JP2020533021A - 幹細胞へのペイロードの送達 - Google Patents

Abstract

本開示は、表面に露出しているホスファチジルセリンと結合することができるＧｌａドメインを用いて、幹細胞、特に非アポトーシス幹細胞を標的にする方法に関する。【選択図】図１Ｅ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年９月５日に出願された米国仮特許出願第６２／５５４，５３０号、２０１７年９月５日に出願された米国仮特許出願第６２／５５４，５３３号、２０１７年１０月６日に出願された米国仮特許出願第６２／５６９，４０３号、２０１７年１０月６日に出願された米国仮特許出願第６２／５６９，４１１号、２０１７年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／５８４，５６５号、及び２０１７年１１月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／５９３，０１４号の利益を主張するものであり、これらの仮特許出願の各々は、その全体が参照により本明細書に援用される。

配列表の援用
本出願はＥＦＳ−Ｗｅｂを使用して電子的に提出された配列表を含むが、この配列表は、紙コピーとコンピュータで読み取り可能な形式（ＣＲＦ）の両方で提供されており、２０１８年９月５日に作成され、サイズが９，８３１バイトである「ＳＴ−ＣＴ１−ＰＣＴ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｔｘｔ」という題目のファイルに記載されている。この配列表はその全体が参照により本明細書に援用される。

本開示は、例えば、細胞内への取り込みを促すことを目的に、Ｇｌａドメインを用いて、幹細胞、特に非アポトーシス幹細胞を標的にする方法に関する。

Ｇｌａドメインは、種々のＧｌａタンパク質に含まれており、このタンパク質の例として、トロンビン、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ（ＰｒＳ）、プロテインＺ、オステオカルシン、マトリックスＧｌａタンパク質、ＧＡＳ６、トランスサイレチン、ペリオスチン、プロリンリッチＧｌａ１、プロリンリッチＧｌａ２、プロリンリッチＧｌａ３、及び、プロリンリッチＧｌａ４などがある。

いわゆるＧｌａタンパク質のＧｌａドメインは、癌細胞及び病原体感染細胞などのアポトーシス細胞の表面でホスファチジルセリン（ＰｔｄＳ、またＰＳとも称する）を結合させることができる。ホスファチジルセリンを特異的に結合させる触媒ドメインを除外した分子について、国際公開第２０１４／１５１５３５号及び国際公開第２０１４／１５１６８３号に開示されており、これらは参照により本明細書に援用される。

Ｇｌａドメイン（ビタミンＫ依存性カルボキシル化／ガンマ−カルボキシルグルタミン化）は、アミノ酸配列において、グルタミン酸残基がビタミンＫ依存性翻訳後のカルボキシル化によって修飾されて、ガンマ−カルボキシルグルタミン酸（Ｇｌａ）となったタンパク質ドメインである。

このＧｌａドメインは、２つのカルボン酸残基の間にカルシウムイオンをキレート化することによってカルシウムイオンを結合させる。これらの残基は、Ｇｌａタンパク質の成熟形態のＮ末端から保存芳香族残基まで連続する領域の一部にある。このため、このドメインの中央部に保存Ｇｌａ−ｘ（３）−Ｇｌａ−ｘ−Ｃｙｓモチーフをもたらし、これはカルボキシラーゼの基質認識に重要な役割を果たすと考えられている。

ホスファチジルセリンはアポトーシス細胞の保存マーカーであり、疾患細胞が免疫クリアランスまたは免疫寛容誘導を減じるのに用いる機序の一部に関わると考えられてきた。このことから、Ｇｌａドメインはアポトーシス細胞のみに結合すると仮定されていた。しかし、驚くべきことに、本発明者らは、本開示のＧｌａドメインを用いて非アポトーシス幹細胞及び／または癌幹細胞などの幹細胞を標的にすることができることを明らかにした。さらに驚くべきことに、本発明者らは、本開示で使用するＧｌａドメインが通常の健常分化細胞とは結合しないこと示唆する証拠を得ている。

このことは、例えば、白血病などの血液癌といった症状を治療するのに用いる幹細胞療法に大きな意味を持つことになる。幹細胞療法は、患者自身の骨髄／幹細胞／免疫系を一掃してからでない限り行うことができない。

この一掃プロセスには、例えば高用量の化学療法、放射線療法、及び／またはＢ細胞除去療法などの「除去療法」が必要になる。

この「除去療法」には副作用が多く、例えば副作用には、口痛及び咽頭痛（患者が食事をするのを困難にする可能性がある）、吐き気及び嘔吐、肺炎及びＣＭＶなどの感染易感染性、貧血、出血、不妊、認知機能障害などがある。こうした副作用は極めて重症なものであり、患者、特に子供が対処するのは困難である。この副作用を最小化するか回避することができれば、患者の生活の質（ＱＯＬ）を大きく向上することができると考えられる。

免疫系を一掃し再起動させると、進行型ＭＳを寛解させることがわかっている。しかしながら、この治療は付随するリスクが大きいため、極めて重症な場合にのみ使用されている。一方で、本開示はＧｌａ成分を用いることで、化学療法が特異的に幹細胞を標的にできるようにする。

本発明は、幹細胞、特に非アポトーシス幹細胞を「特異的に」標的にする機序を提供するものである。本方法で標的とした幹細胞を、例えば単離、処理（遺伝子修正、増強、付加を含む）、標識化、形質転換及び／または除去することができる。したがって、本開示の方法を用いて、幹細胞に治療的介入を行うことができ、例えば遺伝物質及び／もしくはタンパク性物質ならびに／または化学療法剤を送達することができる。

本開示のＧｌａドメインを検出可能な標識、例えば蛍光標識、Ｈｉｓタグ、または磁気ビーズと連結させて、幹細胞の単離及び分類などを行うことができる。これは、診断幹細胞または単離幹細胞をさらに処理して治療用途で利用するのに有益となり得るものである。

本開示を以下の「番号を付した」項にまとめる。

項１ａ．
幹細胞を標的にする方法であって、ガンマ−カルボキシルグルタミン酸成分（Ｇｌａ成分）に連結したペイロードを含む分子と細胞とを接触させる工程を含み、
前記Ｇｌａ成分が、Ｇｌａドメインまたはその活性断片を含み、Ｇｌａタンパク質由来の活性触媒ドメインを含まない、方法。

項１ｂ．
ガンマ−カルボキシルグルタミン酸成分（Ｇｌａ成分）に連結したペイロードを含む分子であって、
前記Ｇｌａ成分が、幹細胞の治療または診断用に、Ｇｌａドメインまたはその活性断片を含み、Ｇｌａタンパク質由来の活性触媒ドメインを含まない、分子。

項１ｃ．
ガンマ−カルボキシルグルタミン酸成分（Ｇｌａ成分）に連結したペイロードを含む分子であって、
前記Ｇｌａ成分が、幹細胞の治療または診断に適した薬剤の製造用に、Ｇｌａドメインまたはその活性断片を含み、Ｇｌａタンパク質由来の活性触媒ドメインを含まない、分子。

項２．
Ｇｌａドメインまたはその活性断片が、トロンビン、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、オステオカルシン、マトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）、ＧＡＳ６、トランスサイレチン（ＴＴＲ）、インターアルファトリプシン阻害剤、ペリオスチン、プロリンリッチＧｌａ１（ＰＲＲＧ１）、プロリンリッチＧｌａ２（ＰＲＲＧ２）、プロリンリッチＧｌａ３（ＰＲＲＧ３）、及び、プロリンリッチＧｌａ４（ＰＲＲＧ４）から独立して選択される、項１ａ、項１ｂ、または項１ｃに記載の使用のための方法または分子。

項３．
前記Ｇｌａドメインまたはその活性断片が、トロンビン、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、及びＧＡＳ６から独立して選択され、例えば、前記ＧｌａドメインがプロテインＳ、特に配列番号１に示した配列由来である、項２に記載の使用のための方法または分子。

項４．
前記Ｇｌａ成分が、ＥＧＦドメイン、例えばカルシウム結合ＥＧＦドメインをさらに含む、項１ａ、項１ｂ、または項１ｃから項３に記載の方法または分子。

項５．
構築物が、トロンビン、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、オステオカルシン、マトリックスＧｌａタンパク質、ＧＡＳ６、トランスサイレチン、ペリオスチン、プロリンリッチＧｌａ１、プロリンリッチＧｌａ２、プロリンリッチＧｌａ３、及びプロリンリッチＧｌａ４から選択されるＥＧＦドメインを含む、項１ａ、項１ｂ、または項１ｃから項４に記載の使用のための方法または分子。

項６．
前記ＥＧＦドメインが、トロンビン、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、及びＧＡＳ６から選択され、例えば、前記ＥＧＦドメインがプロテインＳ由来である、項５に記載の使用のための方法または分子。

項７．
前記Ｇｌａ成分が配列番号６に示した配列か、またはＨｉｓタグを除外したその誘導体を含む、項１ａ、項１ｂ、または項１ｃから項６のいずれか１項に記載の使用のための方法または分子。

項８．
前記Ｇｌａドメイン成分が、クリングルドメインをさらに含む、項１ａ、項１ｂ、または項１ｃから項７に記載の使用のための方法または分子。

項９．
前記クリングルドメインが、活性化転写因子２（ＡＴＦ）、第ＸＩＩ因子（Ｆ１２）、トロンビン（Ｆ２）、ヒアルロン酸結合タンパク質２（ＨＡＢＰ２）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、肝細胞増殖因子活性化因子（ＨＧＦＡＣ）、クレメンタンパク質１（ＫＲＥＭＥＮ１）、ＫＲＥＭＥＮ２、リポタンパク質（Ａ）（ＬＰＡ）、ＬＰＡＬ２、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰまたはＭＳＴ１）、ホスホイノシチド３キナーゼ相互作用タンパク質１（ＰＩＫ３ＩＰ１）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＰＬＡＴ）、ウロキナーゼ（ＰＬＡＵ）、プラスミン（ＰＬＧ）、ＰＲＳＳ１２、チロシンプロテインキナーゼ膜貫通受容体ＲＯＲ１（ＲＯＲ１）、及びチロシンプロテインキナーゼ膜貫通受容体ＲＯＲ２（ＲＯＲ２）からなる群から選択されるタンパク質由来である、項８に記載の使用のための方法または分子。

項１０．
前記方法がインビトロで実施される、項１ａ、項１ｂ、または項１ｃから項９のいずれか１項に記載の方法。

項１１．
前記送達がインビボで細胞に対するものであり、例えば、前記Ｇｌａ成分と前記ペイロードとを含む分子が、患者、例えばヒト患者に投与される、項１ａ、項１ｂ、または項１ｃから項１０のいずれか１項に記載の方法。

項１２．
前記分子が、幹細胞の外表面を標的にする、項１ａ、項１ｂ、または項１ｃから項１１に記載の使用のための方法または分子。

項１３．
前記分子が、幹細胞に内部移行されている、項１ａ、項１ｂ、または項１ｃから項１２に記載の使用のための方法または分子。

項１４．
前記細胞が非アポトーシス性（すなわち健常幹細胞）である、項１ａ、項１ｂ、または項１ｃから項１３に記載の使用のための方法または分子。

項１５．
前記細胞が、アポトーシス性、例えば疾患幹細胞である、項１ａ、項１ｂ、または項１ｃから項１３に記載の使用のための方法または分子。

項１６．
前記幹細胞が、成人幹細胞であり、例えば、外套細胞、放射状グリア細胞、骨髄間質細胞、骨膜、膵臓前駆細胞、血管内皮前駆細胞、芽細胞、及び栄養膜幹細胞などの、前駆細胞、造血幹細胞、筋原幹細胞、骨芽前駆幹細胞、神経幹細胞、及び間葉系幹細胞を含む、項１ａ、項１ｂ、または項１ｃから項１５に記載の使用のための方法または分子。

項１７．
前記幹細胞が表面マーカーＣＤ３４を発現する、項１ａ、項１ｂ、または項１ｃから項１６に記載の使用のための方法または分子。

項１８．
前記幹細胞がＬｉｎｅａｇｅ陽性表面マーカーに対して陰性である（すなわちＬｉｎ−ｖｅである）、項１ａ、項１ｂ、または項１ｃから項１７に記載の使用のための方法または分子。

項１９．
前記幹細胞が、Ｌｉｎ−ｖｅ、ＣＤ３４＋ｖｅ、ＣＤ３８−ｖｅ、ＣＤ４５ＲＡ−ｖｅ、ＣＤ９０陽性、及びＣＤ４９ｆ＋ｖｅである、項１ａ、項１ｂ、または項１ｃから項１８に記載の使用のための方法または分子。

項２０．
前記幹細胞が造血幹細胞である、項１ａ、項１ｂ、または項１ｃから項１７に記載の使用のための方法または分子。

項２１．
前記幹細胞が、ＣＤ４８、ＣＤ１５０、ＣＤ２４４、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＳＣＡ−１、Ｔｈｙ１．１、ｃ−ｋｉｔ、ｌｉｎ、ＣＤ１３５、ｓｌａｍ１／ＣＤ１５０、Ｍａｃ−１（ＣＤ１１ｂ）、ＣＤ４、幹細胞因子（ＳＣＦ）、及びこれらのうちの２つ以上の組み合わせ由来の表面マーカーを発現する、項２０に記載の使用のための方法または分子。

項２２．
前記幹細胞が骨芽前駆細胞である、項１ａ、項１ｂ、または項１ｃから項１９に記載の使用のための方法または分子。

項２３．
前記幹細胞が、グレムリン１、ＴＧＦ−β、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ−２、ＡＬＰＰ、ＭＣＡＭ、コラーゲンＩ、コラーゲン１アルファ１、コラーゲンＩＩ、ＲＵＮＸ２、デコリン、及びこれら（前記の全てのマーカーなど）のうちの２つ以上の組み合わせから選択される表面マーカーを発現する、項２２に記載の使用のための方法または分子。

項２４．
前記幹細胞が骨芽細胞またはその前駆細胞である、項２２または項２３に記載の使用のための方法または分子。

項２５．
前記幹細胞が、Ｒｕｎｘ２、アルカリホスファターゼ／ＡＬＰＰ／ＡＬＰＩ、オステオカルシン、ＢＡＰ１、ＯＰＮ、ＢＡＰ３１、コラーゲンＩ、ＳＣＵＢＥ３、フィブロネクチン、ＳＰＡＲＣ、ＩＧＦＢＰ−３、及びこれら（前記の全てのマーカーなど）のうちの２つ以上の組み合わせから選択される表面マーカーを発現する、項２４に記載の使用のための方法または分子。

項２６．
前記幹細胞が骨細胞またはその前駆細胞である、項１ａ、項１ｂ、または項１ｃから項１６に記載の使用のための方法または分子。

項２７．
前記幹細胞が、ＴＧＦβ、ＲＡＮＫＬ、ＭＣＳＦ、スクレロスチン、ＤＫＫ、及びこれら（前記の全てのマーカーなど）のうちの２つ以上の組み合わせから選択される表面マーカーを発現する、項２６に記載の使用のための方法または分子。

項２８．
前記幹細胞が、オステリックス＋ｖｅ、ＣＤ９０＋ｖｅ、オステオカルシン＋ｖｅ、コラーゲンＩ＋ｖｅ、骨シアロタンパク質＋ｖｅ、及びこれら（前記の全てのマーカーなど）のうちの２つ以上の組み合わせから選択される表面マーカーを発現する、項２６に記載の使用のための方法または分子。

項２９．
前記幹細胞が、アルカリホスファターゼ／ＡＬＰＰ（胎盤性アルカリホスファターゼ）／ＡＬＰＩ＋ｖｅ、コラーゲンＩ＋ｖｅ、コラーゲンＩＩ＋ｖｅ、デコリン＋ｖｅ、ＭＣＡＭ／ＣＤ１４６＋ｖｅ、ＭＥＰＥ／ＯＦ４５＋ｖｅ、オステリックス＋ｖｅ、ＣＤ９０＋ｖｅ、オステリックス／Ｓｐ７＋ｖｅ、ＲＵＮＸ２／ＣＢＦＡ１＋ｖｅ、トロンボポエチン／Ｔｐｏ＋ｖｅ、及びこれら（前記の全てのマーカーなど）のうちの２つ以上の組み合わせから選択される表面マーカーを発現する、項２６に記載の使用のための方法または分子。

項３０．
前記幹細胞が筋原幹細胞である、項１ａ、項１ｂ、または項１ｃから項１９のいずれか１項に記載の使用のための方法または分子。

項３１．
前記幹細胞が、ＣＤ５６、ＣＤ１４６、ＶＥ−カドヘリン、アルファ−平滑筋アクチン、ＦＡＢＰ３、インテグリンアルファ７、デスミン、ミオシン重鎖、ＵＥＡ−１受容体、及びこれら（前記の全てのマーカーなど）のうちの２つ以上の組み合わせから選択されるマーカーを発現する、項３０に記載の使用のための方法または分子。

