WO2009107971A2 - 포스파티딜세린과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 및 이의 용도 - Google Patents

포스파티딜세린과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 및 이의 용도 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a polypeptide that specifically binds to phosphatidylserine and its use, and more particularly, to a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, specifically binding to phosphatidylserine, its phosphatidylserine use,
  • the present invention relates to a phosphatidylserine detection method using the same, its use for detecting dead cells, its use for drug delivery, its therapeutic use for tumor disease, its imaging use, and the like.
  • Phosphatidylserine is an important marker for macrophages to recognize and eliminate apoptosis (Schlegel, RA et al., Cell Death and Differentiation, 2001, 8: 551-563; Lauber, K. et al., Mol Cell 2004, 14: 277-287 Henson, PM et al., Curr Biol 2001, 11: R795-805 Grimsley, C. et al., Trends Cell Biol. 2003, 13: 648-656).
  • phosphatidylserine is present inside the cell membrane but is exposed to the outside of the cell membrane when the cell receives a death signal or when erythrocytes age (Fadeel, B.
  • Macrophages are recognized through cell surface receptors to cause phagocytosis (Fadok, VA et al., J immunol 1992, 148: 2207-2216; Fadok, VA et al., Nature 2000, 405: 85-90; Park , SY et al., Cell Death and Differentiation, in press).
  • phosphatidylserine is also exposed to the outside of the cell membrane under various pathological conditions (Zwaal, R.F.A. et al., Cell.Mol.Life Sci 2005, 62: 971-988). Examples include Scott syndrome, antiphospholipid syndrome, sickle cell anemia, thalassemia, stomatocytosis, uremia, and kidney stones. kidney stone disease, diabetes, hyperglycemia, viral and microbial infections, malaria, pre-eclampsia, hyperbilirubinemia, neoplasia, etc. have. In particular, many tumor cells show increased expression of phosphatidylserine outside of the cell membrane (Utsugi, T.
  • Tumor tissue also releases small blood vessels that expose phosphatidylserine to the outside of the cell membrane (Ran, S. et al., Cancer Res. 2002, 62: 6132-6140; Zwaal, RFA et al., Blood. 1997, 89 : 1121-1132).
  • phosphatidylserine is also observed in non-killing cells among various intracellular physiological processes. Examples include platelet activation, muscle cell fusion, syncytiotrophoblast formation, immunoglobulin-dependent stimulation of mast cells, and T cell migration.
  • platelet activation e.g., platelet activation, muscle cell fusion, syncytiotrophoblast formation, immunoglobulin-dependent stimulation of mast cells, and T cell migration.
  • blocking phosphatidylserine which is expressed during the activation of platelets, may have a therapeutic effect by inhibiting the thrombosis process that may be formed by atherosclerosis (Cederholm, A. and Frosteg, J.). , Ann NY Acad Sci. 2007, 1108: 96-103 Cederholm, A. and Frosteg, J., Drug News Perspect. 2007 20 (5): 321-6). Therefore, these roles of phosphatidylserine have been suggested as phosphatidylserine as a target material for diagnosis, treatment, and treatment tracking, especially in various situations including neoplastic and inflammatory diseases.
  • proteins that can effectively bind phosphatidylserine may also be used to augment the effects of apoptotic cell-based vaccines by interfering with phosphatidylserine recognition and immunosuppressive clearance of killer cells. .
  • the present inventors have studied to search for a new protein or fragment thereof capable of targeting phosphatidylserine, and thus, the present invention was confirmed that the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 can specifically bind to phosphatidylserine.
  • SEQ ID NO: 1 the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 can specifically bind to phosphatidylserine.
  • the present invention provides a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, specifically binding to phosphatidylserine.
  • the present invention provides a polynucleotide encoding the polypeptide.
  • the present invention provides a composition for detecting phosphatidylserine comprising the polypeptide as an active ingredient.
  • the present invention provides the use of the polypeptide for the detection of phosphatidylserine.
  • the present invention is a mixture of phosphatidylserine after mixing the polypeptide with a sample, after removing the unbound or nonspecific bound polypeptide and confirming the binding and location of the polypeptide and the sample A detection method is provided.
  • the present invention provides a composition for detecting apoptotic cells comprising the polypeptide as an active ingredient.
  • the present invention provides the use of the polypeptide for detecting apoptotic cells.
  • the present invention provides a composition for drug delivery comprising the polypeptide as an active ingredient.
  • the present invention provides the use of said polypeptide for drug delivery.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of tumor diseases comprising the polypeptide and the anti-tumor disease agent coupled thereto as an active ingredient.
  • the present invention provides the use of the polypeptide and an anti-tumor disease agent bound thereto for the preparation of a therapeutic agent for tumorous disease.
  • the present invention provides a composition for imaging a tumor disease site comprising the polypeptide as an active ingredient.
  • the present invention provides the use of said polypeptide for imaging of a tumorous disease site.
  • the present invention provides a composition for diagnosing diseases such as Scott syndrome, including the polypeptide as an active ingredient.
  • the present invention provides the use of the polypeptide for the diagnosis of diseases such as Scott syndrome.
  • the present invention focuses on the fact that the polypeptide having the amino acid represented by SEQ ID NO: 1 specifically binds to phosphatidylserine exposed on the cell surface, and has a new sequence of polypeptide having the amino acid represented by SEQ ID NO: 1 and use thereof. It is characterized by providing a composition for detecting phosphatidylserine comprising a polypeptide.
  • the polypeptide of the present invention refers to a polypeptide that specifically binds to phosphatidylserine and has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Peptide fragments of the present invention include all kinds of peptides, polypeptides, proteins, peptide replicas, compounds and biologics, and have the activity of specifically binding to phosphatidylserine expressed on the surface of cells such as tumor cells. Say that.
  • Polypeptides of the invention may be derived from nature and may be synthesized using known peptide synthesis methods.
  • the present invention provides a polynucleotide having a nucleotide sequence encoding the polypeptide of the present invention.
  • the present invention provides a vector having a nucleotide sequence encoding a polypeptide of the present invention and a transformant transformed with the vector.
  • Vectors of the invention include, but are not limited to, plasmid vectors, cosmid vectors, bacteriophage vectors, viral vectors, and the like.
  • Vectors of the present invention may be conventional cloning vectors or expression vectors, which may be used for membrane targeting or secretion in addition to expression control sequences such as promoters, operators, initiation codons, termination codons, polyadenylation signals and enhancers (promoter). It includes a signal sequence or leader sequence and can be prepared in various ways depending on the purpose.
  • the vector also includes a selection marker for selecting a host cell containing the vector and, in the case of a replicable vector, the origin of replication.
  • Transformation with the vector can be carried out by transformation techniques known to those skilled in the art.
  • microprojectile bombardment, electroporation, electroporation, calcium phosphate (CaPO 4 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, PEG-mediated fusion, microinjection (microinjection), and liposome-mediated method (liposome-mediated method) may be used, the transformant is E.
  • coli Esscherichia coli
  • Bacillus subtilis Bacillus subtilis
  • Streptomyces Streptomyces
  • Pseudomonas Pseudomonas
  • Proteus Mira Billy's Proteus mirabilis
  • Staphylococcus Staphylococcus
  • Agrobacterium tumefaciens Tome Pacific Enschede (Agrobacterium tumefaciens)
  • Agrobacterium tumefaciens Tome Pacific Enschede
  • the present inventors conducted various experiments to confirm the function of the polypeptide selected as specifically binding to phosphatidyl serine, and as a result, the peptide of the present invention specifically expresses phosphatidylserine expressed on the surface of aged and dead cells. Recognition confirmed the mediation of adhesion and phagocytosis of these cells. In addition, it can be seen that the peptide of the present invention specifically binds to tumor cells, thereby enabling tumor cell identification and imaging in vivo or ex vivo.
  • the peptide of the present invention can be used as a composition for detecting phosphatidylserine, and furthermore, it can be used as a diagnostic or therapeutic tracking agent for recognizing phosphatidylserine in tumor tissues, or in combination with a separate tumor treatment agent. It can be seen that it can be used as a pharmaceutical composition for preventing and treating diseases.
  • a phage that specifically binds to phosphatidylserine was screened using a commercial M13 phage library.
  • the phage binding specifically to phosphatidylserine was screened through a total of four rounds of screening.
  • peptides having an amino acid consensus sequence of CLSYYPSYC were mainly selected.
  • binding specificity of the selected phage to phosphatidylserine was confirmed. As a result, it was found that the selected phage specifically binds to phosphatidylserine, whereas the control phage hardly binds to phosphatidylcholine or phosphatidylserine. In addition, the selected phage specifically bound to phosphatidylserine liposomes, and the binding of phosphatidylserine was inhibited by the treatment of Annexin V.
  • the selected phage clone or peptide of the present invention specifically binds to dead cells.
  • the selected phage clone and the peptide of the present invention were found to bind well with phosphatidylserine exposed to the dead cells.
  • the peptide of the present invention is induced in the implanted tumor site and can be imaged.
  • the peptide of the present invention was induced in tumor tissues, which can be confirmed by labeling.
  • polypeptide of the present invention specifically binds to phosphatidylserine to recognize and phagocytize dead cells and tumor cells in vivo.
  • the present invention provides a composition for detecting phosphatidylserine comprising the polypeptide of the present invention having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 as an active ingredient.
  • the invention also provides the use of a polypeptide of the invention having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 for the detection of phosphatidylserine.
  • polypeptide of the present invention specifically binds to phosphatidylserine, the present invention
  • the polypeptide of the present invention may be provided in a labeled state.
  • the detectable label may be provided in a link (eg, covalently or crosslinked).
  • the detectable label may be a colorase (e.g. peroxidase, alkaline phosphatase), radioisotope (e.g. 125 I, 32 P, 35 S), chromophore, luminescent or fluorescent material (e.g.
  • FITC Fluorescent Protein
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • EGFP Enhanced Green Fluorescent Protein
  • RFP Red Fluorescent Protein
  • DsRed Discosoma sp. Red fluorescent protein
  • CFP Cyan Fluorescent Protein
  • CGFP Cyan Green Fluorescent Protein
  • YFP Yellow Fluorescent Protein
  • Cy3, Cy5 and Cy7.5 super paramagnetic particles or ultrasuper paramagnetic particles.
  • Detection methods according to labels are well known in the art, but can be performed, for example, by the following method.
  • fluorescent material is used as a detectable label
  • immunofluorescence staining may be used.
  • a fluorescently labeled polypeptide of the present invention may be reacted with a sample to remove unbound or nonspecific binding products, and then fluorescence by peptides may be observed under a fluorescence microscope.
  • the absorbance may be measured by the color reaction of the substrate through the enzymatic reaction, and in the case of the radioactive substance, the radiation emission may be measured.
  • the polypeptide of the present invention can specifically bind to cells exposing phosphatidylserine to the cell surface, and since the phosphatidylserine is exposed to the cell membrane in apoptotic cells, the present invention provides the polypeptide of the present invention as an active ingredient. It provides a composition for detecting apoptotic cells comprising. In addition, the present invention provides the use of the polypeptide of the present invention for detecting dead cells. The detection of dead cells in the above is not limited thereto. For example, a method for detecting phosphatidylserine may be used, and as described above, identification, detection, and quantification of binding of the polypeptide of the present invention may be performed. To facilitate, the polypeptides of the invention can be provided in a labeled state. The detected result may be imaged according to a known imaging method according to the detection label.
  • the polypeptide of the present invention can specifically bind to a cell exposing phosphatidylserine to a cell surface, and thus can be used as an intelligent drug carrier for selectively delivering a drug to the cell.
