WO2013022299A2 - 물질의 고집적 디스플레이를 이용하여 생리적인 조절을 유도하는 방법 - Google Patents

물질의 고집적 디스플레이를 이용하여 생리적인 조절을 유도하는 방법 Download PDF

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    • B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors

Definitions

  • the present invention relates to a method for controlling or inducing a specific physiological form or function using one or more materials displayed in a high density on a nano-assembly matrix in a cell or a living body. It is about. That is, the present invention relates to a method of effectively inducing specific physiological regulation in cells or in vivo by using high concentrations of bioactive substances.
  • proteins in vivo exert their function by interacting with other proteins.
  • two proteins of complementary structure interact with each other, and the bioactive compound specifically interacts with a specific part of the tertiary structure of the protein.
  • the interaction between two proteins strongly suggests that these proteins are functionally related, and bioactive compounds that specifically interact with specific regions of the protein may be linked to, for example, disease related
  • the development of therapeutic agents that can diagnose, prevent, treat or alleviate diseases is presented.
  • new target proteins can be detected or new drugs can be identified by confirming the interaction between "bait", a substance whose functions and characteristics are already known, and "prey,” an interaction partner to be searched and detected.
  • Various methods for screening bioactive substances as candidates have been studied.
  • Target proteins also enhance understanding of biological pathways and delivery systems and provide information on basic cell regulation and disease mechanisms, which can assist in the discovery and detection of bioactive compounds that interact with target proteins. This is a very surprising and powerful means for the development of new drugs, the improvement of conventional drugs and the discovery of new pharmaceutical uses.
  • the pharmaceutical community faces challenges to develop safer and more effective therapies for various diseases in humans, but many of the drugs currently in use are determined by biological efficacy in disease models without identifying their target proteins and molecular targets. It is being regulated (Burdine, L. et al., Chem. Biol. 11: 593,2004). In addition, while biologically active natural products are an important source for drug development, most aspects of their activity are unknown (Clardy, J. et al., Nature 432: 829,2004). Identification of their physiological and molecular targets is not only essential for understanding the therapeutic and adverse effects, but will also enable the development of more advanced second generation therapeutics. In addition, finding new targets for clinically proven compounds will contribute to new therapeutic applications (Ashburn, TT et al., Drug Discov. 3: 673,2004).
  • target screening is used to identify low molecular weight compounds according to a desired phenotype from a large library of compounds (Strausberg, RL at al., Science 300: 294,2003; Stockwell, BR Nature 432: 846, 2004).
  • this approach is not easy to identify the low molecular weight compounds found.
  • the effective detection of various intracellular molecular interactions, such as protein (or low molecular weight) -protein interactions is essential for the understanding of dynamic biological processes and regulatory networks, the development of such target identification techniques has led to genetics, proteomics and It is very important in a variety of life sciences, including system biology.
  • the underlying technology analyzes the diversity of interactions between bioactive substances and molecules (eg, interactions between bioactive small molecule and proteins) in living cells over a wide range of different tissues and disease states. It has many limitations and needs to develop new infrastructure technology.
  • the present inventors while solving the problems of the prior art, as a result of studying a method for dynamically exploring the interaction between the bioactive materials in vivo as well as in vitro , various, Bioactive materials are analyzed by analyzing whether they form a nano-assembly matrix or co-localization on nano-assembly matrix. It has been found that the interaction between them can be explored and verified (see Korean Application No. 10-2008-0079957).
  • various physiological (high unit) complexes exist in the form of "-some” or “complex” such as signalsomes in cells and exosomes outside cells in vivo.
  • the presence of one or several physiologically active substances such as related proteins in the physiological high unit complex has been found to effectively regulate specific physiological functions in cells or in vivo.
  • multi / poly-valent interactions play a very important role in most physiological regulation in cells or in vivo as in efficient physiological regulation mediated based on these complexes (Mammen, M. et. al., Angew. Chem. Int. Ed. 37: 2755, 1998; Kiessling, LL et al., Angew. Chem. Int. Ed. 45: 2348, 2006). That is, multi / poly-valent interactions play an important role in interactions between most bioactive substances such as proteins, rather than mono-valent interactions.
  • the present inventors based on the characteristics of the physiological complex and the interaction control phenomenon, the high concentration of one or more types of bioactive substances displayed in the nano-high complex are present in high concentrations together, thereby reducing their local concentration in cells or in vivo ( local concentration) is increased; Effectively induce multi / poly-valent interactions with a target material and the like; Accordingly, there is a functional synergy with each other; When functionally coordinated with each other, it is determined that the physiological function in the cell or the living body can be effectively regulated.
  • high concentration of the bioactive substance is highly integrated into the artificially formed nano-high unit complex.
  • the present invention was completed by confirming that the physiological function in a cell or a living body can be effectively controlled by displaying in density). Furthermore, the regulation and induction of the physiological function of a cell or a living body is induced by artificially controlling the formation and dis-assembly of the nano-high complex, or the display or capture of a specific substance in the nano-high complex. It also has the advantage of being able to.
  • the present invention aims to effectively induce physiological control by the displayed material or by the interaction of the displayed material with other related materials by the highly integrated display of bioactive materials in an artificial nano-high complex. .
  • highly integrated materials such as antibodies, antigens and epitopes, viral proteins and peptides (such as HIV Tat, HBV, SARS proteins and peptides), disease cell specific receptors and marker binding proteins and peptides (such as disease cell-specific receptor or marker protein-targetting protein / peptide, therapeutic receptor-binding protein / peptide, therapeutic protein and peptide, therapeutic protein / peptide, hemoglobin, Gd3 + ion, therapeutic drug, Vaccines, therapeutics, diagnostics, and imaging materials can vary depending on the specific types of silver condensing peptides, metal scavenging peptides, and related physiological functions. agents, metal chelating agents, blood substitutes, gelling agents, purifica tion platforms, drug delivery platforms, and the like.
  • Such highly integrated materials can be introduced into cells, tissues or organisms in the form of various bioactive substances such as genes, proteins, compounds, etc. and nano-higher complexes can be used in vitro or in vivo such as cells. Formation and division can be arbitrarily regulated intracellularly, extracellularly or in vivo, ex vivo.
  • the present invention provides a method for regulating or inducing a physiological form or function in a cell or body, comprising the following steps:
  • the invention also provides a method of modulating or inducing a physiological form or function in a cell or body, comprising the following steps:
  • the invention also provides a method of modulating or inducing a physiological form or function in a cell or body, comprising the following steps:
  • the invention also provides a method of modulating or inducing a physiological form or function in a cell or body, comprising the following steps:
  • the present invention also provides a composition for vaccine, prophylaxis, mass transfer or treatment of a disease related to the physiological form or function of a cell or body, comprising the nano-high complex separated by the following steps:
  • the present invention also provides a composition for vaccine, prophylaxis, mass transfer or treatment of a disease related to the physiological form or function of a cell or body, comprising the nano-high complex separated by the following steps:
  • the present invention also provides a composition for vaccine, prophylaxis, mass transfer or treatment of a disease related to the physiological form or function of a cell or body, comprising nanounit complexes separated by the following steps:
  • the present invention also provides a composition for vaccine, prophylaxis, mass transfer or treatment of a disease related to the physiological form or function of a cell or body, comprising nanounit complexes separated by the following steps:
  • the present invention also provides a composition for vaccine, prophylaxis, mass transfer or treatment of a disease related to the physiological form or function of a cell or body, comprising nanounit complexes separated by the following steps:
  • the present invention also provides a composition for vaccine, prophylaxis, mass transfer or treatment of a disease related to the physiological form or function of a cell or body, comprising the nano-high complex separated by the following steps:
  • the invention also provides a method for screening a substance that modulates or induces a physiological form or function in a cell or body, comprising the following steps:
  • the invention also provides a method for screening a substance that modulates or induces a physiological form or function in a cell or body, comprising the following steps:
  • the invention also provides a method for screening a substance that modulates or induces a physiological form or function in a cell or body, comprising the following steps:
  • the invention also provides a method for screening a substance that modulates or induces a physiological form or function in a cell or body, comprising the following steps:
  • the invention also provides a method for screening a substance that modulates or induces a physiological form or function in a cell or body, comprising the following steps:
  • the present invention also provides a method for preventing or treating a disease related to a physiological form or function in a cell or body, comprising the following steps:
  • the present invention also provides a method for preventing or treating a disease related to a physiological form or function in a cell or body, comprising the following steps:
  • the present invention also provides a method for preventing or treating a disease related to a physiological form or function in a cell or body, comprising the following steps:
  • the present invention also provides a method for preventing or treating a disease related to a physiological form or function in a cell or body, comprising the following steps:
  • the present invention also provides a use for the prophylaxis or treatment of a disease related to the physiological form or function of a cell or a body of a nanohigh unit complex or a nanounit complex separated by the above method.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of artificially and effectively inducing related physiological control using a bioactive material highly integrated in a nano-higher complex in a cell or a living body.
  • 2 to 8 correspond to a bait material having a high density display of a bioactive material search material.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of the construct displaying X in the nano-assembly when formation of the nano-assembly is induced by direct or indirect interactions between C (mediator) A and B (A and B).
  • B, C and X are the same or different materials;
  • N is the nanohigh-molecular complex forming material). Induced specific physiological regulation by X, A, B, C substances that are highly integrated at N.
  • FIG. 3 illustrates the formation of the nano-unit complex by the interaction between the first mediator (regulator) A, B, and C, and the nano-protocol by interaction between the second mediator (D) E, F
  • FIG. 3 illustrates the formation of the nano-unit complex by the interaction between the first mediator (regulator) A, B, and C, and the nano-protocol by interaction between the second mediator (D) E, F
  • Schematic diagram of the construct displaying X in the complex (A and B and C and D and E and F and X are the same or different materials; N is the nanohigh-unit complex forming material). Induced specific physiological regulation by X, A, B, C, D, E, F materials highly integrated at N.
  • FIGS. 4 (A) and (B) are schematic diagrams of constructs that have direct or indirect interactions through X or X and Y between nanounit complexes (X, Y and A are the same or different materials; N is Nano high unit complex material). Induced specific physiological regulation by X, Y, A substances that are highly integrated at N.
  • FIG. 5 are schematic diagrams of constructs that have direct or indirect interactions between X and Y in the nanohigh-unit complexes (X, Y and A being the same or different materials) N and N 'are nano-high-molecular complexes; (A) use the same nano-high-molecular complexes, (B) different nano-high-molecular complexes, (C) use the same type of probe ). Induced specific physiological regulation by X, Y, A substances that are highly integrated at N.
  • Figure 7 is a schematic diagram of the composition of the interaction between X and Y in the situation where direct or indirect interaction between A and B occurs in the nano-high complex (A and B and C and X and Y are the same or different materials; N and N 'are nano-higher complex formers; (A) using the same nano-higher complexes; (B) different types of nano-higher complexes) .
  • X, Y, A, B, C materials displayed highly integrated at N induce specific physiological regulation involved.
  • FIG. 8 are schematic diagrams of the components interacting between X and Y and X and X in a situation where direct or indirect interactions between A and B occur in the nano-high complex (see FIG. A and B and C and X and Y are the same or different materials; N is the nanohigh-molecular complex forming material; (A) X is not interacting with each other, (B) X is interacting with each other).
  • X, Y, A, B, C materials displayed highly integrated at N induce specific physiological regulation involved.
  • FIG. 9 is a nanosized unit complex structure in which self-association domains of calcium / calmodulin phosphorylated protein interact with each other to form self-assembly.
  • FIG. 10 is a basic structure of a fusion protein for fusion of a search protein (or fluorescent protein) to a self-association domain of calcium / calmodulin phosphorylated protein to form a nano-sized unit complex. It is possible to fuse the C-terminus as well as the N-terminus of calcium / calmodulin phosphorylated protein. Based on this, calcium / calmodulin phosphorylated protein was used as a nano high unit complex forming material.
  • FIG. 11 shows FKBP-mCerulean-FT and FRB-mCitrine in nanounit complexes formed from ferritin protein (FT) and nanounit complexes formed from self-association domain of calcium / calmodulin phosphorylation (CAM) protein in HeLa cells. Interaction of -CAM depends on the presence of rapamycin (A); mCerulean, B; mCitrine is an image taken. According to the format of FIG. 5, the self-association domain of calcium / calmodulin phosphorylation (CAM) protein is used as a nano-high complex forming material like ferritin protein.
  • FT ferritin protein
  • CAM calcium / calmodulin phosphorylation
  • FIG. 12 shows FKBP-mCerulean in a nano-higher complex formed by FKBP (F36M) 2, the first mediator (regulator), from a self-association domain of calcium / calmodulin phosphorylation (CAM) protein in HeLa cells.
  • FKBP F36M
  • F36M the first mediator
  • CAM calcium / calmodulin phosphorylation
  • FIG. 13 shows the interaction between FKBP-mCherry-FT and FRB-EGFP in the nanohigh-unit complex formed by FKBP (F36M) 2, which is the first mediator (regulator) from ferritin (FT) protein in HeLa cells.
  • FKBP F36M 2
  • F36M the first mediator
  • FT ferritin
  • mCerulean, B; mCitrine is an image taken.
  • Figure 3 shows that the ferritin protein is used as a nano-high complex complex forming material.
  • FIG. 14 illustrates the regulation of intracellular NFkB signaling and transcriptional activation by a highly integrated display material (Rel) according to the format of FIG. 3 in a nanohigh-unit complex formed from a magnetic binding domain of calcium / calmodulin phosphorylation (CAM) protein. The degree is plotted.
  • Rel highly integrated display material
  • FIG. 15 is a graph showing the degree of regulation of intracellular NFkB signaling and transcriptional activation by a highly integrated substance (Rel) according to the format of FIG. 3 in a nano-high complex formed from ferritin (FT) protein.
  • FIG. 16 is a graph showing the degree of regulation of intracellular NFkB signaling and transcriptional activation by a highly integrated substance (Rel) according to the format of FIG. 4 in a nanounit complex formed from ferritin (FT) protein.
  • FIG. 17 is a graph showing the degree of regulation of intracellular NFkB signaling and transcriptional activation by a highly integrated substance (Rel) according to the format of FIG. 2 in a nano-high complex formed from ferritin (FT) protein.
  • FIG. 18 shows the degree of regulation of intracellular NFkB signaling and transcriptional activation by highly integrated display material (Rel) according to the format of FIG. 4 in a nanounit complex formed from a self-binding domain of calcium / calmodulin phosphorylation (CAM) protein. Is shown in the graph.
  • Rel highly integrated display material
  • FIG. 19 shows intracellular NFkB signaling by highly integrated display material (Rel) according to the format of FIG. 5 in a nano-unit complex formed from a self-binding domain of calcium / calmodulin phosphorylation (CAM) protein and ferritin (FT) protein. And the degree of regulation of transcriptional activation is shown graphically.
  • Rel highly integrated display material
  • fusion protein 20 is an example of the basic structure of a fusion protein for separating and purifying nanocomposites or nanocomplexes formed from a self-binding domain of calcium / calmodulin phosphorylation (CAM) protein or ferritin protein (FT).
  • CAM calcium / calmodulin phosphorylation
  • FT ferritin protein
  • FIG. 21 is an example of therapeutic or diagnostic materials highly integrated in a nanounit complex or nanomultiunit complex formed from a self-binding domain of calcium / calmodulin phosphorylation (CAM) protein or ferritin protein (FT).
  • CAM calcium / calmodulin phosphorylation
  • FT ferritin protein
  • Figure 22 shows a portion of the therapeutic and diagnostic protein material (1 to 30) of Figure 21 expressed in cells by binding to FRB-mCherry and treated with rapamycin, so that FKBP (F36M) 2 bound ferritin (FT) nanoparticles It is a photograph imaging the high-density display on a high unit complex.
  • FKBP F36M 2 bound ferritin
  • physiologically active substance may be defined as a substance that plays a role of regulating a function of a living body in order to enhance or inhibit the function of a living body.
  • physiologically active substances can be obtained from natural products such as plants and animals, or can be extracted and purified from microorganisms and metabolites of animal and plant cell lines or obtained by chemical synthesis.
  • the bioactive substance may be, for example, a nucleic acid, a nucleotide, a protein, a peptide, an amino acid, a sugar, a lipid, a vitamin or a chemical compound, or the like.
  • searching material is a bioactive material that can be used to explore interactions with other bioactive materials.
  • the term "modulator” refers to a substance that is directly or indirectly related to or interacts with a substance that mediates the function of a cell to be controlled, and the search substance may be a regulator as desired. It may be used to mean a substance that interacts with a probe substance, which activates, induces, blocks, or inhibits intracellular functions mediated by the probe substance or modulator. Inhibiting substances may be used as control substances.
  • a "nano-assembly matrix” refers to a high unit complex (eg, high density) that can be easily observed at high density by the interaction of a nano unit complex with a constant structural skeleton.
  • a high unit complex formed by nanounit complexes having a constant structural skeleton formed by binding proteins 24 subunits such as ferritin through self-assembly to each other the amplified high signal intensity point image that can be easily observed in the present invention. It may be used in the same concept as a pattern).
  • nanoclusters and nanoassemblies are all used in the same sense as nano-higher complexes.
  • the interactions between the probes or between the mediators (regulators) are used.
  • the highly integrated complex of nano-unit complexes was expressed as the formation of nano-unit complexes, which can be confirmed by the change of high signal intensity point image pattern.
  • a material capable of forming a nano high unit complex means any material having a property and a function capable of forming the nano high unit complex.
  • the complex may be formed by mutual interaction or self-assembly.
  • nano unit complex means a complex formed as a base of the nano-high unit complex by self-assembly of proteins or the like. For example, 24 subunits of ferritin protein self-assemble to form nanounit complexes.
  • proteins with self-association domains such as calcium / calmodulin-dependent kinase II, also form nanounit complexes very easily.
  • High unit complexes can be formed.
  • the material capable of forming the nano (high) unit complex of the present application can be seen by demonstrating that it contains a wide range of physiological activity with a magnetic binding domain.
