WO2013048185A2 - 세포 내에서의 빛을 이용한 가역적 단백질 나노클러스터 형성방법 - Google Patents

세포 내에서의 빛을 이용한 가역적 단백질 나노클러스터 형성방법 Download PDF

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이상규
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    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/735—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)

Definitions

  • the present invention relates to a method for forming protein nanoclusters in a cell, and more particularly, a method for forming a reversible protein nanocluster using light in a cell, a method for analyzing protein interactions using photoinduced nanocluster formation, and It relates to a method of reversible inhibition of protein function.
  • US Pat. No. 5,270,163 discloses a method for selecting so-called aptamers, which are single-stranded oligonucleotides that specifically bind to specific biomolecules, and Lunder M. et al., Phage display method. A method of searching for target-binding motifs has been disclosed (Lunder et al ., Appl. Biochem. Biotechnol ., 127 (2): 125-131, 2005), and US Patent Publication No. 2010-0143371 Disclosed are an intrabody, which is a variable domain of a kappa chain of a human antibody that specifically binds to an intracellular protein, and a method of inhibiting the function of the intracellular protein using the same.
  • the protein interaction assays have the disadvantage that they cannot be analyzed in real time or do not completely eliminate the possibility of false-psitive or false-negative.
  • the present invention is to solve various problems, including the above problems, an object of the present invention to provide a method for forming a reversible protein nanocluster using light in the cell.
  • Another object of the present invention is to provide a protein-protein interaction analysis method and kit using photoinduced protein nanocluster formation by the above method.
  • an object of the present invention is to provide a method and kit for inhibiting a specific target protein at the individual or cell level using the photoinduced protein nanocluster formation.
  • these problems are exemplary, and the scope of the present invention is not limited thereby.
  • an expression vector comprising a polynucleotide encoding a fusion protein comprising a photoinduced heterodimer forming protein and a self-assembled protein.
  • the photoinduced heterodimer forming protein may be CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR.
  • the self-assembled protein may be ferritin (ferritin), viral capsid protein, ferritin-like protein, macentosome, calmodulin kinase II ⁇ (CaMKII ⁇ ) or DsRed, the viral capsid protein is CCMV (cowpea) chlorotic mottle virus capsid protein, Norwalk virus capsid protein, SV40 major capsid protein, or papilloma virus capsid protein.
  • CCMV cowpea chlorotic mottle virus capsid protein
  • Norwalk virus capsid protein Norwalk virus capsid protein
  • SV40 major capsid protein papilloma virus capsid protein
  • the fusion protein may further comprise a fluorescent protein
  • the fluorescent protein may be added to the N-terminal or C-terminal of the fusion protein, the photoinduced heterodimer-forming protein and the It can also be inserted between self-assembled proteins.
  • the fluorescent protein is a green fluorescent protein (GFP), a yellow fluorescent protein (YFP), a red fluorescent protein (RFP), an orange fluorescent protein (orange fluorescent protein), cyan Cyan fluorescent protein (CFP), blue fluorescent protein (BFP), or tetracysteine fluorescent motif.
  • the green fluorescent protein is enhanced green fluorescent protein (EGFP), Emerald (Tsien, Annu. Rev.
  • red fluorescent protein is mRuby (Kredel et al ., PLoS ONE , 4). (2): e4391, 2009), mApple (Shaner et al ., Nat. Methods , 5 (6): 545-551, 2008), mStrawberry (Shaner et al ., Nat. Biotechnol ., 22: 1567-1572, 2004), AsRed 2 (Shanner et al ., Nat. Biotehcnol ., 22: 1567-1572, 2004) or mRFP (Campbell et al ., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the orange fluorescent protein is Kusabira Orange (Karawawa et al ., Biochem. J. , 381 (Pt 1): 307-312, 2004), Kusabira Orange 2 (MBL International Corp., Japan), mOrange (2002). Shaner et al ., Nat. Biotechnol ., 22: 1567-1572, 2004), mOrange2 (Shaner et al ., Nat. Biotechnol ., 22: 1567-1572, 2004), dTomato (Shaner et al ., Nat.
  • cyan fluorescent protein is ECFP (enhanced cyan fluorescent protein, Cubitt et al ., Trends Biochem. Sci ., 20: 448-455, 1995), mECFP (Ai et al ., Biochem) . J.
  • tetracysteine motif has the sequence of Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys (SEQ ID NO: 1).
  • Xaa may be an amino acid other than cysteine.
  • the first expression vector comprising a polynucleotide encoding a first fusion protein comprising a photoinduced heterodimer-forming protein and a first self-assembled protein
  • a photoinduced protein comprising a second protein comprising a polynucleotide encoding a second fusion protein comprising a paired protein or a paired protein and a second self-assembled protein.
  • a kit for forming a nanocluster is provided.
  • the photoinduced heterodimer forming protein is CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR
  • the partner protein is CRY or PHR when the photoinduced heterodimer forming protein is CIB or CIBN.
  • It may be PhyB when the heterodimer-forming protein is PIF and FKF1 when the photoinduced heterodimer-forming protein is GIGANTEA.
  • the PIF may be PIF3 or PIF6.
  • CRY or PHR is a partner protein capable of forming homodimers irrespective of light irradiation.
  • the first self-assembled protein and the second self-assembled protein may be independently ferritin, viral capsid protein, ferritin-like protein, macentosome, calmodulin kinase II ⁇ (CaMKII ⁇ ) or DsRed
  • the viral capsid protein may be a cowpea chlorotic mottle virus (CCMV) capsid protein, a Norwalk virus capsid protein, an SV40 major capsid protein, or a papilloma virus capsid protein.
  • CCMV chlorotic mottle virus
  • the first self-assembled protein and the second self-assembled protein may be the same and may be different kinds.
  • the first fusion protein, partner protein and second fusion protein may further comprise a fluorescent protein, wherein the fluorescent protein is the first fusion protein, partner protein and / or second It may be linked to the N-terminus or C-terminus of the fusion protein, or may be inserted between the photoinduced heterodimer forming protein and the first self-assembled protein or between the partner protein and the second self-assembled protein.
  • the fluorescent protein is a green fluorescent protein (GFP), a yellow fluorescent protein (YFP), a red fluorescent protein (RFP), an orange fluorescent protein (orange fluorescent protein), cyan Cyan fluorescent protein (CFP), blue fluorescent protein (BFP), or tetracysteine fluorescent motif.
  • the first expression vector comprising a polynucleotide encoding a first fusion protein comprising a photoinduced heterodimer-forming protein and a first self-assembled protein; And a second expression vector comprising a polynucleotide encoding a second protein comprising a paired protein or a paired protein and a second self-assembled protein.
  • a photoinduced protein nanocluster forming method comprising a light irradiation step of irradiating the transformed cell, tissue or individual with light having a wavelength that induces heterodimer formation between the photoinduced heterodimeric protein and the partner protein.
  • the photoinduced heterodimer-forming protein is CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR
  • the partner protein is the photoinduced heterodimer forming protein is CIB or CRY or PHR if CIBN
  • PIF if the photoinduced heterodimer forming protein is PhyB
  • GIGANTEA if the photoinduced heterodimer forming protein is FKF1
  • the PIF may be PIF3 or PIF6.
  • CRY or PHR is a partner protein capable of forming homodimers irrespective of light irradiation.
  • the first self-assembled protein and the second self-assembled protein are each independently ferritin (ferritin), viral capsid protein, ferritin-like protein, macentosome, calmodulin kinase II ⁇ ( CaMKII ⁇ ) or DsRed, and the viral capsid protein may be a cowpea chlorotic mottle virus (CCMV) capsid protein, a Norwalk virus capsid protein, an SV40 major capsid protein, or a papilloma virus capsid protein.
  • CCMV chlorotic mottle virus
  • the first self-assembled protein and the second self-assembled protein may be the same and may be different kinds.
  • the first fusion protein, partner protein and second fusion protein may further comprise a fluorescent protein, wherein the fluorescent protein is the first fusion protein, partner protein and / or second It may be linked to the N-terminus or C-terminus of the fusion protein, or may be inserted between the photoinduced heterodimer forming protein and the first self-assembled protein or between the partner protein and the second self-assembled protein.
  • the fluorescent protein is a green fluorescent protein (GFP), a yellow fluorescent protein (YFP), a red fluorescent protein (RFP), an orange fluorescent protein (orange fluorescent protein), cyan Cyan fluorescent protein (CFP), blue fluorescent protein (BFP), or tetracysteine fluorescent motif.
  • a first fusion protein comprising a first self-assembled protein, a first fluorescent protein and a photoinduced heterodimer-forming protein
  • 2) optionally a second fluorescent protein and a second self-assembled protein A second fusion protein comprising 3, a third fusion protein comprising a third fluorescent protein
  • 4) a paired protein which forms a heterodimer with the photoinduced heterodimer forming protein upon irradiation with light 5) a bait protein
  • 6 Simultaneously express the target protein to be analyzed in the cell whether the interaction with the bait protein in the cell, wherein the partner protein is expressed in any one of the second fusion protein or the third fusion protein, the bait protein is expressed Is expressed in any one of the second fusion protein, the third fusion protein or the fourth fusion protein including the first self-assembled protein and the first fluorescent protein.
  • the target protein is a fusion protein comprising: characterized in that the expression is included in the fifth fusion protein comprising the other fusion
  • the second fusion protein may be omitted, and the first to fourth fluorescent proteins may be omitted.
  • the first fluorescent protein or the second fluorescent protein emits light of different wavelengths and is either DsRed
  • the first self-assembled protein or the second self-assembled protein can be omitted from the fusion protein containing DsRed.
  • the first to fourth fluorescent proteins are each independently a green fluorescent protein (GFP), a yellow fluorescent protein (YFP), a red fluorescent protein (red fluorescent protein, RFP), cyan fluorescent protein (CFP), blue fluorescent protein (BFP), TagCFP, DsRed or tetratracystein fluorescent motif.
  • GFP green fluorescent protein
  • YFP yellow fluorescent protein
  • RFP red fluorescent protein
  • CFP cyan fluorescent protein
  • BFP blue fluorescent protein
  • TagCFP DsRed or tetratracystein fluorescent motif
  • the first self-assembled protein and the second self-assembled protein are each independently ferritin, viral capsid protein, ferritin-like protein, macentosome, calmodulin kinase II ⁇ (CaMKII ⁇ ) or DsRed.
  • the viral capsid protein may be a cowpea chlorotic mottle virus (CCMV) capsid protein, a Norwalk virus capsid protein, an SV40 major capsid protein, or a papilloma virus capsid protein.
  • CCMV chlorotic mottle virus
  • the first self-assembled protein and the second self-assembled protein may be the same and may be different kinds.
  • the photoinduced heterodimer forming protein is CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR
  • the partner protein is CRY or when the photoinduced heterodimer forming protein is CIB or CIBN.
  • the photoinduced heterodimer forming protein is PIF, it may be PhyB, and when the photoinduced heterodimer forming protein is GIGANTEA, it may be FKF1.
  • the PIF may be PIF3 or PIF6.
  • CRY or PHR is a partner protein capable of forming homodimers irrespective of light irradiation.
  • a first fusion protein comprising a first self-assembled protein, a first fluorescent protein and a photoinduced heterodimer forming protein
  • 2) optionally a second fluorescent protein and a second self-assembled protein A second fusion protein comprising 3, a third fusion protein comprising a third fluorescent protein
  • 4) a paired protein which forms a heterodimer with the photoinduced heterodimer forming protein upon irradiation with light 5) a bait protein
  • 6 Simultaneously express the target protein to be analyzed in the cell whether the interaction with the bait protein in the cell, wherein the partner protein is expressed in any one of the second fusion protein or the third fusion protein, the bait protein is expressed Is expressed in any one of the second fusion protein, the third fusion protein or the fourth fusion protein including the first self-assembled protein and the first fluorescent protein.
  • the target protein is a fusion protein comprising: characterized in that the expression is included in the fifth fusion protein comprising the other fusion
  • the second fusion protein may be omitted, and the first to fourth fluorescent proteins may be omitted.
  • the first fluorescent protein or the second fluorescent protein emits light of different wavelengths and is either DsRed
  • the first self-assembled protein or the second self-assembled protein can be omitted from the fusion protein containing DsRed.
  • the present invention provides a method for screening protein-protein interaction regulators using photoinduced nanocluster formation.
  • each of the first to fourth fluorescent proteins is independently a green fluorescent protein (GFP), a yellow fluorescent protein (YFP), a red fluorescent protein (red fluorescent protein, RFP), cyan fluorescent protein (CFP), blue fluorescent protein (BFP), TagCFP, DsRed or tetratracystein fluorescent motif.
  • GFP green fluorescent protein
  • YFP yellow fluorescent protein
  • RFP red fluorescent protein
  • CFP cyan fluorescent protein
  • BFP blue fluorescent protein
  • BFP blue fluorescent protein
  • TagCFP DsRed or tetratracystein fluorescent motif
  • the first self-assembled protein and the second self-assembled protein are each independently ferritin (ferritin), viral capsid protein, ferritin-like protein, macentosome, calmodulin kinase II ⁇ (CaMKII ⁇ ) or DsRedyl
  • the viral capsid protein may be a cowpea chlorotic mottle virus (CCMV) capsid protein, a Norwalk virus capsid protein, an SV40 major capsid protein, or a papilloma virus capsid protein.
  • CCMV chlorotic mottle virus
  • the first self-assembled protein and the second self-assembled protein may be the same and may be different kinds.
  • the photoinduced heterodimer forming protein is CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR
  • the partner protein is CRY or when the photoinduced heterodimer forming protein is CIB or CIBN.
  • the photoinduced heterodimer forming protein is PIF, it may be PhyB, and when the photoinduced heterodimer forming protein is GIGANTEA, it may be FKF1.
  • the PIF may be PIF3 or PIF6.
  • CRY or PHR is a partner protein capable of forming homodimers irrespective of light irradiation.
  • a first expression vector comprising a first gene construct in which a polynucleotide encoding a first fusion protein comprising a first self-assembled protein, a first fluorescent protein and a photoinduced heterodimer forming protein is operably linked to a promoter;
  • a second expression vector comprising a second gene construct, wherein the polynucleotide encoding a second fusion protein, optionally comprising a second fluorescent protein and a second self-assembled protein, is operably linked to a promoter;
  • a third expression vector comprising a third gene construct in which a polynucleotide encoding a third fusion protein comprising a third fluorescent protein is operably linked to a promoter
  • a fourth expression vector comprising a fourth gene construct, wherein the polynucleotide encoding the first fusion protein, the fourth fusion protein comprising the first fluorescent protein and the bait protein, is operably linked to a promoter.
  • the bait protein is included in any one of the second fusion protein or the third fusion protein and irradiates light to either the second fusion protein or the third fusion protein.
  • the photoinduced heterodimer-forming protein and a partner protein forming a heterodimer, a fusion protein or a fourth fluorescent protein that is selectively expressed the bait protein is not included in the second or third fusion protein
  • the fifth fusion protein comprising a target protein including a target to check whether the interaction between the protein and the bait protein,
  • the second fusion protein may be omitted, and the first to fourth fluorescent proteins may be omitted.
  • the first fluorescent protein or the second fluorescent protein emits light of different wavelengths and is either DsRed
  • the first self-assembled protein or the second self-assembled protein can be omitted from the fusion protein containing DsRed.
  • the first to fourth fluorescent proteins are each independently a green fluorescent protein (GFP), a yellow fluorescent protein (YFP), a red fluorescent protein (red fluorescent protein (RFP)), cyan fluorescent protein (CFP), blue fluorescent protein (BFP), TagCFP, DsRed or tetracysteine fluorescent motif.
  • GFP green fluorescent protein
  • YFP yellow fluorescent protein
  • RFP red fluorescent protein
  • CFP cyan fluorescent protein
  • BFP blue fluorescent protein
  • TagCFP DsRed or tetracysteine fluorescent motif.
  • the first self-assembled protein and the second self-assembled protein are independently ferritin (ferritin), viral capsid protein, ferritin-like protein, macentosome, calmodulin kinase II ⁇ ( CaMKII ⁇ ) or DsRed, and the viral capsid protein may be a cowpea chlorotic mottle virus (CCMV) capsid protein, a Norwalk virus capsid protein, an SV40 major capsid protein, or a papilloma virus capsid protein.
  • CCMV chlorotic mottle virus
  • the first self-assembled protein and the second self-assembled protein may be the same and may be different kinds.
  • the photoinduced heterodimer forming protein is CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR
  • the paired protein is the photoinduced heterodimer forming protein is CIB or CRY or PHR if CIBN
  • PIF if the photoinduced heterodimer forming protein is PhyB
  • GIGANTEA if the photoinduced heterodimer forming protein is FKF1
  • the PIF may be PIF3 or PIF6.
  • CRY or PHR is a partner protein capable of forming homodimers irrespective of light irradiation.
  • a first expression comprising a first gene construct operably linked to a promoter a first polynucleotide encoding a first fusion protein comprising a first self-assembled protein, a first fluorescent protein and a photoinduced heterodimer forming protein vector;
  • a second expression vector comprising a second gene construct, wherein a second polynucleotide encoding a second fusion protein, optionally comprising a second fluorescent protein and a second self-assembled protein, is operably linked to a promoter;
  • a third expression vector comprising a third gene construct in which a third polynucleotide encoding a third fusion protein comprising a third fluorescent protein is operably linked to a promoter
  • a fourth polynucleotide encoding a fourth fusion protein comprising the first fluorescent protein and a polynucleotide encoding a bait protein can be operably linked to the fourth polynucleotide
  • a fourth expression vector comprising a fourth gene construct comprising a site
  • the multiple cloning site for insertion of the polynucleotide encoding the bait protein is included in either the second fusion protein or the third fusion protein, and the second fusion protein. Or a paired protein that forms a heterodimer with the photoinduced heterodimer-forming protein by light irradiation in any one of the third fusion proteins, and encodes the bait protein in the second or third expression vector.
  • a fifth expression vector operably linked to a promoter is an expression vector without multiple cloning sites for insertion of the polynucleotide or a fifth polynucleotide encoding a fifth fusion protein comprising a fourth fluorescent protein that is selectively expressed.
  • Target protein that is the target of the interaction between the protein and the bait protein cancer A polynucleotide containing the screen and the fifth poly multiple cloning site that can be coupled operably to a nucleotide,
  • the second fusion protein may be omitted, and the first to fourth fluorescent proteins may be omitted.
  • the first fluorescent protein or the second fluorescent protein emits light of different wavelengths and is either DsRed
  • the first self-assembled protein or the second self-assembled protein can be omitted from the fusion protein containing DsRed.
  • the first to fourth fluorescent proteins are each independently a green fluorescent protein (GFP), a yellow fluorescent protein (YFP), a red fluorescent protein (red fluorescent protein (RFP)), cyan fluorescent protein (CFP), blue fluorescent protein (BFP), TagCFP, DsRed or tetracysteine fluorescent motif.
  • GFP green fluorescent protein
  • YFP yellow fluorescent protein
  • RFP red fluorescent protein
  • CFP cyan fluorescent protein
  • BFP blue fluorescent protein
  • TagCFP DsRed or tetracysteine fluorescent motif.
  • the first self-assembled protein and the second self-assembled protein are independently ferritin (ferritin), viral capsid protein, ferritin-like protein, macentosome, calmodulin kinase II ⁇ ( CaMKII ⁇ ) or DsRed, and the viral capsid protein may be a cowpea chlorotic mottle virus (CCMV) capsid protein, a Norwalk virus capsid protein, an SV40 major capsid protein, or a papilloma virus capsid protein.
  • CCMV chlorotic mottle virus
  • the first self-assembled protein and the second self-assembled protein may be the same and may be different kinds.
  • the photoinduced heterodimer forming protein is CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR
  • the paired protein is the photoinduced heterodimer forming protein is CIB or CRY or PHR if CIBN
  • PIF if the photoinduced heterodimer forming protein is PhyB
  • GIGANTEA if the photoinduced heterodimer forming protein is FKF1
  • the PIF may be PIF3 or PIF6.
  • CRY or PHR is a partner protein capable of forming homodimers irrespective of light irradiation.
  • a fusion protein comprising a self-assembled protein and a photoinduced heterodimer forming protein, a bait that interacts with a target protein and a partner protein that forms a heterodimer by interacting with the photoinduced heterodimer forming protein
  • a protein is provided with a method for reversible inhibition of target protein function using photoinduced nanocluster formation that is fused to the self-assembled protein or the partner protein.
  • the self-assembled protein may be ferritin, viral capsid protein, ferritin-like protein, macentosome, calmodulin kinase II ⁇ (CaMKII ⁇ ) or DsRed, and the viral capsid protein is cowpea chlorotic mottle virus capsid protein, Norwalk virus capsid protein, SV40 major capsid protein, or papilloma virus capsid protein.
  • the fusion protein may be connected to a fluorescent protein for confirming the formation of nanoclusters.
  • the fluorescent protein may be a green fluorescent protein (GFP), a yellow fluorescent protein (YFP), a red fluorescent protein (RFP), an orange fluorescent protein (OFP) , Cyan fluorescent protein (CFP), blue fluorescent protein (BFP), far-red fluorescent protein or tetracysteine motif (tetracystein motif).
  • the photoinduced heterodimer forming protein is CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR
  • the partner protein is CRY or PHR when the photoinduced heterodimer forming protein is CIB or CIBN.
  • It may be PhyB when the heterodimer-forming protein is PIF and FKF1 when the photoinduced heterodimer-forming protein is GIGANTEA.
  • the PIF may be PIF3 or PIF6.
  • CRY or PHR is a partner protein capable of forming homodimers irrespective of light irradiation.
  • the photoinduced heterodimer-forming protein or the partner protein may form a homodimer regardless of light irradiation.
  • the photoinduced heterodimer-forming protein or the partner protein capable of forming homodimers irrespective of light irradiation may be CRY or PHR.
  • the first fusion protein comprising a first self-assembled protein and a photoinduced heterodimer-forming protein, the second self-assembled protein and the photoinduced heterodimer-forming protein and heterodimers are formed during light irradiation
  • a protein is provided with a method for reversible inhibition of target protein function using photoinduced nanocluster formation that is expressed by fusion to the first self-assembled protein or the second self-assembled protein.
  • the self-assembled protein may be ferritin, viral capsid protein, ferritin-like protein, macentosome, calmodulin kinase II ⁇ (CaMKII ⁇ ) or DsRed, and the viral capsid protein is cowpea chlorotic mottle virus capsid protein, Norwalk virus capsid protein, SV40 major capsid protein, or papilloma virus capsid protein.
  • the fusion protein, the partner protein and the bait protein may be connected to a fluorescent protein for confirming the formation of nanoclusters.
  • the fluorescent protein may be a green fluorescent protein (GFP), a yellow fluorescent protein (YFP), a red fluorescent protein (RFP), an orange fluorescent protein (OFP) , Cyan fluorescent protein (CFP), blue fluorescent protein (BFP), far-red fluorescent protein or tetracysteine motif (tetracystein motif).
  • the photoinduced heterodimer-forming protein is CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR
  • the partner protein is CRY or when the photoinduced heterodimer-forming protein is CIB or CIBN.
  • the photoinduced heterodimer forming protein is PIF, it may be PhyB, and when the photoinduced heterodimer forming protein is GIGANTEA, it may be FKF1.
  • the PIF may be PIF3 or PIF6.
  • CRY or PHR is a partner protein capable of forming homodimers irrespective of light irradiation.
  • the photoinduced heterodimer-forming protein or the partner protein may form a homodimer regardless of light irradiation.
  • the photoinduced heterodimer-forming protein or the partner protein capable of forming homodimers irrespective of light irradiation may be CRY or PHR.
  • a first expression comprising a first gene construct in which a first polynucleotide encoding a fusion protein comprising a self-assembled protein and a photoinduced heterodimer forming protein is operably linked to a promoter.
  • a third polynucleotide encoding a bait protein that interacts with a third expression vector comprising a third gene construct operably linked to a promoter, the bait protein comprising the self-assembled protein or the partner protein Target stage using photoinduced nanocluster formation fused to For the reversible inhibition of the quality function kit is provided.
  • the self-assembled protein may be ferritin, viral capsid protein, ferritin-like protein, macentosome, calmodulin kinase II ⁇ (CaMKII ⁇ ) or DsRed, and the viral capsid protein is cowpea chlorotic mottle virus capsid protein, Norwalk virus capsid protein, SV40 major capsid protein, or papilloma virus capsid protein.
  • the fusion protein, the partner protein and the bait protein may be connected to a fluorescent protein for confirming the formation of nanoclusters.
  • the fluorescent protein may be a green fluorescent protein (GFP), a yellow fluorescent protein (YFP), a red fluorescent protein (RFP), an orange fluorescent protein (OFP) , Cyan fluorescent protein (CFP), blue fluorescent protein (BFP), far-red fluorescent protein or tetracysteine motif (tetracystein motif).
  • the photoinduced heterodimer-forming protein is CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR
  • the partner protein is CRY or when the photoinduced heterodimer-forming protein is CIB or CIBN.
  • the photoinduced heterodimer forming protein is PIF, it may be PhyB, and when the photoinduced heterodimer forming protein is GIGANTEA, it may be FKF1.
  • the PIF may be PIF3 or PIF6.
  • CRY or PHR is a partner protein capable of forming homodimers irrespective of light irradiation.
  • the photoinduced heterodimer-forming protein or the partner protein may form a homodimer regardless of light irradiation.
  • the photoinduced heterodimer-forming protein or the partner protein capable of forming homodimers irrespective of light irradiation may be CRY or PHR.
  • a first polynucleotide encoding a first fusion protein comprising a first self-assembled protein and a photoinduced heterodimer forming protein comprises a first gene construct operably linked to a promoter.
  • a second polynucleotide encoding a second fusion protein comprising a first expression vector, a second self-assembled protein, and a partner protein that forms a heterodimer and the photoinduced heterodimer-forming protein upon irradiation with the promoter.
  • a second cloning site comprising a second expression vector comprising a linked second gene construct, and a third polynucleotide encoding a bait protein that interacts with the target protein, and a multiple cloning site to which the promoter is operably linked
  • a third expression vector comprising a construct, wherein said bait protein comprises said first party
  • the assembly protein or a second kit for reversible inhibition of the target protein function is also a mineral oil which is fused to a self-assembling protein expression using the nanoclusters formed are provided.
  • the self-assembled protein may be ferritin, viral capsid protein, ferritin-like protein, macentosome, calmodulin kinase II ⁇ (CaMKII ⁇ ) or DsRed, and the viral capsid protein is cowpea chlorotic mottle virus capsid protein, Norwalk virus capsid protein, SV40 major capsid protein, or papilloma virus capsid protein.
  • the fusion protein, the partner protein and the bait protein may be linked to a fluorescent protein for confirming the formation of nanoclusters.
  • the fluorescent protein may be a green fluorescent protein (GFP), a yellow fluorescent protein (YFP), a red fluorescent protein (RFP), an orange fluorescent protein (OFP) , Cyan fluorescent protein (CFP), blue fluorescent protein (BFP), far-red fluorescent protein or tetracysteine motif (tetracystein motif).
  • the photoinduced heterodimer forming protein is CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR
  • the partner protein is CRY or PHR when the photoinduced heterodimer forming protein is CIB or CIBN.
  • It may be PhyB when the heterodimer-forming protein is PIF and FKF1 when the photoinduced heterodimer-forming protein is GIGANTEA.
  • the PIF may be PIF3 or PIF6.
  • CRY or PHR is a partner protein capable of forming homodimers irrespective of light irradiation.
  • the photoinduced heterodimer forming protein or the paired protein may form a homodimer regardless of light irradiation.
  • the photoinduced heterodimer-forming protein or the partner protein capable of forming homodimers irrespective of light irradiation may be CRY or PHR.
  • a first expression comprising a first gene construct in which a first polynucleotide encoding a fusion protein comprising a self-assembled protein and a photoinduced heterodimer forming protein is operably linked to a promoter.
  • Mineral oil, which is expressed is also provided a kit for the reversible inhibition of the target protein using functional nanoclusters formed.
  • the self-assembled protein may be ferritin, viral capsid protein, ferritin-like protein, macentosome, calmodulin kinase II ⁇ (CaMKII ⁇ ) or DsRed, and the viral capsid protein is cowpea chlorotic mottle virus capsid protein, Norwalk virus capsid protein, SV40 major capsid protein, or papilloma virus capsid protein.
  • the fusion protein, the partner protein and the bait protein may be linked to a fluorescent protein for confirming the formation of nanoclusters.
  • the fluorescent protein may be a green fluorescent protein (GFP), a yellow fluorescent protein (YFP), a red fluorescent protein (RFP), an orange fluorescent protein (OFP) , Cyan fluorescent protein (CFP), blue fluorescent protein (BFP), far-red fluorescent protein or tetracysteine motif (tetracystein motif).
  • the photoinduced heterodimer forming protein is CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR
  • the partner protein is CRY or PHR when the photoinduced heterodimer forming protein is CIB or CIBN.
  • It may be PhyB when the heterodimer-forming protein is PIF and FKF1 when the photoinduced heterodimer-forming protein is GIGANTEA.
  • the PIF may be PIF3 or PIF6.
  • CRY or PHR is a partner protein capable of forming homodimers irrespective of light irradiation.
  • the photoinduced heterodimer forming protein or the paired protein may form a homodimer regardless of light irradiation.
  • the photoinduced heterodimer-forming protein or the partner protein capable of forming homodimers irrespective of light irradiation may be CRY or PHR.
  • a first polynucleotide encoding a first fusion protein comprising a first self-assembled protein and a photoinduced heterodimer forming protein comprises a first gene construct operably linked to a promoter.
  • a second polynucleotide encoding a second fusion protein comprising a first expression vector, a second self-assembled protein, and a partner protein that forms a heterodimer and the photoinduced heterodimer-forming protein upon irradiation with the promoter.
  • a second expression vector comprising a linked second gene construct, and a third expression comprising a third gene construct operably linked to a promoter, the third polynucleotide encoding a bait protein interacting with the target protein A vector, wherein the bait protein is added to the first self-assembled protein or the second self-assembled protein Mineral oil that is the sum expression is also provided a kit for the reversible inhibition of the target protein function using a nano-cluster formation.
  • the self-assembled protein may be ferritin, viral capsid protein, ferritin-like protein, macentosome, calmodulin kinase II ⁇ (CaMKII ⁇ ) or DsRed, and the viral capsid protein is cowpea chlorotic mottle virus capsid protein, Norwalk virus capsid protein, SV40 major capsid protein, or papilloma virus capsid protein.
  • the fusion protein, the partner protein and the bait protein may be linked to a fluorescent protein for confirming the formation of nanoclusters.
  • the fluorescent protein may be a green fluorescent protein (GFP), a yellow fluorescent protein (YFP), a red fluorescent protein (RFP), an orange fluorescent protein (OFP) , Cyan fluorescent protein (CFP), blue fluorescent protein (BFP), far-red fluorescent protein or tetracysteine motif (tetracystein motif).
  • the photoinduced heterodimer forming protein is CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR
  • the partner protein is CRY or PHR when the photoinduced heterodimer forming protein is CIB or CIBN.
  • It may be PhyB when the heterodimer-forming protein is PIF and FKF1 when the photoinduced heterodimer-forming protein is GIGANTEA.
  • the PIF may be PIF3 or PIF6.
  • CRY or PHR is a partner protein capable of forming homodimers irrespective of light irradiation.
  • the photoinduced heterodimer forming protein or the paired protein may form a homodimer regardless of light irradiation.
  • the photoinduced heterodimer-forming protein or the partner protein capable of forming homodimers irrespective of light irradiation may be CRY or PHR.
  • a first fusion protein comprising a self-assembled protein and a photoinduced heterodimer forming protein, a paired protein and a target protein which interact with the photoinduced heterodimer forming protein to form a heterodimer Or an expression step of simultaneously expressing in an individual; And inducing nanocluster formation to induce photoinduced nanocluster formation by irradiating the cell or individual with light having a wavelength that induces heterodimer formation between the photoinduced heterodimer forming protein and the partner protein.
  • a protein is provided with a method for reversible inhibition of target protein function using photoinduced nanocluster formation that is fused to the self-assembled protein or the partner protein.
  • the self-assembled protein may be ferritin (ferritin), viral capsid protein, ferritin-like protein, macentosome, calmodulin kinase II ⁇ (CaMKII ⁇ ) or DsRed, the viral capsid protein is CCMV (cowpea) chlorotic mottle virus capsid protein, Norwalk virus capsid protein, SV40 major capsid protein, or papilloma virus capsid protein.
  • ferritin ferritin
  • viral capsid protein is CCMV (cowpea) chlorotic mottle virus capsid protein, Norwalk virus capsid protein, SV40 major capsid protein, or papilloma virus capsid protein.
  • the fusion protein, the partner protein and the bait protein may be connected to a fluorescent protein for confirming the formation of nanoclusters.
