KR20200050975A - 엑소좀의 표적화 방법 - Google Patents

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KR20200050975A
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cancer
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vesicles
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테리 허미스턴
맥신 바우존
크리스토퍼 에이치. 콘타그
조나단 하디
마사미츠 카나다
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글래디에이터 바이오사이언시즈 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 본 명세서에 개시된 방법으로부터 수득되거나 수득가능한 GLA 도메인 및 세포외 소포를 포함하는 분자를 이용하여 세포외 소포를 표적화하는 방법에 관한 것이다.

Description

엑소좀의 표적화 방법
관련 출원에 대한 참조설명
본 출원은 2017년 9월 5일자로 출원된 미국 가출원 제62/554,530호, 2017년 9월 5일자로 출원된 미국 가출원 제62/554,533호, 2017년 10월 6일자로 출원된 미국 가출원 제62/569,403호, 2017년 11월 10일자로 출원된 미국 가출원 제62/584,565호 및 2017년 11월 30일자로 출원된 미국 가출원 제62/593,014호의 우선권을 주장한다.
서열 목록 포함
본 출원은 EFS-웹을 통해 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이는 종이 사본 및 컴퓨터 판독가능 형태(CRF)를 모두 제공하며, 파일 명칭은 "ST-CT7-PCT_sequence.txt"이며, 2018년 9월 5일에 생성되었고, 크기는 9,823 바이트이며, 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
본 개시내용은 본 명세서에 개시된 방법으로부터 수득되거나 수득가능한 GLA 도메인 및 세포외 소포(extracellular vesicle)를 포함하는 분자를 사용하여 세포외 소포를 표적화하는 방법에 관한 것이다.
세포외 소포(또한 마이크로소포 또는 마이크로입자로도 알려짐)는 역사적으로 세포가 폐기물을 배출하기 위한 소포인 것으로 생각되었다. 그러나, 최근 세포외 소포는 사실상 절대로 중요한 세포 대 세포 소통에 관여한다는 것이 확립되었다.
세포외 소포는 건강한 세포, 줄기 세포, 및 암 세포와 같은 병든 세포를 비롯한 거의 모든 포유동물 세포로부터 유래될 수 있음이 입증되었다. 세포외 소포는 극히 안정하고, 혈액 혈장, 타액, 소변, 담즙액, 활액, 정액 및 모유를 포함하는 거의 모든 체액에 존재할 수 있다.
암세포와 같은 병든 세포는 엑소좀(exosome)과 같은 세포외 소포를 이용하여 전이를 위한 부위를 준비하고 파종(seed)하는 것으로 생각된다. 병원체 감염된 세포는 감염을 확산시키기 위해 세포외 소포를 사용할 수 있다. 또한, 박테리아 세포는 세포외 소포를 방출하는 것으로 알려져 있다.
이러한 세포외 소포, 특히 병원성 과정에 관여하는 것들을 연구하고, 이해하고, 통제하는 데 있어서 지대한 관심이 있다. 이러한 소포는 줄기 세포에 대한 대안으로서 치료에 사용될 수 있다는 것이 제안되었다.
그러나, 소포는 미세하고 생체내에 낮은 농도로 존재하기 때문에 특정한 실질적인 어려움이 있다. 또한, 정상 세포 유래의 세포외 소포로부터 질병 세포 유래의 세포외 소포를 구별하는 마커들이 거의 없다. 이러한 미세한 실체들이 생체내에서 생물학적 분자, 인자, 이온, 미네랄 등의 혼합물을 포함하는 복잡한 환경에 있다는 점도 또 다른 까다로운 문제이다. 따라서, 이러한 세포외 소포를 분리 및/또는 모니터링하는 것조차 과제이다.
소포를 분리하는 데에는 7 단계 이상이 요구될 수 있고, 사용되는 주요 파라미터는 일반적으로 크기이다. 세포외 소포의 직경은 300㎚ 이하일 수 있고, 낮은 굴절률을 갖기 때문에, 세포외 소포는 현재 사용되는 많은 기술들의 검출 범위 아래에 있다. 나노기술 및 마이크로플루이딕스(microfluidics)를 이용하는 다수의 소형 시스템이 세포외 소포 분석을 촉진하기 위해 개발되었다. 이러한 새로운 시스템은 마이크로NMR 장치, 나노플라즈몬 칩 및 단백질 프로파일링을 위한 자기 전기화학 센서; 및 RNA 검출을 위한 통합된 유체 카트리지를 포함한다. 유세포분석법은 현탁액에서 세포외 소포를 검출하는 광학 방법이다. 그럼에도 불구하고, 단일 세포외 소포를 검출하기 위한 유세포분석법의 이용가능성은 제한된 민감도 및 스웜(swarm) 검출 같은 잠재적인 측정 인공물로 인하여 여전히 부적절하다. 단일 세포외 소포를 검출하는 다른 방법은 원자력 현미경법, 나노입자 추적 분석, 라만 마이크로분광법, 조정가능한 저항 펄스 감지법(tunable resistive pulse sensing), 및 투과 전자 현미경법이다.
연구 및/또는 진단 목적용으로 세포외 소포(vesicle)를 분리할 기회를 넘어서서, 이들 세포외 소포는 페이로드(payload)와 함께 부하하고, 일련의 병들을 표적 및/또는 치료하기 위한 천연 소포로서 사용하기에 적합할 수 있는 것으로도 고려된다. 그러나, 화물 및 표적화 모이어티를 부하하기 위한 잠재성을 실현하기 위해서는 현재 상당한 과제가 존재한다:
Figure pct00001
이러한 세포외 소포 내에 -
Figure pct00002
예컨대, 단백질, 핵산 - 천연 및 비-천연 올리고뉴클레오타이드 - 소 분자, 효소, 치료, 진단/예후 목적 등을 위해 세포외 소포 내에 함유물을 정의하는 프로브;
Figure pct00003
그리고 이러한 세포외 소포 위에 -
Figure pct00004
표적화를 개발, 변경 또는 향상시키고, 치료 단백질을 표시하고, 분석 또는 조작을 위해 세포외 소포를 표지화 및 예를 들어 수집하기 위해,
Figure pct00005
몇몇 마이크로RNA는 소포에 들어가는 것으로 밝혀져 있지만, 물질을 소포 내에 유입시키기 위한 강력한 메커니즘은 지금까지 존재하지 않는다,
Figure pct00006
예를 들어, 전기침투(electroporation)를 통한 손상 시, 형질감염 시약의 통합은 세포외 소포의 상업적 유용성을 손상시킬 수 있고,
Figure pct00007
바이러스 벡터에 의한 비효율적인 형질도입 시, 세포외 소포를 변경시키는 수단을 통한 부하 또는 분리 또한 진단 또는 치료 잠재성 등을 손상시킬 수 있다(문헌[Vader et al., Adv Drug Delivery Rev 106:148-156, 2016, Sutaria et al., Pharm Res 34: 1053-1066, 2017, Lu et al., Eur J Pharm and Biopharm 119: 381-395, 2017] 참조),
Figure pct00008
또한, 사포닌은 세포외 소포의 투과성을 증가시키기 위한 시약으로서 제안되어 왔다. 그러나, 사포닌은 용혈성인 것을 비롯한 복잡한 생물학적 활성을 갖는다. 사포닌 Quil A 및 QS-21의 분획은 항원에 대한 면역 반응을 증가시키는 백신 보조제로 사용된다. 따라서, 사포닌의 사용은 간단하지 않다.
세 번째로, 병인의 전파를 감소시키기 위해 세포외 소포 내의 신호 및 병원성 물질을 표적화하는데 유용할 수 있다.
본 명세서의 개시내용은 상기 문제를 해결한다.
놀랍게도, 병원성 세포, 예를 들어 암세포, 박테리아 세포 등으로부터 방출된 상기 세포외 소포들은 표면 노출된 포스파티딜세린을 갖는다. 노출된 포스파티딜세린은, 예를 들어 "병원성" 소포에 대한 면역 반응을 하향조절(downregulate)하는 작용을 할 수 있다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, "병원성 세포외 소포"는 표면 노출된 포스파티딜세린을 갖지 않는 정상적인 건강한 세포외 소포와는 대조적으로 노출된 포스파티딜세린의 존재를 특징으로 하는 것일 수 있다.
포스파티딜세린은 촉매 도메인의 존재 없이 GLA-도메인을 포함하는 GLA-성분에 의해 표적화될 수 있다. 이들 분자는 아포토시스(apotosis) 세포, 예를 들어 비정상적인 질병/감염 세포로부터 유래된 소포를 표적화하는데 사용될 수 있다.
더욱 더 놀랍게도, 본 발명자들은 GLA-성분이 또한 줄기 세포(예를 들어, 건강한 줄기 세포)에 결합하는 것도 밝혀냈다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 이들 세포는 그 표면 상에 포스파티딜세린을 제공할 수 있으며, 이는 면역 억제 효과 및 줄기 세포의 염증 효과에 기여할 수 있다.
표면 노출된 포스파티딜세린을 갖는 세포로부터 유래된 세포외 소포는 또한 그의 외부 표면 상에 표면 노출된 포스파티딜세린을 갖기도 한다. 따라서, GLA-성분은 또한 줄기 세포 유래의 세포외 소포를 표적화하는 데에도 사용될 수 있다.
GLA-도메인은 페이로드, 예를 들어 표지, 비드, 진단 분자, 표적화 모티프 및/또는 치료제에 연결 또는 융합될 수 있다. 이는 이러한 세포외 소포의 또는 세포외 소포를 통한 분리, 식별, 추적 및/또는 치료적 개입(intervention)을 가능하게 한다.
대안적으로 또는 부가적으로, 페이로드는 치료제, 예를 들어 약물, 생물학적 치료제, 중합체 또는 독소, 예를 들어 치료 바이러스, 종양용해 바이러스, 바이러스 벡터, 항-바이러스 약물, 항-박테리아 약물, 항-기생충제, 항암 약물, 항암 치료법 또는 화학요법제, 바이러스 또는 바이러스 벡터(예를 들어, 종양용해 바이러스)일 수 있다.
따라서, GLA-성분은 GLA-도메인 결합성 표면 노출된 포스파티딜 세린을 통해 세포외 소포의 표면에 페이로드를 정착(anchor)시키는데 사용될 수 있다.
또한, 본 발명자들은 본 개시내용에서 사용되는 GLA-성분이 여기에 부착된 페이로드를 세포외 소포 내에서 수송할 수 있음을 암시하는 데이터를 갖고 있다. 따라서, GLA-성분은 페이로드를 세포외 소포 내부로 전달하는데 사용될 수 있다.
이는 공지된 기존 기술 및 이펙터(effector)/리포터(reporter) 분자가 다시 집중을 받고 소포와 함께 모니터, 분리 및 치료적 개입하도록 사용될 수 있기 때문에 치료 및/또는 진단 용도에 중요한 영향을 미친다.
일단 표지되면, 소포는 예를 들어 생체내에서 모니터될 수 있거나, 유세포법, 자기 분류(magnetic sorting) 등과 같은 공지된 기술을 사용하여 분리될 수 있다.
또한, 특정 형태의 소포의 존재가 특정 병리상태에 대한 비침습성 진단제로서 사용될 수 있다는 것이 밝혀지기 시작하고 있다.
또한, 암이 소포를 사용하여 전이를 파종하고 촉진한다는 가설을 가정하면, 이러한 소포를 치료법으로 파괴, 제거 또는 표적화하는 것은 전이를 예방하거나 감소시키는 방법일 수 있고, 예를 들어, RNAi와 같은 뉴클레오타이드는 세포외 소포로 수송되어 그 소포에 운반된 활성 마이크로RNA를 넉아웃(knock out)시킬 수 있다.
바이러스 감염 세포와 같은 감염 세포에서 흘러나온 소포는 감염 세포 유래의 세포 물질, 예를 들어 RNA, 단백질, 지질 및 탄수화물, 및 또한 바이러스 기원의 핵산을 함유한다. 이러한 소포는 건강한 세포의 감염에 역할을 하는 부분을 가질 수 있다[Altan-Bonnet N. 2016. Extracellular vesicles are the Trojan horses of viral infection. Curr Opin Microbiol 32:77-81; Schorey JS, Cheng Y, Singh PP, Smith VL. 2015, Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions; EMBO Rep 16:24-43, Schorey JS, Harding CV. 2016; Extracellular vesicles and infectious diseases: new complexity to an old story. J Clin Invest 126:1181-9].
엑소좀과 같은 소포는 이들의 작은 크기(예를 들어, 혈액 뇌 장벽을 가로지를 수 있음), 세포의 형질 막과 융합하여 이들의 함유물을 전달하기 위해 자신의 내용물을 전달하는 천연 능력, 안정한 내부 환경 및 핵산(DNA, mRNA 및 miRNA), 지질 및 단백질을 포함하는 기능성 분자를 수용체 세포에 전달하는 능력을 포함하는 여러 특성을 가져 세포로 물질을 전달하기에 이상적이게 된다.
최근의 접근법은 치료 적용을 위하여 세포외 소포를 조작하는 것을 목표로 하고 있다. 이러한 접근법은 소포 함유물을 변경하거나 이들의 이동 경로를 조작하는 것을 포함한다. 특히, 세포외 소포는 종양 세포 침입, 이동 및 증식을 감소시켜 암 치료를 위한 치료적 소포로서 역할을 할 수 있고, 화학요법에 대한 민감도를 증가시킬 수 있으며, 증강된 면역 반응 및 세포사를 촉발할 수 있는 것으로 입증되었다.
또한, 소포는 백신으로서 사용하기에 적합할 수 있다는 것도 밝혀지고 있다. 바이러스 감염 세포로부터 방출된 소포는 정확하게 폴딩되고 프로세싱된 바이러스 물질의 고유한 공급원을 나타내며, 이는 백신접종(vaccination)에서 항원으로 사용하기에 이상적이다. 그러나, 백신은 일반적으로 항원 성분에 대한 면역 반응을 상승시키기 위한 보조제의 존재를 필요로 한다.
고전적인 항온처리, 전기침투 및 형질감염의 접근법을 사용하여 세포외 소포 함유물을 조작하기 위한 종래의 시도들은 불량한 전달 효율, 제한된 크기의 페이로드, 막에 잔류 부형제의 존재 및 어떤 종류의 페이로드가 사용될 수 있는지에 대한 제한으로 인해 제약이 있었다. 따라서, 이러한 소포의 잠재성을 현실화하는 데에는 여전히 몇 가지 과제가 있다. 따라서, 세포외 소포 위 및 내로 함유물을 효과적으로 전달할 수 있는 신규한 방법이 필요하다.
본 개시내용은 분리하여 진단 목적으로 사용하고, 치료적 개입을 위해 표적화하고, 치료제를 예를 들어 RNA 및 DNA를 포함하는 뉴클레오타이드와 같은 분자를 포함하는 유전자 융합 또는 부착을 통해 전달하는데 사용될 수 있게 함으로써 세포외 소포의 잠재성을 활용하는 것을 용이하게 한다.
더욱이, 소포의 표면에서 포스파티딜 세린의 발현은 소포에 대한 면역 반응을 하향조절한다. 세포외 소포의 표면에 존재하는 GLA-성분(부착된 페이로드 없이) 결합성 포스파티딜세린은 소포체를 면역계에 해제(decloak)시킨다. 따라서, 본 개시내용의 GLA-성분은 면역계에 대한 세포외 소포의 가시성을 증가시키는데 사용될 수 있다.
이제, 본 발명은 하기 단락에 요약될 것이다:
1a. 표면 노출된 포스파티딜세린(surface exposed phosphatidyl serine)을 이용하여 세포외 소포를 표적화하는 방법으로서,
상기 세포외 소포, 예를 들어 마이크로소포, 아포토시스 소포 및 엑소좀을 포함할 수 있는 유체 내로 감마-카복시글루탐산 성분(GLA-성분)을 포함하는 분자를 도입시키는 단계를 포함하되,
상기 GLA-성분은 GLA 도메인 또는 이의 활성 단편을 포함하며 GLA 단백질 유래의 활성 촉매 도메인은 포함하지 않는다.
1b. 감마-카복시글루탐산 성분(GLA-성분)에 연결된 페이로드를 포함하는 분자로서,
상기 GLA-성분은 GLA 도메인 또는 이의 활성 단편을 포함하고, 세포외 소포의 치료 또는 진단에 사용하기 위한 GLA 단백질 유래의 활성 촉매 도메인은 포함하지 않는다.
1c. 감마-카복시글루탐산 성분(GLA-성분)에 연결된 페이로드를 포함하는 분자로서,
상기 GLA-성분은 GLA 도메인 또는 이의 활성 단편을 포함하며, 세포외 소포의 치료 또는 진단을 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 GLA 단백질 유래의 활성 촉매 도메인은 포함하지 않는다.
2. 단락 1a, 1b 또는 1c에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 세포외 소포는 10㎚ 내지 1000㎚ 범위의 직경을 갖는다.
3. 단락 1a, 1b, 1c 또는 2에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 세포외 소포는 엑소좀이다.
4. 단락 1 내지 3 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 세포외 소포(예를 들어, 엑소좀)는 직경이 1000㎚ 이하, 예를 들어 1㎚ 내지 10㎛, 예컨대 10㎚ 내지 5㎛, 특히 10㎚ 내지 1㎛, 더 구체적으로 20㎚ 내지 100㎚, 더욱 특히 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100㎚인 것이다.
5. 단락 1a, 1b 또는 1c 내지 4 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 소포는 밀도가 1 내지 1.5 g/㎖, 예컨대 1 내지 1.2 g/㎖, 특히 1.13 내지 1.19 g/㎖ 범위인 것이다.
6. 단락 1a, 1b, 1c 내지 5 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 소포는 Lamp-1, Lamp-2, CD13, CD86, Flotillin, Syntaxin-3, CD2, CD36, CD40, CD40L, CD41a, CD44, CD45, ICAM-1, 인테그린 알파4, LiCAM, LFA-1, Mac-1 알파 및 베타, Vti-IA 및 B, CD3 엡실론 및 제타, CD9, CD18, CD37, CD53, CD63, CD81, CD82, CXCR4, FcR,GluR2/3, HLA-DM(MHC II), 면역글로불린, MHC-I 또는 MHC-II 성분, TCR 베타, 테트라스파닌 및 이들의 2종 이상의 조합으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 막관통 단백질을 포함한다.
7. 단락 1a, 1b, 1c 내지 6 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 소포는 건강하지 않은 세포, 예를 들어, 아포토시스 세포, 괴사 세포, 암 세포, 병원체 감염 세포(예를 들어, 바이러스 감염 세포, 박테리아 감염 세포 또는 기생충 감염 세포)로부터 방출되었다.
8. 단락 7에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 세포는 암 세포이다.
9. 단락 8에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 세포는 암 줄기세포이다.
10. 단락 1 내지 6 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 세포외 소포는 건강한 줄기 세포에서 유래하는 것이다.
11. 단락 1a, 1b, 1c 내지 10 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 유체는 생체외 환자 샘플, 예를 들어 혈액 샘플, 낭포 또는 종양에서 채취된 유체, 균질화된 생검 또는 유사물을 포함한다.
12. 단락 1 내지 10 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 GLA-성분은 생체내 투여된다.
13. 단락 1a, 1b 또는 1c 내지 12 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 GLA 도메인 또는 이의 활성 단편은 트롬빈, 제VII 인자, 제IX인자, 제X인자, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 오스테오칼신, 매트릭스 GLA 단백질, GAS6, 트랜스스레틴, 페리오스틴, 프롤린 풍부 GLA 1, 프롤린 풍부 GLA 2, 프롤린 풍부 GLA 3 및 프롤린 풍부 GLA 4로부터 독립적으로 선택된다.
14. 단락 1a, 1b 또는 1c 내지 13 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 GLA 도메인 또는 이의 활성 단편은 트롬빈, 제VII 인자, 제IX인자, 제X인자, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z 및 GAS6으로부터 독립적으로 선택되고, 예를 들어 단백질 S, 특히 서열번호 1에 제시된 서열을 포함하는 것이다.
15. 단락 1 내지 11 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 GLA 도메인 성분은 EGF 도메인, 예를 들어 칼슘 결합 EGF 도메인을 추가로 포함한다.
16. 단락 15에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 작제물이 트롬빈, 제VII 인자, 제IX인자, 제X인자, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 오스테오칼신, 매트릭스 GLA 단백질, GAS6, 트랜스트레틴, 페리오스틴, 프롤린 풍부 GLA 1, 프롤린 풍부 GLA 2, 프롤린 풍부 GLA 3 및 프롤린 풍부 GLA 4로부터 선택되는 EGF 도메인을 포함한다.
17. 단락 16에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 작제물은 트롬빈, 제VII 인자, 제IX인자, 제X인자, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z 및 GAS6으로부터 독립적으로 선택되는 EGF 도메인, 예를 들어 단백질 S 유래의 EGF 도메인을 포함한다.
18. 단락 1a, 1b 또는 1c 내지 17 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 GLA-성분은 서열번호 6에 제시된 서열 또는 이의 His-태그가 없는 유도체, 특히 서열번호 6에 제시된 서열을 포함한다.
19. 단락 1a, 1b 또는 1c 내지 14 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 GLA-도메인 성분은 크링글(Kringle) 도메인을 추가로 포함한다.
20. 단락 19에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 크링글 도메인은 활성화 전사 인자 2(ATF); 제XII 인자(F12); 트롬빈(F2); 히알루로난-결합 단백질 2(HABP2); 간세포 성장 인자(HGF); 간세포 성장 인자 활성인자(HGFAC); 크레멘(Kremen) 단백질 1(KREMEN1); KREMEN2; 지단백질(a)(LPA); LPAL2; 대식세포-자극 단백질(MSP 또는 MST1); 포스포이노시타이드-3-키나제-상호작용 단백질 1(PIK3IP1); 조직 플라스미노겐 활성인자(PLAT); 유로키나제(PLAU); 플라스민(PLG); PRSS12; 티로신-단백질 키나제 막관통 수용체 ROR1(ROR1); 및 티로신-단백질 키나제 막관통 수용체 ROR2(ROR2)를 포함하는 군으로부터 선택된 단백질에서 유래한다.
21. 단락 1a, 1b 또는 1c 내지 20 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 GLA-성분은 페이로드에 연결된 것이다.
22. 단락 21에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 GLA-성분은 페이로드에 접합된 것이다.
23. 단락 1a, 1b 또는 1c 내지 22 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 GLA-성분은 융합 단백질의 일부이다.
24. 단락 23에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 페이로드는 검출가능한 표지를 포함한다.
25. 단락 24에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 표지는 형광 분자(형광 프로브(예를 들어, 로다민 염료, FITC, FAM, CY5), 비오틴, 효소, 태그(예를 들어, HIS-태그, FLAG-태그, myc-태그), 방사성핵종(특히, 방사성요오드화물, 방사성동위원소, 예컨대 99mTc), 발광 표지 또는 검출가능한 표지가 분자 비콘(Molecular Beacon)에 존재하는 것을 포함하여 NMR 또는 ESR 분광법에 의해 검출될 수 있는 화합물로부터 선택된다.
26. 단락 1a, 1b 또는 1c 내지 25 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 페이로드는 비드, 플레이트 또는 태그, 예를 들어 자기 비드(magnetic bead)와 같은 분리가능한 비드이다.
27. 단락 21 내지 26에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 페이로드는 링커를 통해 GLA-성분에 연결된다.
28. 단락 27에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 링커는 절단 가능하다.
29. 단락 21 내지 28 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 GLA-성분 및 상기 페이로드는 진단용이다.
30. 단락 1a, 1b 또는 1c 내지 29 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 방법은 세포외 소포의 농축 집단을 제공하는 추가 단계를 포함한다.
31. 단락 1a, 1b 또는 1c 내지 30 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 방법은 세포외 소포를 분리하는 단계를 포함한다.
32. 단락 1a, 1b 또는 1c 내지 31 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 방법은 시험관내에서 수행된다.
33. 단락 1a, 1b 또는 1c 내지 32 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 GLA-성분을 포함하는 분자는 치료제이다.
34. 단락 21 내지 25 및 33 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 페이로드는 약물, 화학요법제, 펩타이드(스테이플화된 펩타이드를 포함함) 또는 생물학적 치료제, 예를 들어 항-바이러스 약물, 항-박테리아 약물, 항-기생충제, 항암 약물, 항암 요법을 포함한다.
