CN106366173A - 一种通过结合低氧反应元件控制缺氧反应基因表达的染色质肽 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种染色质肽，它实质上是人体自身细胞缺氧反应基因中低氧反应元件的转录因子所降解而成的寡聚肽以及这些寡聚肽的生物学仿生分子。恶性肿瘤细胞内低氧反应元件的转录因子启动了细胞内的无氧呼吸、细胞增殖、血管形成和发炎，为癌细胞的进一步扩展提供了能量和空间。而由这些转录因子降解产生染色质肽和染色质肽的仿生分子能够特异性的关闭细胞缺氧反应，从而抑制了恶性肿瘤细胞的能量获取途径，使得恶性肿瘤细胞能够自然凋亡，达到了治疗的目的。

Description

一种通过结合低氧反应元件控制缺氧反应基因表达的染色质肽

技术领域

本发明涉及恶性肿瘤人体自身治疗领域，具体涉及一种在组织更新和细胞增殖过程中，能够特异性封闭基因表达瀑布群中低氧反应元件表达的活性染色质肽。

背景技术

根据统计全国每6分钟就有一人被确诊为癌症，每天约有8550人成为新的癌症患者，每七到八人中就有一人死于癌症。未来10年，中国的癌症发病率与死亡率仍将节节攀升，癌症将对人们的身体健康造成巨大的影响，治疗癌症已成为全世界医学领域的重要课题和迫切任务。目前，治疗癌症的技术多种多样，手术、放疗和化疗是目前治疗癌症的三大主要手段,但缺乏特异性选择作用,在杀死肿瘤细胞的同时,也损伤了人体正常的组织细胞,严重影响着治疗计划和患者的生活质量。因此,人们需要寻找新的对人体自身伤害较小的技术来治疗癌症，在众多新型治疗技术中恶性肿瘤人体自身治疗技术引起了较大的关注。

癌细胞在生物学上是指因失去正常调控，过度增殖而形成的可侵犯周围组织或转移至远处新组织的机体组织细胞。癌细胞能够呈无限增殖趋势，同时并不同程度地失去原来细胞固有的形态和功能，同时由于他的无限生长也必将侵占正常细胞的生长空间。细胞增殖是体内所有细胞都具备的基本生物学特性，细胞增殖的实质是在DNA模板严格控制下有序的调控过程。正常的人体细胞在DNA半保留复制时，有极小的概率会产生基因突变，由于人体细胞较多所以在大量的细胞分裂过程中每天会产生大约30-100个癌细胞。身体在免疫力下降或者过多的接触致癌化学药物时，一些变异细胞就会大量繁殖而不受控制，便逐步形成恶性肿瘤。值得关注的是，大部分的人却没有因基因突变而患上癌 症，那是因为人体作为一个有机的整体，它可以通过多种自我调节机制来消灭产生的癌细胞。例如通过体内的免疫机制(T淋巴细胞和B淋巴细胞等)，当免疫细胞发现有变异细胞产生时会采取液体免疫方式和细胞免疫的方式杀死癌细胞；另一个自我调节的有效机制是通过人体产生某些特定的染色质肽调控恶性肿瘤细胞缺氧反应基因群(hypoxia response gene，HRG)的表达，从而达到抑制癌细胞生长的目的，使人体实现了自身治疗。

从化学成分上来说，染色质肽是一种由转录因子降解而产生的寡聚肽，它保留有原来转录因子特定的氨基酸序列，并且与转录因子启动DNA底物具有特异性亲和力。从生物学功能上来讲，染色质肽和它对应的前体转录因子互相拮抗，转录因子通过与特定的DNA片段结合而启动了基因的表达，而转录因子能够结合到对应转录因子编码基因和被调控的下游基因位点，从而负反馈地封闭这些基因表达。

氧气和能量供应是所有细胞维持生命和细胞分裂所必解决及的问题，与细胞维持生命所需的能量相比细胞分裂所需要的氧气和能量要多。正常的人体细胞维持生命和细胞分裂可以通过周围的血管来获取充足的能量，但是恶性肿瘤细胞由于快速分裂的原因，导致肿瘤内微环境中普遍存在着缺氧和能量供应不足的现象。因此，恶性肿瘤细胞是否能够适应缺氧的微环境将直接决定其是否能够增殖、浸润和转移。肿瘤细胞对缺氧反应的适应性主要体现在对细胞缺氧反应基因表达控制上，也就是肿瘤细胞能否促使启动细胞缺氧反应基因群的充分表达。因此我们可以通过控制细胞缺氧反应基因群的表达来抑制恶性肿瘤的生长。细胞缺氧反应基因群的表达是通过对应的转录因子和基因片段结合实现的。与之相反，功能拮抗的染色质肽与缺氧反应基因群基因片段相结合时能够负反馈的关闭缺氧反应基因群的表达。