  • the fluorescent protein may be a green fluorescent protein (GFP), a yellow fluorescent protein (YFP), a red fluorescent protein (RFP), an orange fluorescent protein (OFP) , Cyan fluorescent protein (CFP), blue fluorescent protein (BFP), far-red fluorescent protein or tetracysteine motif (tetracystein motif).
  • the photoinduced heterodimer-forming protein is CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR
  • the partner protein is CRY or when the photoinduced heterodimer-forming protein is CIB or CIBN.
  • the photoinduced heterodimer forming protein is PIF, it may be PhyB, and when the photoinduced heterodimer forming protein is GIGANTEA, it may be FKF1.
  • the PIF may be PIF3 or PIF6.
  • CRY or PHR is a partner protein capable of forming homodimers irrespective of light irradiation.
  • the photoinduced heterodimer-forming protein or the partner protein may form a homodimer regardless of light irradiation.
  • the photoinduced heterodimer-forming protein or the partner protein capable of forming homodimers irrespective of light irradiation may be CRY or PHR.
  • a first polynucleotide encoding a first fusion protein comprising a self-assembled protein and a photoinduced heterodimer forming protein comprising a first gene construct operably linked to a promoter
  • a second gene construct operably linked to a promoter a second polynucleotide encoding a second fusion protein comprising a first expression vector and a paired protein that forms a heterodimer and the photoinduced heterodimer-forming protein upon irradiation with light
  • a third gene construct comprising a second expression vector comprising a third polynucleotide encoding a target protein and a third fusion protein comprising the self-assembled protein operably linked to a promoter.
  • Mineral oil further comprises a third expression vector, or wherein the target protein is included in the second fusion protein
  • the kit for the reversible inhibition of the target protein function using the nanoclusters formed are provided.
  • the self-assembled protein may be ferritin, viral capsid protein, ferritin-like protein, macentosome, calmodulin kinase II ⁇ (CaMKII ⁇ ) or DsRed, and the viral capsid protein is cowpea chlorotic mottle virus capsid protein, Norwalk virus capsid protein, SV40 major capsid protein, or papilloma virus capsid protein.
  • the fusion protein, the partner protein and the bait protein may be linked to a fluorescent protein for confirming the formation of nanoclusters.
  • the fluorescent protein may be a green fluorescent protein (GFP), a yellow fluorescent protein (YFP), a red fluorescent protein (RFP), an orange fluorescent protein (OFP) , Cyan fluorescent protein (CFP), blue fluorescent protein (BFP), far-red fluorescent protein or tetracysteine motif (tetracystein motif).
  • the photoinduced heterodimer forming protein is CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR
  • the partner protein is CRY or PHR when the photoinduced heterodimer forming protein is CIB or CIBN.
  • It may be PhyB when the heterodimer-forming protein is PIF and FKF1 when the photoinduced heterodimer-forming protein is GIGANTEA.
  • the PIF may be PIF3 or PIF6.
  • CRY or PHR is a partner protein capable of forming homodimers irrespective of light irradiation.
  • the photoinduced heterodimer forming protein or the paired protein may form a homodimer regardless of light irradiation.
  • the photoinduced heterodimer-forming protein or the partner protein capable of forming homodimers irrespective of light irradiation may be CRY or PHR.
  • a first polynucleotide encoding a first fusion protein comprising a self-assembled protein and a photoinduced heterodimer forming protein comprising a first gene construct operably linked to a promoter
  • a second gene construct operably linked to a promoter a second polynucleotide encoding a second fusion protein comprising a first expression vector and a paired protein that forms a heterodimer and the photoinduced heterodimer-forming protein upon irradiation with light
  • a second cloning site comprising a second expression vector comprising a polyclonal encoding a target protein operably linked to a promoter and a third polynucleotide encoding the self-assembled protein operably linked to a promoter.
  • the third expression vector including the gene construct Or inducing multiple cloning sites to which the polynucleotide encoding the target protein can be operably linked in the second polynucleotide so that the target protein can be included and expressed in the second fusion protein. Kits for reversible inhibition of target protein function using nanocluster formation are provided.
  • the self-assembled protein may be ferritin, viral capsid protein, ferritin-like protein, macentosome, calmodulin kinase II ⁇ (CaMKII ⁇ ) or DsRed, and the viral capsid protein is cowpea chlorotic mottle virus capsid protein, Norwalk virus capsid protein, SV40 major capsid protein, or papilloma virus capsid protein.
  • the fusion protein, the partner protein and the bait protein may be linked to a fluorescent protein for confirming the formation of nanoclusters.
  • the fluorescent protein may be a green fluorescent protein (GFP), a yellow fluorescent protein (YFP), a red fluorescent protein (RFP), an orange fluorescent protein (OFP) , Cyan fluorescent protein (CFP), blue fluorescent protein (BFP), far-red fluorescent protein or tetracysteine motif (tetracystein motif).
  • the photoinduced heterodimer forming protein is CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR
  • the partner protein is CRY or PHR when the photoinduced heterodimer forming protein is CIB or CIBN.
  • It may be PhyB when the heterodimer-forming protein is PIF and FKF1 when the photoinduced heterodimer-forming protein is GIGANTEA.
  • the PIF may be PIF3 or PIF6.
  • CRY or PHR is a partner protein capable of forming homodimers irrespective of light irradiation.
  • the photoinduced heterodimer forming protein or the paired protein may form a homodimer regardless of light irradiation.
  • the photoinduced heterodimer-forming protein or the partner protein capable of forming homodimers irrespective of light irradiation may be CRY or PHR.
  • 1 is a schematic diagram schematically showing the principle of nanocluster formation induced by light irradiation.
  • FIG. 2 is a fluorescence micrograph of the experimental results showing that the formation of the nanoclusters shown in FIG.
  • Figure 3 is a graph showing the formation and disassembly process of the light-induced nanoclusters over time.
  • Figure 4 is a schematic diagram schematically showing the principle of the protein-protein interaction analysis method using the photoinduced nanocluster formation according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5 is a schematic diagram schematically showing the principle of the protein-to-protein interaction analysis method using the photoinduced nanocluster formation according to another embodiment of the present invention.
  • Figure 6 is a schematic diagram schematically showing the principle of the protein-to-protein interaction analysis method using the photoinduced nanocluster formation according to another embodiment of the present invention.
  • Figure 7 is a schematic diagram schematically showing the principle of the interaction method between proteins using the photoinduced nanocluster formation according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 is a schematic diagram schematically showing the principle of the protein-to-protein interaction analysis method using the photoinduced nanocluster formation according to another embodiment of the present invention.
  • Figure 9 is a schematic diagram showing the concept of a method of inhibiting the function of the target protein by the formation of photoinduced nanoclusters of the present invention.
  • FIG. 10 shows the inhibition of the function of the active protein through the formation of nanoclusters through irradiation of a specific wavelength to the partial active region of the cell and the confinement of target proteins interacting with the active protein present in the partial region. It is a schematic diagram conceptually representing.
  • FIG. 11 is a schematic diagram conceptually illustrating nanocluster formation through light irradiation of a specific cell region in a multicellular region such as an individual or a tissue, and inhibition of function of a target protein present in the specific cell region.
  • FIG. 12 is a schematic diagram conceptually illustrating a method of forming a nanocluster through light irradiation and a method for controlling molecular function thereof according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 13 is a schematic diagram conceptually illustrating a method for forming a nanocluster by light irradiation and two methods of controlling molecular function thereof by irradiating two different nanoparticles according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 14 is a schematic diagram conceptually illustrating a method of forming a nanocluster through light irradiation and a method of controlling molecular function thereof according to another embodiment of the present invention.
  • 15 is a schematic diagram conceptually illustrating a method of forming a nanocluster through light irradiation and a method of controlling molecular function thereof according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 16 is a schematic diagram showing the formation of nanoclusters through light irradiation using the method according to an embodiment of the present invention shown in FIG. 14 and the function control of PI3K protein using the same.
  • FIG. 17 is a schematic diagram showing the formation of nanoclusters through light irradiation using the method according to another embodiment of the present invention and the function regulation of Vav2 protein using the same.
  • FIG. 17 is a schematic diagram showing the formation of nanoclusters through light irradiation using the method according to another embodiment of the present invention and the function regulation of Vav2 protein using the same.
  • FIG. 18 is a fluorescent micrograph showing a result of analyzing the interaction between the mineral oil in accordance with one embodiment of the present invention using an interaction analysis between protein with nanoclusters formed Hras and RBD raf1, and Hras and RBD p110 to be.
  • FIG. 19 is a fluorescence micrograph of cells showing the formation of nanoclusters by light irradiation and the inhibition of function of specific proteins over time to demonstrate the concept shown in FIG. 17.
  • bait protein refers to a protein that interacts with a target protein.
  • projection protein refers to a protein to be analyzed as an interaction partner of the "bait protein”.
  • self-assembled protein refers to a protein that is self-assembly simultaneously with the expression of the protein without the aid of a mediator, a representative self-assembled protein is ferritin (ferritin) ).
  • nanocluster or “protein nanocluster” refers to a population in which nanoparticles formed by self-assembly of self-assembled proteins form clusters by interaction between nanoparticles. do.
  • light-induced heterodimerized protein refers to a protein that forms heterodimers with other proteins when irradiated with light of a particular wavelength.
  • partner protein refers to a target protein that forms a heterodimer with the photoinduced heterodimer-forming protein when irradiated with light of a specific wavelength.
  • fusion protein refers to a protein in which two or more proteins are linked to each other while maintaining their respective functions.
  • heterodimer refers to the formation of a complex by interaction of two different proteins.
  • homodimer means that the same protein interacts with each other to form a complex.
  • operably linked to means that a particular polynucleotide is linked to another polynucleotide to perform its function.
  • the operably linked polynucleotide encoding a particular protein means that the polynucleotide encoding the specific protein is linked so that it can be transcribed into mRNA and translated into the protein by the action of the promoter.
  • operably linked to a polynucleotide encoding another protein it is meant that the particular protein is linked so that it can be expressed in the form of a fusion protein with another protein.
  • CIB refers to cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix protein and is representative of Arabidopsis CIB1 (GenBank No .: NM_119618). There is).
  • CIBN refers to a site that interacts with cryptochrome (CRY) upon irradiation with light as the N-terminus of the CIB.
  • CRY refers to a kryptochrome protein, typically CRY2 (GenBank No .: NM_100320) of Arabidopsis.
  • PHR refers to a phytolyase homolgous region as the N-terminal region of the CRY, and interacts with the CIB or CIBN upon irradiation with light (Kennedy et al ., Nat Methods , 7 (12): 973-975, 2010).
  • Phy refers to a phytochrome protein, and are representative of the Arabidopsis PhyA (GenBank No .: NM_001123784), PhyB (GenBank No .: NM_127435), PIF (phytochrome interacting factor) (Min et al ., Nature, 400: 781-784, 1999)
  • PIF refers to a phytochrome interacting factor, which is representative of the Arabidopsis PIF1 (GenBank No .: NM_001202630), PIF3 (GenBank No .: NM_179295), PIF4 (GenBank No .: NM_180050), PIF5 (GenBank No .: NM_180690), PIF6 (GenBank No .: NM_001203231), or PIF7 (GenBank No .: NM_125520).
  • FKF refers to Flavin-binding, Kelch repeat, F-box proteins, typically FKF1 (GenBank No .: NM_105475) of Arabidopsis. And interact with GIGANTEA proteins upon irradiation with light (Sawa et al ., Science , 318 (5848): 261-265, 2007).
  • GAGANTEA is involved in phytochrome signaling and is known as a protein that regulates flowering time.
  • tetracystein motif is a polypeptide comprising the sequence of Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys (SEQ ID NO: 1), Xaa is an amino acid except cysteine, wherein Depending on the type and length of the polypeptide, the fluorescence pattern varies (Adams et al ., J. Am. Chem. Soc ., 124: 6063-6077, 2002).
  • 1 is a schematic diagram schematically showing the principle of nanocluster formation induced by light irradiation.
  • the present inventors express a photoinduced heterodimer forming protein as a self-assembled protein such as ferritin and a fusion protein, but simultaneously expresses the photoinduced heterodimer forming protein with a partner protein forming a heterodimer by light irradiation. It was predicted that protein nanoclusters would be formed by light irradiation interaction between the self-assembly and the partner protein by self-assembly of the protein (FIG. 1).
  • an expression vector comprising ferritin as a self-assembled protein, CIBN as a photoinduced heterodimer forming protein and a fusion protein linked with a fluorescent protein, and a gene construct encoding PHR as a partner protein
  • an expression vector comprising, irradiated with light of a wavelength that induces the interaction of CIBN and PHR to the transfected cells, and observed with a fluorescence microscope
  • the result shows a strong fluorescence in the cells It was observed (Fig. 2), it was confirmed that the increase and decrease of the number of the corresponding fluorescence point coincided with the light irradiation period (Fig. 3). This demonstrates that nanoclusters were formed by light irradiation between fusion protein self-assemblies in cells.
  • an expression vector comprising a polynucleotide encoding a fusion protein comprising a photoinduced heterodimer forming protein and a self-assembled protein.
  • the photoinduced heterodimer-forming protein may be CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR.
  • the self-assembled protein may be ferritin (ferritin), viral capsid protein, ferritin-like protein, macentosome, calmodulin kinase II ⁇ (CaMKII ⁇ ) or DsRed, the viral capsid protein is CCMV (cowpea) chlorotic mottle virus capsid protein, Norwalk virus capsid protein, SV40 major capsid protein, or papilloma virus capsid protein.
  • CCMV cowpea chlorotic mottle virus capsid protein
  • Norwalk virus capsid protein Norwalk virus capsid protein
  • SV40 major capsid protein papilloma virus capsid protein
  • the fusion protein may further comprise a fluorescent protein
  • the fluorescent protein may be added to the N-terminal or C-terminal of the fusion protein, the photoinduced heterodimer-forming protein and the It can also be inserted between self-assembled proteins.
  • the fluorescent protein is a green fluorescent protein (GFP), a yellow fluorescent protein (YFP), a red fluorescent protein (RFP), an orange fluorescent protein (orange fluorescent protein), cyan Cyan fluorescent protein (CFP), blue fluorescent protein (BFP), or tetracysteine fluorescent motif.
  • the green fluorescent protein is enhanced green fluorescent protein (EGFP), Emerald (Tsien, Annu. Rev.
  • red fluorescent protein is mRuby (Kredel et al ., PLoS ONE , 4). (2): e4391, 2009), mApple (Shaner et al ., Nat. Methods , 5 (6): 545-551, 2008), mStrawberry (Shaner et al ., Nat. Biotechnol ., 22: 1567-1572, 2004), AsRed 2 (Shanner et al ., Nat. Biotehcnol ., 22: 1567-1572, 2004) or mRFP (Campbell et al ., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the orange fluorescent protein is Kusabira Orange (Karawawa et al ., Biochem. J. , 381 (Pt 1): 307-312, 2004), Kusabira Orange 2 (MBL International Corp., Japan), mOrange (2002). Shaner et al ., Nat. Biotechnol ., 22: 1567-1572, 2004), mOrange2 (Shaner et al ., Nat. Biotechnol ., 22: 1567-1572, 2004), dTomato (Shaner et al ., Nat.
  • cyan fluorescent protein is ECFP (enhanced cyan fluorescent protein, Cubitt et al ., Trends Biochem. Sci ., 20: 448-455, 1995), mECFP (Ai et al ., Biochem) . J.
  • tetracysteine motif has the sequence of Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys (SEQ ID NO: 1).
  • Xaa may be an amino acid other than cysteine.
  • the first expression vector comprising a polynucleotide encoding a first fusion protein comprising a photoinduced heterodimer-forming protein and a first self-assembled protein
  • a photoinduced protein comprising a second protein comprising a polynucleotide encoding a second fusion protein comprising a paired protein or a paired protein and a second self-assembled protein.
  • a kit for forming a nanocluster is provided.
  • the photoinduced heterodimer forming protein may be CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR.
  • the partner protein is a protein capable of forming a heterodimer by photoirradiation with the photoinduced heterodimer forming protein, and may be CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR.
  • the heterodimer forming protein When the heterodimer forming protein is CRY or PHR, it may be CIB or CIBN, when the photoinducing heterodimer forming protein is PIF, it is PhyB, and when the photoinducing heterodimer forming protein is GIGANTEA, it is FKF1.
  • the PIF may be PIF3 or PIF6.
  • CRY or PHR is a partner protein capable of forming homodimers irrespective of light irradiation.
  • the first self-assembled protein and the second self-assembled protein may be independently ferritin, viral capsid protein, ferritin-like protein, macentosome, calmodulin kinase II ⁇ (CaMKII ⁇ ) or DsRed.
  • the viral capsid protein may be a cowpea chlorotic mottle virus (CCMV) capsid protein, a Norwalk virus capsid protein, an SV40 major capsid protein, or a papilloma virus capsid protein.
  • CCMV chlorotic mottle virus
  • the first self-assembled protein and the second self-assembled protein may be the same and may be different kinds.
  • the first fusion protein, partner protein and second fusion protein may further comprise a fluorescent protein.
  • the fluorescent protein may be added to the N-terminus or C-terminus of the fusion protein, between the photoinduced heterodimer-forming protein and the first self-assembled protein and / or the paired protein and the second magnetic It can also be inserted between coarse proteins.
  • the fluorescent protein is a green fluorescent protein (GFP), yellow fluorescent protein (YFP), red fluorescent protein (RFP), orange fluorescent protein (orange fluorescent protein), cyan fluorescent protein ( cyan fluorescent protein (CFP), blue fluorescent protein (BFP), or tetracysteine fluorescent motif.
  • the green fluorescent protein may be EGFP, Emerald, Superfolder, GFP, Azami Green, TagGFP, TurboGFP, ZsGreen or T-Sapphire
  • the yellow fluorescent protein may be EYFP, Topaz, Venus, mCitrine, Ypet, TagYFP, PhiYFP, ZsYellow1 or mBanana
  • the red fluorescent protein may be mRuby, mApple, mStrawberry, AsRed2 or mRFP
  • the orange fluorescent protein is Kusabira Orange, Kusabira Orange2, mOrange, mOrange2, dTomato, dTomato-Tandem, TagRFP, TagRFP- T, DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRed-Monomer or mTangerine
  • the cyan fluorescent protein may be ECFP, mECFP, mCerulean, CyPet, AmCyan1, Midori-Ishi Cyan
  • the first expression vector comprising a polynucleotide encoding a first fusion protein comprising a photoinduced heterodimer-forming protein and a first self-assembled protein; And a second expression vector comprising a polynucleotide encoding a second protein comprising a paired protein or a paired protein and a second self-assembled protein.
  • a photoinduced protein nanocluster forming method comprising a light irradiation step of irradiating the transformed cell, tissue or individual with light having a wavelength that induces heterodimer formation between the photoinduced heterodimeric protein and the partner protein.
  • the photoinduced heterodimer forming protein may be CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR.
  • the partner protein is a protein capable of forming a heterodimer by photoirradiation with the photoinduced heterodimer-forming protein, and includes CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY Or PHR, CRY or PHR when the photoinduced heterodimer forming protein is CIB or CIBN, PIF when the photoinduced heterodimer forming protein is PhyB, and GIGANTEA when the photoinduced heterodimer forming protein is FKF1.
  • the photoinduced heterodimer forming protein when the photoinduced heterodimer forming protein is CRY or PHR, it may be CIB or CIBN, when the photoinduced heterodimer forming protein is PIF, PhyB is used, and when the photoinduced heterodimer forming protein is GIGANTEA, FKF1 .
  • the PIF may be PIF3 or PIF6.
  • CRY or PHR is a partner protein capable of forming homodimers irrespective of light irradiation.
  • the first self-assembled protein and the second self-assembled protein are each independently ferritin (ferritin), viral capsid protein, ferritin-like protein, macentosome, calmodulin kinase II ⁇ ( CaMKII ⁇ ) or DsRed, and the viral capsid protein may be a cowpea chlorotic mottle virus (CCMV) capsid protein, a Norwalk virus capsid protein, an SV40 major capsid protein, or a papilloma virus capsid protein.
  • CCMV chlorotic mottle virus
  • the first self-assembled protein and the second self-assembled protein may be the same and may be different kinds.
  • the first fusion protein, the partner protein, and the second fusion protein may further include a fluorescent protein.
  • the fluorescent protein may be added to the N-terminus or C-terminus of the first fusion protein, the partner protein and / or the second fusion protein, and the photoinduced heterodimer-forming protein and the first self-assembled protein. Or between the partner protein and the second self-assembled protein.
  • the fluorescent protein is a green fluorescent protein (GFP), yellow fluorescent protein (YFP), red fluorescent protein (RFP), orange fluorescent protein (orange fluorescent protein), cyan fluorescent protein ( cyan fluorescent protein (CFP), blue fluorescent protein (BFP), or tetracysteine fluorescent motif.
  • the green fluorescent protein may be EGFP, Emerald, Superfolder, GFP, Azami Green, TagGFP, TurboGFP, ZsGreen or T-Sapphire
  • the yellow fluorescent protein may be EYFP, Topaz, Venus, mCitrine, Ypet, TagYFP, PhiYFP, ZsYellow1 or mBanana
  • the red fluorescent protein may be mRuby, mApple, mStrawberry, AsRed2 or mRFP
  • the orange fluorescent protein is Kusabira Orange, Kusabira Orange2, mOrange, mOrange2, dTomato, dTomato-Tandem, TagRFP, TagRFP- T, DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRed-Monomer or mTangerine
  • the cyan fluorescent protein may be ECFP, mECFP, mCerulean, CyPet, AmCyan1, Midori-Ishi Cyan
  • the photoinduced protein nanocluster formation method and kit described above induces nanocluster formation between nanoparticles formed by protein self-assembly by light irradiation, thereby analyzing other protein-protein interactions as well as protein-protein interactions. It can be useful for searching for modulators that regulate
  • the method and kit for photoinduced protein nanocluster formation according to an embodiment of the present invention can reversibly induce photoinduced protein-protein interactions, thereby minimizing damage to living cells and in real time protein-protein interactions. This can be useful for observing the effects of actions.
  • the photoinduced protein nanocluster formation method and kit according to an embodiment of the present invention captures the target protein in the nanocluster using a bait protein that interacts with a specific target protein, thereby reversibly functioning the target protein. Can be used to inhibit.
  • the protein interaction analysis method using the photoinduced nanocluster formation described above and the reversible inhibition method of the target protein are as follows.
  • the first expression vector comprising a first gene construct operably linked to a promoter a first polynucleotide encoding a first fusion protein comprising a first self-assembled protein;
  • a second expression vector comprising a second gene construct in which a photoinduced heterodimer forming protein and a second polynucleotide encoding a second fusion protein comprising said first self-assembled protein are operably linked to a promoter;
  • a third polynucleotide encoding a third fusion protein comprising the photoinduced heterodimer forming protein and a heterologous protein forming a heterodimer, a second fluorescent protein, and a second self-assembled protein by light irradiation is operable in the captive motor.
  • a third expression vector comprising a third gene construct; And a fourth expression vector comprising a fourth gene construct, wherein the fourth polynucleotide encoding the third fusion protein comprising the target protein and the third fluorescent protein is operably linked to a promoter.
  • At least one or more of the fusion protein or the second fusion protein comprises a first fluorescent protein, the first fluorescent protein, the second fluorescent protein and the third fluorescent protein emit light of different wavelengths,
  • first fluorescent protein or the second fluorescent protein is DsRed
  • the first magnetic protein in the fusion protein containing DsRed is provided, a kit for analyzing the interaction between proteins is provided (FIG. 4).
  • the order of the bait protein, the first self-assembled protein, and optionally the first fluorescent protein in the first fusion protein may be any.
  • the first fusion protein may be configured in the order of bait protein, the first fluorescent protein and the first self-assembled protein, or may be configured in the order of the first self-assembled protein, the first fluorescent protein and the bait protein.
  • the order of the photoinduced heterodimer forming protein, the first self-assembled protein, and optionally the first fluorescent protein in the second fusion protein may be any.
  • the second fusion protein may consist of a photoinduced heterodimer-forming protein, a first fluorescent protein, and a first self-assembled protein, and may form a first self-assembled protein, a first fluorescent protein, and a photoinduced heterodimer. It may also consist of proteins in order.
  • the order of the partner protein, the second fluorescent protein, and the second self-assembled protein may be in any order.
  • the N-terminus may be in the order of the partner protein, the second fluorescent protein and the second self-assembled protein, and may be in the order of the second self-assembled protein, the second fluorescent protein and the partner protein.
  • the target protein may be located at the N-terminus
  • the third fluorescent protein may be located at the N-terminus.
  • All of the fusion proteins may include a linker between the monomeric proteins constituting each of the fusion proteins.
  • a first polynucleotide encoding a first fusion protein comprising a first self-assembled protein and a polynucleotide encoding a bait protein operably linked to a promoter are operable to the first polynucleotide.
  • a first expression vector comprising a first gene construct comprising a multicloning site that can be linked to each other;
  • a second expression vector comprising a second gene construct in which a photoinduced heterodimer forming protein and a second polynucleotide encoding a second fusion protein comprising said first self-assembled protein are operably linked to a promoter;
  • a third polynucleotide encoding a third fusion protein comprising the photoinduced heterodimer forming protein and a heterologous protein forming a heterodimer, a second fluorescent protein, and a second self-assembled protein by light irradiation is operable in the captive motor.
  • a third expression vector comprising a third gene construct; And a fourth polynucleotide encoding a fourth fusion protein comprising a third fluorescent protein and a polynucleotide encoding a target protein and a polynucleotide encoding a target protein to be operably linked to the fourth polynucleotide.
  • a fourth expression vector comprising a fourth gene construct, wherein at least one of the first fusion protein and the second fusion protein comprises a first fluorescent protein, and the first fluorescent protein
  • the second fluorescent protein and the third fluorescent protein emit light of different wavelengths, and the first self-assembled protein and the second self-assembled protein do not interact with each other, and the first fluorescent protein or the third fluorescent protein does not interact with each other.
  • the kit for analysis of the interaction between proteins can be omitted.
  • the first to third fluorescent proteins are each independently a green fluorescent protein (GFP), a yellow fluorescent protein (YFP), a red fluorescent protein (red fluorescent protein) , RFP), cyan fluorescent protein (CFP), blue fluorescent protein (BFP), TagCFP, DsRed or tetracysteine fluorescent motif.
  • GFP green fluorescent protein
  • YFP yellow fluorescent protein
  • red fluorescent protein red fluorescent protein
  • RFP red fluorescent protein
  • CFP cyan fluorescent protein
  • BFP blue fluorescent protein
  • TagCFP DsRed or tetracysteine fluorescent motif
  • the first self-assembled protein and the second self-assembled protein are each independently ferritin (ferritin), viral capsid protein, ferritin-like protein, macentosome, calmodulin kinase II ⁇ (CaMKII ⁇ ) or DsRed
  • the viral capsid protein may be a cowpea chlorotic mottle virus (CCMV) capsid protein, a Norwalk virus capsid protein, an SV40 major capsid protein, or a papilloma virus capsid protein.
  • CCMV chlorotic mottle virus
  • the first self-assembled protein and the second self-assembled protein may be the same and may be different kinds.
  • the photoinduced heterodimer forming protein may be CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR.
  • the partner protein is a protein capable of forming a heterodimer by photoirradiation with the photoinduced heterodimer-forming protein, and may be CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY, or PHR. And CRY or PHR when the photoinduced heterodimer forming protein is CIB or CIBN, PIF when the photoinduced heterodimer forming protein is PhyB, and GIGANTEA when the photoinduced heterodimer forming protein is FKF1.
  • the photoinduced heterodimer forming protein When the photoinduced heterodimer forming protein is CRY or PHR, it may be CIB or CIBN, when the photoinduced heterodimer forming protein is PIF, it is PhyB, and when the photoinduced heterodimer forming protein is GIGANTEA, it is FKF1.
  • the PIF may be PIF3 or PIF6.
  • the promoter may be a eukaryotic promoter.
  • FIG. 4 is a schematic diagram schematically showing the principle of the protein-protein interaction analysis method using the photoinduced nanocluster formation according to an embodiment of the present invention.
  • the photoinduced nanocluster forms a heterodimer of the photoinduced heterodimer-forming protein by irradiation with light and a first nanoparticle including a photoinduced heterodimer-forming protein (eg, CIBN). It may be formed by photoinduced interactions between second nanoparticles comprising a partner protein (eg PHR).
  • a partner protein eg PHR
  • the first nanoparticle is formed by self-assembly of two fusion proteins (first fusion protein and second fusion protein) expressed by two gene constructs, respectively, wherein the first fusion protein and the second fusion protein Since the protein has a common self-assembled protein (1 st self-assembled protein, 1 st SAP), hetero-assembled nanoparticles are produced.
  • the first fusion protein and / or the second fusion protein include a first fluorescent protein.
  • the second nanoparticle is a second self-assembled protein (2 nd SAP) that does not interact with the first self-assembled protein, the photoinduced heterodimer-forming protein and a partner protein that forms a heterodimer by irradiation with light
  • the homo-assembled nanoparticles are formed by self-assembly of a third fusion protein comprising a.
  • the third fusion protein also includes a second fluorescent protein that emits light of a wavelength different from that of the first fluorescent protein to determine whether the protein is expressed and nanocluster formation.
  • the target protein to check whether the interaction with the bait protein is expressed in the form of a fusion protein with the first fluorescent protein and the third fluorescent protein that emits light of a different wavelength than the second fluorescent protein. If there is an interaction between the bait protein and the target protein, the position of the nanocluster and the target protein due to the interaction between the photoinduced heterodimer-forming protein and the partner protein are identical by the irradiation of light. do. If the target protein does not interact with the bait protein, the fluorescence representing the target protein will appear in a scattered form within the cytoplasm, unlike the fluorescence by the first nanoparticle and the fluorescence by the second nanoparticle. .
  • the nanoclusters may be formed by homogeneous interactions between the first nanoparticles.
  • the fluorescent patterns of the first nanoparticles and the second nanoparticles do not coincide. This may be distinguished from the nanoclusters formed between the first nanoparticles and the second nanoparticles.
  • CIBN shown in FIG. 4 means the N-terminus (1-170 aa) of the transcription factor bHLH63 protein of A. thaliana and the CIBN is Arabidopsis Cryptochrome 2 when irradiated with blue light of 488 nm. (Liu et al ., Science , 322 (5907): 1535-1539, 2009), which are known to interact with the PHR (photolyase homologous region, 1-488 aa), the N-terminus of Dimer forming proteins.
  • the photoinduced heterodimer-forming protein is denoted CIBN and the partner protein is denoted CRY2 or PHR.
  • PhyB As the photoinduced heterodimer-forming protein, PhyB, PIF3, PIF6, FKF1, GIGANTEA, etc. may be used in addition to CIB or CIBN.
  • PhyB is a phytochrome B protein of Arabidopsis, which is known to interact with phytochrome-interacting factor (PIF) upon red light irradiation (Castillon et al ., Trends Plant Sci ., 12 (11): 514-521 , 2007).
  • PPF1 phytochrome-interacting factor
  • FKF1 flavin-binding, kelch repat, F-box 1
  • FKF1 flavin-binding, kelch repat, F-box 1
  • is regulated by time is responsible for regulating flowering and is known to interact with GIGANTEA protein upon irradiation with blue light (Sawa et al . , Science.
  • GIGANTEA is known to be a nuclear protein involved in phytochrome signaling in Arabidopsis (Huq et al , Proc. Natl. Acad. Soc. USA , 97 (17): 9789-9794, 2000).
  • a first gene consensus in which a first polynucleotide encoding a first fusion protein comprising a photoinduced heterodimer forming protein, a first fluorescent protein, and a first self-assembled protein is operably linked to a promoter.
  • a first expression vector comprising a truck; A second polynucleotide encoding a second fusion protein comprising a photoinduced heterodimer-forming protein and a heterologous protein forming a heterodimer, a second fluorescent protein, and a bait protein by light irradiation; A second expression vector comprising a binary gene construct; And a third expression vector comprising a third gene construct, wherein the third polynucleotide encoding a third fusion protein comprising a target protein, a third fluorescent protein, and a second self-assembled protein is operably linked to a promoter.
  • the first fluorescent protein, the second fluorescent protein and the third fluorescent protein emit light of different wavelengths, and the first self-assembled protein and the second self-assembled protein do not interact with each other. And when either one of the first fluorescent protein and the third fluorescent protein is DsRed, the first self-assembled protein or the second self-assembled protein may be omitted from the fusion protein including DsRed.
  • An assay kit is provided (FIG. 5).
  • a first gene consensus in which a first polynucleotide encoding a first fusion protein comprising a photoinduced heterodimer forming protein, a first fluorescent protein, and a first self-assembled protein is operably linked to a promoter.
  • a first expression vector comprising a truck; Encoding a second fusion protein comprising the photoinduced heterodimer forming protein and a heterodimer to form a heterodimer by light irradiation, and a second polynucleotide and a bait protein operably linked to a promoter.