35. 단락 21 내지 25, 33 및 34 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 페이로드는 독소, 중합체(예를 들어, 합성 또는 천연 발생 중합체), 생물학적 활성 단백질(예를 들어, 효소, 다른 항체 또는 항체 단편, 예컨대 인트라바디(intrabody), 약물(소분자(화학 개체), c, 핵산 및 이의 단편(예를 들어, DNA, RNA 및 이의 단편), 금속 킬레이트제, 나노입자 또는 이들의 2종 이상의 조합을 포함한다.
36. 단락 35에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 독소는 아우리스타틴(예를 들어, MMAE(모노메틸 아우리스타틴 E), MMAF(모노메틸 아우리스타틴F)), 피롤로벤조디아제핀(PBD), 독소루비신, 듀로카마이신, 메이탄시노이드(예를 들어, N 2'-데아세틸-N 2'-(3-머캅토-l-옥소프로필)-메이탄신(DM1), N 2'-데아세틸-N 2'-(4-머캅토-l-옥소펜틸)-메이탄신(DM3) 및 N 2'-데아세틸-N 2'(4-메틸-4-머캅토-l-옥소펜틸)-메이탄신(DM4)), 칼로케아미신, 도라스타틴, 메이탄신, α-아마니틴, 슈도모나스 외독소(Pseudomonas exotoxin, PE38), 리신(ricin) A 체인, 디프테리아 독소, 자리공속(Pokeweed) 항바이러스 단백질(PAP), 사포린, 게론닌(gelonin) 및 튜불리신(tubulysin)으로부터 선택된다.
37. 단락 34 내지 36 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 화학요법제는 테모졸로마이드(temozolomide), 에포틸론(epothilone), 멜팔란(melphalan), 카무스틴(carmustine), 부설판(busulfan), 로머스틴(lomustine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 다카바진(dacarbazine), 포리페프로산(polifeprosan), 아이포스파미드(ifosfamide), 클로람부실(chlorambucil), 메클로레타민(mechlorethamine), 부설판(busulfan), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 카보플라틴, 시스플라틴, 티오테파, 캡시타빈, 카페시타빈(capecitabine), 스트렙토코신(streptozocin), 바이칼루타미드(bicalutamide), 플루타미드(flutamide), 닐루타미드(nilutamide), 류프롤라이드 아세트산염(leuprolide acetate), 독소루비신(doxorubicine) 염산염, 블레오마이신(bleomycin) 황산염, 다우노루비신(daunorubicin) 염산염, 닥티노마이신(dactinomycin), 리포좀성 다우노루비신 구연산염, 리포좀성 독소루비신 염산염, 에피루비신(epirubicin) 염산염, 아이다루비신(idarubicin) 염산염, 미토마이신, 독소루비신, 발루비신(valrubicin), 아나스트로졸(anastrozole), 토레미펜(toremifene) 구연산염, 사이타라빈(cytarabine), 플루오로우라실(fluorouracil), 플루다라빈(fludarabine), 플록수리딘(floxuridine), 인터페론 α-2b, 플리카마이신(plicamycin), 머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 인터페론 α-2a, 메드록시프로게르스테론(medroxyprogersterone) 아세트산염, 에스트라무스틴 인산염 나트륨, 에스트라디올, 류프롤라이드(leuprolide) 아세트산염, 메제스트롤(megestrol) 아세트산염, 옥트레오타이드(octreotide) 아세트산염, 데이틸스틸베스트롤(deithylstilbestrol) 이인산염, 테스토락톤, 고세렐린(goserelin) 아세트산염, 에토포사이드(etoposide) 인산염, 빈크리스틴(vincristine) 황산염, 에토포사이드, 빈블라스틴, 에토포사이드, 빈크리스틴 황산염, 테니포사이드(teniposide), 트라스투주맙(trastuzumab), 젬투주맙 오조가미신(gemtuzumab ozogamicin), 리툭시맙(rituximab), 엑세메스테인(exemestane), 이리노테칸(irinotecan) 염산염, 아스파라기나제, 젬시타빈(gemcitabine) 염산염, 알트레타민(altretamine), 토포테칸(topotecan) 연산염, 하이드록시우레아, 클라드리빈(cladribine), 미토탄(mitotane), 프로카바진 염산염, 비노렐빈 주석산염, 펜트로스타틴 나트륨, 미톡산트론(mitoxantrone), 페가스파르가제(pegaspargase), 데니류킨 디프티틱스(denileukin diftitix), 알트레티노인(altretinoin), 포르피머(profimer), 벡사로텐(bexarotene), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(decetaxel), 삼산화비소, 트레티노인(tretinoin) 및 이들의 2종 이상의 조합으로부터 선택된다.
38. 단락 34 내지 37 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 화학요법제는 알킬화제, 티미딜레이트 신타제 저해제를 포함하는 항대사물질, 탁산, 안트라사이클린, 식물 알카로이드를 포함하는 항미세소관 제제, 및 이들의 2종 이상의 조합으로부터 선택된다.
39. 단락 38에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 화학요법제는 파클리탁셀, 도세탁셀, 아브락산, 카바지탁셀, 이들 중 어느 하나의 유도체, 및 전술한 것들 중 임의의 2 이상의 조합으로부터 선택된다.
40. 단락 38 또는 39에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 알킬화제는 질소 머스타드, 나이트로소우레아, 테트라진, 아지리딘, 플라틴 및 이의 유도체, 비고전적 알킬화제 및 이들의 2종 이상의 조합으로부터 선택된다.
41. 단락 40에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 플라틴이 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 사트라플라틴, 피코플라틴, 네다플라틴, 트리플라틴, 리포플라틴 및 이들의 2종 이상의 조합으로부터 선택된다.
42. 단락 38 내지 41 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 알킬화제는 항엽산제(예를 들어, 메토트렉세이트 및 페메트렉시드), 퓨린 유사체(예를 들어, 티오퓨린류, 예컨대 아자티오퓨린, 머캅토퓨린, 티오퓨린, 플루다라빈(인산염 형태 포함), 펜토스타틴 및 클라드리빈), 피리미딘 유사체(예를 들어, 플루오로피리디민류, 예컨대 5-플루오로우라실 및 이의 전구약물, 예컨대 카펙시타빈[Xeloda®]), 플록수리딘(floxuridine), 젬시타빈, 시타라빈, 데시타빈, 랄티트렉시드(tomudex) 염산염, 클라드리빈 및 6-아자우라실 및 이들의 2종 이상의 조합으로부터 선택되는 항대사물질이다.
43. 단락 40 내지 42 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 안트라사이클린은 다우노루비신(Daunomycin), 다우노루비신(리포좀성), 독소루비신(Adriamycin), 독소루비신(리포좀성), 에피루비신, 이다루비신, 미톡산트론 및 이들의 2종 이상의 조합으로부터 선택되고, 특히 독소루비신이다.
44. 단락 34 내지 43 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 약물은 항암 약물이고, 예를 들어 토포이소머라제 저해제, PARP 저해제 및 이들의 하나 이상의 조합으로부터 선택된다.
45. 단락 34 내지 44 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 항암 요법은 방사성핵종이고, 예를 들어 Y-90, P-32, I-131, In-111, Sr-89, Re-186, Sm-153, Sn-117m 및 이들의 2종 이상의 조합으로부터 선택된다.
46. 단락 1a, 1b, 1c 내지 25 및 27 내지 45 중 어느 하나에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 GLA 성분 및 페이로드를 포함하는 분자를 암 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
47. 단락 46에 따라 사용하기 위한 방법 또는 분자로서, 상기 암은 상피암, 예를 들어 결장직장암, 고환암, 간암, 담도암, 전립선암, 췌장암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 자궁암, 위암, 식도암, 갑상선암, 신장암, 방광암, 뇌암, 두경부암 또는 폐암이고, 또는 대안적으로 상기 암은 혈액암, 예컨대 백혈병, 림프종, 골수암 및 만성 골수증식성 질환, 예컨대 AML일 수 있다.
하나의 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 아포토시스체(apoptotic body)를 표적화하지 않는다.
따라서, 하나의 실시형태에서, 본 발명에 따른 분자는 병원체, 예를 들어 바이러스, 박테리아, 원생동물, 기생충 감염, 및 이의 세포내 형태를 치료하는데 사용된다.
또한, 본 발명은, 소포내 표적화 및 전달(페이로드의 소포내 전달 포함)에 사용하기 위한, GLA 도메인 또는 이의 활성 단편을 포함하는 GLA-성분의 용도로 확대되며, 여기서 상기 GLA-성분은 GLA 단백질 유래의 활성 촉매 도메인을 포함하지 않는다.
또한, 본 발명은, 세포내 표적화 및 전달(페이로드의 세포내 전달 포함, 특히 페이로드는 치료적 엔티티/분자를 포함함)을 위한 의약의 제조를 위한, GLA 도메인 또는 이의 활성 단편을 포함하는 GLA-성분의 용도로 확대되며, 여기서 상기 GLA-성분은 GLA 단백질 유래의 활성 촉매 도메인을 포함하지 않는다.
따라서, 하나의 양태에 따르면, 본 명세서에 개시된 방법을 이용하여 병원체 감염된 인간 세포주, 예를 들어, HEp-2 세포, A549 세포, Calu-3 세포, HEK 및 마딘 다르비 신장세포(Madin Darby Kidney Cell: MDCK) 유래의 소포를, 예컨대 백신에 사용하기 위해, 생성/분리하는 시험관내 방법이 제공된다.
하나의 실시형태에서, 시험관내 생성/분리된 소포에는 GLA 도메인 또는 이의 활성 단편은 포함하되 GLA 단백질 유래의 활성 촉매 도메인은 포함하지 않는 감마-카복시글루탐산 성분(GLA-성분)을 사용하여, 페이로드, 예를 들어, RNA 또는 DNA, 예컨대 CPG와 같은 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드가 부하된다.
하나의 실시형태에서, 시험관내 생성/분리된 소포에는 GLA 도메인 또는 이의 활성 단편은 포함하되 GLP 단백질 유래의 활성 촉매 도메인은 포함하지 않는 감마-카복시글루탐산 성분(GLA-성분)을 사용하여 면역자극기 분자가 부하된다.
세포외 소포 모방체는 연속 압출을 통해 세포를 파괴함으로써 시험관내에서 생성될 수 있다(예를 들어, Jang et al Nano 2013, 7, 7698). 이들 모방체는 이들이 아포토시스 세포 또는 줄기 세포로부터 생성되는 경우 그 표면 상에 포스파티딜세린을 가질 것이다.
하나의 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 GLA 성분에 접합된다.
본 개시내용은 또한 병원체 감염된 세포에서 유래하고 예를 들어, 보강제, 예를 들어 CPG, C3b, ICAM-1과 같은 TLR9 작용제(agonist)로부터 선택되는 외인성 면역자극 분자; 및 본 개시내용에 따른 GLA 성분이 부하된 세포외 소포를 포함하는 백신 조성물을 포함한다.
백신 중의 소포는 생체내에서 또는 시험관내에서 생성되었을 수 있다. 소포는 예를 들어 HEp-2 세포, A549 세포, Calu-3 세포, HEK 및 마딘 다르비 신장 세포(MDCK)로부터 선택된 병원체 감염된 인간 세포주에서 시험관내에서 생성될 수 있다
외인성 면역자극 분자는 "병원체 유래" 소포의 외부 또는 내부에 부하될 수 있거나, 또는 양 위치에 위치할 수 있다.
GLA 성분은 "병원체 유래" 소포의 외부 또는 내부에 부하될 수 있거나, 또는 양 위치에 위치할 수 있다.
하나의 실시형태에서, 면역자극 분자는 GLA 성분에 연결되지 않으며, 즉 별도로 부하되고, 예를 들어 면역자극 분자는 소포 내로 형질감염될 수 있는 플라스미드로서 제공될 수 있고, GLA 성분은 단백질로서 제공된다.
소포에 GLA 성분 및 면역자극 분자 양자에 의한 부하는 GLA 성분이 소포의 표면에서 포스파티딜세린과 결합하여 소포의 존재를 면역계에 나타낸다는 점에서 2가지 다른 작용 기전을 제공한다. 이어서, 면역자극 분자는 소포내의 병원성 물질에 대한 면역계를 증가시킨다.
외인성 면역자극 분자는 GLA 도메인에 연결, 예를 들어 GLA 성분에 접합될 수 있거나, 또는 GLA 성분과 융합체(발현 작제물)일 수 있다.
GLA-성분은 소포의 표면 상의 포스파티딜세린에 결합할 수 있어 자신과 면역자극 분자도 소포 상에 부하할 수 있기 때문에 GLA-성분에 연결된 면역자극 분자를 제공하는 것이 유리하다. 또한, 몇몇 경우 GLA-성분은 소포 상에서 내재화될 수 있고 이와 함께 면역자극 분자를 끌어당길 수 있다.
하나의 실시형태에서, 병원체는 본 명세서에 열거된 바와 같은 박테리아 또는 바이러스, 특히 인플루엔자 바이러스, 예를 들어 인플루엔자 A, B, C 또는 D이다. 인플루엔자 A는 헤마글루티닌 아형 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17, H18 및 뉴라미니다제 아형 N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9, N10, N11, 예컨대 인플루엔자 A: (H1N1) H1N2, H2N1, H911, H3N1, H3N2, 및 H2N3, 신종 인플루엔자 A H1N1 바이러스(CDC 2009 H1N1 Flu 웹사이트)로부터 선택되는 균주를 포함한다.
본 개시내용의 기술은 범용 독감 백신을 제조하는데 적합할 수 있다.
그러나, 계절 독감 백신을 제조하는 데 사용될 때에도, 본 기술은 현재 이용되는 백신을 계란에서 성장시키는 것보다 더 효율적이고 편리할 것 같다.
본 개시내용은 또한 치료를 위한, 특히 백신으로 사용하기 위한 본 개시내용에 따른 "병원체 유래" 소포를 제공한다.
또한, 약제의 제조, 특히 백신 제조에 사용되는 본 개시내용에 따른 "병원체 유래" 소포의 용도도 제공한다.
상기 논의된 바와 같이, GLA-성분은 페이로드, 예컨대 치료용 페이로드를 세포외 소포의 내부로 운반하는데 사용될 수 있다. 치료용 페이로드는 소포 자체에서 작용할 수 있거나, 소포에 의해 세포로 전달되고 세포에서 작용할 수 있거나, 이들 두 시나리오의 조합으로 작용할 수 있다.
일 실시형태에서, GLA성분당 1, 2, 3, 4 또는 5개의 페이로드가 연결된다.
GLA-성분(본 명세서에서 감마-카복시글루탐산 성분으로 지칭되기도 함)은 단백질 S와 같은 GLA 단백질 유래의 촉매 도메인의 부재 하에 GLA 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. 이 폴리펩타이드는 예컨대 단백질 S 유래의 EGF 도메인 및/또는 크링글 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, GLA-성분은 30 내지 300개의 아미노산 잔기, 예를 들어 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 또는 300개의 잔기를 포함한다. 일 실시형태에서, GLA 성분은 4.5 내지 30 kDa의 범위이다. 일 실시형태에서, GLA-성분은 서열번호 1에 제시된 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, GLA-성분은 서열번호 6에 제시된 서열 또는 Hig-태그를 제외시킨 그 유도체를 포함한다.
본 명세서에 사용된 GLA 도메인(비타민 K 의존성 카복실화/감마-카복시글루타믹)은 감마-카복시 글루타메이트(Gla)를 제공하기 위해 아미노 서열 중 글루타메이트 잔기의 비타민 K 의존성 후해독 카복실화에 의해 변형된 단백질 도메인이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 분자에 사용된 GLA 도메인은 천연(야생형) GLA 도메인 유래의 30 내지 45개의 연속 잔기를 포함한다. 일 실시형태에서, GLA 도메인은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 GLA 잔기를 포함한다.
일 실시형태에서, GLA-성분의 30% 이하는 GLA 잔기이다.
일 실시형태에서, GLA-성분은 1 내지 5개의 이황화 결합, 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5개의 이황화 결합을 포함한다.
GLA 도메인은 2개의 카복실산 잔기 사이에 칼슘 이온을 킬레이트화시킴으로써 칼슘 이온을 결합시킨다. 이들 잔기는 성숙한 형태의 Gla 단백질의 N-말단 끝에서 시작하고, 보존된 방향족 잔기로 끝나는 영역의 일부이다. 이는 도메인의 중간에서 발견되고 카복실라제에 의한 기질 인식에 중요한 것으로 보이는 보존적 Gla-x(3)-Gla-x-Cys 모티프를 산출한다.
GLA 도메인은 다수의 단백질, 예컨대 트롬빈, 제VII 인자, 제IX인자, 제X인자, 단백질 C, 단백질 S(PrS), 단백질 Z, 오스테오칼신, 매트릭스 GLA 단백질, GAS6, 트랜스트레틴, 페리오스틴, 프롤린 풍부 GLA 1, 프롤린 풍부 GLA 2, 프롤린 풍부 GLA 3, 및 프롤린 풍부 GLA 4에 함유되어 있다.
본 명세서에 사용된 GLA 도메인은 또한 변형된 도메인이 적합한 시험관내 분석에서 천연 (미변형된 GLA 도메인)의 천연 활성의 적어도 70%(예컨대 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%)를 보유한다면, 천연 GLA 도메인 중의 아미노산의 1 내지 10%(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10%)가 치환 및/또는 결실될 수 있는 단백질도 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 도메인은 전장(full-length)의 천연 도메인이다.
본 명세서에 사용된 EGF 도메인은 보존적 단백질 도메인이다. 이는 약 30 내지 40개의 아미노산 잔기를 포함하고 다수의 대부분의 동물 단백질에서 발견되었다. EGF 유사 도메인의 대부분의 존재는 막 결합 단백질의 세포외 도메인 또는 분비되는 것으로 알려진 단백질에서 발견된다. EGF 유사 도메인은 6개의 시스테인 잔기를 포함한다. EGF 유사 도메인의 주요 구조는 2 가닥 β 시트와 그 다음 짧은 C-말단 2 가닥 β 시트까지 루프이다. 이러한 2개의 β 시트들은 일반적으로 주 시트(N-말단) 및 부 시트(C-말단)으로 표시된다. EGF 유사 도메인은 단백질에서 수많은 직렬 카피(copy)들로 흔히 발생한다: 이들 반복체들은 전형적으로 함께 접혀 기능성 단위로서 단일 선형 솔레노이드 도메인 블록을 형성한다. 일 실시형태에서, 사용된 도메인은 전장의 천연 도메인이다.
본 명세서에서 사용된 EGF 도메인은 또한 변형된 도메인이 적합한 시험관내 분석에서 천연 (미변형된 GLA 도메인)의 천연 활성의 적어도 70%(예컨대 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%)를 보유한다면, 천연 EGF 도메인 중의 아미노산의 1 내지 10%(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 %)가 치환 및/또는 결실될 수 있는 단백질도 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 도메인은 전장의 천연 도메인이다.
본 명세서에 사용된 크링글 도메인은 3개의 이황화 결합에 의해 안정화된 큰 루프로 접히는 자율 단백질 도메인을 의미한다. 이들은 3중 루프(triple loop) 3-이황화물 가교 구조를 특징으로 하며, 이 형태는 다수의 수소 결합 및 작은 역평행 β-시트 부분에 의해 한정된다. 이들은 프로트롬빈 및 유로키나제-타입 플라스미노겐 활성인자를 포함하는 몇몇 혈장 단백질에서, 다양한 카피수로, 혈액 응고 및 섬유소용해성 단백질 전체에 걸쳐 발견되며, 이들은 MEROPS 펩티다제 패밀리 S1A에 속하는 세린 프로테아제이다.
본 명세서에서 사용된 크링글 도메인은 변형된 도메인이 적합한 시험관내 분석에서 천연(미변형된 크링글 도메인)의 천연 활성의 적어도 70%(예를 들어, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%)를 보유한다면, 천연 크링글 도메인에 있는 아미노산의 1 내지 10%(예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10%)가 치환 및/또는 결실될 수 있는 단백질을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 사용된 도메인은 전장 천연 도메인이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 단백질의 활성 단편은 전체 천연 단백질(또는 적절한 도메인) 보다 작으며, 이는 적절한 시험관내 분석에서 천연 전장의 도메인 또는 단백질의 활성의 50% 이상(예를 들어, 60, 70, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%)을 보유한다.
본 명세서에 사용된 촉매 도메인은 예를 들어 도 1a에 예시된 바와 같이 C-말단 방향으로 EGF 도메인의 하류에 있는 도메인(또는 단편)이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 시험관내(in vitro)는 인간 또는 동물 체내에서 수행되지 않은 실험실 작업을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 생체 내(in vivo)는 살아있는 유기체, 특히 인간 또는 동물, 특히 인간에서의 작업/시험/처리를 지칭한다.
세포외 소포(EVs)는 장거리 세포간 소통의 중요한 매개인자이며 원핵 생물 및 진핵 생물 유기체 모두에 걸친 다양한 범위의 생물학적 과정에 관여한다(Arenaccio and Federico, Adv Exp Med Biol 998: 3-19, 2017, Lu et al., Eur J Pharm Biopharm 119: 381-195, 2017, Vader et al., Adv Drug Delivery Rev 106: 148-156, 2016, Lefebvre and Lecuyer, Front Microbiol 8:377, 2017 참조).
세포외 소포는 감염 세포(바이러스, 박테리아 또는 기생충)로부터 유출되고, 이들 감염성 인자 유래의 물질을 함유한다(Schorey et al., EMBO Rep. 16: 24-43, 2015, Schorey and Harding, J. Clin Invest. 126: 1181-1189, 2016 참조). 이 물질은 독소부터 감염성 바이러스(엔벨로프형 및 비엔벨로프형 모두; 문헌[Altan-Bonnet, N, Curr Opin Microbiol 32: 77-81, 2016] 참조)까지 다양할 수 있고, 단일 바이러스 입자 보다는 바이러스 집단을 보다 효과적으로 전달하는 신규 수단일 수 있다(Chen YH et al., Cell 160: 619-630, 2015). 결과적으로, 이들의 분리는 질병에 대한 신속한 진단적 통찰력을 제공할 수 있다.
세포외 소포는 모든 분비된 막 소포를 나타내는 광범위한 용어이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 상기 용어는 엑소좀, 마이크로소포(또한 마이크로입자라고도 함), 엑토좀, 매트릭스 소포, 석회화 소포, 프로스타좀, 온코좀(oncosome), 레트로바이러스-유사 입자, 박테리아 세포외 소포, 내강 소포 및 아포토시스체를 포함한다.
또한, 단백질, RNA, 및 감염 인자 및 세포에 특이적인 탄수화물을 함유하는 세포외 소포는 또한 잠재적으로 동일계내(in situ) 백신접종을 위한 시스템일 수 있다. 이러한 환경에서, GLA 도메인으로 인한 면역 약화성 포스파티딜세린 분자의 결합 및 중화는 면역 검출 및 청소를 가능하게 하고 감염성 질환에 대한 특정 백신접종의 새롭고 더욱 효과적인 방법으로서 기여할 것으로 예상된다.
본 명세서에 사용된 세포외 소포는 마이크로소포, 아포토시스체, 및 엑소좀을 포함한다. 세포외 소포는 일반적으로 직경이 10㎚ 내지 5000㎚ 범위이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 마이크로소포는 세포막으로부터 출아에 의해 형성된 후 방출된 소포를 지칭하며, 예를 들어 일반적으로 직경이 100㎚ 내지 1000㎚ 범위이다.
엑소좀은 다소포체(multivesicular body) 내에서 생산되고, 다소포체와 세포막의 융합 후에 방출된다. 일반적으로, 엑소좀은 직경이 30 내지 100㎚ 범위이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 아포토시스체는 아포토시스 세포에 의해 세포외 환경으로 유출된 소포를 지칭한다. 아포토시스체는 세포내 소통에 관여하지 않을 수 있다. 일반적으로, 아포토시스체의 직경은 800㎚ 내지 5000㎚ 범위이다.
예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 인용되는 문헌들을 참조한다: Modularized Extracellular Vesicles: The Dawn of Prospective Personalized and Precision Medicin, Tao et al Adv. Sci. 2018, 5, 1700449; Mesenchymal Stem Cell-derived Extracellular Vesicles: Towards Cell-free Therapeutic Applications Rani et al, www.moleculartherapy.org vol.23 no. 5, 812-823; 2015; 및 Achieving the Promise of Therapeutic Extracellular Vesicles: The Devil is in the Detail of Therapeutic Loading Sutaria et al, Pharma Res 2017 May; 34(5) 1053-1066.
