JP2024073589A - エキソソームを標的化する方法 - Google Patents

エキソソームを標的化する方法 Download PDF

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Abstract

【課題】ＧＬＡドメインを含む分子および細胞外小胞を使用して細胞外小胞を標的化する方法を提供する。【解決手段】表面に露出したホスファチジルセリンを有する細胞外小胞を標的化する方法であって、ガンマカルボキシグルタミン酸成分（ＧＬＡ成分）であって、ＧＬＡドメインまたはその活性断片を含み、ＧＬＡタンパク質由来の活性触媒ドメインを含まない、ＧＬＡ成分、を含む分子を、細胞外小胞、例えば、マイクロベシクル、アポトーシス小体、およびエキソソームを含み得る流体に導入する工程を含む、方法とする。【選択図】図１Ｅ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年９月５日に出願された米国仮出願第６２／５５４，５３０号、２０１７年９月５日に出願された米国仮出願第６２／５５４，５３３号、２０１７年１０月６日に出願された米国仮出願第６２／５６９，４０３号、２０１７年１０月６日に出願された米国仮出願第６２／５６９，４１１号、２０１７年１１月１０日に出願された米国仮出願第６２／５８４，５６５号、２０１７年１１月３０日に出願された米国仮出願第６２／５９３，０１４号の優先権を主張するものであり、各出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の組み込み
本出願は、ＥＦＳ－ｗｅｂを介して電子的に提出された配列表を含み、これは、ハードコピーおよびコンピューター可読形態（ＣＲＦ）の両方として機能し、２０１８年９月５日に作成された「ＳＴ－ＣＴ７－ＰＣＴ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｔｘｔ」という題名の９，８２３バイトのサイズのファイルからなり、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は、本明細書で開示される方法から取得されるか、または取得可能である、ＧＬＡドメインを含む分子および細胞外小胞を使用して細胞外小胞を標的化する方法に関する。
細胞外小胞（マイクロベシクルまたは微粒子としても知られている）は、歴史的には、細胞が廃棄物を排出するための媒体であると考えられていた。しかし、最近になって、実際には細胞外小胞は極めて重要な細胞間コミュニケーションに関与していることが確立された。
細胞外小胞は、健康な細胞、幹細胞、および癌細胞などの疾患細胞を含む、ほぼすべての哺乳類細胞に由来し得ることが実証された。細胞外小胞は非常に安定しており、血漿、唾液、尿、胆汁、滑液、精液、および母乳を含むほとんどすべての体液中に存在し得る。
癌細胞などの疾患細胞は、エキソソームなどの細胞外小胞を利用して、転移の準備をし、転位の部位を決定する（ｓｅｅｄ）と考えられている。病原体感染細胞は、感染を広げるために細胞外小胞を使用することができる。さらに、細菌細胞は、細胞外小胞を放出することが知られている。
これらの細胞外小胞、特に病原性プロセスに関与する小胞の研究、理解、および活用に大きな関心が寄せられている。これらの小胞は、幹細胞の代替として治療に使用できることが示唆されている。
しかし、小胞は微小であり、生体内で低濃度で存在するため、一定の実際的な難点がある。さらに、疾患細胞由来の細胞外小胞を正常細胞由来の細胞外小胞と区別するためのマーカーはほとんどない。さらに複雑なことは、生体内でこれらの小さな実体が、生体分子、因子、イオン、ミネラルなどの寄せ集めを含む複雑な環境にあることである。したがって、これらの細胞外小胞を分離および／または監視することさえ困難である。
小胞を分離するために７つ以上の工程が必要になる場合があり、通常、利用される主なパラメータはサイズである。細胞外小胞の直径は３００ｎｍ未満であり、それらの屈折率は低いため、細胞外小胞は、現在使用されている多くの技術の検出範囲を下回っている。細胞外小胞の分析を促進するために、ナノテクノロジーとマイクロ流体を活用した多数の小型システムが開発された。これらの新しいシステムには、マイクロＮＭＲデバイス、ナノプラズモンチップ、およびタンパク質プロファイリング用の磁気電子化学的センサー、ＲＮＡ検出用の統合流体カートリッジが含まれる。フローサイトメトリーは、懸濁液中の細胞外小胞を検出する光学的方法である。それにもかかわらず、単一の細胞外小胞を検出するためのフローサイトメトリーの適用性は、限られた感度と群れ（ｓｗａｒｍ）検出などの潜在的な測定エラー（ａｒｔｉｆａｃｔ）とに起因して、依然として不十分である。単一の細胞外小胞を検出する他の方法は、原子間力顕微鏡法、ナノ粒子追跡分析、ラマン顕微分光法、可変抵抗パルスセンシング、および透過電子顕微鏡法である。
研究および／または診断目的で細胞外小胞を単離する機会以外には、これらの細胞外小胞は、ペイロードを搭載し、一連の疾病を標的とし、および／または治療するための天然の媒体としての使用に適しているとも考えられてる。ただし、現在、積み荷を搭載するための可能性を実現すること、その成分を標的化することには、大きな課題がある：
●これらの細胞外小胞中へ－
○治療、診断／予後診断目的などのための、タンパク質、核酸－天然および非天然のオリゴヌクレオチド－小分子、酵素、細胞外小胞内の内容物を画定するプローブ、
●およびこれらの細胞外小胞の上で－
○標的化の開発、変更、および強化、治療用タンパク質の表示、分析または操作のための細胞外小胞の標識化および収集すること、
●一部のマイクロＲＮＡは、小胞に進入することが示されているが、これまでのところ、小胞内に物質を入れるための堅牢な機序は存在しない、
○例えば、エレクトロポレーションによる損傷、トランスフェクション試薬の統合は、細胞外小胞の商業的有用性を損なう可能性がある、
○細胞外小胞を改変する手段を介した、ウイルスベクターによる非効率的な形質導入、ローディングまたは単離も、診断または治療の可能性などを損なう可能性がある（概説、Ｖａｄｅｒら、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ １０６：１４８－１５６、２０１６、Ｓｕｔａｒｉａら、Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ３４：１０５３－１０６６、２０１７、Ｌｕら、Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈａｒｍ １１９：３８１－３９５、２０１７）、
○サポニンは、細胞外小胞の透過性を高めるための試薬としても提案されている。しかし、サポニンには、溶血性であることを含む複雑な生物活性がある。サポニンの画分であるＱｕｉｌ ＡおよびＱＳ－２１は、抗原に対する免疫応答を高めるためのワクチンアジュバントとして使用される。したがって、サポニンの使用は簡単なものではない。
第三に、病原体の広がりを抑えるために、細胞外小胞中の病原性物質とシグナルを標的とすることが有用かもしれない。
本明細書の開示は、上記の問題に対処している。
驚くべきことに、例えば、癌性細胞、細菌細胞などの病原性細胞から放出された上記のような細胞外小胞は、表面にホスファチジルセリンを露出している。露出したホスファチジルセリンは、例えば、「病原性」小胞に対する免疫応答を下方制御するように作用することができる。理論に拘束されることを望まないが、「病原性細胞外小胞」は、表面に露出したホスファチジルセリンを持たない正常な健康な細胞外小胞とは対照的に、露出したホスファチジルセリンの存在によって特徴付けられるかもしれない。
ホスファチジルセリンは、触媒ドメインの存在を伴わない、ＧＬＡドメインを含むＧＬＡ成分によって標的化されることができる。これらの分子は、アポトーシス細胞、例えば、異常、疾患／感染細胞に由来する小胞を標的とするために使用することができる。
さらに驚くべきことに、本発明者らは、ＧＬＡ成分が幹細胞（例えば、健康な幹細胞）にも結合することも示した。理論に拘束されることを望まないが、これらの細胞はそれらの表面にホスファチジルセリンを提示する可能性があり、これは、幹細胞の免疫抑制効果、炎症効果に寄与する可能性がある。
表面にホスファチジルセリンが露出している細胞に由来する細胞外小胞はまた、それらの外面に表面露出したホスファチジルセリンを有する。したがって、ＧＬＡ成分は、幹細胞からの細胞外小胞を標的とするためにも使用できる。
ＧＬＡドメインは、例えば、標識、ビーズ、診断分子、標的化モチーフおよび／または治療薬などのペイロードに連結または融合することができる。これにより、これらの細胞外小胞の分離、識別、追跡、および／または治療的介入が可能になる。
代替的に、または追加的に、ペイロードは、治療薬、例えば、薬物、生物学的治療薬、ポリマーまたは毒素、例えば、治療用ウイルス、腫瘍溶解性ウイルス、ウイルスベクター、抗ウイルス薬、抗菌薬、抗寄生虫剤、抗癌剤、抗癌療法、または化学療法剤、ウイルスまたはウイルスベクター（腫瘍溶解性ウイルスなど）であり得る。
したがって、ＧＬＡ成分を利用して、表面に露出したホスファチジルセリンに結合するＧＬＡドメインを介して、細胞外小胞の表面にペイロードを固定することができる。
さらに、本発明者らは、本開示で利用されるＧＬＡ成分が、それに付着したペイロードを細胞外小胞の内部に輸送できることを示唆するデータを有する。したがって、ＧＬＡ成分を利用して、ペイロードを細胞外小胞の内部に送達することができる。
これは、既知および既存の技術およびエフェクター／レポーター分子に再度焦点を当て、それらを利用して、小胞を監視、分離、および治療的に介入することができるため、治療および／または診断用途に重要な意味を有する。
一旦標識されると、小胞は、例えば、インビボで監視されるか、またはフローサイトメトリー、磁気による選別などの既知の技術を使用して単離されることができる。
さらに、特定の種類の小胞の存在は、特定の病状の非侵襲的診断として使用できることが明らかになり始めている。
さらに、癌が転移を播種および促進するために小胞を使用するという仮説を考慮すると、治療でこれらの小胞を破壊、除去、または標的化することは、転移を予防または低減する方法となり得、例えば、ＲＮＡｉなどのヌクレオチドは、細胞外小胞内に輸送されて、小胞中にある活性マイクロＲＮＡをノックアウトできる。
ウイルス感染細胞などの感染細胞から脱落した小胞は、例えば、ＲＮＡ、タンパク質、脂質、および炭水化物などの感染細胞からの細胞物質、ならびにウイルス起源の核酸も含有する。これらの小胞は、健康な細胞の感染に一部関与する可能性がある。Ａｌｔａｎ－Ｂｏｎｎｅｔ Ｎ．２０１６。細胞外小胞は、ウイルス感染のトロイの木馬である。Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３２：７７－８１；Ｓｃｈｏｒｅｙ ＪＳ、Ｃｈｅｎｇ Ｙ、Ｓｉｎｇｈ ＰＰ、Ｓｍｉｔｈ ＶＬ．２０１５、Ｅｘｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｉｎ ｈｏｓｔ－ｐａｔｈｏｇｅｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ；ＥＭＢＯ Ｒｅｐ １６：２４－４３、Ｓｃｈｏｒｅｙ ＪＳ、Ｈａｒｄｉｎｇ ＣＶ．２０１６；およびＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ：ｎｅｗ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｔｏ ａｎ ｏｌｄ ｓｔｏｒｙ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２６：１１８１－９。
エキソソームなどの小胞には、細胞に物質を送達するために理想的ないくつかの特性があり、これには、それらの小さなサイズ（血液脳関門を通過できるなど）、細胞の原形質膜と融合してそれらの内容物を送達するための自然な能力、安定した内部環境、ならびに核酸（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡ）、脂質、タンパク質を含む機能性分子を受容細胞に送達する能力を含まれる。
最近のアプローチは、治療用途のために細胞外小胞を設計することを目的としている。これらのアプローチには、小胞内容物の改変や、それらの移動経路の操作が含まれる。特に、細胞外小胞は、腫瘍細胞の浸潤、遊走、および増殖を減少させることによる癌の治療のための治療用小胞としての役割を果たし、化学療法への感受性を高め、免疫反応の増強および細胞死を引き起こし得ることが実証されている。
また、小胞がワクチンとしての使用に適している可能性があることも明らかになっている。ウイルス感染細胞から放出された小胞は、正しく折りたたまれ処理されたウイルス物質の独特な供給源であり、ワクチン接種における抗原としての使用に理想的である。しかし、ワクチンは通常、抗原成分に対する免疫応答を高めるためにアジュバントの存在を必要とする。
インキュベーション、エレクトロポレーション、トランスフェクションの古典的なアプローチを使用して細胞外小胞内容物を操作するこれまでの試みは、移入効率の悪さ、ペイロードのサイズの制限、膜内の残留賦形剤の存在、使用できるペイロードの種類の制限のために、限定的であった。したがって、これらの小胞の可能性を実現するための課題がまだいくつか存在する。したがって、内容物を細胞外小胞上および細胞外小胞内へ効果的に送達できる新規方法が必要である。
本開示は、細胞外小胞を単離し、診断目的に使用し、治療的介入のための標的とし、ならびにＲＮＡおよびＤＮＡを含むヌクレオチドなどの分子を含む治療薬を、例えば、付着または遺伝子融合などを通じて細胞へ送達するために使用することを可能にすることにより、細胞外小胞の可能性を活用することを促進する。
さらに、小胞の表面でのホスファチジルセリンの発現は、小胞に対する免疫応答を下方制御する。細胞外小胞の表面のホスファチジルセリンに結合するＧＬＡ成分（ペイロードが付着していない）は、免疫系に対して小胞の覆いをはがす。したがって、本開示のＧＬＡ成分は、免疫系に対する細胞外小胞の可視性を高めるために使用され得る。
ここで、本開示は、以下の段落に要約される。
１ａ．表面に露出したホスファチジルセリンを有する細胞外小胞を標的化する方法であって、
ガンマカルボキシグルタミン酸成分（ＧＬＡ成分）であって、ＧＬＡドメインまたはその活性断片を含み、ＧＬＡタンパク質由来の活性触媒ドメインを含まない、ＧＬＡ成分、を含む分子を、
細胞外小胞、例えば、マイクロベシクル、アポトーシス小体、およびエキソソームを含み得る流体に導入する工程を含む、方法。
１ｂ．細胞外小胞の治療または診断に使用するための、ガンマカルボキシグルタミン酸成分（ＧＬＡ成分）に連結されたペイロードを含む分子であって、
該ＧＬＡ成分が、ＧＬＡドメインまたはその活性断片を含み、ＧＬＡタンパク質由来の活性触媒ドメインを含まない、分子。
１ｃ．細胞外小胞の治療または診断用医薬の製造において使用するための、ガンマカルボキシグルタミン酸成分（ＧＬＡ成分）に連結されたペイロードを含む分子であって、
該ＧＬＡ成分が、ＧＬＡドメインまたはその活性断片を含み、ＧＬＡタンパク質由来の活性触媒ドメインを含まない、分子。
２．該細胞外小胞が、１０ｎｍ～１０００ｎｍの範囲の直径を有する、段落１ａ、１ｂまたは１ｃに記載の使用のための方法または分子。
３．該細胞外小胞がエキソソームである、段落１ａ、１ｂ、１ｃまたは２に記載の使用のための方法または分子。
４．該細胞外小胞（エキソソームなど）が１０００ｎｍ以下、例えば、１ｎｍ～１０μｍ、例えば、１０ｎｍ～５μｍ、特に、１０ｎｍ～１μｍ、より具体的には、２０ｎｍ～１００ｎｍ、より特定的には、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００ｎｍの直径を有する、段落１～３のいずれか１つに記載の使用のための方法または分子。
５．該小胞が、１～１．５ｇ／ｍｌ、例えば、１～１．２ｇ／ｍｌ、特に、１．１３～１．１９ｇ／ｍｌの範囲の密度を有する、段落１ａ、１ｂまたは１ｃ～４のいずれか１つに記載の使用のための方法または分子。
６．該小胞が、Ｌａｍｐ－１、Ｌａｍｐ－２、ＣＤ１３、ＣＤ８６、フロチリン、シンタキシン－３、ＣＤ２、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１ａ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＩＣＡＭ－１、インテグリンアルファ４、ＬｉＣＡＭ、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ－１アルファおよびベータ、Ｖｔｉ－ＩＡおよびＢ、ＣＤ３イプシロンおよびゼータ、ＣＤ９、ＣＤ１８、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＸＣＲ４、ＦｃＲ、ＧｌｕＲ２／３、ＨＬＡ－ＤＭ（ＭＨＣ ＩＩ）、免疫グロブリン、ＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩ成分、ＴＣＲベータ、テトラスパニン、ならびにそれらの２つ以上の組み合わせから独立して選択される１つ以上の膜貫通タンパク質を含む、段落１ａ、１ｂ、１ｃ～５のいずれか１つに記載の使用のための方法または分子。
７．該小胞が、不健康な細胞、例えば、アポトーシス細胞、壊死細胞、癌細胞、病原体感染細胞（ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、または寄生虫感染細胞など）から放出された、段落１ａ、１ｂ、１ｃ～６のいずれか１つに記載の使用のための方法または分子。
８．該細胞が癌細胞である、段落７に記載の使用のための方法または分子。
９．該細胞が癌幹細胞である、段落８に記載の使用のための方法または分子。
１０．該細胞外小胞が健康な幹細胞に由来する、段落１～６のいずれか１つに記載の使用のための方法または分子。
１１．該流体が、生体外患者試料、例えば、血液試料、嚢胞または腫瘍から採取された流体、均質化された生検または類似物を含む、段落１ａ、１ｂ、１ｃ～１０のいずれか１つに記載の使用のための方法または分子。
１２．該ＧＬＡ成分がインビボで投与される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の使用のための方法または分子。
１３．ＧＬＡドメインまたはその活性断片が、トロンビン、ＶＩＩ因子、ＩＸ因子、Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、オステオカルシン、マトリックスＧＬＡタンパク質、ＧＡＳ６、トランススレチン、ペリオスチン、プロリンリッチＧＬＡ１、プロリンリッチＧＬＡ２、プロリンリッチＧＬＡ３、およびプロリンリッチＧＬＡ４から独立して選択される、段落１ａ、１ｂまたは１ｃ～１２のいずれか１つに記載の使用のための方法または分子。
１４．ＧＬＡドメインまたはその活性断片が、トロンビン、ＶＩＩ因子、ＩＸ因子、Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、およびＧＡＳ６、例えばプロテインＳ、特に、配列番号１に示される配列を含むものから独立して選択される、段落１ａ、１ｂまたは１ｃ～１３のいずれか１つに記載の使用のための方法または分子。
１５．該ＧＬＡドメイン成分が、ＥＧＦドメイン、例えばカルシウム結合ＥＧＦドメインをさらに含む、段落１～１１のいずれか１つに記載の使用のための方法または分子。
１６．該構築物が、トロンビン、ＶＩＩ因子、ＩＸ因子、Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、オステオカルシン、マトリックスＧＬＡタンパク質、ＧＡＳ６、トランススレチン、ペリオスチン、プロリンリッチＧＬＡ１、プロリンリッチＧＬＡ２、プロリンリッチＧＬＡ３、およびプロリンリッチＧＬＡ４から選択されるＥＧＦドメインを含む、段落１５に記載の使用のための方法または分子。
１７．該構築物が、トロンビン、ＶＩＩ因子、ＩＸ因子、Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、およびＧＡＳ６から独立して選択されるＥＧＦドメイン、例えば、プロテインＳからのＥＧＦドメインを含む、段落１６に記載の使用のための方法または分子。
１８．該ＧＬＡ成分が、配列番号６に示される配列またはＨｉｓタグが存在しないその誘導体、特に配列番号６に示される配列を含む、段落１ａ、１ｂまたは１ｃ～１７のいずれか１つに記載の使用のための方法または分子。
１９．該ＧＬＡドメイン成分がクリングルドメインをさらに含む、段落１ａ、１ｂまたは１ｃ～１４のいずれかに記載の使用のための方法または分子。
２０．該クリングルドメインが、転写活性因子２（ＡＴＦ）；ＸＩＩ因子（Ｆ１２）；トロンビン（Ｆ２）；ヒアルロナン結合タンパク質２（ＨＡＢＰ２）；肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）；肝細胞増殖因子活性化因子（ＨＧＦＡＣ）；クレメン（Ｋｒｅｍｅｎ）タンパク質１（ＫＲＥＭＥＮ１）；ＫＲＥＭＥＮ２；リポタンパク質（ａ）（ＬＰＡ）；ＬＰＡＬ２；マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰまたはＭＳＴ１）；ホスホイノシチド－３－キナーゼ相互作用タンパク質１（ＰＩＫ３ＩＰ１）；組織プラスミノーゲン活性化因子（ＰＬＡＴ）；ウロキナーゼ（ＰＬＡＵ）；プラスミン（ＰＬＧ）；ＰＲＳＳ１２；チロシンプロテインキナーゼ膜貫通受容体ＲＯＲ１（ＲＯＲ１）；およびチロシンプロテインキナーゼ膜貫通受容体ＲＯＲ２（ＲＯＲ２）を含む群から選択されるタンパク質である、段落１９に記載の使用のための方法または分子。
２１．該ＧＬＡ成分がペイロードに連結される、段落１ａ、１ｂまたは１ｃ～２０のいずれか１つに記載の使用のための方法または分子。
２２．該ＧＬＡ成分が該ペイロードにコンジュゲートされる、段落２１に記載の使用のための方法または分子。
２３．該ＧＬＡ成分が融合タンパク質の一部である、段落１ａ、１ｂまたは１ｃ～２２のいずれか１つに記載の使用のための方法または分子。
２４．ペイロードが検出可能な標識を含む、段落２３に記載の使用のための方法または分子。
２５．該標識が、蛍光分子（蛍光プローブ（ローダミン色素、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ、ＣＹ５など）を含む）、ビオチン、酵素、タグ（例えば、ＨＩＳ－タグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ）、放射性核種（特に、放射性ヨウ化物、放射性同位体、例えば、９９ｍＴｃ）、発光標識、または該検出可能な標識がモレキュラービーコン内にある場合を含む、ＮＭＲもしくはＥＳＲ分光法により検出できる化合物から選択される、段落２４に記載の使用のための方法または分子。
２６．該ペイロードが、ビーズ、プレート、またはタグ、例えば、磁気ビーズなどの単離可能なビーズである、段落１ａ、１ｂまたは１ｃ～２５のいずれか１つに記載の使用のための方法または分子。
２７．該ペイロードがリンカーを介して該ＧＬＡ成分に連結されている、段落２１～２６に記載の使用のための方法または分子。
２８．該リンカーが切断可能である、段落２７に記載の使用のための方法または分子。
２９．該ＧＬＡ成分およびペイロードが診断用である、段落２１～２８のいずれか１つに記載の使用のための方法または分子。
３０．該方法が、該細胞外小胞の富化された集団を提供するさらなる工程を含む、段落１ａ、１ｂまたは１ｃ～２９のいずれか１つに記載の使用のための方法または分子。
３１．該方法が、該細胞外小胞を単離する工程を含む、段落１ａ、１ｂまたは１ｃ～３０のいずれか１つに記載の使用のための方法または分子。
３２．該方法がインビトロで実施される、段落１ａ、１ｂまたは１ｃ～３１のいずれか１つに記載の使用のための方法または分子。
３３．該ＧＬＡ成分を含む該分子が治療薬である、段落１ａ、１ｂまたは１ｃ～３２のいずれか１つに記載の使用のための方法または分子。
３４．該ペイロードが、薬物、化学療法剤、ペプチド（ステープルペプチドを含む）、または生物学的治療薬、例えば、抗ウイルス薬、抗菌薬、抗寄生虫剤、抗癌剤、抗癌療法である、段落２１～２５および３３のいずれか１つに記載の使用のための方法または分子。
３５．該ペイロードが、毒素、ポリマー（例えば、合成もしくは天然に生じるポリマー）、生物学的に活性なタンパク質（例えば、酵素、他の抗体もしくは抗体断片、例えば、細胞内抗体）、薬物（小分子（化学物質）、ｃ、核酸およびその断片（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの断片）、金属キレート剤、ナノ粒子、またはそれらの２つ以上の組み合わせを含む、段落２１～２５、３３および３４のいずれか１つに記載の使用のための方法または分子。