項３２．
前記幹細胞が神経幹細胞である、項１ａ、項１ｂ、または項１ｃから項１９に記載の使用のための方法または分子。

項３３．
前記幹細胞が、ＣＤ１３３、ＣＤ１５、ＣＤ２４低発現（ｌｏｗ）または陰性（−ｖｅ）、ＧＣＴＭ−２、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ネスチン、Ｓｏｘ−２、ＡＢＣＧ２、ＦＧＦ Ｒ４、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−９、及びこれら（前記の全てのマーカーなど）のうちの２つ以上の組み合わせから選択されるマーカーを発現する、項３２に記載の使用のための方法または分子。

項３４．
前記ＣＤ２４マーカーが低発現（ｌｏｗ）または陰性（−ｖｅ）である、項３３に記載の使用のための方法または分子。

項３５．
前記幹細胞が、ＣＤ１３３＋ｖｅ、５Ｅ１２＋ｖｅ、ＣＤ３４−ｖｅ、ＣＤ４５−ｖｅ、及びＣＤ２４低発現（ｌｏｗ）または陰性（−ｖｅ）のマーカー組み合わせを発現する、項３３または項３４に記載の使用のための方法または分子。

項３６．
前記幹細胞が間葉系幹細胞である、項１ａ、項１ｂ、または項１ｃから項１９に記載の使用のための方法または分子。

項３７．
前記幹細胞が、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ２７１、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ２４０、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−９、ＣＤ２９、ＣＤ９０、ＣＤ１４６、ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ４、ＳＴＲＯ−１、幹細胞因子（ＳＣＦ）、及びこれらのうちの２つ以上の組み合わせから選択される表面マーカーを発現する、項３６に記載の使用のための方法または分子。

項３８．
前記幹細胞が脂肪由来である、項１ａ、項１ｂ、または項１ｃから項１９に記載の使用のための方法または分子。

項３９．
前記幹細胞が、Ｋ１５、ＣＤ３４、ネスチン、フォリスタチン、ｐ６３、インテグリンアルファ６、テネイシンＣ、ＥＧＦＲ、ＩＧＦＲ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ因子、及びこれらのうちの２つ以上の組み合わせから選択される表面マーカーを発現する、項３８に記載の使用のための方法または分子。

項４０．
前記幹細胞が、ＣＤ４４、ＩＣＡＭ／ＣＤ５４、ＣＤ３４、インテグリンファミリーメンバー、及びこれらのうちの２つ以上の組み合わせから選択される表面マーカーを発現する、項３８または項３９に記載の使用のための方法または分子。

項４１．
前記幹細胞が卵巣及び卵管上皮幹細胞である、項１ａ、項１ｂ、または項１ｃから項１９に記載の使用のための方法または分子。

項４２．
前記幹細胞が、グレムリン１、Ｌｒｉｇ１、Ｌｇｒ５、Ｂｍｉ１、Ｔｅｒｔ、ＨｏｐＸ、及びこれらのうちの２つ以上の組み合わせから選択される表面マーカーを発現する、項４１に記載の方法。

項４３．
前記幹細胞が胚性幹細胞である、項１ａ、項１ｂ、または項１ｃから項１５に記載の使用のための方法または分子。

項４４．
前記幹細胞を、ＣＤ２４、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ５９、ＣＤ９０、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ３２４、ＣＤ３２６、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ５、幹細胞因子、クリプト（ＴＤＧＦ−１）から選択される１つまたは複数の表面マーカーに基づいて特定することができる、項４３に記載の使用のための方法または分子。

項４５．
前記幹細胞が非癌性である、項１ａ、項１ｂ、または項１ｃから項４４に記載の使用のための方法または分子。

項４６．
前記幹細胞が癌幹細胞である、項１ａ、項１ｂ、または項１ｃから項４４に記載の使用のための方法または分子。

項４７．
前記癌幹細胞が上皮由来のものである、項４６に記載の使用のための方法または分子。

項４８．
癌幹細胞が、ＣＤ４４（少なくとも乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵癌、扁平上皮癌、及び膀胱癌において過剰発現しているもの）、ＣＤ１３３（少なくとも脳腫瘍、大腸癌、肺癌、前立腺癌、及び髄芽腫において過剰発現しているもの）、ＣＤ２４、ＣＤ９０、ＣＤ２７１、ＣＤ４ｆ、ＣＤ１３、及びこれらのうちの２つ以上の組み合わせ（他のマーカーとしてＡＢＣＢ５^＋、ＣＤ４４^＋／ＣＤ２４、ＣＤ３４^＋／ＣＤ３８⁻、及びＣＤ４４^＋／ＥＳＡ^＋が含まれる）から選択される表面マーカーを発現する、項４６または項４７に記載の使用のための方法または分子。

項４９．
前記幹細胞が造血由来のものである、項４６に記載の使用のための方法または分子。

項５０．
前記細胞がＣＤ１９、ＷＴ−１、及びこれらの組み合わせから選択されるマーカーを有する、項４９に記載の使用のための方法または分子。

項５１．
前記Ｇｌａ成分がペイロードと結合している、項１から項５０のいずれか１項に記載の使用のための方法または分子。

項５２．
前記ペイロードが、治療剤、標的剤、及び／または標識を含む、項１ａ、項１ｂ、または項１ｃから項５１に記載の使用のための方法または分子。

項５３．
前記治療剤が、化学物質または生体分子（タンパク質など）、例えば、抗癌剤、抗癌療法剤、化学療法剤、腫瘍崩壊ウイルスなどのウイルスベクターである、項５２に記載の使用のための方法または分子。

項５４．
前記ペイロードが、毒素、ポリマー（例えば、合成ポリマーまたは天然ポリマー）、生物学的活性タンパク質（例えば、酵素、抗体または抗体断片）、薬剤（例えば、小分子（化学物質）または化学療法剤）、核酸及びその断片（例えば、ＤＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びｓｉＲＮＡなどのＲＮＡ、ならびにその断片（ＣＲＩＳＰＲＣａｓ９のｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲａ／ｉを含む））、放射性核種（特に放射性ヨウ素、放射性同位体）、金属キレート剤、ナノ粒子、ならびにレポーター基（蛍光標識もしくは発光標識、またはＮＭＲもしくはＥＳＲ分光器で検出され得る化合物など）から選択される、項１ａ、項１ｂ、または項１ｃから項５３に記載の使用のための方法または分子。

項５５．
前記毒素が、アウリスタチン（例えば、ＭＭＡＥ（モノメチルアウリスタチンＥ）、ＭＭＡＦ（モノメチルアウリスタチンＦ））、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ドキソルビシン、デュオカルマイシン、マイタンシノイド（例えば、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ３）、及びＮ２’−デアセチル−Ｎ２’（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４））、カリケアミシン、ドラスタチン、メイタンシン、α−アマニチン、シュードモナス外毒素（ＰＥ３８）、リシンＡ鎖、ジフテリア毒素、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）、サポリン、ゲロニン、及びチューブリシンから選択される、項５４に記載の使用のための方法または分子。

項５６．
前記化学療法剤が、テモゾロミド、エポチロン類、メルファラン、カルムスチン、ブスルファン、ロムスチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ポリフェプロザン、イホスファミド、クロラムブシル、メクロレタミン、ブスルファン、シクロホスファミド、カルボプラチン、シスプラチン、チオテパ、カペシタビン、ストレプトゾシン、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、酢酸ロイプロリド、塩酸ドキソルビシン、硫酸ブレオマイシン、塩酸ダウノルビシン、ダクチノマイシン、リポソームクエン酸ダウノルビシン、リポソーム塩酸ドキソルビシン、塩酸エピルビシン、塩酸イダルビシン、マイトマイシン、ドキソルビシン、バルルビシン、アナストロゾール、クエン酸トレミフェン、シタラビン、フルオロウラシル、フルダラビン、フロクスウリジン、インターフェロンα−２ｂ、プリカマイシン、メルカプトプリン、メトトレキサート、インターフェロンα−２ａ、酢酸メドロキシプロゲステロン、リン酸エストラムスチンナトリウム、エストラジオール、酢酸ロイプロリド、酢酸メゲストロール、酢酸オクトレオチド、ジエチルスチルベステロール二リン酸、テストラクトン、酢酸ゴセレリン、リン酸エトポシド、硫酸ビンクリスチン、エトポシド、ビンブラスチン、エトポシド、硫酸ビンクリスチン、テニポシド、トラスツズマブ、ゲムツズマブオゾガミシン、リツキシマブ、エキセメスタン、塩酸イリノテカン、アスパラギナーゼ、塩酸ゲムシタビン、アルトレタミン、塩酸トポテカン、ヒドロキシ尿素、クラドリビン、ミトタン、塩酸プロカルバジン、酒石酸ビノレルビン、ペントロスタチン（pentrostatin）ナトリウム、ミトキサントロン、ペガスパルガーゼ、デニロイキンジフチトクス、アリトレチノイン、ポルフィマー、ベキサロテン、パクリタキセル、ドセタキセル、三酸化ヒ素、トレチノイン、及びこれらのうちの２つ以上の組み合わせから選択される、項５３に記載の使用のための方法または分子。

項５７．
前記化学療法剤が、アルキル化剤、チミジル酸シンターゼ阻害剤などの代謝拮抗剤、タキサン、アントラサイクリン、植物アルカロイドを含む微小管阻害剤、及びこれらのうちの２つ以上の組み合わせから選択される、項５２から項５４のいずれか１項に記載の使用のための方法または分子。

項５８．
前記化学療法剤が、パクリタキセル、ドセタキセル、アブラキサン、カバジタキセル、これらのうちのいずれか１つの誘導体、及び上述のいずれかのうちの２つ以上の組み合わせから選択される、項５７に記載の使用のための方法または分子。

項５９．
前記アルキル化剤が、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア（カルムスチンなど）、テトラジン、アジリジン、プラチン及びその誘導体、非古典的アルキル化剤、ならびにこれらのうちの２つ以上の組み合わせから選択される、項５７または項５８に記載の方法。

項６０．
前記プラチンが、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、ピコプラチン、ネダプラチン、トリプラチン、リポプラチン、及びこれらのうちの２つ以上の組み合わせから選択される、項５９に記載の使用のための方法または分子。

項６１．
前記アルキル化剤が、葉酸代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート及びペメトレキセド）、プリンアナログ類（例えば、アザチオプリンなどのチオプリン類、メルカプトプリン、チオプリン、フルダラビン（リン酸塩の形態を含む）、ペントスタチン、及びクラドリビン）、ピリミジンアナログ（例えば、５−フルオロウラシルなどのフロロピリミジン類、及びカペシタビン（Xeloda（登録商標）などのそのプロドラッグ））、フロクスウリジン、ゲムシタビン、シタラビン、デシタビン、塩酸ラルチトレキセド（トムデックス）、クラドリビン、及び６−アザウラシル、ならびにこれらのうちの２つの組み合わせから選択される代謝拮抗剤である、項５７または項５８のうちのいずれか１項に記載の使用のための方法または分子。

項６２．
前記アントラサイクリンが、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ダウノルビシン（リポソーム）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ドキソルビシン（リポソーム）、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、及びこれらの２つ以上の組み合わせから選択される、項５６から項６０のうちのいずれか１項に記載の使用のための方法または分子。

項６３．
前記薬剤が、例えば、トポイソメラーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、及びこれらのうちの２つ以上の組み合わせから選択される抗癌剤である、項５３から項６２のうちのいずれか１項に記載の使用のための方法または分子。

項６４．
前記抗癌療法剤が、例えば、Ｙ−９０、Ｐ−３２、Ｉ−１３１、Ｉｎ−１１１、Ｓｒ−８９、Ｒｅ−１８６、Ｓｍ−１５３、Ｓｎ−１１７ｍ、及びこれらのうちの２つ以上の組み合わせから選択される放射性核種である、項５３から項６４のうちのいずれか１項に記載の使用のための方法または分子。

項６５．
前記Ｇｌａ成分とペイロードとを含む前記分子を、癌患者であって、例えば前記癌が難治性である癌患者に投与することを含む、項１ａ、項１ｂ、または項１ｃから項６４のうちのいずれか１項に記載の使用のための方法または分子。

項６６．
前記癌が、上皮癌、例えば結腸直腸癌、精巣癌、肝癌、胆道癌、神経膠芽腫、黒色腫、前立腺癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮癌、胃癌、食道癌、甲状腺癌、腎癌、膀胱癌、脳癌、頭頸部癌、もしくは肺癌であるか、または前記癌が、血液癌、例えば白血病、リンパ腫、骨髄腫、及び慢性骨髄増多症（ＡＭＬ、ＣＭＬ、ＡＬＬ、及びＣＬＬなど）であり得る、項６５に記載の使用のための方法または分子。

項６７．
前記ペイロードが前記細胞内で活性形態に変換される、項１から項６６のいずれか１項に記載の使用のための方法または分子。

項６８．
前記活性形態への変換が酵素により行われる、項６７に記載の使用のための方法または分子。

項６９．
前記酵素が、カルボキシルエステラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、パラオキソナーゼ（パラオキソナーゼ２など）、マトリックスメタロプロテアーゼ、アルカリホスファターゼ、β−グルクロニダーゼ、プリン−ヌクレオシドホスホリラーゼ、ベータ−ラクタマーゼ（例えば、結核菌及びマイコバクテリウム・カンサシイにより産生されるもの）、及びシトシンデアミナーゼから選択される、項６８に記載の使用のための方法または分子。

項７０．
前記Ｇｌａ成分が、配列番号６に示した配列か、またはＨｉｓタグを除いて同一の配列を有する、項１から項６９のうちのいずれか１項に記載の方法または分子。

一実施形態では、Ｇｌａ成分は、内部移行前に細胞表面に露出しているホスファチジルセリンと結合する。

理論に束縛されることを望まないが、本発明者らは、生物学的な観点から鑑み、ホスファチジルセリンの全てが同じというわけではないと考えている。本発明者らは、酵素ＴＭＥＭ１６Ｆにより露出したホスファチジルセリンが免疫抑制に関与しており、本開示の分子が「認識」するものであると考える。

一実施形態では、幹細胞は成人幹細胞またはそれに由来するベシクルであり、例えば、造血幹細胞、間葉系幹細胞、または間質幹細胞などの体性幹細胞である。

一実施形態では、幹細胞は胚性幹細胞またはそれに由来するベシクルである。一実施形態では、細胞は胚性幹細胞ではない。

一実施形態では、本方法は、哺乳動物幹細胞、例えばヒト幹細胞に関するものである。本明細書で論じられる幹細胞は、主にヒト幹細胞のことである。しかしながら、当業者は必要に応じて、他の哺乳動物の関連または対応する幹細胞集団を同一視することができる。例えば、ＳＳＥＡ−１は、マウス胚性幹細胞、ヒト生殖系列細胞、及び胚性癌細胞のマーカーであり、ＳＳＥＡ−３は、霊長類胚性幹細胞、ヒト胚性生殖系列細胞、ヒト胚性幹細胞、及び胚性癌細胞のマーカーであり、ＳＳＥＡ−４は、霊長類胚性幹細胞、ヒト生殖細胞、ヒト幹細胞、胚性癌細胞のマーカーであり、ＣＤ３２４は、ヒト及びマウスの胚性幹細胞、胚性癌細胞のマーカーであり、ＣＤ９０は、ヒト及びマウスの胚性幹細胞、造血幹細胞、胚性癌細胞のマーカーであり、ＣＤ１１７は、ヒト及びマウスの胚性幹細胞、造血幹前駆細胞、神経堤由来メラニン細胞、始原生殖細胞、胚性癌細胞のマーカーであり、ＣＤ３２６は、ヒト及びマウスの胚性幹細胞、胚性癌細胞のマーカーであり、ＣＤ９は、ヒト及びマウスの胚性幹細胞のマーカーであり、ＣＤ２４は、ヒト及びマウスの胚性幹細胞のマーカーであり、ＣＤ２９は、ヒト及びマウスの胚性幹細胞のマーカーであり、ＣＤ５９は、ヒト及びマウスの胚性幹細胞のマーカーであり、ＣＤ１３３は、ヒト及びマウスの胚性幹細胞、胚性癌細胞、造血幹細胞のマーカーであり、ＣＤ３１は、ヒト及びマウスの胚性幹細胞のマーカーであり、ＴＲＡ−１−６０は、ヒト胚性幹細胞、奇形癌腫、胚性生殖細胞、胚性癌細胞のマーカーであり、ＴＲＡ−１−８１は、ヒト胚性幹細胞、奇形癌腫、胚性生殖細胞、胚性癌細胞のマーカーであり、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ５は、ヒト及びマウスの胚性幹細胞のマーカーであり、幹細胞因子（ＳＣＦ）は、ヒト及び胚性の幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胚性癌細胞のマーカーであり、Ｃｒｉｐｔｏは、ヒト及びマウスの胚性幹細胞、心筋細胞、及び胚性癌細胞のマーカーである。