따라서, 본 개시내용은 예를 들어 병원체 감염, 예를 들어 바이러스 감염, 박테리아 감염 및/또는 기생충 감염의 진단에 사용되는 세포외 소포의 용도를 제공한다.
따라서, 본 개시내용은 예를 들어 병원체 감염, 예컨대 바이러스 감염, 박테리아 감염 및/또는 기생충 감염을 치료하기 위한 세포외 소포의 용도를 제공하며, 특히 여기서 상기 세포외 소포는 병원성 물질을 중화 또는 제거하기 위해 처리되고/되거나, 상기 세포외 소포에는 표적 세포로 전달하기 위한 치료 물질이 부하된다.
따라서, 본 개시내용은 예를 들어 병원체 감염, 예컨대 바이러스 감염, 박테리아 감염 및/또는 기생충 감염을 진단하기 위한 세포외 소포의 용도를 제공한다.
따라서, 본 개시내용은 예를 들어 병원체 감염, 예컨대 바이러스 감염, 박테리아 감염 및/또는 기생충 감염을 치료하기 위한 세포외 소포의 용도를 제공하며, 특히 여기서 상기 세포외 소포는 병원성 물질을 중화 또는 제거하기 위해 처리되고/되거나, 상기 세포외 소포에는 세포로 전달하기 위한 치료 물질이 부하된다.
따라서, 본 개시내용은 암의 진단을 위한 세포외 소포의 용도를 제공한다.
따라서, 본 개시내용은 암을 치료하기 위한 세포외 소포의 용도를 제공하며, 예를 들어 상기 세포외 소포는 병원성 물질을 중화 또는 제거하기 위해 처리되고/되거나, 상기 세포외 소포에는 세포로 전달하기 위한 치료 물질이 부하된다.
본 개시내용에 따른 세포외 소포 및 방법은 또한 자가면역 질환의 진단 및/또는 치료에 유용할 수 있으며, 특히 줄기 세포 유래의 세포외 소포가 유용하다.
하나의 실시형태에서, 본 개시내용의 세포외 소포는 인간 세포 유래인 것이다.
하나의 실시형태에서, 세포외 소포는 줄기 세포(특히 건강한 줄기 세포) 유래인 것이다. 이러한 소포는 줄기 세포 요법과 유사한 방식으로 사용될 수 있다.
하나의 실시형태에서, 본 개시내용의 세포외 소포는 박테리아 세포와 같은 병원성 세포 유래인 것이다.
세포는 상이한 유형의 EV를 분비할 수 있고, 이들은 이들의 하위세포 기원에 따라 분류되었다(Colombo et al., Annu Rev Cell Dev Biol 30: 255-289, 2014). 기원 및 크기의 차이에도 불구하고, 소포 크기의 중복 및 아형-특이적 마커의 부재 때문에 균일한 EV 명명법은 존재하지 않는다. 결과적으로, 여전히 정제하여 소포 종류 간에 구별하는 것이 어렵다. 예를 들어, 문헌에서 역사적으로 사용되고(차등 초원심분리, 220㎚ 여과(Thery et al., Curr Protoc Cell Bioil Chapter 3, Unit 3.22, 2006), 최근 상업적 키트로 방출된 가장 일반적인 엑소좀 정제 프로토콜은 여러 종류의 EV를 동시분리한다(Tkach and Thiery, Cell 164: 1226-1232, 2016 참조). 따라서, "엑소좀"과 같은 용어는 일반적으로 작은 EV의 혼합 집단으로 지칭되며, 따라서 본 발명에서 본 발명자들은 일반 용어 EV를 모든 소포 아형을 지칭하는데 사용하도록 선택하였다.
일반적으로, 세포외 소포는 세라미드류, 콜레스테롤류, 포스포글리세라이드 및 스핑고지질을 포함하는 지질 이중층을 포함한다(Subra et al 2010, Trajkovic et al 2008, Vlassov et al 2012).
모든 세포외 소포는 이들이 수용체 세포에 표적화될 수 있게 하는 표면 분자를 보유하며, 여기서 소포는 자신의 함유물을 다수의 수법(예를 들어, 세포내이입(endocytosis) 및/또는 식작용(phagocytosis), 융합 등)을 통해 시토졸로 전달하여, 수용체 세포의 생리학적 상태를 변형시킨다. 이들은 단백질, 지질 및 유전자 물질에 대한 천연 전달 매개체(vehicle)이기 때문에, 이들은 영상화, 진단을 위해 및/또는 치료 운반체로서 사용하기 위해 다수의 질병 징후들을 따라 능동적으로 탐사되고 있는 특별한 바이오벡터를 나타낸다(문헌[Rufino-Ramos et al., J.Control Release 262: 247-258, 2017, Vader et al., Adv Drug Deliv. Rev 106: 148-156, 2016, Sutaria et al., Pharm Res 34: 1053-1066, 2017, Ingato et al., J. Control Release 241: 174-185, 2016] 참조).
하나의 실시형태에서, 세포외 소포는 엑소좀이다. 엑소좀은 직경이 일반적으로 30 내지 150㎚, 예컨대 30 내지 100㎚이고, 예를 들어 트랜스페린, CD9, CD63, CD61, CD81, TSG101, LAMPS 및 Alix로부터 선택되는 하나 이상의 표면 마커를 가질 수 있다.
하나의 실시형태에서, 세포외 소포는 마이크로소포(microvesicle)(마이크로입자로도 지칭됨)이고, 내피 마이크로입자를 포함한다. 일반적으로, 마이크로소포는 직경이 50 내지 2000㎚ 범위이며, 예를 들어 VCAMP3 및 ARF6으로부터 선택되는 하나 이상의 표면 마커를 보유할 수 있다. 순환성 내피 마이크로입자가 정상 개체의 혈액에서 발견될 수 있지만, 증가된 수의 순환성 내피 마이크로입자는 특정 질환을 가진 개체, 예컨대 고혈압 및 심혈관 장애, 및 자간전증 및 다양한 형태의 혈관염을 가진 개체에서 확인되었다. 이들 질환 상태의 일부에서 내피 마이크로입자는 내피 기능장애 상태를 반영하는 세포 표면 분자의 배열을 갖는 것으로 나타났다. 따라서, 내피 마이크로입자는 질환에서 내피의 기능 상태의 지시인자 또는 지표로서 유용할 수 있고, 잠재적으로 류마티스성 관절염을 비롯한 특정 질환의 발병에 중요한 역할을 할 수 있다.
하나의 실시형태에서, 세포외 소포는 엑토좀이다. 일반적으로, 엑토좀은 직경이 100 내지 1000㎚ 범위, 예컨대 350 내지 400㎚ 범위이며, 예를 들어 TyA 및 C1a로부터 선택되는 하나 이상의 표면 마커를 보유할 수 있다.
하나의 실시형태에서, 소포는 석회화 세포외 소포이다. 이 소포는 아테롬성 동맥경화 플라크 내의 세포로부터 방출된다. 최근, 대식세포 및 평활근 세포(SMC)로부터 유래되는 석회화 EV가 혈관 석회화에서의 역할에 대해 증가된 관심을 받고 있다. 이러한 소포는 심혈관 이환율 및 사망률의 주요 예측인자인 혈관 석회화를 매개하는데 역할을 하는 것으로 생각된다.
하나의 실시형태에서, 세포외 소포는 매트릭스 소포이다. 본 명세서에 언급된 바와 같은 매트릭스 소포는 골 발달에 관여하며, 골아세포 유래 소포는 발달하는 골에서 콜라겐 섬유를 따라 하이드록시아파타이트 결정을 핵화시킨다. 또한, 이들은 플라크 불안정성, 파열 및 후속 심근경색 및 발작을 유도하는 아테롬경화성 플라크 섬유 캡 내에서 미세석회화 형성의 핵화 병소로서 작용한다.
하나의 실시형태에서, 세포외 소포는 프로스타좀이다. 본 명세서에서 사용된 프로스타좀은 전립선 상피세포에 의해 정액으로 분비된 소포를 지칭한다. 이들은 일반적으로 직경이 40 내지 500㎚ 범위이다. 이들은 이례적인 지질 조성 및 지질 래프트(lipid raft)를 닮은 지단백질 막의 치밀하고 고도로 정렬된 구조를 갖는다. 프로스타좀의 생리학적 역할은 정자 운동성의 향상 및 난자로 통과 중에 여성 면역 방어로부터의 공격에 대한 방어에 연루되어 있다. 암성 전립선 세포 및 낮은 분화를 갖는 전립선 세포는 계속해서 프로스타좀을 생성 및 분비한다는 연구들이 밝혀져 있다. 노인 남성에서 전립선암의 높은 빈도는 프로스타좀에 의해 지원되는 면역 보호 활성을 이용할 수 있었다. 프로스타좀에서 발견되는 면역 조절 단백질은 아미노-펩티다제 N(CD13); 디펩티딜-펩티다제 IV(CD26); 엔케팔리나제(중성 엔도펩티다제, CD10); 안지오텐신 전환 효소(ACE, CD143); 조직 인자 TF(CD142, 트롬보플라스틴); 붕괴 촉진 인자(CD55); 프로텍틴(CD59, MAC의 저해제) 및 보체 조절 막 보조인자 단백질(CD46)을 포함한다. 프로스타좀은 또한 높은 수준의 2가 양이온, Zn2+, Ca2+ 및 Mg2+를 함유한다.
하나의 실시형태에서, 세포외 소포는 온코좀이다. 본 명세서에서 사용된 온코좀은 직경이 1㎛ 내지 10㎛ 범위인 큰 세포외 소포를 의미한다. 뇌 종양의 상황에서, EV의 존재는 신경교종 세포로부터 방출되었고 수용체의 변이된 형태인 EGFRvIII을 발현한다. 이러한 소포는 상기 수용체가 없는 종양 세포의 막에 종양단백질 EGFRvIII을 전달하여 종양 촉진 물질을 전파하고 형질전환을 유도할 수 있는 것으로 관찰되었다. Cav-1이 양성인 큰 온코좀은 거세 저항성 및 전이성 질환을 갖는 환자로부터 국부 한정된 전립선 암을 갖는 환자를 식별하는 것으로 밝혀졌다.
하나의 실시형태에서, 세포외 입자는 레트로바이러스-유사 입자이다. 이들은 일반적으로 직경이 75 내지 100㎚ 범위이고 표면 마커 Gag를 보유할 수 있다.
하나의 실시형태에서, 세포외 소포는 박테리아 세포외 소포이다. 이러한 소포는 일반적으로 직경이 10 내지 300㎚ 범위이며, 표면에 PAMP를 보유할 수 있다.
하나의 실시형태에서, 세포외 소포는 강내 소포(intralluminal vesicle)이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 이는 세포 내의 소포를 지칭한다.
역융합(back-fusion)은 엔도좀의 제한 막과 후기 엔도좀 또는 다소포체(multivesicular body) 내의 내부 (강내) 소포의 융합이다. 이 방법은 리소바이포스파티드산(LBPA), 포스파티딜이노시톨-3-포스페이트, Alix, 및 산성 pH에 대한 명백한 의존성에 의해 매개되는 것으로 여겨진다. MHC 클래스 2 및 다른 단백질(CD63 및 MPR)은 이러한 과정을 이용하여 시토졸 내의 위치로, 그리고 다시 형질 막으로 효과적으로 전달한다. 그러나, 병원체도 또한 이 기전을 이용하여 세포(예를 들어, VSV, 탄저균)의 시토졸로 효율적으로 유입된다. 엔도좀과 세포소기관 사이의 세포에서의 정상적인 융합과 달리, 역융합은 정자-난자 융합과 유사한 내부 소포의 외형질 층과 외막의 융합을 필요로 한다.
하나의 실시형태에서, 세포외 소포는 아포토시스체이다. 본 명세서에서 사용된 아포토시스체는 일반적으로 직경이 500 내지 5,000㎚, 예컨대 500 내지 4000㎚ 범위이고, 프로그램된 세포사를 겪는 세포에 의해 방출된다.
줄기 세포 및 마커
하나의 실시형태에서, 본 발명에 따른 세포외 소포(extracellular vesicle)는 줄기 세포로부터 유래한다.
하나의 실시형태에서, 줄기 세포는 배아 줄기 세포이다. 하나의 실시형태에서, 세포는 배아 줄기 세포가 아니다.
하나의 실시형태에서, 줄기 세포는 예를 들어 선조 세포(progenitor cell), 및 조혈 줄기 세포, 근원성 줄기 세포, 골전구 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 예컨대 위성 세포, 방사상 신경교 세포, 골수 간질 세포, 골막, 췌장 선조 세포, 내피 선조 세포, 아세포 및 영양막 줄기 세포를 포함하는 성체 줄기 세포이다.
하나의 실시형태에서, 줄기 세포는 암 줄기 세포이다.
하나의 실시형태에서, 상기 방법은 포유동물 줄기 세포, 예를 들어 인간 줄기 세포에 관한 것이다. 본 명세서에서 논의된 줄기 세포는 주로 인간 줄기 세포이다. 그러나, 당해 기술자는 필요에 따라 다른 포유동물에 대한 적절한 또는 상응하는 줄기 세포 집단을 식별할 수 있다. 예를 들어, SSEA-1은 뮤린 배아 줄기 세포, 인간 생식계열 세포 및 배아 암종 세포에 대한 마커이고; SSEA-3은 영장류 배아 줄기 세포, 인간 배아 생식계열 세포, 인간 배아 줄기 세포 및 배아 암종 세포에 대한 마커이며; SSEA-4는 영장류 배아 줄기 세포, 인간 배아 생식 세포, 인간 줄기 세포, 배아 암종 세포에 대한 마커이고; CD324는 인간 및 뮤린 배아 줄기 세포, 배아 암 세포에 대한 마커이고; CD90은 인간 및 뮤린 배아 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 배아 암종 세포에 대한 마커이고; CD117은 인간 및 뮤린 배아 줄기 세포, 조혈 줄기 선조 세포, 신경관 유래의 멜라닌세포, 원시 생식 세포, 배아 암종 세포에 대한 마커이며; CD326은 인간 및 뮤린 배아 줄기 세포, 배아 암종 세포에 대한 마커이고; CD9는 인간 및 뮤린 배아 줄기에 대한 마커이며; CD24는 인간 및 뮤린 배아 줄기에 대한 마커이고; CD29는 인간 및 뮤린 배아 줄기에 대한 마커이며; CD59는 인간 및 뮤린 배아 줄기에 대한 마커이고; CD133은 인간 및 뮤린 배아 줄기, 배아 암종 세포, 조혈 줄기 세포에 대한 마커이고; CD31은 인간 및 뮤린 배아 줄기에 대한 마커이고; TRA-1-60은 인간 배아 줄기 세포, 테라암종(teracarcinoma), 배아 생식 세포, 배아 암종 세포에 대한 마커이며; TRA-1-81은 인간 배아 줄기 세포, 테라암종, 배아 생식 세포, 배아 암종 세포에 대한 마커이고; Frizzled5는 인간 및 뮤린 배아 줄기 세포에 대한 마커이고; 줄기 세포 인자(SCF)는 인간 및 배아 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 배아 암종 세포에 대한 마커이고; Cripto는 인간 및 뮤린 배아 줄기 세포, 심장근육세포 및 배아 암종 세포에 대한 마커이다.
조혈 줄기 세포(HSC) 또는 혈구모세포(hemocytoblast)는 조혈 과정을 통해 다른 모든 혈액 세포를 생산하는 줄기 세포이다. 이 세포는 중배엽에서 유래되고, 대부분의 뼈의 중심부에 함유되어 있는 적골수에 위치한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 암 줄기 세포는 정상 줄기 세포와 관련된 특성, 구체적으로 특정 암 샘플에서 발견되는 모든 세포 유형을 생성하는 능력을 갖는 종양형성 세포(즉, 종양 또는 혈액 암에서 발견되는 암 세포)를 지칭한다. 예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 인용되는 문헌[Identification and Targeting of Cancer Stem Cells, BioessayS 2009 Oct;31(10) 1038-1049] 참조. 암 줄기 세포는 3 가지 별개의 특성에 의해 정의된다: i) 종양 개시 및 신생물 증식을 유도하는 선택적 능력; ii) 자가-재생을 통해 자신의 무한 카피를 생성하는 능력, 및 iii) 분화를 통해 더 성숙한 비-줄기 세포 암 자손을 발생시키는 잠재성. 암 줄기 세포는 건강한 줄기 세포로부터 반드시 유래되는 것은 아니고, 분화된 세포로부터 유래할 수 있다.
CD34는 또한 조혈 선조 세포 항원 CD34로도 알려져 있으며, 세포-세포 부착 인자로서 작용한다. 줄기 집단을 풍부하게 하는 마커로서 사용될 수 있다.
줄기 세포는 일반적으로 계통 양성 표면 마커에 대해 음성이며(즉, Lin -ve), 예를 들어 줄기 세포는 Lin -ve, CD34 +ve, CD38 -ve, CD45RA -ve, CD90 양성 및 CD49f_+ve이다.
조혈 줄기 세포는 CD48, CD150, CD244, CD34, CD38, SCA-1, Thy1.1, C-kit, lin, CD135, slam1/CD150, Mac-1(CD11b), CD4, 줄기 세포 인자(SCF) 및 이들의 2종 이상의 조합으로부터의 표면 마커를 발현할 수 있다.
골전구 세포는 Gremlin-1, TGF-베타, bFGF, BMP-2, ALPP, MCAM, 콜라겐 I, 콜라겐 1 알파1, 콜라겐 II, RUNX2, 데코린(Decorin), 및 이들의 2종 이상의 조합(예컨대, 모든 상기 마커)으로부터 선택된 표면 마커를 발현할 수 있다.
골아세포 또는 이의 선조 세포는 Runx2, 알칼리성 포스파타제/ALPP/ALPI, 오스테오칼신, BAP1, OPN, BAP31, 콜라겐 I, SCUBE3, 피브로넥틴, SPARC, IGFBP-3 및 이들의 2종 이상의 조합으로부터 선택된 표면 마커를 발현할 수 있다.
골세포 또는 이의 선조 세포는 다음으로부터 선택된 표면 마커를 발현할 수 있다:
i) TGF 베타, RANKL, MCSF, 스클레로스틴(Sclerostin), DKK, 및 이들 중 2 이상의 조합(예를 들어, 모든 상기 마커) 및/또는
ii) 오스테릭스 +ve, CD90 +ve, 오스테오칼신 +ve, 콜라겐 I +ve, 골 시알로단백질 +ve 및 이들의 2종 이상의 조합(예컨대, 상기 모든 마커), 및/또는
iii) 알칼리성 포스파타제/ALPP(알칼리성 포스파타제 태반)/ALPI +ve, 콜라겐 I +ve, 콜라겐 II +ve, 데코린 +ve, MCAM/CD146 +ve, MEPE/OF45 +ve, 오스테릭스 +ve, CD90 +ve, 오스테릭스/Sp7 +ve, RUNX2/CBFA1 +ve, 트롬보포이에틴/Tpo +ve 및 이들의 2종 이상의 조합(예컨대, 모든 상기 마커).
근원성 줄기 세포는 CD56, CD146, VE-카드헤린, 알파-평활근 액틴, FABP3, 인테그린 알파7, 데스민, 미오신 중쇄, UEA-1 수용체 및 이들의 2종 이상의 조합(예컨대, 모든 상기 마커)으로부터 선택된 마커를 발현할 수 있다.
신경 줄기 세포는 다음으로부터 선택된 마커를 발현할 수 있다:
i) CD133, CD15, CD24 저(low) 또는 -ve, GCTM-2, CD45, CD34, 네스틴(Nestin), Sox-2, ABCG2, FGF R4, Frizzled-9, 및 이들의 2종 이상의 조합(예컨대, 모든 상기 마커), 및/또는
ii) CD24 마커 저 또는 -ve, 및/또는
iii) CD133 +ve, 5E12 +ve, CD34 -ve, CD45 -ve 및 CD24 저 또는 -ve의 마커 조합.
중간엽 줄기세포는 CD10, CD13, CD73, CD105, CD271, CD140b, CD240, frizzled-9, CD29, CD90, CD146, oct4, SSEA4, STRO-1, 줄기 세포 인자(SCF) 및 이들의 2종 이상의 조합으로부터 선택되는 표면 마커를 발현할 수 있다.
지방세포 유래인 줄기 세포는 다음으로부터 선택되는 표면 마커를 발현할 수 있다:
i) K15, CD34, 네스트린, 폴리스타틴, p63, 인테그린 알파6, 테아신 C, EGFR, IGFR, frizzled 인자, 및/또는 이들의 2종 이상의 조합, 및/또는
ii) CD44, ICAM/CD54, CD34, 인테그린 패밀리 구성원 및 이들의 2종 이상의 조합.
난소 및 난관 상피 줄기 세포 유래의 줄기 세포는 Gremlin 1, Lrig1, Lgr5, Bmi1, Tert, HopX 및 이들의 2종 이상의 조합으로부터 선택된 표면 마커를 발현할 수 있다.
배아 줄기 세포는 CD24, CD29, CD31, CD59, CD90, CD117, CD133, CD324, CD326, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, frizzled5, 줄기 세포 인자, 크립토(TDGF-1)로부터 선택되는 하나 이상의 표면 마커일 수 있다.
줄기 세포 유래의 세포외 소포는 이들이 유래된 세포로부터의 마커에 기초하여 동정할 수 있다.
기타 정의
본 명세서에 사용된 바와 같은 페이로드는 특히 소포로 전달하기 위해, GLA 도메인에 연결된 분자를 의미한다. 페이로드는 약물, 독소, 화학요법제, 중합체, 생물학적 활성 단백질, 펩타이드(예를 들어, 안정한 펩타이드), 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, DNA 및 RNA, 예컨대 마이크로RNA, shRNA, RNAi 및 유사물, 예컨대 분자 비콘), 방사성 핵종, 금속 킬레이트제, 종양용해 바이러스, 바이러스 벡터, 표지 및/또는 리포터 기를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이 연결된은 융합 단백질(예를 들어, 아마이드 결합을 사용함) 또는 화학적 접합(예를 들어, 말레이미드 화학, 클릭(click) 화학 등)을 포함하여, 페이로드를 GLA-도메인에 연합(association)시키는 임의의 수단을 지칭한다. 페이로드는 또한 세포외 소포 내부로 전달된 물질을 지칭하는데 사용될 수 있으며, 여기서 물질은 GLA-성분에 연결되지 않는다.
GLA 도메인은 선택된 세포를 표적화하고 접근하기 위해 포스파티딜세린(PS)의 노출을 이용하는 독특한 검출 및 전달 플랫폼이다. 포스파티딜세린은 아포토시스 세포의 인식 및 포획(engulfment)에 대한 주요 신호이다. 아포토시스는 진화적으로 보존되고 엄격하게 조절되는 세포사 방식이다(Poon IK et al., Nat Rev Immunol 14: 166-180, 2014). 아포토시스 세포의 포획 및 섭취는 포식작용으로서 알려져 있으며, 이는 막 완전성 상실 및 염증성 함유물의 방출 전에 아포토시스 세포의 직접적이고 효과적인 제거를 제공하며, 따라서 아포토시스의 유해한 염증 효과를 상쇄시킨다. PS 발현은 TLR-유도된 및 사이토카인-유도된 신호전달 캐스케이드 및 면역원성 DC 성숙을 억제하는 작용을 한다(Poon IK et al., Nat Rev Immunol 14: 166-180, 2014, Birge RB Celll Death Differ 23: 962-978, 2016). 결과적으로, 생리학적 조건하에서 표면화된(externalized) 포스파티딜세린은 내성을 촉진하고 국소 및 전신 면역 활성화를 방지하는 우성이고 진화적으로 보존된 면역억제 신호로서 작용한다. 병리학적으로, 포스파티딜세린의 선천적 면역억제 효과는 많은 바이러스, 다른 미생물 및 기생충에 의해 강탈되어 감염을 용이하게 하였고 많은 사례들에서 잠복성을 확립시킨다(Birge RB et al., Cell Death Differ 23: 962-978, 2016, Amara and Mercer J, Nat Rev Microbiol 13: 461-469, 2015, Moller-Tank, S and Maury W Virology 468-470: 565-580, 2014). 포스파티딜세린은 종양 미세환경에서 조절되지 않고 종양 면역의 발달에 길항작용하며, 포스파티딜세린 발현성 엑소좀은 현재 암과의 전투에서 초기 진단술로서 탐구되고 있다(Birge RB et al., Cell Death Diff. 23:962-978, 2016, Lea et al., Oncotarget 8: 14395-14407, 2017, Li X and Wang X, Mol Cancer 16:92, 2017). 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 모든 포스파티딜세린이 생물학적 관점으로부터 동등한 것은 아니라고 생각한다. 본 발명자들은 효소 TMEM16F에 의해 노출된 포스파티딜세린은 면역 억제에 관여하고 본 개시내용의 분자들에 의해 "관찰되는" 것이라고 생각한다.