３６．該毒素が、アウリスタチン（例えば、ＭＭＡＥ（モノメチルアウリスタチンＥ）、ＭＭＡＦ（モノメチルアウリスタチンＦ））、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ドキソルビシン、デュオカルマイシン、メイタンシノイド（例えば、Ｎ２’－デアセチル－Ｎ２’－（３－メルカプト－１－オキソペンチル）－メイタンシン（ＤＭ１）、Ｎ２’－デアセチル－Ｎ２’－（４－メルカプト－１－オキソペンチル）－メイタンシン（ＤＭ３）、およびＮ２’－デアセチル－Ｎ２’（４－メチル－４－メルカプト－１－オキソペンチル）－メイタンシン（ＤＭ４））、カロケアマイシン、ドラスタチン、メイタンシン、α－アマニチン、シュードモナス外毒素（ＰＥ３８）、リシンＡ鎖、ジフテリア毒素、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）、サポリン、ゲロニンおよびツブリシンから選択される、段落３５に記載の使用のための方法または分子。
３７．該化学療法剤が、テモゾロミド、エポチロン、メルファラン、カルムスチン、ブスルファン、ロムスチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ポリフェプロサン、イホスファミド、クロラムブシル、メクロレタミン、ブスルファン、シクロホスファミド、カルボプラチン、シスプラチン、チオテパ、カペシタビン、ストレプトゾシン、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、ロイプロリド酢酸塩、ドキソルビシン塩酸塩、ブレオマイシン硫酸塩、ダウノルビシン塩酸塩、ダクチノマイシン、リポソームダウノルビシンクエン酸塩、リポソームドキソルビシン塩酸塩、エピルビシン塩酸塩、イダルビシン塩酸塩、マイトマイシン、ドキソルビシン、バルルビシン、アナストロゾール、トレミフェンクエン酸塩、シタラビン、フルオロウラシル、フルダラビン、フロクスウリジン、インターフェロンα－２ｂ、プリカマイシン、メルカプトプリン、メトトレキサート、インターフェロンα－２ａ、メドロキシプロゲルステロン酢酸塩、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エストラジオール、ロイプロリド酢酸塩、メゲストロイル酢酸塩、オクトレオチド酢酸塩、ジエチルスチルベストロール二リン酸塩、テストラクトン、ゴセレリン酢酸塩、エトポシドリン酸塩、ビンクリスチン硫酸塩、エトポシド、ビンブラスチン、エトポシド、ビンクリスチン硫酸塩、テニポシド、トラスツズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、リツキシマブ、エキセメスタン、イリノテカン塩酸塩、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン塩酸塩、アルトレタミン、トポテカン塩酸塩、ヒドロキシ尿素、クラドリビン、ミトタン、プロカルバジン塩酸塩、ビノレルビン酒石酸塩、ペントロスタチンナトリウム、ミトキサントロン、ペガスパルガーゼ、デニロイキンジフチチックス、アルトレチノイン、ポルフィマー、ベキサロテン、パクリタキセル、ドセタキセル、三酸化ヒ素、トレチノイン、およびこれらの２つ以上の組み合わせから選択される、段落３４～３６のいずれか１つに記載の使用のための方法または分子。
３８．該化学療法剤が、アルキル化剤、チミジル酸シンターゼ阻害剤を含む代謝拮抗剤、タキサン、アントラサイクリン、植物アルカロイドを含む抗微小管剤、およびこれらの２つ以上の組み合わせから選択される、段落３４～３７のいずれか１つに記載の使用のための方法または分子。
３９．該化学療法剤が、パクリタキセル、ドセタキセル、アブラキサン、カルバジタキセル、これらのいずれか１つの誘導体、および前述のもののいずれかの２つ以上の組み合わせから選択される、段落３８に記載の使用のための方法または分子。
４０．該アルキル化剤が、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、テトラジン、アジリジン、プラチン、およびそれらの誘導体、非古典的アルキル化剤、およびこれらの２つ以上の組み合わせから選択される、請求項３８または３９に記載の使用のための方法または分子。
４１．該プラチンが、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、ピコプラチン、ネダプラチン、トリプラチン、リポプラチン、およびこれらの２つ以上の組み合わせから選択される、段落４０に記載の使用のための方法または分子。
４２．該アルキル化剤が、葉酸代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサートおよびペメトレキセド）、プリン類似体（例えば、チオプリン、例えば、アザチオプリン、メルカプトプリン、チオプリン、フルダラビン（リン酸塩形態を含む）、ペントスタチンおよびクラドリビン）、ピリミジン類似体（例えば、フルオロピリミジン、例えば、５－フルオロウラシル、それらのプロドラッグ、例えば、カペシタビン［Ｘｅｌｏｄａ（登録商標）］）、フロクスウリジン、ゲムシタビン、シタラビン、デシタビン、ラルチトレキセド（トムデックス）塩酸塩、クラドリビン、および６－アザウラシル、およびそれらの２つ以上の組み合わせから選択される代謝拮抗剤である、段落３８～４１のいずれか１つに記載の使用のための方法または分子。
４３．該アントラサイクリンが、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ダウノルビシン（リポソーム）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ドキソルビシン（リポソーム）、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、およびそれらの２つ以上の組み合わせ、特に、ドキソルビシンから選択される、段落４０～４２のいずれか１つに記載の使用のための方法または分子。
４４．該薬物が、例えば、トポイソメラーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、およびそれらの以上の組み合わせから選択される抗癌剤である、段落３４～４３のいずれか１つに記載の使用のための方法または分子。
４５．該抗癌療法が、例えば、Ｙ－９０、Ｐ－３２、Ｉ－１３１、Ｉｎ－１１１、Ｓｒ－８９、Ｒｅ－１８６、Ｓｍ－１５３、Ｓｎ－１１７ｍ、およびそれらの２つ以上の組み合わせから選択される放射性核種である、段落３４～４４のいずれか１つに記載の使用のための方法または分子。
４６．該ＧＬＡ成分およびペイロードを含む該分子を癌患者に投与することを含む、請求項１ａ、１ｂまたは１ｃ～２５および２７～４５のいずれか１つに記載の使用のための方法または分子。
４７．該癌が、上皮癌、例えば、結腸直腸癌、精巣癌、肝臓癌、胆道癌、前立腺癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮癌、胃癌、食道癌、甲状腺癌、腎癌、膀胱癌、脳癌、頭頸部癌、もしくは肺癌であるか、または代替的には、該癌が、血液癌、例えば白血病、リンパ腫、骨髄腫、およびＡＭＬなどの慢性骨髄増殖性疾患である、段落４６に記載の使用のための方法または分子。
一実施形態では、本開示の方法は、アポトーシス小体を標的としない。
したがって、一実施形態では、本開示による分子は、その細胞内形態を含む病原体、例えば、ウイルス、細菌、原生動物、寄生虫感染の治療に利用される。
本開示は、小胞内標的化および送達（ペイロードの小胞内送達を含む）のために、ＧＬＡドメインまたはその活性断片を含むＧＬＡ成分の使用にも拡張され、ここで、ＧＬＡ成分は、ＧＬＡタンパク質由来の活性触媒ドメインを含まない。
本開示は、細胞内標的化および送達用の医薬（ペイロードの小胞内送達を含む、特に、ペイロードが治療的部分／分子を含むもの）の製造のために、ＧＬＡドメインまたはその活性断片を含むＧＬＡ成分の使用にも拡張され、ここで、該ＧＬＡ成分は、ＧＬＡタンパク質由来の活性触媒ドメインを含まない。
したがって、一態様では、例えば、ワクチンで使用するために、本明細書で開示される方法を用いて、例えば、ＨＥｐ－２細胞、Ａ５４９細胞、Ｃａｌｕ－３細胞、ＨＥＫ、およびＭａｄｉｎ Ｄａｒｂｙ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）などの、病原体感染ヒト細胞株から小胞を生成／単離するインビトロ方法が提供される。
一実施形態では、ＧＬＡドメインまたはその活性断片を含み、ＧＬＡタンパク質由来の活性触媒ドメインを含まない、ガンマカルボキシグルタミン酸成分（ＧＬＡ成分）を用いて、インビトロで生成／単離された小胞に、ペイロード、例えば、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ、ＣＰＧなどを搭載する。
一実施形態では、ＧＬＡドメインまたはその活性断片を含み、ＧＬＡタンパク質由来の活性触媒ドメインを含まない、ガンマカルボキシグルタミン酸成分（ＧＬＡ成分）を使用して、インビトロで生成／単離された小胞に、免疫刺激分子を搭載する。
細胞外小胞模倣体は、連続的押し出しにより、細胞を破壊することにより、インビトロで生成でき、例えば、Ｊａｎｇら、Ｎａｎｏ ２０１３、７、７６９８を参照されたい。これらの模倣物は、それらがアポトーシス細胞または幹細胞から生成される場合、それらの表面にホスファチジルセリンを有する。
一実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、ＧＬＡ成分にコンジュゲートしている。
本開示はまた、病原体感染細胞からの細胞外小胞であって、例えば、ＣＰＧ、Ｃ３ｂ、ＩＣＡＭ－１などのＴＬＲ９アゴニストなどのアジュバントから選択される外因性免疫刺激分子と、本開示によるＧＬＡ成分と、を搭載した細胞外小胞を含むワクチン組成物にも及ぶ。
ワクチン中の小胞は、インビボまたはインビトロで産生され得る。小胞は、例えば、ＨＥｐ－２細胞、Ａ５４９細胞、Ｃａｌｕ－３細胞、ＨＥＫ、およびＭａｄｉｎ Ｄａｒｂｙ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）から選択される病原体感染ヒト細胞株においてインビトロで生成され得る。
外因性免疫刺激分子は、「病原体由来」小胞の外部、「病原体由来」小胞の内部に搭載されることができ、または両方の場所に配置することができる。
ＧＬＡ成分は、「病原体由来」小胞の外部、「病原体由来」小胞の内部に搭載されることができ、または両方の場所に配置することができる。
一実施形態では、免疫刺激分子はＧＬＡ成分に連結していない、すなわち、それらは別々に搭載され、例えば、免疫刺激分子は、小胞にトランスフェクトされ得るプラスミドとして提供されてもよく、ＧＬＡ成分は、タンパク質として提供される。
ＧＬＡ成分と免疫刺激分子の両方を小胞に搭載することにより、ＧＬＡ成分が小胞の表面上のホスファチジルセリンに結合し、それによって小胞の存在が免疫系に明らかになるという、２つの別々の作用メカニズムが提供される。免疫刺激分子は、小胞内の病原性物質に対する免疫系の応答を高める。
外因性免疫刺激分子は、ＧＬＡドメインに連結されていてもよく、例えば、ＧＬＡ成分にコンジュゲートされていてもよく、またはＧＬＡ成分との融合（発現構築物）であってもよい。
ＧＬＡ成分は小胞の表面上のホスファチジルセリンと結合することができ、それにより小胞上にそれ自体および免疫刺激分子を搭載することができるため、ＧＬＡ成分に連結された免疫刺激分子を提供することは有利である。さらに、場合によっては、ＧＬＡ成分は小胞内に取り込まれ、それとともに免疫刺激分子を引き寄せることがある。
一実施形態では、病原体は、例えば、本明細書に記載の細菌またはウイルス、特に、インフルエンザウイルス、例えば、インフルエンザＡ、Ｂ、ＣまたはＤである。インフルエンザＡは、ヘマグルチニンサブタイプ、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７、Ｈ１８、ならびにノイラミニダーゼサブタイプ、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、Ｎ９、Ｎ１０、Ｎ１１、例えば、インフルエンザＡから選択された株：（Ｈ１Ｎ１）Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ１、Ｈ９１１、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、およびＨ２Ｎ３、ならびに新型インフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１ウイルスを有する（ＣＤＣ ２００９ Ｈ１Ｎ１Ｆｌｕウェブサイト）。
本開示の技術は、普遍的なインフルエンザワクチンの調製に適切であり得る。
しかし、季節性インフルエンザワクチンの調製に使用される場合でさえ、本技術は、現在利用可能なワクチンを卵で栽培するよりも効率的で便利である。
本開示は、治療、特にワクチンとして使用するための、本開示による「病原体由来」小胞も提供する。
医薬の製造、特に、ワクチンの製造のための、本開示による「病原体由来」小胞の使用も提供される。
上述のように、ＧＬＡ成分を使用して、治療用ペイロードなどのペイロードを細胞外小胞の内部に運ぶことができる。治療用ペイロードは、小胞自体に作用することができ、または小胞によって細胞に送達されて細胞に作用することができ、またはこれら２つのシナリオの組み合わせである。
詳細な開示
一実施形態では、１、２、３、４または５個のペイロードがＧＬＡ成分ごとに連結される。
ＧＬＡ成分（本明細書ではガンマカルボキシグルタミン酸成分とも呼ばれる）は、プロテインＳなどのＧＬＡタンパク質からの触媒ドメインの不在下でＧＬＡドメインを含むポリペプチドを指す。ポリペプチドは、例えば、プロテインＳからのＥＧＦドメインおよび／クリングルドメインをさらに含んでもよい。一実施形態では、ＧＬＡ成分は、３０～３００個のアミノ酸残基、例えば、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０または３００個の残基を含む。一実施形態では、ＧＬＡ成分は、４．５～３０ｋＤａの範囲にある。一実施形態では、ＧＬＡ成分は、配列番号１に示される配列を含む。一実施形態では、ＧＬＡ成分は、配列番号６に示される配列またはＨｉｓタグを除くその誘導体を含む。
本明細書で使用されるとき、ＧＬＡドメイン（ビタミンＫ依存性カルボキシル化／ガンマカルボキシグルタミン酸）は、ガンマカルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）を提供するために、アミノ酸配列中のグルタミン酸残基のビタミンＫ依存性翻訳後カルボキシル化により修飾されたタンパク質ドメインである。一実施形態では、本開示の分子で使用されるＧＬＡドメインは、天然（野生型）ＧＬＡドメインからの３０～４５個の連続した残基を含む。一実施形態では、ＧＬＡドメインは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個のＧＬＡ残基を含む。
一実施形態では、ＧＬＡ成分の３０％以下が、ＧＬＡ残基である。
一実施形態では、ＧＬＡ成分は、１～５個のジスルフィド結合、例えば、１、２、３、４または５個のジスルフィド結合を含む。
ＧＬＡドメインは、２つのカルボン酸残基間でそれらをキレート化することにより、カルシウムイオンを結合する。これらの残基は、Ｇｌａタンパク質の成熟型のＮ末端から始まり、保存された芳香族残基で終わる領域の一部である。これにより、ドメインの中央で見出され、カルボキシラーゼによる基質認識に重要であると思われる、保存されたＧｌａ－ｘ（３）－Ｇｌａ－ｘ－Ｃｙｓモチーフが得られる。
ＧＬＡドメインは、トロンビン、ＶＩＩ因子、ＩＸ因子、Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ（ＰｒＳ）、プロテインＺ、オステオカルシン、マトリックスＧＬＡタンパク質、ＧＡＳ６、トランススレチン、ペリオスチン、プロリンリッチＧＬＡ１、プロリンリッチＧＬＡ ２、プロリンリッチＧＬＡ ３、およびプロリンリッチＧＬＡ ４などの多くのタンパク質に含まれている。
本明細書で使用されるＧＬＡドメインは、修飾されたドメインが、適切なインビトロアッセイにおいて天然（非修飾ＧＬＡドメイン）の天然活性の少なくとも７０％（７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％など）を保持している限り、天然ＧＬＡドメインのアミノ酸の１～１０パーセント（１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０％など）が置換および／または欠失され得るタンパク質にも及ぶ。一実施形態では、ドメインは、完全長の天然ドメインである。
本明細書で使用されるＥＧＦドメインは、保存されたタンパク質ドメインである。それは、約３０～４０のアミノ酸残基を含み、ほとんどの動物性タンパク質の多くで見出されている。ＥＧＦ様ドメインのほとんどの出現は、膜結合タンパク質の細胞外ドメインまたは分泌されることが知られているタンパク質に見られる。ＥＧＦ様ドメインには６つのシステイン残基が含まれている。ＥＧＦ様ドメインの主な構造は、２つのストランドのβシートと、それに続く短いＣ末端へのループ、２つのストランドのβシートである。これらの２つのβシートは通常、メジャー（Ｎ末端）およびマイナー（Ｃ末端）シートとして示される。ＥＧＦ様ドメインは、タンパク質中で多数のタンデムコピーとして頻繁に発生し、これらのリピートは通常、一緒に折り畳まれて、機能ユニットとして単一の線形ソレノイドドメインブロックを形成する。一実施形態では、使用されるドメインは、完全長の天然ドメインである。
本明細書で使用されるＥＧＦドメインは、修飾されたドメインが、適切なインビトロアッセイにおいて天然（非修飾ＥＧＦドメイン）の天然活性の少なくとも７０％（７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％など）を保持している限り、天然ＥＧＦドメインのアミノ酸の１～１０パーセント（１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０％など）が置換および／または欠失され得るタンパク質にも及ぶ。一実施形態では、ドメインは、完全長の天然ドメインである。
本明細書で使用されるクリングルドメインは、３つのジスルフィド結合により安定化された大きなループに折り畳まれる自律タンパク質ドメインを指す。それらは、トリプルループ、３－ジスルフィド架橋構造によって特徴付けられ、その立体構造は、多くの水素結合と逆平行ベータシートの小片によって定義される。それらは、様々なコピー数で、血液凝固および線維素溶解タンパク質にわたって見出され、ＭＥＲＯＰＳペプチダーゼファミリーＳ１Ａに属するセリンプロテアーゼであるプロトロンビンおよびウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子を含む一部の血漿タンパク質で見出される。
本明細書で使用されるクリングルドメインは、修飾されたドメインが、適切なインビトロアッセイにおいて天然（非修飾クリングルドメイン）の天然活性の少なくとも７０％（７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％など）を保持している限り、天然クリングルドメインのアミノ酸の１～１０パーセント（１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０％など）が置換および／または欠失され得るタンパク質にも及ぶ。一実施形態では、使用されるドメインは、完全長の天然ドメインである。
本明細書で使用されるタンパク質の活性断片は、関連するインビトロアッセイにおいて天然の完全長ドメインまたはタンパク質の活性の少なくとも５０％（６０、７０、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％）を保持する天然タンパク質（または関連するドメイン）全体未満のものである。
本明細書で使用される触媒ドメインは、例えば、図１Ａに示されるように、Ｃ末端方向の、ＥＧＦドメインの下流のドメイン（または断片）である。
本明細書で使用されるとき、インビトロは、ヒトまたは動物の身体で行われない実験室作業を指す。
本明細書で使用されるとき、インビボは、生きている生物、特に、ヒトまたは動物、特に、ヒトにおける作業／試験／治療を指す。
細胞外小胞（ＥＶ）は、長距離の細胞間コミュニケーションの重要なメディエーターであり、原核生物と真核生物の両方にわたる多様な生物学的プロセスに関与している（概説、ＡｒｅｎａｃｃｉｏおよびＦｅｄｅｒｉｃｏ、Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ ９９８：３－１９、２０１７、Ｌｕら、Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ １１９：３８１－１９５、２０１７、Ｖａｄｅｒら、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ １０６：１４８－１５６、２０１６、ＬｅｆｅｂｖｒｅおよびＬｅｃｕｙｅｒ、Ｆｒｏｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ８：３７７、２０１７）。
細胞外小胞は、感染細胞（ウイルス、細菌、または寄生虫）から放出され、これらの感染物質からの材料を含んでいる（概説、Ｓｃｈｏｒｅｙら、ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．１６：２４－４３、２０１５、ＳｃｈｏｒｅｙおよびＨａｒｄｉｎｇ、Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１２６：１１８１－１１８９、２０１６）。この材料は、毒素～毒性因子～感染性ウイルス（エンベロープ型および非エンベロープ型の両方；概説、Ａｌｔａｎ－Ｂｏｎｎｅｔ、Ｎ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３２：７７－８１、２０１６）まで様々であり、単一のウイルス粒子ではなくウイルス集団をより効果的に送達するための新規手段となり得る（Ｃｈｅｎ ＹＨら、Ｃｅｌｌ １６０：６１９－６３０、２０１５）。その結果、それらを単離することにより、疾患に対する迅速な診断的洞察が得られる。
細胞外小胞は、分泌されたすべての膜小胞を表す広義の用語である。本明細書で使用される場合、この用語には、エキソソーム、マイクロベシクル（微小粒子とも呼ばれる）、エクトソーム、マトリックス小胞、石灰化小胞、プロスタソーム、オンコソーム、レトロウイルス様粒子、細菌細胞外小胞、管腔内小胞、およびアポトーシス小体が含まれる。
さらに、感染物質および細胞に特異的なタンパク質、ＲＮＡ、および炭水化物を含む細胞外小胞も、潜在的にｉｎ ｓｉｔｕワクチン接種のシステムとなり得る。この設定では、ＧＬＡドメインによる免疫抑制ホスファチジルセリン分子の関与および中和が免疫の検出とクリアランスを可能にし、感染症に対する特異的ワクチン接種の新規かつより効果的な方法として役立つことが想定されている。
本明細書で使用される細胞外小胞には、マイクロベシクル、アポトーシス小体、およびエキソソームが含まれる。細胞外小胞の直径は、一般に、１０ｎｍ～５０００ｎｍの範囲である。
本明細書で使用されるマイクロベシクルは、細胞膜からの出芽による形成後に放出される小胞を指し、例えば、一般に、１００ｎｍ～１０００ｎｍの範囲の直径を有する。
エキソソームは多小胞体内で生成され、多小胞体と細胞膜の融合後に放出される。一般に、エキソソームの直径は３０～１００ｎｍの範囲である。
本明細書で使用されるとき、アポトーシス小体は、アポトーシス細胞によって細胞外環境に放出された小胞を指す。アポトーシス小体は細胞内コミュニケーションに関与していない可能性がある。一般に、アポトーシス小体の直径は、８００ｎｍ～５０００ｎｍの範囲である。
例えば、モジュール化された細胞外小胞については、Ｔｈｅ Ｄａｗｎ ｏｆ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ ａｎｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｔａｏら、Ａｄｖ．Ｓｃｉ．２０１８、５、１７００４４９を、間葉系幹細胞由来細胞外小胞については、Ｔｏｗａｒｄｓ Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｒａｎｉら、ｗｗｗ．ｍｏｌｅｃｕｌａｒｔｈｅｒａｐｙ．ｏｒｇ ｖｏｌ．２３ ｎｏ．５、８１２－８２３ Ｍａｙ ２０１５を、治療用細胞外小胞の有望性の実現については、Ｔｈｅ Ｄｅｖｉｌ ｉｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｅｔａｉｌ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｓｕｔａｒｉａら、Ｐｈａｒｍａ Ｒｅｓ．２０１７ Ｍａｙ；３４（５）１０５３－１０６６を参照されたく、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。