一実施形態では、ペイロードは治療剤を含む。

一実施形態では、ペイロードは検出可能な標識を含む。

一実施形態では、ペイロードはＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列、例えば導入遺伝子またはＲＮＡｉ配列（ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡを含めたｓｉＲＮＡなど）を備えたｃＤＮＡを含む。導入遺伝子をコードするＤＮＡは、一時的または安定的に発現させるために、転写活性ＤＮＡまたはプラスミドにより送達され得る。

一実施形態では、ペイロードは、幹細胞の分化を誘導するのに適し、例えば、細胞を特異的な細胞系列に活性化及び／または成熟させるのに適している。

一実施形態では、本開示の方法は患者の前処置、例えば、幹細胞でのＰＳの発現誘導または増強を含み、例えば、該前処置は、放射線療法、特に骨髄細胞への放射線照射を用いた処置であってもよい。

本開示は、本開示による使用、特に本明細書に記載の使用のための分子を含む医薬組成物にも拡張される。したがって一実施形態では、本開示による分子は細胞内標的の治療に用いられる。

本開示はまた、Ｇｌａドメインまたはその活性断片を含むＧｌａ成分の使用であって、該Ｇｌａ成分が、細胞内ターゲティング及び送達（ペイロードの細胞内送達を含む）を目的としたＧｌａタンパク質由来の活性触媒ドメインを含まない場合の使用にも広げている。

本開示はまた、Ｇｌａドメインまたはその活性断片を含むＧｌａ成分の使用であって、該Ｇｌａ成分が、細胞内ターゲティング及び送達（ペイロードの細胞内送達、特にペイロードが治療物質／分子を含む場合の細胞内送達を含む）に適した薬剤の製造用にＧｌａタンパク質由来の活性触媒ドメインを含まない場合の使用にも広げている。

本技術を用いて、幹細胞移植前に患者の免疫細胞を一掃することができ、例えば該ペイロードは総じて化学療法剤であり、例としてカルムスチンを含むものである。

免疫細胞を除去するための現行方法では、６日前にＢＣＮＵ３００ｍｇ／ｍ２、５日前〜２日前にエトポシド２００ｍｇ／ｍ^２及びシタラビン２００ｍｇ／ｍ^２、ならびに１日前にメルファラン１４０ｍｇ／ｍ^２を用いている（ＢＥＡＭ）。ウサギ抗胸腺細胞グロブリン（２．５ｍｇ／ｋｇ／日）を２日前及び１日前に投与した。この方法は、これらの薬剤それぞれを本開示のＧｌａ分子と結合させることによって調整することができる。

一実施形態では、免疫除去は、癌に対して、つまり血液癌（例えば、ＡＭＬ、ＣＭＬ、ＣＬＬ、またはＡＬＬといった骨髄腫、リンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などの白血病、慢性骨髄増多症、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症、骨髄異形成症候群、及びアミロイド症から選択される）に対して行われる。

一実施形態では、骨髄腫は、多発性骨髄腫、アミロイド症、及び形質細胞腫から選択される。

一実施形態では、骨髄腫は、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症、無症候性骨髄腫、症候性骨髄腫、及びカーレル病から選択される。

一実施形態では、リンパ腫は、未分化大細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、バーキット様リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、甲状腺リンパ腫、及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症から選択される。

一実施形態では、慢性骨髄増多症は、本態性血小板血症、慢性特発性骨髄線維症、及び真性多血球症から選択される。

一実施形態では、白血病は、ＡＭＬなどの急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ヘアリーセル白血病、急性リンパ芽球性白血病、及び慢性リンパ芽球性白血病から選択される。

重症多発性硬化症及び重症関節炎などの重症自己免疫疾患に対して、免疫細胞除去後に幹細胞移植を行うことによって疾患が寛解し得ることが最近明らかになっている。したがって、本開示の除去療法を多発性硬化症及び関節炎などの自己免疫疾患に用いることができる。

一実施形態では、本開示のＧｌａ分子は、検出可能な標識を備えたペイロードに連結、例えば結合している。検出可能標識の例を以下に示す。検出可能標識を用いて、例えば、ＦＡＣＳソーティング、磁気ソーティングなどにより、幹細胞を分類または単離することができる。よって、一実施形態では、本開示のＧｌａ分子を用いて幹細胞を単離または濃縮する方法が提供されている。これまで特定の幹細胞集団、例えば癌幹細胞などを単離することは極めて困難であったことから、この方法は好都合である。

標識化されたＧｌａ分子を、造影剤として、特に診断ツールとしてインビボで用いて、例えば原発腫瘍または転移箇所の癌幹細胞を特定することができる。これは、外科手術及び／または化学療法の後に患者をモニタリングして、癌が寛解していることを確認するのに重要な役割を果たし得る。

Ｇｌａ分子に結合したＤＮＡ導入遺伝子ペイロード及び／またはＲＮＡペイロードを、ウイルスベクター送達（形質導入）または従来のトランスフェクションに代わる細胞内送達として用いることができる。これをインビトロで用いて、細胞内で外因性タンパク質または内因性タンパク質を発現することができるか（例えば、修飾幹細胞が患者に再注入される場合）、またはインビボで適用できる。この遺伝子は一時的に発現してもよく、または幹細胞に安定的に組み込まれるように設計されていてもよい。

本発明者らは驚くべきことに、本開示の分子は、幹細胞に結合するのに加えて、該分子に連結したペイロードと合わせて幹細胞に素早く内部移行されることがわかった。

Ｇｌａタンパク質構造を種々表示した図である。 同上。 同上。 同上。 本開示によるＧｌａ成分の実施形態を示す図である。 アポトーシスを誘導するために過酸化物で処理した乳癌細胞株のプロテインＳ（ＰｒＳ）及びアネキシンの染色を示す図である。Ａは、過酸化物で処理し、ＦＩＴＣ−ＰｒＳで染色したヒトＭＤＡ−２３１細胞を示す。Ｂは、Ａと同様に染色した未処理のＭＤＡ−２３１細胞を示す。Ｃはアネキシンで染色した処理済ＭＤＡ−２３１細胞を示す。Ｄは、過酸化物で処理し、ＰｒＳで染色したヒトＭＣＦ−７細胞を示す。Ｅは、Ｄと同様にしたマウスＭＥＴ−１細胞を示す。ＦはＤと同様にしたマウス４Ｔ１細胞を示す。 ＰｒＳとアネキシンの別々の細胞局在性を示す重ね合わせ図である。Ａは、過酸化物で処理し、Ｃｙ５−ＰｒＳ（赤色）及びＦＩＴＣ−アネキシン（緑色）で染色したマウス４Ｔ１細胞を示す。薄色の矢印は共存していることを示し、赤色の矢印はＰｒＳで染色されたがアネキシンでは染色されていない細胞を示し、緑色の矢印はアネキシンで比較的濃く染色されたがＰｒＳでは比較的薄く染色された細胞を示し、個々の結合パターンを示している（挿入図は別々に染色されたＰｒＳとアネキシンとを示している）。Ｂは、ＦＩＴＣ−ＰｒＳ及びＣｙ５アネキシンで染色された処理済４Ｔ１細胞を示す。緑色の矢印は、ＰｒＳで染色されたがアネキシンでは染色されていない細胞を示す。Ｃは、冷却アネキシンの１０００倍量過剰で予めインキュベートした処理済４Ｔ１細胞のＣｙ５−アネキシン染色結果を示す。 アポトーシス性ＣＯＳ−１細胞をＰｒＳ及びアネキシンで染色した結果を示す図である。細胞を記載した通りにｔ−ＢＨＰで処理し、ＦＩＴＣアネキシン（左）及びＣｙ５−ＰｒＳ（右）で染色した。矢印は、アポトーシス小体とみなされる細胞下構造を示す。 細胞外ベシクルをＰｒＳ及びアネキシンで分別染色した結果を示す図である。細胞外ベシクルは、４Ｔ１細胞から調製し、ＦＩＴＣ−ＰｒＳ（緑色）及びＣｙ５アネキシン（赤色）で染色した。矢印は、アネキシンのみ（赤色の矢印）、ＰｒＳ（緑色の矢印）のみ、及びその両方のタンパク質（薄色の矢印）で染色したベシクルを示す。 ＰｒＳ及びアネキシンの細胞下の局在性を示す図である。ＡとＢは、アポトーシス４Ｔ１細胞をＦＩＴＣ−ＰｒＳ（緑色の矢印）及びＣｙ５アネキシン（赤色の矢印）で染色した結果を示し、薄色の矢印は共局在性を示す。Ｃはアポトーシス小体と見られるものを示す。 ５分以内のＰｒＳの内部移行を示す図である。アポトーシス４Ｔ１細胞をＦＩＴＣ−ＰｒＳ（緑色）及びＣｙ５アネキシン（赤色）で染色し、タンパク質を添加した１０分以内にイメージングした。Ａは重ね合わせたイメージである。Ｂはヘキスト核染色単体である。 マウスにおける４Ｔ１腫瘍のＢＬＩイメージを示す図である。 放射標識付のＰｒＳ及びアネキシンを用いて、ドキソルビシンが４Ｔ１腫瘍に及ぼす影響をＳＰＥＣＴイメージングした結果を示す図である。４Ｔ１乳癌腫瘍を持つマウスを９９ｍＴｃ−ＰｒＳ（Ａ及びＢ）またはアネキシン（Ｃ及びＤ）を用いてイメージングした。ドキソルビシン投与前（Ａ及びＣ）、ならびにドキソルビシン投与２４時間後（Ｂ及びＤ）を示す。 シクロヘキサミドで処置したマウスのＳＰＥＣＴイメージング結果を示す図である。１つのパネルに付き５匹のマウスの処理前（Ａ及びＣ）ならびに処置２４時間後（Ｂ及びＤ）について示している。９９ｍＴｃ−ＰｒＳ（Ａ及びＢ）か、またはアネキシン（Ｃ及びＤ）でマウスをイメージングした。矢印は肝臓シグナルの増加を示す。 感染した脾臓へのＣｙ５−ＰｒＳの局在性を示す図である。ＣＤ１マウスをバイオルミネセンスリステリアで感染させて、感染後２日目にイメージングした。屠殺３０分前にマウスにＣｙ５−ＰｒＳを注射し、脾臓を取り出し凍結させた。中程度に感染したマウス（Ａ）と対照非感染マウス（Ｃ）とを示している。Ｃｙ５チャネル内の各マウスの感染脾臓（Ｂ）と非感染脾臓（Ｄ）の断面を示し、位相差イメージと重ね合わせた。 ドキソルビシンで処置した腫瘍に対するＣｙ５−ＰｒＳの局在性を示す図である。４Ｔ１乳癌腫瘍を移植したマウスをドキソルビシンで処置した場合（右パネル）と処置しなかった場合（左パネル）を示す。２４時間後にマウスにＣｙ５−ＰｒＳを静脈注射し、３０分後に屠殺した。腫瘍を取り出し、凍結して、蛍光顕微鏡検査用に薄片を作製した。４匹の異なるマウスのＣｙ５／位相差イメージを重ねたものを示す。 ＴＳＣの分化を示す図である。増殖因子の存在下（左）または非存在下（右）でＴＳＣを培養した。右パネルの矢印は、分化を表す巨細胞を示している。 栄養膜幹細胞及び分化栄養膜のＰｒＳ染色結果を示す図である。増殖因子の供給を停止することにより栄養膜幹細胞（左）を栄養膜巨細胞（右）に分化させた。細胞をＣｙ５−ＰｒＳで染色し、イメージングした。 ＭＳＣの分化を示す図である。ＭＳＣを本明細書に記載の通りに処置し、脂肪細胞（上パネル）または骨芽細胞（下パネル）に分化させた。分化した細胞はいずれの場合も予想されたモルフォロジーを示した。 ＰｒＳ（緑色）、アネキシン（赤色）、及びヘキスト（青色）で染色したＭＳＣを示す図である。細胞を染色混合液を追加した１０分以内にイメージングした。 ＰｒＳ（緑色、最も明るい領域）、アネキシン（赤色、細胞膜周囲の明るい領域）、及びヘキスト（青色）で染色したＴＳＣを示す図である。細胞を染色混合液を追加した５分以内にイメージングした。 ＴＳＣベシクルの分別染色結果を示す図である。ＴＳＣを図１７で示したように染色した。この細胞群は、アネキシン（赤色）で染色されたがＰｒＳ（緑色）では染色されていない大型ベシクルを分泌している。 Ｃ１７．２神経前駆細胞のＰｒＳ染色結果を示す図である。細胞をＰｒＳ−ＦＩＴＣで染色し、標準型（非共焦点）顕微鏡でイメージングした。 ＰｒＳをＴＳＣに４℃で内部移行させた様子を示す図である。ＦＩＴＣ−ＰｒＳ（緑色）及びＣｙ５アネキシン（赤色）をＴＳＣに４℃で加えて、共焦点顕微鏡でイメージングした。 マウス骨髄由来のＬｉｎｅａｇｅ陰性ＳＣＡ−１／ｃ−ｋｉｔ染色細胞を示す図である。分析の時点では、細胞はＰＩ（ヨウ化プロピジウム、死細胞検出用）でもＰｒＳでも染色されていなかった。造血系の染色（左パネル）とｃ−ｋｉｔ及びＳＣＡ１の染色（右パネル）が見られないことから、緑色（最も明るい領域）で見られるようにＨＳＣ集団が画定される。 長期ＨＳＣのＰｒＳ染色を示す図である。ＨＳＣを図１に示すように単離し、ＦＩＴＣ−ＰｒＳで染色した。ＳＬＡＭパターンをＣｙ７（ｘ軸）で測定した。 短期ＨＳＣのＰｒＳ染色を示す図である。ＨＳＣを図１に示すように単離し、ＦＩＴＣ−ＰｒＳで染色した。ＳＬＡＭパターンをＣｙ７（ｘ軸）で測定した。 長期ＨＳＣへのＰｒＳの内部移行を示す図である。ＨＳＣを上述した通りに調製し、ＰｒＳを染色して、共焦点顕微鏡で調べた。緑色（最も明るい領域）はＦＩＴＣ−ＰｒＳ、青色はヘキスト核染色、赤色はＰＩである。ＰＩ染色が核から排除され、生細胞であることを示していることに留意されたい。 核にＰＩのある死ＨＳＣの例を示す図である。 Ｇｌａ媒介送達は細胞に対して無毒である。

本明細書で使用される細胞内送達は、例えばペイロードを細胞内部に運ぶことを意味する。

一実施形態では、ペイロードは内部移行されない。

一実施形態では、Ｇｌａ成分及びペイロードは内部移行されない。

本明細書で使用されるペイロードは、特に細胞内送達を目的としたＧｌａドメインに連結した分子を意味する。この連結は化学結合を介した結合であってもよく、例えば、マレイミド化学またはクリック化学を用いて、溶媒に露出しているリシンに官能基成分を固定した結合であってもよい。あるいは、この連結は融合であってもよく、例として、連結部がＧｌａ成分を含む融合タンパク質として発現したペプチド結合であってもよい。例えば、この連結は蛍光タンパク質または抗体などの特定の検出可能な標識を付するのに適していると言える。Ｇｌａ成分とペイロードの間が連結されていてもよい。ペイロードは、薬剤、毒素、ポリマー、生物学的活性タンパク質、治療用ウイルス、腫瘍崩壊ウイルス、ウイルスベクター、放射性核種、金属キレート剤、及び／またはレポーター基（標識など）を含んでいてもよい。

一実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのペイロードがＧｌａ成分毎に連結されている。

Ｇｌａ成分（本明細書ではガンマ−カルボキシルグルタミン酸成分とも称する）は、Ｇｌａドメインを含み、プロテインＳなどのＧｌａタンパク質由来の触媒ドメインを含まないポリペプチドを意味する。ポリペプチドは、例えばプロテインＳ由来のＥＧＦドメイン及びクリングルドメインをさらに含んでもよい。一実施形態では、Ｇｌａ成分は、３０個〜３００個のアミノ酸残基を含み、例えば、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個、１６０個、１７０個、１８０個、１９０個、２００個、２１０個、２２０個、２３０個、２４０個、２５０個、２６０個、２７０個、２８０個、２９０個、または３００個の残基を含む。一実施形態では、Ｇｌａ成分は４．５ｋＤａ〜３０ｋＤａの範囲である。一実施形態では、Ｇｌａ成分は配列番号１に示した配列を含む。一実施形態では、Ｇｌａ成分は配列番号６に示した配列を含むか、またはＨｉｓタグを除外したその誘導体を含む。

