965 th aspartic acid (D965, hydrophobicity index: -3.5) of wild-type SpCas9 with tyrosine (hydrophobicity index: -1.3) having a relatively larger hydrophobicity index.
  • the modification is a relatively hydrophobic one or more amino acids selected from amino acid sequences in the 2-1 region, the 2-2 region, the 2-3 region, and/or the region 2-4 of the wild-type SpCas9. It may be a substitution with an amino acid with a large or small index.
  • the modification is a relative to one or more amino acids selected from amino acid sequences within the 2-1 region, the 2-2 region, the 2-3 region, and/or the region 2-4 of wild-type SpCas9. It may be an amino acid having a small functional group.
  • the modification of wild-type SpCas9 is I7, G8, L9, D10, 11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023,
  • One or more amino acids selected from the group consisting of S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 and Y1039 may be substituted with an amino acid having a relatively small functional group.
  • the modification may be to replace the 763 th methionine (M763) of wild-type SpCas9 with isoleucine having a relatively small functional group.
  • the modification may be to replace the 1007th glutamic acid (E1007) of wild-type SpCas9 with leucine having a relatively small functional group.
  • the modification may be to replace the 763 th methionine (M763) and 1007 th glutamic acid (E1007) of the wild-type SpCas9 with isoleucine and leucine having relatively small functional groups, respectively.
  • the modification is relative to one or more amino acids selected from amino acid sequences within the 2-1 region, the 2-2 region, the 2-3 region, and/or the region 2-4 of the wild-type SpCas9. As such, it may be an amino acid having a large functional group.
  • the modification of wild-type SpCas9 is I7, G8, L9, D10, 11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023,
  • One or more amino acids selected from the group consisting of S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 and Y1039 may be substituted with an amino acid having a relatively large functional group.
  • the modification may be to replace the 1038 th phenylalanine (
  • the modification is one or more amino acids selected from amino acid sequences in the 2-1 region, the 2-2 region, the 2-3 region, and/or the region 2-4 of the wild-type SpCas9. It may be an amino acid having a relatively large or small functional group.
  • the modification is a relatively hydrophobic reduction of at least one amino acid selected from the amino acid sequence in the region 2-1, region 2-2, region 2-3 and/or region 2-4 of wild-type SpCas9. It may be a substitution with an amino acid.
  • the modification is a wild-type SpCas9 at 761 isoleucine (I761, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 4.5) and 1038 phenylalanine (F1038, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 2.8), respectively, with relatively reduced hydrophobic methionine (Kyte- Doolittle hydrophobicity: 1.9) and tyrosine (Kyte-Doolittle hydrophobicity: -1.3) may be substituted.
  • the modification is a relatively hydrophobic amino acid selected from the amino acid sequence in the region 2-1, region 2-2, region 2-3 and/or region 2-4 of wild-type SpCas9. It may be a substitution with an increased amino acid.
  • the modification includes methionine at position 763 (M763, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.9) and alanine at position 932 (A932, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.8) of wild-type SpCas9, respectively, and isoleucine (Kyte- Doolittle hydrophobicity: 4.5) and cysteine (Kyte-Doolittle hydrophobicity: 2.5) may be substituted.
  • the modification is a relatively hydrophobic one or more amino acids selected from amino acid sequences in the 2-1 region, the 2-2 region, the 2-3 region, and/or the region 2-4 of the wild-type SpCas9. This may be a reduced or increased substitution with an amino acid.
  • the modification may be a substitution of one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the third region of wild-type SpCas9 with another amino acid.
  • the modification may be a substitution of at least one amino acid selected from the amino acid sequence in the region 3-1 of wild-type SpCas9 with a stereoisomer.
  • the modification may be a substitution of one or more amino acids selected from the group consisting of V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 and L891 of wild-type SpCas9 into stereoisomers.
  • the modification may be to replace the 853th aspartic acid (D853) of wild-type SpCas9 with D-aspartic acid.
  • the modification may be a substitution of one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the 3-1 region of wild-type SpCas9 with an amino acid having a relatively small hydrophobicity index.
  • the modification is one or more amino acids selected from the group consisting of wild-type SpCas9 V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 and L891 as an amino acid having a relatively small hydrophobicity index. It may be a substitution of.
  • the modification may be to replace the 862 th lysine (K862, hydrophobicity index: -3.9) of wild-type SpCas9 with arginine (hydrophobicity index: -4.5) having a relatively smaller hydrophobicity index.
  • the modification may be a substitution of at least one amino acid selected from the amino acid sequence in the region 3-1 of wild-type SpCas9 with an amino acid having a relatively large hydrophobicity index.
  • the modification is one or more amino acids selected from the group consisting of wild-type SpCas9 V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 and L891 as an amino acid having a relatively large hydrophobicity index. It may be a substitution of.
  • the modification may be to replace the 890 th lysine (K890, hydrophobicity index: -3.9) of wild-type SpCas9 with asparagine (hydrophobicity index: -3.5) having a relatively larger hydrophobicity index.
  • the modification may be a substitution of one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the 3-1 region of wild-type SpCas9 with an amino acid having a relatively large or small hydrophobicity index.
  • the modification may be an amino acid having a relatively small size of at least one amino acid selected from the amino acid sequence in the 3-1 region of wild-type SpCas9.
  • the modification is one or more amino acids selected from the group consisting of wild-type SpCas9 V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 and L891 having a relatively small functional group. It may be a substitution with an amino acid.
  • the modification may be to replace the 890 th lysine (K890) of wild-type SpCas9 with asparagine having a relatively small functional group.
  • the modification may be an amino acid having a relatively large functional group of at least one amino acid selected from the amino acid sequence in the 3-1 region of wild-type SpCas9.
  • the modification is one or more amino acids selected from the group consisting of wild-type SpCas9 V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 and L891 having a relatively large functional group. It may be a substitution with an amino acid.
  • the modification may be to replace the 863th asparagine (N863) of wild-type SpCas9 with arginine having a relatively large functional group.
  • the modification may be an amino acid having a relatively large or small functional group in one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the 3-1 region of wild-type SpCas9.
  • the modification may be a substitution of at least one amino acid selected from the amino acid sequence in the region 3-1 of wild-type SpCas9 with an amino acid having a relatively reduced hydrophobicity.
  • the modification of wild-type SpCas9 is K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895,
  • One or more amino acids selected from the group consisting of K896 and D898 may be substituted with an amino acid having a relatively reduced hydrophobicity.
  • the modification is a wild-type SpCas9 glutamic acid at 779 (E779, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5) and lysine at 862 (K862, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.9), respectively, with relatively reduced hydrophobicity (Kyte -Doolittle hydrophobicity: -3.9) and arginine (Kyte-Doolittle hydrophobicity: -4.5) may be substituted.
  • the modification may be a substitution of at least one amino acid selected from the amino acid sequence in the region 3-1 of wild-type SpCas9 with an amino acid having relatively increased hydrophobicity.
  • the modification of wild-type SpCas9 is K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895,
  • One or more amino acids selected from the group consisting of K896 and D898 may be substituted with an amino acid having relatively increased hydrophobicity.
  • the modification is 827th glutamic acid (E827, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5) and 890th lysine (K890, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.9) of wild-type SpCas9, respectively, with relatively increased hydrophobicity of methionine (Kyte -Doolittle hydrophobicity: 1.9) and asparagine (Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5) may be substituted.
  • the modification may be a substitution of one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the 3-1 region of wild-type SpCas9 with an amino acid having a relatively reduced or increased hydrophobicity.
  • the modification may be a substitution of one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the fourth region of wild-type SpCas9 with another amino acid.
  • the modification may be a substitution of at least one amino acid selected from the amino acid sequence in the 4-1 region of wild-type SpCas9 with a stereoisomer.
  • the modification may be a substitution of one or more amino acids selected from the group consisting of T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 and T1138 of wild-type SpCas9 to stereoisomers.
  • the modification may be to replace the 1127th aspartic acid (D1127) of wild-type SpCas9 with D-aspartic acid.
  • the modification may be a substitution of one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the 4-1 region of wild-type SpCas9 with an amino acid having a relatively small hydrophobicity index.
  • the modification may be a substitution of one or more amino acids selected from the group consisting of T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 and T1138 of wild-type SpCas9 with an amino acid having a relatively small hydrophobicity index.
  • the modification may be to replace the 1102 th threonine (T1102, hydrophobicity index: -0.7) of wild-type SpCas9 with proline (hydrophobicity index: -1.6) having a relatively smaller hydrophobicity index.
  • the modification may be a substitution of one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the 4-1 region of wild-type SpCas9 with an amino acid having a relatively large hydrophobicity index.
  • the modification may be a substitution of one or more amino acids selected from the group consisting of T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 and T1138 of wild-type SpCas9 with an amino acid having a relatively large hydrophobicity index.
  • the modification may be to replace the 1106th serine of wild-type SpCas9 (S1106, hydrophobicity index: -0.8) with glycine (hydrophobicity index: -0.4) having a relatively larger hydrophobicity index.
  • the modification may be a substitution of one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the 4-1 region of wild-type SpCas9 with an amino acid having a relatively large or small hydrophobicity index.
  • the modification may be an amino acid having a relatively small size of at least one amino acid selected from the amino acid sequence in the 4-1 region of wild-type SpCas9.
  • the modification is the substitution of one or more amino acids selected from the group consisting of T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 and T1138 of wild-type SpCas9 with an amino acid having a relatively small functional group.
  • the modification may be to replace the 1102 th threonine (T1102) of wild-type SpCas9 with proline having a relatively small functional group.
  • the modification may be an amino acid having a relatively large functional group of at least one amino acid selected from the amino acid sequence in the 4-1 region of wild-type SpCas9.
  • the modification is the substitution of one or more amino acids selected from the group consisting of T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 and T1138 of wild-type SpCas9 with an amino acid having a relatively large functional group.
  • the modification may be to replace the 1127 th aspartic acid (D1127) of wild-type SpCas9 with glutamic acid having a relatively large functional group.
  • the modification may be an amino acid having a relatively large or small functional group in one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the 4-1 region of wild-type SpCas9.
  • the modification may be a substitution of at least one amino acid selected from the amino acid sequence in the 4-1 region of wild-type SpCas9 with an amino acid having a relatively reduced hydrophobicity.
  • the modification may be a substitution of one or more amino acids selected from the group consisting of T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136, and T1138 of wild-type SpCas9 with an amino acid having a relatively reduced hydrophobicity.
  • the modification may be to replace glutreonine at 1102 (T1102, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -0.7) of wild-type SpCas9 with proline (Kyte-Doolittle hydrophobicity: -1.6) having a relatively reduced hydrophobicity.
  • the modification may be a substitution of one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the 4-1 region of wild-type SpCas9 with an amino acid having relatively increased hydrophobicity.
  • the modification may be a substitution of at least one amino acid selected from the group consisting of T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136, and T1138 of wild-type SpCas9 with an amino acid with increased relatively hydrophobicity.
  • the modification may be to replace glutamic acid at 1108 (E1108, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5) of wild-type SpCas9 with methionine having relatively increased hydrophobicity (Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.9).
  • the modification may be a substitution of one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the 4-1 region of wild-type SpCas9 with an amino acid having a relatively reduced or increased hydrophobicity.
  • the modification may be a substitution of two or more amino acids selected from amino acid sequences in the first region, the second region, the third region and/or the fourth region of the wild-type SpCas9 with another amino acid.
  • the modification is a wild-type SpCas9 region 1-1, region 1-2, region 1-3, region 1-4, region 2-1, region 2-2, region 2-3
  • Two or more amino acids selected from the amino acid sequence in the region, the 2-4 region, the 3-1 region, and/or the region 4-1 may be substituted with each stereoisomer.
  • the modification of wild-type SpCas9 is I7, G8, L9, D10, 11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024,
  • the eighth glycine (G8) of wild-type SpCas9 is L-glycine and the 767th asparagine (N767) is L-asparagine
  • the modification is the eighth glycine (G8) and 767th asparagine of wild-type SpCas9 (N767). May be substituted with D-glycine and D-asparagine, respectively.
  • the modification is a wild-type SpCas9 region 1-1, region 1-2, region 1-3, region 1-4, region 2-1, region 2-2, region 2-3
  • Two or more amino acids selected from among the amino acid sequences in the region, the 2-4 region, the 3-1 region and/or the region 4-1 may be substituted with an amino acid having a relatively small hydrophobicity index, respectively.
  • the modification of wild-type SpCas9 is I7, G8, L9, D10, 11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, Two or more amino acids selected from the group
  • the modification is aspartic acid (hydrophobic index: -3.5) with a relatively smaller hydrophobic index of wild-type SpCas9 at 203 alanine (A203, hydrophobicity index: 1.8) and 539th phenylalanine (F539, hydrophobicity index: 2.8), respectively. ) And serine (hydrophobicity index: -0.8).
  • the modification is a wild-type SpCas9 at 601 isoleucine (I601, hydrophobicity index: 4.5) and 1102 th threonine (T1102, hydrophobicity index: -0.7), respectively, asparagine (hydrophobicity index:- 3.5) and proline (hydrophobicity index: -1.6) may be substituted.
  • the modification is the wild-type SpCas9 region 1-1, region 1-2, region 1-3, region 1-4, region 2-1, region 2-2, region 2-
  • Two or more amino acids selected from amino acid sequences in region 3, region 2-4, region 3-1, and/or region 4-1 may be substituted with amino acids having a relatively large hydrophobicity index, respectively.
  • the modification of wild-type SpCas9 is I7, G8, L9, D10, 11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, Two or more amino acids selected from the group
  • the modification is alanine (hydrophobicity index: -3.2) and 1007th glutamic acid (E1007, hydrophobicity index: -3.5) of wild-type SpCas9 at position 840 (hydrophobicity index: 1.8), respectively. ) And leucine (hydrophobicity index: 3.8).
  • the modification includes methionine at position 763 (M763, hydrophobicity index: 1.9) and glutamic acid at position 1007 (E1007, hydrophobicity index: -3.5) of wild-type SpCas9, respectively, isoleucine (hydrophobic index: 4.5) with a relatively higher hydrophobicity index. ) And leucine (hydrophobicity index: 3.8).
  • the modification is the wild-type SpCas9 region 1-1, region 1-2, region 1-3, region 1-4, region 2-1, region 2-2, region 2
  • Two or more amino acids selected from the amino acid sequence in the -3 region, the 2-4 region, the 3-1 region and/or the 4-1 region may be substituted with an amino acid having a relatively large or small hydrophobicity index, respectively.
  • the modification of wild-type SpCas9 is I7, G8, L9, D10, 11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, Two or more amino acids selected from the group
  • the modification is alanine (hydrophobic index: -3.5) and 840 th histidine (H840, hydrophobic index: -3.2) of wild-type SpCas9, respectively, with a relatively higher hydrophobic index (hydrophobic index: 1.8), and the 539th phenylalanine (F539, hydrophobicity index: 2.8) of wild-type SpCas9 may be substituted with serine having a relatively smaller hydrophobicity index (hydrophobicity index: -0.8).
  • the modification is relative to the 763th methionine of wild-type SpCas9 (M763, hydrophobicity index: 1.9), 890th lysine (K890, hydrophobicity index: -3.9) and 1007th glutamic acid (E1007, hydrophobicity index: -3.5), respectively.
  • the modification is the wild-type SpCas9 region 1-1, region 1-2, region 1-3, region 1-4, region 2-1, region 2-2, region
  • Two or more amino acids selected from the amino acid sequences in the 2-3 region, the 2-4 region, the 3-1 region and/or the 4-1 region may each be an amino acid having a relatively small functional group have.
  • the modification of wild-type SpCas9 is I7, G8, L9, D10, 11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, Two or more amino acids selected from the group
  • the branch can be a substitution with an amino acid.
  • the modification includes serine and isoform having relatively small functional groups, respectively, of wild-type SpCas9 at 539th phenylalanine (F539), 763th methionine (M763), 890th lysine (K890), and 1007th glutamic acid (E1007). It may be substituted with leucine, asparagine and leucine.
  • the modification is the wild-type SpCas9 region 1-1, region 1-2, region 1-3, region 1-4, region 2-1, region 2-2, Two or more amino acids selected from amino acid sequences in region 2-3, region 2-4, region 3-1, and/or region 4-1 are each an amino acid having a relatively large functional group I can.
  • the modification is to replace wild-type SpCas9 at 601 isoleucine (I601), 1038 phenylalanine (F1038), and 1127 aspartic acid (D1127) with asparagine, tyrosine, and glutamic acid having a relatively large functional group, respectively.
  • I601 isoleucine I601
  • 1038 phenylalanine F1038
  • 1127 aspartic acid D1127
  • the modification is the wild-type SpCas9 region 1-1, region 1-2, region 1-3, region 1-4, region 2-1, region 2-2 , Two or more amino acids selected from the amino acid sequences in the 2-3rd region, the 2-4 region, the 3-1 region and/or the 4-1 region, respectively, a functional group having a relatively large or small size.
  • Branches can be amino acids.
  • the modification includes serine and isoform having relatively small functional groups, respectively, of wild-type SpCas9 at 539th phenylalanine (F539), 763th methionine (M763), 890th lysine (K890), and 1007th glutamic acid (E1007).
  • Leucine, asparagine and leucine are substituted, and the 601 isoleucine (I601) and 1038 phenylalanine (F1038) may be substituted with asparagine and tyrosine having a relatively large functional group, respectively.
  • the modification is a wild-type SpCas9 region 1-1, region 1-2, region 1-3, region 1-4, region 2-1, region 2-2, region 2-3
  • Two or more amino acids selected from among the amino acid sequences in the region, the 2-4 region, the 3-1 region, and/or the region 4-1 may be substituted with an amino acid having relatively reduced hydrophobicity, respectively.
  • the modification is phenylalanine at position 539 (F539, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 2.8) of wild-type SpCas9, isoleucine at position 601 (I601, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 4.5) and threonine at position 1102 (T1102, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -0.7) may be substituted with relatively reduced hydrophobic serine (Kyte-Doolittle hydrophobicity: -0.8), asparagine (Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5) and proline (Kyte-Doolittle hydrophobicity: -1.6).
  • the modification is the wild-type SpCas9 region 1-1, region 1-2, region 1-3, region 1-4, region 2-1, region 2-2, region 2-
  • Two or more amino acids selected from among the amino acid sequences in region 3, region 2-4, region 3-1, and/or region 4-1 may be substituted with amino acids having relatively increased hydrophobicity, respectively.
  • the modification is the 10th aspartic acid of wild-type SpCas9 (D10, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5), the 763th methionine (M763, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.9), the 840th histidine (H840, Kyte-Doolittle hydrophobicity).
  • the modification is the wild-type SpCas9 region 1-1, region 1-2, region 1-3, region 1-4, region 2-1, region 2-2, region 2
  • Two or more amino acids selected from the amino acid sequences in the -3 region, the 2-4 region, the 3-1 region and/or the 4-1 region may be substituted with an amino acid whose hydrophobicity is decreased or increased, respectively.
  • the modification is a wild-type SpCas9 at 763 methionine (M763, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.9), 890 lysine (K890, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.9) and 1007 glutamic acid (E1007, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5) is substituted with relatively increased hydrophobicity of isoleucine (Kyte-Doolittle hydrophobicity: 4.5), asparagine (Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5) and leucine (Kyte-Doolittle hydrophobicity: 3.8), respectively, and the wild-type SpCas9
  • the 539th phenylalanine F539, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 2.8
  • the modification may be a substitution of the selected one or more amino acids with the same number of other amino acids.
  • the modification may be to replace one isoleucine located in the first region of wild-type SpCas9 with one asparagine.
  • the modification may be to substitute one phenylalanine located in the first region of the wild-type SpCas9 and one lysine located in the third region with one serine (first region) and one asparagine (third region), respectively.
  • the modification includes one methionine and one glutamic acid located in the second region of wild-type SpCas9, and one lysine located in the third region, respectively, one isoleucine, one leucine (second region), and one asparagine (third region). Region).
  • the modification may be a substitution of the selected one or more amino acids with an unequal number of other amino acids.
  • the modification may be to replace one threonine located in the second region of wild-type SpCas9 with cysteine-alanine-alanine, that is, a total of three amino acids.
  • the modification is to substitute methionine-valine (first region) and proline (third region) for one glutamine located in the first region of wild-type SpCas9 and glycine-serine, two consecutive amino acids located in the third region, respectively. Can be.
  • the modification is one serine located in the first region of wild-type SpCas9, lysine-lysine-tyrosine, which is three consecutive amino acids located in the second region, and serine-isoleucine, which is two consecutive amino acids located in the third region, respectively. It may be substituted with alanine (first region), methionine-proline (second region), and cysteine-alanine-threonine-valine (third region).
  • the artificially engineered Cas9 may be a Cas9 variant in which at least one amino acid is added to at least one selected from the first region, the second region, the third region, and the fourth region of the wild-type Cas9.
  • the addition may be the addition of one or more amino acids to the N-terminal and/or C-terminal positions of one or more amino acids present in the selected one or more regions.
  • the addition may be the addition of one or more amino acids at the N-terminal and/or C-terminal positions of one or more amino acids present in the first, second, third and/or fourth regions of wild-type SpCas9. .
  • the addition is at least one positive charge at the N-terminal and/or C-terminal position of one or more amino acids present in the first region, the second region, the third region and/or the fourth region of wild-type SpCas9. It may be the addition of an amino acid having
  • the addition may be the addition of one arginine to the C-terminus of one selected alanine located in the region 1-1 of wild-type SpCas9.
  • the addition may be obtained by adding two amino acids, arginine-lysine, to the N-terminus of the selected glutamic acid located in the 2-2 region of wild-type SpCas9.
  • the addition may be obtained by adding two amino acids, arginine-histidine, to the N-terminus of the selected leucine located in the 3-1 region of wild-type SpCas9.
  • the addition adds two amino acids, lysine-histidine, to the C-terminus of the selected leucine located in the 3-1 region of wild-type SpCas9, and one lysine to the C-terminus of the selected tyrosine located in the 4-1 region. May be added.
  • the addition is at least one N-terminal and/or C-terminal position of one or more amino acids present in the first region, the second region, the third region and/or the fourth region of wild-type SpCas9. It may be the addition of an amino acid having a negative charge.
  • the addition may be obtained by adding one aspartic acid to the N-terminus of one selected glycine located in the 1-2 region of wild-type SpCas9.
  • the addition may be obtained by adding three amino acids, glutamic acid-aspartic acid-glutamic acid, to the C-terminus of the selected methionine located in the 2-3rd region of wild-type SpCas9.
  • the addition may be obtained by adding two amino acids, glutamic acid-glutamic acid, to the N-terminus of the selected isoleucine located in the 3-1 region of wild-type SpCas9.
  • the addition adds two amino acids glutamic acid-aspartic acid to the C-terminus of the selected phenylalanine located in the region 1-1 of wild-type SpCas9, and also adds one to the N-terminus of the selected glutamine located in the region 2-1. It may be that aspartic acid is added.
  • the addition is one at the N-terminal and/or C-terminal position of one or more amino acids present in the first region, the second region, the third region and/or the fourth region of wild-type SpCas9. It may be the addition of amino acids that do not have an above charge.
  • the addition may be the addition of two amino acids, serine-valine, to the C-terminus of one selected phenylalanine located in the region 1-1 of wild-type SpCas9.
  • the addition may be obtained by adding five amino acids, glycine-proline-glutamine-phenylalanine-leucine, to the N-terminus of the selected histidine located in the 2-1 region of wild-type SpCas9.
  • the addition may be obtained by adding two amino acids, alanine-alanine, to the N-terminus of the selected asparagine located in the 3-1 region of wild-type SpCas9.
  • the addition adds two amino acids, phenylalanine-leucine, to the C-terminus of the selected aspartic acid located in the 1-1 region of wild-type SpCas9, and also adds one to the N-terminus of the selected glutamine located in the 1-2 region. It may be added serine.
  • the addition is a positive charge at the N-terminal and/or C-terminal position of one or more amino acids present in the first region, the second region, the third region and/or the fourth region of wild-type SpCas9.
  • the branch may be the addition of one or more amino acids selected from amino acids, amino acids having a negative charge, and amino acids having no charge.
  • the addition may be the addition of six amino acids, histidine-arginine-glycine-serine-alanine-glutamic acid, to the C-terminus of one selected arginine located in the 1-2 region of wild-type SpCas9.
  • the addition is 10 amino acids lysine-lysine-alanine-phenylalanine-glutamine-threonine-methionine-cysteine-aspartic acid-serine at the N-terminus of one selected glycine located in the 3-1 region of wild-type SpCas9.
  • the addition adds two amino acids, phenylalanine-histidine, to the C-terminus of the selected methionine located in the 2-1 region of wild-type SpCas9, and one lysine to the N-terminus of the selected glutamine located in the 2-3 region. May be added.
  • the addition adds two amino acids, aspartic acid-serine, to the C-terminus of the selected lysine located in the 1-1 region of wild-type SpCas9, and six amino acids to the N-terminus of the selected valine located in the 2-4 region.
  • Glutamine-threonine-methionine-cysteine-aspartic acid-lysine was added, and two amino acids, arginine-glycine, were added to the C-terminus of the selected glutamine located in the 4-1 region.
  • the addition may be the addition of one or more functional domains to the N-terminal and/or C-terminal positions of one or more amino acids present in the selected one or more regions.
  • the functional domain may be a domain having an additional function in addition to the original function of wild-type Cas9, that is, a first function of cutting the first strand of DNA double strands and a second function of cutting the second strand of DNA double strands. have.
  • the functional domain is a domain having a function similar to the original function of wild-type Cas9, that is, a first function of cutting the first strand of DNA and/or a second function of cutting the second strand of double strands of DNA.
  • the addition may be the addition of one or more functional domains at the N-terminal and/or C-terminal positions of one or more amino acids present in the first, second, third and/or fourth regions of wild-type SpCas9. have.
  • the artificially engineered Cas9 may be a target-specific Cas9.
  • Target specific Cas9 refers to a Cas9 variant, which is artificially engineered to increase target specificity compared to wild-type Cas9.
  • the “target specificity” is when Cas9 forms a gRNA-Cas9 complex through interaction with gRNA and is close to or localized to a target gene or nucleic acid, that is, a target (nucleic acid) to be manipulated using Cas9, complementary to gRNA. It means to allow the Cas9 to specifically act on the target sequence for proper binding.
  • the target sequence for complete complementary binding (100%) with gRNA is termed on-target, and incomplete complementary binding (less than 100%) with gRNA, that is, includes one or more non-complementary binding
  • the target specificity may vary depending on the degree of complementary binding between the gRNA and the target sequence.
  • the target specificity may be the highest.
  • the target sequence for complementary binding to gRNA is off-target, that is, the complementary binding between the gRNA and the target sequence is less than 100% and contains one or more non-complementary bindings
  • the target specificity is on-target. Compared to the reduced state, the target specificity may further decrease as the number of non-complementary bonds increases.
  • the target specificity when the complementary binding between the gRNA and the target sequence is complete complementary binding (100%), when the target specificity is 100%, when one non-complementary binding between the gRNA and the target sequence is included, that is, gRNA When the complementary binding between the and the target sequence is incomplete complementary binding (95%), the target specificity may be 95%.
  • the target specificity when four non-complementary bonds between the gRNA and the target sequence are included, that is, when the complementary bond between the gRNA and the target sequence is incomplete complementary bond (80%), the target specificity may be 80%.
  • the target sequence for complementary binding to gRNA is off-target, that is, the complementary binding between the gRNA and the target sequence is less than 100%, that is, contains one or more non-complementary binding
  • the target specificity is the It may differ depending on the location of the non-complementary combination.
  • the target specificity when including one non-complementary binding between the gRNA and the target sequence, when the position of the non-complementary binding is located close to the PAM adjacent to the target sequence, the target specificity is that the position of the non-complementary binding is far from the PAM.
  • the target specificity may be lower than that of a remote location.
  • the target specificity may vary depending on the degree of interaction between the target sequence and the complementary gRNA and Cas9.
  • the target specificity may increase as the number of non-complementary binding between the gRNA and the target sequence decreases.
  • target specificity when including one non-complementary bond compared to when it includes three non-complementary bonds between the gRNA and the target sequence is reduced.
  • target specificity when the interaction between the gRNA and Cas9 complementarily bound to the target sequence is reduced, target specificity may be obtained only when the complementary binding between the gRNA and the target sequence is complete complementary binding (100%).
  • the target sequence when the interaction between the gRNA complementarily bound to the target sequence and Cas9 is reduced, the target sequence may have target specificity only when the target sequence is on-target.
  • the target specificity may vary depending on the degree of interaction of Cas9 with the target sequence complementarily bound to the gRNA.
  • the target specificity may increase as the number of non-complementary binding between the gRNA and the target sequence decreases.
  • target specificity when it includes two non-complementary bonds compared to when it includes four non-complementary bonds between the gRNA and the target sequence can be relatively increased.
  • target specificity when the interaction between the target sequence and Cas9 complementarily bound to the gRNA is reduced, target specificity may be obtained only when the complementary binding between the gRNA and the target sequence is complete complementary binding (100%).
  • the target sequence when the interaction between the target sequence complementarily bound to the gRNA and Cas9 is reduced, the target sequence may have target specificity only when the target sequence is on-target.
  • the target-specific Cas9 may be a Cas9 variant that manipulates on-target.
  • the manipulation may be to modify the nucleotide sequence of the on-target so as to cut the nucleotide sequence of the on-target using the Cas9 variant or delete and/or insert one or more nucleotides in the nucleotide sequence of the on-target.
  • the target-specific Cas9 may be a Cas9 variant having the same or increased target specificity for the on-target as the wild-type Cas9.
  • the target-specific Cas9 may be a Cas9 variant that does not manipulate off-targets.
  • the manipulation may be to modify the nucleotide sequence of the off-target so as to cut off the nucleotide sequence of the off-target using the Cas9 variant or delete and/or insert one or more nucleotides in the nucleotide sequence of the off-target.
  • the target-specific Cas9 may be a Cas9 variant having a reduced target specificity for off-target compared to wild-type Cas9.
  • the target-specific Cas9 may have the same target specificity for the on-target as that of the wild-type Cas9, and the target specificity for the off-target may be a Cas9 variant with reduced compared to the wild-type Cas9.
  • the target-specific Cas9 may have the same target specificity for the off-target as the wild-type Cas9, and the target specificity for the on-target may be an increased Cas9 variant compared to the wild-type Cas9.
  • the target-specific Cas9 may be a Cas9 variant whose target specificity for on-target is increased compared to wild-type Cas9, and target specificity for off-target is reduced compared to wild-type Cas9.
  • the target-specific Cas9 may be a Cas9 variant whose target specificity for on-target is reduced compared to wild-type Cas9, and target specificity for off-target is reduced compared to wild-type Cas9.
  • the target-specific Cas9 may be a target-specific SpCas9.
  • Target specific SpCas9 refers to a SpCas9 variant, which is artificially engineered to increase target specificity compared to wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant that manipulates the on-target.
  • the manipulation may be to modify the nucleotide sequence of the on-target so that one or more nucleotides can be deleted and/or inserted into the nucleotide sequence of the on-target or cut the nucleotide sequence of the on-target using the SpCas9 variant.
  • the TS-SpCas9 may be an SpCas9 mutant having the same or increased target specificity for the on-target as that of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 may be an SpCas9 variant that does not manipulate off-targets.
  • the manipulation may be to modify the nucleotide sequence of the off-target so as to cut off the nucleotide sequence of the off-target using the SpCas9 variant, or delete and/or insert one or more nucleotides in the nucleotide sequence of the off-target.
  • the TS-SpCas9 may be an SpCas9 mutant having a reduced target specificity for off-target compared to wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 has the same target specificity for the on-target as that of the wild-type SpCas9, and the target specificity for the off-target may be a reduced SpCas9 variant compared to the wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 has the same target specificity for off-target as wild-type SpCas9, and the target specificity for on-target may be an increased SpCas9 variant compared to wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 may have an increased target specificity for on-target compared to wild-type SpCas9, and a target specificity for off-target may be a reduced SpCas9 variant compared to wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 may have a reduced target specificity for on-target compared to wild-type SpCas9, and a target specificity for off-target may be a reduced SpCas9 variant compared to wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant obtained by modifying at least one amino acid of amino acid sequences in one or more regions selected from the first region, the second region, the third region, and the fourth region of wild-type SpCas9.
  • the first region may be an amino acid sequence (region 1-1) from the 196 th phenylalanine (F196) to the 282 th isoleucine (I282) of wild-type SpCas9.
  • the first region may be an amino acid sequence (region 1-2) from the 316 th proline (P316) to the 394 th asparagine (N394) of wild-type SpCas9.
  • the first region may be an amino acid sequence (region 1-3) from 510th lysine (K510) to 612th asparagine (N612) of wild-type SpCas9.
  • the first region may be an amino acid sequence (regions 1-4) from 678 th threonine (T678) to 698 th histidine (H698) of wild-type SpCas9.
  • the first region is the amino acid sequence from the 196th phenylalanine (F196) to the 282th isoleucine (I282) of the wild-type SpCas9 (region 1-1), the amino acid from the 316th proline (P316) to the 394th asparagine (N394) Sequence (region 1-2), amino acid sequence from 510 lysine (K510) to 612 asparagine (N612) (region 1-3) and amino acid from 678 threonine (T678) to 698 histidine (H698) It may be two regions selected from the sequence (regions 1-4).
  • the first region is the amino acid sequence from the 196th phenylalanine (F196) to the 282th isoleucine (I282) of the wild-type SpCas9 (region 1-1), the amino acid from the 316th proline (P316) to the 394th asparagine (N394) Sequence (region 1-2), amino acid sequence from 510 lysine (K510) to 612 asparagine (N612) (region 1-3) and amino acid from 678 threonine (T678) to 698 histidine (H698) It may be three regions selected from the sequence (regions 1-4).
  • the first region is the amino acid sequence from the 196th phenylalanine (F196) to the 282th isoleucine (I282) of the wild-type SpCas9 (region 1-1), the amino acid from the 316th proline (P316) to the 394th asparagine (N394) Sequence (region 1-2), amino acid sequence from 510 lysine (K510) to 612 asparagine (N612) (region 1-3) and amino acid from 678 threonine (T678) to 698 histidine (H698) Sequence (regions 1-4).
  • the second region may be an amino acid sequence (region 2-1) from the first methionine (M1) to the 22 threonine (T22) of wild-type SpCas9.
  • the second region may be an amino acid sequence (region 2-2) from 731 th proline (P731) to 770 th threonine (T770) of wild-type SpCas9.
  • the second region may be an amino acid sequence (region 2-3) from 926 glutamine (Q926) to 1000 lysine (K1000) of wild-type SpCas9.
  • the second region may be an amino acid sequence (region 2-4) from the 1001 th tyrosine (Y1001) to the 1040 th serine (S1040) of wild-type SpCas9.
  • the second region is the amino acid sequence from the first methionine (M1) to the 22nd threonine (T22) (region 2-1) and the amino acid sequence from the 731st proline (P731) to the 770th threonine (T770) of wild-type SpCas9 It may be (area 2-2).
  • the second region is the amino acid sequence from the first methionine (M1) to the 22nd threonine (T22) (region 2-1) and the amino acid sequence from the 926 glutamine (Q926) to the 1000th lysine (K1000) of wild-type SpCas9 It may be (area 2-3).
  • the second region is the amino acid sequence from the 1st methionine (M1) to the 22nd threonine (T22) of the wild-type SpCas9 (region 2-1) and the amino acid sequence from the 1001st tyrosine (Y1001) to the 1040th serine (S1040) It may be (area 2-4).
  • the second region is the amino acid sequence from the 731st proline (P731) to the 770th threonine (T770) of the wild-type SpCas9 (region 2-2) and the amino acid sequence from the 926th glutamine (Q926) to the 1000th lysine (K1000) It may be (area 2-3).
  • the second region is the amino acid sequence from the 731 th proline (P731) to the 770 th threonine (T770) (region 2-2) of the wild-type SpCas9 and the amino acid sequence from the 1001 th tyrosine (Y1001) to the 1040 th serine (S1040). It may be (area 2-4).
  • the second region is the amino acid sequence from the 926 glutamine (Q926) to the 1000 lysine (K1000) (region 2-3) of the wild-type SpCas9 and the amino acid sequence from the 1001 tyrosine (Y1001) to the 1040 serine (S1040). It may be (area 2-4).
  • the second region is the amino acid sequence from the first methionine (M1) to the 22nd threonine (T22) (region 2-1) of the wild-type SpCas9, and the amino acid sequence from the 731st proline (P731) to the 770th threonine (T770). (Region 2-2) and the amino acid sequence (region 2-3) from 926 glutamine (Q926) to 1000 lysine (K1000).
  • the second region is the amino acid sequence from the first methionine (M1) to the 22nd threonine (T22) (region 2-1) of the wild-type SpCas9, and the amino acid sequence from the 731st proline (P731) to the 770th threonine (T770). (Region 2-2) and an amino acid sequence (region 2-4) from the 1001 th tyrosine (Y1001) to the 1040 th serine (S1040).
  • the second region is the amino acid sequence from the first methionine (M1) to the 22nd threonine (T22) (region 2-1) of the wild-type SpCas9, and the amino acid sequence from the 926 glutamine (Q926) to the 1000th lysine (K1000). (Region 2-3) and an amino acid sequence (region 2-4) from the 1001 th tyrosine (Y1001) to the 1040 th serine (S1040).
  • the second region is the amino acid sequence from the 731st proline (P731) to the 770th threonine (T770) of the wild-type SpCas9 (region 2-2), and the amino acid sequence from the 926th glutamine (Q926) to the 1000th lysine (K1000) (Region 2-3) and an amino acid sequence (region 2-4) from the 1001 th tyrosine (Y1001) to the 1040 th serine (S1040).
  • the second region is the amino acid sequence from the first methionine (M1) to the 22nd threonine (T22) (region 2-1) of the wild-type SpCas9, and the amino acid sequence from the 731st proline (P731) to the 770th threonine (T770).
  • (Region 2-2) amino acid sequence from glutamine at position 926 (Q926) to lysine at position 1000 (K1000) (region 2-3) and amino acid sequence from tyrosine at position 1001 (Y1001) to serine at position 1040 (S1040) It may be (area 2-4).
  • the third region may be an amino acid sequence (region 3-1) from the 775th lysine (K775) to the 900th leucine (L900) of wild-type SpCas9.
  • the fourth region may be an amino acid sequence (region 4-1) from glutamic acid at 1099 (E1099) to valine at 1139 (V1139) of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant obtained by modifying one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the first region of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant obtained by modifying one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the 1-1 region of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 is N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, among the 1-1 region of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant obtained by modifying one or more amino acids selected from amino acid sequences in the 1-2 region of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 is P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, among the 1-2 regions of wild-type SpCas9.
  • G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391 and L393 It may be a SpCas9 variant modified with one or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the TS-SpCas9 may be an SpCas9 variant obtained by modifying one or more amino acids selected from amino acid sequences in the 1-3 region of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 is K510, L513, L514, Y515, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, among the 1-3 regions of wild-type SpCas9.
  • V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, E584, D585, F587, N588, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, and L607 may be a SpCas9 variant modified with one or more amino acids selected from the group consisting of.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant obtained by modifying one or more amino acids selected from amino acid sequences in regions 1-4 of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 is one or more amino acids selected from the group consisting of I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, N692, F693, M694, Q695, L696, I697 and H698 among the 1-4 regions of wild-type SpCas9. It may be a modified SpCas9 variant.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant obtained by modifying one or more amino acids selected from amino acid sequences in the 1-1, 1-2, 1-3, and 1-4 regions of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 is N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, among regions 1-1, 1-2, 1-3, and 1-4 of wild-type SpCas9, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366,
  • the TS-SpCas9 is A203 of wild-type SpCas9; N277; G366; F539; Or it may be an SpCas9 variant modified with I601.