したがって、本開示は、例えば、ウイルス感染、細菌感染および／または寄生虫感染などの病原体による感染の診断のための細胞外小胞の使用を提供する。
したがって、本開示は、例えば、病原体による感染、例えば、ウイルス感染、細菌感染、および／または寄生虫感染の治療のための細胞外小胞の使用を提供し、特に、この場合、細胞外小胞は、病原性物質を中和または除去するために治療され、および／または細胞外小胞には、標的細胞への送達のための治療材料が搭載される。
したがって、本開示は、例えば、ウイルス感染、細菌感染および／または寄生虫感染などの病原体による感染の診断のための細胞外小胞の使用を提供する。
したがって、本開示は、例えば、病原体による感染、例えば、ウイルス感染、細菌感染、および／または寄生虫感染の治療のための細胞外小胞の使用を提供し、特に、この場合、細胞外小胞は、病原性物質を中和または除去するように治療され、および／または細胞外小胞には、細胞への送達のための治療物質が搭載される。
したがって、本開示は、癌の診断のための細胞外小胞の使用を提供する。
したがって、本開示は、癌の治療のための細胞外小胞の使用を提供し、例えば、細胞外小胞が病原性物質を中和または除去するように処理され、および／または細胞外小胞に細胞への送達のための治療物質が搭載される。
本開示による細胞外小胞および方法、特に幹細胞からの細胞外小胞はまた、自己免疫疾患の診断および／または治療に有用であり得る。
一実施形態では、本開示の細胞外小胞は、ヒト細胞からのものである。
一実施形態では、細胞外小胞は、幹細胞（特、健康な幹細胞）からのものである。これらの小胞は、幹細胞療法と同様の方法で使用できる。
一実施形態では、本開示の細胞外小胞は、細菌細胞などの病原細胞からのものである。
細胞はさまざまなタイプのＥＶを分泌することができ、これらはそれらの細胞内起源に従って分類されている（Ｃｏｌｏｍｂｏら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ３０：２５５－２８９、２０１４）。起源とサイズの違いにもかかわらず、小胞サイズの重複とサブタイプ固有のマーカーの不在に起因して、均一なＥＶ命名法は存在しない。その結果、精製し、それによって小胞のタイプを区別することは依然として困難である。例えば、文献において歴史的に使用されている最も人気のあるエキソソーム精製プロトコル（示差超遠心分離、２２０ｎｍ濾過（Ｔｈｅｒｙら、Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｉｌ Ｃｈａｐｔｅｒ ３、Ｕｎｉｔ ３．２２、２００６）－市販キットで最近市場に出た－様々な種類のＥＶの共分離（概説、ＴｋａｃｈおよびＴｈｉｅｒｙ、Ｃｅｌｌ １６４：１２２６－１２３２、２０１６）。したがって、「エキソソーム」のような用語は、一般に、小型ＥＶの混合集団を指し、したがって、本発明では、本発明者らは、すべての小胞サブタイプを指すように総称用語ＥＶを使用することを選択した。
一般に、細胞外小胞は、セラミド、コレステロール、ホスホグリセリド、およびスフィンゴ脂質を含む脂質二重層を含む（Ｓｕｂｒａら、２０１０、Ｔｒａｊｋｏｖｉｃら、２００８、Ｖｌａｓｓｏｖら、２０１２）。
すべての細胞外小胞は、それらが受容細胞に標的されることを可能にする表面分子を担持しており、一連の手段（例えば、エンドサイトーシスおよび／または食作用、融合など）を介してその内容物を細胞質ゾルにシグナル伝達および／または送達し、それにより受容細胞の生理的状態を変更する。それらはタンパク質、脂質、遺伝物質の天然の送達媒体であるため、それらは、画像化、診断のため、および／または治療用キャリアとしての使用のための一連の疾患適応症にわたって積極的に探求されている独特のバイオベクターである（概説、Ｒｕｆｉｎｏ－Ｒａｍｏｓら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ２６２：２４７－２５８、２０１７、Ｖａｄｅｒら、Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ １０６：１４８－１５６、２０１６、Ｓｕｔａｒｉａら、Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．３４：１０５３－１０６６、２０１７、Ｉｎｇａｔｏら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ２４１：１７４－１８５、２０１６）。
一実施形態では、細胞外小胞は、エキソソームである。エキソソームは、一般に直径３０～１００ｎｍなどの３０～１５０ｎｍの範囲であり、例えば、トランスフェリン、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ６１、ＣＤ８１、ＴＳＧ１０１、ＬＡＭＰＳおよびＡｌｉｘから選択される１つ以上の表面マーカーを有してもよい。
１つでは、細胞外小胞はマイクロベシクル（微小粒子とも呼ばれる）であり、内皮微小粒子を含む。一般に、マイクロベシクルは５０～２０００ｎｍの範囲の直径を有し、例えばＶＣＡＭＰ３およびＡＲＦ６から選択される１つ以上の表面マーカーを有してもよい。循環内皮微粒子は正常な人の血液中に見出されるが、高血圧および心血管障害、ならびに妊娠高血圧腎症および様々な形態の血管炎を含む特定の疾患を有する人では、循環内皮微粒子の数が増加していることが確認されている。これらの疾患状態のいくつかにおける内皮微粒子は、内皮機能不全の状態を反映する一連の細胞表面分子を有することが示されている。したがって、内皮微粒子は、疾患における内皮の機能状態の指示または指標として有用である可能性があり、関節リウマチを含む特定の疾患の病因に潜在的に重要な役割を果たし得る。
一実施形態では、細胞外小胞は、エクトソームである。一般に、エクトソームは、３５０～４００ｎｍなどの１００～１０００ｎｍの範囲の直径を有し、例えば、ＴｙＡおよびＣ１ａから選択される１つ以上の表面マーカーを有してもよい。
一実施形態では、小胞は、石灰化した細胞外小胞である。これらの小胞は、アテローム硬化性プラーク内の細胞から放出される。最近、マクロファージおよび平滑筋細胞（ＳＭＣ）に由来する石灰化ＥＶが、血管石灰化におけるそれらの役割についてより多くの注目を集めている。これらの小胞は、心血管系の罹患率および死亡率の主要な予測因子である血管石灰化の媒介に役割を果たすと考えられている。
一実施形態では、細胞外小胞は、マトリックス小胞である。本明細書で言及されるマトリックス小胞は、骨の発達に関与し、骨芽細胞由来の小胞は、発達中の骨のコラーゲン線維に沿ってヒドロキシアパタイト結晶を核形成する。それらはまた、アテローム硬化性プラーク線維性キャップ内の微小石灰化の形成のための核形成の焦点として働き、プラークの不安定性、破裂、およびその後の心筋梗塞および脳卒中を引き起こす。
一実施形態では、細胞外小胞は、プロスタソームである。本明細書で使用されるとき、プロスタソームは、前立腺により上皮細胞から精液に分泌される小胞を指す。通常、それらは、直径は４０～５００ｎｍの範囲である。それらは、異常な脂質組成と、脂質ラフトに似たリポタンパク質膜の緊密で高度に秩序立った構造を持っている。プロスタソームの生理的役割は、精子の運動性の改善と、卵へと向かう経路中の女性の免疫防御からの攻撃に対する保護に関係している。調査により、癌性前立腺細胞および低分化の前立腺細胞がプロスタソームを産生および分泌し続けることが示されている。高齢男性における前立腺癌の高い発生率は、プロスタソームによって支持されている免疫保護活動を利用することができる。プロスタソームで見出される免疫調節タンパク質には、アミノペプチダーゼＮ（ＣＤ１３）；ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＣＤ２６）；エンケファリナーゼ（中性エンドペプチダーゼ、ＣＤ１０）；アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ、ＣＤ１４３）；組織因子ＴＦ（ＣＤ１４２、トロンボプラスチン）；腐敗加速因子（ｄｅｃａｙ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）（ＣＤ５５）；プロテクチン（ＣＤ５９、ＭＡＣの阻害剤）、および補体調節膜補因子タンパク質（ＣＤ４６）が含まれる。プロスタソームには、高レベルの２価カチオン、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋も含まれている。
一実施形態では、細胞外小胞は、オンコソームである。本明細書で使用されるとき、オンコソームは、直径１μｍ～１０μｍの範囲の大きな細胞外小胞を指す。脳腫瘍の文脈では、神経膠腫細胞から放出され、受容体の変異型であるＥＧＦＲｖＩＩＩを発現するＥＶの存在。これらの小胞は、腫瘍タンパク質ＥＧＦＲｖＩＩＩをこの受容体を欠く腫瘍細胞の膜に移すことができ、したがって腫瘍促進物質を増殖させ、形質転換を誘導することが示された。Ｃａｖ－１陽性の大きなオンコソームは、去勢抵抗性および転移性疾患の患者から局所的に限局した前立腺癌の患者を区別することが示されている。
一実施形態では、細胞外粒子は、レトロウイルス様粒子である。これらは、一般に、７５～１００ｎｍの範囲の直径を持ち、表面マーカーＧａｇを有し得る。
一実施形態では、細胞外小胞は、細菌細胞外小胞である。これらの小胞の直径は、一般に、１０～３００ｎｍの範囲であり、それらの表面にＰＡＭＰを有し得る。
一実施形態では、細胞外小胞は、腔内小胞である。本明細書で使用されるとき、これは細胞内の小胞を指す。
逆融合は、多小胞体または後期エンドソーム内の内部（管腔内）小胞とエンドソームの制限膜との融合である。このプロセスは、リゾビホスファチジン酸（ＬＢＰＡ）、ホスファチジルイノシトール－３－リン酸、Ａｌｉｘ、および酸性ｐＨへの明らかな依存によって媒介されると考えられている。ＭＨＣクラス２およびその他のタンパク質（ＣＤ６３およびＭＰＲ）は、このようなプロセスを利用して、細胞質ゾル内の場所に効率的に輸送され、原形質膜に戻る。ただし、病原体はこの機序を利用して、細胞の細胞質ゾルに効率的に侵入する（ＶＳＶ、炭疽菌など）。エンドソームと細胞小器官の間の細胞内での通常の融合とは異なり、逆融合には、融合するために内部小胞と外膜の細胞質外弁尖が必要であり、これは精子－卵融合と同様である。
一実施形態では、細胞外小胞はアポトーシス小体である。本明細書で使用されるアポトーシス小体は、一般に、５００～４０００ｎｍなどの５００～５，０００ｎｍの範囲の直径を有し、プログラムされた細胞死を受けている細胞によって放出される。
幹細胞およびマーカー
一実施形態では、本開示による細胞外小胞は、幹細胞由来である。
一実施形態では、幹細胞は、胚性幹細胞である。一実施形態では、細胞は、胚性幹細胞ではない。
１つでは、幹細胞は成体幹細胞であり、例えば、前駆細胞、造血幹細胞、筋原性幹細胞、骨前駆幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、例えば、サテライト細胞、放射状グリア細胞、骨髄間質細胞、骨膜、膵臓前駆細胞、内皮前駆細胞、芽球細胞、および栄養芽幹細胞を含む。
一実施形態では、幹細胞は、癌幹細胞である。
一実施形態では、この方法は、哺乳動物幹細胞、例えば、ヒト幹細胞に関する。本明細書で議論される幹細胞は、初代ヒト幹細胞である。しかし、当業者は、必要に応じて、他の哺乳動物に関連するまたは対応する幹細胞集団を特定することができる。例えば、ＳＳＥＡ－１は、マウス胚性幹細胞、ヒト生殖系細胞、および胚性癌性細胞のマーカーである；ＳＳＥＡ－３は、霊長類胚性幹細胞、ヒト胚性生殖系細胞、ヒト胚性幹細胞、および胎児性癌細胞のマーカーである；ＳＳＥＡ－４は、霊長類胚性幹細胞、ヒト胚性生殖細胞、ヒト幹細胞、胚性癌細胞のマーカーである；ＣＤ３２４は、ヒトおよびマウス胚性幹細胞、胚性癌細胞のマーカーである；ＣＤ９０は、ヒトおよびマウスの胚性幹細胞、造血幹細胞、胚性癌細胞のマーカーである；ＣＤ１１７は、ヒトおよびマウス胚性幹細胞、造血幹前駆細胞、神経堤由来メラニン細胞、始原生殖細胞、胚性癌細胞のマーカーである；ＣＤ３２６は、ヒトおよびマウス胚性幹細胞、胚性癌細胞；ＣＤ９は、ヒトおよびマウスの胚性幹のマーカーである；ＣＤ２４は、ヒトおよびマウスの胚性幹のマーカーである；ＣＤ２９は、ヒトおよびマウスの胚性幹のマーカーである；ＣＤ５９は、ヒトおよびマウスの胚性幹のマーカーである；ＣＤ１３３は、ヒトおよびマウスの胚性幹細胞、胚性癌細胞、造血幹細胞のマーカーである；ＣＤ３１は、ヒトおよびマウスの胚性幹のマーカーである；ＴＲＡ－１－６０は、ヒト胚性幹細胞、テラ癌腫（ｔｅｒａｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胚性生殖細胞、胚性癌細胞のマーカーである；ＴＲＡ－１－８１は、ヒト胚性幹細胞、テラ癌腫、胚性生殖細胞、胚性癌細胞のマーカーである；Ｆｒｉｚｚｌｅｄ５は、ヒトおよびマウスの胚性幹細胞のマーカーである；幹細胞因子（ＳＣＦ）は、ヒトおよび胚性幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胚性癌細胞のマーカーである；Ｃｒｉｐｔｏは、ヒトおよびマウスの胚性幹細胞、心筋細胞、および胚性癌細胞のマーカーである。
造血幹細胞（ＨＳＣ）または血球芽細胞は、造血の過程を通じて他のすべての血液細胞を生じさせる幹細胞である。それらは中胚葉に由来し、ほとんどの骨のコアに含まれる赤色骨髄にある。
本明細書で使用される癌幹細胞は、正常な幹細胞に関連する特性、特に特定の癌試料で見出されるすべての細胞型を生じさせる能力を有する腫瘍形成性細胞（すなわち、腫瘍または血液癌内で見出される癌細胞）を指す。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ、ＢｉｏｅｓｓａｙＳ ２００９ Ｏｃｔ；３１（１０）１０３８－１０４９を参照されたい。癌幹細胞は、３つの別個の特性により定義される：ｉ）腫瘍を開始し、新生物増殖を駆動するための選択的な能力と：ｉｉ）自己再生により自身のコピーを絶え間なく作り出す能力と、ｉｉｉ）分化によりより多くの非幹細胞癌子孫を生じる可能性。癌幹細胞は、健康な幹細胞に由来する必要はないが、分化した細胞に由来する場合がある。
ＣＤ３４は、造血前駆細胞抗原ＣＤ３４としても知られ、細胞間接着因子としての機能を有する。それは、幹集団を富化するためのマーカーとして使用できる。
幹細胞は、一般に、系統陽性表面マーカーに対して陰性であり（すなわち、Ｌｉｎ－ｖｅ）、例えば、幹細胞は、Ｌｉｎ－ｖｅ、ＣＤ３４＋ｖｅ、ＣＤ３８－ｖｅ、ＣＤ４５ＲＡ－ｖｅ、ＣＤ９０陽性、およびＣＤ４９ｆ＿＋ｖｅである。
造血幹細胞は、ＣＤ４８、ＣＤ１５０、ＣＤ２４４、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＳＣＡ－１、Ｔｈｙ１．１、Ｃ－キット、ｌｉｎ、ＣＤ１３５、ｓｌａｍ１／ＣＤ１５０、Ｍａｃ－１（ＣＤ１１ｂ）、ＣＤ４、幹細胞因子（ＳＣＦ）、およびこれらの２つ以上の組み合わせからの表面マーカーを発現してもよい。
骨前駆細胞は、グレムリン－１、ＴＧＦ－ベータ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ－２、ＡＬＰＰ、ＭＣＡＭ、コラーゲンＩ、コラーゲン１アルファ１、コラーゲンＩＩ、ＲＵＮＸ２、デコリン、およびこれらの２つ以上の組み合わせ（前述のすべてのマーカーなど）から選択される表面マーカーを発現し得る。
骨芽細胞またはその前駆細胞は、Ｒｕｎｘ２、アルカリホスファターゼ／ＡＬＰＰ／ＡＬＰＩ、オステオカルシン、ＢＡＰ１、ＯＰＮ、ＢＡＰ３１、コラーゲンＩ、ＳＣＵＢＥ３、フィブロネクチン、ＳＰＡＲＣ、ＩＧＦＢＰ－３、およびこれらの２つ以上の組み合わせから選択される表面マーカーを発現し得る。
骨細胞またはその前駆細胞は、以下から選択される表面マーカーを発現し得る：
ｉ）ＴＧＦベータ、ＲＡＮＫＬ、ＭＣＳＦ、スクレロスチン、ＤＫＫ、および同様のもの（前述のすべてのマーカーなど）の２つ以上の組み合わせ、および／または
ｉｉ）Ｏｓｔｅｒｉｘ＋ｖｅ、ＣＤ９０＋ｖｅ、オステオカルシン＋ｖｅ、コラーゲンＩ＋ｖｅ、骨シアロプロテイン＋ｖｅ、およびこれらの２つ以上の組み合わせ（前述のすべてのマーカーなど）、および／または
ｉｉｉ）アルカリホスファターゼ／ＡＬＰＰ（アルカリホスファターゼ胎盤）／ＡＬＰＩ＋ｖｅ、コラーゲンＩ＋ｖｅ、コラーゲンＩＩ＋ｖｅ、デコリン＋ｖｅ、ＭＣＡＭ／ＣＤ１４６＋ｖｅ、ＭＥＰＥ／ＯＦ４５＋ｖｅ、ｏｓｔｅｒｉｘ＋ｖｅ、ＣＤ９０＋ｖｅ、ｏｓｔｅｒｉｘ／Ｓｐ７＋ｖｅ、ＲＵＮＸ２／ＣＢＦＡ１＋ｖｅ、トロンボポエチン／Ｔｐｏ＋ｖｅ、およびこれらの２つ以上の組み合わせ（前述のすべてのマーカーなど）。
筋原性幹細胞は、ＣＤ５６、ＣＤ１４６、ＶＥ－カドヘリン、アルファ－平滑筋アクチン、ＦＡＢＰ３、インテグリンアルファ７、デスミン、ミオシン重鎖、ＵＥＡ－１受容体、およびこれらの２つ以上の組み合わせ（前述のすべてのマーカーなど）から選択されるマーカーを発現し得る。
神経幹細胞は、以下から選択されるマーカーを発現し得る：
ｉ）ＣＤ１３３、ＣＤ１５、ＣＤ２４低または－ｖｅ、ＧＣＴＭ－２、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ネスチン、Ｓｏｘ－２、ＡＢＣＧ２、ＦＧＦ Ｒ４、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ－９、およびこれらの２つ以上の組み合わせ（前述のすべてのマーカーなど）、および／または
ｉｉ）ＣＤ２４マーカーは、低または－ｖｅであり、および／または
ｉｉｉ）ＣＤ１３３＋ｖｅ、５Ｅ１２＋ｖｅ、ＣＤ３４－ｖｅ、ＣＤ４５－ｖｅ、およびＣＤ２４低または－ｖｅのマーカーの組み合わせ。
間葉系幹細胞は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ２７１、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ２４０、ｆｒｉｚｚｌｅｄ－９、ＣＤ２９、ＣＤ９０、ＣＤ１４６、ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ４、ＳＴＲＯ－１、幹細胞因子（ＳＣＦ）、およびこれらの２つ以上の組み合わせから選択された表面マーカーを発現してもよい。
脂肪由来の幹細胞は、以下から選択される表面マーカーを発現し得る：
ｉ）Ｋ１５、ＣＤ３４、ネスリン、フォリスタチン、ｐ６３、インテグリンアルファ６、ティーシンＣ、ＥＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ｆｒｉｚｚｌｅｄ因子、および／またはこれらの２つ以上の組み合わせ、および／または
ｉ）ｉＣＤ４４、ＩＣＡＭ／ＣＤ５４、ＣＤ３４、インテグリンファミリーメンバー、およびそれらの２つ以上の組み合わせ。
卵巣および卵管上皮幹細胞からの幹細胞は、グレムリン１、Ｌｒｉｇ１、Ｌｇｒ５、Ｂｍｉ１、Ｔｅｒｔ、ＨｏｐＸ、およびそれらの２つ以上の組み合わせから選択される表面マーカーを発現してもよい。
胚性幹細胞は、ＣＤ２４、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ３２４、ＣＤ３２６、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ｆｒｉｚｚｌｅｄ５、幹細胞因子、ｃｒｙｐｔｏ（ＴＤＧＦ－１）から選択される１つ以上の表面マーカーを発現してもよい。
幹細胞からの細胞外小胞は、それらが由来する細胞からのマーカーに基づいて同定され得る。
その他の定義
本明細書で使用されるとき、ペイロードは、特に小胞への送達のための、ＧＬＡドメインに連結された分子を指す。ペイロードは、薬物、毒素、化学療法薬、ポリマー、生物活性タンパク質、ペプチド（安定なペプチドなど）、ポリヌクレオチド（例えば、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉなどを含み、モレキュラービーコンを含むＤＮＡおよびＲＮＡ）放射性核種、金属キレート剤、腫瘍溶解性ウイルス、ウイルスベクター、標識および／またはレポーター基を含んでもよい。本明細書で使用されるとき、連結されたとは、融合タンパク質（例えば、アミド結合を使用する）または化学的コンジュゲーション（例えば、マレイミド化学、クリック化学など）を含む、ペイロードをＧＬＡドメインに関連付ける任意の手段を指す。ペイロードはまた、細胞外小胞の内部に送達される物質を指すために使用されてもよく、その物質はＧＬＡ成分に連結されていない。
ＧＬＡドメインは、ホスファチジルセリン（ＰＳ）の露出を利用して、選択した細胞を標的として、そこへ接近する独特の検出および送達プラットフォームである。ホスファチジルセリンは、アポトーシス細胞の認識および貪食のための主要なシグナルである。アポトーシスは進化的に保存され、厳密に制御された細胞死のモダリティである（Ｐｏｏｎ ＩＫら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４：１６６－１８０、２０１４）。アポトーシス細胞の貪食および摂取は、エフェロサイトーシスとして知られており、これは、膜の完全性が失われ炎症性内容物が放出される前にアポトーシス細胞を即座かつ効果的に除去し、それによりアポトーシスの有害な炎症効果を相殺するように機能する。ＰＳ発現は、ＴＬＲ誘導およびサイトカイン誘導シグナル伝達カスケードと免疫原性ＤＣ成熟を阻害するように作用する（Ｐｏｏｎ ＩＫら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４：１６６－１８０、２０１４、Ｂｉｒｇｅ ＲＢ Ｃｅｌｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ ２３：９６２－９７８、２０１６）。その結果、生理学的条件下では、外在化ホスファチジルセリンは、耐性を促進し、局所および全身の免疫活性化を妨げる、優先的かつ進化的に保存された免疫抑制シグナルとして機能する。病理学的には、ホスファチジルセリンの生来の免疫抑制効果は、感染を促進し、多くの場合、潜伏を確立するために、多数のウイルス、他の微生物、および寄生虫によって乗っ取られた（Ｂｉｒｇｅ ＲＢら、Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ ２３：９６２－９７８、２０１６、Ａｍａｒａ ＡおよびＭｅｒｃｅｒ Ｊ、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １３：４６１－４６９、２０１５、Ｍｏｌｌｅｒ－Ｔａｎｋ、Ｓ ａｎｄ Ｍａｕｒｙ Ｗ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４６８－４７０：５６５－５８０、２０１４）。ホスファチジルセリンは腫瘍微小環境で調節不全であり、腫瘍免疫の発達に拮抗し、癌との戦いの初期診断としてホスファチジルセリン発現エキソソームが現在探索されている（Ｂｉｒｇｅ ＲＢら、Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆ．２３：９６２－９７８、２０１６、Ｌｅａら、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ８：１４３９５－１４４０７、２０１７、Ｌｉ ＸおよびＷａｎｇ Ｘ、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ １６：９２、２０１７）。理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、すべてのホスファチジルセリンが生物学的観点から同等であるとは考えていない。本発明者らは、酵素ＴＭＥＭ１６Ｆによるホスファチジルセリン露出は、免疫抑制に関与し、本開示の分子によって「見られる」ものであると考えている。
本明細書で使用されるとき、腫瘍溶解性ウイルスは、以下のウイルスを指す：
●優先的に癌細胞に感染して殺傷するウイルス、または
●癌細胞で選択的に複製するウイルス（例えば、それらの複製は癌細胞で上方制御される遺伝子（ｐ５３など）に依存しているため）。
本明細書で使用されるウイルスベクターは、一般に、トランスジーンをコードする複製欠損ウイルスを指す。
本明細書で使用されるとき、インビトロは、ヒトまたは動物の身体で行われない実験室作業を指す。
本明細書で使用されるとき、インビボは、生きている生物、特に、ヒトまたは動物における作業／試験／治療を指す。
本明細書で使用される分子は、最も広い意味で使用され、合成化学分子だけでなく、タンパク質、ポリマー（天然またはその他）、リボ核酸分子、標識などの高分子も含む。
モレキュラービーコンは、均質な溶液中の特定の核酸の存在を報告することができるオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブである。それらは、標的核酸配列に結合すると蛍光が回復する内部消光フルオロフォアを持つヘアピン型分子である。