在分子水平上，己经发现缺氧反应转录因子1(hypoxia-inducible factor l，HIF1)和低氧反应元件(hypoxia responsive element，HRE)是参与肿瘤细胞对缺氧反应基因群调控过程的重要元素。缺氧反应转录因子1只有通过与缺氧反应基 因群每个基因启动子序列内的低氧反应元件结合才能促进缺氧反应基因群的转录和表达。细胞正常的情况下，在缺氧反应基因群的启动子和/或增强子内均存低氧反应元件。低氧反应元件是被调控基因上一段单拷贝或多拷贝的DNA序列，它由核心序列及其两侧的功能序列构成。其核心序列为5'-A/GCGTG-3'，位于mRNA上游的转录调控区，提供与功能性缺氧反应转录因子1特异性结合的DNA结合位点，从而形成转录起始复合物启动缺氧反应基因的转录。

在细胞缺氧时，低氧反应元件的独特转导基因调控系统称作缺氧调控。通过多价和/或异源启动子组合获得缺氧调控启动子，插入到目的基因上游，构建成缺氧诱导表达结构，以用于治疗细胞缺氧导致的疾病。细胞在缺氧环境下，低氧反应元件与活性的低氧诱导因子1(HIF1)特异性结合，启动转录从而调控缺氧反应的下游目的基因的表达。低氧反应元件是缺氧反应基因在低氧环境下转录的最小顺式调控元件，同时它能对中下游相关基因产生作用。

低氧诱导因子1属于异源二聚体蛋白，是细胞中氧平衡反应调控的转录因子，在肿瘤细胞的缺氧适应过程中起着中枢调节的作用，其对下游基因的表达调控影响着肿瘤细胞的糖代谢、增值、凋亡和血管形成，使缺氧的组织细胞能保持氧稳态以耐受缺氧状态。低氧诱导因子1由α和β亚基组成，α亚基用于调控活性，β亚基属于结构型亚基。HIF-1α和HIF-1β能够形成二聚体，被激活后可作用于一系列的靶基因。这些靶基因结构上都包含有低氧反应元件，并且每个低氧反应元件上包含有HIF1的特异性结合的位点。HIF1与其结合位点结合后，在靶基因的转录起始部位形成一个转录起始复合物，启动靶基因的转录。

发明内容

本发明提供了一种通过结合低氧反应元件控制缺氧反应基因表达的染色质肽，其特征在于，所述染色质肽包含8到100个氨基酸残基，能够通过与调控细胞缺氧反应的70到80个基因中的低氧反应元件特异性结合，从而关闭细 胞缺氧反应基因的表达，控制恶性肿瘤细胞在低氧条件下的无限制增值。

优选地，所述染色质肽具体为与低氧反应元件特异性结合的转录因子降解生成的寡聚肽。

优选地，所述转录因子具体为PAS1、NPA1、HIF1、NPA3、SIM1和SIM2中的任何一个或者多个。

优选地，所述低氧反应元件具体为缺氧反应基因上的一段DNA序列，所述DNA序列由核心序列及其两侧的功能序列构成，其中核心序列为5'-(A/G)CGTG-3'。

优选地，所述缺氧反应基因包括控制细胞无氧呼吸反应和/或离子代谢反应和/或新血管生成反应和/或组织发炎免疫反应的基因。

优选地，所述染色质肽可以通过静脉注射、肌肉注射、皮肤渗透和肿瘤部位注射中的任意一种或多种方式补给给人体。

优选地，当所述染色质肽达到药学有效剂量时，用于治疗人类或者动物身体的恶性肿瘤。

优选地，所述药学有效剂量具体指每人每天给药0.05-30mg，可以一次给药或者多次给药。

优选地，所述特异性结合具体指染色质肽对特定片段DNA底物的选择性结合。

优选地，所述染色质肽可以通过液相合成多肽法和/或固相肽合成法和/或转录因子酶切法和/或微生物发酵法和/或酶工程法合成。

优选地，所述染色质肽通过与低氧反应元件结合，用于治疗各种不同机制引起的的恶性肿瘤。

本发明所涉及的染色质肽，实质上是人体自身细胞缺氧反应基因中低氧反应元件的转录因子所降解而成的寡聚肽以及这些寡聚肽的生物学仿生分子。其中细胞缺氧反应包括细胞无氧呼吸反应、细胞增殖反应、血管形成反应和发炎免疫反应等。恶性肿瘤细胞内低氧反应元件的转录因子启动了细胞内的无氧呼 吸、细胞增殖、血管形成和发炎，为癌细胞的进一步扩展提供了能量和空间。而由这些转录因子降解产生染色质肽和染色质肽的仿生分子能够特异性的关闭细胞缺氧反应，从而抑制了恶性肿瘤细胞的能量获取途径，使得恶性肿瘤细胞能够自然凋亡，达到了治疗的目的。

