CN1330666C

CN1330666C - 低氧－诱导因子1αHIF－1α变体和鉴定HIF－1α调节剂的方法

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Publication number: CN1330666C
Application number: CNB99814388XA
Authority: CN
Inventors: A·伯肯斯塔姆; L·波尔林格
Original assignee: Angiogenetics Sweden AB
Current assignee: Swedish Orphan Biovitrum AB
Priority date: 1998-11-13
Filing date: 1999-11-11
Publication date: 2007-08-08
Anticipated expiration: 2019-11-11
Also published as: ZA200103669B; BR9915263A; TR200101345T2; KR20010080411A; CN1330663A; KR100648761B1; JP2002530063A; AU761594B2; EP1141005B1; AU1593100A; ATE374210T1; DE69937199D1; EP1141005A1; WO2000029437A1; HK1043372B; SE9803891D0; CA2350830A1; HK1043372A1; NZ511450A

Abstract

本发明涉及一种鉴定能调节人HIF-1α的功能域的功能的化合物的方法，所述方法包括：(ⅰ)使候选化合物与一种人HIF-1α的变体接触，所述变体基本上没有人HIF-1α的至少一个功能域，或者具有使人HIF-1α的至少一个功能域基本上失活的一个突变，所述一个或多个功能域选自：(a)位于人HIF-1α的178和390位氨基酸之间的PAS-B结构域，(b)基本上位于人HIF-1α的718至721位氨基酸的C-末端核定位序列(NLS)，和(c)基本上位于人HIF-1α的531和584位氨基酸之间的反式激活蛋白/辅激活蛋白结构域(N-TAD)，和(d)基本上位于人HIF-1α的813和826位氨基酸之间的反式激活/辅激活蛋白结构域(C-TAD)，和(ⅱ)测定候选化合物对所述变体的作用。

Description

低氧-诱导因子1αHIF-1α变体和鉴定HIF-1α调节剂的方法

技术领域

本发明涉及人低氧-诱导因子(HIF)-1α的新的变体，以及涉及所述变体在对于HIF-1α中功能基元的阐明的筛选测定中和对于调节HIF-1α的功能的化合物的鉴定中的用途，所述化合物有潜力地用于正常情况下与HIF-1α相关的的靶基因的调节，所述基因是例如血管生成，红细胞生成和糖酵解涉及的基因。

背景技术

氧在脊椎动物细胞的线粒体中作为最终的电子受体起着关键的生物学作用。在进化中，这些细胞发育出感觉氧水平的变化的方法，在该过程中，获得了对包括血管生成，红细胞生成和糖酵解的缺氧症的适应的生理学响应所涉及的基因表达有条件性地调节的能力。这些基因包括血管内皮生长因子，血红细胞生成素，几种糖酵解酶和可诱导氧化氮合酶，并且都表现出包含低氧效应元件(HRES)(有关综述，参见Guillemin和Krasnow(I 997)，细胞(Cell)89，9-12；Wenger和Gassmann(I 997)生物化学(Biol.Chem.)378，609-616)。在低氧条件下，由低氧-诱导因子(HIF)-1α和Arnt组成的杂二聚体复合物识别这些效应元件(Wang等.(I 995)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)92，5510-5514；Gradin等，(I 996)分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)16，5221-5231)。这两个转录因子属于快速生长的碱性-螺旋-环-螺旋(bHLH)-PAS(I！er， Arnt， Sim)蛋白质家族。bHLH/PAS转录因子起着多样生物学作用。

最近产生出的HIF-1α-和Arnt-缺陷胚胎干细胞和小鼠证明了这两个因子在心血管发育和HRE-驱动的靶基因的调控中的关键作用(Maltepe等(1997)自然(Nature)386，403-407)。近来难以理解的是HIF-1α-Arnt复合物的低氧依赖性形成和激活的机理。本发明人和同事最近证明HIF-1α蛋白质水平如果不是在所有的细胞中那就是在大多数细胞中在低氧条件下特异性大量地被正调节。因为HIF-1αmRNA水平响应低氧而没有变化，则该调节模式看起来通过涉及HIF-1α蛋白质水平的稳定化作用的转录后步骤而发生(Huang等(1996)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271，32253-32259；Kallio等(1997)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)94，5667-5672；Salceda和Caro(I 997)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)272，22642-22647)，在前积聚Arnt并且产生细胞核DNA结合复合物。

转录因子进入细胞核常常是一个有条件的控制过程，其响应各种外部和内部刺激和响应发育提示而发生(Vandromme等(I 996)生物化学科学动向(Trends Biochem.Sci.)21，59-64)。因此，该过程可以构成调节转录因子活性的关键机理。蛋白质向细胞核的活性的依赖能量的传输需要被传送的蛋白质(或者其相互作用的配偶体)中存在一个或几个细胞核定位信号(NLSS)。NLS基元是短的氨基酸部分，其可以主要分为两个组：(i)SV40大T抗原型NLS，特征在于四个或多个保守碱性残基的一个单一的簇；和(ii)由两部分组成的NLS，由两个碱性残基组成，一个是任何十个氨基酸的间隔区，一个是接下来的5个残基中的三个是碱性的碱性簇(Vandromme等，上文，和其中的参考)。

Wang等(1995)，美国国家科学院院刊(Proc.Nati.Acad.Sci.USA)92，5510-5514和WO96/39426中公开了纯化的HIF-1α，其氨基酸序列和多核苷酸序列。有人提出(Jiang等(1997)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)272，19253-19260)HIF-1α的531-826位氨基酸包含两个反式激活域，TAD-N(531-575位氨基酸)和TAD-C(786-826位氨基酸)。此外，Pugh等((1997)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)272，1120511214)定义了HIF-1α中两个最小结构域(549-582为和775-826位氨基酸)，它们各自对转录激活起作用。

需要人HIF-1α的新的变体，该变体可以用于对于HIF-1α中功能基元的阐明的筛选测定中和对于调节HIF-1α的功能的化合物的鉴定中，所述化合物有潜力地用于正常情况下与HIF-1α相关的的靶基因的调节，所述基因是例如血管生成，红细胞生成和糖酵解涉及的基因。

发明内容

出人意料地证明HIF-1α的激活机理是一个多步骤过程，包括低氧-依赖性核输入和反式激活结构域的激活(脱抑制)，导致CBP/p300辅激活蛋白的募集。证明可诱导核积聚取决于也携带低氧-诱导反式激活结构域的HIF-1α的C-末端中的核定位信号(NILS)。NLS序列基元中缺失或者单个氨基酸取代都抑制HIF-1α的核输入，并且在全长蛋白质中，这些突变也导致HIF-1α的反式激活活性的抑制和CBP的募集。进一步证明核定位本身不足以反式激活，因为HIF-1α与异源GAL4 DNA结合域的融合产生一种蛋白质，该蛋白质表现出组成型核定位并且对于作为CBP-依赖性转录因子需要低氧刺激。

此外，转录辅激活蛋白SRC-1和TIF2也支持HIF-1α-依赖性转录激活。CBP和SRC-1/TIF2类辅激活蛋白瞄向HIF-1α的N-和C-末端反式激活结构域，并且通过氧化还原调节酶Ref-1增强其功能。事实上，在低氧条件下Ref-1与HIF-1α发生物理作用。因此，反式激活辅激活蛋白CBP和SRC-1/TIF2的Ref-1-依赖性募集引起的低氧-诱导核输入和反式激活可以被功能性相互分开，并且在HIF-1α引起的信号转导中起着关键作用。

因此，本发明第一个方面涉及一种鉴定能调节人HIF-1α的功能域的功能的化合物的方法，所述方法包括：

(i)使候选化合物与一种人HIF-1α的变体接触，所述变体基本上没有人HIF-1α的至少一个功能域，或者具有使人HIF-1α的至少一个功能域基本上失活的一个突变，所述一个或多个功能域选自：

(a)位于人HIF-1α的178和390位氨基酸之间的PAS-B结构域，

(b)基本上位于人HIF-1α的718和721位氨基酸的C-末端核定位序列(NLS)，和

(c)基本上位于人HIF-1α的531和584位氨基酸之间的反式激活蛋白结构域(transactivator domain)(N-TAD)，和

(d)基本上位于人HIF-1α的813和826位氨基酸之间的反式激活蛋白结构域(C-TAD)，和

(ii)测定候选化合物对所述变体的作用。

在一个优选的方式中，所述方法包括(i)使一种候选化合物与表达所述人HIF-1α变体的细胞接触，所述变体与一个分子探针结合，和(ii)检测所述分子探针在该细胞中的定位。所述分子探针优选是一种荧光探针，例如，阿昆拉维多利亚(Aequeora Victoria)绿荧光蛋白，或者其一种变体。细胞核对细胞质的相对荧光变化是一种能调节所述功能域的功能的化合物的指征。

在本发明另一个优选的方式中，所述人HIF-1α的变体调节报道基因的活性；该报道基因活性的变化是一种能调节所述功能域的功能的化合物的指征。该HIF-1α变体能例如与GAL4的DNA结构域融合，表达该HIF-1α变体的细胞含有与报道基因操作地连接的GAL4效应元件。或者，该人HIF-1α变体能与Aequeora Victoria绿荧光蛋白融合，表达该HIF-1α变体的细胞适当地含有与报道基因(如荧火虫荧光素酶基因)操作地连接的促红细胞生成素低氧效应元件。

根据本发明的方法可以适当地在转录辅激活蛋白，特别是一个或多个称之为SRC-1，TIF2或CBP的转录辅激活蛋白的存在下进行。当存在一个转录辅激活蛋白时，根据本发明的方法可以适当地在还存在称之为Ref-1的氧化还原调节蛋白下进行。

当所述人HIF-1α的功能域是PAS-B结构域时，所述人HIF-1α变体可以是例如HIF-1α/1-74(SEQ ID NO：2)；HIF-1α/1-245(SEQ ED NO：3)；HIF-1α/Δ178-390(SEQ DD NO：6)；HIF-1α/331-641(SEQ ID NO：7)；HIF-1α/526-641(SEQ ID NO：8)；HIF-1α/526-813(SEQ ID NO：9)；或HIF-1α/526-826(SEQ ID NO：10).

当所述人HIF-1α的功能域是C-末端核定位序列(NLS)结构域时，所述人HIF-1α变体可以是例如HIF-1α/1-74(SEQ BD NO：2)；HIF-1α/1-245(SEQ ID NO：3)；HIF-1α/1-330(SEQ ID NO：4)；HIF-1α/1-652(SEQ ID NO：5)；HIF-1α/331-641(SEQ ID NO：7)；或HIF-1a/526-641(SEQ ID NO：8)。

当所述人HIF-1α的功能域是基本上位于人HIF-1α的531至584位氨基酸之间的反式激活蛋白结构域(N-TAD)时，所述人HIF-1α变体可以是例如HIF-1α/1-74(SEQ ID NO：2)；HIF-1α/1-245(SEQID NO：3)；HIF-1α/1-330(SEQ ID NO：4)；HIF-1α/776-826(SEQ IDNO：14)；或HIF-1α/776-813(SEQ ID NO：15)。

当所述人HIF-1α的功能域是基本上位于人HIF-1α的813至826位氨基酸之间的反式激活蛋白结构域(C-TAD)时，所述人HIF-1α变体可以是例如HIF-1α/1-74(SEQ ID NO：2)；HIF-1α/I-245(SEQ BDNO：3)；HIF-1α/1-330(SEQ ID NO：4)；HIF-1α/1-652(SEQ DD NO：5)；HIF-1α/331-641(SEQ ED NO：7)；HIF-1α/526-641(SEQ ID NO：8)；HIF-1α/526-813(SEQ ID NO：9)；HIF-1α/1-813(SEQ IID NO：12)；HIF-1α/531-584(SEQ BD NO：13)；HIF-1α/776-813(SEQ DD NO：15)。

在另一方面，本发明提供了一种分离的人HIF-1α变体，所述变体选自HIF-1α/1-74(SEQ ID NO：2)；HIF-1α/1-245(SEQ ID NO：3)；HIF-1α/1-330(SEQ ID NO：4)；HIF-1α/1-652(SEQ BD NO：5)；HIF-1α/Δ178-390(SEQ ID NO：6)；HIF-1α/331-641(SEQ ID NO：7)；HIF-1α/526-641(SEQ ID NO：8)；HIF-1α/526-813(SEQ ID NO：9)；HIF-1α/526-826(SEQ ID NO：10)；HIF-1α/71-826(SEQ ID NO：11)；HIF-1α/1-813(SEQ ID NO：12)，HIF-1α/531-584(SEQ ID NO：13)；HIF-1α/776-826(SEQ ID NO：14)；和HIF-1α/776-813(SEQ ID NO：15)。

如图1所示测定了HIF-1α表现出诱导低氧核转位。用pCMV-HIF-1α瞬时转染COS7细胞，并且在表达24小时之后在用于免疫细胞化学固定之前在含氧量正常(21％O₂)和含氧量低(1％O₂)的条件下再温育6小时。通过间接免疫荧光法使用材料和方法中描述的抗-HIF-1α抗血清测定表达HIF-1α的位置。

如图2所示测定了GFP-HIF-1α对核转位的低氧调节。(A)图示说明GFP和GFP-HIF-1α蛋白质结构。对于HIF-1α，也指出了碱性-螺旋-环-螺旋和PAS(Per/Arnt/Sim)结构域的位置。(B)GFP-HIF-1α融合蛋白的低氧和低氧模拟的化学品诱导的快速核转位。用GFP或GFP-HIF-1α表达载体瞬时转染COS7细胞，并且在表达24小时之后用1％O₂，100μM CoCl₂或者用100μM 2，2’-联吡啶(DP)温育6小时，然后用显微镜检测。(C)低氧诱导正调节内源HIF-1α，而不是GFP-HIF-1α，蛋白质水平。用非融合的GFP表达载体(泳道1和2)或者用GFP-HIF-1α(泳道3和4)转染COS7细胞。转染后将细胞暴露给21％或1％(低氧)氧30分钟，标记为-和+符号。根据材料和方法所述制备全细胞提取物，并且通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和使用抗-HIF-1α抗血清的免疫印迹分析50μg等份。GFP-HIF-1α蛋白质以箭头表示，而星号指内源HIF-1α免疫反应性。左边指分子量标记物(kDa)位置。(D)时间依赖性GFP-HIF-1α的核转位。所A栏所示，用GFP-HIF-1α表达载体转染COS7细胞并且用100μM 2，2’-联吡啶诱导。诱导后在指定的时间点照相。(E)曲线代表GFP-HIF-1α的细胞核进入。用100μM 2，2’-联吡啶诱导GFP-HIF-1α转染的细胞，并且在固定的时间点对总的250个细胞分析荧光分布。N(％)是仅表示核荧光的细胞百分比。

如图3所示测定了低氧信号消除时HIF-1α的细胞核输出。(A)实验策略大纲。用GFP-HIF-1α表达载体(6μg/60-mm培养皿)转染COS7细胞6小时，并且在大气氧下培养12小时，然后它们或者用100μM2，2’-联吡啶诱导或者保持不诱导1小时。接着通过更换培养基去除2，2’-联吡啶并且洗涤细胞，然后细胞在不存在(-)或存在(+)25μM放线菌酮下温育24小时。在这期间，在如箭头所示的不同的时间点用显微镜观察细胞。对于各个时间点，计数并分析总共200个细胞。(B)去除2，2’-联吡啶时HIF-1α从细胞核中再分布。显示在消除后各个时间点的GFP-HIF-1α的亚细胞分布。指出属于各类的细胞的百分比(对于分类，见表I)。也给出了用2，2’-联吡啶诱导之前GFP-HIF-1α的细胞内分布作为参考。

如图4所示测定了GFP-HIF-1α融合蛋白的亚细胞分布。(A)融合蛋白的图示。将所有的表达构建体组装成在CMV启动子控制下表达人源化GFP的pCMX-SAH/Y145F载体。(B)GFP-HIF-1α嵌合蛋白的亚细胞分布。相应于A栏代表的那些的融合构建体被转染到COS7细胞中并且在表达24小时之后向培养基中加入100μM 2，2’-联吡啶(DP)或赋形剂(H₂O)，并且在观察之前温育6小时。使用Zeiss荧光显微镜照相。