  • the TS-SpCas9 is wild-type SpCas9 A203/N277 (A203 and N277); A203/G366; A203/F539; Or it may be a SpCas9 variant modified with A203/I601.
  • the TS-SpCas9 is N277/G366 of wild-type SpCas9; N277/F539; Or it may be SpCas9 modified with N277/I601.
  • the TS-SpCas9 is G366/F539 of wild-type SpCas9; G366/I601; Or it may be SpCas9 modified with F539/I601.
  • the TS-SpCas9 is A203/N277/G366 of wild-type SpCas9; A203/N277/F539; A203/N277/I601; A203/G366/F539; A203/G366/I601; A203/F539/I601; N277/G366/F539; N277/G366/I601; Or it may be SpCas9 modified with G366/F539/I601.
  • the TS-SpCas9 is A203/N277/G366/F539 of wild-type SpCas9; A203/N277/G366/I601; A203/N277/F539/I601; A203/G366/F539/I601; Or it may be SpCas9 modified with N277/G366/F539/I601.
  • the TS-SpCas9 may be an SpCas9 variant obtained by modifying A203/N277/G366/F539/I601 of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant obtained by modifying one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the second region of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 may be an SpCas9 variant obtained by modifying one or more amino acids selected from the amino acid sequence in region 2-1 of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 is a SpCas9 variant in which at least one amino acid selected from the group consisting of I7, G8, L9, D10, 11, G12, V16, G17, W18, A19, V20 and I21 among the 2-1 region of wild-type SpCas9 is modified.
  • at least one amino acid selected from the group consisting of I7, G8, L9, D10, 11, G12, V16, G17, W18, A19, V20 and I21 among the 2-1 region of wild-type SpCas9 is modified.
  • the TS-SpCas9 may be an SpCas9 variant obtained by modifying one or more amino acids selected from the amino acid sequence in region 2-2 of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 is P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, among the 2-2 regions of wild-type SpCas9.
  • E762, M763, A764, R765, E766, and N767 may be a SpCas9 variant modified at least one amino acid selected from the group consisting of.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant obtained by modifying one or more amino acids selected from amino acid sequences in the 2-3rd region of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 is I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, among the 2-3rd regions of wild-type SpCas9.
  • Number of SpCas9 variants modified at least one amino acid selected from the group consisting of V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997 and I998 have.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant obtained by modifying one or more amino acids selected from amino acid sequences in regions 2-4 of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 is Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, among the 2-4 regions of wild-type SpCas9.
  • Number of SpCas9 variants modified at least one amino acid selected from the group consisting of R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 and Y1039 have.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant obtained by modifying one or more amino acids selected from amino acid sequences in the 2-1 region, the 2-2 region, the 2-3 region, and the 2-4 region of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 is I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, among regions 2-1, 2-2, and 2-3 of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 is Y1001 of wild-type SpCas9; P1002; K1003; L1004; E1005; S1006; E1007; F1008; V1009; Y1010; G1011; D1012; Y1013; K1014; V1015; Y1016; D1017; V1018; R1019; K1020; M1021; I1022; A1023; K1024; S1025; E1026; Q1027; E1028; I1029; Or it may be a SpCas9 variant modified with G1030.
  • the TS-SpCas9 is M763 of wild-type SpCas9; D965; E1007 or F1038 may be a modified SpCas9 variant.
  • the TS-SpCas9 is M763/D965 of wild-type SpCas9; M763/E1007; M763/F1038; D965/E1007; E1007/F1038 or D965/F1038 may be a modified SpCas9 variant.
  • the TS-SpCas9 is M763/D965/E1007 of wild-type SpCas9; M763/D965/F1038; M763/E1007/F1038; Or it may be a SpCas9 variant modified with D965/E1007/F1038.
  • the TS-SpCas9 may be an SpCas9 variant obtained by modifying M763/D965/E1007/F1038 of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant obtained by modifying one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the third region of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant obtained by modifying one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the 3-1 region of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 is K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, among the 3-1 regions of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 may be an SpCas9 variant obtained by modifying K890 of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 may be an SpCas9 variant obtained by modifying one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the fourth region of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant obtained by modifying one or more amino acids selected from the amino acid sequence in the 4-1 region of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant in which at least one amino acid selected from the group consisting of T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136, and T1138 among the 4-1 region of wild-type SpCas9 is modified.
  • the TS-SpCas9 may be an SpCas9 variant obtained by modifying T1102 or D1127 of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 may be an SpCas9 variant obtained by modifying T1102/D1127 of wild-type SpCas9.
  • the TS-SpCas9 may be an SpCas9 variant obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in the first region and the second region of wild-type SpCas9.
  • each of the first region and the second region may include at least one modified amino acid.
  • the TS-SpCas9 is one or more amino acids selected from amino acid sequences in the 1-1, 1-2, 1-3, and/or 1-4 regions of wild-type SpCas9; And it may be a SpCas9 variant obtained by modifying one or more amino acids selected from amino acid sequences in the 2-1 region, the 2-2 region, the 2-3 region, and/or the region 2-4, respectively.
  • the TS-SpCas9 is N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, among regions 1-1, 1-2, 1-3, and/or 1-4 of wild-type SpCas9, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G
  • the TS-SpCas9 is A203/M763 of wild-type SpCas9; A203/D965; A203/E1007; A203/F1038; A203/M763/D965; A203/M763/E1007; A203/M763/F1038; A203/D965/E1007; A203/D965/F1038; D965/E1007/F1038; A203/M763/D965/E1007; A203/M763/D965/F1038; A203/M763/E1007/F1038; A203/D965/E1007/F1038; A203/M763/D965/E1007/F1038; A203/D965/E1007/F1038; A203/M763/D965/E1007/F1038; N277/M763; N277/D965; N277/E1007; N277/F1038; N2
  • the TS-SpCas9 is A203/N277/M763 of wild-type SpCas9; A203/N277/D965; A203/N277/E1007; A203/N277/F1038; A203/N277/M763/D965; A203/N277/M763/E1007; A203/N277/M763/F1038; A203/N277/D965/E1007; A203/N277/D965/F1038; A203/N277/E1007/F1038; A203/N277/M763/D965/E1007; A203/N277/M763/D965/F1038; A203/N277/M763/E1007/F1038; A203/N277/M763/E1007/F1038; A203/N277/M763/E1007/F1038; A203/N277/M763/E1007
  • the TS-SpCas9 is A203/N277/G366/M763 of wild-type SpCas9; A203/N277/G366/D965; A203/N277/G366/E1007; A203/N277/G366/F1038; A203/N277/G366/M763/D965; A203/N277/G366/M763/E1007; A203/N277/G366/M763/F1038; A203/N277/G366/D965/E1007; A203/N277/G366/D965/F1038; A203/N277/G366/E1007/F1038; A203/N277/G366/M763/D965/E1007; A203/N277/G366/M763/D965/E1007; A203/N277/G366/M763/D965/E
  • the TS-SpCas9 is A203/N277/G366/F539/M763 of wild-type SpCas9; A203/N277/G366/F539/D965; A203/N277/G366/F539/E1007; A203/N277/G366/F539/F1038; A203/N277/G366/F539/M763/D965; A203/N277/G366/F539/M763/E1007; A203/N277/G366/F539/M763/F1038; A203/N277/G366/F539/D965/E1007; A203/N277/G366/F539/D965/E1007; A203/N277/G366/F539/D965/F1038; A203/N277/G366/F539/E1007/F1038;
  • the TS-SpCas9 may be a SpCas9 variant obtained by modifying two or more amino acids selected from amino acid sequences in the first region and the third region of wild-type SpCas9. At this time, two or more amino acids may exist in different regions, respectively.
  • the TS-SpCas9 is one or more amino acids selected from amino acid sequences in region 1-1, region 1-2, region 1-3, and/or region 1-4 of wild-type SpCas9; And it may be a SpCas9 variant in which at least one amino acid selected from the amino acid sequence in the region 3-1 is modified.
  • the TS-SpCas9 is N199, I201, N202, A203, G205, V206 among wild-type SpCas9 in region 1-1, region 1-1, region 1-2, region 1-3, and/or region 1-4.
  • K890, L891, R895, K896, and D898 may be SpCas9 variants each modified at least one amino acid selected from the group consisting of.
  • the TS-SpCas9 is A203/K890 of wild-type SpCas9; N277/K890; G366/K890; F539/K890; Or it may be a SpCas9 variant modified with I601/K890.
  • the TS-SpCas9 is A203/N277/K890 of wild-type SpCas9; A203/G366/K890; A203/F539/K890; A203/I601/K890; N277/G366/K890; N277/F539/K890; N277/I601/K890; G366/F539/K890; G366/I601/K890; Or it may be a SpCas9 variant modified with F539/I601/K890.
  • the TS-SpCas9 is A203/N277/G366/K890 of wild-type SpCas9; A203/N277/F539/K890; A203/N277/I601/K890; A203/G366/F539/K890; A203/G366/I601/K890; A203/F539/I601/K890; N277/G366/F539/K890; N277/G366/I601/K890; Or it may be a SpCas9 variant modified with G366/F539/I601/K890.

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Abstract

본 발명은 인위적으로 조작된 CRISPR/Cas9 시스템에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 표적 특이성이 향상된 인위적으로 조작된 CRISPR 효소 및 이를 포함하는 인위적으로 조작된 CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 게놈 및/또는 후생유전자(epigenome)의 조작 또는 변형, 게놈 표적화, 게놈 교정 및 체외 진단 등의 용도에 관한 것이다.

Description

표적 특이적 CRISPR 변이체
본 발명은 인위적으로 조작된 CRISPR-Cas9 시스템에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 표적 특이성이 향상된 인위적으로 조작된 CRISPR 효소 및 이를 포함하는 인위적으로 조작된 CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 게놈 및/또는 후생유전자(epigenome)의 조작 또는 변형, 게놈 표적화, 게놈 교정 및 체외 진단 등의 용도에 관한 것이다.
CRISPR-Cas9 시스템은 표적하는 유전자 또는 핵산에 상보적인 서열을 가지는 guide RNA(gRNA)와 표적하는 유전자 또는 핵산을 절단할 수 있는 뉴클레아제인 CRISPR 효소로 구성되며, gRNA와 CRISPR 효소는 CRISPR 복합체를 형성하고, 형성된 CRISPR 복합체에 의해 표적하는 유전자 또는 핵산을 절단 또는 변형시킨다.
하지만 상기와 같은 표적하는 유전자 또는 핵산을 변형시키는 효과와 더불어 원하지 않는 비표적 유전자 또는 핵산을 변형시키는 문제가 아직까지 해결되지 않고 있다. 상기 비표적 유전자 또는 핵산은 gRNA와 일부 상보적인 서열을 가지는 유전자 위치로서, 상기 gRNA와 부분적인 상보적 결합을 형성할 수 있으며, 이러한 부분적인 상보적 결합은 CRISPR 복합체가 해당 유전자 위치, 즉, 변형의 대상이 아닌 비표적 유전자 또는 핵산을 절단 또는 변형시킬 수 있다.
그러므로, CRISPR-Cas9 시스템을 이용한 표적하는 유전자 또는 핵산을 특이적으로 변형시키는 효율을 증대하기 위해, 또는 비표적 유전자 또는 핵산의 변형으로 초래될 수 있는 유전적 결합 등의 문제점을 해결하기 위해 CRISPR-Cas9 시스템의 표적 특이성을 증가시키는 것이 중요하다. 이러한 CRISPR-Cas9 시스템의 표적 특이성을 증가시키기 위해서, 비표적 유전자 후보가 적은 gRNA 선정과 함께 CRISPR 효소의 활성 및/또는 특이성을 조절하는 등의 다양한 연구가 시도되고 있다.
[선행기술문헌]
특허문헌
(특허문헌 001) WO 2019-009682
(특허문헌 002) WO 2017-217768
비특허문헌
(비특허문헌 0001) Kim, D. et al. Nat Methods 12, 237-243, 231 p following 243 (2015)
(비특허문헌 0002) Tsai, S.Q. et al. Nat Biotechnol 33, 187-197 (2015)
(비특허문헌 0003) Kim, S., Kim, D., Cho, S.W., Kim, J. & Kim, J.S. Genome Res 24, 1012-1019 (2014)
(비특허문헌 0004) Cho, S.W. et al. Genome Res 24, 132-141 (2014)
(비특허문헌 0005) Mali, P. et al. Nat Biotechnol 31, 833-838 (2013)
(비특허문헌 0006) Ran, F.A. et al. Cell 154, 1380-1389 (2013)
(비특허문헌 0007) Fu, Y., Sander, J.D., Reyon, D., Cascio, V.M. & Joung, J.K. Nat Biotechnol 32, 279-284 (2014)
(비특허문헌 0008) Nishimasu, H. et al. Cell 156, 935-949 (2014)
(비특허문헌 0009) Kleinstiver, B.P. et al. Nature 529, 490-495 (2016)
(비특허문헌 0010) Slaymaker, I.M. et al. Science 351, 84-88 (2016)
(비특허문헌 0011) Chen, J.S. et al. Nature (2017)
(비특허문헌 0012) Kleinstiver, B.P. et al. Nat Biotechnol 33, 1293-1298 (2015)
(비특허문헌 0013) Kleinstiver, B.P. et al. Nature 523, 481-485 (2015)
(비특허문헌 0014) Chen, Z. & Zhao, H. Nucleic Acids Res 33, e154 (2005)
(비특허문헌 0015) Hsu, P.D. et al. Nat Biotechnol 31, 827-832 (2013)
(비특허문헌 0016) McKenzie, G.J. & Craig, N.L. BMC Microbiol 6, 39 (2006)
(비특허문헌 0017) Kulcsar, P.I. et al. Genome Biol 18, 190 (2017)
(비특허문헌 0018) Zhang, D. et al. Genome Biol 18, 191 (2017)
(비특허문헌 0019) Komor, A.C., Kim, Y.B., Packer, M.S., Zuris, J.A. & Liu, D.R. Nature 533, 420-424 (2016)
(비특허문헌 0020) Kim, D., Kim, S., Park, J. & Kim, J.S. Genome Res 26, 406-415 (2016)
(비특허문헌 0021) Geissmann, Q. PLoS One 8, e54072
본 발명의 일 구체예로서 표적 특이성이 향상된 인위적으로 조작된 CRISPR 효소를 제공하고자 한다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위한 인위적으로 조작된 CRISPR 효소에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 표적 유전자 또는 핵산에 대한 표적 특이성이 향상된 Cas9 및 이를 이용한 CRISPR-Cas9 시스템에 관한 것이다.
본 발명은 특정 목적을 위해 인위적으로 조작된 CRISPR 효소를 제공한다.
구현예에서, 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 인위적인 조작을 포함하는 SpCas9 변이체로서, 상기 인위적인 조작은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9(SpCas9)의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop) 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 인위적인 조작을 포함하는 것일 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 표적 특이성이 향상된 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)는 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM(Protospacer adjacent motif)과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용하는 영역일 수 있다.
상기 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)는 SpCas9의 1001번째 타이로신(Y1001)부터 1030번째 글리신(G1030)까지의 아미노산 서열로 구성된 영역일 수 있다.
이때, 상기 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)는 SpCas9의 Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029 및 G1030을 포함하는 것일 수 있다.
상기 SpCas9의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop) 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산은 SpCas9의 Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029 및 G1030으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산인 것일 수 있다.
이때, 상기 SpCas9의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop) 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산은 SpCas9의 E1007인 것일 수 있다.
상기 인위적인 조작은 SpCas9의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop) 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 제거(deletion)일 수 있다.
상기 인위적인 조작은 SpCas9의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop) 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
이때, 상기 다른 아미노산은 SpCas9의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop) 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산에 비해 상대적으로 기능기(functional group)의 크기가 작은 아미노산일 수 있다.
상기 “기능기(functional group)”는 아민(-NH2) 및 카르복시(-COOH)와 함께 아미노산을 구성하는 요소로, 기능기의 종류 및 위치에 따라 아미노산의 특성이 달라질 수 있다. 기능기는 사이드 체인(side chain) 또는 측쇄로도 불린다.
이때, 상기 다른 아미노산은 SpCas9의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop) 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산에 비해 상대적으로 기능기(functional group)의 크기가 큰 아미노산일 수 있다.
이때, 상기 다른 아미노산은 SpCas9의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop) 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산에 비해 상대적으로 소수성 지표(hydropathy index)가 큰 아미노산일 수 있다.
상기 다른 아미노산은 SpCas9의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop) 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산에 비해 상대적으로 소수성 지표(hydropathy index)가 작은 아미노산일 수 있다.
이때, 상기 다른 아미노산은 생리학적 pH(pH7.4)에서 기능기의 전하(charge)가 중성(neutral) 전하인 아미노산일 수 있다.
상기 SpCas9 변이체는 A203, N277, G366, F539, I601, M763, K890, D965, F1038, T1102 및 D1127으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 인위적인 변형을 추가로 더 포함할 수 있다.
이때, 상기 SpCas9 변이체는 F539, M763 및 K890의 인위적인 변형을 추가로 더 포함할 수 있다.
구현예에서, 상기 SpCas9 변이체는 SpCas9의 1007번째 글루탐산의 인위적인 조작을 포함하는 표적 특이적 SpCas9(Target specific SpCas9; TS-SpCas9) 변이체일 수 있다.
상기 인위적인 조작은 SpCas9의 1007번째 글루탐산의 제거 또는 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
이때, 상기 다른 아미노산은 SpCas9의 1007번째 글루탐산에 비해 상대적으로 기능기의 크기가 크거나 또는 작은 아미노산일 수 있다.
이때, 상기 다른 아미노산은 SpCas9의 1007번째 글루탐산에 비해 상대적으로 소수성 지표가 크거나 또는 작은 아미노산일 수 있다.
이때, 상기 다른 아미노산은 생리학적 pH(pH7.4)에서 중성 전하(neutral charge)를 가지는 아미노산일 수 있다.
이때, 상기 다른 아미노산은 류신 또는 프롤린일 수 있다.
상기 TS-SpCas9 변이체는 A203, N277, G366, F539, I601, M763, K890, D965, F1038, T1102 및 D1127으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 인위적인 변형을 추가로 더 포함할 수 있다.
이때, 상기 TS-SpCas9 변이체는 F539, M763 및 K890의 인위적인 변형을 추가로 더 포함할 수 있다.
구현예에서, 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 상기 TS-SpCas9 변이체를 포함하는 융합 단백질일 수 있다.
상기 융합 단백질은 하나 이상의 기능적(functional) 도메인을 포함할 수 있다.
이때, 상기 기능적(functional) 도메인은 메틸라아제(methylase) 활성, 디메틸라아제(demethylase) 활성, 전사촉진(transcription activation) 활성, 전사 저해(transcription repression) 활성, 전사 방출 인자(transcription release factor) 활성, 히스톤 변형(histone modification) 활성, RNA 절단(cleavage) 활성 또는 핵산 결합(nucleic acid binding) 활성을 가지는 도메인; 단백질(펩타이드 포함)의 분리정제를 위한 태그(tag) 또는 리포터 유전자; NLS(nuclear localization sequence or signal) 또는 NES(nuclear export sequence or signal); 및 디아미네이즈(deaminase)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
구현예에서, 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 상기 SpCas9 변이체, TS-SpCas9 변이체 및/또는 융합 단백질을 암호화하는 핵산의 형태일 수 있다.
구현예에서, 상기 핵산은 벡터에 포함될 수 있다.
구현예에서, 상기 SpCas9 변이체, TS-SpCas9 변이체 및/또는 융합 단백질을 암호화하는 핵산은 세포에 도입될 수 있다.
구현예에서, 상기 SpCas9 변이체, TS-SpCas9 변이체 및/또는 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터는 세포에 도입될 수 있다.
구현예에서, 상기 SpCas9 변이체, TS-SpCas9 변이체 및/또는 융합 단백질은 gRNA와 함께 사용하여 세포의 게놈을 인위적으로 조작할 수 있다.
상기 gRNA는 상기 세포의 게놈 내에 존재하는 표적 유전자의 표적 서열에 상보적 결합을 하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산일 수 있다.
본 발명은 인위적으로 조작된 CRISPR 효소를 통해 표적 특이성이 향상된 CRISPR-Cas 시스템을 게놈 및/또는 후생유전자(epigenome)의 조작 또는 변형, 게놈 표적화, 게놈 교정 및 체외 진단 등에 이용할 수 있다.
도 1은 Cas9 변이체 라이브러리의 스크리닝 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 Cas9 변이체 라이브러리의 스크리닝 후 얻은 Cas9 변이체를 정리한 표이다.
도 3은 각 변이체의 EMX1 유전자의 온-타겟 및 오프-타겟에 대한 indel(%)을 나타낸 그래프이다.
도 4는 E1007을 다양한 아미노산으로 치환한 Cas9 변이체를 이용한 EMX1 유전자의 온-타겟 및 오프-타겟에 대한 indel(%)을 나타낸 그래프이다.
도 5는 E1007을 다양한 아미노산으로 치환한 Cas9 변이체를 이용한 DMD 유전자의 온-타겟 및 오프-타겟에 대한 indel(%)을 나타낸 그래프이다.
도 6은 E1007을 알라닌, 아르기닌, 류신, 프롤린, 세린 또는 타이로신으로 치환한 Cas9 변이체를 이용한 EMX1 유전자의 온-타겟 및 오프-타겟에 대한 indel(%)을 나타낸 그래프이다.
도 7은 E1007을 알라닌, 아르기닌, 류신, 프롤린, 세린 또는 타이로신으로 치환한 Cas9 변이체를 이용한 FANCF02 유전자의 온-타겟 및 오프-타겟에 대한 indel(%)을 나타낸 그래프이다.
도 8은 E1007을 알라닌, 아르기닌, 류신, 프롤린, 세린 또는 타이로신으로 치환한 Cas9 변이체를 이용한 ZSCAN2 유전자의 온-타겟 및 오프-타겟에 대한 indel(%)을 나타낸 그래프이다.
도 9는 E1007을 알라닌, 아르기닌, 류신, 프롤린, 세린 또는 타이로신으로 치환한 Cas9 변이체를 이용한 RUNX1 유전자의 온-타겟 및 오프-타겟에 대한 indel(%)을 나타낸 그래프이다.
도 10은 E1007을 알라닌, 아르기닌, 류신, 프롤린, 세린 또는 타이로신으로 치환한 Cas9 변이체를 이용한 DMD 유전자의 온-타겟 및 오프-타겟에 대한 indel(%)을 나타낸 그래프이다.
도 11은 E1007을 알라닌, 아르기닌, 류신, 프롤린, 세린 또는 타이로신으로 치환한 Cas9 변이체를 이용한 HBB02 유전자의 온-타겟 및 오프-타겟에 대한 indel(%)을 나타낸 그래프이다.
도 12는 E1007을 알라닌, 아르기닌, 류신, 프롤린, 세린 또는 타이로신으로 치환한 Cas9 변이체를 이용한 HBB03 유전자의 온-타겟 및 오프-타겟에 대한 indel(%)을 나타낸 그래프이다.
도 13은 E1007을 알라닌, 아르기닌, 류신, 프롤린, 세린 또는 타이로신으로 치환한 Cas9 변이체를 이용한 HBB04 유전자의 온-타겟 및 오프-타겟에 대한 indel(%)을 나타낸 그래프이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사 또는 동일한 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 이하에 기재된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 다른 참고문헌은 전체가 참고로 포함된다. 추가로, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 태양은 CRISPR 효소에 관한 것이다.
“CRISPR 효소”는 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)-Cas(CRISPR-associated protein) 시스템의 주요 단백질 구성 요소로, guide RNA(gRNA)와 복합체를 형성하여 CRISPR-Cas 시스템을 형성한다.
상기 “gRNA”는 표적 유전자 또는 핵산에 대한 gRNA-CRISPR 효소 복합체, 즉, CRISPR 복합체를 특이적 표적화할 수 있는 RNA를 지칭하며, gRNA는 표적서열에 대한 특이적 RNA로서 CRISPR 효소과 결합하여 CRISPR 효소를 표적 유전자 또는 핵산으로 인도할 수 있다. 이때, 상기 “표적서열”은 표적 유전자 또는 핵산 내에 존재하는 뉴클레오타이드 서열로, 구체적으로는 표적 유전자 또는 핵산 내에 표적 영역의 일부 뉴클레오타이드 서열이며, 이때 “표적 영역”은 표적 유전자 또는 핵산 내에 가이드핵산-에디터단백질에 의해 변형될 수 있는 부위이다.
상기 gRNA는 다수의 도메인을 포함할 수 있다. 각각의 도메인에 의해 3차원 형태 또는 gRNA의 활성 형태의 가닥내 또는 가닥간 상호작용을 할 수 있다.
gRNA는 단일가닥 gRNA(단일 RNA 분자; single gRNA; sgRNA); 또는 이중 gRNA(하나 초과의 통상적으로 2개의 별개의 RNA 분자를 포함함)로서 지칭될 수 있다.
일 구체예에서, 단일가닥 gRNA는 5’으로부터 3’ 방향으로 가이드 도메인, 즉 표적 유전자 또는 핵산에 상보적인 결합을 할 수 있는 가이드 서열(guide sequence)를 포함하는 도메인; 제 1 상보적 도메인; 연결 도메인; 제 2 상보적 도메인, 상기 제 1 상보적 도메인 서열에 상보적인 서열을 가지므로 제 1 상보적 도메인과 이중가닥 핵산을 형성할 수 있는 도메인; 근위 도메인(proximal domain); 및 선택적으로 꼬리 도메인을 포함할 수 있다.
다른 일 구체예로서, 이중 gRNA는 5’으로부터 3’ 방향으로 가이드 도메인, 즉 표적 유전자 또는 핵산에 상보적인 결합을 할 수 있는 가이드 서열(guide sequence)를 포함하는 도메인 및 제 1 상보적 도메인을 포함하는 제 1가닥; 및 제 2 상보적 도메인, 상기 제 1 상보적 도메인 서열에 상보적인 서열을 가지므로 제 1 상보적 도메인과 이중가닥 핵산을 형성할 수 있는 도메인, 근위 도메인(proximal domain); 및 선택적으로 꼬리 도메인을 포함하는 제 2 가닥을 포함할 수 있다.
이때, 상기 제 1가닥은 crRNA라고 지칭될 수 있고, 상기 제 2가닥은 tracrRNA로 지칭될 수 있다. 상기 crRNA는 가이드 도메인과 제 1 상보적 도메인을 포함할 수 있으며, 상기 tracrRNA는 제 2 상보적 도메인, 근위 도메인 및 선택적으로 꼬리 도메인을 포함할 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 단일가닥 gRNA는 3’으로부터 5’ 방향으로 가이드 도메인, 즉 표적 유전자 또는 핵산에 상보적인 결합을 할 수 있는 가이드 서열(guide sequence)를 포함하는 도메인; 제 1 상보적 도메인; 및 제 2 상보적 도메인, 상기 제 1 상보적 도메인 서열에 상보적인 서열을 가지므로 제 1 상보적 도메인과 이중가닥 핵산을 형성할 수 있는 도메인을 포함할 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 CRISPR 효소를 암호화하는 서열을 가지는 핵산 또는 폴리펩타이드(또는 단백질)일 수 있으며, 대표적으로 Type II CRISPR 효소 또는 Type V CRISPR 효소가 많이 사용된다.
상기 CRISPR 효소는 Type II CRISPR 효소일 수 있다.
상기 Type II CRISPR 효소는 Cas9일 수 있다.
이때, 상기 Cas9은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 스타필로코커스 아우레스(Staphylococcus aureus), 노카르디옵시스 다손빌레이(Nocardiopsis dassonvillei), 스트렙토마이세스 프리스티네스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 알리사이클로바클루스 아시도칼다리우스(AlicyclobacHlus acidocaldarius), 바실러스 슈도마이코이데스(Bacillus pseudomycoides), 바실러스 셀레니티레두센스(Bacillus selenitireducens), 엑시구오박테리움 시비리쿰(Exiguobacterium sibiricum), 락토바실러스 델브루에키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 미크로스 킬라 마리나(Microscilla marina), 부르크홀데리아레스 박테리움(Burkholderiales bacterium), 폴라로모나스 나프탈레니보란스(Polaromonas naphthalenivorans), 폴라로모나스 속(Polaromonas sp.), 크로코스파에라 와트소니이(Crocosphaera watsonii), 시아노테세 속(Cyanothece sp.), 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa), 시네코코커스 속(Synechococcus sp.), 아세토할로비움 아라바티쿰(Acetohalobium arabaticum), 암모니펙스 데겐시이(Ammonifex degensii), 칼디셀룰로시럽토 베시이(Caldicelulosiruptor bescii), 칸디다투스 데술포루디스(Candidatus Desulforudis), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile), 피네골디아 마그나(Finegoldia magna), 나트라나에로비우스 써모필러스 (Natranaerobius thermophilus), 펠로토마쿨럼 써모프로피오니쿰(Pelotomaculum thermopropionicum), 아시디티오바실러스 칼두스(Acidithiobacillus caldus), 아시디티오바실러스 페로옥시단스(Acidithiobacillus ferrooxidans), 알로크로마티움 비노숨(Allochromatium vinosum), 마리노박터 속(Marinobacter sp.), 니트로소코커스 할로필러스(Nitrosococcus halophilus), 니트로소코커스 와트소니(Nitrosococcus watsoni), 슈도알테로 모나스 할로플란크티스(Pseudoalteromonas haloplanktis), 크테도노박테르 라세미페르(Ktedonobacter racemifer), 메타노할로비움 에베스티가툼(Methanohalobium evestigatum), 아나베나 바리아빌리스(Anabaena variabilis), 노둘라리아 스푸미게나(Nodularia spumigena), 노스톡 속(Nostoc sp.), 아르트로스피라 맥시마(Arthrospira maxima), 아르트로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 아르트로스피라 속(Arthrospira sp.), 링비아속(Lyngbya sp.), 마이크로콜레우스 크토노플라스테스(Microcoleus chthonoplastes), 오실라토리아 속(Oscillatoria sp.), 페트로토가 모빌리스(Petrotoga mobilis), 써모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus) 또는 아카리오클로리스 마리나(Acaryochloris marina) 등 다양한 미생물 유래의 Cas9일 수 있다.
이때, 상기 Cas9은 자연상태에서 존재하는 미생물에서 분리된 것 또는 재조합적 방법 또는 합성적 방법을 통해 비자연적으로 생산된 것일 수 있다.
Type II CRISPR 효소의 결정 구조는 2종 이상의 자연유래 미생물 Type II CRISPR 효소 분자에 대한 연구(Jinek et al., Science, 343(6176):1247997, 2014) 및 gRNA와 함께 복합체를 이루는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9(SpCas9)에 대한 연구(Nishimasu et al., Cell, 156:935-949, 2014; 및 Anders et al., Nature, 2014, doi: 10.1038/nature13579)를 통해 결정되었다.
상기 Type II CRISPR 효소는 2개의 로브, 즉, 인식(REC) 및 뉴클레아제(NUC) 로브를 포함하며, 각각의 로브는 여러 개의 도메인을 포함한다.
상기 REC 로브는 아르기닌-풍부 브릿지 나선(BH), REC1 도메인 및 REC2 도메인을 포함한다.
이때, 상기 BH 도메인은 긴 α-나선 및 아르기닌 풍부 영역이며, 상기 REC1 및 REC2 도메인은 gRNA 내의 형성되는 이중가닥의, 예를 들어, 단일가닥 gRNA, 이중 gRNA 또는 tracrRNA의 인식에 중요한 역할을 한다.
상기 NUC 로브는 RuvC 도메인, HNH 도메인 및 PAM-상호작용(PI) 도메인을 포함한다. 이때, 상기 RuvC 도메인은 RuvC-유사 도메인을 포괄하는 의미로 사용되고, 또한 상기 HNH 도메인은 HNH-유사 도메인을 포괄하는 의미로 사용된다.
이때, 상기 RuvC 도메인은 Type II CRISPR 효소를 포함하는 자연상태에 존재하는 미생물의 구성원에 대해 구조적으로 유사성을 공유하며, 단일가닥, 예를 들어 표적 유전자 또는 핵산의 비상보성 가닥, 즉, gRNA와 상보적인 결합을 하지 않는 가닥을 절단한다. 상기 RuvC 도메인은 종종 당업계에서 RuvCI 도메인, RuvCII 도메인 및 RuvCIII 도메인으로서, 통상적으로 RuvC I, RuvCII 및 RuvCIII로 지칭된다.
상기 HNH 도메인은 HNH 엔도뉴클레아제와 구조적 유사성을 공유하며, 단일 가닥, 예를 들어 표적 핵산 분자의 상보성 가닥, 즉, gRNA와 상보적인 결합을 하는 가닥을 절단한다. HNH 도메인은 RuvC II와 III 모티프 사이에 위치한다.
상기 PI 도메인은 표적 유전자 또는 핵산 내의 특정 뉴클레오타이드서열, 즉, PAM(Protospacer adjacent motif)을 인식하거나 또는 PAM과 상호작용한다. 이때, 상기 PAM은 Type II CRISPR 효소의 유래(origin)에 따라 다를 수 있다. 예를 들어, CRISPR 효소가 SpCas9 인 경우 PAM은 5'-NGG-3'일 수 있고, 스트렙토코커스 써모필러스 Cas9(StCas9)인 경우 PAM은 5'-NNAGAAW-3'(W = A or T)일 수 있고, 스타필로코커스 아우레스 Cas9(SaCas9)인 경우 PAM은 5’-NNGRR-3’(R = A or G)일 수 있고, 네이세리아 메닝기디티스 Cas9(NmCas9)인 경우 PAM은 5'-NNNNGATT-3'일 수 있고, 캄필로박터 제주니 Cas9(CjCas9)의 경우 PAM은 5'-NNNVRYAC-3' (V = G or C or A, R = A or G, Y = C or T)일 수 있으며, 이때 상기 N은 A, T, G 또는 C; 또는 A, U, G 또는 C일 수 있다. 다만, 전술한 효소의 유래에 따라 PAM이 결정되는 것으로 일반적으로 이해되고 있으나, 해당 유래의 효소의 돌연변이(mutant)에 대한 연구가 진행됨에 따라, 상기 PAM은 달라질 수도 있다.
상기 CRISPR 효소는 표적 유전자 또는 핵산의 이중가닥을 절단하는 기능을 가지는 뉴클레아제 또는 제한효소일 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 완전 활성 CRISPR 효소일 수 있다.
"완전 활성"는 야생형(wild type) CRISPR 효소의 기능과 동일한 기능을 가지고 있는 상태를 의미하며, 이러한 상태의 CRISPR 효소를 완전 활성 CRISPR 효소로 명칭한다. 이때, “야생형(wild type) CRISPR 효소의 기능”은 DNA의 이중 가닥을 절단하는 기능, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 제2 기능을 모두 가지는 상태를 말한다.
상기 완전 활성 CRISPR 효소는 DNA의 이중 가닥을 절단하는 야생형 CRISPR 효소일 수 있다.
상기 완전 활성 CRISPR 효소는 DNA의 이중 가닥을 절단하는 야생형 CRISPR 효소를 변형 또는 조작시킨 CRISPR 효소 변이체일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되거나 또는 하나 이상의 아미노산이 제거된 효소일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산이 부가된 효소일 수 있다. 이때, 부가되는 아미노산의 위치는 야생형 효소의 N 말단, C 말단 또는 아미노산 서열 내일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소보다 기능이 향상된 완전 활성 효소일 수 있다.
예를 들면, 야생형 CRISPR 효소의 특정 변형 또는 조작된 형태, 즉, CRISPR 효소 변이체는 절단해야 하는 DNA 이중 가닥과 결합하지 않거나 또는 일정한 거리 간격을 유지한 상태에서 DNA 이중 가닥을 절단할 수 있다. 이러한 경우, 상기 변형 또는 조작된 형태는 야생형 CRISPR 효소보다 기능 활성이 향상된 완전 활성 CRISPR 효소일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소보다 기능이 감소된 완전 활성 CRISPR 효소일 수 있다.
예를 들면, 야생형 CRISPR 효소의 특정 변형 또는 조작된 형태, 즉, CRISPR 효소 변이체는 절단해야 하는 DNA 이중 가닥과 일정 거리이상으로 근접한 상태 또는 특정 결합이 형성된 상태에서 DNA 이중 가닥을 절단할 수 있다. 이때, 특정 결합은, 예를 들어, 효소의 특정 위치의 아미노산과 절단 위치의 DNA 뉴클레오타이드 서열과의 결합일 수 있다. 이러한 경우, 상기 변형 또는 조작된 형태는 야생형 CRISPR 효소보다 기능 활성이 감소된 완전 활성 CRISPR 효소일 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 불완전 또는 부분 활성 CRISPR 효소일 수 있다.
“불완전 또는 부분 활성”은 야생형 CRISPR 효소의 기능, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 제2 기능 중 선택된 하나의 기능을 가지는 상태를 의미한다. 이러한 상태의 CRISPR 효소는 불완전 또는 부분 활성 CRISPR 효소로 명칭한다. 또한 상기 불완전 또는 부분 활성 CRISPR 효소는 니카아제(nickase)로 지칭될 수 있다.
“니카아제(nickase)”는 표적 유전자 또는 핵산의 이중가닥 중 한 가닥만 절단되도록 조작 또는 변형된 CRISPR 효소를 의미하며, 상기 니카아제는 단일가닥, 예를 들어, 표적 유전자 또는 핵산의 gRNA와 비상보성 가닥 또는 상보성 가닥을 절단하는 뉴클레아제 활성을 가진다. 따라서, 이중가닥을 절단하기 위해서는 2개의 니카아제의 뉴클레아제 활성이 필요하다.
상기 니카아제는 CRISPR 효소의 RuvC 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 가질 수 있다. 즉, 상기 니카아제는 CRISPR 효소의 HNH 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 포함하지 않을 수 있으며, 이를 위해 HNH 도메인은 조작 또는 변경될 수 있다.
일 예로, 상기 CRISPR 효소가 Type II CRISPR 효소일 때, 상기 니카아제는 변형된 HNH 도메인을 포함하는 Type II CRISPR 효소일 수 있다.
예를 들어, 상기 Type II CRISPR 효소가 야생형 SpCas9의 경우, 상기 니카아제는 야생형 SpCas9의 아미노산 서열 840번 히스티딘을 알라닌으로 변이(mutation)시켜 HNH 도메인의 뉴클레아제 활성이 불활성화된 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때 생성된 니카아제, 즉, SpCas9 변이체는 RuvC 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 가지므로, 표적 유전자 또는 핵산의 비상보성 가닥, 즉, gRNA와 상보적인 결합을 하지 않는 가닥을 절단할 수 있다.
또 다른 예를 들어, 상기 Type II CRISPR 효소가 야생형 CjCas9의 경우, 상기 니카아제는 야생형 CjCas9의 아미노산 서열 559번 히스티딘을 알라닌으로 변이(mutation)시켜 HNH 도메인의 뉴클레아제 활성이 불활성화된 CjCas9 변이체일 수 있다. 이때 생성된 니카아제, 즉, CjCas9 변이체는 RuvC 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 가지므로, 표적 유전자 또는 핵산의 비상보성 가닥, 즉, gRNA와 상보적인 결합을 하지 않는 가닥을 절단할 수 있다.