  • mediator refers to a material that induces the formation of a nano-unit complex, which is formed by direct or indirect bonding, interaction and fusion with the nano-unit complex forming material. Includes all cases that can lead to Substances that mediate or regulate the activity of such mediators (modulators) may also be referred to as mediators (regulators) in a broad sense.
  • mediator is a concept encompassing not only a specific compound such as a specific compound or protein that induces the formation of a nano-high complex, but also a phenomenon such as a specific mutation and a specific physiological signal.
  • nanohigh-level complexes can be achieved through interactions between proteins according to physiological signals, RNA-protein interactions, specific mutations of specific proteins, or the use of proteins that only respond to specific compounds. Inducible, and are referred to herein as 'mediated (modulator) substances'.
  • display refers to exposing or loading material into or out of a nano (high) composite directly or indirectly through another material. Include form. It may also modulate or induce physiological morphology or function mediated by loaded materials exposed by the dis-assembly of nano (high) unit complexes.
  • physiological control includes changes and control of various physiological functions or morphologies that are regulated or induced in cells or in vivo. It also includes the regulation or induction of all physiological functions or forms associated with the disease.
  • the present invention provides a high density display of bioactive materials that interact with each other in an artificial nano-high complex or nano-unit complex, thereby mediating the displayed or captured material or the material interacting with them.
  • a method of modulating or inducing various physiological forms or functions in cells or in the body by inhibiting or activating physiological forms or functions (FIG. 1).
  • Such a method according to the present invention can be specifically embodied by the method of the following first, second, third and fourth embodiments.
  • first and second embodiments of the present invention for controlling or inducing physiological form or function in a cell or body using the interaction of a substance form a nano-high unit complex by a mediator (regulator), It is a method capable of regulating or inducing physiological forms or functions mediated by a searcher or a mediator that is highly integrated in the formed nanohigh-unit complex.
  • a specific first aspect of the invention is a method of controlling or inducing physiological form or function in a cell or body, comprising the following steps (FIG. 2):
  • a method for screening a substance that modulates or induces a physiological form or function in a cell or body may include the following steps:
  • a second specific aspect of the present invention is a method of controlling or inducing a physiological form or function in a cell or body (FIG. 3), comprising the following steps:
  • a method for screening a substance for regulating or inducing a physiological form or function in a cell or body including the following steps:
  • each step (i) of the two aspects it may be characterized in that the addition of a material that mediates or controls the interaction between the mediator (regulatory) material.
  • the first method and the second method are commonly used to form nano-high unit complexes by interaction between them using mediators (regulators) known to interact with each other, and then to the formed nano-high unit complexes.
  • mediators regulatory agents
  • the present invention relates to a method for regulating physiological function mediated by a highly integrated display or mediator.
  • the search material from the beginning to the nano-high unit complex forming material Whether to combine to participate in the formation of nano-high unit complexes by the action of mediators (the first method), or the nano-high unit complexes may be formed only by the forming agent and the mediator (the first mediator).
  • another intermediate (regulator) material second mediator (regulator) material
  • second mediator (regulator) material is used to further bind to the resultant (second method).
  • the "addable modulator” refers to a bioactive substance that can be combined with the modulator displayed on the nano-high complex formed in the previous step, and interacts with the modulator to affect the type or number of modulators. Do not receive. That is, since it does not mean only one substance that can interact with the displayed modulator, the modulator may be a combination of two or more.
  • FIG. 1 A schematic diagram of the first method of the present invention is shown in FIG.
  • FIG. 3 A schematic diagram of the second method of the present invention is shown in FIG. 3.
  • nano-high complex complex forming material calcium / calmodulin phosphorylated protein (CAM) or ferritin protein (corresponding to symbol N in Figure 3)
  • FKBP F36M 2
  • RBA E
  • RelA RelA
  • the prey material such as TNF-a is a specific reaction (NFkBB) by binding to the search material (RelA) as a partner material Activity change) can be induced (see Examples).
  • a third aspect of the invention is a method of controlling or inducing a physiological form or function in a cell or body comprising the following steps (FIG. 4):
  • a method for screening a substance for regulating or inducing a physiological form or function in a cell or body including the following steps:
  • the present invention may also provide a method for screening a substance that modulates or induces a physiological form or function in a cell or body, as another variation of the third method, comprising the following steps:
  • the nano-high unit complex forming material forms a nano unit complex by interaction or self-assembly between a plurality of interacting sites without any interaction between a separate search material or an intermediate (regulator) material. It is characterized by controlling or inducing the physiological form or function mediated by the searcher by displaying the search material bound to the nano-unit complex forming material on the nano-unit complex.
  • the search material bound to the nano-high complex material forming material may be characterized in that two or more different search material is bonded to the same nano-high complex, and, further, to control the interaction between the two or more search material May further comprise (FIG. 4B).
  • the "addable modulator” refers to a bioactive substance that can be combined with the modulator displayed on the nano-high complex formed in the previous step, and interacts with the modulator to affect the type or number of modulators. Do not receive. That is, since it does not mean only one substance that can interact with the displayed modulator, the modulator may be a combination of two or more.
  • FIG. 1 A schematic diagram of the third method of the present invention is shown in FIG.
  • a fourth aspect of the invention relates to a method of controlling or inducing a physiological form or function of a cell or body (FIG. 5), comprising the following steps:
  • a method for screening a substance for regulating or inducing a physiological form or function in a cell or body including the following steps:
  • the nanomaterial unit is formed by the direct or indirect interaction between the nanomaterial units and the nanomaterial unit, and the nanomaterial unit is displayed on the formed nanounit complex.
  • the search materials interacting with each other to form a nano-high complex may be the same material or different materials.
  • the nanohigh unit complex forming materials may be the same (Fig. 5A) or different (Fig. 5B).
  • one or more substances that mediate (regulate) the interaction between the search material or the interaction between the search material and the nano-complex forming material may be additionally added, wherein the mediator (regulator) material is added to the search material. It may be characterized in that the addition (fusion) (Fig. 6 to 8).
  • the bait and the prey found to interact with each other by a bait-prey material known to interact with each other, or by the inventor's prior patent (Korean Patent Application No. 10-2008-0079957).
  • the physiological function mediated by the search material or modulator may be inhibited or activated.
  • FIG. 1 A schematic diagram of the fourth method of the present invention is shown in FIG.
  • the method according to the present invention may further provide a modulator capable of interacting with the displayed probe material and display it in a highly integrated manner, thereby controlling or inducing a physiological form or function mediated by the search agent or modulator.
  • the material forming the nano-high complex that is, the nano-high complex forming material, bait material, prey material, nano-high complex formation induction mediator (regulator) material, and the labeling material
  • the bonds between the materials used in may include physical, chemical, electrostatic and biological direct or indirect bonds.
  • a probe including an antibody, a protein, a protein domain, a protein motif, a peptide, or the like may be used.
  • any nanomaterial can be directly or indirectly bonded to the nano-unit complex-forming material, while nano-unit complex-formed material and the prey can be combined to provide.
  • the modulator may be referred to as a substance involved in turning on / off a change in physiological function (inhibition, activation, etc.) of a desired physiological function.
  • a substance involved in turning on / off a change in physiological function (inhibition, activation, etc.) of a desired physiological function As described above, the formation and dis-assembly or display of a specific substance in the nano-assembly or nano-assembly can be controlled by using bioactive substances that interact with each other. It is also possible to control the physiological function in the cell or in vivo.
  • the nano-high unit complex forming material, the search material or the mediator (regulator) material can be labeled by binding the labeling material, wherein the labeling material is not limited thereto, magnetic materials, radioactive It may be characterized in that the material, ELISA enzyme material, fluorescent material or a luminescent material, the fluorescent material may be characterized in that the fluorescent dye, fluorescent protein or fluorescent nanoparticles and the like.
  • the searcher or mediator may be characterized in that the bioactive molecule (bioactive molecule), wherein the bioactive material is not limited thereto, nucleic acid, nucleotides, proteins It may be characterized in that one or more substances selected from the group consisting of peptides, amino acids, sugars, lipids, vitamins and chemical compounds.
  • the method of the present invention can be performed either in vitro or in vivo .
  • the present invention when carried out in vivo , it can be carried out in vivo , tissues and cells of mammals including eukaryotic cells, prokaryotic cells and humans, in vivo, tissues and cells of plants.
  • the invention may be carried out in the cells, tissues or in vivo of Zebra fish, C. elegans, yeast, Fly or Frog.
  • the nano-high unit complex forming material, the bait material, the prey material, the mediator (nano high unit complex formation inducing material) and the labeling materials used in the present invention can be easily introduced into the cell by a generally known method.
  • a generally known method for example, direct injection, introduction using transducible peptides and fusogenic peptides, lipid transporters or combinations thereof; Introduction using electroporation; Introduction with magnetofection; And parenteral administration, oral administration, intranasal administration, subcutaneous administration, aerosolized administration, and intravenous administration to mammals including humans.
  • the method may be performed by a method selected from the above.
  • the formation of the nano-high unit complex in the methods of the present invention can be confirmed using a labeling material.
  • a labeling material may be used by combining the labeling material with the search material, the nano-high unit complex forming material or mediator (regulator) material.
  • mediator (regulator) material If necessary, on the nano-high complex formed by the interaction between specific materials, as the labeling material of the present invention, a radiolabel, a fluorescent material, or a luminescent material may be used.
  • a radiolabel all the labels generally usable including 32 P, 35 S, 3 H, 14 C, etc. can be used, for example.
  • fluorescent material which shows fluorescence by itself or which is fluorescent by interaction between materials
  • fluorescent dyes such as FITC, rhodamine
  • Fluorescent proteins such as ECFP, TagCFP, TFP1, GFP, YFP, CFP, and RFP
  • Tetracysteine fluorescent motifs may be fluorescent nanoparticles.
  • a luminescent material such as luciferase or the like which emits light by itself or exhibits luminescence by interaction between materials can be used.
  • the formation of the nano-unit complex is a method for detecting magnetic, radioactive, ELISA enzyme, fluorescent or luminescent material and optical method, microscope, imaging system, scanner, reader, Measured or detected using commonly known methods such as spectrophotometer, magnetic resonance imaging (MRI), SQUID, MR relaxometer, fluorescent scene associated cell sorting (FACS), fluorometer and luminometer Can also be separated.
  • MRI magnetic resonance imaging
  • SQUID magnetic resonance imaging
  • MR relaxometer magnetic scene associated cell sorting
  • FACS fluorescent scene associated cell sorting
  • fluorometer and luminometer Can also be separated.
  • the nano-high complex formed by the method of the present invention or the nano-unit complex loading the regulatory material in the nano-unit complex or the nano-unit complex or nano-composite (dis-assembly) exposed to the load (dis-assembly) may be characterized by regulating or inducing a physiological form or function mediated by the substance.
  • nano high unit complex forming material refers to a material forming a nano high unit complex, which is a poly / multi-valent material having a plurality of identical or different binding moeity.
  • the self-assembly can form a complex.
  • these composites are preferably composed of nanosized particles.
  • a protein including a self-assembly or a self-association domain wherein the protein having the self-assembly or self-binding domain Ferritin or ferritin, DPS or similar protein (DNA binding protein from starved cells), heat shock protein (HSP), magnetosome constituent protein, viral constituent protein, calcium / calmodulin phosphate protein (calcium / calmodulin-dependent kinase II) and dsRed.
  • nano-high unit complexes for example, gold nanoparticles, quantum nanoparticles (Q dot) or magnetic nanoparticles (magnetic nanoparticles), etc.
  • Particles can be used.
  • ferritin protein was used among substances or proteins capable of forming nano-sized unit complexes by self-assembly.
  • the 24 ferritin proteins form spherical nanoparticle complexes by self-assembly, the outer diameter is about 12 nm, the inner diameter is about 9 nm, and contains more than 2500 iron atoms (Chasteen, ND Struc. Biol. 126: 182-). 194, 1999).
  • "Navigator” or “mediation” when nanohigher complexes are formed by interaction between "searchers” or “mediators” occurring on the surface of nanoparticle complexes formed by ferritin proteins Labels such as fluorescent, luminescent, magnetic, and radioactive materials bound to the "substance" can be dynamically searched by analyzing them using an analyzer such as a microscope.
  • Bioactive substances are all substances that exhibit physiological activity in vivo, and any substance that can interact with various biological substances in a human body to modulate their function or activity may be used. nucleic acid, nucleotide (mono- / oligo- / poly-nucleotide), protein, protein (mono- / oligo- / poly-peptide), amino acid, sugar (mono- / oligo- / poly -saccharides, lipids, vitamins, chemical compounds, but also the smaller molecules that make up the substances.
  • the “interaction mediator (regulatory substance)” which regulates the binding between the search substances, is a substance that promotes the interaction and mediates (regulates) the binding between both substances. no limits. However, a substance that specifically reacts to the search substance pair used is preferred. Since the nano-unit complexes are formed by the interaction of the pair of search materials, ultimately, the “search material interaction mediator (regulator)” is defined as the “inducing material for forming nano-unit complexes" as defined in the present invention. It can be said to belong to “mediators”.
  • a protein regulated according to an external signal may be used, or a characteristic of miRNA that specifically binds to its target mRNA may be used.
  • Rapamycin was used as a mediator (regulator) when the FKBP-FRB pair was used.
  • the 'mediator (regulator) material' which induces the formation of the nano-high unit complex of the present invention is any element capable of forming the nano-high unit complex by directly or indirectly interacting with each other on the surface of the nano-high unit complex forming material. It is a concept to include. Substances that mediate or regulate the activity of such mediators (modulators) may also be referred to as "mediators" of the present invention in a broad sense.
  • Such 'mediators' are not limited so long as they function to induce the formation of nano-higher complexes. Therefore, if the formation of nano-high complexes can be induced by specific phenomena such as binding or mutation between substances that react specifically with each other, both the substance and the specific phenomena can be identified as mediators. That is, in the present invention, the mediator (modulator) is a term that includes all of a specific substance, a specific phenomenon or a specific interaction itself, and such mediator (modulator) may be used in combination of two or more.
  • the nano-higher complexes or nano-unit complexes separated by the method of the present invention are drugs which are collected by, or are loaded into, or loaded into the nano-higher complexes or nano-unit complexes by a search material or a mediator (regulator) material that is highly integrated therewith. Etc., it can be used as a preventive, therapeutic or medical composition for diseases related to the physiological form or function of a cell or body.
  • the present invention in a first aspect, for the vaccine, prophylaxis, and mass transfer of a disease related to the physiological form or function of the cell or body, comprising the nano-high complex isolated by the following steps: Or provide a therapeutic composition:
  • compositions for vaccine, prophylaxis, mass transfer or treatment of diseases related to the physiological form or function of a cell or body comprising a nano-high complex isolated by the following steps do:
  • compositions for vaccine, prophylaxis, mass transfer or treatment of a disease related to a physiological form or function of a cell or body comprising the nanounit complex separated by the following steps. :
  • composition for the prevention, treatment or medical treatment of diseases related to the physiological form or function of a cell or body comprising nanounit complexes separated by the following steps:
  • a vaccine, a prophylactic, a mass carrier or a treatment for a disease related to the physiological form or function of a cell or body comprising a nanounit complex isolated by the following steps: Provide a composition for:
  • the present invention also provides a vaccine, prevention, mass transfer agent or treatment for a disease related to the physiological form or function of a cell or body, comprising the nano-high complex separated by the following steps as a fourth embodiment.
  • a composition :
  • the display material may be further provided with a control material that can interact with the displayed search material, and may be characterized in that the display is separated in high density, and the nano high unit complex or the control material in the nano unit complex is highly integrated. Can be loaded.
  • the present invention provides a method for diagnosing, preventing or treating a disease related to a physiological form or function of a cell or body, comprising the following steps:
  • the invention also provides, as a second aspect, a method for diagnosing, preventing or treating a disease related to a physiological form or function in a cell or body, comprising the following steps:
  • the invention also provides, as a third aspect, a method for diagnosing, preventing or treating a disease related to a physiological form or function in a cell or body, comprising the following steps:
  • the present invention also provides, as a fourth aspect, a method for diagnosing, preventing or treating a disease related to a physiological form or function in a cell or body, comprising the following steps:
  • the search material or modulator is mediated
  • the physiological form or regulation can be diagnosed, prevented or treated diseases related to the physiological form or function mediated by the probe or modulator.
  • the pharmaceutical composition for diagnosing, preventing or treating the disease is provided as a pharmaceutical composition including the separated nano-high complex or nano-unit complex alone or one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents.
  • the complex may be included in the pharmaceutical composition in an appropriate pharmaceutically effective amount depending on the disease and its severity, the age, weight, health condition, sex, route of administration and duration of treatment of the patient.
  • pharmaceutically acceptable refers to a composition that is physiologically acceptable and that, when administered to a human, typically does not cause an allergic reaction such as gastrointestinal disorders, dizziness, or the like.
  • carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, Polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • the pharmaceutical composition may further include fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers and preservatives.
  • Pharmaceutical compositions of the invention can also be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal.
  • the formulations may be in the form of sterile injectable solutions and the like.
  • various proteins were fused to the N-terminus of the magnetic binding domain (FIG. 10) of ferritin (FT) protein and calcium / calmodulin phosphorylation (CAM) protein, and used for dispelling and analyzing material.
  • probe proteins e.g. FKBP and FRB
  • fluorescent proteins e.g. mRFP, EGFP, ECFP, YFP
  • mRFP fluorescent proteins
  • EGFP calcium / calmodulin phosphorylation
  • YFP ferritin protein
  • Recombinant genes based on pcDNA 3.1, which can express branch fusion proteins in mammalian cells by the CMV promoter, were prepared.
  • rapamycin was used as a substance to control the interaction between searchers, and mCerulean, mCherry and mCitrine were used as fluorescent proteins.
  • Electroporation electroporation-1000 V, 35 ms, 2 pulses
  • lipofectamine with recombinant genes FKBP-mCerulean-FT and FRB-mCitrine-CAM in pre-cultured HeLa cells (HeLa cell, ATCC No. CCL-2)
  • cells were placed on a 16-well chamber slide (Nunc) and incubated for 24 hours in a 5% CO 2 incubator fixed at 37 ° C to express the fusion protein.