具体实施方式

本发明包括，从人类基因组数据库中选出的多个染色质肽以及这些染色质肽的生物学仿生分子，这些染色质肽和仿生分子通过与低氧反应元件特异性结合，关闭了细胞缺氧反应基因的表达，达到切断癌细胞能量供应的目，促使恶性肿瘤细胞的自然凋亡或者转化其表型。所述染色质肽以及它们的仿生分子可以用于预防和治疗人类各种恶性肿瘤。

为了达到本发明的目的，根据上述总体过程，本发明提供的染色质肽是能够与低氧反应元件特异性结合的转录因子的降解产物，其分子结构中包含有8到100个氨基酸残基，它们能够特异性地结合到70到80个缺氧反应基因中的低氧反应元件上，从而达到长久关闭包括无氧呼吸反应和/或细胞增殖反应和/或血管形成反应和/或发炎免疫反应等细胞缺氧反应的目的，抑制了恶性肿瘤细胞的能量获取途径，使得恶性肿瘤细胞能够自然凋亡，达到了治疗的目的。

在另一个实施例中，染色质肽为能够与细胞缺氧反应基因中的低氧反应元件特异性结合的转录因子降解产生的寡聚肽。

在又一个实施例中，染色质肽可以为选自表2中序列号1-5中的任何一种或者多种。

在再一个实施例中，染色质肽能够通过细胞膜，细胞核膜，最终到达基因靶位。所以，可以通过静脉注射、肌肉注射、皮肤渗透及肿瘤部位注射方法给药。给药量根据不同病人的具体情况而定，通常可以是每人每天0.05-30mg， 可以一次给药或者多次给药。另外，该染色质肽的分子能够被胃酸中的胃蛋白酶所分解，所以不能通过直接口服给药。

在本发明设计药物分子过程中，包括首先找出人体细胞中参与缺氧反应的基因(超过70个基因)，然后通过蛋白质测序和DNA测序等方法找到这些基因所共有的低氧反应元件，再通过与低氧反应元件相结合的转录因子设计出染色质肽。此外，从人类基因组数据库中检索得到的6个能够与低氧反应元件特异性结合的转录因子，这些转录因子的DNA核心序列为5’-(A/G)CGTG-3’。这里的转录因子，具体包括PAS1、NPA1、HIF1、NPA3、SIM1和SIM2中的任何一个或者多个。这里的“细胞缺氧反应”包括细胞无氧呼吸反应、离子代谢反应、血管形成反应和发炎免疫反应等。这里的低氧反应元件位于缺氧反应基因中的启动子和/或增强子内，它只是缺氧反应基因上的一段DNA序列，由核心序列和两端的功能序列构成，其中核心序列为5'-A/GCGTG-3'。

在本发明中，能够与低氧反应元件特异性结合的染色质肽具有高度的选择性，它能够关闭细胞的缺氧反应基因的表达而不会对细胞基因的其它生理反应造成影响。一方面，所述染色质肽通过关闭细胞的缺氧反应基因的表达，遏制了恶性肿瘤细胞获取快速分裂所需能量，从而可以用来治疗恶性肿瘤；另一方面，对于正常的人体细胞而言，由于维持细胞正常的生命活动和周期性分裂所需能量能够通过血管直接供应，所以染色质肽关闭细胞的缺氧反应基因的表达不会对正常细胞造成影响。

本发明的染色质肽针对各种不同机制引起的的恶性肿瘤均有治疗和预防的效果，包括实体恶性肿瘤和流体恶性肿瘤。所述染色质肽可以通过多种不同方法合成，包括液相合成多肽法、固相肽合成法、转录因子酶切法、微生物发酵法以及酶工程法等，这些合成方法都是本领域技术人员的公知技术。

