WO2022220581A1 - 가시광선으로 광가교 결합되는 신규 화합물 및 이의 용도 - Google Patents

가시광선으로 광가교 결합되는 신규 화합물 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
WO2022220581A1
WO2022220581A1 PCT/KR2022/005350 KR2022005350W WO2022220581A1 WO 2022220581 A1 WO2022220581 A1 WO 2022220581A1 KR 2022005350 W KR2022005350 W KR 2022005350W WO 2022220581 A1 WO2022220581 A1 WO 2022220581A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
halotag
compound
target
target protein
Prior art date
Application number
PCT/KR2022/005350
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
이현우
Original Assignee
서울대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from KR1020210047647A external-priority patent/KR102578912B1/ko
Application filed by 서울대학교산학협력단 filed Critical 서울대학교산학협력단
Priority to EP22728030.2A priority Critical patent/EP4102227A4/en
Priority to US17/784,298 priority patent/US20240182425A1/en
Publication of WO2022220581A1 publication Critical patent/WO2022220581A1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D221/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one nitrogen atom as the only ring hetero atom, not provided for by groups C07D211/00 - C07D219/00
    • C07D221/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one nitrogen atom as the only ring hetero atom, not provided for by groups C07D211/00 - C07D219/00 condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D221/04—Ortho- or peri-condensed ring systems
    • C07D221/06—Ring systems of three rings
    • C07D221/14—Aza-phenalenes, e.g. 1,8-naphthalimide
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus

Definitions

  • the present invention relates to a novel compound photocrosslinked by visible light and uses thereof, and more particularly, to a novel compound photocrosslinked by visible light and temporary spatial proximity photocrosslinking by visible light activation using the same ( s patiotemporal proximity) ph ot o-crosslinking by visible light activation, spotlight ) method.
  • PPI protein-protein interaction
  • PL proximity labeling
  • APEX ascorbate peroxidase
  • BioID BioID
  • TurboID BioID
  • This method has the advantage of being able to reveal local proteome information in various subcellular compartments inside the living cell context.
  • the labeling radii of APEX, BioID/TurboID and other proximity labeling tools are estimated to range from 10 nm to hundreds of nm based on the duration of reactive species or local protein concentration in living cells.
  • This labeling radius is easy for sub-compartment proteome mapping, but this labeling radius is rather wide for the identification or interaction analysis of the physical interaction partner (interactive agent) of the protein of interest (POI).
  • a photocrosslinking reaction is used to capture the physical interactors, in which reactive nitrene or carbene species are converted to reactive nitrene or carbene species by ultraviolet (UV) light activation.
  • Convertible arylazide, diazo or diazirine moieties are used. These species generally have a short lifetime (T 1/2 ⁇ 2 ns) in aqueous solution, allowing them to undergo NH or CH insertion reactions with physically interacting proteins.
  • Photocrosslinking methods using substances containing non-natural amino acids (UAAs) or diazirine residues, such as photo-methionine or photo-leucine, allow the UAA to be integrated via translation machinery in living cells. It enables the photocrosslinking reaction of the protein.
  • Naphthyl azide-based AzNP (4-azido-N-ethy-1,8-naphthalimide), (1) very stable in aqueous solution, has been widely used in hydrogen sulfide sensors, and (2) strong It was used for fluorescence imaging of alkyne-modified biomolecules in living mammalian cells by emitting green fluorescence. shows However, the visible light-induced photocrosslinking activity of AzNP in living cells has not been confirmed so far.
  • the present inventors improve the diffusive labeling of the prior art as a method for identifying an interactor that physically interacts with a target protein in a cell, and an interactor that physically interacts in a living cell
  • the present invention was completed by confirming that it was possible to increase the accuracy of the protein-protein interaction analysis method by improving the diffusive labeling characteristic, which is a limitation of the conventional proximity labeling technology, by photocrosslinking to
  • An object of the present invention is to provide a novel compound that can be crosslinked by visible light and uses thereof.
  • X is characterized in that it is represented by C, N, O, S, Si, or the following [Formula 2],
  • n is an integer from 0 to 10
  • X is straight-chain or pulverized -(CH 2 )m-, H or halogen, wherein m is an integer of 1 to 20,
  • R is H, halogen or -CH 3 .
  • the compound may be characterized as a compound represented by the following [Formula 3]:
  • n is an integer of 1 to 5.
  • the compound may be characterized in that it has protein-binding ability.
  • the compound bound to the target protein or target nucleic acid may be characterized by photocrosslinking to a protein or peptide that interacts with the target protein or target nucleic acid.
  • the target protein may be characterized in that it is an antibody or peptide.
  • the target nucleic acid may be characterized in that it is DNA or RNA.
  • the compound may be characterized by photocrosslinking to a protein or peptide that interacts with the target protein or target nucleic acid by irradiation with visible light.
  • the radius (radius) of the optical cross-linking may be characterized in that 0.01 to 1 nm.
  • the present invention also provides a method of photocrosslinking a target protein or target nucleic acid with an interacting protein or peptide proximate thereto, comprising the steps of:
  • the target protein or target nucleic acid comprises (i) an internally present amine group or an externally introduced amine group, or (ii) an internally existing thiol group or an externally introduced thiol group with the compound It may be characterized in that it is coupled.
  • the target protein or target nucleic acid may be characterized in that it is bound to the compound through a protein tag.
  • the present invention also provides a method for identifying an interacting protein of a target protein comprising the steps of:
  • the target protein may be characterized in that an epitope peptide tag is bound.
  • step (c) the target protein is precipitated with an epitope peptide-specific antibody to identify the protein photocrosslinked with the compound as an interaction protein of the target protein.
  • the step (d) may be identified by mass spectrometry.
  • novel compound according to the present invention can be photocrosslinked with a protein or peptide physically interacting with the target protein or target nucleic acid by the property of being photocrosslinked to the proximal protein or peptide by irradiation with visible light by binding to the target protein or target nucleic acid.
  • diffusive labeling which is a limitation of the conventional proximity labeling technology, can be overcome by photocrosslinking by visible light irradiation, which is a safe method for a living body, and has the advantage of improving the accuracy of protein interaction identification. have.
  • FIG. 1 shows the synthesis process of two AzNP-conjugated HaloTag ligands (VL1 and VL2) and four control ligands (UL1-UL4) according to the present invention.
  • 2A is a schematic diagram showing proximity labeling, proximity labeling according to the present invention, and a conventional photocrosslinking reaction.
  • Figure 2b is a table comparing the characteristics of proximity labeling, proximity labeling according to the present invention, and conventional photocrosslinking reaction.
  • Figure 2c shows the photo-activation reaction mechanism of the AzNP moiety.
  • 2D shows the probe synthesis reaction of the HaloTag-conjugated version of the AzNP moiety.
  • Figure 2e shows the X-ray structures of co-crystallized HaloTag and VL1.
  • 2f is a schematic diagram showing VL1-mediated FKBP-FRB photo-crosslinking following rapamycin treatment under blue LED light illumination.
  • Figure 2g shows the Western blot results showing whether KBP-FRB photo-crosslinking mediated by VL1, VL2, UL2 according to rapamycin treatment under blue LED light illumination.
  • the photocrosslinked products of FKBP25-V5-HaloTag and EGFP-FRB are indicated by red stars, and non-photocrosslinked FKBP25-V5-HaloTag and EGFP-FRB are indicated by blue stars.
  • 3a is a schematic diagram showing proximity photocrosslinking using a phenylazide-conjugated HaloTag ligand.
  • Figure 3b shows the reaction mechanism of UV-activated photocrosslinkers (ie, phenylazide, diazirine).
  • Figure 3c shows the chemical structures (UL1, UL2, UL3, UL4) of UV-activated para-azidophenyl and diazirine conjugated probes.
  • Figure 3d shows the co-crystal structure of HaloTag and UL2.
  • Figure 3e shows a schematic diagram of UL probe mediated FKBP-FRB light crosslinking in the presence of rapamycin and UV light.
  • 3f shows the photocrosslinking test results of EGFP-FRB and FKBP25-V5-HaloTag using various UV-activated photocrosslinking probes.
  • EGFP-FRB and FKBP25-V5-HaloTag cross-linked products are marked with a red asterisk, and uncross-linked FKBP25-V5-HaloTag and EGFP-FRB are marked with a blue asterisk.
  • Figure 3g shows the Western blot results of UL2-mediated photocrosslinking of FKBP25-V5-HaloTag and EGFP-FRB using rapamycin (100 nM) and UV light illumination (10 min) in living cells.
  • EGFP-FRB and FKBP25-V5-HaloTag cross-linked products are marked with a red asterisk, and uncross-linked FKBP25-V5-HaloTag and EGFP-FRB are marked with a blue asterisk.
  • Figure 3h shows the Western blot results of cross-linked FKBP25-V5-HaloTag and EGFP-FRB following immunoprecipitation of FKBP25-V5-HaloTag via C-terminal tagged biotinylated receptor peptide (AP).
  • AP was biotinylated by the addition of biotin ligase (BirA), biotin and ATP, and the biotinylated protein was enriched by streptavidin magnetic beads.
  • 3I is a Coomassie staining result of purified FKBP12-HaloTag cross-linking using purified FRB-EGFP, which shows in lane 6 that FKBP12-HaloTag is cross-linked with FRB-EGFP by UL2 probe after rapamycin pretreatment.
  • 4A is a schematic diagram showing the sequential response of VL1-mediated photocrosslinking and biotin labeling of FKBP12-V5-HaloTag-TurboID in living cells.
  • Figure 4b is a result of observation of the expression of FKBP12-V5-HaloTag-TurboID and EGFP-FRB in HEK293T cells treated with rapamycin (100 nM) or a vehicle for 1 hour in a confocal image.
  • Cells were fixed and permeabilized after incubation with biotin (50 ⁇ M) for 30 min.
  • FKBP25-V5-HaloTag-TruboID was visualized with anti-V5 antibody and anti-mouse Alexa Fluor 568.
  • Figure 4c shows the Western blot results of VL-1 mediated FKBP12-V5-HaloTag and EGFP-FRB light-crosslinking under blue LED light. Photocrosslinked products are marked with red asterisks and uncrosslinked monomers are marked with blue asterisks.
  • FIG. 4D shows anti-Flag enriched binding of FKBP12-HaloTag-V5-TruboID-Flag in the samples from lanes 3 and 4 of FIG. 4c .
  • VL-1 mediated cross-linking products red asterisks
  • anti-V5 and anti-GFP blots are shown as biotinylated proteins in SA-HRP Western blots. Uncrosslinked monomers are indicated by blue asterisks.
  • 5B is a Western blot analysis result using an anti-V5 antibody against VL-1 mediated photo-crosslinking products of various Halotag-V5-POIs. Photocrosslinked products are indicated by red asterisks and uncrosslinked POI-HaloTag proteins are indicated by blue asterisks.
  • 6A is a schematic diagram showing the process of monitoring stress granule formation of G3BP1-HaloTag with VL1 fluorescence under various stress conditions (eg, heat, chemical treatment or viral infection).
  • stress conditions eg, heat, chemical treatment or viral infection.
  • Figure 6b shows the results of confocal images of G3BP1-EBFP-V5-Halotag treated with 500 ⁇ M arsenite or VL1-treated according to heat shock (43° C.) for 1 hour.
  • EGFP of G3BP1-EBFP-V5-Halotag. Fluorescence was observed with BFP channel, VL1 fluorescence was observed with GFP channel, and anti-V5 immunofluorescence was visualized with secondary antibody conjugated to Alexa Fluor 647. Scale bar 10 ⁇ m.
  • Figure 6c shows the Western blot results of the VL1-mediated cross-linking product of G3BP1-EGFP-HaloTag under various stress conditions of Figure 6b.
  • a non-stained sample that was not incubated with VL1 was used as a negative control.
  • 6D is a line scan analysis result of the band intensity of the cross-linked product of FIG. 6B.
  • N-HaloTag SARS-CoV-2 N-V5-HaloTag
  • N-HaloTag 7B is a Western blot result of the VL-mediated cross-linking product of N-HaloTag (indicated by red asterisks). Non-crosslinked N-HaloTags are marked with blue asterisks.
  • Figure 7c schematically shows the VL1-crosslinking proteins of N-HaloTag and HaloTag.
  • the table shows the mass spectrometry protein results tested in triplicate.
  • the intensity of color represents the mass intensity of peptides per VL-crosslinked protein identified with N-HaloTag or HaloTag.
  • Figure 7d shows the normalized mass intensities of the 14 proteins of group I of Figure 7c. RBP is shown in yellow and non-RBP is shown in blue.
  • FIG. 7E shows the Volcano plots of Groups II to IV of FIG. 7C showing statistically significant enrichment of VL1 crosslinked proteins of N-Halotag (8 proteins, Group II) relative to VL1 crosslinked proteins of HaloTag alone.
  • Figure 7h is the anti-V5 and anti-GFP Western blot results of the VL1-cross-linked product of HaloTag-V5-G3BP1 and N-GFP.
  • the photocrosslinked product is indicated by a red asterisk, and the uncrosslinked N-HaloTag protein is indicated by a blue asterisk.
  • Figure 7i is the anti-V5 and anti-GFP Western blot results of the VL1-cross-linked product of N-HaloTag and G3BP1-GFP.
  • the photocrosslinked product is indicated by a red asterisk
  • the uncrosslinked N-HaloTag protein is indicated by a blue asterisk.
  • FIG. 8A shows the complete binding assay of VL1 using biotin-HTL in N-HaloTag-expressing HEK293T cells. After incubation with VL1 (10 ⁇ M) for 60 minutes, biotin-HTL (10 ⁇ M) was treated for 60 minutes. Biotin-HTL can label empty N-HaloTag protein with or without VL1 pretreatment, and streptavidin-HRP can detect this population in Western blot analysis.
  • 8B is a bar graph showing the band intensity of biotin-HTL labeled signals.
  • 8c is a comparison result of photocrosslinking efficiency of VL and UL probes for SARS-CoV-2 N-HaloTag under blue LED illumination.
  • Anti-V5 antibody was used for detection of N-HaloTag.
  • FIG. 8D is a bar graph showing the band intensity of the photocrosslinked product of FIG. 8C.
  • FIG. 8f is a bar graph showing the band intensity of the photocrosslinked product of FIG. 8e.
  • 8G shows the VL1-mediated photocrosslinking product of N-HaloTag over time during blue LED illumination illumination (0-10 min).
  • 8H is a bar graph showing the band intensity of the photocrosslinked product of FIG. 8G.
  • FIG. 9A shows a flow chart of a sample preparation process for mass spectrometry of a cross-linked sample according to the present invention.
  • 9B is a schematic diagram showing processing conditions of each sample used for mass spectrometry of a crosslinked sample according to the present invention.
  • 10A is a result of confirming protein-protein interaction by VL-crosslinking analysis.
  • Figure 10b is a result of comparing the crosslinking effect according to the linker length of HaloTag-G3BP1.
  • a novel compound capable of specifically binding to an amine group or a thiol group and having the property of being photocrosslinked with a proximal protein by blue light was synthesized.
  • the present invention relates to a compound represented by the following [Formula 1] in one aspect:
  • X is characterized in that it is represented by C, N, O, S, Si, or the following [Formula 2],
  • n is an integer from 0 to 10
  • X is straight-chain or pulverized -(CH 2 )m-, H or halogen, wherein m is an integer of 1 to 20,
  • R is H, halogen or -CH 3 .
  • the chemical may be represented by the following Chemical Formula 1'.
  • n is an integer from 0 to 10
  • X is straight-chain or pulverized -(CH 2 )m-, H or halogen, wherein m is an integer of 1 to 20,
  • R may be H, halogen or -CH 3 .
  • n may be a natural number of 2 to 5, and more preferably, n may be 2 or 3.
  • X may be a linear or pulverized -(CH 2 )m, and m may be an integer of 1 to 10. More preferably, X may be a linear -(CH 2 )m-, and m may be an integer of 5 to 10.
  • R may be halogen, more preferably chlorine (Cl).
  • the compound may be characterized as a compound represented by the following [Formula 3], but is not limited thereto:
  • n is an integer of 1 to 5.
  • n may be 1 or 2.
  • n 1, it may mean ligand VL1, and when n is 2, it may mean ligand VL2.
  • the compound is a target substance (eg, a target nucleic acid or a target protein) and a target molecule (eg, an interacting drug, an interacting protein, an interacting peptide) that interacts in a close position. It may be characterized in that it is bound to a material.
  • a target substance eg, a target nucleic acid or a target protein
  • a target molecule eg, an interacting drug, an interacting protein, an interacting peptide
  • the target nucleic acid may be DNA or RNA, but is not limited thereto, and the target protein may be an antibody or peptide, but is not limited thereto.
  • the compound may be characterized in that it is directly bound to a target material, but is not limited thereto.
  • the compound may be an AzNP having an NHS ester group capable of reacting with an amine group of the target material by introducing an amine group present in the target protein or an amine group from the outside when synthesizing the target nucleic acid.
  • the compound may be AzNP having a maleimide group capable of reacting with the target substance by introducing a thiol group from the outside when synthesizing a cysteine group or a target nucleic acid present in the target protein.
  • the compound may be characterized in that it binds through a protein tag, but is not limited thereto. That is, in some embodiments, the compound may be characterized in that it specifically binds to a protein tag, and the protein tag may be Halotag, SNAP-tag or CLIP-tag, but is not limited thereto. does not
  • the protein tag when the ligand is VL1 or V2, the protein tag may preferably be Halotag.
  • the ligand VL1 has a shorter length than VL2 and can bind to the protein tag faster than VL2.
  • the compound may be characterized in that it is photocrosslinked to a nearby molecule that interacts with the target substance.
  • the compound bound to the target protein or target nucleic acid may be characterized by photocrosslinking to the protein or peptide interacting with the target protein or target nucleic acid.
  • the target protein may be characterized as an antibody or peptide, but is not limited thereto.
  • the target nucleic acid may be characterized as DNA or RNA, but is not limited thereto.
  • the compound may be characterized by photocrosslinking to a protein or peptide that interacts with the target protein or target nucleic acid by irradiation with visible light.
  • photocrosslinking when the target substance is treated with living cells or protein mixture and treated with visible light, photocrosslinking can be induced with a protein or interacting peptide with the target substance in the cell or protein mixture.
  • the compound may be characterized by photocrosslinking to a protein that interacts with a target protein fused to the protein tag.
  • the visible light may be used without limitation as long as it is a range of electromagnetic waves visible to the human eye, but preferably light of 400 to 700 nm, and more preferably blue light of 450 to 500 nm. can be
  • the radius (radius) of the optical crosslinking may be characterized in that 0.01 to 1 nm, but is not limited thereto.
  • the length of the PEG linker of [Formula 3] determines the direction of active species on the surface of a protein tag (eg, HaloTag), thereby affecting crosslinking efficiency for a specific interaction partner. Therefore, this feature of the present invention, which has a position-dependent cross-linking efficiency due to the inherently short labeling radius, may be a limiting factor in covering all the complete physical interactions of the target protein, but from another point of view, this structural feature of the present invention Due to this, the present invention has the advantage of being able to identify only a protein that interacts with the target protein by crosslinking it.
  • a protein tag eg, HaloTag
  • the present invention relates to a method of photocrosslinking a target protein or target nucleic acid with an interacting protein or peptide in proximity, comprising the steps of:
  • the target protein or target nucleic acid comprises (i) an internally present amine group or an externally introduced amine group, or (ii) an internally existing thiol group or an externally introduced thiol group with the compound It may be characterized in that it is coupled, but is not limited thereto.
  • the target protein or target nucleic acid may be characterized in that it is bound through a protein tag, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to a method for identifying an interacting protein of a protein of interest comprising the steps of:
  • the target protein may be characterized in that an epitope peptide tag is bound.
  • the target protein can be immunoprecipitated.
  • the target protein may be selected from the group consisting of a Flag tag, Myc tag, HA tag, Avi tag, and V5 tag, but is not limited thereto.
  • the target protein may be separated by immunoprecipitation using magnetic or agarose beads loaded with an antibody capable of binding to an epitope peptide tag, but is not limited thereto.
  • the target protein binds streptavidin, avidin, or biotin, and is separated by sedimentation with magnetic or agarose beads loaded with the analog of streptavidin or an analog of avidin reversibly binding to biotin.
  • a direct interaction partner of a target protein can be selectively and accurately identified in a living cell as compared to a conventional proximity labeling method, thereby confirming a molecular network of the target protein in a living cell.
  • TurboID has been utilized for interaction mapping in various experiments, but due to the rather diffuse labeling properties of biotin-AMP, recent proximity labeling methods (e.g., BioID, TurboID, and APEX) have been used to convert data into biotinylated proteins of cytoplasmic TurboID ( It additionally required a "filtration approach” compared to eg TurboID-NES). However, these filtered data still cannot selectively reflect only direct binding partners, but rather only provide an ambiguous "contour" of the proximal protein compared to the cytoplasmic background, and the protein selected from this data is the target protein. There was a limitation that it could not be deciphered whether it was a true interaction partner of
  • the photocrosslinking (Spotlight) reaction according to the present invention can be orthogonal to the amide coupling-based biotinylation reaction of TurboID.
  • TurboID was applied together, and as a result, it was confirmed that the physical interaction protein of the target protein can be biotinylated together with photocrosslinking by the compound of the present invention.
  • the present invention relates to a method for identifying a protein interacting with a target protein comprising the steps of:
  • the target protein in step (a) may be further fused with biotin ligase.
  • the protein tag may be fused to a target protein by a linker.
  • the linker may be an amide linker, but is not limited thereto.
  • HaloTag-G3BP1 As a result of an experiment using HaloTag-G3BP1 to see if the generation efficiency of the cross-linking product is affected by the linker in the present invention, the HaloTag position at the N-terminus of G3BP1 approaches the surface of the SARS-CoV-2 N protein. It was confirmed that the peptide linker length between HaloTag and G3BP1 was not substantially affected by the length of the peptide linker between HaloTag and G3BP1.
  • linkers known in the art as commonly used for linking proteins/proteins, proteins/peptides or peptides/peptides may be used without limitation to bind HaloTag to a target protein in the present invention.
  • the compound may be characterized in that it specifically binds to a protein tag, and the protein tag may be Halotag, SNAP-tag or CLIP-tag, but is not limited thereto. does not In the present invention, the protein tag may be preferably Halotag.
  • the biotin ligase may be characterized as BirA, BioID or TurboID, but is not limited thereto.
  • the biotin ligase may preferably be TurboID.
  • the step (d) may be characterized in that it further comprises the step of isolating the target protein and the photocrosslinked protein from the lysed cells, and the step of separating the photocrosslinked protein is the objective
  • An epitope peptide tag eg, Flag tag, Myc tag, HA tag, Avi tag, V5 tag, etc.
  • the separation using a magnetic or agarose beads but is not limited thereto.
  • the step of isolating the photocross-linked protein is streptavidin, avidin or biotinylated to a target protein, and reversible to an analog of streptavidin or biotin reversibly binding to the streptavidin, avidin, or biotin. Separation may be characterized by using a magnetic or agarose bead loaded with an avidin analog that binds to, but is not limited thereto.
  • the step (d) may be characterized in that it further comprises the step of digesting the isolated protein with a hydrolase, but is not limited thereto.
  • the hydrolase is trypsin (Trypsin), arginine C (Arg-C), aspartic acid N (Asp-N), glutamic acid C (Glu-C), lysine C (Lys-C), chymotrypsin (Chymotrypsin), may be characterized as selected from the group consisting of proteinase K (Proteinase k) and pronase (Pronase), but is not limited thereto.
  • the step (d) may be characterized in that the interacting protein is identified by mass spectrometry, but is not limited thereto.
  • the mass spectrometer for mass spectrometry may be characterized in that it is selected from the group consisting of LTQ-FT, Orbitrap, Triple-Tof, Q-Tof, Tof-Tof and Q Exactive, but is not limited thereto. does not
  • the protein biotinylated by the control fusion protein in which biotin liages and a protein tag are fused in the cell is excluded from the interaction protein of the target protein. It may be characterized, but is not limited thereto.
  • control conditions (+/- VL1, +/- BirA) are used to confirm that each step of the experiment (eg, photocrosslinking and streptavidin enrichment) works as expected.
  • Mass spectrometry was performed on 8 samples of SARS-CoV-2 N-HaloTag-AP and HaloTag-AP with It may be sufficient to compare the streptavidin-enriched sample of +VL1/+BirA) with the VL1 cross-linked free HaloTag (HaloTag-AP/+VL1/+BirA). It will be able to provide background protein information for other experiments to identify the interacting protein of the target protein.
  • the position of the target protein in living cells is identified based on the property that the compound can permeate into various intracellular organelles and the property of showing green fluorescence, and the interaction of the target protein with the interaction protein candidate group It was confirmed that the action can be verified based on imaging.
  • the present invention relates to a method for localization of a target protein in a cell comprising the steps of:
  • the intracellular movement of the target protein can be easily observed under stress by inducing stress (change in acidity, change in temperature, etc.).
  • the present invention relates to a method for verifying interaction with a target protein and its interactor, comprising the following steps:
  • the intracellular location of the target protein can be identified by green fluorescence
  • the interactor can be identified by a fluorescence different from the green fluorescence, and by observing the co-localization of the two fluorescence, the objective It will be possible to determine whether there is an interaction between the protein and its interactor.
  • fluorescence for identifying the interactor may be identified by labeling the interactor-specific antibody with fluorescence or engineering the interactor to be expressed together with fluorescence in cells.
  • step (a) in the above method it is possible to easily determine how the target protein and its interactor interact in the before and after stress by inducing stress (change in acidity, change in temperature, etc.).
  • Lamin-AC inner nuclear membrane
  • p80-coilin Inner nuclear membrane
  • HNRNPD SAM68 body
  • MRPL12 mitochondrial matrix
  • Tom20 outer mitochondrial membrane
  • SEC61B ER membrane
  • G3BP1 G3BP1 Proteins distributed in various organelles, including (stress granules) or viral proteins.
  • the protein may be a nucleocapsid (N) protein.
  • the virus may be a mammalian infection virus, preferably SARS-CoV-2 virus.
  • the mammal may be a mouse, hamster, dog, cat, pig, goat or primate, including humans.
  • the compound of the present invention is activated by visible light irradiation and has an effective photocrosslinking ability.
  • blue LED household lamps were used in all photocrosslinking experiments using live cells as well as in test tube experiments using VL1. It is particularly noteworthy that the effect was confirmed using ( ⁇ 36 W). That is, the compound of the present invention is capable of effective light crosslinking under low-intensity visible light illumination, suggesting that the present invention can be utilized not only for in vitro experiments using living cells but also for in vivo experiments using live animals.
  • the photocrosslinking product of HaloTag protein was generated within 1 min under blue LED illumination, which was confirmed at a much faster rate than the untargeted in vitro reactive photocrosslinking with bovine serum albumin. It is interpreted to be due to the molecular dense environment.
  • AzNP-conjugated HaloTag ligands (VL1 and VL2) were synthesized with two linker sizes.
  • UL1-UL4 photocrosslinkable HaloTag ligands containing ultraviolet light absorbing para-azidophenyl and diazirine moieties were also prepared (UL1-UL4).
  • the reaction schematic is as shown in FIG. 1 .
  • aryl-azide-PEG2 HaloTag ligand (UL1), 4-azidobezoic acid (compound 8, 83 mg, 0.50 mmol) was mixed with HATU (214 mg, 0.56 mmol), DIPEA (131.3 mg, 1.02 mmol) in 10 ml round It was placed in a bottom flask and dissolved in 2 ml of DCM.
  • aryl-azide-PEG3 HaloTag ligand (UL2)
  • 4-azidobezoic acid (compound 8, 45 mg, 0.28 mmol) was mixed with HATU (105 mg, 0.28 mmol) and DIPEA (64 mg, 0.58 mmol) in 10 ml round bottom It was placed in a flask and dissolved in 2 ml of DCM.
  • Genes were cloned into designated vectors using restriction enzymes and T4 DNA ligase.
  • a tag eg V5 epitope or AviTag
  • the tag sequence was included in the primers used to PCR amplify the gene.
  • the PCR product was digested with a restriction enzyme and ligated to a vector digested with a restriction enzyme (eg, pcDNA3, pCDNA5, pDisplay, pET21a and pH6HTN).
  • a restriction enzyme eg, pcDNA3, pCDNA5, pDisplay, pET21a and pH6HTN.
  • the CMV promoter was used for expression in mammalian cells.
  • [Table 1] shows the plasmids used in the present invention
  • FKBP25-HaloTag 64 kDa
  • EGFP-FRB 48 kDa
  • ATC HEK293T cells
  • HEK293T cells were cultured in DMEM (hyclone, SH30243) supplemented with 10% FBS, 2mM L-glutamine, 50 units/ml penicillin and 50 ⁇ g/ml streptomycin at 37° C., 5% CO 2 conditions.
  • DMEM hyclone, SH30243
  • FBS fetal bovine serum
  • 2mM L-glutamine 50 units/ml
  • penicillin 50 ⁇ g/ml streptomycin
  • streptomycin 50 ⁇ g/ml streptomycin
  • the cells were washed 3 times with DPBS and irradiated with Blue LED light for 10 minutes. After removing the DPBS, the cells were lysed with RIPA lysis buffer (Elpis biotech, EBA-1149) at 4°C for 30 minutes according to the manufacturer's instructions. . The samples were then placed on a 6% SDS-PAGE gel and run at 150V for 60 minutes. The protein on the gel was transferred to a nitrocellulose membrane at 400 mA for 90 min. Protein loading levels were confirmed by Ponce staining. After blocking with TBST containing 2% skim milk for 1 h, primary antibody (mouse anti-V5 antibody, Invitrogen, Cat. No.
  • VL1 successfully produced the photocrosslinking products of FKBP25-HaloTag and EGFP-FRB, which appeared at about 110-120 kDa only under the blue LED lighting condition in which rapamycin was added.
  • VL1 containing a PEG1 linker showed stronger crosslinking efficiency with EGFP-FRB compared to VL2 containing a PEG2 linker (Fig. 2g).
  • HEK293T cells were cultured in 5% CO 2 , 37° C. using DMEM supplemented with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 50 unit/ml penicillin and 50 ⁇ g/ml streptomycin.
  • DMEM fetal bovine serum
  • FBS fetal bovine serum
  • 2 mM L-glutamine fetal bovine serum
  • penicillin 50 ⁇ g/ml streptomycin
  • streptomycin 50 ⁇ g/ml streptomycin.
  • 1000 ng plasmid DNA was mixed with 2 ⁇ g of polyethyleneimine (PEI, Polysciences, 23966) using 100 uL no-FBS, DMEM, and well was added, and 2-3 hours after addition, the medium was replaced with the whole medium again.
  • PEI polyethyleneimine
  • the cells were washed three times with DPBS (thermofisher, 21300), and the cells were fixed with a 4% paraformaldehyde solution (chembio, CBPF-9004) in DPBS for 15 minutes at room temperature. Cells were washed twice with DPBS and permeabilized with cold methanol at -20°C for 5 min. Cells were washed again twice with DPBS and blocked with 2% BSA in DPBS (Millipore, 82-100-6) (blocking buffer) at room temperature for 30 min. To detect HaloTag fusion protein expression, cells were incubated with mouse anti-V5 antibody (Invitrogen, Cat. No. R960-25, dilution 1:5000) for 1 hour at room temperature.
  • mouse anti-V5 antibody Invitrogen, Cat. No. R960-25, dilution 1:5000
  • ligands eg phenyl azide, diazirine
  • HaloTag-G3BP1 HEK293T cells expressing HaloTag-EBFP-V5-G3BP1 (hereinafter, HaloTag-G3BP1) were prepared to confirm that VL1 has stability to capture the temporal spatial change of the interactor under stress conditions (Fig. 6a). .
  • HaloTag -G3BP1 formed stress granules (eg BFP and anti-V5 antibodies) by G3BP1 as known in previous studies, and HaloTag target VL1 fluorescence also overlapped well with BFP and anti-V5 signals (Fig. 6b).
  • VL1 can be used for real-time visualization of a protein of interest (POI) under various stimuli.
  • VL1-mediated photocrosslinking product was changed by stress conditions (eg, sodium arsenite, heat shock)
  • stress conditions eg, sodium arsenite, heat shock
  • SARS CoV-2 N is one of the key protein components of viral particles with RNA-binding domains that play an important role in replication and repackaging of the viral genome in host cells. It is essential to understanding the mechanism of viral replication.
  • Previous research methods for the host interactor of SARS-CoV-2 N were mainly by affinity purification mass spectrometry (AP-MS) and conventional proximity labeling methods.
  • AP-MS data may indicate artificial interaction partners due to dissolution conditions, and the existing proximity labeling method identifies non-physiological interaction partners due to the aforementioned diffusion labeling properties.
  • SARS-CoV-2 N-V5-HaloTag-AP construct (hereinafter, SARS-CoV-2 N-HaloTag) was cloned and a cell line stably expressing it in HEK293T-rex cells was prepared.
  • VL1 successfully targeted the SARS-CoV-2 N-HaloTag protein and cross-linked adjacent proteins (Figs. 7a, 7b). Moreover, almost all cells expressing SARS CoV-2 N-HaloTag were labeled with VL1, so post-treated biotin-HTL was negligibly conjugated with SARS-CoV-2 N-HaloTag after VL1 treatment (Figs. 8a, 8b). ). In addition, VL1 showed particularly strong crosslinking efficiency for SARS-CoV-2 N-HaloTag compared to other photocrosslinking ligands (VL2 and UL probe) under blue LED illumination ( FIGS. 8c - 8f ), and SARS CoV-2 N- The photocrosslinking reaction to HaloTag was efficiently completed within 1 min after treatment with blue LED illumination ( FIGS. 8g and 8h ).
  • HEK293T cells were grown to 60-70% in 100 ⁇ plates. 8,000 ng of plasmid DNA was transfected using PEI transfection reagent, and the medium was replaced with the whole medium after 3 hours. 24 h post transfection, incubated with 10 ⁇ M VL1 for 1 h and washed 3 times with cold DPBS before crosslinking in blue LEDs for 10 min.
  • Cells were collected in DPBS, the pellet was lysed with RIPA buffer, and the lysate was in vitro biotinylated using recombinant wild-type BirA solution (10 ⁇ M BirA, 10 ⁇ M biotin, 200 ⁇ M ATP and 500 ⁇ M MgCl 2 ) at room temperature for 12 hours. To remove free biotin, the lysate was loaded onto an amicon filter and centrifuged at 12,000 x g for 4 x 15 min. 1 x TBS buffer was added to up to 400 ⁇ L of concentrated lysate followed by 100 ⁇ L of washed streptavidin beads.
  • Peptides were analyzed with a Thermo-Scientific®Q Exactive Plus equipped with a nanoelectrospray ion source.
  • the peptide mixture was separated using a C18 reverse-phase HPLC column (500 mm ⁇ 75 ⁇ m i.d.) using a 2.4-17.6% acetonitrile/0.1% formic acid gradient at a flow rate of 300 nL/min for 120 min.
  • precursor ion scan MS spectra (m/z 350 - 2000) were acquired using an Orbitrap spectrometer at a resolution of 70 K at 200 m/z with an internal lock mass.
  • Peptide identification was allowed if it could be established with a probability of more than 95.0% by the Scaffold Local FDR algorithm.
  • a protein identification was allowed if it could be established with a probability greater than or equal to 99.0% and included at least two identified peptides. Protein probabilities were assigned by the Protein Prophet algorithm. 5 Proteins that cannot be differentiated by MS/MS analysis alone because they contain similar peptides were classified to satisfy the principle of parsimony.
  • Tandem mass spectra from database searches were extracted by Proteome Discoverer (version 2.2, Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA). All MS/MS samples were analyzed using Sequest (XCorr only). Sequest was set up to search the Homo sapiens protein sequence database (42230 entries, UniProt (http://www.uniprot.org/)), assuming digestion with trypsin. Sequest was searched for with a fragment ion mass tolerance of 0.80 Da and a parent ion tolerance of 10.0 PPM. The carbamidomethyl of cysteine was designated as a fixed modification in Sequest. Oxidation of methionine and acetyl at the n-terminus was designated as variable modification in Sequest. For volcano plot analysis, five multiple substitutions of missing values were used via panda-view software6.
  • the C-terminus of the SARS-CoV-2 N-HaloTag structure was genetically conjugated with a receptor peptide (AP, also known as Avitag), and purified After in vitro biotinylation reaction using biotin ligase (BirA), it was allowed to be concentrated in streptavidin (SA) beads.
  • AP receptor peptide
  • SA streptavidin
  • the biotinylated N-HaloTag after streptavidin-bead enrichment did not remain in the flow-through fraction at all or was negligible.
  • This strong binding affinity made it possible to use 10% sodium dodecyl sulfate (SDS) buffer as a culture and wash buffer in the concentration step, which was useful for efficiently removing non-covalent binders of bait proteins. Indeed, only four proteins (including bait proteins) were significantly enriched in the SARS-CoV-2 N-HaloTag-AP sample that was not VL1 cross-linked and biotinylated compared to the non-biotinylated sample.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • VL1-crosslinked and biotinylated SARS-CoV-2 N-HaloTag-AP sample i.e., +VL1, +BirA
  • VL1, +BirA the VL1-crosslinked and biotinylated SARS-CoV-2 N-HaloTag-AP sample
  • RBPs Eleven of these proteins (USP10, G3BP1, ANKRD17, STAU2, AHNAK, G3BP2, PRKRA, FNDC3A, STAU1, EIF2AK2 and DHX30) are characterized as RBPs. This proportion of RBP in the N-interacter (50%, 11/22) was significantly higher compared to the human proteome (-5%, 1072/20,380). Notably, 7 out of 22 proteins (32%) of the N interactor are also found in stress granules where viral RNA can reside (e.g., G3BP1, G3BP2, STAU1, STAU240, USP10, PRKRA, EIF2AK2 and CEP85).
  • G3BP1 a well-known RBP and stress granule marker protein.
  • a HaloTag-G3BP1 construct was constructed in which the entire HaloTag was spliced at the N-terminus of G3BP1. The construct was expressed in the cytoplasm in the basal state, and VL1 anchoring did not change this pattern (Fig. 7g), but when SARS-CoV-2 N-GFP was co-expressed, HaloTag-G3BP1 formed granules and It is co-localized with SARS-CoV- 2 N, which means that G3BP1 and SARS-CoV-2 N are in close proximity (Fig. 7h).
  • G3BP1 could be observed in the enriched fraction after western blotting, but GFP signal was not observed in the pass-through fraction. Although not observed, it was found that G3BP1 physically interacts with SARS-CoV-2 N from these results. This is also consistent with recent publications showing that G3BP1 is a physical interaction partner based on various validation methods of S ARS-CoV-2 N (Gordon, DE et al., Nature 2020, 583, 459-468; Nabeel-Shah, S. et al., bioRxiv 2020, 2020.2010.2023.342113).
  • novel compound according to the present invention can be photocrosslinked with a protein or peptide physically interacting with the target protein or target nucleic acid by the property of being photocrosslinked to the proximal protein or peptide by irradiation with visible light by binding to the target protein or target nucleic acid.
  • diffusive labeling which is a limitation of the conventional proximity labeling technology, can be overcome by photocrosslinking by visible light irradiation, which is a safe method for a living body, and has the advantage of improving the accuracy of protein interaction identification. have.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 가시광선으로 광가교 결합되는 신규 화합물 및 이를 이용한 가시광선 활성화에 의한 일시적 공간 근접 광 가교 (<u style="single">spatiotemporal <u style="single">proximity ph<u style="single">oto-crosslinking by visible <u style="single">light activation, spotlight) 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 신규 화합물은 가시광선 조사에 의해 근위 단백질 또는 펩타이드에 광가교 되는 특성에 의해, 목적 핵산 또는 목적 단백질을 상기 신규 화합물과 결합시키고 가시광선을 조사하면 상기 목적 단백질 또는 목적 핵산과 물리적으로 상호작용하는 단백질 또는 펩타이드와 광가교 될 수 있는바, 종래 근접 라벨링 기술의 한계인 확산적인 라벨링(diffusive labeling)을 생체에 안전한 방식인 가시광선 조사에 의한 광가교로 극복할 수 있고, 단백질 상호작용체 식별의 정확도를 향상시킬 수 있는 장점이 있다.