  • the present invention provides a drug delivery composition comprising the polypeptide of the present invention as an active ingredient.
  • the present invention also provides the use of a polypeptide of the invention for drug delivery.
  • the drug delivery composition may be specific for a neoplastic disease.
  • Tumorous diseases are pathological symptoms caused by malignant tumors, but are not limited to, but are not limited to, colon cancer, lung cancer, stomach cancer, esophageal cancer, pancreatic cancer, gallbladder cancer, kidney cancer, bladder cancer, prostate cancer, testicular cancer, cervical cancer , Endometrial cancer, chorionic cancer, ovarian cancer, breast cancer, thyroid cancer, brain cancer, head and neck cancer, malignant melanoma, skin cancer, liver cancer, leukemia, lymphoma, multiple myeloma, chronic myelogenous leukemia myelogenous leukemia, neuroblastoma, aplastic anemia.
  • the effect of the drug may be exerted because the agent is selectively delivered only to tumor cells by the polypeptide of the present invention. It can increase and at the same time significantly reduce side effects on normal tissues.
  • Anti-tumor disease agents that can be linked to the polypeptides of the invention can be used without limitation as long as they are used in conventional tumor therapy.
  • paclitaxel doxorubicin, vincristine, daunorubicin, vinblastine, actinomycin-D, docetaxel, etoposide, teniposide , Bisantrene, homoharringtonine, Gleevec (STI-571), cisplain, 5-fluouracil, 5-fluouracil, adriamycin, methotrexate, Busulfan, chlorambucil, cyclophosphamide, melphalan, nitrogen mustard, nitrosourea, and the like.
  • the linking of the agent with the polypeptide of the present invention may be carried out through methods known in the art, such as covalent bonds, crosslinking, and the like. To this end, the peptide of the present invention may be chemically modified if necessary so long as its activity is not lost.
  • the amount of the peptide of the present invention included in the composition of the present invention may vary depending on the type and amount of the anticancer agent bound.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of neoplastic diseases as an active ingredient using the polypeptide of the present invention and the anti-tumor disease agent bound thereto.
  • the present invention also provides the use of a polypeptide of the invention and an anti-tumor disease agent bound thereto for the preparation of a therapeutic agent for a tumorous disease.
  • the anti-tumor disease agent, the binding method and the neoplastic disease in the pharmaceutical composition are as described above.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be provided by formulating in a suitable form together with the pure form of the polypeptide or a pharmaceutically acceptable carrier.
  • 'Pharmaceutically acceptable refers to a nontoxic composition which, when administered to humans, is physiologically acceptable and typically does not cause allergic or similar reactions such as gastrointestinal disorders, dizziness and the like.
  • Such carriers include all kinds of solvents, dispersion media, oil-in-water or water-in-oil emulsions, aqueous compositions, liposomes, microbeads and microsomes.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be formulated with a suitable carrier depending on the route of administration.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition according to the present invention is not limited thereto, but may be administered orally or parenterally.
  • Parenteral routes of administration include, for example, several routes such as transdermal, nasal, abdominal, muscle, subcutaneous or intravenous.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared in powder, granule, tablet, pill, dragee, capsule, liquid, gel according to a method known in the art together with a suitable oral carrier.
  • suitable oral carriers include sugars, including lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol and maltitol and starch, cellulose, starch including corn starch, wheat starch, rice starch and potato starch, and the like.
  • Fillers such as cellulose, gelatin, polyvinylpyrrolidone, and the like, including methyl cellulose, sodium carboxymethylcellulose, hydroxypropylmethyl-cellulose, and the like.
  • crosslinked polyvinylpyrrolidone, agar, alginic acid or sodium alginate and the like may optionally be added as a disintegrant.
  • the pharmaceutical composition may further include an anticoagulant, a lubricant, a humectant, a perfume, an emulsifier, and a preservative.
  • compositions of the present invention may be formulated according to methods known in the art in the form of injections, transdermal and nasal inhalants together with suitable parenteral carriers.
  • suitable parenteral carriers include, but are not limited to, solvents or dispersion media comprising water, ethanol, polyols (e.g., glycerol, propylene glycol and liquid polyethylene glycols, etc.), mixtures thereof and / or vegetable oils Can be.
  • suitable carriers include Hanks' solution, Ringer's solution, phosphate buffered saline (PBS) containing triethanol amine or sterile water for injection, 10% ethanol, 40% propylene glycol and 5% dextrose Etc. can be used.
  • PBS phosphate buffered saline
  • various antibacterial and antifungal agents such as parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thimerosal, and the like may be further included.
  • the injection may in most cases further comprise an isotonic agent such as sugar or sodium chloride.
  • transdermal administration means that the pharmaceutical composition is locally administered to the skin such that an effective amount of the active ingredient contained in the pharmaceutical composition is delivered into the skin.
  • transdermal administration means that the pharmaceutical composition is locally administered to the skin such that an effective amount of the active ingredient contained in the pharmaceutical composition is delivered into the skin.
  • the compounds used according to the invention may be pressurized packs or by means of suitable propellants, for example dichlorofluoromethane, trichlorofluoromethane, dichlorotetrafluoroethane, carbon dioxide or other suitable gas. It can be delivered conveniently from the nebulizer in the form of an aerosol spray. In the case of a pressurized aerosol, the dosage unit can be determined by providing a valve to deliver a metered amount.
  • gelatin capsules and cartridges for use in inhalers or blowers can be formulated to contain a mixture of the compound and a suitable powder base such as lactose or starch.
  • compositions according to the invention may contain one or more buffers (eg saline or PBS), carbohydrates (eg glucose, mannose, sucrose or dextran), stabilizers (sodium bisulfite, Sodium sulfite or ascorbic acid) antioxidants, bacteriostatic agents, chelating agents (eg EDTA or glutathione), adjuvants (eg aluminum hydroxide), suspending agents, thickening agents and / or preservatives (benzalkonium chloride , Methyl- or propyl-paraben and chlorobutanol).
  • buffers eg saline or PBS
  • carbohydrates eg glucose, mannose, sucrose or dextran
  • stabilizers sodium bisulfite, Sodium sulfite or ascorbic acid
  • bacteriostatic agents eg EDTA or glutathione
  • adjuvants eg aluminum hydroxide
  • suspending agents eg thickening agents and / or preservatives
  • compositions of the present invention may be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal.
  • compositions formulated in such a manner can be administered in a effective amount via several routes, including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous or intramuscular.
  • an 'effective amount' refers to an amount of a compound or extract that, when administered to a patient, enables the tracking of a diagnostic or therapeutic effect.
  • the dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention may be appropriately selected according to the route of administration, the subject to be administered, the target disease and its severity, age, sex weight, individual difference, and disease state.
  • the pharmaceutical composition comprising the polypeptide of the present invention may vary in the amount of the active ingredient depending on the extent of the disease, but usually an effective dose of 10 ⁇ g to 10 mg per single dose based on an adult May be repeated several times a day.
  • the polypeptide of the present invention specifically binds to phosphatidylserine, it may be usefully used for imaging an onset site of a neoplastic disease. Accordingly, the present invention provides a composition for imaging a tumor disease site comprising the polypeptide as an active ingredient. Also provided is the use of a polypeptide of the invention for imaging of a tumorous disease site.
  • the polypeptide may be provided in a labeled state to facilitate identification, detection, and quantification of binding, as described above.
  • phosphatidylserine is exposed to the outside of the cell membrane in a variety of pathological conditions in addition to the tumor disease (Zwaal, R.F.A. et al., Cell.Mol.Life Sci. 2005, 62: 971-988).
  • Examples include Scott syndrome, antiphospholipid syndrome, sickle cell anemia, thalathemia, stomatocytosis, uremia, and kidney stones. kidney stone disease, diabetes, hyperglycemia, viral and microbial infections, malaria, pre-eclampsia, hyperbilirubinemia, neoplasia, etc. have.
  • the present invention comprises Scott syndrome, antiphospholipid syndrome, sickle cell anemia, thalathemia, stomatocytosis, comprising the polypeptide of the present invention as an active ingredient.
  • Tomatocytosis uremia, kidney stone disease, diabetes, hyperglycemia, viral and microbial infections, malaria, pre-eclampsia, high
  • a composition for diagnosing a disease selected from the group consisting of bilirubinemia (hyperbilirubinemia) and neoplasia.
  • the present invention also includes Scott syndrome, antiphospholipid syndrome, sickle cell anemia, thalathemia, stomatocytosis, uremia, Kidney stone disease, diabetes, hyperglycemia, viral and microbial infections, malaria, pre-eclampsia, hyperbilirubinemia, neooplasia
  • a polypeptide of the invention for the diagnosis of a disease selected from the group consisting of:
  • the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention may specifically bind to phosphatidyl serine. Therefore, the polypeptide of the present invention can be used for various purposes such as detection of phosphatidylserine, furthermore, detection or imaging of dead cells and tumor cells expressing phosphatidylserine on the cell surface.
  • FIG. 1 shows the screening process (A), identification of phosphatidylserine and phosphatidylcholine coated plates (B) and phage titers (C) at each selection step in order to select phage specific for phosphatidylserine in the phage library.
  • Screening result (D) is shown (PC: phosphatidylcholine, PS: phosphatidylserine).
  • FIG. 2 shows binding specificity for phosphatidylserine (phage titer (A), phage ELISA (B)) and phosphatidylserine liposomes (C) of selected phage and control phage libraries and inhibition of binding with Annexin V treatment (D) (Phage Lib .: phage library (control), CLSYYPSYC: peptide sequence of the present invention)
  • Figure 3 confirms the binding specificity (A, B, C) to the killed cells of the polypeptide of the present invention and the specificity (D) of phosphatidylserine of phage attached to the dead cells.
  • Normal normal cell population
  • Apoptotic killing
  • Cell population Con peptide: control peptide
  • Figure 4 confirms the binding specificity of the polypeptide of the present invention to apoptotic cells by FACS (A), immunohistochemistry (B) and confocal microscopy (C).
  • FIG. 5 shows the results of in vivo induction and imaging (A) and ex vivo induction and imaging (B) of polypeptides of the invention on tumor sites.
  • Figure 6 confirms the in vivo induction of the polypeptide of the present invention to the tumor site through immunohistochemical staining of tumor vessels (A) and dead cells (B) of cryosection tissue.
  • H460 and H157 human lung cancer cell lines and U937 leukemia cell lines used in the present invention were cultured in RMPI 1640 medium containing 10% fetal bovine serum (FBS, Fetal bovine serum) to which antibiotics (penicillin and streptomycin) were added.
  • FBS fetal bovine serum
  • antibiotics penicillin and streptomycin
  • a plate (or well) coated with phosphatidylcholine or phosphatidylserine To prepare a plate (or well) coated with phosphatidylcholine or phosphatidylserine, first dissolve phosphatidylcholine or phosphatidylserine in ethanol (3 / ml, 100) and then 96-well emulon 1B microtiter plates (Immulon 1B microtiter plates) , Thermo, Milford, Mass., USA) and dried in air for 6 hours. To prevent nonspecific binding, TBS (Tris-HCl 50 mM, pH 7.4, NaCl 150 mM) containing 10 mg / ml BSA (bovine serum albumin) was added thereto and blocked for 1 hour at room temperature. The plate coated with phosphatidylcholine or phosphatidylserine prepared as described above was evaluated through an annexin V binding test as follows, and then the coating was well used.