  • DMEM fetal bovine serum
  • OPTI-MEM OPTI-MEM
  • rapamycin Calbiochem
  • Example 1 various proteins were fused to the N-terminus of the self-binding domain (FIG. 10) of calcium / calmodulin phosphorylation (CAM) protein and used for display and analysis of the material.
  • FOG. 10 calcium / calmodulin phosphorylation
  • FKBP (F36M) 2 was used as a mediator (regulator) and mCerulean and mCitrine were used as fluorescent proteins, and FKBP (F36M) was applied to HeLa cells (HeLa cell, ATCC No. CCL-2) in the same manner as in Example 1. ) 2-mCerulean-CAM and FRB-mCitrine fusion protein were expressed together. Negative control was not treated with rapamycin. In this case, FKBP (F36M) 2 converts monomeric FKBP into dimeric form by converting Phenylalanine, the 36th amino acid of FKBP, into Methionine. Confirmed. That is, it was confirmed that FKBP acts as a mediator (regulator) by mutation.
  • a nano-high unit complex which is a high signal intensity point image pattern, is formed by magnetic coupling of FKBP (F36M) 2 displayed on the nano unit complex. Then, the interaction of the FKBP and FRB displayed on the nano-high unit complex was induced to confirm that the FRB-mCitirine is linked (recruitment) and displayed on the nano-high unit complex according to the format of FIG. 3 (FIG. 12).
  • Simultaneously mutated FKBP interacts with FRB (prey) as a searcher, where the interaction between the searcher (FKBP (F36M) -FRB) is specific for Rapamycin, a substance that mediates (modulates) and as a searcher It was confirmed that the display on the nano-high complex.
  • nano-complexes can be formed by the self-binding domain of calcium / calmodulin phosphorylation (CAM) protein and display highly integrated bioactive materials.
  • CAM calcium / calmodulin phosphorylation
  • FKBP ferritin
  • mCerulean and mCitrine were used as fluorescent proteins. Negative control was not treated with rapamycin.
  • FKBP F36M 2-mCherry-FT and FRB-EGFP fusion proteins were expressed together in HeLa cells (ATC No. CCL-2) according to the method of Example 1.
  • FKBP F36M 2-mCerulean-CAM and FRB-Rel fusion proteins were expressed together in HeLa cells (HeLa cell, ATCC No. CCL-2) in the same manner as in Example 1.
  • FRB-Rel is a fusion protein that fuses the FRB domain and the Rel domain of RelA. It was treated with rapamycin analog (Clontech) followed by TNF-a. FRB used the T2098L mutant for rapamycin analog treatment. TNF-a activates intracellular NFkB signaling and transcription and was analyzed by measuring reporter gene expression by NFkb.
  • FRB-Rel As a result, as shown in FIG. 14, as the rapamycin analog is treated, FRB-Rel is highly integrated and displayed on the nano-high unit complex formed from FKBP (F36M) 2-mCerulean-CAM (FIG. 12). It was confirmed that intracellular NFkB signaling and transcription was activated by TNF-a.
  • FKBP F36M 2-mCherry-FT and FRB-Rel fusion protein were expressed together in HeLa cells (HeLa cell, ATCC No. CCL-2) according to the method of Example 1.
  • the rapamycin analog was treated followed by TNF-a.
  • TNF-a activates intracellular NFkB signaling and transcription and was analyzed by measuring reporter gene expression by NFkb.
  • FRB-Rel was displayed on the nano-high complex formed from FKBP (F36M) 2-mCherry-FT and displayed (FIG. 13) as TNF. It was confirmed that intracellular NFkB signaling and transcription was activated by -a.
  • the Rel-FT fusion protein was expressed in HeLa cells (ATC No. CCL-2) according to the method of Example 1.
  • the resultant was treated with TNF-a.
  • TNF-a activates intracellular NFkB signaling and transcription and was analyzed by measuring reporter gene expression by NFkb.
  • Rel-FT, FKBP-FT, and FRB-FT fusion proteins were expressed in HeLa cells (HeLa cell, ATCC No. CCL-2) according to the method of Example 1.
  • the resultant was treated with rapamycin analog followed by TNF-a.
  • TNF-a activates intracellular NFkB signaling and transcription and was analyzed by measuring reporter gene expression by NFkb.
  • Rel-FT is displayed on the nano-high complex formed from FKBP-FT, FRB-FT, intracellular NFkB signaling activated by TNF-a and It was confirmed that the degree of transcription is induced regulation. Therefore, it was confirmed that high-density display of the bioactive material according to the format of FIG. 2 in the nano-high complex formed by ferritin (FT) protein can induce regulation of intracellular function.
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, various proteins were fused to the N-terminus of the self-binding domain of calcium / calmodulin phosphorylation (CAM) protein and used for display and analysis of the material.
  • CAM calcium / calmodulin phosphorylation
  • FRB-Rel-CAM fusion protein was expressed in HeLa cells (ATC No. CCL-2) according to the method of Example 1.
  • the resultant was treated with TNF-a.
  • TNF-a activates intracellular NFkB signaling and transcription and was analyzed by measuring reporter gene expression by NFkb.
  • intracellular NFkB signaling and transcription was activated by TNF-a by displaying Rel on the nanounit complex formed from the self-binding domain of calcium / calmodulin phosphorylation (CAM) protein. It was confirmed that regulation was induced. Therefore, it was confirmed that high-density display of the bioactive material according to the format of FIG. 4 in the nanounit complex formed by the self-binding domain of calcium / calmodulin phosphorylation (CAM) protein can induce regulation of intracellular function.
  • CAM calcium / calmodulin phosphorylation
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, various proteins were fused to the N-terminus of the self-binding domain of calcium / calmodulin phosphorylation (CAM) protein and used for display and analysis of the material.
  • CAM calcium / calmodulin phosphorylation
  • FRB-Rel-CAM and FKBP-FT fusion proteins were expressed in HeLa cells (ATC No. CCL-2) according to the method of Example 1.
  • the resultant was treated with rapamycin analog followed by TNF-a.
  • TNF-a activates intracellular NFkB signaling and transcription and was analyzed by measuring reporter gene expression by NFkb.
  • Example 11 Various Therapeutic and Diagnostic Materials Displayed Highly Integrated in Nano-Assembly Forms Formed by Ferritin (FT) Proteins and Self-Binding Domains of Calcium / Calmodulin Phosphorylation (CAM) Proteins
  • FIG. 21 shows some examples of fusion of various therapeutic and diagnostic proteins to the self-binding domain and ferritin (FT) protein of calcium / calmodulin phosphorylation (CAM) protein to induce physiological control in cells and in vivo.
  • FT self-binding domain and ferritin
  • CAM calcium / calmodulin phosphorylation
  • one or more physiologically active substances are displayed in high density in an in vitro and in vivo artificial artificial high-molecular complex, so that they It can effectively control the mediated physiological function.
  • the high-intensity display of bioactive substances related to treatment or diagnosis in nanoscale complexes, combined with existing R & D results has a high probability of interaction with target substances associated with pharmacological action or diagnosis. It can be effective in controlling physiological functions such as increasing efficacy according to various advantages such as improving, improving pharmacokinetics and improving biodistribution.
  • the present invention can effectively induce various physiological functions in vitro or in vivo , particularly in vivo , which are mediated by specific bioactive substances.

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Abstract

본 발명은 세포 또는 생체 안에서 나노고단위복합체(nano-assembly matrix)에 고집적(high density)로 디스플레이(display)한 하나 또는 그 이상의 물질들을 이용해서 특이한 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 방법에 관한 것이다. 즉, 생리활성물질들의 고집적을 이용해서 효과적으로 세포 또는 생체내의 특이한 생리적인 조절 유도하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법은, 나노(고)단위복합체의 형성 (assembly) 및 분열(dis-assembly), 또는 나노(고)단위복합체에 특정 물질을 디스플레이(display)하거나 포착(trapping)되는 것을 조절함으로써, 세포 또는 생체 안의 생리적인 조절을 임의적으로 유도할 수 있다.

Description

물질의 고집적 디스플레이를 이용하여 생리적인 조절을 유도하는 방법
본 발명은 세포 또는 생체 안에서 나노고단위복합체(nano-assembly matrix)에 고집적(high density)로 디스플레이(display)한 하나 또는 그 이상의 물질들을 이용해서 특이한 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 방법에 관한 것이다. 즉, 생리활성물질들의 고집적을 이용해서 효과적으로 세포 또는 생체내의 특이한 생리적인 조절을 유도하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로 다양한 생리활성물질들 사이의 역동적인 상호작용에 의해서 여러 가지 생리적인 기능이 조절된다. 이러한 상호작용이 적절히 일어나지 못하면 문제가 생겨 질환이 발생한다. 가령, 생체내의 단백질은 다른 단백질과 상호작용함에 의해 그 기능을 나타낸다. 일반적으로 상보적인 구조의 두 개의 단백질은 상호작용하고, 생리활성화합물은 단백질 3차 구조의 특정부위에 특이적으로 상호작용한다. 일반적으로 두 개의 단백질 사이의 상호작용은 이들 단백질이 기능적으로 관련되어 있음을 강하게 암시하며, 단백질의 특정부위에 특이적으로 상호작용하는 생리활성화합물은 그 단백질의 활성을 조절함에 의해 예컨대, 질환 관련 단백질의 경우 질환을 진단, 예방, 치료 또는 경감시킬 수 있는 치료제로서의 개발가능성을 제시한다.
따라서 신약개발 분야에서는 이미 그 기능 및 특성이 밝혀진 물질인 "베이트(bait)"와 탐색 및 검출 대상이 되는 상호작용 파트너인 "프레이(prey)"의 상호작용을 확인함으로써 신규 표적단백질을 검출하거나 신약후보물질로서 생리활성물질을 스크리닝하는 다양한 방법이 연구되고 있다. 이와 같이, 상호작용 분석을 통한 새로운 표적단백질의 동정 및 분리는 약물의 활성, 효과 및 부작용 등에 대한 유용한 정보를 수득하기 위한 매우 중요한 연구개발과제로 간주된다. 또한, 표적단백질은 생물학적 경로 및 전달체계에 대한 이해를 증진시키고 기초 세포조절 및 질환 메커니즘(mechanism)에 대한 정보를 제공하며, 이러한 정보는 표적단백질과 상호작용하는 생리활성 화합물에 대한 탐색 및 검출을 통하여 신약 개발 및 종래 약물의 개량 및 신규 약제학적 용도의 발견 등에 매우 놀랍고도 강력한 수단이 된다.
의약계는 인간의 다양한 질환에 대한 보다 안전하고 효과적인 치료법을 개발하기 위한 도전에 직면해 있지만, 현재 사용되고 있는 많은 약물들은 그들의 표적단백질 및 분자적 타겟(molecular target) 규명 없이 질환 모델에서의 생물학적 효능에 의해 규정되어지고 있는 실정이다(Burdine, L. et al., Chem. Biol. 11:593,2004). 게다가, 생물적 활성을 지닌 천연물이 약물 개발에 중요한 원천이 되고 있으나, 그들 활성의 양상은 대부분 알려져 있지 않고 있다(Clardy, J. et al., Nature 432:829,2004). 그들의 생리적 대상 및 분자적 타겟에 대한 규명은 치료적 효과 및 역효과에 대한 이해에 필수적일 뿐만 아니라, 이에 의해, 보다 개선된 2세대 치료학의 발전을 가능하게 할 것이다. 또한, 임상적으로 증명된 화합물의 새로운 타겟을 발견하는 일은 치료상의 새로운 응용에 기여하게 될 것이다(Ashburn, T. T. et al., Drug Discov. 3:673,2004).
세포 기반의 스크리닝 방법을 다루는 화학생물학 분야에서 "타겟 스크리닝"은 거대한 화합물 라이브러리로부터 바람직한 표현형에 따라 저분자화합물들을 규명하는데 사용된다(Strausberg, R. L. at al., Science 300:294,2003; Stockwell, B. R. Nature 432:846,2004). 상기 스크리닝의 큰 이점에도 불구하고, 이러한 접근은 발견된 저분자화합물을 규명하기에는 쉽지 않은 방법이다. 그러나, 단백질(또는 저분자화합물)-단백질 상호작용과 같은 다양한 세포내 분자 상호작용의 효과적인 검출은 동적인 생물학적 프로세스 및 조절 네트워크의 이해에 필수적이기 때문에, 이러한 타겟 동정 기술의 발달은 유전학, 단백질학 및 시스템 생물학을 포함한 다양한 생명과학 분야에 있어서 매우 중요하다.
타겟 스크리닝 분야에서, 친화성 크로마토그래피(Phizicky, E. M. et al., Microbiol. Rev. 59:94,1995; Mendelsohn, A. R. et al., Science 284:1948,1999); 단백질/저분자화합물 마이크로어레이; 파지 디스플레이(Sche, P. P. et al., Chem. Biol. 6:707,1999); 효모 2종-/3종-하이브리드 어세이(Licitra, E. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:12817,1996); 발현 프로파일링; 및 효모균주 이종결실(heterologous deletions)이 일어난 효모균주의 평행분석(Zheng, O. et al., Chem. Biol. 11:609,2004)등과 같은 몇몇의 기술들이 생리활성 분자들간 상호작용의 분석을 위해 활용되어 왔다.
그러나, 이러한 모든 기술들은 하이-백그라운드(high background), 가양성(false positives), 낮은 민감도(low sensitivity), 단백질 발현 후의 부적절한 폴딩(inappropriate folding), 간접성(indirectness), 단백질 발현 후의 변형 부족, 또는 세포적 적합성이 포함된 제한된 타겟 접근성 등과 같은 다양한 문제들로 어려움을 겪고 있다. 또한, 인 비트로(in vitro) 결합조건 또는 비-포유동물 세포와 같은 인위적인 환경의 사용은 때때로 실험 결과에 오류를 초래한다.
그러므로, 생리학적으로나 약학적으로 높은 민감도 및 선택도가 고려된 조건에서 생리활성물질들 사이의 상호작용을 직접적으로 조사하는 것이 가장 바람직하다. 종합적으로 볼 때, 상기와 같은 기반기술을 발전시키는 것이 종래 기술과 비교하여 여러가지 이점을 제공하는데 매우 중요하다고 할 수 있다.
첫째, 생리학적으로나 약학적으로 관련된 생리활성물질 및 분자들간 상호작용을 탐색하는 것은 인위적인 실험적 환경에 따른 결과물이 이끌어내는 오류를 크게 감소시킬 수 있고, 둘째, 전체 발현 프로파일 또는 복잡한 생물학적 표현형에 의존하는 여타 간접적 해독 방법과 달리, 생리활성물질 및 분자 상호작용을 명확한 해독 시그널로 직접적으로 해석할 수 있게 한다. 따라서, 생리활성물질 및 분자의 타겟에 대하여 내재된 가(false) 양성/음성 또는 오류를 일으키기 쉬운 추론 등이 미연에 방지될 수 있다. 셋째, 생리활성물질 및 분자들간 상호작용에 있어서 동적인 단일세포 분석이 가능하다. 개개의 살아있는 세포들의 동적 분석(dynamic analysis)은 생리학적 및 약학적으로 광범위한 범위에 걸쳐, 이종간 비동시적으로 일어나는 세포내 프로세스를 탐색할 수 있는 효과적인 방법을 제공한다.
결국, 상기 기반기술은 다른 조직들 및 질환 상태의 넓은 범위에 걸쳐, 살아있는 세포내에서 생리활성물질 및 분자들간의 상호작용(예를 들어, 생리활성 저분자화합물와 단백질간의 상호작용 등)의 다양성을 분석하는데 사용될 수 있는데 많은 한계를 가지고 있으므로 새로운 기반기술의 개발이 필요하다.
이에, 본 발명자는 상기 종래 기술의 문제점을 해결하면서, 인 비트로(in vitro) 뿐만 아니라 인 비보(in vivo)에서 생리활성물질들 사이의 상호작용을 역동적으로 탐색하기 위한 방법을 연구한 결과, 다양한 생리활성물질들이 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하는지(nano-assembly matrix formation) 여부 또는 나노고단위복합체에서 같이 위치하는지(co-localization on nano-assembly matrix) 여부를 분석함으로 생리활성물질들 사이의 상호작용을 탐색, 검증할 수 있음을 규명한 바 있다(국내출원 10-2008-0079957호 참조).
한편, 세포 안에서는 signalsome, 생체 안의 세포 밖에서는 exosome 등의 "-some" 또는 "complex" 등의 형태로 다양한 생리적인 (고단위)복합체가 존재하고 있다. 이러한 생리적인 고단위복합체에 하나 또는 여러 종류의 관련된 단백질 등 생리활성물질들이 함께 존재함으로서 세포 또는 생체 안의 특정 생리적인 기능이 효과적으로 조절됨이 규명되었다. 이러한 복합체를 토대로 매개되는 효율적인 생리적인 조절에서 처럼 세포 또는 생체내에서 대부분의 생리적인 조절에 다가적인 상호작용(multi/poly-valent interactions)가 매우 중요한 역할을 함이 규명되었다( Mammen, M. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 37:2755,1998; Kiessling, L. L. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 45:2348,2006). 즉, 단백질 등 대부분 생리활성물질들 사이의 상호작용에서 단가적인 결합(mono-valent interactions)보다 다가적인 결합(multi/poly-valent interactions)이 주로 중요한 역할을 수행한다.