  • a second expression vector comprising a second gene construct comprising a multicloning site to enable a polynucleotide to be operably linked to the second polynucleotide; And a third fusion protein comprising a third fluorescent protein and a second self-assembled protein, wherein the third polynucleotide operably linked to the promoter and the polynucleotide encoding the target protein are operable to the third polynucleotide.
  • a third expression vector comprising a third gene construct comprising multiple cloning sites that can be linked, provided that the first fluorescent protein, the second fluorescent protein and the third fluorescent protein have different wavelengths; Emits light, and the first self-assembled protein and the second self-assembled protein do not interact with each other, and when any one of the first fluorescent protein or the third fluorescent protein is DsRed, the DsRed is included.
  • Analysis of interaction between proteins in which the first self-assembled protein or the second self-assembled protein can be omitted in the fusion protein A kit is provided.
  • the first to third fluorescent proteins are each independently a green fluorescent protein (GFP), a yellow fluorescent protein (YFP), a red fluorescent protein (red fluorescent protein) , RFP), cyan fluorescent protein CFP, blue fluorescent protein (BFP), enhanced cyan fluorescent protein (ECFP), TagCFP, DsRed, or tetracysteine fluorescent motif May be).
  • GFP green fluorescent protein
  • YFP yellow fluorescent protein
  • red fluorescent protein red fluorescent protein
  • RFP red fluorescent protein
  • cyan fluorescent protein CFP blue fluorescent protein
  • BFP blue fluorescent protein
  • ECFP enhanced cyan fluorescent protein
  • TagCFP DsRed
  • tetracysteine fluorescent motif May be
  • the first self-assembled protein and the second self-assembled protein are each independently ferritin (ferritin), viral capsid protein, ferritin-like protein, macentosome, calmodulin kinase II ⁇ (CaMKII ⁇ ) or DsRed
  • the viral capsid protein may be a cowpea chlorotic mottle virus (CCMV) capsid protein, a Norwalk virus capsid protein, an SV40 major capsid protein, or a papilloma virus capsid protein.
  • CCMV chlorotic mottle virus
  • the first self-assembled protein and the second self-assembled protein may be the same and may be different kinds.
  • the photoinduced heterodimer forming protein may be CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR.
  • the partner protein is a protein capable of forming a heterodimer by photoirradiation with the photoinduced heterodimer-forming protein, and may be CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY, or PHR. And CRY or PHR when the photoinduced heterodimer forming protein is CIB or CIBN, PIF when the photoinduced heterodimer forming protein is PhyB, and GIGANTEA when the photoinduced heterodimer forming protein is FKF1.
  • the photoinduced heterodimer forming protein When the photoinduced heterodimer forming protein is CRY or PHR, it may be CIB or CIBN, when the photoinduced heterodimer forming protein is PIF, it is PhyB, and when the photoinduced heterodimer forming protein is GIGANTEA, it is FKF1.
  • the PIF may be PIF3 or PIF6.
  • the promoter may be a eukaryotic promoter.
  • FIG. 5 is a schematic diagram schematically showing the principle of the protein-to-protein interaction analysis method using the photoinduced nanocluster formation according to another embodiment of the present invention.
  • the nanoclusters are not directly formed between the first nanoparticles and the second nanoparticles, but are indirectly formed by a cluster formation linker.
  • the first nanoparticles are formed by self-assembly of a first fusion protein including a photoinduced heterodimer-forming protein, a first fluorescent protein, and a first self-assembled protein (1 st SAP).
  • the second nanoparticle is formed by self-assembly of a third fusion protein comprising a target protein, a third fluorescent protein that emits light of a wavelength different from the first fluorescent protein, and a second self-assembled protein (2 nd SAP).
  • a third fusion protein comprising a target protein, a third fluorescent protein that emits light of a wavelength different from the first fluorescent protein, and a second self-assembled protein (2 nd SAP).
  • the photoinduced heterodimer-forming protein may be formed by a specific wavelength.
  • the paired protein forms a heterodimer, and interaction occurs between the bait protein and the target protein presented on the surface of the second nanoparticle, a nanocluster formed through the second fusion protein is formed, and each fusion protein is formed.
  • nanoclusters are formed and whether it is false positive or false negative through a unique fluorescent pattern. If no interaction occurs between the bait protein and the target protein, no nanoclusters are formed at all. On the contrary, when the nanoclusters are formed by the formation of photoinduced heterodimers, bait protein E, or homologous dimers of the target protein, the fluorescent patterns according to the fluorescent proteins are different, so that false positives and false negatives can be distinguished.
  • the first expression vector comprising a first gene construct operably linked to a promoter a first polynucleotide encoding a first fusion protein comprising a bait protein and self-assembled protein;
  • a second expression vector comprising a second gene construct operably linked to a promoter by a photoinduced heterodimer forming protein and a second polynucleotide encoding a second fusion protein comprising said self-assembled protein; At least two repeating of the photoinduced heterodimer-forming protein and the heterologous protein forming the heterodimer by light irradiation, and the third polynucleotide encoding the third fusion protein comprising the second fluorescent protein operates on the poromotor
  • a third expression vector comprising a third gene construct possibly connected;
  • a fourth expression vector comprising a fourth gene construct, wherein the fourth polynucleotide encoding the third fusion protein comprising the target protein and the third fluorescent protein is operably linked to a promoter.
  • At least one or more of the fusion protein or the second fusion protein comprises a first fluorescent protein, the first fluorescent protein, the second fluorescent protein and the third fluorescent protein emit light of different wavelengths,
  • the first fluorescent protein is DsRed
  • the self-assembled protein may be omitted from the first fusion protein or the second fusion protein.
  • a multicloning site in which a first polynucleotide encoding a first fusion protein comprising a self-assembled protein and a polynucleotide encoding a bait protein can be operably linked to the first polynucleotide.
  • a first expression vector comprising a first gene construct comprising;
  • a second expression vector comprising a second gene construct operably linked to a promoter by a photoinduced heterodimer forming protein and a second polynucleotide encoding a second fusion protein comprising said self-assembled protein; At least two repeating of the photoinduced heterodimer-forming protein and the heterologous protein forming the heterodimer by light irradiation, and the third polynucleotide encoding the third fusion protein comprising the second fluorescent protein operates on the poromotor
  • a third expression vector comprising a third gene construct possibly connected;
  • a fourth polynucleotide encoding a third fusion protein comprising a third fluorescent protein and a polynucleotide encoding a target protein and a polynucleotide encoding a target protein operably linked to the fourth polynucleotide.
  • a fourth expression vector comprising a fourth gene construct, wherein at least one of the first fusion protein and the second fusion protein comprises a first fluorescent protein, and the first fluorescent protein
  • the second fluorescent protein and the third fluorescent protein emit light of different wavelengths, and when the first fluorescent protein is DsRed, the self-assembled protein is omitted from the first fusion protein or the second fusion protein.
  • a kit for analyzing the interprotein interactions is provided.
  • the first to third fluorescent proteins are each independently a green fluorescent protein (GFP), a yellow fluorescent protein (YFP), a red fluorescent protein (red fluorescent protein) , RFP), cyan fluorescent protein CFP, blue fluorescent protein (BFP), enhanced cyan fluorescent protein (ECFP), TagCFP, DsRed, or tetracysteine fluorescent motif May be).
  • GFP green fluorescent protein
  • YFP yellow fluorescent protein
  • red fluorescent protein red fluorescent protein
  • RFP red fluorescent protein
  • cyan fluorescent protein CFP blue fluorescent protein
  • BFP blue fluorescent protein
  • ECFP enhanced cyan fluorescent protein
  • TagCFP DsRed
  • tetracysteine fluorescent motif May be
  • the photoinduced heterodimer forming protein may be CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR.
  • the partner protein is a protein capable of forming a heterodimer by photoirradiation with the photoinduced heterodimer-forming protein, and may be CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY, or PHR. And CRY or PHR when the photoinduced heterodimer forming protein is CIB or CIBN, PIF when the photoinduced heterodimer forming protein is PhyB, and GIGANTEA when the photoinduced heterodimer forming protein is FKF1.
  • the photoinduced heterodimer forming protein When the photoinduced heterodimer forming protein is CRY or PHR, it may be CIB or CIBN, when the photoinduced heterodimer forming protein is PIF, it is PhyB, and when the photoinduced heterodimer forming protein is GIGANTEA, it is FKF1.
  • the self-assembled protein may be ferritin (ferritin), viral capsid protein, ferritin-like protein, macentosome, calmodulin kinase II ⁇ (CaMKII ⁇ ) or DsRed, wherein the viral capsid protein is CCMV ( cowpea chlorotic mottle virus capsid protein, Norwalk virus capsid protein, SV40 major capsid protein, or papilloma virus capsid protein.
  • CCMV cowpea chlorotic mottle virus capsid protein, Norwalk virus capsid protein, SV40 major capsid protein, or papilloma virus capsid protein.
  • the promoter may be a eukaryotic promoter.
  • FIG. 6 is a schematic diagram schematically showing the principle of the protein-to-protein interaction analysis method using the photoinduced nanocluster formation according to another embodiment of the present invention.
  • a single nanoparticle is used.
  • the nanoparticles form hetero-assembled nanoparticles of a first fusion protein and a decoy protein including a photoinduced heterodimer-forming protein and a self-assembled protein and a second fusion protein including the self-assembled protein.
  • at least one of the first fusion protein or the second fusion protein includes a first fluorescent protein in order to confirm the expression of proteins and the formation of nano clusters.
  • Clustering of the nanoparticles is accomplished by photoinduced interactions between the partner protein of the third fusion protein, including the partner protein and the second fluorescent protein, and the photoinduced heterodimer forming protein.
  • the third fusion protein may comprise at least two or more repeat proteins, and in the case where a protein that forms a homodimer such as PHR is used as a pair protein, even if the pair protein exists in a single copy, the third fusion protein may be By forming a homodimer, nano clusters can be formed. Whether or not the interaction between the bait protein and the target protein is confirmed whether the interaction between the nano-particles and the fourth fusion protein, including the target protein and the third fluorescent protein expressed separately from the first to third fusion proteins Can be analyzed.
  • the nano-clusters are always formed by light irradiation. If there is an interaction between the bait protein and the target protein, the fluorescent pattern of the fourth fusion protein including the target protein is the same as the fluorescent pattern that appears upon the formation of the nano-cluster. Comes out. On the contrary, when there is no interaction between the bait protein and the target protein, the fluorescence pattern of the fourth fusion protein appears to be dispersed at the position where the fourth fusion protein is expressed, unlike the fluorescence pattern according to the nanocluster formation.
  • a first gene construct is operably linked to a promoter a first polynucleotide encoding a first fusion protein comprising a photoinduced heterodimer forming protein, a first fluorescent protein and a self-assembled protein
  • a first expression vector comprising a;
  • a second polynucleotide encoding a second fusion protein comprising a partner protein, a second fluorescent protein, and a bait protein, which forms a heterodimer with the photoinduced heterodimer-forming protein by light irradiation, and forms a homodimer by itself.
  • a second expression vector comprising a second gene construct operably connected to the second expression vector; And a third expression vector comprising a third gene construct, wherein the third polynucleotide encoding a third fusion protein comprising a target protein and a third fluorescent protein is operably linked to a promoter.
  • the first fluorescent protein, the second fluorescent protein and the third fluorescent protein emit light of different wavelengths, and when the first fluorescent protein is DsRed, the self-assembled protein may be omitted from the first fusion protein.
  • a kit for analyzing protein-protein interactions is provided (FIG. 7).
  • a first gene construct is operably linked to a promoter a first polynucleotide encoding a first fusion protein comprising a photoinduced heterodimer forming protein, a first fluorescent protein and a self-assembled protein
  • a first expression vector comprising a
  • a second poly that forms a heterodimer with the photoinduced heterodimer forming protein by light irradiation, encodes a second fusion protein comprising a paired protein, a second fluorescent protein that forms a homodimer by itself, and is operably linked to a promoter
  • a second expression vector comprising a second gene construct comprising a multicloning site into which a nucleotide and a polynucleotide encoding a bait protein can be operably linked to said second polynucleotide;
  • a third polycloning site encoding a third fusion protein comprising a third fluorescent protein and a polynucleotide encoding a target protein and
  • a third expression vector comprising a third gene construct, wherein the first fluorescent protein, the second fluorescent protein, and the third fluorescent protein emit light of different wavelengths,
  • the kit for protein interaction analysis is provided, in which the self-assembled protein can be omitted from the first fusion protein.
  • the photoinduced heterodimer forming protein may be CIB or CIBN.
  • the paired protein may form a heterodimer by photoirradiation with the photoinduced heterodimer-forming protein and may form CRY or PHR regardless of photoinduction.
  • the first to third fluorescent proteins are each independently a green fluorescent protein (GFP), a yellow fluorescent protein (YFP), a red fluorescent protein (red fluorescent protein) , RFP), cyan fluorescent protein CFP, blue fluorescent protein (BFP), enhanced cyan fluorescent protein (ECFP), TagCFP, DsRed, or tetracysteine fluorescent motif May be).
  • GFP green fluorescent protein
  • YFP yellow fluorescent protein
  • red fluorescent protein red fluorescent protein
  • RFP red fluorescent protein
  • cyan fluorescent protein CFP blue fluorescent protein
  • BFP blue fluorescent protein
  • ECFP enhanced cyan fluorescent protein
  • TagCFP DsRed
  • tetracysteine fluorescent motif May be
  • the self-assembled protein may be ferritin (ferritin), viral capsid protein, ferritin-like protein, macentosome, calmodulin kinase II ⁇ (CaMKII ⁇ ) or DsRed, wherein the viral capsid protein is CCMV ( cowpea chlorotic mottle virus capsid protein, Norwalk virus capsid protein, SV40 major capsid protein, or papilloma virus capsid protein.
  • CCMV cowpea chlorotic mottle virus capsid protein, Norwalk virus capsid protein, SV40 major capsid protein, or papilloma virus capsid protein.
  • the promoter may be a eukaryotic promoter.
  • FIG. 7 is a schematic diagram schematically showing the principle of the interaction method between proteins using the photoinduced nanocluster formation according to another embodiment of the present invention.
  • a single nanoparticle is used for this example.
  • the nanoparticles are formed by self-assembly of a first fusion protein comprising a photoinduced heterodimer forming protein, a first fluorescent protein and a self-assembled protein.
  • the nanoparticles form a nanocluster by the interaction between the photoinduced heterodimer-forming protein presented on the surface of the nanoparticle and a partner protein of a second fusion protein including a partner protein, a second fluorescent protein, and a bait protein.
  • the partner protein may be a protein that forms a homozygous dimer irrespective of photoinduction, and such a protein may be CRY2 or PHR, which is an N-terminal domain thereof.
  • a partner protein After homozygous formation of a partner protein, two or more nanoparticles interact with each other by interaction with the nanoparticles to form nanoclusters.
  • the interaction between the bait protein and the target protein can be confirmed through the pattern of fluorescence represented by the third fusion protein in which the third fluorescent protein is linked to the target protein as in the other examples.
  • a polynucleotide encoding a first fusion protein comprising a self-assembled protein, a first fluorescent protein and a photoinduced heterodimer forming protein is operably linked to a promoter;
  • the first to third fluorescent proteins emit light of different wavelengths
  • the light-induced heterodimer-forming protein is a protein capable of forming homodimers irrespective of light irradiation, and the self-assembled protein
  • a kit for analyzing the interaction between proteins is provided, in which the first fluorescent protein can be omitted from the first fusion protein (FIG. 8).
  • a first expression vector operably linked to a promoter a first polynucleotide encoding a first fusion protein comprising a self-assembled protein, a first fluorescent protein and a photoinduced heterodimer forming protein;
  • a second polynucleotide encoding a second fusion protein comprising a partner protein and a second fluorescent protein that interacts with the photoinduced heterodimer forming protein by light irradiation is operably linked to a promoter and encodes a bait protein.
  • a second expression vector comprising multiple cloning sites to which a polynucleotide can be operably linked to said second polynucleotide; And a third polynucleotide encoding a third fusion protein comprising a third fluorescent protein is operably linked to a promoter, and the polynucleotide encoding a target protein to be confirmed whether to interact with the bait protein is the third polynucleotide.
  • a third expression vector comprising multiple cloning sites that can be operably linked thereto, wherein the first to third fluorescent proteins emit light of different wavelengths, and the light-induced heterodimer-forming protein Is a protein capable of forming homodimers irrespective of light irradiation, and when the self-assembled protein is DsRed, a kit for protein interaction analysis is provided, in which the first fluorescent protein can be omitted from the first fusion protein. .
  • the first to third fluorescent proteins are each independently a green fluorescent protein (GFP), a yellow fluorescent protein (YFP), a red fluorescent protein (red fluorescent protein) , RFP), cyan fluorescent protein CFP, blue fluorescent protein (BFP), enhanced cyan fluorescent protein (ECFP), TagCFP, DsRed, or tetracysteine fluorescent motif May be).
  • GFP green fluorescent protein
  • YFP yellow fluorescent protein
  • red fluorescent protein red fluorescent protein
  • RFP red fluorescent protein
  • cyan fluorescent protein CFP blue fluorescent protein
  • BFP blue fluorescent protein
  • ECFP enhanced cyan fluorescent protein
  • TagCFP DsRed
  • tetracysteine fluorescent motif May be
  • the photoinduced heterodimer forming protein may be CRY or PHR.
  • the partner protein is a protein capable of forming a heterodimer by photoirradiation with the photoinduced heterodimer-forming protein, and may be CIB or CIBN.
  • the self-assembled protein may be ferritin (ferritin), viral capsid protein, ferritin-like protein, macentosome, calmodulin kinase II ⁇ (CaMKII ⁇ ) or DsRed, wherein the viral capsid protein is CCMV ( cowpea chlorotic mottle virus capsid protein, Norwalk virus capsid protein, SV40 major capsid protein, or papilloma virus capsid protein.
  • CCMV cowpea chlorotic mottle virus capsid protein, Norwalk virus capsid protein, SV40 major capsid protein, or papilloma virus capsid protein.
  • the promoter may be a eukaryotic promoter.
  • the present invention uses a photoinduced heterodimer-forming protein capable of forming a heterodimer with a partner protein by light irradiation, as well as a homozygous dimer regardless of light irradiation. It can be implemented using a single nanoparticle comprising a heterodimeric forming protein and a self-assembled protein.
  • a first expression vector capable of expressing a first fusion protein composed of a self-assembled protein, a first fluorescent protein and a photoinduced heterodimer-forming protein A second expression vector capable of expressing a second fusion protein composed of a partner protein, a second fluorescent protein, and a bait protein interacting with the photoinduced heterodimeric forming protein; It can be implemented by preparing a third expression vector capable of expressing the third fusion protein consisting of the target protein and the third fluorescent protein to be confirmed whether the interaction with the bait protein.
  • CRY or its N-terminal domain, PHR can be used, and as a partner protein thereof, CIB or its N-terminal CIBN can be used.
  • CIB or its N-terminal CIBN can be used.
  • the expression vectors are co-transduced into cells, light-induced nanoclusters are formed when irradiated with light having a wavelength that induces heterodimer formation between the photoinduced heterodimer-forming protein and the partner protein, in which case the first fluorescent protein
  • the fluorescence pattern by the second fluorescent protein is the same.
  • the fluorescence of the first fluorescent protein appears in the form of a number of strong points at the place where the fusion protein is expressed, and the fluorescence of the second fluorescent protein is also in the shape of the strong point at the same position. Will appear.
  • the fluorescence by the third fluorescent protein linked to the target protein is different depending on whether or not the interaction between the bait protein and the target protein.
  • the fluorescence by the third fluorescent protein also appears in the same position at the same position as the fluorescence by the first fluorescent protein and the second fluorescent protein, the interaction is If this does not occur, the fluorescence caused by the third fluorescent protein will appear as fluorescence dispersed in the expression site of the third fusion protein, unchanged before light irradiation.
  • the protein-protein interaction analysis method may be used to search for substances that promote the interaction between proteins, or substances that promote the interaction between specific proteins or substances that inhibit the interaction between specific proteins. Life phenomena often occur as a result of interactions between specific proteins, for example between receptors and ligands that specifically bind to them, and can develop pathologies when these proteins interact abnormally. Therefore, a substance that promotes or inhibits interaction between specific proteins is likely to be a therapeutic agent for diseases related to the interaction between the proteins.
  • the kits and methods of the present invention can be used very efficiently as a cell level screening method for disease therapeutic candidates.
  • the inventors of the present invention expressed the fusion protein linking the binding domain (AD) of CIBN and CaMKII ⁇ , the fusion protein linked to PHR and Hras, and RBD raf1 at the same time in the cell, and then induced interaction between CIBN and PHR. After irradiating blue light of the wavelength, the interaction between the Hras and RBD raf1 could be confirmed by analyzing the fluorescent pattern (see FIG. 18).
  • a fusion protein comprising a self-assembled protein and a photoinduced heterodimer forming protein, a bait that interacts with a target protein and a partner protein that forms a heterodimer by interacting with the photoinduced heterodimer forming protein
  • a protein is provided with a method for reversible inhibition of target protein function using photoinduced nanocluster formation that is fused to the self-assembled protein or the partner protein.
  • the self-assembled protein may be ferritin, viral capsid protein, ferritin-like protein, macentosome, calmodulin kinase II ⁇ (CaMKII ⁇ ) or DsRed, and the viral capsid protein is cowpea chlorotic mottle virus capsid protein, Norwalk virus capsid protein, SV40 major capsid protein, or papilloma virus capsid protein.
  • the fluorescent protein may be a green fluorescent protein (GFP), a yellow fluorescent protein (YFP), a red fluorescent protein (RFP), an orange fluorescent protein (OFP) , Cyan fluorescent protein (CFP), blue fluorescent protein (BFP), far-red fluorescent protein or tetracysteine motif (tetracystein motif).
  • GFP green fluorescent protein
  • YFP yellow fluorescent protein
  • RFP red fluorescent protein
  • OFP orange fluorescent protein
  • CFP Cyan fluorescent protein
  • BFP blue fluorescent protein
  • far-red fluorescent protein or tetracysteine motif tetracystein motif
  • the green fluorescent protein may be EGFP, Emerald, Superfolder, GFP, Azami Green, TagGFP, TurboGFP, ZsGreen or T-Sapphire
  • the yellow fluorescent protein may be EYFP, Topaz, Venus, mCitrine, Ypet, TagYFP, PhiYFP, ZsYellow1 or mBanana
  • the red fluorescent protein may be mRuby, mApple, mStrawberry, AsRed2 or mRFP
  • the orange fluorescent protein is Kusabira Orange, Kusabira Orange2, mOrange, mOrange2, dTomato, dTomato-Tandem, TagRFP, TagRFP- T, DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRed-Monomer or mTangerine
  • the cyan fluorescent protein may be ECFP, mECFP, mCerulean, CyPet, AmCyan1, Midori-Ishi Cyan
  • the photoinduced heterodimer forming protein may be CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR.
  • the partner protein is a protein capable of forming a heterodimer by photoirradiation with the photoinduced heterodimer forming protein, and may be CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR, CRY or PHR when the photoinduced heterodimer forming protein is CIB or CIBN, PIF when the photoinduced heterodimer forming protein is PhyB, and GIGANTEA when the photoinduced heterodimer forming protein is FKF1, and vice versa.
  • heterodimer forming protein When the heterodimer forming protein is CRY or PHR, it may be CIB or CIBN, when the photoinducing heterodimer forming protein is PIF, it is PhyB, and when the photoinducing heterodimer forming protein is GIGANTEA, it is FKF1.
  • the PIF may be PIF3 or PIF6.
  • the photoinduced heterodimer-forming protein or the partner protein may form a homodimer regardless of light irradiation.
  • the photoinduced heterodimer-forming protein or the partner protein capable of forming homodimers irrespective of light irradiation may be CRY or PHR.
  • the first fusion protein comprising a first self-assembled protein and a photoinduced heterodimer-forming protein, the second self-assembled protein and the photoinduced heterodimer-forming protein and heterodimers are formed during light irradiation
  • a protein is provided with a method for reversible inhibition of target protein function using photoinduced nanocluster formation that is expressed by fusion to the first self-assembled protein or the second self-assembled protein.
  • the first self-assembled protein and the second self-assembled protein may each independently be ferritin, viral capsid protein, ferritin-like protein, macentosome, calmodulin kinase II ⁇ (CaMKII ⁇ ) or DsRed.
  • the viral capsid protein may be a cowpea chlorotic mottle virus (CCMV) capsid protein, a Norwalk virus capsid protein, an SV40 major capsid protein, or a papilloma virus capsid protein.
  • CCMV chlorotic mottle virus
  • the first self-assembled protein and the second self-assembled protein may be the same and may be different kinds.
  • the fusion protein may be connected to a fluorescent protein for confirming the formation of nanoclusters.
  • the fluorescent protein may be a green fluorescent protein (GFP), a yellow fluorescent protein (YFP), a red fluorescent protein (RFP), an orange fluorescent protein (OFP) , Cyan fluorescent protein (CFP), blue fluorescent protein (BFP), far-red fluorescent protein or tetracysteine motif (tetracystein motif).
  • the photoinduced heterodimer forming protein may be CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR.
  • the partner protein is a protein capable of forming a heterodimer by photoirradiation with the photoinduced heterodimer forming protein, and may be CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR, CRY or PHR when the photoinduced heterodimer forming protein is CIB or CIBN, PIF when the photoinduced heterodimer forming protein is PhyB, and GIGANTEA when the photoinduced heterodimer forming protein is FKF1, and vice versa.
  • heterodimer forming protein When the heterodimer forming protein is CRY or PHR, it may be CIB or CIBN, when the photoinducing heterodimer forming protein is PIF, it is PhyB, and when the photoinducing heterodimer forming protein is GIGANTEA, it is FKF1.
  • the PIF may be PIF3 or PIF6.
  • the photoinduced heterodimer-forming protein or the partner protein may form a homodimer regardless of light irradiation.
  • the photoinduced heterodimer-forming protein or the partner protein capable of forming homodimers irrespective of light irradiation may be CRY or PHR.
  • a first expression comprising a first gene construct in which a first polynucleotide encoding a fusion protein comprising a self-assembled protein and a photoinduced heterodimer forming protein is operably linked to a promoter.
  • a third polynucleotide encoding a bait protein that interacts with a third expression vector comprising a third gene construct operably linked to a promoter, the bait protein comprising the self-assembled protein or the partner protein Target stage using photoinduced nanocluster formation fused to For the reversible inhibition of the quality function kit is provided.
  • the self-assembled protein may be ferritin, viral capsid protein, ferritin-like protein, macentosome, calmodulin kinase II ⁇ (CaMKII ⁇ ) or DsRed, and the viral capsid protein is cowpea chlorotic mottle virus capsid protein, Norwalk virus capsid protein, SV40 major capsid protein, or papilloma virus capsid protein.
  • the fusion protein, the partner protein and the bait protein may be linked to a fluorescent protein for confirming the formation of nanoclusters.
  • the fluorescent protein may be a green fluorescent protein (GFP), a yellow fluorescent protein (YFP), a red fluorescent protein (RFP), an orange fluorescent protein (OFP) , Cyan fluorescent protein (CFP), blue fluorescent protein (BFP), far-red fluorescent protein or tetracysteine motif (tetracystein motif).
  • the green fluorescent protein may be enhanced green fluorescent protein (EGFP), Emerald, Superfolder, GFP, Azami Green, TagGFP, TurboGFP, ZsGreen or T-Sapphire
  • the yellow fluorescent protein may be an enhanced yellow fluorescent protein (EYFP), Topaz, Venus, mCitrine, Ypet, TagYFP, PhiYFP, ZsYellow1 or mBanana
  • the red fluorescent protein may be mRuby, mApple, mStrawberry, AsRed2 or mRFP
  • the orange fluorescent protein is Kusabira Orange, Kusabira Orange2, mOrange, mOrange2, dTomato, dTomato-Tandem
  • TagRFP, TagRFP-T DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRed-Monomer or mTangerine
  • the cyan fluorescent protein is ECFP (enhanced cyan fluorescent protein), mECFP, mCerulean
  • the photoinduced heterodimer forming protein may be CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR.
  • the partner protein is a protein capable of forming a heterodimer by photoirradiation with the photoinduced heterodimer forming protein, and may be CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR.
  • heterodimer forming protein When the heterodimer forming protein is CRY or PHR, it may be CIB or CIBN, when the photoinducing heterodimer forming protein is PIF, it is PhyB, and when the photoinducing heterodimer forming protein is GIGANTEA, it is FKF1.
  • the PIF may be PIF3 or PIF6.
  • the photoinduced heterodimer forming protein or the paired protein may form a homodimer regardless of light irradiation.
  • the photoinduced heterodimer-forming protein or the partner protein capable of forming homodimers irrespective of light irradiation may be CRY or PHR.
  • a first polynucleotide encoding a first fusion protein comprising a first self-assembled protein and a photoinduced heterodimer forming protein comprises a first gene construct operably linked to a promoter.
  • a second polynucleotide encoding a second fusion protein comprising a first expression vector, a second self-assembled protein, and a partner protein that forms a heterodimer and the photoinduced heterodimer-forming protein upon irradiation with the promoter.
  • a second cloning site comprising a second expression vector comprising a linked second gene construct, and a third polynucleotide encoding a bait protein that interacts with the target protein, and a multiple cloning site to which the promoter is operably linked
  • a third expression vector comprising a construct, wherein said bait protein comprises said first party
  • the assembly protein or a second kit for reversible inhibition of the target protein function is also a mineral oil which is fused to a self-assembling protein expression using the nanoclusters formed are provided.
  • the first self-assembled protein and the second self-assembled protein may be independently ferritin, viral capsid protein, ferritin-like protein, macentosome, calmodulin kinase II ⁇ (CaMKII ⁇ ) or DsRed.
  • the viral capsid protein may be a cowpea chlorotic mottle virus (CCMV) capsid protein, a Norwalk virus capsid protein, an SV40 major capsid protein, or a papilloma virus capsid protein.
  • CCMV chlorotic mottle virus
  • the fusion protein, the partner protein and the bait protein may be linked to a fluorescent protein for confirming the formation of nanoclusters.
  • the fluorescent protein may be a green fluorescent protein (GFP), a yellow fluorescent protein (YFP), a red fluorescent protein (RFP), an orange fluorescent protein (OFP) , Cyan fluorescent protein (CFP), blue fluorescent protein (BFP), far-red fluorescent protein or tetracysteine motif (tetracystein motif).
  • the green fluorescent protein may be enhanced green fluorescent protein (EGFP), Emerald, Superfolder, GFP, Azami Green, TagGFP, TurboGFP, ZsGreen or T-Sapphire
  • the yellow fluorescent protein may be an enhanced yellow fluorescent protein (EYFP), Topaz, Venus, mCitrine, Ypet, TagYFP, PhiYFP, ZsYellow1 or mBanana
  • the red fluorescent protein may be mRuby, mApple, mStrawberry, AsRed2 or mRFP
  • the orange fluorescent protein is Kusabira Orange, Kusabira Orange2, mOrange, mOrange2, dTomato, dTomato-Tandem
  • TagRFP, TagRFP-T DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRed-Monomer or mTangerine
  • the cyan fluorescent protein is ECFP (enhanced cyan fluorescent protein), mECFP, mCerulean
  • the photoinduced heterodimer forming protein may be CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR.
  • the partner protein is a protein capable of forming a heterodimer by photoirradiation with the photoinduced heterodimer forming protein, and may be CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR.
  • heterodimer forming protein When the heterodimer forming protein is CRY or PHR, it may be CIB or CIBN, when the photoinducing heterodimer forming protein is PIF, it is PhyB, and when the photoinducing heterodimer forming protein is GIGANTEA, it is FKF1.
  • the PIF may be PIF3 or PIF6.
  • the photoinduced heterodimer forming protein or the paired protein may form a homodimer regardless of light irradiation.
  • the photoinduced heterodimer-forming protein or the partner protein capable of forming homodimers irrespective of light irradiation may be CRY or PHR.
  • a first expression comprising a first gene construct in which a first polynucleotide encoding a fusion protein comprising a self-assembled protein and a photoinduced heterodimer forming protein is operably linked to a promoter.
  • Mineral oil, which is expressed is also provided a kit for the reversible inhibition of the target protein using functional nanoclusters formed.
  • the self-assembled protein may be ferritin, viral capsid protein, ferritin-like protein, macentosome, calmodulin kinase II ⁇ (CaMKII ⁇ ) or DsRed, and the viral capsid protein is cowpea chlorotic mottle virus capsid protein, Norwalk virus capsid protein, SV40 major capsid protein, or papilloma virus capsid protein.
  • the fusion protein, the partner protein and the bait protein may be linked to a fluorescent protein for confirming the formation of nanoclusters.