또한, 상기 니카아제는 CRISPR 효소의 HNH 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 가질 수 있다. 즉, 상기 니카아제는 CRISPR 효소의 RuvC 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 포함하지 않을 수 있으며, 이를 위해 RuvC 도메인은 조작 또는 변경될 수 있다.
일 예로, 상기 CRISPR 효소가 Type II CRISPR 효소일 때, 상기 니카아제는 변형된 RuvC 도메인을 포함하는 Type II CRISPR 효소일 수 있다.
예를 들어, 상기 Type II CRISPR 효소가 야생형 SpCas9의 경우, 상기 니카아제는 야생형 SpCas9의 아미노산 서열 10번 아스파르트산을 알라닌으로 변이(mutation)시켜 RuvC 도메인의 뉴클레아제 활성이 불활성화된 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때 생성된 니카아제, 즉, SpCas9 변이체는 HNH 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 가지므로, 표적 유전자 또는 핵산의 상보성 가닥, 즉, gRNA와 상보적인 결합을 하는 가닥을 절단할 수 있다.
또 다른 예를 들어, 상기 Type II CRISPR 효소가 야생형 CjCas9의 경우, 상기 니카아제는 야생형 CjCas9의 아미노산 서열 8번 아스파르트산을 알라닌으로 변이(mutation)시켜 RuvC 도메인의 뉴클레아제 활성이 불활성화된 CjCas9 변이체일 수 있다. 이때 생성된 니카아제, 즉, CjCas9 변이체는 HNH 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 가지므로, 표적 유전자 또는 핵산의 상보성 가닥, 즉, gRNA와 상보적인 결합을 하는 가닥을 절단할 수 있다.
상기 CRISPR 효소는 불활성 CRISPR 효소일 수 있다.
“불활성”은 야생형 CRISPR 효소의 기능, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 제2 기능이 모두 상실된 상태를 의미한다. 이러한 상태의 CRISPR 효소는 불활성 CRISPR 효소로 명칭한다.
상기 불활성 CRISPR 효소는 야생형 CRISPR 효소의 뉴클레아제 활성을 가지는 도메인에 변이로 인한 뉴클레아제 불활성을 가질 수 있다.
상기 불활성 CRISPR 효소는 RuvC 도메인 및 HNH 도메인에 변이로 인한 뉴클레아제 불화성을 가질 수 있다. 즉, 상기 불활성 CRISPR 효소는 CRISPR 효소의 RuvC 도메인 및 HNH 도메인에 의한 뉴클레아제 활성을 포함하지 않을 수 있으며, 이를 위해 RuvC 도메인 및 HNH 도메인은 조작 또는 변경될 수 있다.
일 예로, 상기 CRISPR 효소가 Type II CRISPR 효소일 때, 상기 불활성 CRISPR 효소는 변형된 RuvC 도메인 및 HNH 도메인을 포함하는 Type II CRISPR 효소일 수 있다.
예를 들어, 상기 Type II CRISPR 효소가 야생형 SpCas9의 경우, 상기 불활성 CRISPR 효소는 야생형 SpCas9의 아미노산 서열 10번 아스파르트산과 840번 히스티딘을 모두 알라닌으로 변이(mutation)시켜 RuvC 도메인 및 HNH 도메인의 뉴클레아제 활성이 불활성화된 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때 생성된 불활성 CRISPR 효소, 즉, SpCas9 변이체는 RuvC 도메인 및 HNH 도메인의 뉴클레아제 활성이 불활성 되므로, 표적 유전자 또는 핵산의 이중가닥을 모두 절단할 수 없다.
또 다른 예를 들어, 상기 Type II CRISPR 효소가 야생형 CjCas9의 경우, 상기 불활성 CRISPR 효소는 야생형 CjCas9의 아미노산 서열 8번 아스파르트산과 559번 히스티딘을 모두 알라닌으로 변이(mutation)시켜 RuvC 도메인 및 HNH 도메인의 뉴클레아제 활성이 불활성화된 CjCas9 변이체일 수 있다. 이때 생성된 불활성 CRISPR 효소, 즉, CjCas9 변이체는 RuvC 도메인 및 HNH 도메인의 뉴클레아제 활성이 불활성 되므로, 표적 유전자 또는 핵산의 이중가닥을 모두 절단할 수 없다.
상기 CRISPR 효소는 상기 기재된 뉴클레아제 활성 외에도 헬리카제 활성, 즉, 이중가닥 핵산의 나선 구조를 푸는 기능을 가질 수 있다.
또한, 상기 CRISPR 효소는 CRISPR 효소의 헬리카제 활성에 대해 완전 활성, 불완전 또는 부분 활성, 또는 불활성이 되도록 CRISPR 효소를 변형시킬 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 구체예로서, CRISPR 효소는 인위적으로 조작된 CRISPR 효소일 수 있다.
“인위적으로 조작된(artificially modified or engineered or artificially engineered)”이라는 용어는 자연상태에서 일어나는 존재 그대로의 상태가 아닌, 인위적인 변형을 가하여 생성된 상태를 의미한다. 이때, 상기 인위적인 변형은 CRISPR 효소를 암호화하는 핵산 및/또는 단백질에서 발생될 수 있고, 또한 상기 인위적인 변형은 CRISPR 효소를 암호화하는 핵산에 의해 단백질이 생성되는 과정, 즉, 전사, 전사 후 변형, 변역 및 변역 후 변형 등의 전체 과정에서 발생 가능한 인위적으로 조작할 수 있는 모든 변형을 포함한다. 이하에서, 비자연적인 인위적으로 조작된 또는 변형된 CRISPR 효소는 인위적인 CRISPR 효소 또는 CRISPR 효소 변이체라는 용어와 혼용되어 사용할 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 야생형 CRISPR 효소의 기능, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및/또는 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 제2 기능을 변형시킨 CRISPR 효소 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 기능 중 제1 기능이 상실된 형태일 수 있다.
또는 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 기능 중 제1 기능이 향상된 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 기능 중 제2 기능이 상실된 형태일 수 있다.
또는 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 기능 중 제2 기능이 향상된 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 기능, 즉, 제1 기능 및 제2 기능이 모두 상실된 형태일 수 있다.
또는 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 기능, 즉, 제1 기능 및 제2 기능이 모두 향상된 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 기능, 즉, 제1 기능은 상실되고 제2 기능은 향상된 형태일 수 있다.
또는 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 기능, 즉, 제1 기능은 향상되고 제2 기능은 상실된 형태일 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 gRNA와 상호작용을 통한 gRNA-CRISPR 효소 복합체 형성할 수 있다.
이때, 상기 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 야생형 CRISPR 효소의 gRNA와 상호작용하는 기능을 변형시킨 CRISPR 효소 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소에 비해 gRNA와의 상호작용이 감소된 형태일 수 있다.
또는 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소에 비해 gRNA의 상호작용이 증가된 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제1 기능을 가지면서 gRNA와의 상호작용이 감소된 형태일 수 있다.
또는 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제1 기능을 가지면서 gRNA와의 상호작용이 증가된 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제2 기능을 가지면서 gRNA와의 상호작용이 감소된 형태일 수 있다.
또는 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제2 기능을 가지면서 gRNA와의 상호작용이 증가된 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제1 기능 및 제2 기능을 가지지 않으면서 gRNA와의 상호작용이 감소된 형태일 수 있다.
또는 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제1 기능 및 제2 기능을 가지지 않으면서 gRNA와의 상호작용이 증가된 형태일 수 있다.
이때, gRNA와 CRISPR 효소 변이체의 상호작용 세기에 따라 다양한 gRNA-CRISPR 효소 복합체가 형성될 수 있고, CRISPR 효소 변이체에 따라 표적 서열에 접근 또는 절단하는 기능에 차이가 생길 수 있다.
예를 들어, gRNA와의 상호작용이 감소된 CRISPR 효소 변이체에 의해 형성된 gRNA-CRISPR 효소 복합체는 gRNA와 완전히 상보적 결합을 하는 표적 서열에 근접 또는 국소화되는 경우에만 오직 표적 서열의 이중가닥 또는 단일가닥을 절단할 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 상기 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 야생형 CRISPR 효소의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 CRISPR 효소 변이체일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 제거시킨 형태일 수 있다.
일 예로, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 양전하를 가지는 아미노산들 중 하나 이상의 아미노산을 제거시킨 형태일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 음전하를 가지는 아미노산들 중 하나 이상의 아미노산을 제거시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 예로, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 전하를 가지지 않는 아미노산들 중 하나 이상의 아미노산을 제거시킨 형태일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 양전하를 가지는 아미노산들, 음전하를 가지는 아미노산들 및 전하를 가지지 않는 아미노산들 중 하나 이상의 아미노산을 제거시킨 형태일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 아미노산 서열 중 선택된 적어도 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시킨 형태일 수 있다.
이때, 상기 다른 아미노산, 즉 치환시킨 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린 중 선택된 하나의 아미노산일 수 있다.
이때, 상기 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린은 각각의 아미노산 및 이에 부가적으로 변형될 수 있는 메틸화(methylation), 아세틸화(acetylation), 인산화(phosphorylation) 등의 화학적으로 변형된 형태를 모두 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 양전하를 가지는 아미노산들 중 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시킨 형태일 수 있다. 이때, 다른 아미노산은 상기 선택된 하나 이상의 아미노산의 입체 이성질체, 양전하를 가지는 다른 아미노산들, 음전하를 가지는 아미노산들 및 전하를 가지지 않는 아미노산들 중 선택된 하나 이상의 아미노산일 수 있다.
다른 일로, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 음전하를 가지는 아미노산들 중 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시킨 형태일 수 있다. 이때, 다른 아미노산은 상기 선택된 하나 이상의 아미노산의 입체 이성질체, 음전하를 가지는 다른 아미노산들, 양전하를 가지는 아미노산들 및 전하를 가지지 않는 아미노산들 중 선택된 하나 이상의 아미노산일 수 있다.
또 다른 일 예로, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 전하를 가지지 않는 아미노산들 중 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시킨 형태일 수 있다. 이때, 다른 아미노산은 상기 선택된 하나 이상의 아미노산의 입체 이성질체, 전하를 가지지 않는 다른 아미노산들, 양전하를 가지는 아미노산들 및 음전하를 가지는 아미노산들 중 선택된 하나 이상의 아미노산일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 양전하를 가지는 아미노산들, 음전하를 가지는 아미노산들 및 전하를 가지지 않는 아미노산들 중 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시킨 형태일 수 있다. 이때, 다른 아미노산은 상기 선택된 하나 이상의 아미노산의 입체 이성질체, 양전하를 가지는 아미노산들, 음전하를 가지는 아미노산들 및 전하를 가지지 않는 아미노산들 중 선택된 하나 이상의 아미노산일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 치환 및/또는 제거시킨 형태일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 상기 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 야생형 CRISPR 효소의 아미노산 서열 내에 적어도 하나 이상의 아미노산이 부가된 CRISPR 효소 변이체일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 아미노산 서열과 비교하여 적어도 하나 이상의 아미노산을 부가시킨 형태일 수 있다.
또는 상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 아미노산 서열 내에 적어도 하나 이상의 기능적(functional) 도메인을 부가시킨 형태일 수 있다.
이때, 상기 기능적 도메인은 하나 이상의 아미노산으로 구성되며, 펩타이드 또는 폴리펩타이드일 수 있다.
이때, 상기 기능적 도메인은 야생형 CRISPR 효소의 원래 기능, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 제2 기능 이외에 부가적인 기능을 가지는 도메인일 수 있다.
또는 상기 기능적 도메인은 야생형 CRISPR 효소의 원래 기능, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및/또는 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 제2 기능과 유사한 기능을 가지는 도메인일 수 있다.
일 예로, 상기 기능적 도메인은 메틸라아제(methylase) 활성, 디메틸라아제(demethylase) 활성, 전사촉진(transcription activation) 활성, 전사 저해(transcription repression) 활성, 전사 방출 인자(transcription release factor) 활성, 히스톤 변형(histone modification) 활성, RNA 절단(cleavage) 활성 또는 핵산 결합(nucleic acid binding) 활성을 가지는 도메인일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 기능적 도메인은 단백질(펩타이드 포함)의 분리정제를 위한 태그(tag) 또는 리포터 유전자일 수 있다. 이때, 상기 태그는 히스티딘(His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그 및 티오레독신(Trx) 태그 등을 포함하며, 상기 리포터 유전자는 글루타티온-S-트랜스 퍼라제(GST), 호스라디시(horseradish) 과산화효소(HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질(GFP), HcRed, DsRed, 청록색 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP) 및 청색 형광 단백질(BFP)을 포함하는 자가형광 단백질을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.
또 다른 일 예로, 상기 기능적 도메인은 디아미네이즈(deaminase)일 수 있다.
예를 들어, 불완전 또는 부분 CRISPR 효소에 시티딘 디아미네이즈(cytidine deaminase)를 기능적 도메인으로 추가로 포함할 수 있다. 또는 불완전 또는 부분 CRISPR 효소에 아데닌 디아미네이즈(adenine deaminase)를 기능적 도메인으로 추가로 포함할 수 있다.
다른 일 예로, 상기 기능적 도메인은 NLS(nuclear localization sequence or signal) 또는 NES(nuclear export sequence or signal)일 수 있다.
예를 들어, CRISPR 효소는 하나 이상의 NLS를 포함할 수 있다. 이때, 상기 NLS는 CRISPR 효소의 아미노 말단 또는 그 근처; 카르복시 말단 또는 그 근처; 또는 이들의 조합에 하나 이상의 NLS를 포함할 수 있다. 상기 NLS는 하기로부터 유래된 NLS 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다: 아미노산 서열 PKKKRKV(SEQ ID NO: 1)를 갖는 SV40 바이러스 대형 T-항원의 NLS; 뉴클레오플라스민(nucleoplasmin)으로부터의 NLS(예를 들어, 서열 KRPAATKKAGQAKKKK(SEQ ID NO: 2)를 갖는 뉴클레오플라스민 이분(bipartite) NLS); 아미노산 서열 PAAKRVKLD(SEQ ID NO: 3) 또는 RQRRNELKRSP(SEQ ID NO: 4)를 갖는 c-myc NLS; 서열 NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY(SEQ ID NO: 5)를 갖는 hRNPA1 M9 NLS; 임포틴-알파로부터의 IBB 도메인의 서열 RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV(SEQ ID NO: 6); 마이오마(myoma) T 단백질의 서열 VSRKRPRP(SEQ ID NO: 7) 및 PPKKARED(SEQ ID NO: 8); 인간 p53의 서열 POPKKKPL(SEQ ID NO: 9); 마우스 c-abl IV의 서열 SALIKKKKKMAP(SEQ ID NO: 10); 인플루엔자 바이러스 NS1의 서열 DRLRR(SEQ ID NO: 11) 및 PKQKKRK(SEQ ID NO: 12); 간염 바이러스 델타 항원의 서열 RKLKKKIKKL(SEQ ID NO: 13); 마우스 Mx1 단백질의 서열 REKKKFLKRR(SEQ ID NO: 14); 인간 폴리(ADP-리보스) 중합효소의 서열 KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(SEQ ID NO: 15); 및 스테로이드 호르몬 수용체(인간) 글루코코르티코이드의 서열 RKCLQAGMNLEARKTKK(SEQ ID NO: 16).
상기 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 야생형 CRISPR 효소의 특정 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 CRISPR 효소 변이체일 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 야생형 CRISPR 효소의 특정 영역 내에 하나 이상의 아미노산이 부가된 CRISPR 효소 변이체일 수 있다.
이때, 상기 야생형 CRISPR 효소의 특정 영역은 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 선택된 하나 이상의 영역일 수 있다.
상기 제 1 영역은 gRNA와 상호작용하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
상기 제 1 영역은 표적서열과 상호작용하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
상기 제 1 영역은 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)과 상호작용하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
상기 제 1 영역은 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
이때, 상기 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM과 먼 말단 부위(PAM distal end)는 PAM 위치에서 멀리 위치한 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 말단의 6 내지 10개의 염기쌍, 즉, gRNA의 6 내지 10개 염기서열과 이와 상보적인 결합을 하는 표적서열의 6 내지 10개 염기서열을 의미할 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 CRISPR 효소의 REC 로브(lobe)에 위치한 영역일 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 CRISPR 효소의 REC 도메인 전체 또는 일부 일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 CRISPR 효소의 제1 기능 또는 제2 기능을 수행하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
상기 제 2 영역은 gRNA와 상호작용하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
상기 제 2 영역은 표적서열과 상호작용하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
상기 제 2 영역은 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)과 상호작용하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
상기 제 2 영역은 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
이때, 상기 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM과 먼 말단 부위(PAM distal end)는 PAM 위치에서 멀리 위치한 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 말단의 6 내지 10개의 염기쌍, 즉, gRNA의 6 내지 10개 염기서열과 이와 상보적인 결합을 하는 표적서열의 6 내지 10개 염기서열을 의미할 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 CRISPR 효소의 NUC 로브(lobe)에 위치한 영역일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 CRISPR 효소의 NUC 로브(lobe)의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)를 포함하는 영역일 수 있다.
이때, 상기 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)는 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM(Protospacer adjacent motif)과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용하는 영역일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 CRISPR 효소의 RuvC 도메인 전체 또는 일부일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 CRISPR 효소의 RuvC 도메인의 메탈 의존적 핵산 절단 부위(metal dependent nucleic acid cleaving region)를 포함하는 RuvC 도메인 일부 일 수 있다.
이때, 상기 RuvC 도메인의 메탈 의존적 핵산 절단 부위는 RuvC 도메인에서 메탈과 상호작용에 의해 표적 위치의 핵산간의 결합을 절단할 수 있는 영역을 의미할 수 있다.
상기 메탈 의존적 핵산 절단 부위는 메탈과 상호작용하는 부분과 표적 위치의 핵산간의 결합을 절단하는 부분으로 구성될 수 있다.
상기 제 3 영역은 야생형 CRISPR 효소의 제1 기능 또는 제2 기능을 수행하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
상기 제 3 영역은 gRNA와 상호작용하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
상기 제 3 영역은 표적서열과 상호작용하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
상기 제 3 영역은 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)과 상호작용하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
상기 제 3 영역은 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
이때, 상기 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM과 먼 말단 부위(PAM distal end)는 PAM 위치에서 멀리 위치한 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 말단의 6 내지 10개의 염기쌍, 즉, gRNA의 6 내지 10개 염기서열과 이와 상보적인 결합을 하는 표적서열의 6 내지 10개 염기서열을 의미할 수 있다.
상기 제 3 영역은 야생형 CRISPR 효소의 NUC 로브(lobe)에 위치한 영역일 수 있다.
상기 제 3 영역은 야생형 CRISPR 효소의 HNH 도메인 전체 또는 일부일 수 있다.
상기 제 3 영역은 야생형 CRISPR 효소의 HNH 도메인의 메탈 의존적 핵산 절단 부위(metal dependent nucleic acid cleaving region)를 포함하는 HNH 도메인 일부 일 수 있다.
이때, 상기 HNH 도메인의 메탈 의존적 핵산 절단 부위는 HNH 도메인에서 메탈과 상호작용에 의해 표적 위치의 핵산간의 결합을 절단할 수 있는 영역을 의미할 수 있다.
상기 제 4 영역은 표적 유전자 또는 핵산 내의 특정 뉴클레오타이드서열, 즉, PAM(Protospacer adjacent motif)을 인식할 수 있는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
상기 제 4 영역은 표적 유전자 또는 핵산 내의 특정 뉴클레오타이드서열, 즉, PAM(Protospacer adjacent motif)과 상호작용하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
상기 제 4 영역은 gRNA의 일부 뉴클레오타이드 서열과 상호작용하는 야생형 CRISPR 효소의 일부분일 수 있다.
상기 제 4 영역은 야생형 CRISPR 효소의 NUC 로브(lobe)에 위치한 영역일 수 있다.
상기 제 4 영역은 야생형 CRISPR 효소의 PI 도메인 전체 또는 일부 일 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 선택된 하나 이상의 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 CRISPR 효소 변이체일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역 및 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 1 영역 및 제 2 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 1 영역 및 제 3 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 1 영역 및 제 4 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 2 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 2 영역 및 제 3 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 2 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 2 영역 및 제 4 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 3 영역 및 제 4 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역, 제 2 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 1 영역, 제 2 영역 및 제 3 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역, 제 2 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 1 영역, 제 2 영역 및 제 4 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 1 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 넷 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
상기 CRISPR 효소 변이체는 상기 하나 이상의 영역에서 선택된 적어도 하나 이상의 아미노산의 변형을 포함할 수 있다.
이때, 상기 변형은 상기 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
이때, 상기 변형은 상기 선택된 하나 이상의 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
일 예로, 상기 다른 아미노산은 상기 선택된 아미노산의 입체 이성질체일 수 있다.
예를 들면, 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역 내에 위치한 L-글루타민을 D-글루타민으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 다른 아미노산은 상기 선택된 아미노산의 소수성 지표(hydropathy index)보다 작은 소수성 지표를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 2 영역 내에 위치한 페닐알라닌(소수성 지표: 2.8)을 소수정 지표가 더 작은 글리신(소수성 지표: -0.4)으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 예로, 상기 다른 아미노산은 상기 선택된 아미노산의 소수성 지표(hydropathy index)보다 큰 소수성 지표를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역 내에 위치한 세린(소수성 지표: -0.8)을 소수정 지표가 더 큰 류신(소수성 지표: 3.8)으로 치환시키는 것일 수 있다.
일 예로, 상기 다른 아미노산은 상기 선택된 아미노산의 기능기(functional group)보다 크기가 작은 기능기를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 3 영역 내에 위치한 발린을 발린의 기능기보다 작은 기능기를 가지는 알라닌으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 다른 아미노산은 상기 선택된 아미노산의 기능기(functional group)보다 크기가 큰 기능기를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 2 영역 내에 위치한 글리신을 글리신의 기능기보다 큰 기능기를 가지는 히스티딘으로 치환시키는 것일 수 있다.
일 예로, 상기 다른 아미노산은 상기 선택된 아미노산의 소수성(hydrophobicity)보다 소수성이 증가된 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역 내에 위치한 아스파라긴(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5)을 트레오닌(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -0.7)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 다른 아미노산은 상기 선택된 아미노산의 소수성(hydrophobicity)보다 소수성이 감소된 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 4 영역 내에 위치한 시스테인(Kyte-Doolittle hydrophobicity: 2.5)을 프롤린(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -1.6)으로 치환시키는 것일 수 있다.
일 예로, 상기 다른 아미노산은 상기 선택된 아미노산보다 크기가 큰 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 3 영역 내에 위치한 라이신(분자량: 146.189)을 트립토판(분자량: 204.228)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 다른 아미노산은 상기 선택된 아미노산보다 크기가 작은 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 2 영역 내에 위치한 페닐알라닌(분자량: 165.192)을 글루탐산(분자량: 147.131)으로 치환시키는 것일 수 있다.
일 예로, 상기 다른 아미노산은 상기 선택된 아미노산과 다른 전하를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 2 영역 내에 위치한 글루탐산(음전하)을 류신(중성전하)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 다른 아미노산은 상기 선택된 아미노산과 다른 분류(class)의 기능기를 가지는 아미노산일 수 있다. 이때, 상기 분류는 지방족(aliphatic), 방향족(aromatic), 비고리형(acyclic), 고리형(cyclic), 황 함유형(sulfur-containing) 및 수산기 함유형(hydroxyl-containing) 중 선택된 하나일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 3 영역 내에 위치한 페닐알라닌(방향족)을 발린(지방족)으로 치환시키는 것일 수 있다.
상기 변형은 상기 선택된 하나 이상의 아미노산이 동일한 개수의 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역 내에 위치한 하나의 알라닌을 하나의 글리신으로 치환시키는 것일 수 있다. 또는 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역 내에 위치한 하나의 아르기닌과 제 4 영역 내에 위치한 하나의 히스티딘을 하나의 류신(제 1 영역)과 하나의 세린(제 4 영역)으로 각각 치환시키는 것일 수 있다. 또는 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 2 영역 내에 위치한 하나의 아르기닌과 하나의 발린 및 제 3 영역 내에 위치한 하나의 류신을 각각 하나의 페닐알라닌, 즉 총 세 개의 페닐알라닌으로 치환시키는 것일 수 있다.
상기 변형은 상기 선택된 하나 이상의 아미노산이 동일하지 않은 개수의 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 2 영역 내에 위치한 하나의 류신을 시스테인-알라닌-알라닌, 즉, 총 세 개의 아미노산들로 치환시키는 것일 수 있다. 또는 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역 내에 위치한 하나의 히스티딘과 제 3 영역에 위치한 연속된 두 개의 아미노산인 알라닌-글루타민을 각각 메티오닌-발린(제 1 영역) 및 프롤린(제 3 영역)으로 치환시키는 것일 수 있다. 또는 상기 변형은 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역 내에 위치한 하나의 글루탐산, 제 2 영역 내에 위치한 연속된 세 개의 아미노산인 알라닌-류신-히스티딘 및 제 3 영역 내에 위치한 연속된 두 개의 아미노산인 트립토판-세린을 각각 알라닌(제 1 영역), 메티오닌-프롤린(제 2 영역) 및 시스테인-알라닌-트레오닌-발린(제 3 영역)으로 치환시키는 것일 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 야생형 CRISPR 효소의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 선택된 하나 이상의 영역 내에 적어도 하나 이상의 아미노산을 부가시킨 CRISPR 효소 변이체일 수 있다.
이때, 상기 부가는 상기 선택된 하나 이상의 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 하나 이상의 아미노산의 부가일 수 있다.
일 예로, 상기 부가는 상기 선택된 하나 이상의 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 하나 이상의 양전하를 가지는 아미노산의 부가일 수 있다.
예를 들어, 상기 부가는 제 1 영역 내에 위치한 선택된 하나의 알라닌의 C-말단에 하나의 아르기닌을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 제 3 영역 내에 위치한 선택된 글루탐산의 N-말단에 두 개의 아미노산들인 히스티딘-라이신을 부가시킨 것일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 부가는 상기 선택된 하나 이상의 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 하나 이상의 음전하를 가지는 아미노산의 부가일 수 있다.
예를 들어, 상기 부가는 제 2 영역 내에 위치한 선택된 하나의 트레오닌의 N-말단에 하나의 아스파르트산을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 제 4 영역 내에 위치한 선택된 히스티딘의 C-말단에 세 개의 아미노산들인 글루탐산-아스파르트산-글루탐산을 부가시킨 것일 수 있다.
또 다른 일 예로, 상기 부가는 상기 선택된 하나 이상의 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 하나 이상의 전하를 가지지 않는 아미노산의 부가일 수 있다.
예를 들어, 상기 부가는 제 2 영역 내에 위치한 선택된 하나의 시스테인의 C-말단에 두 개의 아미노산들인 세린-발린을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 제 3 영역 내에 위치한 선택된 라이신의 N-말단에 다섯 개의 아미노산들인 글리신-프롤린-글루타민-페닐알라닌-류신을 부가시킨 것일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 부가는 상기 선택된 하나 이상의 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 양전하를 가지는 아미노산들, 음전하를 가지는 아미노산들 및 전하를 가지지 않는 아미노산들 중 선택된 하나 이상의 아미노산의 부가일 수 있다.
예를 들어, 상기 부가는 제 1 영역 내에 위치한 선택된 하나의 아르기닌의 C-말단에 여섯 개의 아미노산들인 히스티딘-아르기닌-글리신-세린-알라닌-글루탐산을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 제 4 영역 내에 위치한 선택된 하나의 글리신의 N-말단에 열 개의 아미노산들인 라이신-라이신-알라닌-페닐알라닌-글루타민-트레오닌-메티오닌-시스테인-아스파르트산-세린을 부가시킨 것일 수 있다.
상기 부가는 상기 선택된 하나 이상의 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 하나 이상의 기능적(functional) 도메인의 부가일 수 있다.
이때, 상기 기능적 도메인은 야생형 CRISPR 효소의 원래 기능, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 제2 기능 이외에 부가적인 기능을 가지는 도메인일 수 있다.
또는 상기 기능적 도메인은 야생형 CRISPR 효소의 원래 기능, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및/또는 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 제2 기능과 유사한 기능을 가지는 도메인일 수 있다.
일 예로, 상기 기능적 도메인은 메틸라아제(methylase) 활성, 디메틸라아제(demethylase) 활성, 전사촉진(transcription activation) 활성, 전사 저해(transcription repression) 활성, 전사 방출 인자(transcription release factor) 활성, 히스톤 변형(histone modification) 활성, RNA 절단(cleavage) 활성 또는 핵산 결합(nucleic acid binding) 활성을 가지는 도메인일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 기능적 도메인은 단백질(펩타이드 포함)의 분리정제를 위한 태그(tag) 또는 리포터 유전자일 수 있다. 이때, 상기 태그는 히스티딘(His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그 및 티오레독신(Trx) 태그 등을 포함하며, 상기 리포터 유전자는 글루타티온-S-트랜스 퍼라제(GST), 호스라디시(horseradish) 과산화효소(HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질(GFP), HcRed, DsRed, 청록색 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP) 및 청색 형광 단백질(BFP)을 포함하는 자가형광 단백질을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.
또 다른 일 예로, 상기 기능적 도메인은 디아미네이즈(deaminase)일 수 있다. 이때, 상기 디아미네이즈는 아데닌 디아미네이즈(adenine deaminase) 및/또는 시티딘 디아미네이즈(cytidine deaminase)일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 기능적 도메인은 NLS(nuclear localization sequence or signal) 또는 NES(nuclear export sequence or signal)일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 구현예에서, 상기 인위적으로 조작된 CRISPR 효소는 인위적으로 조작된 Cas9일 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 Cas9은 야생형 Cas9의 특정 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 Cas9 변이체일 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 Cas9은 야생형 Cas9의 특정 영역 내에 적어도 하나 이상의 아미노산을 부가시킨 Cas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 야생형 Cas9의 특정 영역은 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 선택된 하나 이상의 영역일 수 있다.
상기 제 1 영역은 gRNA와 상호작용하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
상기 제 1 영역은 표적서열과 상호작용하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
상기 제 1 영역은 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)과 상호작용하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
상기 제 1 영역은 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
이때, 상기 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM과 먼 말단 부위(PAM distal end)는 PAM 위치에서 멀리 위치한 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 말단의 6 내지 10개의 염기쌍, 즉, gRNA의 6 내지 10개 염기서열과 이와 상보적인 결합을 하는 표적서열의 6 내지 10개 염기서열을 의미할 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 Cas9의 REC 로브(lobe)에 위치한 영역일 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 Cas9의 REC 도메인 전체 또는 일부 일 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 Cas9의 REC 도메인의 C 말단의 300개의 아미노산으로 이루어진 영역일 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 Cas9의 REC 도메인의 N 말단의 220개의 아미노산으로 이루어진 영역일 수 있다.
일 예로, 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9(SEQ ID NO: 17)의 경우,
상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 94번째 아스파르트산(D94)부터 717번째 글리신(G717)까지의 아미노산 서열 전체 또는 일부일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 196번째 페닐알라닌(F196)부터 282번째 아이소류신(I282)까지의 아미노산 서열(제 1-1 영역, SEQ ID NO: 18)일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 316번째 프롤린(P316)부터 394번째 아스파라긴(N394)까지의 아미노산 서열(제 1-2 영역, SEQ ID NO: 19)일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 510번째 라이신(K510)부터 612번째 아스파라긴(N612)까지의 아미노산 서열(제 1-3 영역, SEQ ID NO: 20)일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 678번째 트레오닌(T678)부터 698번째 히스티딘(H698)까지의 아미노산 서열(제 1-4 영역, SEQ ID NO: 21)일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 196번째 페닐알라닌(F196)부터 282번째 아이소류신(I282)까지의 아미노산 서열(제 1-1 영역), 316번째 프롤린(P316)부터 394번째 아스파라긴(N394)까지의 아미노산 서열(제 1-2 영역), 510번째 라이신(K510)부터 612번째 아스파라긴(N612)까지의 아미노산 서열(제 1-3 영역) 및 678번째 트레오닌(T678)부터 698번째 히스티딘(H698)까지의 아미노산 서열(제 1-4 영역) 중 선택된 두 개의 영역일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 196번째 페닐알라닌(F196)부터 282번째 아이소류신(I282)까지의 아미노산 서열(제 1-1 영역), 316번째 프롤린(P316)부터 394번째 아스파라긴(N394)까지의 아미노산 서열(제 1-2 영역), 510번째 라이신(K510)부터 612번째 아스파라긴(N612)까지의 아미노산 서열(제 1-3 영역) 및 678번째 트레오닌(T678)부터 698번째 히스티딘(H698)까지의 아미노산 서열(제 1-4 영역) 중 선택된 세 개의 영역일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 196번째 페닐알라닌(F196)부터 282번째 아이소류신(I282)까지의 아미노산 서열(제 1-1 영역), 316번째 프롤린(P316)부터 394번째 아스파라긴(N394)까지의 아미노산 서열(제 1-2 영역), 510번째 라이신(K510)부터 612번째 아스파라긴(N612)까지의 아미노산 서열(제 1-3 영역) 및 678번째 트레오닌(T678)부터 698번째 히스티딘(H698)까지의 아미노산 서열(제 1-4 영역)일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 야생형 Cas9이 야생형 SaCas9의 경우,
상기 제 1 영역은 야생형 SaCas9의 75번째 아스파라긴(N75)부터 426번째 라이신(K426)까지의 아미노산 서열 전체 또는 일부일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 1 영역은 야생형 SaCas9의 207번째 트레오닌(T207)부터 426번째 라이신(K426)까지의 아미노산 서열일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 Cas9의 제1 기능 또는 제2 기능을 수행하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
상기 제 2 영역은 gRNA와 상호작용하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
상기 제 2 영역은 표적서열과 상호작용하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
상기 제 2 영역은 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)과 상호작용하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
상기 제 2 영역은 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
이때, 상기 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM과 먼 말단 부위(PAM distal end)는 PAM 위치에서 멀리 위치한 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 말단의 6 내지 10개의 염기쌍, 즉, gRNA의 6 내지 10개 염기서열과 이와 상보적인 결합을 하는 표적서열의 6 내지 10개 염기서열을 의미할 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 Cas9의 NUC 로브(lobe)에 위치한 영역일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 Cas9의 NUC 로브(lobe)의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)를 포함하는 영역일 수 있다.
이때, 상기 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)는 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM(Protospacer adjacent motif)과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용하는 영역일 수 있다.
예를 들어, 야생형 SpCas9의 경우, 상기 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)는 야생형 SpCas9의 1001번째 타이로신(Y1001)부터 1030번째 글리신(G1030)까지의 영역일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 Cas9의 RuvC 도메인 전체 또는 일부일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 Cas9의 RuvC 도메인의 메탈 의존적 핵산 절단 부위(metal dependent nucleic acid cleaving region)를 포함하는 RuvC 도메인 일부 일 수 있다.
이때, 상기 RuvC 도메인의 메탈 의존적 핵산 절단 부위는 RuvC 도메인에서 메탈과 상호작용에 의해 표적 위치의 핵산간의 결합을 절단할 수 있는 영역을 의미할 수 있다.
상기 메탈 의존적 핵산 절단 부위는 메탈과 상호작용하는 부분과 표적 위치의 핵산간의 결합을 절단하는 부분으로 구성될 수 있다.
일 예로, 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 59번째 알라닌(A59)까지의 아미노산 서열(RuvC I 영역)의 전체 또는 일부일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 718번째 아스파르트산(D718)부터 774번째 글루타민(Q774)까지의 아미노산 서열(RuvC II 영역)의 전체 또는 일부일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 909번째 세린(S909)부터 1098번째 트레오닌(T1098)까지의 아미노산 서열(RuvC III 영역)의 전체 또는 일부일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 RuvC I 영역, RuvC II 영역 및/또는 RuvC III 영역 일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역, SEQ ID NO: 22)일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역, SEQ ID NO: 23)일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 926번째 글루타민(Q926)부터 1000번째 라이신(K1000)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역, SEQ ID NO: 24)일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1001번째 타이로신(Y1001)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-4 영역, SEQ ID NO: 25)일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역) 및 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역)일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역) 및 926번째 글루타민(Q926)부터 1000번째 라이신(K1000)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역)일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역) 및 1001번째 타이로신(Y1001)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-4 영역)일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역) 및 926번째 글루타민(Q926)부터 1000번째 라이신(K1000)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역)일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역) 및 1001번째 타이로신(Y1001)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-4 영역)일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 926번째 글루타민(Q926)부터 1000번째 라이신(K1000)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역) 및 1001번째 타이로신(Y1001)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-4 영역)일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역), 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역) 및 926번째 글루타민(Q926)부터 1000번째 라이신(K1000)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역)일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역), 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역) 및 1001번째 타이로신(Y1001)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-4 영역)일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역), 926번째 글루타민(Q926)부터 1000번째 라이신(K1000)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역) 및 1001번째 타이로신(Y1001)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-4 영역)일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역), 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역), 926번째 글루타민(Q926)부터 1000번째 라이신(K1000)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역) 및 1001번째 타이로신(Y1001)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-4 영역)일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 야생형 Cas9이 야생형 SaCas9의 경우,
상기 제 2 영역은 야생형 SaCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 41번째 발린(V41)까지의 아미노산 서열(RuvC I 영역)의 전체 또는 일부일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SaCas9의 436번째 아이소류신(I436)부터 481번째 글루탐산(E481)까지의 아미노산 서열(RuvC II 영역)의 전체 또는 일부일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SaCas9의 651번째 타이로신(Y651)부터 775번째 발린(V775)까지의 아미노산 서열(RuvC III 영역)의 전체 또는 일부일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SaCas9의 RuvC I 영역, RuvC II 영역 및/또는 RuvC III 영역 일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SaCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 25번째 트레오닌(T25)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역)일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SaCas9의 471번째 프롤린(P471)부터 481번째 글루탐산(E481)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역)일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 제 2 영역은 야생형 SaCas9의 667번째 아스파라긴(N667)부터 740번째 세린(S740)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역)일 수 있다.
상기 제 3 영역은 야생형 Cas9의 제1 기능 또는 제2 기능을 수행하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
상기 제 3 영역은 gRNA와 상호작용하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
상기 제 3 영역은 표적서열과 상호작용하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
상기 제 3 영역은 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)과 상호작용하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
상기 제 3 영역은 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
이때, 상기 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM과 먼 말단 부위(PAM distal end)는 PAM 위치에서 멀리 위치한 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 말단의 6 내지 10개의 염기쌍, 즉, gRNA의 6 내지 10개 염기서열과 이와 상보적인 결합을 하는 표적서열의 6 내지 10개 염기서열을 의미할 수 있다.
상기 제 3 영역은 야생형 Cas9의 NUC 로브(lobe)에 위치한 영역일 수 있다.
상기 제 3 영역은 야생형 Cas9의 HNH 도메인 전체 또는 일부일 수 있다.
상기 제 3 영역은 야생형 Cas9의 HNH 도메인의 메탈 의존적 핵산 절단 부위(metal dependent nucleic acid cleaving region)를 포함하는 HNH 도메인 일부 일 수 있다.
이때, 상기 HNH 도메인의 메탈 의존적 핵산 절단 부위는 HNH 도메인에서 메탈과 상호작용에 의해 표적 위치의 핵산간의 결합을 절단할 수 있는 영역을 의미할 수 있다.