본 명세서에 사용된 종양용해 바이러스는 다음과 같은 바이러스를 의미한다:
Figure pct00009
암세포를 우선적으로 감염 및 사멸시키는 것, 또는
Figure pct00010
암 세포에서 선택적으로 복제하는 것(예를 들어, 암 세포의 복제가 p53과 같은 암 세포에서 상향조절되는 유전자에 의존적이기 때문에).
본 명세서에 사용된 바와 같은 바이러스 벡터는 일반적으로 이식유전자(transgene)를 암호화하는 복제 결핍 바이러스를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 시험관내에서는 인간 또는 동물 체내에서 수행되지 않는 실험실 작업을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 생체 내에서는 살아있는 유기체, 특히 사람 또는 동물에서의 작업/시험/처리를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 분자는 가장 넓은 의미로 사용되며 합성 화학 분자뿐만 아니라 단백질, 중합체(천연 또는 기타), 리보핵산 분자, 표지 등과 같은 거대분자를 포함한다.
분자 비콘은 균질한 용액에서 특정 핵산의 존재를 보고할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 혼성화 프로브이다. 이들은 표적 핵산 서열에 결합할 때 형광이 복원되는 내부적으로 켄칭된 형광단을 갖는 헤어핀형 분자이다.
본 명세서에 사용된 스테이플화된 펩타이드는 펩타이드들의 약리학적 성능을 향상시키기 위한 합성 보조기(brace)에 의해 유지되는 다수의 직렬 펩타이드를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 약물은, 문맥이 달리 나타내지 않는 한, 작은 화학적 개체, 예를 들어 유기 화학 방법에 의해 합성된 것, 특히 승인 또는 허가된 분자, 또는 치료용으로, 특히 인간에서 허가를 받고 있는 과정에 있는 것을 지칭하고자 한다. 본 명세서에 사용된 약물은 항바이러스 화합물, 항생제 및 항암 요법을 포함한다.
본 명세서에 사용된 항바이러스 화합물(항바이러스제)은 광범위한 스펙트럼의 항-바이러스제 및 특정 바이러스 또는 특정 바이러스 패밀리에 특이적인 "좁은" 스펙트럼을 포함하여, 특히 바이러스 감염 치료용으로 사용되는 약제 부류를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 항생제는 박테리아의 성장을 억제하거나 박테리아를 파괴하는 약제 또는 제제를 지칭한다. 항균제 및 항생제는 문맥상 달리 지시되지 않는 한, 여기서 호환 가능하게 사용된다.
본 명세서에 사용된 항-기생충제는 기생충의 성장을 억제하고 기생충을 파괴하거나 숙주로부터 기생충을 제거하는 약제 또는 제제를 지칭한다.
항암 요법은 항암 약물, 화학요법, 방사선요법, 면역-종양학 요법 등을 포함하는 광범위한 용어이다.
본 명세서에 사용되는 항암 약물은 일반적으로 소분자 암 치료를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 화학요법은 일반적으로 세포독성제를 지칭하며 항신생물제를 포함한다.
생물학적 치료제(또한, 생물약학, 생물학적 또는 생물학 제제라고도 지칭됨)는 생물학적 공급원으로부터 "유래된" 치료 생성물, 예를 들어 재조합 단백질 및 단편, 예컨대 항체 분자, 예컨대 항체, 항체 결합 단편 및 다중특이적 항체 분자, 폴리뉴클레오타이드, 치료 바이러스, 종양용해 바이러스, 바이러스 벡터 및 이러한 물질들의 복합 조합체이다. 생물학적 활성 단백질은 생물학적 치료제의 아군이며, 재조합 단백질 및 이의 활성 단편(항체 분자를 포함함)을 포함한다.
본 명세서에 사용된 항체 분자는 전장 중쇄 및 경쇄를 갖는 완전한 항체 또는 이의 단편, 및 예를 들어 Fab, 변형된 Fab, Fab', 변형된 Fab', F(ab')2, Fv, Fab-Fv, Fab-dsFv, 단일 도메인 항체(예를 들어, VH 또는 VL 또는 VHH), scFv, 인트라바디(intrabody), 2가, 3가 또는 4가 항체, Bis-scFv, 디아바디, 트라이아바디, 테트라바디 중 어느 하나를 포함하는 분자 및 상기 중 임의의 것의 에피토프-결합 단편을 포함한다(예를 들어, 문헌[Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9): 1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217] 참조). 이들 항체 단편을 생성 및 제조하는 방법은 본 기술분야에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181] 참조). 본 발명에 사용하기 위한 다른 항체 단편은 WO2005/003169, WO2005/003170 및 WO2005/003171에 기재된 Fab 및 Fab' 단편을 포함한다. 다가의 항체는 다중 특이적, 예를 들어 이중특이적을 포함할 수 있고, 또는 단일특이적일 수 있다(예를 들어, WO 92/22853 및 WO 05/113605 참조). 이중특이적 및 다중특이적 항체 변이체가 본 실시예에서 특히 고려되는데, 그 이유는 목적이 두 개의 독립적인 표적 단백질을 중화시키는 것이기 때문이다. 본 명세서에 개시된 항체 유래의 가변 영역은 2개의 표적 항원에 결합하고 중화시킬 수 있는 단일 항체 변이체를 생성하도록 하는 방식으로 구성될 수 있다.
항체 및 이의 결합 단편, 특히 도메인 항체, VHH, 단일 쇄 Fvs(scFvs), ds-scFvs, dsFv 및 인트라바디와 같은 작은 항체 단편은 본 기술을 사용하여 세포내로 전달될 수 있다.
하나의 실시형태에서, 항체 분자는 인간 또는 인간화된 것이다.
독소는 독성 물질, 특히 천연 공급원, 특히 단백질로부터 유래된 것이다. 칼리케아미신(calicheamicin)과 같은 많은 독소들은 암 치료에 사용된다. 또한, 화학요법제는 독성(또는 독소)으로 간주될 수 있다. 따라서 독소의 정의는 본 명세서의 다른 정의와 겹친다. 그러나, 뱀독과 같은 신경독은 독소이지만 화학요법제가 아니다. 그러나, 통상의 기술자는 이러한 기술적 정의에 익숙하며, 본 개시내용의 문맥의 의미를 이해할 수 있다.
본 명세서에 사용된 진단제는 질병 병태를 진단, 또는 모니터 또는 이해하기 위해 분석 또는 영상화에 사용되는 제제이다. 진단제는 일반적으로 일부 방식으로 가시화, 측정 또는 모니터될 수 있는 표지 또는 유사물과 같은 리포터 분자를 포함할 것이다.
본 개시내용에 사용하기에 적합한 방사성 핵종은 탈륨-201, 테크네튬-99m, 요오드-123, 요오드 131, 요오드-125, 불소-18 및 산소-15를 포함한다.
본 명세서에 사용된 비정상 세포 또는 병원성 세포는 정상적인 건강한 세포와 차이가 있는, 특히 마커 또는 마커들의 돌연변이 또는 상향조절, 예컨대 병태 또는 질환의 소인 또는 발달과 연관된; 병태 또는 질환과 연관된 비정상을 가진 세포에 관한 것이며, 예를 들어 전암세포, 암, 병원체 감염된 세포, 겸상 적혈구 빈혈 또는 이와 유사한 질병의 세포이다.
본 명세서에 사용된 아포토시스는 유기체 성장의 정상 및 제어된 부분으로서 발생하는 세포사 경로이다. 아포토시스에 의한 세포사는 괴사와 같은 세포사 기전보다 주변 조직에 덜 손상을 입힌다.
본 명세서에 사용되는 괴사는 질병 또는 손상 유래의 세포사이다. 이는 사이토카인 및 인자를 주변 세포를 손상시킬 수 있는 주변 조직으로 방출한다. 괴저는 괴사성 세포사의 예이다.
화학요법제
화학요법제 및 화학요법 또는 세포독성제는 문맥상 달리 나타내지 않는 한 본 명세서에서 호환 가능하게 사용된다.
본 명세서에 사용된 화학요법은 악성 세포 및 조직에 "선택적으로" 파괴성인 특정 항신생물성 화학 제제 또는 약물, 예를 들어 알킬화제, 티미딜레이트 신타제 저해제를 포함하는 항대사물질, 안트라사이클린, 식물 알카로이드를 포함하는 항-미세소관 제제, 토포이소머라제 저해제, parp 저해제 및 다른 항종양제를 지칭하려는 것이다. 이러한 정황에서 선택적으로는 물론 이들 제제 중 다수가 심각한 부작용이 있기 때문에 느슨하게 사용된다.
바람직한 투여량은 치료되는 암의 성질에 기초하여 시술자에 의해 선택될 수 있다.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 알킬화제의 예는 알킬화제 질소 머스타드, 나이트로소우레아, 테트라진, 아지리딘, 플라틴 및 유도체, 및 비-고전적 알킬화제를 포함한다.
예를 들어, 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 새트라플라틴, 피코플라틴, 네다플라틴, 트리플라틴 및 리포플라틴(시스플라틴의 리포좀 형태), 특히 시스플라틴, 카보플라틴 및 옥살리플라틴과 같은 백금 함유 화학요법제(플라틴류라고도 지칭됨)를 포함한다.
시스플라틴의 투여량은 정확한 암에 따라 약 20 내지 약 270 ㎎/㎡ 범위이다. 종종 투여량은 약 70 내지 약 100 ㎎/㎡ 범위이다.
질소 머스타드는 메클로에타민, 사이클로포스파미드, 멜팔란, 클로람부실, 아이포스파미드 및 부설판을 포함한다.
나이트로소우레아는 N-나이트로소-N-메틸우레아(MNU), 카무스틴(carmustine)(BCNU), 로무스틴(CCNU) 및 세무스틴(MeCCNU), 포테무스틴 및 스트렙토조토신을 포함한다. 테트라진은 다카바진, 미토졸로마이드 및 테모졸로마이드를 포함한다.
아지리딘은 티오테파, 마이토마이신 및 다이아지퀀(AZQ)을 포함한다.
본 개시내용의 방법에 사용될 수 있는 항대사물질의 예는 항엽산제(예를 들어, 메토트렉세이트 및 페메트렉시드), 퓨린 유사체(예를 들어, 티오퓨린류, 예컨대 아자티오퓨린, 머캅토퓨린, 티오퓨린, 플루다라빈(인산염 형태를 포함함), 펜토스타틴 및 클라드리빈), 피리미딘 유사체(예를 들어, 플루오로피리미딘류, 예컨대 5-플루오로우라실 및 이의 전구약물, 예컨대 카페시타빈[Xeloda®]), 플록스우리딘, 젬시타빈, 시타라빈, 데시타빈, 랄티트렉시드(tomudex) 염산염, 클라드리빈 및 6-아자우라실을 포함한다. 본 개시내용의 방법에 사용될 수 있는 안트라사이클린의 예는 다우노루비신(다우노마이신), 다우노루비신(리포좀성), 독소루비신(아드리아마이신), 독소루비신(리포좀성), 에피루비신, 아이다루비신, 현재 방광암 치료에 사용되는 발루비신 및 안트라사이클린 유사체인 미톡산트론, 특히 독소루비신을 포함한다.
본 개시내용의 방법에 사용될 수 있는 항-미세소관 제제의 예는 빈카 알카로이드 및 탁산을 포함한다.
빈카 알카로이드는 완전 천연 화학물질, 예를 들어 빈크리스틴 및 빈블라스틴 및 반-합성 빈카 알카로이드, 예를 들어 비노렐빈, 빈데신 및 빈플루닌을 포함한다.
탁산은 파클리탁셀, 도세탁셀, 아브락산, 카바지탁셀 및 이들의 유도체를 포함한다. 본 명세서에 사용된 탁산의 유도체는 탁솔과 같은 탁산의 리포뮬레이션, 예를 들어, 마이셀 포뮬레이션을 포함하고, 유도체는 또한 탁산인 출발 물질을 변형시키는데 합성 화학이 사용된 화학적 유도체를 포함한다.
본 개시내용의 방법에 사용될 수 있는 토포이소머라제 저해제는 I형 토포이소머라제 저해제, II형 토포이소머라제 저해제 및 II형 토포이소머라제 독을 포함한다. I형 저해제는 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan), 인도테칸(indotecan) 및 인디미테칸(indimitecan)을 포함한다. II형 저해제는 제니스테인 및 다음 구조를 갖는 ICRF 193을 포함한다:
II형 독은 암사크린, 에토포사이드, 에토포사이드 포스페이트, 테니포사이드 및 독소루비신 및 플루오로퀴놀론을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 화학요법은 PARP 저해제이다.
본 개시내용에서 페이로드로 사용하기에 적합한 바이러스
하나의 실시형태에서, 본 발명에 사용된 바이러스는 예를 들어 헤르페스바이러스(예컨대, 단순 헤르페스 바이러스 1), 폭스바이러스(예컨대, 백시니아 바이러스), 헤파드나바이러스, 플라비바이러스, 토가바이러스, 코로나바이러스, D형 간염바이러스, 오르토믹소바이러스(orthomyxovirus), 파라믹소바이러스(paramyxovirus)(예컨대, 홍역 또는 뉴캐슬 병 바이러스(Newcastle disease virus)), 랍도바이러스(rhabdovirus), 부니아바이러스(bunyavirus), 필로바이러스(filovirus) 및 랍도바이러스과(예컨대, 소포성 구내염 인디애나 바이러스)(VSV)로부터 선택된 엔벨로프 바이러스이다.
하나의 실시형태에서, 본 개시내용에 사용된 바이러스는 예를 들어 아데노바이러스과(예컨대, 아데노바이러스), 파필로마바이러스과(papilomaviridae), 피코르나바이러스과(picornaviridae)(예를 들어, 콕사키 바이러스 또는 세네카 밸리(Seneca Valley) 바이러스(예를 들어, 세네카바이러스), 레오바이러스(reovirus)로부터 선택되는 비-엔벨로프 바이러스이다.
하나의 실시형태에서, 바이러스는 아데노바이러스, 예를 들어 그룹 B 바이러스(특히, Ad3, Ad7, Ad11, Ad14, Ad16, Ad21, Ad34, Ad35, Ad51 또는 이의 키메라, 예컨대, Enadenotucirev), 그룹 C 바이러스(특히 Ad1, 2, 5, 6 또는 이의 키메라), 그룹 D 바이러스(특히 Ad8, Ad10, Ad13, Ad 15, Ad17, Ad19, Ad20, Ad22, Ad30, Ad32, Ad33, Ad36, Ad37, Ad38, Ad39, Ad42, Ad43, Ad44, Ad45, Ad46, Ad47, Ad48, Ad49, Ad50 또는 이의 키메라), 그룹 E 바이러스(특히 Ad4), 그룹 F 바이러스(특히 Ad40, Ad41 또는 이의 키메라) 및 그룹 B, C, D, E 또는 F 바이러스의 2 이상의 키메라로부터 선택되는 것과 같은 인간 아데노바이러스를 포함한다.
대부분의 바이러스는 표적 세포 인식 및 섭취와 관련된 잘 알려진 단백질을 보유한다. 종양용해 바이러스로 더욱 선택적인 종양 표적화를 가능하게 하거나 재유도하는 상기 바이러스의 친화성의 변형은 문헌[Verheije and Rottier, Adv. Virology 2012:798526, 2012]에 기술된 방법을 사용하여 도입시킬 수 있다.
천연 바이러스 표적화에 관여하지 않는 추가 바이러스 세포 표면 단백질은 그 위에 조작된 표적화 모티프를 가질 수 있다(예를 들어, 문헌[Ad virion minor coat protein IX Salisch et al., PLoS One 12: e0174728, 2017]).
엔벨로프 바이러스는 바이러스 캡시드를 덮는 외막(엔벨로프)을 갖는다. 엔벨로프는 전형적으로 숙주 세포막의 일부(인지질 및 단백질)로부터 유래되지만, 또한 일부 바이러스 단백질도 포함한다. 엔벌로프의 표면 상의 당단백질은 숙주의 막 상의 수용체 부위를 식별하고 결합하도록 작용한다. 이어서, 바이러스 엔벨로프는 숙주의 막과 융합하여, 캡시드 및 바이러스 게놈이 숙주로 들어가서 감염되게 한다.
다양한 종양용해 바이러스는 본 명세서에 참조에 의해 인용된 WO 2014/13834에 개시되어 있다.
단순 헤르페스 바이러스(HSV)는 4개의 필수 당단백질인 gD, gH/gL, gB에 의해 세포로 들어가고, 그 수용체들인 넥틴 1 및 HVEM 중 하나에 gD 결합에 의해 캐스케이드 방식으로 활성화된다. HSV의 재표적화(retargeting)는 리간드 및 scFvs 를 gC 및/또는 gD 단백질 또는 gH 내로 삽입함으로써 달성되었다(문헌[Campadelli-Fiume, G et al., Med Virol 21: 213-226, 2011, Gatta, V.PLoS Pathog 11: e1004907, 2015] 참조]. 종양용해성 단순 헤르페스 바이러스 타입 1 벡터는 임상용으로 개발되었다. 이들 바이러스는 복제 적격성(replication competent)이고, 바이러스 복제, 신경병인성 및 면역 회피에 영향을 미치는 유전자에 돌연변이를 갖고, 예를 들어, 제1 세대 바이러스, 예컨대 NV1020(R7020), dlsptk, d18.36tk, hrR3, R3616, 1716, 제2 세대 바이러스, 예컨대 G207(MGH-1), 3616UB, SUP, NV1023, 제3 세대 바이러스, 예컨대 G47Δ, 전사 발현 벡터, 예컨대 G92A, d12.CALP, Myb34.5, 돌연변이유전자 발현 벡터, 예컨대 rRP450, 및 기타 바이러스, 예컨대 탈리모진 라헤르파렙벡(Talimogene laherparepvec: T-Vec)를 포함한다. HSV-1 벡터는 광범위한 고형 종양, 예를 들어 신경교종, 흑색종, 유방, 전립선, 결장, 난소 및 췌장 암들의 치료에 유용한 것으로 생각된다. HSV-1 바이러스는 광범위한 세포 유형 및 종을 감염시키고, 이는 사실상 세포용해성이며, 바이러스의 복제 생활환은 숙주 세포 파괴를 초래하고, 상당히 특성화되어 있는 큰 게놈(152K)을 갖지만, 많은 비필수 유전자를 함유하여, 치료 유전자의 삽입에 대한 30K 이하의 공간을 제공한다. 일반적으로, HSV 바이러스는 안전성 이유로 티미딘 키나제 유전자가 돌연변이되지 않는다. 탈리모진 라헤르파렙벡은 흑색종 치료용으로 승인된 종양용해 헤르페스 바이러스(oncolytic herpes virus)이다. 다른 헤르페스 베이시스 바이러스로는 G207, SEPREHVIR(HSV-1716)(Virttu Biologics), HSV-1 R3616 돌연변이체, HSV-1 1716 돌연변이체, NV1020(R7020), R3616 돌연변이체(RL1 결실)를 포함하고, KM100 돌연변이체는 UL48(트란스작용인자 피막 단백질 pUL48[VP16]을 암호화함) 및 RL2 유전자에 삽입체, G92A, 돌연변이체, Myb34.5 및 rQNestin34.5를 보유한다.
폭스바이러스 - 변형된 백시니아 안카라(MVA)와 같은 백시니아 바이러스가 사용될 수 있다(Galmichmc et al., J Gen Virol 78: 3019-3027, 1997). MVA는 종양 관련 항원 MUC-1에 대해 지향성인, 삽입된 scFv를 운반하는 p14 융합 분자로 대체될 수 있다(Paul, S et al., Viral Immunol 20: 664-671, 2007). 또한, 문헌[Liang et al., Viruses 6: 3787-3808, 2014, Hsiao JC et al., J Virol 73: 8750-8761, 1999 참조, Chen TL and Roffler S, Med Res. Rev. 28: 885-928, 2008 및 Kinoshita T et al., J.Biochem 144: 287-294, 2008] 참조. Jx-594(Jennerex 제품)는 티미딘 키나제-결실된 백시니아 바이러스 + GM-CSF이다. GL-ONC1은 전염증성 마우스 모델에서 광범위한 고형 종양의 퇴행 및 제거를 유발하는 약독화된 백시니아 바이러스(Lister 균주)이다.
파라믹소바이러스(예컨대, 홍역 또는 뉴캐슬병 바이러스)
홍역 바이러스(MeV)는 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae)에 속하는 모블리바이러스(Morbillivirus) 속의 단일 가닥의 음성-센스, 엔벨로프형(비-분절화된) RNA 바이러스이다. 홍역 바이러스는 두 개의 엔벨로프 당단백질인 헤마글루티닌(H) 부착 단백질 및 융합(F) 단백질을 보유한다. 부착, 진입 및 후속 세포-세포 융합은 2개의 홍역 수용체, CD46 및 신호전달 림프구 활성화 분자(SLAM)를 통해 매개된다. 예를 들어, 문헌(Msaouel P et al., Methods Mol Biol 797: 141-162, 2012, Robinson S. and Galanis, E. Expert Opin Biol Ther. 17: 353-363, 2017, Aref S et al., Viruses 8. Pii:E294, 2016 참조); (Chen TL And Roffler S, Med Res. Rev. 28: 885-928, 2008 and Kinoshita T et al., J.Biochem 144: 287-294, 2008 참조), 및 (Russell SJ And Peng KW, Curr Topic Microbiol. Immunol 330: 213-241, 2009, Robinson S and Galanis, E Expert Opin Biol. Ther 17: 353-363, 2017, Aref S et al., Viruses 8. Pii:E294,2016). 인간 갑상선 요오드화나트륨 심포터(symporter) 또는 MV-NIS를 암호화하는 홍역 바이러스는 홍역 바이러스의 약독화된 종양용해성 Edmonston(Ed) 균주이다. 방사성 요오드 영상화는 NIS 유전자 발현 모니터링을 위한 신규 기술을 제공한다.
뉴캐슬 질병 바이러스가 또한 사용될 수 있다.
아데노바이러스과 아데노바이러스는 종양용해제로서 사용되는 가장 광범위하게 연구된 바이러스 중 하나이다. 이 바이러스의 천연 지향성을 변경하기 위하여, 다수의 펩타이드 및 단백질들이 비리온 관련 바이러스 단백질들 내로 조작되었다(Verheije MH and Rottier PJM Adv Virol 2012: 798526, 2012 참조). 그러나, 이들은 모두 상당한 문제점이 있는 핵 내에 바이러스의 어셈블리에 의존적이다.
다른 비-엔벨로프형 바이러스로는 콕사키바이러스, 폴레오바이러스 및 레오바이러스를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Altan-Bonnet, N, Curr Opin Microbiol 32: 77-81, 2016 및 Chen YH et al., Cell 160: 619-630, 2015 참조, Chen TL and Roffler S, Med Res. Rev. 28: 885-928, 2008 및 Kinoshita T et al., J Biochem 144: 287-294, 2008 참조 및 Verheije MH and Rottier PJM Adv Virol 2012:798526, 2012 참조].
수많은 아데노바이러스가 있으며, 예를 들어 Ad5-yCD/mutTKSR39rep-hIL12가 예컨대 전립선암의 치료용으로 추진되었고, Oncos Therapeutics 제품인 CGTG-102(Ad5/3-D24-GMCSF)가 예컨대 연조직 육종의 치료용으로, Oncorine(H101), CG0070, Enadenotucirev(EnAd) WO2005/118825, WO2008/080003에 개시된 OvAd1 및 OvAd2, 예컨대 절제불가능한 악성 흉막 중피종을 위한 ONCOS-102, 및 예컨대 신경교종을 위한 DNX-2401이 있다.