  • annexin V For binding annexin V, histidine-attached recombinant annexin V protein (20 / ml) was dissolved in TBS buffer containing 10 mg / ml BSA and then phosphatidylcholine or phosphatidylserine. It was placed in a coated ELISA plate. Thereafter, it was left at room temperature for 1 hour. It was washed three times with TBS-T buffer, and the bound Annexin V protein was measured by reacting with HRP bound mouse anti-histidine IgG antibody (Santa Cruz Biotechnology) as described above and by reacting with TBM substrate.
  • HRP bound mouse anti-histidine IgG antibody Santa Cruz Biotechnology
  • the plate used in the present invention was well bonded with Annexin V, and thus the coating of the plate was well established. Coated plates were used in the following experiments.
  • Peptide binding to phosphatidylserine was screened using the M13 phage library (New England Biolabs, Ipswich, Mass.) exposing 7-mer random cyclic peptides fused to pIII.
  • the M13 phage library 10 having 2 ⁇ 10 11 plaque-forming units (pfu) in TBS buffer 100 containing 10 mg / ml BSA was added to a well coated with phosphatidylcholine. And left for 1 hour with gentle shaking at room temperature (subtraction step). Subsequently, the subtracted phage library adhering to phosphatidylcholine was placed in a phosphatidylserine-coated well and left for 1 hour with gentle shaking at room temperature. In order to remove unbound or weakly bound phage, it was strongly washed at least 10 times with TBS-T (TBS containing 0.05% Tween-20) buffer.
  • TBS-T TBS containing 0.05% Tween-20
  • Phages bound to phosphatidylserine coated wells were eluted with 100 0.2 M glycine-HCl (pH 2.2) buffer containing 1 mg / ml BSA for 10 minutes at room temperature. Eluted phage were immediately neutralized with 1M Tris-HCl (pH 9.1) and amplified with 20 ml of ER2738 bacteria (New England Biolabs) according to the manufacturer's instructions (see Figure 1A).
  • phages in the supernatant of the culture were precipitated with a polyethylene glycol / NaCl solution and then titer was measured.
  • the titer was measured using an LB plate containing IPTG and X-gal, incubated overnight at 37 ° C, and the number of blue colonies was counted.
  • the primary screened phages were further screened (2nd to 4th) by fitting 2 x 10 11 pfu, and the screening process was as described above.
  • Example ⁇ 2-1> In order to confirm that the phages specific for phosphatidylserine in Example ⁇ 2-1> were enriched (enrichment), each of the rounds (1st to 4th) in Example ⁇ 2-1> was selected as phosphatidylcholine. Phage titers from wells coated with phosphatidylcholine and phosphatidylserine were compared to each other.
  • phages specific for phosphatidylserine were selected through four selection rounds, and single-chain DNA was isolated from the selected phage clones.
  • DNA was isolated from at least 30 phage clones and their sequencing was analyzed. The amino acid sequences obtained through the sequencing results were sorted by the CLUSTAL W program to identify consensus peptide sequences.
  • An advanced BLAST search (EMBL / GenBank / DDBJ) was performed to identify proteins having high homology with the peptide sequence.
  • peptides having an amino acid consensus sequence of CLSYYPSYC were mainly selected, and human proteins having high homology with peptides having an amino acid sequence of CLSYYPSYC were identified as proteins shown in Table 1 below. .
  • the binding specificity of the selected phage clones to phosphatidylserine was measured through phage binding tests as follows.
  • Selected phage clones (1 ⁇ 10 9 pfu) and amplified M13 phage library (control, 1 ⁇ 10 9 pfu) were placed in 100 TBS buffer with phosphatidylcholine or phosphatidylserine prepared as in Example ⁇ 1-2>. Added to coated wells. It was then incubated for 1 hour at room temperature with gentle shaking. This was strongly washed 10 times with TBS-T (TBS containing 0.05% Tween-20) buffer and then the bound phage was bound to wells with 100 mg of 0.2 M glycine-HCl (pH 2.2) buffer containing 1 mg / ml BSA. Eluted for a minute. Eluted phages were immediately neutralized with 1M Tris-HCl (pH 9.1) and the titer of each eluted phage was measured.
  • TBS-T TBS containing 0.05% Tween-20
  • the selected phageclone of the present invention binds strongly to phosphatidylserine, whereas the control M13 phage library hardly binds to wells coated with phosphatidylcholine or phosphatidylserine. .
  • the selected phageclone was also partially bound to phosphatidylcholine, but less than about 5% of the binding to phosphatidylcholine was found to specifically bind to phosphatidylserine.
  • the binding specificity of the selected phage clones to phosphatidylserine was measured by phage ELISA as follows.
  • Emulon 1B microtiter plates were coated with phosphatidylcholine or phosphatidylserine as described in Example ⁇ 1-2> above. It was then blocked for 1 hour at room temperature with TBS medium containing 10 mg / ml BSA.
  • Selected phage clones were added to wells coated with phosphatidylcholine or phosphatidylserine in 100 TBS buffer and allowed to incubate for 1 hour at room temperature with gentle shaking.
  • Amplified M13 phage library (1 ⁇ 10 9 pfu) was used as a control. This was strongly washed six times with TBS-T (TBS containing 0.05% Tween-20) buffer, and then the phage bound to the well was horseradish peroxidase (HRP) -bound anti-M13 antibody (New England Biolabs) (dilution, 1: 4000 in). TBS-T) and detection at room temperature for 1 hour. Then, color reaction was performed with HRP substrate solution (TMB, Pierce). The color reaction was stopped by the addition of 2N H 2 SO 4 and the absorbance was measured at 450 nm using a microplate reader (Bio-Rad, model 550).
  • phage ELISA was performed on microplates coated with phosphatidylserine liposomes as follows.
  • phosphatidylcholine or phosphatidylcholine / phosphatidylserine liposomes 50:50 Mol.%
  • Known methods Oka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95: 9535-9540, 1998; Fadok, VA et al., Nature 405: 85-90, 2000
  • Emulon 1B microtiter plates were coated with 100 liposomes (20 / ml) at 4 ° C. overnight. After blocking for 1 hour at room temperature with TBS medium containing 10 mg / ml BSA, the selected phage clones were added to the coated wells in 100 TBS buffer and allowed to shake for 1 hour at room temperature with gentle shaking. Incubate. Amplified M13 phage library (1 ⁇ 10 9 pfu) was used as a control.
  • Specificity of the selected phage clones to phosphatidylserine was measured by confirming binding to phosphatidylserine in the presence of annexin V.
  • the Imulon 1B microtiter plates were coated with phosphatidylserine as described in Example ⁇ 1-2>. It was then blocked for 1 hour at room temperature with TBS medium containing 10 mg / ml BSA.
  • Selected phage clones were added to wells coated with phosphatidylserine in 100 TBS buffer and left to incubate for 1 hour at room temperature with gentle shaking.
  • the phage clone was incubated in the presence of Annexin V protein (10 nM), and then added to a well coated with phosphatidylserine in 100 TBS buffer as described above, which was slowly shaken at room temperature. Leave for 1 hour.
  • the phage plaque assay was used to determine whether the selected phage clones bind to various apoptotic cells.
  • Etopoeside 50 uM, Sigma
  • the treatment was treated for 4 hours for U937 cells and 18 hours for H460 cells and H157 cells.
  • FACS analysis fluorescence activated cell sorting analyses was performed after staining with Annexin V (BD Biosciences) according to the manufacturer's instructions.
  • phage binding assays killed cells were washed with PBS, then placed in DMEM medium containing 10 mg / ml BSA and pre-incubated for 30 minutes at room temperature. Amplified phage library (control) or selected phage clones were added to the precultured cells in an amount of 1 ⁇ 10 9 pfu and incubated for 1 hour at 4 ° C. while slowly shaking. Unbound phage was strongly washed with DMEM medium containing 10 mg / ml BSA and 0.05% Tween-20.
  • Bound phages were eluted by treatment with 1 ml of 0.2 M glycine-HCl (pH 2.2) containing 1 mg / ml BSA at room temperature for 10 minutes. Eluted phage were immediately neutralized with 1M Tris-HCl (pH 9.1) and then phage titers measured.
  • phosphatidylserine molecules were well exposed on the surfaces of H460 cells (Fig. 3A), H157 cells (Fig. 3B), and U937 cells (Fig. 3C) (Figs. 3A to 3C right).
  • Panels), M13 phage library used as a control hardly binds, it can be seen that the selected phage of the present invention binds to the dead cells as compared to the normal phage does not bind very much.
  • a group pre-incubated with annexin V (10) for 30 minutes and cultured with killed cells (H460 cells) before being cultured with phage were used as a pre-cultured annexin as a control group, and the phages described above. Titers were measured by binding and eluting as described in -1>.
  • the peptide sequence shown in the selected phage clone that is, the group treated with the peptide 50 synthesized according to the amino acid sequence of CLSYYPSYC and the control group treated with the untreated group and the control peptide, the phage was measured in the above Example Titers were measured by binding and elution as described in ⁇ 4-1>.
  • the peptides of the present invention were treated for the killed cells as follows and confirmed by FACS analysis.
  • the peptide used in the present invention was synthesized according to the standard Fmoc method in the form of fluorescein (fluorescein) bonded to the N-terminus, and separated and used by HPLC (Peptron Co.).
  • Peptide or control peptide (amino acid sequence: NSSVDK) of the present invention was dissolved in Hepes buffer (pH 7.4, Hepes 10 mM NaCl 2 138 mM, and with / without CaCl 2 ) with a final concentration of 2.5, normal H460 cells or killed H460 cells (1 ⁇ 10 5 cells / ml) and a final volume of 0.5ml were incubated at room temperature for 15 minutes. The cells were washed with binding buffer and immediately followed by FACS analysis (FACSScan, Becton Dickinson, San Jose, Calif.).
  • the peptides of the present invention were treated with apoptotic cells as compared to the case where normal cells were treated with the peptides of the present invention (left panel) and with dead cells with the control peptides (right panel). In the case of the peptide of the present invention was found to bind well with dead cells.
  • H460 cells were cultured in chamber slides (Nalgen Nunc Int.) And apoptosis was induced as described in Example ⁇ 4-1> above.
  • the killed cells were washed with PBS and then incubated for 30 minutes at room temperature with peptides labeled with 10 ⁇ M of fluorescein in tyrodes buffer. These cells were then incubated with Annexin V Alexa Powder 594 (annexin V Alexa fluor 594, Molecular Probes) for 15 minutes at room temperature.
  • the cells were washed with PBS and then fixed for 4 minutes with 4% paraformaldehyde.
  • DAPI 46-diamidino-2-phenylindole
  • H460 cells (1 ⁇ 10 7 cells) suspended in RPMI medium containing 10% FBS in 6-week old BALB / c male nude mice (SLC, Inc.) were placed on the right shoulder region. Injection was subcutaneously. Then, the tumor cells were allowed to grow to a size of 0.5 to 1 cm for 3 weeks.
  • mice carrying tumor cells were divided into camptothecin-treated and untreated groups, respectively, and then the camptothecin-treated groups were treated with one batch of camptothecin (Sigma, 10 mg / kg) 24 hours before peptide treatment.
  • Each mouse was then injected with a fluorescein-labeled peptide (fluorescein-labeled CLSYYPSYC) or control peptide (50 each) through the tail vein under isoflurane anesthesia.
  • Peptides induced in tumors were identified with an optical imaging system (ART Advanced Research Technologies Inc., Montreal, Canada) using 470 nM / GFP filters for each hour after peptide injection.
  • the signal of the peptide of the present invention labeled with fluorescein in the tumor tissue in the group treated with the peptide of the present invention was strongly measured from 2 hours. It was found that the fluorescein signal was weakly detected or hardly detected when the peptide of the invention was not treated or the control peptide was treated.