本明細書で使用されるステープルペプチドは、合成ブレースによって保持される複数のタンデムペプチドを指し、これはペプチドの薬理学的性能を高めることを意図している。
本明細書で使用される薬物は、文脈が別のことを示さない限り、例えば、有機化学法により合成された小さな化学物質、特に、承認または認可された分子、または特に人間での治療用途のために認可の過程にある分子を指すことが意図される。本明細書で使用される薬物には、抗ウイルス化合物、抗生物質、および抗癌療法が含まれる。
本明細書で使用される抗ウイルス化合物（抗ウイルス剤）は、広域スペクトル抗ウイルス剤、および特定のウイルスまたは特定のウイルスファミリーに特異的な「狭い」スペクトルのものを含む、ウイルス感染の治療に特に使用される薬剤のクラスを指す。
本明細書で使用される抗生物質は、細菌の増殖を阻害するか、細菌を破壊する医薬または薬剤を指す。抗菌剤および抗生物質は、文脈で特に指示がない限り、本明細書では交換可能に使用される。
本明細書で使用される抗寄生虫は、寄生虫の成長を阻害するか、寄生虫を破壊するか、または宿主から寄生虫を除去する医薬または薬剤を指す。
抗癌療法は、抗癌薬、化学療法、放射線療法、免疫腫瘍療法などを含む広義の用語である。
本明細書で使用される抗癌薬は、一般に小分子癌療法を指す。
本明細書における化学療法は、一般的に細胞傷害剤を指し、抗腫瘍薬を含む。
生物学的治療薬（生物製剤、生物学的薬剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、または生物学的製剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃ）とも呼ばれる）は、生物学的起源、例えば、抗体、抗体結合断片、および多重特異性抗体分子、ポリヌクレオチド、治療用ウイルス、腫瘍溶解性ウイルス、ウイルスベクター、およびそのような材料の複雑な組み合わせを含む抗体分子を含む、組換えタンパク質および断片に「由来する」治療用製品である。生物学的に活性なタンパク質は、生物学的治療薬の下位群であり、組換えタンパク質およびその活性断片（抗体分子を含む）が含まれる。
本明細書で使用される抗体分子には、全長重鎖および軽鎖を有する完全抗体、またはその断片、およびそれらのいずれか１つを含む分子、例えば、Ｆａｂ、改変Ｆａｂ、Ｆａｂ’、改変Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆａｂ－Ｆｖ、Ｆａｂ－ｄｓＦｖ、シングルドメイン抗体（例えば、ＶＨもしくはＶＬもしくはＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、細胞内抗体、２価、３価、または４価抗体、２価ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、および前述のもののいずれかのエピトープ結合断片（例えば、ＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ、２００５、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１２６－１１３６；ＡｄａｉｒおよびＬａｗｓｏｎ、２００５、Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ－Ｏｎｌｉｎｅ ２（３）、２０９－２１７を参照されたい）が含まれる。これらの抗体断片を生成および産生するための方法は当技術分野において周知である（例えば、Ｖｅｒｍａら、１９９８、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１６、１６５～１８１を参照のこと）。本発明で使用するための他の抗体断片には、ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０およびＷＯ２００５／００３１７１に記載されているＦａｂおよびＦａｂ’断片が含まれる。多価抗体は、複数の特異性、例えば二重特異性を含んでもよく、または単一特異性でもよい（例えば、ＷＯ９２／２２８５３およびＷＯ０５／１１３６０５を参照されたい）。２つの独立した標的タンパク質を中和することが目的であるため、この例では、二重特異性および多重特異性抗体バリアントが特に考慮される。本明細書に開示される抗体からの可変領域は、２つの標的抗原に結合して中和することができる単一の抗体バリアントを産生するように構成され得る。
抗体およびその結合断片、特に、ドメイン抗体、ＶＨＨ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｄｓ－ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、および細胞内抗体などの小さな抗体断片は、本技術を使用して細胞内に送達され得る。
一実施形態では、抗体分子は、ヒトのものまたはヒト化されたものである。
毒素は、特に天然源、特にタンパク質に由来する有毒物質である。カリケアマイシンなどの多くの毒素は、癌治療に使用される。さらに、化学療法薬は、毒性（または毒素）とみなすことができる。したがって、毒素の定義は、本明細書の他の定義と重複している。しかし、ヘビ毒のような神経毒は毒素であるが、化学療法薬ではない。しかし、当業者はこれらの技術的定義に精通しており、本開示の文脈の意味を理解することができる。
本明細書で使用される診断薬は、疾患状態を診断、監視、または理解するための分析または画像化で使用される薬剤である。診断薬は、一般に、何らかの方法で視覚化、測定、または監視できる標識などのレポーター分子で構成される。
本開示の使用に適した放射性核種には、タリウム－２０１、テクネチウム－９９ｍ、ヨウ素－１２３、ヨウ素１３１、ヨウ素－１２５、フッ素－１８、および酸素－１５が含まれる。
本明細書で使用される異常な細胞または病原性細胞は、正常な健康な細胞とは異なる細胞、特に、マーカー（複数可）の変異または上方制御を有する細胞、例えば、状態または疾患の素因または発症に関連付けられる異常さ、状態または疾患に関連付けられる異常さを有する細胞、例えば、前癌細胞、癌、病原体感染細胞、鎌状赤血球貧血または同様のものに関連する。
本明細書で使用されるアポトーシスは、細胞死への経路であり、これは、生物の成長の正常かつ制御された部分として生じる。アポトーシスによる細胞死は、壊死などの細胞死機序よりも周囲の組織への損傷が少ない。
本明細書で使用される壊死は、疾患または損傷による細胞死である。それは、サイトカインおよび因子を周囲の組織に放出し、周囲の細胞に損傷を与える可能性がある。壊疽は、壊死性細胞死の一例である。
化学療法剤
化学療法剤および化学療法剤または細胞毒性剤は、文脈がそうではないことを示さない限り、本明細書で互換的に使用される。
本明細書で使用される化学療法は、悪性細胞および組織を「選択的に」破壊する特定の抗新生物化学薬剤または薬物、例えば、アルキル化剤、チミジル酸シンターゼ阻害剤を含む代謝拮抗剤、アントラサイクリン、植物アルカロイドを含む抗微小管剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ｐａｒｐ阻害剤、および他の抗腫瘍剤を指す。もちろん、これらの剤の多くには深刻な副作用があるため、この文脈では選択的に大まかに使用される。
好ましい用量は、治療されている癌の性質に基づいて、担当医によって選択され得る。
本開示の方法で使用され得るアルキル化剤の例には、アルキル化剤、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、テトラジン、アジリジン、プラチンおよび誘導体、ならびに非古典的アルキル化剤が含まれる。
例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、ピコプラチン、ネダプラチン、トリプラチンおよびリポプラチン（シスプラチンのリポソーム版）、特にシスプラチン、カルボプラチンおよびオキサリプラチンなどの白金含有化学療法剤（プラチンとも呼ばれる）。
シスプラチンの用量は、正確な癌に応じて、約２０～約２７０ｍｇ／ｍ２の範囲である。多くの場合、用量は約７０～約１００ｍｇ／ｍ２の範囲である。
ナイトロジェンマスタードには、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミド、およびブスルファンが含まれる。
ニトロソウレアには、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－メチル尿素（ＭＮＵ）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、およびセムスチン（ＭｅＣＣＮＵ）、フォテムスチン、およびストレプトゾトシンが含まれる。テトラジンには、ダカルバジン、ミトゾロミド、テモゾロミドが含まれる。
アジリジンには、チオテパ、マイトマイシン、およびジアジコン（ＡＺＱ）が含まれる。
本開示の方法で使用され得る代謝拮抗剤の例には、葉酸代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサートおよびペメトレキセド）、プリン類似体（例えば、チオプリン、例えば、アザチオプリン、メルカプトプリン、チオプリン、フルダラビン（リン酸塩形態を含む）、ペントスタチンおよびクラドリビン）、ピリミジン類似体（例えば、フルオロピリミジン、例えば、５－フルオロウラシル、それらのプロドラッグ、例えば、カペシタビン［Ｘｅｌｏｄａ（登録商標）］）、フロクスウリジン、ゲムシタビン、シタラビン、デシタビン、ラルチトレキセド（トムデックス）塩酸塩、クラドリビン、および６－アザウラシルが含まれる。本開示の方法で使用され得るアントラサイクリンの例には、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ダウノルビシン（リポソーム）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ドキソルビシン（リポソーム）、エピルビシン、イダルビシン、現在膀胱癌治療のみに使用されているバルルビシン、およびミトキサントロン、アントラサイクリン類似体、特にドキソルビシンが含まれる。
本開示の方法で使用され得る抗微小管剤の例には、ビンカアルカロイドおよびタキサンが含まれる。
ビンカアルカロイドには、ビンクリスチンおよびビンブラスチンなどの完全に天然の化学物質と、ビノレルビン、ビンデシン、およびビンフルニンなどの半合成ビンカアルカロイドが含まれる。
タキサンには、パクリタキセル、ドセタキセル、アブラキサン、カルバジタキセル、およびそれらの誘導体が含まれる。本明細書で使用されるタキサンの誘導体には、例えば、ミセル処方におけるタキソールのようなタキサンの再製剤化が含まれ、誘導体には、タキサンである出発物質を修飾するために合成化学が使用される化学誘導体も含まれる。
本開示の方法で使用され得るトポイソメラーゼ阻害剤には、Ｉ型トポイソメラーゼ阻害剤、ＩＩ型トポイソメラーゼ阻害剤、およびＩＩ型トポイソメラーゼ毒が含まれる。Ｉ型阻害剤には、トポテカン、イリノテカン、インドテカン、およびインジミテカンが含まれる。ＩＩ型阻害剤には、ゲニステインとＩＣＲＦ １９３が含まれ、ＩＣＲＦ１９３の構造は次のとおりである：
ＩＩ型の毒には、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシド、およびドキソルビシン、およびフルオロキノロンが含まれる。
一実施形態では、化学療法剤はＰＡＲＰ阻害剤である。
本開示におけるペイロードとして使用するのに適したウイルス
一実施形態では、本開示で使用されるウイルスは、例えば、ヘルペスウイルス（単純ヘルペス１型など）、ポックスウイルス（ワクシニアウイルスなど）、ヘパドナウイルス、フラビウイルス、トガウイルス、コロナウイルス、Ｄ型肝炎、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス（麻疹またはニューカッスル病ウイルスなど）、ラブドウイルス、ブニヤウイルス、フィロウイルス、およびラブドウイルス科（水疱性口内炎インディアナウイルス（ＶＳＶ）などから選択される、エンベロープ型ウイルスである。
一実施形態では、本開示で使用されるウイルスは、例えば、アデノウイルス科（アデノウイルスなど）、パピローマウイルス科、ピコルナウイルス科（コクサッキーウイルスまたはセネカバレーウイルス（例えば、セネカウイルス）など）、レオウイルスから選択される非エンベロープウイルスである。
一実施形態では、ウイルスは、グループＢウイルス（特に、Ａｄ３、Ａｄ７、Ａｄ１１、Ａｄ１４、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ５１、またはそれらのキメラ体、例えば、Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）、グループＣウイルス（特に、Ａｄ１、２、５、６、またはそれらのキメラ体）、グループＤウイルス（特に、Ａｄ８、Ａｄ１０、Ａｄ１３、Ａｄ１５、Ａｄ１７、Ａｄ１９、Ａｄ２０、Ａｄ２２、Ａｄ３０、Ａｄ３２、Ａｄ３３、Ａｄ３６、Ａｄ３７、Ａｄ３８、Ａｄ３９、Ａｄ４２、Ａｄ４３、Ａｄ４４、Ａｄ４５、Ａ４６、Ａｄ４７、Ａｄ４８、Ａｄ４９、Ａｄ５０、またはそれらのキメラ体）、グループＥウイルス（特に、Ａｄ４）、グループＦウイルス（特に、Ａｄ４０、Ａｄ４１、またはそれらのキメラ体）、ならびにグループＢ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、またはＦウイルスの２つ以上のキメラ体から選択されるアデノウイルス、例えば、ヒトアデノウイルスである。
ウイルスの大半は、標的細胞の認識および取り込みに関連するよく知られたタンパク質を有する。腫瘍溶解性ウイルスへのより選択的な腫瘍標的化をリダイレクトまたは可能にするためのそれらの指向性の変更は、概説、ＶｅｒｈｅｉｊｅおよびＲｏｔｔｉｅｒ、Ａｄｖ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０１２：７９８５２６、２０１２に記載されている方法を用いて導入されてもよい。
天然ウイルス標的化に関与しないさらなるウイルス細胞表面タンパク質には、標的化モチーフが組み込まれている場合がある（Ａｄ ｖｉｒｉｏｎ ｍｉｎｏｒ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ＩＸ Ｓａｌｉｓｃｈら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １２：ｅ０１７４７２８、２０１７）。
エンベロープウイルスには、ウイルスカプシドを覆う外膜（エンベロープ）がある。エンベロープは通常、宿主細胞膜（リン脂質およびタンパク質）の一部に由来するが、いくつかのウイルスタンパク質も含む。エンベロープの表面にある糖タンパク質は、宿主の膜上の受容体部位を特定して結合するのに役立つ。次に、ウイルスのエンベロープが宿主の膜と融合し、カプシドとウイルスのゲノムが宿主に侵入して感染することができる。
様々な腫瘍溶解性ウイルスがＷＯ２０１４／１３８３４に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、ｇＤがその受容体、ネクチン１およびＨＶＥＭの１つに結合することによってカスケード式に活性化される、４つの必須糖タンパク質、ｇＤ、ｇＨ／ｇＬ、ｇＢの手段によって細胞に進入する。ＨＳＶの再標的化は、リガンドおよびｓｃＦｖをｇＣおよび／またはｇＤタンパク質またはｇＨに挿入することにより達成された（Ｃａｍｐａｄｅｌｌｉ－Ｆｉｕｍｅ、Ｇら、Ｒｅｖ ｉｎ Ｍｅｄ Ｖｉｒｏｌ ２１：２１３－２２６、２０１１、Ｇａｔｔａ、Ｖ ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ １１：ｅ１００４９０７、２０１５）。腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス１型ベクターは、臨床使用のために開発された。これらのウイルスは複製能力があり、ウイルス複製、神経病原性、および免疫回避に影響する遺伝子に変異を有し、例えば、ＮＶ１０２０（Ｒ７０２０）、ｄｌｓｐｔｋ、ｄ１８．３６ｔｋ、ｈｒＲ３、Ｒ３６１６、１７１６などの第１世代、Ｇ２０７（ＭＧＨ－１）、３６１６ＵＢ、ＳＵＰ、ＮＶ１０２３などの第２世代のウイルス、Ｇ４７Δなどの第３世代ウイルス、Ｇ９２Ａ、ｄ１２．ＣＡＬＰ、Ｍｙｂ３４．５などの転写発現ベクター、ｒＲＰ４５０などのトランスジーン発現ベクター、およびタリモジーン・ラヘルパレプベック（Ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ）（Ｔ－Ｖｅｃ）などのその他のウイルスを含む。ＨＳＶ－１ベクターは、神経膠腫、黒色腫、乳癌、前立腺癌、結腸癌、卵巣癌、および膵臓癌などの広範な固形腫瘍の治療に役立つと考えられている。ＨＳＶ－１ウイルスは、広範な細胞型および種に感染し、生来細胞溶解性であり、ウイルスの複製生活環は、宿主細胞の破壊をもたらし、それは、十分に特徴付けられた大きなゲノム（１５２Ｋ）を持つが、治療遺伝子の挿入のために最大３０Ｋの空間を提供する必須ではない多数の遺伝子も含有する。一般に、ＨＳＶウイルスは、安全上の理由からチミジンキナーゼ遺伝子において変異されない。タリモジーン・ラヘルパレプベックは腫瘍溶解性ヘルペスウイルスであり、黒色腫の治療での使用が承認されている。その他のヘルペスに基づくウイルスには、Ｇ２０７、Ｖｉｒｔｔｕ ＢｉｏｌｏｇｉｃｓによるＳＥＰＲＥＨＶＩＲ（ＨＳＶ－１７１６）、ＨＳＶ－１ Ｒ３６１６変異体、ＨＳＶ－１ １７１６変異体、ＮＶ１０２０（Ｒ７０２０）、Ｒ３６１６変異体（欠失型ＲＬ１）、ＵＬ４８で挿入を有するＫＭ１００変異体（トランスアクチベーター外被タンパク質ｐＵＬ４８［ＶＰ１６］をコードする）、およびＲＬ２遺伝子、Ｇ９２Ａ、変異体、Ｍｙｂ３４．５、およびｒＱネスチン３４．５が含まれる。
改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）などのポックス－ワクシニアウイルスを使用できる（Ｇａｌｍｉｃｈｅ ＭＣら、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７８：３０１９－３０２７、１９９７）。ＭＶＡは、腫瘍関連抗原ＭＵＣ－１に対して指向された挿入ｓｃＦｖを有するｐ１４融合分子で置換されてもよい（Ｐａｕｌ、Ｓら、Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０：６６４－６７１、２００７）。概説、Ｌｉａｎｇ Ｌら、Ｖｉｒｕｓｅｓ ６：３７８７－３８０８、２０１４、Ｈｓｉａｏ ＪＣら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：８７５０－８７６１、１９９９、概説、Ｃｈｅｎ ＴＬおよびＲｏｆｆｌｅｒ Ｓ、Ｍｅｄ Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．２８：８８５－９２８、２００８、ならびにＫｉｎｏｓｈｉｔａ Ｔら、Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １４４：２８７－２９４、２００８も参照されたい。ＪｅｎｎｅｒｅｘによるＪＸ－５９４は、ＧＭ－ＣＳＦを付加し、チミジンキナーゼを削除した、ワクシニアウイルスとである。ＧＬ－ＯＮＣ１は、弱毒化ワクシニアウイルス（Ｌｉｓｔｅｒ株）であり、前臨床マウスモデルにおいて広範囲な固形腫瘍の退行および除去を引き起こす。
パラミクソウイルス（麻疹やニューカッスル病ウイルスなど）、
麻疹ウイルス（ＭｅＶ）は、パラミクソウイルス科のモルビリウイルス（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）属の一本鎖ネガティブセンスエンベロープ（非セグメント）ＲＮＡウイルスである。麻疹ウイルスは、２つのエンベロープ糖タンパク質、ヘマグルチニン（Ｈ）付着タンパク質、および融合（Ｆ）タンパク質を有する。付着、侵入、およびその後の細胞間融合は、２つの麻疹受容体、ＣＤ４６およびシグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）を介して媒介される。例えば、概説、Ｍｓａｏｕｅｌ Ｐら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７９７：１４１－１６２、２０１２、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＳおよびＧａｌａｎｉｓ、Ｅ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．１７：３５３－３６３、２０１７、Ａｒｅｆ Ｓら、Ｖｉｒｕｓｅｓ ８．Ｐｉｉ：Ｅ２９４、２０１６）；（概説、Ｃｈｅｎ ＴＬおよびＲｏｆｆｌｅｒ Ｓ、Ｍｅｄ Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．２８：８８５－９２８、２００８、ならびにＫｉｎｏｓｈｉｔａ Ｔら、Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １４４：２８７－２９４、２００８）、ならびに（Ｒｕｓｓｅｌｌ ＳＪおよびＰｅｎｇ ＫＷ、Ｃｕｒｒ Ｔｏｐｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ３３０：２１３－２４１、２００９、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ＳおよびＧａｌａｎｉｓ、Ｅ Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ １７：３５３－３６３、２０１７、Ａｒｅｆ Ｓら、Ｖｉｒｕｓｅｓ ８．Ｐｉｉ：Ｅ２９４、２０１６）を参照されたい。ヒト甲状腺ヨウ化ナトリウム共輸送体またはＭＶ－ＮＩＳをコードする麻疹ウイルスは、麻疹ウイルスの弱毒化した腫瘍溶解性エドモンストン（Ｅｄ）株である。放射性ヨウ素画像化は、ＮＩＳ遺伝子発現モニタリングのための新しい手法を提供する。
ニューカッスル病ウイルスも使用される場合がある。
アデノウイルス科アデノウイルスは、腫瘍溶解剤として使用されている最も広く研究されているウイルスの一つである。一連のペプチドおよびタンパク質が、ウイルスのネイティブなの天然の指向性を改変するために、ビリオン関連ウイルスタンパク質に組み込まれている（Ｖｅｒｈｅｉｊｅ ＭＨおよびＲｏｔｔｉｅｒ ＰＪＭ Ａｄｖ Ｖｉｒｏｌ ２０１２：７９８５２６、２０１２）。ただし、これらはすべて、核内のウイルスアセンブリに依存しているため、大きな課題がある。
その他の非エンベロープウイルスには、コクサッキーウイルス、ポリオウイルス、およびレオウイルスが含まれる。例えば、概説、Ａｌｔａｎ－Ｂｏｎｎｅｔ、Ｎ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３２：７７－８１、２０１６、およびＣｈｅｎ ＹＨら、Ｃｅｌｌ １６０：６１９－６３０、２０１５、概説、Ｃｈｅｎ ＴＬおよびＲｏｆｆｌｅｒ Ｓ、Ｍｅｄ Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．２８：８８５－９２８、２００８、およびＫｉｎｏｓｈｉｔａ Ｔら、Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １４４：２８７－２９４、２００８、および概説、Ｖｅｒｈｅｉｊｅ ＭＨおよびＲｏｔｔｉｅｒ ＰＪＭ Ａｄｖ Ｖｉｒｏｌ ２０１２：７９８５２６、２０１２）を参照されたい。
多数のアデノウイルスが存在し、例えば、前立腺癌の治療のために開始されたようなＡｄ５－ｙＣＤ／ｍｕｔＴＫＳＲ３９ｒｅｐ－ｈＩＬ１２、例えば、軟部組織肉腫の治療のためのＯｎｃｏｓ ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによるＣＧＴＧ－１０２（Ａｄ５／３－Ｄ２４－ＧＭＣＳＦ）、例えば、切除不能悪性胸膜中皮腫のための、オンコリン（Ｏｎｃｏｒｉｎｅ）（Ｈ１０１）、ＣＧ００７０、Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ（ＥｎＡｄ）ＷＯ２００５／１１８８２５、ＷＯ２００８／０８０００３で開示されたＯｖＡｄ１およびＯｖＡｄ２、ＯＮＣＯＳ－１０２、ならびに例えば、神経膠腫のためのＤＮＸ－２４０１である。
Ｃａｖａｔａｋは、悪性黒色腫の治療に役立つ野生型コクサッキーウイルスＡ２１の調製物に対する商品名である。セネカバレーウイルス（ＮＴＸ－０１０）および（ＳＶＶ－００１）、例えば、小細胞肺癌および神経芽細胞腫。
さまざまな癌および細胞増殖性疾患の治療などのために使用される、Ｒｅｏｖｉｒｕｓ－Ｒｅｏｌｙｓｉｎ（登録商標）（ｐｅｌａｒｅｏｒｅｐ、野生型レオウイルス、血清型３デアリング、Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）ＶＳＶは、腫瘍溶解剤として探索されているもう１つのエンベロープウイルスである。例えば、Ｂｅｔａｎｃｏｕｒｔ Ｄら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８９：１１７８６－１１８００、２０１５）、および概説、Ｈａｓｔｉｅ ＥおよびＧｒｄｚｅｌｉｓｈｖｉｌｉ ＶＺ Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ９３：２５２９－２５４５、２０１２）を参照されたい。