本发明的其他实施例中，还可以包括从人类基因组数据库中检索出来的6个缺氧反应转录因子，由这些转录因子降解得到的6个染色质肽中有两个化学结构完全相同，因此最后得到5个不同分子结构的染色质肽。

表1与低氧反应元件相关的转录因子和染色质肽及其功能

说明：表1中所有列出的染色质肽序列均可用于关闭低氧反应元件的表达

基于以上的分析，我们设计出了一种通过结合低氧反应元件控制缺氧反应基因表达的染色质肽，可以用于治疗人体的恶性肿瘤。染色质肽序列和生物功能见表1。

通过对6个缺氧反应转录因子及其对应的染色质肽的氨基酸序列进行分析，得到5个不同结构的染色质太药物分子。染色质肽的结构以及对应的HRE片段见表2。

我们发现，在参与细胞缺氧反应的70多个基因中，它们上游部位的启动子和/或增强子上都或存在低氧反应元件，本发明提供的5个染色质肽都能够与所述低氧反应元件特异性结合，从而达到关闭和/或抑制缺氧反应基因表达的效果，切断恶性肿瘤细胞通过缺氧反应获取能量的途径，最终实现恶性肿瘤的有效治疗。

表2染色质肽及其对应的HRE片段

经过分析表明，本发明提供的5个染色质肽对所结合的DNA片段局要高度的特异性，它们选择性地与含有5'-A/GCGTG-3'片段的低氧反应元件相结合，而不会影响其它基因的表达，很少有正常细胞的生理活动受到本发明提供的5个染色质肽的影响。这种现象是由两个因素造成，第一，正常细胞大部分处于分裂间歇期，DNA以凝聚状染色体形式存在，因此不易与染色质肽相结合，而癌细胞分裂比较活跃，DNA遗传物质以丝状的染色质的形式存在，导致染色质肽容易结合到特定的靶位，从而关闭缺氧反应基因的表达；第二，正常细胞分裂间歇期较长，同一时间内只有较少正常细胞处于分裂周期内，因此可以通过周围血管直接获取分裂所需要的能量，而癌细胞分裂周期较快，通过周围血管获取的能量不能满足癌细胞分裂的要求，因此癌细胞的分裂更加依赖于缺氧反应基因的表达。

人体自身的调控机制十分复杂，恶性肿瘤的产生可能只是由于癌细胞产生后逃脱了众多调控机制的某一种，从而导致能够无限制的分裂，但所有的癌细胞无限分裂过程中都需要较多的能量，因此都会利用转录因子来启动缺氧反应基因的表达，为分裂过程提供能量。本发明提供的5个染色质肽，通过与缺氧反应基因中的低氧反应元件结合，有效的关闭了细胞的缺氧反应，因此，对不同机制引发的癌症均有治疗效果。

本专利提供的染色质肽与低氧反应元件结合，关闭癌细胞缺氧反应后，少 量的癌细胞仍然具有分裂和分化能力，这些癌细胞在特定情况下，比如染色质肽从靶位脱落或者细胞分裂，可能导致复发。因此，可以考虑补充本发明的染色质肽，使得癌细胞分裂长期处于受抑制状态。

以下用具体实例来说明本发明的技术方案。

实例一

通过液相多肽合成法合成表2中序列号1-5的染色质肽。基本合成方式是，将单个N-α保护的氨基酸反复加到生长的多肽链上，分步地实现整个合成步骤。合成过程主要包括，用保护基保护氨基酸的N-α，然后分步添加到的多肽链上，并且将该多肽链锚固在化学稳定的载体上。合成过程完成之后，可以通过离心洗涤将合成的染色质肽和溶剂分离，然后去除保护基团，最后将多肽链从载体上裂解下来进行提纯。

实例二

关闭细胞低氧反应元件的染色质肽的动物药效试验，测试所述染色质肽对小白鼠肺癌的抑制作用。

小白鼠肺癌转至骨髓，因感染部位范围太广，无法进行放疗。只用NPA1转录因子所对应的染色质肽进行测试，该染色质肽的分子结构为RKEKSRNAARSRR，从第二天开始，每天通过肌肉注射给药0.2mg，以一个月为一个疗程。在治疗过程中，使用抗生素控制并发感染，在连续用药三个疗程后肿瘤基本消失。

实例三

测定染色质肽RRKEKSRDAARSRR对小白兔肝恶性肿瘤的治疗效果。小白兔肝恶性肿瘤，放疗不敏感。采用静脉注射的方式每天给药0.3mg，连续用药70天后，肿瘤明显变小，继续用药30天肿瘤基本消失。