이에, 본 발명자는 이러한 생리적인 복합체의 특성 및 상호작용 조절 현상을 토대로 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이된 생리활성물질들이 하나 또는 그 이상의 종류가 함께 고농도로 존재함으로써, 세포 또는 생체 안에서 그들의 국소농도(local concentration)이 증가되고; 표적물질 등과의 다가적인 상호작용(multi/poly-valent interactions)을 효과적으로 유도하고; 이에 따라 서로 기능적으로 시너지(synergy)를 이루고; 서로 기능적으로 조정(coordination)되면, 세포 또는 생체 안의 생리적인 기능을 효과적으로 조절 유도할 수 있을 것이라 판단하여, 예의 실험 연구한 결과, 인위적으로 형성 유도된 나노고단위복합체에 생리활성물질을 고집적(high density)로 디스플레이 함으로써, 세포 또는 생체 안의 생리적인 기능을 효과적으로 조절 유도할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 나아가 상기 나노고단위복합체의 형성(assembly) 및 분열(dis-assembly), 또는 나노고단위복합체에 특정 물질을 디스플레이 또는 포착하는 것을 인위적으로 조절 유도함으로써 세포 또는 생체의 생리적인 기능을 임의적으로 조절 유도할 수 있다는 장점도 있다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
발명의 요약
본 발명은 특정 생리활성물질이 매개하는 세포 또는 생체내에서의 생리적인 기능을 인위적으로 조절 유도하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 구체적으로, 본 발명은 인위적인 나노고단위복합체에 생리활성물질들이 고집적으로 디스플레이 됨으로써, 디스플레이된 물질에 의해서 또는 디스플레이된 물질과 다른 관련 물질의 상호작용에 의하여 생리적인 조절을 효과적으로 유도하는 것을 목적으로 한다.
가령, 고집적 디스플레이된 물질들, 그 일부 예들로써 항체, 항원 및 에피톱(epitope), 바이러스 단백질 및 펩타이드(HIV Tat, HBV, SARS 단백질 및 펩타이드 등), 질병 세포 특이 수용체 및 마커 결합 단백질 및 펩타이드(disease cell-specific receptor or marker protein-targetting protein/peptide), 치료 수용체 결합 단백질 및 펩타이드 (therapeutic receptor-binding protein/peptide), 치료 단백질 및 펩타이드(therapeutic protein/peptide), 헤모글로빈, Gd3+ 이온, 치료제 약물, 은 농축 펩타이드(silver condensing peptide), 금속 청소 펩타이드(metal scavenging peptide) 등의 여러 특이한 종류 및 관련된 생리적인 기능에 따라 백신(vaccines), 치료제(therapeutics), 진단제(diagnostics), 이미징용 물질(imaging agents), 금속 킬레이팅용 물질(metal chelating agents), 혈액 제제(blood substitutes), 젤화 물질(gelling agents), 물질 분리토대(purification platforms), 물질 전달토대(drug delivery platforms) 등의 개발 등에 효과적으로 활용될 수 있다.
이러한 고집적 디스플레이된 물질은 유전자, 단백질, 화합물 등의 여러 생리활성물질 형태로 세포, 조직 또는 생체에 투입될 수 있고 나노고단위복합체는 인 비트로(in vitro) 또는 인 비보(in vivo)가령, 세포 안, 세포 밖 또는 생체 안, 생체 밖 등에서 임의적으로 형성 및 분열을 조절할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질, 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 탐색물질을 고집적으로 디스플레이함으로써, 상기 매개(조절)물질 또는 탐색물질이 매개하는 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 방법을 제공한다:
(i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
(ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고, 상기 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 탐색물질을 고집적으로 디스플레이함으로써, 상기 매개(조절)물질 또는 탐색물질이 매개하는 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 방법을 제공한다:
(i) 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
(ii) 상기 탐색물질을 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이함으로써, 상기 탐색물질이 매개하는 생리적인 형태 또는 기능을 조절 유도하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 방법을 제공한다:
(i) 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
(ii) 상기 탐색물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 탐색물질을 고집적으로 디스플레이함으로써, 상기 탐색물질이 매개하는 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계에 의하여 분리된 나노고단위복합체를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능에 관련된 질환의 백신용, 예방용, 물질전달체용 또는 치료용 조성물을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질, 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 탐색물질을 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노고단위복합체를 분리하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계에 의하여 분리된 나노고단위복합체를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능에 관련된 질환의 백신용, 예방용, 물질전달체용 또는 치료용 조성물을 제공한다:
(i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
(ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 상기 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 탐색물질을 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노고단위복합체를 분리하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계에 의하여 분리된 나노단위복합체를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능에 관련된 질환의 백신용, 예방용, 물질전달체용 또는 치료용 조성물을 제공한다:
(i) 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
(ii) 상기 탐색물질을 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노단위복합체를 분리하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계에 의하여 분리된 나노단위복합체를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능에 관련된 질환의 백신용, 예방용, 물질전달체용 또는 치료용 조성물을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질, 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
(ii) 상기 매개조절물질과 탐색물질을 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노단위복합체를 분리하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계에 의하여 분리된 나노단위복합체를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능에 관련된 질환의 백신용, 예방용, 물질전달체용 또는 치료용 조성물을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
(ii) 상기 매개조절물질을 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노단위복합체를 분리하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계에 의하여 분리된 나노고단위복합체를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능에 관련된 질환의 백신용, 예방용, 물질전달체용 또는 치료용 조성물을 제공한다:
(i) 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
(ii) 상기 탐색물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 탐색물질을 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노고단위복합체를 분리하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 물질의 스크리닝용 방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질, 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 탐색물질을 고집적으로 디스플레이하는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 표적 후보물질을 제공하는 단계; 및
(iv) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 생리적인 형태 또는 기능을 기준으로, 표적 후보물질의 존재 하에서 생리적인 형태 또는 기능에 변화가 발생하는 경우의 표적 후보물질을 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절하는 물질로 선정하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 물질의 스크리닝용 방법을 제공한다:
(i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계;
(ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 상기 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 탐색물질을 고집적으로 디스플레이하는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 표적 후보물질을 제공하는 단계; 및
(iv) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 생리적인 형태 또는 기능을 기준으로, 표적 후보물질의 존재 하에서 생리적인 형태 또는 기능에 변화가 발생하는 경우의 표적 후보물질을 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절하는 물질로 선정하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 물질의 스크리닝용 방법을 제공한다:
(i) 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계;
(ii) 상기 탐색물질을 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이하는 단계;
(iii) 상기 나노단위복합체에 표적 후보물질을 제공하거나, 상기 나노단위복합체를 분리하여 세포, 조직 또는 생체 내에 도입하여 탐색물질간 상호작용에 의하여 또는 첨가된 매개(조절)물질에 의하여 형성된 나노고단위복합체에 표적 후보물질을 제공하는 단계; 및
(iv) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 생리적인 형태 또는 기능을 기준으로, 표적 후보물질의 존재 하에서 생리적인 형태 또는 기능에 변화가 발생하는 경우의 표적 후보물질을 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절하는 물질로 선정하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 물질의 스크리닝용 방법을 제공한다:
(i) 제1매개(조절)물질, 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계;
(ii) 상기 제1매개(조절)물질과 탐색물질을 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이하는 단계;
(iii) 상기 나노단위복합체에 표적 후보물질을 제공하거나, 상기 나노단위복합체를 분리하여 세포, 조직 또는 생체 내에 도입하여 제1매개(조절)물질간 상호작용에 의하여 또는 첨가된 제2매개(조절)물질에 의하여 형성된 나노고단위복합체에 표적 후보물질을 제공하는 단계; 및
(iv) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 생리적인 형태 또는 기능을 기준으로, 표적 후보물질의 존재 하에서 생리적인 형태 또는 기능에 변화가 발생하는 경우의 표적 후보물질을 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절하는 물질로 선정하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 물질의 스크리닝용 방법을 제공한다:
(i) 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계;
(ii) 상기 탐색물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 탐색물질을 고집적으로 디스플레이하는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 표적 후보물질을 제공하는 단계; 및
(iv) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 생리적인 형태 또는 기능을 기준으로, 표적 후보물질의 존재 하에서 생리적인 형태 또는 기능에 변화가 발생하는 경우의 표적 후보물질을 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절하는 물질로 선정하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능에 관련된 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질, 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계;
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 탐색물질을 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노고단위복합체를 분리하는 단계; 및
(iii) 상기 분리된 나노고단위복합체를 세포, 조직 또는 생체 내에 도입하여 상기 탐색물질 또는 매개(조절)물질이 매개하는 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도시켜 세포 또는 체내의 생리적 형태 또는 기능에 관련된 질환을 예방 또는 치료하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능에 관련된 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다:
(i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계;
(ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 상기 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 탐색물질을 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노고단위복합체를 분리하는 단계; 및
(iii) 상기 분리된 나노고단위복합체를 세포, 조직 또는 생체 내에 도입하여 상기 탐색물질 또는 매개(조절)물질이 매개하는 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도시켜 세포 또는 체내의 생리적 형태 또는 기능에 관련된 질환을 예방 또는 치료하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능에 관련된 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다:
(i) 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계;
(ii) 상기 탐색물질을 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노단위복합체를 분리하는 단계; 및
(iii) 상기 분리된 나노단위복합체를 세포, 조직 또는 생체 내에 도입하여 상기 탐색물질이 매개하는 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도시키거나, 도입된 나노단위복합체를 세포, 조직 또는 생체 내에서 탐색물질간 상호작용에 의하여 또는 탐색물질과 상호작용하는 매개(조절)물질에 의하여 나노고단위복합체를 형성시킨 후 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 탐색물질 또는 매개(조절)물질이 매개하는 생리적인 형태 기능을 조절 또는 유도시켜 세포 또는 체내의 생리적 형태 또는 기능에 관련된 질환을 예방 또는 치료하는 단계.
본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능에 관련된 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다:
(i) 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계;
(ii) 상기 탐색물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 탐색물질을 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노고단위복합체를 분리하는 단계; 및
(iii) 상기 분리된 나노고단위복합체를 세포, 조직 또는 생체 내에 도입하여 상기 탐색물질이 매개하는 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도시켜 세포 또는 체내의 생리적 형태 또는 기능에 관련된 질환을 예방 또는 치료하는 단계.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의하여 분리된 나노고단위복합체 또는 나노단위복합체의 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능에 관련된 질환의 예방 또는 치료용 용도를 제공한다.
본 발명의 다른 특징 및 구현예는 다음의 상세한 설명 및 첨부된 특허청구범위로부터 더욱 명백해 질 것이다.
도 1은 세포 또는 생체 안에서 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 생리활성물질을 이용해서 관련된 생리적 조절을 인위적으로 효과적으로 유도하는 것에 대한 모식도이다. 이하 도 2 내지 도 8에서 생리활성물질인 탐색물질을 고집적 디스플레이시킨 베이트물질에 해당한다.
도 2는 매개(조절)물질 A와 B간의 직접적인 또는 C를 통한 간접적인 상호작용에 의해 나노고단위복합체의 형성이 유도될 때 나노고단위복합체에서 X를 디스플레이하는 구성물에 대한 개략도이다(A와 B와 C와 X는 동일한 또는 상이한 물질; N은 나노고단위복합체 형성물질). N에 고집적 디스플레이되는 X, A, B, C 물질에 의하여 관련된 특이한 생리적인 조절을 유도한다.
도 3은 제1매개(조절)물질 A, B, C 간의 상호작용에 의해 나노고단위복합체의 형성이 유도되면서, 제2매개(조절)물질 D, E, F 간의 상호작용에 의해 나노고단위복합체에서 X를 디스플레이하는 구성물에 대한 개략도이다(A와 B와 C와 D와 E와 F와 X는 동일한 또는 상이한 물질; N은 나노고단위복합체 형성물질). N에 고집적 디스플레이되는 X, A, B, C, D, E, F 물질에 의하여 관련된 특이한 생리적인 조절을 유도한다.
도 4 (A)와 (B)는 나노단위복합체에서 X 또는 X와 Y간의 직접적인 또는 A를 통한 간접적인 상호작용을 하는 구성물에 대한 개략도이다(X와 Y와 A는 동일한 또는 상이한 물질; N은 나노고단위복합체 형성물질). N에 고집적 디스플레이되는 X, Y, A 물질에 의하여 관련된 특이한 생리적인 조절을 유도한다.
도 5 (A), (B) 및 (C)는 나노고단위복합체에서 X와 Y간의 직접적인 또는 A를 통한 간접적인 상호작용을 하는 구성물에 대한 개략도이다(X와 Y와 A는 동일한 또는 상이한 물질; N 및 N'은 나노고단위복합체 형성물질; (A) 동일한 나노고단위복합체 형성물질 이용, (B) 서로 다른 종류의 나노고단위복합체 형성물질 이용, (C)는 동일한 종류의 탐색물질 이용). N에 고집적 디스플레이되는 X, Y, A 물질에 의하여 관련된 특이한 생리적인 조절을 유도한다.
도 6 (A), (B) 및 (C)는 나노고단위복합체에서 X와 Y간의 상호작용이 각 탐색물질에 결합된 매개(조절)물질인 A 및 B에 의하여 또는 A, B 및 C에 의하여 간접적으로 이루어지는 구성물에 대한 개략도이다(X와 Y와 A와 B와 C는 동일한 또는 상이한 물질; N 및 N'은 나노고단위복합체 형성물질; (A) 동일한 나노고단위복합체 형성물질 이용, (B) 서로 다른 종류의 나노고단위복합체 형성물질 이용, (C) 동일한 종류의 탐색물질 이용). N에 고집적 디스플레이되는 X, Y, A, B, C 물질에 의하여 관련된 특이한 생리적인 조절을 유도한다.
도 7 (A)와 (B)는 나노고단위복합체에서 A와 B간의 직접적인 또는 C를 통한 간접적인 상호작용이 일어나는 상황에서 X와 Y간의 상호작용을 하는 구성물에 대한 개략도이다(A와 B와 C와 X와 Y는 동일한 또는 상이한 물질; N 및 N'은 나노고단위복합체 형성물질; (A) 동일한 나노고단위복합체 형성물질 이용, (B) 서로 다른 종류의 나노고단위복합체 형성물질 이용). N에 고집적 디스플레이되는 X, Y, A, B, C 물질에 의하여 관련된 특이한 생리적인 조절을 유도한다.
도 8 (A)와 (B)는 나노고단위복합체에서 A와 B간의 직접적인 또는 C를 통한 간접적인 상호작용이 일어나는 상황에서 X와 Y 및 X와 X간의 상호작용을 하는 구성물에 대한 개략도이다(A와 B와 C와 X와 Y는 동일한 또는 상이한 물질; N은 나노고단위복합체 형성물질; (A) X가 서로 상호작용이 없는 경우, (B) X가 서로 상호작용이 있는 경우). N에 고집적 디스플레이되는 X, Y, A, B, C 물질에 의하여 관련된 특이한 생리적인 조절을 유도한다.
도 9는 칼슘/칼모듈린 인산화 단백질의 자기결합(self-association) 도메인이 상호작용해서 자기조립에 의하여 형성되는 나노크기의 단위복합체 구조이다.
도 10은 칼슘/칼모듈린 인산화 단백질의 자기결합(self-association) 도메인에 탐색단백질(또는 형광단백질)을 결합(fusion)해서 나노크기의 단위복합체를 만들기 위한 융합단백질의 기본 구조이다. 칼슘/칼모듈린 인산화 단백질의 N-말단 뿐만 아니라 C-말단에도 융합이 가능하다. 이를 토대로 칼슘/칼모듈린 인산화 단백질을 나노고단위복합체 형성물질로 사용했다.
도 11은 헬라세포에서 칼슘/칼모듈린 인산화(CAM) 단백질의 자기결합(self-association) 도메인으로부터 형성된 나노단위복합체과 페리틴 단백질(FT)로부터 형성된 나노단위복합체에서 FKBP-mCerulean-FT과 FRB-mCitrine-CAM의 상호작용을 매개(조절)물질(rapamycin)의 존재 여부에 따라 A; mCerulean, B; mCitrine 이미징한 사진이다. 도 5의 형식에 따라 칼슘/칼모듈린 인산화(CAM) 단백질의 자기결합(self-association) 도메인이 페리틴 단백질처럼 나노고단위복합체 형성물질로서 사용됨을 보여 준다.
도 12는 헬라세포에서 칼슘/칼모듈린 인산화(CAM) 단백질의 자기결합(self-association) 도메인으로부터 제1매개(조절)물질인 FKBP(F36M)2에 의해 형성된 나노고단위복합체에서 FKBP-mCerulean-CAM과 FRB-mCitrine의 상호작용을 제2매개(조절)물질(rapamycin)의 존재 여부에 따라 A; mCerulean, B; mCitrine 이미징한 사진이다. 도 3의 형식에 따라 칼슘/칼모듈린 인산화(CAM) 단백질의 자기결합(self-association) 도메인이 페리틴 단백질처럼 나노고단위복합체 형성물질로서 사용됨을 보여 준다.
도 13은 헬라세포에서 페리틴(FT) 단백질으로부터 제1매개(조절)물질인 FKBP(F36M)2에 의해 형성된 나노고단위복합체에서 FKBP-mCherry-FT과 FRB-EGFP의 상호작용을 제2매개(조절)물질(rapamycin)의 존재 여부에 따라 A; mCerulean, B; mCitrine 이미징한 사진이다. 도 3의 형식에 따라 페리틴 단백질이 나노고단위복합체 형성물질로서 사용됨을 보여 준다.
도 14는 칼슘/칼모듈린 인산화(CAM) 단백질의 자기결합 도메인으로부터 형성된 나노고단위복합체에 도 3의 형식에 따라 고집적 디스플레이한 물질(Rel)에 의해 세포내 NFkB 신호전달 및 전사 활성화의 조절되는 정도를 그래프로 나타낸 것이다.
도 15는 페리틴(FT) 단백질으로부터 형성된 나노고단위복합체에 도 3의 형식에 따라 고집적 디스플레이한 물질(Rel)에 의해 세포내 NFkB 신호전달 및 전사 활성화의 조절되는 정도를 그래프로 나타낸 것이다.
도 16은 페리틴(FT) 단백질으로부터 형성된 나노단위복합체에 도 4의 형식에 따라 고집적 디스플레이한 물질(Rel)에 의해 세포내 NFkB 신호전달 및 전사 활성화의 조절되는 정도를 그래프로 나타낸 것이다.
도 17은 페리틴(FT) 단백질으로부터 형성된 나노고단위복합체에 도 2의 형식에 따라 고집적 디스플레이한 물질(Rel)에 의해 세포내 NFkB 신호전달 및 전사 활성화의 조절되는 정도를 그래프로 나타낸 것이다.