ウイルスによってコードされたタンパク質
一実施形態では、本開示の方法で使用されるウイルスまたはベクターは、トランスジーンを含み、この場合、例えば、トランスジーンは、細胞内の欠損遺伝物質を置換し、細胞に新しいまたは増強された機能を提供し、細胞を治療に対して感作させ、細胞内の機能を遮断し、または治療用タンパク質またはペプチドを発現させる。一実施形態では、本開示によるペイロードとして使用されるウイルスは、例えば、ＲＮＡｉ配列、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド（例えば、抗体分子またはその結合断片、ケモカイン、サイトカイン、免疫調節剤、蛍光タグまたは酵素）から独立して選択される物質をコードするトランスジーン（複数可）を含む。
これには、前臨床的可能性が示されているが、効果的かつ経済的な送達手段が欠けている独特のフォーマット、例えば、ペプチド、細胞内抗体、代替骨格などが含まれるが、これらに限定されず（概説、Ｂｏｌｄｉｃｋｅ Ｔ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ ２６：９２５－９４５、２０１７、ＭａｒｓｃｈａｌｌおよびＤｕｂｅｌ、Ｃｏｍｐｕｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊ １４：３０４－３０８、２０１６、ＭｉｅｒｓｃｈおよびＳｉｄｈｕ Ｆ１０００Ｒｅｓ ５．ｐｉｉ．Ｆ１０００ Ｆａｃｕｌｔｙ Ｒｅｖ．１９４７、２０１６、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｔｓｏｍａｉａ Ｅｕｒ Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ９４：４５９－４７０、２０１５、Ｍａｒｓｃｈａｌｌ ＡＬＪら、Ｍａｂｓ ７：１０１０－１０３５、２０１５、ＡｌＤｅｇｈａｉｔｈｅｒ Ｄら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５５：Ｓ４－Ｓ２０ら、２０１５）））、ならびに、腫瘍細胞、腫瘍幹細胞、腫瘍関連内皮、腫瘍関連間質に対して治療効果のある薬剤が含まれる。特に興味深いのは、例えば、治療薬、バイオマーカー、診断薬などの複数の機能を果たし得る分子である。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）遺伝子は、臨床的に承認されたプロドラッグ（ガンシクロビルＧＣＶ）を伴う確立されたプロドラッグ変換酵素である。例えば、Ｈｏｌｄｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３４７５－３４８５、１９９３、Ｔｏｕｒａｉｎｅ ＲＬら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：１７０５－１７１１、１９９８を参照されたい。
さらに、治療の過程中のウイルス療法の活性を画像化し追跡するために、チミジンキナーゼタンパク質の発現を利用することもできる。陽電子放射断層撮影法および単一光子放射コンピューター断層撮影法はどちらも、癌および癌治療の検出および監視のために日常的に使用される方法であり、適切なチミジンキナーゼ基質が投与されたときにチミジンキナーゼタンパク質の発現を検出するための実行可能な手段である（Ｗａｎｇ ＪＱら、Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １３：５４９－５５６、２００５、Ｔｊｕｖａｊｅｖ ＪＧら、Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ ４３：１０７２－１０８３、２００２）。あるいは、ＴＫなどのように、腫瘍溶解性ウイルスにおける診断および治療目的のための剤として、ＮＩＳ遺伝子を使用することができる（Ｍｉｌｌｅｒ ＡおよびＲｕｓｓｅｌｌ Ｓ Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ １６：１５－３２、２０１６、Ｒａｖｅｒａ Ｓら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ ７９：２６１－２８９、２０１７、Ｐｏｒｔｕｌａｎｏら、Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｖ．３５：１０６－１４９、２０１４）．。
一実施形態では、ＲＡＳまたはＲＡＳシグナル伝達経路内のタンパク質と相互作用して阻害する抗体は、本開示のウイルスにおいて、例えばＧＬＡ成分との融合タンパク質としてコードされる。ＲＡＳ遺伝子は、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、およびＫＲＡＳを含む多重遺伝子ファミリーを構成する。例えば、Ｂｏｓ ＪＬ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４９：４６８２－４６８９、１９８９；およびＣｅｔｉｎ Ｍら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４２９：５６２－５７３、２０１７を参照されたい。
標識
一実施形態では、ペイロードは、蛍光標識、化学発光標識、放射標識、酵素、色素、またはリガンドを含む。
本開示に従う標識は、アッセイを使用して検出され得る任意の部分として定義される。レポーター分子の非限定的な例には、酵素、放射標識、ハプテン、蛍光標識、燐光分子、化学発光分子、発色団、光親和性分子、着色粒子、またはビオチンなどのリガンドが含まれる。本明細書で使用される標識は、タグ、例えば、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグなども含む。標識には、アビジンの基質であるビオチンが含まれる。
標識は、コンジュゲーションまたは融合によってＧＬＡ成分に連結できる。標識は、唯一のペイロードであるか、治療用ペイロードなどの別の部分に追加される。
標識コンジュゲートは、診断薬としての使用に適している。診断薬は、インビトロ診断で使用するものと、一般に、「ダイレクトイメージング」として知られるインビボ診断プロトコルで使用するものとの、一般に２つのクラスに分類される。ペプチドおよびポリペプチドへのそれらの付着方法と同様に、多くの適切な造影剤が当技術分野で知られている（例えば、米国特許第５，０２１，２３６号、同第４，９３８，９４８号および同第４，４７２，５０９号を参照されたい）。使用される画像化部分は、常磁性イオン、放射性同位体、蛍光色素、ＮＭＲ検出可能物質、およびＸ線造影剤である。
常磁性イオンの場合、例として、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、および／またはエルビウム（ＩＩＩ）などのイオンが言及されてもよく、ガドリニウムが特に好ましい。Ｘ線画像化などの他の状況で有用なイオンには、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）、特にビスマス（ＩＩＩ）が含まれるが、これらに限定されない。
治療的および／または診断用途のための放射性同位体の場合には、アスタチン２１１、１４炭素、５１クロム、３６塩素、５７コバルト、５８コバルト、銅６７、１５２Ｅｕ、ガリウム６７、３水素、ヨウ素１２３、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１、インジウム１１１、５９鉄、３２リン、レニウム１８６、レニウム１８８、７５セレン、３５硫黄、テクネチウム９９ｍおよび／またはイットリウム９０が言及されてもよい。１２５Ｉは、特定の実施形態での使用に適しており、テクニシウム９９ｍおよび／またはインジウム１１１は、それらの低エネルギーおよび長い検出範囲に対する適合性のために特に適している。放射性標識されたペプチドおよびポリペプチドは、当該分野で周知の方法に従って産生され得る。例えば、ペプチドおよびポリペプチドは、ヨウ化ナトリウムおよび／またはカリウム、および次亜塩素酸ナトリウムなどの化学酸化剤、またはラクトペルオキシダーゼなどの酵素酸化剤との接触によりヨウ素化されることができる。リガンド交換プロセスにより、テクネチウム９９ｍでペプチドを標識でき、例えば、過テクネチナートを第一スズ溶液で還元し、還元されたテクネチウムをＳｅｐｈａｄｅｘカラム上にキレート化し、ペプチドをこのカラムに適用することができる。あるいは、例えば、過テクネート、ＳＮＣｌ２などの還元剤、フタル酸ナトリウムカリウム溶液などの緩衝液、およびペプチドをインキュベートすることにより、直接的な標識技術が使用されてもよい。金属イオンとして存在する放射性同位体をペプチドに結合するためにしばしば使用される中間官能基は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。
ペイロードとしての使用に適した蛍光標識には、アレクサ３５０、アレクサ４３０、ＡＭＣＡ、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ－Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＲＸ、カスケードブルー、Ｃｙ３、Ｃｙ５，６－ＦＡＭ、フルオレセインイソチオシアネート、ＨＥＸ、６－ＪＯＥ、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー、ＲＥＧ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、レノグラフィン（Ｒｅｎｏｇｒａｐｈｉｎ）、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、テトラメチルローダミン、および／またはテキサスレッドが含まれる。
別のタイプのペイロードは、インビトロでの使用に適したものであり、ペプチドが二次結合リガンド、および／または発色基質との接触時に着色生成物を生成する酵素（酵素タグ）に結合しているものである。適切な酵素の例には、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、（セイヨウワサビ）水素ペルオキシダーゼ、またはグルコースオキシダーゼが含まれる。適切な二次結合リガンドは、ビオチンおよびアビジンおよびストレプトアビジン化合物である。そのような標識の使用は、当業者に周知であり、例えば、米国特許第３，８１７，８３７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９３９，３５０号、同第３，９９６，３４５号、同第４，２７７，４３７号、同第４，２７５，１４９号および同第４，３６６，２４１号に記載されている。
ペプチドをその「共役パートナー」に連結するための付着のための他の方法は、当技術分野で知られている。いくつかの付着方法は、例えば、有機キレート化剤、例えば、ジエチレントリアミンペンタ酢酸無水物（ＤＴＰＡ）；エチレントリアミン四酢酸；Ｎ－クロロ－ｐ－トルエンスルホンアミド；および／または抗体に結合したテトラクロロ－３α－６α－ジフェニルグリコリル－３（米国特許第４，４７２，５０９号および同第４，９３８，９４８号）を用いる金属キレート錯体の使用である。ペプチドまたはポリペプチドは、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩などのカップリング剤の存在下で酵素と反応させてもよい。フルオレセインマーカーとのコンジュゲートは、これらのカップリング剤の存在下で、またはイソチオシアネートとの反応により調製される。
一実施形態では、標識は、幹細胞の核を染色または標識することができる。
併用療法
一実施形態では、使用される化学療法剤の組み合わせは、例えば、プラチンと５－ＦＵまたはそのプロドラッグ、例えば、シスプラチンまたはオキサプラチンとカペシタビンまたはゲムシタビン、例えばＦＯＬＦＯＸである。
一実施形態では、化学療法は、化学療法剤、特に、細胞毒性化学療法剤の組み合わせを含む。
一実施形態では、化学療法の組み合わせは、シスプラチンなどのプラチン、およびフルオロウラシルまたはカペシタビンを含む。
一実施形態では、カペシタビンとオキサリプラチン（Ｘｅｌｏｘ）の化学療法の組み合わせ。
一実施形態では、化学療法は、場合によりオキサリプラチンと組み合わせた、フォリン酸と５－ＦＵの組み合わせである。
一実施形態では、化学療法は、場合によりオキサリプラチン（ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ）と組み合わせた、フォリン酸、５－ＦＵおよびイリノテカン（ＦＯＬＦＩＲＩ）の組み合わせである。レジメンは、以下から構成される：イリノテカン（９０分にわたって１８０ｍｇ／ｍ２のＩＶ）、同時に、フォリン酸（１２０分にわたって４００ｍｇ／ｍ２［または２ｘ２５０ｍｇ／ｍ２］のＩＶ）；続いて、フルオロウラシル（４００～５００ｍｇ／ｍ２ＩＶボーラス）、次いで、フルオロウラシル（４６時間にわたって２４００～３０００ｍｇ／ｍ２の静脈内注入）。通常、このサイクルは２週間ごとに繰り返される。上記の投与量は、サイクルごとに変動し得る。
一実施形態では、化学療法の組み合わせは、微小管阻害剤、例えば、硫酸ビンクリスチン、エポチロンＡ、Ｎ－［２－［（４－ヒドロキシフェニル）アミノ］－３－ピリジニル］－４－メトキシベンゼンスルホンアミド（ＡＢＴ－７５１）、タキソール由来化学療法剤、例えば、パクリタキセル、アブラキサン、またはドセタキセルまたはそれらの組み合わせを利用する。
一実施形態では、化学療法の組み合わせは、ｍＴｏｒ阻害剤を使用する。ｍＴｏｒ阻害剤の例には、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、ＷＹＥ－３５４、ＫＵ－００６３７９４、パパマイシン（シロリムス）、テムシロリムス、デフォロリムス（ＭＫ－８６６９）、ＡＺＤ８０５５、およびＢＥＺ２３５（ＮＶＰ－ＢＥＺ２３５）が含まれる。
一実施形態では、併用療法は、ＭＥＫ阻害剤を使用する。ＭＥＫ阻害剤の例には、ＡＳ７０３０２６、ＣＩ－１０４０（ＰＤ１８４３５２）、ＡＺＤ６２４４（セルメチニブ）、ＰＤ３１８０８８、ＰＤ０３２５９０１、ＡＺＤ８３３０、ＰＤ９８０５９、Ｕ０１２６－ＥｔＯＨ、ＢＩＸ ０２１８９またはＢＩＸ ０２１８８が含まれる。
一実施形態では、化学療法の組み合わせは、ＡＫＴ阻害剤を使用する。ＡＫＴ阻害剤の例には、ＭＫ－２２０６およびＡＴ７８６７が含まれる。
一実施形態では、組み合わせは、オーロラキナーゼ阻害剤を利用する。オーロラキナーゼ阻害剤の例には、オーロラＡ阻害剤Ｉ、ＶＸ－６８０、ＡＺＤ１１５２－ＨＱＰＡ（バラセルチブ）、ＳＮＳ－３１４メシレート、ＰＨＡ－６８０６３２、ＺＭ－４４７４３９、ＣＣＴ１２９２０２およびヘスペラジンが含まれる。
一実施形態では、併用療法は、例えば、ＷＯ２０１０／０３８０８６に開示されているｐ３８阻害剤、例えば、Ｎ－［４－（｛４－［３－（３－ｔｅｒｔ－ブチル－１－ｐ－トリル－１Ｈ－ピラゾール）－５－イル）ウレイド］ナフタレン－１－イルオキシ｝メチル）ピリジン－２－イル］－２－メトキシアセトアミドを利用する。
一実施形態では、この組み合わせは、Ｂｃｌ－２阻害剤を利用する。Ｂｃｌ－２阻害剤の例には、オバトクラックスメシル酸塩、ＡＢＴ－７３７、ＡＢＴ－２６３（ナビトクラックス）、およびＴＷ－３７が含まれる。
一実施形態では、化学療法の組み合わせは、カペシタビン（ｘｅｌｏｄａ）、リン酸フルダラビン、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａ）、デシタビン、ラルチトレキセド（ｔｏｍｕｄｅｘ）、ゲムシタビン塩酸塩、およびクラドリビンなどの代謝拮抗薬を含む。
一実施形態では、併用療法は、ガンシクロビルを含み、これは、免疫応答および／または腫瘍血管新生の制御を支援することができる。
一実施形態では、化学療法はＰＡＲＰ阻害剤を含む。
一実施形態では、併用療法は、ＤＨＯＤＨ酵素の活性の特異的阻害を伴う癌代謝の阻害剤を含む。
一実施形態では、本明細書の方法で使用される１つまたは複数の療法はメトロノーム療法、すなわち低用量の抗癌薬による連続的または頻繁な治療であり、他の治療法と同時に行われることが多い。
一実施形態では、例えば、２、３、４、５、６、７、８回などの複数サイクルの治療（化学療法など）の使用が提供される。
一実施形態では、化学療法は２８日間のサイクルで使用される。
本開示のＧＬＡ成分は、感染細胞に由来する細胞外小胞を標的とすることにより、以下の感染症の１つ以上を治療するように適合させることができる：アルゼンチン出血熱（フニンウイルス（Ｊｕｎｉｎ ｖｉｒｕｓ））、回虫症（回虫（Ａｓｃａｒｉｓ ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ））、アスペルギルス症（アスペルギルス種）、アストロウイルス感染（アストロウイルス科ファミリー）、バベシア症（バベシア腫）、バシラスセレウス感染（バシラス・セレウス）、細菌性肺炎（複数細菌）、細菌性腟炎（細菌性腟炎細菌叢）、バクテロイデス感染（バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ））、バランチジウム症（バランチジウム・コリ（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ））、バルトネラ症（バルトネラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ））、ベイリサスカリス（Ｂａｙｌｉｓａｓｃａｒｉｓ）感染（Ｂａｙｌｉｓａｓｃａｒｉｓ）、ＢＫウイルス感染（ＢＫウイルス）、黒色砂毛症（Ｐｉｅｄｒａｉａ ｈｏｒｔａｅ）、ブラストサイトーシス（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｏｓｉｓ）（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｓ）、ブラストミセス症（ブラストミセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ））、ボリビア出血熱（マチュポ（Ｍａｃｈｕｐｏ）ウイルス）、ボツリヌス中毒症および乳児ボツリヌス中毒症（クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）；注：ボツリヌス中毒はボツリヌス菌による感染ではないが、ボツリヌス毒素の摂取によって引き起こされる）、ブラジル出血熱（サビア（Ｓａｂｉａ）ウイルス）、ブルセラ症（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、腺ペスト（腸内細菌科）、バークホルデリア感染（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、ブルリ潰瘍（マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ））、カリシウイルス感染症（カリシウイルス（ノロウイルスおよびサポウイルス））、カンピロバクター症（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、膣カンジダ症（Ｔｈｒｕｓｈ）としても知られているカンジダ症（カンジダ）、毛細血管症（フィリピン毛頭虫（Ｃａｐｉｌｌａｒｉａ ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｎｓｉｓ）による腸疾患、肝毛頭虫（Ｃａｐｉｌｌａｒｉａ ｈｅｐａｔｉｃａ）による肝疾患、および肺毛頭虫（Ｃａｐｉｌｌａｒｉａ ａｅｒｏｐｈｉｌａ）による肺疾患）、カリオン病（バルトネラ・バシリホルミス（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ））、猫ひっかき病（バルトネラ・ヘンセラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ））、蜂巣炎（通常はグループＡ連鎖球菌およびブドウ球菌）、アメリカトリパノソーマ症（トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ））としても知られるシャーガス病、軟性下疳（ヘモフィルス・デュクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ））、水痘（水痘帯状疱疹ウイルス）、チクングニア熱（アルファウイルス）、クラミジア（クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ））、ＴＷＡＲとしても知られるクラミドフィラ肺炎感染症（クラミドフィラ肺炎（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、コレラ（ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ））、クロモブラストミコーシス（フォンセカ・ペドロソイ（Ｆｏｎｓｅｃａｅａ ｐｅｄｒｏｓｏｉ））、ツボカビ（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｓｉｓ）（Ｂａｔｒａｃｈｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｄｅｎｄｒａｂａｔｉｄｉｓ）、肝吸虫症（Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、クロストリジウム・ディフィシル腸炎（クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ））、コクシジオイデス症（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｏｍｙｃｏｓｉｓ）（コクシジオイデス・イミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）およびコクシジオイデス・ポサダシイ（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｐｏｓａｄａｓｉｉ））、コロラドダニ熱（コロラドダニ熱ウイルス）、一般的な風邪／急性ウイルス性鼻咽頭炎／急性鼻感冒（通常はライノウイルスおよびコロナウイルス）、クリミアコンゴ出血熱（クリミアコンゴ出血熱ウイルス）、クリプトコッカス症（クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ））、クリプトスポリジウム症（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、皮膚幼虫移行症（通常、ブラジル鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｅ）および複数の他の寄生虫）、シクロスポラ症（シクロスポラ・カイエタネンシス（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ））、嚢虫症（有鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ ｓｏｌｉｕｍ））、サイトメガロウイルス感染症（サイトメガロウイルス）、デング熱（デングウイルス、例えば、ＤＥＮ－１、ＤＥＮ－２、ＤＥＮ－３およびＤＥＮ－４）、二核アメーバ症（二核アメーバ（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂａ ｆｒａｇｉｌｉｓ））、ジフテリア（コリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ））、裂頭条虫症（Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ）、メジナ虫症（Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓ ｍｅｄｉｎｅｎｓｉｓ）、エボラ出血熱（エボラウイルス）、エキノコックス症（エキノコックス）、エーリキア症（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）、腸内細菌科（カルバペネム耐性腸内細菌科）、腸蟯虫症（蟯虫（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉｓ））、腸球菌感染症（エンテロコッカス）、腸内ウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）、発疹チフス（発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ））、紅斑感染症（パルボウイルスＢ１９）、突発性発疹（ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ－６）およびヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ－７））、肝蛭症（Ｆａｓｃｉｏｌａｓｉｓ）（肝蛭および巨大肝蛭）、肥大吸虫症（Ｆａｓｃｉｏｌｏｐｓｉｓ ｂｕｓｋｉ）、フィラリア症（Ｆｉｌａｒｉｏｉｄｅａ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）による食中毒、自由生活性アメーバ感染（さまざまな病原体）、フソバクテリウム感染（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ガス壊疽（通常、パーフリンゲンス（ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）などのクロストリジウム）、ゲオトリクム症（ゲオトリクム・カンジドゥム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ））、ジアルジア症（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）、鼻疽（バークホルデリア・マレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ））、顎口虫症（ナソトーマ・スピニゲルム（Ｇｎａｔｈｏｓｔｏｍａ ｓｐｉｎｉｇｅｒｕｍ）およびナソトーマ・ヒスピダム（Ｇｎａｔｈｏｓｔｏｍａ ｈｉｓｐｉｄｕｍ））、淋病（ナイセリア・ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ））、鼠径肉芽腫（クレプシエラ・グラヌロマティス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ））、グループＡ連鎖球菌感染（ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、グループＢ連鎖球菌感染（ストレプトコッカス・アガラシチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ））、ヘモフィルスインフルエンザ感染（ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ））、手足口病（エンテロウイルス、主にコクサッキーＡウイルスおよびエンテロウイルス７１（ＥＶ７１））、ハンタウイルス肺症候群（シンノンブレ（Ｓｉｎ Ｎｏｍｂｒｅ）ウイルス）、ハートランドウイルス病（ハートランドウイルス）、ヘリコバクターピロリ感染（ヘリコバクターピロリ）、溶血性尿毒症症候群（Ｏ１５７：Ｈ７、Ｏ１１１、Ｏ１０４：Ｈ４などの大腸菌）、腎症候群を伴う出血性発熱（ブニヤウイルス科）、Ａ型肝炎（Ａ型肝炎ウイルス）、Ｂ型肝炎（Ｂ型肝炎ウイルス）、Ｃ型肝炎（Ｃ型肝炎ウイルス）、Ｄ型肝炎（Ｄ型肝炎ウイルス）、Ｅ型肝炎（Ｅ型肝炎ウイルス）、単純ヘルペス（単純ヘルペスウイルス１および２（ＨＳＶ－１およびＨＳＶ－２）、ヒストプラスマ症（ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ））、鉤虫感染症（ズビニ鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｄｕｏｄｅｎａｌｅ）およびアメリカ鉤虫（Ｎｅｃａｔｏｒ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ））、ヒトボカウイルス感染（ヒトボカウイルス）、ヒトユーインギエールリヒア症（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｅｗｉｎｇｉｉ）、ヒト顆粒球アナプラズマ症（アナプラズマ・ファゴサイトフィルム（Ａｎａｐｌａｓｍａ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ））、ヒトメタニューモウイルス感染症（ヒトメタニューモウイルス）、ヒト単球性エールリヒア症（エールリヒア・シャフェンシス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ））、ヒトパピローマウイルス感染症（ヒトパピローマウイルス）、ヒトパラインフルエンザウイルス感染（ヒトパラインフルエンザウイルス）、条虫症（小型条虫（Ｈｙｍｅｎｏｌｅｐｉｓ ｎａｎａ）および縮小条虫（Ｈｙｍｅｎｏｌｅｐｉｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ））、エプスタイン－バーウイルス感染性単核球症（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス）、インフルエンザ（オルトミクソウイルス科）、イソスポラ症（イソスポラ・ベリイ（Ｉｓｏｓｐｏｒａ ｂｅｌｌｉ））、川崎病、角膜炎（様々な病原体）、キンゲラ・キンゲ感染（Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ）、ラッサ熱（ラッサ（Ｌａｓｓａ）ウイルス）、レジオネラ病としても知られるレジオネラ症（レジオネラ肺炎）、リーシュマニア症（リーシュマニア）、ハンセン病（マイコバクテリウム・レプラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）およびマイコバクテリウム・レプロマトーシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒｏｍａｔｏｓｉｓ））、レプトスピラ症（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リステリア症（リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ））、ライム病（ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア・ガリニ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｇａｒｉｎｉｉ）、ボレリア・アフゼリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ａｆｚｅｌｉｉ））、リンパ系フィラリア症（バンクロフト糸状虫（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ ｂａｎｃｒｏｆｔｉ）およびマレー糸状虫（Ｂｒｕｇｉａ ｍａｌａｙｉ））、リンパ球性脈絡髄膜炎（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）、マラリア（マラリア原虫）、マールブルグ出血熱（マールブルクウイルス）、麻疹（麻疹ウイルス）、中東呼吸器症候群（中東呼吸症候群コロナウイルス）、類鼻疽（バークホルデリア・シュードマレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ））、髄膜炎（各種）、髄膜炎菌性疾患（髄膜炎菌）（ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））、メタゴニムス症（通常、横川吸虫症）、ミクロスポリジウム症（ミクロスポリジア・フィラム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ ｐｈｙｌｕｍ））、伝染性軟属腫（伝染性軟属腫（Ｍｏｌｌｕｓｃｕｍ ｃｏｎｔａｇｉｏｓｕｍ）ウイルス）、サル痘（サル痘ウイルス）、おたふく風邪（おたふく風邪ウイルス）、ネズミチフス（リケッチア・チフィ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｙｐｈｉ））、マイコプラズマ肺炎（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、菌腫（アクチノマイセトーマ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｏｍａ））および真菌ユーマイセトーマ（Ｅｕｍｙｃｅｔｏｍａ））、蝿蛆症（寄生性双翅目ハエ幼虫）、新生児結膜炎（最も一般的にはクラミジア・トラコーマ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）およびナイセリア・ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ））、ノロウイルス感染（ノロウイルス）、ノカルジア症（ノカルジア、例えば、Ｎ．アステロイデス（ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ））、回旋糸状虫症（オンコセルカ・ボルブルス（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ ｖｏｌｖｕｌｕｓ））、オピストルキス症（オピストルキス・ビベリニ（Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓ ｖｉｖｅｒｒｉｎｉ）およびオピストルキス・フェリネウス（Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓ ｆｅｌｉｎｅｕｓ））
、パラコクシジオイデス症（パラコウシジオイデス・ブラシリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ））、肺吸虫症（パラゴニマス（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ）、例えば、ウェステルマニ（ｗｅｓｔｅｒｍａｎｉ））、パスツレラ症（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、骨盤内炎症性疾患（様々な病原体）、百日咳（ボルデテラ・パータシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ））、ペスト（エルシニア・ペスチス（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ））、肺炎球菌感染症（ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、ニューモシスチス肺炎（ニューモシスチス・ジロベシ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ））、肺炎（様々な病原体）、ポリオ（ポリオウイルス）、プレボテラ感染（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、原発性アメーバ性髄膜脳炎（通常、ネグレリア・フォーレリ（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｆｏｗｌｅｒｉ））、進行性多巣性白質脳症（ＪＣウイルス）、オウム病（クラミドフィラ・シタッシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ））、Ｑ熱（コクシエラ・ブルネッティ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ））、狂犬病（狂犬病ウイルス）、回帰熱（ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、例えば、Ｂ．ヘルムシ（ｈｅｒｍｓｉｉ）およびＢ．レカレンティス（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ））、呼吸器合胞体ウイルス感染症（呼吸器合胞体ウイルス）、ライノスポリジウム症（ライノスポリジウム・シーベリ（Ｒｈｉｎｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｅｅｂｅｒｉ）、ライノウイルス感染症（ライノウイルス）、リケッチア感染症（リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）種）、リケッチア痘症（リケッチア・アカリ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ａｋａｒｉ））、リフトバレー熱（リフトバレー熱ウイルス）、ロッキーマウンテン紅斑熱（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、ロタウイルス感染症（ロタウイルス）、風疹（風疹ウイルス）、サルモネラ症（サルモネラ）、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳコロナウイルス）、住血吸虫症（住血吸虫）、敗血症（様々な病原体）、赤痢菌感染症（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、帯状疱疹（水痘帯状疱疹ウイルス）、天然痘（大痘瘡および小痘瘡）、スポロトリクム症（スポロトリックス・シェンキィ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ））、ブドウ球菌食中毒（ブドウ球菌）、ブドウ球菌感染症（ブドウ球菌）、糞線虫症（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ）、亜急性硬化性全脳炎（はしかウイルス）、梅毒（梅毒トレポネーマ）、テニア症（Ｔａｅｎｉａ）、破傷風（クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ））、白癬性毛瘡（通常、トリコフィトン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ））、頭部白癬（トリコフィトン・トンズランス（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｔｏｎｓｕｒａｎｓ））、体部白癬（通常、トリコフィトン）、股部白癬（通常、エピデルモフィトン・フロッコースム（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｆｌｏｃｃｏｓｕｍ）、トリコフィトン・ルブルム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ）、および トリコフィトン・メンタグロフィテス（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ））、手白癬（Ｔｉｎｅａ ｍａｎｕｍ）（トリコフィトン・ルブルム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ））、黒癬（通常、ホールタエ・ウェルネッキ（Ｈｏｒｔａｅａ ｗｅｒｎｅｃｋｉｉ））、足白癬（通常、トリコフィトン）、爪白癬（通常、トリコフィトン）、癜風（マラセジア（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ））、トキソカラ症（イヌ回虫症またはネコ回虫症）、トラコーマ（クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ））、トキソプラズマ症（トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ））、旋毛虫症（トリキネラ・スピラリス（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｓｐｉｒａｌｉｓ））、トリコモナス症（腟トリコモナス）、鞭虫症（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ ｔｒｉｃｈｉｕｒａ）、結核（通常は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ））、野兎病（フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ））、腸チフス（サルモネラ・エンテリカ、亜種エンテリカ、血清型チフス）、発疹チフス（リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ））、ウレアプラズマ・ウレアリチカム感染（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、バレー熱（コクシジオイデス・イミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）またはコクシジオイデス・ポサダシイ（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｐｏｓａｄａｓｉｉ））、ベネズエラウマ脳炎（ベネズエラウマ脳炎ウイルス）、ベネズエラ出血熱（グアナリト（Ｇｕａｎａｒｉｔｏ）ウイルス）、ビブリオ・バルニフィカス感染（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）、腸炎ビブリオ・パラヘモリチカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ウイルス性肺炎（様々なウイルス）、ウエストナイル熱（ウエストナイルウイルス）、白色砂毛（バイゲル毛芽胞菌（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｂｅｉｇｅｌｉｉ））、仮性結核菌感染症（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、エルシニア症（エルシニア・エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ））、黄熱（黄熱ウイルス）、ならびに接合菌症（接合菌）。
細胞内病原体
病原体が細胞内に入ると、細胞環境によってある程度のレベルの保護が病原体に提供される可能性があるため、細胞内細胞病原体は、治療が最も難しいものの一部となり得る。
病原体は、ウイルス、細菌、真菌、原生動物などであってよい。本開示の分子は、細胞内病原体、特に本明細書に開示されている病原体の治療に特に有用である。
注目すべき細胞内細菌には、バルトネラ・ヘンセラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ）、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、サルモネラ・チフィ（，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ ｔｙｐｈｉ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、マイコバクテリウム（結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）など）、ノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｇｉｔｉｄｉｓ）が含まれる。
エリスロマイシン、ドキシサイクリン、アジスロマイシン、リファンピン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、ドキシサイクリン、シプロフロキサシン、アンピシリン、トリメトプリム－スルファメトキサゾール、クロラムフェニコール、ＴＭＰ－ＳＭＺ（トリメトプリム－スルファメトキサゾール）、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、クラリスロマイシン、テトラサイクリン、グリシルサイクリン、エサンブトール、リファブチン、イミペネム、セフォタキシム、アミカシン、バンコマイシン、ミノサイクリン、ペニシリンＧ、アンピシリン、フルオロキノロン、アズトレオナム、およびそれらの２つ以上の組み合わせから選択される１つ以上の抗生剤。
結核菌は治療が難しいことで有名である。独立した一態様において、本開示は、潜在性および／または活性なＴＢの治療のための分子を提供し、この場合、１つ以上のＴＢ薬物は、本明細書に記載のＧＬＡ成分へペイロードとしてコンジュゲートされる。
本開示の分子は、マイコバクテリウムが位置する細胞内にそれらを送達することにより、現在の医薬品の効力を大幅に増加させることができる場合がある。
結核（ＴＢ）の治療は、結核が潜在性か活動性か、患者が成人か、子供か、妊娠中か、ＨＩＶ陽性か、または前述の組み合わせなどを含む、多くの要因に依存する。以下の詳細は、本発明のすべての側面、例えば、どの分子を調製するか、それらをどのように使用して患者を治療するか、に関する。
ＨＩＶ患者および２～１１歳の子供の潜在性結核の治療は、６～９か月間の毎日のイソニアジドである。妊娠中の患者は、毎日ではなく毎週２回治療される場合がある。
したがって、本開示の分子の一実施形態では、ＧＬＡ成分は、イソニアジドまたはその等価物を含むペイロードに連結される。悪化因子のない１２歳以上の患者の潜在性結核の治療には、イソニアジドおよびリファペンチンを週に１回、３か月間投与できる。あるいは、リファンピンは４ヶ月間毎日投与されてもよい。
これは、一実施形態では、ペイロードはリファペンチンをさらに含む。
あるいは、本明細書に記載のＧＬＡドメインがリファペンチンを含むペイロードに連結されている分子を提供してもよい。本開示による分子の組み合わせは、治療における使用のために提供され得る。
活動性結核の第一選択治療は、多くの場合、イソニアジド、リファンピン、エサンブトール、ピラジナミド、およびそれらの２つ以上の組み合わせから選択される。
したがって、リファンピンを含むペイロードに連結された、本明細書に記載のＧＬＡ成分を含む本開示による分子が提供される。
エサンブトールを含むペイロードに連結された、本明細書に記載のＧＬＡ成分を含む本開示による分子も提供される。
さらなる一実施形態では、ピラジンアミドを含むペイロードに連結された、本明細書に記載のＧＬＡ成分を含む本開示による分子が提供される。
明確に想定されるように、本明細書に開示される細胞外小胞を使用するＴＢの治療に使用されるペイロードは、２つ以上、例えば、３つの薬物、または４つの薬物、例えば、イソニアジドとリファマイシン、イソニアジドとピラキシンアミド、イソニアジドとエサンブトール、リファマイシンとピラキシンアミド、リファマイシンとエサンブトール、ピラキシンアミドとエサンブトール、イソニアジドとリファマイシンとピラキシンアミド、イソニアジドとリファマイシンとエサンブトール、およびイソニアジドとリファマイシンとピラキシンアミドとエサンブトールを含み得る。
ウイルス病原体には、インフルエンザ、ヒト免疫不全ウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、天然痘ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、韓国出血熱ウイルス、水痘、帯状疱疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス１または２、Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス、Ｍａｒｂｕｒｇウイルス、ハンタウイルス、黄熱病ウイルス、Ａ、Ｂ、ＣまたはＥ型肝炎、エボラウイルス、ヒトパピローマウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、狂犬病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ロタウイルス、ＨＩＶ（ＨＴＬＶ－１および－２など）．が含まれる。
抗ウイルス薬はＧＬＡ成分に連結されてもよく、以下：アバカビル、アシクロビル（Ａｃｉｃｌｏｖｉｒ）、アシクロビル（Ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）、アデフォビル、アマンタジン、アンプレナビル、アンプリゲン、アルビドール、アタザナビル、アトリプラ、ボセプレビルテット、シドフォビル、コンビビル、ダルナビル デラビルジン、ジダノシン、ドコサノール、エドクスジン、エファビレンツ、エムトリシタビン、エンフビルチド、エンテカビル、侵入阻害剤、ファムシクロビル、フォミビルセン、フォサンプレナビル、フォスカルネット、フォスフォネット、ガンシクロビル、イバシタビン、イミナビル、イドクスウリジン、イミキモド、インジナビル、イノシン、インテグラーゼ阻害剤、インターフェロンＩＩＩ型、インターフェロンＩＩ型、インターフェロンＩ型、インターフェロン、ラミブジン、ロピナビル、ロビリド（Ｌｏｖｉｒｉｄｅ）、マラビロク、マロキシジン、メチサゾン、ネルフィナビル、ネビラピン、ネキサビル、ヌクレオシド類似体、オセルタミビル、ペグインターフェロンアルファ－２ａ、ペンシクロビル、ペラミビル、プレコナリル、ポドフィロトキシン、プロテアーゼ阻害剤、ラルテグラビル（Ｒａｌｔｅｇｒａｖｉｒ）、逆転写酵素阻害剤、リバビリン、リマンタジン、リトナビル、ピラミジン、サクイナビル、スタブジン、相乗効果増強剤（抗レトロウイルス剤）、ティーツリーオイル、テラプレビル、テノホビル、テノホビルジソプロキシル、チプラナビル、トリフルリジン、トリジビル、トロマンタジン、ツルバダ、バラシクロビル、バルガンシクロビル、ビクリビロック、ビダラビン、ビラミジン、ザルシタビン、ザナミビル、およびジドブジンの１つ以上から独立して選択されてもよい。