Description

가시광선으로 광가교 결합되는 신규 화합물 및 이의 용도
본 발명은 가시광선으로 광가교 결합되는 신규 화합물 및 이의 용도에 관한 것으로, 더 상세하게는 가시광선으로 광가교 결합되는 신규 화합물 및 이를 이용한 가시광선 활성화에 의한 일시적 공간 근접 광 가교 (spatiotemporal proximity photo-crosslinking by visible light activation, spotlight) 방법에 관한 것이다.
살아있는 세포에서 대부분의 단백질은 다른 단백질과의 물리적 상호 작용에 의하여 거대 분자 복합체를 형성하고 생물학적 기능을 수행한다. 그러나 살아있는 세포에서 단백질-단백질 상호 작용(Protein-Protein Interaction: PPI) 네트워크를 안정적으로 탐구할 수 있는 방법은 극히 한정적이다. 최근에는 APEX(ascorbate peroxidase)나 BioID 또는 TurboID와 같은 다양한 바이오틴 라이게이즈(biotin ligase)와 같이 유전적으로 암호화 가능한 효소를 사용하여 in situ 생성된 반응성 종(reactive species)을 기반으로 하는 근접 라벨링(PL, proximity labeling) 기술이 개발되었는데, APEX 또는 BioID/TurboID에 의해 생성된 반응성 종은 살아있는 세포의 효소 근처에 있는 근위 단백질에 공유 결합되어 세포 용해 후 질량 분석법을 사용하여 분석된다. 이 방법은 살아있는 세포 컨텍스트 내부의 다양한 세포 내 구획에서 국소 프로테옴 정보를 밝혀낼 수 있다는 장점이 있다.
APEX, BioID/TurboID 및 그 밖의 근접 라벨링 도구(예: T-Rex, PhotoPPI)의 라벨링 반경은 살아있는 세포에서 반응성 종의 지속시간 또는 국소 단백질 농도를 기준으로 10 nm에서 수 백 nm 범위로 추정된다. 이 라벨링 반경은 하위 구획 프로테옴 매핑에 용이하나, 이 라벨링 반경은 목적 단백질 (POI)의 물리적 상호 작용 파트너 (상호작용체)의 식별 또는 상호 작용 분석에서는 다소 넓다.
한편, 상호작용체 매핑의 경우, 물리적 상호작용체를 캡처하기 위하여, 광가교 반응이 사용되는데, 이 반응에서는 자외선 (UV) 광 활성화에 의해 반응성 니트렌 (nitrene) 또는 카르벤 (carbene) 종으로 전환될 수 있는 아릴아자이드(arylazide), 디아조(diazo) 또는 디아지린(diazirine) 모이어티를 사용한다. 이러한 종은 일반적으로 수용액에서 짧은 수명 (T1/2 < 2 ns)을 가지므로 물리적으로 상호 작용하는 단백질과 N-H 또는 C-H 삽입 반응을 수행할 수 있다. 광-메티오닌 (photo-methionine) 또는 광-류신 (photo-leucine)과 같은 비천연 아미노산(UAA) 또는 디아지린 잔기를 함유하는 물질을 사용하는 광가교 방법은 UAA가 살아있는 세포에서 번역 기계를 통해 통합되는 단백질의 광가교 반응을 가능하게 한다.
그러나, 이 방법은 (i) UAA의 프로테옴-전체 통합으로 인한 독성 및 (ii) 생체 시스템에 해로운 결과를 초래하는 광 조사와 같은 중요한 2 가지 문제점을 야기시킨다. 근접 라벨링과 광가교 기술의 문제점을 극복하기 위하여 가시광선에 의한 광가교를 시도해 볼 수 있으나, 현재 알려진 대부분의 사용 가능한 가시광 활성 부분 (예: benzoyl azide, vinyl azide)은 생리학적 시스템에서 불안정하기 때문에 (Brachet, E. et al., Chem. Sci. 2015, 6, 987-992; Borra, S. et al., Org. Biol. Chem. 2019, 17, 5971-5981), 이를 세포 내 근접 라벨링에 접목시키는 데에는 한계가 있다.
나프틸 아자이드 기반 AzNP (4-azido-N-ethy-1,8-naphthalimide)는, (1) 수용액에서 매우 안정적이고 황화 수소 센서 (hydrogen sulfide sensor)에서 널리 사용된 바 있으며, (2) 강한 녹색 형광을 방출하여 살아있는 포유류 세포에서 알킨으로 변형된 생체 분자의 형광 영상화에 사용되었고, (3) 자외선 조사 시 AzNP는 단백질에 공유 결합할 수 있는 아릴 니트렌 종으로 전환될 수 있는 좋은 광가교 능력을 보여준다. 그러나, 살아있는 세포에서 AzNP의 가시광 유도 광가교 활성은 현재까지 확인된 바 없다.
본 발명자들은 세포 내에서 목적 단백질과 물리적으로 상호작용하는 상호작용체를 동정하기 위한 방안으로, 종래 기술의 확산적인 표지 특성(diffusive labeling)을 개선하고 살아있는 세포 내에서 물리적으로 상호작용하는 상호작용체를 정확하게 식별해 내기 위한 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 가시광선에 의해 근위 단백질에 광가교 될 수 있는 화합물을 신규하게 합성하였고, 상기 화합물을 이용하는 경우, 가시광선 조사로 살아있는 세포에 독성 없이 근위 단백질에 광가교 됨으로써 종래 근접 라벨링 기술의 한계점인 확산적인 표지 특성을 개선하여 단백질-단백질 상호작용 분석 방법의 정확도를 높일 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다
본 발명의 목적은 가시광선에 의해 가교될 수 있는 신규 화합물 및 이의 용도를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2022005350-appb-img-000001
상기 [화학식 1]에서,
X는 C, N, O, S, Si, 또는 하기 [화학식 2]로 표시되는 것을 특징으로 하며,
[화학식 2]
Figure PCTKR2022005350-appb-img-000002
상기 [화학식 2]에서,
n은 0 내지 10의 정수이고,
X는 직쇄 또는 분쇄형의 -(CH2)m-, H 또는 할로겐이며, 상기 m은 1 내지 20의 정수이고,
R은 H, 할로겐 또는 -CH3이다.
본 발명에 있어서,
상기 화합물은 하기 [화학식 3]으로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 할 수 있다:
[화학식 3]
Figure PCTKR2022005350-appb-img-000003
상기 [화학식 3]에서, n은 1 내지 5의 정수이다.
본 발명에 있어서, 상기 화합물은 단백질 결합능이 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 목적 단백질 또는 목적 핵산과 결합된 상기 화합물은 상기 목적 단백질 또는 목적 핵산과 상호작용하는 단백질 또는 펩타이드에 광가교 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 목적 단백질은 항체 또는 펩타이드인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 목적 핵산은 DNA 또는 RNA 인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 화합물은 가시광선 조사에 의해 상기 목적 단백질 또는 목적 핵산과 상호작용하는 단백질 또는 펩타이드에 광가교 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 광가교 결합의 반경(radius)는 0.01 내지 1 nm인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는, 목적 단백질 또는 목적 핵산을 이에 근접하는 상호작용 단백질 또는 펩타이드와 광가교하는 방법을 제공한다:
(a) 목적 단백질 또는 목적 핵산과 결합되어 있는 상기 화합물을 상기 목적 단백질 또는 상기 목적 핵산과 상호작용하는 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 시료에 처리하는 단계; 및
(b) 가시광선을 처리하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 목적 단백질 또는 목적 핵산은 (i) 내재적으로 존재하는 아민기 또는 외부에서 도입된 아민기, 또는 (ii) 내재적으로 존재하는 티올기 또는 외부에서 도입된 티올기를 통하여 상기 화합물과 결합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 목적 단백질 또는 목적 핵산은 단백질 태그를 통하여 상기 화합물과 결합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 목적 단백질의 상호작용 단백질을 식별하는 방법을 제공한다:
(a) 세포 내에서 목적 단백질을 발현시키는 단계;
(b) 상기 세포에 상기 화합물을 처리하는 단계;
(c) 상기 세포에 가시광선을 조사하는 단계; 및
(d) 상기 세포를 용해시켜 상기 화합물과 광가교 결합된 단백질을 목적 단백질의 상호작용 단백질로 식별하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 목적 단백질은 에피토프 펩타이드 태그(tag)가 결합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계에서 상기 목적 단백질은 에피토프 펩타이드 특이적 항체로 침강시켜 상기 화합물과 광가교 결합된 단백질을 목적 단백질의 상호작용 단백질로 식별하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계는 질량분석법에 의해 식별되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 따른 신규 화합물은 목적 단백질 또는 목적 핵산과 결합시킴으로써 가시광선 조사에 의해 근위 단백질 또는 펩타이드에 광가교 되는 특성에 의해, 목적 단백질 또는 목적 핵산과 물리적 상호작용하는 단백질 또는 펩타이드와 광가교 될 수 있는바, 종래 근접 라벨링 기술의 한계인 확산적인 라벨링(diffusive labeling)을 생체에 안전한 방식인 가시광선 조사에 의한 광가교로 극복할 수 있고, 단백질 상호작용체 식별의 정확도를 향상시킬 수 있는 장점이 있다.
도 1은 본 발명에 따른 2 개의 AzNP 접합 HaloTag 리간드(VL1 및 VL2) 및 4 개의 대조군 리간드 (UL1-UL4)의 합성 과정을 보여준다.
도 2a는 근접 라벨링, 본 발명에 따른 근접 라벨링, 종래의 광가교 반응을 보여주는 모식되이다.
도 2b는 근접 라벨링, 본 발명에 따른 근접 라벨링, 종래의 광가교 반응의 특징을 비교한 표이다.
도 2c는 AzNP 모이어티의 광-활성 반응 메커니즘을 보여준다.
도 2d는 AzNP 모이어티의 HaloTag-접합 버전의 프로브 합성 반응을 보여준다.
도 2e는 공동-크리스탈화된 HaloTag과 VL1의 X-ray 구조를 보여준다.
도 2f는 청색 LED 광 조명 하에서 라파마이신 처리에 따른 VL1 매개 FKBP-FRB 광-가교를 보여주는 모식도이다.
도 2g는 청색 LED 광 조명 하에서 라파마이신 처리에 따른 VL1, VL2, UL2에 의해 매개된 KBP-FRB 광-가교 여부를 보여주는 웨스턴 블랏 결과를 보여준다. FKBP25-V5-HaloTag과 EGFP-FRB의 광가교 생성물을 적색 별표로 표시되었고, 광가교되지 않은 FKBP25-V5-HaloTag과 EGFP-FRB는 청색 별로 표시되었다.
도 3a는 페닐아자이드 접합 HaloTag 리간드를 사용한 근접 광가교를 보여주는 모식도이다.
도 3b는 UV 활성 광가교제(즉, 페닐아자이드, 디아지린)의 반응 메커니즘을 보여준다.
도 3c는 UV 활성 파라-아자이도페닐 및 디아지린 접합 프로브의 화학 구조(UL1, UL2, UL3, UL4)를 보여준다.
도 3d는 HaloTag과 UL2의 공동-크리스탈 구조를 보여준다.
도 3e는 라파마이신 및 UV 광의 존재하에서 UL 프로브 매개 FKBP-FRB 광 가교의 모식도를 보여준다.
도 3f는 다양한 UV 활성화 광가교 프로브를 사용한 EGFP-FRB 및 FKBP25-V5-HaloTag의 광가교 테스트 결과를 보여준다. EGFP-FRB 및 FKBP25-V5-HaloTag 가교 생성물은 적색 별표로 표시되었고, 가교되지 않은 FKBP25-V5-HaloTag 및 EGFP-FRB는 청색 별표로 표시되었다.
도 3g 살아있는 세포에서 라파마이신(100nM) 및 UV 광 조명(10분)을 사용한 FKBP25-V5-HaloTag 및 EGFP-FRB의 UL2 매개 광 가교의 웨스턴 블롯 결과를 보여준다. EGFP-FRB 및 FKBP25-V5-HaloTag 가교 생성물은 적색 별표로 표시되었고, 가교되지 않은 FKBP25-V5-HaloTag 및 EGFP-FRB는 청색 별표로 표시되었다.
도 3h는 C-말단 태그가 있는 바이오틴화 수용체 펩타이드(AP)를 통한 FKBP25-V5-HaloTag의 면역 침전에 따른 가교된 FKBP25-V5-HaloTag 및 EGFP-FRB의 웨스턴 블롯 결과를 보여준다. 세포 용해물에서 AP는 바이오틴 리가제(BirA), 바이오틴 및 ATP의 첨가에 의해 바이오틴화되었고, 바이오틴화된 단백질은 스트렙타비딘 자기 비드에 의해 농축되었다. 용출된 분획에서 가교된 EGFP-FRB 및 FKBP25-V5-HaloTag 제품(적색 별표)과 비가교 EGFP-FRB(청색 별표)가 모두 라파마이신 처리된 샘플에서 관찰되었다. EGFP-FRB의 검출을 위해 항-EGFP 항체를 사용하였다.
도 3i는 라파마이신 전처리로 FKBP12-HaloTag가 UL2 프로브에 의해 FRB-EGFP와 가교됨을 레인 6에서 보여주는 정제된 FRB-EGFP를 사용한 정제된 FKBP12-HaloTag 가교의 쿠마시 염색 결과이다.
도 4a는 살아있는 세포에서 FKBP12-V5-HaloTag-TurboID의 VL1-매개 광가교 및 바이오틴 표지의 순차적 반응을 보여주는 모식도이다.
도 4b는 HEK293T 세포에서 라파마인신(100nM) 또는 운반체를 1시간 처리하고 FKBP12-V5-HaloTag-TurboID 및 EGFP-FRB 발현을 공초점 이미지로 관찰한 결과이다. 세포는 바이오틴 (50 μM)로 30분 동안 인큐베이션 한 후 고정 및 투과화하였다. FKBP25-V5-HaloTag-TruboID를 항-V5 항체 및 항-마우스 Alexa Fluor 568로 시각화하였다. 바이오틴화된 단백질은 고정 및 투과화 후 SA-647 항체로 시각화하였다. 녹색 채널은 EGFP 신호를 보여준다. Scale bar = 10 μm.
도 4c는 청색 LED 광 하에서 VL-1 매개 FKBP12-V5-HaloTag과 EGFP-FRB 광-가교의 웨스턴 브랏 결과를 보여준다. 광가교된 생성물은 적색 별표로, 가교되지 않은 모노머는 청색 별표로 표시되었다.
도 4d는 도 4c의 레인 3과 레인 4의 샘플에서 FKBP12-HaloTag-V5-TruboID-Flag의 항-Flag 농축된 결괄르 보여준다. 항-V5 및 항-GFP 블랏에서 VL-1 매개 가교된 생성물(적색 별표)는 SA-HRP 웨스턴 블랏에서 바이오틴화된 단백질로 보여진다. 비가교된 모노머는 청색 별표로 나타내었다.
도 5a는 다양한 세포 내 국소화된 HaloTag-접합된 POI와 VL의 형광 이미지를 보여준다. Scale bar = 10 μm. VL1 형광은 공초점 현미경의 GFP 채널에서 관찰되었다 (여기 파장 = 488 nm).
도 5b는 다양한 Halotag-V5-POI의 VL-1 매개 광-가교 생성물에 대한 항-V5 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석 결과이다. 광가교된 생성물은 적색 별표로, 비가교된 POI-HaloTag 단백질들은 청색 별표로 나타내었다.
도 6a는 다양한 스트레스 조건 (예: 열, 화학물질 처리 또는 바이러스 감염) 하에 VL1 형광과 함께 G3BP1-HaloTag의 스트레스 과립 형성을 모니터링하는 과정을 보여주는 모식도이다.
도 6b는 500 μM 아비산염(arsenite) 처리 또는 1시간 동안 열 충격 (43℃에 따라 VL1-처리된 G3BP1-EBFP-V5-Halotag의 공초점 이미지 결과를 나타낸다. G3BP1-EBFP-V5-Halotag의 EGFP 형광을 BFP 채널로 관찰하였다. VL1 형광은 GFP 채널에서 관찰하였고, 항-V5 면역 형광은 Alexa Fluor 647에 접합된 2차 항체로 시각화하였다. Scale bar = 10 μm.
도 6c는 도 6b의 다양한 스트레스 조건에서 G3BP1-EGFP-HaloTag의 VL1-매개 가교 생성물의 웨스턴 블롯 결과를 보여준다. VL1으로 인큐베이션 되지 안흔 샘플을 음성 대조군으로 사용하였다.
도 6d는 도 6b의 가교 생성물의 밴드 강도의 라인 스캔 분석한 결과이다.
도 7a는 N-HaloTag(SARS-CoV-2N-V5-HaloTag)의 공초점 이미징 결과이다.
도 7b는 N-HaloTag의 VL-매개 가교 생성물의 웨스턴 블롯 결과이다(적색 별표로 표시됨). 비-가교된 N-HaloTag은 청색 별표로 표시되었다.
도 7c는 N-HaloTag과 HaloTag의 VL1-가교 단백질을 개략적으로 보여준다. 표는 3중으로 실험된 질량 분석된 단백질 결과를 보여준다. 색의 강도는 N-HaloTag 또는 HaloTag과 식별된 VL-가교된 단백질 당 펩타이드의 질량 강도를 나타낸다.
도 7d는 도 7c의 그룹 I의 14개 단백질의 정상화된 질량 강도를 나타낸다. RBP는 황색, 비-RBP는 청색으로 나타내었다.
도 7e는 HaloTag 단독의 VL1 가교된 단백질에 대한 N-Halotag의 VL1 가교된 단백질 (8개 단백질, 그룹 II)의 통계적으로 유의한 농축을 보여주는 도 7c의 그룹 II 내지 그룹 IV의 볼케이노 플랏을 보여준다.
도 7f는 293T 세포에서 HAloTag-G3BP1과 VL1의 공초점 현미경 이미지를 나타낸다. Scale bar = 10 μm.
도 7g는 293T 세포에서 HaloTag-V5-G3BP1과 공동 발현된 N-GFP의 공초점 현미경 이미지를 나타낸다. HaloTag-V5-G3BP1는 항-V5 항체 (AF568-접합된 2차 항체, 적색 형광 채널), VL1 및 N-GFP는 GFP 채널로 관찰하였다. 화살표는 스트레스 과립 형성을 나타낸다. Scale bar = 10 μm.
도 7h는 HaloTag-V5-G3BP1과 N-GFP의 VL1-가교된 생성물의 항-V5 및 항-GFP 웨스턴 블롯 결과이다. 광가교된 생성물을 적색 별표로 비가교된 N-HaloTag 단백질을 청색 별표로 표시하였다.
도 7i는 N-HaloTag과 G3BP1-GFP의 VL1-가교된 생성물의 항-V5 및 항-GFP 웨스턴 블롯 결과이다. 광가교된 생성물을 적색 별표로 비가교된 N-HaloTag 단백질을 청색 별표로 표시하였다.
도 8a는 N-HaloTag-발현 HEK293T 세포에서 바이오틴-HTL을 이용한 VL1의 완성 결합 분석을 나타낸다. VL1(10μM)으로 60분 동안 인큐베이션한 후 바이오틴-HTL(10μM)을 60분 동안 처리하였다. 바이오틴-HTL은 VL1의 사전 처리 여부에 관계없이 빈 N-HaloTag 단백질을 라벨링 할 수 있으며 streptavidin-HRP는 웨스턴 블롯 분석에서 이 집단을 감지할 수 있다.
도 8b는 바이오틴-HTL 표지된 신호의 밴드 강도를 나타내는 막대 그래프이다.
도 8c는 청색 LED 조명 하에서 SARS-CoV-2N-HaloTag에 대한 VL 및 UL 프로브의 광가교 효율을 비교한 결과이다. N-HaloTag의 검출을 위해 항-V5 항체를 사용하였다.
도 8d는 도 8c의 광가교 생성물의 밴드 강도를 나타내는 막대 그래프이다.
도 8e는 자외선 조명 하에서 SARS-CoV-2N-HaloTag에 대한 VL 및 UL 프로브의 광가교 효율을 비교한 결과이다. N-HaloTag의 검출을 위해 항-V5 항체를 사용하였다.
도 8f는 도 8e의 광가교 생성물의 밴드 강도를 나타내는 막대 그래프이다.
도 8g는 청색 LED 조명 조명 (0-10분) 동안 시간 경과에 따른 N-HaloTag의 VL1 매개 광가교 생성물을 보여준다.
도 8h는 도 8g의 광가교 생성물의 밴드 강도를 나타내는 막대 그래프이다.
도 9a는 본 발명에 따른 가교 샘플의 질량 분석을 위한 샘플 준비 과정의 흐름도를 보여준다.
도 9b는 본 발명에 따른 가교 샘플의 질량 분석에 사용된 각 샘플의 처리 조건을 보여주는 모식도이다.
도 10a는 VL-가교 분석에 의해 단백질-단백질 상호작용을 확인한 결과이다.
도 10b는 HaloTag-G3BP1의 링커 길이에 따른 가교 효과를 비교한 결과이다.
이하, 본 명세서를 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세히 설명한다. 그러나, 본 명세서에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 명세서의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되지는 않는다. 본 명세서의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 명세서를 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
본 발명에서는 아민기 또는 티올기에 특이적으로 결합할 수 있고, 청색광에 의해 근위 단백질과 광가교 되는 특성을 가지는 신규한 화합물을 합성하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서 하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물에 관한 것이다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2022005350-appb-img-000004
상기 [화학식 1]에서,
X는 C, N, O, S, Si, 또는 하기 [화학식 2]로 표시되는 것을 특징으로 하며,
[화학식 2]
Figure PCTKR2022005350-appb-img-000005
상기 [화학식 2]에서,
n은 0 내지 10의 정수이고,
X는 직쇄 또는 분쇄형의 -(CH2)m-, H 또는 할로겐이며, 상기 m은 1 내지 20의 정수이고,
R은 H, 할로겐 또는 -CH3이다.
본 발명에 있어서, 상기 화학물은 하기 화학식 1'로 표시될 수 있다.
[화학식 1']
Figure PCTKR2022005350-appb-img-000006
상기 [화학식 1']에서,
n은 0 내지 10의 정수이고,
X는 직쇄 또는 분쇄형의 -(CH2)m-, H 또는 할로겐이며, 상기 m은 1 내지 20의 정수이고,
R은 H, 할로겐 또는 -CH3 일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 [화학식 1']에서, 바람직하게는 상기 n은 2 내지 5의 자연수일 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 n은 2 또는 3 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 X는 직쇄 또는 분쇄형의 -(CH2)m일 수 있으며, 상기 m 은 1 내지 10의 정수일 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 X는 직쇄형의 -(CH2)m- 일 수 있으며, 상기 m 은 5 내지 10의 정수일 수 있다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 R은 할로겐 일 수 있으며, 보다 바람직하게는 염소(Cl) 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 화합물은 하기 [화학식 3]으로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다:
[화학식 3]
Figure PCTKR2022005350-appb-img-000007
상기 [화학식 3]에서, n은 1 내지 5의 정수이다.