本明細書で使用されるＧｌａドメイン（ビタミンＫ依存性カルボキシル化／ガンマ−カルボキシルグルタミン化）は、アミノ酸配列において、グルタミン酸残基がビタミンＫ依存性翻訳後のカルボキシル化によって修飾されて、ガンマ−カルボキシルグルタミン酸（Ｇｌａ）となったタンパク質ドメインである。一実施形態では、本開示の分子に含まれるＧｌａドメインは、天然（野生型）Ｇｌａドメイン由来の３０個〜４５個の連続残基を含む。一実施形態では、Ｇｌａドメインは３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個のＧｌａ残基を含む。

一実施形態では、Ｇｌａ成分の３０％以下がＧｌａ残基である。

一実施形態では、Ｇｌａ成分は、１個〜５個のジスルフィド結合、例えば１個、２個、３個、４個、または５個のジスルフィド結合を含む。

Ｇｌａドメインは、２つのカルボン酸残基の間にカルシウムイオンをキレート化することによってカルシウムイオンを結合させる。これらの残基は、Ｇｌａタンパク質の成熟形態のＮ末端から保存芳香族残基まで連続する領域の一部である。その結果、該ドメインの中央部に保存Ｇｌａ−ｘ（３）−Ｇｌａ−ｘ−Ｃｙｓモチーフをもたらし、これはカルボキシラーゼの基質認識に重要な役割を果たすと考えられている。

Ｇｌａドメインは、種々のタンパク質に含まれており、このＧｌａタンパク質の例としては、トロンビン、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ（ＰｒＳ）、プロテインＺ、オステオカルシン、マトリックスＧｌａタンパク質、ＧＡＳ６、トランスサイレチン、ペリオスチン、プロリンリッチＧｌａ１、プロリンリッチＧｌａ２、プロリンリッチＧｌａ３、及び、プロリンリッチＧｌａ４などがある。

本明細書で使用されるＧｌａドメインは、天然Ｇｌａドメインに含まれるアミノ酸の１％〜１０％（１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％など）が置換または欠失されている可能性があるタンパク質にも拡張されるが、但し修飾ドメインが、適正なインビトロアッセイにおいて、天然ドメイン（未修飾Ｇｌａドメイン）の持つ天然活性の少なくとも７０％（７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％など）を保持する場合に限る。

本明細書で使用されるＥＧＦドメインは、保存されたタンパク質ドメインを意味する。これは約３０個〜４０個のアミノ酸残基を含み、主に動物タンパク質の大多数に見られるものである。ＥＧＦ様ドメインは多くの場合、膜結合型タンパク質の細胞外ドメイン、または分泌されることが判明しているタンパク質に見られる。ＥＧＦ様ドメインは６個のシステイン残基を含む。ＥＧＦ様ドメインの主構造は、二本鎖βシート、短いＣ末端までのループ、二本鎖βシートと続く構造である。これらの２つのβシートは通例、メジャー（Ｎ末端）シート及びマイナー（Ｃ末端）シートとして表される。ＥＧＦ様ドメインはタンパク質の種々のタンデムコピーで生じることが多く、典型的には、この反復部が相互に折り畳まって、機能単位として単一の鎖状ソレノイドドメインブロックを形成する。一実施形態では、使用するドメインは完全長天然ドメインである。

本明細書で使用されるＥＧＦドメインは、天然ＥＧＦドメインに含まれるアミノ酸の１％〜１０％（１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％など）が置換または欠失されている可能性があるタンパク質にも拡張されるが、但し修飾ドメインが、適正なインビトロアッセイにおいて、天然ドメイン（未修飾ＥＧＦドメイン）の持つ天然活性の少なくとも７０％（７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％など）を保持する場合に限る。一実施形態では、該タンパク質は完全長天然ドメインである。

本明細書で使用されるクリングルドメインは、３つのジスルフィド結合で安定化した大きなループに折り畳まれた自律的タンパク質ドメインを意味する。これは三重のループである３つのジスルフィド架橋構造によって特徴付けられ、そのループの立体構造は複数の水素結合と小片のアンチパラレルβシートとによって決まる。このドメインは、一部の血漿タンパク質においては、血液凝固タンパク質及び線維素溶解タンパク質に様々なコピー数で見られるものであり、この血漿タンパク質の例として、ＭＥＲＯＰＳペプチダーゼファミリーＳ１Ａに属するセリンプロテアーゼ類であるプロトロンビン、及びウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子が挙げられる。

本明細書で使用されるクリングルドメインは、天然クリングルドメインに含まれるアミノ酸の１％〜１０％（１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％など）が置換または欠失されている可能性があるタンパク質にも拡張されるが、但し修飾ドメインが、適正なインビトロアッセイにおいて、天然ドメイン（未修飾クリングルドメイン）の持つ天然活性の少なくとも７０％（７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％など）を保持する場合に限る。一実施形態では、使用するドメインは完全長天然ドメインである。

本明細書で使用されるタンパク質の活性断片は、全天然タンパク質（または関連ドメイン）よりも小さく、適切なインビトロアッセイにおいて、天然完全長ドメインまたはタンパク質の活性部の少なくとも５０％（６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）を保持するものである。

本明細書で使用される触媒ドメインは、例えば図１Ａに示すように、Ｃ末端方向においてＥＧＦドメイン下流にあるドメイン（または断片）である。

本明細書で使用されるインビトロは、ヒトまたは動物の生体内で実施されていない実験作業を意味する。

本明細書で使用されるインビボは、生体内、特にヒトまたは動物で行われる作業／試験／処置を意味する。

本明細書で使用される幹細胞は、分化することができる未分化細胞を意味し、胚性幹細胞及び成人幹細胞、特に成人幹細胞を含むものである。

造血幹細胞（ＨＳＣ）または血球芽細胞は、造血プロセスにより全ての他の血液細胞を生じさせる幹細胞である。これらは中胚葉に由来し、赤色骨髄にあってほとんどの骨の中心部に含まれている。

本明細書で使用される癌幹細胞は、正常幹細胞の特性、具体的には、特定の癌サンプルに含まれる全ての細胞型を生じさせることができるという特性を持つ腫瘍化細胞（すなわち腫瘍または血液癌に含まれる癌細胞）を意味する。例えば、Identification and Targeting of Cancer Stem Cells, BioessayS 2009 Oct; 31 (10) 1038-1049を参照されたい。癌幹細胞は、以下の３つの異なる特性である、ｉ）腫瘍を誘起し、腫瘍性増殖を促進させる選択的能力、ｉｉ）自己複製により無限に細胞自体のコピーを生成する能力、ｉｉｉ）分化により成熟した非幹細胞癌の後代をもたらす潜在能力により定義されている。癌幹細胞は、必ずしも健常幹細胞由来とは限らず、分化細胞由来であってもよい。

ＣＤ３４は造血前駆細胞の抗原ＣＤ３４として知られており、細胞−細胞接着因子としての機能を有するものである。これをマーカーとして用いて、幹細胞集団を濃縮することができる。

本明細書で使用される分子は最も広義で使用され、合成化学分子を含むが、タンパク質、ポリマー（天然その他）、リボ核酸分子、標識などの高分子も含んでいる。

ペイロードは、薬剤、毒素、ポリマー、生物学的活性タンパク質、放射性核種、金属キレート剤、及び／またはレポーター基を含んでいてもよい。

本明細書で使用される薬剤は、特に文脈で示されない限り、例えば、有機化学法によって合成された小化学物質、特に治療用に、とりわけヒトでの治療用に承認もしくは認可されたか、または認可のプロセス中である分子を意味することが意図される。本明細書で使用される薬剤には、抗ウイルス化合物、抗生物質、及び抗癌療法剤も含まれる。

本明細書で使用される抗ウイルス化合物（抗ウイルス剤）は、特にウイルス感染を治療するのに使用する薬剤の種類を意味し、広範囲の抗ウイルス剤や、特定のウイルスまたは特定のウイルスファミリーに対する「狭域」スペクトル薬も含むものである。

本明細書で使用される抗生物質は、細菌の増殖を抑制し、細菌を死滅させる医薬または薬剤を意味する。特に文脈で示されない限り、抗菌剤と抗生物質とは互換可能に使用される。

本明細書で使用される抗寄生虫剤は、寄生虫の増殖を抑制し、寄生虫を死滅させるかまたは宿主から寄生虫を除去する医薬または薬剤を意味する。

抗癌療法は、抗癌剤、化学療法、放射線療法、免疫腫瘍学療法などを含む広義の用語である。

本明細書で使用される抗癌剤は通例、小分子癌療法剤を意味する。

本明細書での化学療法剤は通例、細胞傷害性薬剤を意味し、抗腫瘍薬を含む。

生物学的治療剤（バイオ医薬品、生物学的作用剤、生物学的製剤とも称される）は、生物学的供給源に「由来」する治療用製剤であり、例えば、抗体、抗体結合断片、及び多特異的抗体分子などの抗体分子を含む組み換えタンパク質及び断片、ならびにこうした物質の種々の組み合わせなどがある。生物学的活性タンパク質は生物学的治療剤のサブグループであり、組み換えタンパク質及びその活性断片（抗体分子など）を含むものである。

本明細書で使用される抗体分子は、完全長の重鎖及び軽鎖を有する完全抗体またはその断片を含み、ならびにそのいずれか１つ、例えばＦａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、修飾Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆａｂ−Ｆｖ、Ｆａｂ−ｄｓＦｖ、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨ、ＶＬ、またはＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、二価抗体、三価抗体または四価抗体、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、及び上記のいずれかのエピトープ結合断片を有する分子を含む（例えば、Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136、Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217を参照）。こうした抗体断片を作成及び製造する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181を参照）。本発明で使用する他の抗体断片には、国際公開第２００５／００３１６９号、同第２００５／００３１７０号、同第２００５／００３１７１号に記載のＦａｂ断片及びＦａｂ’断片が含まれる。多価抗体は多特異性のもの、例えば二重特異性のものを含んでもよく、または単一特異性のもの（例えば、国際公開第９２／２２８５３号及び同第０５／１１３６０５号を参照）であってもよい。本例では二重特異性抗体バリアント及び多特異性抗体バリアントが特に検討されているが、これは２つの独立した標的タンパク質を中和することを目的としているからである。本明細書で開示する抗体由来の可変領域は、２つの標的抗原と結合し、それらを中和することができる単一抗体バリアントを産生するように構成されていてもよい。

抗体及びその結合断片、特にドメイン抗体などの小抗体断片、ＶＨＨ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｄｓ−ｓｃＦｖ、及びｄｓＦｖを、本技術を用いて細胞内に送達することができる。

一実施形態では、抗体またはその結合断片は、チェックポイント阻害剤、例えば抗ＰＤ−１阻害剤または抗ＰＤ−Ｌ１阻害剤である。

一実施形態では、抗体分子はヒト由来またはヒト化されたものである。

毒素は有毒物質であり、とりわけ天然供給源由来のもの、特にタンパク質である。カリチアマイシンなどの多くの毒素が癌療法に使用されている。さらに、化学療法剤も毒性がある（または毒素である）と考えることができる。したがって、毒素の定義が本明細書の他の用語の定義と重複している。しかしながら、ヘビ毒などの神経毒は毒素であるが、化学療法剤ではない。一方、当業者はこれらの技術用語の定義に精通しており、本開示の文脈での意味を理解することができる。

本明細書で使用される診断剤は、病態を診断するか、標識化するか、またはモニタリングもしくは理解するための分析またはイメージングに用いる作用剤である。診断剤は一般的に、標識か、または何らかの方法で可視化、測定、もしくはモニタリング可能である標識に類するものなどのレポーター分子を含むものである。

本開示で使用するのに適した放射性核種には、タリウム^２０１、テクネチウム^９９ｍ、ヨウ素^１２３、ヨウ素^１３１、ヨウ素^１２５、フッ素^１８、及び酸素^１５が挙げられる。

細胞内抗体を例えばＧｌａ融合を介して送達するのに、Ｇｌａ成分を用いることにも特に関心が持たれている。この場合、例として細胞内抗体をＧｌａ成分のＮ末端またはＣ末端と融合することになる。細胞内抗体は、細胞内抗原を標的にすることができる。

一実施形態では、ＲＡＳシグナル伝達経路においてＲＡＳまたはタンパク質と相互作用してこれを阻害する抗体を、本ペイロードで使用する。ＲＡＳ遺伝子は、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、及びＫＲＡＳを含む多重遺伝子ファミリーを構成する。ＲＡＳタンパク質は、低分子のグアノシンヌクレオチド結合ＧＴＰアーゼであり、細胞内の重要なシグナル伝達ハブとして機能するものである。ＲＡＳ／ＭＡＰＫ経路については腫瘍形成の点で広く研究されている。体細胞の調節不全が癌の主な原因の１つであるからである。体細胞においてＲＡＳには悪性腫瘍の約２０％で変異が見られている（Bos JL, Cancer Res. 49: 4682-4689, 1989）。本特定の場合においては、例えば、Ｇｌａ成分をＲＡＳ細胞内抗体に融合することを想定している（Cetin M et al., J Mol Biol. 429:562-573, 2017に記載）。

本明細書で使用されるアポトーシスは、生物増殖の正常で制御された要素として生じる細胞死経路である。アポトーシスによる細胞死は、ネクローシスなどの細胞死機序よりも周囲の組織へのダメージが少なくなる。

本明細書で使用されるネクローシスは、疾患または傷害による細胞死である。これによって、サイトカインや周囲の細胞にダメージを与える可能性がある因子が周囲の組織に放出される。壊疽はネクローシスの細胞死の一例である。

化学療法剤
特に文脈で示されない限り、化学療法剤及び化学療法薬剤または細胞傷害性薬剤は本明細書で互換可能に使用される。

本明細書で使用される化学療法剤は、悪性細胞及び組織を「選択的」に破壊する特定の抗腫瘍性化学作用剤または薬剤を意味することが意図されており、例えば、アルキル化剤、チミジル酸シンターゼ阻害剤などの代謝拮抗剤、アントラサイクリン、植物アルカロイドなどの微小管阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、及び他の抗腫瘍剤が挙げられる。こうした薬剤の多くは重篤な副作用を持つために、本文脈では選択的という語句が概ね用いられている。

好ましい用量は、治療する癌の性質に基づいて実施者が選択することができる。

本開示の方法に用いることができるアルキル化剤の例としては、アルキル化剤ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、テトラジン、アジリジン、プラチン及び誘導体、ならびに非古典的アルキル化剤が挙げられる。

白金含有化学療法剤（プラチンとも称する）の例としては、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、ピコプラチン、ネダプラチン、トリプラチン、及びリポプラチン（シスプラチンのリポソーム型）が挙げられ、特にシスプラチン、カルボプラチン、及びオキサリプラチンが挙げられる。

シスプラチンの用量は、対象となる癌に応じて約２０ｍｇ／ｍ^２〜２７０ｍｇ／ｍ^２の範囲である。用量の範囲は約７０ｍｇ／ｍ^２〜１００ｍｇ／ｍ^２となることが多い。

ナイトロジェンマスタード類には、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミド、及びブスルファンが含まれる。

ニトロソウレア類には、Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチル尿素（ＭＮＵ）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）及びセムスチン（ＭｅＣＣＮＵ）、ホテムスチン、ならびにストレプトゾトシンが含まれる。テトラジン類には、ダカルバジン、ミトゾロミド、及びテモゾロミドが含まれる。

アジリジン類には、チオテパ、マイトマイシン、及びジアジクオン（ＡＺＱ）が含まれる。本開示の方法で使用することができる代謝拮抗剤の例としては、葉酸代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート及びペメトレキセド）、プリンアナログ類（例えば、アザチオプリンなどのチオプリン類、メルカプトプリン、チオプリン、フルダラビン（リン酸塩の形態を含む）、ペントスタチン、及びクラドリビン）、ピリミジンアナログ（例えば、５−フルオロウラシルなどのフロロピリミジン類、及びカペシタビン（Xeloda（登録商標）などのそのプロドラッグ））、フロクスウリジン、ゲムシタビン、シタラビン、デシタビン、塩酸ラルチトレキセド（トムデックス）、クラドリビン、及び６−アザウラシルが挙げられる。

本開示の方法で使用することができるアントラサイクリン類の例としては、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ダウノルビシン（リポソーム）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ドキソルビシン（リポソーム）、エピルビシン、イダルビシン、現状膀胱癌の治療のみ用いられるバルルビシンや、ミトキサントロン、アントラサイクリンアナログが挙げられ、特にドキソルビシンが挙げられる。

本開示の方法で使用することができる微小管阻害剤の例としては、ビンカアルカロイド類及びタキサン類が挙げられる。

ビンカアルカロイド類には、例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチンなどの完全に天然の化学物質と、例えば、ビノレルビン、ビンデシン、及びビンフルニンなどの半合成のビンカアルカロイド類とが含まれる。