如图5所示测定了鉴定HIF-1α的C-末端中低氧-诱导NLS基元。(A)分析人(h)和小鼠(m)HIF-1α序列发现两个保守的核定位信号(NLS)基元。该N-末端NLS基元表现出与如X·光滑核质蛋白所例示的二分一样NLS序列的同源性，而C-末端NLS基元与SV40大T抗原-样NLS序列相关。(B)NLS基元中的点诱变对GFP-HIF-1α融合蛋白在细胞核中的积聚的影响。用携带野生型或突变的HIF-1αNLS序列的各种GFP-HIF-1α融合蛋白表达质粒转染COS7细胞。所述突变分别是在残基17和18处一个(Arg变为Ala)或者两个(Arg变为Gly)氨基酸变化，或者是在密码子719处的一个氨基酸变化(Lys变为Thr)。转染后，在荧光显微镜观察之前用100μM 2，2’-联吡啶或只用赋形剂将细胞处理6小时。

如图6所示测定了重叠的C-末端结构介导通过HIF-1α的可诱导的核转位和转录激活。(A)GFP-HIF-1α嵌合体对低氧响应基因的转录激活。或者用GFP或者用GFP-HIF-1α融合构建体和低氧响应报道基因(HRE-luc)一起共转染COS7细胞。转染6小时后，在收集之前将细胞接触21％或1％O₂ 30小时。使标准化的报道基因活性以相对于正常含氧量中非融合GFP的活性表示。给出进行的两个独立实验的以三次重复+/-SEM的结果。(B)GFP-HIF-1α对转录的激活是Arnt-依赖性的。或者用GFP或者用GFP-HIF-1α表达载体和低氧响应报道基因(HRE-luc，存在野生型Arnt或显性失活Arnt突变体，ArntΔb，缺少DNA结合b结构域)一起共转染COS7细胞。在收集之前将细胞接触21％或1％O₂ 30小时并且测定报道基因。使标准化的报道基因活性以相对于正常含氧量中非融合GFP的活性表示。给出进行的两个独立实验的以三次重复+/-SEM的结果。(C)GAL4-HIF-1α融合蛋白的功能分析。和A栏中表征的一样的HIF-1α亚区与GAL4 DNA结合域(GAL4 DBD)融合，并且和一个在GAL4结合位点的5个拷贝的控制下由胸腺苷激酶最小启动子驱动的表达荧光素酶基因的报道基因质粒一起转染到COS7细胞中。在收集之前将细胞接触21％或1％O₂ 30小时并且测定报道基因。使标准化的报道基因活性以相对于正常含氧量中非融合GAL4DBD的活性表示。给出进行的两个独立实验的以三次重复+/-SEM的结果。(D)GAL4-HIF-1α的组成型核定位。用p CMX-GAL4-HIF-1α瞬时转染COS7细胞并且在表达24小时之后在免疫细胞化学观察之前暴露给正常含氧量(21％O₂)或低氧(1％O₂)条件6小时。使用抗-GAL4-DBD抗血清，生物素化抗-兔Ig抗体，和与streptoavidin偶联的Texas Red进行对表达的GAL4-HIF-1α融合蛋白的间接免疫荧光分析。

如图7所示测定了HIF-1α对CBP辅激活蛋白的低氧-依赖性募集。(A)CBP对低氧响应基因表达的刺激。或者用GFP-HIF-1α或者用GFP--HIF-1αK719T与HRE-荧光素酶报道基因和Rous肉瘤病毒(RSV)-驱动CBP表达载体(或者空表达质粒)一起共转染COS7细胞。转染之后6小时收集细胞之前将细胞接触21％或1％O₂ 30小时。用碱性磷酸酶表达的PRSV-AF共转染对荧光素酶校正转染效率。以相对于正常含氧量的GFP-HIF-1α的值表示该数据。(B)消除可诱导细胞核输入的NLS突变不影响CBP的低氧依赖性募集。GAL4-HIF-1α或GAL4-HIF-1α反式激活结构域融合蛋白和有或没有CBP表达质粒的GAL4响应报道基因质粒一起被转染到COS7细胞中。收集细胞之前将细胞接触21％或1％O₂ 30小时并且分析报道基因。(C)CBP靶向HIF-1α的C-末端反式激活结构域。在有或没有CBP表达载体存在下，将包含最小C-末端反式激活结构域(776-826位氨基酸)或者其缺失突变体的GAL4融合蛋白和GAL4响应报道基因质粒一起转染到COS7细胞中。收集细胞之前将细胞接触21％或1％O₂ 30小时并且分析报道基因。用碱性磷酸酶活性校正转染效率之后，以相对于正常含氧量的GAL4的值表示该报道基因活性。

如图8所示测定了转录辅激活蛋白TEF2增强HIF-1α-介导的反式激活功能并且在体内与HIF-1α相互作用。如材料和方法中所述，用指明的0.5μg pT81/HRE-Luc报道基因构建体，hHIF1-α表达载体(pCMV4/HIF-1α，0.2μg)，Arnt表达载体(pCW4/Arnt，0.2μg)和0.75-1.5μg或者TIF2(pSG5/TIF2)或者CBP(Rc/RSV-CBP-HA)瞬时共转染COS 7细胞。适当时通过加入亲本pCMV4保持DNA总量不变。转染后，或者在正常含氧量(21％O₂)或者在低氧条件下(1％O₂)孵育细胞。用碱性磷酸酶表达的PRSV-AF共转染对荧光素酶活性校正转染效率。以相对于用pCMV4和只有报道基因并且在正常含氧量下温育转染的细胞的荧光素酶活性表示数据。以两次独立实验的平均值±S.E.表示数值。

如图9所示测定了转录辅激活蛋白SRC-1以低氧-依赖性方式刺激HIF-1α-活性并且在体外与HIF-1α相互作用。用指明的0.5μgpT81/HRE-Luc，0.2μg pCMV4/HIF-1α(hHIF1-α)，0.2μg pCWV4/Arnt(Arnt)和0.75-1.5μg SRC-1(pSG5/SRC-1)共转染(A)COS 7细胞和(B)人胚胎肾293细胞。转染后，收获前使细胞接触21％或1％O₂36小时。以图1图例中描述的相对荧光素酶活性表示荧光素酶值。给出重复三次独立实验的结果±S.E.。(C)对于与HIF-1α功能性相互作用来说不需要SRC-1 PAS结构域。(上)图示代表全长SRC-1和SRC-IΔPAS。(下)pGAL4/HIF 71-826与表达荧光素酶基因的报道基因质粒和1.5μg全长SRC-1或SRC-1的缺失突变体，缺失PAS结构域的SRC-1ΔPAS一起共转染到COS7中，所述荧光素酶基因的表达是在5个拷贝的GAL4结合位点的控制下由胸苷激酶最小启动子驱动。收获前使细胞接触21％或1％O₂36小时并且测定报道基因。以图1图例中描述的相对荧光素酶活性表示荧光素酶值。给出重复二次两个独立实验的结果±S.E.。(D)SRC-1和HIF-1α之间的体外相互作用。用10μg表达质粒pGST-HIF-1α(GST-HIF)或者空GST表达载体(GST)转染COS7细胞。细胞接触100μM CoCl₂或赋形剂(H₂O)24小时。制备细胞提取物并且与[35S]甲硫氨酸-标记的体外翻译的SRC-1蛋白质一起温育。该复合物在谷胱甘肽-琼脂糖小球上固定2小时并且用沸腾的样品缓冲液洗脱。在5％SDS-PAGE上分析洗脱出的材料并且用荧光自显影图观察。1/5x输入(Input)代表结合反应中使用的[35S]甲硫氨酸-标记的SRC-1的量的五分之一。左边给出分子量标记的位置。

如图10所示测定了对于HIF-1α介导的反式激活功能和对于体内与HIF-1α的相互作用来说不需要SRC-1的LXXLL基元。图示代表全长SRC-1和突变体SRC-1 M1234。黑色条框代表线性SRC-1序列中LXXLL基元的大体位置；带编号的圈指LXXLL基元的突变位点，其中保守的亮氨酸残基被丙氨酸置换。(下)pGAL4/HIF 71-826与GAL4-响应报道基因质粒和1.5μg全长SRC-1或突变的SRC-1，SRC-1M1234一起共转染到COS7细胞中。收获前使细胞接触21％或1％O₂36小时并且测定报道基因。以图1图例中描述的相对荧光素酶活性表示荧光素酶值。给出重复二次两个独立实验的结果±S.E.。

如图11所示测定了CBP和SRC-1辅激活蛋白调节的HIF-1α结构的定义。(A)HIF-1α的不同亚区与GAL4 DBD融合并且在不存在或存在1.5μgCBP或SRC-1表达质粒下与GAL4-4响应报道基因质粒一起转染到COS7细胞中。收获前使细胞接触21％或1％O₂36小时。(B)Arnt的C-末端反式激活区域介导CBP和SRC-1的转录激活。用指示的GAL4/Arnt融合蛋白和1.5μgCBP或SRC-1与GAL4-响应报道基因质粒一起共转柒COS7细胞。转染后6小时，收获前使细胞接触21％或1％O₂36小时并且测定报道基因。(C)HIF-1α防止Arnt与CBP和SRC-1功能性相互作用。GAL4/Arnt 128-774和缺失突变体(GAL4/Arnt128-603)，如所指出的，与0.2μgh HIF-1α表达载体和1.5μgCBP和SRC-1一起转染到COS7细胞中。接触21％或1％O₂36小时之后测定荧光素酶活性。相对于正常含氧量中非融合GAL4的活性表示校正的报道基因活性。给出重复两次三个独立实验的结果±S.E.。

如图12所示测定了CBP和SRC-1协同增强HIF-1α-介导的转录激活。(A)用pCMV4/HIF-1α和0.75-1.5μg of SRC-1和/或0.75-1.5μg of CBP表达质粒与低氧-响应报道基因(pT8 1/HRE-Luc)一起瞬时共转染COS7细胞，并且接着接触21％或1％O2。以图1图例中描述的相对荧光素酶活性表示荧光素酶值。给出重复二次三个独立实验的结果±S.E.。(B)GAL4/HIF-1α融合蛋白的CBP和SRC-1引起的协同激活。用GAL4/HIF-1α融合构建体在不存在或存在CBP和/或SRC-1下，如所指出的(以μg计)，与GAL4-响应报道基因质粒一起共转染COS7细胞。收集之前使细胞接触21％或1％O₂。使用碱性磷酸酶活性校正转染效率之后以相对于正常含氧量中GAL4的活性表示报道基因活性。给出重复两次进行的两个独立实验的结果±S.E.。(C)p300蛋白质以低氧-依赖性方式刺激HIF-1α的两个最小反式激活结构域的活性。(右栏)图示代表全长p300(pCWV β-p300-HA)和p300Δ(pCWVβ-p300Δ1254-1376)(左栏)HIF-1α的两个最小反式激活结构域与GAL4 DBD融合并且在不存在或存在p3 00，p3 00Δ和/或SRC-1表达载体下，如所指定的，与GAL4-响应报道基因质粒一起转染到COS7细胞中。收集之前使细胞接触21％或1％O₂。以相对于正常含氧量中GAL4的活性表示校正过的报道基因活性。给出重复两次进行的一个代表实验的结果。

如图13所示测定了Ref-1增强HIF-1α功能。(A)用不同的GAL4/HIF-1α融合构建体在不存在或存在1.5μg Ref-1(pCMV5/Ref-1)下，如所指出的，与GAL4-响应报道基因质粒一起共转染COS7细胞。收集之前使细胞接触21％或1％O₂。使用碱性磷酸酶活性校正转染效率之后，以相对于正常含氧量中GAL4的活性表示报道基因活性。给出重复两次进行的两个独立实验的结果±S.E.。(B)Ref-1加强HIF-1α的CBP和SRC-1激活。和(A)中所示一样的GAL4/HIF-1α融合蛋白在不存在或存在不同组合的Ref-1(0.75μg)，CBP(0.75μg)，和/或SRC-1(0.75μg)下，如所指出的，与GAL4-响应报道基因质粒一起共转染到COS7细胞中。下栏表示点标记的面积的增大。

如图14所示测定了多水平调节HIF-1α活性的模型。低氧导致蛋白酶体-介导的降解的抑制，并且结果稳定蛋白质(1)，并且通过暴露其细胞核定位信号而刺激HIF-1α的核输入(2)。接着，Arnt配偶体因子在细胞核中补充HIF-1α，并且得到的HIF-1α/Arnt杂二聚体识别靶基因的低氧响应元件(HRES)并且(3)与转录辅激活蛋白(例如CBP/p300)功能性相互作用以激活靶启动子。细胞核中发生的事件的顺序(Arnt二聚合作用，DNA结合，和CBP的补充)还不曾得知。

附图说明

图1显示了HIF-1α表现出诱导低氧核转位。

图2显示了GFP-HIF-1α对核转位的低氧调节。(A)图示说明GFP和GFP-HIF-1α蛋白质结构。(B)GFP-HIF-1α融合蛋白的低氧和低氧模拟的化学品诱导的快速核转位。(C)低氧诱导正调节内源HIF-1α，而不是GFP-HIF-1α，蛋白质水平。(D)时间依赖性GFP-HIF-1α的核转位。(E)曲线代表GFP-HIF-1α的细胞核进入。

图3显示了低氧信号消除时HIF-1α的细胞核输出。(A)实验策略大纲。(B)去除2，2’-联吡啶时HIF-1α从细胞核中再分布。

图4显示了GFP-HIF-1α融合蛋白的亚细胞分布。(A)融合蛋白的图示。(B)GFP-HIF-1α嵌合蛋白的亚细胞分布。

图5显示了鉴定HIF-1α的C-末端中低氧-诱导NLS基元。(A)分析人(h)和小鼠(m)HIF-1α序列发现两个保守的核定位信号(NLS)基元。(B)NLS基元中的点诱变对GFP-HIF-1α融合蛋白在细胞核中的积聚的影响。

图6显示了重叠的C-末端结构介导通过HIF-1α的可诱导的核转位和转录激活。(A)GFP-HIF-1α嵌合体对低氧响应基因的转录激活。(B)GFP-HIF-1α对转录的激活是Arnt-依赖性的。(C)GAL4-HIF-1α融合蛋白的功能分析。(D)GAL4-HIF-1α的组成型核定位。

图7显示了HIF-1α对CBP辅激活蛋白的低氧-依赖性募集。(A)CBP对低氧响应基因表达的刺激。(B)消除可诱导细胞核输入的NLS突变不影响CBP的低氧依赖性募集。(C)CBP靶向HIF-1α的C-末端反式激活结构域。

图8显示了转录辅激活蛋白TEF2增强HIF-1α-介导的反式激活功能并且在体内与HIF-1α相互作用。

图9显示了转录辅激活蛋白SRC-1以低氧-依赖性方式刺激HIF-1α-活性并且在体外与HIF-1α相互作用。

图10显示了对于HIF-1α介导的反式激活功能和对于体内与HIF-1α的相互作用来说不需要SRC-1的LXXLL基元。

图11显示了CBP和SRC-1辅激活蛋白调节的HIF-1α结构的定义。(A)HIF-1α的不同亚区与GAL4 DBD融合并且在不存在或存在1.5μgCBP或SRC-1表达质粒下与GAL4-4响应报道基因质粒一起转染到COS7细胞中。(B)Arnt的C-末端反式激活区域介导CBP和SRC-1的转录激活。(C)HIF-1α防止Arnt与CBP和SRC-1功能性相互作用。

图12显示了CBP和SRC-1协同增强HIF-1α-介导的转录激活。(A)用pCMV4/HIF-1α和0.75-1.5μg of SRC-1和/或0.75-1.5μg of CBP表达质粒与低氧-响应报道基因(pT8 1/HRE-Luc)一起瞬时共转染COS7细胞，并且接着接触21％或1％O₂。(B)GAL4/HIF-1α融合蛋白的CBP和SRC-1引起的协同激活。(C)p300蛋白质以低氧-依赖性方式刺激HIF-1α的两个最小反式激活结构域的活性。

图13显示了Ref-1增强HIF-1α功能。(A)用不同的GAL4/HIF-1α融合构建体在不存在或存在1.5μgRef-1(pCMV5/Ref-1)下，如所指出的，与GAL4-响应报道基因质粒一起共转染COS7细胞。(B)Ref-1加强HIF-1α的CBP和SRC-1激活。

图14显示了多水平调节HIF-1α活性的模型。

具体实施方式

1.HIF-1α表现出低氧-诱导核输入

为了研究HIF-1α的细胞内定位，我们用CMV启动子-驱动HIF-1α表达载体瞬时转染猴的COS7细胞。表达24小时之后，在正常含氧量(21％O₂)或低氧(1％O₂)条件下将细胞又培养6小时。用多克隆抗-HIF-1α抗体(Kallio等，1997)免疫染色，显示HIF-1α免疫反应主要位于正常含氧量细胞的细胞质中，在核区室也检测到了一些反应性。令人感兴趣的是，细胞暴露于低氧导致HIF-1α的非常惊人的细胞核积聚，几乎没有任何可检测的保留在细胞质中的免疫反应性(图1)。