본 발명에 따른 상기 [화학식 3]에서, 바람직하게는 상기 n 은 1 또는 2일 수 있다. 상기 n 이 1인 경우 리간드 VL1을 의미하며, n 이 2인 경우 상기 리간드 VL2 를 의미할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 화합물은 목적 물질 (예컨대, 목적 핵산 또는 목적 단백질)과 상호작용하는 근접분자 (예컨대, 근접한 위치에 존재하는 상호작용 약물, 상호작용 단백질, 상호작용 펩타이드)를 식별하기 위하여 목적 물질에 결합되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 목적 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있으나, 이에 한정되지는 않으며, 상기 목적 단백질은 항체 또는 펩타이드일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
일 양태로서, 상기 화합물은 목적 물질에 직접 결합되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 화합물은 목적 단백질에 존재하는 아민기 (amine) 또는 목적 핵산을 합성할 때 외부에서 아민기를 도입함으로써, 상기 목적 물질의 아민기와 반응할 수 있는 NHS ester기를 갖는 AzNP 일 수 있다.
또한, 상기 화합물은 목적 단백질에 존재하는 시스테인기 또는 목적 핵산을 합성할 때 외부에서 티올(thiol)기를 도입함으로써, 상기 목적 물질과 반응할 수 있는 maleimide기를 갖는 AzNP 일 수 있다.
다른 양태로서, 상기 화합물은 단백질 태그를 통해 결합되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 즉, 일부 양태에서 상기 화합물은 단백질 태그(tag)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 단백질 태그는 Halotag, SNAP-tag 또는 CLIP-tag 인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 리간드가 VL1 또는 V2인 경우, 상기 단백질 태그는 바람직하게는 Halotag일 수 있다. 상기 리간드 VL1은 VL2 보다 길이가 짧아 상기 단백질 태그에 VL2에 비하여 빠르게 결합할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 화합물은 상기 목적 물질과 상호작용하는 근접분자에 광가교 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다.
즉, 목적 단백질 또는 목적 핵산과 결합되어 있는 상기 화합물은 상기 목적 단백질 또는 목적 핵산과 상호작용하는 단백질 또는 펩타이드에 광가교 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 목적 단백질은 항체 또는 펩타이드인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 목적 핵산은 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 화합물은 가시광선 조사에 의해 상기 목적 단백질 또는 목적 핵산과 상호작용하는 단백질 또는 펩타이드에 광가교 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다.
일 양태로서, 상기 목적 물질을 살아있는 세포나 단백질 혼합물에 처리하고 가시광선을 처리하면, 상기 세포나 단백질 혼합물 내 상기 목적 물질과 상호작용하는 단백질 또는 상호작용하는 펩타이드와 광가교 결합을 유도할 수 있다.
일 양태로서, 상기 화합물은 상기 단백질 태그에 융합되어 있는 목적 단백질과 상호작용하는 단백질에 광가교 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 가시광선은 사람의 눈에 보이는 전자기파의 영역이면 제한없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 400 내지 700 nm 의 빛일 수 있으며, 보다 바람직하게는 450 내지 500 nm 의 청색광(blue light) 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 광가교 결합의 반경(radius)는 0.01 내지 1 nm인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 일 양태로서, 상기 [화학식 3]의 PEG 링커 길이는 단백질 태그 (예컨대, HaloTag) 표면에서 활성 종의 방향을 결정하여 특정 상호작용 파트너에 대한 가교 효율에 영향을 미칠 수 있을 것이다. 따라서, 본질적으로 짧은 라벨링 반경으로 인한 위치 의존적 가교 효율을 가지는 본 발명의 이러한 특징이 목적 단백질의 완전한 물리적 상호작용을 모두 커버하는 데에는 제한 요인이 될 수 있으나, 다른 관점에서 본 발명의 이러한 구조적 특징에 기인하여, 본 발명은 목적 단백질의 확실한 상호 작용 단백질만을 가교하여 식별해 낼 수 있다는 장점을 갖는다.
본 발명은 다른 관점에서, 다음 단계를 포함하는 목적 단백질 또는 목적 핵산을 근접하는 상호작용 단백질 또는 펩타이드와 광가교하는 방법에 관한 것이다:
(a) 목적 단백질 또는 목적 핵산과 결합되어 있는 상기 화합물을 상기 목적 단백질 또는 상기 목적 핵산과 상호작용하는 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 시료에 처리하는 단계; 및
(b) 가시광선을 처리하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 목적 단백질 또는 목적 핵산은 (i) 내재적으로 존재하는 아민기 또는 외부에서 도입된 아민기, 또는 (ii) 내재적으로 존재하는 티올기 또는 외부에서 도입된 티올기를 통하여 상기 화합물과 결합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 다른 양태로서 상기 목적 단백질 또는 목적 핵산은 단백질 태그를 통하여 결합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 목적 단백질의 상호작용 단백질을 식별하는 방법에 관한 것이다:
(a) 세포 내에서 목적 단백질을 발현시키는 단계;
(b) 상기 세포에 상기 화합물을 처리하는 단계;
(c) 상기 세포에 가시광선을 조사하는 단계; 및
(d) 상기 세포를 용해시켜 상기 화합물과 광가교 결합된 단백질을 목적 단백질의 상호작용 단백질로 식별하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 목적 단백질은 에피토프 펩타이드 태그(tag)가 결합되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다. 목적 단백질이 에피토프 펩타이드 태깅됨으로써, 상기 목적 단백질은 면역침강시킬 수 있다.
일 양태로서, 상기 목적 단백질은 Flag tag, Myc tag, HA tag, Avi tag 및 V5 tag로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 목적 단백질은 에피토프 펩타이드 태그에 결합가능한 항체를 탑재한 마그네틱 또는 아가로즈 비드로 면역침강시켜 분리하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
다른 양태로서, 상기 목적 단백질은 스트렙타비딘, 아비딘 또는 바이오틴을 결합시키고, 상기 스트렙타비딘의 유사체 또는 바이오틴에 가역적으로 결합하는 아비딘의 유사체를 탑재한 마그네틱 또는 아가로즈 비드로 침강시켜 분리하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
한편, 본 발명에서는 종래의 근접 라벨링 방법과 비교하여 살아있는 세포에서 목적 단백질의 직접적인 상호 작용 파트너를 선택적으로 정확도 높게 식별해 낼 수 있으며, 이로써 살아있는 세포 내 목적 단백질의 분자 네트워크를 확인할 수 있다.
TurboID는 다양한 실험에서 상호작용체 매핑에 활용되었으나, 바이오틴-AMP의 다소 확산적인 표지 특성으로 인해, 근래의 근접 라벨링 방법(예: BioID, TurboID 및 APEX)은 데이터를 세포질 TurboID의 바이오틴화된 단백질(예: TurboID-NES)과 비교하는 "여과 접근 방식(filtration approach)"을 추가로 요구하였다. 그러나 이러한 필터링된 데이터는 여전히 직접 결합하는 파트너만을 선별적으로 반영할 수 없으며 오히려 세포질 백그라운드와 비교하여 근위 단백질의 불명확한 "윤곽(contour)"만 제공할 뿐, 이 데이터로부터 선별된 단백질이 목적 단백질의 진정한 상호 작용 파트너인지 여부를 해독할 수는 없다는 한계가 있었다.
이러한 문제점을 극복하고자, 본 발명에 따른 광가교 (Spotlight) 반응은 TurboID의 아미드 커플링 기반 바이오틴화 반응과 직교할 수 있다는 점에 착안하여, 본 발명에서는 동일한 대상 목적 단백질에 대해 본 발명에 따른 광가교 반응에 부가하여 TurboID를 함께 적용하여 보았으며, 그 결과 목적 단백질의 물리적 상호작용 단백질이 본 발명 화합물에 의해 광가교 되는 것과 함께 바이오틴화 될 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 다음 단계를 포함하는 목적 단백질의 상호 작용 단백질을 식별하는 방법에 관한 것이다:
(a) 세포 내에서 단백질 태그가 융합되어 있는 목적 단백질을 발현시키는 단계;
(b) 상기 세포에 상기 화합물을 처리하는 단계;
(c) 상기 세포에 가시광선을 조사하는 단계; 및
(d) 상기 세포를 용해하여 광가교 결합된 단백질을 목적 단백질의 상호 작용 단백질로 식별하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 목적 단백질은 바이오틴 라이게이즈 (biotin ligase)가 추가로 융합되어 있을 수 있다.
일 양태로서, 상기 단백질 태그는 링커에 의해 목적 단백질에 융합되어 있을 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 링커는 아마이드(amide) 링커일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
한편, 본 발명에서 가교 생성물의 생성 효율이 상기 링커에 의해 영향을 받는지 HaloTag-G3BP1를 이용하여 실험해 본 결과, G3BP1의 N-말단에 있는 HaloTag 위치가 SARS-CoV-2N 단백질 표면에 접근하는 유연성을 어느 정도 가질 수 있어 HaloTag와 G3BP1 사이의 펩타이드 링커 길이에 의해 실질적으로 영향을 받지 않는 것으로 확인되었다.
따라서, 단백질/단백질, 단백질/펩타이드 또는 펩타이드/펩타이드 간의 연결을 위하여 통상적으로 사용 가능한 것으로 본 기술 분야에 알려져 있는 링커는 본 발명에서 HaloTag과 목적 단백질을 결합하는데 제한없이 사용될 수 있을 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 화합물은 단백질 태그(tag)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 단백질 태그는 Halotag, SNAP-tag 또는 CLIP-tag 인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명에 있어서, 상기 단백질 태그는 바람직하게는 Halotag일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 바이오틴 라이게이즈는 BirA, BioID 또는 TurboID인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명에 있어서, 상기 바이오틴 라이게이즈는 바람직하게는 TurboID 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계는 용해된 세포에서 목적 단백질과 광가교 결합된 단백질을 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 광가교 결합된 단백질을 분리하는 단계는 목적 단백질을 면역 침강시킬 수 있도록 목적 단백질에 에피토프 펩타이드 태그 (예컨대, Flag tag, Myc tag, HA tag, Avi tag, V5 tag 등)을 융합시키고, 상기 에피토프 펩타이드 태그에 특이적으로 결합하는 항체를 탑재한 마그테닉 또는 아가로즈 비드를 이용하여 분리하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
다른 양태로서, 상기 광가교 결합된 단백질을 분리하는 단계는 목적 단백질에 스트렙타비딘, 아비딘 또는 바이오틴화하고, 상기 스트렙타비딘, 아비딘, 바이오틴에 가역적으로 결합하는 스트렙타비딘의 유사체 또는 바이오틴에 가역적으로 결합하는 아비딘의 유사체를 탑재한 마그네틱 또는 아가로즈 비드를 이용하여 분리하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계는 상기 분리된 단백질을 가수분해 효소로 분해(digestion)시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 가수분해 효소는 트립신(Trypsin), 아르기닌 C(Arg-C), 아스파르트산 N(Asp-N), 글루탐산 C(Glu-C), 라이신 C(Lys-C), 키모트립신(Chymotrypsin), 프로테인나아제 K(Proteinase k) 및 프로나아제(Pronase)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계는 질량분석법에 의해 상호작용 단백질을 식별하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 질량 분석을 위한 질량분석기는 LTQ-FT, Orbitrap, Triple-Tof, Q-Tof, Tof-Tof 및 Q Exactive로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계는, 세포 내에서 바이오틴 라이게이즈 (biotin liages) 및 단백질 태그가 융합되어 있는 대조군 융합 단백질에 의해 바이오틴화 되는 단백질은 목적 단백질의 상호 작용 단백질에서 제외시키는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에서는 상기 양태와 관련한 일 실시예에서, 실험의 각 단계(예: 광가교 및 스트렙타비딘 농축)가 예상대로 작동하는지 확인하기 위하여 4가지 제어 조건(+/- VL1, +/- BirA)으로 SARS-CoV-2N-HaloTag-AP 및 HaloTag-AP의 8개 샘플에 대한 질량 분석을 수행하였지만, 목적 단백질의 상호작용 단백질을 식별하기 위하여, VL1 가교 POI-HaloTag(POI-HaloTag-AP/+VL1/+BirA)의 스트렙타비딘 농축 샘플과 VL1 가교 유리 HaloTag(HaloTag-AP/+VL1/+BirA)를 비교하는 것으로 충분할 수 있으며, 이 경우 유리 HaloTag 가교 단백질은 본 발명을 적용하여 다양한 종류의 목적 단백질의 상호작용 단백질을 식별하기 위한 다른 실험에 대해서도 배경 단백질 정보를 제공할 수 있을 것이다.
또한, 본 발명에서는 상기 화합물이 다양한 세포 내 소기관에 투과될 수 있는 특성과 더불어 녹색 형광을 나타내는 특성에 기초하여 살아있는 세포 내에서 목적 단백질의 위치를 식별하고, 목적 단백질의 상호작용 단백질 후보군과의 상호작용 여부를 이미징 기반으로 검증할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 다음 단계를 포함하는 목적 단백질 세포 내 위치 식별 방법에 관한 것이다:
(a) 세포 내에서 단백질 태그가 융합되어 있는 목적 단백질을 발현시키는 단계;
(b) 상기 세포에 상기 화합물을 처리하는 단계;
(c) 상기 세포에 가시광선을 조사하는 단계; 및
(d) 상기 목적 단백질의 세포 내 위치를 녹색 형광으로 식별하는 단계.
본 발명에 의하면, 상기 방법에서 (a) 단계 이후, 스트레스 (산도 변화, 온도 변화 등)를 유발함으로써 스트레스 상황에서 목적 단백질의 세포 내 이동을 용이하게 관찰할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 다음 단계를 포함하는 목적 단백질과 이의 상호작용체와 상호작용 검증방법에 관한 것이다:
(a) 세포 내에서 단백질 태그가 융합되어 있는 목적 단백질과 이의 상호작용체를 발현시키는 단계;
(b) 상기 세포에 상기 화합물을 처리하는 단계;
(c) 상기 세포에 가시광선을 조사하는 단계; 및
(d) 상기 목적 단백질과 상기 상호작용체가 세포 내 공동 국소화(co-localized) 되는지 확인하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 목적 단백질의 세포 내 위치는 녹색 형광으로 식별될 수 있고, 상기 상호작용체는 상기 녹색 형광과 상이한 형광에 의해 식별될 수 있으며, 상기 두 형광의 공동 국소화를 관찰함으로써 상기 목적 단백질과 이의 상호작용체 간의 상호작용 여부를 확인할 수 있을 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 상호작용체를 식별하기 위한 형광은 상기 상호작용체 특이적 항체에 형광을 표지하거나 상기 상호작용체가 세포 내에서 형광과 함께 발현되도록 엔지니어링 함으로써 식별 가능할 것이다.
본 발명에 의하면, 상기 방법에서 (a) 단계 이후, 스트레스 (산도 변화, 온도 변화 등)를 유발함으로써 스트레스 전후 상황에서 어떻게 목적 단백질과 이의 상호작용체가 상호작용하는지를 용이하게 판별할 수 있다.
본 발명의 일부 양태로서, Lamin-AC(핵 내부 막), p80-coilin (Cajal body), HNRNPD (SAM68 바디), MRPL12 (미토콘드리아 매트릭스), Tom20 (외부 미토콘드리아 막), SEC61B (ER 막) 및 G3BP1 (스트레스 과립)를 포함한 다양한 세포소기관에 분포하는 단백질들 또는 바이러스 단백질 일 수있다. 예컨대, 상기 단백질은 뉴클레오캡시드(nucleocapsid, N) 단백질 일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 바이러스는 포유동물 감염 바이러스일 수 있으며, 바람직하게는 SARS-CoV-2 바이러스일 수 있다. 상기 포유동물은 인간을 포함한 마우스, 햄스터, 개, 고양이, 돼지, 염소 또는 영장류일 수 있다.
본 발명 화합물은 가시광선 조사에 의해 활성화되어 효과적으로 광 가교 능력을 가진다는 것을 알 수 있으며, 특히, 본 발명에서는 VL1을 이용한 테스트 튜브 내 실험 뿐만 아니라 살아있는 세포를 이용한 모든 광가교 실험에서 청색 LED 가정용 램프 (~36W)를 사용하여 그 효과를 확인하였다는 점이 특히 주목할 만하다. 즉, 본 발명 화합물은 저강도 가시광 조명에서 효과적인 광 가교가 가능하며, 이는 살아있는 세포를 이용한 in vitro 실험 뿐만 아니라, 살아있는 동물을 이용하는 in vivo 실험에도 본 발명이 활용될 수 있음을 시사한다.
한편, 살아있는 세포 실험에서 HaloTag 단백질의 광가교 생성물이 청색 LED 조명 하에 1분 이내에 생성되었는데, 이는 소 혈청 알부민과의 표적화되지 않은 in vitro 반응 광 가교보다 훨씬 빠른 속도로 확인되었으며, 이는 살아있는 세포의 거대분자 밀집 환경으로 인한 것으로 해석된다.
상술한 결과들은 가시광선 활성화에 의한 일시적 공간 근접 광 가교(spatiotemporal proximity photo-crosslinking by visible light activation, spotlight) 방법이 생리적 조건에서 효과적으로 일시적 상호 작용 파트너를 정확하게 포착해 낼 수 있음을 뒷받침한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석하지 않는 것은 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다.
실시예 1. HaloTag 특이적 AzNP 리간드 합성
두 개의 링커 크기로 AzNP 접합 HaloTag 리간드(VL1 및 VL2)를 합성하였다. VL1은 가시광선 영역에서 상당히 강한 흡광도를 나타내었다; Mmax= 375 nm, 소광 계수 값 = 2,230 M-1cm-1;. 대조 실험을 위해 자외선 광 흡수 파라-아지도페닐 및 디아지린 부분을 포함하는 다른 광가교성 HaloTag 리간드도 준비하였다 (UL1-UL4). 반응 개략도는 도 1에 나타난 바와 같다.
(1-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)-6-chlorohexane) 합성
0℃에서 DMF 중 2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethanol (17.5 mg, 화합물 2, 0.1mmol)의 용액에 NaH (6 mg, 0.15 mmol)를 첨가하였다. 0℃에서 30분 동안 교반한 후, 1-chloro-6-iodohexane (18.6μL, 0.12mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 교반하고, 실온으로 가온하고, 2시간 동안 교반하였다. 염화암모늄을 0℃에서 반응 혼합물에 첨가하고, diethyl ether (10㎖ x 3)로 추출한 후, saturated brine (10㎖)으로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조한 후 여과하고, 진공에서 농축하였다. 조 물질을 실리카겔 상에서 플래시 크로마토그래피로 정제하여 (1-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)-6-chlorohexane) (12 mg, 화합물 3, 수율: 40%)을 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, Chloroform_d) δ(m, 6H), 3.60 - 3.57 (m, 2H), 3.53 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.46 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 3.39 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 1.82 - 1.73 (m, 2H), 1.60 (p, J = 6.8 Hz, 2H), 1.52 - 1.31 (m, 6H). 13C NMR (100 MHz, Chloroform-d) δ70.74, 70.72, 70.66, 70.11, 70.04, 50.70, 45.07, 32.56, 29.46, 26.71, 25.43. APCI-MS: m/z calcd. for 293.15, measured for 265.88 [M+H-N2]+.
(2-(2-(2-((6-chlorohexyl)oxy)ethoxy)ethoxy)ethan-1-amine) 합성
반응 튜브 내부의 공기를 수소로 교체하기 위한 2회의 진공/H2 사이클 후, 화합물 3 (35mg, 0.12mmol), 10% Pd/C(화합물 3의 3.5mg 10wt%) 및 MeOH(0.6㎖) 중 1N HCl 2-3방울의 혼합물을 수소 풍선 아래에서 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 필터를 사용하여 여과하여 (2-(2-(2-((6-chlorohexyl)oxy)ethoxy)ethoxy)ethan-1-amine (화합물 4)를 정량적 수율로서 수득하였다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ- 8.02 (m, 3H), 3.59 (dq, J = 6.7, 3.6, 3.1 Hz, 4H), 3.55 - 3.41 (m, 8H), 3.35 (d, J = 2.9 Hz, 2H), 2.90 (t, J = 5.3 Hz, 2H), 1.73 - 1.63 (m, 2H), 1.46 (dd, J = 9.9, 4.7 Hz, 2H), 1.40 - 1.24 (m, 4H). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ70.31 - 69.74 (m), 67.01, 45.82, 38.82, 32.45, 29.47, 26.54, 25.35. APCI-MS: m/z calcd for 267.16, measured for 267.95 [M+H]+.