タキサン類には、パクリタキセル、ドセタキセル、アブラキサン、カバジタキセル、及びその誘導体が含まれる。本明細書で使用されるタキサン類の誘導体には、例えばミセル調製でのタキソールといったタキサン類の組成変更物が含まれ、また合成化学を用いて出発物質であるタキサンを修飾した化学誘導体も含まれる。

本開示の方法で使用することができるトポイソメラーゼ阻害剤には、Ｉ型トポイソメラーゼ阻害剤、ＩＩ型トポイソメラーゼ阻害剤、及びＩＩ型トポイソメラーゼ抑制剤が含まれる。Ｉ型阻害剤類には、トポテカン、イリノテカン、インドテカン、及びインジミテカンが含まれる。ＩＩ型阻害剤類には、ゲニステイン、及び以下の構造を持つＩＣＲＦ１９３が含まれる。

ＩＩ型抑制剤類には、アムサクリン、エトポシド、エトポシドリン酸塩、テニポシド、ならびにドキソルビシン及びフルオロキノロン類が含まれる。

一実施形態では、化学療法剤はＰＡＲＰ阻害剤である。
標識

一実施形態では、ペイロードは、蛍光標識、化学発光標識、放射標識、酵素、染料、またはリガンドを含む。

本開示の標識は、アッセイで検出可能な任意の部分として定義される。レポーター分子の非限定的な例として、酵素、放射標識、ハプテン類、蛍光標識、リン光分子、化学発光分子、発色団、光親和性分子、着色された粒子またはビオチンなどのリガンドが挙げられる。

一般的には、標識複合体を診断剤として用いるのが好ましい。診断剤は概して、インビトロ診断用と、通例「直接イメージング」として知られるインビボ診断プロトコル用の２つの種類に分けられる。多くの適した造影剤が当該技術分野で知られており、ペプチド及びポリペプチドに結合させる方法も知られている（例えば、米国特許第５，０２１，２３６号、同第４，９３８，９４８号、同第４，４７２，５０９号を参照）。使用するイメージング部は、常磁性イオン、放射性同位体、蛍光色素、ＮＭＲ検出可能物質、及びＸ線造影剤であり得る。

常磁性イオンの場合には、例として、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）、及び／またはエルビウム（ＩＩＩ）を挙げることができ、特にガドリニウムが好ましいと考えられる。他の状況、例えばＸ線イメージングなどに有用なイオンとして、以下に限定されないが、ランタン（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）、また特にビスマス（ＩＩＩ）が挙げられる。
治療用途及び／または診断用途の放射性同位体の場合には、アスタチン^２１１、^１４炭素、^５１クロム、^３６塩素、^５７コバルト、^５８コバルト、銅^６７、^１５２Ｅｕ、ガリウム^６７、^３水素、ヨウ素^１２３、ヨウ素^１２５、ヨウ素^１３１、インジウム^１１１、^５９鉄、^３２リン、レニウム^１８６、レニウム^１８８、^７５セレン、^３５硫黄、テクネチウム^９９ｍ、及び／またはイットリウム^９０を挙げることができる。^１２５Ｉは、特定の実施形態で使用するのに適しており、テクネチウム^９９ｍ及び／またはインジウム^１１１は、低エネルギーであり広範囲検出に適しているために、特に適している。放射標識ペプチド及びポリペプチドは、当該技術分野で周知の方法により作製することができる。例えば、ヨウ化ナトリウム及び／もしくはヨウ化カリウムと、次亜塩素酸ナトリウムなどの化学酸化剤、またはラクトペルオキシダーゼなどの酵素酸化剤とを接触させることにより、ペプチド及びポリペプチドをヨウ素化することができる。リガンド交換プロセスにより、例えば、過テクネチウム酸塩をスズ溶液で還元し、還元されたテクネチウムをセファデックスカラムでキレート化し、ペプチドをこのカラムに適用することにより、ペプチドをテクネチウム^９９ｍで標識化することができる。あるいは、直接標識化する技術を使用することができ、例えば、過テクネチウム酸塩と、ＳＮＣｌ_２などの還元剤と、ナトリウムカリウムフタル酸溶液などの緩衝溶液と、ペプチドとをインキュベーションする方法を使用することができる。ペプチドに金属イオンの形で存在する放射性同位体を結合させるのによく使用される中間官能基は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。

ペイロードとしての使用に適した蛍光標識には、Ａｌｅｘａ３５０、Ａｌｅｘａ４３０、ＡＭＣＡ、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ−Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲＸ、カスケードブルー、Ｃｙ３、Ｃｙ５、６−ＦＡＭ、イソチオシアン酸フルオレセイン、ＨＥＸ、６−ＪＯＥ、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー、ＲＥＧ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、レノグラフィン（Renographin）、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、テトラメチルローダミン、及び／またはテキサスレッドが含まれる。

ペイロードの別の種類は、インビトロでの使用に適し、ペプチドが第２の結合リガンド及び／または酵素（酵素タグ）に連結しているものであり、これらが発色基質と接触すると着色生成物をもたらすことになる。適した酵素の例として、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、（ホースラディッシュ）水素ペルオキシダーゼ、またはグルコースオキシダーゼが挙げられる。好ましい第２の結合リガンドは、ビオチン及びアビジン、ならびにストレプトアビジンの化合物である。こうした標識の使用は当業者に周知であり、例えば、米国特許第３，８１７，８３７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９３９，３５０号、同第３，９９６，３４５号、同第４，２７７，４３７号、同第４，２７５，１４９号、及び同第４，３６６，２４１号に記載されている。

ペプチドとその結合部分とを連結させるための他の結合方法も当該技術分野で公知である。こうした結合方法として、例えば、抗体に結合した、ジエチレントリアミンペンタ酢酸無水物（ＤＴＰＡ）、エチレントリアミン四酢酸、Ｎ−クロロ−ｐ−トルエンスルホンアミド、及び／またはテトラクロロ−３−６−ジフェニルグリコウリル−３などの有機キレート剤を用いた金属キレート錯体の使用が挙げられる（米国特許第４，４７２，５０９号及び同第４，９３８，９４８号）。ペプチドまたはポリペプチドを、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩などのカップリング剤存在下で酵素と反応させることもできる。フルオレセインマーカーとの複合体を、こうしたカップリング剤の存在下で、またはイソチオシアネートと反応させることで調製する。

一実施形態では、標識は幹細胞の核を染色または標識化することができる。

本開示でペイロードとしての使用に適したウイルス類
一実施形態では、本開示に使用されるウイルスはエンベロープウイルスであり、例えば、ヘルペスウイルス（単純ヘルペス１型など）、ポックスウイルス（ワクチニアウイルスなど）、ヘパドナウイルス、フラビウイルス、トガウイルス、コロナウイルス、Ｄ型肝炎、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス（麻疹またはニューキャッスル病ウイルスなど）、ラブドウイルス、ブニヤウイルス、フィロウイルス、及びラブドウイルス科（水疱性口内炎インディアナウイルス（ＶＳＶ）など）から選択される。

一実施形態では、本開示で使用されるウイルスは、非エンベロープウイルスであり、例えば、アデノウイルス科（アデノウイルスなど）、パピローマウイルス科、ピコルナウイルス科（コクサッキーウイルスまたはセネカバレーウイルス（例えばセネカウイルス））、レオウイルスから選択される。

一実施形態では、ウイルスは、アデノウイルス、例えばヒトアデノウイルスであり、Ｂ群ウイルス（特に、Ａｄ３、Ａｄ７、Ａｄ１１、Ａｄ１４、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ５１、またはエナデノツシレブなどのそのキメラ型）、Ｃ群ウイルス（特に、Ａｄ１、Ａｄ２、Ａｄ５、Ａｄ６、またはそのキメラ型）、Ｄ群ウイルス（特にＡｄ８、Ａｄ１０、Ａｄ１３、Ａｄ１５、Ａｄ１７、Ａｄ１９、Ａｄ２０、Ａｄ２２、Ａｄ３０、Ａｄ３２、Ａｄ３３、Ａｄ３６、Ａｄ３７、Ａｄ３８、Ａｄ３９、Ａｄ４２、Ａｄ４３、Ａｄ４４、Ａｄ４５、Ａ４６、Ａｄ４７、Ａｄ４８、Ａｄ４９、Ａｄ５０、またはそのキメラ型）、Ｅ群ウイルス（特にＡｄ４）、Ｆ群ウイルス（特に、Ａｄ４０、Ａｄ４１、またはそのキメラ型）、ならびにＢ群、Ｃ群、Ｄ群、Ｅ群、またはＦ群ウイルスのうちの２つ以上のキメラ型から選択される。

ウイルスの大多数は、標的細胞の認識及び取り込みに関連した周知のタンパク質を含む。腫瘍崩壊ウイルスへの選択性が高い腫瘍ターゲティングを作用させるか、または可能にするためのトロピズムの変更については、Verheije and Rottier, Adv. Virology 2012: 798526, 2012の総説に記載の方法により行うことができる。

天然ウイルスターゲティングに関与していないその他のウイルス細胞表面タンパク質は、その表面に改変された標的モチーフを有する場合がある（例えば、Ａｄビリオンマイナーコートタンパク質ＩＸ、Salisch et al., PLoS One 12: e0174728, 2017を参照）。

エンベロープウイルスはウイルスカプシドを覆う外膜（エンベロープ）を持つ。エンベロープは通例、宿主細胞膜（リン脂質及びタンパク質）の一部に由来するが、一部のウイルスタンパク質も含む。エンベロープの表面にある糖タンパク質は、宿主細胞膜の受容体部位を認識し、そこに結合する機能を持つ。さらに、ウイルスエンベロープは宿主膜と融合することで、カプシド及びウイルスゲノムが宿主に侵入して宿主を感染させることができる。

種々の腫瘍崩壊ウイルスが国際公開第２０１４／１３８３４号に開示されており、これは参照により本明細書に援用される。

単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、４つの必須糖タンパク質であるｇＤ、ｇＨ／ｇＬ、ｇＢを用いて、ｇＤが受容体、ネクチン１、及びＨＶＥＭのうちの１つに結合することによってカスケード様式で活性化されて細胞に侵入する。ＨＳＶは、リガンド及びｓｃＦｖをｇＣタンパク質及び／またはｇＤタンパク質もしくはｇＨに挿入することによって再ターゲティングする（Campadelli-Fiume, G et al., Rev in Med Virol 21: 213-226, 2011、Gatta, V PLoS Pathog 11: e1004907, 2015）。臨床用として腫瘍崩壊単純ヘルペスウイルス１型ベクターが開発されてきた。こうしたウイルスは複製可能であり、ウイルス複製、神経病原性、及び免疫回避能に影響を及ぼす遺伝子に変異を含み、このウイルスには、例えば、ＮＶ１０２０（Ｒ７０２０）、ｄｌｓｐｔｋ、ｄ１８．３６ｔｋ、ｈｒＲ３、Ｒ３６１６、１７１６などの第１世代ウイルス、Ｇ２０７（ＭＧＨ−１）、３６１６ＵＢ、ＳＵＰ、ＮＶ１０２３などの第２世代ウイルス、Ｇ４７Δなどの第３世代ウイルス、Ｇ９２Ａ、ｄ１２．ＣＡＬＰ、Ｍｙｂ３４．５などの転写発現ベクター、ｒＲＰ４５０などの導入遺伝子発現ベクター、及びタリモジーン・ラハーパレプベック（Ｔ−ｖｅｃ）などの他のウイルスが含まれる。ＨＳＶ−１ベクターは、種々の固形腫瘍、例えば、神経膠腫、黒色腫、乳癌、前立線癌、大腸癌、卵巣癌、及び膵癌の治療に有用であると考えられている。ＨＳＶ−１ウイルスは元来細胞溶解性であり、広範の細胞型及び細胞種に感染し、ウイルスの複製ライフサイクルによって宿主細胞の破壊をもたらすものである。このウイルスの特性は明らかになっており、ゲノムサイズが大きく（１５２Ｋ）、多数の非必須遺伝子を含んでいるため、最大３０Ｋまで治療遺伝子を挿入するスペースがある。ＨＳＶウイルスでは一般に、安全上の点からチミジンキナーゼ遺伝子に変異を導入しない。タリモジーン・ラハーパレプベックは、腫瘍崩壊ヘルペスウイルスであり、黒色腫の治療への使用が承認されている。他のヘルペス系ウイルスとして、Ｇ２０７、ＳＥＰＲＥＨＶＩＲ（ＨＳＶ−１７１６）（Virttu Biologics製）、ＨＳＶ−１、Ｒ３６１６変異体、ＨＳＶ−１の１７１６変異体、ＮＶ１０２０（Ｒ７０２０）、Ｒ３６１６変異体（ＲＬ１欠失）、ＫＭ１００変異体（ＵＬ４８（トランス活性化因子テグメントタンパク質ｐＵＬ４８［ＶＰ１６］をコード）及びＲＬ２遺伝子に挿入体を持つもの）、Ｇ９２Ａ変異体、Ｍｙｂ３４．５、ならびにｒＱＮｅｓｔｉｎ３４．５が挙げられる。

ポックスウイルス−修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）などのワクチニアウイルスを用いることができ（Galmiche MC et al., J Gen Virol 78: 3019-3027, 1997）、ＭＶＡは、腫瘍関連抗原ＭＵＣ−１に対する挿入ｓｃＦｖを担持するｐ１４融合分子で置き換えることができる（Paul, S et al., Viral Immunol 20: 664-671, 2007）。Liang L et al., Viruses 6: 3787-3808, 2014、Hsiao JC et al., J Virol 73: 8750-8761, 1999、Chen TL and Roffler S, Med Res. Rev. 28: 885-928, 2008の総説、及びKinoshita T et al., J Biochem 144: 287-294, 2008を参照されたい。ＪＸ−５９４（Jennerex製）は、チミジンキナーゼを欠損させＧＭ−ＣＳＦを付加したワクシニアウイルスである。ＧＬ−ＯＮＣ１は、前臨床マウスモデルにおいて広範な固形腫瘍を退縮及び消失させる弱毒ワクシニアウイルス（Lister株）である。

パラミクソウイルス（麻疹またはニューキャッスル病ウイルスなど）

麻疹ウイルス（ＭｅＶ）は一本鎖マイナスセンスであり、パラミクソウイルス科モルビリウイルス属に属するエンベロープ（非セグメント化）ＲＮＡウイルスである。麻疹ウイルスは２つのエンベロープ糖タンパク質であるヘマグルチニン（Ｈ）結合タンパク質と融合（Ｆ）タンパク質とを有する。結合、取り込み、それに続く細胞−細胞融合は、２つの麻疹受容体であるＣＤ４６及びシグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）により媒介される。例えば、Msaouel P et al., Methods Mol Biol 797: 141-162, 2012、Robinson S. and Galanis, E. Expert Opin Biol Ther. 17: 353-363, 2017、Aref S et al., Viruses 8. Pii:E294, 2016)の総説、Chen TL and Roffler S, Med Res. Rev. 28: 885-928及びKinoshita T et al., J Biochem 144: 287-294, 2008の総説、ならびにRussell SJ and Peng KW, Curr Topic Microbiol. Immunol 330: 213-241, 2009、Robinson S and Galanis, E Expert Opin Biol. Ther 17: 353-363, 2017、Aref S et al., Viruses 8. Pii: E294, 2016を参照されたい。ヒト甲状腺ヨウ化ナトリウム共輸送体またはＭＶ−ＮＩＳをコードする麻疹ウイルスは、麻疹ウイルスの弱毒腫瘍崩壊エドモンストン（Ｅｄ）株である。放射性ヨウ素イメージングは、ＮＩＳ遺伝子発現モニタリングの新規技術となっている。

ニューキャッスル病ウイルスも使用することができる。

アデノウイルス科アデノウイルスは、腫瘍崩壊剤として使用されるウイルスの中で特に最も広く研究されているものである。一連のペプチド及びタンパク質をビリオン結合ウイルスタンパク質に改変して、ウイルスの天然トロピズムを変えることが行われてきた（Verheije MH and Rottier PJM Adv Virol 2012: 798526, 2012の総説）。しかしながら、これらのいずれも核内のウイルスアセンブリに左右され、これが大きな課題となっている。

他の非エンベロープウイルスには、コクサッキーウイルス、ポリオウイルス、及びレオウイルスが含まれる。例えば、Altan-Bonnet, N, Curr Opin Microbiol 32: 77-81, 2016及びChen YH et al., Cell 160: 619-630, 2015の総説、Chen TL and Roffler S, Med Res. Rev. 28: 885-928, 2008及びKinoshita T et al., J Biochem 144: 287-294, 2008の総説、ならびにVerheije MH and Rottier PJM Adv Virol 2012: 798526, 2012の総説を参照されたい。