为了进一步研究HIF-1α的激活机理及其在活细胞中的亚细胞定位，我们构建了携带在CMV启动子控制下表达的全长HIF-1α的符合读框的GFP-融合物(图2A中图示说明)的载体。用亲本GFP构建体或嵌合GFP-HIF-1α构建体瞬时转染COS7细胞后，在大约20-30％的细胞中发现荧光，反映出转染效率的水平。只有GFP的荧光在细胞内均匀分布，低氧处理对荧光活性的强度或亚细胞分布都没有影响(图2B)。在正常含氧量细胞中瞬时表达GFP-HIF-1α构建体得到模拟用单独的GFP观察到的图象的信号，这样体现出遍布细胞的荧光活性(图2B)。

对于定量目的，对于HIF-1α的区室化作用通常分析200-300个荧光细胞，并且再分成四类(Ylikomi等(1992)EMBO J.11，3681-3694)：N，仅含有核荧光的细胞；N＞C，核荧光比胞质荧光占优势的细胞；N＝C，细胞质和细胞核区室中荧光分布相同的细胞；和N＜C，细胞质中荧光强度超过细胞核中的荧光强度的细胞。表1给出了属于各类的细胞的百分比。在正常含氧量条件下，65％瞬时表达GFP-HIF-1α构建体的细胞属于N＝C类；而有限数的细胞(8％)表现出优先的HIF-1α核区室化作用(N类)。相反，细胞暴露给低氧(1％O2)导致GFP-HIF-1α的几乎完全的核积聚(图2B)，其中90％在转染细胞表现出仅是核荧光(N类；表I).此外，用已知模拟靶基因表达的低氧诱导(Wenger和Gassmann(1997)生物化学(Biol.Chem.)378，609-616)和HIF-1αDNA结合活性的诱导(Wang等(1995)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)92，5510-5514；Gradin等(I 996)分子细胞生物学(Mol.CellBiol.)16，5221-5231)的化合物，例如CoCl₂或者2，2’-联吡啶(DP)铁螯合物，处理细胞，也诱导GFP-HIF-1α的核输入。事实上，我们没有观察到这些诱导HIF-1α的核转位的处理的力度的任何定量或定性差异(图2B)。

我们和其它人最近证实了响应低氧的HIF-1α的激活的关键机理是正调节HIF-1α蛋白质水平。该响应取决于HIF-1α蛋白质的稳定化作用而不是提高的HIF-1αmRNA表达水平或增强的HIF-1αmRNA的翻译的结果(Huang等(1996)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271，3225 3-3 225 9；Kallio等(I 997)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)94，5667-5672；Salceda和Caro(1997)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)272，22642-22647)。因为我们没有检测到GFP-HIF-1α在低氧刺激时荧光相对强度的任何改变(图2B)，我们通过免疫印迹分析检测转染后瞬时转染的正常含氧量细胞或者暴露给低氧(1％氧)的细胞中GFP-HIF-1α蛋白质的表达水平。如图2C所示，检测到，与正常含氧量细胞相比，低氧细胞中GFP-HIF-1α蛋白质的表达水平没有提高(比较3和4道)。但是，作为参考，暴露给低氧的细胞的提取物中内源HIF-1α水平被正调节(图2C，2和4道，星号指内源HIF-1α)。事实上，如早期的文献指出的(Kallio等，上文)，由于快速周转，在正常含氧量的细胞中基本上检测不到内源HIF-1α(图2C，1和3道)。因此这些实验证明在正常含氧量的细胞中GFP有效稳定HIF-1α，并且GFP融合蛋白的用途使得我们忽略调节HIF-1α功能的早期水平，并且使我们研究不加上蛋白质返转调节复杂性情况下细胞内HIF-1α的区室化作用。

COS7细胞暴露给低氧或低氧-模拟化合物例如2，2’-联吡啶时，GFP-HIF-1α的核积聚动力学表现出大约30分钟的核转移半最大时间(图2D和E)和在+37℃下暴露1小时之后蛋白质的完全核输入。与其它表现出信号诱导核输入的转录因素相比这些动力学十分缓慢。例如，对于糖皮质激素受体报道过可诱导核转运明显快得多的时间进程(Ogawa等(I 995)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)92，11899-11903；Carey等(I996)细胞生物学杂志(J.Cell Biol.)133，985-996；Htun等(I 996)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)93，4845-4850)，配体-依赖性转录因子表现出激素依赖性核转位。

为了进一步表征活细胞中HIF-1α区室化作用的低氧信号-依赖性调节，我们接着提问了暴露给低氧后接着将细胞恢复到正常含氧量或者去除低氧-模拟化合物是否影响GFP-HIF-1α的细胞内定位。结果我们通过用2，2’-联吡啶处理转染的细胞1小时第一次诱导GFP-HIF-1α的核输入(84％的细胞属于N类)。接着通过在培养基中洗涤细胞去除2，2’-联吡啶，再在正常水平的大气氧压下培养细胞(在图3A中图示表示)。在正常含氧量条件下培养12小时之后，75％的转染细胞在细胞核和细胞质区室两者中表现出相等的GFP-HIF-1α分布(C＝N类)，和GFP-HIF-1α的专一的细胞核聚集(N类)由84％减少到5％(图3B)。在去除2，2’-联吡啶24小时之后观察到几乎相同的GFP-HIF-1α分布(图3B)。因此，低氧-诱导的GFP-HIF-1α核保留可能会在去除低氧信号之后反转。为了解决该反转是否依赖于从头合成的GFP-HIF-1α的不成分的核输入，我们也进行了该项在蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺存在下的去除实验。在这些条件下，2，2’-联吡啶诱导的GFP-HIF-1α核保留的反转与没有环己酰亚胺存在下所观察到的非常类似，即GFP-HIF-1α的核聚集(N类)从84％减少到3％，伴随着属于C＝N类的GFP-HIF-1α的聚集从6％增加到82％(图3B)，表明蛋白质的原始核聚集的输出。

2.PAS域在HIF-1α的核输入的调节中的作用

为了鉴定HIF-1α的核输入中涉及的结构基元，我们制备了多种包含与HIF-1α的不同的亚结构域融合的GFP的表达载体(图4A中图示表示)。这些构建体在COS 7细胞中瞬时表达之后，将这些细胞或者接触2，2’-联吡啶或者放置不处理6小时，接着分析该融合蛋白的区室化作用。如4B中所示，覆盖b HLH基元(aa 1-74；SEQ ID NO：2)的HIF-1α的大多数N-末端区与GFP的融合导致该蛋白质在正常含氧量条件下的优先核积聚。此外，接触2，2’-联吡啶不改变该蛋白质的核积聚(图4B和表I)。事先证明b HLH结构域中碱性DNA结合域对于bHLH-PAS转录因子Arnt和dioxin(芳基烃)受体的核定位是足够的(Eguchi等(I 997)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)272，17640-17647；Ikuta等(I 998)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)273，2895-2904)。因此，与这些蛋白质类似，该分离的HIF-1α的bHLH结构域介导组成型核输入。与这些发现极好吻合的是，HIF-1α在氨基酸17-33之间包含一个类似于ofxenopus laevis核质蛋白的两部分组成的NLS基元(Dingwall等(I 987)EMBO J.6，69-74)(图5A)。

令人感兴趣的是，HIF-1α的N-末端部分延伸至覆盖除了bHLH外还有PAS-A基元(HIF-1α/1-245；图4A；SEQ ID NO：3)或整个PAS结构域(HIF-1α/1-330；SEQ ID NO：4)的片段产生GFP-融合蛋白，其中bHLH结构域中的组成型NLS基元看起来是隐蔽的。和HIF-1α/1-74不一样，这两种蛋白质表现出显著的胞质荧光活性(图4B)，该荧光活性在正常含氧量和低氧条件下都可检测并且分别得到N＝C类转染细胞26％-95％的分数(表I)。这些结构表明PAS结构域具有抑制HIF-1α的bHLH结构域中的NLS基元介导的核输入结构，导致该蛋白质在胞质中停留。该模型对此的有力支持中，包含缺失PAS结构域的重要部分最特别是PAS B基元(HIF-1α/Δ178-390；图4A；SEQID NO：6)的HIF-1α突变体的GFP融合蛋白，在正常含氧量条件下，荧光主要在于细胞核(图4B)，得到80％的核评分(N和N＞C类)(表I)。暴露给低氧对GFP-HIF-1α/Δ178-390的亚细胞定位没有其它影响(图4B；表I)。因此，去除HIF-1α的PAS结构域中的抑制基元或胞质停留信号导致将该蛋白质从低氧调节中解偶联。

3.鉴定HIF-1α的C-末端中的NLS基元

为了进一步研究哪一个结构基元介导低氧-诱导HIF-1α的核区室化作用并且构成HIF-1α的功能体系结构，我们接着检测了包含位于该PAS结构域的C-末端的HIF-1α结构的GFP融合蛋白的细胞内定位，所述融合蛋白即融合蛋白GFP-HIF-1α/331-641和GFP-HIF-1α/526-641(图4A)(SEQ ID NOS：7和8分别给出了HIF-1α/331-641和HIF-1α/526-641的序列)。这两种蛋白质证明细胞质和细胞核两者中的荧光(100％的细胞属于N C类；表I)不被低氧改变，因此不可区别于亲本GFP蛋白质的性质(图4B)。与我们上面观察的PAS结构域抑制N-末端bHLH结构域中组成型NLS基元介导的核输入相吻合，包含bHLH/PAS结构域和HIF-1α的C-末端延伸至氨基酸652的融合蛋白(GFP-HIF-1α/1-652；SEQ ID NO：5给出HIF-1α/1-652的序列)表现出专一胞质/核周定位(图4B)，100％转染细胞落入N＜C类(表I)。重要的是，和与全长HIF-1α融合的GFP不同，GFP-HIF-1α/l-652对低氧或联吡啶处理没有响应，因此不能在这些条件下进行核转位，表明正是HIF-1α的C-末端携带可以作为用于诱导核积聚的重要的决定簇起作用的序列。惊人地，与覆盖氨基酸526-826的HIf-1α的C-末端的GFP融合(SEQ DD NO：10)产生证实专一核荧光的蛋白质(图4B)。因此，如图5A所示，HIF-1α在该蛋白质的该区包含第二个NLS基元。事实上，序列分析表明HIF-1α氨基酸718这部分存在一个真实的SV40大T抗原型NLS基元，特征在于单一一簇四个连续的碱基，RKRK。在小鼠HIF-1α蛋白质中该基元也是保守的(图5A)。在正常含氧量和低氧条件下都检测到包含该基元的GFP-HIF-1α/526-826引起的核荧光，证明携带该第二SV40大T抗原型NLS基元的HIF-1α的该结构域介导组成型核输入(图4B；表I)。

4.C-末端NLS基元中一个单一氨基酸特别破坏低氧可诱导的全长HIF-1α的核输入

如果HIF-1α的C-末端中存在第二个NLS基元并且HIF-1α的N-末端部分不能表现出低氧-诱导核积聚，我们通过诱变分析研究了N-和C-末端NLS基元在可诱导的核输入中的作用。为此我们在全长HIF-1α中引入HIF-1α的N-末端由两部分组成的NLS基元的N-末端Arg残基的一个或两个变化，或者在C-末端NLS基元中将Lys 719诱变为Thr(图5A)。如图5B所示，N-末端NLS基元中的点突变不影响HIF-1α的低氧可诱导核转位。但是重要的是，C-末端NLS基元中单一氨基酸变化导致HIF-1α在细胞核中响应低氧的积聚的能力戏剧性降低(图5B)，得到主要地细胞质定位蛋白质评分(N＜C类)，正常含氧量期间为96％低氧条件下为81％(Table II)。结果，这些实验证明HIF-1α的C-末端NLS基元介导低氧-诱导的该蛋白质的核输入。

C-末端NLS基元中引入相同的氨基酸变化严重消弱该与GFP融合的分离的HIF-1α的C-末端的组成型核积聚(将表I中的GFP-HIF-1α/526-826与表II中的GFP-HIF-1α/526-826K719T相比较)。因此，尽管分离的C-末端NLS基元介导组成型活性，其在全长HIF-1α中表现出低氧-诱导活性。因为缺少PAS结构域的主要部分，大多数特别是PAS-B基元的GFP-HIF-1α/Δ178-390(图4A)，表现出组成型核定位(图4B和5B)，表现出C-末端NLS基元与PAS结构域以密切配偶体关系在介导可诱导核输入响应中起作用。为了试验该观点，我们在PAS B缺失突变体GFP-HIF-1α/Δ178-3 90中引入Lys 719变为Thr的单一氨基酸变化。令人感兴趣的是，该双突变体在正常含氧量或低氧条件下没有表现出任何明显的核输入(图5B)，得到主要定位于细胞质区室的评分，分别是82％和85％(N＜C类)(Table II)。总之，这些结果证明N-末端碱性区域不作为全长蛋白质中的NLS基元起作用，和C-末端NLS基元在介导HIF-1α的可诱导核输入中起着关键作用。

5.HIF-1α响应低氧的多步骤激活途径的证据

我们接着在功能共转染测试中检测了GFP-HIF-1α融合蛋白的能力，其中GFP-HIF-1α表达载体和在单纯疱疹胸腺嘧啶脱氧核苷激酶启动子和荧光素酶基基因之前携带三个串联的红细胞生成素低氧效应元件(BRE)的拷贝的低氧-响应基因报道基因构建体一起引入到COS7细胞中。不存在共表达的蛋白质或者在瞬时表达的亲本GFP的存在下通过低氧处理(1％ O₂；图6A)或者用2，2’-联吡啶培养(没有给出数据)没有明显改变报道基因活性，最可能是由于COS 7细胞中的内源HIF-1α活性的低水平。但是，GFP-HIF-1α的共表达在正常含氧量下就已经导致刺激报道基因活性(大约2倍)，可能由于如上所述GFP部分对HIF-1α水平的稳定作用，在这些条件下小的但是可检测的HIF-1α的积聚位于细胞核。低氧进一步刺激报道基因活性大约4倍(图6A)。在对照实验中，野生型HIF-1α的瞬时表达也得到相似模式的报道基因激活，虽然具有稍微低一些的效力，当暴露给低氧时产生大约2倍的激活响应。因此，GFP与紧邻接的N-末端碱性(DNA结合)区的融合物不干扰转录激活。事实上，GFP部分对融合蛋白的稳定化作用(图2C)可能确实增强HIF-1α产生的激活响应的效率。如所预期的，在该项功能测定中，缺失DNA结合bHLH区的GFP-HIF-1α融合蛋白(GFP-HIF-1α/331-641，GFP-HIF-1α/526-641和GFP-HIF-1α/526-826)不诱导任何报道基因活性。

尽管野生型Arnt的异位表达不显著增强GFP-HIF-1α的低氧-诱导转录激活，缺失DNA结合碱性(b)结构域的显性失活Arnt突变体，ArntΔb(lindebro等(I 995)ENMO J.14，3528-3539)的瞬时表达导致对低氧-依赖性激活响应的强有力的抑制(图6B)。因此，这些结果证明GFP-HIF-1α引起的HRE-驱动的报道基因表达的低氧-诱导的转录激活关键取决于与bHLH-PAS配偶体因子Arnt的相互作用。与这些结果相一致，缺失与Arnt的重要的二聚合界面(Lindebro等，上文)PAS-B结构域的突变体GFP-HIF-1α/Δ178-390没有响应低氧而显著诱导HRE-依赖性报道基因表达(图6A)。