  • the fluorescent protein may be a green fluorescent protein (GFP), a yellow fluorescent protein (YFP), a red fluorescent protein (RFP), an orange fluorescent protein (OFP) , Cyan fluorescent protein (CFP), blue fluorescent protein (BFP), far-red fluorescent protein or tetracysteine motif (tetracystein motif).
  • the green fluorescent protein may be enhanced green fluorescent protein (EGFP), Emerald, Superfolder, GFP, Azami Green, TagGFP, TurboGFP, ZsGreen or T-Sapphire
  • the yellow fluorescent protein may be an enhanced yellow fluorescent protein (EYFP), Topaz, Venus, mCitrine, Ypet, TagYFP, PhiYFP, ZsYellow1 or mBanana
  • the red fluorescent protein may be mRuby, mApple, mStrawberry, AsRed2 or mRFP
  • the orange fluorescent protein is Kusabira Orange, Kusabira Orange2, mOrange, mOrange2, dTomato, dTomato-Tandem
  • TagRFP, TagRFP-T DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRed-Monomer or mTangerine
  • the cyan fluorescent protein is ECFP (enhanced cyan fluorescent protein), mECFP, mCerulean
  • the photoinduced heterodimer forming protein may be CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR.
  • the partner protein is a protein capable of forming a heterodimer by photoirradiation with the photoinduced heterodimer forming protein, and may be CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR.
  • heterodimer forming protein When the heterodimer forming protein is CRY or PHR, it may be CIB or CIBN, when the photoinducing heterodimer forming protein is PIF, it is PhyB, and when the photoinducing heterodimer forming protein is GIGANTEA, it is FKF1.
  • the PIF may be PIF3 or PIF6.
  • the photoinduced heterodimer forming protein or the paired protein may form a homodimer regardless of light irradiation.
  • the photoinduced heterodimer-forming protein or the partner protein capable of forming homodimers irrespective of light irradiation may be CRY or PHR.
  • a first polynucleotide encoding a first fusion protein comprising a first self-assembled protein and a photoinduced heterodimer forming protein comprises a first gene construct operably linked to a promoter.
  • a second polynucleotide encoding a second fusion protein comprising a first expression vector, a second self-assembled protein, and a partner protein that forms a heterodimer and the photoinduced heterodimer-forming protein upon irradiation with the promoter.
  • a second expression vector comprising a linked second gene construct, and a third expression comprising a third gene construct operably linked to a promoter, the third polynucleotide encoding a bait protein interacting with the target protein A vector, wherein the bait protein is added to the first self-assembled protein or the second self-assembled protein Mineral oil that is the sum expression is also provided a kit for the reversible inhibition of the target protein function using a nano-cluster formation.
  • the first self-assembled protein and the second self-assembled protein may be independently ferritin, viral capsid protein, ferritin-like protein, macentosome, calmodulin kinase II ⁇ (CaMKII ⁇ ) or DsRed.
  • the viral capsid protein may be a cowpea chlorotic mottle virus (CCMV) capsid protein, a Norwalk virus capsid protein, an SV40 major capsid protein, or a papilloma virus capsid protein.
  • CCMV chlorotic mottle virus
  • the fusion protein, the partner protein and the bait protein may be linked to a fluorescent protein for confirming the formation of nanoclusters.
  • the fluorescent protein may be a green fluorescent protein (GFP), a yellow fluorescent protein (YFP), a red fluorescent protein (RFP), an orange fluorescent protein (OFP) , Cyan fluorescent protein (CFP), blue fluorescent protein (BFP), far-red fluorescent protein or tetracysteine motif (tetracystein motif).
  • the green fluorescent protein may be enhanced green fluorescent protein (EGFP), Emerald, Superfolder, GFP, Azami Green, TagGFP, TurboGFP, ZsGreen or T-Sapphire
  • the yellow fluorescent protein may be an enhanced yellow fluorescent protein (EYFP), Topaz, Venus, mCitrine, Ypet, TagYFP, PhiYFP, ZsYellow1 or mBanana
  • the red fluorescent protein may be mRuby, mApple, mStrawberry, AsRed2 or mRFP
  • the orange fluorescent protein is Kusabira Orange, Kusabira Orange2, mOrange, mOrange2, dTomato, dTomato-Tandem
  • TagRFP, TagRFP-T DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRed-Monomer or mTangerine
  • the cyan fluorescent protein is ECFP (enhanced cyan fluorescent protein), mECFP, mCerulean
  • the photoinduced heterodimer forming protein may be CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR.
  • the partner protein is a protein capable of forming a heterodimer by photoirradiation with the photoinduced heterodimer forming protein, and may be CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR.
  • heterodimer forming protein When the heterodimer forming protein is CRY or PHR, it may be CIB or CIBN, when the photoinducing heterodimer forming protein is PIF, it is PhyB, and when the photoinducing heterodimer forming protein is GIGANTEA, it is FKF1.
  • the PIF may be PIF3 or PIF6.
  • the photoinduced heterodimer forming protein or the paired protein may form a homodimer regardless of light irradiation.
  • the photoinduced heterodimer-forming protein or the partner protein capable of forming homodimers irrespective of light irradiation may be CRY or PHR.
  • a first fusion protein comprising a self-assembled protein and a photoinduced heterodimer forming protein, a paired protein and a target protein which interact with the photoinduced heterodimer forming protein to form a heterodimer, are cells or An expression step of simultaneously expressing in the individual; And inducing nanocluster formation to induce photoinduced nanocluster formation by irradiating the cell or individual with light having a wavelength that induces heterodimer formation between the photoinduced heterodimer forming protein and the partner protein.
  • a protein is provided with a method for reversible inhibition of target protein function using photoinduced nanocluster formation that is fused to the self-assembled protein or the partner protein.
  • the self-assembled protein may be ferritin, viral capsid protein, ferritin-like protein, macentosome, calmodulin kinase II ⁇ (CaMKII ⁇ ) or DsRed, and the viral capsid protein is cowpea chlorotic mottle virus capsid protein, Norwalk virus capsid protein, SV40 major capsid protein, or papilloma virus capsid protein.
  • the fluorescent protein may be a green fluorescent protein (GFP), a yellow fluorescent protein (YFP), a red fluorescent protein (RFP), an orange fluorescent protein (OFP) , Cyan fluorescent protein (CFP), blue fluorescent protein (BFP), far-red fluorescent protein or tetracysteine motif (tetracystein motif).
  • GFP green fluorescent protein
  • YFP yellow fluorescent protein
  • RFP red fluorescent protein
  • OFP orange fluorescent protein
  • CFP Cyan fluorescent protein
  • BFP blue fluorescent protein
  • far-red fluorescent protein or tetracysteine motif tetracystein motif
  • the green fluorescent protein may be enhanced green fluorescent protein (EGFP), Emerald, Superfolder, GFP, Azami Green, TagGFP, TurboGFP, ZsGreen or T-Sapphire
  • the yellow fluorescent protein may be an enhanced yellow fluorescent protein (EYFP), Topaz, Venus, mCitrine, Ypet, TagYFP, PhiYFP, ZsYellow1 or mBanana
  • the red fluorescent protein may be mRuby, mApple, mStrawberry, AsRed2 or mRFP
  • the orange fluorescent protein is Kusabira Orange, Kusabira Orange2, mOrange, mOrange2, dTomato, dTomato-Tandem
  • TagRFP, TagRFP-T DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRed-Monomer or mTangerine
  • the cyan fluorescent protein is ECFP (enhanced cyan fluorescent protein), mECFP, mCerulean
  • the photoinduced heterodimer forming protein may be CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR.
  • the partner protein is a protein capable of forming a heterodimer by photoirradiation with the photoinduced heterodimer forming protein, and may be CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR, CRY or PHR when the photoinduced heterodimer forming protein is CIB or CIBN, PIF when the photoinduced heterodimer forming protein is PhyB, and GIGANTEA when the photoinduced heterodimer forming protein is FKF1, and vice versa.
  • heterodimer forming protein When the heterodimer forming protein is CRY or PHR, it may be CIB or CIBN, when the photoinducing heterodimer forming protein is PIF, it is PhyB, and when the photoinducing heterodimer forming protein is GIGANTEA, it is FKF1.
  • the PIF may be PIF3 or PIF6.
  • the photoinduced heterodimer-forming protein or the partner protein may form a homodimer regardless of light irradiation.
  • the photoinduced heterodimer-forming protein or the partner protein capable of forming homodimers irrespective of light irradiation may be CRY or PHR.
  • a first polynucleotide encoding a first fusion protein comprising a self-assembled protein and a photoinduced heterodimer forming protein comprising a first gene construct operably linked to a promoter
  • a second gene construct operably linked to a promoter a second polynucleotide encoding a second fusion protein comprising a first expression vector and a paired protein that forms a heterodimer and the photoinduced heterodimer-forming protein upon irradiation with light
  • a third gene construct comprising a second expression vector comprising a third polynucleotide encoding a target protein and a third fusion protein comprising the self-assembled protein operably linked to a promoter.
  • Mineral oil further comprises a third expression vector, or wherein the target protein is included in the second fusion protein
  • the kit for the reversible inhibition of the target protein function using the nanoclusters formed are provided.
  • a first polynucleotide encoding a first fusion protein comprising a self-assembled protein and a photoinduced heterodimer forming protein comprising a first gene construct operably linked to a promoter
  • a second gene construct operably linked to a promoter a second polynucleotide encoding a second fusion protein comprising a first expression vector and a paired protein that forms a heterodimer and the photoinduced heterodimer-forming protein upon irradiation with light
  • a second cloning site comprising a second expression vector comprising a polyclonal encoding a target protein operably linked to a promoter and a third polynucleotide encoding the self-assembled protein operably linked to a promoter.
  • the third expression vector including the gene construct Or inducing multiple cloning sites to which the polynucleotide encoding the target protein can be operably linked in the second polynucleotide so that the target protein can be included and expressed in the second fusion protein. Kits for reversible inhibition of target protein function using nanocluster formation are provided.
  • the fusion protein and the partner protein may be connected to a fluorescent protein for confirming the formation of nanoclusters.
  • the fluorescent protein may be a green fluorescent protein (GFP), a yellow fluorescent protein (YFP), a red fluorescent protein (RFP), an orange fluorescent protein (OFP) , Cyan fluorescent protein (CFP), blue fluorescent protein (BFP), far-red fluorescent protein or tetracysteine motif (tetracystein motif).
  • the green fluorescent protein may be enhanced green fluorescent protein (EGFP), Emerald, Superfolder, GFP, Azami Green, TagGFP, TurboGFP, ZsGreen or T-Sapphire
  • the yellow fluorescent protein may be an enhanced yellow fluorescent protein (EYFP), Topaz, Venus, mCitrine, Ypet, TagYFP, PhiYFP, ZsYellow1 or mBanana
  • the red fluorescent protein may be mRuby, mApple, mStrawberry, AsRed2 or mRFP
  • the orange fluorescent protein is Kusabira Orange, Kusabira Orange2, mOrange, mOrange2, dTomato, dTomato-Tandem
  • TagRFP, TagRFP-T DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRed-Monomer or mTangerine
  • the cyan fluorescent protein is ECFP (enhanced cyan fluorescent protein), mECFP, mCerulean
  • the photoinduced heterodimer forming protein may be CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR.
  • the partner protein is a protein capable of forming a heterodimer by photoirradiation with the photoinduced heterodimer forming protein, and may be CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY or PHR, CRY or PHR when the photoinduced heterodimer forming protein is CIB or CIBN, PIF when the photoinduced heterodimer forming protein is PhyB, and GIGANTEA when the photoinduced heterodimer forming protein is FKF1, and vice versa.
  • heterodimer forming protein When the heterodimer forming protein is CRY or PHR, it may be CIB or CIBN, when the photoinducing heterodimer forming protein is PIF, it is PhyB, and when the photoinducing heterodimer forming protein is GIGANTEA, it is FKF1.
  • the PIF may be PIF3 or PIF6.
  • the photoinduced heterodimer-forming protein or the partner protein may form a homodimer regardless of light irradiation.
  • the photoinduced heterodimer-forming protein or the partner protein capable of forming homodimers irrespective of light irradiation may be CRY or PHR.
  • Figure 9 is a schematic diagram showing the concept of a method of inhibiting the function of the target protein by the formation of photoinduced nanoclusters of the present invention.
  • FIG. 11 is a schematic diagram conceptually illustrating nanocluster formation through light irradiation of a specific cell region in a multicellular region such as an individual or a tissue, and inhibition of function of a target protein present in the specific cell region.
  • the method of the present invention is a very useful method in that it can be observed by comparing the difference between the adjacent experimental group and the control group in a sample.
  • the nanoparticles are heterogeneous formed by self-assembly of a fusion protein of a self-assembled protein (SAP) and a photoinduced heterodimer forming protein (eg, CIBN) and a fusion protein of the self-assembled protein and a bait protein
  • SAP self-assembled protein
  • CIBN photoinduced heterodimer forming protein
  • bait proteins act as bait to capture target proteins inherent in cells
  • photoinduced heterodimer-forming proteins are nano-acted by interacting with a pair of proteins (eg PHR) that form homodimers. Clusters are formed and the target protein trapped in the bait protein is eventually confined within the nanoclusters.
  • FIG. 13 is a schematic diagram conceptually illustrating a method for forming a nanocluster by light irradiation and two methods of controlling molecular function thereof by irradiating two different nanoparticles according to another embodiment of the present invention.
  • the first nanoparticle is a self-assembly of a first fusion protein comprising a first self-assembled protein (1st SAP) and a photoinduced heterodimer-forming protein and a second fusion protein comprising the first self-assembled protein and a bait protein.
  • the second nanoparticle is composed of a second self-assembled protein (2nd SAP), a photoinduced heterodimer-forming protein, and a partner protein of a third fusion protein including a paired protein which forms a heterodimer by irradiation.
  • 2nd SAP second self-assembled protein
  • the target protein captured by the bait protein Is eventually confined within the nanoclusters.
  • the nanoparticles are homozygous complexes formed by self-assembly of a first fusion protein including a self-assembled protein and a photoinduced heterodimer-forming protein.
  • the nanoparticles form a paired protein and a bait protein that form a homodimer regardless of irradiation.
  • the nano-cluster is formed upon irradiation with a wavelength of light to induce heterodimer formation between the photoinduced heterodimer-forming protein and the partner protein, the target protein inherent in the cell Is trapped in the bait protein and eventually confined within the nanoclusters.
  • nanoparticles are homozygous formed by self-assembly of a first fusion protein comprising a self-assembled protein and a photoinduced heterodimer-forming protein (eg, PHR) that forms a homodimer regardless of light irradiation It is a complex, and simultaneously expresses a second fusion protein comprising a photoinduced heterodimer-forming protein and a partner protein which forms a heterodimer by light irradiation, and a bait protein, and then irradiates the photoinduced heterodimer-forming protein and a partner protein by light irradiation. Inducing heterodimer formation between the cells, the target protein inherent in the cell is captured by the bait protein and eventually confined in the nanoclusters.
  • a photoinduced heterodimer-forming protein eg, PHR
  • FIG. 16 is a schematic diagram showing the formation of nanoclusters through light irradiation using the method according to an embodiment of the present invention shown in FIG. 14 and the function control of PI3K protein using the same.
  • the cytoplasmic protein p110 PI3K catalytic subunit
  • PIP2 phosphatidyl-inositol-4,5-bisphosphate
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • FIG. 17 is a schematic diagram conceptually illustrating a method of forming a nanocluster through light irradiation and a method of controlling molecular function thereof according to another embodiment of the present invention.
  • This schematic diagram shows how the overexpressed target protein functions in the cell and the target protein is confined by nanocluster formation upon light irradiation.
  • the nanoparticles are self-assembled proteins and photoinduced heterodimers.
  • a homozygous complex formed by self-assembly of a first fusion protein comprising a forming protein, wherein the second fusion protein including a partner protein and a target protein forming a homodimer irrespective of light irradiation is simultaneously expressed in a cell.
  • the light is irradiated at a wavelength that induces heterodimer formation between the irradiated heterodimer-forming protein and the partner protein, a nanocluster is formed, and a target protein is confined in the nanocluster.
  • N-terminal of cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix is a protein that expresses fusion proteins in cells to form nanoparticles by self-assembly of self-assembled proteins and forms homodimers regardless of light irradiation.
  • PHR cryptochrome 2
  • DH-PH target protein
  • nanoclusters are formed and the Vav2 protein is trapped within the nanoclusters, thereby causing adhesion cells induced by Vav2.
  • the methods and kits of the present invention are useful methods capable of effectively appropriately and reversibly controlling the function of specific target proteins expressed in or embedded in cells and proteins underlying them on biochemical pathways.
  • Cyan fluorescent protein (CFP) and CIB1 Cyan fluorescent protein (CFP) at the N-terminus of the association domain (AD), 315-478 amino acid residues of CaMKII ⁇ ) involved in the self-assembly of the CaMKII ⁇ gene (GenBank No .: NM_012920).
  • a polynucleotide encoding 1-498 amino acids corresponding to the PHR domain (photolysase-related domain) of the CRY2 gene was inserted into the pmCherry-N1 vector (Clontech, USA) to construct the PHR CRY2- mCherry construct.
  • CRY protein or PHR forms homodimers when expressed in cells (FIG. 1).
  • Example 2 Construction of a vector for protein interaction analysis
  • the present inventors express the bait protein and the target protein in order to confirm whether the protein interaction analysis method using the photoinduced nanocluster formation of the present invention can be used for the interaction analysis between different proteins based on the results of Experimental Example 1.
  • An expression vector that can be produced was prepared as follows.
  • the CRY2 (GenBank No .: NM_100320) PHR moiety (1-498) was linked to the N-terminus of the ECFP, and the active Hras (GenBank No .: NM_001130442.1, Q61L mutant, as a bait protein at the C-terminus of the ECFP)
  • the active Hras GenBank No .: NM_001130442.1, Q61L mutant, as a bait protein at the C-terminus of the ECFP
  • the YFP-RBD p100 construct was constructed by inserting it into the frame.
  • Example 3 Construction of a vector for reversible protein inhibition
  • Cyan fluorescent protein (mCerulean) and CIB1 gene (GenBank accession number) at the N-terminus of an association domain (AD-association domain, 315-478 amino acid residues of CaMKII ⁇ ) involved in self-assembly of CaMKII ⁇ gene (GenBank accession no. : NM_119618)
  • a polynucleotide encoding a fusion protein obtained by sequentially fusion of an N-terminus (CIBN, 1-170 amino acid residues of CIB1) participating in photoinduced protein interaction was prepared, and then the pmCerulean-C1 vector (Clontech, USA) to construct a CIBN-mCerulean-AD construct.
  • a polynucleotide encoding 1-498 amino acids corresponding to PHR of the CRY2 gene was inserted into the pmCitrine-C1 vector (Clonthch, USA) to prepare an mCitrine-PHR CRY2 construct.
  • CRY proteins or PHRs form homodimers when expressed in cells.
  • CRY2 (GenBank Accession No .: NM_100320) Connects the PHR portion (1-498) to the C-terminus of mCitrine, and the tail of Rit (GeneBank Accession No .: NM_006912), a protein located at the C-terminus of the PHR. , Amino residue: 193-219) to prepare a polynucleotide encoding a fusion protein sequentially fused, and then inserted into the mCitrine-C1 vector (Clontech, USA) to prepare the mCitrine-PHR CRY2 -Rit tail construct It was.
  • the rit tail is a protein that is directly attached to the negatively charged phospholipids present in the cell membrane and can capture the protein into the cell membrane.
  • DH-PH of Vav2 (GenBank Accession No .: NM_001134398) which induces the formation of the PHR moiety (1-498) of the CRY2 gene (GenBank No .: NM_100320) and the adhesion cell body (lamellipodia) as a target protein at the C-terminus of mCitrine.
  • a polynucleotide encoding a fusion protein was obtained by sequentially fusion of the (amino residue: 167-541) portion and the tail of the Rit protein (GeneBank accession number: NM_006912).
  • Vav2 -Rit tail construct was constructed by inserting into the pmCitrine-C1 vector (Clontech, USA). Since the Vav2 protein is weakly moved to the cell membrane with the PH domain to activate the protein present in the cell membrane, the Vav2 protein can function in the cell membrane even without the rit tail, but in the present embodiment, the Vav2 protein is recruited to the cell membrane. To be sure, we used the Rit tail construct.
  • Abp140 (actin binding protein 140, GenBank Accession No .: NM_001183658) N-terminal portion (1-17) is a peptide consisting of lifeact (Riedl et al ., Nat. Methods , 5: 605-), a marker for visualizing F-actin . 607, 2008) was inserted at the C-terminus of pmCherry-C1 (Clonetech, USA) to prepare the mCherry-lifeact construct.
  • nanoparticles formed by fusion proteins including photoinduced heterodimer forming proteins and self-assembled proteins, can form clusters and visualize them through interaction with partner proteins by irradiation of light. It was.
  • Example 1-1 PHR-CFP-Hras (active) construct prepared in Example 2-1, on pre-cultured Cos-7 cells (ATCC No. CRL-1651)
  • the YFP-RBD raf1 construct prepared in the truck and Example 2-2 was introduced together using electroporation (electroporation-1000 V, 35 ms, 2 pulses), and then the cells were 96-well glass bottom plate.
  • the fusion protein was expressed by incubating for 24 hours in a 10% CO 2 incubator fixed at 37 ° C. (Matrical Bioscience, USA).
  • Example 1-1 PHR-CFP-Hras (active) construct prepared in Example 2-1, on pre-cultured Cos-7 cells (ATCC No. CRL-1651)
  • the YFP-RBD p110 construct prepared in the truck and Example 2-3 was introduced together using electroporation (electroporation-1000 V, 35 ms, 2 pulses), and then the cells were placed in a 96-well glass bottom plate.
  • the fusion protein was expressed by incubating for 24 hours in a 10% CO 2 incubator fixed at 37 ° C. (Matrical Bioscience, USA).
  • CIBN-RFP-AD construct prepared in Example 1-1 PHR-CFP-Hras prepared in Example 2-4, on pre-cultured Cos-7 cells (ATCC No. CRL-1651) (inactive) Construct and the YFP-RBD raf1 construct prepared in Example 2-2 were introduced together using electroporation (electroporation-1000 V, 35 ms, 2 pulses), and then the cells were The fusion protein was expressed by incubating in a well glass bottom plate (Matrical Bioscience, USA) for 24 hours in a 10% CO 2 incubator fixed at 37 ° C.
  • CIBN-RFP-AD construct prepared in Example 1-1 PHR-CFP- prepared in Example 2-1, on pre-cultured Cos-7 cells (ATCC No. CRL-1651)
  • Hras (active) construct and the YFP-CRIB PAK1 construct prepared in Example 2-5 were 96
  • the fusion protein was expressed by incubating in a well-bottomed glass bottom plate (Matrical Bioscience, USA) for 24 hours in a 10% CO 2 incubator fixed at 37 ° C.
  • the Hras (active) protein used as the bait protein interacted with the target protein RBD raf1 protein while interacting with the CIBN-RFP-AD fusion protein to form self-assembled nanoparticles.
  • PHR-ECFP-bait where CIBN, a self-assembled photoinduced heterozygote forming protein, formed a homodimer by irradiation of light. By interacting with the protein, nanoclusters were formed, but due to the failure of interaction between the bait protein and the target protein, the target protein could not form a complex with the nanocluster, and thus the fluorescence linked to the target protein was dispersed as it is. Because it appears.
  • kit and method for analyzing protein interaction can be usefully used for analyzing the interaction between different proteins without the possibility of false positive and false negative.
  • CIBN-mCerulean-AD construct mCitrine-PHR CRY2 -DHPH Vav2 -Rit tail construct and mCherry-lifeact construct prepared in Examples 3-1, 3-4 and 3-5, respectively
  • blue light with a wavelength of 488 nm, which causes the interaction between CIBN and CRY2, was irradiated for 4 minutes at intervals of 10 seconds and over time. The pattern of fluorescence in the cells was observed.
  • the photoinduced protein nanocluster forming method can be very useful as a tool for the study of protein function through analysis of the interaction between various proteins and reversible inhibition of the function of a specific target protein.
  • SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of a tetratracysteine fluorescent motif.

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Abstract

본 발명은 단백질간의 상호작용 및 기능을 효율적으로 분석하기 위하여, 광유도 이형 이합체 형성 단백질 및 제1자기조립단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1발현벡터; 및 상기 광유도 동형 이합체 형성 단백질과 동형 이합체를 형성하는 짝 단백질 또는 상기 짝 단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2발현벡터를 준비하는 발현벡터 준비단계; 상기 제1발현벡터 및 제2발현벡터로 세포, 조직 또는 개체를 형질전환시키는 형질전환 세포, 조직 또는 개체의 제조단계; 및 상기 형질전환 세포, 조직 또는 개체에 상기 광유도 이형 이합체 단백질과 상기 짝 단백질 사이의 이형 이합체 형성을 유도하는 파장의 빛을 조사하는 광조사단계를 포함하는 광유도 단백질 나노클러스터 형성방법을 제공한다.

Description

세포 내에서의 빛을 이용한 가역적 단백질 나노클러스터 형성방법
본 출원은 2011년 9월 30일자로 출원된 대한민국 특허출원 제2011-0100334호 및 2011년 12월 7일자로 출원된 대한민국 특허출원 제2011-0130081호에 대한 우선권을 주장한다. 상기 출원들은 전체로서 본 문서에 참조로 포함된다.
본 발명은 세포 내에서의 단백질 나노클러스터의 형성방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 세포 내에서의 빛을 이용한 가역적 단백질 나노클러스터 형성방법, 광유도 나노클러스 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석 방법 및 단백질 기능의 가역적 저해방법에 관한 것이다.
일반적으로 다양한 생리활성 물질간의 역동적인 상호작용에 의해서 여러 가지 생리적인 기능이 조절되고, 이러한 상호작용이 적절히 일어나지 못하거나, 상호작용이 일어나지 않아야 할 분자 사이에 상호작용 발생하는 비정상적인 상황에서 질병이 초래되기도 한다. 일반적으로 상보적인 구조의 두 개의 단백질은 상호작용하고, 생리활성 화합물은 단백질 3차 구조의 특정부위에 특이적으로 상호작용하는데, 이들 생리활성 화합물은 대상 단백질의 기능을 조절함으로써, 당해 단백질과 관련된 질환의 진단 또는 예방, 치료 및 경감시킬 수 있는 치료제 후보물질이 될 수 있다.
이러한 단백질간의 상호작용 및 단백질과 소분자 화합물 간의 상호작용을 분석함으로써, 질병 표적 또는 치료제를 스크리닝하고자 하는 연구가 지속되어 왔다. 그 예로, 파지디스플레이(Sche et al., Chem. Biol., 6: 707, 1999), 효모 2종-/3종-하이브리드 분석(Licitra et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 12817, 1996), 이종결손(heterologous deletions)이 일어난 효모균주의 평행분석(Zheng et al., Chem. Biol., 11: 609, 2004) 등과 같은 기술을 들 수 있다. 그러나, 이들 기술들은 높은 배경(high background), 위양성(false positive), 낮은 민감도(low sensitivity) 등과 같은 문제점을 가지고 있고, 시험관내 조건에서의 반응 또는 비포유동물 세포를 사용한 반응의 경우, 실험결과를 100% 신뢰하기 어려운 단점을 가지고 있다.
아울러, 일반적으로 특정 단백질의 기능을 연구함에 있어서, 해당 단백질을 암호화하는 유전자의 결실 또는 돌연변이를 유도하거나 해당 단백질을 발현하는 세포 또는 개체에 해당 단백질에 특이적인 저해제를 처리한 후 세포 또는 개체 내에서의 생리화학적 변화를 관찰하는 방법을 사용하곤 한다.
이러한 방법 중, 미국 특허 제5,270,163호는 특정 바이오분자에 특이적으로 결합하는 단일가닥 올리고뉴클레오티드인 소위 앱타머(aptamer)의 선별방법을 개시하고 있고, Lunder M. 등은 파지 디스플레이(phage display) 방법을 이용하여 표적-결합 모티프를 탐색하는 방법을 개시한 바 있으며(Lunder et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 127(2): 125-131, 2005), 미국 공개특허 제2010-0143371호는 세포내 단백질에 특이적으로 결합하는 인간 항체의 카파쇄(kappa chain)의 가변 도메인(variable domain)인 인트라바디(intrabody)와 이를 이용한 상기 세포내 단백질의 기능 저해방법을 개시하고 있다.
그러나 상기 단백질 상호작용 분석방법들은 실시간 분석이 불가능하거나, 위양성(false-psitive), 위음성(false-negative)의 가능성을 완전히 제거하지 못하고 있다는 단점이 있고, 상기 단백질 저해방법은 유전자 돌연변이 유발이나 특정 단백질에 대한 특이적 저해제의 탐색을 전제로 하는 비용과 시간이 많이 소요되는 방법으로서 비효율적일 뿐만 아니라, 이들 돌연변이나 특이적 저해제의 처리의 경우 비가역적인 단백질 불활성화를 야기하는 경우가 많아서, 세포 생존에 필수적인 단백질의 경우에는 이와 같은 방법으로 그 기능을 연구하기 어려운 점이 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 세포 내에서의 빛을 이용한 가역적 단백질 나노클러스터 형성방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
아울러 본 발명은 상기 방법에 의한 광유도 단백질 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석 방법 및 키트를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
더 나아가, 본 발명은 상기 광유도 단백질 나노클러스터 형성을 이용한 개체 또는 세포 수준에서 특정 표적 단백질의 저해방법 및 키트를 제공하는 것을 목적으로다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 광유도 이형 이합체 형성 단백질 및 자기조립단백질을 포함하는 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터가 제공된다.
상기 발현벡터에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있다.
상기 발현벡터에 있어서, 상기 자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다. 상기 자기조립단백질에 대한 설명은 후술할 제1자기조립단백질 및 제2자기조립단백질에도 동일하게 적용된다.
상기 발현벡터에 있어서, 상기 융합단백질은 형광단백질을 추가로 포함할 수 있고, 상기 형광단백질은 상기 융합단백질의 N-말단 또는 C-말단에 부가될 수 있으며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상기 자기 조립 단백질 사이에 삽입될 수도 있다. 이 때, 상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다. 상기 녹색형광단백질은 EGFP(enhanced green fluorescent protein), Emerald(Tsien, Annu. Rev. Biochem., 67: 509-544, 1998), Superfolder(Pedelacq et al., Nat. Biotech., 24: 79-88, 2006), GFP(Prendergast et al., Biochem., 17(17): 3448-3453, 1978), Azami Green(Karasawa, et al., J. Biol. Chem., 278: 34167-34171, 2003), TagGFP(Evrogen, Russia), TurboGFP(Shagin et al., Mol. Biol. Evol., 21(5): 841-850, 2004), ZsGreen(Matz et al., Nat. Biotechnol., 17: 969-973, 1999) 또는 T-Sapphire(Zapata-Hommer et al., BMC Biotechnol., 3:5, 2003)일 수 있고, 상기 황색형광단백질은 EYFP(enhanced yellow fluorescent protein, Tsien, Annu. Rev. Biochem., 67: 509-544, 1998), Topaz(Hat et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 1: 627-633, 2002), Venus(Nagai et al., Nat. Biotechnol., 20(1): 87-90, 2002), mCitrine(Griesbeck et al., J. Biol. Chem., 276: 29188-29194, 2001), Ypet(Nguyet and Daugherty, Nat. Biotechnol., 23(3): 355-360, 2005), TagYFP(Evrogen, Russia), PhiYFP(Shagin et al., Mol. Biol. Evol., 21(5): 841-850, 2004), ZsYellow1(Matz et al., Nat. Biotechnol., 17: 969-973, 1999) 또는 mBanana(Shaner et al., Nat. Biotechnol., 22: 1567-1572, 2004)일 수 있으며, 상기 적색형광단백질은 mRuby(Kredel et al., PLoS ONE, 4(2):e4391, 2009), mApple(Shaner et al., Nat. Methods, 5(6): 545-551, 2008), mStrawberry(Shaner et al., Nat. Biotechnol., 22: 1567-1572, 2004), AsRed2(Shanner et al., Nat. Biotehcnol., 22: 1567-1572, 2004) 또는 mRFP(Campbell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(12): 7877-7882, 2002)일 수 있고, 상기 주황형광단백질은 Kusabira Orange(Karawawa et al., Biochem. J., 381(Pt 1): 307-312, 2004), Kusabira Orange2(MBL International Corp., Japan), mOrange(Shaner et al., Nat. Biotechnol., 22: 1567-1572, 2004), mOrange2(Shaner et al., Nat. Biotechnol., 22: 1567-1572, 2004), dTomato(Shaner et al., Nat. Biotechnol., 22: 1567-1572, 2004), dTomato-Tandem(Shaner et al., Nat. Biotechnol., 22: 1567-1572, 2004), TagRFP(Merzlyak et al., Nat. Methods, 4(7): 555-557, 2007), TagRFP-T(Shaner et al., Nat. Methods, 5(6): 545-551, 2008), DsRed(Baird et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 11984-11989, 1999), DsRed2(Clontech, USA), DsRed-Express(Clontech, USA), DsRed-Monomer(Clontech, USA) 또는 mTangerine(Shaner et al., Nat. Biotechnol., 22: 1567-1572, 2004)일 수 있으며, 상기 청록색형광단백질은 ECFP(enhanced cyan fluorescent protein, Cubitt et al., Trends Biochem. Sci., 20: 448-455, 1995), mECFP(Ai et al., Biochem. J., 400(3): 531-540, 2006), mCerulean(Koushik et al., Biophys. J., 91(12): L99-L101, 2006), CyPet(Nguyet and Daugherty, Nat. Biotechnol., 23(3): 355-360, 2005), AmCyan1(Matz et al., Nat. Biotechnol., 17: 969-973, 1999), Midori-Ishi Cyan(Karawawa et al., Biochem. J., 381(Pt 1): 307-312, 2004), TagCFP(Evrogen, Russia) 또는 mTFP1(Ai et al., Biochem. J., 400(3): 531-540, 2006)일 수 있고, 상기 청색형광단백질은 EBFP(enhanced blue fluorescent protein, Clontech, USA), EBFP2(Ai et al., Biochemistry, 46(20): 5904-5910, 2007), Azurite(Mena et al., Nat. Biotechnol., 24: 1569-1571, 2006) 또는 mTagBFP(Subach et al., Chem. Biol., 15(10: 1116-1124, 2008)일 수 있고, 상기 원적색형광단백질은 mPlum(Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101: 16745-16749, 2004), mCherry(Shanner et al., Nat. Biotehcnol., 22: 1567-1572, 2004), dKeima-Tandem(Kogure et al., Methods, 45(3): 223-226, 2008), JRed(Shagin et al., Mol. Biol. Evol., 21(5): 841-850, 2004), mRaspberry(Shanner et al., Nat. Biotehcnol., 22: 1567-1572, 2004), HcRed1(Fradkov et al., Biochem. J., 368(Pt 1): 17-21, 2002), HcRed-Tandem(Fradkov et al., Nat. Biotechnol., 22(3): 289-296, 2004) 또는 AQ143(Shkrob et al., Biochem. J., 392: 649-654, 2005)일 수 있으며, 상기 테트라시스테인 모티프는 Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys(서열번호 1)의 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 Xaa는 시스테인을 제외한 아미노산일 수 있다. 상술한 형광단백질에 대한 설명은 후술할 제1형광단백질, 제2형광단백질, 제3형광단백질 및 제4형광단백질에도 동일하게 적용된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 광유도 이형 이합체 형성 단백질 및 제1자기조립단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1발현벡터; 및
상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질 또는 상기 짝 단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2발현벡터를 포함하는 광유도 단백질 나노클러스터 형성용 키트가 제공된다.