Cavatak은 악성 흑색종의 치료에 유용한 야생형 콕사키바이러스 A21의 제조 상품명이다. Seneca Valley virus(NTX-010) 및 (SW-001)은 예컨대 소세포 폐암 및 신경아세포종을 위한 것이다.
레오바이러스 - Reolysin®(pelareorep; 야생형 레오바이러스(Reovirus); 혈청형 3 Dearing; Oncolytics Biotech)은 예컨대 다양한 암 및 세포 증식 장애의 치료용이다.
소포성 구내염 바이러스(VSV) VSV는 종양용해제로서 탐구되고 있는 또 다른 엔벨로프 바이러스이다. 예를 들어, 문헌[Betancourt D et al., J Virol 89: 11786-11800, 2015] 참조 및 문헌[Hastie E and Grdzelishvili VZ J Gen Virol 93: 2529-2545, 2012] 참조.
바이러스에 의해 암호화된 단백질
하나의 실시형태에서, 본 개시내용의 방법에 사용되는 바이러스 또는 벡터는 돌연변이유전자(transgene)를 포함하며, 예를 들어, 여기서 돌연변이유전자는 세포 내의 결함 유전 물질을 대체하고, 세포에 신규 또는 증강된 기능을 제공하며, 치료에 대해 세포를 감작시키고, 세포에서 기능을 차단하거나, 또는 치료 단백질 또는 펩타이드를 발현하는 것이다. 하나의 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 페이로드로서 사용되는 바이러스는 예를 들어 RNAi 서열, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드(예를 들어, 항체 분자 또는 이의 결합 단편, 케모카인, 사이토카인, 면역조절제, 형광 태그 또는 효소)로부터 독립적으로 선택된 인자를 암호화하는 돌연변이유전자 또는 돌연변이유전자들을 포함한다.
이것은 임상전 전망을 나타냈지만 전달에 효과적인 경제적인 수단이 부족한고유의 형식, 예를 들어 펩타이드, 인트라바디(intrabody) 및 대안적 스캐폴드(문헌[Boldicke T, Protein Sci 26: 925-945, 2017, Marschall and Dubel, Comput Struct Biotechnol J 14: 304-308, 2016, Miersch and Sidhu F1000Res 5.pii.F1000 Faculty Rev. 1947, 2016, Peptides, Tsomaia Eur J Med Chem 94: 459-470, 2015, Marschall ALJ et al, Mabs 7: 1010-1035, 2015, AlDeghaither D et al., J Clin Pharmacol. 55:S4-S20, 2015] 참조)를 포함하지만, 이에 국한되지 않으며, 종양 세포, 종양 줄기 세포, 종양 관련 내피 및 종양 관련 간질에 치료 효과를 갖는 제제를 포함한다. 특히, 여러 기능, 예를 들어 치료제, 바이오마커 및/또는 진단제로서 작용할 수 있는 분자가 중요하다. 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제(HSV-TK) 유전자는 임상적으로 승인된 전구약물(간시클로비어-GCV)을 갖는 잘 확립된 전구약물 전환 효소이다(예를 들어, 문헌[Holder et al., Cancer Res. 53: 3475-3485, 1993, Touraine RL et al., Gene Therapy 5: 1705-1711, 1998] 참조).
또한, 티미딘 키나제 단백질 발현은 치료 과정 동안 바이러스요법의 활성을 영상화하고 추적하는 데에도 활용될 수 있다. 양전자 방출 단층촬영 및 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영은 둘 다 암 및 암 치료법의 검출 및 모니터링에 통용되는 방법이며, 둘 다 적절한 티미딘 키나제 기질이 투여될 때 티미딘 키나제 단백질의 발현을 검출하는 실행가능한 수법이다(Wang JQ et al., Bioorg Med Chem 13: 549-556, 2005, Tjuvajev JG et al, J. Nucl Med 43: 1072-1083, 2002). 대안적으로, NIS 유전자는 TK와 같은 종양용해 바이러스에서 진단 및 치료 목적을 위한 제제로서 탐구되고 있다(Miller A and Russell S Expert Opin Biol Ther 16: 15-32, 2016, Ravera S et al., Annu Rev Physiol 79: 261-289, 2017, Portulano et al., Endocr Rev. 35:106-149, 2014).
하나의 실시형태에서, RAS 신호전달 경로에서 RAS 또는 단백질과 상호작용하고 억제하는 항체는 본 개시내용의 바이러스에, 예를 들어 GLA-성분과 융합 단백질로서 암호화된다. RAS 유전자는 HRAS, NRAS 및 KRAS를 포함하는 다중유전자 패밀리를 구성한다. 예를 들어, 문헌[Bos JL, Cancer Res. 49: 4682-4689, 1989; 및 Cetin M et al., J Mol Biol. 429: 562-573, 2017] 참조.
표지
하나의 실시형태에서, 페이로드는 형광 표지, 화학발광 표지, 방사성 표지, 효소, 염료 또는 리간드를 포함한다.
본 발명에 따른 표지는 분석을 사용하여 검출될 수 있는 임의의 모이어티로서 정의된다. 리포터 분자의 비제한적인 예는 효소, 방사성 표지, 합텐, 형광 표지, 인광 분자, 화학발광 분자, 발색단, 광친화성 분자, 착색된 입자 또는 리간드, 예컨대 비오틴을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 표지는 또한 태그, 예를 들어 His-태그, Flag-태그 및 이의 유사물을 포함한다. 표지는 아비딘의 기질인 비오틴을 포함한다.
표지는 접합 또는 융합에 의해 GLA-성분에 연결될 수 있다. 표지는 유일한 페이로드일 수 있거나, 또는 치료 페이로드와 같은 다른 개체에 부가될 수 있다.
표지 접합체는 진단제로서 사용하기에 적합하다. 진단제는 일반적으로 두 부류, 즉 시험관내 진단에 사용하기 위한 것, 및 일반적으로 "유도 영상화(directed imaging)"로 알려진 생체내 진단 프로토콜에 사용하기 위한 것에 속한다. 많은 적절한 영상화제는 펩타이드 및 폴리펩타이드에 부착하기 위한 방법들로서 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,021,236호, 제4,938,948호 및 제4,472,509호 참조). 사용된 영상화 모이어티는 상자성 이온, 방사성 동위원소, 플루오로크롬, NMR-검출가능 물질, 및 X선 영상화제일 수 있다.
상자성 이온의 경우, 예시적으로 이온, 예컨대 크롬(III), 망간(II), 철(III), 철(II), 코발트(II), 니켈(II), 구리(II), 네오디뮴(III), 사마륨(III), 이테르븀(III), 가돌리늄(III), 바나듐(III), 테르븀(III), 디스프로슘(III), 홀뮴(III) 및/또는 에르븀(III)을 들 수 있고, 특히 가돌리늄이 바람직하다. X선 영상화와 같이 다른 정황에서 유용한 이온은 란탄(III), 금(III), 납(II), 및 특히 비스무스(III)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
치료 및/또는 진단 적용을 위한 방사성 동위원소의 경우, 아스타틴211, 14탄소, 51크롬, 36염소, 57코발트, 58코발트, 구리67, 152Eu, 갈륨67, 3수소, 요오드123, 요오드125, 요오드131, 인듐111, 59철, 32인, 레늄186, 레늄188, 75셀레늄, 35황, 테크니슘99m 및/또는 이트륨90을 예로 들 수 있다. 125I는 특정 실시형태에서 사용하기에 적합하고, 테크니슘99m 및/또는 인듐111은 이들의 낮은 에너지 및 장범위 검출에 대한 적합성으로 인해 특히 적합하다. 방사성 표지된 펩타이드 및 폴리펩타이드는 본 기술분야에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 펩타이드 및 폴리펩타이드는 요오드화 나트륨 및/또는 요오드화 칼륨 및 차아염소산나트륨과 같은 화학적 산화제 또는 락토퍼옥시다제와 같은 효소적 산화제와 접촉함으로써 요오드화될 수 있다. 펩타이드는 리간드 교환 공정에 의해, 예를 들어 퍼테크네이트를 주석 용액으로 환원시키고, 환원된 테크네튬을 세파덱스 컬럼 상에 킬레이트화시키고, 이 컬럼에 펩타이드를 적용함으로써, 테크네튬99m으로 표지화시킬 수 있다. 대안적으로, 예를 들어 퍼테크네이트, SNCl2와 같은 환원제, 나트륨-칼륨 프탈레이트 용액과 같은 완충액, 및 펩타이드를 항온처리함으로써, 직접 표지화 기술을 사용할 수 있다. 금속 이온으로서 존재하는 방사성 동위원소를 펩타이드에 결합시키는데 종종 사용되는 중간 작용기는 다이에틸렌트라이아민펜타아세트산(DTPA) 또는 에틸렌 디아민테트라아세트산(EDTA)이다.
페이로드로서 사용하기에 적합한 형광 표지는 Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, 캐스케이드 블루(Cascade Blue), Cy3, Cy5,6-FAM, 플루오레세인 아이소티오시아네이트, HEX, 6-JOE, 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린 500,오레곤 그린 514, 퍼시픽 블루(Pacific Blue), REG, 로다민 그린(Rhodamine Green), 로다민 레드(Rhodamine Red), 레노그라핀(Renographin), ROX, TAMRA, TET, 테트라메틸로다민, 및/또는 텍사스 레드(Texas Red)를 포함한다.
시험관내에서 사용하기에 적합한 또 다른 유형의 페이로드는 펩타이드가 2 차 결합 리간드 및/또는 발색성 기질과 접촉시 유색 생성물을 생성하는 효소(효소 태그)에 연결되어 있는 경우이다. 적합한 효소의 예는 우레아제, 알칼리성 포스파타제, (양고추냉이) 수소 퍼옥시다제 또는 글루코스 옥시다제를 포함한다. 적합한 2 차 결합 리간드는 비오틴 및 아비딘 및 스트렙타비딘 화합물이다. 이러한 표지의 사용은 본 기술분야의 숙련된 자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 제3,817,837호, 제3,850,752호, 제3,939,350호, 제3,996,345호, 제4,277,437호, 제4,275,149호 및 제4,366,241호에 기재되어 있다.
펩타이드를 이의 "접합 파트너"에 연결하기 위한 부착에 대하여 본 기술분야에는 다른 방법들이 알려져 있다. 몇몇 부착 방법은 예를 들어 항체에 부착된 다이에틸렌트라이아민펜타아세트산 무수물(DTPA); 에틸렌트라이아민테트라아세트산; N-클로로-p-톨루엔설폰아마이드; 및/또는 테트라클로로-3α,6α-다이페닐글리코우릴-3과 같은 유기 킬레이트제를 이용하는 금속 킬레이트 착물의 사용을 수반한다(미국 특허 제4,472,509호 및 제4,938,948호). 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 또한 글루타르알데히드 또는 과요오드산염과 같은 커플링제의 존재하에 효소와 반응시킬 수 있다. 플루오레세인 마커와의 접합체는 상기 커플링제의 존재 하에 또는 아이소티오시아네이트와의 반응에 의해 제조한다.
하나의 실시형태에서, 표지는 줄기 세포의 핵을 염색 또는 표지화할 수 있다.
조합 요법
하나의 실시형태에서, 사용되는 화학요법제의 조합은 예를 들어 플라틴과 5-FU 또는 이의 전구약물, 예를 들어 시스플라틴 또는 옥사플라틴과 카페시타빈 또는 젬시타빈, 예를 들어 FOLFOX이다.
하나의 실시형태에서, 화학요법은 화학요법제, 특히 세포독성 화학요법제의 조합을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 화학요법 조합은 플라틴, 예컨대 시스플라틴과 플루오로우라실 또는 카페시타빈을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 화학요법 조합은 카페시타빈과 옥살리플라틴(Xelox)이다.
하나의 실시형태에서, 화학요법은 폴린산과 5-FU의 조합, 경우에 따라 옥살리플라틴과의 조합이다.
하나의 실시형태에서, 화학요법은 폴린산, 5-FU 및 이리노테칸의 조합(FOLFIRI), 경우에 따라 옥살리플라틴과의 조합(FOLFIRINOX)이다. 처방은 다음과 같이 이루어진다: 폴린산(120분 동안 400 ㎎/㎡(또는 2×250 ㎎/㎡) IV)과 동시에 이리노테칸(180 ㎎/㎡, 90분 동안); 그 다음 플루오로우라실(400 내지 500 ㎎/㎡ IV 볼러스), 그 다음 플루오로우라실(2400 내지 3000 ㎎/㎡, 정맥내 주입, 46 시간 동안). 이 사이클은 일반적으로 2주마다 반복한다. 상기 제시된 투여량은 사이클마다 달라질 수 있다.
하나의 실시형태에서, 화학요법 조합은 미세소관 저해제, 예를 들어 빈크리스틴 설페이트, 에포틸론 A, N-[2-[(4-하이드록시페닐)아미노]-3-피리디닐]-4-메톡시벤젠설폰아마이드(ABT-751), 탁솔 유래의 화학요법제, 예를 들어 파클리탁셀, 아브락산 또는 도세탁셀 또는 이의 조합을 사용한다.
하나의 실시형태에서, 화학요법 조합은 mTor 저해제를 사용한다. mTor 저해제의 예로는 에버롤리무스(RAD001), WYE-354, KU-0063794, 파파마이신(시롤리무스), 템시롤리무스, 데포롤리무스(MK-8669), AZD8055 및 BEZ235(NVP-BEZ235)를 들 수 있다.
하나의 실시형태에서, 조합 요법은 MEK 저해제를 사용한다. MEK 저해제의 예는 AS703026, CI-1040(PD184352), AZD6244(셀루메티닙(Selumetinib)), PD318088, PD0325901, AZD8330, PD98059, U0126-EtOH, BIX02189 또는 BIX02188을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 화학요법 조합은 AKT 저해제를 사용한다. AKT 저해제의 예는 MK-2206 및 AT7867을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 조합은 오로라(aurora) 키나제 저해제를 사용한다. 오로라 키나제 저해제의 예로는 Aurora A 저해제 I, VX-680, AZD1152-HQPA(바라세팁(Barasertib)), SNS-314 메실레이트, PHA-680632, ZM-447439, CCT129202 및 헤스페라딘을 들 수 있다.
하나의 실시형태에서, 조합 요법은 예를 들어 WO2010/038086에 개시된 바와 같은 p38 저해제, 예컨대 N-[4-({4-[3-(3-tert-부틸-1-p-톨릴-1H-피라졸-5-일)우레이도]나프탈렌-1-일옥시}메틸)피리딘-2-일]-2-메톡시아세트아마이드를 사용한다.
하나의 실시형태에서, 조합은 Bcl-2 저해제를 사용한다. Bcl-2 저해제의 예는 오바토클락스(obatoclax) 메실레이트, ABT-737, ABT-263(나비토클락스) 및 TW-37을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 화학요법 조합은 항대사물질, 예컨대 카페시타빈(xeloda), 플루다라빈 포스페이트, 플루다라빈(fludara), 데시타빈, 랄티트렉시드(tomudex), 젬시타빈 염산염 및 클라드리빈을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 조합 요법은 면역 반응 및/또는 종양 혈관형성을 제어하는데 도움을 줄 수 있는 간시클로비어(ganciclovir)를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 화학요법은 PARP 저해제를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 조합 요법은 DHODH 효소 활성의 특이적 억제를 가진 암 대사의 저해제를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 본 명세서의 방법에 사용되는 하나 이상의 요법은 메트로놈성(metronomic)이며, 즉 종종 다른 치료 방법과 동반 제공되는, 낮은 투여량의 항암 약물에 의한 연속적 또는 빈번한 치료이다.
하나의 실시형태에서, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8회 같은 치료(예컨대, 화학요법)의 복수 사이클의 사용이 제공된다.
하나의 실시형태에서, 화학요법은 28 일 사이클로 사용된다.
본 발명의 GLA-성분은 감염 세포로부터 유래된 세포외 소포를 표적화함에 의하여 하기 감염 중 하나 이상을 치료하도록 개조될 수 있다: 아시네토박터 감염(아시네박터 바우마니이(Acinetobacter baumannii)), 방선균증(악티노마이세스 이스라엘리(Actinomyces israelii), 악티노마이세스 제렌세리애(Actinomyces gerencseriae) 및 프로피오니박테륨 프로피오니쿠스(Propionibacterium propionicus)), 아프리카 트립파노소마증(트리파노소마 부르세이(Trypanosoma burcei))으로도 알려진 아프리카 수면병, AIDS - 후천성 면역결핍 증후군(HIV(인간 면역결핍 바이러스)), 아메바증(엔타모에바 히스토리티카(Entamoeba histolytica)), 아나플라스마증(아나플라스마(Anaplasma) 종), 주혈선충증(안지오스트론길루스(Angiostrongylus)), 고래회충증(아니사키스(Anisakis)), 탄저균(바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis)), 아카노박테륨 용혈균 감염(아르카노박테륨 해몰라이티쿰(Arcanobacterium haemolyticum)), 아르헨티나 출혈열(주닌 바이러스(Junin virus)), 회충증[아스카리스 룸브리코이데스(Ascaris lumbricoides)], 아스페르길로시스증(아스페르길루스(Aspergillus) 종), 애스트로바이러스 감염(아스트로비리대(Astroviridae) 과), 바베시아 감염증(바베시아(Babesia) 종), 바실러스 세레우스 감염(바실러스 세레우스(Bacillus cereus)), 박테리아 폐렴(다중 박테리아), 박테리아성 질염(박테리아성 질염 미생물총), 박테로이데스 감염(Bacteroides), 대장섬모충증(발란티디움 콜라이(Balantidium coli)), 바르토넬라증(바르토넬라(Bartonella)), 베이리사스카리스 감염(바일리사스카리스(Baylisascaris)), BK 바이러스 감염(BK 바이러스), 흑색사모증(피에드라이아 호르태(Piedraia hortae)), 블라스토시스티스 감염증(블라스토시스티스(Blastocystis)), 분아균증(블라스토마이세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis)), 볼리비아 출혈열(마추포(Machupo) 바이러스), 보툴리누스증 및 영아 보툴리누스증(클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum); 주: 보툴리누스증은 클로스트리듐 보툴리넘에 의한 감염이 아니고 보툴리눔 독소의 섭취에 의해 유발된 것임), 브라질 출혈열(사비아(Sabia) 바이러스), 브루셀라병(브루셀라(Brucella)), 선페스트(엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae)), 부르크홀데리아 감염병(부르크홀데리아(Burkholderia)), 부룰리 궤양(마이코박테륨 울세란스(Mycobacterium ulcerans)), 칼리시 바이러스(칼리시비리대(Caliciviridae)(노로바이러스 및 사포바이러스)), 캄필로박터증(캄필로박터(Campylobacter)), 트러시(Thrush)라고도 알려진 칸디다증(칸디다(Candida)), 모세선충증(카필라리아 필로피넨시스(Capillaria philippinensis)에 의한 장 질환, 카필라리아 헤파티카(Capillaria hepatica)에 의한 간 질환 및 카필라리아 에어로필라(Capillaria aerophila)에 의한 폐 질환), 캐리온 병(바토넬라 바실리포르미스(Bartonella bacilliformis)), 고양이 할큄병(바토넬라 헨셀래(Bartonella henselae)), 봉와직염(일반적으로 그룹 A 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 스타필로코커스(Staphylococcus)), 미국 트리파노소마증이라고도 알려진 샤가스 병(트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi)), 연성하감(해모필루스 두크레이(Haemophilus ducreyi)), 수두(바리셀라 조스터(Varicella zoster) 바이러스), 치쿤구니야(알파바이러스(Alphavirus)), 클라미디아(클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)), TWAR이라고도 알려진 클라미디아 폐렴균 감염증(클라미도필라 뉴모니애(Chlamydophila pneumoniae)), 콜레라(비브리오 콜레래(Vibrio cholerae)), 크로모블라스토진균증(폰세카애 페드로소이(Fonsecaea pedrosoi)), 키트리디오마이코시스(바트라초키트리움 덴드라바티디스(Batrachochytrium dendrabatidis)), 간흡충증(클로노르키스 시넨시스(Clonorchis sinensis)), 클로스트리듐 디피실레균 대장염(클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile)), 콕시디오이데스증(콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis) 및 콕시디오이데스 포사다시이(Coccidioides posadasii)), 콜로라도진드기열(콜로라도 틱 열 바이러스(Colorado tick fever virus)), 일반 감기/급성 바이러스 비인두염/급성 코리자(일반적으로 리노바이러스 및 코로나바이러스), 크리미안 콩고 출혈열(크리미안 콩고 출혈열 바이러스(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus)), 크립토코커스증(크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans)), 크립토스포리듐증(크립토스포리듐(Cryptosporidium)), 피부리슈만편모충증(일반적으로 안사일로스토마 브라질리엔스(Ancylostoma braziliense) 및 복수의 다른 기생충), 원포자충 감염증(사이클로스포라 카에타넨시스(Cyclospora cayetanensis)), 낭충증(태니아 솔리움(Taenia solium)), 거대세포바이러스 감염증(사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus)), 뎅기열(뎅기(Dengue) 바이러스, 예컨대 DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4), 디엔트아메바증(디엔타모에바 프라길리스(Dientamoeba fragilis)), 디프테리아(코리네박테륨 디프테리애(Corynebacterium diphtheriae)), 열두조충증(디필로보트리움(Diphyllobothrium)), 용선충증(드루쿤쿨루스 메디넨시스(Dracunculus medinensis)), 에볼라 출혈열(에볼라바이러스(Ebolavirus)), 포낭충증(에키노코커스(Echinococcus)), 에르리히증(에르리히아(Ehrlichia)), 장내세균과(카바페넴 내성 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae)), 요충증(엔테로비우스 베르미쿨라리스(Enterobius vermicularis)), 장내구균 감염증(엔테로코커스(Enterococcus)), 엔테로바이러스(Enterovirus), 발진티푸스(리케치아 프로바제키이(Rickettsia prowazekii)), 감염성 홍반(파보바이러스 B19), 돌발성 발진(인간 헤르페스바이러스 6 (HHV-6) 및 인간 헤르페스바이러스 7 (HHV-7)), 간질증(파스키올라 헵타티카(Fasciola hepatica) 및 파스시올라 기간티카(Fasciola gigantica)), 장흡충증(Fasciolopsis buski), 사상충증(Filarioidea), 클로스트리듐 퍼프리젠스에 의한 식중독(Clostridium perfringens), 자유 아메바 감염(다양한 병원체), 푸조박테륨 감염증(Fusobacterium), 가스 괴저병(일반적으로 클로스트리듐, 예컨대 퍼프린젠스), 지오트리쿰증(Geotrichum candidum), 편모충증(Giardia lamblia), 마비저(Burkholderia mallei), 악구충증(Gnathostoma spinigerum 및 Gnathostoma hispidum), 임질(Neisseria gonorrhoeae), 서혜부 육아종(Klebsiella granulomatis), 그룹 A 스트렙토코커스 감염증(Streptococcus pyogenes), 그룹 B 스트렙토코커스 감염증(Streptococcus agalactiae), 헤모필루스 인플루엔자 ㄱ가감염증(Haemophilus