일 예로, 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 제 3 영역은 야생형 SpCas9의 775번째 라이신(K775)부터 908번째 류신(L908)까지의 아미노산 서열의 전체 또는 일부일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 3 영역은 야생형 SpCas9의 775번째 라이신(K775)부터 900번째 류신(L900)까지의 아미노산 서열(제 3-1 영역, SEQ ID NO: 26)일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 야생형 Cas9이 야생형 SaCas9의 경우,
상기 제 3 영역은 야생형 SaCas9의 521번째 아이소류신(I521)부터 629번째 글루탐산(E629)까지의 아미노산 서열의 전체 또는 일부일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 3 영역은 야생형 SaCas9의 523번째 라이신(K523)부터 627번째 류신(L627)까지의 아미노산 서열(제 3-1 영역)일 수 있다.
상기 제 4 영역은 표적 유전자 또는 핵산 내의 특정 뉴클레오타이드서열, 즉, PAM(Protospacer adjacent motif)을 인식할 수 있는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
상기 제 4 영역은 표적 유전자 또는 핵산 내의 특정 뉴클레오타이드서열, 즉, PAM(Protospacer adjacent motif)과 상호작용하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
상기 제 4 영역은 gRNA의 일부 뉴클레오타이드 서열과 상호작용하는 야생형 Cas9의 일부분일 수 있다.
상기 제 4 영역은 야생형 Cas9의 NUC 로브(lobe)에 위치한 영역일 수 있다.
상기 제 4 영역은 야생형 Cas9의 PI 도메인 전체 또는 일부 일 수 있다.
일 예로, 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 제 4 영역은 야생형 SpCas9의 1099번째 글루탐산(E1099)부터 1368번째 아스파르트산(D1368)까지의 아미노산 서열의 전체 또는 일부일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 4 영역은 야생형 SpCas9의 1099번째 글루탐산(E1099)부터 1139번째 발린(V1139)까지의 아미노산 서열(제 4-1 영역, SEQ ID NO: 27)일 수 있다.
다른 일 예로, 상기 야생형 Cas9이 야생형 SaCas9의 경우,
상기 제 4 영역은 야생형 SaCas9의 910번째 라이신(K910)부터 1053번째 글리신(G1053)까지의 아미노산 서열의 전체 또는 일부일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 제 4 영역은 야생형 SaCas9의 910번째 라이신(K910)부터 970번째 아스파르트산(D970)까지의 아미노산 서열(제 4-1 영역)일 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 Cas9은 야생형 Cas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 선택된 하나 이상의 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 Cas9 변이체일 수 있다.
상기 Cas9 변이체는 야생형 Cas9의 제 1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 지방족(aliphatic) 또는 아마이드(amide) 계열의 기능기를 가지는 아미노산들, 즉, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281 및 I282 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391 및 L393로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588 및 I601으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606 및 L607로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 중 N692, M694, Q695 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 선택된 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역 내에 위치할 수 있다. 또는 선택된 둘 이상의 아미노산은 같은 영역 내에 위치할 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 중 A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 중 K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 선택된 셋 이상의 아미노산은 각각 다른 영역 내에 위치할 수 있다. 또는 선택된 셋 이상의 아미노산은 같은 영역 내에 위치할 수 있다. 또는 선택된 셋 이상의 아미노산은 각각 같거나 다른 영역 내에 위치할 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 중 A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 중 A203, N277, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 중 G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 Cas9 변이체는 야생형 Cas9의 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11 및 G12로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20 및 I21로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 I761, E762, M763, R765, E766 및 N767로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763 및 A764로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 중 D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987 및 Y988로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997 및 I998로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-4 영역 중 Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-4 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 2-2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 선택된 둘 이상의 아미노산은 각각 제 2-1 영역 및 제 2-2 영역 내에 위치할 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 2-2 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766 및 N767로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 2-2 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763 및 A764로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 선택된 둘 이상의 아미노산은 각각 제 2-1 영역 및 제 2-3 영역 내에 위치할 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 2-3 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987 및 Y988로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 2-3 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997 및 I998로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 선택된 둘 이상의 아미노산은 각각 제 2-1 영역 및 제 2-4 영역 내에 위치할 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 2-4 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 2-4 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 및 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 선택된 둘 이상의 아미노산은 각각 제 2-2 영역 및 제 2-3 영역 내에 위치할 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 및 제 2-3 영역 중 I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987 및 Y988로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 및 제 2-3 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997 및 I998로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 및 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 선택된 둘 이상의 아미노산은 각각 제 2-2 영역 및 제 2-4 영역 내에 위치할 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 및 제 2-4 영역 중 I761, E762, M763, R765, E766, N767, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 및 제 2-4 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 선택된 둘 이상의 아미노산은 각각 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역 내에 위치할 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역 중 D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 선택된 셋 이상의 아미노산은 각각 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및 제 2-3 영역 내에 위치할 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및 제 2-3 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987 및 Y988로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및 제 2-3 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997 및 I998로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 선택된 셋 이상의 아미노산은 각각 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및 제 2-4 영역 내에 위치할 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및 제 2-4 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및 제 2-4 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 선택된 셋 이상의 아미노산은 각각 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역 내에 위치할 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역 중 I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 선택된 셋 이상의 아미노산은 각각 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역 내에 위치할 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 Cas9 변이체는 야생형 Cas9의 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 및 L891로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 전하(charge)를 가지는 아미노산들, 즉, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 Cas9 변이체는 야생형 Cas9의 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 Cas9 변이체는 야생형 Cas9의 제 1 영역 및 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 1 영역 및 제 2 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 1 영역 및 제 2 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 및 제 2-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 및 제 2-1 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281 및 I282로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 및 제 2-2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 및 제 2-2 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, I761, E762, M763, R765, E766 및 N767로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 및 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1영역 및 제 2-3 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987 및 Y988로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 및 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1영역 및 제 2-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 및 제 2-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 및 제 2-1 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391 및 L393로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 및 제 2-1 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391 및 L393로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 및 제 2-2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 및 제 2-2 영역 중 P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, I761, E762, M763, R765, E766 및 N767로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 및 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2영역 및 제 2-3 영역 중 P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987 및 Y988로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 및 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2영역 및 제 2-4 영역 중 P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 2-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 2-1 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588 및 I601로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 2-1 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606 및 L607로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 2-2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 2-2 영역 중 K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, I761, E762, M763, R765, E766 및 N767로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 2-2 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763 및 A764으로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 2-3 영역 중 K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987 및 Y988로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 2-3 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997 및 I998로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 2-4 영역 중 K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 2-4 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 2-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 2-1 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, N692, M694, Q695 및 H698로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 2-1 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 2-2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 2-2 영역 중 N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766 및 N767로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 2-2 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763 및 A764으로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 2-3 영역 중 N692, M694, Q695, H698, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987 및 Y988로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 2-3 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997 및 I998로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 2-4 영역 중 N692, M694, Q695, H698, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 2-4 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
이때, 상기 제 1 영역은 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 2 영역은 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 2 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 2 영역 중 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 Cas9 변이체는 야생형 Cas9의 제 1 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 1 영역 및 제 3 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 1 영역 및 제 3 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 및 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 및 제 3-1 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 및 L891로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 및 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391 및 L393; 및 제 3-1 영역 중 전하를 가지는 아미노산들, 즉, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 3-1 영역 중 K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 및 L891로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606 및 L607; 및 제 3-1 영역 중 전하를 가지는 아미노산들, 즉, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 3-1 영역 중 N692, M694, Q695, H698, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 및 L891로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697; 및 제 3-1 영역 중 전하를 가지는 아미노산들, 즉, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
이때, 상기 제 1 영역은 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 3 영역은 제 3-1 영역일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 3 영역 중 A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 및 L891로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 3 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 Cas9 변이체는 야생형 Cas9의 제 1 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 1 영역 및 제 4 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 1 영역 및 제 4 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 및 제 3-1 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 및 제 4-1 영역 중 P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 및 제 4-1 영역 중 K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606 및 L607; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 및 제 4-1 영역 중 N692, M694, Q695, H698, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
이때, 상기 제 1 영역은 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 4 영역은 제 4-1 영역일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 4 영역 중 A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 Cas9 변이체는 야생형 Cas9의 제 2 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 2 영역 및 제 3 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 2 영역 및 제 3 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 3-1 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 및 L891로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20 및 I21; 및 제 3-1 영역 중 전하를 가지는 아미노산들, 즉, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 및 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 및 제 3-1 영역 중 I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 및 L891로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763 및 A764; 및 제 3-1 영역 중 전하를 가지는 아미노산들, 즉, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 및 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 및 제 3-1 영역 중 V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987 및 Y988로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997 및 I998; 및 제 3-1 영역 중 전하를 가지는 아미노산들, 즉, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-4 영역 및 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-4 영역 및 제 3-1 영역 중 V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-4 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038; 및 제 3-1 영역 중 전하를 가지는 아미노산들, 즉, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
이때, 상기 제 2 영역은 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 3 영역은 제 3-1 영역일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2 영역 및 제 3 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, Y981, H982, H983, A984, H985, D965, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2 영역 및 제 3 영역 중 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 Cas9 변이체는 야생형 Cas9의 제 2 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 2 영역 및 제 4 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 2 영역 및 제 4 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 및 제 4-1 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20 및 I21; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 및 제 4-1 영역 중 I761, E762, M763, R765, E766, N767, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763 및 A764; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 및 제 4-1 영역 중 D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997 및 I998; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-4 영역 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-4 영역 및 제 4-1 영역 중 Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2-4 영역 중 극성을 가지지 않는 아미노산들, 즉, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
이때, 상기 제 2 영역은 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 4 영역은 제 4-1 영역일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2 영역 및 제 4 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2 영역 및 제 4 영역 중 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1038, Y1039, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 Cas9 변이체는 야생형 Cas9의 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 3 영역 및 제 4 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 상기 제 3 영역 및 제 4 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 및 제 4-1 영역 중 V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 전하를 가지는 아미노산들, 즉, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 Cas9 변이체는 야생형 Cas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 셋 이상의 아미노산은 적어도 둘 이상의 영역에 존재할 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 셋 이상의 아미노산은 적어도 둘 이상의 영역에 존재할 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
이때, 상기 제 1 영역은 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 2 영역은 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 3 영역은 제 3-1 영역일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역 및 제 3 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역 및 제 3 영역 중 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
이때, 상기 제 1 영역은 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 2 영역은 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 4 영역은 제 4-1 영역일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역 및 제 4 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 및 D1127로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역 및 제 4 영역 중 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037, F1038, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
이때, 상기 제 1 영역은 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 3 영역은 제 3-1 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 4 영역은 제 4-1 영역일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, T1102 및 D1127로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
이때, 상기 제 2 영역은 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 3 영역은 제 3-1 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 4 영역은 제 4-1 영역일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 및 D1127로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037, F1038, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 넷 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다. 이때, 넷 이상의 아미노산은 적어도 둘 이상의 영역에 존재할 수 있다.
일 구체예로서, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 넷 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
이때, 상기 제 1 영역은 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 2 영역은 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 3 영역은 제 3-1 영역일 수 있다.
이때, 상기 제 4 영역은 제 4-1 영역일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 및 D1127로 구성된 군에서 선택된 넷 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9 변이체는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037, F1038, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 넷 이상의 아미노산을 변형시킨 형태일 수 있다.
상기 Cas9 변이체는 상기 하나 이상의 영역에서 선택된 적어도 하나 이상의 아미노산의 변형을 포함할 수 있다.
이때, 상기 변형은 상기 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역, 제 1-4 영역 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역, 제 2-4 영역, 제 3-1 영역 및/또는 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산의 제거일 수 있다.
이때, 상기 변형은 상기 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
일 예로, 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 입체 이성질체로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 입체 이성질체로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 야생형 SpCas9의 510번째 라이신(K510)이 L-라이신인 경우, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 510번째 라이신(K510)을 D-라이신으로 치환시키는 것일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 539번째 페닐알라닌(F539, 소수성 지표: 2.8)을 상대적으로 소수성 지표가 더 작은 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환시키는 것일 수 있다. 또는 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 601번째 아이소류신(I601, 소수성 지표: 4.5)을 상대적으로 소수성 지표가 더 작은 아스파라긴(소수성 지표: -3.5)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 277번째 아스파라긴(N277, 소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 더 큰 히스티딘(소수성 지표: -3.2)으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 크거나 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 작은 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 작은 기능기를 가지는 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 539번째 페닐알라닌(F539)을 상대적으로 크기가 작은 기능기를 가지는 세린으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 203번째 알라닌(A203)을 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 아스파르트산으로 치환시키는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 366번째 글리신(G366)을 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 세린으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 크거나 작은 기능기를 가지는 아미노산일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성(hydrophobicity)이 감소된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 감소된 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 539번째 페닐알라닌(F539, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 2.8) 및 601번째 아이소류신(I601, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 4.5)을 각각 상대적으로 소수성이 더 감소된 세린(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -0.8) 및 아스파라긴(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 277번째 아스파라긴(N277, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5) 및 682번째 페닐알라닌(F682, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 2.8)을 각각 상대적으로 소수성이 증가된 히스티딘(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.2) 및 발린(Kyte-Doolittle hydrophobicity: 4.2)으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 감소하거나 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 입체 이성질체로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 입체 이성질체로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 야생형 SpCas9의 12번째 글리신(G12)이 L-글리신인 경우, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 12번째 글리신(G12)을 D-글리신으로 치환시키는 것일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 1038번째 페닐알라닌(F1038, 소수성 지표: 2.8)을 상대적으로 소수성 지표가 더 작은 타이로신(소수성 지표: -1.3)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, P1002, L1004, F1008, V1009, G1011, V1015, V1018, M1021, I1022, A1023, I1029, G1030, A1032, A1034, F1037 및 F1038로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 763번째 메티오닌(M763, 소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 더 큰 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시키는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 965번째 아스파르트산(D965, 소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 더 큰 타이로신(소수성 지표: -1.3)으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 크거나 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 작은 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 작은 기능기를 가지는 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 763번째 메티오닌(M763)을 상대적으로 크기가 작은 기능기를 가지는 아이소류신으로 치환시키는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 1007번째 글루탐산(E1007)을 상대적으로 크기가 작은 기능기를 가지는 류신으로 치환시키는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 763번째 메티오닌(M763) 및 1007번째 글루탐산(E1007)을 상대적으로 크기가 작은 기능기를 가지는 아이소류신 및 류신으로 각각 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 큰 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, D10, I11, G12, I761, E762, M763, R765, E766, N767, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 1038번째 페닐알라닌(F1038)을 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 타이로신으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 크거나 작은 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 감소된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 감소된 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 761번째 아이소류신(I761, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 4.5) 및 1038번째 페닐알라닌(F1038, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 2.8)을 각각 상대적으로 소수성이 감소된 메티오닌(Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.9) 및 타이로신(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -1.3)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 763번째 메티오닌(M763, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.9) 및 932번째 알라닌(A932, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.8)을 각각 상대적으로 소수성이 증가된 아이소류신(Kyte-Doolittle hydrophobicity: 4.5) 및 시스테인(Kyte-Doolittle hydrophobicity: 2.5)으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 감소되거나 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 입체 이성질체로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 및 L891로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 입체 이성질체로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 야생형 SpCas9의 853번째 아스파르트산(D853)이 L-아스파르트산인 경우, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 853번째 아스파르트산(D853)을 D-아스파르트산으로 치환시키는 것일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 및 L891로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 862번째 라이신(K862, 소수성 지표: -3.9)을 상대적으로 소수성 지표가 더 작은 아르기닌(소수성 지표: -4.5)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 및 L891로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 890번째 라이신(K890, 소수성 지표: -3.9)을 상대적으로 소수성 지표가 더 큰 아스파라긴(소수성 지표: -3.5)으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 크거나 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 작은 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 및 L891로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 작은 기능기를 가지는 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 890번째 라이신(K890)을 상대적으로 크기가 작은 기능기를 가지는 아스파라긴으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 큰 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890 및 L891로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 863번째 아스파라긴(N863)을 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 아르기닌으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 크거나 작은 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 감소된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 감소된 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 779번째 글루탐산(E779, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5) 및 862번째 라이신(K862, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.9)을 각각 상대적으로 소수성이 감소된 라이신(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.9) 및 아르기닌(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -4.5)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 827번째 글루탐산(E827, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5) 및 890번째 라이신(K890, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.9)을 각각 상대적으로 소수성이 증가된 메티오닌(Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.9) 및 아스파라긴(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5)으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 감소되거나 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 입체 이성질체로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 입체 이성질체로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 야생형 SpCas9의 1127번째 아스파르트산(D1127)이 L-아스파르트산인 경우, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 1127번째 아스파르트산(D1127)을 D-아스파르트산으로 치환시키는 것일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 1102번째 트레오닌(T1102, 소수성 지표: -0.7)을 상대적으로 소수성 지표가 더 작은 프롤린(소수성 지표: -1.6)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 1106번째 세린(S1106, 소수성 지표: -0.8)을 상대적으로 소수성 지표가 더 큰 글리신(소수성 지표: -0.4)으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 크거나 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 작은 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 작은 기능기를 가지는 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 1102번째 트레오닌(T1102)을 상대적으로 크기가 작은 기능기를 가지는 프롤린으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 큰 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 1127번째 아스파르트산(D1127)을 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 글루탐산으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 크기가 크거나 작은 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 감소된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 감소된 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 1102번째 글루트레오닌(T1102, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -0.7)을 상대적으로 소수성이 감소된 프롤린(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -1.6)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 1108번째 글루탐산(E1108, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5)을 상대적으로 소수성이 증가된 메티오닌(Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.9)으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성이 감소되거나 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역, 제 1-4 영역 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역, 제 2-4 영역, 제 3-1 영역 및/또는 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각의 입체 이성질체로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 및 D1127로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각의 입체 이성질체로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 야생형 SpCas9의 8번째 글리신(G8)이 L-글리신이고 767번째 아스파라긴(N767)이 L-아스파라긴인 경우, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 8번째 글리신(G8) 및 767번째 아스파라긴(N767)을 각각 D-글리신 및 D-아스파라긴으로 치환시키는 것일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역, 제 1-4 영역 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역, 제 2-4 영역, 제 3-1 영역 및/또는 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 및 D1127로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 203번째 알라닌(A203, 소수성 지표: 1.8) 및 539번째 페닐알라닌(F539, 소수성 지표: 2.8)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 더 작은 아스파르트산(소수성 지표: -3.5) 및 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환시키는 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 601번째 아이소류신(I601, 소수성 지표: 4.5) 및 1102번째 트레오닌(T1102, 소수성 지표: -0.7)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 더 작은 아스파라긴(소수성 지표: -3.5) 및 프롤린(소수성 지표: -1.6)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역, 제 1-4 영역 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역, 제 2-4 영역, 제 3-1 영역 및/또는 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 및 D1127로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 840번째 히스티딘(H840, 소수성 지표: -3.2) 및 1007번째 글루탐산(E1007, 소수성 지표: -3.5)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 더 큰 알라닌(소수성 지표: 1.8) 및 류신(소수성 지표: 3.8)으로 치환시키는 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 763번째 메티오닌(M763, 소수성 지표: 1.9) 및 1007번째 글루탐산(E1007, 소수성 지표: -3.5)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 더 큰 아이소류신(소수성 지표: 4.5) 및 류신(소수성 지표: 3.8)으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역, 제 1-4 영역 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역, 제 2-4 영역, 제 3-1 영역 및/또는 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성 지표가 크거나 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 및 D1127로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성 지표가 크거나 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 10번째 아스파르트산(D10, 소수성 지표: -3.5) 및 840번째 히스티딘(H840, 소수성 지표: -3.2)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 더 큰 알라닌(소수성 지표: 1.8)으로 치환시키고, 또한 야생형 SpCas9의 539번째 페닐알라닌(F539, 소수성 지표: 2.8)을 상대적으로 소수성 지표가 더 작은 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환시키는 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성 지표가 크거나 작은 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 763번째 메티오닌(M763, 소수성 지표: 1.9), 890번째 라이신(K890, 소수성 지표: -3.9) 및 1007번째 글루탐산(E1007, 소수성 지표: -3.5)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 더 큰 아이소류신(소수성 지표: 4.5), 아스파라긴(소수성 지표: -3.5) 및 류신(소수성 지표: 3.8)으로 치환시키고, 또한 야생형 SpCas9의 539번째 페닐알라닌(F539, 소수성 지표: 2.8)을 상대적으로 소수성 지표가 더 작은 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환시키는 것일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역, 제 1-4 영역 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역, 제 2-4 영역, 제 3-1 영역 및/또는 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 크기가 작은 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, D10, I11, G12, A203, N277, G366, K510, Y515, F539, G582, V583, E584, D585, N588, I601, N692, M694, Q695, H698, I761, E762, M763, R765, E766, N767, V838, D839, H840, D853, N854, K855, K862, N863, R864, A889, K890, L891, D965, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102 및 D1127로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 크기가 작은 기능기를 가지는 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 539번째 페닐알라닌(F539), 763번째 메티오닌(M763), 890번째 라이신(K890) 및 1007번째 글루탐산(E1007)을 각각 상대적으로 크기가 작은 기능기를 가지는 세린, 아이소류신, 아스파라긴 및 류신으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역, 제 1-4 영역 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역, 제 2-4 영역, 제 3-1 영역 및/또는 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 크기가 큰 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 601번째 아이소류신(I601), 1038번째 페닐알라닌(F1038) 및 1127번째 아스파르트산(D1127)을 각각 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 아스파라긴, 타이로신 및 글루탐산으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역, 제 1-4 영역 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역, 제 2-4 영역, 제 3-1 영역 및/또는 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 크기가 크거나 작은 기능기(functional group)를 가지는 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 크기가 크거나 작은 기능기를 가지는 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 539번째 페닐알라닌(F539), 763번째 메티오닌(M763), 890번째 라이신(K890) 및 1007번째 글루탐산(E1007)을 각각 상대적으로 크기가 작은 기능기를 가지는 세린, 아이소류신, 아스파라긴 및 류신으로 치환시키고, 또한 601번째 아이소류신(I601) 및 1038번째 페닐알라닌(F1038)을 각각 상대적으로 크기가 큰 기능기를 가지는 아스파라긴 및 타이로신으로 치환시키는 것일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역, 제 1-4 영역 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역, 제 2-4 영역, 제 3-1 영역 및/또는 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성이 감소된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성이 감소된 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 539번째 페닐알라닌(F539, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 2.8), 601번째 아이소류신(I601, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 4.5) 및 1102번째 트레오닌(T1102, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -0.7)을 각각 상대적으로 소수성이 감소된 세린(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -0.8), 아스파라긴(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5) 및 프롤린(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -1.6)으로 치환시키는 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역, 제 1-4 영역 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역, 제 2-4 영역, 제 3-1 영역 및/또는 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성이 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성이 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 10번째 아스파르트산(D10, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5), 763번째 메티오닌(M763, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.9), 840번째 히스티딘(H840, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.2) 및 890번째 라이신(K890, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.9)을 각각 상대적으로 소수성이 증가된 알라닌(Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.8), 아이소류신(Kyte-Doolittle hydrophobicity: 4.5), 알라닌(Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.8) 및 아스파라긴(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5)으로 치환시키는 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역, 제 1-4 영역 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역, 제 2-4 영역, 제 3-1 영역 및/또는 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성이 감소되거나 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 I7, G8, L9, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696, I697, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, M763, A764, K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896, D898, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, A984, A987, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038, Y1039, T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 각각 상대적으로 소수성이 감소되거나 증가된 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들면, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 763번째 메티오닌(M763, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 1.9), 890번째 라이신(K890, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.9) 및 1007번째 글루탐산(E1007, Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5)을 각각 상대적으로 소수성이 증가된 아이소류신(Kyte-Doolittle hydrophobicity: 4.5), 아스파라긴(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -3.5) 및 류신(Kyte-Doolittle hydrophobicity: 3.8)으로 치환시키고, 또한 야생형 SpCas9의 539번째 페닐알라닌(F539, Kyte-Doolittle hydrophobicity: 2.8)을 상대적으로 소수성이 감소된 세린(Kyte-Doolittle hydrophobicity: -0.8)으로 치환시키는 것일 수 있다.
상기 변형은 상기 선택된 하나 이상의 아미노산이 동일한 개수의 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내에 위치한 하나의 아이소류신을 하나의 아스파라긴으로 치환시키는 것일 수 있다. 또는 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내에 위치한 하나의 페닐알라닌과 제 3 영역 내에 위치한 하나의 라이신을 하나의 세린(제 1 영역)과 하나의 아스파라긴(제 3 영역)으로 각각 치환시키는 것일 수 있다. 또는 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2 영역 내에 위치한 하나의 메티오닌과 하나의 글루탐산 및 제 3 영역 내에 위치한 하나의 라이신을 각각 하나의 아이소류신, 하나의 류신(제 2 영역) 및 하나의 아스파라긴(제 3 영역)으로 치환시키는 것일 수 있다.
상기 변형은 상기 선택된 하나 이상의 아미노산이 동일하지 않은 개수의 다른 아미노산으로의 치환일 수 있다.
예를 들어, 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 2 영역 내에 위치한 하나의 트레오닌을 시스테인-알라닌-알라닌, 즉, 총 세 개의 아미노산들로 치환시키는 것일 수 있다. 또는 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내에 위치한 하나의 글루타민과 제 3 영역에 위치한 연속된 두 개의 아미노산인 글리신-세린을 각각 메티오닌-발린(제 1 영역) 및 프롤린(제 3 영역)으로 치환시키는 것일 수 있다. 또는 상기 변형은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내에 위치한 하나의 세린, 제 2 영역 내에 위치한 연속된 세 개의 아미노산인 라이신-라이신-타이로신 및 제 3 영역 내에 위치한 연속된 두 개의 아미노산인 세린-아이소류신을 각각 알라닌(제 1 영역), 메티오닌-프롤린(제 2 영역) 및 시스테인-알라닌-트레오닌-발린(제 3 영역)으로 치환시키는 것일 수 있다.
상기 인위적으로 조작된 Cas9은 야생형 Cas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 선택된 하나 이상의 영역 내에 적어도 하나 이상의 아미노산을 부가시킨 Cas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 부가는 상기 선택된 하나 이상의 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 하나 이상의 아미노산의 부가일 수 있다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 하나 이상의 아미노산의 부가일 수 있다.
일 구체예로서, 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 하나 이상의 양전하를 가지는 아미노산의 부가일 수 있다.
예를 들어, 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 내에 위치한 선택된 하나의 알라닌의 C-말단에 하나의 아르기닌을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 내에 위치한 선택된 글루탐산의 N-말단에 두 개의 아미노산들인 아르기닌-라이신을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내에 위치한 선택된 류신의 N-말단에 두 개의 아미노산들인 아르기닌-히스티딘을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내에 위치한 선택된 류신의 C-말단에 두 개의 아미노산들인 라이신-히스티딘을 부가시키고, 또한 제 4-1 영역 내에 위치한 선택된 타이로신의 C-말단에 하나의 라이신을 부가시킨 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 하나 이상의 음전하를 가지는 아미노산의 부가일 수 있다.
예를 들어, 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 내에 위치한 선택된 하나의 글리신의 N-말단에 하나의 아스파르트산을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 내에 위치한 선택된 메티오닌의 C-말단에 세 개의 아미노산들인 글루탐산-아스파르트산-글루탐산을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내에 위치한 선택된 아이소류신의 N-말단에 두 개의 아미노산들인 글루탐산-글루탐산을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 내에 위치한 선택된 페닐알라닌의 C-말단에 두 개의 아미노산들인 글루탐산-아스파르트산을 부가시키고, 또한 제 2-1 영역 내에 위치한 선택된 글루타민의 N-말단에 하나의 아스파르트산을 부가시킨 것일 수 있다.
또 다른 일 구체예로서, 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 하나 이상의 전하를 가지지 않는 아미노산의 부가일 수 있다.
예를 들어, 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 내에 위치한 선택된 하나의 페닐알라닌의 C-말단에 두 개의 아미노산들인 세린-발린을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 내에 위치한 선택된 히스티딘의 N-말단에 다섯 개의 아미노산들인 글리신-프롤린-글루타민-페닐알라닌-류신을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내에 위치한 선택된 아스파라긴의 N-말단에 두 개의 아미노산들인 알라닌-알라닌을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 내에 위치한 선택된 아스파르트산의 C-말단에 두 개의 아미노산들인 페닐알라닌-류신을 부가시키고, 또한 제 1-2 영역 내에 위치한 선택된 글루타민의 N-말단에 하나의 세린을 부가시킨 것일 수 있다.
다른 일 구체예로서, 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 양전하를 가지는 아미노산들, 음전하를 가지는 아미노산들 및 전하를 가지지 않는 아미노산들 중 선택된 하나 이상의 아미노산의 부가일 수 있다.
예를 들어, 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 내에 위치한 선택된 하나의 아르기닌의 C-말단에 여섯 개의 아미노산들인 히스티딘-아르기닌-글리신-세린-알라닌-글루탐산을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내에 위치한 선택된 하나의 글리신의 N-말단에 열 개의 아미노산들인 라이신-라이신-알라닌-페닐알라닌-글루타민-트레오닌-메티오닌-시스테인-아스파르트산-세린을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 내에 위치한 선택된 메티오닌의 C-말단에 두 개의 아미노산들인 페닐알라닌-히스티딘을 부가시키고, 또한 제 2-3 영역 내에 위치한 선택된 글루타민의 N-말단에 하나의 라이신을 부가시킨 것일 수 있다. 또는 상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 내에 위치한 선택된 라이신의 C-말단에 두 개의 아미노산들인 아스파르트산-세린을 부가시키고, 제 2-4 영역 내에 위치한 선택된 발린의 N-말단에 여섯 개의 아미노산들인 글루타민-트레오닌-메티오닌-시스테인-아스파르트산-라이신을 부가시키고, 또한 제 4-1 영역 내에 위치한 선택된 글루타민의 C-말단에 두 개의 아미노산들인 아르기닌-글리신을 부가시킨 것일 수 있다.
이때, 상기 부가는 상기 선택된 하나 이상의 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 하나 이상의 기능적(functional) 도메인의 부가일 수 있다.
상기 기능적 도메인은 야생형 Cas9의 원래 기능, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 제2 기능 이외에 부가적인 기능을 가지는 도메인일 수 있다.
또는 상기 기능적 도메인은 야생형 Cas9의 원래 기능, 즉, DNA의 이중 가닥 중 제1 가닥을 절단하는 제1 기능 및/또는 DNA의 이중 가닥 중 제2 가닥을 절단하는 제2 기능과 유사한 기능을 가지는 도메인일 수 있다.
상기 기능적 도메인 관련 설명은 상기 기술한 바와 같다.
일 예로, 상기 상기 야생형 Cas9이 야생형 SpCas9의 경우,
상기 부가는 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 N-말단 및/또는 C-말단의 위치에 하나 이상의 기능적 도메인의 부가일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 구체예에서, 상기 인위적으로 조작된 Cas9은 표적 특이적 Cas9일 수 있다.
“표적 특이적 Cas9(Target specific Cas9; TS-Cas9)”은 Cas9 변이체로, 야생형 Cas9에 비해 상대적으로 표적 특이성(specificity)이 증가하도록 인위적으로 조작하여 생성된 Cas9 변이체를 의미한다.
이때, 상기 “표적 특이성”은 Cas9이 gRNA와의 상호작용을 통해 gRNA-Cas9 복합체를 형성하여 표적 유전자 또는 핵산, 즉, Cas9을 이용해 조작하고자 하는 대상(핵산)에 근접 또는 국소화될 때, gRNA와 상보적 결합을 하는 표적 서열에 특이적으로 Cas9이 작용할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 이때, gRNA와 완전한 상보적 결합(100%)하는 표적 서열은 온-타겟(on-target)으로 명명하며, gRNA와 불완전한 상보적 결합(100% 미만)하는, 즉, 하나 이상의 비상보적 결합을 포함하는 표적 서열은 오프-타겟(off-target)으로 명명한다.
상기 표적 특이성은 gRNA와 표적 서열간의 상보적 결합 정도에 따라 변할 수 있다.
일 예로, gRNA와 상보적 결합을 하는 표적 서열이 온-타겟, 즉, gRNA와 표적 서열간의 상보적 결합이 완전한 상보적 결합(100%)인 경우, 표적 특이성이 가장 높은 상태일 수 있다.
다른 일 예로, gRNA와 상보적 결합을 하는 표적 서열이 오프-타겟, 즉, gRNA와 표적 서열간의 상보적 결합이 100% 미만으로 하나 이상의 비상보적 결합을 포함하는 경우, 표적 특이성은 온-타겟에 비해 감소된 상태일 수 있으며, 상기 비상보적 결합의 개수가 증가함에 따라 상기 표적 특이성은 더 감소할 수 있다.
예를 들어, gRNA와 표적 서열간의 상보적 결합이 완전한 상보적 결합(100%)인 경우, 상기 표적 특이성을 100%라면, gRNA와 표적 서열간의 하나의 비상보적 결합이 포함된 경우, 즉, gRNA와 표적 서열간의 상보적 결합이 불완전한 상보적 결합(95%)인 경우, 상기 표적 특이성은 95%일 수 있다. 또는 gRNA와 표적 서열간의 네 개의 비상보적 결합이 포함된 경우, 즉, gRNA와 표적 서열간의 상보적 결합이 불완전한 상보적 결합(80%)인 경우, 상기 표적 특이성은 80%일 수 있다.
또 다른 일 예로, gRNA와 상보적 결합을 하는 표적 서열이 오프-타겟, 즉, gRNA와 표적 서열간의 상보적 결합이 100% 미만, 즉, 하나 이상의 비상보적 결합을 포함하는 경우, 표적 특이성은 상기 비상보적 결합의 위치에 따라 다를 수 있다.
예를 들어, 상기 gRNA와 표적 서열간의 하나의 비상보적 결합을 포함할 때, 상기 비상보적 결합의 위치가 표적 서열에 인접한 PAM에 근접하게 위치한 경우, 표적 특이성은 비상보적 결합의 위치가 PAM에 멀리 떨어져 위치한 경우에 비해 표적 특이성이 낮을 수 있다.
상기 표적 특이성은 표적 서열과 상보적 결합을 한 gRNA와 Cas9의 상호작용 정도에 따라 변할 수 있다.
일 예로, 표적 서열과 상보적 결합을 한 gRNA와 Cas9의 상호작용이 감소된 경우, 상기 gRNA와 표적 서열 간에 비상보적 결합의 수가 감소할수록 표적 특이성은 증가할 수 있다.
예를 들어, 표적 서열과 상보적 결합을 한 gRNA와 Cas9의 상호작용이 감소된 경우, 상기 gRNA와 표적 서열 간에 세 개의 비상보적 결합을 포함할 때에 비해 하나의 비상보적 결합을 포함할 때 표적 특이성이 상대적으로 증가할 수 있다.
다른 일 예로, 표적 서열과 상보적 결합을 한 gRNA와 Cas9의 상호작용이 감소된 경우, 상기 gRNA와 표적 서열간의 상보적 결합이 완전한 상보적 결합(100%)일 때만 표적 특이성을 가질 수 있다.
예를 들어, 표적 서열과 상보적 결합을 한 gRNA와 Cas9의 상호작용이 감소된 경우, 상기 표적 서열이 온-타겟일 때만 표적 특이성을 가질 수 있다.
상기 표적 특이성은 gRNA와 상보적 결합을 한 표적 서열과 Cas9의 상호작용 정도에 따라 변할 수 있다.
일 예로, gRNA와 상보적 결합을 한 표적 서열과 Cas9의 상호작용이 감소된 경우, 상기 gRNA와 표적 서열 간에 비상보적 결합의 수가 감소할수록 표적 특이성은 증가할 수 있다.
예를 들어, gRNA와 상보적 결합을 한 표적 서열과 Cas9의 상호작용이 감소된 경우, 상기 gRNA와 표적 서열 간에 네 개의 비상보적 결합을 포함할 때에 비해 두 개의 비상보적 결합을 포함할 때 표적 특이성이 상대적으로 증가할 수 있다.
다른 일 예로, gRNA와 상보적 결합을 한 표적 서열과 Cas9의 상호작용이 감소된 경우, 상기 gRNA와 표적 서열간의 상보적 결합이 완전한 상보적 결합(100%)일 때만 표적 특이성을 가질 수 있다.
예를 들어, gRNA와 상보적 결합을 한 표적 서열과 Cas9의 상호작용이 감소된 경우, 상기 표적 서열이 온-타겟일 때만 표적 특이성을 가질 수 있다.
상기 표적 특이적 Cas9은 온-타겟을 조작하는 Cas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 조작은 Cas9 변이체를 이용해 온-타겟의 뉴클레오타이드 서열을 절단하거나, 온-타겟의 뉴클레오타이드 서열 내에 하나 이상의 뉴클레오타이드를 삭제 및/또는 삽입할 수 있도록 온-타겟의 뉴클레오타이드 서열을 변형시키는 것일 수 있다.
상기 표적 특이적 Cas9은 온-타겟에 대한 표적 특이성이 야생형 Cas9과 동일하거나 증가된 Cas9 변이체일 수 있다.
상기 표적 특이적 Cas9은 오프-타겟을 조작하지 않는 Cas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 조작은 Cas9 변이체를 이용해 오프-타겟의 뉴클레오타이드 서열을 절단하거나, 오프-타겟의 뉴클레오타이드 서열 내에 하나 이상의 뉴클레오타이드를 삭제 및/또는 삽입할 수 있도록 오프-타겟의 뉴클레오타이드 서열을 변형시키는 것일 수 있다.
상기 표적 특이적 Cas9은 야생형 Cas9에 비해 오프-타겟에 대한 표적 특이성이 감소된 Cas9 변이체일 수 있다.
상기 표적 특이적 Cas9은 온-타겟에 대한 표적 특이성이 야생형 Cas9과 동일하며, 오프-타겟에 대한 표적 특이성은 야생형 Cas9에 비해 감소된 Cas9 변이체일 수 있다.
상기 표적 특이적 Cas9은 오프-타겟에 대한 표적 특이성이 야생형 Cas9과 동일하며, 온-타겟에 대한 표적 특이성은 야생형 Cas9에 비해 증가된 Cas9 변이체일 수 있다.
상기 표적 특이적 Cas9은 온-타겟에 대한 표적 특이성이 야생형 Cas9에 비해 증가하며, 오프-타겟에 대한 표적 특이성은 야생형 Cas9에 비해 감소된 Cas9 변이체일 수 있다.
상기 표적 특이적 Cas9은 온-타겟에 대한 표적 특이성이 야생형 Cas9에 비해 감소하며, 오프-타겟에 대한 표적 특이성은 야생형 Cas9에 비해 감소된 Cas9 변이체일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 실시예에서, 상기 표적 특이적 Cas9은 표적 특이적 SpCas9일 수 있다.
“표적 특이적 SpCas9(Target specific SpCas9; TS-SpCas9)”은 SpCas9 변이체로, 야생형 SpCas9에 비해 상대적으로 표적 특이성(specificity)이 증가하도록 인위적으로 조작하여 생성된 SpCas9 변이체를 의미한다.