상기 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR이고, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1일 수 있다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다. 상기 짝 단백질 중 CRY 또는 PHR은 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 짝 단백질이다.
상기 키트에 있어서, 상기 제1자기조립단백질 및 제2자기조립단백질은 독립적으로 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다. 단, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질이 동시에 사용되는 경우, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질은 동일할 수 있고, 서로 다른 종류의 것일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 제1융합단백질, 짝 단백질 및 제2융합단백질 중 적어도 하나 이상은 형광단백질을 추가로 포함할 수 있고, 상기 형광단백질은 상기 제1융합단백질, 짝 단백질 및/또는 제2융합단백질의 N-말단 또는 C-말단에 연결되거나, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상기 제1자기조립단백질 사이 또는 상기 짝 단백질과 상기 제2자기조립단백질 사이에 삽입될 수도 있다. 이 때, 상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 광유도 이형 이합체 형성 단백질 및 제1자기조립단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1발현벡터; 및 상기 광유도 동형 이합체 형성 단백질과 동형 이합체를 형성하는 짝 단백질 또는 상기 짝 단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2발현벡터를 준비하는 발현벡터 준비단계;
상기 제1발현벡터 및 제2발현벡터로 세포, 조직 또는 개체를 형질전환시키는 형질전환 세포, 조직 또는 개체의 제조단계; 및
상기 형질전환 세포, 조직 또는 개체에 상기 광유도 이형 이합체 단백질과 상기 짝 단백질 사이의 이형 이합체 형성을 유도하는 파장의 빛을 조사하는 광조사단계를 포함하는 광유도 단백질 나노클러스터 형성방법이 제공된다.
상기 광유도 단백질 나노클러스터 형성방법에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR이고, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1일 수 있다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다. 상기 짝 단백질 중 CRY 또는 PHR은 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 짝 단백질이다.
상기 광유도 단백질 나노클러스터 형성방법에 있어서, 상기 제1자기조립단백질 및 제2자기조립단백질은 각각 독립적으로 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다. 단, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질이 동시에 사용되는 경우, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질은 동일할 수 있고, 서로 다른 종류의 것일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 제1융합단백질, 짝 단백질 및 제2융합단백질 중 적어도 하나 이상은 형광단백질을 추가로 포함할 수 있고, 상기 형광단백질은 상기 제1융합단백질, 짝 단백질 및/또는 제2융합단백질의 N-말단 또는 C-말단에 연결되거나, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상기 제1자기조립단백질 사이 또는 상기 짝 단백질과 상기 제2자기조립단백질 사이에 삽입될 수도 있다. 이 때, 상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
본 발명의 다른 일관점에 따르면, 1) 제1자기조립단백질, 제1형광단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질, 2) 선택적으로 제2형광단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질, 3) 제3형광단백질을 포함하는 제3융합단백질, 4) 광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질, 5) 미끼 단백질, 및 6) 상기 미끼 단백질과의 상호작용 여부의 분석대상인 표적 단백질을 세포 내에서 동시에 발현시키되, 상기 짝 단백질은 상기 제2융합단백질 또는 상기 제3융합단백질 중 어느 하나에 포함되어 발현되고, 상기 미끼 단백질은 상기 제2융합단백질, 상기 제3융합단백질 또는 상기 제1자기조립단백질 및 상기 제1형광단백질을 포함하는 제4융합단백질 중 어느 하나에 포함되어 발현되며, 상기 표적 단백질은 상기 미끼 단백질이 포함된 융합단백질을 제외한 다른 융합단백질 또는 제4형광단백질을 포함하는 제5융합단백질에 포함되어 발현되는 것을 특징으로 하는 융합단백질 발현단계;
상기 융합단백질들이 동시에 발현된 세포에 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 및 상기 짝 단백질의 이형 이합체 형성을 유도하는 파장의 빛을 조사하여 나노 클러스터 형성을 유도하는 광유도 나노클러스터 형성단계; 및
상기 형광단백질들의 형광의 패턴과 강도를 관찰하는 형광 관찰단계를 포함하며,
다만, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질이 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성하는 경우에는, 상기 제2융합단백질은 생략될 수 있고, 상기 제1형광단백질 내지 제4형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하며, 상기 제1형광단백질 또는 제2형광단백질 중 어느 하나가 DsRed인 경우, DsRed가 포함된 융합단백질에서 상기 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질은 생략이 가능한, 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질 간 상호작용 분석방법이 제공된다.
상기 분석방법에 있어서, 상기 제1형광단백질 내지 제4형광단백질은 각각 독립적으로 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
상기 분석방법에 있어서, 상기 제1자기조립단백질 및 제2자기조립단백질은 각각 독립적으로, 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다. 단, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질이 동시에 사용되는 경우, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질은 동일할 수 있고, 서로 다른 종류의 것일 수 있다.
상기 분석방법에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR이고, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1일 수 있다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다. 상기 짝 단백질 중 CRY 또는 PHR은 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 짝 단백질이다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 1) 제1자기조립단백질, 제1형광단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질, 2) 선택적으로 제2형광단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질, 3) 제3형광단백질을 포함하는 제3융합단백질, 4) 광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질, 5) 미끼 단백질, 및 6) 상기 미끼 단백질과의 상호작용 여부의 분석대상인 표적 단백질을 세포 내에서 동시에 발현시키되, 상기 짝 단백질은 상기 제2융합단백질 또는 상기 제3융합단백질 중 어느 하나에 포함되어 발현되고, 상기 미끼 단백질은 상기 제2융합단백질, 상기 제3융합단백질 또는 상기 제1자기조립단백질 및 상기 제1형광단백질을 포함하는 제4융합단백질 중 어느 하나에 포함되어 발현되며, 상기 표적 단백질은 상기 미끼 단백질이 포함된 융합단백질을 제외한 다른 융합단백질 또는 제4형광단백질을 포함하는 제5융합단백질에 포함되어 발현되는 것을 특징으로 하는 융합단백질 발현단계;
상기 융합단백질들이 동시에 발현된 세포에 상기 미끼 단백질과 상기 표적 단백질 사이의 단백질 상호작용 조절 후보물질을 처리하는 단계;
상기 조절 후보물질 처리 전, 후 또는 동시에 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 및 상기 짝 단백질의 이형 이합체 형성을 유도하는 파장의 빛을 조사하여 나노 클러스터를 형성을 유도하는 광유도 나노클러스터 형성단계; 및
상기 형광단백질들의 형광의 패턴과 강도를 관찰하는 형광 관찰단계를 포함하며,
다만, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질이 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성하는 경우에는, 상기 제2융합단백질은 생략될 수 있고, 상기 제1형광단백질 내지 제4형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하며, 상기 제1형광단백질 또는 제2형광단백질 중 어느 하나가 DsRed인 경우, DsRed가 포함된 융합단백질에서 상기 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질은 생략이 가능한, 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 조절물질의 스크리닝 방법이 제공된다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 상기 제1형광단백질 내지 제4형광단백질은 각각 독립적으로 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 상기 제1자기조립단백질 및 제2자기조립단백질은 각각 독립적으로 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다. 단, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질이 동시에 사용되는 경우, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질은 동일할 수 있고, 서로 다른 종류의 것일 수 있다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR이고, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1일 수 있다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다. 상기 짝 단백질 중 CRY 또는 PHR은 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 짝 단백질이다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면,
제1자기조립단백질, 제1형광단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터;
선택적으로 제2형광단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터,
제3형광단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터,
선택적으로 상기 제1자기조립단백질, 상기 제1형광단백질 및 미끼 단백질을 포함하는 제4융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제4유전자 컨스트럭트를 포함하는 제4발현벡터를 포함하며,
상기 제4발현벡터가 포함되지 않는 경우, 상기 미끼 단백질은 상기 제2융합단백질 또는 상기 제3융합단백질 중 어느 하나에 포함되고, 상기 제2융합단백질 또는 상기 제3융합단백질 중 어느 하나에 광 조사에 의해 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질이 포함되며, 상기 제2융합단백질 또는 상기 제3융합단백질 중 미끼 단백질이 포함되지 않은 융합단백질 또는 선택적으로 발현되는 제4형광단백질을 포함하는 제5융합단백질에 상기 미끼 단백질과의 단백질간 상호작용 여부 확인대상인 표적 단백질이 포함되고,
다만, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질이 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성하는 경우에는, 상기 제2융합단백질은 생략될 수 있고, 상기 제1형광단백질 내지 제4형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하며, 상기 제1형광단백질 또는 제2형광단백질 중 어느 하나가 DsRed인 경우, DsRed가 포함된 융합단백질에서 상기 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질은 생략이 가능한, 단백질간 상호작용 분석용 키트가 제공된다.
상기 단백질간 상호작용 분석용 키트에 있어서, 상기 제1형광단백질 내지 제4형광단백질은 각각 독립적으로 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
상기 단백질간 상호작용 분석용 키트에 있어서, 상기 제1자기조립단백질 및 제2자기조립단백질은 각각 독립적으로 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다. 단, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질이 동시에 사용되는 경우, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질은 동일할 수 있고, 서로 다른 종류의 것일 수 있다.
상기 단백질간 상호작용 분석용 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR이고, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1일 수 있다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다. 상기 짝 단백질 중 CRY 또는 PHR은 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 짝 단백질이다.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면,
제1자기조립단백질, 제1형광단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터;
선택적으로 제2형광단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터,
제3형광단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터,
선택적으로 상기 제1자기조립단백질, 상기 제1형광단백질를 포함하는 제4융합단백질을 암호화하는 제4폴리뉴클레오티드 및 미끼 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 제4폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결될 수 있는 다중 클로닝 부위를 포함하는 제4유전자 컨스트럭트를 포함하는 제4발현벡터를 포함하며,
상기 제4발현벡터가 포함되지 않는 경우, 상기 미끼 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 삽입을 위한 다중 클로닝 부위는 상기 제2융합단백질 또는 상기 제3융합단백질 중 어느 하나에 포함되고, 상기 제2융합단백질 또는 상기 제3융합단백질 중 어느 하나에 광 조사에 의해 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질이 포함되며, 상기 제2발현벡터 또는 상기 제3발현벡터 중 미끼 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 삽입을 위한 다중 클로닝 부위가 포함되지 않은 발현벡터 또는 선택적으로 발현되는 제4형광단백질을 포함하는 제5융합단백질을 암호화하는 제5폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제5발현벡터에 상기 미끼 단백질과의 단백질간 상호작용 여부 확인대상인 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 제5폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결될 수 있는 다중 클로닝 부위가 포함되고,
다만, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질이 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성하는 경우에는, 상기 제2융합단백질은 생략될 수 있고, 상기 제1형광단백질 내지 제4형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하며, 상기 제1형광단백질 또는 제2형광단백질 중 어느 하나가 DsRed인 경우, DsRed가 포함된 융합단백질에서 상기 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질은 생략이 가능한, 단백질간 상호작용 분석용 키트가 제공된다.
상기 단백질간 상호작용 분석용 키트에 있어서, 상기 제1형광단백질 내지 제4형광단백질은 각각 독립적으로 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
상기 단백질간 상호작용 분석용 키트에 있어서, 상기 제1자기조립단백질 및 제2자기조립단백질은 각각 독립적으로 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다. 단, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질이 동시에 사용되는 경우, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질은 동일할 수 있고, 서로 다른 종류의 것일 수 있다.
상기 단백질간 상호작용 분석용 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR이고, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1일 수 있다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다. 상기 짝 단백질 중 CRY 또는 PHR은 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 짝 단백질이다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 자기조립단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질를 포함하는 융합단백질, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상호작용하여 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질 및 표적 단백질과 상호작용을 하는 미끼 단백질을 상기 표적 단백질을 내재적 단백질로 발현하는 세포 또는 개체에서 동시에 발현시키는 발현단계; 및 상기 세포 또는 개체에 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상기 짝 단백질 사이의 이형 이합체 형성을 유도하는 파장의 빛을 조사하여 광유도 나노클러스터 형성을 유도하는 나노클러스터 형성 유도단계를 포함하며, 상기 미끼 단백질은 상기 자기조립단백질 또는 상기 짝 단백질에 융합되어 발현되는 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해방법이 제공된다.
상기 방법에 있어서, 상기 자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 융합단백질, 상기 짝 단백질 및 상기 미끼 단백질 중 적어도 하나 이상에는 나노클러스터 형성 여부를 확인하기 위한 형광단백질이 연결될 수 있다. 이 때, 상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR이고, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1일 수 있다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다. 상기 짝 단백질 중 CRY 또는 PHR은 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 짝 단백질이다.
상기 방법에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있다. 이 경우 상기 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 CRY 또는 PHR일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 제1자기조립단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질, 제2자기조립단백질 및 광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 포함하는 제2융합단백질, 및 표적 단백질과 상호작용하는 미끼 단백질을 상기 표적 단백질을 내재적 단백질로 발현하는 세포 또는 개체에서 동시에 발현시키는 발현단계; 및 상기 세포 또는 개체에 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상기 짝 단백질 사이의 이형 이합체 형성을 유도하는 파장의 빛을 조사하여 광유도 나노클러스터 형성을 유도하는 나노클러스터 형성 유도단계를 포함하며, 상기 미끼 단백질은 상기 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질에 융합되어 발현되는 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해방법이 제공된다.
상기 방법에 있어서, 상기 자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 저해방법에 있어서, 상기 융합단백질, 상기 짝 단백질 및 상기 미끼 단백질 중 적어도 하나 이상에는 나노클러스터 형성 여부를 확인하기 위한 형광단백질이 연결될 수 있다. 이 때, 상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)일 수 있다.
상기 저해방법에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR이고, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1일 수 있다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다. 상기 짝 단백질 중 CRY 또는 PHR은 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 짝 단백질이다.
상기 저해방법에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있다. 이 경우 상기 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 CRY 또는 PHR일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 자기조립단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상호작용하여 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터 및 표적 단백질과 상호작용을 하는 미끼 단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 포함하며, 상기 미끼 단백질은 상기 자기조립단백질 또는 상기 짝 단백질에 융합되어 발현되는 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트가 제공된다.
상기 방법에 있어서, 상기 자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 저해방법에 있어서, 상기 융합단백질, 상기 짝 단백질 및 상기 미끼 단백질 중 적어도 하나 이상에는 나노클러스터 형성 여부를 확인하기 위한 형광단백질이 연결될 수 있다. 이 때, 상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)일 수 있다.
상기 저해방법에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR이고, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1일 수 있다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다. 상기 짝 단백질 중 CRY 또는 PHR은 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 짝 단백질이다.
상기 저해방법에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있다. 이 경우 상기 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 CRY 또는 PHR일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 제1자기조립단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터, 제2자기조립단백질 및 광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터, 및 표적 단백질과 상호작용하는 미끼 단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있는 다중 클로닝 부위 및 상기 프로모터를 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 포함하며, 상기 미끼 단백질은 상기 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질에 융합되어 발현되는 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트가 제공된다.
상기 키트에 있어서, 상기 자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 융합단백질, 상기 짝 단백질 및 상기 미끼 단백질 중 적어도 하나 이상에는 나노클러스터 형성 여부를 확인하기 위한 형광단백질이 연결될 수 있다. 이 때, 상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR이고, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1일 수 있다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다. 상기 짝 단백질 중 CRY 또는 PHR은 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 짝 단백질이다.
상기 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있다. 이 경우 상기 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 CRY 또는 PHR일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 자기조립단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상호작용하여 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터 및 표적 단백질과 상호작용을 하는 미끼 단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있는 다중 클로닝 부위 및 상기 프로모터를 포함하는 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 포함하며, 상기 미끼 단백질은 상기 자기조립단백질 또는 상기 짝 단백질에 융합되어 발현되는 있는 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트가 제공된다.
상기 키트에 있어서, 상기 자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 융합단백질, 상기 짝 단백질 및 상기 미끼 단백질 중 적어도 하나 이상에는 나노클러스터 형성 여부를 확인하기 위한 형광단백질이 연결될 수 있다. 이 때, 상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR이고, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1일 수 있다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다. 상기 짝 단백질 중 CRY 또는 PHR은 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 짝 단백질이다.
상기 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있다. 이 경우 상기 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 CRY 또는 PHR일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 제1자기조립단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터, 제2자기조립단백질 및 광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터, 및 표적 단백질과 상호작용하는 미끼 단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 포함하며, 상기 미끼 단백질은 상기 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질에 융합되어 발현되는 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트가 제공된다.
상기 키트에 있어서, 상기 자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 융합단백질, 상기 짝 단백질 및 상기 미끼 단백질 중 적어도 하나 이상에는 나노클러스터 형성 여부를 확인하기 위한 형광단백질이 연결될 수 있다. 이 때, 상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR이고, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1일 수 있다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다. 상기 짝 단백질 중 CRY 또는 PHR은 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 짝 단백질이다.
상기 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있다. 이 경우 상기 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 CRY 또는 PHR일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 자기조립단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상호작용하여 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질 및 표적 단백질을 세포 또는 개체에서 동시에 발현시키는 발현단계; 및 상기 세포 또는 개체에 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상기 짝 단백질 사이의 이형 이합체 형성을 유도하는 파장의 빛을 조사하여 광유도 나노클러스터 형성을 유도하는 나노클러스터 형성 유도단계를 포함하며, 상기 표적 단백질은 상기 자기조립단백질 또는 상기 짝 단백질에 융합되어 발현되는 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해방법이 제공된다.
상기 저해방법에 있어서, 상기 자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 저해방법에 있어서, 상기 융합단백질, 상기 짝 단백질 및 상기 미끼 단백질 중 적어도 하나 이상에는 나노클러스터 형성 여부를 확인하기 위한 형광단백질이 연결될 수 있다. 이 때, 상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)일 수 있다.
상기 저해방법에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR이고, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1일 수 있다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다. 상기 짝 단백질 중 CRY 또는 PHR은 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 짝 단백질이다.
상기 저해방법에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있다. 이 경우 상기 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 CRY 또는 PHR일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 자기조립단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터, 및 광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터를 포함하며, 표적 단백질 및 상기 자기조립단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호호하하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 추가적으로 포함하거나, 상기 표적 단백질이 제2융합단백질에 포함되는, 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트가 제공된다.
상기 키트에 있어서, 상기 자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 융합단백질, 상기 짝 단백질 및 상기 미끼 단백질 중 적어도 하나 이상에는 나노클러스터 형성 여부를 확인하기 위한 형광단백질이 연결될 수 있다. 이 때, 상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR이고, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1일 수 있다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다. 상기 짝 단백질 중 CRY 또는 PHR은 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 짝 단백질이다.
상기 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있다. 이 경우 상기 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 CRY 또는 PHR일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 자기조립단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터, 및 광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터를 포함하며, 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있는 다중 클로닝 부위 및 상기 자기조립단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제3유전자컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 추자적으로 포함하거나, 상기 표적단백질이 상기 제2융합단백질에 포함되어 발현될 수 있도록, 상기 제2폴리뉴클레오티드 내에 상기 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결될 수 있는 다중 클로닝 부위가 포함되는, 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트가 제공된다.
상기 키트에 있어서, 상기 자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 융합단백질, 상기 짝 단백질 및 상기 미끼 단백질 중 적어도 하나 이상에는 나노클러스터 형성 여부를 확인하기 위한 형광단백질이 연결될 수 있다. 이 때, 상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR이고, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1일 수 있다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다. 상기 짝 단백질 중 CRY 또는 PHR은 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 짝 단백질이다.
상기 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있다. 이 경우 상기 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 CRY 또는 PHR일 수 있다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 세포 또는 조직 내에서 단백질 나노클러스터를 형성함으로써 효율적으로 단백질간 상호작용을 분석할 수 있고 특정 표적 단백질의 기능을 시공간적으로 그리고 가역적으로 조절할 수 있다. 물론 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
도 1은 광조사에 의해 유도되는 나노클러스터 형성 원리를 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 2는 상기 도 1에 도시된 나노클러스터의 형성이 실제 가능함을 보여주는 실험결과에 대한 형광현미경 사진이다.
도 3은 시간의 경과에 따른 광유도 나노클러스터의 형성 및 해체 과정을 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석방법의 원리를 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 5는 본 발명의 다른 일실시예에 따른 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석방법의 원리를 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 6은 본 발명의 다른 일실시예에 따른 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석방법의 원리를 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 7은 본 발명의 다른 일실시예에 따른 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석방법의 원리를 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 8은 본 발명의 다른 일실시예에 따른 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석방법의 원리를 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 9는 본 발명의 광유도 나노클러스터 형성에 의한 표적 단백질의 기능 저해방법의 개념을 나타내는 개요도이다.
도 10은 세포의 부분 활성영역(partial active region)에 대하여 특정 파장의 광조사를 통한 나노클러스터 형성과 상기 부분영역에 존재하는 활성단백질과 상호작용하는 표적단백질의 감금을 통한 상기 활성 단백질의 기능 저해를 개념적으로 나타내는 개요도이다.
도 11은 개체 또는 조직 등 다세포영역에서 특정 세포영역에 대한 광조사를 통한 나노클러스터 형성과 상기 특정 세포영역에 존재하는 표적단백질의 기능 저해를 개념적으로 나타내는 개요도이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 광조사를 통한 나노클러스터 형성과 그에 의한 분자기능 조절 방법을 개념적으로 나타낸 개요도이다.
도 13은 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 두 가지 다른 나노입자에 대한 광조사에 의한 나노클러스터의 형성과 그에 의한 분자기능 조절 방법을 개념적으로 나타낸 개요도이다.
도 14는 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 광조사를 통한 나노클러스터 형성과 그에 의한 분자기능 조절 방법을 개념적으로 나타낸 개요도이다.
도 15는 본 발명의 다른 실시예에 따른 광조사를 통한 나노클러스터 형성과 그에 의한 분자기능 조절 방법을 개념적으로 나타낸 개요도이다.
도 16은 도 14에 도시된 본 발명의 일 실시예 따른 방법을 이용한 광조사를 통한 나노클러스터 형성과 이를 이용한 PI3K 단백질의 기능 조절을 도식적으로 나타낸 개요도이다.
도 17은 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 방법을 이용한 광조사를 통한 나노클러스터 형성과 이를 이용한 Vav2 단백질의 기능 조절을 도식적으로 나타낸 개요도이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석방법을 이용하여 Hras와 RBDraf1, 그리고 Hras와 RBDp110 사이의 상호작용을 분석한 결과를 나타내는 형광현미경 사진이다.
도 19는 도 17에 도시된 개념을 입증하기 위해, 광조사에 의한 나노클러스터의 형성과 시간 경과에 따른 특정 단백질의 기능 억제 결과를 보여주는 세포에 대한 형광현미경 사진이다.
용어의 정의
본 문서에서 사용되는 용어를 정의하면 하기와 같다.
본 문서에서 사용되는 "미끼(bait) 단백질"이란, 표적 단백질과 상호작용을 하는 단백질을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 "표적(pray) 단백질"이란, 상기 "미끼 단백질"의 상호작용 파트너로서, 분석 대상이 되는 단백질을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 "자기조립단백질(self-assembled protein, SAP)"은 매개물질의 도움 없이 단백질 발현과 동시에 자가조립(self-assembly)되는 단백질을 의미하며, 대표적인 자기조립단백질로는 페리틴(ferritin)을 들 수 있다.
본 문서에서 사용되는 "나노클러스터(nanocluster)" 또는 "단백질 나노클러스터(protein nanocluster)"는 자기조립단백질의 자가조립에 의해 형성된 나노입자가 나노입자간 상호작용에 의해 군집을 형성한 군집체를 의미한다.
본 문서에서 사용되는 "광유도 이형 이합체 형성 단백질(light-induced heterodimerized protein)"는 특정 파장의 빛을 조사할 경우 다른 단백질과 이형 이합체(heterodimer)를 형성하는 단백질을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 "짝 단백질(partner protein)"은 특정 파장의 빛을 조사할 경우 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 대상 단백질을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 "융합 단백질(fusion protein)"은 둘 이상의 단백질이 각각의 기능을 유지하면서 서로 연결된 단백질을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 "이형 이합체(heterodimer)"는 서로 다른 두 가지 단백질이 상호작용에 의해 하나의 복합체(complex)를 형성한 것을 의민한다.
본 문서에서 사용되는 "동형 이합체(homodimer)"는 같은 단백질이 서로 두 개가 상호작용하여 하나의 복합체(complex)를 형성한 것을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 "작동 가능하게 연결된(operably linked to)"는 특정 폴리뉴클레오티드가 그 기능을 발휘할 수 있게 다른 폴리뉴클레오티드에 연결된 것을 의미한다. 즉, 특정 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결되었다는 것은 당해 프로모터의 작용에 의해 mRNA로 전사되고 당해 단백질로 번역까지 될 수 있게 연결되었다는 것을 의미하고, 특정 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 다른 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되었다는 것은 당해 특정 단백질이 다른 단백질과 융합단백질의 형태로 발현될 수 있게 연결되었다는 것을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 "CIB"는 크립토크롬-상호작용 염기성 헬릭스-루프-헬릭스 단백질(cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix protein)을 의미하며, 대표적으로 애기장대의 CIB1(GenBank No.: NM_119618)가 있다.
본 문서에서 사용되는 "CIBN"은 상기 CIB의 N-말단으로서 광조사시 크립토크롬(cryptochrome, CRY)와 상호작용하는 부위를 의미한다.
본 문서에서 사용되는 "CRY"는 크립토크롬(chryptochrome) 단백질을 의미하며, 대표적으로 애기장대의 CRY2(GenBank No.: NM_100320)가 있다.
본 문서에서 사용되는 "PHR"은 상기 CRY의 N-말단 부위로서 파이토라이아제 상동성 지역(phytolyase homolgous region)을 의미하며, 광조사시 상기 CIB 또는 CIBN과 상호작용한다(Kennedy et al., Nat. Methods, 7(12): 973-975, 2010).
본 문서에서 사용되는 "Phy"는 파이토크롬(phytochrome) 단백질을 의미하고, 대표적으로 애기장대의 PhyA(GenBank No.: NM_001123784), PhyB(GenBank No.: NM_127435) 등이 있으며, PIF(phytochrome interacting factor)와 상호작용하는 것으로 알려져 있다(Min et al., Nature, 400: 781-784, 1999)
본 문서에서 사용되는 "PIF"는 파이토크롬 상호작용 인자(phytochrome interacting factor)을 의미하며, 대표적으로 애기장대의 PIF1(GenBank No.: NM_001202630), PIF3(GenBank No.: NM_179295), PIF4(GenBank No.: NM_180050), PIF5(GenBank No.: NM_180690), PIF6(GenBank No.: NM_001203231) 또는 PIF7(GenBank No.: NM_125520)이 있다.
본 문서에서 사용되는 "FKF"는 플라빈-결합, 켈치 반복, F-박스(Flavin-binding, Kelch repeat, F-box) 단백질을 의미하고, 대표적으로 애기장대의 FKF1(GenBank No.: NM_105475)이 있으며, 광조사시 GIGANTEA 단백질과 상호작용하는 것으로 알려져 있다(Sawa et al., Science, 318(5848): 261-265, 2007).
본 문서에서 사용되는 "GIGANTEA"는 파이토크롬 신호전달에 관련되어 있고, 꽃의 개화시기를 조절하는 단백질로 알려져 있다.
본 문서에서 사용되는 "테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)"는 Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys(서열번호 1)의 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, Xaa는 시스테인을 제외한 아미노산으로서, 상기 Xaa의 종류와 폴리펩티드의 길이에 따라, 형광패턴이 달라진다(Adams et al., J. Am. Chem. Soc., 124: 6063-6077, 2002).
본 발명의 다양한 실시예에 따른 단백질 상호작용 분석방법을 첨부되는 도면을 통해 설명하기로 한다.
도 1은 본 광조사에 의해 유도되는 나노클러스터 형성 원리를 개략적으로 도시한 개요도이다.
본 발명자들은 광유도 이형 이합체 형성단백질을 페리틴과 같은 자기조립단백질과 융합단백질로 발현시키되 상기 광유도 이형 이합체 형성단백질과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질과 동시에 발현시킬 경우, 상기 자기조립단백질의 자기조립에 의한 자기조립체와 상기 짝 단백질 사이의 광조사 상호작용에 의해 단백질 나노클러스터가 형성될 것이라고 예측하였다(도 1). 이에 실제, 자기조립단백질로서 페리틴, 광유도 이형 이합체 형성 단백질인 CIBN 및 형광단백질을 연결한 융합단백질을 암호화하는 유전자컨스트럭트를 포함하는 발현벡터와, 짝 단백질로서 PHR을 암호화하는 유전자컨스트럭트를 포함하는 발현벡터로 세포를 동시에 형질감염시킨 후, 형질감염된 세포에 CIBN 및 PHR의 상호작용을 유도하는 파장의 빛을 조사한 후, 형광현미경으로 관찰한 결과, 세포 내에서 강한 형광을 나타내는 점이 생성되는 것을 관찰하였고(도 2), 해당 형광점의 갯수의 증감이 광조사주기와 일치함을 확인하였다(도 3). 이는 세포 내에서 융합단백질 자기조립체끼리 광조사에 의해 나노클러스터를 형성하였음을 입증하는 것이다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 광유도 이형 이합체 형성 단백질 및 자기조립단백질을 포함하는 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터가 제공된다.
상기 발현벡터에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있다.
상기 발현벡터에 있어서, 상기 자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다. 상기 자기조립단백질에 대한 설명은 후술할 제1자기조립단백질 및 제2자기조립단백질에도 동일하게 적용된다.