当該技術分野では、例えば、有効性を高めるために、抗ウイルス薬を組み合わせて使用できることがよく知られている。
したがって、一実施形態では、本発明の分子は、原虫病、例えば、マラリア、アフリカ睡眠病などを治療するために、ペイロードとともに提供される。
顕著な原虫寄生虫には、マラリアなどのプラスモディウム属寄生虫が含まれる。マラリアを治療するために使用される薬物は、例えば、キニーネおよび関連薬剤、クロロキン、アモジアキン、ピリメタミン、プログアニル、スルホンアミド、メフロキン、アトバコン、プリマキン、アレミシニンおよびその誘導体、ハロファントリン、ドキシサイクリン、クリンダマイシン、スルファジアジン、およびそれらの２つ以上の組み合わせ。
一実施形態では、本開示の分子は、賦形剤、希釈剤および／または担体を含む医薬組成物中で提供される。一実施形態では、組成物は非経口製剤としてである。
非経口製剤は、消化管を通して送達されないように設計された製剤を意味する。典型的な非経口送達経路は注射、移植または注入を含む。
一実施形態では、非経口製剤は注射剤の形態である。注射には、静脈内、皮下、頭蓋内、髄腔内、腫瘍内、または筋肉内注射が含まれる。本明細書で使用される注射は、注射器を介して体内に液体を挿入することを意味する。
一実施形態では、非経口製剤は注入剤の形態である。
本明細書で使用される注入は、点滴、注入ポンプ、シリンジドライバーまたは同等の装置によるより遅い速度での流体の投与を意味する。一実施形態では、注入は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、６５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０または１１５分など、１．５分～１２０分の範囲の期間にわたって投与される。
一実施形態では、製剤は静脈内（ｉ．ｖ．）投与用である。この経路は、大部分の臓器および組織への迅速なアクセスを可能にし、転移、例えば確立された転移、特に肝臓および肺などの高度に血管新生された領域に位置する転移の治療に特に有用であるため、特に効果的である。
治療用製剤は典型的に、製造および保存条件下で無菌かつ安定であろう。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、またはヒトへの投与に適した他の非経口製剤として製剤化することができ、シリンジまたはバイアルなどの予め充填された装置として、特に単回投与として製剤化することができる。
上述のように、製剤は、一般に、薬学的に許容される希釈剤または担体、例えば、ウイルスと適合し、ウイルスが必要な期間安定である非毒性の等張性担体を含む。
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの分散剤もしくは界面活性剤、またはポリソルベート８０もしくは４０などの非イオン性界面活性剤の使用によって維持することができる。分散液において、必要な粒径の維持は、界面活性剤の存在によって補助され得る。等張化剤の例には、組成物中の糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムが含まれる。
したがって、実施形態では、本明細書に記載のＧＬＡ成分が１つ以上の抗マラリア薬を含むペイロードに連結されている本開示による分子が提供される。
本明細書の文脈における「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含める（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味することが意図される。
技術的に適切な場合には、本発明の実施形態を組み合わせることができる。
本明細書では、特定の特徴／要素を含む実施形態が説明される。本開示はまた、該特徴／要素からなるまたは本質的になる別個の実施形態にも及ぶ。
特許および出願などの技術的参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
技術的背景は、本明細書の技術的開示の一部であり、修正の根拠として使用することができ、なぜなら、その議論は先行技術の議論に限定されず、本発明の分野および適用において遭遇する技術的問題の議論も含むからである。
本明細書に具体的かつ明示的に列挙された任意の実施形態は、単独で、または１つもしくは複数のさらなる実施形態と組み合わせて、「除くクレーム」に基づいて形成し得る。
本出願は、米国シリアル番号：第６２／５５４５３０号、第６２／５６９，４０３号、第６２／５５４５３３号、第６２／５６９，４１１号、第６２／５８４，５６５号、および第６２／５９３，０１４号からの優先権を主張する。これらの各出願は、参照により組み込まれる。これらの出願は、本明細書の修正の根拠として使用することができる。
ここで、以下の実施例を参照して本発明を説明するが、これらの実施例は単なる例示であり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例
図１Ａ～ＤはＧＬＡタンパク質構造の様々な描写を示す。 同上。 同上、 同上。 本開示によるＧＬＡ成分の一実施形態を示す。 過酸化物で処理してアポトーシスを誘導した乳癌細胞株のプロテインＳ（ＰｒＳ）およびアネキシン染色を示している。Ａ、過酸化物で処理し、ＦＩＴＣ－ＰｒＳで染色したヒトＭＤＡ－２３１細胞。Ｂ、Ａのように染色された未処理ＭＤＡ－２３１細胞。Ｃ、アネキシンで染色された処理済みＭＤＡ－２３１細胞。Ｄ、過酸化物で処理され、ＰｒＳで染色されたヒトＭＣＦ－７細胞。Ｅ、ＤのようにしたマウスＭＥＴ－１細胞。Ｆ、Ｄのようにしたマウス４Ｔ１細胞。 重複しているが、別個の、ＰｒＳとアネキシンの細胞内局在が示されている。Ａ、過酸化物で処理され、Ｃｙ５ ＰｒＳ（赤）およびＦＩＴＣアネキシン（緑）で染色されたマウス４Ｔ１細胞。明るい矢印、共局在シグナル；赤色矢印、アネキシンではなくＰｒＳで染色された細胞；緑色矢印、アネキシンでは比較的明るいが、ＰｒＳではあまり明るくない細胞染色。これは、明確な結合パターンが示されている（図は、ＰｒＳとアネキシン染色を別々に示す）。Ｂ、ＦＩＴＣ ＰｒＳおよびＣｙ５アネキシンで染色された処理済み４Ｔ１細胞。緑色矢印、アネキシンではなくＰｒＳで染色された細胞。Ｃ、１，０００倍過剰の冷アネキシンを用いてプレインキュベートした処理済み４Ｔ１細胞のＣｙ５アネキシン染色。 ＰｒＳとアネキシンによるアポトーシスＣＯＳ－１細胞の染色を示す。細胞を記載のようにｔ－ＢＨＰで処理し、ＦＩＴＣアネキシン（左）とＣｙ５ ＰｒＳ（右）で染色した。矢印は、アポトーシス小体と推定される細胞内構造を示す。 ＰｒＳとアネキシンによる細胞外小胞の示差的染色を示す。細胞外小胞を４Ｔ１細胞から調製し、ＦＩＴＣ ＰｒＳ（緑色）およびＣｙ５アネキシン（赤色）で染色した。矢印は、アネキシンのみ（赤色矢印）、ＰｒＳのみ（緑色矢印）、および両方のタンパク質（明るい矢印）で染色された小胞を示す。 ＰｒＳとアネキシンの細胞内局在を示す。Ａ、Ｂ、アポトーシス４Ｔ１細胞は、ＦＩＴＣ ＰｒＳ（緑色矢印）およびＣｙ５アネキシン（赤色矢印）で染色された；明るい矢印、共局在。Ｃ、可能なアポトーシス小体。 ５分以内のＰｒＳの内在化を示す。アポトーシス４Ｔ１細胞をＦＩＴＣ ＰｒＳ（緑色）およびＣｙ５アネキシン（赤色）で染色し、タンパク質添加後１０分以内に画像化した。Ａ、合成された画像。Ｂ、Ｈｏｅｓｃｈｔ核染色のみ。 マウスの４Ｔ１腫瘍のＢＬＩ画像を示す。 放射性標識ＰｒＳとアネキシンを用いた４Ｔ１腫瘍に対するドキソルビシンの効果のＳＰＥＣＴ画像。４Ｔ１乳癌腫瘍を有するマウスは、ドキソルビシンの前（ＡおよびＣ）ならびに２４時間後（ＢおよびＤ）に９９ｍＴｃ ＰｒＳ（ＡおよびＢ）またはアネキシン（ＣおよびＤ）で画像化された。 シクロヘキサミド治療マウスのＳＰＥＣＴ画像を示す。パネルあたり５匹のマウスが、治療前（ＡおよびＣ）および治療後２４時間（ＢおよびＤ）で示される。マウスは９９ｍＴｃ ＰｒＳ（ＡおよびＢ）またはアネキシン（ＣおよびＤ）のいずれかで画像化された。矢印は肝臓シグナルの増加を示している。 感染した脾臓へのＣｙ５ ＰｒＳの局在を示す。ＣＤ１マウスに生物発光リステリアを感染させ、感染後２日目に画像化した。犠牲にする３０分前にマウスにＣｙ５ ＰｒＳを注射し、脾臓を摘出し、凍結した。中程度に感染したマウス（Ａ）および非感染マウス（Ｃ）を示す。Ｃｙ５チャンネルの各マウスの感染脾臓（Ｂ）および非感染脾臓（Ｄ）のセクションが表示され、位相コントラスト画像と合成される。 ドキソルビシンで治療した腫瘍へのＣｙ５ ＰｒＳの局在を示す。４Ｔ１乳癌腫瘍を移植したマウスは、ドキソルビシンで治療された（右パネル）か、未治療のまま（左パネル）である。２４時間後、マウスにＣｙ５ ＰｒＳを静脈内注射し、３０分後に犠牲にした。腫瘍を取り出し、凍結し、蛍光顕微鏡検査のために切片化した。４つの異なるマウスからの合成されたＣｙ５ ／位相コントラスト画像が示される。 ＴＳＣの分化を示す。ＴＳＣは、成長因子の存在下（左）または非存在下（右）で培養された。右パネルの矢印は、分化に特徴的な巨大細胞を示している。 栄養膜幹細胞および分化した栄養膜のＰｒＳ染色を示す。栄養膜幹細胞（左）は、成長因子の除去により、栄養膜巨細胞（右）に分化した。細胞をＣｙ５ ＰｒＳで染色し、画像化した。 ＭＳＣの分化を示す。ＭＳＣは、脂肪細胞（上パネル）または骨芽細胞（下パネル）への分化のために、本文に記載されているように処理された。分化した細胞は、それぞれの場合に予想される形態を示した。 ＰｒＳ（緑色）、アネキシン（赤色）、ヘキスト（青色）で染色されたＭＳＣを示す。細胞は、染色混合物を添加してから１０分以内に画像化した。 ＰｒＳ（緑色、最も明るい領域）、アネキシン（赤色、細胞膜周辺の明るい部分）、およびＨｏｅｃｈｓｔ（青色）で染色されたＴＳＣを示す。細胞は、染色混合物を添加してから５分以内に画像化した。 ＴＳＣ小胞の示差染色を示す。ＴＳＣは図１７のように染色された。細胞のグループは、ＰｒＳ（緑色）ではなくアネキシン（赤色）で染色する大きな小胞を分泌している。 Ｃ１７．２神経前駆細胞のＰｒＳ染色を示す。細胞をＰｒＳ－ＦＩＴＣで染色し、標準（非共焦点）顕微鏡で画像化した。 ４ＣでのＰｒＳのＴＳＣへの内在化を示す。ＦＩＴＣ ＰｒＳ（緑色）およびＣｙ５アネキシン（赤色）を４ＣでＴＳＣに添加し、共焦点顕微鏡で撮像した。 マウス骨髄由来の陰性系統のＳＣＡ－１／ｃ－キット染色細胞を示す。分析のこの時点では、細胞はＰＩ（ヨウ化プロピジウム；死細胞を検出するため）またはＰｒＳで染色されなかった。造血系統の染色（左パネル）およびｃ－キットとＳＣＡ１の染色（右パネル）の欠如は、緑色（最も明るい領域）で示されるＨＳＣの集団を定義する。 長期ＨＳＣのＰｒＳ染色。ＨＳＣは図１のように単離され、ＦＩＴＣ ＰｒＳで染色された。ＳＬＡＭパターンはＣｙ７で決定された（ｘ軸）。 短期ＨＳＣのＰｒＳ染色。ＨＳＣは図１のように単離され、ＦＩＴＣ ＰｒＳで染色された。ＳＬＡＭパターンはＣｙ７で決定された（ｘ軸）。 長期ＨＳＣにおけるＰｒＳの内在化を示す。ＨＳＣは記載のように調製され、ＰｒＳについて染色され、共焦点顕微鏡で検査された。緑色（最も明るい領域）、ＦＩＴＣ ＰｒＳ；青色、Ｈｏｅｓｃｈｔ核染色；赤色、ＰＩ。ＰＩ染色は核から除外されており、細胞が生きていることを示している。 核ＰＩを示す死んだＨＳＣの一例を示す。 ＧＬＡを介した送達は細胞に対して無毒である本明細書には、関連する配列表に配列１～６も含まれている。
本プロジェクトは、ＳＰＥＣＴ（単一光子コンピューター断層撮影）の生体内造影剤としての標識組換えＰｒＳの試験を開始した。驚くべきことに、分子はアポトーシス細胞に急速に内部移行することが見出された。この予想外の発見により、本発明者らは、この現象をさらに調査することになり、その結果、本発明者あらは、ＰｒＳがいくつかのタイプの非アポトーシス幹細胞のサブセットにも取り込まれていることを見出した。
ＰｒＳは、配列番号６に示されるタンパク質Ｓ ＧＬＡドメインおよびタンパク質Ｓ ＥＧＦドメインである。
方法
蛍光については、製造元の指示に従って、Ａｍｅｒｓｈａｍ（ＧＥ Ｈｅａｔｈｃａｒｅ）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）標識キットをそれぞれ使用して、Ｃｙ５およびＦＩＴＣのコンジュゲートを達成した。両方のキットは、コンジュゲートされていないフルオロフォアを除去するためのカラムを提供する。最初に、１ｍｌ中に０．７７ｍｇのＰｒＳ（フラクション２）、および１ｍｌ中に０．７７ｍｇのアネキシンをＦＩＴＣで標識し、アポトーシス細胞への結合の特異性を試験した。共局在および競合研究のために、１ｍｌ中のＰｒＳ ０．６８ｍｇ（フラクション３）およびアネキシン０．６８ｍｇをＣｙ５で標識した。共焦点顕微鏡では、第２の積載からの０．７６ｍｇのＰｒＳがＦＩＴＣで標識付けされ、以前に標識付けされたＣｙ５コンジュゲートしたアネキシンが使用された。標識化キットの製造元の指示によれば、標識化の正確な効率は決定されておらず、カラムからの回収率は８５％であると想定されていることに注意されたい。したがって、いずれの場合でも、２つのタンパク質の相対的な染色強度はこれらの偶発性を反映する可能性がある。細胞は最初に３０分間染色されたが、その後５分未満で十分であると判断された。アポトーシス細胞特異性についてＰｒＳを試験するために、４つの乳癌細胞株：ヒトＭＤＡ－２３１およびＭＣＦ７、ならびにマウス４Ｔ１およびＭＥＴ－１が最初に使用された。その後、ＣＯＳ－１サル腎細胞も使用された。過酸化水素または三級ブチルヒドロペルオキシド（ｔ－ＢＨＰ）でアポトーシスが誘導された。細胞を、ウェル当たり６ｘ１０４個の細胞で２４ウェルプレートに、またはウェル当たり１ｘ１０４の細胞でＥｐｐｅｎｄｏｒｆチャンバースライドに播種し、次の日、３０分～２時間の時点で、２ｍＭのＨ２Ｏ２、またはｔ－ＢＨＰを用いて、アポトーシスを誘導した。誘導後、ウェルをアネキシン結合バッファー（ＡＢ；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で洗浄し、標識タンパク質で染色した。過去の経験と文献から、５．５μｇ／ｍｌのアネキシンタンパク質が染色に使用された。この量は、提供されたゲル画像に基づいて、アネキシンの分子量を３６ｋＤ、組換えＰｒＳを３０ｋＤと想定することにより、ＰｒＳの等モル添加のために調整された。細胞は１５分間染色された。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２色素は、核酸の可視化に使用された。次に、ウェルをＡＢで洗浄し、ＥＶＯＳ蛍光顕微鏡を使用して、まだ生存できる状態で観察した。共焦点顕微鏡検査には、Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｍａｇｉｎｇ ＦａｃｉｌｉｔｙのＬｅｉｃａ ＳＰ８顕微鏡が採用された。次に、ウェルをＡＢで洗浄し、Ｌｅｉｃａ ｓｐ８顕微鏡を使用して観察した。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２色素を核の可視化に使用した。毒性研究のために、ＰｒＳを栄養膜幹細胞（ＴＳＣ）に添加し、Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒを使用してトリパンブルーで生存率を試験した。
腫瘍を検出する能力について標識タンパク質を試験するために、５ｘ１０４ ４Ｔ１－ｌｕｃ細胞を、５匹の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスのグループの左腋窩脂肪体に移植した。マウスを毎日生体内生物発光イメージング（ＢＬＩ）で画像化し、移植後１週間から腫瘍の成長をモニターし始めた。次いで、マウスを、移植後１１日目に１３ｍｇ／ｋｇ体重の腹腔内（ＩＰ）ドキソルビシンで治療し、翌日にＢＬＩを実施した。腫瘍を有する対照マウスは、ドキソルビシンで未治療のままにした。処置の４８時間後、マウスを、静脈内トレーサー注射（麻酔１．３ｇ／ｋｇのウレタンＩＰ）の１時間後に、シングルヘッドＡ－ＳＰＥＣＴガンマカメラ（Ｇａｍｍａ Ｍｅｄｉｃａ）で撮像した；１ｍｍのピンホールコリメータ、１２８ｘ１２８イメージングマトリックスへの１２８工程、１工程あたり１５秒、２．７ｃｍのＲＯＲ；ＦＯＶ＝胸上部／首。各プロテインの注射量は、１６０μｌ（８００μＣｉ）だった。次に、動物を犠牲にし、生体内分布を実施した。シクロヘキサミド治療実験のために、５匹の若い（７週齢）雄Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスのグループに麻酔をかけ（１．３ｇ／ｋｇのウレタンＩＰ）、５０ｍｇ／ｋｇのシクロヘキシミドを静脈内注射した。シクロヘキシミド注射の１時間４５分後、トレーサーを注射した（１用量あたりＰｒＳ＝１８０ｕｌ／１．２ｍＣｉ；１用量あたりアネキシンＶ＝１７０μｌ／１．０５ｍＣｉ）。トレーサー注射の４５分後、Ａ－ＳＰＥＣＴガンマカメラのシングルヘッドパラレルホールコリメータ（１２８ｘ１２８マトリックス）を使用して、１０分間の静的全身画像でマウスを撮像した。
生きている動物の感染によるアポトーシス部位への蛍光ＰｒＳの特異的な局在を試験するために、ＣＤ１マウスに生物発光のリステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を静脈内注射した。この細菌性病原体は、脾臓を含む多くの臓器に感染し、単球および顆粒球の広範なアポトーシスが発生する。感染後の特定の時点では、脾臓が細菌の複製の主要部位であるため、細菌からの脾臓のＢＬＩシグナルは、アポトーシスのプローブの局在化と相関する可能性がある。マウスは毎日感染させられ、画像化された。脾臓シグナルが明らかとなった場合（感染後２日目、８週齢のＣＤ１雌マウスにおいて細菌の２ｘ１０５コロニー形成単位）、３００ｍｇ／ｋｇ体重のＣｙ５ ＰｒＳをマウスに注射し、３０分後に動物を犠牲にし、脾臓を摘出し、ＯＣＴで凍結し、蛍光顕微鏡検査のために切片化した。感染していない対照マウスを使用した。
フローサイトメトリーを実施した。上記のように調製された、新たに標識されたＦＩＴＣ ＰｒＳが使用された。マウス造血幹細胞（ＨＳＣ）は、この研究室で日常的に精製される。細胞は、ｃ－キット＋、陰性系統細胞を染色することにより、正常なマウス骨髄から単離された。細胞をさらに特徴付けるために、ＳＬＡＭマーカー染色も実施した。これらのマーカーは、自己再生および分化する細胞を染色するが、非染色ＨＳＣは分化しかできない。ＦＩＴＣ ＰｒＳによるその後の染色により、結果に示すように、ＳＬＡＭ染色細胞の陽性率が明らかになった。次に、細胞をＦＩＴＣ用に選別し、核の可視化のためにＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２を使用して共焦点顕微鏡で検査した。
結果
細胞培養におけるアポトーシスのコンテキストでＰｒＳ結合特異性を評価するために、いくつかのヒトおよびマウスの乳癌細胞株を使用した。上記のように過酸化物でアポトーシスを誘導し、ＦＩＴＣ ＰｒＳ結合を評価した。これらの実験の例を図２に示す。図２のパネルＢに示すように、未処理の細胞は最小限の結合を示した。より高い濃度および／またはより長いインキュベーション時間では細胞が剥離し、染色および顕微鏡検査が不可能になるため、過酸化物の濃度およびインキュベーション時間は、少数の細胞のみが影響を受けるように選択された。さらに、多くの影響を受けていない細胞の存在は、各フィールド内の内部負対照として機能した。ＦＩＴＣ－アネキシンは、ＰｒＳと同様のアポトーシスに対する特異性を示し、内部正対照として機能した。次に、本発明者らは、２つのタンパク質の共局在化と競合結合を試験した。共局在化のために、ＦＩＴＣおよびＣｙ５標識ＰｒＳおよびアネキシンの両方を調製した。４Ｔ１細胞を過酸化物で処理し、フルオロフォアの両方の組み合わせを使用して、Ｃｙ５およびＦＩＴＣ標識ＰｒＳおよびアネキシンで染色した。次に、細胞をＥＶＯＳ蛍光顕微鏡で視覚化した。結果を図３に示す。試験した条件下で、すべての明るい染色細胞は、両方のタンパク質での染色を示した。しかし、Ｃｙ５を使用するかＦＩＴＣを使用するかにかかわらず、ＰｒＳは弱くはあるものの、アネキシンが染色しなかった一部の細胞を染色したようだ（図３）。各タンパク質による異なる細胞の相対染色強度は、２つのプローブ間で異なる場合があり、つまり、場合により、アネキシンは２つの細胞を等しい強度で染色するが、ＰｒＳは２つの細胞を等しい強度で染色せず、その逆も同様であった（図３Ａ、緑色矢印および挿入図）。したがって、両方のプローブは、一般に、同じ細胞を染色したが、それらはわずかな違いを示すように見えた。競合アッセイでは、増大過剰量の非標識アネキシンをアポトーシス４Ｔ１細胞とともに１５分間プレインキュベートし、次いで、細胞をＣｙ５ ＰｒＳで染色した。驚くべきことに、これらのタンパク質は同じ標的分子、露出したＰＳに結合すると考えられているが、ＰｒＳの染色は、試験した最高の過剰量である１，０００倍過剰のアネキシンによってさえも遮断されなかった（図３Ｃ）。多くの細胞型で、アネキシンとＰｒＳの共染色が観察された。２つのタンパク質は一般に各細胞型の同じ細胞を染色したが、他の違いも明らかになった。特に、細胞よりも小さいいくつかの物体は、示差的に染色された（図４）。過酸化物処理後に数を増加して存在したこれらの物体は、アポトーシス小体；アポトーシス細胞の断片化中に生成される膜結合細胞断片、として解釈された。これらの物体の一部は両方のタンパク質で染色したが、図４に示すように、ＰｒＳはこれらの実体を染色したが、アネキシンは染色しなかった。この観察は予想外だった。細胞内実体の示差染色をさらに検討するために、標準的な遠心分離プロトコルを使用して、４Ｔ１マウス腫瘍細胞から細胞外小胞（ＥＶ）を調製した。また、２つのタンパク質はこれらの小胞を示差的に染色し（図５）、この結果は、生物学的および治療的意味を持つ可能性がある。
ＥＶ、具体的には、エキソソーム、マイクロベシクル（ＭＶ）、およびアポトーシス小体（ＡＢ）は、細胞間の生体分子の移動を介した細胞間コミュニケーションにおいて重要な役割を果たすと推定される。これらのＥＶ型の生合成は異なり、それらは、エンドソーム（エキソソーム）もしくは原形質膜（ＭＶ）のいずれかから発生するか、またはプログラム細胞死（ＡＢ）の産物である。すべての哺乳類細胞はＥＶを分泌すると考えられている。ＥＶの各型は、分子積み荷を隣接細胞と遠隔細胞の両方に移動させることができ、腫瘍の発生や進行に関与するなどの細胞の挙動に影響を与える。実際、ＥＶは、増殖性シグナル伝達の維持、成長抑制の回避、細胞死への抵抗、エネルギー代謝の再プログラミング、ゲノム不安定性の獲得、および腫瘍微小環境の発達を含む、癌のほぼすべての特質で役割を果たす可能性がある。また、それらは、血管新生の誘導、浸潤の制御、転移前ニッチの開始、炎症の持続、および免疫監視の回避にも関与している。免疫細胞もＥＶを介して通信しているようであり、腫瘍細胞、感染組織、および傷からのシグナルとしてＥＶを認識している。ＥＶの生物学と癌の特質に対するそれらの寄与についてのより深い理解は、癌の診断と治療の新しい可能性につながる。さらなるＥＶ表面マーカーの開発は、この分野を進めるために不可欠であり、ＰｒＳはそのような決定要因となり得る。
蛍光顕微鏡によるこれらの研究に続いて、ＰｒＳおよびアネキシンによる染色の細胞内局在を共焦点顕微鏡により評価した。マウス４Ｔ１細胞（Ｌｕｃ－ＧＦＰレポーターを欠く）を、チャンバーあたり１ｘ１０４細胞で８部チャンバースライドにプレーティングし、翌日、２ｍＭのＨ２Ｏ２またはｔ－ＢＨＰ（２時間暴露）でアポトーシスを誘導した。次いで、細胞を洗浄し、ＰｒＳおよびアネキシンで１５分間染色した。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２色素を使用して核酸を染色した。すべての場合において、最も明るく染色された細胞は両方のプローブで染色された。しかし、多くの細胞では、標識ＰｒＳは細胞質で観察されたが、標識アネキシンは観察されなかった（図６）。アネキシンは内在化され、いくつかの細胞の小胞に出現するが、同じ細胞内で表面局在ＰｒＳを伴った内在化アネキシンは観察されなかった。２つのタンパク質はどちらもＰＳに結合すると予測されていたので、これらの結果は予想外だった。