상기 TS-SpCas9은 온-타겟을 조작하는 SpCas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 조작은 SpCas9 변이체를 이용해 온-타겟의 뉴클레오타이드 서열을 절단하거나, 온-타겟의 뉴클레오타이드 서열 내에 하나 이상의 뉴클레오타이드를 삭제 및/또는 삽입할 수 있도록 온-타겟의 뉴클레오타이드 서열을 변형시키는 것일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 온-타겟에 대한 표적 특이성이 야생형 SpCas9과 동일하거나 증가된 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 오프-타겟을 조작하지 않는 SpCas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 조작은 SpCas9 변이체를 이용해 오프-타겟의 뉴클레오타이드 서열을 절단하거나, 오프-타겟의 뉴클레오타이드 서열 내에 하나 이상의 뉴클레오타이드를 삭제 및/또는 삽입할 수 있도록 오프-타겟의 뉴클레오타이드 서열을 변형시키는 것일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9에 비해 오프-타겟에 대한 표적 특이성이 감소된 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 온-타겟에 대한 표적 특이성이 야생형 SpCas9과 동일하며, 오프-타겟에 대한 표적 특이성은 야생형 SpCas9에 비해 감소된 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 오프-타겟에 대한 표적 특이성이 야생형 SpCas9과 동일하며, 온-타겟에 대한 표적 특이성은 야생형 SpCas9에 비해 증가된 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 온-타겟에 대한 표적 특이성이 야생형 SpCas9에 비해 증가하며, 오프-타겟에 대한 표적 특이성은 야생형 SpCas9에 비해 감소된 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 온-타겟에 대한 표적 특이성이 야생형 SpCas9에 비해 감소하며, 오프-타겟에 대한 표적 특이성은 야생형 SpCas9에 비해 감소된 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 중 선택된 하나 이상의 영역 내의 아미노산 서열 중 적어도 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 196번째 페닐알라닌(F196)부터 282번째 아이소류신(I282)까지의 아미노산 서열(제 1-1 영역)일 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 316번째 프롤린(P316)부터 394번째 아스파라긴(N394)까지의 아미노산 서열(제 1-2 영역)일 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 510번째 라이신(K510)부터 612번째 아스파라긴(N612)까지의 아미노산 서열(제 1-3 영역)일 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 678번째 트레오닌(T678)부터 698번째 히스티딘(H698)까지의 아미노산 서열(제 1-4 영역)일 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 196번째 페닐알라닌(F196)부터 282번째 아이소류신(I282)까지의 아미노산 서열(제 1-1 영역), 316번째 프롤린(P316)부터 394번째 아스파라긴(N394)까지의 아미노산 서열(제 1-2 영역), 510번째 라이신(K510)부터 612번째 아스파라긴(N612)까지의 아미노산 서열(제 1-3 영역) 및 678번째 트레오닌(T678)부터 698번째 히스티딘(H698)까지의 아미노산 서열(제 1-4 영역) 중 선택된 두 개의 영역일 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 196번째 페닐알라닌(F196)부터 282번째 아이소류신(I282)까지의 아미노산 서열(제 1-1 영역), 316번째 프롤린(P316)부터 394번째 아스파라긴(N394)까지의 아미노산 서열(제 1-2 영역), 510번째 라이신(K510)부터 612번째 아스파라긴(N612)까지의 아미노산 서열(제 1-3 영역) 및 678번째 트레오닌(T678)부터 698번째 히스티딘(H698)까지의 아미노산 서열(제 1-4 영역) 중 선택된 세 개의 영역일 수 있다.
상기 제 1 영역은 야생형 SpCas9의 196번째 페닐알라닌(F196)부터 282번째 아이소류신(I282)까지의 아미노산 서열(제 1-1 영역), 316번째 프롤린(P316)부터 394번째 아스파라긴(N394)까지의 아미노산 서열(제 1-2 영역), 510번째 라이신(K510)부터 612번째 아스파라긴(N612)까지의 아미노산 서열(제 1-3 영역) 및 678번째 트레오닌(T678)부터 698번째 히스티딘(H698)까지의 아미노산 서열(제 1-4 영역)일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역)일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역)일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 926번째 글루타민(Q926)부터 1000번째 라이신(K1000)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역)일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1001번째 타이로신(Y1001)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-4 영역)일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역) 및 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역)일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역) 및 926번째 글루타민(Q926)부터 1000번째 라이신(K1000)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역)일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역) 및 1001번째 타이로신(Y1001)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-4 영역)일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역) 및 926번째 글루타민(Q926)부터 1000번째 라이신(K1000)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역)일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역) 및 1001번째 타이로신(Y1001)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-4 영역)일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 926번째 글루타민(Q926)부터 1000번째 라이신(K1000)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역) 및 1001번째 타이로신(Y1001)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-4 영역)일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역), 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역) 및 926번째 글루타민(Q926)부터 1000번째 라이신(K1000)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역)일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역), 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역) 및 1001번째 타이로신(Y1001)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-4 영역)일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역), 926번째 글루타민(Q926)부터 1000번째 라이신(K1000)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역) 및 1001번째 타이로신(Y1001)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-4 영역)일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역), 926번째 글루타민(Q926)부터 1000번째 라이신(K1000)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역) 및 1001번째 타이로신(Y1001)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-4 영역)일 수 있다.
상기 제 2 영역은 야생형 SpCas9의 1번째 메티오닌(M1)부터 22번째 트레오닌(T22)까지의 아미노산 서열(제 2-1 영역), 731번째 프롤린(P731)부터 770번째 트레오닌(T770)까지의 아미노산 서열(제 2-2 영역), 926번째 글루타민(Q926)부터 1000번째 라이신(K1000)까지의 아미노산 서열(제 2-3 영역) 및 1001번째 타이로신(Y1001)부터 1040번째 세린(S1040)까지의 아미노산 서열(제 2-4 영역)일 수 있다.
상기 제 3 영역은 야생형 SpCas9의 775번째 라이신(K775)부터 900번째 류신(L900)까지의 아미노산 서열(제 3-1 영역)일 수 있다.
상기 제 4 영역은 야생형 SpCas9의 1099번째 글루탐산(E1099)부터 1139번째 발린(V1139)까지의 아미노산 서열(제 4-1 영역)일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281 및 I282로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 중 P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391 및 L393로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 K510, L513, L514, Y515, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, E584, D585, F587, N588, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606 및 L607으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-4 영역 중 I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, N692, F693, M694, Q695, L696, I697 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, K510, L513, L514, Y515, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, E584, D585, F587, N588, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, N692, F693, M694, Q695, L696, I697 및 H698으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203; N277; G366; F539; 또는 I601을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277(A203과 N277); A203/G366; A203/F539; 또는 A203/I601을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 N277/G366; N277/F539; 또는 N277/I601을 변형시킨 SpCas9일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 G366/F539; G366/I601; 또는 F539/I601을 변형시킨 SpCas9일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366; A203/N277/F539; A203/N277/I601; A203/G366/F539; A203/G366/I601; A203/F539/I601; N277/G366/F539; N277/G366/I601; 또는 G366/F539/I601을 변형시킨 SpCas9일 수 있다.
또 다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539; A203/N277/G366/I601; A203/N277/F539/I601; A203/G366/F539/I601; 또는 N277/G366/F539/I601을 변형시킨 SpCas9일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539/I601를 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20 및 I21로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766 및 N767로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 중 I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997 및 I998로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-4 영역 중 Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역 및 제 2-3 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예세서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 Y1001; P1002; K1003; L1004; E1005; S1006; E1007; F1008; V1009; Y1010; G1011; D1012; Y1013; K1014; V1015; Y1016; D1017; V1018; R1019; K1020; M1021; I1022; A1023; K1024; S1025; E1026; Q1027; E1028; I1029; 또는 G1030을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763; D965; E1007 또는 F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763/D965; M763/E1007; M763/F1038; D965/E1007; E1007/F1038 또는 D965/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763/D965/E1007; M763/D965/F1038; M763/E1007/F1038; 또는 D965/E1007/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763/D965/E1007/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, V838, D839, H840, K848, D849, D850, D853, N854, K855, R859, D861, K862, N863, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, A889, K890, L891, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 K890을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 T1102 또는 D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 상기 제 1 영역 및 제 2 영역은 각각 적어도 하나 이상의 변형된 아미노산을 포함할 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/M763; A203/D965; A203/E1007; A203/F1038; A203/M763/D965; A203/M763/E1007; A203/M763/F1038; A203/D965/E1007; A203/D965/F1038; D965/E1007/F1038; A203/M763/D965/E1007; A203/M763/D965/F1038; A203/M763/E1007/F1038; A203/D965/E1007/F1038; A203/M763/D965/E1007/F1038; N277/M763; N277/D965; N277/E1007; N277/F1038; N277/M763/D965; N277/M763/E1007; N277/M763/F1038; N277/D965/E1007; N277/D965/F1038; N277/E1007/F1038; N277/M763/D965/E1007; N277/M763/D965/F1038; N277/M763/E1007/F1038; N277/D965/E1007/F1038; N277/M763/D965/E1007/F1038; G366/M763; G366/D965; G366/E1007; G366/F1038; G366/M763/D965; G366/M763/E1007; G366/M763/F1038; G366/D965/E1007; G366/D965/F1038; G366/E1007/F1038; G366/M763/D965/E1007; G366/M763/D965/F1038; G366/M763/E1007/F1038; G366/D965/E1007/F1038; G366/M763/D965/E1007/F1038; F539/M763; F539/D965; F539/E1007; F539/F1038; F539/M763/D965; F539/M763/E1007; F539/M763/F1038; F539/D965/E1007; F539/D965/F1038; F539/E1007/F1038; F539/M763/D965/E1007; F539/M763/D965/F1038; F539/M763/E1007/F1038; F539/D965/E1007/F1038; F539/M763/D965/E1007/F1038; I601/M763; I601/D965; I601/E1007; I601/F1038; I601/M763/D965; I601/M763/E1007; I601/M763/F1038; I601/D965/E1007; I601/D965/F1038; I601/E1007/F1038; I601/M763/D965/E1007; I601/M763/D965/F1038; I601/M763/E1007/F1038; I601/D965/E1007/F1038; 또는 I601/M763/D965/E1007/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/M763; A203/N277/D965; A203/N277/E1007; A203/N277/F1038; A203/N277/M763/D965; A203/N277/M763/E1007; A203/N277/M763/F1038; A203/N277/D965/E1007; A203/N277/D965/F1038; A203/N277/E1007/F1038; A203/N277/M763/D965/E1007; A203/N277/M763/D965/F1038; A203/N277/M763/E1007/F1038; A203/N277/D965/E1007/F1038; A203/N277/M763/D965/E1007/F1038; A203/G366/M763; A203/G366/D965; A203/G366/E1007; A203/G366/F1038; A203/G366/M763/D965; A203/G366/M763/E1007; A203/G366/M763/F1038; A203/G366/D965/E1007; A203/G366/D965/F1038; A203/G366/E1007/F1038; A203/G366/M763/D965/E1007; A203/G366/M763/D965/F1038; A203/G366/M763/E1007/F1038; A203/G366/D965/E1007/F1038; A203/G366/M763/D965/E1007/F1038; A203/F539/M763; A203/F539/D965; A203/F539/E1007; A203/F539/F1038; A203/F539/M763/D965; A203/F539/M763/E1007; A203/F539/M763/F1038; A203/F539/D965/E1007; A203/F539/D965/F1038; A203/F539/E1007/F1038; A203/F539/M763/D965/E1007; A203/F539/M763/D965/F1038; A203/F539/M763/E1007/F1038; A203/F539/D965/E1007/F1038; A203/F539/M763/D965/E1007/F1038; A203/I601/M763; A203/I601/D965; A203/I601/E1007; A203/I601/F1038; A203/I601/M763/D965; A203/I601/M763/E1007; A203/I601/M763/F1038; A203/I601/D965/E1007; A203/I601/D965/F1038; A203/I601/E1007/F1038; A203/I601/M763/D965/E1007; A203/I601/M763/D965/F1038; A203/I601/M763/E1007/F1038; A203/I601/D965/E1007/F1038; A203/I601/M763/D965/E1007/F1038; N277/G366/M763; N277/G366/D965; N277/G366/E1007; N277/G366/F1038; N277/G366/M763/D965; N277/G366/M763/E1007; N277/G366/M763/F1038; N277/G366/D965/E1007; N277/G366/D965/F1038; N277/G366/E1007/F1038; N277/G366/M763/D965/E1007; N277/G366/M763/D965/F1038; N277/G366/M763/E1007/F1038; N277/G366/D965/E1007/F1038; N277/G366/M763/D965/E1007/F1038; N277/F539/M763; N277/F539/D965; N277/F539/E1007; N277/F539/F1038; N277/F539/M763/D965; N277/F539/M763/E1007; N277/F539/M763/F1038; N277/F539/D965/E1007; N277/F539/D965/F1038; N277/F539/E1007/F1038; N277/F539/M763/D965/E1007; N277/F539/M763/D965/F1038; N277/F539/M763/E1007/F1038; N277/F539/D965/E1007/F1038; N277/F539/M763/D965/E1007/F1038; N277/I601/M763; N277/I601/D965; N277/I601/E1007; N277/I601/F1038; N277/I601/M763/D965; N277/I601/M763/E1007; N277/I601/M763/F1038; N277/I601/D965/E1007; N277/I601/D965/F1038; N277/I601/E1007/F1038; N277/I601/M763/D965/E1007; N277/I601/M763/D965/F1038; N277/I601/M763/E1007/F1038; N277/I601/D965/E1007/F1038; N277/I601/M763/D965/E1007/F1038; G366/F539/M763; G366/F539/D965; G366/F539/E1007; G366/F539/F1038; G366/F539/M763/D965; G366/F539/M763/E1007; G366/F539/M763/F1038; G366/F539/D965/E1007; G366/F539/D965/F1038; G366/F539/E1007/F1038; G366/F539/M763/D965/E1007; G366/F539/M763/D965/F1038; G366/F539/M763/E1007/F1038; G366/F539/D965/E1007/F1038; G366/F539/M763/D965/E1007/F1038; G366/I601/M763; G366/I601/D965; G366/I601/E1007; G366/I601/F1038; G366/I601/M763/D965; G366/I601/M763/E1007; G366/I601/M763/F1038; G366/I601/D965/E1007; G366/I601/D965/F1038; G366/I601/E1007/F1038; G366/I601/M763/D965/E1007; G366/I601/M763/D965/F1038; G366/I601/M763/E1007/F1038; G366/I601/D965/E1007/F1038; G366/I601/M763/D965/E1007/F1038; F539/I601/M763; F539/I601/D965; F539/I601/E1007; F539/I601/F1038; F539/I601/M763/D965; F539/I601/M763/E1007; F539/I601/M763/F1038; F539/I601/D965/E1007; F539/I601/D965/F1038; F539/I601/E1007/F1038; F539/I601/M763/D965/E1007; F539/I601/M763/D965/F1038; F539/I601/M763/E1007/F1038; F539/I601/D965/E1007/F1038 또는 F539/I601/M763/D965/E1007/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/M763; A203/N277/G366/D965; A203/N277/G366/E1007; A203/N277/G366/F1038; A203/N277/G366/M763/D965; A203/N277/G366/M763/E1007; A203/N277/G366/M763/F1038; A203/N277/G366/D965/E1007; A203/N277/G366/D965/F1038; A203/N277/G366/E1007/F1038; A203/N277/G366/M763/D965/E1007; A203/N277/G366/M763/D965/F1038; A203/N277/G366/M763/E1007/F1038; A203/N277/G366/D965/E1007/F1038; A203/N277/G366/M763/D965/E1007/F1038; A203/N277/F539/M763; A203/N277/F539/D965; A203/N277/F539/E1007; A203/N277/F539/F1038; A203/N277/F539/M763/D965; A203/N277/F539/M763/E1007; A203/N277/F539/M763/F1038; A203/N277/F539/D965/E1007; A203/N277/F539/D965/F1038; A203/N277/F539/E1007/F1038; A203/N277/F539/M763/D965/E1007; A203/N277/F539/M763/D965/F1038; A203/N277/F539/M763/E1007/F1038; A203/N277/F539/D965/E1007/F1038; A203/N277/F539/M763/D965/E1007/F1038; A203/N277/I601/M763; A203/N277/I601/D965; A203/N277/I601/E1007; A203/N277/I601/F1038; A203/N277/I601/M763/D965; A203/N277/I601/M763/E1007; A203/N277/I601/M763/F1038; A203/N277/I601/D965/E1007; A203/N277/I601/D965/F1038; A203/N277/I601/E1007/F1038; A203/N277/I601/M763/D965/E1007; A203/N277/I601/M763/D965/F1038; A203/N277/I601/M763/E1007/F1038; A203/N277/I601/D965/E1007/F1038; A203/N277/I601/M763/D965/E1007/F1038; A203/G366/F539/M763; A203/G366/F539/D965; A203/G366/F539/E1007; A203/G366/F539/F1038; A203/G366/F539/M763/D965; A203/G366/F539/M763/E1007; A203/G366/F539/M763/F1038; A203/G366/F539/D965/E1007; A203/G366/F539/D965/F1038; A203/G366/F539/E1007/F1038; A203/G366/F539/M763/D965/E1007; A203/G366/F539/M763/D965/F1038; A203/G366/F539/M763/E1007/F1038; A203/G366/F539/D965/E1007/F1038; A203/G366/F539/M763/D965/E1007/F1038; A203/G366/I601/M763; A203/G366/I601/D965; A203/G366/I601/E1007; A203/G366/I601/F1038; A203/G366/I601/M763/D965; A203/G366/I601/M763/E1007; A203/G366/I601/M763/F1038; A203/G366/I601/D965/E1007; A203/G366/I601/D965/F1038; A203/G366/I601/E1007/F1038; A203/G366/I601/M763/D965/E1007; A203/G366/I601/M763/D965/F1038; A203/G366/I601/M763/E1007/F1038; A203/G366/I601/D965/E1007/F1038; A203/G366/I601/M763/D965/E1007/F1038; A203/F539/I601/M763; A203/F539/I601/D965; A203/F539/I601/E1007; A203/F539/I601/F1038; A203/F539/I601/M763/D965; A203/F539/I601/M763/E1007; A203/F539/I601/M763/F1038; A203/F539/I601/D965/E1007; A203/F539/I601/D965/F1038; A203/F539/I601/E1007/F1038; A203/F539/I601/M763/D965/E1007; A203/F539/I601/M763/D965/F1038; A203/F539/I601/M763/E1007/F1038; A203/F539/I601/D965/E1007/F1038; A203/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038; N277/G366/F539/M763; N277/G366/F539/D965; N277/G366/F539/E1007; N277/G366/F539/F1038; N277/G366/F539/M763/D965; N277/G366/F539/M763/E1007; N277/G366/F539/M763/F1038; N277/G366/F539/D965/E1007; N277/G366/F539/D965/F1038; N277/G366/F539/E1007/F1038; N277/G366/F539/M763/D965/E1007; N277/G366/F539/M763/D965/F1038; N277/G366/F539/M763/E1007/F1038; N277/G366/F539/D965/E1007/F1038; N277/G366/F539/M763/D965/E1007/F1038; N277/G366/I601/M763; N277/G366/I601/D965; N277/G366/I601/E1007; N277/G366/I601/F1038; N277/G366/I601/M763/D965; N277/G366/I601/M763/E1007; N277/G366/I601/M763/F1038; N277/G366/I601/D965/E1007; N277/G366/I601/D965/F1038; N277/G366/I601/E1007/F1038; N277/G366/I601/M763/D965/E1007; N277/G366/I601/M763/D965/F1038; N277/G366/I601/M763/E1007/F1038; N277/G366/I601/D965/E1007/F1038; N277/G366/I601/M763/D965/E1007/F1038; G366/F539/I601/M763; G366/F539/I601/D965; G366/F539/I601/E1007; G366/F539/I601/F1038; G366/F539/I601/M763/D965; G366/F539/I601/M763/E1007; G366/F539/I601/M763/F1038; G366/F539/I601/D965/E1007; G366/F539/I601/D965/F1038; G366/F539/I601/E1007/F1038; G366/F539/I601/M763/D965/E1007; G366/F539/I601/M763/D965/F1038; G366/F539/I601/M763/E1007/F1038; G366/F539/I601/D965/E1007/F1038; 또는G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539/M763; A203/N277/G366/F539/D965; A203/N277/G366/F539/E1007; A203/N277/G366/F539/F1038; A203/N277/G366/F539/M763/D965; A203/N277/G366/F539/M763/E1007; A203/N277/G366/F539/M763/F1038; A203/N277/G366/F539/D965/E1007; A203/N277/G366/F539/D965/F1038; A203/N277/G366/F539/E1007/F1038; A203/N277/G366/F539/M763/D965/E1007; A203/N277/G366/F539/M763/D965/F1038; A203/N277/G366/F539/M763/E1007/F1038; A203/N277/G366/F539/D965/E1007/F1038; A203/N277/G366/F539/M763/D965/E1007/F1038; A203/N277/G366/I601/M763; A203/N277/G366/I601/D965; A203/N277/G366/I601/E1007; A203/N277/G366/I601/F1038; A203/N277/G366/I601/M763/D965; A203/N277/G366/I601/M763/E1007; A203/N277/G366/I601/M763/F1038; A203/N277/G366/I601/D965/E1007; A203/N277/G366/I601/D965/F1038; A203/N277/G366/I601/E1007/F1038; A203/N277/G366/I601/M763/D965/E1007; A203/N277/G366/I601/M763/D965/F1038; A203/N277/G366/I601/M763/E1007/F1038; A203/N277/G366/I601/D965/E1007/F1038; A203/N277/G366/I601/M763/D965/E1007/F1038; N277/G366/F539/I601/M763; N277/G366/F539/I601/D965; N277/G366/F539/I601/E1007; N277/G366/F539/I601/F1038; N277/G366/F539/I601/M763/D965; N277/G366/F539/I601/M763/E1007; N277/G366/F539/I601/M763/F1038; N277/G366/F539/I601/D965/E1007; N277/G366/F539/I601/D965/F1038; N277/G366/F539/I601/E1007/F1038; N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007; N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038; N277/G366/F539/I601/M763/E1007/F1038; N277/G366/F539/I601/D965/E1007/F1038; N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/M763; A203/N277/G366/F539/I601/D965; A203/N277/G366/F539/I601/E1007; A203/N277/G366/F539/I601/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965; A203/N277/G366/F539/I601/M763/E1007; A203/N277/G366/F539/I601/M763/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/D965/E1007; A203/N277/G366/F539/I601/D965/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/E1007/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007; A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/M763/E1007/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/D965/E1007/F1038; 또는 A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 3-1 영역 중 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, V838, D839, H840, K848, D849, D850, D853, N854, K855, R859, D861, K862, N863, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, A889, K890, L891, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/K890; N277/K890; G366/K890; F539/K890; 또는 I601/K890을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/K890; A203/G366/K890; A203/F539/K890; A203/I601/K890; N277/G366/K890; N277/F539/K890; N277/I601/K890; G366/F539/K890; G366/I601/K890; 또는 F539/I601/K890을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/K890; A203/N277/F539/K890; A203/N277/I601/K890; A203/G366/F539/K890; A203/G366/I601/K890; A203/F539/I601/K890; N277/G366/F539/K890; N277/G366/I601/K890; 또는 G366/F539/I601/K890을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539/K890; A203/N277/G366/I601/K890; 또는 N277/G366/F539/I601/K890을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539/I601/K890을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/T1102; N277/T1102; G366/T1102; F539/T1102; I601/T1102; A203/D1127; N277/D1127; G366/D1127; F539/D1127; I601/D1127; A203/T1102/D1127; N277/T1102/D1127; G366/T1102/D1127; F539/T1102/D1127; 또는I601/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/T1102; A203/G366/T1102; A203/F539/T1102; A203/I601/T1102; N277/G366/T1102; N277/F539/T1102; N277/I601/T1102; G366/F539/T1102; G366/I601/T1102; F539/I601/T1102; A203/N277/D1127; A203/G366/D1127; A203/F539/D1127; A203/I601/D1127; N277/G366/D1127; N277/F539/D1127; N277/I601/D1127; G366/F539/D1127; G366/I601/D1127; F539/I601/D1127; A203/N277/T1102/D1127; A203/G366/T1102/D1127; A203/F539/T1102/D1127; A203/I601/T1102/D1127; N277/G366/T1102/D1127; N277/F539/T1102/D1127; N277/I601/T1102/D1127; G366/F539/T1102/D1127; G366/I601/T1102/D1127; 또는 F539/I601/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/T1102; A203/N277/F539/T1102; A203/N277/I601/T1102; A203/G366/F539/T1102; A203/G366/I601/T1102; A203/F539/I601/T1102; N277/G366/F539/T1102; N277/G366/I601/T1102; G366/F539/I601/T1102; A203/N277/G366/D1127; A203/N277/F539/D1127; A203/N277/I601/D1127; A203/G366/F539/D1127; A203/G366/I601/D1127; A203/F539/I601/D1127; N277/G366/F539/D1127; N277/G366/I601/D1127; G366/F539/I601/D1127; A203/N277/G366/T1102/D1127; A203/N277/F539/T1102/D1127; A203/N277/I601/T1102/D1127; A203/G366/F539/T1102/D1127; A203/G366/I601/T1102/D1127; A203/F539/I601/T1102/D1127; N277/G366/F539/T1102/D1127; N277/G366/I601/T1102/D1127; 또는 G366/F539/I601/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539/T1102; A203/N277/G366/I601/T1102; N277/G366/F539/I601/T1102; A203/N277/G366/F539/D1127; A203/N277/G366/I601/D1127; N277/G366/F539/I601/D1127; A203/N277/G366/F539/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/T1102/D1127; 또는 N277/G366/F539/I601/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539/I601/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/D1127; 또는 A203/N277/G366/F539/I601/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 3-1 영역 중 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, V838, D839, H840, K848, D849, D850, D853, N854, K855, R859, D861, K862, N863, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, A889, K890, L891, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763/K890; K890/D965; K890/E1007; 또는 K890/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763/K890/D965; M763/K890/E1007; M763/K890/F1038; K890/D965/E1007; 또는 K890/E1007/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763/K890/D965/E1007; M763/K890/D965/F1038; M763/K890/E1007/F1038; K890/D965/E1007/F1038; 또는 M763/K890/D965/E1007/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763/T1102; D965/T1102; E1007/T1102; F1038/T1102; M763/D1127; D965/D1127; E1007/D1127; F1038/D1127; M763/T1102/D1127; D965/T1102/D1127; E1007/T1102/D1127; 또는 F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763/D965/T1102; M763/E1007/T1102; M763/F1038/T1102; D965/E1007/T1102; D965/F1038/T1102; E1007/F1038/T1102; M763/D965/D1127; M763/E1007/D1127; M763/F1038/D1127; D965/E1007/D1127; D965/F1038/D1127; E1007/F1038/D1127; M763/D965/T1102/D1127; M763/E1007/T1102/D1127; M763/F1038/T1102/D1127; D965/E1007/T1102/D1127; D965/F1038/T1102/D1127; 또는 E1007/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763/D965/E1007/T1102; M763/D965/F1038/T1102; M763/E1007/F1038/T1102; D965/E1007/F1038/T1102; M763/D965/E1007/F1038/T1102; M763/D965/E1007/D1127; M763/D965/F1038/D1127; M763/E1007/F1038/D1127; D965/E1007/F1038/D1127; M763/D965/E1007/F1038/D1127; M763/D965/E1007/T1102/D1127; M763/D965/F1038/T1102/D1127; M763/E1007/F1038/T1102/D1127; D965/E1007/F1038/T1102/D1127; 또는 M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 K890/T1102; K890/D1127; 또는 K890/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 셋 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 3-1 영역 중 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, V838, D839, H840, K848, D849, D850, D853, N854, K855, R859, D861, K862, N863, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, A889, K890, L891, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/M763/K890; A203/K890/D965; A203/K890/E1007; A203/K890/F1038; A203/M763/K890/D965; A203/M763/K890/E1007; A203/M763/K890/F1038; A203/K890/D965/E1007; A203/K890/D965/F1038; A203/K890/E1007/F1038; A203/M763/K890/D965/E1007; A203/M763/K890/D965/F1038; A203/M763/K890/E1007/F1038; A203/K890/D965/E1007/F1038; A203/M763/K890/D965/E1007/F1038; N277/M763/K890; N277/K890/D965; N277/K890/E1007; N277/K890/F1038; N277/M763/K890/D965; N277/M763/K890/E1007; N277/M763/K890/F1038; N277/K890/D965/E1007; N277/K890/D965/F1038; N277/K890/E1007/F1038; N277/M763/K890/D965/E1007; N277/M763/K890/D965/F1038; N277/M763/K890/E1007/F1038; N277/K890/D965/E1007/F1038; N277/M763/K890/D965/E1007/F1038; G366/M763/K890; G366/K890/D965; G366/K890/E1007; G366/K890/F1038; G366/M763/K890/D965; G366/M763/K890/E1007; G366/M763/K890/F1038; G366/K890/D965/E1007; G366/K890/D965/F1038; G366/K890/E1007/F1038; G366/M763/K890/D965/E1007; G366/M763/K890/D965/F1038; G366/M763/K890/E1007/F1038; G366/K890/D965/E1007/F1038; G366/M763/K890/D965/E1007/F1038; F539/M763/K890; F539/K890/D965; F539/K890/E1007; F539/K890/F1038; F539/M763/K890/D965; F539/M763/K890/E1007; F539/M763/K890/F1038; F539/K890/D965/E1007; F539/K890/D965/F1038; F539/K890/E1007/F1038; F539/M763/K890/D965/E1007; F539/M763/K890/D965/F1038; F539/M763/K890/E1007/F1038; F539/K890/D965/E1007/F1038; F539/M763/K890/D965/E1007/F1038; I601/M763/K890; I601/K890/D965; I601/K890/E1007; I601/K890/F1038; I601/M763/K890/D965; I601/M763/K890/E1007; I601/M763/K890/F1038; I601/K890/D965/E1007; I601/K890/D965/F1038; I601/K890/E1007/F1038; I601/M763/K890/D965/E1007; I601/M763/K890/D965/F1038; I601/M763/K890/E1007/F1038; I601/K890/D965/E1007/F1038; 또는 I601/M763/K890/D965/E1007/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/M763/K890; A203/N277/K890/D965; A203/N277/K890/E1007; A203/N277/K890/F1038; A203/N277/M763/K890/D965; A203/N277/M763/K890/E1007; A203/N277/M763/K890/F1038; A203/N277/K890/D965/E1007; A203/N277/K890/D965/F1038; A203/N277/K890/E1007/F1038; A203/N277/M763/K890/D965/E1007; A203/N277/M763/K890/D965/F1038; A203/N277/M763/K890/E1007/F1038; A203/N277/K890/D965/E1007/F1038; A203/N277/M763/K890/D965/E1007/F1038; A203/G366/M763/K890; A203/G366/K890/D965; A203/G366/K890/E1007; A203/G366/K890/F1038; A203/G366/M763/K890/D965; A203/G366/M763/K890/E1007; A203/G366/M763/K890/F1038; A203/G366/K890/D965/E1007; A203/G366/K890/D965/F1038; A203/G366/K890/E1007/F1038; A203/G366/M763/K890/D965/E1007; A203/G366/M763/K890/D965/F1038; A203/G366/M763/K890/E1007/F1038; A203/G366/K890/D965/E1007/F1038; A203/G366/M763/K890/D965/E1007/F1038; A203/F539/M763/K890; A203/F539/K890/D965; A203/F539/K890/E1007; A203/F539/K890/F1038; A203/F539/M763/K890/D965; A203/F539/M763/K890/E1007; A203/F539/M763/K890/F1038; A203/F539/K890/D965/E1007; A203/F539/K890/D965/F1038; A203/F539/K890/E1007/F1038; A203/F539/M763/K890/D965/E1007; A203/F539/M763/K890/D965/F1038; A203/F539/M763/K890/E1007/F1038; A203/F539/K890/D965/E1007/F1038; A203/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038; A203/I601/M763/K890; A203/I601/K890/D965; A203/I601/K890/E1007; A203/I601/K890/F1038; A203/I601/M763/K890/D965; A203/I601/M763/K890/E1007; A203/I601/M763/K890/F1038; A203/I601/K890/D965/E1007; A203/I601/K890/D965/F1038; A203/I601/K890/E1007/F1038; A203/I601/M763/K890/D965/E1007; A203/I601/M763/K890/D965/F1038; A203/I601/M763/K890/E1007/F1038; A203/I601/K890/D965/E1007/F1038; A203/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038; N277/G366/M763/K890; N277/G366/K890/D965; N277/G366/K890/E1007; N277/G366/K890/F1038; N277/G366/M763/K890/D965; N277/G366/M763/K890/E1007; N277/G366/M763/K890/F1038; N277/G366/K890/D965/E1007; N277/G366/K890/D965/F1038; N277/G366/K890/E1007/F1038; N277/G366/M763/K890/D965/E1007; N277/G366/M763/K890/D965/F1038; N277/G366/M763/K890/E1007/F1038; N277/G366/K890/D965/E1007/F1038; N277/G366/M763/K890/D965/E1007/F1038; N277/F539/M763/K890; N277/F539/K890/D965; N277/F539/K890/E1007; N277/F539/K890/F1038; N277/F539/M763/K890/D965; N277/F539/M763/K890/E1007; N277/F539/M763/K890/F1038; N277/F539/K890/D965/E1007; N277/F539/K890/D965/F1038; N277/F539/K890/E1007/F1038; N277/F539/M763/K890/D965/E1007; N277/F539/M763/K890/D965/F1038; N277/F539/M763/K890/E1007/F1038; N277/F539/K890/D965/E1007/F1038; N277/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038; N277/I601/M763/K890; N277/I601/K890/D965; N277/I601/K890/E1007; N277/I601/K890/F1038; N277/I601/M763/K890/D965; N277/I601/M763/K890/E1007; N277/I601/M763/K890/F1038; N277/I601/K890/D965/E1007; N277/I601/K890/D965/F1038; N277/I601/K890/E1007/F1038; N277/I601/M763/K890/D965/E1007; N277/I601/M763/K890/D965/F1038; N277/I601/M763/K890/E1007/F1038; N277/I601/K890/D965/E1007/F1038; N277/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038; G366/F539/M763/K890; G366/F539/K890/D965; G366/F539/K890/E1007; G366/F539/K890/F1038; G366/F539/M763/K890/D965; G366/F539/M763/K890/E1007; G366/F539/M763/K890/F1038; G366/F539/K890/D965/E1007; G366/F539/K890/D965/F1038; G366/F539/K890/E1007/F1038; G366/F539/M763/K890/D965/E1007; G366/F539/M763/K890/D965/F1038; G366/F539/M763/K890/E1007/F1038; G366/F539/K890/D965/E1007/F1038; G366/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038; G366/I601/M763/K890; G366/I601/K890/D965; G366/I601/K890/E1007; G366/I601/K890/F1038; G366/I601/M763/K890/D965; G366/I601/M763/K890/E1007; G366/I601/M763/K890/F1038; G366/I601/K890/D965/E1007; G366/I601/K890/D965/F1038; G366/I601/K890/E1007/F1038; G366/I601/M763/K890/D965/E1007; G366/I601/M763/K890/D965/F1038; G366/I601/M763/K890/E1007/F1038; G366/I601/K890/D965/E1007/F1038; G366/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038; F539/I601/M763/K890; F539/I601/K890/D965; F539/I601/K890/E1007; F539/I601/K890/F1038; F539/I601/M763/K890/D965; F539/I601/M763/K890/E1007; F539/I601/M763/K890/F1038; F539/I601/K890/D965/E1007; F539/I601/K890/D965/F1038; F539/I601/K890/E1007/F1038; F539/I601/M763/K890/D965/E1007; F539/I601/M763/K890/D965/F1038; F539/I601/M763/K890/E1007/F1038; F539/I601/K890/D965/E1007/F1038; 또는 F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/M763/K890; A203/N277/G366/K890/D965; A203/N277/G366/K890/E1007; A203/N277/G366/K890/F1038; A203/N277/G366/M763/K890/D965; A203/N277/G366/M763/K890/E1007; A203/N277/G366/M763/K890/F1038; A203/N277/G366/K890/D965/E1007; A203/N277/G366/K890/D965/F1038; A203/N277/G366/K890/E1007/F1038; A203/N277/G366/M763/K890/D965/E1007; A203/N277/G366/M763/K890/D965/F1038; A203/N277/G366/M763/K890/E1007/F1038; A203/N277/G366/K890/D965/E1007/F1038; A203/N277/G366/M763/K890/D965/E1007/F1038; A203/N277/F539/M763/K890; A203/N277/F539/K890/D965; A203/N277/F539/K890/E1007; A203/N277/F539/K890/F1038; A203/N277/F539/M763/K890/D965; A203/N277/F539/M763/K890/E1007; A203/N277/F539/M763/K890/F1038; A203/N277/F539/K890/D965/E1007; A203/N277/F539/K890/D965/F1038; A203/N277/F539/K890/E1007/F1038; A203/N277/F539/M763/K890/D965/E1007; A203/N277/F539/M763/K890/D965/F1038; A203/N277/F539/M763/K890/E1007/F1038; A203/N277/F539/K890/D965/E1007/F1038; A203/N277/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038; A203/N277/I601/M763/K890; A203/N277/I601/K890/D965; A203/N277/I601/K890/E1007; A203/N277/I601/K890/F1038; A203/N277/I601/M763/K890/D965; A203/N277/I601/M763/K890/E1007; A203/N277/I601/M763/K890/F1038; A203/N277/I601/K890/D965/E1007; A203/N277/I601/K890/D965/F1038; A203/N277/I601/K890/E1007/F1038; A203/N277/I601/M763/K890/D965/E1007; A203/N277/I601/M763/K890/D965/F1038; A203/N277/I601/M763/K890/E1007/F1038; A203/N277/I601/K890/D965/E1007/F1038; A203/N277/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038; A203/G366/F539/M763/K890; A203/G366/F539/K890/D965; A203/G366/F539/K890/E1007; A203/G366/F539/K890/F1038; A203/G366/F539/M763/K890/D965; A203/G366/F539/M763/K890/E1007; A203/G366/F539/M763/K890/F1038; A203/G366/F539/K890/D965/E1007; A203/G366/F539/K890/D965/F1038; A203/G366/F539/K890/E1007/F1038; A203/G366/F539/M763/K890/D965/E1007; A203/G366/F539/M763/K890/D965/F1038; A203/G366/F539/M763/K890/E1007/F1038; A203/G366/F539/K890/D965/E1007/F1038; A203/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038; A203/G366/I601/M763/K890; A203/G366/I601/K890/D965; A203/G366/I601/K890/E1007; A203/G366/I601/K890/F1038; A203/G366/I601/M763/K890/D965; A203/G366/I601/M763/K890/E1007; A203/G366/I601/M763/K890/F1038; A203/G366/I601/K890/D965/E1007; A203/G366/I601/K890/D965/F1038; A203/G366/I601/K890/E1007/F1038; A203/G366/I601/M763/K890/D965/E1007; A203/G366/I601/M763/K890/D965/F1038; A203/G366/I601/M763/K890/E1007/F1038; A203/G366/I601/K890/D965/E1007/F1038; A203/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038; A203/F539/I601/M763/K890; A203/F539/I601/K890/D965; A203/F539/I601/K890/E1007; A203/F539/I601/K890/F1038; A203/F539/I601/M763/K890/D965; A203/F539/I601/M763/K890/E1007; A203/F539/I601/M763/K890/F1038; A203/F539/I601/K890/D965/E1007; A203/F539/I601/K890/D965/F1038; A203/F539/I601/K890/E1007/F1038; A203/F539/I601/M763/K890/D965/E1007; A203/F539/I601/M763/K890/D965/F1038; A203/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038; A203/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038; A203/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038; N277/G366/F539/M763/K890; N277/G366/F539/K890/D965; N277/G366/F539/K890/E1007; N277/G366/F539/K890/F1038; N277/G366/F539/M763/K890/D965; N277/G366/F539/M763/K890/E1007; N277/G366/F539/M763/K890/F1038; N277/G366/F539/K890/D965/E1007; N277/G366/F539/K890/D965/F1038; N277/G366/F539/K890/E1007/F1038; N277/G366/F539/M763/K890/D965/E1007; N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038; N277/G366/F539/M763/K890/E1007/F1038; N277/G366/F539/K890/D965/E1007/F1038; N277/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038; N277/G366/I601/M763/K890; N277/G366/I601/K890/D965; N277/G366/I601/K890/E1007; N277/G366/I601/K890/F1038; N277/G366/I601/M763/K890/D965; N277/G366/I601/M763/K890/E1007; N277/G366/I601/M763/K890/F1038; N277/G366/I601/K890/D965/E1007; N277/G366/I601/K890/D965/F1038; N277/G366/I601/K890/E1007/F1038; N277/G366/I601/M763/K890/D965/E1007; N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038; N277/G366/I601/M763/K890/E1007/F1038; N277/G366/I601/K890/D965/E1007/F1038; N277/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038; G366/F539/I601/M763/K890; G366/F539/I601/K890/D965; G366/F539/I601/K890/E1007; G366/F539/I601/K890/F1038; G366/F539/I601/M763/K890/D965; G366/F539/I601/M763/K890/E1007; G366/F539/I601/M763/K890/F1038; G366/F539/I601/K890/D965/E1007; G366/F539/I601/K890/D965/F1038; G366/F539/I601/K890/E1007/F1038; G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007; G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038; G366/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038; G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038; 또는 G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539/M763/K890; A203/N277/G366/F539/K890/D965; A203/N277/G366/F539/K890/E1007; A203/N277/G366/F539/K890/F1038; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965; A203/N277/G366/F539/M763/K890/E1007; A203/N277/G366/F539/M763/K890/F1038; A203/N277/G366/F539/K890/D965/E1007; A203/N277/G366/F539/K890/D965/F1038; A203/N277/G366/F539/K890/E1007/F1038; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/E1007; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038; A203/N277/G366/F539/M763/K890/E1007/F1038; A203/N277/G366/F539/K890/D965/E1007/F1038; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038; A203/N277/G366/I601/M763/K890; A203/N277/G366/I601/K890/D965; A203/N277/G366/I601/K890/E1007; A203/N277/G366/I601/K890/F1038; A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965; A203/N277/G366/I601/M763/K890/E1007; A203/N277/G366/I601/M763/K890/F1038; A203/N277/G366/I601/K890/D965/E1007; A203/N277/G366/I601/K890/D965/F1038; A203/N277/G366/I601/K890/E1007/F1038; A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/E1007; A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038; A203/N277/G366/I601/M763/K890/E1007/F1038; A203/N277/G366/I601/K890/D965/E1007/F1038; A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038; N277/G366/F539/I601/M763/K890; N277/G366/F539/I601/K890/D965; N277/G366/F539/I601/K890/E1007; N277/G366/F539/I601/K890/F1038; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965; N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007; N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038; N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007; N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038; N277/G366/F539/I601/K890/E1007/F1038; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038; N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038; N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038; A203/G366/F539/I601/M763/K890; A203/G366/F539/I601/K890/D965; A203/G366/F539/I601/K890/E1007; A203/G366/F539/I601/K890/F1038; A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965; A203/G366/F539/I601/M763/K890/E1007; A203/G366/F539/I601/M763/K890/F1038; A203/G366/F539/I601/K890/D965/E1007; A203/G366/F539/I601/K890/D965/F1038; A203/G366/F539/I601/K890/E1007/F1038; A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007; A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038; A203/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038; A203/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038; A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038; A203/N277/F539/I601/M763/K890; A203/N277/F539/I601/K890/D965; A203/N277/F539/I601/K890/E1007; A203/N277/F539/I601/K890/F1038; A203/N277/F539/I601/M763/K890/D965; A203/N277/F539/I601/M763/K890/E1007; A203/N277/F539/I601/M763/K890/F1038; A203/N277/F539/I601/K890/D965/E1007; A203/N277/F539/I601/K890/D965/F1038; A203/N277/F539/I601/K890/E1007/F1038; A203/N277/F539/I601/M763/K890/D965/E1007; A203/N277/F539/I601/M763/K890/D965/F1038; A203/N277/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038; A203/N277/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038; A203/N277/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965; A203/N277/G366/F539/I601/K890/E1007; A203/N277/G366/F539/I601/K890/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/K890/E1007/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038; 또는 A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 셋 