도 18은 칼슘/칼모듈린 인산화(CAM) 단백질의 자기결합 도메인으로부터 형성된 나노단위복합체에 도 4의 형식에 따라 고집적 디스플레이한 물질(Rel)에 의해 세포내 NFkB 신호전달 및 전사 활성화의 조절되는 정도를 그래프로 나타낸 것이다.
도 19는 칼슘/칼모듈린 인산화(CAM) 단백질의 자기결합 도메인 및 페리틴(FT) 단백질으로부터 형성된 나노고단위복합체에 도 5의 형식에 따라 고집적 디스플레이한 물질(Rel)에 의해 세포내 NFkB 신호전달 및 전사 활성화의 조절되는 정도를 그래프로 나타낸 것이다.
도 20은 칼슘/칼모듈린 인산화(CAM) 단백질의 자기결합 도메인 또는 페리틴 단백질(FT)로부터 형성된 나노단위복합체 또는 나노고단위복합체를 분리 및 정제를 위한 융합단백질의 기본 구조의 한 예이다. 이러한 융합단백질은 용이하게 분리정제할 수 있다.
도 21은 칼슘/칼모듈린 인산화(CAM) 단백질의 자기결합 도메인 또는 페리틴 단백질(FT)로부터 형성된 나노단위복합체 또는 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 치료용 또는 진단용 물질들의 예이다.
도면 22은 도 21의 치료용 및 진단용 단백질 물질의 일부(1 내지 30) 예들을 FRB-mCherry에 결합해서 세포 내에 발현하고 rapamycin을 처리함에 따라, FKBP(F36M)2이 결합된 페리틴(FT) 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이한 것을 이미징한 사진이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
본원에서 "생리활성물질"이란, 생물이 생을 영위함에 있어서 생체의 기능을 증진시키거나 혹은 억제시키는 등의 조절 역할을 하는 물질이라 정의할 수 있다. 이러한 생리활성의 물질은 동식물과 같은 천연물로부터 얻거나 미생물 및 동식물 세포주의 대사산물로부터 추출 정제 할수도 있고 화학합성에 의해서도 얻을수 있다. 생리활성물질은 예를 들어, 핵산, 뉴클레오타이드, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 당, 지질, 비타민 또는 화합물(chemical compound) 등일 수 있다.
본원에서 "탐색 물질"이란, 다른 생리활성물질과의 상호작용을 탐색하는데 이용될 수 있는 생리활성물질이다.
본원에서 "조절 물질“이란 조절하고자 하는 대상이 되는 세포 내 기능을 매개하는 물질과 직접 또는 간접으로 관련된 또는 상호작용하는 물질을 일컫는 용어로서, 목적하는 바에 따라 탐색물질이 조절 물질이 될 수도 있고, 탐색물질과 결합하여 상호작용하는 물질을 의미하는 것으로 사용될 수 있다. 상기 탐색물질 또는 매개(조절)물질이 매개하는 세포 내 기능을 촉진(activating), 유도(inducing), 억제(blocking), 또는 저해(inhibiting)하는 물질을 조절 물질로 할 수도 있다.
본원에서 "나노고단위복합체(nano-assembly matrix)"란 일정한 구조골격을 가진 나노단위복합체의 상호작용(interaction)에 의하여 고집적(high density)되어 쉽게 관찰될 수 있는 고단위복합체(예를 들면, 페리틴 등과 같은 단백질 24 subunit이 서로 자기조립을 통해 결합해서 형성된 일정한 구조골격을 갖는 나노단위복합체가 서로 상호작용을 함으로써 형성된 고단위복합체로서, 본 발명에서는 쉽게 관찰할 수 있는 증폭된 고신호강도 점상이미지패턴과 같은 개념으로 사용되기도 한다)를 의미한다. 당업계에서는 나노클러스터(nanoclusters), 나노어셈블리(nanoassemblies)"는 모두 나노고단위복합체와 동일한 의미로 사용된다. 본 발명의 실시예에서는, 탐색물질간 상호작용 또는 매개(조절)물질간의 상호작용에 의한 나노단위복합체의 고집적된 복합체를 나노고단위복합체 형성으로 표현하였다. 한편, 이는 고신호강도 점상이미지패턴의 변화로도 확인될 수 있다.
본원에서 "나노고단위복합체를 형성할 수 있는 물질(이하, '나노고단위복합체 형성물질'이라 한다)"이란 상기 나노고단위복합체를 형성할 수 있는 성질 및 기능을 가지고 있는 모든 물질을 의미하며, 한가지 예로서 페리틴과 같이 여러 개의 동일한 또는 상이한 상호작용부위(binding moeity)를 가진 다가결합성(poly/multi-valent) 물질로서, 서로간의 상호작용 또는 자기조립(self-assembly)에 의해 복합체를 형성할 수 있는 물질을 의미한다. 본 발명에서는 매개(조절)물질간의 상호작용에 의해 관찰가능한 고신호강도 점상이미지패턴, 또는 탐색물질간의 상호작용에 의해 나노고단위복합체,즉, 관찰가능한 고신호강도 점상이미지패턴을 형성하는 물질을 의미한다.
본원에서 "나노단위복합체"란, 상기 나노고단위복합체의 토대가 되는 복합체로서 단백질 등의 자기조립에 의하여 복합체를 형성한 것을 의미한다. 가령, 페리틴 단백질 24 subunit이 자기조립되어 나노단위복합체를 형성한다. 특히 본원에서 처음으로 증명한 바, 칼슘/칼모듈린 인산화 단백질(calcium/calmodulin-dependent kinase II)처럼 자기결합(self-association) 도메인을 가진 단백질들도 매우 용이하게 나노단위복합체를 형성하고 나아가 나노고단위복합체를 형성할 수 있다. 따라서 본원의 나노(고)단위복합체를 형성할 수 있는 물질은 자기결합 도메인을 가진 광범위한 생리활성을 포함함을 증명함으로써 알 수 있다.
본원에서 "매개(조절)물질"이란 나노고단위복합체 형성을 유도하는 물질을 의미하며, 이는 상기 나노고단위복합체 형성물질과 직접 또는 간접적인 결합, 상호작용 및 융합을 통해서 나노고단위복합체의 형성을 유도할 수 있는 모든 경우를 포함한다. 이러한 매개(조절)물질의 활성을 매개 또는 조절하는 물질 또한 넓은 의미의 매개(조절)물질이라고 할 수 있다. 상기 매개(조절)물질은 나노고단위복합체 형성을 유도하는 특정 화합물이나 단백질 등의 구체적인 물질인 경우뿐만 아니라, 특정 돌연변이(mutation) 등의 현상과 특정 생리적인 신호 등을 아우르는 개념이다. 예를 들어, 생리적인 신호에 따른 단백질간의 상호작용, RNA와 단백질의 상호작용이나, 특정 단백질의 특정 돌연변이(mutation), 또는 구체적인 화합물에만 반응하는 단백질의 사용 등을 통해 나노고단위복합체의 형성을 유도할 수 있고, 이들을 본 명세서에서 '매개(조절)물질'로 나타내고 있다.
본원에서 "디스플레이(display)"란, 나노(고)단위복합체 밖 또는 안에 물질을 직접적으로 또는 다른 물질을 매개하여 간접적으로 드러내는(exposing) 또는 나노(고)단위복합체 안에 물질을 적재(loading)하는 형태를 포함한다. 나노(고)단위복합체의 분열(dis-assembly)에 따라 노출되는 적재된 물질에 의하여 매개되는 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도할 수도 있다.
본원에서 "생리적인 조절"이란, 세포 또는 생체내에서 조절 또는 유도되는 여러 가지 생리적인 기능 또는 형태 등의 변화 및 조절을 포함한다. 따라서 질환과 관련된 모든 생리적인 기능 또는 형태 등의 조절 또는 유도도 포함한다.
이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.
본 발명은, 인위적인 나노고단위복합체 또는 나노단위복합체에 서로 상호작용하는 생리활성물질들을 고집적(high density)로 디스플레이시킴으로써, 상기 디스플레이되는 물질 또는 포착되는 물질, 또는 이들과 상호작용하는 물질이 매개하는 생리적인 형태 또는 기능을 억제 또는 활성화시킴으로써 세포 내 또는 체내의 다양한 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 방법에 관한 것이다 (도 1). 이러한 본 발명에 의한 방법은, 구체적으로 하기의 제1태양, 제2태양, 제3태양 및 제4의 태양의 방법으로 구체화될 수 있다.
물질의 상호작용을 이용하여 세포 또는 체내의 생리적 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하기 위한 본 발명의 구체적인 제1태양 및 제2 태양은 매개(조절)물질에 의해 나노고단위복합체를 형성한 후, 상기 형성된 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 탐색물질 또는 매개조절물질이 매개하는 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도할 수 있는 방법이다.
우선, 본 발명의 구체적인 제1 태양은, 다음의 단계를 포함하는 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 방법 (도 2)이다:
(i) 매개(조절)물질, 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 탐색물질을 고집적으로 디스플레이함으로써, 상기 매개(조절)물질 또는 탐색물질이 매개하는 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 단계.
이때, 제1 방법의 변형예로서, 다음의 단계를 포함하는 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 물질의 스크리닝용 방법을 제공할 수 있다:
(i) 매개(조절)물질, 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 탐색물질을 고집적으로 디스플레이하는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 표적 후보물질을 제공하는 단계; 및
(iv) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 생리적인 형태 또는 기능을 기준으로, 표적 후보물질의 존재 하에서 생리적인 형태 또는 기능에 변화가 발생하는 경우의 표적 후보물질을 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절하는 물질로 선정하는 단계.
아울러, 본 발명의 구체적인 제2 태양은, 다음의 단계를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 방법 (도 3)이다:
(i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
(ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고, 상기 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 탐색물질을 고집적으로 디스플레이함으로써, 상기 매개(조절)물질 또는 탐색물질이 매개하는 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 단계.
이때, 제2 방법의 변형예로서, 다음의 단계를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 물질의 스크리닝용 방법을 제공할 수 있다:
(i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계;
(ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 상기 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 탐색물질을 고집적으로 디스플레이하는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 표적 후보물질을 제공하는 단계; 및
(iv) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 생리적인 형태 또는 기능을 기준으로, 표적 후보물질의 존재 하에서 생리적인 형태 또는 기능에 변화가 발생하는 경우의 표적 후보물질을 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절하는 물질로 선정하는 단계.
그리고, 상기 두 태양의 각 (i) 단계에서는 상기 매개(조절)물질간의 상호작용을 매개하거나 조절하는 물질을 첨가하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 제1방법 및 제2방법은 공통적으로 우선, 서로 상호작용을 하는 것으로 알려져 있는 매개(조절)물질을 이용하여 그들 간의 상호작용에 의해 나노고단위복합체를 형성시킨 후, 형성된 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이되어 있는 탐색물질 또는 매개(조절)물질에 의하여 매개되는 생리적인 기능을 조절하는 방법에 관한 것이다.
다만, 본 발명의 제1방법 및 제2방법 수행에 있어서 가장 큰 차이점은, 매개(조절)물질의 작용에 의한 나노고단위복합체 형성 단계에 있어서, 탐색물질을 처음부터 나노고단위복합체 형성물질에 결합시켜 매개(조절)물질 작용에 의한 나노고단위복합체 형성에 참여시킬 것인지(제1방법), 또는 나노고단위복합체를 형성물질과 매개(조절)물질(제1매개(조절)물질)만으로 먼저 나노고단위복합체를 형성시킨 후, 또 다른 매개(조절)물질(제2매개(조절)물질)을 이용하여 상기 결과물에 추가로 결합시켜 사용할 것인지(제2방법)이다. 이때, 상기 매개(조절)물질(제1매개(조절)물질이나 제2매개(조절)물질 포함)의 작용을 매개하거나 조절하는 물질을 추가로 사용할 수 있다. 이때,“추가 가능한 조절물질”이란, 그 전 단계에서 형성된 나노고단위복합체에 디스플레이되어 있는 조절물질과 결합 가능한 생리활성물질을 의미하는 것으로, 조절물질과 상호작용하는 것이면 그 종류나 개수에 영향을 받지 않는다. 즉, 디스플레이되어 있는 조절물질과 상호작용 가능한 단 1개의 물질을 의미하는 것이 아니므로, 조절물질은 2개 이상의 조합인 경우도 무방하다.
본 발명의 제1방법에 대한 개략도는 도 2에 나타내었다.
본 발명의 제2방법에 대한 개략도는 도 3에 나타내었다.
도 3의 개략도를 중심으로 본 발명의 일 실시예를 살펴보면, 도 3에서, 나노고단위복합체 형성물질인 칼슘/칼모듈린 인산화 단백질(CAM) 또는 페리틴 단백질(도 3의 기호 N에 해당)에 매개(조절)물질로 세포내에서 하나의 단백질(monomer)로 퍼져서 존재하는 FKBP 단백질에 특정 돌연변이(mutation)를 일으킨 FKBP(F36M)2 (도 3의 기호 A, B, D에 해당)를 통해 자기들끼리 서로 결합해서 자발적으로 나노고단위복합체의 형성을 유도한 후, 상기 결과물에 제2매개(조절)물질인 FRB(도 3의 E)과 RelA(도 3의 X에 해당)를 제2매개(조절)물질의 작용을 조절하는 물질 Rapamycin(도 3의 F)에 의해 상기 나노고단위복합체에 집적시킨다. 실시예의 결과로부터도 알 수 있는 바와 같이, Rapamycine의 처리에 의하여, FKBP(36M)2와 FRB가 나노고단위복합체의 표면에 디스플레이된다. 또한, 상기 RelA 탐색물질에 대한 프레이물질로서 TNF-a(기호 Y)를 처리시, 이때, TNF-a와 같은 프레이물질은 파트너 물질인 탐색물질(RelA)과의 결합에 의하여, 특정 반응(NFkB 활성도 변화)을 유도할 수 있다 (실시예 참조).
그리고 본 발명의 제3태양은, 다음의 단계를 포함하는 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 방법(도 4)이다:
(i) 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
(ii) 상기 탐색물질을 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이함으로써, 상기 탐색물질이 매개하는 생리적인 형태 또는 기능을 조절 유도하는 단계.
이때, 제3 방법의 변형예로서, 다음의 단계를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 물질의 스크리닝용 방법을 제공할 수 있다:
(i) 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계;
(ii) 상기 탐색물질을 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이하는 단계;
(iii) 상기 나노단위복합체에 표적 후보물질을 제공하거나, 상기 나노단위복합체를 분리하여 세포, 조직 또는 생체 내에 도입하여 탐색물질간 상호작용에 의하여 또는 첨가된 매개(조절)물질에 의하여 형성된 나노고단위복합체에 표적 후보물질을 제공하는 단계; 및
(iv) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 생리적인 형태 또는 기능을 기준으로, 표적 후보물질의 존재 하에서 생리적인 형태 또는 기능에 변화가 발생하는 경우의 표적 후보물질을 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절하는 물질로 선정하는 단계.
본 발명은 또한, 제3 방법의 또 다른 변형예로서, 다음의 단계를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 물질의 스크리닝용 방법을 제공할 수 있다:
(i) 제1매개(조절)물질, 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계;
(ii) 상기 제1매개(조절)물질과 탐색물질을 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이하는 단계;
(iii) 상기 나노단위복합체에 표적 후보물질을 제공하거나, 상기 나노단위복합체를 분리하여 세포, 조직 또는 생체 내에 도입하여 제1매개(조절)물질간 상호작용에 의하여 또는 첨가된 제2매개(조절)물질에 의하여 형성된 나노고단위복합체에 표적 후보물질을 제공하는 단계; 및
(iv) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 생리적인 형태 또는 기능을 기준으로, 표적 후보물질의 존재 하에서 생리적인 형태 또는 기능에 변화가 발생하는 경우의 표적 후보물질을 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절하는 물질로 선정하는 단계.
상기 제3방법은 별도의 탐색물질이나 매개(조절)물질간의 상호작용없이 상기 나노고단위복합체 형성물질이 다수개의 상호작용 부위간의 상호작용 또는 자기조립에 의하여 나노단위복합체를 형성하고, 이에 의하여 상기 나노고단위복합체 형성물질에 결합되어 있는 탐색물질을 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이함으로써 상기 탐색물질이 매개하는 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 것을 특징으로 한다.
이때, 나노고단위복합체 형성물질에 결합되는 탐색물질은 서로 다른 2 이상의 탐색물질이 동일한 나노고단위복합체에 결합되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 아울러, 상기 2이상의 탐색물질간의 상호작용을 조절하는 물질을 추가로 포함할 수 있다 (도 4B).
이때, 상기 매개(조절)물질(제1매개(조절)물질이나 제2매개(조절)물질 포함)의 작용을 매개하거나 조절하는 물질을 추가로 사용할 수 있다. 이때,“추가 가능한 조절물질”이란, 그 전 단계에서 형성된 나노고단위복합체에 디스플레이되어 있는 조절물질과 결합 가능한 생리활성물질을 의미하는 것으로, 조절물질과 상호작용하는 것이면 그 종류나 개수에 영향을 받지 않는다. 즉, 디스플레이되어 있는 조절물질과 상호작용 가능한 단 1개의 물질을 의미하는 것이 아니므로, 조절물질은 2개 이상의 조합인 경우도 무방하다.
본 발명의 제3방법에 대한 개략도는 도 4에 나타내었다.
도 4의 개략도를 중심으로 본 발명의 일 실시예를 살펴보면, 도 4에서, 나노고단위복합체 형성물질인 페리틴 단백질(도 4의 기호 N에 해당)에 탐색물질 (도 4의 기호 X 에 해당)로서 Rel을 결합시켜 형성된 나노단위복합체에 Rel을 집적시킨 후 집적된 Rel에 의하여 이와 상호작용하는 TNF-a에 의하여 세포 내 특정 반응(NFkB 활성도 변화)을 유도할 수 있는지 확인하였다 (실시예 참조).
그리고 본 발명의 제4태양은, 다음의 단계를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 방법(도 5)에 관한 것이다:
(i) 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
(ii) 상기 탐색물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 탐색물질을 고집적으로 디스플레이함으로써, 상기 탐색물질이 매개하는 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 단계.
이때, 제4 방법의 변형예로서, 다음의 단계를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 물질의 스크리닝용 방법을 제공할 수 있다:
(i) 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계;
(ii) 상기 탐색물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 탐색물질을 고집적으로 디스플레이하는 단계;
(iii) 상기 나노고단위복합체에 표적 후보물질을 제공하는 단계; 및
(iv) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 생리적인 형태 또는 기능을 기준으로, 표적 후보물질의 존재 하에서 생리적인 형태 또는 기능에 변화가 발생하는 경우의 표적 후보물질을 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절하는 물질로 선정하는 단계.
상기 제4방법은 나노고단위복합체에 결합된 탐색물질을 직접 또는 간접적인 탐색물질간 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여, 형성된 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이함으로써, 상기 탐색물질이 매개하는 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 것을 특징으로 한다. 이때, 나노고단위복합체를 형성하도록 서로 상호작용하는 탐색물질은 서로 동일한 물질이거나 상이한 물질일 수 있다. 또한, 나노고단위복합체 형성물질은 서로 동일하거나 (도 5A), 상이할 수 있다 (도 5B).
아울러, 탐색물질간의 상호작용 또는 탐색물질과 나노고단위복합체형성물질간의 상호작용을 매개(조절)하는 물질을 부가적으로 하나 이상 첨가할 수 있으며,이때, 상기 매개(조절)물질은 탐색물질에 결합(fusion)시켜 첨가되는 것을 특징으로 할 수 있다 (도 6 내지 도 8).
상기 제 5방법에서는, 서로 상호작용을 하는 것으로 알려진 베이트-프레이물질, 또는 본 발명자의 선행 특허 (국내특허출원 제10-2008-0079957호)에 의하여 서로 상호작용을 하는 것으로 탐색된 베이트와 프레이를 탐색물질로서 사용할 수 있다. 탐색물질 간의 상호작용에 의하여 형성된 나노고단위복합체에 상기 탐색물질과 결합할 수 있는 조절물질을 디스플레이하는 경우, 상기 탐색물질 또는 조절물질에 의하여 매개되는 생리적인 기능을 억제하거나 활성화시킬 수 있다.
본 발명의 제4방법에 대한 개략도는 도 5에 나타내었다.
도 5의 개략도를 중심으로 본 발명의 일 실시예를 살펴보면, 도 5에서, 나노고단위복합체 형성물질인 칼슘/칼모듈린 인산화 단백질(CAM) 및 페리틴 단백질(도 5의 기호 N에 해당)에 탐색물질 (도 5의 기호 X에 해당)로서 FRB와 FKBP을 결합시켜 매개조절물질(A)로서 라파마이신 유사체에 의해 형성된 나노고단위복합체에 FRB, FKBP, Rel을 집적시킨 후 집적된 Rel에 의하여 이와 상호작용하는 TNF-a에 의하여 세포 내 특정 반응(NFkB 활성도 변화)을 유도할 수 있는지 확인하였다 (실시예 참조).
본 발명에 따른 방법은 상기 디스플레이된 탐색물질과 상호작용 할 수 있는 조절물질을 추가로 제공하여 고집적으로 디스플레이함으로써, 탐색물질 또는 조절물질이 매개하는 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도할 수 있다.
본 발명의 상기 방법들에서, 나노고단위복합체를 형성하는 물질들, 즉 나노고단위복합체 형성 물질, 베이트물질, 프레이물질, 나노고단위복합체 형성 유도 매개(조절)물질, 그리고 표지물질 등 본 발명에서 사용되는 물질들 간의 결합은 물리적, 화학적, 정전기적 및 생물학적인 직접 또는 간접 결합을 포함할 수 있다. 그 중에서도, 생물학적 결합이 이루어지는 경우, 항체(antibody), 단백질(protein), 단백질 도메인(domain), 단백질 모티프(motif), 펩타이드 등을 포함하는 탐침(probe)을 사용할 수 있다.
본 발명의 상기 방법들에 의하여 형성되는 나노고단위복합체 또는 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이되어 있는 탐색물질 또는 매개(조절)물질에 이와 상호작용하는 세포 내 또는 생체 내의 다른 물질이 포착(trapping 또는 sequestering)될 수 있다. 따라서, 나노고단위복합체에 디스플레이되어 있는 베이트물질, 프레이물질 또는 조절물질에 포착(trapping 또는 sequestering)되는 다른 물질이 매개하는 생리적 형태 또는 기능을 조절 또는 유도시키는 것도 가능하다.
또한, 나노고단위복합체 형성 물질에 임의의 탐색물질을 직접 또는 간접적으로 결합시키는 한편, 나노고단위복합체 형성 물질과 프레이를 결합하여 제공할 수 있다. 또한, 나노고단위복합체 형성 물질과 매개(조절)물질을 결합하여 제공하는 한편, 베이트물질과 프레이물질에 각각 매개(조절)물질을 결합하여 제공할 수 있다.
조절물질은 목적하고자 하는 생리적인 기능의 변화(생리적인 기능의 억제, 활성화 등)의 on/off에 관여하는 물질이라 할 수 있다. 상기와 같이, 나노고단위복합체의 형성(assembly) 및 분열(dis-assembly) 또는 나노고단위복합체에 특정 물질을 디스플레이하는 것은, 서로 상호작용하는 생리활성물질들을 이용함으로써 조절 가능하며, 이러한 조절에 의하여 세포 내 또는 생체 내의 생리적인 기능도 조절할 수 있게 된다.
또한, 목적하고자 하는 생리적인 기능의 변화, 예를 들면 특정 물질의 활성의 촉진 여부, 특정 물질의 생산량의 증가나 억제 등의 변화를 확인함으로써, 상기 방법에 의하여 세포의 생리적 기능이 조절되었는지 여부를 판별할 수 있게 된다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 나노고단위복합체 형성물질, 탐색물질 또는 매개(조절)물질은 표지물질이 결합시켜 표지할 수 있으며, 이때, 상기 표지물질은 이로 제한되는 것은 아니나, 자성 물질, 방사성 물질, ELISA용 효소 물질, 형광성 물질 또는 발광성 물질임을 특징으로 할 수 있고, 상기 형광성 물질은 형광 염료, 형광 단백질 또는 형광 나노입자 등임을 특징으로 할 수 있다.
아울러, 본 발명의 방법에 있어서, 상기 탐색물질 또는 매개(조절)물질은 생리활성물질(bioactive molecule)임을 특징으로 할 수 있고, 이때, 상기 생리활성물질은 이로 한정되는 것은 아니나 핵산, 뉴클레오타이드, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 당, 지질, 비타민 및 화합물(chemical compound)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질임을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 방법은 in vitro 또는 in vivo 어느계에서도수행가능하다. 그 중에서 본 발명을 in vivo에서 수행하는 경우, 진핵세포, 원핵세포, 인간을 포함한 포유동물의 생체내, 조직내 및 세포내, 식물의 생체내, 조직내 및 세포내에서 수행할 수 있다. 특히, 본 발명은 제프라 피쉬(Zebra fish), 선충(C. elegans), 효모(Yeast), 초파리(Fly) 또는 개구리(Frog)의 세포내, 조직내 또는 생체내에서도 수행될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 나노고단위복합체 형성 물질, 베이트물질, 프레이물질, 매개물질(나노고단위복합체 형성 유도 물질) 및 표지물질들은 일반적으로 널리 알려진 방법에 의해 용이하게 상기 세포내로 도입할 수 있다. 예를 들어, 직접 도입(direct injection), 세포전달성 펩타이드(transducible peptide 및 fusogenic peptide), 지질 전달체 또는 이들의 결합체를 이용한 도입; 일렉트로포레이션(electroporation)을 이용한 도입; 마그네토펙션(magnetofection)을 이용한 도입; 및 인간을 포함한 포유동물로의 장관외(parenteral) 투여, 경구(oral) 투여, 비강내 (intranasal) 투여, 피하(subcutaneous) 투여, 에어로졸(aerosolized) 투여 및 정맥(intravenous) 투여 중 어느 하나로 구성된 군에서 선택되는 방법 등에 의해 수행될 수 있음은 자명하다.
한편, 본 발명의 방법들에서 상기 나노고단위복합체 형성은 표지물질을 사용하여 확인될 수 있다. 특히 상기 탐색물질, 상기 나노고단위복합체 형성물질 또는 매개(조절)물질에 표지물질을 결합시켜 사용할 수 있다. 필요한 경우, 특정 물질들 사이의 상호작용에 의해 형성된 나노고단위복합체상에서, 본 발명의 표지물질로는 방사성 표지, 형광성 물질 또는 발광성 물질을 사용할 수 있다. 방사성 표지로서는, 예를 들어 32P, 35S, 3H 및 14C 등을 포함하여 일반적으로 사용 가능한 표지를 모두 사용할 수 있다. 그리고, 그 자체로서 형광을 나타내거나 물질들간의 상호작용에 의해 형광성을 나타내는 형광물질(fluorescent material)로서는, 예를 들어, FITC, rhodamine 등 형광 염료들; ECFP, TagCFP, m제TFP1, GFP, YFP, CFP 및 RFP 등의 형광 단백질; 테트라시스테인 형광성 모티프(tetracystein motif); 또는 형광을 내는 나노입자일 수 있다. 발광성 물질로서는, 그 자체로서 발광을 내거나 물질들간의 상호작용에 의해 발광을 나타내는 발광체(luminescent material) 예를 들어, 루시퍼레이즈(luciferase) 등을 사용할 수 있다.
아울러, 본 발명의 방법에서, 상기 나노고단위복합체 형성은 자성, 방사성, ELISA용 효소, 형광성 또는 발광성 물질을 감지하는 방법 및 광학적 방법, 현미경, 이미징시스템, 스캐너(scanner), 리더(reader), 스펙트로포토미터(spectrophotometer), MRI(magnetic resonance imaging), SQUID, MR relaxometer, FACS(fluorescene associated cell sorting), 형광검출기(fluorometer) 및 발광검출기(luminometer) 등 일반적으로 널리 알려진 방법을 이용하여 측정되거나 감지될 수 있으며, 또한 분리될 수 있다.
추가로, 본 발명의 방법에 의하여 형성된 나노고단위복합체 또는 상기 나노단위복합체 안에 조절물질을 고집적으로 적재(loading)해서 나노고단위복합체 또는 나노단위복합체의 분열(dis-assembly)에 따라 노출되는 적재된 물질에 의하여 매개되는 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는것을 특징으로 할 수 있다.
이하에서는 상기 방법들에서 사용되는 구체적인 구성 요소에 대해 설명한다.
"나노고단위복합체 형성물질"은 나노고단위복합체를 형성하는 물질은 여러 개의 동일한 또는 상이한 상호작용부위(binding moeity)를 가진 다가결합성(poly/multi-valent) 물질로서, 서로간의 상호작용 또는 자기조립(self-assembly)에 의해 복합체를 형성할 수 있다. 바람직하게는 자기조립에 의해 복합체를 형성할 수 있는 물질을 사용하는 것이 좋다. 비제한적으로 이들 복합체는 나노크기의 입자로 구성되어 있는 것이 적합하다.
이때, 자기조립에 의한 나노고단위복합체 형성의 바람직한 예로서, 자기조립 또는 자기결합(self-association) 도메인을 포함하는 단백질 등을 들 수 있으며, 이때, 상기 자기조립 또는 자기결합 도메인을 갖는 단백질은 페리틴 또는 유사 단백질(ferritin), DPS 또는 유사 단백질(DNA binding protein from starved cells), HSP(heat shock protein), 마그네토좀(magnetosome) 구성단백질, 바이러스 구성단백질, 칼슘/칼모듈린 인산화 단백질(calcium/calmodulin-dependent kinase II) 및 dsRed 등을 들 수 있다. 화학적으로 합성한 다양한 나노입자도 나노고단위복합체 형성이 가능한데, 예를 들어, 금나노입자(gold nanoparticle), 양자나노입자(Q dot) 또는 자성나노입자(magnetic nanoparticle) 등을 포함한 여러 종류의 나노입자를 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 자기조립(self-assembly)에 의해 나노크기의 단위복합체를 형성할 수 있는 물질 또는 단백질들 중에 페리틴(ferritin) 단백질을 이용하였다.
페리틴 단백질은 24개가 자기조립에 의해 구형 나노입자복합체을 형성하며 외경은 약 12nm이며, 내경은 약 9nm인 구조를 이루며, 2500개 이상의 철 원자를 함유한다(Chasteen, N.D. Struc. Biol. 126:182-194, 1999). 페리틴 단백질의 의해 형성되는 나노입자복합체의 표면상에서 일어나는 "탐색물질" 사이 또는 "매개(조절)물질" 간의 상호작용에 의해 나노고단위복합체가 형성되는 경우, "탐색물질" 또는 "매개(조절)물질"에 결합시킨 형광, 발광, 자성, 방사성 물질 등의 표지물질(label)을 현미경 등의 분석기기를 이용하여 분석함으로써 역동적으로 탐색할 수 있다.
탐색 물질은 서로 간에 상호작용이 일어나는 생리활성물질이면 어느 것이든 사용할 수 있다. 생리활성물질은 생체 내에서 생리적인 활성을 나타내는 모든 물질로서, 인간의 생체 내의 다양한 생체물질과 상호작용하여 이들의 기능 또는 활성을 조절할 수 있는 물질이면 어느 것이든 사용할 수 있으나, 바람직한 예로서 핵산(nucleic acid), 뉴클레오타이드(mono-/oligo-/poly-nucleotide), 단백질(protein), 펩타이드(mono-/oligo-/poly-peptide), 아미노산(amino acid), 당(mono-/oligo-/poly-saccharide), 지질(lipid), 비타민, 화합물(chemical compound)을 들 수 있으나, 나아가 상기 물질들을 구성하는 더 작은 분자들도 포함한다.
베이트물질 및 프레이물질 쌍으로 작용하는 탐색물질의 상호작용에 대한 구체적인 예로서, Rapamycin 화합물의 약제학적으로 관련된 결합파트너인 FRB와 FKBP 단백질의 상호작용, FK506 화합물과 이것의 약제학적으로 관련된 결합파트너인 FKBP 단백질의 상호작용, AP1510 화합물과 결합하는 FKBP 단백질의 상호작용, IkBα 단백질과 이것의 결합파트너인 RelA 단백질의 상호작용, TNFa 생리적인 신호에 따라 조절되는 IkBα 단백질과 이것의 결합파트너인 bTrCP 또는 IKKb 단백질의 상호작용, miRNA와 mRNA의 세포내 상호작용(lin-28 mRNA에 결합하는 let-7b miRNA), Ago2 단백질과 miRNA의 상호작용, MS2 결합 mRNA 부위와 결합하는 MS2 단백질의 상호작용, DHFR 단백질과 MTX 화합물 세포내 상호작용 등을 들 수 있다.
상기 탐색물질간의 결합을 조절하는 “상호작용 매개(조절) 물질”은 상기 상호작용을 촉진하여 양 물질간 결합을 매개(조절)하는 물질이고, 해당 기능을 발휘하는 물질이면 생리활성물질이든 화합물이든 제한이 없다. 그러나, 사용하는 탐색물질쌍에 특이적으로 반응하는 물질이 바람직하다. 이러한 탐색물질 쌍의 상호작용에 의해 나노고단위복합체를 형성하므로, 궁극적으로 상기 “탐색물질 상호작용 매개(조절) 물질”은 본 발명에서 정의하고 있는 “나노고단위복합체 형성을 유도하는 물질”인 "매개(조절)물질"에 속한다고 할 수 있다.
상기 물질간의 상호작용을 매개(조절)함에 있어서, 필요에 따라, 외부 신호에 따라 조절되는 단백질을 사용할 수도 있고, 자신의 표적인 mRNA와 특이적으로 결합하는 miRNA의 특성을 이용할 수도 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 FKBP-FRB 쌍을 사용한 경우 Rapamycin을 매개(조절)물질로 사용하였다.
본 발명의 나노고단위복합체의 형성을 유도하는 '매개(조절)물질'은 상기 나노고단위복합체 형성 물질의 표면에서 서로 직접 또는 간접적으로 상호작용해서 나노고단위복합체를 형성시킬 수 있는 모든 요소를 포함하는 개념이다. 이러한 매개(조절)물질의 활성을 매개 또는 조절하는 물질 또한 넓은 의미의 본 발명의 '매개(조절)물질'이라고 할 수 있다.
이러한 '매개(조절)물질'은 나노고단위복합체를 형성을 유도한다는 해당 기능을 발휘하는 요소라면 제한이 없다. 그러므로 서로 특이적으로 반응하는 물질간의 결합이나 돌연변이 등의 특정 현상에 의해 나노고단위복합체의 형성을 유도할 수 있으면, 해당 물질이든 특정 현상이든 모두 매개(조절)물질로 파악될 수 있다. 즉, 본 발명에서 매개(조절)물질이란, 특정 물질, 특정 현상 또는 특정 상호작용 자체 등을 모두 포함하는 용어이며, 이러한 매개(조절)물질은 2개 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에 의하여 분리된 나노고단위복합체 또는 나노단위복합체는 이에 고집적으로 디스플레이되는 탐색물질 또는 매개(조절)물질에 의하여, 또는 이에 포집되거나, 나노고단위복합체 또는 나노단위복합체에 적재되는 약물 등 물질에 의하여, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능에 관련된 질환의 예방, 치료 또는 의료용 조성물로 사용될 수 있다.
이에 본 발명은 다른 관점에서, 제 1태양으로서, 다음의 단계에 의하여 분리된 나노고단위복합체를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능에 관련된 질환의 백신용, 예방용, 물질전달체용 또는 치료용 조성물을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질, 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 탐색물질을 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노고단위복합체를 분리하는 단계.
아울러, 제2 태양으로서, 다음의 단계에 의하여 분리된 나노고단위복합체를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능에 관련된 질환의 백신용, 예방용, 물질전달체용 또는 치료용 조성물을 제공한다:
(i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
(ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 상기 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 탐색물질을 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노고단위복합체를 분리하는 단계.