多数のアデノウイルスがあり、例えば前立腺癌の治療用などのＡｄ５−ｙＣＤ／ｍｕｔＴＫＳＲ３９ｒｅｐ−ｈＩＬ１２、例えば軟組織肉腫治療用のＣＧＴＧ−１０２（Ａｄ５／３−Ｄ２４−ＧＭＣＳＦ）（Oncos Therapeutics製）、Ｏｎｃｏｒｉｎｅ（Ｈ１０１）、ＣＧ００７０、国際公開第２００５／１１８８２５号に記載のエナデノツシレブ（ＥｎＡｄ）、国際公開第２００８／０８０００３号に開示のＯｖＡｄ１及びＯｖＡｄ２、例えば切除不能な悪性胸膜中皮腫用のＯＮＣＯＳ−１０２、ならびに例えば神経膠腫用のＤＮＸ−２４０１がある。

Cavatakは野生型コクサッキーウイルスＡ２１の調製物の登録商標名であり、悪性黒色腫の治療に有用なものである。セネカバレーウイルス（ＮＴＸ−０１０及びＳＶＶ−００１）は、例えば小細胞性肺癌及び神経芽細胞腫に用いられる。

レオウイルス−Reolysin（登録商標）（ペラレオレプ（pelareorep）、野生型レオウイルス、血清型３−Dearing、Oncolytics Biotech製）は、例えば種々の癌及び増殖性疾患の治療に用いられる。

水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）は、別のエンベロープウイルスであり、腫瘍崩壊剤として検討されている。例えば、Betancourt D et al., J Virol 89: 11786-11800, 2015や、Hastie E and Grdzelishvili VZ J Gen Virol 93: 2529-2545, 2012)の総説を参照されたい。
ウイルスによりコードされたタンパク質

一実施形態では、本開示の方法で使用されるウイルスまたはベクターは、導入遺伝子を含み、例えば該導入遺伝子は、細胞内の欠陥遺伝性物質を置き換えるか、細胞内に新規または増強された作用を提供するか、細胞を治療に対して感作させるか、細胞内の作用を遮断するか、または治療用タンパク質もしくはペプチドを発現するものである。

一実施形態では、本開示のペイロードとして使用されるウイルスは、導入遺伝子を含み、例えば、該導入遺伝子は、ＲＮＡｉ配列、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド（例えば、抗体分子もしくはその結合断片、ケモカイン、サイトカイン、免疫調節剤、蛍光タグ、または酵素）から独立して選択される作用剤をコードするものである。

これには、以下に限定されないが、前臨床では見込みがあったが送達に対して有効で安価な手段を持たない特有の形態である、例えば、ペプチド、細胞内抗体、及び代替スキャフォールドが含まれる（Boldicke T, Protein Sci 26: 925-945, 2017、Marschall and Dubel, Comput Struct Biotechnol J 14: 304-308, 2016、Miersch and Sidhu F1000Res 5.pii.F1000 Faculty Rev. 1947, 2016, Peptides、Tsomaia Eur J Med Chem 94:459-470, 2015、Marschall ALJ et al, Mabs 7: 1010-1035, 2015、AlDeghaither D et al., J Clin Pharmacol. 55: S4-S20, 2015の総説を参照）。また、腫瘍細胞、腫瘍幹細胞、腫瘍関連内皮細胞、及び腫瘍関連間質に治療効果のある作用剤も含まれる。例えば治療剤、バイオマーカー、及び／または診断剤として、複数の機能を働かせることができる分子に特に関心が持たれている。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子は、臨床的に承認されたプロドラッグ（ガンシクロビル−ＧＣＶ）と合わせて用いる十分研究されたプロドラッグ変換酵素であり、例えばHolder et al., Cancer Res. 53: 3475-3485, 1993、Touraine RL et al., Gene Therapy 5: 1705-1711, 1998を参照されたい。

さらに、チミジンキナーゼタンパク質の発現を利用して、治療の間にウイルス療法の作用をイメージング及びトラックすることもできる。陽子射出断層撮影法及び単一光子放出型コンピュータ断層撮影法は共に、癌及び癌療法を検出し、モニタリングするのに常套的に用いられる方法であり、適正なチミジンキナーゼ基質が投与された場合にチミジンキナーゼタンパク質の発現を検出できる手段となる（Wang JQ et al., Bioorg Med Chem 13: 549-556, 2005、Tjuvajev JG et al, J Nucl Med 43: 1072-1083, 2002）。あるいは、ＮＩＳ遺伝子を使用することができ、これはＴＫと同様に、腫瘍崩壊ウイルスにおける診断用及び治療用の作用剤として利用されてきた（Miller A and Russell S Expert Opin Biol Ther 16: 15-32, 2016、Ravera S et al., Annu Rev Physiol 79: 261-289, 2017、Portulano et al., Endocr Rev. 35: 106-149, 2014）。

一実施形態では、ＲＡＳシグナル伝達経路でＲＡＳまたはタンパク質と相互作用し、かつこれらを阻害する抗体は、本開示のウイルスにおいて、例えば、Ｇｌａ成分を持つ融合タンパク質としてコードされる。ＲＡＳ遺伝子は、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、及びＫＲＡＳを含む多重遺伝子ファミリーを構成する。例えば、Bos JL, Cancer Res. 49: 4682-4689, 1989、及びCetin M et al., J Mol Biol.429:562-573, 2017を参照されたい。
組み合わせ療法

一実施形態では、Ｇｌａ成分を、第２の療法剤、例えば抗癌療法剤と合わせて用いている。これはＧｌａ成分とは別に投与される（すなわち、Ｇｌａ成分と連結していない）療法剤である。

一実施形態では、使用される化学療法剤の組み合わせは、本明細書に記載の化学療法剤、例えば、プラチンと５−ＦＵまたはそのプロドラッグとの組み合わせ、例えば、ＦＯＬＦＯＸなどのシスプラチンまたはオキサプラチンとカペシタビンまたはゲムシタビンとの組み合わせである。

一実施形態では、化学療法は、化学療法剤、特に細胞傷害性化学療法剤の組み合わせを含む。

一実施形態では、化学療法剤の組み合わせはシスプラチンなどのプラチンとフルオロウラシルまたはカペシタビンとを含む。

一実施形態では、化学療法剤の組み合わせは、カペシタビンとオキサリプラチンである（Ｘｅｌｏｘ）。

一実施形態では、化学療法は、フォリン酸と５−ＦＵとの組み合わせであり、任意選択的にオキサリプラチンと併用している。

一実施形態では、化学療法は、フォリン酸と５−ＦＵとイリノテカンとの組み合わせ（ＦＯＬＦＩＲＩ）であり、任意選択的にオキサリプラチンと併用する（ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ）。このレジメンでは、イリノテカン（１８０ｍｇ／ｍ^２、ＩＶ、９０分超）とフォリン酸（４００ｍｇ／ｍ^２（または２×２５０ｍｇ／ｍ^２）、ＩＶ、１２０分超）とを同時に用いて、続いてフルオロウラシル（４００〜５００ｍｇ／ｍ^２、ＩＶ、ボーラス）、次にフルオロウラシル（２４００〜３０００ｍｇ／ｍ^２、静脈内注入、４６時間超）を用いる。このサイクルを通例、２週間毎に繰り返す。上記に示した投与量はサイクル間で変動する場合がある。

一実施形態では、化学療法剤の組み合わせに、微小管阻害剤、例えば、硫酸ビンクリスチン、エポチロンＡ、Ｎ−［２−［（４−ヒドロキシフェニル）アミノ］−３−ピリジニル］−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（ＡＢＴ−７５１）、タキソール由来化学療法剤（パクリタキセル、アブラキサン、またはドセタキセル）、またはこれらの組み合わせが用いられる。

一実施形態では、組み合わせ療法にｍＴｏｒ阻害剤が用いられる。ｍＴｏｒ阻害剤の例として、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、ＷＹＥ−３５４、ＫＵ−００６３７９４、ラパマイシン（シロリムス）、テムシロリムス、デフォロリムス（ＭＫ−８６６９）、ＡＺＤ８０５５、及びＢＥＺ２３５（ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５）が挙げられる。

一実施形態では、組み合わせ療法にＭＥＫ阻害剤が用いられる。ＭＥＫ阻害剤の例として、ＡＳ７０３０２６、ＣＩ−１０４０（ＰＤ１８４３５２）、ＡＺＤ６２４４（セルメチニブ）、ＰＤ３１８０８８、ＰＤ０３２５９０１、ＡＺＤ８３３０、ＰＤ９８０５９、Ｕ０１２６−ＥｔＯＨ、ＢＩＸ０２１８９、またはＢＩＸ０２１８８が挙げられる。

一実施形態では、組み合わせ療法にＡＫＴ阻害剤が用いられる。ＡＫＴ阻害剤の例として、ＭＫ−２２０６及びＡＴ７８６７が挙げられる。

一実施形態では、組み合わせ療法にオーロラキナーゼ阻害剤が用いられる。オーロラキナーゼ阻害剤の例として、オーロラＡ阻害剤Ｉ、ＶＸ−６８０、ＡＺＤ１１５２−ＨＱＰＡ（バラセルチブ）、ＳＮＳ−３１４メシレート、ＰＨＡ−６８０６３２、ＺＭ−４４７４３９、ＣＣＴ１２９２０２、及びヘスペラジンが挙げられる。

一実施形態では、組み合わせ療法に、例えば国際公開第２０１０／０３８０８６号に開示されている通り、Ｎ−［４−（｛４−［３−（３-ｔｅｒｔ−ブチル−１−ｐ−トリル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）ウレイド］ナフタレン−１−イルオキシ｝メチル）ピリジン−２−イル］−２−メトキシアセトアミドなどのｐ３８阻害剤が用いられる。

一実施形態では、組み合わせ療法にＢｃｌ−２阻害剤が用いられる。Ｂｃｌ−２阻害剤の例として、オバトクラックスメシレート、ＡＢＴ−７３７、ＡＢＴ−２６３（ナビトクラックス）、及びＴＷ−３７が挙げられる。

一実施形態では、組み合わせ療法には、例えば、抗ＰＤ−１阻害剤または抗ＰＤ−Ｌ１阻害剤などのチェックポイント阻害剤が含まれる。

一実施形態では、化学療法組み合わせには、カペシタビン（ゼローダ）、フルダラビンリン酸エステル、フルダラビン（フルダラ）、デシタビン、ラルチトレキセド（トムデックス）、塩酸ゲムシタビン、及びクラドリビンなどの代謝拮抗剤が含まれる。

一実施形態では、化学療法組み合わせにはガンシクロビルが含まれ、これは免疫応答及び／または腫瘍血管系の制御を補助することができる。

一実施形態では、化学療法剤にはＰＡＲＰ阻害剤が含まれる。

一実施形態では、組み合わせ療法には、ＤＨＯＤＨ酵素活性を特異的に抑制する癌代謝阻害剤が含まれる。

一実施形態では、本明細書の方法で使用される１つまたは複数の療法はメトロノミック療法である。これは抗癌剤の低用量を用いた継続治療または頻回治療であり、他の療法と併用されることが多い。

一実施形態では、治療（化学療法）の複数サイクルの使用、例えば２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回のサイクルの使用が提供されている。

一実施形態では、化学療法は１サイクル２８日で適用される。

一実施形態では、本開示の分子は、賦形剤、希釈剤、及び／または担体を含む医薬組成物で提供される。一実施形態では、組成物は非経口製剤である。

非経口製剤とは、消化管を介して送達されるものではない製剤を意味する。典型的な非経口送達経路として、注射、移植、または注入が挙げられる。

一実施形態では、非経口製剤は注射の形態である。注射には、静脈注射、皮下注射、頭蓋内注射、髄腔内注射、腫瘍内注射、または筋肉内注射が含まれる。本明細書で使用される注射は、シリンジを介して身体に液体入れることを意味する。

一実施形態では、非経口製剤は注入の形態である。

本明細書で使用される注入は、点滴、注入ポンプもしくはシリンジポンプ、または同等のデバイスを用いてゆっくりとした速度で流体を投与することを意味する。一実施形態では、注入は１．５分〜１２０分の期間、例えば、約３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、６５分、７０分、６５分、８０分、８５分、９０分、９５分、１００分、１０５分、１１０分、または１１５分投与される。

一実施形態では、製剤は静脈（ＩＶ）に投与される。この経路が特に有効であるのは、器官及び組織の大多数に迅速にアクセスすることができ、特に転移、例えば、中でも肝臓及び肺などの血管に富む領域にある樹立転移の治療に有用であるからである。

治療製剤は通例、無菌であり、製造及び保管の状況下で安定である。組成物は、ヒトへの投与に適した溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または他の非経口製剤として製剤化され、また単一投与用のシリンジ、バイアルなどの予め充填されたデバイスとして製剤化され得る。

上記で論じたように、製剤は一般にウイルスに適合性があり、必要な期間ウイルスの安定性を保つ薬学的に許容できる希釈剤または担体、例えば、無毒等張性担体などを含む。

前記担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例として、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒である場合がある。適正な流動性は、例えば、レシチンなどの分散剤もしくは界面活性剤、またはポリソルベート８０またはポリソルベート４０などの非イオン性界面活性剤を用いることによって保持することができる。分散液では、界面活性剤の存在により所定の粒子サイズを維持し易くすることができる。等張剤の例として、その組成物に含まれる糖類や、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール類、または塩化ナトリウムが挙げられる。

一実施形態では、本開示のＧｌａ成分とペイロードとを含む部分を持つキットであって、該ペイロードが該Ｇｌａ成分に連結しているか、または連結したいない、キットが提供されている。

本明細書の文脈での「comprising（含む）」は、「including（含む）」の意味を有することが意図される。

技術的に妥当な場合には、本発明の実施形態を組み合わせることができる。

実施形態は、特定の特性または要素を含むものとして本明細書に記載されている。本開示はまた、該特性もしくは要素からなるまたは本質的になる別々の実施形態にも拡張される。

特許及び特許出願などの専門的な参考文献が参照により本明細書に援用される。

背景技術は本明細書の技術開示の一部であり、補正の根拠として用いることができる。背景技術の考察は、当該技術分野及び本技術の適用において直面する技術的問題の考察も含んでおり、先行技術の考察に限定されるものではないからである。

本明細書に具体的及び明確に記述した実施形態のいずれも、単独でまたは１つもしくは複数のさらなる実施形態と合わせてディスクレーマーの根拠を形成することができる。

本出願は、米国特許出願第６２／５５４５３０号、同第６２／５６９，４０３号、同第６２／５５４５３３号、同第６２／５６９，４１１号、同第６２／５８４，５６５号、及び同第６２／５９３，０１４の優先権を主張するものである。これらの出願はそれぞれ参照により援用される。これらの出願は、本明細書の訂正の根拠として用いることができる。

本発明を以下、次の実施例を参照にして説明するが、これは単に例示であり、本発明の範囲を何ら限定するものとして解釈されるべきではない。

本明細書は、関連する配列表にある配列番号１〜配列番号６も含んでいる。

本プロジェクトでは、標識付組み換えＰｒＳをＳＰＥＣＴ（単光子形コンピュータ断層撮影）用のインビボイメージング造影剤として評価することを試みた。驚くべきことに、本発明の分子がアポトーシス細胞に迅速に内部移行されたことがわかった。この予期せぬ発見によって発明者らはこの現象をさらに調べた結果、ＰｒＳが同様に種々の非アポトーシス幹細胞のサブセットに内部移行することがわかった。