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/M763/T1102; A203/D965/T1102; A203/E1007/T1102; A203/F1038/T1102; A203/M763/D965/T1102; A203/M763/E1007/T1102; A203/M763/F1038/T1102; A203/D965/E1007/T1102; A203/D965/F1038/T1102; A203/E1007/F1038/T1102; A203/M763/D965/E1007/T1102; A203/M763/D965/F1038/T1102; A203/M763/E1007/F1038/T1102; A203/D965/E1007/F1038/T1102; A203/M763/D965/E1007/F1038/T1102; N277/M763/T1102; N277/D965/T1102; N277/E1007/T1102; N277/F1038/T1102; N277/M763/D965/T1102; N277/M763/E1007/T1102; N277/M763/F1038/T1102; N277/D965/E1007/T1102; N277/D965/F1038/T1102; N277/E1007/F1038/T1102; N277/M763/D965/E1007/T1102; N277/M763/D965/F1038/T1102; N277/M763/E1007/F1038/T1102; N277/D965/E1007/F1038/T1102; N277/M763/D965/E1007/F1038/T1102; G366/M763/T1102; G366/D965/T1102; G366/E1007/T1102; G366/F1038/T1102; G366/M763/D965/T1102; G366/M763/E1007/T1102; G366/M763/F1038/T1102; G366/D965/E1007/T1102; G366/D965/F1038/T1102; G366/E1007/F1038/T1102; G366/M763/D965/E1007/T1102; G366/M763/D965/F1038/T1102; G366/M763/E1007/F1038/T1102; G366/D965/E1007/F1038/T1102; G366/M763/D965/E1007/F1038/T1102; F539/M763/T1102; F539/D965/T1102; F539/E1007/T1102; F539/F1038/T1102; F539/M763/D965/T1102; F539/M763/E1007/T1102; F539/M763/F1038/T1102; F539/D965/E1007/T1102; F539/D965/F1038/T1102; F539/E1007/F1038/T1102; F539/M763/D965/E1007/T1102; F539/M763/D965/F1038/T1102; F539/M763/E1007/F1038/T1102; F539/D965/E1007/F1038/T1102; F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102; I601/M763/T1102; I601/D965/T1102; I601/E1007/T1102; I601/F1038/T1102; I601/M763/D965/T1102; I601/M763/E1007/T1102; I601/M763/F1038/T1102; I601/D965/E1007/T1102; I601/D965/F1038/T1102; I601/E1007/F1038/T1102; I601/M763/D965/E1007/T1102; I601/M763/D965/F1038/T1102; I601/M763/E1007/F1038/T1102; I601/D965/E1007/F1038/T1102; I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102; A203/M763/D1127; A203/D965/D1127; A203/E1007/D1127; A203/F1038/D1127; A203/M763/D965/D1127; A203/M763/E1007/D1127; A203/M763/F1038/D1127; A203/D965/E1007/D1127; A203/D965/F1038/D1127; A203/E1007/F1038/D1127; A203/M763/D965/E1007/D1127; A203/M763/D965/F1038/D1127; A203/M763/E1007/F1038/D1127; A203/D965/E1007/F1038/D1127; A203/M763/D965/E1007/F1038/D1127; N277/M763/D1127; N277/D965/D1127; N277/E1007/D1127; N277/F1038/D1127; N277/M763/D965/D1127; N277/M763/E1007/D1127; N277/M763/F1038/D1127; N277/D965/E1007/D1127; N277/D965/F1038/D1127; N277/E1007/F1038/D1127; N277/M763/D965/E1007/D1127; N277/M763/D965/F1038/D1127; N277/M763/E1007/F1038/D1127; N277/D965/E1007/F1038/D1127; N277/M763/D965/E1007/F1038/D1127; G366/M763/D1127; G366/D965/D1127; G366/E1007/D1127; G366/F1038/D1127; G366/M763/D965/D1127; G366/M763/E1007/D1127; G366/M763/F1038/D1127; G366/D965/E1007/D1127; G366/D965/F1038/D1127; G366/E1007/F1038/D1127; G366/M763/D965/E1007/D1127; G366/M763/D965/F1038/D1127; G366/M763/E1007/F1038/D1127; G366/D965/E1007/F1038/D1127; G366/M763/D965/E1007/F1038/D1127; F539/M763/D1127; F539/D965/D1127; F539/E1007/D1127; F539/F1038/D1127; F539/M763/D965/D1127; F539/M763/E1007/D1127; F539/M763/F1038/D1127; F539/D965/E1007/D1127; F539/D965/F1038/D1127; F539/E1007/F1038/D1127; F539/M763/D965/E1007/D1127; F539/M763/D965/F1038/D1127; F539/M763/E1007/F1038/D1127; F539/D965/E1007/F1038/D1127; F539/M763/D965/E1007/F1038/D1127; I601/M763/D1127; I601/D965/D1127; I601/E1007/D1127; I601/F1038/D1127; I601/M763/D965/D1127; I601/M763/E1007/D1127; I601/M763/F1038/D1127; I601/D965/E1007/D1127; I601/D965/F1038/D1127; I601/E1007/F1038/D1127; I601/M763/D965/E1007/D1127; I601/M763/D965/F1038/D1127; I601/M763/E1007/F1038/D1127; I601/D965/E1007/F1038/D1127; 또는 I601/M763/D965/E1007/F1038/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/M763/T1102/D1127; A203/D965/T1102/D1127; A203/E1007/T1102/D1127; A203/F1038/T1102/D1127; A203/M763/D965/T1102/D1127; A203/M763/E1007/T1102/D1127; A203/M763/F1038/T1102/D1127; A203/D965/E1007/T1102/D1127; A203/D965/F1038/T1102/D1127; A203/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/M763/D965/E1007/T1102/D1127; A203/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/M763/T1102/D1127; N277/D965/T1102/D1127; N277/E1007/T1102/D1127; N277/F1038/T1102/D1127; N277/M763/D965/T1102/D1127; N277/M763/E1007/T1102/D1127; N277/M763/F1038/T1102/D1127; N277/D965/E1007/T1102/D1127; N277/D965/F1038/T1102/D1127; N277/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/M763/D965/E1007/T1102/D1127; N277/M763/D965/F1038/T1102/D1127; N277/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/M763/T1102/D1127; G366/D965/T1102/D1127; G366/E1007/T1102/D1127; G366/F1038/T1102/D1127; G366/M763/D965/T1102/D1127; G366/M763/E1007/T1102/D1127; G366/M763/F1038/T1102/D1127; G366/D965/E1007/T1102/D1127; G366/D965/F1038/T1102/D1127; G366/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/M763/D965/E1007/T1102/D1127; G366/M763/D965/F1038/T1102/D1127; G366/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; F539/M763/T1102/D1127; F539/D965/T1102/D1127; F539/E1007/T1102/D1127; F539/F1038/T1102/D1127; F539/M763/D965/T1102/D1127; F539/M763/E1007/T1102/D1127; F539/M763/F1038/T1102/D1127; F539/D965/E1007/T1102/D1127; F539/D965/F1038/T1102/D1127; F539/E1007/F1038/T1102/D1127; F539/M763/D965/E1007/T1102/D1127; F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127; F539/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; F539/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; I601/M763/T1102/D1127; I601/D965/T1102/D1127; I601/E1007/T1102/D1127; I601/F1038/T1102/D1127; I601/M763/D965/T1102/D1127; I601/M763/E1007/T1102/D1127; I601/M763/F1038/T1102/D1127; I601/D965/E1007/T1102/D1127; I601/D965/F1038/T1102/D1127; I601/E1007/F1038/T1102/D1127; I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127; I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; 또는 I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/M763/T1102; A203/N277/D965/T1102; A203/N277/E1007/T1102; A203/N277/F1038/T1102; A203/N277/M763/D965/T1102; A203/N277/M763/E1007/T1102; A203/N277/M763/F1038/T1102; A203/N277/D965/E1007/T1102; A203/N277/D965/F1038/T1102; A203/N277/E1007/F1038/T1102; A203/N277/M763/D965/E1007/T1102; A203/N277/M763/D965/F1038/T1102; A203/N277/M763/E1007/F1038/T1102; A203/N277/D965/E1007/F1038/T1102; A203/N277/M763/D965/E1007/F1038/T1102; A203/G366/M763/T1102; A203/G366/D965/T1102; A203/G366/E1007/T1102; A203/G366/F1038/T1102; A203/G366/M763/D965/T1102; A203/G366/M763/E1007/T1102; A203/G366/M763/F1038/T1102; A203/G366/D965/E1007/T1102; A203/G366/D965/F1038/T1102; A203/G366/E1007/F1038/T1102; A203/G366/M763/D965/E1007/T1102; A203/G366/M763/D965/F1038/T1102; A203/G366/M763/E1007/F1038/T1102; A203/G366/D965/E1007/F1038/T1102; A203/G366/M763/D965/E1007/F1038/T1102; A203/F539/M763/T1102; A203/F539/D965/T1102; A203/F539/E1007/T1102; A203/F539/F1038/T1102; A203/F539/M763/D965/T1102; A203/F539/M763/E1007/T1102; A203/F539/M763/F1038/T1102; A203/F539/D965/E1007/T1102; A203/F539/D965/F1038/T1102; A203/F539/E1007/F1038/T1102; A203/F539/M763/D965/E1007/T1102; A203/F539/M763/D965/F1038/T1102; A203/F539/M763/E1007/F1038/T1102; A203/F539/D965/E1007/F1038/T1102; A203/F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102; A203/I601/M763/T1102; A203/I601/D965/T1102; A203/I601/E1007/T1102; A203/I601/F1038/T1102; A203/I601/M763/D965/T1102; A203/I601/M763/E1007/T1102; A203/I601/M763/F1038/T1102; A203/I601/D965/E1007/T1102; A203/I601/D965/F1038/T1102; A203/I601/E1007/F1038/T1102; A203/I601/M763/D965/E1007/T1102; A203/I601/M763/D965/F1038/T1102; A203/I601/M763/E1007/F1038/T1102; A203/I601/D965/E1007/F1038/T1102; A203/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102; N277/G366/M763/T1102; N277/G366/D965/T1102; N277/G366/E1007/T1102; N277/G366/F1038/T1102; N277/G366/M763/D965/T1102; N277/G366/M763/E1007/T1102; N277/G366/M763/F1038/T1102; N277/G366/D965/E1007/T1102; N277/G366/D965/F1038/T1102; N277/G366/E1007/F1038/T1102; 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G366/I601/M763/D965/F1038/D1127; G366/I601/M763/E1007/F1038/D1127; G366/I601/D965/E1007/F1038/D1127; G366/I601/M763/D965/E1007/F1038/D1127; F539/I601/M763/D1127; F539/I601/D965/D1127; F539/I601/E1007/D1127; F539/I601/F1038/D1127; F539/I601/M763/D965/D1127; F539/I601/M763/E1007/D1127; F539/I601/M763/F1038/D1127; F539/I601/D965/E1007/D1127; F539/I601/D965/F1038/D1127; F539/I601/E1007/F1038/D1127; F539/I601/M763/D965/E1007/D1127; F539/I601/M763/D965/F1038/D1127; F539/I601/M763/E1007/F1038/D1127; F539/I601/D965/E1007/F1038/D1127; 또는 F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/M763/T1102/D1127; A203/N277/D965/T1102/D1127; A203/N277/E1007/T1102/D1127; A203/N277/F1038/T1102/D1127; A203/N277/M763/D965/T1102/D1127; A203/N277/M763/E1007/T1102/D1127; A203/N277/M763/F1038/T1102/D1127; A203/N277/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/M763/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/M763/T1102/D1127; A203/G366/D965/T1102/D1127; A203/G366/E1007/T1102/D1127; A203/G366/F1038/T1102/D1127; A203/G366/M763/D965/T1102/D1127; A203/G366/M763/E1007/T1102/D1127; A203/G366/M763/F1038/T1102/D1127; A203/G366/D965/E1007/T1102/D1127; A203/G366/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/M763/D965/E1007/T1102/D1127; A203/G366/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/F539/M763/T1102/D1127; A203/F539/D965/T1102/D1127; A203/F539/E1007/T1102/D1127; A203/F539/F1038/T1102/D1127; A203/F539/M763/D965/T1102/D1127; A203/F539/M763/E1007/T1102/D1127; A203/F539/M763/F1038/T1102/D1127; A203/F539/D965/E1007/T1102/D1127; A203/F539/D965/F1038/T1102/D1127; A203/F539/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/F539/M763/D965/E1007/T1102/D1127; A203/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/F539/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/F539/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/I601/M763/T1102/D1127; A203/I601/D965/T1102/D1127; A203/I601/E1007/T1102/D1127; A203/I601/F1038/T1102/D1127; A203/I601/M763/D965/T1102/D1127; A203/I601/M763/E1007/T1102/D1127; A203/I601/M763/F1038/T1102/D1127; A203/I601/D965/E1007/T1102/D1127; A203/I601/D965/F1038/T1102/D1127; A203/I601/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127; A203/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/M763/T1102/D1127; N277/G366/D965/T1102/D1127; N277/G366/E1007/T1102/D1127; N277/G366/F1038/T1102/D1127; N277/G366/M763/D965/T1102/D1127; N277/G366/M763/E1007/T1102/D1127; N277/G366/M763/F1038/T1102/D1127; N277/G366/D965/E1007/T1102/D1127; N277/G366/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/M763/D965/E1007/T1102/D1127; N277/G366/M763/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/F539/M763/T1102/D1127; N277/F539/D965/T1102/D1127; N277/F539/E1007/T1102/D1127; N277/F539/F1038/T1102/D1127; N277/F539/M763/D965/T1102/D1127; N277/F539/M763/E1007/T1102/D1127; N277/F539/M763/F1038/T1102/D1127; N277/F539/D965/E1007/T1102/D1127; N277/F539/D965/F1038/T1102/D1127; N277/F539/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/F539/M763/D965/E1007/T1102/D1127; N277/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127; N277/F539/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/F539/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/I601/M763/T1102/D1127; N277/I601/D965/T1102/D1127; N277/I601/E1007/T1102/D1127; N277/I601/F1038/T1102/D1127; N277/I601/M763/D965/T1102/D1127; N277/I601/M763/E1007/T1102/D1127; N277/I601/M763/F1038/T1102/D1127; N277/I601/D965/E1007/T1102/D1127; N277/I601/D965/F1038/T1102/D1127; N277/I601/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127; N277/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; N277/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/F539/M763/T1102/D1127; G366/F539/D965/T1102/D1127; G366/F539/E1007/T1102/D1127; G366/F539/F1038/T1102/D1127; G366/F539/M763/D965/T1102/D1127; G366/F539/M763/E1007/T1102/D1127; G366/F539/M763/F1038/T1102/D1127; G366/F539/D965/E1007/T1102/D1127; G366/F539/D965/F1038/T1102/D1127; G366/F539/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/F539/M763/D965/E1007/T1102/D1127; G366/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127; G366/F539/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/F539/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/I601/M763/T1102/D1127; G366/I601/D965/T1102/D1127; G366/I601/E1007/T1102/D1127; G366/I601/F1038/T1102/D1127; G366/I601/M763/D965/T1102/D1127; G366/I601/M763/E1007/T1102/D1127; G366/I601/M763/F1038/T1102/D1127; G366/I601/D965/E1007/T1102/D1127; G366/I601/D965/F1038/T1102/D1127; G366/I601/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127; G366/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; G366/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; F539/I601/M763/T1102/D1127; F539/I601/D965/T1102/D1127; F539/I601/E1007/T1102/D1127; F539/I601/F1038/T1102/D1127; F539/I601/M763/D965/T1102/D1127; F539/I601/M763/E1007/T1102/D1127; F539/I601/M763/F1038/T1102/D1127; F539/I601/D965/E1007/T1102/D1127; F539/I601/D965/F1038/T1102/D1127; F539/I601/E1007/F1038/T1102/D1127; F539/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127; F539/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; 또는 F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/M763/T1102; A203/N277/G366/D965/T1102; A203/N277/G366/E1007/T1102; A203/N277/G366/F1038/T1102; A203/N277/G366/M763/D965/T1102; A203/N277/G366/M763/E1007/T1102; A203/N277/G366/M763/F1038/T1102; A203/N277/G366/D965/E1007/T1102; A203/N277/G366/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/M763/D965/E1007/T1102; A203/N277/G366/M763/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/M763/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/D965/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/M763/D965/E1007/F1038/T1102; A203/N277/F539/M763/T1102; A203/N277/F539/D965/T1102; A203/N277/F539/E1007/T1102; A203/N277/F539/F1038/T1102; A203/N277/F539/M763/D965/T1102; A203/N277/F539/M763/E1007/T1102; A203/N277/F539/M763/F1038/T1102; A203/N277/F539/D965/E1007/T1102; A203/N277/F539/D965/F1038/T1102; A203/N277/F539/E1007/F1038/T1102; A203/N277/F539/M763/D965/E1007/T1102; A203/N277/F539/M763/D965/F1038/T1102; A203/N277/F539/M763/E1007/F1038/T1102; A203/N277/F539/D965/E1007/F1038/T1102; A203/N277/F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102; A203/N277/I601/M763/T1102; A203/N277/I601/D965/T1102; A203/N277/I601/E1007/T1102; A203/N277/I601/F1038/T1102; A203/N277/I601/M763/D965/T1102; A203/N277/I601/M763/E1007/T1102; A203/N277/I601/M763/F1038/T1102; A203/N277/I601/D965/E1007/T1102; A203/N277/I601/D965/F1038/T1102; A203/N277/I601/E1007/F1038/T1102; A203/N277/I601/M763/D965/E1007/T1102; A203/N277/I601/M763/D965/F1038/T1102; A203/N277/I601/M763/E1007/F1038/T1102; A203/N277/I601/D965/E1007/F1038/T1102; A203/N277/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102; A203/G366/F539/M763/T1102; A203/G366/F539/D965/T1102; A203/G366/F539/E1007/T1102; A203/G366/F539/F1038/T1102; A203/G366/F539/M763/D965/T1102; A203/G366/F539/M763/E1007/T1102; A203/G366/F539/M763/F1038/T1102; A203/G366/F539/D965/E1007/T1102; A203/G366/F539/D965/F1038/T1102; A203/G366/F539/E1007/F1038/T1102; A203/G366/F539/M763/D965/E1007/T1102; A203/G366/F539/M763/D965/F1038/T1102; A203/G366/F539/M763/E1007/F1038/T1102; A203/G366/F539/D965/E1007/F1038/T1102; A203/G366/F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102; A203/G366/I601/M763/T1102; A203/G366/I601/D965/T1102; A203/G366/I601/E1007/T1102; A203/G366/I601/F1038/T1102; A203/G366/I601/M763/D965/T1102; A203/G366/I601/M763/E1007/T1102; A203/G366/I601/M763/F1038/T1102; A203/G366/I601/D965/E1007/T1102; A203/G366/I601/D965/F1038/T1102; A203/G366/I601/E1007/F1038/T1102; A203/G366/I601/M763/D965/E1007/T1102; A203/G366/I601/M763/D965/F1038/T1102; A203/G366/I601/M763/E1007/F1038/T1102; A203/G366/I601/D965/E1007/F1038/T1102; A203/G366/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102; A203/F539/I601/M763/T1102; A203/F539/I601/D965/T1102; A203/F539/I601/E1007/T1102; A203/F539/I601/F1038/T1102; A203/F539/I601/M763/D965/T1102; A203/F539/I601/M763/E1007/T1102; A203/F539/I601/M763/F1038/T1102; A203/F539/I601/D965/E1007/T1102; A203/F539/I601/D965/F1038/T1102; A203/F539/I601/E1007/F1038/T1102; A203/F539/I601/M763/D965/E1007/T1102; A203/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102; A203/F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102; A203/F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102; A203/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102; N277/G366/F539/M763/T1102; N277/G366/F539/D965/T1102; N277/G366/F539/E1007/T1102; N277/G366/F539/F1038/T1102; N277/G366/F539/M763/D965/T1102; N277/G366/F539/M763/E1007/T1102; N277/G366/F539/M763/F1038/T1102; N277/G366/F539/D965/E1007/T1102; N277/G366/F539/D965/F1038/T1102; N277/G366/F539/E1007/F1038/T1102; N277/G366/F539/M763/D965/E1007/T1102; N277/G366/F539/M763/D965/F1038/T1102; N277/G366/F539/M763/E1007/F1038/T1102; N277/G366/F539/D965/E1007/F1038/T1102; N277/G366/F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102; N277/G366/I601/M763/T1102; N277/G366/I601/D965/T1102; N277/G366/I601/E1007/T1102; N277/G366/I601/F1038/T1102; N277/G366/I601/M763/D965/T1102; N277/G366/I601/M763/E1007/T1102; N277/G366/I601/M763/F1038/T1102; N277/G366/I601/D965/E1007/T1102; N277/G366/I601/D965/F1038/T1102; N277/G366/I601/E1007/F1038/T1102; N277/G366/I601/M763/D965/E1007/T1102; N277/G366/I601/M763/D965/F1038/T1102; N277/G366/I601/M763/E1007/F1038/T1102; N277/G366/I601/D965/E1007/F1038/T1102; N277/G366/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102; G366/F539/I601/M763/T1102; G366/F539/I601/D965/T1102; G366/F539/I601/E1007/T1102; G366/F539/I601/F1038/T1102; G366/F539/I601/M763/D965/T1102; G366/F539/I601/M763/E1007/T1102; G366/F539/I601/M763/F1038/T1102; G366/F539/I601/D965/E1007/T1102; G366/F539/I601/D965/F1038/T1102; G366/F539/I601/E1007/F1038/T1102; G366/F539/I601/M763/D965/E1007/T1102; G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102; G366/F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102; G366/F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102; G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/M763/D1127; A203/N277/G366/D965/D1127; A203/N277/G366/E1007/D1127; A203/N277/G366/F1038/D1127; A203/N277/G366/M763/D965/D1127; A203/N277/G366/M763/E1007/D1127; A203/N277/G366/M763/F1038/D1127; A203/N277/G366/D965/E1007/D1127; A203/N277/G366/D965/F1038/D1127; A203/N277/G366/E1007/F1038/D1127; A203/N277/G366/M763/D965/E1007/D1127; A203/N277/G366/M763/D965/F1038/D1127; A203/N277/G366/M763/E1007/F1038/D1127; A203/N277/G366/D965/E1007/F1038/D1127; A203/N277/G366/M763/D965/E1007/F1038/D1127; A203/N277/F539/M763/D1127; A203/N277/F539/D965/D1127; A203/N277/F539/E1007/D1127; A203/N277/F539/F1038/D1127; A203/N277/F539/M763/D965/D1127; A203/N277/F539/M763/E1007/D1127; A203/N277/F539/M763/F1038/D1127; A203/N277/F539/D965/E1007/D1127; A203/N277/F539/D965/F1038/D1127; A203/N277/F539/E1007/F1038/D1127; A203/N277/F539/M763/D965/E1007/D1127; A203/N277/F539/M763/D965/F1038/D1127; A203/N277/F539/M763/E1007/F1038/D1127; A203/N277/F539/D965/E1007/F1038/D1127; A203/N277/F539/M763/D965/E1007/F1038/D1127; A203/N277/I601/M763/D1127; A203/N277/I601/D965/D1127; A203/N277/I601/E1007/D1127; A203/N277/I601/F1038/D1127; A203/N277/I601/M763/D965/D1127; A203/N277/I601/M763/E1007/D1127; A203/N277/I601/M763/F1038/D1127; A203/N277/I601/D965/E1007/D1127; A203/N277/I601/D965/F1038/D1127; A203/N277/I601/E1007/F1038/D1127; A203/N277/I601/M763/D965/E1007/D1127; A203/N277/I601/M763/D965/F1038/D1127; A203/N277/I601/M763/E1007/F1038/D1127; A203/N277/I601/D965/E1007/F1038/D1127; A203/N277/I601/M763/D965/E1007/F1038/D1127; A203/G366/F539/M763/D1127; A203/G366/F539/D965/D1127; A203/G366/F539/E1007/D1127; A203/G366/F539/F1038/D1127; A203/G366/F539/M763/D965/D1127; A203/G366/F539/M763/E1007/D1127; A203/G366/F539/M763/F1038/D1127; A203/G366/F539/D965/E1007/D1127; A203/G366/F539/D965/F1038/D1127; A203/G366/F539/E1007/F1038/D1127; A203/G366/F539/M763/D965/E1007/D1127; A203/G366/F539/M763/D965/F1038/D1127; A203/G366/F539/M763/E1007/F1038/D1127; A203/G366/F539/D965/E1007/F1038/D1127; A203/G366/F539/M763/D965/E1007/F1038/D1127; A203/G366/I601/M763/D1127; A203/G366/I601/D965/D1127; A203/G366/I601/E1007/D1127; A203/G366/I601/F1038/D1127; A203/G366/I601/M763/D965/D1127; A203/G366/I601/M763/E1007/D1127; A203/G366/I601/M763/F1038/D1127; A203/G366/I601/D965/E1007/D1127; A203/G366/I601/D965/F1038/D1127; A203/G366/I601/E1007/F1038/D1127; A203/G366/I601/M763/D965/E1007/D1127; A203/G366/I601/M763/D965/F1038/D1127; A203/G366/I601/M763/E1007/F1038/D1127; A203/G366/I601/D965/E1007/F1038/D1127; A203/G366/I601/M763/D965/E1007/F1038/D1127; A203/F539/I601/M763/D1127; A203/F539/I601/D965/D1127; A203/F539/I601/E1007/D1127; A203/F539/I601/F1038/D1127; A203/F539/I601/M763/D965/D1127; A203/F539/I601/M763/E1007/D1127; A203/F539/I601/M763/F1038/D1127; A203/F539/I601/D965/E1007/D1127; A203/F539/I601/D965/F1038/D1127; A203/F539/I601/E1007/F1038/D1127; A203/F539/I601/M763/D965/E1007/D1127; A203/F539/I601/M763/D965/F1038/D1127; A203/F539/I601/M763/E1007/F1038/D1127; A203/F539/I601/D965/E1007/F1038/D1127; A203/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/D1127; N277/G366/F539/M763/D1127; N277/G366/F539/D965/D1127; N277/G366/F539/E1007/D1127; N277/G366/F539/F1038/D1127; N277/G366/F539/M763/D965/D1127; N277/G366/F539/M763/E1007/D1127; N277/G366/F539/M763/F1038/D1127; N277/G366/F539/D965/E1007/D1127; N277/G366/F539/D965/F1038/D1127; N277/G366/F539/E1007/F1038/D1127; N277/G366/F539/M763/D965/E1007/D1127; N277/G366/F539/M763/D965/F1038/D1127; N277/G366/F539/M763/E1007/F1038/D1127; N277/G366/F539/D965/E1007/F1038/D1127; N277/G366/F539/M763/D965/E1007/F1038/D1127; N277/G366/I601/M763/D1127; N277/G366/I601/D965/D1127; N277/G366/I601/E1007/D1127; N277/G366/I601/F1038/D1127; N277/G366/I601/M763/D965/D1127; N277/G366/I601/M763/E1007/D1127; N277/G366/I601/M763/F1038/D1127; N277/G366/I601/D965/E1007/D1127; N277/G366/I601/D965/F1038/D1127; N277/G366/I601/E1007/F1038/D1127; N277/G366/I601/M763/D965/E1007/D1127; N277/G366/I601/M763/D965/F1038/D1127; N277/G366/I601/M763/E1007/F1038/D1127; N277/G366/I601/D965/E1007/F1038/D1127; N277/G366/I601/M763/D965/E1007/F1038/D1127; G366/F539/I601/M763/D1127; G366/F539/I601/D965/D1127; G366/F539/I601/E1007/D1127; G366/F539/I601/F1038/D1127; G366/F539/I601/M763/D965/D1127; G366/F539/I601/M763/E1007/D1127; G366/F539/I601/M763/F1038/D1127; G366/F539/I601/D965/E1007/D1127; G366/F539/I601/D965/F1038/D1127; G366/F539/I601/E1007/F1038/D1127; G366/F539/I601/M763/D965/E1007/D1127; G366/F539/I601/M763/D965/F1038/D1127; G366/F539/I601/M763/E1007/F1038/D1127; G366/F539/I601/D965/E1007/F1038/D1127; 또는 G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/M763/T1102/D1127; A203/N277/G366/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/M763/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/M763/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/M763/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/M763/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/T1102/D1127; A203/N277/F539/D965/T1102/D1127; A203/N277/F539/E1007/T1102/D1127; A203/N277/F539/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/D965/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/E1007/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/F539/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/T1102/D1127; A203/N277/I601/D965/T1102/D1127; A203/N277/I601/E1007/T1102/D1127; A203/N277/I601/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/D965/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/E1007/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/I601/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/T1102/D1127; A203/G366/F539/D965/T1102/D1127; A203/G366/F539/E1007/T1102/D1127; A203/G366/F539/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/D965/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/E1007/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/D965/E1007/T1102/D1127; A203/G366/F539/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/D965/E1007/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/T1102/D1127; A203/G366/I601/D965/T1102/D1127; A203/G366/I601/E1007/T1102/D1127; A203/G366/I601/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/D965/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/E1007/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/D965/E1007/T1102/D1127; A203/G366/I601/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/T1102/D1127; A203/F539/I601/D965/T1102/D1127; A203/F539/I601/E1007/T1102/D1127; A203/F539/I601/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/D965/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/E1007/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/D965/E1007/T1102/D1127; A203/F539/I601/D965/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/T1102/D1127; N277/G366/F539/D965/T1102/D1127; N277/G366/F539/E1007/T1102/D1127; N277/G366/F539/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/D965/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/E1007/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/D965/E1007/T1102/D1127; N277/G366/F539/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/D965/E1007/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/T1102/D1127; N277/G366/I601/D965/T1102/D1127; N277/G366/I601/E1007/T1102/D1127; N277/G366/I601/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/D965/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/E1007/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/D965/E1007/T1102/D1127; N277/G366/I601/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/T1102/D1127; G366/F539/I601/D965/T1102/D1127; G366/F539/I601/E1007/T1102/D1127; G366/F539/I601/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/D965/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/E1007/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/D965/E1007/T1102/D1127; G366/F539/I601/D965/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; 또는 G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539/M763/T1102; A203/N277/G366/F539/D965/T1102; A203/N277/G366/F539/E1007/T1102; A203/N277/G366/F539/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/D965/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/E1007/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/D965/E1007/T1102; A203/N277/G366/F539/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/D965/E1007/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/D965/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/T1102; A203/N277/G366/I601/D965/T1102; A203/N277/G366/I601/E1007/T1102; A203/N277/G366/I601/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/D965/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/E1007/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/D965/E1007/T1102; A203/N277/G366/I601/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/D965/E1007/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/D965/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102; N277/G366/F539/I601/M763/T1102; N277/G366/F539/I601/D965/T1102; N277/G366/F539/I601/E1007/T1102; N277/G366/F539/I601/F1038/T1102; N277/G366/F539/I601/M763/D965/T1102; N277/G366/F539/I601/M763/E1007/T1102; N277/G366/F539/I601/M763/F1038/T1102; N277/G366/F539/I601/D965/E1007/T1102; N277/G366/F539/I601/D965/F1038/T1102; N277/G366/F539/I601/E1007/F1038/T1102; N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/T1102; N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102; N277/G366/F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102; N277/G366/F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102; N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102; A203/G366/F539/I601/M763/T1102; A203/G366/F539/I601/D965/T1102; A203/G366/F539/I601/E1007/T1102; A203/G366/F539/I601/F1038/T1102; A203/G366/F539/I601/M763/D965/T1102; A203/G366/F539/I601/M763/E1007/T1102; A203/G366/F539/I601/M763/F1038/T1102; A203/G366/F539/I601/D965/E1007/T1102; A203/G366/F539/I601/D965/F1038/T1102; A203/G366/F539/I601/E1007/F1038/T1102; A203/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/T1102; A203/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102; A203/G366/F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102; A203/G366/F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102; A203/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102; A203/N277/F539/I601/M763/T1102; A203/N277/F539/I601/D965/T1102; A203/N277/F539/I601/E1007/T1102; A203/N277/F539/I601/F1038/T1102; A203/N277/F539/I601/M763/D965/T1102; A203/N277/F539/I601/M763/E1007/T1102; A203/N277/F539/I601/M763/F1038/T1102; A203/N277/F539/I601/D965/E1007/T1102; A203/N277/F539/I601/D965/F1038/T1102; A203/N277/F539/I601/E1007/F1038/T1102; A203/N277/F539/I601/M763/D965/E1007/T1102; A203/N277/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102; A203/N277/F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102; A203/N277/F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102; A203/N277/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/M763/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/D965/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/E1007/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/M763/E1007/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/M763/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/D965/E1007/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102; 또는 A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539/M763/D1127; A203/N277/G366/F539/D965/D1127; A203/N277/G366/F539/E1007/D1127; A203/N277/G366/F539/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/D965/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/E1007/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/D965/E1007/D1127; A203/N277/G366/F539/D965/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/E1007/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/D965/E1007/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/D965/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/E1007/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/D965/E1007/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/D965/E1007/F1038/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/D1127; A203/N277/G366/I601/D965/D1127; A203/N277/G366/I601/E1007/D1127; A203/N277/G366/I601/F1038/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/D965/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/E1007/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/F1038/D1127; A203/N277/G366/I601/D965/E1007/D1127; A203/N277/G366/I601/D965/F1038/D1127; A203/N277/G366/I601/E1007/F1038/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/D965/E1007/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/D965/F1038/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/E1007/F1038/D1127; A203/N277/G366/I601/D965/E1007/F1038/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/D965/E1007/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/D1127; N277/G366/F539/I601/D965/D1127; N277/G366/F539/I601/E1007/D1127; N277/G366/F539/I601/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/D965/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/E1007/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/D965/E1007/D1127; N277/G366/F539/I601/D965/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/E1007/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/E1007/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/D965/E1007/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/D1127; A203/G366/F539/I601/D965/D1127; A203/G366/F539/I601/E1007/D1127; A203/G366/F539/I601/F1038/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/D965/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/E1007/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/F1038/D1127; A203/G366/F539/I601/D965/E1007/D1127; A203/G366/F539/I601/D965/F1038/D1127; A203/G366/F539/I601/E1007/F1038/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/E1007/F1038/D1127; A203/G366/F539/I601/D965/E1007/F1038/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/D1127; A203/N277/F539/I601/D965/D1127; A203/N277/F539/I601/E1007/D1127; A203/N277/F539/I601/F1038/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/D965/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/E1007/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/F1038/D1127; A203/N277/F539/I601/D965/E1007/D1127; A203/N277/F539/I601/D965/F1038/D1127; A203/N277/F539/I601/E1007/F1038/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/D965/E1007/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/D965/F1038/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/E1007/F1038/D1127; A203/N277/F539/I601/D965/E1007/F1038/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/D965/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/E1007/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/E1007/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/D965/E1007/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/D965/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/E1007/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/E1007/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/D965/E1007/F1038/D1127; 또는 A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539/M763/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/D965/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/E1007/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/D965/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/E1007/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/D965/E1007/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/D965/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/E1007/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/D965/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/E1007/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/D965/E1007/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/D965/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/E1007/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/D965/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/E1007/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; 또는 A203/N277/G366/F539/I601/M763/D965/E1007/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 셋 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 셋 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 제 3-1 영역 중 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763/K890/T1102; K890/D965/T1102; K890/E1007/T1102; K890/F1038/T1102; M763/K890/D1127; K890/D965/D1127; K890/E1007/D1127; K890/F1038/D1127; M763/K890/T1102/D1127; K890/D965/T1102/D1127; K890/E1007/T1102/D1127; 또는 K890/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763/K890/D965/T1102; M763/K890/E1007/T1102; M763/K890/F1038/T1102; K890/D965/E1007/T1102; K890/D965/F1038/T1102; K890/E1007/F1038/T1102; M763/K890/D965/D1127; M763/K890/E1007/D1127; M763/K890/F1038/D1127; K890/D965/E1007/D1127; K890/D965/F1038/D1127; K890/E1007/F1038/D1127; M763/K890/D965/T1102/D1127; M763/K890/E1007/T1102/D1127; M763/K890/F1038/T1102/D1127; K890/D965/E1007/T1102/D1127; K890/D965/F1038/T1102/D1127; 또는 K890/E1007/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763/K890/D965/E1007/T1102; M763/K890/D965/F1038/T1102; M763/K890/E1007/F1038/T1102; K890/D965/E1007/F1038/T1102; M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102; M763/K890/D965/E1007/D1127; M763/K890/D965/F1038/D1127; M763/K890/E1007/F1038/D1127; K890/D965/E1007/F1038/D1127; M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127; M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; 또는 M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 넷 이상의 아미노산을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 넷 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 제 3-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4-1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 제 3-1 영역 중 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, D839, H840, K848, D849, D850, D853, K855, R859, D861, K862, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, K890, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/M763/K890/T1102; A203/K890/D965/T1102; A203/K890/E1007/T1102; A203/K890/F1038/T1102; A203/M763/K890/D965/T1102; A203/M763/K890/E1007/T1102; A203/M763/K890/F1038/T1102; A203/K890/D965/E1007/T1102; A203/K890/D965/F1038/T1102; A203/K890/E1007/F1038/T1102; A203/M763/K890/D965/E1007/T1102; A203/M763/K890/D965/F1038/T1102; A203/M763/K890/E1007/F1038/T1102; A203/K890/D965/E1007/F1038/T1102; A203/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102; N277/M763/K890/T1102; N277/K890/D965/T1102; N277/K890/E1007/T1102; N277/K890/F1038/T1102; N277/M763/K890/D965/T1102; N277/M763/K890/E1007/T1102; N277/M763/K890/F1038/T1102; N277/K890/D965/E1007/T1102; N277/K890/D965/F1038/T1102; N277/K890/E1007/F1038/T1102; N277/M763/K890/D965/E1007/T1102; N277/M763/K890/D965/F1038/T1102; N277/M763/K890/E1007/F1038/T1102; N277/K890/D965/E1007/F1038/T1102; N277/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102; G366/M763/K890/T1102; G366/K890/D965/T1102; G366/K890/E1007/T1102; G366/K890/F1038/T1102; G366/M763/K890/D965/T1102; G366/M763/K890/E1007/T1102; G366/M763/K890/F1038/T1102; G366/K890/D965/E1007/T1102; G366/K890/D965/F1038/T1102; G366/K890/E1007/F1038/T1102; G366/M763/K890/D965/E1007/T1102; G366/M763/K890/D965/F1038/T1102; G366/M763/K890/E1007/F1038/T1102; G366/K890/D965/E1007/F1038/T1102; G366/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102; F539/M763/K890/T1102; F539/K890/D965/T1102; F539/K890/E1007/T1102; F539/K890/F1038/T1102; F539/M763/K890/D965/T1102; F539/M763/K890/E1007/T1102; F539/M763/K890/F1038/T1102; F539/K890/D965/E1007/T1102; F539/K890/D965/F1038/T1102; F539/K890/E1007/F1038/T1102; F539/M763/K890/D965/E1007/T1102; F539/M763/K890/D965/F1038/T1102; F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102; F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102; F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102; I601/M763/K890/T1102; I601/K890/D965/T1102; I601/K890/E1007/T1102; I601/K890/F1038/T1102; I601/M763/K890/D965/T1102; I601/M763/K890/E1007/T1102; I601/M763/K890/F1038/T1102; I601/K890/D965/E1007/T1102; I601/K890/D965/F1038/T1102; I601/K890/E1007/F1038/T1102; I601/M763/K890/D965/E1007/T1102; I601/M763/K890/D965/F1038/T1102; I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102; I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102; I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102; A203/M763/K890/D1127; A203/K890/D965/D1127; A203/K890/E1007/D1127; A203/K890/F1038/D1127; A203/M763/K890/D965/D1127; A203/M763/K890/E1007/D1127; A203/M763/K890/F1038/D1127; A203/K890/D965/E1007/D1127; A203/K890/D965/F1038/D1127; A203/K890/E1007/F1038/D1127; A203/M763/K890/D965/E1007/D1127; A203/M763/K890/D965/F1038/D1127; A203/M763/K890/E1007/F1038/D1127; A203/K890/D965/E1007/F1038/D1127; A203/M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127; N277/M763/K890/D1127; N277/K890/D965/D1127; N277/K890/E1007/D1127; N277/K890/F1038/D1127; N277/M763/K890/D965/D1127; N277/M763/K890/E1007/D1127; N277/M763/K890/F1038/D1127; N277/K890/D965/E1007/D1127; N277/K890/D965/F1038/D1127; N277/K890/E1007/F1038/D1127; N277/M763/K890/D965/E1007/D1127; N277/M763/K890/D965/F1038/D1127; N277/M763/K890/E1007/F1038/D1127; N277/K890/D965/E1007/F1038/D1127; N277/M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127; G366/M763/K890/D1127; G366/K890/D965/D1127; G366/K890/E1007/D1127; G366/K890/F1038/D1127; G366/M763/K890/D965/D1127; G366/M763/K890/E1007/D1127; G366/M763/K890/F1038/D1127; G366/K890/D965/E1007/D1127; G366/K890/D965/F1038/D1127; G366/K890/E1007/F1038/D1127; G366/M763/K890/D965/E1007/D1127; G366/M763/K890/D965/F1038/D1127; G366/M763/K890/E1007/F1038/D1127; G366/K890/D965/E1007/F1038/D1127; G366/M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127; F539/M763/K890/D1127; F539/K890/D965/D1127; F539/K890/E1007/D1127; F539/K890/F1038/D1127; F539/M763/K890/D965/D1127; F539/M763/K890/E1007/D1127; F539/M763/K890/F1038/D1127; F539/K890/D965/E1007/D1127; F539/K890/D965/F1038/D1127; F539/K890/E1007/F1038/D1127; F539/M763/K890/D965/E1007/D1127; F539/M763/K890/D965/F1038/D1127; F539/M763/K890/E1007/F1038/D1127; F539/K890/D965/E1007/F1038/D1127; F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127; I601/M763/K890/D1127; I601/K890/D965/D1127; I601/K890/E1007/D1127; I601/K890/F1038/D1127; I601/M763/K890/D965/D1127; I601/M763/K890/E1007/D1127; I601/M763/K890/F1038/D1127; I601/K890/D965/E1007/D1127; I601/K890/D965/F1038/D1127; I601/K890/E1007/F1038/D1127; I601/M763/K890/D965/E1007/D1127; I601/M763/K890/D965/F1038/D1127; I601/M763/K890/E1007/F1038/D1127; I601/K890/D965/E1007/F1038/D1127; 또는 I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/M763/K890/T1102/D1127; A203/K890/D965/T1102/D1127; A203/K890/E1007/T1102/D1127; A203/K890/F1038/T1102/D1127; A203/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/M763/K890/E1007/T1102/D1127; A203/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/M763/K890/T1102/D1127; N277/K890/D965/T1102/D1127; N277/K890/E1007/T1102/D1127; N277/K890/F1038/T1102/D1127; N277/M763/K890/D965/T1102/D1127; N277/M763/K890/E1007/T1102/D1127; N277/M763/K890/F1038/T1102/D1127; N277/K890/D965/E1007/T1102/D1127; N277/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; N277/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/M763/K890/T1102/D1127; G366/K890/D965/T1102/D1127; G366/K890/E1007/T1102/D1127; G366/K890/F1038/T1102/D1127; G366/M763/K890/D965/T1102/D1127; G366/M763/K890/E1007/T1102/D1127; G366/M763/K890/F1038/T1102/D1127; G366/K890/D965/E1007/T1102/D1127; G366/K890/D965/F1038/T1102/D1127; G366/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; G366/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; G366/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; F539/M763/K890/T1102/D1127; F539/K890/D965/T1102/D1127; F539/K890/E1007/T1102/D1127; F539/K890/F1038/T1102/D1127; F539/M763/K890/D965/T1102/D1127; F539/M763/K890/E1007/T1102/D1127; F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127; F539/K890/D965/E1007/T1102/D1127; F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127; F539/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; F539/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; I601/M763/K890/T1102/D1127; I601/K890/D965/T1102/D1127; I601/K890/E1007/T1102/D1127; I601/K890/F1038/T1102/D1127; I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127; I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127; I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; 