  • mice were anesthetized and then opened.
  • PBS and 4% paraformaldehyde (PFA) fixative were perfused through the heart and tumor tissues and organs were removed. Cryosections of each tissue were followed by observation of the peptides of the invention by fluorescence microscopy. Tumor vessels were stained by immunohistochemistry using secondary antibodies labeled with antibody against mouse CD31 (BD Pharmigen) and Alexa 568 (alexa 568). Apoptosis in tumor tissues was confirmed by in vitro terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling (TUNEL) assay according to the manufacturer's (Chemicon Int. USA) instructions.
  • TUNEL in vitro terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling
  • Fig. 6 when the peptide of the present invention was treated, a large amount of the peptide of the present invention was observed at the site stained with CD31 in tumor tissue (top panel), but rarely was observed when the control peptide was treated. It was found that it was not (interrupted panel). On the other hand, the peptide of the present invention was not observed in the liver and lung tissue as a control organ. However, in the kidney, the peptide was excreted through urine, so the fluorescence of the peptide in the urinary excretion pathway was not observed. Was observed (bottom panel).
  • the peptide fluorescence signal of the present invention was found to be confirmed in a large amount at the site where the TUNEL staining, that is, the site of cell death.
  • the polypeptide of the present invention may specifically bind to phosphatidylserine. Therefore, the polypeptide of the present invention can be used for various purposes such as detection of phosphatidylserine, furthermore, detection or imaging of dead cells and tumor cells expressing phosphatidylserine on the cell surface.

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Abstract

본 발명은 포스파티딜세린과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지며, 포스파티딜세린과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드, 이의 포스파티딜세린 검출용도, 이를 이용하는 포스파티딜세린 검출방법, 이의 사멸세포 검출용도, 이의 약물 전달용도, 이의 종양성 질환 치료용도, 종양성 질환부위의 영상화용도 등에 관한 것이다. 본 발명의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드는 포스파티딜세린과 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 포스파티딜세린의 검출, 더 나아가 포스파티딜세린을 세포 표면으로 발현하는 사멸세포 및 종양세포의 검출 또는 영상화 등에 다양하게 사용될 수 있다.

Description

포스파티딜세린과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 및 이의 용도
본 발명은 포스파티딜세린과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지며, 포스파티딜세린과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드, 이의 포스파티딜세린 검출용도, 이를 이용하는 포스파티딜세린 검출방법, 이의 사멸세포 검출용도, 이의 약물 전달용도, 이의 종양성 질환 치료용도, 종양성 질환부위의 영상화용도 등에 관한 것이다.
포스파티딜세린(phosphatidylserine, PS)은 대식세포가 사멸세포를 인식하여 제거하는 중요한 표지자이다(Schlegel, R.A. et al., Cell Death and Differentiation, 2001, 8:551-563; Lauber, K. et al., Mol Cell 2004, 14: 277-287 Henson, P.M. et al., Curr Biol 2001, 11: R795-805 Grimsley, C. et al.,Trends Cell Biol. 2003, 13: 648-656). 정상적으로 포스파티딜세린은 세포막의 내부에 존재하나 세포가 사멸신호를 받거나 적혈구가 노화되면 세포막의 외부로 노출되며(Fadeel, B. et al., Cell Mol Life Sci, 2003, 60:2575-2585), 이것을 대식세포가 세포표면의 수용체를 통해서 인식하여 탐식작용을 일으킨다(Fadok, V.A. et al., J immunol 1992, 148:2207-2216; Fadok, V. A. et al., Nature 2000, 405:85-90; Park, S.Y.et. al., Cell Death and Differentiation, in press).
사멸세포 이외에도 포스파티딜세린은 또한 여러 가지 병적인 상황에서도 세포막의 외부로 노출된다(Zwaal, R.F.A. et al., Cell. Mol. Life Sci 2005, 62:971-988). 그 예로 스코트 증후군(Scott syndrome), 항인지질 증후군(antiphospholipid syndrome), 겸상 적혈구 빈혈증(sickle cell anemia), 탈라세미아(thalassemia), 스토마토싸이토시스(stomatocytosis), 요독증(uremia), 신장결석(kidney stone disease), 당뇨병(diabetes), 고혈당증(hyperglycemia), 바이러스 감염 및 미생물 감염, 말라리아(malaria), 전-자간증(pre-eclampsia), 고빌리루빈혈증(hyperbilirubinemia), 신생물 종양(neoplasia) 등이 있다. 특히, 많은 종양세포들이 세포막의 외부로 포스파티딜세린의 발현 증가를 나타나며(Utsugi, T. et al., Cancer Res. 1991, 15:3062-3066; Rao, L. et al., Thromb Res. 1992, 67:517-531; Sigimura, M. et al., Fibrinolysis. 1994, 5:365-373; Ran, S. et al., Cancer Res. 2002, 62:6132-6140; Woehlecke, H. et al., Biochem J. 2003, 376:489-495), 이것은 미분화성 발암성 세포(undifferentiated tumorigenic cell)에서 더욱 저명하게 나타난다. 종양조직은 또한 포스파티딜세린을 세포막의 외부로 노출하는 소혈관을 방출한다(Ran, S. et al., Cancer Res. 2002, 62:6132-6140; Zwaal, R.F.A. et al., Blood. 1997, 89:1121-1132).
더욱이, 포스파티딜세린은 여러 가지 세포 내 생리학적 과정 중에서 비사멸세포에서도 또한 관찰된다. 그러한 예로는 혈소판의 활성화 과정, 근육세포의 융합과정, 합포체성 영양세포(syncytiotrophoblast)의 형성, 비만세포(mast cells)의 이뮤노글로불린 의존성 자극, 및 T 세포의 이동 등이 있다 (Fadeel, B. et al., Cell Death Differ 2006, 13:360-2 Ran, S. et al., Int J Radiat Oncol Biol Phys 2002, 54:1479-84 Schlegel, R. A. et al., Cell Death Differ 2001, 8:551-63.). 그 중에 특히 혈소판의 활성화 과정에서 발현되는 포스파티딜세린을 차단함은 동맥경화에 의해 형성될 수 있는 혈전형성(thrombosis)과정을 억제함으로써 그 치료효과를 나타낼 수도 있다(Cederholm, A. and Frosteg, J., Ann N Y Acad Sci. 2007, 1108:96-103 Cederholm, A. and Frosteg, J., Drug News Perspect. 2007 20(5):321-6). 따라서, 이러한 포스파티딜리세린의 역할들로 인해 특히 종양성 및 염증성 질환을 비롯한 여러 상황에서 포스파티딜세린은 진단, 치료, 및 치료추적을 위한 표적 물질로 제시되고 있다.
또한, 포스파티딜세린의 인식의 억제는 조사된 림프종(irradiated lymphoma)에서 세포의 면역성(immunogenicity)을 증가시킨다고 보고되었다(Bondanza, A. et al., J Exp Med 2004, 200:1157-65). 따라서, 포스파티딜세린에 효과적으로 결합할 수 있는 단백질은 사멸세포의 포스파티딜세린의 인식과 면역억제성 제거를 방해함으로써 아폽토틱 세포-기반 백신(apoptotic cell-based vaccines)의 효과를 증대시키는데도 사용될 수 있을 것이다.
이에 본 발명자들은 포스파티딜세린을 표적화할 수 있는 새로운 단백질 또는 그 단편을 탐색하고자 연구한 결과, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드가 포스파티딜세린에 특이적으로 결합할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 포스파티딜세린에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지며, 포스파티딜세린(phosphatidylserine)과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 포스파티딜세린 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 포스파티딜세린 검출을 위한 상기 폴리펩티드의 용도를 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 시료와 혼합한 후, 미결합 또는 비특이적인 결합된 폴리펩티드를 제거한 다음 상기 폴리펩티드와 시료와의 결합 여부 및 위치를 확인하는 포스파티딜세린의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 사멸세포(apoptotic cell) 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 사멸세포(apoptotic cell) 검출을 위한 상기 폴리펩티드의 용도를 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 약물 전달을 위한 상기 폴리펩티드의 용도를 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩티드 및 이와 결합된 항-종양성 질환 제제를 유효성분으로 포함하는 종양성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 종양성 질환 치료제의 제조를 위한 상기 폴리펩티드 및 이와 결합된 항-종양성 질환 제제의 용도를 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 종양성 질환 부위의 영상화용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 종양성 질환 부위의 영상화를 위한 상기 폴리펩티드의 용도를 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 스코트 증후군 등의 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 스코트 증후군 등의 질환의 진단을 위한 상기 폴리펩티드의 용도를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산을 가지는 폴리펩티드가 세포 표면에 노출되는 포스파티딜세린과 특이적으로 결합한다는 점에 착안하여 서열번호 1로 표시되는 아미노산을 가지는, 새로운 서열의 폴리펩티드와 이의 용도로서 상기 폴리펩티드를 포함하는 포스파티딜세린(phosphatidylserine) 검출용 조성물 등을 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 폴리펩티드는 포스파티딜세린에 특이적으로 결합하며, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 말한다. 본 발명의 펩티드 단편은 모든 종류의 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 펩티드 모조물, 화합물 및 생물제제를 포함하며, 종양 세포 등의 세포의 표면에서 발현되는 포스파티딜세린에 특이적으로 결합할 수 있는 활성을 갖는 것을 말한다. 본 발명의 폴리펩티드는 천연으로부터 유래될 수도 있으며, 공지의 펩티드 합성 방법을 이용하여 합성될 수 있다.
아울러, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
아울러, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 염기서열을 가지는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 벡터는 통상의 클로닝 벡터 또는 발현벡터일 수 있으며, 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한 상기 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.
상기 벡터로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 미세사출법(microprojectile bombardment), 전기충격유전자전달법(electroporation), 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화 칼슘(CaCl2) 침전, PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection) 및 리포좀 매개법(liposome-mediated method)를 이용할 수 있으며, 상기 형질전환체는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명자들은 포스파티딜 세린에 특이적으로 결합하는 것으로 선별된 상기 폴리펩티드의 기능을 확인하고자 다양한 실험을 수행한 결과, 본 발명의 펩티드가 노화된 세포 및 사멸 세포의 표면에서 발현되는 포스파티딜세린을 특이적으로 인식함으로써 상기 세포의 부착 및 탐식을 매개한다는 사실을 확인하였다. 또한, 본 발명의 펩티드가 종양 세포에 특이적으로 결합하여 in vivo 또는 ex vivo에서 종양세포 확인 및 영상화가 가능함을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 펩티드를 포스파티딜세린의 검출용 조성물로 이용할 수 있음을 알 수 있었으며, 더 나아가 종양조직 내에 포스파티딜세린을 인식하는 진단 또는 치료추적용 제제, 또는 별도의 종양 치료용 제제와 더불어 종양성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 등으로서 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
보다 구체적으로 본 발명의 일 실시예에서는 상용의 M13 파지 라이브러리를 이용하여 포스파티딜세린과 특이적으로 결합하는 파지를 스크리닝하였다. 그 결과, 총 4 라운드의 스크리닝을 통해 포스파티딜세린과 특이적으로 결합하는 파지를 스크리닝할 수 있었으며, 이의 서열을 분석한 결과 CLSYYPSYC의 아미노산 공통서열을 가지는 펩티드가 주로 선별됨을 알 수 있었다.