influenzae), 수족구병(Enteroviruses, 주로 콕사키 A 바이러스 및 엔테로바이러스 71 (EV71)), 한타바이러스 폐증후군(Sin Nombre 바이러스), 하트랜드 바이러스 질환(Heartland 바이러스), 헬리코박터 파이롤리 감염증(Helicobacter pylori), 용혈요독성 증후군(Escherichia coli, 예컨대 O157:H7, O111 및 O104:H4), 신증후군성 출혈열(부니아바이러스 과), A형 간염(A형 간염 바이러스), B형 간염(B형 간염 바이러스), C형 간염(C형 간염 바이러스), D형 간염(D형 간염 바이러스), E형 간염(E형 간염 바이러스), 단순 헤르페스(단순 헤르페스 바이러스 1 및 2(HSV-1 및 HSV-2), 히스토플라스마증(히스토플라즈마 캅술라툼(Histoplasma capsulatum)), 십이지장충(안사이클로스토마 두오데날레(Ancylostoma duodenale) 및 네카토르 아메리카누스(Necator americanus)), 인간 보카바이러스 감염증(인간 보카바이러스(Human bocavirus)), 인간 에를리히증(에를리히하 에윙이(Ehrlichia ewingii)), 인간 과립구성 아나플라스마증(아나플라스마 파고사이토필룸(Anaplasma phagocytophilum)), 인간 메타뉴모바이러스 감염증(인간 메타뉴모바이러스(Human metapneumovirus)), 인간 단핵구 에를리히증(에를리히아 카페엔시스(Ehrlichia chaffeensis)), 인간 유두종바이러스 감염증(인간 유두종바이러스), 인간 파라인플루엔자 바이러스 감염증(인간 파라인플루엔자 바이러스), 왜소조충증(하이메놀렙시스 나나(Hymenolepis nana) 및 하이메놀렙시스 디미누타(Hymenolepis diminuta)), 엡스타인-바 바이러스 전염성 단핵구증(엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스), 인플루엔자(오쏘믹소비리대(Orthomyxoviridae)), 포자충증(이소스포라 벨리(Isospora belli)), 가와사키병, 각막염(다양한 병원체), 킨겔라 킨개 감염증(킨겔라 킨개(Kinglella kingae)), 라사열(라사(Lassa) 바이러스), 레지오네르병으로도 알려진 레지오넬라증(레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila)), 리슈만편모충증(리슈마니아(Leishmania)), 한센병(마이코박테륨 레프래(Mycobacterium leprae) 및 마이코박테륨 레프로마토시스(Mycobacterium lepromatosis)), 렙토스피라증(렙토스피라(Leptospira)), 리스테리아증(리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)), 라임병(보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 보렐리아 가리니이(Borrelia garinii) 및 보렐리아 아프젤리이(Borrelia afzelii)), 림프사상충증(부케레리아 반크로프티(Wuchereria bancrofti) 및 브루기아 말라이이(Brugia malayi)), 림프구성 맥락수막염(림프구성맥락수막염 바이러스), 말라리아(플라스모듐(Plasmodium)), 마르부르크 출혈열(마르부르크(Marburg) 바이러스), 홍역(홍역 바이러스), 중동 호흡기 증후군(중동 호흡기 증후군 코로나바이러스), 유비저증(부르크홀데리아 슈도말레이(Burkholderia pseudomallei)), 뇌수막염(다수), 수막염(네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis)), 요코가와흡충증(일반적으로, 메타고니무스 요카가와이(Metagonimus yokagawai)), 미포자충증(미크로스포리디아 필룸(Microsporidia phylum)), 전염성 연속종(전염성 염속증(Molluscum contagiosum) 바이러스), 원두증(원두증 바이러스), 볼거리(멈프스 바이러스), 발진열(리케챠 티피(Rickettsia typhi)), 마이코플라스마 폐렴(마이코플라즈마 뉴모니애(Mycoplasma pneumoniae)), 진균종(악티노마이세토마(Actinomycetoma) 및 진균 유마이세토마(Eumycetoma)), 구더기증(기생충성 구더기), 신생아 결막염(클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 및 네이세리아 고노로애(Neisseria gonorrhoeae)가 가장 일반적임), 노로바이러스 감염증(노로바이러스), 노카르디아증(노카르디아(Nocardia), 예컨대, 엔. 아스테로이데스(N. asteroides)), 회선사상충증(온코세르카 볼불루스(Onchocerca volvulus)), 간흡충증(오피스토르키스 비레리니(Opisthorchis viverrini) 및 오피스토르키스 펠리뉴스(Opisthorchis felineus)), 파라콕시디오이드 진균증(파라콕시디오이데스 브라실리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis)), 폐흡충증(파라고니무스(Paragonimus), 예컨대 웨스테르마니(westermani)), 파스퇴렐라증(파스퇴렐라(Pasteurella)), 골반염(각종 병원체), 백일해(보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis)), 흑사병(예르시니아 페스티스(Yersinia pestis)), 폐렴구균 감염(스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)), 주폐포자충 폐렴(뉴모시스티스 지로베시이(Pneumocystis jirovecii)), 폐렴(각종 병원체), 소아마비(폴레오바이러스), 프리보텔라 감염증(프레보텔라(Prevotella)), 원발성 아메바성 뇌수막염(일반적으로, 내글레리아 포울레리(Naegleria fowleri)), 진행성 다초점 백질 뇌병증(JC 바이러스), 앵무새병(클라미도필라 프시타시(Chlamydophila psittaci)), Q열(콕시엘라 부르네티이(Coxiella burnetii)), 광견병(광견병 바이러스), 재귀열(보르렐리아(Borrelia), 예컨대, 비. 헤름시이(B. hermsii) 및 비. 레쿠렌티스(B. recurrentis)), 호흡기 세포융합 바이러스 감염(호흡기 세포융합 바이러스), 라이노스포리듐증(라이노스포리듐 시베리(Rhinosporidium seeberi)), 라이노바이러스 감염증(라이노바이러스), 리케차 감염(리케차 종(Rickettsia species)), 리케차폭스(리케차 아카리(Rickettsia akari)), 리프트밸리열(리프트밸리열(Rift Valley fever) 바이러스), 로키산 홍반열(Rickettsia rickettsii), 로타바이러스 감염(로타바이러스), 풍진(풍진 바이러스), 살모넬라증(살모넬라(Salmonella)), 중증 급성 호흡기 증후군(SARS 코로나바이러스), 주혈흡충증(쉬스토소마(Schistosoma)), 폐혈증(각종 병원체), 시겔라증(시겔라(Shigella)), 대상포진(대상포진 바이러스), 천연두(베리올라 메이저(Variola major) 또는 베리올라 마이너(Variola minor)), 스포로트리쿰증(스포로트릭스 쉔키이(Sporothrix schenckii)), 포도상구균 식중독(스타필로코커스(Staphylococcus)), 포도상구균 감염증(스타필로코커스), 간충증(스트롱기로이데스 스테르코랄리스(Strongyloides stercoralis)), 아급성 경화성 범뇌염(홍역 바이러스), 매독(트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum)), 조충병(태니아(Taenia)), 파상풍(클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani)), 백선성 모창(일반적으로 트리코피톤(Trichophyton)), 두부 백선(트리코피톤 톤수란스(Trichophyton tonsurans)), 체부 백선(일반적으로 트리코피톤), 완선(일반적으로 에피더포피톤 플록코섬(Epidermophyton floccosum), 트리코피톤 루브룸(Trichophyton rubrum), 및 트리코피톤 멘타그로피테스(Trichophyton mentagrophytes)), 손 백선(트리코피톤 루브룸), 흑색피부곰팡이증(일반적으로, 호르태아 웨르네키이(Hortaea werneckii)), 무좀(일반적으로 트리코피톤), 조갑백선(일반적으로 트리코피톤), 어루러기(말라세지아(Malassezia)), 톡소카라증(톡소카라 카니스(Toxocara canis) 또는 톡소카라 카티(Toxocara cati)), 트라코마(클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)), 톡소플라즈마증(톡소플라즈마 곤디이(Toxoplasma gondii)), 선모충증(트리키넬라 스피랄리스(Trichinella spiralis)), 트리코모나스증(트리코모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis)), 편충증(트리추리스 트리추라(Trichuris trichiura)), 결핵(일반적으로, 마이코박테륨 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)), 야토병(프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis)), 장티푸스(살모넬라 엔테리카 아종 엔테리카(Salmonella enterica subsp. enterica), 세로바르 티피(serovar typhi)), 발진티푸스(리케차(Rickettsia)), 우레아플루스마우레알리티쿰 감염증(우레아플라즈마 우레알라이티쿰(Ureaplasma urealyticum)), 계곡열(콕시디오데스 이미티스(Coccidioides immitis) 또는 콕시디오데스 포사다시이(Coccidioides posadasii)), 베네수엘라 말뇌염(베네수엘라 말뇌염 바이러스), 베네수엘라 출혈열(구아나리토(Guanarito) 바이러스), 패혈증 비브리오 감염증(비브로 불니피쿠스(Vibrio vulnificus)), 비브리오 파라헤몰라이티쿠스 장염(비브리오 파라헤몰라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)), 바이러스 폐렴(각종 바이러스), 웨스트나일열(웨스트 나일 바이러스), 백사모증(트리코스포론 베이겔리이(Trichosporon beigelii)), 예르시니아 거짓결핵균증(예르시니아 슈도투베르쿨로시스(Yersinia pseudotuberculosis)), 예르시니아증(예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)), 황열(황열 바이러스) 및 털곰팡이증(지고마이세테스(Zygomycetes)).
세포내 병원체
세포내 세포 병원체는 이 병원체가 세포 내부에 있는 즉시 세포 환경에 의하여 병원체에 약간의 방어 레벨이 제공될 수 있기 때문에 치료하기에 가장 어려운 것 중 일부일 수 있다.
병원체는 바이러스, 박테리아, 진균, 원생동물 등일 수 있다. 본 개시내용의 분자들은 세포내 병원체, 특히 본 명세서에 개시된 병원체의 치료에 특히 유용하다.
주목할 만한 세포내 박테리아는 바토넬라 헨셀레, 프란시셀라 툴라렌시스, 리스테리아 모노사이토게네스, 살모넬라 티피(Salmonell typhi), 브루셀라, 레지오넬라, 마이코박테륨(예컨대, 마이코박테륨 투베르쿨로시스), 노카르디아, 로도코커스 에퀴(Rhodococcus equi), 예르시니아(Yersinia), 네세리아 메닝기티디스(Neisseria meninggitidis)를 포함한다.
하나 이상의 항생제는 에리스로마이신, 독시사이클린, 아지트로마이신, 리팜핀, 스트렙토마이신, 젠타미신, 독시사이클린, 시프로플록사신, 앰피실린, 트리메토프림-설파메톡사졸, 클로람페니콜, TMP-SMZ(트리메토프림-설파메톡사졸), 레보플록사신, 목시플록사신, 클라리트로마이신, 테트라사이클린, 글리실사이클린, 에탐부톨, 리파부틴, 이미페넴, 세포탁심, 아미카신, 반코마이신, 미노사이클린, 페니실린 G, 앰피실린, 플루오로퀴놀론, 아즈트레오남 및 이들의 2종 이상의 조합으로부터 선택된다.
마이코박테륨 튜베르큘로시스는 치료하기 어려운 것으로 악명이 높다. 하나의 독립된 양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 TB 약물이 본 명세서에 기술된 GLA-성분에 페이로드로서 접합되어 있는 잠복성 및/또는 활성 TB를 치료하기 위한 분자를 제공한다.
본 개시내용의 분자는 현재의 의약을 마이코박테륨이 위치한 세포 내부로 전달함으로써 의약의 효능을 크게 증가시킬 수 있다.
TB에 대한 치료는 TB가 잠복성 또는 활성인지, 환자가 성인인지, 소아인지, 임산부인지, HIV 양성자인지 또는 이들의 조합인지를 포함하는 다수의 인자들에 의존적이다. 이하 상세한 설명은 본 발명의 모든 양태, 예를 들어 어떤 분자를 제조할 것인지, 그리고 이를 이용하여 환자를 어떻게 치료할 것인지에 관한 것이다.
HIV 환자 및 2 내지 11세 연령 범위의 소아에서 잠복성 TB의 치료는 6 내지 9개월 동안 매일 아이소나이아자이드이다. 임산부는 매일과 대조적으로 주당 2회 처리될 수 있다.
즉, 본 개시내용의 분자의 하나의 실시형태에서, GLA-성분은 아이소나이아자이드 또는 이의 등가물을 포함하는 페이로드에 연결된다.
합병증 요인 없이 12세 이상인 환자에서 잠복성 TB의 치료는 주당 1회씩 3개월 동안 아이소나이아자이드 및 리파펜틴으로 제공될 수 있다. 대안적으로, 리팜핀이 4개월 동안 매일 제공될 수 있다.
이러한 하나의 실시형태에서, 페이로드는 리파펜틴을 추가로 포함한다.
대안적으로, 리파펜틴을 포함하는 페이로드에 본 명세서에 기술된 바와 같은 GLA 도메인이 연결된 분자가 제공될 수 있다. 본 개시내용에 따른 분자의 조합은 치료용으로 제공될 수 있다.
활성 TB에 대한 제일선의 치료는 종종 아이소나이아자이드, 리팜핀, 에탐부톨, 피라진아마이드 및 이들의 2종 이상의 조합으로부터 선택된다.
따라서, 리팜핀을 포함하는 페이로드에 연결된, 본 명세서에 기술된 바와 같은 GLA-성분을 포함하는 본 개시내용에 따른 분자가 제공된다.
또한, 에탐부톨을 포함하는 페이로드에 연결된, 본 명세서에 기술된 바와 같은 GLA-성분을 포함하는 본 개시내용에 따른 분자도 제공된다.
추가 실시형태에 따르면, 피라진아마이드를 포함하는 페이로드에 연결된, 본 명세서에 기술된 바와 같은 GLA-성분을 포함하는 본 개시내용에 따른 분자가 제공된다.
분명하게 예상되는 것으로서, 본 명세서에 개시된 세포외 소포를 이용하는 TB의 치료에 사용되는 페이로드는 2 종 이상, 예컨대 3 종 또는 4 종의 약물, 예컨대 아이소나이아자이드 및 리파마이신, 아이소나이아자이드 및 피락신아마이드, 아이소나이아자이드 및 에탐부톨, 리파마이신 및 피락신아마이드, 리파마이신 및 에탐부톨, 피락신아마이드 및 에탐부톨, 아이소나이아자이드 및 리파마이신 및 피락신아마이드, 아이소나이아자이드 및 리파마이신 및 에탐부톨, 및 아이소나이아자이드 및 리파마이신 및 피락신아마이드 및 에탐부톨을 포함할 수 있다.
바이러스 병원체는 인플루엔자, 인간 면역결핍 바이러스, 뎅기 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 천연두 바이러스, 호흡기합포체 바이러스, 한국 출혈열 바이러스, 수두, 수두 대상포진 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 1 또는 2, 엡스타인-바 바이러스, 말부르그 바이러스, 한타바이러스, 황열 바이러스, A형, B형, C형 또는 E형 간염, 에볼라 바이러스, 인간 유두종 바이러스, 리노바이러스, 콕사키 바이러스, 소아마비 바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 광견병 바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 로타바이러스, HIV(예컨대, HTLV-1 및 -2)를 포함한다.
GLA-성분에 연결될 수 있는 항바이러스 약물은 다음 중 하나 이상으로부터 독립적으로 선택될 수 있다: 아바카비어, 아시클로버, 아사이클로버, 아데포비어, 아만타딘, 암프레나비어, 앰플리겐, 아르바이돌, 아타자나비어, 아트리플라, 보세프레비레르테트, 시도포비어, 콤비비어, 다루나비어, 델라비르딘, 디다노신, 도코사놀, 에독수딘, 에파비렌즈, 엠트리시타빈, 엔푸비어타이드, 엔테카비어, 엔트리 저해제, 팜시클로비어, 포미비르센, 포삼프레나비어, 포스카네트, 포스포네트, 간시클로비어, 이바시타빈, 이뮤노비어, 아이독스우리딘, 이미퀴모드, 인디나비어, 이노신, 엔테그라제 저해제, 인터페론 제III형, 인터페론 제II형, 인터페론 제I형, 인터페론, 라미부딘, 로피나비어, 로비라이드, 마라비록, 모록시딘, 메티사존, 넬피나비어, 네비라핀, 넥사비어, 뉴클레오사이드 유사체, 오셀타미비어, 페그인터페론, 알파-2a, 펜시클로비어, 페라미비어, 플레코나릴, 포도필로톡신, 프로테아제 저해제, 랄테그라비어, 역전사효소 저해제, 리바비린, 리만타딘, 리토나비어, 피라미딘, 사퀴나비어, 스타부딘, 상승작용성 저해제(항레트로바이러스성), 차나무 오일, 텔라프레비어, 테노포비어, 테노포비어 디소프록실, 티프라나비어, 트라이플루리딘, 트라이지비어, 트로만타딘, 트루바다, 발라시클로비어, 발간시클로비어, 비크리비록, 비다라빈, 비라미딘, 잘시타빈, 자나미비어 및 지도부딘.
항바이러스 약물은 예를 들어 유효성을 증가시키기 위해 조합으로 사용될 수 있다는 것은 본 기술 분야에 잘 알려져 있다.
따라서, 하나의 실시형태에서, 본 발명의 분자는 원생동물 질환, 예를 들어 말라리아, 아프리카 수면병 등을 치료하기 위해 페이로드와 함께 제공된다.
주목할 만한 원생동물 기생충은 말라리아와 같은 플라스모듐형 기생충을 포함한다. 말라리아 치료에 사용된 약물은 예를 들어 퀴닌 및 관련 제제, 콜로로퀸, 아모디아퀸, 피리메타민, 프로구아닐, 설폰아마이드, 메플로퀸, 아토바쿠온, 프리마퀸, 아레미시닌 및 이의 유도체, 할로판트린, 독시사이클린, 클린다마이신, 설파디아진 및 이들의 2 종 이상의 조합을 포함한다.
?하나의 실시형태에서, 본 개시내용의 분자는 부형제, 희석제 및/또는 운반체를 포함하는 약제학적 조성물에 제공된다. 하나의 실시형태에서, 조성물은 비경구 제제이다.
비경구 제제는 GI 관을 통해 전달되지 않도록 설계된 제제를 의미한다. 전형적인 비경구 전달 경로는 주사, 이식 또는 주입을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 비경구 제제는 주사제 형태이다. 주사는 정맥내, 피하, 두개강내, 척수내, 종양내 또는 근육내 주사를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 주사는 주사기를 통한 액체의 체내 삽입을 의미한다.
하나의 실시형태에서, 비경구 제제는 주입 형태이다.
본 명세서에 사용된 주입은 점적, 주입 펌프, 주사기 드라이버 또는 동등한 기기에 의해 더 느린 속도로 유체를 투여하는 것을 의미한다. 하나의 실시형태에서, 주입은 1.5분 내지 120분의 범위의 기간 동안, 예컨대 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110 또는 115분의 기간에 걸쳐 투여된다.
하나의 실시형태에서, 제제는 정맥내(iv) 투여용이다. 이 경로는 대다수의 기관 및 조직에 신속한 접근을 가능하게 하기 때문에 특히 효과적이며, 전이, 예를 들어, 소정의 전이, 특히 간 및 폐와 같은 고도로 혈관발달된 영역에 위치한 전이의 치료에 특히 유용하다.
치료 제제는 전형적으로 제조 및 저장 조건 하에서 멸균성이고 안정할 것이다. 조성물은 인간에게 투여하기에 적합한 용액, 마이크로에멀젼, 리포좀, 또는 다른 비경구 제제로서 제형화될 수 있고, 주사기 또는 바이엘과 같은 사전충전된 기기, 특히 1회 용량으로서 제형화될 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 제제는 일반적으로 약제학적으로 허용되는 희석제 또는 운반체, 예를 들어 바이러스와 상용성이고 바이러스가 필요한 시간 동안 안정한 비독성 등장성 운반체를 포함할 것이다.
운반체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 분산제 또는 계면활성제 또는 폴리소르베이트 80 또는 40과 같은 비이온성 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 분산액에서 요구되는 입자 크기의 유지는 계면활성제의 존재에 의하여 도움을 받을 수 있다. 등장제의 예는 당, 만니톨, 소르비톨과 같은 폴리알콜, 또는 조성물 중의 염화나트륨을 포함한다.
따라서, 본 명세서에 기재된 GLA-성분이 하나 이상의 항-말라리아 약물을 포함하는 페이로드에 연결되어 있는 본 개시내용에 따른 분자가 제공된다.
본 명세서의 문맥에서 "포함하는(comprising)"은 "포함하는(including)"을 의미하는 것으로 생각한다.
기술적으로 적절한 경우, 본 발명의 실시형태는 조합될 수 있다.
실시형태들은 특정 특징/요소를 포함하는 것으로 본 명세서에 설명된다. 또한, 본 개시내용은 상기 특징/요소로 이루어지거나 또는 본질적으로 이루어지는 별도의 실시양태들에까지 확대된다.
특허 및 출원과 같은 기술적 참고문헌은 본 명세서에 참조에 의해 인용된다.
기술 배경은 본 명세서의 기술적 개시내용의 부분이고, 여기서의 논의가 본 발명의 분야 및 적용에서 마주치는 기술 문제들의 논의를 포함하는 것처럼 선행 기술을 논의하는데 제한되는 것이 아니기 때문에 보정서의 기초로서 사용될 수 있다.
본 명세서에서 구체적이고 명시적으로 언급된 모든 실시형태들은 단독으로 또는 하나 이상의 추가 실시형태들과 조합으로서 권리불요구의 기초를 형성할 수 있다.
본 출원은 미국 일련 번호 62/554,530, 62/569,403, 62/554,533, 62/569,411, 62/584,565 및 62/593,014의 우선권을 주장한다. 이 출원들은 본 명세서에 대한 보정을 위한 기초로서 사용될 수 있다.
이제, 본 발명은 이하 실시예를 참조하여 설명될 것이며, 이는 단지 예시적인 것으로서, 어떠한 식으로든지 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 간주되지 않아야 한다.
실시예
도 1a 내지 도 1d는 GLA 단백질 구조의 다양한 표현을 나타낸다.
도 1e는 본 발명에 따른 GLA-성분의 실시형태를 나타낸다.
도 2는 아포토시스를 유도하기 위해 과산화물로 처리된 유방암 세포주의 단백질 S(PrS) 및 아넥신 염색을 나타낸다. A, 과산화물로 처리되고 FITC-PrS에 의해 염색된 인간 MDA-231 세포. B, A에서와 같이 염색된 미처리된 MDA-231 세포. C, 아넥신에 의해 염색된 처리된 MDA-231 세포. D, 과산화물로 처리되고 PrS에 의해 염색된 인간 MCF-7 세포. E, D에서와 같은 뮤린 MET-1 세포. F, D에서와 같은 뮤린 4T1 세포.
도 3은 PrS 및 아넥신의 중첩되지만 전혀 다른 세포 국재화를 나타낸다. A, 과산화물로 처리되고 Cy5PrS(적색) 및 FITC 아넥신(녹색)으로 염색된 뮤린 4T1 세포. 밝은 화살표, 동시-국재화된 신호; 적색 화살표, 아넥신이 아닌 PrS로 염색한 세포; 녹색 화살표, 아넥신에 의해 더 밝고 PrS에 의해 덜 밝게 염색하고, 전혀 다른 결합 패턴을 나타내는 세포(삽입문은 PrS 및 아넥신 염을 각각 나타낸다). B, FITC PrS 및 Cy5 아넥신으로 염색된 처리된 4T1 세포. 녹색 화살표, 아넥신이 아닌 PrS로 염색한 세포. C, 1,000배 과량의 콜드 아넥신으로 예비항온배양된 처리된 4T1 세포의 Cy5 아넥신 염색.
도 4는 PrS 및 아넥신을 이용하여 아포토시스 COS-1 세포를 염색한 것을 나타낸다. 세포는 기술된 바와 같이 t-BHP로 처리하고 FITC 아넥신(왼쪽) 및 Cy5 PrS(오른쪽)로 염색하였다. 화살표는 아포토시스체인 것으로 추정되는 아세포 구조를 나타낸다.
도 5는 PrS 및 아넥신을 이용한 세포외 소포의 차등 염색을 나타낸다. 세포외 소포는 4T1 세포로부터 제조하여 FITC PrS(녹색) 및 Cy5 아넥신(적색)으로 염색하였다. 화살표는 아넥신(적색 화살표) 만으로, PrS(녹색 화살표) 만으로, 그리고 두 단백질(밝은 화살표)을 이용하여 염색한 소포를 나타낸다.
도 6은 PrS 및 아넥신의 아세포 국재화를 나타낸다. A, B, FITC PrS(녹색 화살표) 및 Cy5 아넥신(적색 화살표)에 의해 염색된 아포토시스성 4T1 세포; 밝은 화살표, 동시국재화. C, 가능한 아포토시스체.
도 7은 5분 내에 PrS의 내재화를 나타낸다. 아포토시스성 4T1 세포는 FITC PrS(녹색) 및 Cy5 아넥신(적색)으로 염색하고 단백질 첨가 후 10분 내에 영상화하였다. A. 병합된 영상. B. 훽스트(Hoescht) 핵 염색 단독.
도 8은 마우스에 존재하는 4T1 종양의 BLI 영상을 나타낸다.