또는 I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/M763/K890/T1102; A203/N277/K890/D965/T1102; A203/N277/K890/E1007/T1102; A203/N277/K890/F1038/T1102; A203/N277/M763/K890/D965/T1102; A203/N277/M763/K890/E1007/T1102; A203/N277/M763/K890/F1038/T1102; A203/N277/K890/D965/E1007/T1102; A203/N277/K890/D965/F1038/T1102; A203/N277/K890/E1007/F1038/T1102; A203/N277/M763/K890/D965/E1007/T1102; A203/N277/M763/K890/D965/F1038/T1102; A203/N277/M763/K890/E1007/F1038/T1102; A203/N277/K890/D965/E1007/F1038/T1102; A203/N277/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102; A203/G366/M763/K890/T1102; A203/G366/K890/D965/T1102; A203/G366/K890/E1007/T1102; A203/G366/K890/F1038/T1102; A203/G366/M763/K890/D965/T1102; A203/G366/M763/K890/E1007/T1102; A203/G366/M763/K890/F1038/T1102; A203/G366/K890/D965/E1007/T1102; A203/G366/K890/D965/F1038/T1102; A203/G366/K890/E1007/F1038/T1102; A203/G366/M763/K890/D965/E1007/T1102; A203/G366/M763/K890/D965/F1038/T1102; A203/G366/M763/K890/E1007/F1038/T1102; A203/G366/K890/D965/E1007/F1038/T1102; A203/G366/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102; A203/F539/M763/K890/T1102; A203/F539/K890/D965/T1102; A203/F539/K890/E1007/T1102; A203/F539/K890/F1038/T1102; A203/F539/M763/K890/D965/T1102; A203/F539/M763/K890/E1007/T1102; A203/F539/M763/K890/F1038/T1102; A203/F539/K890/D965/E1007/T1102; A203/F539/K890/D965/F1038/T1102; A203/F539/K890/E1007/F1038/T1102; A203/F539/M763/K890/D965/E1007/T1102; A203/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102; A203/F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102; A203/F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102; A203/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102; A203/I601/M763/K890/T1102; A203/I601/K890/D965/T1102; A203/I601/K890/E1007/T1102; A203/I601/K890/F1038/T1102; A203/I601/M763/K890/D965/T1102; A203/I601/M763/K890/E1007/T1102; A203/I601/M763/K890/F1038/T1102; A203/I601/K890/D965/E1007/T1102; A203/I601/K890/D965/F1038/T1102; A203/I601/K890/E1007/F1038/T1102; A203/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102; A203/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102; A203/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102; A203/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102; A203/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102; N277/G366/M763/K890/T1102; N277/G366/K890/D965/T1102; N277/G366/K890/E1007/T1102; N277/G366/K890/F1038/T1102; N277/G366/M763/K890/D965/T1102; N277/G366/M763/K890/E1007/T1102; N277/G366/M763/K890/F1038/T1102; N277/G366/K890/D965/E1007/T1102; N277/G366/K890/D965/F1038/T1102; N277/G366/K890/E1007/F1038/T1102; N277/G366/M763/K890/D965/E1007/T1102; N277/G366/M763/K890/D965/F1038/T1102; N277/G366/M763/K890/E1007/F1038/T1102; N277/G366/K890/D965/E1007/F1038/T1102; N277/G366/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102; N277/F539/M763/K890/T1102; N277/F539/K890/D965/T1102; N277/F539/K890/E1007/T1102; N277/F539/K890/F1038/T1102; N277/F539/M763/K890/D965/T1102; N277/F539/M763/K890/E1007/T1102; N277/F539/M763/K890/F1038/T1102; N277/F539/K890/D965/E1007/T1102; N277/F539/K890/D965/F1038/T1102; N277/F539/K890/E1007/F1038/T1102; N277/F539/M763/K890/D965/E1007/T1102; N277/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102; N277/F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102; N277/F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102; 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또는 F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/M763/K890/T1102/D1127; A203/N277/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/K890/E1007/T1102/D1127; A203/N277/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/M763/K890/E1007/T1102/D1127; A203/N277/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/M763/K890/T1102/D1127; A203/G366/K890/D965/T1102/D1127; A203/G366/K890/E1007/T1102/D1127; A203/G366/K890/F1038/T1102/D1127; A203/G366/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/G366/M763/K890/E1007/T1102/D1127; A203/G366/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/G366/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/G366/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/G366/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/F539/M763/K890/T1102/D1127; A203/F539/K890/D965/T1102/D1127; A203/F539/K890/E1007/T1102/D1127; A203/F539/K890/F1038/T1102/D1127; A203/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/F539/M763/K890/E1007/T1102/D1127; A203/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/F539/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/F539/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/F539/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/I601/M763/K890/T1102/D1127; A203/I601/K890/D965/T1102/D1127; A203/I601/K890/E1007/T1102/D1127; A203/I601/K890/F1038/T1102/D1127; A203/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127; A203/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/M763/K890/T1102/D1127; N277/G366/K890/D965/T1102/D1127; N277/G366/K890/E1007/T1102/D1127; N277/G366/K890/F1038/T1102/D1127; N277/G366/M763/K890/D965/T1102/D1127; N277/G366/M763/K890/E1007/T1102/D1127; N277/G366/M763/K890/F1038/T1102/D1127; N277/G366/K890/D965/E1007/T1102/D1127; N277/G366/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; N277/G366/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/F539/M763/K890/T1102/D1127; N277/F539/K890/D965/T1102/D1127; N277/F539/K890/E1007/T1102/D1127; N277/F539/K890/F1038/T1102/D1127; N277/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127; N277/F539/M763/K890/E1007/T1102/D1127; N277/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127; N277/F539/K890/D965/E1007/T1102/D1127; N277/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/F539/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/F539/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; N277/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/I601/M763/K890/T1102/D1127; N277/I601/K890/D965/T1102/D1127; N277/I601/K890/E1007/T1102/D1127; N277/I601/K890/F1038/T1102/D1127; N277/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; N277/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127; N277/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; N277/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127; N277/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; N277/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; 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G366/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; G366/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; G366/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; G366/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; F539/I601/M763/K890/T1102/D1127; F539/I601/K890/D965/T1102/D1127; F539/I601/K890/E1007/T1102/D1127; F539/I601/K890/F1038/T1102/D1127; F539/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; F539/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127; F539/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; F539/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127; F539/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; F539/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; F539/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; 또는 F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/M763/K890/T1102; A203/N277/G366/K890/D965/T1102; A203/N277/G366/K890/E1007/T1102; A203/N277/G366/K890/F1038/T1102; A203/N277/G366/M763/K890/D965/T1102; A203/N277/G366/M763/K890/E1007/T1102; A203/N277/G366/M763/K890/F1038/T1102; A203/N277/G366/K890/D965/E1007/T1102; A203/N277/G366/K890/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/K890/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/M763/K890/D965/E1007/T1102; A203/N277/G366/M763/K890/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/M763/K890/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/K890/D965/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102; A203/N277/F539/M763/K890/T1102; A203/N277/F539/K890/D965/T1102; A203/N277/F539/K890/E1007/T1102; A203/N277/F539/K890/F1038/T1102; A203/N277/F539/M763/K890/D965/T1102; A203/N277/F539/M763/K890/E1007/T1102; A203/N277/F539/M763/K890/F1038/T1102; A203/N277/F539/K890/D965/E1007/T1102; A203/N277/F539/K890/D965/F1038/T1102; A203/N277/F539/K890/E1007/F1038/T1102; A203/N277/F539/M763/K890/D965/E1007/T1102; 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A203/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/D1127; A203/F539/I601/K890/D965/D1127; A203/F539/I601/K890/E1007/D1127; A203/F539/I601/K890/F1038/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/D965/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/E1007/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/F1038/D1127; A203/F539/I601/K890/D965/E1007/D1127; A203/F539/I601/K890/D965/F1038/D1127; A203/F539/I601/K890/E1007/F1038/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/D1127; A203/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/D1127; N277/G366/F539/K890/D965/D1127; N277/G366/F539/K890/E1007/D1127; N277/G366/F539/K890/F1038/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/D965/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/E1007/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/F1038/D1127; N277/G366/F539/K890/D965/E1007/D1127; N277/G366/F539/K890/D965/F1038/D1127; N277/G366/F539/K890/E1007/F1038/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/E1007/F1038/D1127; N277/G366/F539/K890/D965/E1007/F1038/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/D1127; N277/G366/I601/K890/D965/D1127; N277/G366/I601/K890/E1007/D1127; N277/G366/I601/K890/F1038/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/D965/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/E1007/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/F1038/D1127; N277/G366/I601/K890/D965/E1007/D1127; N277/G366/I601/K890/D965/F1038/D1127; N277/G366/I601/K890/E1007/F1038/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/E1007/F1038/D1127; N277/G366/I601/K890/D965/E1007/F1038/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/D1127; G366/F539/I601/K890/D965/D1127; G366/F539/I601/K890/E1007/D1127; G366/F539/I601/K890/F1038/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/D965/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/E1007/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/F1038/D1127; G366/F539/I601/K890/D965/E1007/D1127; G366/F539/I601/K890/D965/F1038/D1127; G366/F539/I601/K890/E1007/F1038/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/D1127; G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/D1127; 또는 G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/M763/K890/T1102/D1127; A203/N277/G366/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/K890/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/M763/K890/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/K890/T1102/D1127; A203/N277/F539/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/F539/K890/E1007/T1102/D1127; A203/N277/F539/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/K890/E1007/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/K890/T1102/D1127; A203/N277/I601/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/I601/K890/E1007/T1102/D1127; A203/N277/I601/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/K890/T1102/D1127; A203/G366/F539/K890/D965/T1102/D1127; A203/G366/F539/K890/E1007/T1102/D1127; A203/G366/F539/K890/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/K890/E1007/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/G366/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/K890/T1102/D1127; A203/G366/I601/K890/D965/T1102/D1127; A203/G366/I601/K890/E1007/T1102/D1127; A203/G366/I601/K890/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/G366/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/T1102/D1127; A203/F539/I601/K890/D965/T1102/D1127; A203/F539/I601/K890/E1007/T1102/D1127; A203/F539/I601/K890/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/T1102/D1127; N277/G366/F539/K890/D965/T1102/D1127; N277/G366/F539/K890/E1007/T1102/D1127; N277/G366/F539/K890/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/E1007/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/K890/D965/E1007/T1102/D1127; N277/G366/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/T1102/D1127; N277/G366/I601/K890/D965/T1102/D1127; N277/G366/I601/K890/E1007/T1102/D1127; N277/G366/I601/K890/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127; N277/G366/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/T1102/D1127; G366/F539/I601/K890/D965/T1102/D1127; G366/F539/I601/K890/E1007/T1102/D1127; G366/F539/I601/K890/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127; G366/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; 또는 G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539/M763/K890/T1102; A203/N277/G366/F539/K890/D965/T1102; A203/N277/G366/F539/K890/E1007/T1102; A203/N277/G366/F539/K890/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/K890/E1007/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/K890/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/K890/D965/E1007/T1102; A203/N277/G366/F539/K890/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/K890/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/K890/T1102; A203/N277/G366/I601/K890/D965/T1102; A203/N277/G366/I601/K890/E1007/T1102; A203/N277/G366/I601/K890/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/K890/E1007/T1102; A203/N277/G366/I601/M763/K890/F1038/T1102; A203/N277/G366/I601/K890/D965/E1007/T1102; 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A203/G366/F539/I601/K890/D965/T1102; A203/G366/F539/I601/K890/E1007/T1102; A203/G366/F539/I601/K890/F1038/T1102; A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/T1102; A203/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/T1102; A203/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102; A203/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/T1102; A203/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102; A203/G366/F539/I601/K890/E1007/F1038/T1102; A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102; A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102; A203/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102; A203/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102; A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102; N277/G366/F539/I601/M763/K890/T1102; N277/G366/F539/I601/K890/D965/T1102; N277/G366/F539/I601/K890/E1007/T1102; N277/G366/F539/I601/K890/F1038/T1102; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/T1102; N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/T1102; N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102; N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/T1102; N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102; N277/G366/F539/I601/K890/E1007/F1038/T1102; 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A203/G366/F539/I601/K890/F1038/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/D1127; A203/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/D1127; A203/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/D1127; A203/G366/F539/I601/K890/E1007/F1038/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/D1127; A203/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/D965/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/E1007/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/E1007/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/E1007/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/E1007/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/D1127; 또는 A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 A203/N277/G366/F539/M763/K890/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/K890/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/K890/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/K890/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/K890/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/K890/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/K890/E1007/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/K890/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/K890/D965/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/K890/E1007/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/K890/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/D965/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/E1007/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/E1007/F1038/T1102/D1127; A203/N277/G366/F539/I601/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127; 또는 A203/N277/G366/F539/I601/M763/K890/D965/E1007/F1038/T1102/D1127을 변형시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 제거시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697; 제 2 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039; 제 3 영역 중 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, V838, D839, H840, K848, D849, D850, D853, N854, K855, R859, D861, K862, N863, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, A889, K890, L891, R895, K896 및 D898; 및/또는 제 4 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 제거시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역, 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시킨 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203(소수성 지표: 1.8)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203(소수성 지표: 1.8)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아스파르트산(소수성 지표: -3.5)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 중 G366(소수성 지표: -0.4)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘, 라이신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-2 영역 중 G366(소수성 지표: -0.4)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 I601(소수성 지표: 4.5)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 I601(소수성 지표: 4.5)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아스파라긴(소수성 지표: -3.5)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 A203(소수성 지표: 1.8), G366(소수성 지표: -0.4), F539(소수성 지표: 2.8) 및 I601(소수성 지표: 4.5)를 각각 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203(소수성 지표: 1.8)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아스파르트산(소수성 지표: -3.5)으로 치환하고, 제 1-2 영역 중 G366(소수성 지표: -0.4)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환하고, 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환하고, 제 1-3 영역 중 I601(소수성 지표: 4.5)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아스파라긴(소수성 지표: -3.5)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 N277(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 알라닌, 시스테인, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 N277(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 히스티딘(소수성 지표: -3.2)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작거나 큰 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 A203(소수성 지표: 1.8), N277(소수성 지표: -3.5), G366(소수성 지표: -0.4), F539(소수성 지표: 2.8) 및 I601(소수성 지표: 4.5)를 각각 상대적으로 소수성 지표가 작거나 큰 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203(소수성 지표: 1.8)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아스파르트산(소수성 지표: -3.5)으로 치환하고, 제 1-1 영역 중 N277(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 히스티딘(소수성 지표: -3.2)으로 치환하고, 제 1-2 영역 중 G366(소수성 지표: -0.4)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환하고, 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환하고, 제 1-3 영역 중 I601(소수성 지표: 4.5)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아스파라긴(소수성 지표: -3.5)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539를 상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539를 상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산인 아스파르트산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역, 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 N199, I201, N202, A203, G205, V206, A208, A210, I211, L212, A214, L216, L222, N224, L225, I226, A227, Q228, L229, G231, N235, G236, L237, G239, N240, L241, I242, A243, L244, L246, G247, L248, N251, N255, L258, A259, A262, L264, Q265, L266, L275, N277, L278, L279, A280, Q281, I282, P316, L317, A319, M321, I322, L332, L334, L335, A337, L338, V339, L343, P344, I350, F351, F352, G358, A360, G361, I363, G365, G366, A367, F372, F375, I376, P378, I379, L380, M383, G385, L389, L390, V391, L393, L513, L514, F518, V520, L524, V527, V530, G533, M534, P537, A538, F539, L540, G542, A547, I548, V549, L551, L552, F553, V559, V561, L564, F569, I572, C574, F575, V578, I580, G582, V583, F587, A589, L591, G592, L597, L598, I600, I601, F606, L607, I679, L680, F682, L683, G687, F688, A689, F693, M694, L696 및 I697로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 상대적으로 작거나 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역, 제 1-2 영역 제 1-3 영역 및/또는 제 1-4 영역 중 A203, N277, G366, F539 및 I601를 각각 상대적으로 작거나 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203 및 N277, 제 1-2 영역 중 G366, 제 1-3 영역 중 I601을 각각 상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산인 아스파르트산, 히스티딘, 세린, 아스파라긴으로 치환시키고, 제 1-3 영역 중 F539를 상대적으로 작은 기능기를 가지는 세린으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 시스테인, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 중 D965(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 알라닌, 시스테인, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-3 영역 중 D965(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 타이로신(소수성 지표: -1.3)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-4 영역 중 E1007(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 알라닌, 시스테인, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-4 영역 중 E1007(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 류신(소수성 지표: 3.8)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 및 제 2-4 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9) 및 E1007(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시키고, 제 2-4 영역 중 E1007(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 류신(소수성 지표: 3.8)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-4 영역 중 F1037 및/또는 F1038을 각각 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-4 영역 중 F1038(소수성 지표: 2.8)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 타이로신(소수성 지표: -1.3)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 중 I7, G8, L9, D10, I11, G12, V16, G17, W18, A19, V20, I21, P731, A732, I733, G736, I737, L738, V741, V743, V744, L747, V748, V750, M751, G752, P756, I759, V760, I761, E762, M763, A764, R765, E766, N767, I927, V931, A932, I934, L935, M939, L949, I950, V953, V955, I956, L958, L962, V963, D965, F966, F970, F972, V975, U978, Y981, H982, H983, A984, H985, D986, A987, Y988, L989, A991, V992, V993, G994, A996, L997, I998, Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029, G1030, A1032, A1034, Y1036, F1037, F1038 및 Y1039로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 소수성 지표가 작거나 큰 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-1 영역, 제 2-2 영역, 제 2-3 영역 및/또는 제 2-4 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9), D965(소수성 지표: -3.5) 및 F1038(소수성 지표: 2.8)을 상대적으로 소수성 지표가 작거나 큰 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시키고, 제 2-3 영역 중 D965(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 타이로신(소수성 지표: -1.3)으로 치환시키고, 제 2-4 영역 중 F1038(소수성 지표: 2.8)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 타이로신(소수성 지표: -1.3)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, V838, D839, H840, K848, D849, D850, D853, N854, K855, R859, D861, K862, N863, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, A889, K890, L891, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K890(소수성 지표: -3.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K890(소수성 지표: -3.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아스파라긴(소수성 지표: -3.5)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, V838, D839, H840, K848, D849, D850, D853, N854, K855, R859, D861, K862, N863, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, A889, K890, L891, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 전하를 가지지 않는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 글루타민으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K775, R778, E779, R780, K782, R783, E785, E786, K789, E790, K797, E798, H799, E802, E809, K810, R820, D821, D825, E827, D829, R832, D835, D837, V838, D839, H840, K848, D849, D850, D853, N854, K855, R859, D861, K862, N863, R864, K866, D868, E873, E874, K877, K878, K880, R884, A889, K890, L891, R895, K896 및 D898로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K890 및/또는 K896을 각각 상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글리신, 아이소류신, 류신, 프롤린, 세린, 트레오닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K890을 상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산인 아스파르트산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K896을 상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 라이신, 프롤린, 세린, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102(소수성 지표: -0.7)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 프롤린(소수성 지표: -1.6)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 S1106을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 알라닌, 시스테인, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 S1106(소수성 지표: -0.8)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 글리신(소수성 지표: -0.4)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 상대적으로 소수성 지표가 작거나 큰 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102 및 S1136을 각각 상대적으로 소수성 지표가 작거나 큰 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102(소수성 지표: -0.7)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 프롤린(소수성 지표: -1.6)으로 치환시키고, S1106(소수성 지표: -0.8)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 글리신(소수성 지표: -0.4)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102을 상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102을 상대적으로 작은 기능기를 가지는 프롤린으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 D1127을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 D1127을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 글루탐산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102, S1106, E1108, S1116, D1117, D1125, D1127, D1135, S1136 및 T1138로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 아미노산을 상대적으로 작거나 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102 및 D1127을 상대적으로 작거나 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 4-1 영역 중 T1102을 상대적으로 작은 기능기를 가지는 프롤린으로 치환시키고, D1127을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 글루탐산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역, 제 2 영역 제 3 영역 및/또는 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 둘 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 둘 이상의 아미노산은 각각 다른 영역에 존재할 수 있다.
이때, 각 영역에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 치환 관련 설명은 상기 기술한 바와 같다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9) 및/또는 A764(소수성 지표: 1.8)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 시스테인, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환시키고, 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 I601(소수성 지표: 4.5)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 2-3 영역 중 D965(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 알라닌, 시스테인, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 I601(소수성 지표: 4.5)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아스파라긴(소수성 지표: -3.5)으로 치환시키고, 제 2-3 영역 중 D965(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 타이로신(소수성 지표: -1.3)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9) 및/또는 A764(소수성 지표: 1.8)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 시스테인, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키며; 제 2-4 영역 중 E1107(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 알라닌, 시스테인, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환시키고, 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시키며, 제 2-4 영역 중 E1007(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 류신(소수성 지표: 3.8)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환시키고, 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539 및/또는 I601을 각각 극성을 가지는 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘, 라이신, 세린, 트레오닌 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 3-1 영역 중 K890(소수성 지표: -3.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539 및 I601을 각각 극성을 가지는 아미노산인 트레오닌 및 글루탐산으로 치환시키고, 제 3-1 영역 중 K890(소수성 지표: -3.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아스파라긴(소수성 지표: -3.5)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203(소수성 지표: 1.8)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 4-1 영역 중 T1102을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 라이신, 프롤린, 세린, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203(소수성 지표: 1.8)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아스파르트산(소수성 지표: -3.5)으로 치환시키고, 제 4-1 영역 중 T1102(소수성 지표: -0.7)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 프롤린(소수성 지표: -1.6)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 4-1 영역 중 D1127을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환시키고, 제 4-1 영역 중 D1127을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 글루탐산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9) 및/또는 A764(소수성 지표: 1.8)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 시스테인, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시키고, 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-4 영역 중 E1007 및 제 3-1 영역 중 K890을 각각 전하를 가지지 않는 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 E1007을 전하를 가지지 않는 아미노산인 프롤린으로 치환시키고, 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9) 및/또는 제 2-4 영역 중 E1007(소수성 지표: -3.5)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 시스테인, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 및 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시키고, 제 2-4 영역 중 E1007을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 류신(소수성 지표: 3.8)으로 치환시키고, 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9) 및/또는 A764(소수성 지표: 1.8)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 시스테인, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 4-1 영역 중 T1102을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 라이신, 프롤린, 세린, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시키고, 제 4-1 영역 중 T1102(소수성 지표: -0.7)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 프롤린(소수성 지표: -1.6)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-4 영역 중 F1037 및/또는 F1038을 각각 극성을 가지는 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘, 라이신, 세린, 트레오닌 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 4-1 영역 중 D1127을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 2-4 영역 중 F1038을 극성을 가지는 아미노산인 타이로신으로 치환시키고, 제 4-1 영역 중 D1127을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 글루탐산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 및 제 4 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 4-1 영역 중 T1102을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 라이신, 프롤린, 세린, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시키고, 제 4-1 영역 중 T1102(소수성 지표: -0.7)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 프롤린(소수성 지표: -1.6)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K890(소수성 지표: -3.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 4-1 영역 중 D1127을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 3-1 영역 중 K890(소수성 지표: -3.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아스파라긴(소수성 지표: -3.5)으로 치환시키고, 제 4-1 영역 중 D1127을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 글루탐산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 제 2 영역 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산; 제 3 영역; 및/또는 내의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 아미노산을 각각 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9) 및/또는 제 2-4 영역 중 E1007(소수성 지표: -3.5)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 시스테인, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 및 제 3-1 영역 중 K890(소수성 지표: -3.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539(소수성 지표: 2.8)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 세린(소수성 지표: -0.8)으로 치환시키고, 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9) 및 제 2-4 영역 중 E1007(소수성 지표: -3.5)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5) 및 류신(소수성 지표: 3.8)으로 치환시키고, 및 제 3-1 영역 중 K890(소수성 지표: -3.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아스파라긴(소수성 지표: -3.5)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539 및/또는 I601; 및 제 2-4 영역 중 F1037 및/또는 F1038을 각각 극성을 가지는 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘, 라이신, 세린, 트레오닌 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 및 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 4-1 영역 중 T1102을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 라이신, 프롤린, 세린, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539를 극성을 가지는 아미노산인 세린으로 치환시키고, 제 2-4 영역 중 F1038을 극성을 가지는 아미노산인 타이로신으로 치환시키고, 및 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시키고, 제 4-1 영역 중 T1102을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 프롤린(소수성 지표: -1.6)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 I601을 극성을 가지는 아미노산인 글루탐산으로 치환시키고, 제 2-4 영역 중 F1038을 극성을 가지는 아미노산인 타이로신으로 치환시키고, 및 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시키고, 제 4-1 영역 중 T1102을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 프롤린(소수성 지표: -1.6)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539 및 중 I601을 각각 극성을 가지는 아미노산인 세린 및 아스파라긴으로 치환시키고, 제 2-4 영역 중 F1038을 극성을 가지는 아미노산인 타이로신으로 치환시키고, 및 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시키고, 제 4-1 영역 중 T1102을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 프롤린(소수성 지표: -1.6)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539 및/또는 I601을 각각 극성을 가지는 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘, 라이신, 세린, 트레오닌 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9) 및/또는 제 2-4 영역 중 E1007(소수성 지표: -3.5)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 시스테인, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 및 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 I601을 극성을 가지는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시키고, 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시키고, 및 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 F539 및 중 I601을 각각 극성을 가지는 아미노산인 세린 및 아스파라긴으로 치환시키고, 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9) 및 제 2-4 영역 중 E1007(소수성 지표: -3.5)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5) 및 류신(소수성 지표: 3.8)으로 치환시키고, 및 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203(소수성 지표: 1.8)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9) 및/또는 A764(소수성 지표: 1.8)을 각각 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 시스테인, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 및 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203(소수성 지표: 1.8)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아스파르트산(소수성 지표: -3.5)으로 치환시키고, 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시키고, 제 2-4 영역 중 F1038을 극성을 가지는 아미노산인 타이로신으로 치환시키고, 및 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않는 아미노산인 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 I601(소수성 지표: 4.5)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 제 2-3 영역 중 D965(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 알라닌, 시스테인, 글리신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시키고; 및 제 4-1 영역 중 T1102을 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 라이신, 프롤린, 세린, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 I601(소수성 지표: 4.5)를 상대적으로 소수성 지표가 작은 아미노산인 아스파라긴(소수성 지표: -3.5)으로 치환시키고, 제 2-2 영역 중 M763(소수성 지표: 1.9)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 아이소류신(소수성 지표: 4.5)으로 치환시키고, 제 2-3 영역 중 D965(소수성 지표: -3.5)을 상대적으로 소수성 지표가 큰 아미노산인 타이로신(소수성 지표: -1.3)으로 치환시키고, 및 제 4-1 영역 중 T1102(소수성 지표: -0.7)을 상대적으로 소수성 지표가 작은 프롤린(소수성 지표: -1.6)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203, N277; 제 1-2 영역 중 G366; 및 제 1-3 영역 중 F539, I601로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 작거나 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시키고; 제 2-2 영역 중 M763 및 제 2-4 영역 중 E1007, F1038로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 상대적으로 작거나 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시키고; 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않은 아미노산으로 치환시키고, 제 4-1 영역 중 T1102 및 D1127로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산을 상대적으로 작거나 큰 기능기를 가지는 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-3 영역 중 G366 및 제 1-3 영역 중 F539, I601을 각각 세린(상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산), 세린(상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산) 및 아스파라긴(상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산)으로 치환시키고, 제 2-2 영역 중 M763 및 제 2-4 영역 중 E1007을 각각 아이소류신(상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산) 및 류신(상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산)으로 치환시키고, 제 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않은 아스파라긴으로 치환시키고, 제 4-1 영역 중 D1127을 상대적으로 큰 기능기를 가지는 글루탐산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 제 1-1 영역 중 A203, N277, 제 1-3 영역 중 G366 및 제 1-3 영역 중 F539, I601을 각각 아스파르트산(상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산), 히스티딘(상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산), 세린(상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산), 세린(상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산) 및 아스파라긴(상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산)으로 치환시키고, 제 2-2 영역 중 M763 및 제 2-4 영역 중 E1007, F1038을 각각 아이소류신(상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산), 류신(상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산) 및 타이로신(상대적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산)으로 치환시키고, 제 제 3-1 영역 중 K890을 전하를 가지지 않은 아스파라긴으로 치환시키고, 제 4-1 영역 중 T1102 및 D1127을 각각 프롤린(상대적으로 작은 기능기를 가지는 아미노산) 및 글루탐산(상댁적으로 큰 기능기를 가지는 아미노산)으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 TS-SpCas9의 일 실시예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539, M763, K890 및/또는 E1007을 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539을 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판 및 타이로신으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539을 세린으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 상기 F539을 세린으로 치환시킨 TS-SpCas9(F539S)는 야생형 SpCas9와 비교하여 SpCas9(F539S)의 REC 도메인과 표적 서열 및/또는 gRNA의 PAM distal end와의 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763을 시스테인, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 하나의 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763을 아이소류신으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 상기 M763을 아이소류신으로 치환시킨 TS-SpCas9(M763I)는 야생형 SpCas9과 비교하여 SpCas9(M763I)의 RuvC 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 K890을 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 K890을 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 상기 K890을 아스파라긴으로 치환시킨 TS-SpCas9(K890N)는 야생형 SpCas9과 비교하여 SpCas9(K890N)의 HNH 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체일 수 있다.
일 구현예로서, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 E1007을 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 E1007을 류신으로 치환시킨 SpCas9 변이체(SEQ ID NO: 28)일 수 있다. 이때, 상기 E1007을 류신으로 치환시킨 TS-SpCas9(E1007L)은 야생형 SpCas9과 비교하여 SpCas9(E1007L)의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)와 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM(Protospacer adjacent motif)과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체이다.
예를 들어, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 E1007을 프롤린으로 치환시킨 SpCas9 변이체(SEQ ID NO: 29)일 수 있다. 이때, 상기 E1007을 프롤린으로 치환시킨 TS-SpCas9(E1007P)은 야생형 SpCas9과 비교하여 SpCas9(E1007P)의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)와 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM(Protospacer adjacent motif)과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체이다.