아울러, 제3 태양으로서, 다음의 단계에 의하여 분리된 나노단위복합체를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능에 관련된 질환의 백신용, 예방용, 물질전달체용 또는 치료용 조성물을 제공한다:
(i) 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
(ii) 상기 탐색물질을 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노단위복합체를 분리하는 단계.
아울러, 제3 태양의 변형예로서, 다음의 단계에 의하여 분리된 나노단위복합체를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능에 관련된 질환의 예방, 치료용 또는 의료용 조성물을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질, 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
(ii) 상기 매개조절물질과 탐색물질을 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노단위복합체를 분리하는 단계.
아울러, 제3 태양의 또다른 변형예로서, 다음의 단계에 의하여 분리된 나노단위복합체를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능에 관련된 질환의 백신용, 예방용, 물질전달체용 또는 치료용 조성물을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
(ii) 상기 매개조절물질을 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노단위복합체를 분리하는 단계.
본 발명은 또한, 제4태양으로서, 다음의 단계에 의하여 분리된 나노고단위복합체를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능에 관련된 질환의 백신용, 예방용, 물질전달체용 또는 치료용 조성물을 제공한다:
(i) 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
(ii) 상기 탐색물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 탐색물질을 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노고단위복합체를 분리하는 단계.
이때, 상기 디스플레이된 탐색물질과 상호작용 할 수 있는 조절물질을 추가로 제공하여 고집적으로 디스플레이한 후 분리하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 나노고단위복합체 또는 상기 나노단위복합체 안에 조절물질을 고집적으로 적재(loading)할 수 있다.
이에 본 발명은 제1 태양으로서, 다음의 단계를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능에 관련된 질환의 진단, 예방 또는 치료방법을 제공한다:
(i) 매개(조절)물질, 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계;
(ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 탐색물질을 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노고단위복합체를 분리하는 단계; 및
(iii) 상기 분리된 나노고단위복합체를 세포, 조직 또는 생체 내에 도입하여 상기 탐색물질 또는 매개(조절)물질이 매개하는 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도시켜 세포 또는 체내의 생리적 형태 또는 기능에 관련된 질환을 진단, 예방 또는 치료하는 단계.
본 발명은 또한, 제2 태양으로서, 다음의 단계를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능에 관련된 질환의 진단, 예방 또는 치료방법을 제공한다:
(i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계;
(ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 상기 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 탐색물질을 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노고단위복합체를 분리하는 단계; 및
(iii) 상기 분리된 나노고단위복합체를 세포, 조직 또는 생체 내에 도입하여 상기 탐색물질 또는 매개(조절)물질이 매개하는 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도시켜 세포 또는 체내의 생리적 형태 또는 기능에 관련된 질환을 진단, 예방 또는 치료하는 단계.
본 발명은 또한, 제3 태양으로서, 다음의 단계를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능에 관련된 질환의 진단, 예방 또는 치료방법을 제공한다:
(i) 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계;
(ii) 상기 탐색물질을 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노단위복합체를 분리하는 단계; 및
(iii) 상기 분리된 나노단위복합체를 세포, 조직 또는 생체 내에 도입하여 상기 탐색물질이 매개하는 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도시키거나, 도입된 나노단위복합체를 세포, 조직 또는 생체 내에서 탐색물질간 상호작용에 의하여 또는 탐색물질과 상호작용하는 매개(조절)물질에 의하여 나노고단위복합체를 형성시킨 후 나노고단위복합체에 고집적으로 디스플레이된 탐색물질 또는 매개(조절)물질이 매개하는 생리적인 형태 기능을 조절 또는 유도시켜 세포 또는 체내의 생리적 형태 또는 기능에 관련된 질환을 진단, 예방 또는 치료하는 단계.
본 발명은 또한, 제4 태양으로서, 다음의 단계를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능에 관련된 질환의 진단, 예방 또는 치료방법을 제공한다:
(i) 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계;
(ii) 상기 탐색물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 탐색물질을 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노고단위복합체를 분리하는 단계; 및
(iii) 상기 분리된 나노고단위복합체를 세포, 조직 또는 생체 내에 도입하여 상기 탐색물질이 매개하는 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도시켜 세포 또는 체내의 생리적 형태 또는 기능에 관련된 질환을 진단, 예방 또는 치료하는 단계.
이때, 상기 나노고단위복합체에 디스플레이된 탐색물질과 상호작용 할 수 있는 조절물질을 추가로 제공하여, 상기 나노고단위복합체에 조절물질을 고집적으로 디스플레이한 후 분리함으로써, 탐색물질 또는 조절물질이 매개하는 생리적인 형태 또는 조절 유도시켜 상기 탐색물질 또는 조절물질이 매개하는 생리적 형태 또는 기능에 관련된 질환을 진단, 예방 또는 치료할 수 있다.
이때, 상기 질환의 진단, 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물은 상기 분리된 나노고단위복합체 또는 나노단위복합체를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 약학 조성물로 제공될 수 있으며, 상기 복합체는 질환 및 이의 중증정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료 기간 등에 따라 적절한 약학적으로 유효한 양으로 약학 조성물에 포함될 수 있다.
상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리톤, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
상기 약학 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 멸균 주사 용액 등의 형태일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 페리틴 단백질 및 칼슘/칼모듈린 인산화(CAM) 단백질의 자기결합 도메인에 의한 나노고단위복합체 형성 및 물질의 디스플레이 분석
칼슘/칼모듈린 인산화(CAM) 단백질의 자기결합 도메인(도 9 및 도 10)의 N-말단(또는 C-말단)에 다양한 단백질을 결합(fusion)해서 하기 실시예에서 물질의 디스플레이 및 분석에 사용했다. 하기 실시예들에서 증명된 것처럼 칼슘/칼모듈린 인산화(CAM) 단백질의 자기결합 도메인에 의해 나노단위복합체 및 나노고단위복합체이 형성되고 다양한 생리활성물질을 고집적 디스플레이함으로써 생리적인 조절 유도할 수 있음을 확인된다. 아울러, 페리틴 유전자인 FTH1(GenBank Acc. No. BC013724)와 FTL(GenBank Acc. No. BC016346)은 미국의 Open BioSystems사에서 구입하였다.
본 발명에서는 페리틴(FT) 단백질 및 칼슘/칼모듈린 인산화(CAM) 단백질의 자기결합 도메인(도 10)의 N-말단에 다양한 단백질을 결합(fusion)해서 물질의 디스펠레이 및 분석에 사용했다. 칼슘/칼모듈린 인산화(CAM) 단백질이나 페리틴 단백질(FT로 표기)의 아미노기 말단에 다양한 탐색 단백질(예, FKBP와 FRB)과 형광 단백질(예, mRFP, EGFP, ECFP, YFP)을 부착한 여러 가지 융합 단백질을 CMV promoter에 의해 포유동물 세포에서 발현할 수 있는 pcDNA 3.1을 기반으로 한 재조합 유전자를 제조하였다. 본 분석에서는, 탐색물질간의 상호작용을 조절하는 물질로서 rapamycin을 사용하고 형광단백질로는 mCerulean, mCherry와 mCitrine을 사용하였다.
미리 배양된 헬라세포(HeLa cell, ATCC No. CCL-2)에 재조합 유전자 FKBP-mCerulean-FT와 FRB-mCitrine-CAM를 일렉트로포레이션 (electroporation - 1000 V, 35 ms, 2 pulses) 또는 lipofectamine을 사용하여 도입시킨 후, 세포를 16-well chamber slide(Nunc)에 깔고 37℃ 로 고정된 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하며 상기 융합 단백질을 발현시켰다. 이미징을 위해 세포배양액을 10% FBS가 들어있는 DMEM(Gibco)에서 OPTI-MEM(Gibco)으로 바꾸어 준 후, 250nM 농도(Stock 농도는 1mM, DMSO에 녹아있음)의 rapamycin(Calbiochem)을 세포에 처리하고, 세포내의 페리틴 융합 단백질의 분포를 공초점 현미경으로 확인하였다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 조절물질로서 rapamycin을 처리함에 따라, 나노단위복합체에 디스플레이되어 있는 탐색물질인 FKBP와 FRB의 상호작용이 유도되어 도 5의 형식에 따라 고신호강도의 점상이미지패턴인 나노고단위복합체가 형성됨을 확인하였다. 이때, rapamycin을 처리하지 않은 것을 음성대조구로 하였다. 따라서, 칼슘/칼모듈린 인산화(CAM) 단백질의 자기결합 도메인에 의해 나노단위복합체 및 나노고단위복합체이 형성되고 탐색물질로서 생리활성물질을 고집적 디스플레이할 수 있음을 확인했다.
실시예 2: 칼슘/칼모듈린 인산화(CAM) 단백질의 자기결합 도메인에 의해 나노고단위복합체 형성 및 물질의 디스플레이를 분석
실시예 1과 같이 칼슘/칼모듈린 인산화(CAM) 단백질의 자기결합 도메인(도 10)의 N-말단에 다양한 단백질을 결합(fusion)해서 물질의 디스플레이 및 분석에 사용하였다.
매개(조절)물질로는 FKBP(F36M)2를 사용하고 형광단백질로는 mCerulean과 mCitrine을 사용하였고, 실시예 1과 같은 방법으로 헬라세포(HeLa cell, ATCC No. CCL-2)에 FKBP(F36M)2-mCerulean-CAM과 FRB-mCitrine 융합단백질을 함께 발현시켰다. rapamycin을 처리하지 않은 것을 음성대조구로 하였다. 이때, FKBP(F36M)2는 FKBP의 36번째 아미노산인 Phenylalanine을 Methionine으로 바꿔주어 monomeric FKBP를 dimeric 형태로 바꿔준 것으로, 사전실험에서 자기들끼리 서로 결합하여 나노고단위복합체의 형성을 유도할 수 있음을 확인하였다. 즉, FKBP는 돌연변이에 의하여 매개(조절)물질 역할을 함을 확인하였다.
그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, 조절물질로서 rapamycin을 처리함에 따라, 나노단위복합체에 디스플레이되어 있는 FKBP(F36M)2의 자기결합에 따라 고신호강도의 점상이미지패턴인 나노고단위복합체가 형성되고, 이어서 나노고단위복합체에 디스플레이되어 있는 FKBP와 FRB의 상호작용이 유도되어 FRB-mCitirine이 결합(recruitment)되어 나노고단위복합체에 도 3의 형식에 따라 디스플레이됨을 확인하였다(도 12). 동시에 변이된 FKBP는 탐색물질로서 FRB(프레이)와 상호작용하며, 이때, 탐색물질(FKBP(F36M)-FRB) 간의 상호작용이 이를 매개(조절)하는 물질인 Rapamycin에 특이적이며, 탐색물질로서 나노고단위복합체에 디스플레이됨을 확인하였다.
따라서, 칼슘/칼모듈린 인산화(CAM) 단백질의 자기결합 도메인에 의해 나노고단위복합체가 형성되고 생리활성물질을 고집적 디스플레이할 수 있음을 확인했다.
실시예 3: 페리틴(FT) 단백질에 의해 나노고단위복합체 형성 및 물질의 디스플레이 분석
실시예 1과 동일한 방법으로 페리틴(FT) 단백질의 N-말단에 다양한 단백질을 결합(fusion)해서 물질의 디스플레이 및 분석에 사용했다. 매개(조절)물질로는 FKBP(F36M)2를 사용하고 형광단백질로는 mCerulean과 mCitrine을 사용하였다. rapamycin을 처리하지 않은 것을 음성대조구로 하였다.
즉, 실시예 1의 방법에 따라 헬라세포(HeLa cell, ATCC No. CCL-2)에 FKBP(F36M)2-mCherry-FT 및 FRB-EGFP 융합단백질을 함께 발현시켰다.
그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 250nM의 rapamycin을 처리함에 따라, 나노단위복합체에 디스플레이되어 있는 FKBP(F36M)2의 자기결합에 따라 고신호강도의 점상이미지패턴인 나노고단위복합체가 형성되고, 이어서 나노고단위복합체에 디스플레이되어 있는 FKBP와 FRB의 상호작용이 유도되어 FRB-EGFP가 결합(recruitment)되어 나노고단위복합체에 도 3의 형식에 따라 디스플레이됨을 확인하였다.
따라서, 실시예 2의 CAM 뿐만 아니라, 페리틴(FT) 단백질 역시 이에 의해 나노고단위복합체가 형성되고 생리활성물질을 고집적 디스플레이할 수 있음을 확인했다.
실시예 4: 칼슘/칼모듈린 인산화(CAM) 단백질의 자기결합 도메인에 의해 형성된 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이된 물질에 의해 세포내 NFkB 신호전달 및 전사 활성도의 조절 분석
실시예 1과 동일한 방법으로 칼슘/칼모듈린 인산화(CAM) 단백질의 자기결합 도메인(도 10)의 N-말단에 다양한 단백질을 결합(fusion)해서 물질의 디스플레이 및 분석에 사용했다.
즉, 실시예 1과 동일한 방법으로 헬라세포(HeLa cell, ATCC No. CCL-2)에 FKBP(F36M)2-mCerulean-CAM과 FRB-Rel 융합단백질을 함께 발현시켰다. FRB-Rel은 FRB 도메인과 RelA의 Rel 도메인을 결합(fusion) 시킨 융합단백질이다. 상기에 rapamycin analog(Clontech)를 처리하고 이어서 TNF-a를 처리했다. rapamycin analog 처리하는 경우 FRB는 T2098L 돌연변이체를 사용했다. TNF-a가 세포내 NFkB 신호전달 및 전사도를 활성화 시킴을 NFkb에 의한 리포터 유전자 발현정도를 측정해서 분석했다.
그 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, rapamycin analog을 처리함에 따라, FKBP(F36M)2-mCerulean-CAM로부터 형성된 나노고단위복합체에 FRB-Rel이 결합(recruitment)되어 고집적 디스플레이됨(도 12)으로써 TNF-a에 의해 활성화된 세포내 NFkB 신호전달 및 전사도가 조절 유도됨을 확인하였다.
따라서, 칼슘/칼모듈린 인산화(CAM) 단백질의 자기결합 도메인에 의해 형성된 나노고단위복합체에 도 3의 형식에 따라 생리활성물질을 고집적 디스플레이함으로써 세포내 기능을 조절 유도할 수 있음을 확인했다.
실시예 5 : 페리틴(FT) 단백질에 의해 형성된 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이된 물질에 의해 세포내 NFkB 신호전달 및 전사 활성도의 조절 분석
실시예 1과 동일한 방법으로 페리틴(FT) 단백질의 N-말단에 다양한 단백질을 결합(fusion)해서 물질의 디스플레이 및 분석에 사용했다.
즉, 실시예 1의 방법에 따라 헬라세포(HeLa cell, ATCC No. CCL-2)에 FKBP(F36M)2-mCherry-FT과 FRB-Rel 융합단백질을 함께 발현시켰다. 상기에 rapamycin analog를 처리하고 이어서 TNF-a를 처리했다. TNF-a가 세포내 NFkB 신호전달 및 전사도를 활성화 시킴을 NFkb에 의한 리포터 유전자 발현정도를 측정해서 분석했다.
그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이, rapamycin analog을 처리함에 따라, FKBP(F36M)2-mCherry-FT로부터 형성된 나노고단위복합체에 FRB-Rel이 결합(recruitment)되어 디스플레이됨(도 13)으로써 TNF-a에 의해 활성화된 세포내 NFkB 신호전달 및 전사도가 조절 유도됨을 확인하였다.
따라서, 페리틴(FT) 단백질에 의해 형성된 나노고단위복합체에 도 3의 형식에 따라 생리활성물질을 고집적 디스플레이함으로써 세포내 기능을 조절 유도할 수 있음을 확인했다.
실시예 6: 페리틴(FT) 단백질에 의해 형성된 나노단위복합체에 고집적 디스플레이된 물질에 의해 세포내 NFkB 신호전달 및 전사 활성도의 조절을 분석
실시예 1과 동일한 방법으로 페리틴(FT) 단백질의 N-말단에 다양한 단백질을 결합(fusion)해서 물질의 디스플레이 및 분석에 사용했다.
즉, 실시예 1의 방법에 따라 헬라세포(HeLa cell, ATCC No. CCL-2)에 Rel-FT 융합단백질을 발현시켰다. 상기 결과물에 TNF-a를 처리했다. TNF-a가 세포내 NFkB 신호전달 및 전사도를 활성화 시킴을 NFkb에 의한 리포터 유전자 발현정도를 측정해서 분석했다.
그 결과, 도 16에 나타난 바와 같이, 페리틴(FT) 단백질로부터 형성된 나노단위복합체에 Rel이 디스플레이됨으로써 TNF-a에 의해 활성화된 세포내 NFkB 신호전달 및 전사도가 조절 유도됨을 확인하였다. 따라서, 페리틴(FT) 단백질에 의해 형성된 나노단위복합체에 도 4의 형식에 따라 생리활성물질을 고집적 디스플레이함으로써 세포내 기능을 조절 유도할 수 있음을 확인했다.
실시예 7: 페리틴(FT) 단백질에 의해 형성된 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이된 물질에 의해 세포내 NFkB 신호전달 및 전사 활성도의 조절을 분석
실시예 1과 동일한 방법으로 페리틴(FT) 단백질의 N-말단에 다양한 단백질을 결합(fusion)해서 물질의 디스플레이 및 분석에 사용했다.
즉, 실시예 1의 방법에 따라 헬라세포(HeLa cell, ATCC No. CCL-2)에 Rel-FT, FKBP-FT, FRB-FT 융합단백질을 발현시켰다. 상기 결과물에 rapamycin analog를 처리하고 이어서 TNF-a를 처리했다. TNF-a가 세포내 NFkB 신호전달 및 전사도를 활성화 시킴을 NFkb에 의한 리포터 유전자 발현정도를 측정해서 분석했다.