도 9는 방사성표지된 PrS 및 아넥신을 이용하여 4T1 종양에 대한 독소루비신의 효과를 나타낸 SPECT 영상이다. 4T1 유방암 종양을 가진 마우스는 독소루비신 전(A 및 C) 및 24h 후(B 및 D)에 99mTc PrS(A 및 B), 또는 아넥신(C 및 D)으로 영상화되었다.
도 10은 사이클로헥사마이드-처리된 마우스의 SPECT 영상화를 나타낸다. 패널당 5 마리 마우스가 처리 전(A 및 C) 및 24h 후에 제시된다. 마우스는 99mTc PrS(A 및 B) 또는 아넥신(C 및 D)로 영상화되었다. 화살표는 증가된 간 신호를 나타낸다.
도 11은 감염된 비장에 대한 Cy5 PrS의 국재화를 나타낸다. CD1 마우스는 생물발광성 리스테리아(Listeria)로 감염되었고 감염 2일 후에 영상화하였다. 마우스를 희생시키기 30분 전에 Cy5 PrS를 주사하였고, 비장을 떼어내어 동결시켰다. 중간 간염(A) 및 대조 미감염된(C) 마우스가 제시된다. Cy5 채널에서 각 마우스의 감염(B) 및 미감염(D) 비장의 단면이 제시되며, 위상차현미경 영상과 병합하였다.
도 12는 독소루비신으로 처리된 종양에 대한 Cy5 PrS의 국재화를 나타낸다. 4T1 유방암 종양을 이식한 마우스는 독소루비신으로 처리하거나(오른쪽 패널) 또는 미처리하였다(왼쪽 패널). 24시간 후 마우스에 Cy5 PrS를 정맥내 주사하였고 30분 후 희생시켰다. 종양을 떼어내어 동결시켰고 형광 현미경검사를 위해 단면화하였다. 4 마리의 다른 마우스로부터의 병합된 Cy5/위상차현미경 영상이 제시된다.
도 13은 TSC의 분화를 나타낸다. 성장인자의 존재(왼쪽) 또는 부재(오른쪽) 하에 TSC를 배양하였다. 오른쪽 패널의 화살표는 분화의 특징인 거대 세포를 나타낸다.
도 14는 영양막 줄기 세포 및 분화된 영양막의 PrS 염색을 나타낸다. 영양막 줄기 세포(왼쪽)는 성장인자의 제거에 의하여 양양막 거대 세포(오른쪽)로 분화되었다. 이 세포는 Cy5 PrS로 염색하고 영상화하였다.
도 15는 MSC 분화를 나타낸다. MSC는 함지방세포(상부 패널) 또는 골아세포(하부 패널)로의 분화에 대하여 교재에 설명된 바와 같이 처리하였다. 분화된 세포는 각각의 경우에 예상된 형태를 보여주었다.
도 16은 PrS(녹색), 아넥신(적색) 및 훽스트(청색)로 염색된 MSC를 나타낸다. 세포는 염색 혼합물을 첨가한 지 10분 내에 영상화되었다.
도 17은 PrS(녹색, 가장 밝은 영역), 아넥신(적색, 세포막 주위에 밝은 부분), 및 훽스트(청색)으로 염색된 TSC를 나타낸다. 세포는 염색 혼합물을 첨가한 지 5분 내에 영상화되었다.
도 18은 TSC 소포의 차등 염색을 나타낸다. TSC는 도 17에서와 같이 염색하였다. 세포 그룹은 PrS(녹색)가 아닌 아넥신(적색)dmn로 염색한 분비성 큰 소포들이다.
도 19는 C17.2 신경 선조 세포의 PrS 염색을 나타낸다. 이 세포는 PrS-FITC를 이용하여 염색하였고 표준(비-공초점) 현미경검사로 영상화하였다.
도 20은 4C에서 TSC 내로의 PrS의 내재화를 나타낸다. 4C에서 TSC에 FITC PrS(녹색) 및 Cy5 아넥신(적색)이 첨가되었고 공초점 현미경검사로 영상화하였다.
도 21은 마우스 골수 유래의 계통 음성의 SCA-1/c-키트 염색 세포를 나타낸다. 이 세포는 이 분석에의 이 시점에서 PI(프로피듐 요오다이드; 사세포 검출을 위함) 또는 PrS에 의해 염색되지 않았다. 조혈 계통(왼쪽 패널)의 염색 및 c-키트 및 SCA1(오른쪽 패널)의 염색의 부재는 녹색(가장 밝은 영역)으로 나타나는 HSC 집단을 의미한다.
도 22는 장기간 HSC의 PrS 염색. HSC는 도 1에서와 같이 분리하였고, FITC PrS로 염색하였다. SLAM 패턴은 Cy7(x-축)에 의해 결정되었다.
도 23은 단기간 HSC의 PrS 염색. HSC는 도 1에서와 같이 분리하였고 FITC PrS에 의하여 염색되었다. SLAM 패턴은 Cy7(x-축)에 의해 결정되었다.
도 24는 장기간 HSC에서의 PrS의 내재화를 나타낸다. HSC는 기재된 바와 같이 제조하였고, PrS로 염색했으며, 공초점 현미경검사로 조사하였다. 녹색(가장 밝은 영역), FITC PrS; 청색, 훽스트 핵 염색; 적색, PI. 특히, PI 염색은 핵으로부터 배제되었고, 이는 세포가 살아 있다는 것을 나타낸다.
도 25는 핵 PI를 나타내는 죽은 HSC의 예를 나타낸다.
도 26은 GLA-매개의 전달은 세포에 비독성이다.
본 명세서는 또한 관련된 서열 목록에서 서열 1 내지 6을 포함한다.
본 프로젝트는 SPECT(단일 광자 전산화 단층촬영)을 위한 생체내 영상화제로서 표지된 재조합 PrS의 시험을 위해 시작하였다. 놀랍게도, 이 분자는 아포토시스 세포 내로 빠르게 내재화된 것으로 발견되었다. 이러한 예상치못한 발견은 이 현상을 더욱 탐구하게 하였고, 그 결과 PrS는 여러 종류의 비아포토시스성 줄기 세포의 아군 내로도 내재화되었음을 발견하였다.
PrS는 서열번호 6에 제시된 바와 같은 단백질 S EGF 도메인 및 단백질 S GLA 도메인이다.
방법
형광을 위해 Amersham(GE Healthcare) 및 Molecular Probes(Invitrogen) 표지화 키트를 각각 제조업체의 지시에 따라 사용하여 Cy5 및 FITC의 접합을 달성하였다. 두 키트는 미접합된 형광단을 제거하기 위한 컬럼을 제공한다. 먼저, 0.77㎖의 PrS(분획 2) 1㎖와 0.77㎖의 아넥신 1㎖를 FITC로 표지화하여 아포토시스 세포에 대한 결합 특이성에 대해 시험하였다. 동시국재화 및 경쟁 연구를 위하여 0.68㎖의 PrS(분획 3) 1㎖ 및 0.68㎖의 아넥신을 Cy5로 표지화하였다. 공초점 현미경검사에는 2차 운송으로부터의 PrS 0.76㎎을 FTIC로 표지화하고, 사전 표지된 Cy5-접합된 아넥신을 사용하였다. 표지화의 정확한 효율은 결정되지 않았고, 컬럼으로부터의 회수는 표지화 키트의 제조업자의 지시에 따라 85%인 것으로 추정되었음을 유의해야 한다. 즉, 두 단백질의 상대적인 염색 강도는 어떠한 경우든지 이러한 우연을 반영할 수 있다. 세포는 처음에는 30분 동안 염색하였지만, 5 분 미만이 충분한 것으로 이후에 결정되었다. 아포토시스 세포 특이성에 대하여 PrS를 시험하기 위하여 4가지 유방암 세포주를 처음 사용하였다; 인간 MDA-231 및 MCF7 및 뮤린 4T1 및 MET-1. 이어서, COS-1 원숭이 신장 세포도 사용하였다. 아포토시스는 과산화수소 또는 3차-부틸 하이드로퍼옥사이드(t-BHP)를 이용하여 유도하였다. 세포는 24 웰 평판에 웰 당 6×104개의 세포씩 또는 에펜도르프 챔버 슬라이드에 웰당 1x104 세포씩 평판배양하였고, 아포토시스는 다음 날 2mM H2O2 또는 t-BHP를 사용하여 30분 내지 2시간의 시점동안 유도하였다. 유도 후, 웰은 아넥신 결합 완충액(AB; Santa Cruz Biotech)으로 세척하였고, 표지된 단백질을 이용하여 염색하였다. 과거의 경험과 문헌으로부터 5.5 ㎍/㎖의 아넥신 단백질을 염색에 사용하였다. 이 양은 제공된 겔 영상에 기초하여 아넥신의 분자량은 36 kD이고 재조합 PrS는 30 kD인 것으로 추정하여 PrS를 등몰 첨가하기 위해 조정하였다. 세포는 15분 동안 염색하였다. 훽스트 33342 염료는 핵산을 가시화하기 위해 사용하였다. 웰은 그 다음 AB를 이용하여 세척하였고 여전히 살아있는 동안 EVOS 형광 현미경검사를 사용하여 관찰하였다. 공초점 현미경검사를 위하여 Stanford Cell Sciences Imaging Facility의 Leica SP8 현미경검사를 이용하였다. 웰은 그 다음 AB로 세척하였고, Leica sp8 현미경검사를 사용하여 관찰하였다. 훽스트 33342 염료는 핵을 가시화하는데 사용하였다. 독성 연구를 위하여 PrS를 영양막 줄기 세포(TSC)에 첨가하였고 생존능은 Nexcelom Cellometer를 사용하여 트립판 블루로 시험하였다.
종양을 검출하는 능력에 대하여 표지된 단백질을 시험하기 위하여, 5x104 4T1-luc 세포를 5 마리의 수컷 BALB/c 마우스의 군에 왼쪽 액와 지방체 내에 이식하였다. 마우스는 매일 생체내 생물발광 영상화(BLI)로 영상화하여 이식 후 1주째부터 시작하여 종양 성장을 모니터하였다. 마우스는 그 다음 이식 후 11일째에 13 ㎎/kg 체중의 복강내(IP) 독소루비신으로 처리하였고, BLI는 다음 날 수행하였다. 종양을 보유하는 대조 마우스는 독소루비신으로 처리하지 않고 방치하였다. 처리 48 시간 후에 마우스는 정맥내 트레이서(tracer) 주사(1.3 g/kg의 우레탄 IP 마취) 1 시간 후에 단일 헤드 A-SPECT 감마 카메라(Gamma Medica); 1㎜ 핀홀 콜리메이트, 128 단계가 들은 128×128 영상화 매트릭스, 단계당 15초, 2.7㎝ ROR; FOV = 상위 흉부/목부를 가지고 영상화하였다. 각 단백질의 주사된 투여량은 160㎕(800 μCi)였다. 그 다음, 동물을 희생시키고 체내분포가 수행되었다. 사이클로헥사민 처리 실험을 위하여, 5 마리의 어린(7주령) 수컷 Swiss Webster 마우스 군을 마취시키고(1.3 g/kg의 우레탄 IP), 50 ㎎/kg 사이클로헥시미드를 정맥내 주사하였다. 사이클로헥시미드 주사 후 1시간 45분째에, 트레이서를 주사하였다(PrS = 180 ㎕/1.2 mCi/투여량; 아넥신 V = 170 ㎕/1.05 mCi/투여량). 트레이서 주사 45분 후에 마우스는 A-SPECT 감마 카메라 상의 단일 헤드 평행 홀 콜리메이터(128×128 매트릭스)를 사용하여 10분 정지 전신 영상으로 영상화하였다.
살아 있는 동물에 주사함으로써 아포토시스 부위에 형광 PrS가 특이적 국재화하는지를 시험하기 위하여, CD1 마우스에게 생물발광성 리스테리아 모노사이토게네스를 정맥내 주사하였다. 이 박테리아 병원체는 비장을 포함하는 많은 기관을 감염시키고, 여기서 단핵구 및 과립구의 광범위한 아포토시스가 일어난다. 감염 후 특정 시점에서 비장은 박테리아 복제의 주요 부위이고, 따라서 그 박테리아로부터의 비장 BLI 신호는 아포토시스에 대한 프로브의 국재화와 관련이 있을 수 있다. 마우스는 매일 감염되고 영상화되었다. 비장 신호가 명백해졌을 때(8주령의 CD1 암컷 마우스에서 2x105 콜로니형성단위의 박테리아에 대한 감염 2일 후), 300 ㎎/kg(체질량)의 Cy5 Prs를 마우스에게 주사하였고, 30분 후 동물을 희생시켰고, 비장을 꺼내어 OCT에 동결시키고, 형광 현미경검사를 위해 단면화하였다. 미감염된 대조용 마우스를 사용하였다.
유세포분석을 수행하였다. 상기 기재된 바와 같이 제조한 새로 표지화된 FITC PrS를 이용하였다. 뮤린 조혈 줄기 세포(HSC)는 이 실험실에서 통상적으로 정제하였다. 이 세포는 계통 음성 세포를 c-Kit+에 대해 염색하여 정상 마우스 골수로부터 분리하였다. 세포를 추가로 특성화하기 위하여, SLAM 마커 염색도 수행하였다. 이 마커들은 자가 재생하고 분화하는 세포를 염색하는 반면, 비-염색성 HSC는 분화만 할 수 있다. FITC PrS에 의한 후속 염색은 결과에 제시된 바와 같이 SLAM 염색 세포에서 양성 퍼센트를 나타내었다. 세포는 그 다음 FITC에 대해 분류하였고, 핵 가시화를 위하여 훽스트 33342를 사용하여 공초점 현미경검사로 조사하였다.
결과
세포 배양액에 있는 아포토시스의 상황에서 PrS 결합 특이성을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 몇몇 인간 및 뮤린 유방암 세포주를 이용하였다. 아포토시스는 전술한 바와 같이 과산화물로 유도하였고, FITC PrS 결합이 평가되었다. 이 실험의 예는 도 2에 제시된다. 도 2의 패널 B에 제시된 바와 같이 미처리된 세포는 최소 결합을 나타내었다. 과산화물의 농도 및 항온처리 시간은 더 높은 농도 및/또는 더 긴 항온처리 시간에서 세포가 탈착되었고 염색과 현미경검사가 가능하지 않았기 때문에 소수의 세포만이 영향을 받을 정도로 선택되었다. 또한, 많은 영향을 받지 않은 세포의 존재는 각 필드 내에서 내부 음성 대조군으로서 작용하였다. FITC-아넥신은 PrS와 유사한 아포토시스에 대한 특이성을 나타내었으며, 이는 내부 양성 대조군으로서 작용한다. 본 발명자들은 그 다음 동시국재화 및 경쟁 결합을 위한 2 가지 단백질을 시험하였다. 동시국재화를 위해, FITC 및 Cy5 표지된 PrS 및 아넥신을 제조하였다. 4T1 세포는 과산화물로 처리하였고 Cy5 및 FITC 표지된 PrS 및 아넥신을 가지고 형광단의 양 조합을 이용하여 염색하였다. 세포는 그 다음 EVOS 형광 현미경검사에서 가시화되었다. 결과는 도 3에 제시된다. 시험된 조건 하에서, 모든 밝은 염색성 세포는 양 단백질에 의한 염색을 나타내었다. Cy5를 사용하든지 또는 FITC를 사용하든지 간에, 아넥신이 약하게라도 염색하지 못한 일부 세포를 PrS는 염색하는 것으로 나타났다(도 3). 각 단백질에 의한 다른 세포들의 상대적 염색 강도는 두 프로브 사이에 상이하였고, 즉 때로 아넥신은 두 세포를 동일한 강도로 염색하고, PrS는 염색하지 못하였고, 반대의 경우도 마찬가지였다(도 3a, 녹색 화살표 및 삽입문). 따라서, 두 프로브는 일반적으로 동일 세포를 염색하였지만, 미묘한 차이를 나타내는 것으로 드러났다. 경쟁 분석에서는 미표지된 아넥신의 증가하는 과도한 양을 아포토시스성 4T1 세포와 15분 동안 예비항온처리하였고, 그 다음 세포는 Cy5 PrS에 의하여 염색되었다. 놀랍게도, PrS의 염색은 특히 시험된 최고의 과량인 1,000 배 과량의 아넥신에 의해 차단되지 않았지만(도 3c), 이 두 단백질은 동일한 표적 분자, 즉 노출된 PS에 결합하는 것으로 생각된다. 아넥신 및 PrS의 동시염색은 많은 세포 유형에서 관찰되었다. 두 단백질은 일반적으로 각 세포 유형 중의 동일 세포들을 염색하였지만, 다른 차이가 분명해지기 시작하였다(도 4). 특히, 세포보다 작은 몇몇 물체를 차등 염색하였다(도 4). 과산화물 처리 후에 증가된 수로 존재하는 상기 물체는 아포토시스체로 이해되었다; 막-결합된 세포 단편은 아포토시스성 세포의 단편화 동안 생산되었다. 도 4에 도시된 바와 같이, PrS는 이러한 개체를 염색한 반면, 아넥신은 염색하지 못했고, 이 물질들의 몇몇은 두 단백질에 의하여 염색되었다. 이러한 관찰은 예상치 못하였다. 아세포 개체의 차등 염색을 더욱 탐구하기 위하여, 세포외 소포(EV)를 표준 원심분리 프로토콜을 사용하여 4T1 뮤린 종양 세포로부터 제조하였다. 두 단백질은 또한 상기 소포들을 차등 염색하였고(도 5), 이는 생물학적 및 치료적 연루성을 가질 수 있는 결과이다.
EV, 특히 엑소좀, 마이크로소포(MV) 및 아포토시스체(AB)는 세포 사이에 생물분자의 전이를 통해 세포-세포 연통에 주 역할을 하는 것으로 추정된다. 이러한 유형의 EV의 생물발생은 다르고, 엔도솜(엑소좀) 또는 형질막(MV)에서 기원하거나, 프로그램된 세포사(AB)의 생성물이다. 모든 포유동물 세포는 EV를 분비하는 것으로 추정된다. 각 유형의 EV는 이웃 세포 및 원거리 세포 모두에 분자 화물을 전이할 수 있어, 종양 발달 및 진행에 수반되는 것과 같은 세포 행동에 영향을 미친다. 사실상, EV는 증식 신호전달 지속, 성장 억제 회피, 세포사 저항, 에너지 대사 재프로그래밍, 게놈 불안정성 획득, 및 종양 미세환경 개발을 포함하여, 암의 거의 모든 특질(hallmark)에 역할을 할 수 있다. 이들은 또한 혈관형성의 유도, 침입의 제어, 전이전성 틈새(premetastatic niche)의 개시, 염증 유지 및 면역 감시 회피에 관련되어 있다. 면역 세포는 또한 EV를 통해 소통하는 것으로 나타나고 EV를 종양 세포, 감염 조직 및 상처로부터의 신호로서 인식할 수 있다. EV의 생물학 및 이의 암 특질에 대한 기여도의 더 깊은 이해는 암의 진단 및 치료를 위한 새로운 가능성을 유도한다. 추가 EV 표면 마커의 개발은 이 분야를 진보시키는데 필수적이며, PrS는 이러한 결정인자일 수 있다.
형광 현미경에 의한 이 연구 이후, PrS 및 아넥신에 의한 염색의 아세포 국소화는 이어서 공초점 현미경검사를 통해 평가하였다. 뮤린의 4T1 세포(Luc-GFP 리포터 결여)는 8 부분 챔버 슬라이드 상에 챔버당 1×104개 세포로 평판배양하였고, 다음 날 아포토시스는 2mM H2O2 또는 t-BHP(2 시간 노출)로 유도하였다. 이어서 세포를 세척하고 PrS 및 아넥신으로 15분 동안 염색하였다. 훽스트 33342 염료를 사용하여 핵산을 염색하였다. 모든 경우에, 가장 밝게 염색된 세포를 두 프로브로 염색하였다. 그러나, 많은 세포에서 표지된 PrS는 세포질에서 관찰된 반면, 표지된 아넥신은 관찰되지 않았다(도 6). 아넥신이 내재화되었고 몇몇 세포의 소포에서 나타나지만, 동일 세포에서 표면 국재화된 PrS와 함께 내재화된 아넥신은 관찰되지 않았다. 이들 결과는 두 단백질이 모두 PS에 결합하는 것으로 추정되기 때문에 예상치 못한 것이었다.
그러나, 분명히 두 단백질은 시험된 저해제에 상이하게 반응하였다. PrS의 내재화를 더 연구하기 위해, 시간 경과 실험을 수행하였다. 아포토시스 4T1 세포는 Cy5 아넥신 및 FITC PrS로 5분 동안 염색하였고, 프로브의 첨가 5분 이내에 관찰되었다. PrS는 이들 세포의 세포질에서 즉시 관찰되었으며, 이는 5분 이내에 내재화를 나타낸다(도 7). 시간 경과 영상화는 또한 PrS 및 아넥신이 초기 시점에 동일세포를 동등하게 항상 염색하지 못했음을 나타내었다. 도 7의 세포는 아포토시스의 다른 단계에 있는 것으로 나타나는데, 왼쪽의 세포는 명백하게 무손상인 핵 막으로 둘러싸인 미응집된 핵을 보여주는 반면, 오른쪽의 세포는 종종 아포토시스 과정의 후기에 일어나는 염색질 응축의 특징인 강한 염색성을 나타낸다. 이와 같은 염색 패턴은 아넥신보다 PrS가 아포토시스에 더 빨리 결합한다는 것을 시사할 수 있다. 이러한 점에서 순전히 추측이지만, 이러한 우선성은 지금까지 관찰된 상기 단백질들 사이에 많은 차이를 설명해 줄 것이다. 예를 들어, 도 3A 및 도 3B에서와 같은 아넥신이 아닌 PrS에 의한 몇몇 세포의 염색은 아포토시스 과정에 더 빨리 결합하는 PrS로 인할 것일 수 있다. 살아있는 동물에서 PrS 국재화를 조사하기 위하여, 여러 실험을 수행하였다. 이 연구들은 생체내에서 아포토시스의 화학적 및 감염적 유도뿐만 아니라 아포토시스를 유도하는 것으로 공지된 독소루비신으로 처리된 종양에 대한 PrS의 국재화를 이용하였다. HYNIC-표지화된 PrS 및 아넥신을 사용한 SPECT 영상화는 4T1luc 유방암을 제공하고 독소루비신으로 처리된 동물에서 수행하였다. 4T1 종양은 루시퍼라제에 의해 표지화되었기 때문에, 생체내 생물발광 영상화(BLI)를 이용하여 마우스에서 영상화될 수 있다. 이 실험으로부터의 영상들 중 하나는 도 8에 제시된다. 이 방법은 종양 이식을 평가하고 개개의 동물들에서 경시적인 진행을 추적하는데 사용될 수 있다. 그 다음 독소루비신으로 처리된 동물 및 대조군의 SPECT 영상화를 위하여 99mTc 표지된 PrS 및 아넥신을 사용하였다. 그 결과의 예는 도 9에 제시된다. 두 동물의 두부 및 흉부의 영상은 타액선에서 PrS 프로브의 비특이적 축적 및 이 프로브에 의한 낮은 신호 대 소음비를 나타낸다. 따라서, 제시된 PrS 영상에서 표시의 역치는 더욱 배경을 드러나 보이도록 저하되었고, 결과적으로 더 밝은 위색채의 영상을 생성하였다. 낮은 신호 대 소음 비는 차선인 단 1㎎의 단백질의 HYNIC 표지화로 인하여, 그리고 HYNIC:단백질 표지화 비의 조절 연구를 수행하는 것이 불가능함으로 인하여 가능성이 있다.