다른 일 구현예로서, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539 및 M763을 각각 원래의 아미노산과다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539 및 M763을 각각 세린 및 아이소류신으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 상기 F539 및 M763을 각각 세린 및 아이소류신으로 치환시킨 TS-SpCas9(F539S, M763I)는 야생형 SpCas9와 비교하여 SpCas9(F539S, M763I)의 REC 도메인과 표적 서열 및/또는 gRNA의 PAM distal end와의 상호작용이 변화되고, SpCas9(F539S, M763I)의 RuvC 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예로서, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539 및 K890을 각각 원래의 아미노산과다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539 및 K890을 각각 세린 및 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 상기 F539 및 K890을 각각 세린 및 아스파라긴으로 치환시킨 TS-SpCas9(F539S, K890N)는 야생형 SpCas9와 비교하여 SpCas9(F539S, K890N)의 REC 도메인과 표적 서열 및/또는 gRNA의 PAM distal end와의 상호작용이 변화되고, SpCas9(F539S, K890N)의 HNH 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예로서, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539 및 E1007을 각각 원래의 아미노산과다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539 및 E1007을 각각 세린 및 류신으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 상기 F539 및 E1007을 각각 세린 및 류신으로 치환시킨 TS-SpCas9(F539S, E1007L)는 야생형 SpCas9와 비교하여 SpCas9(F539S, E1007L)의 REC 도메인과 표적 서열 및/또는 gRNA의 PAM distal end와의 상호작용이 변화되고, SpCas9(F539S, E1007L)의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)와 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM(Protospacer adjacent motif)과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체이다.
다른 일 구현예로서, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763 및 K890을 각각 원래의 아미노산과다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산은 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763 및 K890을 각각 아이소류신 및 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 상기 M763 및 K890을 각각 아이소류신 및 아스파라긴으로 치환시킨 TS-SpCas9(M763I, K890N)는 야생형 SpCas9와 비교하여 SpCas9(M763I, K890N)의 RuvC 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화되고, SpCas9(M763I, K890N)의 HNH 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체일 수 있다.
또 다른 일 구현예로서, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763 및 E1007을 각각 원래의 아미노산과다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산은 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763 및 E1007을 각각 아이소류신 및 류신으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 상기 M763 및 E1007을 각각 아이소류신 및 류신으로 치환시킨 TS-SpCas9(M763I, E1007L)는 야생형 SpCas9와 비교하여 SpCas9(M763I, E1007L)의 RuvC 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화되고, SpCas9(M763I, E1007L)의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)와 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM(Protospacer adjacent motif)과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체이다.
또 다른 일 구현예로서, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 K890 및 E1007을 각각 원래의 아미노산과다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산은 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 아미노산일 수 있다.
예를 들어, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 K890 및 E1007을 각각 아스파라긴 및 류신으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 상기 K890 및 E1007을 각각 아스파라긴 및 류신으로 치환시킨 TS-SpCas9(K890N, E1007L)는 야생형 SpCas9와 비교하여 SpCas9(K890N, E1007L)의 HNH 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화되고, SpCas9(K890N, E1007L)의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)와 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM(Protospacer adjacent motif)과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체이다.
일 구현예로서, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539, M763 및 K890을 각각 원래의 아미노산과다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 아미노산일 수 있다.)
예를 들어, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539, M763 및 K890을 각각 세린, 아이소류신 및 아스파라긴으로 치환시킨 SpCas9 변이체(SEQ ID NO: 30)일 수 있다. 이때, 상기 F539, M763 및 K890을 각각 세린, 아이소류신 및 아스파라긴으로 치환시킨 TS-SpCas9(F539S, M763I, K890N)는 야생형 SpCas9와 비교하여 SpCas9(F539S, M763I, K890N)의 REC 도메인과 표적 서열 및/또는 gRNA의 PAM distal end와의 상호작용이 변화되고, SpCas9(F539S, M763I, K890N)의 RuvC 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화되고, SpCas9(F539S, M763I, K890N)의 HNH 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체일 수 있다.
다른 일 구현예로서, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539, M763 및 E1007을 각각 원래의 아미노산과다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 아미노산일 수 있다.)
예를 들어, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539, M763 및 E1007을 각각 세린, 아이소류신 및 류신으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 상기 F539, M763 및 E1007을 각각 세린, 아이소류신 및 류신으로 치환시킨 TS-SpCas9(F539S, M763I, E1007L)는 야생형 SpCas9와 비교하여 SpCas9(F539S, M763I, E1007L)의 REC 도메인과 표적 서열 및/또는 gRNA의 PAM distal end와의 상호작용이 변화되고, SpCas9(F539S, M763I, E1007L)의 RuvC 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화되고, SpCas9(F539S, M763I, E1007L)의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)와 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM(Protospacer adjacent motif)과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체이다.
다른 일 구현예로서, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763, K890 및 E1007을 각각 원래의 아미노산과다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 아미노산일 수 있다.)
예를 들어, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 M763, K890 및 E1007을 각각 아이소류신, 아스파라긴 및 류신으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 상기 M763, K890 및 E1007을 각각 아스파라긴, 아이소류신 및 류신으로 치환시킨 TS-SpCas9(M763I, K890N, E1007L)는 야생형 SpCas9와 비교하여 SpCas9(M763I, K890N, E1007L)의 RuvC 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화되고, SpCas9(M763I, K890N, E1007L)의 HNH 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화되고, SpCas9(M763I, K890N, E1007L)의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)와 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM(Protospacer adjacent motif)과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체이다.
또 다른 일 구현예로서, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539, K890 및 E1007을 각각 원래의 아미노산과다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 아미노산일 수 있다.)
예를 들어, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539, K890 및 E1007을 각각 세린, 아스파라긴 및 류신으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다. 이때, 상기 F539, K890 및 E1007을 각각 세린, 아스파라긴 및 류신으로 치환시킨 TS-SpCas9(F539S, K890N, E1007L)는 야생형 SpCas9와 비교하여 SpCas9(F539S, K890N, E1007L)의 REC 도메인과 표적 서열 및/또는 gRNA의 PAM distal end와의 상호작용이 변화되고, SpCas9(F539S, K890N, E1007L)의 HNH 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화되고, SpCas9(F539S, K890N, E1007L)의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)와 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM(Protospacer adjacent motif)과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체이다.
다른 일 구현예로서, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539, M763, K890 및 E1007을 각각 원래의 아미노산과다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신, 아이소류신, 류신, 페닐알라닌 및 발린으로 구성된 군에서 선택된 아미노산일 수 있다.)
예를 들어, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539, M763, K890 및 E1007을 각각 세린, 아이소류신, 아스파라긴 및 류신으로 치환시킨 SpCas9 변이체(SEQ ID NO: 31)일 수 있다. 이때, 상기 F539, M763, K890 및 E1007을 각각 세린, 아스파라긴, 아이소류신 및 류신으로 치환시킨 TS-SpCas9(F539S, M763I, K890N, E1007L)는 야생형 SpCas9와 비교하여 SpCas9(F539S, M763I, K890N, E1007L)의 REC 도메인과 표적 서열 및/또는 gRNA의 PAM distal end와의 상호작용이 변화되고, SpCas9(F539S, M763I, K890N, E1007L)의 RuvC 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화되고, SpCas9(F539S, M763I, K890N, E1007L)의 HNH 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화되고, SpCas9(F539S, M763I, K890N, E1007L)의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)와 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM(Protospacer adjacent motif)과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체이다.
예를 들어, 상기 SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539, M763, K890 및 E1007을 각각 세린, 아이소류신, 아스파라긴 및 프롤린으로 치환시킨 SpCas9 변이체(SEQ ID NO: 32)일 수 있다. 이때, 상기 F539, M763, K890 및 E1007을 각각 세린, 아스파라긴, 아이소류신 및 프롤린으로 치환시킨 TS-SpCas9(F539S, M763I, K890N, E1007P)는 야생형 SpCas9와 비교하여 SpCas9(F539S, M763I, K890N, E1007P)의 REC 도메인과 표적 서열 및/또는 gRNA의 PAM distal end와의 상호작용이 변화되고, SpCas9(F539S, M763I, K890N, E1007P)의 RuvC 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화되고, SpCas9(F539S, M763I, K890N, E1007P)의 HNH 도메인과 메탈과의 상호작용이 변화되고, SpCas9(F539S, M763I, K890N, E1007P)의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)와 gRNA-표적서열 이형이중가닥(heteroduplex)의 PAM(Protospacer adjacent motif)과 먼 말단 부위(PAM distal end)와 상호작용이 변화된 SpCas9 변이체이다.
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 구현예에서, 상기 인위적으로 조작된 Cas9은 융합 단백질일 수 있다.
상기 융합 단백질(fusion protein)은 표적 특이적 Cas9과 하나 이상의 기능적 도메인을 포함하는 인위적으로 생산된 하나의 단백질일 수 있다.
상기 표적 특이적 Cas9 관련 설명은 상기 기술한 바와 같다.
상기 기능적 도메인 관련 설명은 상기 기술한 바와 같다.
예를 들어, 상기 융합 단백질은 TS-SpCas9과 디아미네이즈(deaminase)를 포함하는 인위적으로 생산된 하나의 단백질일 수 있다.
이때, 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 D10 및 E1007을 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또는 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 D10, F539, M763, K890 및 E1007을 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또는 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 H840 및 E1007을 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또는 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 F539, M763, H840, K890 및 E1007을 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
또는 상기 TS-SpCas9은 야생형 SpCas9의 D10, F539, M763, H840, K890 및 E1007을 각각 원래의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환시킨 SpCas9 변이체일 수 있다.
이때, 상기 디아미네이즈는 아데닌 디아미네이즈(adenine deaminase) 및/또는 시티딘 디아미네이즈(cytidine deaminase)일 수 있다.
이때, 상기 융합 단백질은 TS-SpCas9의 N 말단에 디아미네이즈가 융합된 형태의 인위적으로 생산된 하나의 단백질일 수 있다.
또는 상기 융합 단백질은 TS-SpCas9의 C 말단에 디아미네이즈가 융합된 형태의 인위적으로 생산된 하나의 단백질일 수 있다.
또는 상기 융합 단백질은 TS-SpCas9의 N 말단 및 C 말단에 각각 동일하거나 다른 디아미네이즈가 융합된 형태의 인위적으로 생산된 하나의 단백질일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 CRISPR 효소, 인위적으로 조작된 CRISPR 효소, CRISPR 효소 변이체, Cas9, 인위적으로 조작된 Cas9, Cas9 변이체 또는 표적 특이적 Cas9은 폴리펩타이드 또는 단백질일 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 CRISPR 효소, 인위적으로 조작된 CRISPR 효소, CRISPR 효소 변이체, Cas9, 인위적으로 조작된 Cas9, Cas9 변이체 또는 표적 특이적 Cas9은 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산일 수 있다.
상기 CRISPR 효소, 인위적으로 조작된 CRISPR 효소, CRISPR 효소 변이체, Cas9, 인위적으로 조작된 Cas9, Cas9 변이체 또는 표적 특이적 Cas9을 도입하고자 하는 대상에 맞추어 코돈 최적화(codon optimization)된 것일 수 있다.
“코돈 최적화”는 고유 서열의 적어도 하나의 코돈을 숙주 세포의 유전자에 더욱 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체하면서, 고유 아미노상 서열을 유지함으로써 관심 숙주 세포에서의 발현의 증진을 위해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 의미한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대한 특정 편향을 가지며, 코돈 편향(유기체 간의 코돈 사용의 차이)은 종종 mRNA의 번역의 효율과 상호관련 되며, 이는 번역되는 코돈의 특성 및 특정 tRNA 분자의 이용가능성에 의해 좌우되는 것을 여겨진다. 세포에서 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩타이드 합성에 가장 빈번하게 사용되는 코돈을 반영한 것이다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화에 기초하여 주어진 유기체에서 최적의 유전자 발현을 위해 맞춤화될 수 있다.
상기 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산은 비벡터 형태일 수 있다.
상기 비벡터는 네이키드 DNA, DNA 복합체 또는 mRNA일 수 있다.
상기 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산은 벡터에 포함될 수 있다.
이때, 상기 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산은 하나의 벡터에 포함되거나 또는 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산이 분할되어 여러 개의 벡터에 포함될 수 있다.
상기 벡터는 플라스미드일 수 있다.
상기 벡터는 바이러스 또는 비바이러스 벡터일 수 있다.
상기 벡터는 하나 이상의 조절/제어 구성요소를 포함할 수 있다.
이때, 상기 조절/제어 구성요소는 포로모터, 인핸서, 인트론, 폴리아데닐화 신호, 코작 공통(Kozak consensus) 서열, 내부 리보솜 유입 부위(internal ribosome entry site, IRES), 스플라이스 억셉터 및/또는 2A 서열을 포함할 수 있다.
상기 프로모터는 RNA 중합효소 II에 의해 인식되는 프로모터일 수 있다.
상기 프로모터는 RNA 중합효소 III에 의해 인식되는 프로모터일 수 있다.
상기 프로모터는 유도성 프로모터일 수 있다.
상기 프로모터는 대상 특이적 프로모터일 수 있다.
상기 프로모터는 바이러스 또는 비바이러스 프로모터일 수 있다.
상기 프로모터는 제어 영역(폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 핵산)에 따라 적합한 프로모터를 이용할 수 있다.
예를 들어, CRISPR 효소를 위해 유용한 프로모터는 CMV, EF-1a, EFS, MSCV, PGK 또는 CAG 프로모터일 수 있다.
벡터는 바이러스 벡터 또는 재조합 바이러스 벡터일 수 있다.
상기 바이러스는 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스일 수 있다.
이때, 상기 DNA 바이러스는 이중가닥 DNA(dsDNA) 바이러스 또는 단일가닥 DNA(ssDNA) 바이러스 일 수 있다.
이때, 상기 RNA 바이러스는 단일가닥 RNA(ssRNA) 바이러스일 수 있다.
상기 바이러스는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(AAV), 백시니아바이러스, 폭스바이러스 또는 단순포진 바이러스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일반적으로 바이러스는 숙주(예를 들면, 세포)를 감염시켜, 숙주 내에 바이러스의 유전정보를 암호화하는 핵산을 도입시키거나 숙주의 게놈 내로 유전정보를 암호화하는 핵산을 삽입시킬 수 있다. 이러한 특징을 가지는 바이러스를 이용하여 대상 내로 가이드핵산 및/또는 에디터단백질을 도입시킬 수 있다. 바이러스를 이용하여 도입된 CRISPR 효소는 대상(예를 들면, 세포)에서 일시적으로 발현될 수 있다. 또는 바이러스를 이용하여 도입된 CRISPR 효소는 대상(예를 들면, 세포)에서 장기간(예를 들면, 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 6개월, 9개월, 1년, 2년 또는 영구적) 지속적으로 발현될 수 있다.
바이러스의 패키징 능력은 적어도 2kb 내지 50kb로 바이러스 종류에 따라 다를 수 있다. 이러한 패키징 능력에 따라 CRISPR 효소를 단독으로 포함하는 바이러스 벡터를 설계하거나 CRISPR 효소 및 추가로 gRNA를 포함하는 바이러스 벡터를 설계할 수 있다. 또는 CRISPR 효소, gRNA 및 추가 구성요소를 포함하는 바이러스 벡터를 설계할 수 있다.
일 예로, CRISPR 효소를 암호화하는 핵산은 재조합 렌티바이러스 벡터에 포함될 수 있다.
다른 일 예로, CRISPR 효소를 암호화하는 핵산은 재조합 아데노바이러스 벡터에 포함될 수 있다.
또 다른 일 예로, CRISPR 효소를 암호화하는 핵산은 재조합 AAV 벡터에 포함될 수 있다.
다른 일 예로, CRISPR 효소를 암호화하는 핵산은 혼성 바이러스, 예를 들어 본 명세서에 기재한 바이러스 중 하나 이상의 혼성체 벡터에 포함될 수 있다.
본 명세서에 의해 개시되는 일 구현예에서, CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체를 사용하기 위해, 이를 코딩하는 핵산으로부터 그를 발현시킬 수 있다. 이는 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체를 코딩하는 핵산을 복제 및/또는 발현을 위한 원핵 또는 진핵 세포로 형질전환시키기 위해 중간체 벡터로 클로닝할 수 있다. CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체를 생산하기 위해 CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체를 코딩하는 핵산을 저장 또는 조작하기 위하여 중간체 벡터는 전형적으로 원핵생물 벡터, 예를 들어 플라스미드, 또는 셔틀 벡터, 또는 곤충 벡터이다. CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체를 코딩하는 핵산을 또한 식물 세포, 동물 세포, 바람직하게는 포유동물 세포 또는 인간 세포, 진균 세포, 박테리아 세포, 또는 원생동물 세포에 투여하기 위해 발현 벡터로 클로닝할 수 있다.
발현을 달성하기 위해, 전형적으로 CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체를 코딩하는 서열을 전사를 지시하는 프로모터를 함유하는 발현 벡터로 서브클로닝한다. 조작된 단백질을 발현시키기 위한 박테리아 발현 시스템은 예를 들어 대장균(E. coli), 바실러스(Bacillus) 종, 및 살모넬라(Salmonella)에서 얻을 수 있다. 이러한 발현 시스템을 위한 키트는 상업적으로 입수가능하다. 포유동물 세포, 효모, 및 곤충 세포를 위한 진핵세포 발현 시스템은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 또한 상업적으로 입수가능하다.
핵산 발현을 지시하는데 사용되는 프로모터는 특정한 적용에 따라 좌우된다. 예를 들어, 전형적으로 강력한 구성 프로모터는 융합 단백질의 발현 및 증식을 위해 사용된다. 대조적으로, CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체를 유전자 조절을 위해 생체내로 투여하는 경우에는, CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체의 특정한 용도에 따라 구성 또는 유도 프로모터가 사용될 수 있다. 또한, CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체의 투여에 바람직한 프로모터는 약한 프로모터, 예컨대 HSV TK 또는 유사한 활성을 갖는 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한 전사활성화에 반응성인 요소, 예를 들어 저산소증 반응 요소, Gal4 반응 요소, lac 저해인자 반응 요소, 및 소분자 제어 시스템, 예컨대 테트라시클린-조절된 시스템 및 RU-486 시스템을 포함할 수 있다.
프로모터 이외에도, 전형적으로 발현 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포인 숙주 세포에서 핵산 발현을 위해 필요한 모든 추가의 요소를 함유하는 전사 유닛 또는 발현 카세트를 함유한다. 따라서, 전형적인 발현 카세트는 예를 들어 CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터, 및 예를 들어 전사체의 효율적인 폴리아데닐화, 전사 종결, 리보솜 결합 부위, 또는 번역 종결을 위해 필요한 임의의 신호를 함유한다. 카세트의 추가의 요소에는 예를 들어 인핸서 및 슬라이싱된 이종의 인트론 신호가 포함될 수 있다.
유전자 정보를 세포에 전달하기 위한 특정한 발현 벡터는 CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체의 의도된 용도, 예를 들어 식물, 동물, 박테리아, 진균, 원생동물 등에서의 발현과 관련하여 선택된다. 표준 박테리아 발현 벡터에는 플라스미드, 예컨대 pBR322 기재 플라스미드, pSKF, pET23D, 및 상업적으로 입수가능한 태그-융합 발현 시스템, 예컨대 GST 및 LacZ가 포함된다.
진핵세포 바이러스로부터의 조절 요소를 함유하는 발현 벡터는 종종 진핵세포 발현 벡터, 예를 들어 SV40 벡터, 유두종 바이러스 벡터, 및 엡스테인-바르(Epstein-Barr) 바이러스로부터 유래된 벡터에서 사용된다. 다른 예시적인 진핵세포 벡터에는 pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, 바쿨로바이러스 pDSVE, 및 SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 쥐 유방 종양 바이러스 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, 또는 진핵 세포에서의 발현에 효과적인 것으로 제시된 프로모터의 지시 하에 단백질 발현을 허용하는 임의의 다른 벡터가 포함된다.
CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체를 발현하기 위한 벡터는 가이드 RNA의 발현을 유도하기 위한 RNA Pol III 프로모터, 예를 들어 H1, U6 또는 7SK 프로모터를 포함할 수 있다. 이들 인간 프로모터는 플라스미드 형질감염 이후 포유동물 세포에서 CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체의 발현을 허용한다.
일부 발현 시스템은 안정하게 형질감염된 세포주의 선택을 위한 마커, 예컨대 티미딘 키나제, 히그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제, 및 디히드로폴레이트 리덕타제를 갖는다. 폴리헤드린 프로모터 또는 다른 강력한 바쿨로 바이러스 프로모터의 지시 하에 gRNA 코딩 서열과 함께 곤충 세포에서 바쿨로바이러스 벡터를 사용하는 것과 같은 고수율 발현 시스템 또한 적합하다.
발현 벡터에 전형적으로 포함되는 요소에는 또한 E. coli에서 기능하는 레플리콘, 재조합 플라스미드를 보유하는 박테리아의 선택을 허용하기 위해 항생제 내성을 코딩하는 유전자, 및 재조합 서열의 삽입을 허용하기 위해 플라스미드의 비필수 영역에서의 독특한 제한 부위를 포함한다.
표준 형질감염 방법을 이용하여 다량의 단백질을 발현하는 박테리아, 포유동물, 효모 또는 곤충 세포주를 생성한 다음, 표준 기술을 이용하여 정제한다 (예를 들어, Colley et al., 1989, J. Biol. Chem., 264:17619-22; Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990) 참고). 진핵 및 원핵 세포의 형질전환은 표준 기술에 따라 수행한다 (예를 들어, Morrison, 1977, J. Bacteriol. 132:349-351; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds, 1983) 참고).
외래 뉴클레오티드 서열을 숙주 세포에 도입하는 임의의 공지된 절차를 이용할 수 있다. 이들 절차는 인산칼슘 형질감염, 폴리브렌, 원형질체 융합, 전기천공, 뉴클레오펙션, 리포좀, 현미주사, 네이키드 DNA, 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 에피좀형 및 편입형 둘 다, 및 클로닝된 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 또는 다른 외래 유전자 물질을 숙주 세포에 도입하기 위한 다른 널리 공지된 방법의 이용을 포함한다. 이용된 특정한 유전자 조작 절차는 CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체를 발현할 수 있는 숙주 세포에 적어도 하나의 유전자를 성공적으로 도입할 수 있어야만 한다.
본 명세서에 의해 개시되는 일 구현예에서, CRISPR 효소 변이체 및/또는 Cas9 변이체를 발현할 수 있는 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 세포를 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시옐는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들의 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어 자명할 것이다.
실시예 1. Sniper Cas9 변이체
Sniper Cas9은 SpCas9의 F539, M763 및 K890이 변형된 SpCas9 변이체(SEQ ID NO: 30)이며(WO 2019-009682 참고), 하기의 실시예는 상기 Sniper Cas9의 표적 특이성을 향상시키기 위해 Sniper Cas9의 변이체를 개발에 관한 것이다.
1. Sniper Cas9 변이체 라이브러리
Sniper Cas9 변이체 라이브러리는 3가지의 독립적인 프로토콜을 사용하여 제작하였다. 첫번째 라이브러리의 경우, Sniper Cas9 플라스미드를 XL1-red competent cells (Agilent)로 형질 도입시키고, 판매자의 매뉴얼에 따라 세포를 배양하였다. 두번째, 세번째 라이브러리의 경우, Gibson Assembly로 설계된 프라이머를 사용하여 낮은 오류율(0-5 mutations/kb) 조건에서 Genemorph II(Agilent) 및 Diversify PCR 무작위 돌연변이 유발 키트(Clontech)를 사용하여 Sniper Cas9 플라스미드 서열의 전체 Original Sniper Cas9에서 Error-prone PCR을 수행하였다. 이어서 PCR 생성물을 겔 정제 하였다. 정제된 무작위 돌연변이된 라이브러리 및 Sniper Cas9 플라스미드의 백본을 Gibson 조립하였다. 조립된 라이브러리는 EnduraTM electrocompetent cells (Lucigen)로 형질도입시키고 chloramphenicol LB plates (12.5μg/mL)에서 37℃에서 밤새 배양하였다. 형질 도입된 세포가 배양 후, 각 라이브러리는 midi prep kit (NucleoBond Xtra Midi EF, Macherey-Nagel)를 이용하여 분리정제 하였다. 수득한 라이브러리는 다중 타겟 시스템을 이용한 표적 특이적 Cas9 스크리닝 방법(WO 2017-217768 참고)을 이용하여 표적 특이적 Sniper Cas9 변이체를 선별하였다. 총 네 번의 스크리닝 중 첫 스크리닝은 gDNA에 target insertion이 없는 스크리닝 세포를 이용하여 on-target activity가 있는 variant 들을 selection 하고 후에 온전한 스크리닝 방법을 세 번 반복하였다(도 1). (inducer 조건: 10ng/mL anhydroustetracyclin during recovery, 0ng/mL during plating)
2. 위치포화돌연변이 (site-saturation mutagenesis)를 통한 20개 아미노산의 variant 구축
pBLC-Sniper Cas9 플라스미드를 주형으로 위치포화돌연변이 방법으로 PCR을 수행한 후 Forward primer: agtaccccaagctggagagcnnkttcgtgtacggcgactacaagg(SEQ ID NO: 33); Reverse primer: tcttgatcagggcggtgcc(SEQ ID NO: 34); DpnI (Enzynomics); T4 PNK (Enzynomics); 및 T4 Ligase (Enzynomics)를 함께 처리하여 construct를 생성한 후 DH5alpha 대장균에 형질전환 하였다. 100개의 colony를 무작위로 Sanger sequencing 하여 20개의 아미노산 변이체를 각각 얻었다.
3. 표적 특이적 Cas9 변이체를 암호화하는 플라스미드
야생형 SpCas9이 암호화되어 있는 플라스미드(p3s-Cas9HC; Addgene plasmid #43945)를 구매하여 표적 특이적 SpCas9 변이체를 생성을 위해 이용하였다. 표적 특이적 SpCas9 변이체를 위한 construct는 p3s-Cas9HC 플라스미드를 백본과 원하는 위치에 돌연변이를 포함하는 핵산 서열과의 Gibson 조립에 의해 생성하였다. 모든 contructs는 Sanger sequencing로 확인하였다. 이렇게 만들어진 p3s-Sniper Cas9 plasmid와 selected 된 pBLC-Sniper 2.0 후보들을 PmlI (Enzynomics) 과 XhoI (Enzynomics) 제한효소 처리하여 p3s-Sniper 백본과 Sniper 2.0 insert를 각각 겔 정제하였다. 정제된 DNA를 T4 ligase (Enzynomics) 처리하여 p3s-Sniper 2.0 constructs를 생성하였다. 모든 constructs는 Sanger sequencing으로 확인하였다.
실시예 2. Sniper Cas9 변이체의 표적 유전자 조작 효과
실험 방법
1. Cell culture and transfection conditions
1-1. Sniper Cas9 변이체 및 sgRNA 발현 플라스미드
HEK293T 세포(ATCC, CRL-11268)를 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% 항생제가 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. Sniper Cas9 변이체에 의한 게놈 조작을 위해, 형질 도입을 전에 HEK293T 세포를 24-well plate에 70-80% confluency가 되도록 접종하였다. Sniper Cas9 변이체 발현 플라스미드 500ng 및 sgRNA 발현 플라스미드 500ng을 lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 사용하여 세포에 형질 도입하였다. 형질 도입 72시간 후에 Exgene Cell SV mini (GeneAll)을 이용하여 genomic DNA를 분리추출하였다.
1-2. Sniper Cas9 변이체 및 gRNA (ribonucleoprotein; RNP)
HEK293T 세포(ATCC, CRL-11268)를 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% 항생제가 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. Sniper Cas9 변이체에 의한 게놈 조작을 위해, 형질 도입을 전에 HEK293T 세포를 24-well plate에 70-80% confluency가 되도록 접종하였다. Sniper Cas9 변이체 4μg 및 sgRNA 4μg을 세포에 도입하였다. 도입 후에 Exgene Cell SV mini (GeneAll)을 이용하여 genomic DNA를 분리추출하였다.
2. Targeted deep sequencing
표적 위치 및 잠재적 오프-타겟 위치는 표적된 딥 시퀀싱(targeted deep sequencing)에 의해 분석되었다. 딥 시퀀싱 라이브러리는 PCR에 의해 생성되었다. TruSeq HT Dual Index 프라이머를 각 시료에 라벨을 붙이기 위해 사용하였다. 풀 라이브러리(pooled libraries)를 MiSeq을 사용하여 paired-end sequencing을 수행하였다.
실험 결과
본 실시예에서 Sniper Cas9 변이체의 표적 유전자 조작 효과를 확인하기 위해 다양한 유전자를 표적으로하여 각각 표적 유전자에 따른 Sniper Cas9 변이체의 indel(%) 효과를 확인하였다.
1. Sniper Cas9 변이체
상기 실시예 1의 “1. Sniper Cas9 변이체 라이브러리“를 3차 스크리닝한 후 얻은 각각 라이브러리의 100개의 random colony를 Sanger sequence 하여 Agilent library에서 1개, Clontech library에서 5개, Mutator library에서 2개의 변이체를 얻었다(도 2). Agilent library에서 K4, K112, I492, R671 및 K735가 변이된 Sniper Cas9 변이체(Ag1)를 확인하였고, Clontech library에서 I350, E1007 및 M1021이 변이된 Sniper Cas9 변이체(Cl1); S1277이 변이된 Sniper Cas9 변이체(Cl2); E1007이 각각 다른 아미노산으로 변이된 2개의 Sniper Cas9 변이체(Cl3, Cl4); E1007 및 K1192가 변이된 Sniper Cas9 변이체(Cl5), 총 5개의 Sniper Cas9 변이체가 확인되었다. 또한 Mutator library에서 A889가 변이된 Sniper Cas9 변이체(Mu1); 및 K1191이 변이된 Sniper Cas9 변이체(Mu2)가 확인되었다. 각각의 Sniper Cas9 변이체를 세포에 처리하여 온-타겟 및 오프-타겟에서의 indel를 확인하였다.
그 결과, EMX 유전자를 표적 유전자로 한 경우, Cl1, Cl3 및 Cl4 Sniper Cas9 변이체가 Sniper Cas9에 비해 온-타겟에서의 indel은 증가하면서 오프-타겟에서의 indel은 감소한 것을 확인하였다(도 3). 상기 세개의 Sniper Cas9 변이체는 모두 E1007의 변이를 포함하고 있으며, 따라서, E1007가 Cas9의 표적 특이적 활성을 높이는 중요한 위치로 판단하였다.
2. E1007이 변이된 Sniper Cas9 변이체
Sniper Cas9의 1007번째 글루탐산을 어떤 아미노산으로 치환하였을 때 Sniper Cas9 변이체의 표적 특이적 활성이 증가하는지 다양한 아미노산 치환을 통해 확인하였다.
그 결과, EMX 유전자(도 4) 및 DMD 유전자(도 5)를 표적 유전자로 하여 온-타겟 및 오프-타겟에서의 indel를 확인하였고, 이를 통해 알라닌, 아르기닌, 류신, 프롤린, 세린 및 타이로신을 치환 아미노산 후보군으로 선정하였다.
E1007을 각각의 아미노산 후보군으로 치환하여 matching GX19 표적 유전자들(EMX1, FANCF02, ZSCAN2, RUNX1)과 mismatching gX19 표적 유전자들 (DMD, HBB02, HBB03, HBB04)에서 온-타겟 및 오프-타겟에서의 indel를 확인하였다(도 6-13). 그 결과, E1007이 류신으로 치환된 Sniper Cas9 변이체(SEQ ID NO: 31) 또는 E1007이 프롤린으로 치환된 Sniper Cas9 변이체(SEQ ID NO: 32)가 온-타겟에서의 indel은 증가하면서, 오프-타겟에서의 indel은 감소하여 표적 특이성이 증가하는 것을 확인하였다.
또한, Sniper Cas9 변이체(E1007L 또는 E1007P)와 sgRNA을 RNP로 세포에 처리하여 확인한 결과, 야생형 SpCas9과 비교하여 온-타겟의 indel은 증가하면서 오프-타겟의 indel은 감소하여 표적 특이성이 증가한 것을 확인하였다(표 1).
RNP (Sniper Cas9 변이체 및 sgRNA)에 의한 표적별 indel(%) 확인
CAS9 Conc. 4㎍ sgRNA Conc. 4㎍ Inde(%)
On-target Off-target
WT SpCas9 5mg/ml 0.8 ZSCAN 3292 1.22 4.5 0.3
5mg/ml 0.8 HBB03 2996 1.34 22.1 3.9
5mg/ml 0.8 HBB04 2528 1.58 5.3 4.8
Sniper Cas9 variantE1007L 5mg/ml 0.8 ZSCAN 3292 1.22 11.6 0 NaN
5mg/ml 0.8 HBB03 2996 1.34 22.8 0.8
5mg/ml 0.8 HBB04 2528 1.58 4.7 0.1
Sniper Cas9 variantE1007P 5mg/ml 0.8 ZSCAN 3292 1.22 9.3 0.1
5mg/ml 0.8 HBB03 2996 1.34 29.3 4.7
5mg/ml 0.8 HBB04 2528 1.58 8.4 0.8
상기의 결과를 통해, Sniper Cas9의 1007번째 글루탐산이 다른 아미노산으로 치환된 Sniper Cas9 변이체가 Sniper Cas9에 비해 표적 특이성이 향상됨을 확인할 수 있다.
본 발명은 인위적으로 조작된 CRISPR 효소를 통해 표적 특이성이 향상된 CRISPR-Cas 시스템을 게놈 및/또는 후생유전자(epigenome)의 조작 또는 변형, 게놈 표적화, 게놈 교정 및 체외 진단 등에 이용할 수 있다.
야생형 SpCas9의 아미노산 서열, 각 영역의 아미노산 서열 및 일 구현예의 표적 특이적 SpCas9 변이체의 아미노산 서열

Claims (30)

  1. 인위적인 조작을 포함하는 SpCas9 변이체로서,
    상기 인위적인 조작은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9(SpCas9)의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop) 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 인위적인 조작을 포함하고,
    표적 특이성이 향상된 SpCas9 변이체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)는 SpCas9의 1001번째 타이로신(Y1001)부터 1030번째 글리신(G1030)까지의 아미노산 서열로 구성된 영역인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 엔드-캡핑 루프(end-capping loop)는 SpCas9의 Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029 및 G1030을 포함하는 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 SpCas9의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop) 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산은 SpCas9의 Y1001, P1002, K1003, L1004, E1005, S1006, E1007, F1008, V1009, Y1010, G1011, D1012, Y1013, K1014, V1015, Y1016, D1017, V1018, R1019, K1020, M1021, I1022, A1023, K1024, S1025, E1026, Q1027, E1028, I1029 및 G1030으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 SpCas9의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop) 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산은 SpCas9의 E1007인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 인위적인 조작은 SpCas9의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop) 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 제거(deletion)인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 인위적인 조작은 SpCas9의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop) 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로의 치환인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 다른 아미노산은 SpCas9의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop) 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산에 비해 상대적으로 기능기(functional group)의 크기가 작은 아미노산인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 다른 아미노산은 SpCas9의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop) 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산에 비해 상대적으로 기능기(functional group)의 크기가 큰 아미노산인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 다른 아미노산은 SpCas9의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop) 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산에 비해 상대적으로 소수성 지표(hydropathy index)가 큰 아미노산인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  11. 제7항에 있어서,
    상기 다른 아미노산은 SpCas9의 엔드-캡핑 루프(end-capping loop) 내에 존재하는 하나 이상의 아미노산에 비해 상대적으로 소수성 지표(hydropathy index)가 작은 아미노산인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  12. 제7항에 있어서,
    상기 다른 아미노산은 생리학적 pH(pH7.4)에서 중성 전하(neutral charge)를 가지는 아미노산인 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 SpCas9 변이체는 A203, N277, G366, F539, I601, M763, K890, D965, F1038, T1102 및 D1127으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 인위적인 변형을 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 SpCas9 변이체는 F539, M763 및 K890의 인위적인 변형을 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 SpCas9 변이체.
  15. 제1항의 SpCas9 변이체는 SpCas9의 1007번째 글루탐산의 인위적인 조작을 포함하는 표적 특이적 SpCas9(Target specific SpCas9; TS-SpCas9) 변이체.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 인위적인 조작은 SpCas9의 1007번째 글루탐산의 제거 또는 다른 아미노산으로의 치환인 것을 특징으로 하는 표적 특이적 SpCas9(Target specific SpCas9; TS-SpCas9) 변이체.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 다른 아미노산은 SpCas9의 1007번째 글루탐산에 비해 상대적으로 기능기의 크기가 크거나 또는 작은 아미노산인 것을 특징으로 하는 표적 특이적 SpCas9(Target specific SpCas9; TS-SpCas9) 변이체.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 다른 아미노산은 SpCas9의 1007번째 글루탐산에 비해 상대적으로 소수성 지표가 크거나 또는 작은 아미노산인 것을 특징으로 하는 표적 특이적 SpCas9(Target specific SpCas9; TS-SpCas9) 변이체.
  19. 제16항에 있어서,
    상기 다른 아미노산은 생리학적 pH(pH7.4)에서 중성 전하(neutral charge)를 가지는 아미노산인 것을 특징으로 하는 표적 특이적 SpCas9(Target specific SpCas9; TS-SpCas9) 변이체.
  20. 제16항에 있어서,
    상기 다른 아미노산은 류신 또는 프롤린인 것을 특징으로 하는 표적 특이적 SpCas9(Target specific SpCas9; TS-SpCas9) 변이체.
  21. 제15항에 있어서,
    상기 표적 특이적 SpCas9(Target specific SpCas9; TS-SpCas9) 변이체는 A203, N277, G366, F539, I601, M763, K890, D965, F1038, T1102 및 D1127으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 인위적인 변형을 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 특이적 SpCas9(Target specific SpCas9; TS-SpCas9) 변이체.
  22. 제15항에 있어서,
    상기 표적 특이적 SpCas9(Target specific SpCas9; TS-SpCas9) 변이체는 F539, M763 및 K890의 인위적인 변형을 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 특이적 SpCas9(Target specific SpCas9; TS-SpCas9) 변이체.
  23. 제15항의 TS-SpCas9 변이체를 포함하는 융합 단백질.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 하나 이상의 기능적(functional) 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 기능적(functional) 도메인은 메틸라아제(methylase) 활성, 디메틸라아제(demethylase) 활성, 전사촉진(transcription activation) 활성, 전사 저해(transcription repression) 활성, 전사 방출 인자(transcription release factor) 활성, 히스톤 변형(histone modification) 활성, RNA 절단(cleavage) 활성 또는 핵산 결합(nucleic acid binding) 활성을 가지는 도메인; 단백질(펩타이드 포함)의 분리정제를 위한 태그(tag) 또는 리포터 유전자; NLS(nuclear localization sequence or signal) 또는 NES(nuclear export sequence or signal); 및 디아미네이즈(deaminase)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  26. 제1항이 SpCas9 변이체, 제15항의 TS-SpCas9 변이체 또는 제23항의 융합 단백질을 암호화하는 핵산.
  27. 제26항의 핵산을 포함하는 벡터.
  28. 제26항의 핵산 또는 제27항의 벡터를 포함하는 세포.
  29. 제1항이 SpCas9 변이체, 제15항의 TS-SpCas9 변이체 또는 제23항의 융합 단백질과 gRNA를 세포에 도입하는 단계를 포함하는 세포의 게놈을 인위적으로 조작하는 방법.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 gRNA는 상기 세포의 게놈 내에 존재하는 표적 유전자의 표적 서열에 상보적 결합을 하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산인 것을 특징으로 하는 세포의 게놈을 인위적으로 조작하는 방법.
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