상기 발현벡터에 있어서, 상기 융합단백질은 형광단백질을 추가로 포함할 수 있고, 상기 형광단백질은 상기 융합단백질의 N-말단 또는 C-말단에 부가될 수 있으며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상기 자기 조립 단백질 사이에 삽입될 수도 있다. 이 때, 상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다. 상기 녹색형광단백질은 EGFP(enhanced green fluorescent protein), Emerald(Tsien, Annu. Rev. Biochem., 67: 509-544, 1998), Superfolder(Pedelacq et al., Nat. Biotech., 24: 79-88, 2006), GFP(Prendergast et al., Biochem., 17(17): 3448-3453, 1978), Azami Green(Karasawa, et al., J. Biol. Chem., 278: 34167-34171, 2003), TagGFP(Evrogen, Russia), TurboGFP(Shagin et al., Mol. Biol. Evol., 21(5): 841-850, 2004), ZsGreen(Matz et al., Nat. Biotechnol., 17: 969-973, 1999) 또는 T-Sapphire(Zapata-Hommer et al., BMC Biotechnol., 3:5, 2003)일 수 있고, 상기 황색형광단백질은 EYFP(enhanced yellow fluorescent protein, Tsien, Annu. Rev. Biochem., 67: 509-544, 1998), Topaz(Hat et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 1: 627-633, 2002), Venus(Nagai et al., Nat. Biotechnol., 20(1): 87-90, 2002), mCitrine(Griesbeck et al., J. Biol. Chem., 276: 29188-29194, 2001), Ypet(Nguyet and Daugherty, Nat. Biotechnol., 23(3): 355-360, 2005), TagYFP(Evrogen, Russia), PhiYFP(Shagin et al., Mol. Biol. Evol., 21(5): 841-850, 2004), ZsYellow1(Matz et al., Nat. Biotechnol., 17: 969-973, 1999) 또는 mBanana(Shaner et al., Nat. Biotechnol., 22: 1567-1572, 2004)일 수 있으며, 상기 적색형광단백질은 mRuby(Kredel et al., PLoS ONE, 4(2):e4391, 2009), mApple(Shaner et al., Nat. Methods, 5(6): 545-551, 2008), mStrawberry(Shaner et al., Nat. Biotechnol., 22: 1567-1572, 2004), AsRed2(Shanner et al., Nat. Biotehcnol., 22: 1567-1572, 2004) 또는 mRFP(Campbell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(12): 7877-7882, 2002)일 수 있고, 상기 주황형광단백질은 Kusabira Orange(Karawawa et al., Biochem. J., 381(Pt 1): 307-312, 2004), Kusabira Orange2(MBL International Corp., Japan), mOrange(Shaner et al., Nat. Biotechnol., 22: 1567-1572, 2004), mOrange2(Shaner et al., Nat. Biotechnol., 22: 1567-1572, 2004), dTomato(Shaner et al., Nat. Biotechnol., 22: 1567-1572, 2004), dTomato-Tandem(Shaner et al., Nat. Biotechnol., 22: 1567-1572, 2004), TagRFP(Merzlyak et al., Nat. Methods, 4(7): 555-557, 2007), TagRFP-T(Shaner et al., Nat. Methods, 5(6): 545-551, 2008), DsRed(Baird et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 11984-11989, 1999), DsRed2(Clontech, USA), DsRed-Express(Clontech, USA), DsRed-Monomer(Clontech, USA) 또는 mTangerine(Shaner et al., Nat. Biotechnol., 22: 1567-1572, 2004)일 수 있으며, 상기 청록색형광단백질은 ECFP(enhanced cyan fluorescent protein, Cubitt et al., Trends Biochem. Sci., 20: 448-455, 1995), mECFP(Ai et al., Biochem. J., 400(3): 531-540, 2006), mCerulean(Koushik et al., Biophys. J., 91(12): L99-L101, 2006), CyPet(Nguyet and Daugherty, Nat. Biotechnol., 23(3): 355-360, 2005), AmCyan1(Matz et al., Nat. Biotechnol., 17: 969-973, 1999), Midori-Ishi Cyan(Karawawa et al., Biochem. J., 381(Pt 1): 307-312, 2004), TagCFP(Evrogen, Russia) 또는 mTFP1(Ai et al., Biochem. J., 400(3): 531-540, 2006)일 수 있고, 상기 청색형광단백질은 EBFP(enhanced blue fluorescent protein, Clontech, USA), EBFP2(Ai et al., Biochemistry, 46(20): 5904-5910, 2007), Azurite(Mena et al., Nat. Biotechnol., 24: 1569-1571, 2006) 또는 mTagBFP(Subach et al., Chem. Biol., 15(10: 1116-1124, 2008)일 수 있고, 상기 원적색형광단백질은 mPlum(Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101: 16745-16749, 2004), mCherry(Shanner et al., Nat. Biotehcnol., 22: 1567-1572, 2004), dKeima-Tandem(Kogure et al., Methods, 45(3): 223-226, 2008), JRed(Shagin et al., Mol. Biol. Evol., 21(5): 841-850, 2004), mRaspberry(Shanner et al., Nat. Biotehcnol., 22: 1567-1572, 2004), HcRed1(Fradkov et al., Biochem. J., 368(Pt 1): 17-21, 2002), HcRed-Tandem(Fradkov et al., Nat. Biotechnol., 22(3): 289-296, 2004) 또는 AQ143(Shkrob et al., Biochem. J., 392: 649-654, 2005)일 수 있으며, 상기 테트라시스테인 모티프는 Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys(서열번호 1)의 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 Xaa는 시스테인을 제외한 아미노산일 수 있다. 상술한 형광단백질에 대한 설명은 후술할 제1형광단백질, 제2형광단백질, 제3형광단백질 및 제4형광단백질에도 동일하게 적용된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 광유도 이형 이합체 형성 단백질 및 제1자기조립단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1발현벡터; 및
상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질 또는 상기 짝 단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2발현벡터를 포함하는 광유도 단백질 나노클러스터 형성용 키트가 제공된다.
상기 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성할 수 있는 단백질로서, CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 반대로 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1이다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다. 상기 짝 단백질 중 CRY 또는 PHR은 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 짝 단백질이다.
상기 키트에 있어서, 상기 제1자기조립단백질 및 제2자기조립단백질은 각각 독립적으로 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다. 단, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질이 동시에 사용되는 경우, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질은 동일할 수 있고, 서로 다른 종류의 것일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 제1융합단백질, 짝 단백질 및 제2융합단백질 중 적어도 하나 이상은 형광단백질을 추가로 포함할 수 있다. 이 때, 상기 형광단백질은 상기 융합단백질의 N-말단 또는 C-말단에 부가될 수 있으며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상기 제1자기조립단백질 사이 및/또는 상기 짝 단백질과 상기 제2자기조립단백질 사이에 삽입될 수도 있다. 상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다. 여기서, 상기 녹색형광단백질은 EGFP, Emerald, Superfolder, GFP, Azami Green, TagGFP, TurboGFP, ZsGreen 또는 T-Sapphire일 수 있고, 상기 황색형광단백질은 EYFP, Topaz, Venus, mCitrine, Ypet, TagYFP, PhiYFP, ZsYellow1 또는 mBanana일 수 있으며, 상기 적색형광단백질은 mRuby, mApple, mStrawberry, AsRed2 또는 mRFP일 수 있고, 상기 주황형광단백질은 Kusabira Orange, Kusabira Orange2, mOrange, mOrange2, dTomato, dTomato-Tandem, TagRFP, TagRFP-T, DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRed-Monomer 또는 mTangerine일 수 있으며, 상기 시안형광단백질은 ECFP, mECFP, mCerulean, CyPet, AmCyan1, Midori-Ishi Cyan, TagCFP 또는 mTFP1일 수 있고, 상기 청색형광단백질은 EBFP, EBFP2, Azurite 또는 mTagBFP일 수 있고, 상기 원적색형광단백질은 mPlum, mCherry, dKeima-Tandem, JRed, mRaspberry, HcRed1, HcRed-Tandem 또는 AQ143일 수 있으며, 상기 테트라시스테인 모티프는 Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys(서열번호 1)의 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 Xaa는 시스테인을 제외한 아미노산일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 광유도 이형 이합체 형성 단백질 및 제1자기조립단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1발현벡터; 및 상기 광유도 동형 이합체 형성 단백질과 동형 이합체를 형성하는 짝 단백질 또는 상기 짝 단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2발현벡터를 준비하는 발현벡터 준비단계;
상기 제1발현벡터 및 제2발현벡터로 세포, 조직 또는 개체를 형질전환시키는 형질전환 세포, 조직 또는 개체의 제조단계; 및
상기 형질전환 세포, 조직 또는 개체에 상기 광유도 이형 이합체 단백질과 상기 짝 단백질 사이의 이형 이합체 형성을 유도하는 파장의 빛을 조사하는 광조사단계를 포함하는 광유도 단백질 나노클러스터 형성방법이 제공된다.
상기 광유도 단백질 나노클러스터 형성방법에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있다.
상기 광유도 단백질 나노클러스터 형성방법에 있어서, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성할 수 있는 단백질로서, CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 반대로 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1이다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다. 상기 짝 단백질 중 CRY 또는 PHR은 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 짝 단백질이다.
상기 광유도 단백질 나노클러스터 형성방법에 있어서, 상기 제1자기조립단백질 및 제2자기조립단백질은 각각 독립적으로 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다. 단, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질이 동시에 사용되는 경우, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질은 동일할 수 있고, 서로 다른 종류의 것일 수 있다.
상기 광유도 단백질 나노클러스터 형성방법에 있어서, 상기 제1융합단백질, 짝 단백질 및 제2융합단백질 중 적어도 하나 이상은 형광단백질을 추가로 포함할 수 있다. 이 때, 상기 형광단백질은 상기 제1융합단백질, 짝 단백질 및/또는 제2융합단백질의 N-말단 또는 C-말단에 부가될 수 있으며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상기 제1자기조립단백질의 사이 또는 상기 짝 단백질과 상기 제2자기조립단백질의 사이에 삽입될 수도 있다. 상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다. 여기서, 상기 녹색형광단백질은 EGFP, Emerald, Superfolder, GFP, Azami Green, TagGFP, TurboGFP, ZsGreen 또는 T-Sapphire일 수 있고, 상기 황색형광단백질은 EYFP, Topaz, Venus, mCitrine, Ypet, TagYFP, PhiYFP, ZsYellow1 또는 mBanana일 수 있으며, 상기 적색형광단백질은 mRuby, mApple, mStrawberry, AsRed2 또는 mRFP일 수 있고, 상기 주황형광단백질은 Kusabira Orange, Kusabira Orange2, mOrange, mOrange2, dTomato, dTomato-Tandem, TagRFP, TagRFP-T, DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRed-Monomer 또는 mTangerine일 수 있으며, 상기 시안형광단백질은 ECFP, mECFP, mCerulean, CyPet, AmCyan1, Midori-Ishi Cyan, TagCFP 또는 mTFP1일 수 있고, 상기 청색형광단백질은 EBFP, EBFP2, Azurite 또는 mTagBFP일 수 있고, 상기 원적색형광단백질은 mPlum, mCherry, dKeima-Tandem, JRed, mRaspberry, HcRed1, HcRed-Tandem 또는 AQ143일 수 있으며, 상기 테트라시스테인 모티프는 Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys(서열번호 1)의 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 Xaa는 시스테인을 제외한 아미노산일 수 있다.
상술한 광유도 단백질 나노클러스터 형성방법 및 키트는 단백질 자기조립에 의해 형성되는 나노입자 사이의 나노클러스터 형성을 빛의 조사에 의해 유도함으로써, 다른 단백질-단백질 상호작용의 분석은 물론 단백질-단백질 상호작용을 조절하는 조절물질을 탐색하는데 유용하게 사용될 수 있다. 아울러, 본 발명의 일 실시예에 따른 광유도 단백질 나노클러스터 형성방법 및 키트는 광유도 단백질-단백질 상호작용을 가역적으로 유도할 수 있기 때문에, 살아 있는 세포의 손상을 최소화하여 실시간으로 단백질-단백질 상호작용에 따른 효과를 관찰하는데 유용하게 사용할 수 있다. 더 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 광유도 단백질 나노클러스터 형성방법 및 키트는 특정 표적단백질과 상호작용하는 미끼단백질을 이용하여 상기 표적단백질을 나노클러스터 내에 포획함으로써, 상기 표적단백질의 기능을 가역적으로 저해하는데 활용할 수 있다.
상술한 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질 상호작용 분석방법 및 표적 단백질의 가역적 저해방법을 설명하면 하기와 같다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 제1자기조립단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터; 광유도 이형 이합체 형성 단백질 및 상기 제1자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터; 광조사에 의해 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질, 제2형광단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 포로모터에 작동가능하게 연결된 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터; 및 표적단백질 및 제3형광단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호화하는 제4폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제4유전자 컨스트럭트를 포함하는 제4발현벡터를 포함하며, 다만, 상기 제1융합단백질 또는 상기 제2융합단백질 중 적어도 하나 이상은 제1형광단백질을 포함하고, 상기 제1형광단백질, 상기 제2형광단백질 및 상기 제3형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하며, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질은 서로 상호작용을 하지 않고, 상기 제1형광단백질 또는 상기 제2형광단백질 중 어느 하나가 DsRed인 경우, DsRed가 포함된 융합단백질에서 상기 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질은 생략이 가능한, 단백질간 상호작용 분석용 키트가 제공된다(도 4).
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 제1융합단백질 내의 미끼단백질, 제1자기조립단백질 및 선택적으로 제1형광단백질의 순서는 어느 것이라도 무방하다. 예를 들어 상기 제1융합단백질은 미끼단백질, 제1형광단백질 및 제1자기조립단백질의 순으로 구성될 수도 있고, 제1자기조립단백질, 제1형광단백질 및 미끼단백질의 순으로 구성될 수도 있다. 마찬가지로, 상기 제2융합단백질 내의 광유도 이형 이합체 형성 단백질, 제1자기조립단백질 및 선택적으로 제1형광단백질의 순서 역시 어느 것이라도 무방하다. 예를 들어 상기 제2융합단백질은 광유도 이형 이합체 형성 단백질, 제1형광단백질 및 제1자기조립단백질의 순으로 구성될 수도 있고, 제1자기조립단백질, 제1형광단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질의 순으로 구성될 수도 있다. 마찬가지로 제3융합단백질에 있어서도, 짝 단백질과 제2형광단백질 및 제2자기조립단백질의 순서는 어떤 순서가 되더라도 무방하다. 예를 들어, N-말단부터 짝 단백질, 제2형광단백질 및 제2자기조립단백질의 순일 수도 있고, 제2자기조립단백질, 제2형광단백질 및 짝 단백질의 순서가 될 수 있다. 마지막으로 제4융합단백질의 경우에도 표적 단백질이 N-말단에 위치할 수도 있고, 제3형광단백질이 N-말단에 위치할 수 있다.
상기 모든 융합단백질들은 각 융합단백질을 구성하는 단위체 단백질들 사이에 링커가 포함될 수 있다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 제1자기조립단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하고 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1폴리뉴클레오티드 및 미끼 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 제1폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결될 수 있는 다중클로닝 부위를 포함하는 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터; 광유도 이형 이합체 형성 단백질 및 상기 제1자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터; 광조사에 의해 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질, 제2형광단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 포로모터에 작동가능하게 연결된 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터; 및 제3형광단백질을 포함하는 제4융합단백질을 암호화하고 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제4폴리뉴클레오티드 및 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 제4폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결될 수 있는 다중클로닝 부위를 포함하는 제4유전자 컨스트럭트를 포함하는 제4발현벡터를 포함하며, 다만, 상기 제1융합단백질 또는 상기 제2융합단백질 중 적어도 하나 이상은 제1형광단백질을 포함하고, 상기 제1형광단백질, 상기 제2형광단백질 및 상기 제3형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하며, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질은 서로 상호작용을 하지 않고, 상기 제1형광단백질 또는 제2형광단백질 중 어느 하나가 DsRed인 경우, DsRed가 포함된 융합단백질에서 상기 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질은 생략이 가능한, 단백질간 상호작용 분석용 키트가 제공된다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 제1형광단백질 내지 제3형광단백질은 각각 독립적으로 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 제1자기조립단백질 및 제2자기조립단백질은 각각 독립적으로 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다. 단, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질이 동시에 사용되는 경우, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질은 동일할 수 있고, 서로 다른 종류의 것일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성할 수 있는 단백질로서, CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 반대로 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1이다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 프로모터는 진핵 프로모터일 수 있다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석방법의 원리를 개략적으로 도시한 개요도이다. 도 4에 나타난 바와 같이, 광유도 나노 클러스터는 광유도 이형 이합체 형성 단백질(예를 들어, CIBN)을 포함하는 제1나노입자와 빛의 조사에 의해 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질와 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질(예를 들어, PHR)을 포함하는 제2나노입자 사이의 광유도 상호작용에 의해 형성될 수 있다.
이때, 제1나노입자는 두 가지 유전자 컨스트럭트에 의해 각각 발현된 두 융합단백질(제1융합단백질 및 제2융합단백질)의 자기조립에 의해 형성되는데, 상기 제1융합단백질 및 상기 제2융합단백질은 공통의 자기조립단백질(제1자기조립단백질, 1st self-assembled protein, 1st SAP)을 가지고 있기 때문에, 이형조립 나노입자가 생성된다. 단백질의 발현 및 나노 클러스터 형성 여부 확인을 위해, 상기 제1융합단백질 및/또는 상기 제2융합단백질에는 제1형광단백질이 포함된다. 한편, 제2나노입자는 상기 제1자기조립단백질과 상호작용하지 않는 별도의 제2자기조립단백질(2nd SAP)과 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 빛 조사에 의해 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 포함하는 제3융합단백질의 자기조립에 의해 형성되는 동형조립 나노입자이다. 상기 제3융합단백질 역시 단백질의 발현 여부 및 나노클러스터 형성 여부를 확인하기 위하여, 상기 제1형광단백질과 상이한 파장의 빛을 방출하는 제2형광단백질을 포함한다. 한편, 상기 미끼 단백질과의 상호작용 여부를 확인하고자 하는 표적 단백질은 상기 제1형광단백질 및 상기 제2형광단백질과 상이한 파장의 빛을 방출하는 제3형광단백질과의 융합단백질 형태로 발현되게 된다. 만일, 상기 미끼 단백질과 상기 표적 단백질 사이에 상호작용이 있을 경우, 빛의 조사에 의해 광유도 이형 이합체 형성단백질과 짝 단백질 간의 상호작용에 의한 나노클러스터의 위치와 상기 표적 단백질의 위치가 동일하게 나타나게 된다. 만일 표적 단백질이 미끼 단백질과 상호작용을 하지 않는다면, 표적단백질을 나타내는 형광은 제1나노입자에 의한 형광, 제2나노입자에 의한 형광과 달리 점의 형태로 나타나지 않고 세포질 내에 분산된 형태로 나타날 것이다. 한편, 나노클러스터가 형성되더라도 제1나노입자 사이의 동형 상호작용에 의해 나노클러스터가 형성될 수 있는데, 이 경우 제1나노입자에 의한 형광 패턴과 제2나노입자에 의한 형광 패턴이 일치하지 않기 때문에, 이를 제1나노입자와 제2나노입자 사이에 형성된 나노클러스터와 구분할 수 있다.
도 4에 도시된 CIBN은 애기장대(A. thaliana)의 전사인자 bHLH63 단백질의 N 말단(1-170 aa)을 의미하며 상기 CIBN은 488 nm의 청색광을 조사할 경우 애기장대 크립토크롬 2(cryptochrome 2)의 N-말단 부위인 PHR(photolyase homologous region, 1-488 aa)와 상호작용을 하는 것으로 알려져 있는(Liu et al., Science, 322(5907): 1535-1539, 2009), 대표적인 광유도 이형 이합체 형성 단백질이다. 이하, 편의상 도면상에서 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIBN으로 표기되고, 짝 단백질은 CRY2 또는 PHR로 표기된다. 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질로는 CIB 또는 CIBN 외에 PhyB, PIF3, PIF6, FKF1, GIGANTEA 등이 사용될 수 있다. PhyB는 애기장대의 피토크롬 B(phytochrome B) 단백질로서, 적색광 조사시 PIF(phytochrome-interacting factor)와 상호작용하는 것으로 알려져 있다(Castillon et al., Trends Plant Sci., 12(11): 514-521, 2007). FKF1(flavin-binding, kelch repat, F-box 1)은 시간에 의해 조절되며, 개화를 조절하는 기능을 담당하는 것으로 알려져 있고, 청색광 조사시 GIGANTEA 단백질과 상호작용하는 것으로 알려져 있다(Sawa et al., Science. 318(5848): 261-265, 2007). GIGANTEA는 애기장대에서 피토크롬 신호전달에 관여하는 핵 단백질로 알려져 있다(Huq et al, Proc. Natl. Acad. Soc. U.S.A., 97(17): 9789-9794, 2000).
본 발명의 일 관점에 따르면, 광유도 이형 이합체 형성 단백질, 제1형광단백질 및 제1자기조립단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터; 광조사에 의해 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질, 제2형광단백질 및 미끼단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 포로모터에 작동 가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터; 및 표적단백질, 제3형광단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 포함하며, 다만, 상기 제1형광단백질, 상기 제2형광단백질 및 상기 제3형광단백질은 서로 상이한 파장의 빛을 방출하고, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질은 서로 상호작용을 하지 않으며, 상기 제1형광단백질 또는 상기 제3형광단백질 중 어느 하나가 DsRed인 경우, DsRed가 포함된 융합단백질에서 상기 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질은 생략이 가능한, 단백질간 상호작용 분석용 키트가 제공된다(도 5).
본 발명의 일 관점에 따르면, 광유도 이형 이합체 형성 단백질, 제1형광단백질 및 제1자기조립단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터; 광조사에 의해 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질 및 제2형광단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하고 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2폴리뉴클레오티드 및 미끼 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 제2폴리뉴클레오티드에 작동 가능하도록 연결될 수 있게 하는 다중클로닝 부위를 포함하는 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터; 및 제3형광단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호화하고, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제3폴리뉴클레오티드 및 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 제3폴리뉴클레오티드에 작동 가능하도록 연결될 수 있는 다중 클로닝 부위를 포함하는 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 포함하며, 다만, 상기 제1형광단백질, 상기 제2형광단백질 및 상기 제3형광단백질은 서로 상이한 파장의 빛을 방출하고, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질은 서로 상호작용을 하지 않으며, 상기 제1형광단백질 또는 상기 제3형광단백질 중 어느 하나가 DsRed인 경우 상기, 상기 DsRed를 포함하는 융합단백질에서 상기 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질은 생략이 가능한, 단백질간 상호작용 분석용 키트가 제공된다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 제1형광단백질 내지 제3형광단백질은 각각 독립적으로 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 제1자기조립단백질 및 제2자기조립단백질은 각각 독립적으로 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다. 단, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질이 동시에 사용되는 경우, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질은 동일할 수 있고, 서로 다른 종류의 것일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성할 수 있는 단백질로서, CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 반대로 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1이다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 프로모터는 진핵 프로모터일 수 있다.
도 5는 본 발명의 다른 일실시예에 따른 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석방법의 원리를 개략적으로 도시한 개요도이다. 도 5에 나타난 바와 같이, 나노 클러스터는 제1나노입자와 제2나노입자 사이에 직접적으로 형성되지 않고, 클러스터 형성 링커(cluster formation linker)에 의해 간접적으로 형성된다. 구체적으로, 제1나노입자는 광유도 이형 이합체 형성 단백질, 제1형광단백질 및 제1자기조립단백질(1st SAP)을 포함한 제1융합단백질의 자기조립에 의해 형성된다. 제2나노입자는 표적단백질, 상기 제1형광단백질과 다른 파장의 빛을 방출하는 제3형광단백질 및 제2자기조립단백질(2nd SAP)을 포함하는 제3융합단백질의 자기조립에 의해 형성된다. 상기 제1나노입자 및 상기 제2나노입자 외에 짝 단백질, 제2형광단백질 및 미끼 단백질을 포함하는 제2융합단백질이 세포 내에서 동시에 발현될 경우, 특정 파장에 의해 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상기 짝 단백질이 이형 이합체를 형성하고, 상기 미끼 단백질과 제2나노입자 표면에 제시된 표적 단백질 사이에 상호작용이 일어날 경우, 상기 제2융합단백질을 매개로 한 나노클러스터가 형성되며, 각 융합단백질이 갖는 특유의 형광 패턴을 통해 이러한 나노클러스터의 형성 여부 및 위양성 또는 위음성 여부를 판정할 수 있게 된다. 만약 미끼 단백질과 표적 단백질 사이에 상호작용이 일어나지 않는다면, 나노클러스터 아예 형성되지 않는다. 반대로 광유도 이형 이합체 형성 단백질, 미끼 단백질 E또는 표적 단백질의 동형 이합체 형성에 의해 나노클러스터가 형성될 경우에는 각 형광단백질에 따른 형광 패턴이 상이하게 되므로, 위양성 및 위음성을 구분할 수 있게 된다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 미끼 단백질 및 자기조립단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터; 광유도 이형 이합체 형성 단백질 및 상기 자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터; 광조사에 의해 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질이 적어도 두 개 이상 반복되고, 제2형광단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 포로모터에 작동가능하게 연결된 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터; 및 표적단백질 및 제3형광단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호화하는 제4폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제4유전자 컨스트럭트를 포함하는 제4발현벡터를 포함하며, 다만, 상기 제1융합단백질 또는 상기 제2융합단백질 중 적어도 하나 이상은 제1형광단백질을 포함하고, 상기 제1형광단백질, 상기 제2형광단백질 및 상기 제3형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하며, 상기 제1형광단백질이 DsRed인 경우, 상기 제1융합단백질 또는 상기 제2융합단백질에서 상기 자기조립단백질은 생략이 가능한, 단백질간 상호작용 분석용 키트가 제공된다(도 6).
본 발명의 일 관점에 따르면, 자기조립단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드 및 미끼 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 제1폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결될 수 있는 다중클로닝 부위를 포함하는 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터; 광유도 이형 이합체 형성 단백질 및 상기 자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터; 광조사에 의해 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질이 적어도 두 개 이상 반복되고, 제2형광단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 포로모터에 작동가능하게 연결된 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터; 및 제3형광단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호화하고 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제4폴리뉴클레오티드 및 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 제4폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결될 수 있는 다중클로닝 부위를 포함하는 제4유전자 컨스트럭트를 포함하는 제4발현벡터를 포함하며, 다만, 상기 제1융합단백질 또는 상기 제2융합단백질 중 적어도 하나 이상은 제1형광단백질을 포함하고, 상기 제1형광단백질, 상기 제2형광단백질 및 상기 제3형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하고, 상기 제1형광단백질이 DsRed인 경우, 상기 제1융합단백질 또는 상기 제2융합단백질에서 상기 자기조립단백질은 생략이 가능한, 단백질간 상호작용 분석용 키트가 제공된다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 제1형광단백질 내지 제3형광단백질은 각각 독립적으로 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성할 수 있는 단백질로서, CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 반대로 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1이다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 프로모터는 진핵 프로모터일 수 있다.
도 6은 본 발명의 다른 일실시예에 따른 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석방법의 원리를 개략적으로 도시한 개요도이다. 도 6에 나타난 바와 같이, 상기 실시예에 의하면 단일한 나노입자가 사용된다. 상기 나노입자는 광유도 이형 이합체 형성 단백질 및 자기조립단백질을 포함하는 제1융합단백질과 미끼단백질 및 상기 자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질의 이형조립 나노입자를 형성한다. 이 때, 단백질의 발현 및 나노 클러스터 형성 여부를 확인하기 위해 상기 제1융합단백질 또는 상기 제2융합단백질 중 적어도 하나에는 제1형광단백질이 포함된다. 상기 나노입자의 클러스터 형성은 짝 단백질과 제2형광단백질을 포함하는 제3융합단백질의 짝 단백질과 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 사이의 광유도 상호작용에 의해 달성된다. 상기 제3융합단백질은 짝 단백질을 적어도 두 개 이상 반복체로 포함할 수도 있고, PHR과 같이 동형이합체를 형성하는 단백질이 짝 단백질로 사용되는 경우에는 짝 단백질이 단일 카피만 존재해도 제3융합단백질의 동형 이합체 형성에 의해 나노 클러스터를 형성할 수 있게 된다. 미끼 단백질과 표적 단백질 사이의 상호작용 여부는 상기 제1융합단백질 내지 제3융합단백질과 별도로 발현되는 표적단백질 및 제3형광단백질을 포함하는 제4융합단백질과 상기 나노입자사이의 상호작용 여부를 확인함으로써 분석될 수 있다. 이 경우 광 조사에 의해 나노 클러스터는 항상 형성되는데, 미끼 단백질과 표적 단백질 사이의 상호작용이 있으면, 표적 단백질을 포함하는 제4융합단백질의 형광 패턴이 나노 클러스터의 형성에 따라 나타나는 형광 패턴과 동일하게 나온다. 반대로, 미끼 단백질과 표적 단백질 사이의 상호작용이 없는 경우에는 제4융합단백질의 형광 패턴은 나노클러스터 형성에 따른 형광 패턴과 달리 제4융합단백질이 발현된 위치에서 분산되어 나타나게 된다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 광유도 이형 이합체 형성 단백질, 제1형광단백질 및 자기조립단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터; 광조사에 의해 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하고, 스스로 동형 이합체를 형성하는 짝 단백질, 제2형광단백질 및 미끼 단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터; 및 표적 단백질 및 제3형광단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 포함하며, 다만, 상기 제1형광단백질, 상기 제2형광단백질 및 상기 제3형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하고, 상기 제1형광단백질이 DsRed인 경우, 상기 제1융합단백질에서 상기 자기조립단백질은 생략이 가능한, 단백질간 상호작용 분석용 키트가 제공된다(도 7).
본 발명의 일 관점에 따르면, 광유도 이형 이합체 형성 단백질, 제1형광단백질 및 자기조립단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터; 광조사에 의해 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하고, 스스로 동형 이합체를 형성하는 짝 단백질, 제2형광단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하고 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2폴리뉴클레오티드 및 미끼 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 제2폴리뉴클레오티드에 작동 가능하도록 연결될 수 있는 다중클로닝 부위를 포함하는 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터; 및 제3형광단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호화하고 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제3폴리뉴클레오티드 및 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 제3폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결될 수 있는 다중클로닝 부위를 포함하는 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 포함하며, 다만, 상기 제1형광단백질, 상기 제2형광단백질 및 상기 제3형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하고, 상기 제1형광단백질이 DsRed인 경우, 상기 제1융합단백질에서 상기 자기조립단백질은 생략이 가능한, 단백질간 상호작용 분석용 키트가 제공된다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB 또는 CIBN일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성할 수 있고 광유도와 무관하게 동형 이합체를 형성하는 단백질로서, CRY 또는 PHR일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 제1형광단백질 내지 제3형광단백질은 각각 독립적으로 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 프로모터는 진핵 프로모터일 수 있다.
도 7은 본 발명의 다른 일실시예에 따른 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석방법의 원리를 개략적으로 도시한 개요도이다. 도 7에 나타난 바와 같이, 상기 실시예의 경우 단일한 나노입자가 사용된다. 상기 나노입자는 광유도 이형 이합체 형성 단백질, 제1형광단백질 및 자기조립단백질을 포함하는 제1융합단백질의 자기조립에 의해 형성된다. 상기 나노입자는 나노입자 표면에 제시된 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 짝 단백질, 제2형광단백질 및 미끼단백질을 포함하는 제2융합단백질의 짝 단백질 사이의 상호작용에 의해 나노클러스터를 형성하게 된다. 이 경우 상기 짝 단백질은 광유도와 무관하게 동형 이형 이합체를 형성하는 단백질을 사용하며, 이러한 단백질로는 CRY2 또는 이의 N-말단 도메인인 PHR이 사용될 수 있다. 짝 단백질의 동형 이합체 형성 후 상기 나노입자와의 상호작용에 의해 두 개 이상의 나노입자가 서로 상호작용을 통해 나노클러스터가 형성된다. 미끼 단백질과 표적 단백질 사이의 상호작용 여부는 다른 실시예와 마찬가지로 표적단백질에 제3형광단백질이 연결된 제3융합단백질에 의해 나타나는 형광의 패턴을 통해 확인 가능하다. 즉, 제3융합단백질에 의해 나타나는 형광 패턴이 나노클러스터를 구성하고 있는 제1융합단백질에 의해 나타나는 형광 패턴 및 나노입자 사이의 가교 역할을 수행하는 제2융합단백질에 의해 나타나는 형광 패턴과 동일할 경우, 이는 미끼 단백질과 표적 단백질이 동일한 위치에 존재함을 간접적으로 증명하는 것이고, 이는 결국 미끼 단백질과 표적 단백질 사이의 상호작용에 대한 증거가 된다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 자기조립단백질, 제1형광단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1발현벡터; 광조사에 의해 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상호작용하는 짝 단백질, 제2형광단백질 및 미끼단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2발현벡터; 및 상기 미끼 단백질과 상호작용 여부 확인대상인 표적 단백질 및 제3형광단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제3발현벡터를 포함하며,
다만, 상기 제1형광단백질 내지 제3형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하고, 상기 광 유도 이형 이합체 형성 단백질은 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 단백질이며, 상기 자기조립단백질이 DsRed인 경우, 상기 제1융합단백질에서 제1형광단백질은 생략이 가능한, 단백질간 상호작용 분석용 키트가 제공된다(도 8).