간에서 아포토시스를 유도하는 사이클로헥사마이드로 처리된 마우스의 SPECT 영상화도 수행하였다(도 10). 도 10에서 각 패널에는 5 마리의 마우스의 전신 영상이 제시된다. 많은 방사성표지된 프로브와 같이, 배경은 신장에서 관찰된다. 사이클로헥사마이드에 의한 마우스의 처리는 간에서 아넥신 SPECT 신호를 증가시켰다. 또한, PrS는 아넥신에 비하여 낮은 신호를 나타내었다. 아넥신은 사이클로헥사마이드 처리된 마우스의 아포토시스 간을 검출할 수 있었고, 이에 반해 PrS는 처리로 인하여 간에서 약간의 신호 증가만을 나타내었다. SPECT 영상화 및 HYNIC 표지화의 수반되는 합병증과 무관하게 아포토시스 조직 및 처리된 종양에 대한 PrS의 국재화를 시험하기 위하여, 아포토시스 반응을 유도하는 박테리아에 의해 감염된 마우스 및 종양 보유 마우스에게 Cy5 PrS를 주사하였다. 주사를 위하여, 본 발명자들은 루시퍼라제로 표지화되고 BLI를 위해 잘 특성화된 박테리아 병원체인 리스테리아 모노사이토게네스를 이용하였다. 비장으로부터의 특징적인 BLI 신호는 우수한 동시국재화 연구를 가능하게 한다. CD1 마우스는 전술한 바와 같이 감염시켰고 감염 2일 후에 BLI로 영상화하였다. 그 다음, 마우스에게 Cy5 PrS를 주사하였고 30분 후 희생시켰으며, 단면화 및 형광 현미경검사를 위하여 비장을 떼어냈다(도 11). 모든 경우에, 감염된 마우스로부터의 비장 단면은 대조군보다 훨씬 큰 Cy5 형광 신호를 나타내었다. 도 11에서 제시된 감염된 마우스는 낮은 광자 카운트를 보여주었고, 이는 감염이 이 동물에서 아직 매우 많이 진행되지는 않았음을 시사한다. 많은 마우스들은 이 날에 비장으로부터 10배의 신호 강도를 나타낸다. 하지만, Cy5 채널 형광은 제시된 미감염 대조군에 비해 여전히 매우 강했다. 이 결과는 이러한 동물에서 과립구 및 대식세포가 아넥신 신호의 주요 근원인 것으로 밝혀져 있기 때문에 감염에 대해 진행 중인 선천적 면역 반응을 반영할 수 있다(이 세포들은 조직 파괴를 제한하기 위하여 아포토시스에 대해 프로그램된다).
그 다음, 독소루비신으로 처리된 4T1 종양에 대하여 형광 PrS의 국재화를 시험하였다. 종양 이식된 마우스를 전술한 바와 같이 독소루비신으로 처리하였고, 희생시키기 30분 전에 Cy5 PrS를 정맥내 주사하였고 종양을 떼어내어 단면화하고 형광현미경검사하였다. 결과는 도 12에 제시된다. 처리된 동물에서는 강한 염색 면적이 관찰된 반면, 미처리된 종양 구역에서는 더 작은 신호가 관찰되었다,. 몇몇 미처리된 종양은 배경보다 큰 신호가 있는 작은 면적을 나타내었지만, 처리된 종양과 유사한 강도의 신호는 어떠한 미처리된 구역에서도 관찰되지 않았다.
줄기 세포는 분화 세포와 표현형이 상이하며 면역 반응의 유도를 회피하기 위하여 비-아포토시스적으로 PS를 발현할 수 있다. 영양막 줄기 세포(TSC)는 배양액에서 여러 유형의 영양막으로 분화한다. TSC는 섬유아세포 성장 인자, 액티빈 및 헤파린의 존재 하에 증식된 마우스 자궁 찰과세포(scrapings)로부터 제조된다. TSC는 상기 인자들이 배지로부터 제거되면 거대 세포로 자발적으로 분화한다(도 13). TSC는 PrS에 의해 염색되었고, 반면 배양액에서 상기 세포에서 유래하는 분화된 영양막은 염색되지 않았다(도 14). 본 발명자들은 또한 PrS가 아포토시스 유도 없이 줄기 세포 내로 내재화된다는 것을 결정하였다. 이 결과는 아포토시스가 유도된 종양 세포주에서 이루어진 관찰을 확인시켜준다. 아포토시스의 유도 없이 종양 세포에서는 최소의 염색이 관찰되었다. 줄기 세포에서 내재화를 시험하기 위하여, 본 발명자들은 중간엽 줄기 세포(MSC) 및 TSC를 이용하였다. MSC는 마우스 골수로부터 준비하였다. 마우스로부터 골수를 플러싱하였고, 성장인자의 부재 하에 6일 동안 배양하였다. 이 항온배양 동안 MSC 및 조혈 줄기 세포(HSC)는 복제하는 반면, 섬유아세포는 몇 세대 이후에는 부착하지만 증식하지 않는다. 6 일 후 단층이 가시화된다. 트립신처리에 의해 통과하는 즉시, 부착성 MSC는 유지된 반면, 현탁 성장한 HSC는 유실되었다. 섬유아세포는 성장인자의 부재로 인하여 지속되지 못하고, 유지되지도 못한다. 따라서, 이 간단한 절차는 MSC의 거의 균일한 집단을 생성한다. 이 세포의 동질성을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 배양액을 각각 덱사메타손 및 글리세롤 포스페이트(골아세포로 분화를 유도하기 위해) 또는 덱사메타손 및 인도메타신(지방세포로 분화를 유도하기 위해)으로 처리하였다. 결과는 도 15에 제시된다. 상기 처리들에 대한 반응으로, 분화 세포는 각 세포들의 출현을 나타내었다. 지방세포는 큰 지방 소포를 함유하였고, 골아세포는 뚜렷한 세포내 콜라겐 및 무기질화로 인하여 어두웠다.
준세포성 염색 패턴을 평가하기 위하여, 미분화 MSC는 PrS 및 아넥신, 뿐만 아니라 훽스트 핵 염색 시약으로 염색하였고 공초점 현미경검사로 관찰하였다. 관찰 결과는 표 16에 제시된다. PrS는 빠르게 내재화된다. MSC의 경우, 20개의 세포 중 약 1개가 PrS에 의하여 염색되었고 이는 이전 데이터와 일치하는 것이지만, 염색된 정확한 퍼센트는 결정되지 않았다. MSC의 형태는 불균일하며, 이들 세포는 배양액 내로 풍부한 물질을 분비하고 이 중 일부는 챔버 슬라이드의 표면에 부착하여 몇몇 영상에서 배경을 초래한다. 그렇더라도 데이터는 첨가한지 5분 이내에 내재화된 PrS 및 표면에 아넥신을 분명하게 나타낸다. TSC는 또한 MSC에서와 같이 염색되고 영상화되었다. 이 관찰들은 역시 이들 세포 내로의 내재화를 확인시켜주며, 이 또한 단백질 첨가 5분 이내에 일어난다. 결과는 도 17에 제시된다. TSC는 형태학적으로 꽤 가변적이며, 이 도면에서 관찰할 수 있듯이 분화의 부재 하에 다핵화될 수 있다. MSC에서와 같이, 이 원시 세포들은 배양액 내로 풍부한 물질을 유출시켰고, 이들 중 일부가 세포외 소포로서 확립되었다(이전 데이터). 이 물질은 다시 영상화를 어렵게 한다. 몇몇 EV는 PrS가 아닌 아넥신에 의해 염색되며, 이 현상은 도 18의 TSC에서 관찰할 수 있다. 이러한 TSC 클러스터의 영상에서 세포들에 의해 방출되고 dLT는 소포들은 내재화되는 PrS가 아닌 아넥신에 의하여 염색된다. 이러한 패턴들은 PrS 및 아넥신의 특이성 및 결합 표적들에 관한 흥미로운 의문을 유발시킨다. 두 단백질은 모두 PS에 결합하는 것으로 정평이 나 있다. 하지만, 상이한 준세포 국재화 패턴 뿐만 아니라 EV에 대한 차등 결합은 상기 단백질들이 정확하게 동일한 방식으로 결합하지 않는다는 것을 암시한다. 이러한 차이의 기초를 확립하기 위하여 추가 연구가 필요할 것이며, 이는 유의성이 있음을 입증할 수 있다. 또한, 본 발명자들은 성상세포 및 다른 신경 세포로 시험관내에서 분화할 수 있는 형질전환된 세포주인 신경 선조세포주 C17.2의 PrS 염색을 관찰하였다(도 19). 이러한 형질전환된 세포의 약 5%가 염색되었고, 이 퍼센트는 추정치이다. 놀랍게도, 상기 세포들이 4℃로 냉각되었을 때에도 TSC 내로의 유입이 일어났다(도 20). 하지만, 챔버는 현미경 상에 놓는 즉시 지속적으로 냉각될 수 없음을 유의해야 한다. 그럼에도 불구하고, 온도는 영상화 절차의 5분 기간 내에 많이 상승할 수는 없다. 이 결과는 참을 수 없지만 더욱 제어된 조건 하에서 분명하게 반복되어야 한다. 이 발견이 입증된다면, 이 기전은 실제로 큰 관심을 받을 것이다.
본 발명자들은 PrS를 이용하여 조혈 줄기 세포(HSC)를 염색하는데 성공하였다. 유세포분석을 사용하여 본 발명자들은 HSC를 PrS로 염색되는지를 결정하였고, 공초점 현미경검사를 사용하여 상기 세포들 내에 PrS의 내재화를 관찰하였다. HSC는 형광 활성화 세포 분류법(FACS)을 이용하여 동정 및 분리하였다. 이 세포들은 계통 음성 SCA/c-키트 양성 세포처럼 골수에서 동정되었다(도 21). 이 세포를 그 다음 FITC-PrS로 염색하였다. 장기 및 단기의 HSC의 두 집단은 SLAM 마커 염색 패턴을 이용하여 동정할 수 있다. SLAM(신호전달 림프구 활성화 분자) 마커 CD48, CD150, CD229 및 CD244는 HSC를 상이한 패턴으로 차등 염색하여, SLAM 패턴-양성 염색은 자가-재생 및 분화 능력 모두를 나타내는 반면, SLAM 패턴-음성 HSC는 단지 분화만 할 수 있다. PrS는 장기 HSC의 아군(도 22) 및 또한 단기 HSC(도 23)를 염색하였다. 제시된 세포들은 요오드화 프로피듐(PI) 음성이며, 이는 모두 생세포임을 의미한다. 이 결과는 줄기 세포의 아군이 아포토시스의 유도 없이 PrS에 의하여 염색됨을 입증하는 이전 실험들을 확인시켜준다.
본 발명자들은 그 다음 HSC 내로 PrS의 내재화에 대한 실험을 진행하였다. 이 실험은 많은 인자들에 의하여 복잡하였다. 아마도, 가장 어려운 점은 배양액에서 하룻밤 사이에 다수가 죽는 HSC 배양액의 생존성이었다. 따라서, 본 발명자들은 유세포분석 및 공초점 현미경검사가 동일한 날에 일어나도록 실험 시간을 맞추어야 했다. 또한, 이 세포들은 부착성이 아니어서 현미경검사에 적합하지 않다. 현미경검사를 더 효율적이게 하기 위하여, 세포를 소량의 배지에 재현탁시켰다. 마지막으로, 본 발명자들은 현미경검사에 의해 분석된 PrS-염색된 세포가 여전히 생존성인지를 확인해야 했다. 이 분석 및 분리 과정 동안 많은 HSC가 죽었다. 따라서, 훽스트 핵 염색 외에도 PI가 첨가되고 스캔되었으며, 다른 채널이 이용되었다. PI-밝은 핵의 존재는 사세포를 시사하였다. 이러한 어려움과 시간의 복잡함에도 불구하고, 본 발명자들은 이 실험을 수행할 수 있었고 생 HSC 내로 PrS의 내재화를 확인시켜 주었다(도 24). 이 세포들은 핵 PI 염색의 부족에 의하여 살아있는 것으로 확인되었다. 하지만, 도 25에서 관찰되듯이 몇몇 세포는 죽었거나 죽어가고 있었다. 제시된 실험의 복잡함과 기간에도 불구하고, 결과는 내재화를 나타낸다.
마지막으로, 도 26에서 본 발명자들은 TSC에 대해 예비 독성 연구를 수행하였고, 135 ㎍/㎖의 농도에서 생존능은 PBS에 비하여 30분 후 78%에서 74%로 극히 최소 정도만 감소되었음을 확인하였다. 이 수준에서 배양액 부피의 10%가 PrS 함유 용액임을 고려하면, 이 결과는 PrS가 줄기 세포에 기본적으로 비독성이라는 우리의 정성적 관찰을 확인시켜주었고, 관찰된 최소 독성은 상당히 제조물 자체의 오염 함량으로 인한 것일 수 있다. PrS의 낮은 농도는 생존능에 어떠한 영향도 나타내지 않았다. 시험된 단백질의 최고 수준은 염색에 사용된 농도의 1000배 이상이었다. 이 프로젝트의 공식적인 부분은 아닌 완전 독성 연구에는 훨씬 더 광범위한 시험이 요구될 것이지만, 본 연구에서 PrS는 극히 낮은 독성을 나타낸다.
요약
상기 결과들은 PrS가 많은 유형의 줄기 세포를 포함하는 다수의 PrS 발현 세포 내로 빠르게 내재화된다는 것을 나타내었고, 이는 PrS가 치료제 개발 목표를 향한 조작에 적응할 수 있는 독특한 특성을 보유한다는 것을 암시한다. 또한, 도 3 및 도 7에서 관찰되는 바와 같은 PrS와 아넥신 간의 특이성의 차이는 이들 두 단백질 간에 결합 자체가 상이하다는 것을 암시한다. 아넥신은 사량체이고 PrS는 단량체라는 단순한 사실은 이들 차이를 설명할 수 없고, 이들 데이터는 세포 표면 상의 몇몇 다른 성분이 PrS 결합에 관여할 수 있음을 암시한다. 모듈식 조작의 능력뿐만 아니라 PrS의 결합, 특이성 및 내재화의 기전은 많은 가능성을 제공한다.
실시예 2
줄기 세포는 분화 세포와 표현형이 상이하고 면역 반응의 유도를 회피하기 위해 비-아포토시스적으로 PS를 발현할 수 있다. 줄기 세포는 아포토시스의 유도 없이 형광 표지의 페이로드를 포함하는 본 개시내용의 GLA 도메인 분자를 이용하여 염색하였다.
태반에서 여러 유형의 영양막으로 분화하는 영양막 줄기 세포(도 14)는 단백질 S에 의하여 염색된 반면, 배양액에서 이들 세포로부터 유래되는 분화된 영양막은 염색되지 않았다. 염색은 생체내 분화된 줄기 세포와 시험관내에서 분화된 세포를 구별할 수 있었다.
이 데이터를 통해 본 개시내용의 분자는 생체내 또는 생체외 샘플 중의 세포를 표적화하는데 사용될 수 있다.
결론
세포외 소포는 다수의 병을 진단 및 치료하기 위한 신나는 기회를 보여준다. 본 발명자들은 Gla 도메인이 포스파티딜세린의 발현을 인식한다는 것을 증명하였다. 이 성질은 포스파티딜세린을 발현하는 세포외 소포의 동정, 세포외 소포의 분리, 세포외 소포의 표적화 및/또는 예를 들어 치료 물질과 함께 소포의 부하에 활용될 수 있다. 이는 세포외 소포가 미세한 준세포 개체이기 때문에 놀라운 것이다.
Figure pct00011
Figure pct00012
SEQUENCE LISTING <110> GLAdiator BioSciences Inc. <120> METHOD OF TARGETING EXOSOMES <130> WO 2019/050998 <140> PCT/US2018/049619 <141> 2018-09-05 <150> US 62/554,530 <151> 2017-09-05 <150> US 62/554,533 <151> 2017-09-05 <150> US 62/569,403 <151> 2017-10-06 <150> US 62/569,411 <151> 2017-10-06 <150> US 62/584,565 <151> 2017-11-10 <150> US 62/593,014 <151> 2017-11-30 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> X is gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> X is gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> X is gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> X is gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> misc_feature <222> (25)..(26) <223> X is gamma-carboxyglutamic acid residue <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> X is gamma-carboxyglutamic 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Pro Ser Ile Cys Gly Thr Ala Val Cys 165 170 175 Lys Asn Ile Pro Gly Asp Phe Glu Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Arg 180 185 190 Tyr Asn Leu Lys Ser Lys Ser Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys Ser Glu 195 200 205 Asn Met Cys Ala Gln Leu Cys Val Asn Tyr Pro Gly Gly Tyr Thr Cys 210 215 220 Tyr Cys Asp Gly Lys Lys Gly Phe Lys Leu Ala Gln Asp Gln Lys Ser 225 230 235 240 Cys Glu Ser Arg His His His His His His 245 250

Claims (33)

  1. 표면 노출된 포스파티딜 세린(surface exposed phosphatidyl serine)을 이용하여 세포외 소포를 표적화하는 방법으로서,
    상기 세포외 소포를 포함할 수 있는 유체 내로 감마-카복시글루탐산 성분(GLA-성분)을 포함하는 분자를 도입시키는 단계를 포함하되, 상기 GLA-성분은 GLA 도메인 또는 이의 활성 단편을 포함하며 GLA 단백질 유래의 활성 촉매 도메인을 포함하지 않는, 세포외 소포를 표적화하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포외 소포가 엑소좀엑소좀(exosome)인, 세포외 소포를 표적화하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 엑소좀이 30㎚ 내지 100㎚ 범위의 직경을 갖는, 세포외 소포를 표적화하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소포가 1 내지 1.5 g/㎖, 예컨대 1 내지 1.2 g/㎖, 특히 1.13 내지 1.19 g/㎖ 범위의 밀도를 갖는, 세포외 소포를 표적화하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소포가 Lamp-1, Lamp-2, CD13, CD86, Flotilin, Syntaxin-3, CD2, CD36, CD40, CD40L, CD41a, CD44, CD45, ICAM-1, 인테그린 알파4, LiCAM, LFA-1, Mac-1 알파 및 베타, Vti-IA 및 B, CD3 엡실론 및 제타, CD9, CD18, CD37, CD53, CD63, CD81, CD82, CXCR4, FcR, GluR2/3, HLA-DM(MHC II), 면역글로불린, MHC-I 또는 MHC-II 성분, TCR 베타, 테트라스파닌(tetraspanins) 및 이들의 2종 이상의 조합으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 막관통 단백질을 포함하는, 세포외 소포를 표적화하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소포가 건강하지 않은 세포, 예를 들어 아포토시스 세포, 괴사 세포, 암 세포, 병원체 감염 세포(예를 들어, 바이러스 감염 세포, 박테리아 감염 세포 또는 기생충 감염 세포)로부터 방출된, 세포외 소포를 표적화하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 세포가 암 세포인, 세포외 소포를 표적화하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 세포가 암 줄기 세포인, 세포외 소포를 표적화하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유체는 생체외 환자 샘플,예를 들어 혈액 샘플, 낭포 또는 종양으로부터 채취된 유체, 균질화된 생검 또는 유사물을 포함하는, 세포외 소포를 표적화하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GLA 도메인 또는 이의 활성 단편이 트롬빈, 제VII 인자, 제IX인자, 제X인자, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 오스테오칼신, 매트릭스 GLA 단백질, GAS6, 트랜스트레틴(Transthretin), 페리오스틴(Periostin), 프롤린 풍부 GLA 1, 프롤린 풍부 GLA 2, 프롤린 풍부 GLA 3 및 프롤린 풍부 GLA 4로부터 독립적으로 선택되는, 세포외 소포를 표적화하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GLA 도메인 또는 이의 활성 단편이 단백질 S 유래이고, 예를 들어 서열번호 1에 제시된 서열을 포함하는, 세포외 소포를 표적화하는 방법.
  12. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GLA 도메인 성분이 EGF 도메인, 예를 들어 칼슘 결합 EGF 도메인을 추가로 포함하는, 세포외 소포를 표적화하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 작제물이 트롬빈, 제VII 인자, 제IX인자, 제X인자, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 오스테오칼신, 매트릭스 GLA 단백질, GAS6, 트랜스트레틴, 페리오스틴, 프롤린 풍부 GLA 1, 프롤린 풍부 GLA 2, 프롤린 풍부 GLA 3 및 프롤린 풍부 GLA 4로부터 선택되는 EGF 도메인을 포함하는, 세포외 소포를 표적화하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 작제물이 단백질 S로부터 선택되는 EGF 도메인을 포함하는, 세포외 소포를 표적화하는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GLA-성분이 서열번호 6에 제시된 서열 또는 His-태그가 존재하지 않는 상기 서열의 유도체, 특히 서열번호 6을 포함하는, 세포외 소포를 표적화하는 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GLA-도메인 성분이 크링글(Kringle) 도메인을 추가로 포함하는, 세포외 소포를 표적화하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 크링글 도메인이 활성화 전사 인자 2(ATF); 제XII 인자(F12); 트롬빈(F2); 히알루로난-결합 단백질 2(HABP2); 간세포 성장 인자(HGF); 간세포 성장 인자 활성인자(HGFAC); 크레멘(Kremen) 단백질 1(KREMEN1); KREMEN2;지단백질(a) (LPA); LPAL2; 대식세포-자극 단백질(MSP 또는 MST1); 포스포이노시티드-3-키나제-상호작용 단백질 1(PIK3IP1); 조직 플라스미노겐 활성인자(PLAT); 유로키나제(PLAU); 플라스민(PLG); PRSS12; 티로신-단백질 키나제 막관통 수용체 ROR1(ROR1); 및 티로신-단백질 키나제 막관통 수용체 ROR2(ROR2)를 포함하는 군으로부터 선택되는 단백질 유래인 것인, 세포외 소포를 표적화하는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GLA-성분이 페이로드(payload)에 연결된, 세포외 소포를 표적화하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 GLA-성분이 상기 페이로드에 접합되어 있는, 세포외 소포를 표적화하는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GLA-성분이 융합 단백질의 일부인 것인, 세포외 소포를 표적화하는 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 페이로드가 검출가능한 표지를 포함하는, 세포외 소포를 표적화하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 표지가 형광 단백질(형광 프로브(예를 들어, 로다민 염료, FITC, FAM, CY5) 포함), 비오틴, 효소, 태그(예를 들어, HIS-태그, FLAG-태그, myc-태그), 방사성핵종(특히 방사성 요오드화물, 방사성 동위원소, 예컨대 99 mTc), 발광 표지 또는 검출가능한 표지가 분자 비콘(Molecular Beacon) 내에 있는 것을 포함한 NMR 또는 ESR 분광법에 의해 검출될 수 있는 화합물로부터 선택되는, 세포외 소포를 표적화하는 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 페이로드는 비드, 플레이트 또는 태그, 예를 들어, 자기 비드(magnetic bead)와 같은 분리가능한 비드를 포함하는, 세포외 소포를 표적화하는 방법.
  24. 제18항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 페이로드는 링커를 통해 상기 GLA-성분에 연결되어 있는, 세포외 소포를 표적화하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 링커는 절단 가능한 것인, 세포외 소포를 표적화하는 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소포의 풍부한 집단(enriched population)을 제공하는 단계를 추가로 포함하는, 세포외 소포를 표적화하는 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소포를 분리하는 단계를 포함하는, 세포외 소포를 표적화하는 방법.
  28. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GLA-성분을 포함하는 분자가 치료제인, 세포외 소포를 표적화하는 방법.
  29. 제17항 내지 제21항 및 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 페이로드가 약물, 화학요법제, 펩타이드(스테이플화된 펩타이드를 포함함) 또는 생물학적 치료제, 예를 들어 항바이러스 약물, 항박테리아 약물, 항기생충제, 항암 약물, 항암 요법 또는 종양용해 바이러스 또는 바이러스 벡터를 포함하는, 세포외 소포를 표적화하는 방법.
  30. 제1항 내지 제21항, 제29항 및 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 페이로드가 독소, 중합체(예를 들어, 합성 또는 천연 발생 중합체), 생물학적 활성 단백질(예를 들어, 효소, 다른 항체 또는 항체 단편), 약물(소분자(화학 개체), c, 핵산 및 이의 단편(예를 들어, DNA, RNA 및 이의 단편), 금속 킬레이트제, 나노입자 또는 이들의 2종 이상의 조합을 포함하는, 세포외 소포를 표적화하는 방법.
  31. 제1항 내지 제22항 및 제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, GLA 성분 및 페이로드를 포함하는 분자를 암 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 암은 상피암, 예를 들어 결장직장암, 고환암, 간암, 담도암, 전립선암, 췌장암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 자궁암, 위암, 식도암, 갑상선암, 신장암, 방광암, 뇌암, 두경부암 또는 폐암이고, 또는 대안적으로 상기 암은 혈액암, 예를 들어 백혈병, 림프종, 골수암 및 만성 골수증식성 질환, 예컨대 AML, CML, ALL 및 CLL일 수 있는, 세포외 소포를 표적화하는 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 방법으로부터 수득할 수 있는 소포 또는 소포 집단.
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