또한, 본 발명의 다른 실시예에서는 선별된 파지의 포스파티딜세린에 대한 결합 특이성을 확인하였다. 그 결과, 대조군 파지는 포스파티딜콜린 또는 포스파티딜세린과는 거의 결합하지 않는 데에 비해서 선별된 파지는 포스파티딜세린에 특이적으로 결합함을 알 수 있었다. 아울러, 선별된 파지는 포스파티딜세린 리포좀에도 특이적으로 결합하였으며, 아넥신 V의 처리에 의해 포스파티딜세린과의 결합이 저해됨을 알 수 있었다.
아울러, 본 발명의 또다른 실시예에서는 선별된 파지 클론 또는 본 발명의 펩티드가 사멸 세포와 특이적으로 결합하는지 확인하였다. 그 결과, 선별된 파지 클론 및 본 발명의 펩티드가 사멸세포에 노출된 포스파티딜세린과 잘 결합함을 알 수 있었다.
본 발명의 또다른 실시예에서는 본 발명의 펩티드가 이식된 종양 부위에 유도되고, 이를 영상화할 수 있는지 확인하였다. 그 결과, 본 발명의 펩티드가 처리한 군에서는 종양 조직에 본 발명의 펩티드가 유도되었고, 이를 표지를 통해 확인할 수 있음 알 수 있었다.
결론적으로, 본 발명의 폴리펩티드가 포스파티딜세린과 특이적으로 결합하여 생체내에서 사멸세포 및 종양세포의 인식과 탐식을 할 수 있음을 알 수 있었다.
참고로, 상기에서 언급한 뉴클레오티드 및 단백질 작업에는 다음의 문헌을 참조할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)).
따라서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 본 발명의 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 포스파티딜세린(phosphatidylserine) 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 포스파티딜 세린 검출을 위한 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 본 발명의 폴리펩티드의 용도를 제공한다.
아울러, 본 발명의 폴리펩티드는 포스파티딜세린과 특이적으로 결합하므로 본 발명은
(a) 본 발명의 폴리펩티드를 시료와 혼합하는 단계;
(b) 미결합되거나 비특이적으로 결합된 상기 폴리펩티드를 제거하는 단계; 및
(c) 상기 폴리펩티드의 결합 여부 및 위치를 확인하는 단계를 포함하는 포스파티딜세린의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 폴리펩티드의 결합 여부의 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 본 발명의 폴리펩티드는 표지된 상태로 제공될 수 있다. 즉, 검출가능한 표지에 링크(예: 공유 결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 발색효소(예: 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제), 방사성 동위원소(예: 125I, 32P, 35S), 크로모포어(chromophore), 발광물질 또는 형광물질(예: FITC, RITC, 형광단백질(GFP(Green Fluorescent Protein); EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein), RFP(Red Fluorescent Protein); DsRed(Discosoma sp. red fluorescent protein); CFP(Cyan Fluorescent Protein), CGFP(Cyan Green Fluorescent Protein), YFP(Yellow Fluorescent Protein), Cy3, Cy5 및 Cy7.5), 상자성입자(super paramagnetic particles) 또는 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)일 수 있다.
표지에 따른 검출 방법은 당업계에 널리 알려져 있으나, 예를 들어 다음과 같은 방법에 의해 수행될 수 있다. 만약 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 면역형광염색법을 이용할 수 있다. 예컨대, 형광물질로 표지된 본 발명의 폴리펩티드를 시료와 반응시키고 미결합 또는 비특이적인 결합 산물을 제거한 다음 형광현미경 하에서 펩티드에 의한 형광을 관찰할 수 있다. 또한 검출가능한 표지로 효소를 이용하는 경우에는 효소반응을 통한 기질의 발색반응에 의해 흡광도를 측정하고, 방사선 물질인 경우에는 방사선 방출량을 측정함으로써 수행할 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드는 포스파티딜세린을 세포 표면으로 노출하는 세포와 특이적으로 결합할 수 있으며, 사멸세포(apoptotic cell)에서 포스파티딜세린이 세포막으로 노출되므로 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 사멸세포(apoptotic cell) 검출용 조성물을 제공한다. 아울러, 본 발명은 사멸세포 검출을 위한 본 발명의 폴리펩티드의 용도를 제공한다. 상기에서 사멸세포의 검출은 이에 한정되지는 않으나, 예를 들어, 상기 포스파티딜세린의 검출시의 방법을 이용할 수 있으며, 상기에서 기재한 바와 같이 본 발명의 폴리펩티드의 결합 여부의 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 본 발명의 폴리펩티드는 표지된 상태로 제공될 수 있다. 검출된 결과는 검출표지에 따른 공지된 영상화 방법에 따라 영상화될 수도 있다.
또한 본 발명의 폴리펩티드는 포스파티딜세린을 세포 표면으로 노출하는 세포와 특이적으로 결합할 수 있으므로 약물을 상기 세포에 선택적으로 전달하는 지능형 약물 전달체로서 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 약물 전달을 위한 본 발명의 폴리펩티드의 용도를 제공한다.
상기한 바와 같이, 세포막의 외부로 포스파티딜세린의 발현 증가는 흑색종 및 대장암 세포(Utsugi, T. et al., Cancer Res. 1991, 15:3062-3066), 난소암 세포(Rao, L. et al., Thromb Res. 1992, 67:517-531), 위암 및 간암 세포(Sugimura, M. et al., Blood Coagul. Fibrinolysis. 1994, 5:365-373; Woehlecke, H. et al., Biochem J. 2003, 376:489-495), 암조직의 내피세포(Ran, S. et al., Cancer Res. 2002, 62:6132-6140) 등 여러 종양세포에서 나타나며, 이것은 미분화성 발암성 세포(undifferentiated tumorigenic cell)에서 더욱 저명하게 나타난다. 종양조직은 또한 포스파티딜세린을 세포막의 외부로 노출하는 소혈관을 방출한다(Ran, S. et al., Cancer Res. 2002, 62:6132-6140; Zwaal, R.F.A. et al., Blood. 1997, 89:1121-1132).
따라서, 상기 약물 전달용 조성물은 종양성 질환에 특이적일 수 있다. 종양성 질환이란 악성 종양에 의해 병리적 증상을 보이는 질환으로서, 그 예로는 이에 한정되지는 않으나, 대장암, 폐암, 위암, 식도암, 췌장암, 담낭암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 난소암, 유방암, 갑상선암, 뇌암, 두경부암, 악성흑색종, 피부암, 간암, 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma), 복합 골수종(multiple myeloma), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia), 신경아종(neuroblastoma), 재생불량성 빈혈일 수 있다.
본 발명의 약물 전달용 조성물에 포함되는 본 발명의 폴리펩티드를 종래 항-종양성 질환 제제와 연결하여 치료에 이용한다면 본 발명의 폴리펩티드에 의해 상기 제제가 종양 세포에만 선택적으로 전달되기 때문에 약의 효력을 증가시킬 수 있고 동시에 정상조직에 미치는 부작용을 현저히 줄일 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드에 연결될 수 있는 항-종양성 질환 제제는 종래 종양 치료에 사용되는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 예컨대, 파클리탁셀, 독소루비신, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀(docetaxel), 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌(bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴(cisplain), 5-플로오우라실(5-fluouracil), 아드리아마이신(adriamycin), 메토트렉세이트(methotrexate), 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란(melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard), 니트로소우레아(nitrosourea) 등이 있다. 상기 제제와 본 발명의 폴리펩티드의 연결은 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 공유 결합, 가교 등을 통해 수행될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 펩티드는 필요하다면 그 활성이 소실되지 않는 범위에서 화학적으로 수식(modification)될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함되는 본 발명의 펩티드의 양은 결합되는 항암제의 종류 및 양에 따라 달라질 수 있다.
한편, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 및 이와 결합된 항-종양성 질환 제제를 유효성분으로 종양성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 종양성 질환 치료제의 제조를 위한 본 발명의 폴리펩티드 및 이와 결합된 항-종양성 질환 제제의 용도를 제공한다.
이 때, 상기 약학적 조성물에서 항-종양성 질환 제제, 결합 방법 및 종양성 질환에 대해서는 상기에서 기재한 바와 같다.
한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 폴리펩티드의 순수한 형태 또는 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화함으로써 제공될 수 있다. '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.
한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 투여 경로에 따라 적합한 담체와 함께 제형화될 수 있다. 상기 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로로는 이에 한정되지는 않으나 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적 투여 경로로는 예를 들면, 경피, 비강, 복강, 근육, 피하 또는 정맥 등의 여러 경로가 포함된다.
본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당 업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 경피 투여는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)에 기술되어 있다.
흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달 할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.
그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 안정화제(아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산) 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제(벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올)를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 진단 또는 치료 효과의 추적을 가능하게 하는 화합물 또는 추출물의 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 대상 질환 및 이의 중증정도, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 성인을 기준으로 할 때 1회 투여시 10 ㎍ 내지 10 ㎎의 유효용량으로 하루에 수 차례 반복 투여될 수 있다.
아울러, 본 발명의 폴리펩티드는 포스파티딜세린과 특이적으로 결합하므로 종양성 질환의 발병 부위의 영상화에도 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 종양성 질환 부위의 영상화용 조성물을 제공한다. 또한 종양성 질환 부위의 영상화를 위한 본 발명의 폴리펩티드의 용도를 제공한다. 상기 폴리펩티드는 결합 여부의 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 표지된 상태로 제공될 수 있으며, 이에 대해서는 상기에서 기술한 바와 같다.
또한, 포스파티딜세린은 상기 종양성 질환 이외에도 여러 가지 병적인 상황에서도 세포막의 외부로 노출된다(Zwaal, R.F.A. et al., Cell. Mol. Life Sci. 2005, 62:971-988). 그 예로 스코트 증후군(Scott syndrome), 항인지질 증후군(antiphospholipid syndrome), 겸상 적혈구 빈혈증(sickle cell anemia), 탈라세미아(thalathemia), 스토마토싸이토시스(stomatocytosis), 요독증(uremia), 신장결석(kidney stone disease), 당뇨병(diabetes), 고혈당증(hyperglycemia), 바이러스 감염 및 미생물 감염, 말라리아(malaria), 전-자간증(pre-eclampsia), 고빌리루빈혈증(hyperbilirubinemia), 신생물 종양(neoplasia) 등이 있다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는, 스코트 증후군(Scott syndrome), 항인지질 증후군(antiphospholipid syndrome), 겸상 적혈구 빈혈증(sickle cell anemia), 탈라세미아(thalathemia), 스토마토싸이토시스(stomatocytosis), 요독증(uremia), 신장결석(kidney stone disease), 당뇨병(diabetes), 고혈당증(hyperglycemia), 바이러스 감염 및 미생물 감염, 말라리아(malaria), 전-자간증(pre-eclampsia), 고빌리루빈혈증(hyperbilirubinemia), 신생물 종양(neoplasia)으로 이루어진 군에서 선택된 질환의 진단용 조성물을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명은 스코트 증후군(Scott syndrome), 항인지질 증후군(antiphospholipid syndrome), 겸상 적혈구 빈혈증(sickle cell anemia), 탈라세미아(thalathemia), 스토마토싸이토시스(stomatocytosis), 요독증(uremia), 신장결석(kidney stone disease), 당뇨병(diabetes), 고혈당증(hyperglycemia), 바이러스 감염 및 미생물 감염, 말라리아(malaria), 전-자간증(pre-eclampsia), 고빌리루빈혈증(hyperbilirubinemia), 신생물 종양(neoplasia)으로 이루어진 군에서 선택된 질환의 진단을 위한 본 발명의 폴리펩티드의 용도를 제공한다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드는 포스파티딜 세린과 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 포스파티딜세린의 검출, 더 나아가 포스파티딜세린을 세포 표면으로 발현하는 사멸세포 및 종양세포의 검출 또는 영상화 등에 다양하게 사용될 수 있다.