为了分析HIF-1α独立于内源DNA结合和二聚合作用结构域和Arnt配偶体的功能活性，我们接着将HIF-1α与异源GAL4的DNA结合域融合。使用在胸腺嘧啶脱氧核苷激酶启动子和荧光素酶基因前面携带5个的GAL4 DNA结合元件的报道基因构建体通过校正测试监测COS7细胞中融合蛋白的功能活性。转染之后6小时更换培养基，细胞或者放置不诱导或者在收集之前暴露给1％的氧30小时。在空表达载体或者表达最小结合域的载体存在下，通过降低氧的水平不改变报道基因活性。正常含氧量下GAL4-HIF-1α的瞬时表达导致合适的(大约4-至5-倍)报道基因激活(图6C)。但是，当在1％氧下培养细胞时(图6C；或者用100μM 2，2’-联吡啶；没有给出数据)，GAL4-HIF-1α的功能活性被进一步增强大约2-倍，导致超过背景水平大约8-至10-倍的报道基因活性的刺激(图6C)。该GAL4 DNA结合域已知携带能将融合蛋白带给细胞核的一个NLS基元(Ma和Ptashne(1987)Cell 51，113-119)。因此我们使用了抗GAL4的DNA结合域的抗体来通过免疫荧光检查正常含氧量和低氧细胞中GA.L4-HIF-1α融合蛋白的细胞内定位。如图6D所示，GAL 4 DNA结合域介导GA.L4-HIF-1α融合蛋白的组成型细胞核定位(图6D)。给出GA.L4-HIF-1α表现出低氧-诱导功能活性的事实，这些数据证明HIF-1α的可诱导核输入对于转录激活是不足够的，表明HIF-1α暴露给低氧时多步骤激活途径。

6.重叠C-末端结构介导HIF-1α可诱导核转位和转录激活

以缺失分析为基础，已报道过HIF-1α携带两个反式激活结构域(Jiang等(1997)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)272，19253-19260；Pugh等(1997)生物化学杂志(J.Biol.Chem.).272，11205-11214)。尽管存在的数据与这两个结构域的表达水平的低氧可诱导性相矛盾，但是最小反式激活结构域在图谱中已经确定是残基531-582和775-826。与这些发现相吻合，缺失反式激活结构域但是表现出组成型核转位的GFP-HIF-1α片段(例如GFP-HIF-1α/1-74)不诱导报道基因活性。以相似的方式，融合蛋白GFP-HIF-1α/1-245和GFP-HIF-1α/1-330完全没有任何功能活性(没有给出数据)。此外，没有刺激HRE-依赖性报道基因活性超过背景值的GFP-HIF-1α/1-652的瞬时表达(图6A)，尽管该蛋白质包含一个HIF-1α的反式激活结构域，当与GAL 4 DNA结构域融合时导致转录激活(图6C)，以类似于瞬时表达的GFP-HIF-1α的水平表达(没有给出数据)。该结果与GFP-HIF-1α/1-652不能进入细胞核相一致(图4B)。结果，这些数据证明可诱导的核定位和反式激活功能，尽管包含在HIF-1α的C-末端中，代表可以相互分开的不同的功能整体。HIF-1α中缺失最多13个C-末端氨基酸残基导致在GFP-HIF-1α/1-813和GAL4-HIF-1α/1-813(图6A和6C)情况下转录活性的显著降低的发现进一步强化了该结论，尽管这两种蛋白质能够进入细胞核(图4B和没有给出数据)。

7.CBP辅激活蛋白的HIF-1α-低氧-依赖性募集引起的转录激活被从可诱导NLS基元功能性去偶联

CREB结合蛋白CBP是一种已知与多种组成型活性或可诱导DNA结合转录因子相互作用的转录辅激活蛋白蛋白质，其中所述组成型活性或可诱导DNA结合转录因子其中包括CREB，c-Fos，c-Jun，类固醇受体超家族的各成员，和p53(Shikama等(1997)细胞生物学动态(Trends Cell Biol.)7，230-236)。还已经证明CBP与HIf-1α实际上相关并且在Hep3B细胞中红细胞生成素启动子的低氧依赖性反式激活中起着作用(Arany等(1996)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)93，12969-12973)。因此我们开始检验CBP的过量表达对最小HRE-驱动报道基因的GFP-HIF-1α引起的低氧-依赖性激活的影响。正如所预期的，低氧条件下的GFP-HIF-1α的瞬时表达导致与正常含氧量条件下观察到的激活响应相比大约4-至5-倍的BRE-依赖性报道基因刺激(图6A和7A)。GFP-HIF-1α与CBP的共表达进一步将低氧-依赖性激活响应增强大约3-倍，导致超过在正常含氧量下观察到的水平大约15-倍的报道基因活性刺激，进一步确立CBP支持HIF-1α/Arnt复合体的转录(图7A)。这与证明单一氨基酸突变体GFP-HIF-1αK719T蛋白质不能经历可诱导核积聚(图5B和表II)，GFP-HIF-1αK719T不产生低氧-依赖性激活响应的数据极好地吻合。此外，GFP-HIF-1αK719T与CBP的共表达在低氧条件下不产生任何报道基因活性的显著刺激，表明核转位-缺陷HIF-1α蛋白质功能上与CBP相互作用。作为另一个对照，我们检验了暴露给低氧是否影响瞄向CBP调节的其它转录因子的功能。在这些实验中，我们在报道基因测试中观察到低氧对视黄酸受体的功能活性的CBP引起的配体-依赖性增强没有影响(没有给出数据)，所述视黄酸受体是完善表征的CBP的靶物(有关综述，见Torchia等(1998)细胞生物学最新观点(Curr.Opin.Cell Biol.)10，373-383)。

如上所述，HIF-1α与GAL4 DNA结合域的融合产生报道基因活性合适(大约2-倍)的低氧-依赖性激活的嵌合蛋白(图6C和7B)。但是在CBP存在下，在低氧条件下又观察到报道基因的19倍刺激，而在正常含氧量条件下，CBP只是稍微(2-至3-倍)增强GAL4-HIF-1α活性(图7B)。我们接着想检验携带两个HIF-1α反式激活结构域并且当与GFP融合时表现出专一核定位的包含C-末端亚区526-826的GAL4DNA结合域融合蛋白的反式激活能力(图4B和5B)。该嵌合蛋白产生合适(大约2-倍)的报道基因活性的低氧-依赖性激活，但是CBP超表达后有效地增强其可诱导激活功能(图7B)。因此，这些数据证明HIF-1α的C-末端以低氧-依赖性方式恢复CBP。令人感兴趣的是，CBP也能出人意料地增强在HIF-1α的低氧-可诱导NLS基元中携带定点突变的GAL4-HIF-1α/526-826 K719T融合蛋白的活性。事实上，CBP通过GAL4-HIF-1α/526-826或GAL4-HIF-1α/526-826 K719T支持可诱导转录的作用是非常类似的(图7B)，因此证明低氧-可诱导NLS基元的失活不改变该结构域响应低氧被辅激活蛋白恢复并且接着反式激活的能力。我们还检验了CBP支持分离的C-末端反式激活结构域(氨基酸776-826)与GAL4 DNA结合域融合的功能的能力。令人感兴趣的是，尽管该结构域在低氧细胞中CBP存在下介导激活作用，但是其不响应缺失113个最C-末端氨基酸之后的CBP(图7C；比较GAL4-HIF-1α/776-826与GAL4-HIF-1α/776-813)，强烈提示这些残基构成CBP引起的低氧-依赖性调节的靶物。

8.GIF2在哺乳动物细胞中以低氧依赖性方式增强HIF-1α活性并且与受体相互作用

为了更好地理解HIF-1α的转录激活机理，我们测试了转录辅激活蛋白TIF2的瞬时表达对HIF-1α的功能活性的影响。TIF2属于转录辅激活蛋白的p160家族，已经证明核受体介导的转录激活需要TIF2(Takeshita等(1997)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)272，27629-27634)。我们首先使用COS7细胞进行了瞬时转染实验。如图8所示，不存在共表达的蛋白质时低氧处理(1％O₂)不显著改变报道基因活性，最可能由于COS7细胞内低水平的内源HIF-1α活性(没有公开的发现)。HIF-1α和Arnt瞬时共表达时，pT81/IM-luc报道基因活性在正常含氧量条件下刺激大约10-倍，可能由于在这些条件下定位的细胞核中的小的但是可检测的HIF-1α的积聚。这些报道基因活性表现出低氧引起的合适增加(大约1.5-倍)(图8)。但是，正如所预期的，当与不存在外源辅激活蛋白下的低氧刺激的活性相比CBP的异位表达以剂量依赖方式进一步增强HIF-1α引起的低氧-依赖性激活(2-至3-倍)。尽管CBP的表达在正常含氧量下已经稍微刺激HIF-1α活性，但是其总的活性几乎完全取决于对低氧的暴露，这一点前面已经描述过。由于在感染之前的细胞中已经存在大量的内源CBP，该效果最大限于3-倍。HIF-1α与TIF2一起的共表达导致超过正常含氧量下观察到的水平的报道基因的有效激活(大约12-倍)，从而确定TIF2和CBP两者支持HIF-1α/Arnt复合体引起的转录(图8)。结论是，原来鉴定为支持多种类固醇激素受体家族成员引起的激素依赖性转录活性的辅激活蛋白的TIF-2也作为在HIF-1α/Arnt复合体引起的低氧-依赖性转录活性中的有条件控制的辅激活蛋白。

响应低氧，HIF-1α输入细胞核并且表现出严格地核定位。为了表征活细胞中HIF-1α对转录激活的TIF2-依赖性增强的机理，我们接着提问TIF2的超表达是否影响HIF-1α的细胞内定位。为此我们用编码绿荧光蛋白(GFP)与全长HIF-1α的读框内融合物的表达载体瞬时转染了COS7细胞。如上所述，该GFP-HIF-1α构建体的荧光在正常含氧量条件下在细胞内均匀分布，用低氧-模拟剂2，2’-联吡啶将转染的细胞处理2小时导致GFP-HIF-1α蛋白质的完全核积聚。在正常含氧量下，在GFP-HIF-1α的存在下TIF2辅激活蛋白的瞬时转染对荧光活性的强度和亚细胞分布没有影响。但是，共表达GFP-HIF-1α和TIF2的细胞暴露给2，2’-联吡啶时，在细胞核中类似点结构中检测到GFP-HIF-1α-依赖性荧光活性。先前描述过TIF2是主要与细胞核中这样的类似点的不连续体相关的细胞核蛋白质(Voegel等(I 998)EMBO J.17，507-519)。这些发现强有力地提示TIIF-2诱导细胞核中GFP-HIF-1α的再定位，指示GFP-HIF-1α和TIF2在体内相互作用，并且点样的荧光模式可能代表转录活性染色质。

如上所述，暴露给低氧后将细胞恢复正常含氧量或者去除模拟低氧的化合物导致HIF-1α的细胞核积聚的输出。为了确定GFP-HIF-1α和TIF2之间的体内相互作用是否取决于低氧刺激物，我们因此首先将转染的细胞暴露给2，2’联吡啶，然后在通过在培养基中洗涤细胞而去除2，2’联吡啶之后在正常空气氧含量水平下进一步将其培养。正如所预期的，在正常含氧量条件下培养24小时之后，发现细胞核和细胞质区室两者中GFP-HIF-1α的分布与暴露给低氧信号之前的荧光活性的分布是不可区分的。TIF2的瞬时表达不诱导GFP-HIF-1α的输出中任何定量或定性差别，证明TIF2对HIF-1α的低氧-诱导的细胞核再定位在去除低氧信号之后可以反转。

9.SRC-1对HIF-1α的低氧-诱导的反式激活功能的调节

如上所述，TIF2属于包括SRC-1的p160家族的一个正在生长的家族。TIF2和SRC-I两者都表现出具有和辅激活蛋白一样的增强配体激活的细胞核激素受体的多个成员的转录效率的相似活性(Voegel等，上文)。SRC-1已被证实直接地组成型地与CBP相互作用(Yao等(I 996)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)93，106261063 1)。而且，与CBP类似，SRC-1已经表现出具有固有的-组蛋白酰基转移酶活性(Spencer等(1997)Nature 389，194-198)。以此为背景，我们测试了SRC-1调节最小HRE-驱动报道基因的HIF-1α-依赖性转录激活的能力。在使用COS7细胞的瞬时转染实验中，与不存在外源辅激活蛋白下的低氧-刺激活性相比较，HRE-依赖性报道基因活性被SRC-1以剂量-依赖性方式从2-倍刺激到8-倍(图9A)。正常含氧量条件下SRC-1的瞬时表达也增强HIF-1α的转录活性，尽管达到一个较小的程度(大约3-倍；图9A)。因此，SRC-1和TIF2都具有增强HIF-1α的转录效率的类似性质。为了确定p160家族辅激活蛋白成员对HIF-1α功能的调节是否是细胞类型特异性的，我们接着在人293胚胎肾细胞系中进行了类似的转染实验。在这些实验中我们发现SRC-1(图9B)和TIF2(没有给出数据)可以显著增强293细胞内HIF-1α-依赖性转录激活。

令人感兴趣的是，类似于HIF-1α，p160家族的辅激活蛋白属于更大家族的bHLH/PAS因子(在图9C中图示表示)。SRC-1最初克隆为一个N-末端截短的片段(Ofiate等(1995)Science 270，1354-1357)，这里称之为SRC-1ΔPAS(图9C)，缺失bHLH/PAS基元。bHLH和PAS结构域代表有效的蛋白质/蛋白质相互作用界面，并且对于HIF-1α和Arnt之间的二聚合作用是关键的(Gradin等(I 996)分子细胞生物学(Mol.Cell Biol.)16，522f-51231；

Wang等(I 995)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)92，5510-5514)。为了研究SRC-1的bHLH/PAS基元在HIF-1α引起的低氧-依赖性反式激活中的作用，我们检查了SRC-1ΔPAS或全长SRC-1的超表达对一种融合蛋白GAL4/HIF 71-826的转录活性的影响，所述融合蛋白包含读框内与hHIF-1α覆盖氨基酸71-826的片段融合的GAL4 DBD。使用GAL4-响应报道基因监测该构建体的低氧-依赖性激活。如图9C所示，该嵌合蛋白介导报道基因活性的4-倍低氧-依赖性激活。与SRC-1对HIF-1α/Arnt复合体介导的转录激活的作用相一致，在低氧条件下全长SRC-1辅激活蛋白的共表达进一步将GAL4/HIF71-826增强大约12-倍，导致超过在正常含氧量下观察到的水平大约45-倍的报道基因的刺激(图9C)。SRC-1表现出对单独GAL4 DBD的转录活性没有可检测到的影响(没有给出数据)。这些结果证明SRC-1瞄向HIF-1α蛋白质。接着，我们检验了SRC-1ΔPAS突变体对GAL4/HIF 71-826-介导的反式激活的影响。该截短的辅激活蛋白片段表现出在增强低氧-依赖性激活响应中如果不是比全长SRC-1更具有效活性就是表现得非常类似(图9C)。因此，在增强类固醇激素受体-依赖性转录调节中与SRC-1ΔPAS野生型活性极好一致(Ofiate等，上文)，SRC-1的bHLH和PAS基元对于支持HIF-1α功能不是重要的。

本发明实验指明CBP和SRC-1增强低氧细胞中HIF-1α引起的转录潜能的功能重要性。CBP先前已经证明与HIF-1α发生物理相互作用(Arany等(1995)Nature 374，81-84)。为了研究SRC-1是否能与HIF-1α相互作用，我们使用存在或不存在100μM CoCl₂下瞬时表达GST-标记的HIF-1α的COS7细胞制备的细胞提取物进行谷胱甘肽-S-转移酶(GST)沉淀测试，CoCl₂是一种已知模拟靶基因表达的低氧诱导并且激活HIF-1α的化合物(Wenger&Gassmann(I 997)生物化学(Biol.Chem.)378，609-616)。该材料接着与体外翻译的[35S]标记的SRC-1一起培养。如图9D所示，在CoCl₂存在下，固定在谷胱甘肽-Sepharose小球上的GST-HIF-1α融合蛋白特异性保留[35S]标记的SRC-1(4道)，而我们没有观察到与从未处理细胞提取的GST-HIF-1α的显著结合，或者与单独的GST的结合(2道)。因此，SRC-1在体外以低氧-依赖性方式与HIF-1α相互作用。

10.LXXLL基元在HIF-1α-SRC-1相互作用中的作用

SRC-1包含短序列基元LXXLL的四个拷贝。在该蛋白质的中心相互作用结构域中鉴定了这些基元中的三个，并且在人SRC-1的8个最C-末端氨基酸中发现了第四个基元(Heery等(1997)Nature 387，733736)。证明该LXX LL基元对于介导SRC-1与细胞核受体占据的配体的结合是必需的。为了研究SRC-1的LXX LL基元在HIF-1α引起的低氧-依赖性反式激活中的作用，我们在瞬时转染实验中比较了野生型SRC-1和SRC-1 M1234的能力，SRC-1 M1234是一种突变蛋白，其中分别在残基636/7， 693/4，752/3和1438/9处将保守的亮氨酸(couplets)取代为丙氨酸。如图10所示，其中所有四个功能结合基元失效的突变蛋白在低氧条件下将GAL4/HIF 71-826的活性增强到和野生型SRC-1一样的程度。此外，野生型SRC-1或SRC-1 M1234与GST-HIF-1α蛋白质在COS7细胞中的瞬时表达对正常含氧量下荧光活性的亚细胞分布没有影响。在低氧条件下，SRC-1诱导GST-HIF-1α的再定位从均匀的核分布到在细胞核中不连续的象点一样的结构。SRC-1 M1234蛋白也产生这样的效果，表明这两种蛋白质在体内以低氧-依赖性方式与HIF-1α相互作用。这些结果一起证明，与细胞核受体信号传导相反，LXXLL基元对于HIF-1α-SRC-1相互作用不是必需的。