UL1 합성
aryl-azide-PEG2 HaloTag 리간드(UL1)를 합성하기 위하여, 4-azidobezoic acid(화합물 8, 83mg, 0.50mmol)를 HATU(214mg, 0.56mmole), DIPEA(131.3mg, 1.02mmol)가 있는 10㎖ 둥근 바닥 플라스크에 넣어주고, 2㎖의 DCM에 용해시켰다. 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 또는 색이 갈색으로 변할 때까지 교반하고, 이어서, 1 ㎖ DCM에 용해된 2-(2-((6-chlorohexyl)oxy)ethoxy)ethanamine (138 mg, 0.61 mmoles)을 반응 혼합물에 적가한 후, 반응물을 실온에서 추가로 3시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후, 용매를 감압 하에 제거하여 무색 오일을 얻었고, 이를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용리액: 헥산 중 40% EtOAc)로 정제하여 무색 오일로 순수한 UL1 (168 mg, 90%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ(d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.06 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.67 (br s, 1H), 3.70 - 3.63 (m, 6H), 3.62 - 3.57 (m, 2H), 3.52 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.46 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 1.78 - 1.70 (m, 2H), 1.61-1.54 (m, 2H), 1.46 - 1.32 (m, 4H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ143.35, 131.19, 128.93, 119.04, 77.16, 71.39, 70.35, 70.12, 69.81, 45.12, 39.84, 38.73, 32.59, 29.55, 26.78, 25.50, HR-ESI-MS: m/z calcd. for 368.1615, measured for 368.1614.
UL2 합성
aryl-azide-PEG3 HaloTag 리간드(UL2)를 합성하기 위하여, 4-azidobezoic acid(화합물 8, 45mg, 0.28mmol)를 HATU(105mg, 0.28mmol), DIPEA(64mg, 0.58mmol)가 있는 10㎖ 둥근 바닥 플라스크에 넣은 후 2㎖의 DCM에 용해시켰다. 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 또는 색이 갈색으로 변할 때까지 교반하고, 이어서, 1 ㎖ DCM에 용해된 2-(2-(2-((6-chlorohexyl)oxy)ethoxy)ethoxy)ethanamine (68mg, 0.25mmole)을 반응 혼합물에 적가한 후, 반응물을 실온에서 추가로 3시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후, 용매를 감압하에 제거하여 무색 오일을 얻었고, 이를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(용리액: 헥산 중 60% EtOAc)로 정제하여 무색 오일로 UL2(98 mg, 95%)를 얻었다.
1H NMR (400 MHz, Acetone) δ(d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.77 (s, 1H), 7.16 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 3.66 - 3.54 (m, 12H), 3.54 - 3.49 (m, 2H), 3.41 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 1.75 (m, 2H), 1.57 - 1.49 (m, 2H), 1.47 - 1.32 (m, 4H). 13C NMR (101 MHz, Acetone) δ143.74, 132.45, 129.94, 119.66, 71.56, 71.10, 71.09, 70.92, 70.76, 70.54, 45.75, 40.50, 38.72, 33.36, 30.28, 27.36, 26.15, HR-ESI-MS: m/z calcd. for 412.1877, measured for 412.1877
UL3 합성
N-(2-(2-(2-((6-chlorohexyl)oxy)ethoxy)ethoxy)ethyl)-3-(3-methyl-3H-diazirin-3-yl)propenamide (UL3)를 합성하기 위하여, 실온에서 3-(3-methyl-3H-diazirin-3-yl)propanoic acid (화합물 9, 13.4mg, 0.05mmol), EDC-HCl(10.5mg, 0.055mmol), TEA(7uL, 0.05mmol) 및 건조 THF(0.3㎖) 중 DMAP(6.1mg, 0.05mmol)를 THF(0.2 ㎖) 중 2-(2-(2-((6-chlorohexyl)oxy)ethoxy)ethoxy)ethan-1-aminium chloride (1c, 15.2 mg, 0.05 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 2시간 동안 교반하고, 진공에서 농축시켰다. 조 물질을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 UL3 (7 mg, 수율: 37%)를 수득하였다.
1H NMR (600 MHz, Chloroform-d) δ(s, 1H), 3.64 - 3.51 (m, 12H), 3.48 - 3.42 (m, 4H), 2.02 - 1.98 (m, 2H), 1.79 - 1.72 (m, 4H), 1.60 (p, J = 6.9 Hz, 2H), 1.45 (dt, J = 14.8, 6.8 Hz, 2H), 1.37 (q, J = 8.0 Hz, 2H), 1.02 (s, 3H). 13C NMR (150 MHz, Chloroform-d) δ71.26, 70.50, 70.47, 70.20, 70.05, 69.82, 45.01, 39.27, 32.50, 30.57, 30.06, 29.38, 26.65, 25.46, 25.37, 19.86. HRMS-DART: m/z calcd for 377.2081, measured for 378.2154 [M+H]+.
UL4 합성
N-(2-(2-(2-((6-chlorohexyl)oxy)ethoxy)ethoxy)ethyl)-4-(3-(trifluoromethyl)-3H-diazirin-3-yl)benzamide (UL4)를 합성하기 위하여, 실온에서 4-(3-(trifluoromethyl)-3H-diazirin-3-yl)benzoic acid (화합물 10, 11.5 mg, 0.05 mmol), EDC-HCl (10.5 mg, 0.055 mmol), TEA (7 uL, 0.05 mmol) 및 조 THF(0.3㎖) 중 DMAP(6.1mg, 0.05mmol)의 용액을 THF(0.2 ㎖) 중 2-(2-(2-((6-chlorohexyl)oxy)ethoxy)ethoxy)ethan-1-aminium chloride (15.2 mg, 0.05 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 2시간 동안 교반하고, 진공에서 농축시켰다. 조 물질을 플래시 크로마토그래피로 정제하여 UL4 (14 mg, 수율: 60%)를 얻었다.
1H NMR (600 MHz, Chloroform-d) δ- 7.82 (m, 2H), 7.23 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.09 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 3.68 - 3.61 (m, 10H), 3.54 (dd, J = 5.8, 3.7 Hz, 2H), 3.51 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.40 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 1.78 - 1.71 (m, 2H), 1.54 (dt, J = 14.7, 6.9 Hz, 2H), 1.45 - 1.38 (m, 2H), 1.32 (p, J = 7.6, 7.1 Hz, 2H). 13C NMR (100 MHz, Chloroform-d) δ135.70, 132.10, 127.62, 126.46, 126.45, 121.93 (d, J = 274.8 Hz), 71.27, 70.54, 70.52, 70.25, 70.05, 69.76, 45.00, 39.91, 32.50, 29.35, 28.36 (d, J = 40.5 Hz), 26.64, 25.36. HRMS-DART: m/z calcd for 479.1799, measured for 480.1871 [M+H]+.
VL1 합성
3-(6-azido-1,3-dioxo-1H-benzo[de]isoquinolin-2(3H)-yl)propanoic acid (화합물 11, 180 mg, 0.582 mmol)를 HATU(254mg, 0.67mmol) 및 DIPEA(240ul, 1.3mmol)와 함께 10 ㎖ 둥근 바닥 플라스크의 1 ㎖ DMF에 넣은 후, 반응 혼합물이 황색 침전물이 될 때까지 실온에서 30분 동안 교반하였다. 그 다음 NH2-PEG2-HTL (화합물 7)을 DMF 1㎖와 함께 첨가하고 반응 혼합물이 잠시 균일한 액체로 변하고 다시 침전물이 되어 추가 1시간 동안 교반을 유지한 다음 EtOAc 및 물을 사용하여 워크업을 수행하고 유기층을 Na2SO4로 건조시키고 실리카겔 컬럼(CHCl3 중 1% MeOH)을 사용하여 정제를 수행하여 180mg의 황색 분말(60%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ(dd, J = 7.3, 1.1 Hz, 1H), 8.59 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.45 (dd, J = 8.4, 1.0 Hz, 1H), 7.75 (dd, J = 8.4, 7.4 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.28 (s, 1H), 4.54 - 4.44 (m, 2H), 3.62 - 3.38 (m, 11H), 2.71 - 2.61 (m, 2H), 1.81 - 1.69 (m, 2H), 1.58 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 1.48 - 1.31 (m, 4H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ163.97, 163.53, 143.73, 132.44, 131.95, 129.28, 129.04, 126.99, 124.46, 122.55, 118.81, 114.80, 77.16, 71.37, 70.35, 70.10, 69.90, 45.15, 39.32, 37.02, 34.86, 32.61, 29.55, 26.79, 25.52.
VL2 합성
3-(6-azido-1,3-dioxo-1H-benzo[de]isoquinolin-2(3H)-yl)propanoic acid (화합물 11, 116 mg, 0.37 mmol)를 HATU(160mg, 0.42mmol) 및 DIPEA(255ul,)와 함께 10 ㎖ 둥근 바닥 플라스크의 1 ㎖ DMF에 넣은 후, 반응 혼합물이 황색 침전물이 될 때까지 실온에서 30분 동안 교반하였다. 그 다음 NH2-PEG3-HTL (화합물 4) 을 DMF 1㎖와 함께 첨가하고 반응 혼합물이 잠시 균일한 액체로 변하고 다시 침전물이 되어 추가 1시간 동안 교반을 유지한 다음 EtOAc 및 물을 사용하여 워크업을 수행하고 유기층을 Na2SO4로 건조시키고 실리카겔 컬럼(CHCl3 중 1% MeOH)을 사용하여 정제를 수행하여 황색 분말(55%)을 얻었다.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ(dd, J = 7.3, 1.0 Hz, 1H), 8.59 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.45 (dd, J = 8.4, 1.0 Hz, 1H), 7.75 (dd, J = 8.3, 7.4 Hz, 1H), 7.48 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.40 (s, 1H), 4.53 - 4.46 (m, 2H), 3.65 - 3.53 (m, 9H), 3.50 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.45 (dt, J = 11.0, 6.0 Hz, 4H), 2.70 - 2.61 (m, 2H), 1.79 - 1.69 (m, 2H), 1.56 (dd, J = 14.5, 7.0 Hz, 2H), 1.37 (ddd, J = 23.3, 15.9, 8.7 Hz, 4H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ170.42 , 163.96 , 163.51, 143.70, 132.42, 131.93, 129.28, 129.01, 126.98, 124.46, 122.58, 118.85, 114.79, 71.36, 70.63 (d, J = 4.7 Hz), 70.26 (d, J = 15.8 Hz), 69.95, 45.14, 39.38, 37.04, 34.81, 32.63, 29.52, 26.78, 25.51.
HaloTag-UL2 및 Halotag-VL1의 co-crystalized holo-protein complex의 X-선 단백질 구조 분석을 사용하여 UL2의 파라 아지도페닐 모이어티와 VL1의 AzNP 모이어티는 HaloTag의 표면에 잘 노출되어 있는 것을 확인하였다 (도 2).
실시예 2. 플라스미드 제작 및 클로닝
제한 효소와 T4 DNA 라이게이즈를 이용하여 유전자를 지정된 벡터로 클로닝하였다. 태그(예: V5 에피토프 또는 AviTag) 또는 신호 서열을 단백질에 추가시키고자, 유전자를 PCR 증폭하는데 사용되는 프라이머에 태그 서열을 포함시켰다. PCR 생성물을 제한 효소로 절단하고, 제한 효소로 절단된 벡터 (예 : pcDNA3, pCDNA5, pDisplay, pET21a 및 pH6HTN)에 연결하였다. 포유류 세포에서의 발현을 위해, CMV 프로모터를 사용하였다. 하기 [표 1] 은 본 발명에서 사용된 플라스미드를 나타낸다
Name Features Promotor/
Vector		 Details
Nucleocapsid-Halotag KpnI-Nucleocapsid-TEV-NheI-V5-Halotag-TEV-AviTag-Stop-NotI CMV/pCDNA5 AviTag: GLNDIFEAQKIEWHE
V5: GKPIPNPLLGLDST
TEV: ENLYFQSENLYFQS
N-HaloTag-TurboID KpnI-Nucleocapsid-TEV-NheI-HaloTag-BamHI-V5-TurboID-Flag-NotI CMV/pCDNA5 Flag: DYKDDDDK
Halotag-(33aa)-G3BP1 KpnI-AviTag-NheI-V5-HaloTag-BamHI-TEV-Flag-G3BP1-Stop-NotI CMV/
pCDNA5		 AviTag: GLNDIFEAQKIEWHE
V5: GKPIPNPLLGLDST
TEV: ENLYFQSENLYFQS
HA: YPYDVPDYA
Halotag-(11aa)-G3BP1 HindIII-V5-HaloTag-Flag-ClaI-G3BP1-GSG-His6-Stop CMV/pCDNA5 Flag: DYKDDDDK
V5: GKPIPNPLLGLDST
G3BP1-Halotag KpnI-G3BP1-BamHI-V5-Halotag-TEV-GSG-His6-Stop CMV/pCDNA5 V5: GKPIPNPLLGLDST
TEV: ENLYFQSENLYFQS
G3BP1-BFP-Halotag KpnI-G3BP1-BamHI-Linker-EBFP-AgeI-V5-Halotag-TEV-His6-Stop-XhoI CMV/pCDNA5 Linker: GAPGSAGSAAGSG
V5: GKPIPNPLLGLDST
TEV: ENLYFQSENLYFQS
FKBP25-V5-HaloTag-AviTag KpnI-FKBP25-BamHI-NheI-V5-HaloTag-Avitag-Stop-NotI CMV/
pCDNA5		 V5: GKPIPNPLLGLDST
AviTag: GLNDIFEAQKIEWHE
FKBP12-Halotag-TurboID-Flag SpnI-FKBP12-NheI-HaloTag-BamHI-V5-TurboID-Flag-NotI CMV/
pCDNA5		 V5: GKPIPNPLLGLDST
Flag:DYKDDDDKDYKDDDDK
EGFP-FRB AgeI-EGFP-HindIII-EcoRI-FRB-Stop-BamHI CMV/pEGFP EGFP: Enhanced green fluorescent protein
FRB: FK506 rapamycin binding domain of mTOR
V5-LaminA/C-Halotag KpnI-AviTag-NheI-V5-Halotag--EcoRI-LaminA/C-Stop-NotI CMV/pCDNA5 AviTag: GLNDIFEAQKIEWHE
V5: GKPIPNPLLGLDST
Tom20-V5-Halotag KpnI-Tom20-Linker-NheI-V5-Halotag-TEV-AviTag-Stop-NotI CMV/pCDNA5 Linker: GGSGDPPVAT
AviTag: GLNDIFEAQKIEWHE
V5: GKPIPNPLLGLDST
P80Coilin-V5-Halotag KpnI-p80Coilin-BamHI-V5-Halotag-TEV-AviTag-Stop-NotI CMV/pCDNA5 AviTag: GLNDIFEAQKIEWHE
V5: GKPIPNPLLGLDST
MRPL12-V5-Halotag KpnI-MRPL12-NheI-V5-Halotag-Strep2-STOP-NotI CMV/pCDNA5 V5: GKPIPNPLLGLDST
Strep2: WSHPQFEK
HNRNPD-V5-Halotag KpnI-HRNPD-NheI-Linker-TEV-V5-AViTag-Halotag-His6-Stop-NotI CMV/pCDNA5 Linker: GGSG
V5-Halotag-Sec61b AflII-V5-Halotag-TEV-AviTag-NheI-Sec61Beta-Stop-XhoI CMV/pCDNA5 AviTag: GLNDIFEAQKIEWHE
V5: GKPIPNPLLGLDST
FKBP12-EGFP NdeI-FKBP12-HindIII-NotI-EGFP-XhoI-His6-Stop T7/pET21a His6: Six histidine for Ni-NTA affinity purification
EGFP: Enhanced green fluorescent protein
FRB-V5-HaloTag NotI-His6-FRB-V5-SacII-HaloTag-Stop-NotI T7/pH6HTN His6: Six histidine for Ni-NTA affinity purification
FRB: FK506 rapamycin binding domain of mTOR
V5: GKPIPNPLLGLDST
BirA-His6 XbaI-BirA-HindIII-NotI-His6-Stop T7/pET28a His6: Six histidine for Ni-NTA affinity purification
Nucleocapsid-GFP KpnI-Nucleocapsid-BsiWI-Linker-NheI- EGFP -Stop-NotI CMV/pCDNA5 EGFP: Enhanced green fluorescent protein
Linker: GAPGSAGSAAGSG
EGFP KpnI-EGFP-Stop-NotI CMV/pCDNA5 EGFP: Enhanced green fluorescent protein
HA-FRB HindIII-HA-MluI-FRB-Stop CMV/PRK5 FRB: FK506 rapamycin binding domain of mTOR
HA: YPYDVPDYA
실시예 3. HaloTag 특이적 AzNP 리간드의 광가교 활성 확인
HEK293T 세포 (ATCC) 에서 FKBP25-HaloTag(64kDa)과 EGFP-FRB(48kDa)를 공동 발현시키고, 라파마이신 유도성 FKBP25-FRB 단백질 복합체를 사용하여 리간드의 광 가교 활성을 테스트하였다.
HEK293T 세포를 10% FBS, 2mM L-글루타민, 50units/㎖ 페니실린 및 50㎍/㎖ 스트렙토마이신으로 보충된 DMEM (hyclone, SH30243)에서 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다. 60-70% 컨플루언시의 12웰 플레이트에 1000ng 플라스미드 DNA를 100uL no-FBS, DMEM을 사용하여 2㎍의 폴리에틸렌이민(PEI, Polysciences, 23966)과 혼합하여 각 웰에 첨가하였으며, 2-3 시간 후 배지를 완전 배지로 교환하였다. 24 시간 트랜스펙션 후, 10μM VL1을 첨가한 DMEM을 1시간 동안 세포에 처리하였다. 그런 다음 세포를 DPBS로 3회 세척하고 Blue LED 조명을 10분 동안 조사하였으며, DPBS를 제거한 후 RIPA 용해 버퍼(Elpis biotech, EBA-1149)로 세포를 제조자 지침에 따라 4℃에서 30분 동안 용해시켰다. 이후 샘플을 6% SDS-PAGE 겔에 넣고, 150V로 60분 동안 런닝시켰다. 겔 상의 단백질을 90분 동안 400mA에서 니트로셀룰로오스 막으로 트랜스퍼하였다. 단백질 로딩 수준은 퐁슈 염색으로 확인하였다. 1시간 동안 2% 탈지유를 함유하는 TBST로 블로킹한 후, 2% 탈지유를 함유하는 TBST에 희석된 1차 항체 (마우스 항-V5 항체, Invitrogen, Cat. No. R960-25, 1:5000 희석액 혹은 마우스 항-GFP 항체 Invitrogen, Cat No. 33-2600, 1:1000 희석액)로 교환하고 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1xTBST 버퍼로 4회(각 5분) 세척 후, 2% 탈지유를 함유하는 TBST에 희석된 2차 항체 (염소 항-mouse HRP 접합 항체, BioRad, Cat. No. 1706516, 1:1000 희석액)로 30분 동안 인큐베이션하였다. 1xTBST 버퍼로 4회 세척 후 ECL 키트(Biorad, 1705061)로 현상하고 Gel doc machine(Genesys)으로 이미지 촬영하였다.
그 결과, VL1은 라파마이신을 첨가한 청색 LED 조명 조건에서만 약 110-120 kDa에 나타나는 FKBP25-HaloTag 및 EGFP-FRB의 광가교 생성물을 성공적으로 생성하한다는 것을 확인할 수 있었다. FKBP25-HaloTag에 대한 이 반응에서 PEG1 링커를 포함하는 VL1은 PEG2 링커를 포함하는 VL2와 비교하여 EGFP-FRB와의 더 강한 가교 효율을 보여주었다 (도 2g).