도 1은 파지 라이브러리에서 포스파티딜세린에 특이적인 파지를 선별하기 위하여, 그 선별과정(A), 포스파티딜세린 및 포스파티딜콜린으로 코팅된 플레이트의 확인(B) 및 각 선별단계에서의 파지 타이터(C) 및 선별결과(D)를 나타낸 것이다.(PC: 포스파티딜콜린, PS: 포스파티딜세린)
도 2는 선별된 파지 및 대조군 파지 라이브러리의 포스파티딜세린(파지 타이터(A), 파지 ELISA(B)) 및 포스파티딜세린 리포좀(C)에 대한 결합 특이성과 아넥신 V 처리에 따른 결합 저해(D)를 확인한 것이다.(Phage Lib.: 파지 라이브러리(대조군), CLSYYPSYC: 본 발명의 펩티드 서열)
도 3은 본 발명의 폴리펩티드의 사멸세포에 대한 결합 특이성(A, B, C) 및 사멸 세포에 부착된 파지의 포스파티딜세린에 대한 특이성(D)을 확인한 것이다.(Normal: 정상세포군, Apoptotic: 사멸세포군, Con peptide: 대조군 펩티드)
도 4는 사멸세포에 대한 본 발명의 폴리펩티드의 결합 특이성을 FACS(A), 면역조직화학법(B) 및 공초점 현미경(C)으로 확인한 것이다.
도 5는 종양 부위에 대한 본 발명의 폴리펩티드의 생체 내(in vivo) 유도 및 영상화(A) 및 생체외(ex vivo) 유도 및 영상화(B) 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 종양 부위에 대한 본 발명의 폴리펩티드의 생체 내(in vivo) 유도를 동결절편 조직의 종양혈관(A) 및 사멸세포(B)에 대한 면역조직학적 염색을 통해 확인한 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
세포배양 및 플레이트의 제조
<1-1> 세포배양
본 발명에서 사용된 H460 및 H157 인간 폐암 세포주 및 U937 백혈병 세포주는 항생제(페니실린 및 스트렙토마이신)가 첨가된 10% 우태아혈청(FBS, Fetal bovine serum)을 포함하는 RMPI 1640 배지에서 배양하였으며, 3 내지 4일마다 개대배양하였다.
<1-2> 포스파티딜콜린 또는 포스파티딜세린으로 코팅된 플레이트의 제조
포스파티딜콜린 또는 포스파티딜세린으로 코팅된 플레이트(또는 웰)를 제조하기 위하여, 우선 포스파티딜콜린 또는 포스파티딜세린을 에탄올에 녹인 다음(3/ml, 100 ), 96-웰 이뮬론 1B 마이크로타이터 플레이트(Immulon 1B microtiter plates, Thermo, Milford, MA, USA)에 넣고, 이를 6시간 동안 공기중에서 건조하였다. 비특이적 결합을 방지하기 위하여 10 mg/ml의 BSA(bovine serum albumin)를 포함하는 TBS (Tris-HCl 50 mM, pH 7.4, NaCl 150 mM)을 넣고 실온에서 1시간 동안 블로킹(blocking) 하였다. 상기와 같이 제조된 포스파티딜콜린 또는 포스파티딜세린으로 코팅된 플레이트는 다음과 같이 아넥신 V 결합 테스트(annexin V binding test)를 통해 평가한 뒤, 코팅이 잘 된 것을 사용하였다.
아넥신 V의 결합을 위하여, 히스티딘이 부착된 재조합 아넥신 V 단백질(his-tagged recombinant annexin V protein (20 /ml))를 10mg/ml의 BSA를 포함하는 TBS 버퍼에 녹인 다음 포스파티딜콜린 또는 포스파티딜세린으로 코팅된 ELISA 플레이트에 넣었다. 그 후, 실온에서 1시간동안 놓아 두었다. 이를 TBS-T 버퍼로 3회 세척하고, 결합된 아넥신 V 단백질을 상기한 바와 같이 HRP가 결합된 마우스 항-히스티딘 IgG 항체(Santa Cruz Biotechnology)와 반응시키고, TBM 기질로 반응시켜 측정하였다.
그 결과 도 1B(포스파티딜 세린으로 코팅된 것을 테스트한 결과)에서와 같이 본 발명에서 사용한 플레이트는 아넥신 V와 잘 결합하며, 이에 상기 플레이트의 코팅이 잘 이루어짐을 알 수 있었다. 코팅된 플레이트는 이하의 실험에서 사용되었다.
<실시예 2>
포스파티딜세린와 결합하는 파지의 스크리닝
<2-1> 포스파티딜세린 결합 파지의 스크리닝
pIII에 융합된 7-mer 랜덤 싸이클릭 펩티드(random cyclic peptides)를 노출하는 M13 파지 라이브러리(New England Biolabs, Ipswich, MA)를 사용하여 다음과 같이 포스파티딜세린과 결합하는 펩티드를 스크리닝하였다.
10 mg/ml의 BSA를 포함하는 TBS 버퍼(100 )에 2 x 1011 플라크-형성 유닛트(plaque-forming units, pfu)를 가지는 상기 M13 파지 라이브러리(phage library, 10 )를 포스파티딜콜린으로 코팅된 웰에 넣고 실온에서 서서히 흔들어 주면서(gentle shaking) 1시간 동안 놓아 두었다(subtraction step). 그런 다음 포스파티딜콜린에 부착하는 파지가 제거된(subtracted) 파지 라이브러리를 포스파티딜세린으로 코팅된 웰에 넣고 실온에서 서서히 흔들어 주면서 1시간 동안 놓아 두었다. 결합되지 않거나 약하게 결합된 파지를 제거하기 위하여 이를 TBS-T (TBS containing 0.05% Tween-20) 버퍼로 적어도 10회 이상 강하게 세척하였다(washing). 포스파티딜세린이 코팅된 웰에 결합한 파지를 1 mg/ml BSA를 포함하는 100 의 0.2 M glycine-HCl (pH 2.2) 버퍼로 실온에서 10분간 용출하였다(elution). 용출된 파지를 즉시 1M Tris-HCl (pH 9.1)로 중화하고, 제조사의 지침에 따라서 20 ml의 ER2738 박테리아(New England Biolabs사)로 증폭하였다(도 1A 참조).
증폭 후, 배양액의 상등액에 있는 파지를 폴리에틸렌 글리콜/NaCl 용액으로 침전시킨 다음 타이터(titer)를 측정하였다. 타이터의 측정은 IPTG와 X-gal을 포함하는 LB 플레이트를 사용하였고, 37℃에서 밤새 배양한 다음 파란색 콜로니의 수를 계수하였다.
측정된 타이터를 이용하여 1차적으로 선별된 파지를 2 x 1011 pfu를 맞추어 추가적인 선별(2차 내지 4차)을 하였으며, 선별과정은 상기에 기재한 것과 같이 하였다.
<2-2> 포스파티딜세린에 특이적인 파지 클론의 확인
상기 실시예 <2-1>에서 포스파티딜세린에 특이적인 파지가 농축이 되었는지(enrichment) 확인하기 위하여 상기 실시예 <2-1>에서의 각각의 라운드(1차 내지 4차)의 선별시 포스파티딜콜린으로 코팅된 웰을 포함하였으며, 포스파티딜콜린 및 포스파티딜세린으로 코팅된 웰로부터의 파지 타이터를 서로 비교하였다.
그 결과, 도 1C에서 보듯이, 포스파티딜세린에 특이적인 펩티드가 2차 라운드에서부터 농축됨을 알 수 있었다.
<2-3> 포스파티딜세린에 특이적인 파지의 선별
상기 실시예 <2-1>에서와 같이 모두 4회의 선별 라운드를 거쳐 포스파티딜세린에 특이적인 파지를 선별하였으며, 선별된 파지 클론에서 단일-사슬 DNA를 분리하였다. 적어도 30개 이상의 파지 클론에서 DNA를 분리하였으며, 이의 염기서열을 분석(sequencing)하였다. 염기서열 분석 결과를 통해 얻은 아미노산 서열을 CLUSTAL W 프로그램으로 정렬하여 공통되는 펩티드 서열(consensus peptide sequence)을 확인하였다. 상기 펩티드 서열과 상동성이 큰 단백질을 확인하기 위하여 어드밴스드 BLAST 서치(advanced BLAST search (EMBL/GenBank/DDBJ))를 수행하였다.
그 결과, 도 1D에서 보듯이, CLSYYPSYC의 아미노산 공통서열을 가지는 펩티드가 주로 선별되었으며, 상기 CLSYYPSYC의 아미노산 서열을 가지는 펩티드와 상동성이 큰 인간 단백질은 하기 표 1에 기재한 것과 같은 단백질이 확인되었다.
표 1 Example of human proteins containing identical amino acid sequences to peptide
Peptide sequence Homologous amino acids Name of proteins Accesion number
CLSYYPSYC 297LSYYRSY303 Vacuolar protein sorting-associated protein Q8N1B4
63LSYSPSY69 E-selectin precursor P16581
293LSYYP297 Tenascin-N precursor Q9UQP3
715YYPSY719 Protein transport protein Sec24A Q95486
291YYPSY295 Transmembrane protein 66 precursor Q5R491
149YYPSY153 Transcription factor E2-alpha P15923
<실시예 3>
선별된 파지의 포스파티딜세린에 대한 결합 특이성 확인
<3-1> 파지 타이터 측정을 통한 결합 특이성 확인
선별된 파지 클론의 포스파티딜세린에 대한 결합 특이성(binding specificity)을 다음과 같이 파지 결합 테스트(phage binding tests)를 통해 측정하였다.
선별된 파지 클론(1 x 109 pfu) 및 증폭된 M13 파지 라이브러리(대조군, 1 x 109 pfu)을 100 TBS 버퍼에 넣어 상기 실시예 <1-2>에서와 같이 제조한 포스파티딜콜린 또는 포스파티딜세린으로 코팅된 웰에 첨가하였다. 그런 다음 이를 천천히 흔들어 주면서 실온에서 1시간 동안 놓아 두었다(incubate). 이를 TBS-T (TBS containing 0.05% Tween-20) 버퍼로 10회 강하게 세척한 다음 웰에 결합한 파지를 1 mg/ml BSA를 포함하는 100 의 0.2 M glycine-HCl (pH 2.2) 버퍼로 실온에서 10분간 용출하였다. 용출된 파지를 즉시 1M Tris-HCl (pH 9.1)로 중화하고 각각의 용출된 파지의 타이터를 측정하였다.
그 결과, 도 2A에서 보듯이, 대조군인 M13 파지 라이브러리에서는 포스파티딜콜린 또는 포스파티딜세린으로 코팅된 웰에 거의 결합하지 않는 데에 비해, 본 발명의 선별된 파지클론은 포스파티딜세린과 강하게 결합함을 알 수 있었다. 선별된 파지클론은 포스파티딜콜린에도 일부 결합하나 포스파티딜세린과의 결합에 비해서 약 5%미만으로 나타나 포스파티딜세린과 특이적으로 결합함을 알 수 있었다.
<3-2> 파지 ELISA를 통한 결합 특이성 확인
선별된 파지 클론의 포스파티딜세린에 대한 결합 특이성(binding specificity)을 다음과 같이 파지 ELISA를 통해 측정하였다.
이를 간략히 설명하면, 이뮬론 1B 마이크로타이터 플레이트(Immulon 1B microtiter plates)를 상기 실시예 <1-2>에 기재한 바와 같이 포스파티딜콜린 또는 포스파티딜세린으로 코팅하였다. 그런 다음 10mg/ml의 BSA를 포함하는 TBS 배지로 실온에서 1시간동안 블로킹(blocking)하였다.