11.与辅激活蛋白CBP和SRC-1相互作用的HIF-1α的功能结构域的定义

为了鉴定可以作为与SRC-1和CBP辅激活蛋白相互作用界面的HIF-1α结构，我们构建了一系列包含不同长度的HIF-1α片段的GAL4DBD融合蛋白(如图11A图示说明)。

这些构建体与GAL4响应报道基因一起被瞬时转染到COS7细胞中。在没有异位表达的辅激活蛋白存在下，全长HIF-1α与GAL4 DBD的融合产生显著的报道基因活性的低氧-依赖性诱导(如图11A)。CBP或SRC-1的共表达强(大约8-至10-倍)增强低氧细胞中HIF-1α的转录效率。这些辅激活蛋白也被增加到小于正常含氧量条件下GAL4/HIF 1-826的转录活性程度。CBP或SRC-1都不能单独增强GAL4DBD的转录活性(没有给出数据)。

GAL4/HIF 71-826，其缺失HIF-1α的bHLH结构域(SEQ ID NO：11给出HIF-1α/71-826的氨基酸序列)，诱导的相对荧光活性超过背景水平大约3.5倍(图11A)。在共表达的CBP或SRC-1的存在下，与在没有外源辅激活蛋白存在下低氧下观察到的活性相比，低氧条件下GAL4/HIF 71-826分别将荧光素酶活性诱导高30-和34-倍的水平。

我们接着检验了CBP和SRC-1对GAL4融合蛋白的活性的影响，所述融合蛋白包含C-末端连接HIF-1α的DNA结合和二聚合作用结构域的序列。GAL4/HIF526-826单独产生低氧-诱导激活响应，与该HIF-1α片段中存在两个不同的反式激活结构域完全一致，所述两个不同的反式激活结构域分别是有花纹的N-TAD和C-TAD，见图11A，它们当与GAL4 DBD融合时以低氧-依赖性方式起作用(Jiang等(1997)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)272，19253-19260；Pugh等(I 997)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)11205-11214)。瞬时表达CBP或SRC-1时，GAL4/HIF 526-826的转录活性被大大刺激(大约7-至9-倍)，证明这些辅激活蛋白瞄向HIF-1α的碳末端。此外，这些结果进一步证明CBP和SRC-1对HIF-1α功能的增强效果不依赖于HIF-1α的bHLH和PAS结构域的存在。

为了进一步研究所述辅激活蛋白是否瞄向HIF-1α的一个或两个转录激活结构域，我们下面缺失了残基813-826，这是一个HIF-1α的C-末端反式激活结构域中包含的区并且鉴定为是一个与CBP相互作用的点(Arany等(1996)美国国家科学院院刊93，1296912973)。令人感兴趣的是，GAL4/HIF 1-813(SEQ ID NO：12给出了HIF-1a/1-813的氨基酸序列)保持了CBP和SRC-1超表达显著增强(14-至13-倍)的低氧-诱导响应(图11A)，表明该辅激活蛋白也可以调节HIF-1α的N-末端反式激活结构域的低氧-依赖性功能。

以此为背景，我们有兴趣检验HIF-1α的各个反式激活结构域的调节性质。如图11A所示，GAI-4/HIF 531-584(SEQ ID NO：13给出了HIF-1α/531-584的氨基酸序列)，一种覆盖HIF-1α的N-末端反式激活结构域的嵌合蛋白，表现出低氧-依赖性报道基因活性的诱导，尽管比覆盖两个反式激活结构域的构建体的效率低。但是，CBP存在下，在低氧细胞中发现11-倍报道基因活性刺激，SRC-1的共表达在相同条件下只稍微(1.5-倍)增强GAL4/HIF 531-584的活性。

我们接着检验了携带N-末端反式激活结构域和一种提出作为抑制序列起作用的结构的GAL4/HIF 526-641的反式激活能力(Jiang等，上文)。与GAL4/HIF 531-584相比，该嵌合蛋白的转录活性被大大降低，而且表现出CBP和SRC-1对其反式激活功能的影响完全消除(图11A)，表明在残基584和641之间包含一个抑制区，其可以在一定的还没有鉴定的条件下服务于调节HIF-1α功能，或者，该N-末端反式激活结构域与该序列的融合当在该全长蛋白质之外表达时产生错折叠结构域。

相比之下，包含HIF-1α的羧基-末端反式激活结构域，GAL4/HIF776-826的融合蛋白(SEQ ID NO：14给出HIF-1α/776-826的氨基酸序列)，产生非常适度的(大约2-倍)低氧-依赖性诱导响应。

但是，在CBP(29-倍增加)或SRC-1(I 7-被增加)存在下，其转录活性被显著增强。缺失13个最C-末端氨基酸时，不管存在不存在辅激活蛋白，GAL4/HIF 776-813(SEQ IID NO：15给出HIF-1α/776-813的氨基酸序列)的基础活性和可诱导性质都完全被取消(图11A)。

总之，这些结果提示(i)CBP通过瞄向HIF-1α的反式激活结构域而介导HIF-1α的低氧-诱导转录激活，而SRC-1看起来主要通过该受体的C-末端反式激活结构域施加其作用；和(ii)HIF-1α的13个最C-末端氨基酸对于CBP或SRC-1刺激C-末端反式激活结构域是决定性的。但是，在全长蛋白质中，该C-末端蛋白质在决定CBP或SRC-1存在下低氧-依赖性功能活性中只起着次要部分作用。

因为HIF-1α的功能配偶体因子Arnt最近被证明与CBP/p300相互作用(Kobayashi等(1997)生物化学杂志(J.Biochem.)122，703-710)，我们也检验了RC-1是否可能与Arnt功能上相互作用。在正常含氧量细胞中，Arnt作为组成型活性转录因子对E box-驱动的启动子作用。与CBP或SRC-1一起，我们在COS7细胞中瞬时表达与GAL4DBD融合的Arnt together with either CBP or SRC-1。在这些实验中我们发现GAL4/Arnt 128-774对报道基因的组成型激活被CBP orSRC-1的共表达进一步有效增强(图11B)。缺失Arnt的C-末端反式激活结构域(图11B图示说明)完全破坏了这些辅激活蛋白对GAL4/Arnt128-603的转录的作用(Fig.11B)。这些发现提示HIF-1α杂二聚体的亚基，HIF-1α和Arnt，独立地与CBP和SRC-1相互作用。令人感兴趣的是，尽管Arnt与CBP和SRC-1组成型相互作用，但是HIF-1α-Arnt杂二聚体复合物与CBP或SRC-1的功能联系是低氧依赖性的。因此，与HIF-1α的二聚合作用看起来将低氧-依赖性调节施与Arnt与这些辅激活蛋白功能上相互作用的能力。为了进一步验证该问题，我们分析了正常含氧量下HIF-1α的超表达对GAL4/Arnt融合蛋白的活性的影响。当与单独用GAL4融合蛋白转染的细胞相比时，用HIF-1α和GAL4/Arnt128-774共转染COS7细胞导致报道基因大约4-倍的激活(图11C)，可能由于正常含氧量下细胞核中已经存在少量的HIF-1α。但是，HIF-1α与CBP或SRC-1的共表达完全破坏了报道基因的组成型激活(图11C)。该效果与两种辅激活蛋白中的一种存在时用GAL4/Arnt 128-603观察到的不能辨别(图11B)。但是该缺失的突变体，当与HIF-1α共转染时又导致大约5-倍刺激的报道基因活性(图11C)，与其通过PAS结构域与HIF-1α功能上相互作用的能力相一致。这些结果与与HIF-1α的二聚合作用减弱Arnt与CBP或SRC-1功能性相互作用的能力的模型相吻合。但是，该推导的HIF-1α的负调节作用的机理需要更进一步研究。

12.SRC-1和CBP协同作用增强HIF-1α-依赖性转录

CBP或SRC-1增强HIF-1α的转录活性的能力促使我们研究两个辅激活蛋白的共表达对HIF-1α功能的影响。我们首先研究了SRC-1和CBP分别的瞬时表达和相互之间组合瞬时表达对最小低氧响应元件驱动的报道基因的HIF-1α的低氧-依赖性激活的影响。如上面9A和2B所示，COS7和293细胞中SRC-1对该报道基因的HIF-1α-依赖性激活的影响分别是严格剂量依赖性的。例如，在低SRC-1表达载体浓度下(0.75μg)，没有检测到对该报道基因的HIF-1α-依赖性激活的显著影响(图9A；9B；12A)。以类似方式，相同低浓度的CBP表达载体不产生增强的HIF-1α的反式激活功能(图12A)。在这些条件下，发现了这些报道基因的不好的低氧-依赖性诱导性。但是，在分别不得到显著效果的剂量下瞬时表达SRC-1和CBP时可以重新恢复有效的低氧-依赖性激活响应(图12A)，表明这两个辅激活蛋白之间在增强HIF-1α功能方面具有非常强的协同性。

为了进一步确证该协同效果，我们下面检验了多种GAL4 DBD融合蛋白的反式转录能力，所述融合蛋白包含HIF-1α的不同亚区。低浓度的SRC-1和CBP产生合适的跨越缺失N-末端bHLH结构域的HIF-1α的GAL4/HIF 71-826的转录激活的刺激(图12B)。相反，SRC-1和CBP的共表达在低氧细胞中产生强的增强的GAL4/HIF 71-826介导的激活响应。该效果超过相对在单独CBP或SRC-1存在下检测到的效果的加和，并且也使用GAL4/HIF 526-826融合蛋白进行了观察，所述融合蛋白包含HIF-1α的N-末端和C-末端反式激活结构域两者(图12B)。此外，低浓度的CBP和SRC-1的共表达通过GAL4/HIF 531-584和GA.L4/HIF 776-826中分别包含的HIF-1α的各反式激活结构域有效刺激低氧-诱导转录激活。这些结果与证明HIF-1α的两个反式激活结构域独立地可以与CBP或SRC-1相互作用的数据很好地一致(图11A)。这些数据还与这样的想法相一致，即CBP和SRC-1相互之间组成型相互作用，并且，与类固醇激素受体家族成员的转录激活的机理类似，在低氧细胞中募集两种辅激活蛋白对于触发HIF-1α的完全活性可能是必需的。还要确定这两类对HIF-1α的辅激活蛋白的募集是否同时发生或者以暂时被调节方式发生。此外，到目前为止还不清楚CBP，SRC-1或者两者在低氧激活时是否提供与HIF-1α的激活结构域的物理接触点。令人感兴趣的是，当被分析的GAL4-HIF-1α融合蛋白中包含HIF-1α的两个反式激活结构域时，HIF-1α和这两个辅激活蛋白之间的功能相互作用是协同的。相反，在SRC-1和CBP两者存在下，覆盖分离的反式激活结构域的GAL4融合蛋白表现出调节的加和模式，强有力地提示这两个辅激活蛋白的协同调节可能需要HIF-1α的两个反式激活结构域的存在和完整性。

CBP和p300是非常相关的蛋白质，它们表现出非常强的序列相似性和它们作为辅激活蛋白作用的相似功能(Arany等(1994)Cell 77，799-800)。与CBP类似，在SRC-1存在下，p300增强通过包含HIF-1α的一个或两个反式激活结构域的GAL4融合蛋白的报道基因的低氧-依赖性转录激活(图12C)。如在使用CBP的实验中观察到的(图12B)，CBP/p300和SRC-1类辅激活蛋白一起产生更合适的(3-至4-倍)位于HIF-1α的残基531和584之间的N-末端反式激活结构域的低氧激活(图12C)，而在SRC-1存在下，CBP或p300通过HIF-1α的C-末端反式激活结构域更有效地刺激(大约11-倍)低氧激活(图12C)。

尽管CBP/p300类辅激活蛋白作用的机理还不十分清楚，最近的发现提示这些蛋白质不只是通过作为DNA结合因子和转录引发因子之间的简单的接合体起作用而且还通过携带固有的组蛋白酰基转移酶活性而对转录调节起作用，连接它们调节染色质结构和/或功能(Korzus等(1998)Science 279，703-707)。为了研究p300的酰基转移酶活性在支持HIF-1α-依赖性转录中的有效作用，我们用p300缺失突变体，p300ΔHAT，转染COS7细胞，所述突变体缺失位于该蛋白质中心的组蛋白酰基转移酶(HAT)结构域(在图12C右栏图示表示)。不存在SRC-1下，p300ΔHAT的瞬时表达导致只有非常合适(2-倍)的包含HIF-1α的N-末端反式激活结构域的GAL4/HIF 531-584产生的低氧-依赖性激活响应的刺激，而其对覆盖最小C-末端激活结构域的GAL4/HIF 776-826的低氧-诱导转录活性不产生显著影响(图12C)。SRC-1的存在下，p300ΔHAT增强报道基因活性，最特别是当在低氧细胞中与包含HIF-1α的C-末端激活结构域的GAL4/HIF776-826一起共表达时。但是，p300ΔHAT在产生该响应中比野生型p300效率小大约2-倍(图12C)，表明p300的酰基转移酶催化活性可能贡献于引发HIF-1α-介导的转录激活响应的完全活性。但是，观察到在增强HIF-1α的激活效率中CBP/p300和SRC-1之间的协同性，和SRC-1也具有固有的组蛋白酰基转移酶活性的事实(Spencer等(1997)Nature 389，194-198)，缺失p300的酰基转移酶结构域的效果可能被CBP-相关的蛋白质，可能是SRC-1本身的相应的活性遮蔽。

13.CBP和SRC-1存在下Ref-1加强HIF-1α功能

细胞核氧化还原调节剂Ref-1已知通过Fos和Jun的保守的半胱氨酸的还原来稳定AP-1的DNA结合活性。Ref-1是一种双功能酶：它具有氧化还原和内切酶DNA修复活性(Xanthoudakis等(1992)ENOO J.11，3323-3335)并且涉及低氧条件下基因表达的HIF-1α-依赖性诱导的正调节(Huang等(I996)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271，32253-32259)。以此为背景，我们想进一步研究Ref-1对HIF-1α-依赖性转录激活的效果，并且检验其对HIF-1α与辅激活蛋白CBP和SRC-1的功能相互作用的影响。为了研究HIF-1α是否是Ref-1调节的一个靶物，我们开始使用含有不同的HIF-1α的亚片段的不同的GAL4DBD融合蛋白。如图13A所示，Ref-1的瞬时超表达明显促进覆盖HIF-1α的两个反式激活结构域的融合蛋白GAL4/HIF 71-826和GAL4/HIF 526-826对报道基因表达的低氧诱导。包含HIF-1α的N-末端反式激活结构域的GAL4/HIF 531-584的转录激活功能只是非常合适的但是在低氧细胞中Ref-1对其明显刺激，而Ref-1产生更有效的包含C-末端反式激活结构域的GAL4/HIF 776-826对低氧-诱导反式激活的调节(图13A)。

根据辅激活蛋白CBP和SRC-1对HIF-1α功能的显著增强，我们接着检验了Ref-1对GAL4-HIF-1α融合蛋白结合CBP，SRC-1或者两种蛋白质的转录激活的影响。Ref-1与CBP或SRC-1的瞬时表达之后，与存在该融合蛋白和单独的Ref-1获得的结果相比，试验的GAL4-HIF-1α融合蛋白的低氧-诱导转录激活不显著改变(图13B)。

但是引人注目的是，包含两个或单个各HIF-1α反式激活结构域的所有的融合蛋白的低氧-诱导转录能力在CBP和SRC-1存在下引人注目地被Ref-1的共表达增强(10-至53-倍)(图13B)。在这些条件下，覆盖N-或C-末端反式激活结构域的融合蛋白分别产生12-或53-倍低氧-依赖性激活响应，而包含缺失CBP相互作用界面GAL4/HIF776-813的C-末端反式激活结构域的融合蛋白没有表现出被Ref-1和辅激活蛋白调节。因此，这些数据表明这两种辅激活蛋白在这些条件下对于Ref-1介导的对HIF-1α-依赖性转录的影响是有限的。此外，这些结果清楚地证明N-末端和C-末端反式激活结构域HIF-1α两者是Ref-1调节的靶物，意味着Ref-1与CBP和SRC-1类的转录辅激活蛋白一起在HIF-1α功能调节中起着关键作用。此外，这是代表Ref-1调节的靶物的反式激活结构域的第一个实例，并且，相反地，这些数据代表在哺乳动物细胞中鉴定的HIF-1α反式激活结构域的非共价蛋白质修饰剂的第一个实例。