ＰｒＳは、配列番号６に示すように、プロテインＳのＧｌａドメインとプロテインＳのＥＧＦドメインである。

方法
蛍光測定用に、Ｃｙ５及びＦＩＴＣを、それぞれAmersham（GE Healthcare）社及びMolecular Probes（Invitrogen）社製の標識化キットを用いて製造業者の指示書に従って結合させた。これらのキットは結合しなかった蛍光体を除去するカラムを備えている。まず、１ｍｌ中のＰｒＳ（第２分画）０．７７ｍｇと、１ｍｌ中のアネキシン０．７７ｍｇとをＦＩＴＣで標識化し、アポトーシス細胞への結合特異性を評価した。共局在性及び競合作用の検討を行うため、１ｍｌに溶かしたＰｒＳ（第３分画）０．６８ｍｇとアネキシン０．６８ｍｇとをＣｙ５で標識化した。共焦点顕微鏡で観察するため、第２の出荷由来のＰｒＳ０．７６ｍｇをＦＩＴＣで標識化し、また予め標識化したＣｙ５結合アネキシンを用いた。正確な標識化率を算出していないが、標識化キットの製造業者の指示書に基づき、カラムからの回収率は８５％であると見積もったことに留意されたい。したがって、どの場合も２つのタンパク質の相対染色強度は、これらの偶然性が影響する場合がある。細胞を最初に３０分間染色したが、５分未満でも十分であることが後に判明した。アポトーシス細胞の特異性についてＰｒＳを評価するために、４つの乳癌細胞株であるヒトＭＤＡ−２３１、ヒトＭＣＦ７、マウス４Ｔ１、及びマウスＭＥＴ−１をまず使用した。続いて、ＣＯＳ−１サル腎細胞を同様に使用した。過酸化水素またはｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ｔ−ＢＨＰ）を用いてアポトーシスを誘導した。細胞を２４ウェルプレートに１ウェル当たり６×１０^４個の細胞となるように、またはEppendorf社のチャンバースライドに１ウェルあたり１×１０^４個の細胞になるように入れ、翌日に２ｍＭのＨ_２Ｏ_２またはｔ−ＢＨＰを３０分〜２時間の時点で用いてアポトーシスを誘導した。誘導後にウェルをアネキシン結合緩衝液（ＡＢ、Santa Cruz Biotech社）で洗浄し、標識化したタンパク質で染色した。過去の経験や文献から、染色にはアネキシンタンパク質５．５ｇ／ｍｌを用いた。この量は、得られたゲルイメージに基づいてアネキシンの分子量が３６ｋＤであり、組み換えＰｒＳの分子量が３０ｋＤであると見積もることで、等モルのＰｒＳを添加するように調整した。細胞を１５分間染色した。ヘキスト３３３４２染料を用いて核酸を可視化した。続いてウェルをＡＢで洗浄し、生存している間にＥＶＯＳ蛍光顕微鏡を用いて観察した。共焦点顕微鏡では、スタンフォード細胞科学イメージング施設（Stanford Cell Sciences Imaging Facility）でLeica SP8顕微鏡を用いた。続いてウェルをＡＢで洗浄し、Leica SP8顕微鏡を用いて観察した。ヘキスト３３３４２染料を用いて核を可視化した。毒性の検討では、ＰｒＳを栄養膜幹細胞（ＴＳＣ）に加え、生存度をNexcelom製の細胞自動カウント装置（Cellometer）でトリパンブルーを用いて評価した。

標識化したタンパク質の腫瘍検出能について評価するために、５×１０^４個の４Ｔ１−ｌｕｃ細胞を５匹の雄ＢＡＬＢ／ｃマウス群の左腋窩部脂肪パットに移植した。移植１週間後からマウスを毎日インビボバイオルミネセンスイメージング（ＢＬＩ）で画像化し、腫瘍増殖をモニタリングした。移植後１１日目に体重１ｋｇ当たりドキソルビシン１３ｍｇを用いてマウスを腹膜内（ＩＰ）処置し、ＢＬＩを翌日に実施した。腫瘍を担持する対照マウスにはドキソルビシンでの処置を行わなかった。処置の４８時間後、静脈内トレーサー注射（麻酔としてウレタン１．３ｇ／ｋｇ、腹腔内）した１時間後にシングルヘッドＡ−ＳＰＥＣＴガンマカメラ（Gamma Medica社製）でマウスをイメージングした。このカメラの測定条件は、１ｍｍのピンホールコリメータ、１２８×１２８イメージングマトリックスに１２８ステップ、１ステップ当たり１５秒、２．７ｃｍのＲＯＲ、ＦＯＶ＝胸郭上部／頚部である。各タンパク質の注射投与量を１６０μｌ（８００μＣｉ）とした。続いて動物を屠殺し、体内分布測定を行った。シクロヘキサミド処置の実験では、５匹の幼若（７週齢）雄Swiss Websterマウス群に麻酔をかけ（ウレタン１．３ｇ／ｋｇ、腹腔内）、シクロヘキシミド５０ｍｇ／ｋｇを静脈内に注射した。シクロヘキシミドを注射した１時間４５分後に、トレーサーを注射した（１投与当たりＰｒＳ＝１８０μｌ／１．２ｍＣｉ、１投与当たりアネキシンＶ＝１７０μｌ／１．０５ｍＣｉ）。トレーサーを注射した４５分後に、Ａ−ＳＰＥＣＴガンマカメラでシングルヘッド平行孔コリメータ（１２８×１２８マトリックス）を用いて、マウスを１０分の全身静態像としてイメージングした。

生きた動物において感染に起因したアポトーシス部位への蛍光ＰｒＳの特異的局在性を評価するために、バイオルミネセンスのリステリア・モノサイトゲネスをＣＤ１マウスに静脈内注射した。この細菌性病原体は脾臓を含む多くの器官に感染し、単球及び顆粒球の広範なアポトーシスを引き起こすものである。感染後の特定の時点で脾臓は細菌複製の主部位となるため、細菌由来の脾臓ＢＬＩシグナルは、アポトーシスのプローブ局在性と相関を持ち得る。マウスを感染させて、毎日イメージングを行った。脾臓シグナルがはっきりとしてから（８週齢のＣＤ１雌マウスに細菌の２×１０^５のコロニー形成単位を感染させた後の２日目）、マウスに体重１ｋｇ当たりＣｙ５−ＰｒＳ３００ｍｇを注射し、３０分後に屠殺した。脾臓を取り出し、ＯＣＴで凍結して、蛍光顕微鏡検査用に薄片を作製した。非感染の対照マウスも用いた。

フローサイトメトリーを実施した。新たに標識化したＦＩＴＣ−ＰｒＳを、上述した通りに調製して使用した。マウス造血幹細胞（ＨＳＣ）は、本研究施設で通常の方法で精製している。この細胞をｃ−ｋｉｔ＋のＬｉｎｅａｇｅ陰性細胞に対して染色することにより正常マウス骨髄から単離した。細胞の特性をさらに明らかにするために、ＳＬＡＭマーカー染色も実施した。これらのマーカーは自己再生かつ分化する細胞を染色する一方、分化のみ可能であるＨＳＣを染色しない。続いてＦＩＴＣ−ＰｒＳで染色することにより、以下の「結果」に示すように、ＳＬＡＭ染色細胞における陽性率を得た。次に細胞をＦＩＴＣによって分類して、共焦点顕微鏡で調べ、ヘキスト３３３４２を用いて核を視覚化した。

結果
細胞培養におけるアポトーシスという観点でのＰｒＳ結合特異性を評価するために、複数のヒト及びマウスの乳癌細胞株を用いた。上述したように、アポトーシスを過酸化物で誘導し、ＦＩＴＣ−ＰｒＳ結合を評価した。これらの実験結果の例を図２に示す。例えば図２のパネルＢに示すように、未処置の細胞は結合が最も弱くなった。選択した過酸化物濃度及びインキュベーション時間は、極少数の細胞しか影響を受けない程度とした。濃度が高い及び／またはインキュベーション時間が長いと、細胞が剥離し、染色及び顕微鏡観察ができなかったからである。さらに、影響を受けなかった細胞の存在を、各領域内の内部陰性対照として用いた。ＦＩＴＣ−アネキシンは、ＰｒＳと同様のアポトーシスに対する特異性を示し、内部陽性対照として機能する。次に、２つのタンパク質を共局在性及び競合的結合について評価した。共局在性については、ＦＩＴＣとＣｙ５との両方で標識化したＰｒＳ及びアネキシンを調製した。４Ｔ１細胞を過酸化物で処置し、Ｃｙ５とＦＩＴＣとで標識化したＰｒＳ及びアネキシンで、蛍光体の組み合わせを用いて染色した。次に、細胞をＥＶＯＳ蛍光顕微鏡で可視化した。結果を図３に示す。試験条件下で、全ての鮮明染色細胞が、両方のタンパク質で染色されていることを示した。しかしながら、Ｃｙ５を用いるかＦＩＴＣを用いるかに関わらず、ＰｒＳはアネキシンで染色されなかった一部の細胞を微弱ではあるが染色する様子であった（図３）。各タンパク質毎の種々の細胞の相対的な染色強度は、２つのプローブ間で異なる場合があった。すなわち、アネキシンは２つの細胞を同等の強度で染色する一方で、ＰｒＳは同等に染色しない場合があり、その逆もまた同様であった（図３Ａの緑色矢印及び挿入図）。したがって、この両方のプローブは概して同じ細胞を染色するが、わずかな違いがある様子であった。競合的アッセイにおいては、標識化していないアネキシンの十分過剰量をアポトーシス性４Ｔ１細胞と合わせて１５分間プレインキュベートした後、細胞をＣｙ５−ＰｒＳで染色した。これらのタンパク質は、同じ標的分子である露出したＰＳに結合すると考えられるが、驚くべきことに、ＰｒＳ染色は、１０００倍過剰量のアネキシン、すなわち最も過剰な評価量のアネキシンでもブロックされなかった（図３Ｃ）。アネキシンとＰｒＳの共染色を多くの細胞種で観察した。２つのタンパク質は通例、各細胞種で同じ細胞を染色したが、違いも明らかになった。特に、細胞よりも小さい一部の対象では異なって染色された（図４）。これらの対象物は、過酸化物処置後に数が増加したものであり、アポトーシス小体、つまりアポトーシス細胞が断片化される間に産生する膜結合型細胞断片とみなされた。この対象物の中には両方のタンパク質で染色されたものもあるが、図４に示すように、ＰｒＳで染色されたのに対しアネキシンでは染色されなかったものもあった。この観察結果は予想外のものであった。細胞下の構成要素の異なった染色をさらに調べるために、標準の遠心分離プロトコルを用いて、細胞外ベシクル（ＥＶ）を４Ｔ１マウス腫瘍細胞から調製した。２つのタンパク質はこれらのベシクルも異なって染色し（図５）、この結果は生物学的及び治療的な意味を持つと考えられる。

ＥＶ、特にエキソソーム、マイクロベシクル（ＭＶ）、及びアポトーシス小体（ＡＢ）は、細胞間の生体分子の伝達による細胞−細胞コミュニケーションに重要な役割を果たすと考えられる。こうした種類のＥＶのバイオジェネシスは様々であり、エンドソームに由来のもの（エキソソーム）もしくは原形質膜由来のもの（ＭＶ）であるか、またはプログラム細胞死の産物（ＡＢ）である。全ての哺乳動物細胞は、ＥＶを分泌すると考えられている。各種類のＥＶは、分子貨物を隣接細胞及び離れた細胞の両方に運ぶことができ、腫瘍発達及び腫瘍進行に関与する挙動などの細胞の挙動に影響を与える。実際、ＥＶは、癌のほぼ全ての特徴に関与することができ、その特徴としては、増殖シグナル伝達の保持、成長抑制の回避、細胞死の阻止、エネルギー代謝の再プログラム、ゲノム不安定性の獲得、及び腫瘍微小環境の形成が挙げられる。ＥＶは、血管新生の誘導、浸潤の制御、転移前ニッチの惹起、炎症の保持、及び免疫監視の回避にも関与することがわかっている。免疫細胞は、ＥＶを介した伝達も行っていると思われ、ＥＶは腫瘍細胞、感染組織、及び創傷からのシグナルとして機能すると考えている。ＥＶの生物学的作用やＥＶが癌の特徴に及ぼす影響を深く理解することによって、癌の診断及び治療に新しい可能性をもたらすことになる。さらなるＥＶ表面マーカーの開発がこの分野の開発を加速させるのに不可欠であり、ＰｒＳはその要となり得る。

蛍光顕微鏡を用いた上記の検討に続いて、ＰｒＳ及びアネキシンでの染色の細胞下局在性を共焦点顕微鏡により評価した。マウス４Ｔ１細胞（Ｌｕｃ−ＧＦＰレポーターを欠損）を８区画のチャンバースライドに１チャンバー当たり１×１０^４個の細胞になるように入れ、翌日に２ｍＭのＨ_２Ｏ_２またはｔ−ＢＨＰ（２時間曝露）でアポトーシスを誘導した。続いて細胞を洗浄し、ＰｒＳ及びアネキシンで１５分間染色した。ヘキスト３３３４２染料を用いて、核酸を染色した。全ての場合において、最も鮮明な染色細胞は両方のプローブで染色されていた。しかしながら、多くの細胞においてその細胞質で標識付ＰｒＳが観察された一方、標識付アネキシンは観察されなかった（図６）。アネキシンは内部移行され、少数の細胞のベシクル内で見られているが、同じ細胞で表面に局在化したＰｒＳと合わせて内部移行されたアネキシンは観察されなかった。この２つのタンパク質はＰＳを結合させると考えられているため、こうした結果は予想外であった。ＰｒＳの内部移行についてさらに調べるために、経時的な実験を行った。アポトーシス４Ｔ１細胞をＣｙ５−アネキシンとＦＩＴＣ−ＰｒＳとで５分間染色し、プローブを添加した後５分以内に観察した。ＰｒＳを細胞の細胞質において直ちに観察したところ、５分以内に内部移行することを示した（図７）。イメージの経時変化により、ＰｒＳとアネキシンは、初期の時点では必ずしも同一の細胞を同程度に染色するわけではないことがわかった。図７の細胞はアポトーシスの異なる段階にあるように見える。左側の細胞は、ほぼ無傷の核膜に囲まれた凝縮していない核を示しているのに対し、右側の細胞は、アポトーシス過程の後期に生じるクロマチン凝縮に特徴的な濃い染色を示している。こうした染色パターンから、ＰｒＳはアネキシンよりもアポトーシスの初期の段階で結合していることを示していると言える。この点では単なる推測にすぎないが、こうした優先度は、今まで観測してきたこの２つのタンパク質の様々な違いを説明すると考える。例えば、図３Ａ及び図３Ｂに示すように一部の細胞がＰｒＳでは染色されてアネキシンでは染色されないが、これはＰｒＳがアポトーシスの過程の初期に結合した結果と考えられる。ＰｒＳの生きた動物内での局在性を調べるために、複数の実験を行った。これらの検討には、インビボでのアポトーシスの化学誘導及び感染誘導、ならびにアポトーシスを引き起こすとして知られるドキソルビシンで処置した腫瘍に対するＰｒＳの局在性を応用した。ＨＹＮＩＣで標識化したＰｒＳ及びアネキシンを用いたＳＰＥＣＴイメージングを、４Ｔ１ｌｕｃ乳房腫瘍を持ちドキソルビシンで処置した動物で行った。４Ｔ１腫瘍をルシフェラーゼで標識化したため、マウスにおいてインビボバイオルミネセンスイメージング（ＢＬＩ）を用いてイメージングすることができる。この実験のイメージング結果の１つを図８に示す。この方法を用いて腫瘍移植を評価し、個々の動物における進行を経時的に追跡することができる。次に、９９ｍＴｃで標識化したＰｒＳ及びアネキシンを用いて、ドキソルビシン及び対照で処置した動物のＳＰＥＣＴイメージングを行った。その結果の例を図９に示す。２匹の動物の頭部と胸部のイメージは、唾液腺においてＰｒＳプローブが非特異的に蓄積されることや、このプローブを用いた場合にＳＮ比が低くなることを示している。したがって、示したＰｒＳイメージングにおける表示のしきい値を下げてバックグラウンドをより鮮明にすると、明るい擬色イメージが得られた。低いＳＮ比は、タンパク質１ｍｇ（最適以下）というわずかな量のＨＹＮＩＣを標識することに起因し、またＨＹＮＩＣ対タンパク質の標識比についての対照試験が実施できないことに起因すると考えられる。

肝臓でのアポトーシスを誘導するシクロヘキサミドで処置したマウスのＳＰＥＣＴイメージングも実施した（図１０）。図１０では、５匹のマウスの全身イメージを各パネルに示している。多くの放射標識されたプローブと同様に、バックグラウンド信号が腎臓部で見られている。マウスをシクロヘキサミドで処置することにより、肝臓でのアネキシンＳＰＥＣＴシグナルが増加した。この場合も、ＰｒＳはアネキシンに比べてシグナルが弱かった。アネキシンではシクロヘキサミド処置マウスのアポトーシス肝臓を検出することができたが、ＰｒＳでは処置によって肝臓でのシグナルがわずかに増加しただけであった。ＳＰＥＣＴイメージングとは別に、アポトーシス組織及び処置済腫瘍へのＰｒＳの局在性や、ＨＹＮＩＣ標識化に付随する複雑性を評価するために、アポトーシス応答を誘導する細菌で感染させたマウスと腫瘍担持マウスとにＣｙ５−ＰｒＳを注射した。感染に関しては、ルシフェラーゼで標識化した細菌性病原体であり、ＢＬＩに対しての特性がよくわかっているリステリア・モノサイトゲネスを用いた。脾臓からの特徴的なＢＬＩシグナルから、共局在性を良好に検討することができる。ＣＤ１マウスを上述した通りに感染させ、感染の２日後にＢＬＩでイメージングした。次に、マウスにＣｙ５−ＰｒＳを注射して、３０分後に屠殺した。脾臓を取り出して薄片化し、蛍光顕微鏡観察を行った（図１１）。全ての場合で、感染マウスからの脾片は対照よりはるかに明るいＣｙ５蛍光シグナルを示した。図１１では、感染マウスでフォトンカウント数が低くなっており、この動物では感染があまり進行していなかったことを示している。同日に、多くのマウスで脾臓からのシグナル強度が１０倍となっている。一方で、Ｃｙ５チャネル蛍光強度は非感染の対照に比べて依然として非常に強くなっていた。この結果は感染に対する進行中の固有の免疫応答を示し得る。こうした動物では顆粒球及びマクロファージがアネキシンシグナルの主なソースと見られているからである（これらの細胞はアポトーシスが組織破壊を限定するようにプログラムされている）。