선별된 파지 클론을 100 TBS 버퍼에 넣어 포스파티딜콜린 또는 포스파티딜세린으로 코팅된 웰에 첨가하고, 이를 천천히 흔들어 주면서 실온에서 1시간 동안 놓아 두었다(incubate). 증폭된 M13 파지 라이브러리(1 x 109 pfu)는 대조군으로 사용하였다. 이를 TBS-T (TBS containing 0.05% Tween-20) 버퍼로 6회 강하게 세척한 다음 웰에 결합한 파지를 HRP(horseradish peroxidase)-결합된 항-M13 항체(New England Biolabs) (dilution, 1:4000 in TBS-T)와 실온에서 1시간 동안 결합시켜 검출하였다. 그런 다음 HRP 기질 용액(TMB, Pierce)으로 발색반응을 시켰다. 발색반응은 2N H2SO4를 첨가하여 중단시키고 마이크로플레이트 리더(microplate reader, Bio-Rad, model 550)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 2B에서 보듯이, 대조군인 M13 파지 라이브러리의 경우 포스파티딜세린이 거의 검출되지 않은 데에 비해 선별된 파지 라이브러리의 경우 포스파티딜세린과 특이적으로 강하게 결합함을 알 수 있었다.
<3-3> 포스파티딜세린 리포좀에 대한 결합 특이성 확인
포스파티딜세린 대신 포스파티딜세린 리포좀에도 본 발명의 펩티드가 결합특이성을 가지는지 알아보기 위하여 다음과 같이 파지 ELISA를 포스파티딜세린 리포좀으로 코팅된 마이크로플레이트에서 수행하였다.
포스파티딜콜린 또는 포스파티딜콜린/포스파티딜세린 리포좀(50:50 Mol.%)을 제조하기 위하여, 공지된 방법(Oka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:9535-9540, 1998; Fadok, V. A. et al., Nature 405:85-90, 2000)을 이용하여 다음과 같이 제조하였다. 보다 구체적으로 클로로포름에서 포스파티딜콜린 또는 포스파티딜세린:포스파티딜콜린을 각각 50:50의 몰 비율로 혼합한 혼합물을 진공하에서 건조시킨 다음 TBS 버퍼에서 수화시키고(hydrate), 얼음(ice) 상에서 5 내지 10분간 초음파 처리(sonication)하였다.
이뮬론 1B 마이크로타이터 플레이트를 4℃에서 밤새 100 의 리포좀(20 /ml)으로 코팅하였다. 10mg/ml의 BSA를 포함하는 TBS 배지로 실온에서 1시간동안 블로킹(blocking)한 다음, 선별된 파지 클론을 100 TBS 버퍼에 넣어 코팅된 웰에 첨가하고, 이를 천천히 흔들어 주면서 실온에서 1시간 동안 놓아 두었다(incubate). 증폭된 M13 파지 라이브러리(1 x 109 pfu)는 대조군으로 사용하였다. 이를 TBS-T (TBS containing 0.05% Tween-20) 버퍼로 6회 강하게 세척한 다음 웰에 결합한 파지를 HRP(horseradish peroxidase)-결합된 항-M13 항체(New England Biolabs) (dilution, 1:4000 in TBS-T)와 실온에서 1시간 동안 결합시켜 검출하였다. 그런 다음 HRP 기질 용액(TMB, Pierce)으로 발색반응을 시켰다. 발색반응은 2N H2SO4를 첨가하여 중단시키고 마이크로플레이트 리더(microplate reader, Bio-Rad, model 550)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 2C에서 보듯이, 대조군인 M13 파지 라이브러리의 경우 포스파티딜세린이 거의 검출되지 않은 데에 비해 선별된 파지 라이브러리의 경우 포스파티딜세린과 특이적으로 강하게 결합함을 알 수 있었으며, 이는 실시예 <3-2>의 결과와 동일한 것이었다.
<3-4> 아넥신 V의 처리에 따른 포스파티딜세린과의 결합 저해 확인
선별된 파지 클론의 포스파티딜세린에 대한 특이성을 아넥신 V(annexin V)의 존재 하에서 포스파티딜세린에 결합 여부를 확인하여 측정하였다.
이를 간략히 설명하면, 이뮬론 1B 마이크로타이터 플레이트(Immulon 1B microtiter plates)를 상기 실시예 <1-2>에 기재한 바와 같이 포스파티딜세린으로 코팅하였다. 그런 다음 10mg/ml의 BSA를 포함하는 TBS 배지로 실온에서 1시간동안 블로킹(blocking)하였다.
선별된 파지 클론을 100 TBS 버퍼에 넣어 포스파티딜세린으로 코팅된 웰에 첨가하고, 이를 천천히 흔들어 주면서 실온에서 1시간 동안 놓아 두었다(incubate). 아넥신 V를 첨가한 군에서는 상기 파지 클론을 아넥신 V 단백질(10 nM)의 존재하에서 배양한 다음 상기와 같이 100 TBS 버퍼에 넣어 포스파티딜세린으로 코팅된 웰에 첨가하고, 이를 천천히 흔들어 주면서 실온에서 1시간 동안 놓아 두었다. 이를 TBS-T (TBS containing 0.05% Tween-20) 버퍼로 6회 강하게 세척한 다음 웰에 결합한 파지를 HRP(horseradish peroxidase)-결합된 항-M13 항체(New England Biolabs) (dilution, 1:4000 in TBS-T)와 실온에서 1시간 동안 결합시켜 검출하였다. 그런 다음 HRP 기질 용액(TMB, Pierce)으로 발색반응을 시켰다. 발색반응은 2N H2SO4를 첨가하여 중단시키고 마이크로플레이트 리더(microplate reader, Bio-Rad, model 550)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 2D에서 보듯이, 아넥신 V를 첨가한 경우 본 발명의 펩티드의 포스파티딜세린과의 결합을 크게 저해함을 알 수 있었다.
<실시예 4>
사멸세포에 대한 결합 특이성 확인
<4-1> 사멸 세포에 대한 파지 클론의 결합 확인
선별된 파지 클론이 여러 가지 사멸 세포(apoptotic cells)에 대해서 결합하는지를 파지 플라크 분석(phage plaque assay)을 통해 살펴 보았다. H460 세포, H157 세포 및 U937 세포에 대해서 에토포사이드(etoposide, 50 uM, Sigma)를 처리하여 세포사멸 또는 아폽토시스(apoptosis)를 유도하였다. 상기 처리는 U937 세포에 대해서는 4시간, H460 세포 및 H157 세포에 대해서는 18시간동안 처리하였다.
사멸세포 표면에 포스파티딜세린 분자가 노출되었는지 확인하기 위하여, FACS 분석(fluorescence activated cell sorting analyses)을 제조사의 지침에 따라서 아넥신 V(BD Biosciences사)로 염색한 다음 수행하였다.
파지 결합 분석에 있어서, 사멸 세포를 PBS로 세척한 다음, 10mg/ml BSA를 포함하는 DMEM 배지에 넣고, 실온에서 30분간 전배양하였다. 전배양된 세포에 증폭된 파지 라이브러리(대조군) 또는 선별된 파지 클론을 1 x 109 pfu의 양으로 넣고 천천히 흔들어 주면서 4℃에서 1시간동안 배양하였다. 결합되지 않은 파지는 10mg/ml의 BSA와 0.05% 트윈-20(Tween-20)을 포함하는 DMEM 배지로 강하게 세척하였다. 결합된 파지는 실온에서 1mg/ml BSA를 포함하는 1 ml의 0.2 M 글리신-HCl (pH 2.2)로 10분간 처리하여 용출시켰다. 용출된 파지는 1M 트리스-HCl (pH 9.1)로 즉시 중화시킨 다음 파지 타이터를 측정하였다.
그 결과, 도 3A 내지 도 3C에서 보듯이, H460 세포(도 3A), H157 세포(도 3B) 및 U937 세포(도 3C)의 표면에 포스파티딜세린 분자가 잘 노출되어 있었으며(도 3A 내지 도 3C 우측 패널 참조), 대조군으로 사용된 M13 파지 라이브러리의 경우 거의 결합하지 않고, 정상세포에 대해서는 본 발명의 선별된 파지가 그다지 결합하지 않는 데에 비해 사멸세포와는 잘 결합함을 알 수 있었다.
<4-2> 사멸세포에 대한 결합 특이성 확인
사멸 세포에 부착된 파지의 포스파티딜세린에 대한 특이성은 아넥신 V과의 경쟁적 저해 여부로 측정하였다.
이를 위하여, 사멸 세포(H460 세포)를 파지와 배양하기 전에 아넥신 V(10 )로 30분간 전배양한 군과 대조군으로는 아넥신으로 전배양하지 않은 것을 사용하였으며, 파지는 상기 실시예 <4-1>에 기재한 바와 같이 결합 및 용출하여 타이터를 측정하였다.
아울러, 선별된 파지 클론에 나타나는 펩티드 서열, 즉 CLSYYPSYC의 아미노산 서열에 따라 합성된 펩티드(50 )를 처리한 군과 대조군으로 미처리 군 및 대조군 펩티드로 처리한 군에 대해서도 측정하였으며, 파지는 상기 실시예 <4-1>에 기재한 바와 같이 결합 및 용출하여 타이터를 측정하였다.
그 결과, 도 3D에서 보듯이, 아넥신 V를 전처리한 경우 파지의 결합이 저해되어 파지 타이터가 크게 감소함을 알 수 있었다(왼쪽 패널). 아울러, 합성한 펩티드 미처리군 및 대조군 펩티드 처리군의 경우 별다른 차이가 없는데에 비해서 합성한 본 발명의 펩티드를 처리한 경우 파지의 결합이 저해되어 파지 타이터가 크게 감소함을 알 수 있었다(오른쪽 패널).
<4-3> FACS 분석을 통한 사멸 세포에 대한 본 발명의 펩티드의 결합 확인
사멸 세포의 포스파티딜세린을 본 발명의 펩티드가 결합하는지 알아보기 위하여 다음과 같이 사멸세포에 대해서 표지된 본 발명의 펩티드를 처리한 다음 이를 FACS 분석으로 확인하였다.
본 발명에서 사용된 펩티드는 N-말단에 플루오레신(fluorescein)이 결합된 형태로, 표준 Fmoc 방법에 따라 합성하였으며, HPLC(Peptron Co.)로 분리하여 사용하였다.
본 발명의 펩티드 또는 대조군 펩티드(아미노산 서열 : NSSVDK)는 최종 농도가 2.5로 하여 Hepes 버퍼(pH 7.4, Hepes 10 mM NaCl2 138 mM, and with/without CaCl2)에 용해하였으며, 정상 H460 세포 또는 사멸 H460세포(1 x 105 cells/ml)와 최종 부피 0.5ml로 하여 실온에서 15분간 배양하였다. 상기 세포는 결합 버퍼로 세척한 다음 FACS 분석을 즉시 수행하였다(FACSScan, Becton Dickinson, San Jose, CA).
그 결과, 도 4A에서 보듯이, 정상세포에 본 발명의 펩티드를 처리한 경우(왼쪽 패널) 및 사멸세포에 대조군 펩티드를 처리한 경우(오른쪽 패널)에 비해 사멸세포에 본 발명의 펩티드를 처리한 경우 본 발명의 펩티드가 사멸세포와 잘 결합함을 알 수 있었다.