본 발명의 일 관점에 따르면, 자기조립단백질, 제1형광단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1발현벡터; 광조사에 의해 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상호작용하는 짝 단백질 및 제2형광단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 미끼 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 상기 제2폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결될 수 있는 다중 클로닝 부위를 포함하는 제2발현벡터; 및 제3형광단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 상기 미끼 단백질과 상호작용 여부 확인대상인 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 제3폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결될 수 있는 다중 클로닝 부위를 포함하는 제3발현벡터를 포함하며, 다만, 상기 제1형광단백질 내지 제3형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하고, 상기 광 유도 이형 이합체 형성 단백질은 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 단백질이며, 상기 자기조립단백질이 DsRed인 경우, 상기 제1융합단백질에서 제1형광단백질은 생략이 가능한, 단백질간 상호작용 분석용 키트가 제공된다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 제1형광단백질 내지 제3형광단백질은 각각 독립적으로 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CRY 또는 PHR일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성할 수 있는 단백질로서, CIB 또는 CIBN 일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 프로모터는 진핵 프로모터일 수 있다.
도 8에서 보는 바와 같이, 본 발명은 광조사에 의해 짝 단백질과 이형 이합체를 형성함은 물론, 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 이용하여, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 및 자기조립단백질을 포함하는 단일 나노입자를 이용하여 구현될 수 있다. 구체적으로, 자기조립단백질, 제1형광단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질로 구성되는 제1융합단백질을 발현할 수 있는 제1발현벡터; 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상호작용하는 짝 단백질, 제2형광단백질 및 미끼 단백질로 구성된 제2융합단백질을 발현할 수 있는 제2발현벡터; 상기 미끼 단백질과 상호작용 여부 확인대상이 되는 표적단백질 및 제3형광단백질로 구성되는 제3융합단백질을 발현할 수 있는 제3발현벡터를 제작함으로써 구현될 수 있다. 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 광유도 이형 이합체 형성 단백질로는 CRY나 이의 N-말단 도메인인 PHR을 사용할 수 있고, 이에 대한 짝 단백질로는 CIB나 이의 N-말단인 CIBN을 사용할 수 있다. 상기 발현벡터들을 세포내에 공형질도입한 후, 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 짝 단백질 사이의 이형 이합체 형성을 유도하는 파장의 빛을 조사할 경우, 광유도 나노클러스터가 형성되고 이 경우 제1형광단백질과 제2형광단백질에 의한 형광 패턴이 동일하게 나타난다. 즉, 나노클러스터 형성에 따라 제1형광단백질에 의한 형광은 당해 융합단백질이 발현된 장소에서 다수의 강한 점의 형태로 나타나게 되고, 이와 동 위치에 제2형광단백질에 의한 형광 역시 강한 점의 형상으로 나타나게 된다. 한편, 표적 단백질과 연결된 제3형광단백질에 의한 형광은 상기 미끼 단백질과 상기 표적 단백질 사이의 상호작용 여부에 따라 다르게 나타난다. 즉, 상기 표적 단백질과 상기 미끼 단백질 사이에 상호작용이 일어나면, 제3형광단백질에 의한 형광 역시 상기 제1형광단백질 및 상기 제2형광단백질에 의한 형광과 동일한 위치에 동일한 양상으로 나타나고, 상호작용이 일어나지 않으면, 제3형광단백질에 의한 형광은 광조사 이전과 변함없이, 당해 제3융합단백질의 발현장소에서 분산된 형태의 형광으로 나타나게 된다.
아울러, 상기 단백질간 상호작용 분석방법은 단백질간 상호작용의 조절물질 즉, 특정 단백질간의 상호작용을 촉진하는 물질 또는 특정 단백질간의 상호작용을 억제하는 물질을 탐색하기 위한 용도로 사용될 수 있다. 생명 현상은 특정 단백질간의 상호작용, 예를 들어 수용체와 이에 특이적으로 결합하는 리간드 간의 상호작용의 결과로 나타나는 경우가 많고 이러한 단백질간 상호작용이 비정상적으로 이루어질 때 병리현상으로 발전할 수 있다. 따라서, 특정 단백질간의 상호작용을 촉진 또는 억제하는 물질은 해당 단백질간 상호작용과 관련된 질병의 치료제가 될 가능성이 높다. 따라서, 본 발명의 키트 및 방법은 질병 치료제 후보물질의 세포수준의 스크리닝 방법으로 매우 효율적으로 사용될 수 있다.
본 발명자들은 실제 CIBN과 CaMKIIα의 결합도메인(AD)를 연결한 융합단백질과 PHR과 Hras가 연결된 융합단백질 및 RBDraf1을 세포 내에서 동시에 발현시킨 후, CIBN과 PHR 사이의 상호작용을 유도하는 488 nm 파장의 청색광을 조사한 후 형광패턴을 분석함으로써 상기 Hras와 RBDraf1 사이의 상호작용을 확인할 수 있었다(도 18 참조).
본 발명의 일 관점에 따르면, 자기조립단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질를 포함하는 융합단백질, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상호작용하여 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질 및 표적 단백질과 상호작용을 하는 미끼 단백질을 상기 표적 단백질을 내재적 단백질로 발현하는 세포 또는 개체에서 동시에 발현시키는 발현단계; 및 상기 세포 또는 개체에 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상기 짝 단백질 사이의 이형 이합체 형성을 유도하는 파장의 빛을 조사하여 광유도 나노클러스터 형성을 유도하는 나노클러스터 형성 유도단계를 포함하며, 상기 미끼 단백질은 상기 자기조립단백질 또는 상기 짝 단백질에 융합되어 발현되는 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해방법이 제공된다.
상기 방법에 있어서, 상기 자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 융합단백질, 짝 단백질 및 미끼 단백질 중 적어도 하나 이상에는 나노클러스터 형성 여부를 확인하기 위한 형광단백질이 연결될 수 있다. 이 때, 상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)일 수 있다. 여기서, 상기 녹색형광단백질은 EGFP, Emerald, Superfolder, GFP, Azami Green, TagGFP, TurboGFP, ZsGreen 또는 T-Sapphire일 수 있고, 상기 황색형광단백질은 EYFP, Topaz, Venus, mCitrine, Ypet, TagYFP, PhiYFP, ZsYellow1 또는 mBanana일 수 있으며, 상기 적색형광단백질은 mRuby, mApple, mStrawberry, AsRed2 또는 mRFP일 수 있고, 상기 주황형광단백질은 Kusabira Orange, Kusabira Orange2, mOrange, mOrange2, dTomato, dTomato-Tandem, TagRFP, TagRFP-T, DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRed-Monomer 또는 mTangerine일 수 있으며, 상기 시안형광단백질은 ECFP, mECFP, mCerulean, CyPet, AmCyan1, Midori-Ishi Cyan, TagCFP 또는 mTFP1일 수 있고, 상기 청색형광단백질은 EBFP, EBFP2, Azurite 또는 mTagBFP일 수 있고, 상기 원적색형광단백질은 mPlum, mCherry, dKeima-Tandem, JRed, mRaspberry, HcRed1, HcRed-Tandem 또는 AQ143일 수 있으며, 상기 테트라시스테인 모티프는 Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys(서열번호 1)의 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 Xaa는 시스테인을 제외한 아미노산일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성할 수 있는 단백질로서, CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 반대로 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1이다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있다. 이 경우 상기 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 CRY 또는 PHR일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 제1자기조립단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질, 제2자기조립단백질 및 광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 포함하는 제2융합단백질, 및 표적 단백질과 상호작용하는 미끼 단백질을 상기 표적 단백질을 내재적 단백질로 발현하는 세포 또는 개체에서 동시에 발현시키는 발현단계; 및 상기 세포 또는 개체에 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상기 짝 단백질 사이의 이형 이합체 형성을 유도하는 파장의 빛을 조사하여 광유도 나노클러스터 형성을 유도하는 나노클러스터 형성 유도단계를 포함하며, 상기 미끼 단백질은 상기 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질에 융합되어 발현되는 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해방법이 제공된다.
상기 방법에 있어서, 상기 제1자기조립단백질 및 제2자기조립단백질은 각각 독립적으로 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다. 단, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질이 동시에 사용되는 경우, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질은 동일할 수 있고, 서로 다른 종류의 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 융합단백질, 상기 짝 단백질 및 상기 미끼 단백질 중 적어도 하나 이상에는 나노클러스터 형성 여부를 확인하기 위한 형광단백질이 연결될 수 있다. 이 때, 상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성할 수 있는 단백질로서, CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 반대로 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1이다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있다. 이 경우 상기 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 CRY 또는 PHR일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 자기조립단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상호작용하여 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터 및 표적 단백질과 상호작용을 하는 미끼 단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 포함하며, 상기 미끼 단백질은 상기 자기조립단백질 또는 상기 짝 단백질에 융합되어 발현되는 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트가 제공된다.
상기 키트에 있어서, 상기 자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 융합단백질, 상기 짝 단백질 및 상기 미끼 단백질 중 적어도 하나 이상에는 나노클러스터 형성 여부를 확인하기 위한 형광단백질이 연결될 수 있다. 이 때, 상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)일 수 있다. 여기서, 상기 녹색형광단백질은 EGFP(enhanced green fluorescent protein), Emerald, Superfolder, GFP, Azami Green, TagGFP, TurboGFP, ZsGreen 또는 T-Sapphire일 수 있고, 상기 황색형광단백질은 EYFP(enhanced yellow fluorescent protein), Topaz, Venus, mCitrine, Ypet, TagYFP, PhiYFP, ZsYellow1 또는 mBanana일 수 있으며, 상기 적색형광단백질은 mRuby, mApple, mStrawberry, AsRed2 또는 mRFP일 수 있고, 상기 주황형광단백질은 Kusabira Orange, Kusabira Orange2, mOrange, mOrange2, dTomato, dTomato-Tandem, TagRFP, TagRFP-T, DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRed-Monomer 또는 mTangerine일 수 있으며, 상기 청록색형광단백질은 ECFP(enhanced cyan fluorescent protein), mECFP, mCerulean, CyPet, AmCyan1, Midori-Ishi Cyan, TagCFP 또는 mTFP1일 수 있고, 상기 청색형광단백질은 EBFP(enhanced blue fluorescent protein), EBFP2, Azurite 또는 mTagBFP일 수 있고, 상기 원적색형광단백질은 mPlum, mCherry, dKeima-Tandem, JRed, mRaspberry, HcRed1, HcRed-Tandem 또는 AQ143일 수 있으며, 상기 테트라시스테인 모티프는 Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys(서열번호 1)의 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 Xaa는 시스테인을 제외한 아미노산일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성할 수 있는 단백질로서, CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 반대로 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1이다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있다. 이 경우 상기 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 CRY 또는 PHR일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 제1자기조립단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터, 제2자기조립단백질 및 광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터, 및 표적 단백질과 상호작용하는 미끼 단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있는 다중 클로닝 부위 및 상기 프로모터를 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 포함하며, 상기 미끼 단백질은 상기 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질에 융합되어 발현되는 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트가 제공된다.
상기 키트에 있어서, 상기 제1자기조립단백질 및 제2자기조립단백질은 각각 독립적으로 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 융합단백질, 짝 단백질 및 미끼 단백질 중 적어도 하나 이상에는 나노클러스터 형성 여부를 확인하기 위한 형광단백질이 연결될 수 있다. 이 때, 상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)일 수 있다. 여기서, 상기 녹색형광단백질은 EGFP(enhanced green fluorescent protein), Emerald, Superfolder, GFP, Azami Green, TagGFP, TurboGFP, ZsGreen 또는 T-Sapphire일 수 있고, 상기 황색형광단백질은 EYFP(enhanced yellow fluorescent protein), Topaz, Venus, mCitrine, Ypet, TagYFP, PhiYFP, ZsYellow1 또는 mBanana일 수 있으며, 상기 적색형광단백질은 mRuby, mApple, mStrawberry, AsRed2 또는 mRFP일 수 있고, 상기 주황형광단백질은 Kusabira Orange, Kusabira Orange2, mOrange, mOrange2, dTomato, dTomato-Tandem, TagRFP, TagRFP-T, DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRed-Monomer 또는 mTangerine일 수 있으며, 상기 청록색형광단백질은 ECFP(enhanced cyan fluorescent protein), mECFP, mCerulean, CyPet, AmCyan1, Midori-Ishi Cyan, TagCFP 또는 mTFP1일 수 있고, 상기 청색형광단백질은 EBFP(enhanced blue fluorescent protein), EBFP2, Azurite 또는 mTagBFP일 수 있고, 상기 원적색형광단백질은 mPlum, mCherry, dKeima-Tandem, JRed, mRaspberry, HcRed1, HcRed-Tandem 또는 AQ143일 수 있으며, 상기 테트라시스테인 모티프는 Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys(서열번호 1)의 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 Xaa는 시스테인을 제외한 아미노산일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성할 수 있는 단백질로서, CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 반대로 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1이다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있다. 이 경우 상기 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 CRY 또는 PHR일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 자기조립단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상호작용하여 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터 및 표적 단백질과 상호작용을 하는 미끼 단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있는 다중 클로닝 부위 및 상기 프로모터를 포함하는 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 포함하며, 상기 미끼 단백질은 상기 자기조립단백질 또는 상기 짝 단백질에 융합되어 발현되는 있는 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트가 제공된다.
상기 키트에 있어서, 상기 자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 융합단백질, 상기 짝 단백질 및 상기 미끼 단백질 중 적어도 하나 이상에는 나노클러스터 형성 여부를 확인하기 위한 형광단백질이 연결될 수 있다. 이 때, 상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)일 수 있다. 여기서, 상기 녹색형광단백질은 EGFP(enhanced green fluorescent protein), Emerald, Superfolder, GFP, Azami Green, TagGFP, TurboGFP, ZsGreen 또는 T-Sapphire일 수 있고, 상기 황색형광단백질은 EYFP(enhanced yellow fluorescent protein), Topaz, Venus, mCitrine, Ypet, TagYFP, PhiYFP, ZsYellow1 또는 mBanana일 수 있으며, 상기 적색형광단백질은 mRuby, mApple, mStrawberry, AsRed2 또는 mRFP일 수 있고, 상기 주황형광단백질은 Kusabira Orange, Kusabira Orange2, mOrange, mOrange2, dTomato, dTomato-Tandem, TagRFP, TagRFP-T, DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRed-Monomer 또는 mTangerine일 수 있으며, 상기 청록색형광단백질은 ECFP(enhanced cyan fluorescent protein), mECFP, mCerulean, CyPet, AmCyan1, Midori-Ishi Cyan, TagCFP 또는 mTFP1일 수 있고, 상기 청색형광단백질은 EBFP(enhanced blue fluorescent protein), EBFP2, Azurite 또는 mTagBFP일 수 있고, 상기 원적색형광단백질은 mPlum, mCherry, dKeima-Tandem, JRed, mRaspberry, HcRed1, HcRed-Tandem 또는 AQ143일 수 있으며, 상기 테트라시스테인 모티프는 Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys(서열번호 1)의 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 Xaa는 시스테인을 제외한 아미노산일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성할 수 있는 단백질로서, CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 반대로 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1이다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있다. 이 경우 상기 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 CRY 또는 PHR일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 제1자기조립단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터, 제2자기조립단백질 및 광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터, 및 표적 단백질과 상호작용하는 미끼 단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 포함하며, 상기 미끼 단백질은 상기 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질에 융합되어 발현되는 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트가 제공된다.
상기 키트에 있어서, 상기 제1자기조립단백질 및 제2자기조립단백질은 각각 독립적으로 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 융합단백질, 짝 단백질 및 미끼 단백질 중 적어도 하나 이상에는 나노클러스터 형성 여부를 확인하기 위한 형광단백질이 연결될 수 있다. 이 때, 상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)일 수 있다. 여기서, 상기 녹색형광단백질은 EGFP(enhanced green fluorescent protein), Emerald, Superfolder, GFP, Azami Green, TagGFP, TurboGFP, ZsGreen 또는 T-Sapphire일 수 있고, 상기 황색형광단백질은 EYFP(enhanced yellow fluorescent protein), Topaz, Venus, mCitrine, Ypet, TagYFP, PhiYFP, ZsYellow1 또는 mBanana일 수 있으며, 상기 적색형광단백질은 mRuby, mApple, mStrawberry, AsRed2 또는 mRFP일 수 있고, 상기 주황형광단백질은 Kusabira Orange, Kusabira Orange2, mOrange, mOrange2, dTomato, dTomato-Tandem, TagRFP, TagRFP-T, DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRed-Monomer 또는 mTangerine일 수 있으며, 상기 청록색형광단백질은 ECFP(enhanced cyan fluorescent protein), mECFP, mCerulean, CyPet, AmCyan1, Midori-Ishi Cyan, TagCFP 또는 mTFP1일 수 있고, 상기 청색형광단백질은 EBFP(enhanced blue fluorescent protein), EBFP2, Azurite 또는 mTagBFP일 수 있고, 상기 원적색형광단백질은 mPlum, mCherry, dKeima-Tandem, JRed, mRaspberry, HcRed1, HcRed-Tandem 또는 AQ143일 수 있으며, 상기 테트라시스테인 모티프는 Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys(서열번호 1)의 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 Xaa는 시스테인을 제외한 아미노산일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성할 수 있는 단백질로서, CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 반대로 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1이다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있다. 이 경우 상기 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 CRY 또는 PHR일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 자기조립단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질를 포함하는 제1융합단백질, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상호작용하여 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질 및 표적 단백질을 세포 또는 개체에서 동시에 발현시키는 발현단계; 및 상기 세포 또는 개체에 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상기 짝 단백질 사이의 이형 이합체 형성을 유도하는 파장의 빛을 조사하여 광유도 나노클러스터 형성을 유도하는 나노클러스터 형성 유도단계를 포함하며, 상기 표적 단백질은 상기 자기조립단백질 또는 상기 짝 단백질에 융합되어 발현되는 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해방법이 제공된다.
상기 방법에 있어서, 상기 자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 융합단백질 및 상기 짝 단백질 중 적어도 하나 이상에는 나노클러스터 형성 여부를 확인하기 위한 형광단백질이 연결될 수 있다. 이 때, 상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)일 수 있다. 여기서, 상기 녹색형광단백질은 EGFP(enhanced green fluorescent protein), Emerald, Superfolder, GFP, Azami Green, TagGFP, TurboGFP, ZsGreen 또는 T-Sapphire일 수 있고, 상기 황색형광단백질은 EYFP(enhanced yellow fluorescent protein), Topaz, Venus, mCitrine, Ypet, TagYFP, PhiYFP, ZsYellow1 또는 mBanana일 수 있으며, 상기 적색형광단백질은 mRuby, mApple, mStrawberry, AsRed2 또는 mRFP일 수 있고, 상기 주황형광단백질은 Kusabira Orange, Kusabira Orange2, mOrange, mOrange2, dTomato, dTomato-Tandem, TagRFP, TagRFP-T, DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRed-Monomer 또는 mTangerine일 수 있으며, 상기 청록색형광단백질은 ECFP(enhanced cyan fluorescent protein), mECFP, mCerulean, CyPet, AmCyan1, Midori-Ishi Cyan, TagCFP 또는 mTFP1일 수 있고, 상기 청색형광단백질은 EBFP(enhanced blue fluorescent protein), EBFP2, Azurite 또는 mTagBFP일 수 있고, 상기 원적색형광단백질은 mPlum, mCherry, dKeima-Tandem, JRed, mRaspberry, HcRed1, HcRed-Tandem 또는 AQ143일 수 있으며, 상기 테트라시스테인 모티프는 Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys(서열번호 1)의 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 Xaa는 시스테인을 제외한 아미노산일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성할 수 있는 단백질로서, CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 반대로 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1이다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있다. 이 경우 상기 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 CRY 또는 PHR일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 자기조립단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터, 및 광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터를 포함하며, 표적 단백질 및 상기 자기조립단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호호하하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 추가적으로 포함하거나, 상기 표적 단백질이 제2융합단백질에 포함되는, 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 자기조립단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터, 및 광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터를 포함하며, 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있는 다중 클로닝 부위 및 상기 자기조립단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제3유전자컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 추자적으로 포함하거나, 상기 표적단백질이 상기 제2융합단백질에 포함되어 발현될 수 있도록, 상기 제2폴리뉴클레오티드 내에 상기 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결될 수 있는 다중 클로닝 부위가 포함되는, 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트가 제공된다.
상기 키트에 있어서, 상기 융합단백질 및 상기 짝 단백질 중 적어도 하나 이상에는 나노클러스터 형성 여부를 확인하기 위한 형광단백질이 연결될 수 있다. 이 때, 상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)일 수 있다. 여기서, 상기 녹색형광단백질은 EGFP(enhanced green fluorescent protein), Emerald, Superfolder, GFP, Azami Green, TagGFP, TurboGFP, ZsGreen 또는 T-Sapphire일 수 있고, 상기 황색형광단백질은 EYFP(enhanced yellow fluorescent protein), Topaz, Venus, mCitrine, Ypet, TagYFP, PhiYFP, ZsYellow1 또는 mBanana일 수 있으며, 상기 적색형광단백질은 mRuby, mApple, mStrawberry, AsRed2 또는 mRFP일 수 있고, 상기 주황형광단백질은 Kusabira Orange, Kusabira Orange2, mOrange, mOrange2, dTomato, dTomato-Tandem, TagRFP, TagRFP-T, DsRed, DsRed2, DsRed-Express, DsRed-Monomer 또는 mTangerine일 수 있으며, 상기 청록색형광단백질은 ECFP(enhanced cyan fluorescent protein), mECFP, mCerulean, CyPet, AmCyan1, Midori-Ishi Cyan, TagCFP 또는 mTFP1일 수 있고, 상기 청색형광단백질은 EBFP(enhanced blue fluorescent protein), EBFP2, Azurite 또는 mTagBFP일 수 있고, 상기 원적색형광단백질은 mPlum, mCherry, dKeima-Tandem, JRed, mRaspberry, HcRed1, HcRed-Tandem 또는 AQ143일 수 있으며, 상기 테트라시스테인 모티프는 Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys(서열번호 1)의 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 Xaa는 시스테인을 제외한 아미노산일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성할 수 있는 단백질로서, CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 반대로 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1이다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있다. 이 경우 상기 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 CRY 또는 PHR일 수 있다.
이하 상기 가역적 단백질 기능 저해방법 및 키트를 도면에 의해 보다 상세하게 설명한다.
도 9는 본 발명의 광유도 나노클러스터 형성에 의한 표적 단백질의 기능 저해방법의 개념을 나타내는 개요도이다. 세포 내에 미끼 단백질과 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 가지고 있는 나노입자와 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 발현시킨 후, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상기 짝 단백질의 이형 이합체 형성을 유도하는 파장의 빛을 조사하여 상기 나노입자간의 클러스터(나노클러스터)를 형성시킬 경우, 상기 미끼 단백질에 포획된 상기 표적 단백질은 결국 상기 나노클러스터 내에 감금된다.
도 10은 세포의 부분영역(active region)에 대하여 특정 파장의 광조사를 통한 나노클러스터 형성과 상기 부분영역에 존재하는 활성단백질과 상호작용하는 표적단백질의 감금을 통한 상기 활성 단백질의 기능 저해를 개념적으로 나타내는 개요도이다. 레이져 등을 이용하면 세포내의 특정 부분에만 광을 조사할 수 있기 때문에, 본 발명의 방법은 세포내 일부 구역의 단백질 기능 저해에 따른 효과를 조사할 때 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 11은 개체 또는 조직 등 다세포영역에서 특정 세포영역에 대한 광조사를 통한 나노클러스터 형성과 상기 특정 세포영역에 존재하는 표적단백질의 기능 저해를 개념적으로 나타내는 개요도이다. 본 발명의 방법은 한 시료 내에서 인접한 실험군과 대조군 상이의 변화를 비교하여 관찰할 수 있다는 점에서 매우 유용한 방법이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 광조사를 통한 나노클러스터 형성과 그에 의한 분자기능 조절 방법을 개념적으로 나타낸 개요도이다. 도 12에 나타난 바와 같이, 나노입자는 자기조립단백질(SAP)과 광유도 이형 이합체 형성 단백질(예컨대, CIBN)의 융합단백질과, 상기 자기조립단백질과 미끼 단백질의 융합단백질의 자기조립에 의해 형성된 이형 복합체로서 미끼 단백질은 세포에 내재하고 있는 표적 단백질을 포획하는 미끼 역할을 수행하고, 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 동형 이합체를 형성하고 있는 짝 단백질(예컨대, PHR)과 광조사시 상호작용을 통해 나노클러스터를 형성하게 되고, 미끼 단백질에 포획된 표적 단백질은 결국 상기 나노클러스터 내에 감금되게 된다.
도 13은 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 두 가지 다른 나노입자에 대한 광조사에 의한 나노클러스터의 형성과 그에 의한 분자기능 조절 방법을 개념적으로 나타낸 개요도이다. 이 경우 제1나노입자는 제1자기조립단백질(1st SAP)과 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질과 상기 제1자기조립단백질과 미끼 단백질을 포함하는 제2융합단백질의 자기조립에 의해 이형 복합체로 형성되고, 제2나노입자는 제2자기조립단백질(2nd SAP)과 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 포함하는 제3융합단백질의 자기조립에 의해 형성되는데, 상기 제1나노입자와 제2나노입자의 표면에 노출된 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 짝 단백질이 광조사에 의해 상호작용함으로써 나노클러스터가 형성되면 미끼 단백질에 포획된 표적 단백질은 결국 상기 나노클러스터 내에 감금되게 된다.
도 14는 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 광조사를 통한 나노클러스터 형성과 그에 의한 분자기능 조절 방법을 개념적으로 나타낸 개요도이다. 이 경우, 나노입자는 자기조립단백질과 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질의 자기조립에 의해 형성되는 동형 복합체로서, 광조사와 무관하게 동형이합체를 형성하는 짝 단백질과 미끼 단백질을 포함하는 제2융합단백질을 세포 내에서 동시에 발현시킨 후, 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 짝 단백질 사이의 이형 이합체 형성을 유도하는 파장의 광조사시 나노클러스터가 형성되며, 세포에 내재하고 있는 표적 단백질은 미끼 단백질에 포획되어 결국 상기 나노클러스터 내에 감금된다.
도 15는 본 발명의 다른 실시예에 따른 광조사를 통한 나노클러스터 형성과 그에 의한 분자기능 조절 방법을 개념적으로 나타낸 개요도이다. 도 15에서 나타난 바와 같이, 나노입자는 자기조립단백질과 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성하는 광유도 이형 이합체 형성 단백질(예컨대, PHR)을 포함하는 제1융합단백질의 자기조립에 의해 형성되는 동형 복합체이고, 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질과 미끼 단백질을 포함하는 제2융합단백질을 동시에 발현시킨 뒤, 광조사를 통해 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 짝 단백질 사이의 이형 이합체 형성을 유도하면, 세포에 내재하고 있는 표적 단백질은 미끼 단백질에 포획되어 결국 상기 나노클러스터에 감금된다.
도 16은 도 14에 도시된 본 발명의 일 실시예 따른 방법을 이용한 광조사를 통한 나노클러스터 형성과 이를 이용한 PI3K 단백질의 기능 조절을 도식적으로 나타낸 개요도이다. 세포질 내 단백질인 p110(PI3K catalytic subunit)은 PDGF(platelet-derived growth factor)와 같은 성장인자를 세포에 처리하면, 세포막에 부착된 기질인 PIP2(phosphatidyl-inositol-4,5-bisphosphate)을 인산화시키는데, PIP2의 인산화로 PIP3(phosphatidyl-inositol-3,4,5-bisphosphate)가 생성되면, 세포질에 있던 PIP3 바이오센서인 Akt단백질의 PH도메인이 생성된 PIP3를 인식하여 세포막으로 이동하게 된다. 그러나, 본 발명의 광유도 나노클러스터 형성을 통하여 세포질 내의 내재 단백질인 p110을 미끼 단백질로서 PI3K 조절 서브유닛인 p85의 iSH2(inter Src homology 2 domain) 단백질로 포획하여 상기 나노클러스터 내에 감금시키면, PIP2의 인산화가 저해되어 결국, PH 도메인의 세포막으로의 이동이 저해될 수 있다.
도 17은 본 발명의 다른 실시예에 따른 광조사를 통한 나노클러스터 형성과 그에 의한 분자기능 조절 방법을 개념적으로 나타낸 개요도이다. 이 개요도는 과발현된 표적단백질이 세포 내에 기능을 작용하다가 광조사에 따른 나노클러스터 형성에 의해 표적단백질이 감금되는 것에 대한 방법으로, 도 17에서 나타난 바와 같이 나노입자는 자기조립단백질과 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질의 자기조립에 의해 형성되는 동형 복합체로서, 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성하는 짝 단백질과 표적 단백질을 포함하는 제2융합단백질을 세포 내에서 동시에 발현시킨 후, 상기 광조사 이형 이합체 형성 단백질과 상기 짝 단백질 사이의 이형 이합체 형성을 유도하는 파장의 광조사시 나노클러스터가 형성되며, 표적단백질이 상기 나노클러스터 내에 감금된다.
본 발명의 발명자들은 도 17에 도시된 개념을 실험적으로 입증하기 위하여, CaMKIIα 유전자(GenBank No.: NM_012920)의 자기조립에 관여하는 결합도메인(association domain, AD)과 광유도 이형 이합체를 형성하는 CIBN(N-terminal of cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix)의 융합단백질을 세포 내에 발현시켜서 자기조립단백질의 자기조립에 의한 나노입자를 형성시키고, 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성하는 단백질이자 광유도에 따라 상기 CIBN과 이형 이합체를 형성하는 PHR(photolyase homologous region of cryptochrome 2)을 표적 단백질 Vav2(DH-PH) 단백질과 융합단백질로 발현시킨 뒤, 상기 CIBN과 PHR 사이의 이형 이합체를 형성할 수 있는 488 nm 파장의 청색광을 조사할 경우, 나노 클러스터가 형성되고 나노 클러스터 내에 상기 Vav2 단백질이 포획되어, Vav2에 의해 유도된 접착용 세포체(lamellipodia)의 형성이 억제됨을 실험적으로 입증하였다(도 19 참조). 반면, 표적 단백질인 Vav2가 누락된 유전자 컨스트럭트를 사용할 경우에는 나노클러스터는 형성되지만, 접착용 세포체의 형성은 광조사 전이나 후나 차이가 없음을 알 수 있었다(도 19 참조). 따라서, 본 발명의 방법 및 키트는 세포 내에 발현된 또는 내재하고 있는 특정 표적 단백질 및 생화학적 경로상 그 하위에 존재하는 단백질의 기능을 유효 적절하게 그리고 가역적으로 조절할 수 있는 유용한 방법임을 알 수 있다.
실시예 1: 벡터의 제작
1-1: CIBN-CFP-AD 컨스트럭트의 제작
CaMKIIα 유전자(GenBank No.: NM_012920)의 자기조립에 관여하는 결합도메인(Association domain (AD), CaMKIIα의 315-478 아미노산 잔기)의 N-말단에 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP)와 CIB1(cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix 1) 유전자(GenBank No.: NM_119618) 광유도 단백질 상호작용에 참여하는 N-말단(CIBN, CIB1의 1-170 아미노산 잔기)를 순차적으로 융합시킨 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제조한 후, 이를 pCFP-C1 벡터(Clontech, USA)에 삽입하여 CIBN-CFP-AD 컨스트럭트를 제작하였다(도 1).
1-2: PHR CRY2 -mCherry 컨스트럭트의 제작
CRY2 유전자(GenBank No.: NM_100320)의 PHR 도메인(photolysase-related domain)에 해당하는 1-498 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 pmCherry-N1 벡터(Clontech, USA)에 삽입하여 PHRCRY2-mCherry 컨스트럭트를 제작하였다. CRY 단백질 또는 PHR은 세포 내에서 발현시킬 경우 동형 이합체를 형성한다(도 1).
실시예 2: 단백질 상호작용 분석용 벡터의 제작
본 발명자들은 상기 실험예 1의 결과를 토대로 본 발명의 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질 상호작용 분석방법을 다른 단백질간의 상호작용 분석에 활용할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 미끼 단백질과 표적 단백질을 발현할 수 있는 발현벡터를 하기와 같이 제작하였다.
2-1: PHR-ECFP-Hras(active) 컨스트럭트의 제작
CRY2(GenBank No.: NM_100320) PHR 부분(1-498)을 ECFP의 N-말단에 연결하고, 상기 ECFP의 C-말단에 미끼 단백질로서 활성형 Hras(GenBank No.: NM_001130442.1, Q61L mutant, CAAX-deleted)가 위치하는 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제조한 후, 이를 pECFP-C1 벡터(Clontech, USA)에 삽입하여 PHR-ECFP-Hras(active) 컨스트럭트를 제작하였다.
2-2: YFP-RBD raf1 컨스트럭트의 제작
pYFP 벡터(Clontech, USA)의 YFP를 암호화하는 유전자의 3'-말단에 Raf1(GenBank No.: NM_002880.3)의 Ras 결합 도메인(RBDraf1, 51-131 아미노산 잔기)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 프레임에 맞게 삽입하여 YFP-RBDraf1 컨스트럭트를 제작하였다.