ドキソルビシンで処置した４Ｔ１腫瘍に対する蛍光ＰｒＳの局在性を評価した。腫瘍を移植したマウスを上述した通りにドキソルビシンで処置し、Ｃｙ５−ＰｒＳを静脈内に注射した３０分後に屠殺した。腫瘍を取り出して薄片化し、蛍光顕微鏡観察を行った。結果を図１２に示す。染色強度が強い領域を処置済動物で観察したのに対し、中程度のシグナルを未処置の腫瘍片で観察した。一部の未処置の腫瘍にはバックグラウンドよりも高いシグナルを持つ小さい領域があったが、未処置片のいずれにおいても処置済腫瘍と同様の強度を持つシグナルを観察しなかった。

幹細胞は分化細胞由来の表現型に特徴があり、ＰＳを非アポトーシス的に発現させて免疫応答の誘導を回避することができる。栄養膜幹細胞（ＴＳＣ）は培養下で複数の種類の栄養膜に分化する。ＴＳＣを、線維芽細胞増殖因子、アクチビン、及びヘパリンの存在下で増殖させたマウスの子宮擦過物から調製した。ＴＳＣは、これらの因子を培養液から除去すると自発的に巨細胞に分化する（図１３）。ＴＳＣはＰｒＳで染色されたが、培養下で分化したこの細胞由来の栄養膜は染色されなかった（図１４）。また、ＰｒＳはアポトーシスを誘導することなく幹細胞に内部移行されることが明らかになった。この結果は、アポトーシスを誘導した腫瘍細胞株での観察結果と同様である。アポトーシスを誘導しない場合には、腫瘍細胞ではわずかな染色しか観察されなかった。幹細胞内への内部移行について評価するために、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）及びＴＳＣを用いた。ＭＳＣをマウス骨髄から調製した。骨髄をマウスからフラッシュし、増殖因子を含めずに６日間培養した。このインキュベーションの間に、ＭＳＣと造血幹細胞（ＨＳＣ）は複製するのに対して、線維芽細胞は付着するが数世代を超えては増殖しない。６日後には単層を見ることができるようになる。トリプシン処理で継代培養する際に、付着性を持つＭＳＣは保持されるが、懸濁液で増殖するＨＳＣは失われる。線維芽細胞は増殖因子がないために生き残らず、保持もされない。したがって、この簡単な手順によりＭＳＣの略同種の集団を得る。こうした細胞の同一性を確認するために、デキサメタゾンとリン酸グリセロール（骨芽細胞への分化を誘導）、またはデキサメタゾンとインドメタシン（脂肪細胞への分化を誘導）とで別々に培養物を処理した。結果を図１５に示す。上記の処理に反応して、分化した細胞はそれぞれの細胞の外観を示した。脂肪細胞は大きい脂肪ベシクルを含み、骨芽細胞は特有の細胞内コラーゲンを有しかつミネラル化されて濃い色になった。

細胞下染色パターンを評価するために、未分化ＭＳＣをＰｒＳ及びアネキシン、ならびにヘキスト核染色試薬で染色し、共焦点顕微鏡で観察した。観察結果を図１６に示す。ＰｒＳは迅速に内部移行した。ＭＳＣの場合には、２０個の細胞のうちの約１個がＰｒＳで染色され、これは以前のデータと一致しているが、染色された正確な割合は算出しなかった。ＭＳＣのモルフォロジーにはばらつきがあり、３種類の細胞は培養液に多くの物質を分泌し、その一部がチャンバースライドの表面に付着してイメージングのバックグラウンドになる場合がある。それにも関わらず、データは、添加の５分以内に内部移行されたＰｒＳと、表面に付着したアネキシンとをはっきりと示している。さらに、ＭＳＣに対して行ったのと同様に、ＴＳＣを染色してイメージングした。その観察結果、この細胞への内部移行も確認し、これは同様にタンパク質添加の５分以内に生じている。結果を図１７に示す。ＴＳＣはモルフォロジーがかなり変わり易く、図からわかるように分化しない場合には多核性になり得る。ＭＳＣと同様に、この初代細胞は培養液に多くの物質を排出しており、その一部を細胞外ベシクルと定めた（以前のデータ）。前述したように、この物質はイメージングを困難にする。ＥＶの一部はアネキシンで染色されＰｒＳで染色されないが、この現象は図１８に示すようにＴＳＣで見ることができる。ＴＳＣのクラスターを示すこのイメージでは、細胞が放出したベシクルはアネキシンで染色されるが、内部移行するＰｒＳでは染色されない。このパターンは、ＰｒＳ及びアネキシンの特異性及び結合標的に関して興味深い問題を投げかけている。この２つのタンパク質は共にＰＳを結合させると考えられている。しかしながら、ＥＶに対する異なる結合と、固有の細胞下局在パターンから、これらは全く同じように結合しているわけではないことが示唆される。この違いの論拠を明らかにするためにさらなる検討が必要であり、その検討により有意な差であることが明らかにできるであろう。インビトロで星状細胞及び他の神経細胞に分化可能な形質転換細胞株である神経前駆細胞株Ｃ１７．２のＰｒＳ染色も観察した（図１９）。この形質転換細胞の約５％が染色されたが、この割合は推定である。注目すべきことに、細胞を４℃に冷却した場合でもＴＳＣへの取り込みが生じた（図２０）。一方で、このチャンバーは顕微鏡にセットすると冷却し続けることができないことに留意されたい。それにも関わらず、温度はイメージング手順の５分の時間内ではほとんど上昇することはないと考えられる。この結果は、誘発的ではあるが、さらに制御された条件下で確実に再現させる必要がある。この発見が実証されれば、この機序は極めて興味深いものであると言える。

発明者らは造血幹細胞（ＨＳＣ）を問題なくＰｒＳで染色することができた。フローサイトメトリーを用いて、ＨＳＣがＰｒＳで染色されることを明らかにし、これらの細胞へのＰｒＳの内部移行を共焦点顕微鏡で観察した。蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いてＨＳＣを特定し、単離した。骨髄において細胞をＬｉｎｅａｇｅ陰性のＳＣＡ／ｃ−ｋｉｔ陽性細胞として特定した（図２１）。続いて、この細胞をＦＩＴＣ−ＰｒＳで染色した。ＨＳＣの２つの集団である、短期及び長期を、ＳＬＡＭマーカー染色のパターンから同定することができる。ＳＬＡＭ（シグナル伝達リンパ球活性化分子）マーカーであるＣＤ４８、ＣＤ１５０、ＣＤ２２９、及びＣＤ２４４は特有のパターンでＨＳＣを個々に染色し、ＳＬＡＭパターン陽性染色の場合、自己再生かつ分化できることを示す一方、ＳＬＡＭパターン陰性ＨＳＣの場合、分化のみできることを示す。ＰｒＳは長期ＨＳＣのサブセットを染色し（図２２）、短期ＨＳＣも染色した（図２３）。用いた細胞はヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陰性であることから、全て生細胞であることを意味している。この結果は、幹細胞のサブセットがアポトーシスを誘導することなくＰｒＳで染色されることを示した前述の実験結果を裏付けるものである。

続いて、ＰｒＳのＨＳＣへの内部移行を評価した。この実験は多くの因子によって複雑になっていた。最も困難な問題はＨＳＣ培養における生存率と言えるが、これは一晩で培養液中の多数が死滅するからである。したがって、フローサイトメトリー分析及び共焦点顕微鏡測定を同日に実施できるように実験時間を調整しなければならなかった。さらに、細胞が付着性ではなく、顕微鏡測定には適しているとは言えなかった。顕微鏡で効率よく測定するために、細胞を培養液の小液滴に再懸濁した。最終的に、顕微鏡で分析したＰｒＳ染色細胞がまだ生きているかを確認する必要があった。ＨＳＣの多くは、分析と単離の過程で死滅した。よって、ヘキスト核染色に加えてＰＩを加えスキャンし、別のチャネルも用いた。ＰＩで明るくなった核があると、死細胞を意味した。こうした課題やタイミングの難しさがあったが、実験を実施することができ、ＰｒＳが生きたＨＳＣに内部移行することを確認した（図２４）。細胞は核のＰＩ染色がないことによって生きていると確認した。しかしながら、図２５に示すように一部の細胞は死滅するか、乾燥していた。上述の実験の複雑性や実験期間の問題があったが、実験結果から内部移行が示されている。

最後に、図２６に示すように、ＴＳＣに対する毒性の予備検討を行った。１３５μｇ／ｍｌの濃度で３０分後に生存率が７８％から７４％になり、ＰＢＳに比べて極めてわずかな減少であることがわかった。現状、培養液量の１０％がＰｒＳ含有溶液であることを考慮すると、この結果から、ＰｒＳは基本的に幹細胞に無害であるという本発明者らの定量評価結果を裏付けており、観察されたわずかな毒性は調製時のコンタミネーションによるものであると考えられる。ＰｒＳの濃度が低い場合には、生存率に何ら影響がなかった。試験したタンパク質レベルは、最も高い場合には染色で使用する濃度の１０００倍超であった。十分な毒性検討は正式には本研究の一部ではなく、非常に広範な試験を必要とするものであるが、本発明者らの検討ではＰｒＳはほとんど毒性を示していない。

概要
上記の結果によると、ＰｒＳは、種々の幹細胞を含めた、ＰｒＳを発現する一連の細胞に迅速に内部移行することが明らかとなり、このことは、ＰｒＳが、治療剤の開発を目指した処理に適する特有の性質を持つことを示唆している。さらに、図３及び図７で見られるように、ＰｒＳとアネキシン間の特異性の違いから、結合そのものがこの２つのタンパク質間で異なっていると言える。アネキシンが四量体でありＰｒＳが単量体であるという単なる事実によってこうした違いを説明することはできず、上述のデータから、細胞表面の他のいくつかの要素がＰｒＳ結合に関与していると考えられる。このＰｒＳの結合、特異性、及び内部移行の機序、ならびにモジュール処理性能は、多くの可能性をもたらすものである。

実施例２
幹細胞は分化細胞由来の表現型に特徴があり、ＰＳを非アポトーシス的に発現して免疫応答の誘導を回避することができる。幹細胞を、アポトーシスを誘導することなく、蛍光標識したペイロードを含む本開示のＧｌａドメイン分子で染色した。

栄養膜幹細胞（図１４）は、胎盤において複数の種類の栄養膜に分化するものであり、プロテインＳで染色されたが、培養液中のこの細胞由来の分化栄養膜は染色されなかった。この染色はインビボで分化された幹細胞とインビトロで分化された細胞とを区別することができた。

このデータによれば、本開示の分子を使用することで、インビボサンプルまたはエクスビボサンプルで細胞を標的にすることができる。

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Claims (25)

1. 幹細胞を標的にする方法であって、ガンマ−カルボキシルグルタミン酸成分（Ｇｌａ成分）に連結したペイロードを含む分子と細胞とを接触させる工程を含み、
   前記Ｇｌａ成分が、Ｇｌａドメインまたはその活性断片を含み、前記分子がＧｌａタンパク質由来の活性触媒ドメインを含まない、方法。
2. Ｇｌａドメインまたはその活性断片が、トロンビン、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、オステオカルシン、マトリックスＧｌａタンパク質（ＭＧＰ）、ＧＡＳ６、トランスサイレチン（ＴＴＲ）、インターアルファトリプシン阻害剤、ペリオスチン、プロリンリッチＧｌａ１（ＰＲＲＧ１）、プロリンリッチＧｌａ２（ＰＲＲＧ２）、プロリンリッチＧｌａ３（ＰＲＲＧ３）、及びプロリンリッチＧｌａ４（ＰＲＲＧ４）から独立して選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記Ｇｌａドメインまたはその活性断片がプロテインＳ由来である、請求項２に記載の方法。
4. 前記Ｇｌａ成分が、ＥＧＦドメイン、例えばカルシウム結合ＥＧＦドメインをさらに含む、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の方法。
5. 構築物が、トロンビン、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、オステオカルシン、マトリックスＧｌａタンパク質、ＧＡＳ６、トランスサイレチン、ペリオスチン、プロリンリッチＧｌａ１、プロリンリッチＧｌａ２、プロリンリッチＧｌａ３、及びプロリンリッチＧｌａ４から選択されるＥＧＦドメインを含む、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記ＥＧＦドメインがプロテインＳ由来である、請求項５に記載の方法。
7. 前記Ｇｌａドメイン成分が、クリングルドメインをさらに含む、請求項１から請求項６のいずれかに記載の方法。
8. 前記クリングルドメインが、活性化転写因子２（ＡＴＦ）、第ＸＩＩ因子（Ｆ１２）、トロンビン（Ｆ２）、ヒアルロン酸結合タンパク質２（ＨＡＢＰ２）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、肝細胞増殖因子活性化因子（ＨＧＦＡＣ）、クレメンタンパク質１（ＫＲＥＭＥＮ１）、ＫＲＥＭＥＮ２、リポタンパク質（Ａ）（ＬＰＡ）、ＬＰＡＬ２、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰまたはＭＳＴ１）、ホスホイノシチド３キナーゼ相互作用タンパク質１（ＰＩＫ３ＩＰ１）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＰＬＡＴ）、ウロキナーゼ（ＰＬＡＵ）、プラスミン（ＰＬＧ）、ＰＲＳＳ１２、チロシンプロテインキナーゼ膜貫通受容体ＲＯＲ１（ＲＯＲ１）、及びチロシンプロテインキナーゼ膜貫通受容体ＲＯＲ２（ＲＯＲ２）からなる群から選択されるタンパク質由来である、請求項１０に記載の方法。
9. 前記Ｇｌａ成分が配列番号６に示した配列を含む、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記方法がインビトロで実施される、請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記送達がインビボで細胞に対して行われ、例えば、前記Ｇｌａ成分及び前記ペイロードを含む分子が患者に投与される、請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記分子が前記幹細胞の外表面を標的にする、請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記分子が前記幹細胞に内部移行される、請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記細胞が非アポトーシス性である、請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記細胞がアポトーシス性、例えば疾患幹細胞である、請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記幹細胞が、胚性幹細胞または成人幹細胞であり、外套細胞、放射状グリア細胞、骨髄間質細胞、骨膜、膵臓前駆細胞、血管内皮前駆細胞、芽細胞、及び栄養膜幹細胞などの、前駆細胞、造血幹細胞、筋原幹細胞、骨芽前駆幹細胞、神経幹細胞、及び間葉系幹細胞を含む、請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記幹細胞が表面マーカーＣＤ３４を発現する、請求項１から請求項１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記幹細胞がＬｉｎｅａｇｅ陽性表面マーカーに対して陰性である（すなわちＬｉｎ−ｖｅである）、請求項１から請求項１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記幹細胞が、ＣＤ９０＋ｖｅ、ＣＤ１３３＋ｖｅ、ＣＤ１０５＋ｖｅ、ＣＤ４５＋、Ｌｉｎ−ｖｅ、ＣＤ４８−ｖｅ、及びＣＤ２４４−ｖｅである、請求項１から請求項１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記幹細胞が、Ｌｉｎ−ｖｅ、ＣＤ３４＋ｖｅ、ＣＤ３８−ｖｅ、ＣＤ４５ＲＡ−ｖｅ、ＣＤ９０＋ｖｅ、及びＣＤ４９ｆ＋ｖｅである、請求項１から請求項１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 前記幹細胞が非癌性である、請求項１から請求項２１のいずれか１項に記載の方法。
22. 前記幹細胞が癌幹細胞である、請求項１から請求項２２のいずれか１項に記載の方法。
23. 前記癌幹細胞が上皮由来のものである、請求項２３に記載の方法。
24. 癌幹細胞が、ＣＤ４４（少なくとも乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵癌、扁平上皮癌、及び膀胱癌において過剰発現しているもの）、ＣＤ１３３（少なくとも脳腫瘍、大腸癌、肺癌、前立腺癌、及び髄芽腫において過剰発現しているもの）、ＣＤ２４、ＣＤ９０、ＣＤ２７１、ＣＤ４ｆ、ＣＤ１３、及びこれらのうちの２つ以上の組み合わせから選択される表面マーカーを発現する、請求項４４または請求項４５に記載の方法。
25. 前記幹細胞が造血性由来のものである、請求項１から請求項２２のいずれか１項に記載の方法。