<4-4> 면역조직화학법을 이용한 사멸세포에 대한 본 발명의 펩티드의 결합 확인
H460 세포를 챔버 슬라이드(Nalgen Nunc Int.)에서 배양하고, 상기 실시예 <4-1>에 기재한 것과 같이 아폽토시스를 유도하였다. 사멸세포를 PBS로 세척한 다음 타이로이드 완충액(tyrodes buffer)에서 10 μM의 플루오레신으로 표지된 펩티드와 실온에서 30분간 배양하였다. 그런 다음 이들 세포를 아넥신 V 알렉사 분말 594(annexin V Alexa fluor 594, Molecular Probes사))로 실온에서 15분간 배양하였다. 세포를 PBS로 세척한 다음 4% 파라포름알데히드로 5분간 고정하였다. 이후, 핵 염색제인 46-디아미디노-2-페닐인돌(4,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)로 대응염색(counterstain)한 다음 마운팅액(Molecular Probes사)을 처리하고 형광 현미경(Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 촬영하였다.
그 결과, 도 4B에서 보듯이, 정상세포에 본 발명의 펩티드 또는 아넥신 V를 처리한 경우 표지가 되지 않았고(하단 패널), 사멸세포에 대조군 펩티드 또는 아넥신 V를 처리한 경우 아넥신 V로 처리한 경우만 표지가 되었다(중단 패널). 이에 비해서 사멸세포에 본 발명의 펩티드 또는 아넥신 V를 처리한 경우 두 경우 모두에서 표지가 되었고, 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 사진을 합성한 결과 본 발명의 펩티드와 아넥신 V가 서로 동일한 부위에 결합함을 알 수 있었다(상단 패널)
또한 도 4C에서 보듯이, 레이저 공초점 현미경(LEICA사)을 이용하여 영상을 촬영한 경우, 사멸세포에 본 발명의 펩티드 또는 아넥신 V를 처리한 경우 본 발명의 펩티드와 아넥신 V가 서로 동일한 부위에 결합함을 더 정확하게 알 수 있었다.
<실시예 5>
본 발명의 펩티드의 생체 내 유도(in vivo homing) 및 영상화
<5-1> 본 발명의 펩티드의 생체 내 유도 및 영상화
모든 동물실험은 국립경북대학교의 가이드라인(guidelines )에 따라 수행되었다. 종양 이식(tumor xenografts)을 하기 위하여, 6주령 BALB/c 수컷 누드 마우스(SLC, Inc.)에 10% FBS를 포함하는 RPMI 배지에 부유시킨 H460 세포(1 x 107 세포)를 오른쪽 어깨 부위에 피하 주사하였다. 그런 다음 3주간 종양세포가 0.5 내지 1cm의 크기로 자랄 수 있도록 하였다.
종양세포를 가지고 있는 마우스를 각각 캠프토테신 처리군 및 미처리군으로 나눈 다음 캠프토테신 처리군에는 펩티드 처리 24시간 전에 1회분의 캠프토테신(Sigma, 10 mg/kg)을 처리하였다. 그런 다음 각각의 마우스에 플루오레신이 표지된 본 발명의 펩티드(fluorescein-labeled CLSYYPSYC) 또는 대조군 펩티드(각각 50 )를 이소플루란 마취(isoflurane anesthesia)하에서 꼬리 정맥을 통해 투입하였다. 종양에 유도되는 펩티드는 펩티드 투입 후 각각의 시간 동안에 470 nM/GFP 필터를 사용하여 광학 영상화 시스템(ART Advanced Research Technologies Inc., Montreal, Canada)으로 확인하였다. 사용된 각각의 마우스에 대해서, 플루오레신의 기저 수치(baseline fluorescence)는 펩티드의 주입 전에 측정하였다. 얻어진 영상은 eXplore Optix optiView Software를 사용하여 처리되었고, 표준화되었다(normalize). 종양 조직의 생체 외(ex vivo) 영상화는 펩티드 투입 2시간 후 마우스로부터 종양을 제거한 다음 수행하였으며, 그 영상은 상기한 바와 같이 처리되었다.
종양 조직에 대한 생체 내 유도 확인 결과, 도 5A에서 보듯이, 본 발명의 펩티드가 처리된 군에서 종양 조직에서 플루오레신으로 표지된 본 발명의 펩티드의 신호가 2시간째부터 강하게 측정되었으나, 본 발명의 펩티드를 처리하지 않거나 대조군 펩티드를 처리한 경우 플루오레신 신호가 미약하게 검출되거나 거의 검출되지 않음을 알 수 있었다.
아울러, 종양 조직에 대한 생체 외 영상화 결과, 도 5B에서 보듯이, 상기와 같이 본 발명의 펩티드가 처리된 군에서는 종양 조직에서 플루오레신 신호가 강하게 측정되었으나, 본 발명의 펩티드를 처리하지 않거나 대조군 펩티드를 처리한 경우 플루오레신 신호가 미약하게 검출되거나 거의 검출되지 않음을 알 수 있었다.
<5-2> 조직학적 시험을 통한 본 발명의 펩티드의 생체 내 유도의 확인
조직학적 시험을 위하여, 상기 마우스를 마취한 다음 개복하였다. 심장을 통해 PBS 및 4% paraformaldehyde (PFA) 고정액을 관류시키고, 종양 조직 및 기관을 제거하였다. 각 조직을 동결절단(Cryosections)한 다음 형광현미경법(fluorescence microscopy)으로 본 발명의 펩티드를 관찰하였다. 종양 혈관(tumor vessels)은 마우스 CD31에 대한 항체(BD Pharmigen) 및 알렉사 568(alexa 568)로 표지된 2차 항체를 이용하여 면역조직화학법(immunohistochemistry)으로 염색하였다. 종양 조직에서의 세포사멸은 제조사(Chemicon Int. USA)의 지침에 따라 TUNEL(in vitro terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling) 분석법으로 확인하였다.
그 결과, 도 6에서 보듯이, 본 발명의 펩티드를 처리한 경우 종양 조직에서 CD31에 의해 염색된 부위에서 다량으로 본 발명의 펩티드가 관찰되나(상단 패널), 대조군 펩티드를 처리한 경우 거의 관찰되지 않음을 알 수 있었다(중단 패널). 한편 대조군 기관으로서 간(liver) 및 폐(lung)의 조직에서는 본 발명의 펩티드가 관찰되지 않았으며, 다만 신장(kidney)의 경우 펩티드가 소변을 통해 배설되므로 요배설 경로에 있는 펩티드에 의한 형광이 관찰되었다(하단 패널).
아울러, TUNEL 분석 결과, 도 6B에서 보듯이, 본 발명의 펩티드 형광신호가 TUNEL 염색이 되는 부위, 즉 세포 사멸이 일어나는 부위에서 다량으로 확인됨을 알 수 있었다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드는 포스파티딜세린과 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 포스파티딜세린의 검출, 더 나아가 포스파티딜세린을 세포 표면으로 발현하는 사멸세포 및 종양세포의 검출 또는 영상화 등에 다양하게 사용될 수 있다.

Claims (23)

  1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지며, 포스파티딜세린과 특이적으로 결합하는 폴리펩티드.
  2. 제1항의 폴리펩티드를 암호화하는 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드.
  3. 제2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  4. 제3항의 벡터로 형질전환된 형질전환체.
  5. 제1항의 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 포스파티딜세린 검출용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포어(chromophore), 발광물질 및 형광물질(fluorescer)로 이루어진 군에서 선택되는 하나로 표지된 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. (a) 제1항의 폴리펩티드를 시료와 혼합하는 단계;
    (b) 미결합되거나 비특이적으로 결합된 상기 폴리펩티드를 제거하는 단계; 및
    (c) 상기 폴리펩티드의 결합 여부 및 위치를 확인하는 단계를 포함하는 포스파티딜 세린의 검출 방법.
  8. 제1항의 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 사멸세포(apoptotic cell) 검출용 조성물.
  9. 제1항의 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 조성물은 종양성 질환에 특이적인 것임을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 종양성 질환은 대장암, 폐암, 위암, 식도암, 췌장암, 담낭암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 난소암, 유방암, 갑상선암, 뇌암, 두경부암, 악성흑색종, 피부암, 간암, 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma), 복합 골수종(multiple myeloma), 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia), 신경아종(neuroblastoma), 재생불량성 빈혈로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제9항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 파클리탁셀, 독소루비신, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀(docetaxel), 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌(bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴(cisplain), 5-플로오우라실(5-fluouracil), 아드리아마이신(adriamycin), 메토트렉세이트(methotrexate), 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란(melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard), 니트로소우레아(nitrosourea)로 이루어진 군에서 선택된 항-종양성 질환 제제와 결합된 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제1항의 폴리펩티드 및 이와 결합된 항-종양성 질환 제제를 유효성분으로 포함하는 종양성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 항-종양성 질환 제제는 파클리탁셀, 독소루비신, 빈크리스틴, 다우노루비신(daunorubicin), 빈블라스틴(vinblastine), 액티노마이신-D(actinomycin-D), 도세탁셀(docetaxel), 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 비산트렌(bisantrene), 호모해링토닌(homoharringtonine), 글리벡(Gleevec; STI-571), 시스플라틴(cisplain), 5-플로오우라실(5-fluouracil), 아드리아마이신(adriamycin), 메토트렉세이트(methotrexate), 부설판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란(melphalan), 니트로겐 무스타드(nitrogen mustard), 니트로소우레아(nitrosourea)로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제1항의 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 종양성 질환 부위의 영상화용 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 발색효소, 방사성동위원소, 크로모포어(chromophore), 발광물질, 형광물질(fluorescer), 상자성입자(super paramagnetic particles) 및 초상자성입자(ultrasuper paramagnetic particles)로 이루어진 군에서 선택되는 하나로 표지된 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제1항의 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 스코트 증후군(Scott syndrome), 항인지질 증후군(antiphospholipid syndrome), 겸상 적혈구 빈혈증(sickle cell anemia), 탈라세미아(thalathemia), 스토마토싸이토시스(stomatocytosis), 요독증(uremia), 신장결석(kidney stone disease), 당뇨병(diabetes), 고혈당증(hyperglycemia), 바이러스 감염 및 미생물 감염, 말라리아(malaria), 전-자간증(pre-eclampsia), 고빌리루빈혈증(hyperbilirubinemia), 신생물 종양(neoplasia)으로 이루어진 군에서 선택된 질환의 진단용 조성물.
  18. 포스파티딜세린 검출을 위한 제1항의 폴리펩티드의 용도.
  19. 사멸세포(apoptotic cell) 검출을 위한 제1항의 폴리펩티드의 용도.
  20. 약물 전달을 위한 제1항의 폴리펩티드의 용도.
  21. 종양성 질환 치료제의 제조를 위한 제1항의 폴리펩티드 및 이와 결합된 항-종양성 질환 제제의 용도.
  22. 종양성 질환 부위의 영상화를 위한 제1항의 폴리펩티드의 용도.
  23. 스코트 증후군(Scott syndrome), 항인지질 증후군(antiphospholipid syndrome), 겸상 적혈구 빈혈증(sickle cell anemia), 탈라세미아(thalathemia), 스토마토싸이토시스(stomatocytosis), 요독증(uremia), 신장결석(kidney stone disease), 당뇨병(diabetes), 고혈당증(hyperglycemia), 바이러스 감염 및 미생물 감염, 말라리아(malaria), 전-자간증(pre-eclampsia), 고빌리루빈혈증(hyperbilirubinemia), 신생물 종양(neoplasia)으로 이루어진 군에서 선택된 질환의 진단을 위한 제1항의 폴리펩티드의 용도.
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