2-3: YFP-RBD p110 컨스트럭트의 제작
pYFP 벡터(Clontech, USA)의 YFP를 암호화하는 유전자의 3'-말단에 p110 alpha(GenBank No.: NM_006218.2)의 Ras 결합 도메인(RBDp100, 133-332 아미노산 잔기)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 프레임에 맞게 삽입하여 YFP-RBDp100 컨스트럭트를 제작하였다.
2-4: PHR-ECFP-Hras(inactive) 컨스트럭트의 제작
상기 실시예 2-1에서 제작한 PHR-ECFP-Hras(active) 컨스트럭트에서 Hras(active) 유전자를 Hras(inactive) 유전자(S17N mutant, CAAX-deleted)로 치환하여 PHR-ECFP-Hras(inactive) 컨스트럭트를 제작하였다.
2-5: YFP-CRIB PAK1 컨스트럭트의 제작
상기 실시예 2-3에서 제작한 YFP-RBDp100 컨스트럭트에서 RBDp100 유전자를 CRIBPAK1 유전자(GenBank No.: NM_001128620.1 69-108 아미노산 잔기)로 치환하여 pYFP-CRIBPAK1 컨스트럭트를 제작하였다.
실시예 3: 가역적 단백질 저해용 벡터 제작
3-1: CIBN-mCerulean-AD 컨스트럭트의 제작
CaMKIIα 유전자(GenBank 등록번호: NM_012920)의 자기조립에 관여하는 결합도메인(Association domain (AD), CaMKIIα의 315-478 아미노산 잔기)의 N-말단에 시안형광단백질(mCerulean)와 CIB1 유전자(GenBank 등록번호: NM_119618) 광유도 단백질 상호작용에 참여하는 N-말단(CIBN, CIB1의 1-170 아미노산 잔기)를 순차적으로 융합시킨 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제조한 후, 이를 pmCerulean-C1 벡터(Clontech, USA)에 삽입하여 CIBN-mCerulean-AD 컨스트럭트를 제작하였다.
3-2: mCitrine-PHR CRY2 컨스트럭트의 제작
CRY2 유전자(GenBank No.: NM_100320)의 PHR에 해당하는 1-498 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 pmCitrine-C1 벡터(Clonthch, USA)에 삽입하여 mCitrine-PHRCRY2 컨스트럭트를 제작하였다. CRY 단백질 또는 PHR은 세포 내에서 발현시킬 경우 동형 이합체를 형성한다.
3-3: mCitrine-PHR CRY2 -Rit tail 컨스트럭트의 제작
CRY2(GenBank 등록번호: NM_100320) PHR 부분(1-498)을 mCitrine의 C-말단에 연결하고, 상기 PHR의 C-말단에 세포막에 위치하는 단백질인 Rit(GeneBank 등록번호: NM_006912)의 꼬리(tail, 아미노 잔기 : 193-219)를 순차적으로 융합시킨 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제조한 후, 이를 mCitrine-C1 벡터(Clontech, USA)에 삽입하여 mCitrine-PHRCRY2-Rit tail 컨스트럭트를 제작하였다. Rit tail은 세포막에 존재하는 음전하를 띠는 인지질에 직접 전기적으로 부착되는 단백질로서 세포막으로 단백질을 포획할 수 있다.
3-4: mCitrine-PHR CRY2 -DHPH Vav2 -Rit tail 컨스트럭트의 제작
mCitrine의 C-말단에 CRY2 유전자(GenBank No.: NM_100320)의 PHR 부분(1-498)과 표적단백질로서 접착용 세포체(lamellipodia)의 형성을 유도하는 Vav2(GenBank 등록번호: NM_001134398)의 DH-PH(아미노 잔기 : 167-541)부분 그리고 Rit 단백질(GeneBank 등록번호: NM_006912)의 꼬리 부분(tail, 아미노 잔기: 193-219)을 순차적으로 융합시킨 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제조한 후, 이를 pmCitrine-C1 벡터(Clontech, USA)에 삽입하여 mCitrine-PHRCRY2-DHPHVav2-Rit tail 컨스트럭트를 제작하였다. Vav2 단백질은 PH 도메인을 갖고서 세포막으로 약하게 이동하여 세포막에 존재하는 단백질을 활성화시키기 때문에, Rit tail이 없더라도 세포막에서의 기능을 발휘할 수 있으나, 본 발명의 실시예에서는 Vav2 단백질의 세포막으로의 recruit를 보다 확실하게 하기 위하여 Rit tail 컨스트럭트를 사용하였다.
3-5: mCherry-lifeact 컨스트럭트의 제작
Abp140(actin binding protein 140, GenBank 등록번호: NM_001183658) N-말단 부분(1-17)으로 이루어진 펩티드로서 F-액틴을 시각화하기 위한 마커인 lifeact(Riedl et al., Nat. Methods, 5: 605-607, 2008)를 pmCherry-C1(Clonetech, USA)의 C-말단에 삽입하여, mCherry-lifeact 컨스트럭트를 제조하였다.
실험예 1: 광유도에 의한 나노클러스터 형성 여부 확인
상기 실시예 1에서 제작한 CIBN-RFP-FT 컨스트럭트와 CRY2 컨스트럭트를 미리 배양한 Cos-7 세포(ATCC No. CRL-1651)에 공형질도입한 후, CIBN과 CRY2 사이의 상호작용을 유발하는 488 nm 파장의 청색광을 12초 간격으로 1초씩 총 5초 동안 조사한 후, 세포 내의 형광을 관찰하였다. 그 결과, 빛을 조사한 경우에는 세포질 내에 분산되어 있던 적색 형광이 다수의 강한 점의 형태로 나타났다가, 시간이 지나면 세포질 내로 다시 분산된 형태로 나타남을 알 수 있었다(도 2). 이를 형광을 띠는 점의 수를 세는 방식으로 분석한 경우에도 빛의 조사시 점의 갯수가 급격히 증가하였다가 시간이 지남에 따라 점의 수가 점진적으로 줄어드는 양상을 발견할 수 있다(도 3). 이로써, 본 발명자들은 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 자기조립단백질을 포함하는 융합단백질에 의해 형성된 나노입자가 빛의 조사에 의해 짝 단백질과의 상호작용을 통해 클러스터를 형성하여 이를 시각화할 수 있음을 증명하였다.
실험예 2: 단백질 상호작용 분석
2-1: CIBN-RFP-AD, PHR-ECFP-Hras(active) 및 YFP-RBD raf1 의 공형질도입
미리 배양된 Cos-7 세포(ATCC No. CRL-1651)에 실시예 1-1에서 제작한 CIBN-RFP-AD 컨스트럭트, 실시예 2-1에서 제작한 PHR-CFP-Hras(active) 컨스트럭트 및 실시예 2-2에서 제작한 YFP-RBDraf1 컨스트럭트를 전기천공법(electroporation - 1000 V, 35 ms, 2 pulses)을 사용하여 같이 도입시킨 후, 세포를 96-well glass bottom plate(Matrical Bioscience, USA)에 깔고 37℃로 고정된 10% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하며 상기 융합 단백질을 발현시켰다.
2-2: CIBN-RFP-AD, PHR-ECFP-Hras(active) 및 YFP-RBD p110 의 공형질도입
미리 배양된 Cos-7 세포(ATCC No. CRL-1651)에 실시예 1-1에서 제작한 CIBN-RFP-AD 컨스트럭트, 실시예 2-1에서 제작한 PHR-CFP-Hras(active) 컨스트럭트 및 실시예 2-3에서 제작한 YFP-RBDp110 컨스트럭트를 전기천공법(electroporation - 1000 V, 35 ms, 2 pulses)을 사용하여 같이 도입시킨 후, 세포를 96-well glass bottom plate(Matrical Bioscience, USA)에 깔고 37℃로 고정된 10% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하며 상기 융합 단백질을 발현시켰다.
2-3: CIBN-RFP-AD, PHR-ECFP-Hras(inactive) 및 YFP-RBD raf1 의 공형질도입
음성 대조군으로서, 미리 배양된 Cos-7 세포(ATCC No. CRL-1651)에 실시예 1-1에서 제작한 CIBN-RFP-AD 컨스트럭트, 실시예 2-4에서 제작한 PHR-CFP-Hras(inactive) 컨스트럭트 및 실시예 2-2에서 제작한 YFP-RBDraf1 컨스트럭트를 전기천공법(electroporation - 1000 V, 35 ms, 2 pulses)을 사용하여 같이 도입시킨 후, 세포를 96-well glass bottom plate(Matrical Bioscience, USA)에 깔고 37℃로 고정된 10% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하며 상기 융합 단백질을 발현시켰다.
2-4: CIBN-RFP-AD, PHR-ECFP-Hras(active) 및 YFP-CRIB PAK1 의 공형질도입
역시 음성 대조군으로서, 미리 배양된 Cos-7 세포(ATCC No. CRL-1651)에 실시예 1-1에서 제작한 CIBN-RFP-AD 컨스트럭트, 실시예 2-1에서 제작한 PHR-CFP-Hras(active) 컨스트럭트 및 실시예 2-5에서 제작한 YFP-CRIBPAK1 컨스트럭트를 전기천공법(electroporation - 1000 V, 35 ms, 2 pulses)을 사용하여 같이 도입시킨 후, 세포를 96-well glass bottom plate(Matrical Bioscience, USA)에 깔고 37℃로 고정된 10% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하며 상기 융합 단백질을 발현시켰다.
2-5: 광조사에 따른 나노클러스 형성 여부 분석
상기 실험예 2-1 내지 2-4에서 공형질도입된 각각의 세포에 CIBN과 CRY2 사이의 상호작용을 유발하는 488 nm 파장의 청색광을 10초 간격으로 1초씩 총 7초 동안 조사한 후, 세포 내의 형광을 관찰하였다(도 18). 그 결과, CIBN-RFP-AD 컨스트럭트, PHR-ECFP-Hras(active) 컨스트럭트 및 YFP-RBDraf1 컨스트럭트를 공형질도입한 세포에 빛을 조사한 경우 적색, 청록색 및 황색 형광 모두 분산된 형태에서 강한 점의 형태로 변화되어 나타났으며, 형광 점의 패턴이 각 색깔별로 동일하여, 이들 형광을 나타내는 형광단백질이 동일한 위치에 존재하고 있음을 알 수 있었다(도 18a). 이는 자기조립단백질인 CaMKIIα의 AD(집합 도메인)에 의해 자기조립된 나노입자가 서로 상호작용에 의해 나노클러스터를 형성하였음을 의미하며, 동형 이합체를 형성한 PHR-CFP-Hras(active) 융합단백질이 자기조립 나노입자를 형성하는 CIBN-RFP-AD 융합단백질과 상호작용하면서 미끼 단백질로 사용된 Hras(active) 단백질이 표적 단백질인 RBDraf1 단백질과 상호작용하였음을 증명하는 것이다.
아울러, CIBN-RFP-AD 컨스트럭트, PHR-ECFP-Hras(active) 컨스트럭트 및 YFP-RBDp110 컨스트럭트를 공형질도입시킨 세포에 빛을 조사한 경우에도, 상기와 같이, 적색, 청록색 및 황색 형광 모두 분산된 형태에서 강한 점의 형태로 변화되어 나타났으며, 형광 점의 패턴이 각 색깔별로 동일하여, 이들 형광을 나타내는 형광단백질이 동일한 위치에 존재하고 있음을 알 수 있었다(도 18c).
반면, CIBN-RFP-AD 컨스트럭트, PHR-ECFP-Hras(inactive) 컨스트럭트 및 YFP-RBDraf1를 공형질도입시킨 세포(도 18b)와 CIBN-RFP-AD 컨스트럭트, PHR-ECFP-Hras(active) 컨스트럭트 및 YFP-CRIBPAK1 컨스트럭트를 공형질도입시킨 세포(도 18d)의 경우 빛 조사시 적색과 청록색 형광은 다수의 강한 점의 형태로 나타나고 그 패턴이 일치된 반면, 황색 형광은 아무런 변화가 없었다.
이는, 미끼 단백질과 표적 단백질 사이에 아무런 상호작용이 없는 경우 설명이 되는데(도 7), 자기조립된 광유도 이형 접합체 형성 단백질인 CIBN이 빛의 조사에 의해 동형 이합체를 형성한 PHR-ECFP-미끼단백질과 상호작용함으로써, 나노클러스터는 형성되었으나, 미끼단백질과 표적단백질 사이의 상호작용의 실패로 인하여, 표적단백질이 상기 나노클러스터와 복합체를 형성하지 못함으로 인하여 표적단백질에 연결된 형광이 그대로 분산된 형태로 나타나기 때문이다.
한편, 만일 광유도 이형 이합체 형성 단백질 사이의 동형 이합체 형성이 발생할 경우, 광유도 단백질 상호작용이 없는 경우에도 나노클러스터가 형성되고, 짝 단백질과의 상호작용이 저해되기 때문에, 이를 충분히 구분할 수 있게 된다.
이와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 상호작용 분석용 키트 및 방법은 위양성 및 위음성의 가능성을 배제한 채 다른 단백질간의 상호작용 분석에 유용하게 사용될 수 있다.
실험예 3: 광유도에 의한 단백질 기능저해 여부 확인
상기 실시예 3-1, 3-4 및 3-5 에서 각각 제작한 CIBN-mCerulean-AD 컨스트럭트, mCitrine-PHRCRY2-DHPHVav2-Rit tail 컨스트럭트 및 mCherry-lifeact 컨스트럭트를 미리 배양한 NIH-3T3 세포(ATCC No. CRL-1658)에 공형질도입한 후, CIBN과 CRY2 사이의 상호작용을 유발하는 488 nm 파장의 청색광을 10초 간격으로 4분 동안 조사하고 시간의 경과에 따른 세포 내의 형광의 양상을 관찰하였다. 그 결과, 빛을 조사한 경우에는 세포질 내에 강한 녹색 형광 점이 형성되어, 나노클러스터가 형성되었음을 알 수 있었고, 라멜라포디아(lamellipodia) 형성이 저해되는 것을 관찰하였다(도 19). 본 발명의 발명자들은 이러한 접착용 세포체 형성 저해가 Vav2 단백질의 나노클러스터 내의 감금에 의한 것인지 확증하기 위하여, 상기 실시예 3-4에서 제조한 mCitrine-PHRCRY2-DHPHVav2-Rit tail 대신, 상기 실시예 1-3에서 제작한 DHPHVav2가 생략된 mCitrine-PHRCRY2-Rit tail을 사용하여, 동일한 실험을 수행하였다. 그 결과, 도 19에서 나타난 바와 같이, 광조사를 한 경우에 나노클러스터는 형성되었으나, 세포체 형성은 이와 무관한 것으로 관찰하였다. 이는, 본 발명의 방법이 제대로 작동하고 있음을 증명하는 것이다.
본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른, 광유도 단백질 나노클러스터 형성방법은 다양한 단백질간의 상호작용의 분석 및 특정 표적 단백질의 기능의 가역적 저해를 통해 단백질의 기능 연구를 위한 도구로 매우 유용하게 사용될 수 있다.
서열번호 1은 테트라시스테인 형광 모티프(tetracysteine fluorescent motif)의 아미노산 서열이다.

Claims (63)

  1. 광유도 이형 이합체 형성 단백질 및 자기조립단백질을 포함하는 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR인, 발현벡터.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed인, 발현벡터.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질인, 발현벡터.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 융합단백질의 N-말단 또는 C-말단에 형광단백질이 부가되거나, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상기 자기조립단백질 사이에 상기 형광단백질이 삽입되는, 발현벡터.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)인, 발현벡터.
  7. 광유도 이형 이합체 형성 단백질 및 제1자기조립단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1발현벡터; 및
    상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질 또는 상기 짝 단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2발현벡터를 포함하는 광유도 단백질 나노클러스터 형성용 키트.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR이고, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1인, 광유도 단백질 나노클러스터 형성용 키트.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 1자기조립단백질 및 제2자기조립단백질은 각각 독립적으로 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질인, 광유도 단백질 나노클러스터 형성용 키트.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 제1융합단백질, 짝 단백질 및 제2융합단백질 중 적어도 하나 이상은 형광단백질을 추가로 포함하는, 광유도 단백질 나노클러스터 형성용 키트.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 형광단백질은 상기 제1융합단백질, 짝 단백질 및/또는 제2융합단백질의 N-말단 또는 C-말단에 연결되거나, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상기 제1자기조립단백질 사이 또는 상기 짝 단백질과 상기 제2자기조립단백질 사이에 삽입되는, 광유도 단백질 나노클러스터 형성용 키트.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)인, 광유도 단백질 나노클러스터 형성용 키트.
  13. 광유도 이형 이합체 형성 단백질 및 제1자기조립단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1발현벡터; 및 상기 광유도 동형 이합체 형성 단백질과 동형 이합체를 형성하는 짝 단백질 또는 상기 짝 단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2발현벡터를 준비하는 발현벡터 준비단계;
    상기 제1발현벡터 및 제2발현벡터로 세포, 조직 또는 개체를 형질전환시키는 형질전환 세포, 조직 또는 개체의 제조단계; 및
    상기 형질전환 세포, 조직 또는 개체에 상기 광유도 이형 이합체 단백질과 상기 짝 단백질 사이의 이형 이합체 형성을 유도하는 파장의 빛을 조사하는 광조사단계를 포함하는 광유도 단백질 나노클러스터 형성방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR이고, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR이고, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1인, 광유도 단백질 나노클러스터 형성방법.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 제1자기조립단백질 및 제2자기조립단백질은 각각 독립적으로 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed인, 광유도 단백질 나노클러스터 형성방법.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 제1융합단백질, 짝 단백질 및 제2융합단백질 중 적어도 하나 이상은 형광단백질을 추가로 포함하는, 광유도 단백질 나노클러스터 형성방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 형광단백질은 상기 제1융합단백질, 짝 단백질 및/또는 제2융합단백질의 N-말단 또는 C-말단에 연결되거나, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상기 제1자기조립단백질 사이 또는 상기 짝 단백질과 상기 제2자기조립단백질 사이에 삽입되는, 광유도 단백질 나노클러스터 형성방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)인, 광유도 단백질 나노클러스터 형성방법.
  19. 1) 제1자기조립단백질, 제1형광단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질, 2) 선택적으로 제2형광단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질, 3) 제3형광단백질을 포함하는 제3융합단백질, 4) 광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질, 5) 미끼 단백질, 및 6) 상기 미끼 단백질과의 상호작용 여부의 분석대상인 표적 단백질을 세포 내에서 동시에 발현시키되, 상기 짝 단백질은 상기 제2융합단백질 또는 상기 제3융합단백질 중 어느 하나에 포함되어 발현되고, 상기 미끼 단백질은 상기 제2융합단백질, 상기 제3융합단백질 또는 상기 제1자기조립단백질 및 상기 제1형광단백질을 포함하는 제4융합단백질 중 어느 하나에 포함되어 발현되며, 상기 표적 단백질은 상기 미끼 단백질이 포함된 융합단백질을 제외한 다른 융합단백질 또는 제4형광단백질을 포함하는 제5융합단백질에 포함되어 발현되는 것을 특징으로 하는 융합단백질 발현단계;
    상기 융합단백질들이 동시에 발현된 세포에 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 및 상기 짝 단백질의 이형 이합체 형성을 유도하는 파장의 빛을 조사하여 나노 클러스터 형성을 유도하는 광유도 나노클러스터 형성단계; 및
    상기 형광단백질들의 형광의 패턴과 강도를 관찰하는 형광 관찰단계를 포함하며,
    다만, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질이 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성하는 경우에는, 상기 제2융합단백질은 생략될 수 있고, 상기 제1형광단백질 내지 제4형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하며, 상기 제1형광단백질 또는 제2형광단백질 중 어느 하나가 DsRed인 경우, DsRed가 포함된 융합단백질에서 상기 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질은 생략이 가능한, 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질 간 상호작용 분석방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 제1형광단백질 내지 제4형광단백질은 각각 독립적으로 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)인, 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질 간 상호작용 분석방법.
  21. 제19항에 있어서,
    상기 제1자기조립단백질 및 제2자기조립단백질은 각각 독립적으로 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed인, 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질 간 상호작용 분석방법.
  22. 제19항에 있어서,
    상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR이고, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR이고, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1인, 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질 간 상호작용 분석방법.
  23. 1) 제1자기조립단백질, 제1형광단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질, 2) 선택적으로 제2형광단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질, 3) 제3형광단백질을 포함하는 제3융합단백질, 4) 광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질, 5) 미끼 단백질, 및 6) 상기 미끼 단백질과의 상호작용 여부의 분석대상인 표적 단백질을 세포 내에서 동시에 발현시키되, 상기 짝 단백질은 상기 제2융합단백질 또는 상기 제3융합단백질 중 어느 하나에 포함되어 발현되고, 상기 미끼 단백질은 상기 제2융합단백질, 상기 제3융합단백질 또는 상기 제1자기조립단백질 및 상기 제1형광단백질을 포함하는 제4융합단백질 중 어느 하나에 포함되어 발현되며, 상기 표적 단백질은 상기 미끼 단백질이 포함된 융합단백질을 제외한 다른 융합단백질 또는 제4형광단백질을 포함하는 제5융합단백질에 포함되어 발현되는 것을 특징으로 하는 융합단백질 발현단계;
    상기 융합단백질들이 동시에 발현된 세포에 상기 미끼 단백질과 상기 표적 단백질 사이의 단백질 상호작용 조절 후보물질을 처리하는 단계;
    상기 조절 후보물질 처리 전, 후 또는 동시에 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 및 상기 짝 단백질의 이형 이합체 형성을 유도하는 파장의 빛을 조사하여 나노 클러스터를 형성을 유도하는 광유도 나노클러스터 형성단계; 및
    상기 형광단백질들의 형광의 패턴과 강도를 관찰하는 형광 관찰단계를 포함하며,
    다만, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질이 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성하는 경우에는, 상기 제2융합단백질은 생략될 수 있고, 상기 제1형광단백질 내지 제4형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하며, 상기 제1형광단백질 또는 제2형광단백질 중 어느 하나가 DsRed인 경우, DsRed가 포함된 융합단백질에서 상기 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질은 생략이 가능한, 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 조절물질의 스크리닝 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 제1형광단백질 내지 제4형광단백질은 각각 독립적으로 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)인, 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 조절물질의 스크리닝 방법.
  25. 제23항에 있어서,
    상기 제1자기조립단백질 및 제2자기조립단백질은 각각 독립적으로 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed인, 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 조절물질의 스크리닝 방법.
  26. 제23항에 있어서,
    상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR이고, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR이고, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1인, 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 조절물질의 스크리닝 방법.
  27. 제1자기조립단백질, 제1형광단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터;
    선택적으로 제2형광단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터,
    제3형광단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터,
    선택적으로 상기 제1자기조립단백질, 상기 제1형광단백질 및 미끼 단백질을 포함하는 제4융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제4유전자 컨스트럭트를 포함하는 제4발현벡터를 포함하며,
    상기 제4발현벡터가 포함되지 않는 경우, 상기 미끼 단백질은 상기 제2융합단백질 또는 상기 제3융합단백질 중 어느 하나에 포함되고, 상기 제2융합단백질 또는 상기 제3융합단백질 중 어느 하나에 광 조사에 의해 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질이 포함되며, 상기 제2융합단백질 또는 상기 제3융합단백질 중 미끼 단백질이 포함되지 않은 융합단백질 또는 선택적으로 발현되는 제4형광단백질을 포함하는 제5융합단백질에 상기 미끼 단백질과의 단백질간 상호작용 여부 확인대상인 표적 단백질이 포함되고,
    다만, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질이 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성하는 경우에는, 상기 제2융합단백질은 생략될 수 있고, 상기 제1형광단백질 내지 제4형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하며, 상기 제1형광단백질 또는 제2형광단백질 중 어느 하나가 DsRed인 경우, DsRed가 포함된 융합단백질에서 상기 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질은 생략이 가능한, 단백질간 상호작용 분석용 키트.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 제1형광단백질 내지 제4형광단백질은 각각 독립적으로 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)인, 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 조절물질의 스크리닝 방법.
  29. 제27항에 있어서,
    상기 제1자기조립단백질 및 제2자기조립단백질은 각각 독립적으로 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed인, 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 조절물질의 스크리닝 방법.
  30. 제27항에 있어서,
    상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR이고, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR이고, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1인, 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 조절물질의 스크리닝 방법.
  31. 제1자기조립단백질, 제1형광단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터;
    선택적으로 제2형광단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터,
    제3형광단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터,
    선택적으로 상기 제1자기조립단백질, 상기 제1형광단백질를 포함하는 제4융합단백질을 암호화하는 제4폴리뉴클레오티드 및 미끼 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 제4폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결될 수 있는 다중 클로닝 부위를 포함하는 제4유전자 컨스트럭트를 포함하는 제4발현벡터를 포함하며,
    상기 제4발현벡터가 포함되지 않는 경우, 상기 미끼 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 삽입을 위한 다중 클로닝 부위는 상기 제2융합단백질 또는 상기 제3융합단백질 중 어느 하나에 포함되고, 상기 제2융합단백질 또는 상기 제3융합단백질 중 어느 하나에 광 조사에 의해 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질이 포함되며, 상기 제2발현벡터 또는 상기 제3발현벡터 중 미끼 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 삽입을 위한 다중 클로닝 부위가 포함되지 않은 발현벡터 또는 선택적으로 발현되는 제4형광단백질을 포함하는 제5융합단백질을 암호화하는 제5폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제5발현벡터에 상기 미끼 단백질과의 단백질간 상호작용 여부 확인대상인 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 제5폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결될 수 있는 다중 클로닝 부위가 포함되고,
    다만, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질이 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성하는 경우에는, 상기 제2융합단백질은 생략될 수 있고, 상기 제1형광단백질 내지 제4형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하며, 상기 제1형광단백질 또는 제2형광단백질 중 어느 하나가 DsRed인 경우, DsRed가 포함된 융합단백질에서 상기 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질은 생략이 가능한, 단백질간 상호작용 분석용 키트.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 제1형광단백질 내지 제4형광단백질은 각각 독립적으로 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)인, 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 조절물질의 스크리닝 방법.
  33. 제31항에 있어서,
    상기 제1자기조립단백질 및 제2자기조립단백질은 각각 독립적으로 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed인, 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 조절물질의 스크리닝 방법.
  34. 제31항에 있어서,
    상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR이고, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR이고, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1인, 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 조절물질의 스크리닝 방법.
  35. 자기조립단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질를 포함하는 융합단백질, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상호작용하여 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질 및 표적 단백질과 상호작용을 하는 미끼 단백질을 상기 표적 단백질을 내재적 단백질로 발현하는 세포 또는 개체에서 동시에 발현시키는 발현단계; 및
    상기 세포 또는 개체에 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상기 짝 단백질 사이의 이형 이합체 형성을 유도하는 파장의 빛을 조사하여 광유도 나노클러스터 형성을 유도하는 나노클러스터 형성 유도단계를 포함하며,
    상기 미끼 단백질은 상기 자기조립단백질 또는 상기 짝 단백질에 융합되어 발현되는 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해방법.
  36. 제35항에 있어서,
    상기 자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed인, 표적 단백질 기능의 가역적 저해방법.
  37. 제35항에 있어서,
    상기 융합단백질, 짝 단백질 및 미끼 단백질 중 적어도 하나 이상에는 나노클러스터 형성 여부를 확인하기 위한 형광단백질이 연결되는, 표적 단백질 기능의 가역적 저해방법.
  38. 제37항에 있어서,
    상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)인, 표적 단백질 기능의 가역적 저해방법.
  39. 제35항에 있어서,
    상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR이고, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR이고, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1인, 표적 단백질 기능의 가역적 저해방법.
  40. 제35항에 있어서,
    상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성하는, 표적 단백질 기능의 가역적 저해방법.
  41. 제1자기조립단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질, 제2자기조립단백질 및 광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 포함하는 제2융합단백질, 및 표적 단백질과 상호작용하는 미끼 단백질을 상기 표적 단백질을 내재적 단백질로 발현하는 세포 또는 개체에서 동시에 발현시키는 발현단계; 및
    상기 세포 또는 개체에 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상기 짝 단백질 사이의 이형 이합체 형성을 유도하는 파장의 빛을 조사하여 광유도 나노클러스터 형성을 유도하는 나노클러스터 형성 유도단계를 포함하며,
    상기 미끼 단백질은 상기 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질에 융합되어 발현되는 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해방법.
  42. 제41항에 있어서,
    상기 제1자기조립단백질 및 제2자기조립단백질은 각각 독립적으로 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed인, 표적 단백질 기능의 가역적 저해방법.
  43. 제41항에 있어서,
    상기 제1융합단백질, 제2융합단백질, 짝 단백질 및 미끼 단백질 중 적어도 하나 이상에는 나노클러스터 형성 여부를 확인하기 위한 형광단백질이 연결되는, 표적 단백질 기능의 가역적 저해방법.
  44. 제43항에 있어서,
    상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)인, 표적 단백질 기능의 가역적 저해방법.
  45. 제41항에 있어서,
    상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR이고, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR이고, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1인, 표적 단백질 기능의 가역적 저해방법.
  46. 제41항에 있어서,
    상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성하는, 저해방법.
  47. 자기조립단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터;
    상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상호작용하여 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터; 및
    표적 단백질과 상호작용을 하는 미끼 단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 포함하며,
    상기 미끼 단백질은 상기 자기조립단백질 또는 상기 짝 단백질에 융합되어 발현되는 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트.
  48. 제16항에 있어서,
    상기 자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질인, 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트.
  49. 제47항에 있어서,
    상기 융합단백질, 상기 짝 단백질 및 상기 미끼 단백질 중 적어도 하나 이상에는 나노클러스터 형성 여부를 확인하기 위한 형광단백질이 연결되는, 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트.
  50. 제49항에 있어서,
    상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)인, 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트.
  51. 제47항에 있어서,
    상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR이고, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR이고, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1인, 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트.
  52. 제47항에 있어서,
    상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성하는, 저해방법.
  53. 제1자기조립단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터;
    제2자기조립단백질 및 광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터; 및
    표적 단백질과 상호작용하는 미끼 단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있는 다중 클로닝 부위 및 상기 프로모터를 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 포함하며,
    상기 미끼 단백질은 상기 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질에 융합되어 발현되는 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트.
  54. 제53항에 있어서,
    상기 제1자기조립단백질 및 제2자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed인, 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트.
  55. 제53항에 있어서,
    상기 제1융합단백질, 제2융합단백질, 짝 단백질 및 미끼 단백질 중 적어도 하나 이상에는 나노클러스터 형성 여부를 확인하기 위한 형광단백질이 연결되는, 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트.
  56. 제55항에 있어서,
    상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)인, 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트.
  57. 제53항에 있어서,
    상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR이고, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR이고, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1인, 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트.
  58. 제53항에 있어서,
    상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 광 조사와 무관하게 동형 이합체를 형성하는, 저해방법.
  59. 제1자기조립단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터;
    제2자기조립단백질 및 광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터; 및
    표적 단백질과 상호작용하는 미끼 단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있는 다중 클로닝 부위 및 상기 프로모터를 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 포함하며,
    상기 미끼 단백질은 상기 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질에 융합되어 발현되는 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트.
  60. 자기조립단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터;
    상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상호작용하여 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터; 및
    표적 단백질과 상호작용을 하는 미끼 단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있는 다중 클로닝 부위 및 상기 프로모터를 포함하는 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 포함하며,
    상기 미끼 단백질은 상기 자기조립단백질 또는 상기 짝 단백질에 융합되어 발현되는 있는 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트.
  61. 자기조립단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질를 포함하는 제1융합단백질, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상호작용하여 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질 및 표적 단백질을 세포 또는 개체에서 동시에 발현시키는 발현단계; 및
    상기 세포 또는 개체에 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상기 짝 단백질 사이의 이형 이합체 형성을 유도하는 파장의 빛을 조사하여 광유도 나노클러스터 형성을 유도하는 나노클러스터 형성 유도단계를 포함하며,
    상기 표적 단백질은 상기 자기조립단백질 또는 상기 짝 단백질에 융합되어 발현되는, 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해방법.
  62. 자기조립단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터, 및
    광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터를 포함하며,
    표적 단백질 및 상기 자기조립단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호호하하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 추가적으로 포함하거나, 상기 표적 단백질이 제2융합단백질에 포함되는, 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트.
  63. 자기조립단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터, 및
    광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터를 포함하며,
    표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있는 다중 클로닝 부위 및 상기 자기조립단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제3유전자컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 추자적으로 포함하거나,
    상기 표적단백질이 상기 제2융합단백질에 포함되어 발현될 수 있도록, 상기 제2폴리뉴클레오티드 내에 상기 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결될 수 있는 다중 클로닝 부위가 포함되는, 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 표적 단백질 기능의 가역적 저해용 키트.
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