しかし、明らかに、２つのタンパク質は、試験した阻害剤に対して異なる反応を示した。ＰｒＳの内在化をさらに研究するために、時間経過実験が実施された。アポトーシス４Ｔ１細胞をＣｙ５アネキシンとＦＩＴＣ ＰｒＳで５分間染色し、プローブ添加後５分以内に観察した。ＰｒＳはこれらの細胞の細胞質で即時に観察され、５分以内に内在化を示した（図７）。時間経過の画像はまた、ＰｒＳとアネキシンが初期の時点で同じ細胞を常に等しく染色するわけではないことを示した。図７の細胞は、アポトーシスの異なる段階にあるように見え、左側の細胞は、明らかに無傷の核膜に囲まれた未凝縮核を示しており、一方で、右側の細胞は、アポトーシス過程の後期に起こるクロマチン凝縮に特徴的なことが多い強い染色を示している。これらのような染色パターンは、アポトーシスのより早い段階でアネキシンよりもＰｒＳが結合することを示している可能性がある。この時点では純粋に推測であるが、そのような選択性は、これまで観察されてきたこれらのタンパク質の間の多くの違いを説明する。例えば、図３ＡおよびＢのように、アネキシンではなくＰｒＳによるいくつかの細胞の染色は、アポトーシスの過程の早い段階でのＰｒＳの結合による可能性がある。生きている動物におけるＰｒＳの局在を調べるために、いくつかの実験が実施された。これらの研究では、インビボでのアポトーシスの化学的および感染性誘導、ならびにアポトーシスを誘導することが知られているドキソルビシンで治療された腫瘍へのＰｒＳの局在化を利用した。ＨＹＮＩＣ標識ＰｒＳとアネキシンを使用したＳＰＥＣＴイメージングを、４Ｔ１ｌｕｃ乳房腫瘍を投与し、ドキソルビシンで治療した動物で実施した。４Ｔ１腫瘍はルシフェラーゼで標識されているため、インビボ生物発光イメージング（ＢＬＩ）を使用して、それらはマウス内で画像化できる。この実験からの画像の１つを図８に示す。この方法は、腫瘍移植を評価し、経時的に個々の動物における進行を追跡するために使用できる。次いで、９９ｍＴｃ標識ＰｒＳおよびアネキシンは、ドキソルビシンおよび対照で治療された動物のＳＰＥＣＴイメージングのために使用された。結果の一例を図９に示す。２匹の動物の頭部およびお胸部の画像は、唾液腺におけるＰｒＳプローブの非特異的蓄積と、このプローブを使用した低いシグナル対ノイズ比を示している。そのため、表示されているＰｒＳ画像における表示の閾値を下げて背景をより明らかにし、画像の偽色をより明るくした。低いシグナル対ノイズ比は、たった１ｍｇのタンパク質のＨＹＮＩＣラベリングに起因するようであり、これは最適ではなく、またＨＹＮＩＣ：タンパク質ラベリング比の管理された研究を実行できないことにも起因する。
肝臓でのアポトーシスを誘導するシクロヘキサミドで治療したマウスのＳＰＥＣＴイメージングも実施した（図１０）。図１０では、５匹のマウスの全身画像が各パネルに示されている。多くの放射標識プローブと同様に、腎臓にはバックグラウンドが見られる。マウスをシクロヘキサミドで治療すると、肝臓のアネキシンＳＰＥＣＴシグナルが増加した。繰り返すが、ＰｒＳはアネキシンと比較して低いシグナルを示した。アネキシンは、シクロヘキサミド治療マウスのアポトーシス肝臓を検出することができたが、一方で、ＰｒＳは、治療に起因して肝臓においてシグナルのわずかな増加のみを示した。ＳＰＥＣＴイメージングおよび付随するＨＹＮＩＣ標識の複雑化とは無関係に、ＰｒＳのアポトーシス組織および治療された腫瘍への局在を試験するために、アポトーシス応答を誘導する細菌に感染したマウスおよび担癌マウスにＣｙ５ ＰｒＳを注射した。感染については、本発明者らは、ルシフェラーゼで標識され、ＢＬＩについて十分に特徴づけられた細菌性病原体であるリステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を使用した。脾臓からの特徴的なＢＬＩシグナルは、優れた共局在研究を提供する。上記のようにＣＤ１マウスを感染させ、感染後２日目にＢＬＩで画像化した。次いで、マウスにＣｙ５ ＰｒＳを注射し、３０分後に犠牲にし、切片化および蛍光顕微鏡検査のために脾臓を摘出した（図１１）。すべての場合において、感染マウスの脾臓切片は、対照よりもはるかに大きなＣｙ５蛍光シグナルを示した。図１１では、示された感染マウスの光子数は少なく、これは、この動物では感染がまだあまり進行していないことを示している。多くのマウスは、この日に、脾臓からのこのシグナル強度の１０倍を示す。ただし、Ｃｙ５チャネルの蛍光は、示されている非感染対照に比べて依然として非常に強かった。この結果は、顆粒球とマクロファージがそのような動物におけるアネキシンシグナルの主なソースであることが示されているため、感染に対する進行中の自然免疫応答を反映している可能性がある（これらの細胞は組織破壊を制限するためにアポトーシスのためにプログラムされている）。
次に、ドキソルビシンで治療された４Ｔ１腫瘍への蛍光ＰｒＳの局在を試験した。腫瘍を移植したマウスを上記のようにドキソルビシンで治療し、Ｃｙ５ ＰｒＳを静脈内注射し、その３０分後に犠牲にして、切片化および蛍光顕微鏡検査のために腫瘍を取り出した。結果を図１２に示す。治療動物では強い染色の領域が観察されたが、未治療の腫瘍切片からはより控えめなシグナルが観察された。一部の未治療腫瘍は、バックグラウンドよりも高いシグナルの小さな領域を示したが、未治療切片のいずれにおいても、治療された腫瘍と同様の強度のシグナルは観察されなかった。
幹細胞は、分化細胞とは表現型が異なり、免疫応答の誘導を避けるためにＰＳを非アポトーシス的に発現する場合がある。栄養膜幹細胞（ＴＳＣ）は、培養中のいくつかのタイプの栄養膜に分化する。ＴＳＣは、線維芽細胞成長因子、アクチビン、およびヘパリンの存在下で成長したマウスの子宮掻爬物から調製される。これらの因子が培地から除去されると、ＴＳＣは自発的に巨大細胞に分化する（図１３）。ＴＳＣはＰｒＳで染色されたが、培養中のこれらの細胞に由来する分化した栄養膜は染色されなかった（図１４）。また、本発明者らは、ＰｒＳはアポトーシスを誘導することなく幹細胞に取り込まれることも確認した。この結果は、アポトーシスが誘導された腫瘍細胞株で行われた観察を裏付けている。アポトーシスの誘導を伴うことなく、腫瘍細胞では最小限の染色が観察された。幹細胞の内在化を試験するために、本発明者らは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）およびＴＳＣを利用した。ＭＳＣはマウス骨髄から調製された。骨髄をマウスから洗い流し、成長因子の不在下で６日間培養した。このインキュベーション中に、ＭＳＣおよび造血幹細胞（ＨＳＣ）は複製するが、一方で、線維芽細胞は付着するが、数世代を超えて増殖することはなかった。６日後、単分子層が明らかになる。トリプシン処理により継代すると、付着ＭＳＣは保持されるが、懸濁液中で成長するＨＳＣは失われる。線維芽細胞は成長因子が不在のために持続せず、保持もされない。したがって、この簡単な手順により、ほぼ均一なＭＳＣ集団が得られる。これらの細胞の同一性を確認するために、本発明者らは、デキサメタゾンとグリセロールリン酸（骨芽細胞への分化を誘導するため）またはデキサメタゾンとインドメタシン（脂肪細胞への分化を誘導するため）を用いて培養物を別々に処理した。結果を図１５に示す。上記の処理に応じて、分化した細胞はそれぞれの細胞の外観を示した。脂肪細胞には大きな脂肪小胞が含まれ、骨芽細胞は暗く、特徴的な細胞内コラーゲンおよびミネラル化を伴った。
細胞内染色パターンを評価するために、未分化ＭＳＣをＰｒＳとアネキシン、およびＨｏｅｃｈｓｔ核染色試薬で染色し、共焦点顕微鏡で観察した。観察結果を図１６に示す。ＰｒＳは急速に内在化された。ＭＳＣの場合、ＰｒＳで染色された２０個の細胞のうち約１個は、以前のデータと一致したが、染色された正確な割合は決定されなかった。ＭＳＣの形態は不均一であり、これらの細胞は豊富な物質を培地に分泌し、その一部はチャンバースライドの表面に付着し、一部の画像にバックグラウンドが生じる原因となる。それにもかかわらず、データは、添加の５分以内でのＰｒＳ内在化および表面上のアネキシンを明確に示している。ＴＳＣもＭＳＣで行われたように染色および画像化された。観察により、これらの細胞への内在化も確認され、これもタンパク質の添加から５分以内に生じる。結果を図１７に示す。ＴＳＣは形態的に非常に多様であり、図に見られるように、分化がない場合は多核になる可能性がある。ＭＳＣと同様に、これらの初代細胞は豊富な物質を培地に放出し、本発明者らは、その一部を細胞外小胞として確証した（以前のデータ）。この物質も、画像化を困難にする原因となる。一部のＥＶはＰｒＳではなくアネキシンで染色されるが、この現象は図１８のＴＳＣで確認できる。ＴＳＣのクラスターのこの画像では、細胞によって放出される小胞は、内在化されるＰｒＳではなくアネキシンで染色される。これらのパターンは、ＰｒＳとアネキシンの特異性と結合標的に関する興味深い疑問を提起する。２つのタンパク質は両方ともＰＳに結合すると言われている。ただし、ＥＶへの異なる結合および明確な細胞内局在パターンは、それらがまったく同じ方法では結合していないことを示唆している。この違いの根拠を確立するには、さらなる研究が必要であり、これは重要であることが判明する可能性がある。また、本発明者らは、神経前駆細胞株Ｃ１７．２（図１９）のＰｒＳ染色も観察し、これは、インビトロで星状細胞や他の神経細胞に分化できる形質転換細胞株である。割合は推定値であるが、これらの形質転換細胞の約５％が染色された。驚くべきことに、細胞が４℃に冷却された場合でも、ＴＳＣへの進入が生じた（図２０）。ただし、顕微鏡に配置した後はチャンバーを連続的に冷却することはできないことに留意しなければならない。それにもかかわらず、温度は、画像化手順の５分の時間枠内ではあまり上昇しなかったはずである。この結果は、挑発的であるが、より制御された条件下で明確に繰り返さなければならない。知見が実証された場合、その機序は実に非常に興味深いものであるはずだ。
本発明者らは、造血幹細胞（ＨＳＣ）をＰｒＳで染色することに成功した。フローサイトメトリーを使用して、本発明者らは、ＨＳＣがＰｒＳで染色されることを確認し、共焦点顕微鏡でこれらの細胞のＰｒＳの内部移行を観察した。ＨＳＣは、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を使用して同定および単離された。細胞は、骨髄では陰性系列、ＳＣＡ／ｃ－キット陽性細胞として同定された（図２１）。次に、これらをＦＩＴＣ－ＰｒＳで染色した。ＨＳＣの２つの集団、短期および長期は、ＳＬＡＭマーカー染色のパターンで特定できる。ＳＬＡＭ（Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）マーカーＣＤ４８、ＣＤ１５０、ＣＤ２２９、およびＣＤ２４４は、ＳＬＡＭパターン陽性染色が自己再生と分化の両方の能力の指標となるのに対し、ＳＬＡＭパターン陰性ＨＳＣが分化のみの能力の指標となるように、異なるパターンを伴ってＨＳＣを示差的に染色する。ＰｒＳは、長期ＨＳＣ（図２２）、および短期ＨＳＣ（図２３）のサブセットも染色した。示されている細胞はヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陰性であり、これらはすべて生細胞である。この結果は、アポトーシスの誘導を伴うことなく幹細胞のサブセットがＰｒＳで染色されることを実証する以前の実験を裏付けている。
次に、本発明者らは、ＰｒＳのＨＳＣへの内在化についての試験に進んだ。この実験は多くの要因によって複雑になった。おそらく最も難しいのは、ＨＳＣの培養での生存であり、ここでは、培地で一晩で大量に死亡する。したがって、本発明者らは、フローサイトメトリー分析と共焦点顕微鏡検査が同じ日に行われるように、実験のタイミングを合わせる必要があった。さらに、細胞は接着性ではないため、顕微鏡検査は最適ではない。顕微鏡検査をより効率的にするために、細胞を少量の培地に再懸濁した。最後に、本発明者らは、顕微鏡で分析したＰｒＳ染色細胞がまだ生きていることを確認する必要があった。多くのＨＳＣは、分析と単離のプロセス中に死亡した。そのため、Ｈｏｅｓｃｈｔ核染色に加えてＰＩが追加およびスキャンされ、別のチャネルが使用された。ＰＩの明るい核の存在は、死んだ細胞を示した。これらの困難とタイミングの複雑さにもかかわらず、本発明者らは実験を行うことができ、ＰｒＳの生存ＨＳＣへの内在化を確認した（図２４）。細胞は、核ＰＩ染色の欠如により生きていると確認された。ただし、図２５に示すように、一部の細胞は死んでいるか死にかけていた。示されている実験の複雑さと長さにもかかわらず、結果は内部化を示している。
最後に、図２６では、本発明者らは、ＴＳＣの予備毒性試験を実施し、１３５μｇ／ｍｌの濃度では、ＰＢＳに比べて３０分後に生存率が７８％～７４％に非常にわずかに低下することを確認した。このレベルでは、培養量の１０％がＰｒＳを含む溶液であったことを考慮すると、この結果は、ＰｒＳが基本的に幹細胞に対して無毒であり、観察された軽度の毒性はおそらく調製液自体の汚染内容物に起因するものであるという我々の定性的観察を裏付けた。より低濃度のＰｒＳは生存率に影響を与えなかった。試験したタンパク質の最高レベルは、染色に使用した濃度の１０００倍以上だった。正式にはこのプロジェクトの一部ではなかった完全な毒性試験では、はるかに広範な試験が必要になるが、当節では、ＰｒＳは、非常に少ない毒性しか示さない。
概要
上記の結果は、ＰｒＳが多くのタイプの幹細胞を含むＰｒＳを発現する一連の細胞中に急速に内在化することを示しており、ＰｒＳが治療薬の開発を目的とした操作に適した独自の特性を持っていることを示唆している。さらに、図３および７に見られるように、ＰｒＳとアネキシンの特異性の違いは、結合自体がこれら２つのタンパク質間で異なることを示唆している。アネキシンが四量体であり、ＰｒＳが単量体であるという事実だけではこれらの違いを説明することができず、これらのデータは細胞表面上の他のある成分がＰｒＳ結合に関与している可能性を示唆している。ＰｒＳの結合、特異性、および内在化の機序、ならびにモジュラー操作の特性は、多くの可能性を提供する。
実施例２
幹細胞は、分化細胞とは表現型が異なり、免疫応答の誘導を避けるためにＰＳを非アポトーシス的に発現する場合がある。幹細胞は、アポトーシスの誘導なしに、蛍光標識のペイロードを含む本開示のＧＬＡドメイン分子で染色された。
胎盤でいくつかのタイプの栄養膜に分化する栄養膜幹細胞（図１４）はプロテインＳで染色されたが、培養中のこれらの細胞に由来する分化した栄養膜は染色されなかった。この染色は、インビボで分化した幹細胞とインビトロで分化した細胞を区別することができた。
本開示の分子のこのデータは、インビボまたはインビトロ試料中の細胞を標的とするために使用され得る。
結論
細胞外小胞は、一連の病気の診断および治療のための刺激的な機会となる。本発明者らは、Ｇｌａドメインがホスファチジルセリンの発現を認識することを実証した。この特性は、ホスファチジルセリンを発現する細胞外小胞の同定、細胞外小胞の単離、例えば治療物質を用いる細胞外小胞の標的化、および／またはそれらの小胞への搭載のために利用することができる。これは、細胞外小胞は微小な細胞内実体であるため、驚くべきことである。

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Claims (33)

  1. 表面に露出したホスファチジルセリンを有する細胞外小胞を標的化する方法であって、
    ガンマカルボキシグルタミン酸成分（ＧＬＡ成分）であって、ＧＬＡドメインまたはその活性断片を含み、ＧＬＡタンパク質由来の活性触媒ドメインを含まない、ＧＬＡ成分、を含む分子を、
    前記細胞外小胞を含み得る流体に導入する工程を含む、方法。
  2. 前記細胞外小胞がエキソソームである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記エキソソームが３０ｎｍ～１００ｎｍの範囲の直径を有する、請求項２に記載の方法。
  4. 前記小胞が、１～１．５ｇ／ｍｌの範囲、例えば、１～１．２ｇ／ｍｌ、特に１．１３～１．１９ｇ／ｍｌの密度を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記小胞が、Ｌａｍｐ－１、Ｌａｍｐ－２、ＣＤ１３、ＣＤ８６、フロチリン、シンタキシン－３、ＣＤ２、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１ａ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＩＣＡＭ－１、インテグリンアルファ４、ＬｉＣＡＭ、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ－１アルファおよびベータ、Ｖｔｉ－ＩＡおよびＢ、ＣＤ３イプシロンおよびゼータ、ＣＤ９、ＣＤ１８、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＸＣＲ４、ＦｃＲ、ＧｌｕＲ２／３、ＨＬＡ－ＤＭ（ＭＨＣ ＩＩ）、免疫グロブリン、ＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩ成分、ＴＣＲベータ、テトラスパニン、ならびにそれらの２つ以上の組み合わせから独立して選択される１つ以上の膜貫通タンパク質を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記小胞が、不健康な細胞、例えば、アポトーシス細胞、壊死細胞、癌細胞、病原体感染細胞（ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、または寄生虫感染細胞など）から放出された、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記細胞が癌細胞である、請求項６に記載の方法。
  8. 前記細胞が癌幹細胞である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記流体が、生体外患者試料、例えば、血液試料、嚢胞または腫瘍から採取された流体、均質化された生検または類似物を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. ＧＬＡドメインまたはその活性断片が独立して、トロンビン、ＶＩＩ因子、ＩＸ因子、Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、オステオカルシン、マトリックスＧＬＡタンパク質、ＧＡＳ６、トランススレチン、ペリオスチン、プロリンリッチＧＬＡ１、プロリンリッチＧＬＡ２、プロリンリッチＧＬＡ３、およびプロリンリッチＧＬＡ４から選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. ＧＬＡドメインまたはその活性断片がプロテインＳ由来であり、例えば、配列番号１に示される配列を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記ＧＬＡドメイン成分が、ＥＧＦドメイン、例えば、カルシウム結合ＥＧＦドメインをさらに含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記構築物が、トロンビン、ＶＩＩ因子、ＩＸ因子、Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、オステオカルシン、マトリックスＧＬＡタンパク質、ＧＡＳ６、トランススレチン、ペリオスチン、プロリンリッチＧＬＡ１、プロリンリッチＧＬＡ２、プロリンリッチＧＬＡ３、およびプロリンリッチＧＬＡ４から選択されるＥＧＦドメインを含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記構築物が、プロテインＳから選択されるＥＧＦドメインを含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記ＧＬＡ成分が、配列番号６に示される配列またはＨｉｓタグが存在しないその誘導体、特に配列番号６を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記ＧＬＡドメイン成分が、クリングルドメインをさらに含む、請求項１～１５のいずれかに記載の方法。
  17. 前記クリングルドメインが、活性化転写因子２（ＡＴＦ）；ＸＩＩ因子（Ｆ１２）；トロンビン（Ｆ２）；ヒアルロナン結合タンパク質２（ＨＡＢＰ２）；肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）；肝細胞増殖因子活性化因子（ＨＧＦＡＣ）；クレメン（Ｋｒｅｍｅｎ）タンパク質１（ＫＲＥＭＥＮ１）；ＫＲＥＭＥＮ２；リポタンパク質（ａ）（ＬＰＡ）；ＬＰＡＬ２；マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰまたはＭＳＴ１）；ホスホイノシチド－３－キナーゼ相互作用タンパク質１（ＰＩＫ３ＩＰ１）；組織プラスミノーゲン活性化因子（ＰＬＡＴ）；ウロキナーゼ（ＰＬＡＵ）；プラスミン（ＰＬＧ）；ＰＲＳＳ１２；チロシンプロテインキナーゼ膜貫通受容体ＲＯＲ１（ＲＯＲ１）；およびチロシンプロテインキナーゼ膜貫通受容体ＲＯＲ２（ＲＯＲ２）を含む群から選択されるタンパク質に由来する、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記ＧＬＡ成分が、ペイロードに連結される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記ＧＬＡ成分が、前記ペイロードにコンジュゲートされる、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記ＧＬＡ成分が、融合タンパク質の一部である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. ペイロードが検出可能な標識を含む、請求項１９に記載の方法。
  22. 前記標識が、蛍光タンパク質（の場合を含む、蛍光プローブ（ローダミン色素、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ、ＣＹ５など）、ビオチン、酵素、タグ（例えば、ＨＩＳタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ）、放射性核種（特に、放射性ヨウ化物、放射性同位体、例えば、９９ｍＴｃ）、発光標識、または前記検出可能な標識がモレキュラービーコン内にある場合を含む、ＮＭＲもしくはＥＳＲ分光法により検出できる化合物から選択される、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記ペイロードが、ビーズ、プレート、またはタグ、例えば、磁気ビーズなどの単離可能なビーズである、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記ペイロードが、リンカーを介して前記ＧＬＡ成分に連結される、請求項１８～２３に記載の方法。
  25. 前記リンカーが切断可能である、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記方法が、前記小胞の富化された集団を提供するさらなる工程を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記方法が、前記小胞を単離する工程を含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記ＧＬＡ成分を含む前記分子が治療薬である、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記ペイロードが、薬物、化学療法剤、ペプチド（ステープルペプチドを含む）、または生物学的治療薬、例えば、抗ウイルス薬、抗菌薬、抗寄生虫剤、抗癌剤、抗癌療法、または腫瘍溶解性ウイルスもしくはウイルスベクターを含む、請求項１７～２１および２９のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記ペイロードが、毒素、ポリマー（例えば、合成もしくは天然に生じるポリマー）、生物学的に活性なタンパク質（例えば、酵素、他の抗体もしくは抗体断片）、薬物（小分子（化学物質）、ｃ、核酸およびその断片（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの断片）、金属キレート剤、ナノ粒子、またはそれらの２つ以上の組み合わせを含む、請求項１～２１、２９および３０のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記ＧＬＡ成分およびペイロードを含む前記分子を癌患者に投与することを含む、請求項１～２２および２４～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記癌が、上皮癌、例えば、結腸直腸癌、精巣癌、肝臓癌、胆道癌、前立腺癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮癌、胃癌、食道癌、甲状腺癌、腎癌、膀胱癌、脳癌、頭頸部癌、もしくは肺癌であるか、または代替的には、前記癌が、血液癌、例えば白血病、リンパ腫、骨髄腫、ならびにＡＭＬ、ＣＭＬ、ＡＬＬ、およびＣＬＬなどの慢性骨髄増殖性疾患である、請求項３１に記載の方法。
  33. 請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法から取得可能な小胞または小胞の集団。
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