그 결과, 도 17에 나타난 바와 같이, rapamycin analog을 처리함에 따라, FKBP-FT, FRB-FT로부터 형성된 나노고단위복합체에 Rel-FT이 디스플레이됨으로써 TNF-a에 의해 활성화된 세포내 NFkB 신호전달 및 전사도가 조절 유도됨을 확인하였다. 따라서, 페리틴(FT) 단백질에 의해 형성된 나노고단위복합체에 도 2의 형식에 따라 생리활성물질을 고집적 디스플레이함으로써 세포내 기능을 조절 유도할 수 있음을 확인했다.
실시예 8: 칼슘/칼모듈린 인산화(CAM) 단백질의 자기결합 도메인에 의해 형성된 나노단위복합체에 고집적 디스플레이된 물질에 의해 세포내 NFkB 신호전달 및 전사 활성도의 조절을 분석
실시예 1과 동일한 방법으로 칼슘/칼모듈린 인산화(CAM) 단백질의 자기결합 도메인의 N-말단에 다양한 단백질을 결합(fusion)해서 물질의 디스플레이 및 분석에 사용했다.
즉, 실시예 1의 방법에 따라 헬라세포(HeLa cell, ATCC No. CCL-2)에 FRB-Rel-CAM 융합단백질을 발현시켰다. 상기 결과물에 TNF-a를 처리했다. TNF-a가 세포내 NFkB 신호전달 및 전사도를 활성화 시킴을 NFkb에 의한 리포터 유전자 발현정도를 측정해서 분석했다.
그 결과, 도 18에 나타난 바와 같이, 칼슘/칼모듈린 인산화(CAM) 단백질의 자기결합 도메인으로부터 형성된 나노단위복합체에 Rel이 디스플레이됨으로써 TNF-a에 의해 활성화된 세포내 NFkB 신호전달 및 전사도가 조절 유도됨을 확인하였다. 따라서, 칼슘/칼모듈린 인산화(CAM) 단백질의 자기결합 도메인에 의해 형성된 나노단위복합체에 도 4의 형식에 따라 생리활성물질을 고집적 디스플레이함으로써 세포내 기능을 조절 유도할 수 있음을 확인했다.
실시예 9: 칼슘/칼모듈린 인산화(CAM) 단백질의 자기결합 도메인 및 페리틴(FT) 단백질에 의해 형성된 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이된 물질에 의해 세포내 NFkB 신호전달 및 전사 활성도의 조절을 분석
실시예 1과 동일한 방법으로 칼슘/칼모듈린 인산화(CAM) 단백질의 자기결합 도메인의 N-말단에 다양한 단백질을 결합(fusion)해서 물질의 디스플레이 및 분석에 사용했다.
즉, 실시예 1의 방법에 따라 헬라세포(HeLa cell, ATCC No. CCL-2)에 FRB-Rel-CAM, FKBP-FT 융합단백질을 발현시켰다. 상기 결과물에 rapamycin analog를 처리하고 이어서 TNF-a를 처리했다. TNF-a가 세포내 NFkB 신호전달 및 전사도를 활성화 시킴을 NFkb에 의한 리포터 유전자 발현정도를 측정해서 분석했다.
그 결과, 도 19에 나타난 바와 같이, rapamycin analog을 처리함에 따라, FRB-Rel-CAM, FKBP-FT로부터 형성된 나노고단위복합체에 Rel이 디스플레이됨으로써 TNF-a에 의해 활성화된 세포내 NFkB 신호전달 및 전사도가 조절 유도됨을 확인하였다. 따라서, 칼슘/칼모듈린 인산화(CAM) 단백질의 자기결합 도메인 및 페리틴(FT) 단백질에 의해 형성된 나노고단위복합체에 도 5의 형식에 따라 생리활성물질을 고집적 디스플레이함으로써 세포내 기능을 조절 유도할 수 있음을 확인했다.
실시예 10: 칼슘/칼모듈린 인산화(CAM) 단백질의 자기결합 도메인 및 페리틴(FT) 단백질에 의해 형성된 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이된 물질의 분리 정제
칼슘/칼모듈린 인산화(CAM) 단백질의 자기결합 도메인 및 페리틴(FT) 단백질의 N-말단(또는 C-말단)에 다양한 단백질을 결합(fusion)해서 직접적인 방법 또는 FRB 도메인과 결합해서 간접적인 방법 등 여러 가지 다양한 형식을 통해 물질의 고집적 디스플레이에 사용했다 (도 20).
이렇게 디스플레이된 융합단백질을 분리 정제함으로써, 세포 밖에서 또는 생체 안에서 생리활성물질을 고집적 디스플레이하여 처리함으로써 국소농도를 효과적으로 증가해서 세포 및 생체내 생리적인 조절 유도할 수 있음을 확인하였다.
실시예 11: 칼슘/칼모듈린 인산화(CAM) 단백질의 자기결합 도메인 및 페리틴(FT) 단백질에 의해 형성된 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이된 다양한 치료용 및 진단용 물질들
도 21은 칼슘/칼모듈린 인산화(CAM) 단백질의 자기결합 도메인 및 페리틴(FT) 단백질에 다양한 치료용 및 진단용 단백질을 결합(fusion)해서 디스플레이한 일부 예들로서 세포 및 생체내 생리적인 조절 유도할 수 있다. 이러한 치료용 및 진단용 단백질 물질의 일부 예들을 FRB-mCherry에 결합해서 세포내에 발현하고 rapamycin을 처리함에 따라, 도12과 도 13에 나타난 FKBP(F36M)2과 결합된 칼슘/칼모듈린 인산화(CAM) 단백질의 자기결합 도메인 및 페리틴(FT) 단백질에 의해 형성된 나노고단위복합체에 고집적 디스플레이할 수 있다(도 22).
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 동일 계 또는 동일 장의 인 비트로(in vitro) 및 인 비보(in vivo)의, 인위적인 나노고단위복합체에서 하나 또는 그 이상의 생리활성물질들이 고집적으로 디스플레이 됨으로써, 그들이 매개되는 생리적인 기능을 효과적으로 조절시킬 수 있다. 가령 한가지 예로써 약리작용과 관련해서, 나노고단위복합체에 치료 또는 진단과 관련된 생리활성물질의 고집적 디스플레이를 통해서 기존의 연구개발 결과와 결부해서 약리작용 또는 진단과 관련된 표적물질과의 상호작용 확률이 향상하고, pharmacokinetics가 향상하고, biodistribution이 향상하는 등 여러 가지 장점에 따라 약효능(efficacy)가 증가하는 등 생리적인 기능을 효과적으로 조절시킬 수 있는 효과를 볼 수 있다.
나아가 상기 나노고단위복합체의 형성(assembly) 및 분열(dis-assembly), 또는 나노고단위복합체에 특정 물질을 디스플레이 또는 포착하는 것을 인위적으로 조절함으로써 세포 또는 생체 안의 생리적인 기능을 임의적으로 조절 유도할 수 있다는 장점도 있다.
따라서, 본 발명은 특정 생리활성물질에 의하여 매개되는 세포내 또는 생체내에서 일어나는 다양한 생리적인 기능을 인 비트로(in vitro) 특히 인 비보(in vivo)에서 효과적으로 조절 유도할 수 있다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (38)

  1. 다음의 단계를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 방법:
    (i) 매개(조절)물질, 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
    (ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 탐색물질을 고집적으로 디스플레이함으로써, 상기 매개(조절)물질 또는 탐색물질이 매개하는 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 단계.
  2. 다음의 단계를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 방법:
    (i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
    (ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고, 상기 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 탐색물질을 고집적으로 디스플레이함으로써, 상기 매개(조절)물질 또는 탐색물질이 매개하는 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 단계.
  3. 다음의 단계를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 방법:
    (i) 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
    (ii) 상기 탐색물질을 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이함으로써, 상기 탐색물질이 매개하는 생리적인 형태 또는 기능을 조절 유도하는 단계.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, (i)단계에서 상기 매개(조절)물질간의 상호작용을 매개하거나 조절하는 물질을 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 다음의 단계를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 방법:
    (i) 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
    (ii) 상기 탐색물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 탐색물질을 고집적으로 디스플레이함으로써, 상기 탐색물질이 매개하는 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 단계.
  6. 제1항 내지 제3항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디스플레이된 탐색물질과 상호작용 할 수 있는 조절물질을 추가로 제공하여 고집적으로 디스플레이함으로써, 탐색물질 또는 조절물질이 매개하는 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 탐색물질간의 상호작용은 직접 또는 간접적으로 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제5항에 있어서, 탐색물질간의 상호작용 또는 탐색물질과 나노고단위복합체형성물질간의 상호작용을 매개(조절)하는 물질을 부가적으로 하나 이상 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 매개(조절)물질은 탐색물질에 결합(fusion)시켜 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 내지 제3항, 제5항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 탐색물질, 매개(조절)물질 또는 나노고단위복합체 형성물질은 표지물질이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 표지물질은 자성 물질, 방사성 물질, ELISA용 효소 물질, 형광성 물질 또는 발광성 물질임을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 형광성 물질은 형광 염료, 형광 단백질 또는 형광 나노입자임을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항 내지 제3항, 제5항 및 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 탐색물질 또는 매개(조절)물질은 생리활성물질(bioactive molecule)임을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 생리활성물질은 핵산, 뉴클레오타이드, 단백질, 펩타이드, 아미노산, 당, 지질, 비타민 및 화합물(chemical compound)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질임을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항 내지 제3항 및 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 나노고단위복합체를 형성하는 물질은 여러 개의 동일한 또는 상이한 상호작용부위(binding moeity)를 가진 다가결합성(poly/multi-valent) 물질로서, 서로간의 상호작용 또는 자기조립(self-assembly)에 의해 복합체를 형성할 수 있는 물질인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 나노고단위복합체를 형성하는 물질은 자기조립 또는 자기결합(self-association) 도메인을 포함하는 단백질, 금나노입자(gold nanoparticle), 양자나노입자(Q dot) 및 자성나노입자(magnetic nanoparticle)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 자기조립 또는 자기결합 도메인을 갖는 단백질은 페리틴 또는 유사 단백질(ferritin), DPS 또는 유사 단백질(DNA binding protein from starved cells), HSP(heat shock protein), 마그네토좀(magnetosome) 구성단백질, 바이러스 구성단백질, 칼슘/칼모듈린 인산화 단백질(calcium/calmodulin-dependent kinase II) 및 dsRed로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제1항 내지 제3항 및 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 세포, 조직 또는 생체내에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 제프라 피쉬(Zebra fish), 선충(C. elegans), 효모(Yeast), 초파리(Fly), 개구리(Frog), 포유동물 및 식물로 구성된 군에서 선택된 세포, 조직 또는 생체인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제18항에 있어서, 세포, 조직 또는 생체내로의 도입은 직접 도입(direct injection), 세포전달성 펩타이드(transducible peptide 및 fusogenic peptide), 지질 전달체 또는 이들의 결합체를 이용한 도입; 일렉트로포레이션(electroporation)을 이용한 도입; 마그네토펙션(magnetofection)을 이용한 도입; 및 포유동물로의 장관외(parenteral) 투여, 경구(oral) 투여, 비강내 (intranasal) 투여, 피하(subcutaneous) 투여, 에어로졸(aerosolized) 투여 및 정맥(intravenous) 투여 중 어느 하나로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제1항 내지 제3항 및 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 나노고단위복합체 형성은 자성, 방사성, ELISA용 효소, 형광성 또는 발광성 물질을 감지하는 방법 및 광학적 방법, 현미경, 이미징시스템, 스캐너(scanner), 리더(reader), 스펙트로포토미터(spectrophotometer), MRI(magnetic resonance imaging), SQUID, MR relaxometer, FACS(fluorescene associated cell sorting), 형광검출기(fluorometer) 및 발광검출기(luminometer) 로 구성된 군에서 선택된 방법을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제1항 내지 제3항, 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 나노고단위복합체 또는 상기 나노단위복합체 안에 조절물질을 고집적으로 적재(loading)해서 나노고단위복합체 또는 나노단위복합체의 분열(dis-assembly)에 따라 노출되는 적재된 물질에 의하여 매개되는 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는것을 특징으로 하는 방법.
  23. 다음의 단계에 의하여 분리된 나노고단위복합체를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능에 관련된 질환의 백신용, 예방용, 물질전달체용 또는 치료용 조성물:
    (i) 매개(조절)물질, 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
    (ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 탐색물질을 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노고단위복합체를 분리하는 단계.
  24. 다음의 단계에 의하여 분리된 나노고단위복합체를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능에 관련된 질환의 백신용, 예방용, 물질전달체용 또는 치료용 조성물:
    (i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
    (ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 상기 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 탐색물질을 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노고단위복합체를 분리하는 단계.
  25. 다음의 단계에 의하여 분리된 나노단위복합체를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능에 관련된 질환의 백신용, 예방용, 물질전달체용 또는 치료용 조성물:
    (i) 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
    (ii) 상기 탐색물질을 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노단위복합체를 분리하는 단계.
  26. 다음의 단계에 의하여 분리된 나노단위복합체를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능에 관련된 질환의 백신용, 예방용, 물질전달체용 또는 치료용 조성물:
    (i) 매개(조절)물질, 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
    (ii) 상기 매개조절물질과 탐색물질을 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노단위복합체를 분리하는 단계.
  27. 다음의 단계에 의하여 분리된 나노단위복합체를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능에 관련된 질환의 백신용, 예방용, 물질전달체용 또는 치료용 조성물:
    (i) 매개(조절)물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
    (ii) 상기 매개조절물질을 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노단위복합체를 분리하는 단계.
  28. 다음의 단계에 의하여 분리된 나노고단위복합체를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능에 관련된 질환의 백신용, 예방용, 물질전달체용 또는 치료용 조성물:
    (i) 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
    (ii) 상기 탐색물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 탐색물질을 고집적으로 디스플레이한 후, 형성된 나노고단위복합체를 분리하는 단계.
  29. 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디스플레이된 탐색물질과 상호작용 할 수 있는 조절물질을 추가로 제공하여 고집적으로 디스플레이한 후 분리하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  30. 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노고단위복합체 또는 상기 나노단위복합체 안에 조절물질을 고집적으로 적재(loading)하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  31. 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탐색물질, 상기 매개(조절)물질, 또는 상기 나노고단위복합체 형성물질은 표지물질이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  32. 다음의 단계를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 물질의 스크리닝용 방법:
    (i) 매개(조절)물질, 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계; 및
    (ii) 상기 매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 탐색물질을 고집적으로 디스플레이하는 단계;
    (iii) 상기 나노고단위복합체에 표적 후보물질을 제공하는 단계; 및
    (iv) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 생리적인 형태 또는 기능을 기준으로, 표적 후보물질의 존재 하에서 생리적인 형태 또는 기능에 변화가 발생하는 경우의 표적 후보물질을 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절하는 물질로 선정하는 단계.
  33. 다음의 단계를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 물질의 스크리닝용 방법:
    (i) 제1매개(조절)물질, 제2매개(조절)물질, 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계;
    (ii) 상기 제1매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하고 상기 제2매개(조절)물질간의 상호작용에 의하여 상기 탐색물질을 고집적으로 디스플레이하는 단계;
    (iii) 상기 나노고단위복합체에 표적 후보물질을 제공하는 단계; 및
    (iv) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 생리적인 형태 또는 기능을 기준으로, 표적 후보물질의 존재 하에서 생리적인 형태 또는 기능에 변화가 발생하는 경우의 표적 후보물질을 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절하는 물질로 선정하는 단계.
  34. 다음의 단계를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 물질의 스크리닝용 방법:
    (i) 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계;
    (ii) 상기 탐색물질을 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이하는 단계;
    (iii) 상기 나노단위복합체에 표적 후보물질을 제공하거나, 상기 나노단위복합체를 분리하여 세포, 조직 또는 생체 내에 도입하여 탐색물질간 상호작용에 의하여 또는 첨가된 매개(조절)물질에 의하여 형성된 나노고단위복합체에 표적 후보물질을 제공하는 단계; 및
    (iv) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 생리적인 형태 또는 기능을 기준으로, 표적 후보물질의 존재 하에서 생리적인 형태 또는 기능에 변화가 발생하는 경우의 표적 후보물질을 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절하는 물질로 선정하는 단계.
  35. 다음의 단계를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 물질의 스크리닝용 방법:
    (i) 제1매개(조절)물질, 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계;
    (ii) 상기 제1매개(조절)물질과 탐색물질을 나노단위복합체에 고집적으로 디스플레이하는 단계;
    (iii) 상기 나노단위복합체에 표적 후보물질을 제공하거나, 상기 나노단위복합체를 분리하여 세포, 조직 또는 생체 내에 도입하여 제1매개(조절)물질간 상호작용에 의하여 또는 첨가된 제2매개(조절)물질에 의하여 형성된 나노고단위복합체에 표적 후보물질을 제공하는 단계; 및
    (iv) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 생리적인 형태 또는 기능을 기준으로, 표적 후보물질의 존재 하에서 생리적인 형태 또는 기능에 변화가 발생하는 경우의 표적 후보물질을 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절하는 물질로 선정하는 단계.
  36. 다음의 단계를 포함하는, 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절 또는 유도하는 물질의 스크리닝용 방법:
    (i) 탐색물질 및 나노고단위복합체 형성물질을 동일한 장(field) 또는 계(system)에서 제공하는 단계;
    (ii) 상기 탐색물질간의 상호작용에 의하여 나노고단위복합체를 형성하여 상기 탐색물질을 고집적으로 디스플레이하는 단계;
    (iii) 상기 나노고단위복합체에 표적 후보물질을 제공하는 단계; 및
    (iv) 표적 후보물질이 존재하지 않는 경우의 생리적인 형태 또는 기능을 기준으로, 표적 후보물질의 존재 하에서 생리적인 형태 또는 기능에 변화가 발생하는 경우의 표적 후보물질을 세포 또는 체내의 생리적인 형태 또는 기능을 조절하는 물질로 선정하는 단계.
  37. 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 디스플레이된 탐색물질과 상호작용 할 수 있는 조절물질을 추가로 제공하여 고집적으로 디스플레이하는 것을 특징으로 하는 방법.
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