한편, 상기 결과를 검증하기 위하여 HA-FRB(13 kDa)와 FKBP25-V5-HaloTag를 이용하여 추가 실험을 진행한 결과에서도 HA-FRB와 FKBP25-V5-HaloTag의 가교 생성물의 예상 분자량에 가까운 약 80 kDa에서 VL1 매개 광가교 생성물이 확인되었다(데이터 미도시).
이와 같은 결과는 VL1이 상호작용 파트너의 태그 단백질 크기와 무관하게 HaloTag-접합 POI (POI-HaloTag)의 상호작용체를 선택적으로 교차 연결한다는 것을 나타낸다. 한편, UV 광 조명으로 광가교 생성물을 생성하는 UL1 - UL4 중 어느 것도 청색 LED 조명 조건에서 광가교 생성물을 생성하지는 못했다 (도 2g).
실시예 4. TurboID 융합에 따른 근접 라벨링 반경의 감소
FKBP12 단백질에 HaloTag 및 TurboID를 태그하고 라파마이신 처리에 의해 FRB가 광가교 및 바이오틴화될 수 있는지 확인하고자 하였다 (도 4a).
HEK293T 세포를 10% FBS, 2mM L-글루타민, 50unit/㎖ 페니실린 및 50㎍/㎖ 스트렙토마이신이 보충된 DMEM을 이용하여 5% CO2, 37℃에서 배양하였다. 세포가 60-70% 컨플루언시일 때, 12웰 플레이트의 경우, 1000 ng 플라스미드 DNA를 100 uL no-FBS, DMEM을 사용하여 2㎍의 폴리에틸렌이민(PEI, Polysciences, 23966)과 혼합하고, 웰에 첨가하고, 첨가 2-3시간 후, 배지를 전체 배지로 다시 교체하였다. 24시간 트랜스펙션 후, DMEM 중 10μM VL1을 1시간 동안 세포 내로 처리하였다.
이미징 실험을 위하여 세포를 DPBS(thermofisher, 21300)로 3회 세척하고, 세포를 실온에서 15분 동안 DPBS 중 4% 파라포름알데히드 용액(chembio, CBPF-9004)으로 고정하였다. 세포를 DPBS로 두 번 세척하고 -20℃에서 5분 동안 차가운 메탄올로 투과화하였다. 세포를 DPBS로 다시 2회 세척하고 실온에서 DPBS 중 2% BSA(밀리포어, 82-100-6) (블로킹 버퍼)로 30분 동안 블로킹하였다. HaloTag 융합 단백질 발현을 검출하기 위하여, 세포를 실온에서 1시간 동안 마우스 항-V5 항체 (Invitrogen, Cat. No. R960-25, 1:5000 희석액)와 함께 인큐베이션하였다. TBST로 5분씩 4회 세척한 후, 세포를 실온에서 30분 동안 2차 Alexa Fluor 568-염소 항-마우스 IgG (Invitrogen, Cat. No. A-11004, 1:1000 희석액)와 동시에 인큐베이션하였다.
웨스턴 블롯 실험을 위하여, 세포를 DPBS로 3회 세척하고 Blue LED 조명을 10분 동안 조사하고 DPBS를 제거한 후 RIPA 용해 버퍼(Elpis biotech, EBA-1149)를 첨가하였다. 4 ℃에서 30분 동안 세포를 용해시켰다. 샘플을 6% SDS-PAGE 젤에 넣고 150V에서 60분 동안 전개시킨 후, 겔 상에서 분리된 단백질을 90분 동안 400mA에서 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 트랜스퍼하였다. 단백질 로딩 수준을 퐁슈 염색으로 확인하고 퐁슈는 1xTBST 버퍼로 제거하였다. 1시간 동안 TBST 중 2% 스킴 밀크로 블로킹하고, 블로킹 용액을 2% 탈지유 용액에 희석된 1차 항체 (마우스 항-V5 항체 (Invitrogen, Cat. No. R960-25, 1:5000 희석액))로 교체한 후 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1xTBST 버퍼로 세척을 4회 (각각 5분) 진행한 후, 멤브레인을 30분 동안 TBST 중 2% 탈지유 용액에 희석된 2차 항체 (염소 항-mouse HRP 접합 항체, BioRad, Cat. No. 1706516, 1:1000 희석액)와 함께 인큐베이션하였다. 1xTBST 버퍼로 4회 세척한 후 ECL kit (Biorad, 1705061)로 현상하고 Gel doc machine (Genesys)으로 이미지를 촬영하였다
이미징 실험 결과, 라파마이신 처리 하에 FKBP12-HaloTag-TurboID는 EGFP-FRB와 공동 국소화되었으며(co-localized), 이는 접합된 FKBP12가 기능적으로 FRB 도메인과 복합체를 형성할 수 있음을 나타낸다 (도 4b). 웨스턴 블롯 결과에서는 라파마이신 처리된 샘플에서만 EGFP-FRB(48kDa)와 FKBP12-HaloTag-V5-TurboID(84kDa)의 가교 생성물이 약 140kDa에서 나타났으며 (도 4c), 레인 1과 레인 3 및 4에서 가교 패턴의 급격한 변화(sharp change)는 FKBP12의 단백질 상호작용체의 급격한 변화(drastic change)를 나타낸다. 항-Flag (마우스 항-Flag, Sigma Aldrich Cat. No. F1804) 면역 침전 후 SA-HRP (Pierce Cat. No, 21130) 웨스턴 블롯한 결과는 FKBP12 및 FRB 가교 생성물이 바이오틴화되었음을 보여주었다 (도 4d). 이 가교된 FKBP12 및 FRB 생성물 외에도 VL1과 가교되지 않았던 TurboID에 의해 바이오틴화된 수많은 단백질이 통과 분획(flow-through fraction)에서 검출되었다. 이는 종래 근접 라벨링 방법(즉, TurboID 방법)은 상호작용체 뿐만 아니라 라벨링 반경 내에 존재하는 모든 인근 단백질도 허위 라벨링을 하는 반면, 본 발명 (Spolight)은 더 엄격하게 물리적으로 상호 작용하는 단백질을 식별하는 방법이라는 것을 의미한다 (도 4a).
실시예 5. 광가교 화합물의 세포 내 구획에서 단백질-단백질 상호작용의 식별
HaloTag 단백질과 AzNP-접합 HaloTag 리간드(VL1) 사이의 특이성(specificity)과 이들이 살아있는 세포의 다양한 세포 내 구획에서 지협적인 단백질-단백질 상호작용 (PPI) 네트워크를 포착해 낼 수 있는지 테스트하고자 하였다.
VL1은 녹색 형광을 방출하고 (λ= 540 nm), 그 형광은 광가교 반응 후 증가하기 때문에, 살아있는 세포에서 VL1은 표적화 및 POI-HaloTag의 형성이 실시간으로 쉽게 추적될 수 있는 반면, 다른 UV 가교 리간드(예: 페닐 아자이드, 디아지린)는 무시할 수 있는 형광 방출로 인해 현미경 이미징으로 시각화되지 않을 것으로 예상하였다.
이를 확인하기 위하여, 실시예 4와 기재된 방식과 유사한 방법으로 형광 이미지를 관찰하고, 웨스턴 블랏 실험을 마우스 항-V5 항체 (Invitrogen, Cat. No. R960-25, 1:5000 희석액)를 이용하여 진행하였다. 예상대로 형광 이미징 실험 결과, 녹색 형광 VL1이 핵 내막(Lamin-AC), Cajal 몸체(p80-coilin), SAM68 몸체(HNRNPD), 미토콘드리아 기질(MRPL12), 미토콘드리아 외막(Tom20), 소포체 막(SEC61B) 및 스트레스 과립(G3BP1)을 포함하여, 다양한 세포 내 구획에서 다양한 HaloTag 단백질을 표적으로 하는 것으로 나타났다 (도 5a).
웨스턴 블롯 결과에서는 다양한 세포내 소기관의 모든 POI-HaloTag 구조가 청색 LED 조명 아래에서 VL1과 가교 생성물을 생성함을 보여주었다(도 5b). 흥미롭게도 각 POI-HaloTag은 국소적인 미세 환경을 반영할 수 있는 고유한 VL1 가교 패턴을 보여주었다. 이러한 결과는 VL1이 우수한 막 투과성을 가지며 미토콘드리아 기질 단백질(즉, MRPL12)과 같은 세포 소기관의 내부 부분에 도달하여 청색 LED 광 활성화로 각 구획에서 상호 작용하는 단백질을 포착할 수 있음을 뒷받침한다.
실시예 6. 스트레스 조건에서 광가교 화합물의 상호작용체의 일시적 공간 변화 식별
VL1이 스트레스 조건에서 상호작용체의 일시적 공간 변화를 포착할 수 있는 안정성을 가지고 있는지 확인하기 위하여 (도 6a) HaloTag-EBFP-V5-G3BP1(이하, HaloTag-G3BP1)을 발현하는 HEK293T 세포를 준비하였다.
상기 세포를 VL1과 함께 1시간 동안 인큐베이션 한 후 세척하고, 아비산나트륨(As2O3, 500 μM) 처리에 의한 산화 스트레스 또는 열 스트레스 (43 ℃하에 1시간 동안 자극하였다. 이와 같은 자극에 의해 HaloTag-G3BP1은 이전 연구에서 알려진 바와 같이 G3BP1에 의한 스트레스 과립 (예: BFP 및 항-V5 항체)을 형성하였으며 HaloTag 표적 VL1 형광도 BFP 및 항-V5 신호와 잘 오버랩되었다 (도 6b).
이와 같은 결과는 VL1이 다양한 자극 하에서 목적 단백질(Protein of interest, POI)의 실시간 시각화에 사용될 수 있음을 나타낸다. 또한 VL1 매개 광가교 생성물이 스트레스 조건(예: 아비산 나트륨, 열 충격)에 의해 변화되었음을 확인함으로써 본 발명이 환경 변화에 따른 G3BP1 상호작용체의 변화를 포착할 수 있음을 확인하였다 (도 6c, 6d).
한편, G3BP1 상호작용체의 변화는 G3BP1-GFP 및 GFP-결합 단백질(GBP)-HaloTag 시스템에서 재현 가능하였으며 (데이터 미도시), 따라서 GFP 태그는 지정된 목적 단백질(POI)의 기존 복제 라이브러리의 빠른 상호작용체 매핑에 유용할 수 있음을 알 수 있었다. VL1을 이용하여 청색 LED 광에서 활성화하는 본 발명은 UV 조명 아래에서 UL2를 사용하는 것과 비교하여 더 많은 가교 단백질을 보여주었으며, 이는 주로 UV 광보다 가시광선의 우수한 세포 침투에 기인하는 것으로 해석된다.
실시예 7. 살아있는 세포에서 SARS-CoV-2-뉴클레오캡시드(N) 단백질-HaloTag을 이용한 상호작용체 동정
본 발명 시스템을 이용하여 SARS-CoV-2N의 숙주 내 상호작용체를 규명하고자 하였다. SARS CoV-2N은 숙주 세포에서 바이러스 게놈의 복제 및 재포장에 중요한 역할을 하는 RNA 결합 도메인을 가진 바이러스 입자의 핵심 단백질 구성 요소 중 하나로, 바이러스와 상호작용하는 숙주 단백질에 대한 연구는 숙주 세포에서 바이러스 복제 메커니즘을 이해하는데 필수적이다. SARS-CoV-2N의 숙주 상호작용체에 대한 종래 연구방법은 주로 친화성 정제 질량 분석법(AP-MS) 및 기존의 근접 라벨링 방법에 의한 것이었다. 그러나 AP-MS 데이터는 용해 조건에 의한 인공적인 상호작용 파트너를 나타낼 수 있으며, 기존 근접 라벨링 방법은 앞서 언급한 확산 라벨링 특성으로 인해 비생리적 상호작용 파트너가 식별되기도 한다.
따라서 본 발명에서는 SARS-CoV-2N의 물리적 상호작용에 대한 또 다른 중요한 정보를 제공할 수 있을 것으로 예측하고, 인간 세포에서 SARS-CoV-2N의 숙주 상호작용 네트워크를 규명하기 위하여, SARS-CoV-2N-V5-HaloTag-AP 컨스트럭트(이하 SARS-CoV-2N-HaloTag)를 클로닝하고 HEK293T-rex 세포에서 이를 안정적으로 발현하는 세포주를 제작하였다.
순차적 이미징 및 웨스턴 블롯 실험에서 VL1은 SARS-CoV-2N-HaloTag 단백질을 성공적으로 표적화하고 인접 단백질을 가교하였다 (도 7a, 7b). 더욱이, SARS CoV-2N-HaloTag을 발현하는 거의 모든 세포는 VL1으로 표지되었는데, 따라서 후처리된 바이오틴-HTL은 VL1 처리 후 SARS-CoV-2N-HaloTag와 무시할 정도로 접합되었다 (도 8a, 8b). 또한, VL1은 청색 LED 조명에서 다른 광가교 리간드(VL2 및 UL 프로브)와 비교하여 SARS-CoV-2N-HaloTag에 특히 강력한 가교 효율을 나타내었으며(도 8c - 8f), SARS CoV-2N-HaloTag에 대한 광가교 반응은 청색 LED 조명 처리 후 1분 이내에 효율적으로 완료되었다 (도 8g, 8h).
SARS-CoV-2N의 숙주 세포 내 물리적 상호작용체를 식별하고자, 위와 같은 구성 또는 대조군에 대해 LC-MS/MS 분석을 위한 3중 (triplicate) 생물학적 샘플을 준비하였다 (도 9).
구체적으로, 가교된 생성물의 질량 분석을 위하여 HEK293T 세포를 100Φ접시에서 60-70%가 될 때까지 성장시켰다. 8,000ng의 플라스미드 DNA를 PEI 트랜스펙션 시약을 사용하여 트랜스펙션 시키고 배지를 3시간 후 전체 배지로 교체하였다. 트랜스펙션 24 시간 후, 10μM VL1과 함께 1시간 동안 인큐베이션하고 10분 동안 청색 LED에서 가교하기 전에 차가운 DPBS로 3회 세척하였다. 세포를 DPBS에서 모아 만들어진 펠렛을 RIPA 버퍼로 용해시키고, 용해물을 실온에서 12시간 동안 재조합 야생형 BirA 용액 (10μM BirA, 10μM 바이오틴, 200μM ATP 및 500μM MgCl2)을 사용하여 in vitro 바이오틴화하였다. 유리 바이오틴을 제거하기 위하여 용해물을 amicon 필터에 로딩하고 4 x 15분 동안 12,000 x g에서 원심분리하였다. 1 x TBS 버퍼를 최대 400μL의 농축 용해물에 첨가한 다음, 100μL의 세척된 스트렙타비딘 비드를 첨가하였다. 10분 인큐베이션 후, TBS 중 2㎖ SDS를 최종 농도가 2 - 10%가 되도록 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션하였다. 비드를 TBS 버퍼에서 2% SDS로 4회 세척하고 37℃에서 1시간 동안 50mM ABC 버퍼에서 10mM DTT와 함께 인큐베이션하였다. 알킬화는 암 조건의 37℃에서 ABC 버퍼 중 55mM IAM으로 수행되었다. 1시간 인큐베이션 후, 용액을 200μL의 트립신 용액(2㎍ 트립신, 50mM ABC 완충액 중 1mM CaCl2)으로 교체하고 37℃에서 12시간 동안 혼합하였다. 그런 다음, 상층액을 zip-tip(thermofisher, 87784)을 사용하여 탈염하고, 용출된 분획을 speed vac을 사용하여 건조한 후 LC-MS/MS에 로드할 때까지 냉동고에 보관하였다.
펩타이드는 나노전자분무 이온 소스가 장착된 Thermo-Scientific®Q Exactive Plus로 분석되었다. C18 역상 HPLC 컬럼(500 mm × 75 μm i.d.)을 사용하여 2.4?17.6% 아세토니트릴/0.1% 포름산 구배를 사용하여 300nL/min의 유속으로 120분 동안 펩티드 혼합물을 분리하였다. MS/MS 분석을 위해 내부 잠금 질량 (internal lock mass)이 있는 200m/z에서 70K의 분해능에서 Orbitrap 분광기를 사용하여 전구체 이온 스캔 MS 스펙트럼(m/z 350 - 2000)을 획득하였다. HCD 스펙트럼에 대해 m/z 200에서 17,500의 분해능이 설정되었고 15개의 가장 집중적인 이온이 더 높은 에너지 충돌 해리(HCD)에 의해 분리 및 단편화되었다. 단백질 식별을 위해 Scaffold(버전 4.11.0, Proteome Software Inc., Portland, OR)를 사용하여 MS/MS 기반 펩타이드 및 단백질 식별을 검증하였다.
Scaffold Local FDR 알고리즘에 의해 95.0% 이상의 확률로 확립될 수 있는 경우 펩타이드 식별이 허용되었다. 단백질 식별은 99.0% 이상의 확률로 확립될 수 있고 적어도 2개의 식별된 펩타이드를 포함하는 경우 허용되었다. 단백질 확률은 Protein Prophet 알고리즘에 의해 할당되었다. 5 유사 펩타이드를 함유하고 있어 MS/MS 분석만으로는 감별이 불가능한 단백질들을 간결성의 원칙(principlesof parsimony)을 만족시키기 위해 분류하였다.
데이터베이스 검색에서 탠덤 질량 스펙트럼은 Proteome Discoverer(버전 2.2, Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA)에 의해 추출되었다. 모든 MS/MS 샘플은 Sequest(XCorr 전용)를 사용하여 분석되었다. Sequest는 트립신을 사용한 분해를 가정하여 Homo sapiens 단백질 서열 데이터베이스(42230개 항목, UniProt(http://www.uniprot.org/))를 검색하도록 설정되었다. 0.80 Da의 단편 이온 질량 허용 오차와 10.0 PPM의 모 이온 허용 오차로 Sequest를 검색하였다. 시스테인의 카르바미도메틸은 Sequest에서 고정된 변형으로 지정되었다. n-말단의 메티오닌과 아세틸의 산화는 Sequest에서 가변 변형으로 지정되었다. 볼케이노 플롯 분석의 경우, panda-view 소프트웨어6를 통해 누락된 값의 5가지 다중 대체를 이용하였다.
SARS-CoV-2N-HaloTag의 VL1-가교된 생성물을 농축하기 위하여, SARS-CoV-2N-HaloTag 구조의 C-말단에 수용체 펩타이드(AP, Avitag로도 알려짐)를 유전적으로 접합시켜, 정제된 바이오틴 리가제(BirA)를 사용한 in vitro 바이오틴화 반응 후 스트렙타비딘(SA) 비드에서 농축될 수 있도록 하였다. 혼합물에 BirA와 biotin/ATP를 첨가하여 N-HaloTag을 바이오틴화 하였다. 바이오틴과 스트렙타비딘 사이의 펨토몰 수준의 결합 친화도에 따라, 스트렙타비딘-비드 농축 후 바이오틴화 된 N-HaloTag은 통과 분획에 전혀 남아 있지 않거나 무시할 수 있는 수준이었다. 이러한 강력한 결합 친화력이 농축 단계에서 10% 도데실 황산나트륨(SDS) 버퍼를 배양 및 세척 완충제로 사용할 수 있도록 하였으며, 이는 미끼 단백질 (bait protein)의 비공유 결합제를 효율적으로 제거하는데 유용하였다. 실제로, 바이오틴화 되지 않은 샘플과 비교하여 VL1 가교 및 바이오틴화 되지 않은 SARS-CoV-2N-HaloTag-AP 샘플에서는 단지 4개의 단백질 (미끼 단백질 포함)만이 상당히 농축되었다. 대조적으로, VL1-가교 및 바이오틴화된 SARS-CoV-2N-HaloTag-AP 샘플 (즉, +VL1, +BirA)은 161개의 단백질이 확인되어, 수많은 VL1-가교 단백질이 SARS-CoV-2N-HaloTag-AP 단백질과 함께 살아남았다.
HaloTag에 고유한 친화도를 가지는 일부 알려지지 않은 내인성 단백질이 VL1과 가교될 수도 있다는 가능성 때문에, 대조군으로 유리 HaloTag-AP 구조에 대해서도 VL1 결합 친화도를 확인하고자 청색 LED 조명 아래에서 VL1 가교물을 생성하였다.
동일한 질량분석 방법에 따른 HaloTag-AP 결과는 상세한 배경 단백질 정보를 제공하였으며, 이를 근거로 SARS-CoV-2N-HaloTag-AP의 VL1 가교 단백질 정보를 필터링하여 N-상호작용체를 얻을 수 있었다. 두 샘플에서 MS1 신호 강도를 비교하여 VL1-가교된 N-HaloTag 샘플에서 독점적인 14 단백질(G3BP1, G3BP2, STAU2, AHNAK, ANKRD17, PRKRA, CEP85, FBXO7, FNDC3A, GOLGA3, TSFM AIP, USP10, USP47)을 확인하였다 (그룹 I, 도 7d). 또한, N-HaloTag과 HaloTag 사이의 중복 단백질(그룹 II에서 IV) 중 다른 8개 단백질(ERCC6L, USP24, GSK3B, STAU1, EIF2AK2, VIM, AHCY 및 DHX30)이 유의하게 VL1-가교된 HaloTag-AP 샘플보다 VL1-가교된 N-HaloTag 샘플에서 풍부하였다 (도 7e). 이 상대적 정량 분석에서 총 22개의 단백질을 "N-상호작용체"로 선별할 수 있었다 (도 7f). 이들 단백질 중 11개 (USP10, G3BP1, ANKRD17, STAU2, AHNAK, G3BP2, PRKRA, FNDC3A, STAU1, EIF2AK2 및 DHX30)는 RBP로 특성화된다. N-상호작용체에서 RBP의 이와 같은 비율 (50%, 11/22)은 인간 프로테옴(~5%, 1072/20,380)과 비교하여 상당히 높은 수준이었다. 특히, N 상호작용체 22개 단백질 중 7개 (32%)는 바이러스 RNA가 상주할 수 있는 스트레스 과립(예: G3BP1, G3BP2, STAU1, STAU240, USP10, PRKRA, EIF2AK2 및 CEP85)에서도 발견되는데, 이 데이터는 SARS-CoV-2N이 스트레스 과립에 있는 임의의 RBP 또는 임의의 상주 단백질과 난잡하게 상호작용하지는 않는다는 것을 시사한다. 한편, 잘 알려져 있는 스트레스 과립 상주 RBP인 PABPC1 및 THRAP3은 N-HaloTag-AP에는 가교되지 않았지만 유리 HaloTag-AP와 가교된 샘플에서 풍부하였다.
SARS-CoV-2N과 N-상호작용체가 VL1 매개 가교 반경 내에 있는지 검증하기 위하여, 기존에 RBP 및 스트레스 과립 마커 단백질로 잘 알려진 G3BP1을 선택하였다. 전체 HaloTag을 G3BP1의 N-말단에서 접합시킨 HaloTag-G3BP1 컨스트럭트를 제작하였다. 상기 컨스트럭트는 기저 상태에서 세포질에서 발현되었고, VL1 고정(anchoring)도 이러한 양상을 변화시키지 않았으나 (도 7g), SARS-CoV-2N-GFP가 공동 발현될 때 HaloTag-G3BP1은 과립을 형성하고 SARS-CoV-2N와 공동 국소화되는바, 이는 G3BP1과 SARS-CoV-2N이 근접 거리에 있음을 의미한다 (도 7h).
웨스턴 블롯 결과에서도, HaloTag-G3BP1이 청색 LED 조명 하에서 SARS-CoV-2N-GFP와 VL1-가교된 생성물을 형성하고 SARS-CoV-2N-HaloTag도 G3BP1-GFP와 VL1-가교된 생성물을 형성함을 보여주었다 (도 7i, 도 5h).
G3BP1-GFP의 공동 발현 여부에 따라 N-Halotag-TurboID-Flag를 사용하여 N 단백질에 대한 항-Flag IP를 수행한 결과, 웨스턴 블롯 후 농축 분획에서 G3BP1을 관찰할 수 있었지만 통과 분획에서는 GFP 신호가 관찰되지 않았는데, 이와 같은 결과로부터 G3BP1이 SARS-CoV-2N과 물리적으로 상호작용함을 알 수 있었다. 이는 G3BP1이 SARS-CoV-2N의 다양한 검증 방법을 기반으로 물리적 상호 작용 파트너임을 보여주는 최근 간행물과도 일치한다 (Gordon, D. E. et al., Nature 2020, 583, 459-468; Nabeel-Shah, S. et al., bioRxiv 2020, 2020.2010.2023.342113).
위와 같이 가교된 생성물은 HaloTag-G3BP1 컨스트럭트 특이적으로 생성되었음을 추가로 확인되었는데 (즉, G3BP1-HaloTag에서는 생성되지 않았음)(도 10a), 이는 G3BP1과 SARS-CoV-2N 상호작용이 G3BP1의 N-말단 도메인에서 이루어진다는 것을 의미한다. 또한, Halotag-Flag-G3BP1에서 사용된 링커(11 아미노산) 보다 긴 링커(33 아미노산)를 가지는 haloTag-2xTEV-Flag-G3BP1 컨스트럭트를 사용하는 경우 거의 동일한 가교 결과가 얻어지는바, 이 시스템은 HaloTag와 POI 사이의 링커 크기와 무관한 것을 알 수 있었다(도 10b). 대조적으로, VL2 (PEG3 링커, VL1보다 3.43 Å 더 김)를 사용하는 경우에는 HaloTag-2xTEV-Flag-G3BP1 또는 Halotag-Flag-G3BP1에서 수행될 때 VL1을 사용하여 얻은 결과와 비교하여 다른 가교 결과가 얻어졌다(도 10b).
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다
본 발명에 따른 신규 화합물은 목적 단백질 또는 목적 핵산과 결합시킴으로써 가시광선 조사에 의해 근위 단백질 또는 펩타이드에 광가교 되는 특성에 의해, 목적 단백질 또는 목적 핵산과 물리적 상호작용하는 단백질 또는 펩타이드와 광가교 될 수 있는바, 종래 근접 라벨링 기술의 한계인 확산적인 라벨링(diffusive labeling)을 생체에 안전한 방식인 가시광선 조사에 의한 광가교로 극복할 수 있고, 단백질 상호작용체 식별의 정확도를 향상시킬 수 있는 장점이 있다.