实例四

狗乳腺癌，肿块约40mm×48mm，大范围转移。通过肿瘤部位直接注射染色质肽MKEKSKNAARTRR，每次1mg，每周一次。20天过后，肿块明显变 小。

实例五

测定PAS1转录因子对应的染色质肽RKEKSRDAARCRR对人体食管癌的治疗效果。病人食管癌中期，肿块大小27mm×24mm，年纪较大无法进行化疗。采用静脉注射的方式给药，用药量为每天1mg，分三次用药，在连续用药2个月后检测发现肿块明显变小，部分癌组织脱落，继续用药2个月后病人基本康复。

实例六

测定染色质肽RRKEKSRDAARSRR对胃癌病人的治疗效果。主肿块的大小为60mm×68mm×42mm，采用静脉注射的方式给药。用药量为每天0.5mg，连续用药90天后发现大部分的癌组织坏死，肿瘤块明显变小，继续用药50天后基本恢复正常。

实例七

药物安全性试验，测量染色质肽对小白兔急性毒性试验。

空白实验：取体重在1.6kg-1.9kg的健康小白兔10只，平均分成5组。各组小白兔的腹腔内注射生理盐水，每只小白兔生理盐水注射的量为1g/kg体重。在注射24小时内，每小时测量一次体温，结果显示24小时内5组小白兔的体温正常。

对照实验：取体重在1.6kg-1.9kg的健康小白兔10只，平均分成5组。各组小白兔的腹腔内注射含有不同浓度染色质肽RKEKSRDAARSRRGKEN的生理盐水，每只小白兔生理盐水注射的量为1g/kg体重。在注射24小时内，每小时测量一次体温，结果显示24小时内5组小白兔的体温正常。

实例八

药物安全性试验，测量染色质肽对小白鼠急性毒性试验。

空白实验：取24只健康小白鼠，平均分成6组。各组组小白鼠的腹腔内注射生理盐水，每只小白鼠生理盐水注射的量为0.5g。在注射24小时内，每 小时测量一次体温，结果显示24小时内6组小白鼠的体温正常。

对照实验：取24只健康小白鼠，平均分成6组。各组小白兔的腹腔内注射含有不同浓度染色质肽RKEKSRDAARSRRGKEN的生理盐水，每只小白鼠生理盐水注射的量为0.5g。在注射24小时内，每小时测量一次肛温，结果显示24小时内体温正常。

需要说明的是，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种通过结合低氧反应元件控制缺氧反应基因表达的染色质肽，其特征在于，所述染色质肽包含8到100个氨基酸残基，能够通过与调控细胞缺氧反应的70到80个基因中的低氧反应元件特异性结合，从而关闭细胞缺氧反应基因的表达，控制恶性肿瘤细胞在低氧条件下的无限制增值。

2.根据权利要求1所述的染色质肽，其特征在于，所述染色质肽具体为与低氧反应元件特异性结合的转录因子降解生成的寡聚肽。

3.根据权利要求2所述染色质肽，其特征在于，所述转录因子具体为PAS1、NPA1、HIF1、NPA3、SIM1和SIM2中的任何一个或者多个。

4.根据权利要求1所述染色质肽，其特征在于，所述低氧反应元件具体为缺氧反应基因上的一段DNA序列，所述DNA序列由核心序列及其两侧的功能序列构成，其中核心序列为5'-(A/G)CGTG-3'。

5.根据权利要求1所述染色质肽，其特征在于，所述缺氧反应基因包括控制细胞无氧呼吸反应和/或离子代谢反应和/或新血管生成反应和/或组织发炎免疫反应的基因。

6.根据权利要求1和2中的任何一项所述染色质肽，其特征在于，所述染色质肽可以通过静脉注射、肌肉注射、皮肤渗透和肿瘤部位注射中的任意一种或多种方式补给给人体。

7.根据权利要求1和2中任何一项所述的染色质肽，其特征在于，当所述染色质肽达到药学有效剂量时，用于治疗人类或者动物身体的恶性肿瘤。

8.根据权利要求1所述的染色质肽，其特征在于，所述特异性结合具体指染色质肽对特定片段DNA底物的选择性结合。

9.根据权利要求1所述的染色质肽，其特征在于，所述染色质肽可以通过液相合成多肽法和/或固相肽合成法和/或转录因子酶切法和/或微生物发酵法和/或酶工程法合成。

10.根据权利要求1所述的染色质肽，其特征在于，所述染色质肽通过与低氧反应元件结合，用于治疗各种不同机制引起的的恶性肿瘤。