Ref-1激活HIF-1α的准确机理是未知的。令人感兴趣的是，一种GFP标记的Ref-1融合蛋白在正常含氧量和低氧条件下专一定位于细胞核表明，HIF-1α的核转位对于与Ref-1的功能相互作用是必需的。该氧化还原蛋白已经证明体外与Jun形成复合物(Xanthoudakis等(1994)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)91，2327)。为了进一步研究Ref-1是否可以与HIF-1α相互作用，我们尝试通过使用一种交联剂例如将半胱氨酸巯基氧化为二硫键的肼来捕获这种相互作用。使用GST-标记的纯化的Ref-1进行一系列实验。[35S]甲硫氨酸-标记的体外翻译的GAL4/HIF1-826在没有肼存在下与GST/Ref-1一起温育。发现GAL4/HIF 1-826微弱结合GST/Ref-1和稳定Ref-1和GAL4/HIF之间的这种相互作用的交联剂。当在没有GST/Ref-1存在下单独与抗-GST亲和凝胶温育时或者其与纯化的GST温育时没有发现[35S]甲硫氨酸-标记的GAL4/HIF的结合，表明没有显著的背景结合。

接着，我们用[35S]甲硫氨酸-标记的体外翻译的GAL4/HIF776-826和GAL4/HIF 531-584试验了一系列推翻(pull-down)实验。GAL4/HIF 531-584结合GST/Ref1，并且没有观察到肼的作用，与HIF-1α的N-末端反式激活结构域中不存在半胱氨酸残基相一致。也检测到GAL4/HIF 726-826和GST/Ref-1之间的相互作用，并且该相互作用在肼的存在下有所增强。与该发现很好地一致，即C-TAD包含两个半胱氨酸残基。在存在或不存在肼时观察到该标记的蛋白质对GST的低水平的背景结合。免疫印迹分析证实单独GST/Ref-1或单独的GST的输入浓度是近似的。

上面的实验证实Ref-1促进CBP和SRC-1辅激活蛋白两者对HIF-1α的低氧-诱导启动子激活的影响。此外，Ref-1与不同的HIF-1α的N-和C-末端反式激活结构域发生功能性和物理性相互作用。但是，只有HIF-1α的C-末端而不是N-末端激活结构域包含半胱氨酸残基，通过该残基发生Ref-1调节(Xanthoudakis等(1992)ENMO J.11，3323-3335)。这些数据表明辅助因子，可能是一种辅激活蛋白，可以介导与至少HIF-1α的N-末端反式激活结构域的相互作用。

材料和方法

(a)试剂

在巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子控制下，编码修饰的并且高度发色形式的GFP的pCMX-SAH/Y145F表达载体是Dr.KazuhikoUmesono(东京大学，日本)馈赠的礼物。该人源化GFP(SAH/Y145F)包含一个S65A突变，其给该蛋白质带来波长位移和温度抗性以及Y145P取代，提高GFP的分子内稳定性。表达全长小鼠CBP的pRc/RSV-mCBP-HA构建体是Dr.Richard H.Goodman(VollumInstitute，Oregon)馈赠的礼物。通过从pGEX-4T3-HIF-1α切割HIF-1α编码区作为BamHI/Not I片段(用Klenow聚合酶补平Not I位点)并且符合读框地将其连接到BamHI/Nhe I打开的pCMX-SAH/Y1 45F中，其中用Klenow将NheI位点平端，产生表达全长HIF-1α的GFP-融合物的载体。通过将HIF-1α的BamHI/SpeI片段插入到BamHI/NheI-消化的pCMX-SAH/Y 145F中来装配缺失突变体HIF-1α/1-652。通过PCR使用Pfu DNA聚合酶(Stratagene)与携带BamHI或NheI末端的引物对一起通过扩增等价DNA序列产生编码HIF-1α的亚片段(相应于氨基酸331-641，526-641，和526-826)的GFP融合物。将得到的产物插入BamHI/Nhe I打开的pCMX-SAH/Y1 45F中。从相应的细菌GST融合物表达载体切割下携带氨基末端序列HIF-1α(1-74，1-245，1-330)的GFP融合物并且符合读框地插入pCMX-SAH/Y1 45F的BamHI/NheI位点(NheI平端)。通过通过PstI消化裂解C-末端13个氨基酸来产生末端是氨基酸813的GFP-HIF-1α融合蛋白。通过将HIF-1α插入物裂解为BamHI/Nhe I片段并且将它们再连接到pCMX表达载体中来组装相应的GAL4 DNA-结合结构域融合蛋白。

通过重叠PCR(Ausubel等，1994)进行C-末端NLS的定点诱变，其中期望的突变(密码子719 AAG-＞ACA)被引入到一个PCR产物中，然后作为EcoRI-PstI亚片段被插入pGFP-HIF-1α/526-826中。携带K719T突变的全长HIF-1α的GFP融合物然后通过将HIF-1α的氨基末端BamHI-SpeI片段插入到pGFP-HIF-1α/526-826 K719T中来组装。使用特异性寡核苷酸的PCR-为基础的诱变被用来产生对N-末端NLS基元的突变。通过对插入物测序证实PCR反应的保真度和构建物的鉴定。

(b)细胞培养和转染

我们在补充有10％胎牛血清加青霉素(50IU/ml)和链霉素(50μg/ml)的Dulbeeco’s极限必需培养基(DMEM)中常规维持COS7细胞(来自ATCC)。对于分析活细胞中HIF-1α的核转位，我们在COS7细胞中瞬时表达GFP-标记的HIF-1α及其各种突变体质粒。在6厘米直径塑料皿中在包被硅烷的盖玻片上培养细胞，并且在转染之前将培养基变成没有酚红的OPTI-MEM培养基(Life Technologies，Inc.)。将含有6μg用于GFP标记的HIF-1α表达质粒及其各种突变体的质粒混合物与12μL的TransIT-LT 1试剂(Panvera Corp.，Madison，WI)混合并且加入该培养物中。培养6小时之后，用含有10％FCS的DMEM置换培养基。24小时后用1％O₂，100μM 2，2’-联吡啶或100μM CoCl₂诱导或者只用赋形剂处理。

在共转染测试中分析GFP和GAL4融合构建体的转录活性，其中效应基因质粒(0.2μg/30-mm皿)和报道基因(1.5μg/30-mm皿)一起引入到COS7或HeLa细胞中。在胸苷激酶最小启动子和分别5个或3个GAL4或HIF-响应元件的拷贝的控制下，报道基因质粒编码萤火虫荧光素酶基因。

(c)免疫细胞化学分析

用全长HIF-1α(pCMV-HIF-1α)或者与GAL4 DNA结合域融合的HIF-1α(pCMX-GAL4-HIF-1α)的表达质粒瞬时转染在包被纤连蛋白的盖玻片上培养的COS7细胞。各种处理后，室温下用4％的低聚甲醛的PBS溶液固定细胞30分钟。使用抗-HIF-1α抗血清(Kallio等(1997)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)94，5667-5672)或者抗-GAL4-DBD抗血清(Upstate Biotechnology)，和合适的生物素化-第二抗体和链抗生物素蛋白-偶联的异硫氰酸荧光素或德克萨斯红(Amershain)进行细胞的免疫染色。在载玻片上安装盖玻片并且进行显微镜分析。

(d)目测活细胞中GFP-标记的蛋白质的细胞内运输

在转染之后24和72小时之间以可检测水平表达瞬时表达的GFP。通常情况下，转染之后48小时将细胞用于进一步的实验。各种处理之后，使用Zeiss Axiovert 135附有恒温箱并且装备有加热层，FITC-过滤装置和带有从Gixenon bumer(Carl Zeiss Jena GmbH，Jena，德国)购得的发光源的落射荧光显微镜观察细胞。使用KodakEchtachrome 400照相，并且根据Ylikomi等((1992)EMBOJ.11，3681-3694)的描述半定量评价GFP-标记的蛋白的亚细胞定位。简要地说，不知内情的观察者进行GFP-标记的蛋白的亚细胞定位，检测到GFP荧光的大约有200个细胞。将GFP荧光阳性细胞分为四种不同类别：对于细胞质优势荧光，N＜C；N＝C，细胞质和细胞核区室中具有相同的荧光分布的细胞；对于细胞核优势荧光，N＞C；对于专一细胞核荧光，为N类。

(e)免疫印迹和检测

对于检测HIF-1α融合蛋白表达，基本上根据描述过的(Kallio等(1997)美国国家科学院院刊94，5667-5672)制备全细胞提取物。简要地说，在TEN缓冲液(40mM Tris-HCI，pH7.9；10mM EDTA；150mM NaCl)中收获细胞。在液氮中冷冻细胞沉淀并且通过再悬浮于80μl的细胞抽提缓冲液(10mM Hepes，pH7.9；400mM NaCl；0.1mM EDTA；5％(v/v)甘油；1mM二硫苏糖醇；1mM苯基甲基磺酰氟)中，接着以最大速率离心30分钟，解冻。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳之后将50μg全细胞蛋白质印迹到硝基纤维素滤纸上并且在5％脱脂奶的PBS溶液中封闭过夜。使用抗-HIF-1α抗血清作为第一抗体，在含有1％脱脂奶的PBS溶液中以1∶500稀释2小时。洗涤后，将在PBS/1％脱脂奶中以1∶750稀释的抗-兔IgG-辣根过氧化物酶偶联物(AmershaTn)用作第二抗体。用PBS充分洗涤之后，根据厂商说明使用增强的化学发光(Amersham)目测这些复合物。

表I

GFP-HIF-1α嵌合体的亚细胞分布。用指定的融合构建体双份转染细胞，并且在转染24小时之后在显微镜观察之前用100μM的2，2’-联吡啶(dipyridyl)或者只用赋形剂诱导6小时，并计数细胞，将细胞分为四类：N，仅含有核荧光的细胞；N＞C，核荧光比胞质荧光占优势的细胞；N＝C，荧光分布相同的细胞；和N＜C，细胞质中荧光强度超过细胞核中的荧光强度的细胞。共对200至300个细胞分析了荧光分布，表中指明了属于各类分类的细胞百分比。

	正常含氧量				低氧(联吡啶)
	正常含氧量				低氧(联吡啶)					N	N＞C	N＝C	N＜C	N	N＞C	N＝C	N＜C
GFP	0	0	100	0	0	0	100	0		N	N＞C	N＝C	N＜C	N	N＞C	N＝C	N＜C
GFP	0	0	100	0	0	0	100	0	GFP-HIF-1α	8	27	65	0	90	7	3	0
GFP-HIF-1α/1-74	69	20	11	0	56	35	9	0	GFP-HIF-1α	8	27	65	0	90	7	3	0
GFP-HIF-1α/1-74	69	20	11	0	56	35	9	0	GFP-HIF-1α/1-245	36	38	26	0	31	43	26	0
GFP-HIF-1α/1-330	0	9	91	0	0	5	95	0	GFP-HIF-1α/1-245	36	38	26	0	31	43	26	0
GFP-HIF-1α/1-330	0	9	91	0	0	5	95	0	GFP-HIF-1α/Δ178-390	57	23	20	0	42	29	29	0
GFP-HIF-1α/331-641	0	0	100	0	0	0	100	0	GFP-HIF-1α/Δ178-390	57	23	20	0	42	29	29	0
GFP-HIF-1α/331-641	0	0	100	0	0	0	100	0	GFP-HIF-1α/526-641	0	0	100	0	0	0	100	0
GFP-HIF-1α/1-652	0	0	0	100	0	0	0	100	GFP-HIF-1α/526-641	0	0	100	0	0	0	100	0
GFP-HIF-1α/1-652	0	0	0	100	0	0	0	100	GFP-HIF-1α/526-826	100	0	0	0	100	0	0	0
GFP-HIF-1α/526-813	90	10	0	0	83	11	3	0	GFP-HIF-1α/526-826	100	0	0	0	100	0	0	0

表II

NLS基元中携带点突变的GFP-HIF-1α嵌合体的亚细胞分布，用指定的融合构建体双份转染细胞，并且在转染24小时之后在显微镜观察之前用100μM的2，2’-联吡啶或者只用赋形剂诱导6小时，并计数细胞。将细胞分为表I列出的四类。共对200至300个细胞分析了荧光分布，表中指明了属于各类分类的细胞百分比。

	正常含氧量				低氧(联吡啶)
	正常含氧量				低氧(联吡啶)					N	N＞C	N＝C	N＜C	N	N＞C	N＝C	N＜C
GFP-HIF-1αK719T	0	0	4	96	0	0	19	81		N	N＞C	N＝C	N＜C	N	N＞C	N＝C	N＜C
GFP-HIF-1αK719T	0	0	4	96	0	0	19	81	GFP-HIF-1α/R18A	37	15	48	0	82	6	12	0
GFP-HIF-1αR17G/R18G	50	24	26	0	84	8	18	0	GFP-HIF-1α/R18A	37	15	48	0	82	6	12	0
GFP-HIF-1αR17G/R18G	50	24	26	0	84	8	18	0	GFP-HIF-1α/Δ178-390K719T	0	0	18	82	0	0	15	85
GFP-HIF-1α/526-826K719T	26	24	50	0	15	14	71	0	GFP-HIF-1α/Δ178-390K719T	0	0	18	82	0	0	15	85

序列表

<110>Pharmacia & Upjohn

<120>蛋白质变体

<130>1848

<140>

<141>

<160>15

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>826

<212>PRT

<213>人

<300>

<303>Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.

<304>92

<306>5510-5514

<308>GenBank U22431

<309>1995-06-28

<400>1

Met Glu Gly Ala Gly Gly Ala Asn Asp Lys Lys Lys Ile Ser Ser Glu

1 5 10 15

Arg Arg Lys Glu Lys Ser Arg Asp Ala Ala Arg Ser Arg Arg Ser Lys

20 25 30

Glu Ser Glu Val Phe Tyr Glu Leu Ala His Gln Leu Pro Leu Pro His

35 40 45

Asn Val Ser Ser His Leu Asp Lys Ala Ser Val Met Arg Leu Thr Ile

50 55 60

Ser Tyr Leu Arg Val Arg Lys Leu Leu Asp Ala Gly Asp Leu Asp Ile

65 70 75 80

Glu Asp Asp Met Lys Ala Gln Met Asn Cys Phe Tyr Leu Lys Ala Leu

85 90 95

Asp Gly Phe Val Met Val Leu Thr Asp Asp Gly Asp Met Ile Tyr Ile

100 105 110

Ser Asp Asn Val Asn Lys Tyr Met Gly Leu Thr Gln Phe Glu Leu Thr

115 120 125

Gly His Ser Val Phe Asp Phe Thr His Pro Cys Asp His Glu Glu Met

130 135 140

Arg Glu Met Leu Thr His Arg Asn Gly Leu Val Lys Lys Gly Lys Glu

145 150 155 160

Gln Asn Thr Gln Arg Ser Phe Phe Leu Arg Met Lys Cys Thr Leu Thr

165 170 175

Ser Arg Gly Arg Thr Met Asn Ile Lys Ser Ala Thr Trp Lys Val Leu

180 185 190

His Cys Thr Gly His Ile His Val Tyr Asp Tnr Asn Ser Asn Gln Pro

195 200 205

Gln Cys Gly Tyr Lys Lys Pro Pro Met Thr Cys Leu Val Leu Ile Cys

210 215 220

Glu Pro Ile Pro His Pro Ser Asn Ile Glu Ile Pro Leu Asp Ser Lys

225 230 235 240

Thr Phe Leu Ser Arg His Ser Leu Asp Met Lys Phe Ser Tyr Cys Asp

245 250 255

Glu Arg Ile Thr Glu Leu Met Gly Tyr Glu Pro Glu Glu Leu Leu Gly

260 265 270

Arg Ser Ile Tyr Glu Tyr Tyr His Ala Leu Asp Ser Asp His Leu Thr

275 280 285

Lys Thr His His Asp Met Phe Thr Lys Gly Gln Val Thr Thr Gly Gln

290 295 300

Tyr Arg Met Leu Ala Lys Arg Gly Gly Tyr Val Trp Val Glu Thr Gln

305 310 315 320

Ala Thr Val Ile Tyr Asn Thr Lys Asn Ser Gln Pro Gln Cys Ile Val

325 330 335

Cys Val Asn Tyr Val Val Ser Gly Ile Ile Gln His Asp Leu Ile Phe

340 345 350

Ser Leu Gln Gln Thr Glu Cys Val Leu Lys Pro Val Glu Ser Ser Asp

355 360 365

Met Lys Met Thr Gln Leu Phe Thr Lys Val Glu Ser Glu Asp Thr Ser

370 375 380

Ser Leu Phe Asp Lys Leu Lys Lys Glu Pro Asp Ala Leu Thr Leu Leu

385 390 395 400

Ala Pro Ala Ala Gly Asp Thr Ile Ile Ser Leu Asp Phe Gly Ser Asn

405 410 415

Asp Thr Glu Thr Asp Asp Gln Gln Leu Glu Glu Val Pro Leu Tyr Asn

420 425 430

Asp Val Met Leu Pro Ser Pro Asn Glu Lys Leu Gln Asn Ile Asn Leu

435 440 445

Ala Met Ser Pro Leu Pro Thr Ala Glu Thr Pro Lys Pro Leu Arg Ser

450 455 460

Ser Ala Asp Pro Ala Leu Asn Gln Glu Val Ala Leu Lys Leu Glu Pro

465 470 475 480

Asn Pro Glu Ser Leu Glu Leu Ser Phe Thr Met Pro Gln Ile Gln Asp

485 490 495

Gln Thr Pro Ser Pro Ser Asp Gly Ser Thr Arg Gln Ser Ser Pro Glu

500 505 510

Pro Asn Ser Pro Ser Glu Tyr Cys Phe Tyr Val Asp Ser Asp Met Val

515 520 525

Asn Glu Phe Lys Leu Glu Leu Val Glu Lys Leu Phe Ala Glu Asp Thr

530 535 540

Glu Ala Lys Asn Pro Phe Ser Thr Gln Asp Thr Asp Leu Asp Leu Glu

545 550 555 560

Met Leu Ala Pro Tyr Ile Pro Met Asp Asp Asp Phe Gln Leu Arg Ser

565 570 575

Phe Asp Gln Leu Ser Pro Leu Glu Ser Ser Ser Ala Ser Pro Glu Ser

580 585 590

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Lys Thr Val Thr Lys Asp Arg Met Glu Asp Ile Lys Ile Leu Ile Ala

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Ser Pro Ser Pro Thr His Ile His Lys Glu Thr Thr Ser Ala Thr Ser

645 650 655

Ser Pro Tyr Arg Asp Thr Gln Ser Arg Thr Ala Ser Pro Asn Arg Ala

660 665 670

Gly Lys Gly Val Ile Glu Gln Thr Glu Lys Ser His Pro Arg Ser Pro

675 680 685

Asn Val Leu Ser Val Ala Leu Ser Gln Arg Thr Thr Val Pro Glu Glu

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Glu Leu Asn Pro Lys Ile Leu Ala Leu Gln Asn Ala Gln Arg Lys Arg

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Lys Met Glu His Asp Gly Ser Leu Phe Gln Ala Val Gly Ile Gly Thr

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Leu Leu Gln Gln Pro Asp Asp His Ala Ala Thr Thr Ser Leu Ser Trp

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Lys Arg Val Lys Gly Cys Lys Ser Ser Glu Gln Asn Gly Met Glu Gln

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Lys Thr Ile Ile Leu Ile Pro Ser Asp Leu Ala Cys Arg Leu Leu Gly

770 775 780

Gln Ser Met Asp Glu Ser Gly Leu Pro Gln Leu Thr Ser Tyr Asp Cys

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Glu Val Asn Ala Pro Ile Gln Gly Ser Arg Asn Leu Leu Gln Gly Glu

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Glu Leu Leu Arg Ala Leu Asp Gln Val Asn

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<210>2

<211>74

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人HIF-1α的亚结构域1-74

<400>2

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20 25 30

Glu Ser Glu Val Phe Tyr Glu Leu Ala His Gln Leu Pro Leu Pro His

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Asn Val Ser Ser His Leu Asp Lys Ala Ser Val Met Arg Leu Thr Ile

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Ser Tyr Leu Arg Val Arg Lys Leu Leu Asp

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<210>3

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<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人HIF-1α的亚结构域1-245

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1 5 10 15

Arg Arg Lys Glu Lys Ser Arg Asp Ala Ala Arg Ser Arg Arg Ser Lys

20 25 30

Glu Ser Glu Val Phe Tyr Glu Leu Ala His Gln Leu Pro Leu Pro His

35 40 45

Asn Val Ser Ser His Leu Asp Lys Ala Ser Val Met Arg Leu Thr Ile

50 55 60

Ser Tyr Leu Arg Val Arg Lys Leu Leu Asp Ala Gly Asp Leu Asp Ile

65 70 75 80

Glu Asp Asp Met Lys Ala Gln Met Asn Cys Phe Tyr Leu Lys Ala Leu

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Ser Asp Asn Val Asn Lys Tyr Met Gly Leu Thr Gln Phe Glu Leu Thr

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210 215 220

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Thr Phe Leu Ser Arg

245

<210>4

<211>330

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人HIF-1α的亚结构域1-330

<400>4

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1 5 10 15

Arg Arg Lys Glu Lys Ser Arg Asp Ala Ala Arg Ser Arg Arg Ser Lys

20 25 30

Glu Ser Glu Val Phe Tyr Glu Leu Ala His Gln Leu Pro Leu Pro His

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Asn Val Ser Ser His Leu Asp Lys Ala Ser Val Met Arg Leu Thr Ile

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Ser Tyr Leu Arg Val Arg Lys Leu Leu Asp Ala Gly Asp Leu Asp Ile

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Glu Asp Asp Met Lys Ala Gln Met Asn Cys Phe Tyr Leu Lys Ala Leu

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Asp Gly Phe Val Met Val Leu Thr Asp Asp Gly Asp Met Ile Tyr Ile

100 105 110

Ser Asp Asn Val Asn Lys Tyr Met Gly Leu Thr Gln Phe Glu Leu Thr

115 120 125

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Gln Asn Thr Gln Arg Ser Phe Phe Leu Arg Met Lys Cys Thr Leu Thr

165 170 175

Ser Arg Gly Arg Thr Met Asn Ile Lys Ser Ala Thr Trp Lys Val Leu

180 185 190

His Cys Thr Gly His Ile His Val Tyr Asp Thr Asn Ser Asn Gln Pro

195 200 205

Gln Cys Gly Tyr Lys Lys Pro Pro Met Thr Cys Leu Val Leu Ile Cys

210 215 220

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<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人HIF-1α的亚结构域1-652

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Arg Arg Lys Glu Lys Ser Arg Asp Ala Ala Arg Ser Arg Arg Ser Lys

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Glu Ser Glu Val Phe Tyr Glu Leu Ala His Gln Leu Pro Leu Pro His

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180 185 190

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210 215 220

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Thr Phe Leu Ser Arg His Ser Leu Asp Met Lys Phe Ser Tyr Cys Asp

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Arg Ser Ile Tyr Glu Tyr Tyr His Ala Leu Asp Ser Asp His Leu Thr

275 280 285

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Tyr Arg Met Leu Ala Lys Arg Gly Gly Tyr Val Trp Val Glu Thr Gln

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Asn Glu Phe Lys Leu Glu Leu Val Glu Lys Leu Phe Ala Glu Asp Thr

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Glu Ala Lys Asn Pro Phe Ser Thr Gln Asp Thr Asp Leu Asp Leu Glu

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Met Leu Ala Pro Tyr Ile Pro Met Asp Asp Asp Phe Gln Leu Arg Ser

565 570 575

Phe Asp Gln Leu Ser Pro Leu Glu Ser Ser Ser Ala Ser Pro Glu Ser

580 585 590

Ala Ser Pro Gln Ser Thr Val Thr Val Phe Gln Gln Thr Gln Ile Gln

595 600 605

Glu Pro Thr Ala Asn Ala Thr Thr Thr Thr Ala Thr Thr Asp Glu Leu

610 615 620

Lys Thr Val Thr Lys Asp Arg Met Glu Asp Ile Lys Ile Leu Ile Ala

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Ser Pro Ser Pro Thr His Ile His Lys Glu Thr Thr

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<210>6

<211>613

<212>PRT

<213>人工序列

<400>6

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Glu Ser Glu Val Phe Tyr Glu Leu Ala His Gln Leu Pro Leu Pro His

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Gln Asn Thr Gln Arg Ser Phe Phe Leu Arg Met Lys Cys Thr Leu Thr

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Glu Leu Val Glu Lys Leu Phe Ala Glu Asp Thr Glu Ala Lys Asn Pro

325 330 335

Phe Ser Thr Gln Asp Thr Asp Leu Asp Leu Glu Met Leu Ala Pro Tyr

340 345 350

Ile Pro Met Asp Asp Asp Phe Gln Leu Arg Ser Phe Asp Gln Leu Ser

355 360 365

Pro Leu Glu Ser Ser Ser Ala Ser Pro Glu Ser Ala Ser Pro Gln Ser

370 375 380

Thr Val Thr Val Phe Gln Gln Thr Gln Ile Gln Glu Pro Thr Ala Asn

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Asp Arg Met Glu Asp Ile Lys Ile Leu Ile Ala Ser Pro Ser Pro Thr

420 425 430

His Ile His Lys Glu Thr Thr Ser Ala Thr Ser Ser Pro Tyr Arg Asp

435 440 445

Thr Gln Ser Arg Thr Ala Ser Pro Asn Arg Ala Gly Lys Gly Val Ile

450 455 460

Glu Gln Thr Glu Lys Ser His Pro Arg Ser Pro Asn Val Leu Ser Val

465 470 475 480

Ala Leu Ser Gln Arg Thr Thr Val Pro Glu Glu Glu Leu Asn Pro Lys

485 490 495

Ile Leu Ala Leu Gln Asn Ala Gln Arg Lys Arg Lys Met Glu His Asp

500 505 510

Gly Ser Leu Phe Gln Ala Val Gly Ile Gly Thr Leu Leu Gln Gln Pro

515 520 525

Asp Asp His Ala Ala Thr Thr Ser Leu Ser Trp Lys Arg Val Lys Gly

530 535 540

Cys Lys Ser Ser Glu Gln Asn Gly Met Glu Gln Lys Thr Ile Ile Leu

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Ile Pro Ser Asp Leu Ala Cys Arg Leu Leu Gly Gln Ser Met Asp Glu

565 570 575

Ser Gly Leu Pro Gln Leu Thr Ser Tyr Asp Cys Glu Val Asn Ala Pro

580 585 590

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595 600 605

Leu Asp Gln Val Asn

610

<210>7

<211>311

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人HIF-1α的亚结构域331-641

<400>7

Gln Pro Gln Cys Ile Val Cys Val Asn Tyr Val Val Ser Gly Ile Ile

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Gln His Asp Leu Ile Phe Ser Leu Gln Gln Thr Glu Cys Val Leu Lys

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Pro Val Glu Ser Ser Asp Met Lys Met Thr Gln Leu Phe Thr Lys Val

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Glu Ser Glu Asp Thr Ser Ser Leu Phe Asp Lys Leu Lys Lys Glu Pro

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Leu Asp Phe Gly Ser Asn Asp Thr Glu Thr Asp Asp Gln Gln Leu Glu

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<210>8

<211>116

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人HIF-1α的亚结构域526-641

<400>8

Asp Met Val Asn Glu Phe Lys Leu Glu Leu Val Glu Lys Leu Phe Ala

1 5 10 15

Glu Asp Thr Glu Ala Lys Asn Pro Phe Ser Thr Gln Asp Thr Asp Leu

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Leu Arg Ser Phe Asp Gln Leu Ser Pro Leu Glu Ser Ser Ser Ala Ser

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Leu Ile Ala Ser

115

<210>9

<211>288

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人HIF-1α的亚结构域526-813

<400>9

Asp Met Val Asn Glu Phe Lys Leu Glu Leu Val Glu Lys Leu Phe Ala

1 5 10 15

Glu Asp Thr Glu Ala Lys Asn Pro Phe Ser Thr Gln Asp Thr Asp Leu

20 25 30

Asp Leu Glu Met Leu Ala Pro Tyr Ile Pro Met Asp Asp Asp Phe Gln

35 40 45

Leu Arg Ser Phe Asp Gln Leu Ser Pro Leu Glu Ser Ser Ser Ala Ser

50 55 60

Pro Glu Ser Ala Ser Pro Gln Ser Thr Val Thr Val Phe Gln Gln Thr

65 70 75 80

Gln Ile Gln Glu Pro Thr Ala Asn Ala Thr Thr Thr Thr Ala Thr Thr

85 90 95

Asp Glu Leu Lys Thr Val Thr Lys Asp Arg Met Glu Asp Ile Lys Ile

100 105 110

Leu Ile Ala Ser Pro Ser Pro Thr His Ile His Lys Glu Thr Thr Ser

115 120 125

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Arg Ser Pro Asn Val Leu Ser Val Ala Leu Ser Gln Arg Thr Thr Val

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Arg Lys Arg Lys Met Glu His Asp Gly Ser Leu Phe Gln Ala Val Gly

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Leu Ser Trp Lys Arg Val Lys Gly Cys Lys Ser Ser Glu Gln Asn Gly

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Tyr Asp Cys Glu Val Asn Ala Pro Ile Gln Gly Ser Arg Asn Leu Leu

275 280 285

<210>10

<211>301

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人HIF-1α的亚结构域526-826

<400>10

Asp Met Val Asn Glu Phe Lys Leu Glu Leu Val Glu Lys Leu Phe Ala

1 5 10 15

Glu Asp Thr Glu Ala Lys Asn Pro Phe Ser Thr Gln Asp Thr Asp Leu

20 25 30

Asp Leu Glu Met Leu Ala Pro Tyr Ile Pro Met Asp Asp Asp Phe Gln

35 40 45

Leu Arg Ser Phe Asp Gln Leu Ser Pro Leu Glu Ser Ser Ser Ala Ser

50 55 60

Pro Glu Ser Ala Ser Pro Gln Ser Thr Val Thr Val Phe Gln Gln Thr

65 70 75 80

Gln Ile Gln Glu Pro Thr Ala Asn Ala Thr Thr Thr Thr Ala Thr Thr

85 90 95

Asp Glu Leu Lys Thr Val Thr Lys Asp Arg Met Glu Asp Ile Lys Ile

100 105 110

Leu Ile Ala Ser Pro Ser Pro Thr His Ile His Lys Glu Thr Thr Ser

115 120 125

Ala Thr Ser Ser Pro Tyr Arg Asp Thr Gln Ser Arg Thr Ala Ser Pro

130 135 140

Asn Arg Ala Gly Lys Gly Val Ile Glu Gln Thr Glu Lys Ser His Pro

145 150 155 160

Arg Ser Pro Asn Val Leu Ser Val Ala Leu Ser Gln Arg Thr Thr Val

165 170 175

Pro Glu Glu Glu Leu Asn Pro Lys Ile Leu Ala Leu Gln Asn Ala Gln

180 185 190

Arg Lys Arg Lys Met Glu His Asp Gly Ser Leu Phe Gln Ala Val Gly

195 200 205

Ile Gly Thr Leu Leu Gln Gln Pro Asp Asp His Ala Ala Thr Thr Ser

210 215 220

Leu Ser Trp Lys Arg Val Lys Gly Cys Lys Ser Ser Glu Gln Asn Gly

225 230 235 240

Met Glu Gln Lys Thr Ile Ile Leu Ile Pro Ser Asp Leu Ala Cys Arg

245 250 255

Leu Leu Gly Gln Ser Met Asp Glu Ser Gly Leu Pro Gln Leu Thr Ser

260 265 270

Tyr Asp Cys Glu Val Asn Ala Pro Ile Gln Gly Ser Arg Asn Leu Leu

275 280 285

Gln Gly Glu Glu Leu Leu Arg Ala Leu Asp Gln Val Asn

290 295 300

<210>11

<211>756

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人HIF-1α的亚结构域71-826

<400>11

Lys Leu Leu Asp Ala Gly Asp Leu Asp Ile Glu Asp Asp Met Lys Ala

1 5 10 15

Gln Met Asn Cys Phe Tyr Leu Lys Ala Leu Asp Gly Phe Val Met Val

20 25 30

Leu Thr Asp Asp Gly Asp Met Ile Tyr Ile Ser Asp Asn Val Asn Lys

35 40 45

Tyr Met Gly Leu Thr Gln Phe Glu Leu Thr Gly His Ser Val Phe Asp

50 55 60

Phe Thr His Pro Cys Asp His Glu Glu Met Arg Glu Met Leu Thr His

65 70 75 80

Arg Asn Gly Leu Val Lys Lys Gly Lys Glu Gln Asn Thr Gln Arg Ser

85 90 95

Phe Phe Leu Arg Met Lys Cys Thr Leu Thr Ser Arg Gly Arg Thr Met

100 105 110

Asn Ile Lys Ser Ala Thr Trp Lys Val Leu His Cys Thr Gly His Ile

115 120 125

His Val Tyr Asp Thr Asn Ser Asn Gln Pro Gln Cys Gly Tyr Lys Lys

130 135 140

Pro Pro Met Thr Cys Leu Val Leu Ile Cys Glu Pro Ile Pro His Pro

145 150 155 160

Ser Asn Ile Glu Ile Pro Leu Asp Ser Lys Thr Phe Leu Ser Arg His

165 170 175

Ser Leu Asp Met Lys Phe Ser Tyr Cys Asp Glu Arg Ile Thr Glu Leu

180 185 190

Met Gly Tyr Glu Pro Glu Glu Leu Leu Gly Arg Ser Ile Tyr Glu Tyr

195 200 205

Tyr His Ala Leu Asp Ser Asp His Leu Thr Lys Thr His His Asp Met

210 215 220

Phe Thr Lys Gly Gln Val Thr Thr Gly Gln Tyr Arg Met Leu Ala Lys

225 230 235 240

Arg Gly Gly Tyr Val Trp Val Glu Thr Gln Ala Thr Val Ile Tyr Asn

245 250 255

Thr Lys Asn Ser Gln Pro Gln Cys Ile Val Cys Val Asn Tyr Val Val

260 265 270

Ser Gly Ile Ile Gln His Asp Leu Ile Phe Ser Leu Gln Gln Thr Glu

275 280 285

Cys Val Leu Lys Pro Val Glu Ser Ser Asp Met Lys Met Thr Gln Leu

290 295 300

Phe Thr Lys Val Glu Ser Glu Asp Thr Ser Ser Leu Phe Asp Lys Leu

305 310 315 320

Lys Lys Glu Pro Asp Ala Leu Thr Leu Leu Ala Pro Ala Ala Gly Asp

325 330 335

Thr Ile Ile Ser Leu Asp Phe Gly Ser Asn Asp Thr Glu Thr Asp Asp

340 345 350

Gln Gln Leu Glu Glu Val Pro Leu Tyr Asn Asp Val Met Leu Pro Ser

355 360 365

Pro Asn Glu Lys Leu Gln Asn Ile Asn Leu Ala Met Ser Pro Leu Pro

370 375 380

Thr Ala Glu Thr Pro Lys Pro Leu Arg Ser Ser Ala Asp Pro Ala Leu

385 390 395 400

Asn Gln Glu Val Ala Leu Lys Leu Glu Pro Asn Pro Glu Ser Leu Glu

405 410 415

Leu Ser Phe Thr Met Pro Gln Ile Gln Asp Gln Thr Pro Ser Pro Ser

420 425 430

Asp Gly Ser Thr Arg Gln Ser Ser Pro Glu Pro Asn Ser Pro Ser Glu

435 440 445

Tyr Cys Phe Tyr Val Asp Ser Asp Met Val Asn Glu Phe Lys Leu Glu

450 455 460

Leu Val Glu Lys Leu Phe Ala Glu Asp Thr Glu Ala Lys Asn Pro Phe

465 470 475 480

Ser Thr Gln Asp Thr Asp Leu Asp Leu Glu Met Leu Ala Pro Tyr Ile

485 490 495

Pro Met Asp Asp Asp Phe Gln Leu Arg Ser Phe Asp Gln Leu Ser Pro

500 505 510

Leu Glu Ser Ser Ser Ala Ser Pro Glu Ser Ala Ser Pro Gln Ser Thr

515 520 525

Val Thr Val Phe Gln Gln Thr Gln Ile Gln Glu Pro Thr Ala Asn Ala

530 535 540

Thr Thr Thr Thr Ala Thr Thr Asp Glu Leu Lys Thr Val Thr Lys Asp

545 550 555 560

Arg Met Glu Asp Ile Lys Ile Leu Ile Ala Ser Pro Ser Pro Thr His

565 570 575

Ile His Lys Glu Thr Thr Ser Ala Thr Ser Ser Pro Tyr Arg Asp Thr

580 585 590

Gln Ser Arg Thr Ala Ser Pro Asn Arg Ala Gly Lys Gly Val Ile Glu

595 600 605

Gln Thr Glu Lys Ser His Pro Arg Ser Pro Asn Val Leu Ser Val Ala

610 615 620

Leu Ser Gln Arg Thr Thr Val Pro Glu Glu Glu Leu Asn Pro Lys Ile

625 630 635 640

Leu Ala Leu Gln Asn Ala Gln Arg Lys Arg Lys Met Glu His Asp Gly

645 650 655

Ser Leu Phe Gln Ala Val Gly Ile Gly Thr Leu Leu Gln Gln Pro Asp

660 665 670

Asp His Ala Ala Thr Thr Ser Leu Ser Trp Lys Arg Val Lys Gly Cys

675 680 685

Lys Ser Ser Glu Gln Asn Gly Met Glu Gln Lys Thr Ile Ile Leu Ile

690 695 700

Pro Ser Asp Leu Ala Cys Arg Leu Leu Gly Gln Ser Met Asp Glu Ser

705 710 715 720

Gly Leu Pro Gln Leu Thr Ser Tyr Asp Cys Glu Val Asn Ala Pro Ile

725 730 735

Gln Gly Ser Arg Asn Leu Leu Gln Gly Glu Glu Leu Leu Arg Ala Leu

740 745 750

Asp Gln Val Asn

755

<210>12

<211>813

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人HIF-1α的亚结构域1-813

<400>12

Met Glu Gly Ala Gly Gly Ala Asn Asp Lys Lys Lys Ile Ser Ser Glu

1 5 10 15

Arg Arg Lys Glu Lys Ser Arg Asp Ala Ala Arg Ser Arg Arg Ser Lys

20 25 30

Glu Ser Glu Val Phe Tyr Glu Leu Ala His Gln Leu Pro Leu Pro His

35 40 45

Asn Val Ser Ser His Leu Asp Lys Ala Ser Val Met Arg Leu Thr Ile

50 55 60

Ser Tyr Leu Arg Val Arg Lys Leu Leu Asp Ala Gly Asp Leu Asp Ile

65 70 75 80

Glu Asp Asp Met Lys Ala Gln Met Asn Cys Phe Tyr Leu Lys Ala Leu

85 90 95

Asp Gly Phe Val Met Val Leu Thr Asp Asp Gly Asp Met Ile Tyr Ile

100 105 110

Ser Asp Asn Val Asn Lys Tyr Met Gly Leu Thr Gln Phe Glu Leu Thr

115 120 125

Gly His Ser Val Phe Asp Phe Thr His Pro Cys Asp His Glu Glu Met

130 135 140

Arg Glu Met Leu Thr His Arg Asn Gly Leu Val Lys Lys Gly Lys Glu

145 150 155 160

Gln Asn Thr Gln Arg Ser Phe Phe Leu Arg Met Lys Cys Thr Leu Thr

165 170 175

Ser Arg Gly Arg Thr Met Asn Ile Lys Ser Ala Thr Trp Lys Val Leu

180 185 190

His Cys Thr Gly His Ile His Val Tyr Asp Thr Asn Ser Asn Gln Pro

195 200 205

Gln Cys Gly Tyr Lys Lys Pro Pro Met Thr Cys Leu Val Leu Ile Cys

210 215 220

Glu Pro Ile Pro His Pro Ser Asn Ile Glu Ile Pro Leu Asp Ser Lys

225 230 235 240

Thr Phe Leu Ser Arg His Ser Leu Asp Met Lys Phe Ser Tyr Cys Asp

245 250 255

Glu Arg Ile Thr Glu Leu Met Gly Tyr Glu Pro Glu Glu Leu Leu Gly

260 265 270

Arg Ser Ile Tyr Glu Tyr Tyr His Ala Leu Asp Ser Asp His Leu Thr

275 280 285

Lys Thr His His Asp Met Phe Thr Lys Gly Gln Val Thr Thr Gly Gln

290 295 300

Tyr Arg Met Leu Ala Lys Arg Gly Gly Tyr Val Trp Val Glu Thr Gln

305 310 315 320

Ala Thr Val Ile Tyr Asn Thr Lys Asn Ser Gln Pro Gln Cys Ile Val

325 330 335

Cys Val Asn Tyr Val Val Ser Gly Ile Ile Gln His Asp Leu Ile Phe

340 345 350

Ser Leu Gln Gln Thr Glu Cys Val Leu Lys Pro Val Glu Ser Ser Asp

355 360 365

Met Lys Met Thr Gln Leu Phe Thr Lys Val Glu Ser Glu Asp Thr Ser

370 375 380

Ser Leu Phe Asp Lys Leu Lys Lys Glu Pro Asp Ala Leu Thr Leu Leu

385 390 395 400

Ala Pro Ala Ala Gly Asp Thr Ile Ile Ser Leu Asp Phe Gly Ser Asn

405 410 415

Asp Thr Glu Thr Asp Asp Gln Gln Leu Glu Glu Val Pro Leu Tyr Asn

420 425 430

Asp Val Met Leu Pro Ser Pro Asn Glu Lys Leu Gln Asn Ile Asn Leu

435 440 445

Ala Met Ser Pro Leu Pro Thr Ala Glu Thr Pro Lys Pro Leu Arg Ser

450 455 460

Ser Ala Asp Pro Ala Leu Asn Gln Glu Val Ala Leu Lys Leu Glu Pro

465 470 475 480

Asn Pro Glu Ser Leu Glu Leu Ser Phe Thr Met Pro Gln Ile Gln Asp

485 490 495

Gln Thr Pro Ser Pro Ser Asp Gly Ser Thr Arg Gln Ser Ser Pro Glu

500 505 510

Pro Asn Ser Pro Ser Glu Tyr Cys Phe Tyr Val Asp Ser Asp Met Val

515 520 525

Asn Glu Phe Lys Leu Glu Leu Val Glu Lys Leu Phe Ala Glu Asp Thr

530 535 540

Glu Ala Lys Asn Pro Phe Ser Thr Gln Asp Thr Asp Leu Asp Leu Glu

545 550 555 560

Met Leu Ala Pro Tyr Ile Pro Met Asp Asp Asp Phe Gln Leu Arg Ser

565 570 575

Phe Asp Gln Leu Ser Pro Leu Glu Ser Ser Ser Ala Ser Pro Glu Ser

580 585 590

Ala Ser Pro Gln Ser Thr Val Thr Val Phe Gln Gln Thr Gln Ile Gln

595 600 605

Glu Pro Thr Ala Asn Ala Thr Thr Thr Thr Ala Thr Thr Asp Glu Leu

610 615 620

Lys Thr Val Thr Lys Asp Arg Met Glu Asp Ile Lys Ile Leu Ile Ala

625 630 635 640

Ser Pro Ser Pro Thr His Ile His Lys Glu Thr Thr Ser Ala Thr Ser

645 650 655

Ser Pro Tyr Arg Asp Thr Gln Ser Arg Thr Ala Ser Pro Asn Arg Ala

660 665 670

Gly Lys Gly Val Ile Glu Gln Thr Glu Lys Ser His Pro Arg Ser Pro

675 680 685

Asn Val Leu Ser Val Ala Leu Ser Gln Arg Thr Thr Val Pro Glu Glu

690 695 700

Glu Leu Asn Pro Lys Ile Leu Ala Leu Gln Asn Ala Gln Arg Lys Arg

705 710 715 720

Lys Met Glu His Asp Gly Ser Leu Phe Gln Ala Val Gly Ile Gly Thr

725 730 735

Leu Leu Gln Gln Pro Asp Asp His Ala Ala Thr Thr Ser Leu Ser Trp

740 745 750

Lys Arg Val Lys Gly Cys Lys Ser Ser Glu Gln Asn Gly Met Glu Gln

755 760 765

Lys Thr Ile Ile Leu Ile Pro Ser Asp Leu Ala Cys Arg Leu Leu Gly

770 775 780

Gln Ser Met Asp Glu Ser Gly Leu Pro Gln Leu Thr Ser Tyr Asp Cys

785 790 795 800

Glu Val Ash Ala Pro Ile Gln Gly Ser Arg Asn Leu Leu

805 810

<210>13

<211>54

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人HIF-1α的亚结构域531-584

<400>13

Phe Lys Leu Glu Leu Val Glu Lys Leu Phe Ala Glu Asp Thr Glu Ala

1 5 10 15

Lys Asn Pro Phe Ser Thr Gln Asp Thr Asp Leu Asp Leu Glu Met Leu

20 25 30

Ala Pro Tyr Ile Pro Met Asp Asp Asp Phe Gln Leu Arg Ser Phe Asp

35 40 45

Gln Leu Ser Pro Leu Glu

50

<210>14

<211>51

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人HIF-1α的亚结构域776-826

<400>14

Ser Asp Leu Ala Cys Arg Leu Leu Gly Gln Ser Met Asp Glu Ser Gly

1 5 10 15

Leu Pro Gln Leu Thr Ser Tyr Asp Cys Glu Val Asn Ala Pro Ile Gln

20 25 30

Gly Ser Arg Asn Leu Leu Gln Gly Glu Glu Leu Leu Arg Ala Leu Asp

35 40 45

Gln Val Asn

50

<210>15

<211>38

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人HIF-1α的亚结构域776-813

<400>15

Ser Asp Leu Ala Cys Arg Leu Leu Gly Gln Ser Met Asp Glu Ser Gly

1 5 10 15

Leu Pro Gln Leu Thr Ser Tyr Asp Cys Glu Val Asn Ala Pro Ile Gln

20 25 30

Gly Ser Arg Asn Leu Leu

35

Claims

1.一种鉴定能调节人HIF-1α的功能域的功能的化合物的方法，所述方法包括：

(i)使候选化合物与表达一种人HIF-1α的变体的细胞接触，所述变体与一个分子探针结合，所述变体没有人HIF-1α的至少一个功能域，或者具有使人HIF-1α的至少一个功能域失活的一种突变，所述一个或多个功能域选自：

(a)位于人HIF-1α的178和390位氨基酸之间的PAS-B结构域，

(b)位于人HIF-1α的718至721位氨基酸的C-末端核定位序列NLS，和

(c)位于人HIF-1α的531和584位氨基酸之间的反式激活蛋白结构域N-TAD，和

(d)位于人HIF-1α的813和826位氨基酸之间的反式激活蛋白结构域C-TAD，和

(ii)检测所述分子探针在细胞中的定位，定位的变化是能调节所述功能域的功能的化合物的指征。

2.根据权利要求1的方法，其中所述人HIF-1α的功能域是C-末端核定位序列NLS结构域。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述分子探针是一种荧光探针，其中细胞核对细胞质的相对荧光变化是能调节所述功能域的功能的一种化合物的指征。

4.根据权利要求3的方法，其中所述分子探针是阿昆拉维多利亚绿荧光蛋白。

5.一种鉴定能调节位于人HIF-1α的718至721位氨基酸的C-末端核定位序列NLS的功能的化合物的方法，包括

(i)使候选化合物与表达人HIF-1α的变体的细胞接触，所述变体缺失所述NLS，或者具有使所述NLS失活的一种突变，和

(ii)检测所述候选化合物对所述变体的作用。

6.根据权利要求5的方法，其中所述人HIF-1α的变体调节报道基因的活性；该报道基因的活性改变是能调节所述NLS的功能的化合物的指征。

7.根据权利要求6的方法，其中所述人HIF-1α的变体与GAL4的DNA结合域融合，并且其中所述细胞含有与报道基因操作地连接的GAL4效应元件。

8.根据权利要求7的方法，其中所述人HIF-1α的变体与阿昆拉维多利亚绿荧光蛋白融合，并且其中所述细胞含有与报道基因操作地连接的红细胞生成素低氧效应元件。

9.根据权利要求7或8的方法，其中所述报道基因是萤火虫荧光素酶基因。

10.根据权利要求5的方法，在转录辅激活蛋白的存在下进行所述方法。

11.根据权利要求10的方法，其中所述转录辅激活蛋白选自SRC-1，TIF2和CBP。

12.根据权利要求11的方法，在氧化还原调节蛋白Ref-1的存在下进行。