Claims (15)

  1. 하기 [화학식 1]로 표시되는 화합물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2022005350-appb-img-000008
    상기 [화학식 1]에서,
    X는 C, N, O, S, Si, 또는 하기 [화학식 2]로 표시되는 것을 특징으로 하며,
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2022005350-appb-img-000009
    상기 [화학식 2]에서,
    n은 0 내지 10의 정수이고,
    X는 직쇄 또는 분쇄형의 -(CH2)m-, H 또는 할로겐이며, 상기 m은 1 내지 20의 정수이고,
    R은 H, 할로겐 또는 -CH3이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 화합물은 하기 [화학식 3]으로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 화합물:
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2022005350-appb-img-000010
    상기 [화학식 3]에서, n은 1 내지 5의 정수이다.
  3. 제1항에 있어서, 상기 화합물은 단백질 결합능이 있는 것을 특징으로 하는, 화합물.
  4. 제1항에 있어서, 목적 단백질 또는 목적 핵산과 결합된 상기 화합물은 상기 목적 단백질 또는 목적 핵산과 상호작용하는 단백질 또는 펩타이드에 광가교 결합하는 것을 특징으로 하는, 화합물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 목적 단백질은 항체 또는 펩타이드인 것을 특징으로 하는, 화합물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 목적 핵산은 DNA 또는 RNA 인 것을 특징으로 하는, 화합물.
  7. 제4항에 있어서, 상기 화합물은 가시광선 조사에 의해 상기 목적 단백질 또는 목적 핵산과 상호작용하는 단백질 또는 펩타이드에 광가교 결합하는 것을 특징으로 하는, 화합물.
  8. 제4항에 있어서, 상기 광가교 결합의 반경(radius)는 0.01 내지 1 nm인 것을 특징으로 하는, 화합물.
  9. 다음 단계를 포함하는 목적 단백질 또는 목적 핵산을 근접하는 상호작용 단백질 또는 펩타이드와 광가교하는 방법:
    (a) 목적 단백질 또는 목적 핵산과 결합되어 있는 제1항의 화합물을 상기 목적 단백질 또는 상기 목적 핵산과 상호작용하는 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 시료에 처리하는 단계; 및
    (b) 가시광선을 처리하는 단계.
  10. 제9항에 있어서, 상기 목적 단백질 또는 목적 핵산은 (i) 내재적으로 존재하는 아민기 또는 외부에서 도입된 아민기, 또는 (ii) 내재적으로 존재하는 티올기 또는 외부에서 도입된 티올기를 통하여 제1항의 화합물과 결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 목적 단백질 또는 목적 핵산은 단백질 태그를 통하여 결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 방법.
  12. 다음 단계를 포함하는 목적 단백질의 상호작용 단백질을 식별하는 방법:
    (a) 세포 내에서 목적 단백질을 발현시키는 단계;
    (b) 상기 세포에 제1항 화합물을 처리하는 단계;
    (c) 상기 세포에 가시광선을 조사하는 단계; 및
    (d) 상기 세포를 용해시켜 상기 화합물과 광가교 결합된 단백질을 목적 단백질의 상호작용 단백질로 식별하는 단계.
  13. 제12항에 있어서, 상기 목적 단백질은 에피토프 펩타이드 태그(tag)가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 (d) 단계에서 상기 목적 단백질은 에피토프 펩타이드 특이적 항체로 침강시켜 상기 화합물과 광가교 결합된 단백질을 목적 단백질의 상호작용 단백질로 식별하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 (d) 단계는 질량분석법에 의해 식별되는 것을 특징으로 하는, 방법.
PCT/KR2022/005350 2021-04-13 2022-04-13 가시광선으로 광가교 결합되는 신규 화합물 및 이의 용도 WO2022220581A1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP22728030.2A EP4102227A4 (en) 2021-04-13 2022-04-13 NEW COMPOUND FOR PHOTOCROSSLINKING BY VISIBLE LIGHT AND ITS USE
US17/784,298 US20240182425A1 (en) 2021-04-13 2022-04-13 Novel compounds photo-crosslinked by visible light and uses thereof

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2021-0047647 2021-04-13
KR1020210047647A KR102578912B1 (ko) 2021-04-13 2021-04-13 가시광선으로 광가교 결합을 일으키는 신규 화합물 및 이의 용도
KR20210151263 2021-11-05
KR10-2021-0151263 2021-11-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022220581A1 true WO2022220581A1 (ko) 2022-10-20

Family

ID=83640517

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2022/005350 WO2022220581A1 (ko) 2021-04-13 2022-04-13 가시광선으로 광가교 결합되는 신규 화합물 및 이의 용도

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20240182425A1 (ko)
EP (1) EP4102227A4 (ko)
WO (1) WO2022220581A1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012078559A2 (en) * 2010-12-07 2012-06-14 Yale University Small-molecule hydrophobic tagging of fusion proteins and induced degradation of same
WO2014109985A1 (en) * 2013-01-14 2014-07-17 The Regents Of The University Of Michigan Fluorogenic dendrimer reporters and related methods of use

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10088491B2 (en) * 2013-03-15 2018-10-02 Lawrence Livermore National Security, Llc Methods for the selective sequestration of alkyne-presenting molecules and related compositions and methods

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012078559A2 (en) * 2010-12-07 2012-06-14 Yale University Small-molecule hydrophobic tagging of fusion proteins and induced degradation of same
WO2014109985A1 (en) * 2013-01-14 2014-07-17 The Regents Of The University Of Michigan Fluorogenic dendrimer reporters and related methods of use

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BORRA, S. ET AL., ORG BIOL. CHEM., vol. 17, 2019, pages 5971 - 5981
BRACHET, E. ET AL., CHEM SCI, vol. 6, 2015, pages 987 - 992
GORDON, D. E. ET AL., NATURE, vol. 583, 2020, pages 459 - 468
KAMARUDDIN MOHD AIZUDDIN; UNG PHUC; HOSSAIN MOHAMMED IQBAL; JARASRASSAMEE BOONYARIN; O’MALLEY WILLIAM; THOMPSON PHILIP; SCAN: "A facile, click chemistry-based approach to assembling fluorescent chemosensors for protein tyrosine kinases", BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS, ELSEVIER, AMSTERDAM NL, vol. 21, no. 1, 1 January 1900 (1900-01-01), Amsterdam NL , pages 329 - 331, XP029121260, ISSN: 0960-894X, DOI: 10.1016/j.bmcl.2010.11.005 *
MISHRA PRATYUSH KUMAR, KANG MYEONG-GYUN, LEE HAKBONG, KIM SEUNGJOON, CHOI SUBIN, SHARMA NIRMALI, PARK CHEOL-MIN, KO JAEWON, LEE CH: "A chemical tool for blue light-inducible proximity photo-crosslinking in live cells", CHEMICAL SCIENCE, ROYAL SOCIETY OF CHEMISTRY, UNITED KINGDOM, vol. 13, no. 4, 26 January 2022 (2022-01-26), United Kingdom , pages 955 - 966, XP055977448, ISSN: 2041-6520, DOI: 10.1039/D1SC04871F *
ZENG YAN-SYUN, GAO RUO-CING, WU TING-WEI, CHO CHIEN, TAN KUI-THONG: "Fluorescent Probe Encapsulated in SNAP-Tag Protein Cavity To Eliminate Nonspecific Fluorescence and Increase Detection Sensitivity", BIOCONJUGATE CHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, US, vol. 27, no. 8, 17 August 2016 (2016-08-17), US , pages 1872 - 1879, XP055977442, ISSN: 1043-1802, DOI: 10.1021/acs.bioconjchem.6b00290 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP4102227A4 (en) 2024-10-23
EP4102227A1 (en) 2022-12-14
US20240182425A1 (en) 2024-06-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2018062866A2 (en) CELL-PERMEABLE (CP)-Cas9 RECOMBINANT PROTEIN AND USES THEREOF
WO2016028036A1 (en) Advanced macromolecule transduction domain (amtd) sequences for improvement of cell-permeability, polynucleotides encoding the same, method to identify the unique features of amtds comprising the same, method to develop the amtd sequences comprising the same
WO2012128580A1 (en) Water-soluble polypeptides comprised of repeat modules, method for preparing the same and method for a target-specific polypeptide and analysis of biological activity thereof
WO2018074884A1 (ko) 재조합 단백질 및 그의 용도
WO2014077648A1 (ko) 인간 및 마우스 ｌ１ｃａｍ 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
WO2020111449A1 (ko) 보툴리눔 독소 활성을 결정하는 세포 기반 방법
WO2020251284A1 (ko) 아프리카 돼지 열병 바이러스 유래 p72, p104, p205 단백질 절편 및 이의 용도
WO2022220581A1 (ko) 가시광선으로 광가교 결합되는 신규 화합물 및 이의 용도
Yang et al. A bifunctional amino acid to study protein–protein interactions
WO2019182417A1 (ko) 황열 바이러스 유래 ns1 단백질, 이에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도
Lapeyre et al. Aryldithioethyloxycarbonyl (Ardec): a new family of amine protecting groups removable under mild reducing conditions and their applications to peptide synthesis
WO2022065913A1 (ko) 요산산화효소-알부민 접합체, 그 제조방법 및 용도
WO2009107971A2 (ko) 포스파티딜세린과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 및 이의 용도
WO2020080672A1 (ko) Pd-l1과 pd-1 간 상호작용 분석 방법, pd-l1과 pd-1 간 상호작용 저해제 및 상기 저해제의 스크리닝 방법
WO2013052851A9 (en) Methods and compositions for polypeptide and protein labeling using lipoic acid ligases specific to resorufin
WO2024049154A1 (ko) 비방사성 동위원소로 치환된 페놀 화합물 및 이의 용도
WO2021096263A1 (ko) 세포 이미징 조성물, 및 이를 이용한 세포 물질 이미징 방법
WO2016117949A1 (ko) 포스파티딜이노시톨포스페이트 결합 물질의 세포 사멸 검출 용도
WO2017026776A1 (en) Improved cell-permeable reprogramming factor (icp-rf) recombinant protein and use thereof
WO2020209645A1 (ko) 프로그램화된 세포 사멸 단백질 리간드-1 (pd-l1)에 대한 항체 및 이의 용도
WO2013022299A2 (ko) 물질의 고집적 디스플레이를 이용하여 생리적인 조절을 유도하는 방법
WO2020085767A1 (ko) 암세포 사멸 조성물 및 이의 용도
WO2015088256A1 (ko) 광견병 바이러스를 중화시킬 수 있는 결합 분자
WO2023167564A1 (ko) 티올 반응성 에디티브를 이용한 항체-약물 컨쥬게이트의 제조 수율을 높이는 방법
WO2020085563A1 (ko) 인간 순수 만능줄기세포에 특이적인 단일클론항체 n16-f2

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 17784298

Country of ref document: US

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2022728030

Country of ref document: EP

Effective date: 20220615

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22728030

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE