BR112020004319A2 - método de alvejamento de exossomas - Google Patents

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Jonathan Hardy
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Abstract

A presente divulgação refere-se a um método de alvejamento de vesículas extracelulares que empregam uma molécula que compreende um domínio GLA e vesículas extracelulares obtidas ou obteníveis a partir de um método divulgado no presente documento.

Description

“MÉTODO DE ALVEJAMENTO DE EXOSSOMAS”
[0001] A presente divulgação refere-se a um método de alvejamento de vesículas extracelulares que emprega uma molécula que compreende um domínio GLA e vesículas extracelulares obtidas ou obteníveis a partir de um método divulgado no presente documento.
ANTECEDENTES DA TÉCNICA
[0002] Vesículas extracelulares (também conhecidas como microvesículas ou micropartículas) eram historicamente consideradas veículos para as células ejetarem material residual. Entretanto, recentemente, estabeleceu-se que, de fato, vesículas extracelulares estão envolvidas na comunicação de célula para célula de vital importância.
[0003] Demonstrou-se que as vesículas extracelulares podem ser derivadas de quase todas as células de mamíferos, incluindo células saudáveis, células-tronco e células doentes, tais como células cancerígenas. As vesículas extracelulares são extremamente estáveis e podem existir em quase todos os fluidos corporais, incluindo: plasma sanguíneo, sálvia, urina, bile, líquido sinovial, sêmen e leite materno.
[0004] Considera-se que células doentes, tais como células cancerígenas, empregam vesículas extracelulares, tais como os exossomas, para preparar e semear locais para metástase. As células infectadas por patógenos podem empregar vesículas extracelulares para espalhar a infecção. Além disso, sabe-se que as células bacterianas liberam vesículas extracelulares.
[0005] Há um grande interesse em estudar, compreender e explorar essas vesículas extracelulares, especialmente aquelas envolvidas em processos patogênicos. Sugeriu-se que essas vesículas podem ser empregadas em terapia como alternativa às células-tronco.
[0006] No entanto, existem certas dificuldades práticas, visto que as vesículas são ínfimas e estão presentes em baixas concentrações in vivo. Além disso, existem poucos marcadores para distinguir vesículas extracelulares derivadas de células doentes e vesículas extracelulares derivadas de células normais. Uma complicação adicional é que, in vivo, essas minúsculas entidades estão em um ambiente complexo, compreendendo uma mistura de moléculas biológicas, fatores, íons, minerais, etc. Portanto, até mesmo isolar e/ou monitorar essas vesículas extracelulares é um desafio.
[0007] Podem ser necessárias sete ou mais etapas para isolar as vesículas, e o principal parâmetro empregado é geralmente o tamanho. Uma vez que o diâmetro das vesículas extracelulares pode ser inferior a 300 nm e visto que têm um baixo índice de refração, vesículas extracelulares estão abaixo da faixa de detecção de muitas técnicas atualmente utilizadas. Vários sistemas miniaturizados, que exploram nanotecnologia e microfluidos, foram desenvolvidos para acelerar a análise de vesículas extracelulares. Esses novos sistemas incluem um dispositivo microNMR, um chip nanoplasmônico e um sensor magneto-eletroquímico para perfilagem de proteínas; e um cartucho fluídico integrado para detecção de RNA. A citometria de fluxo é um método óptico para detectar vesículas extracelulares em suspensão. No entanto, a aplicabilidade da citometria de fluxo para detectar vesículas extracelulares únicas ainda é inadequada devido à sensibilidade limitada e a possíveis artefatos de medição, tais a detecção de enxame. Outros métodos para detectar vesículas extracelulares únicas são microscopia de força atômica, análise de rastreamento de nanopartículas, microespectroscopia Raman, sensor de pulso resistivo sintonizável e microscopia eletrônica de transmissão.
[0008] Além da oportunidade de isolar a vesícula extracelular para fins de estudo e/ou diagnóstico, também é considerado que essas vesículas extracelulares podem ser adequadas para uso como veículos naturais para carregar cargas úteis, alvejar e/ou tratar uma variedade de enfermidades. No entanto, atualmente existem desafios significativos para realizar o potencial de carregar cargas e porções químicas de alvejamento: • nessas vesículas extracelulares - o tais como proteínas, ácidos nucléicos -
oligonucleotídeos naturais e não naturais - pequenas moléculas, enzimas, sondas para definir o conteúdo nas vesículas extracelulares para tratamento, fins de diagnóstico/prognóstico, etc.; • e nessas vesículas extracelulares - o desenvolver, alterar ou melhorar o alvejamento, exibir proteínas terapêuticas, identificar e, por exemplo, coletar vesículas extracelulares para análise ou manipulação, • foi demonstrado que alguns microRNAs entram nas vesículas, mas até o momento não existe um mecanismo robusto para colocar material dentro da vesícula, o por exemplo, danificada por eletroporação, a integração de reagentes de transfecção pode comprometer a utilidade comercial da vesícula extracelular, o transdução ineficiente por vetores virais, carregamento ou isolamento por meios que alteram as vesículas extracelulares também pode comprometer o potencial diagnóstico ou terapêutico, etc. (revisado em Vader et al., Adv Drug Delivery Rev 106: 148 a 156, 2016, Sutaria et. al., Pharm Res 34: 1.053 a 1.066, 2017, Lu et al., Eur J Pharm and Biopharm 119: 381 a 395, 2017), o saponinas também foram sugeridas como reagentes para aumentar a permeabilidade das vesículas extracelulares. No entanto, as saponinas têm atividade biológica complicada, incluindo serem hemolíticas. As frações de saponinas Quil A e QS-21 são usadas como adjuvantes da vacina para aumentar as respostas imunes ao antígeno. Portanto, o uso de saponinas não é simples.
[0009] Em terceiro lugar, pode ser útil alvejar o material patogênico e sinais nas vesículas extracelulares para reduzir a propagação da patogênese.
[0010] A divulgação neste documento aborda os problemas acima.
[0011] Surpreendentemente, essas vesículas extracelulares liberadas a partir de células patogênicas, por exemplo, células cancerosas, células bacterianas, etc., têm fosfatidilserina exposta na superfície. A fosfatidilserina exposta pode, por exemplo, atuar para regular de modo decrescente as respostas imunes às vesículas "patogênicas". Embora não deseje ser limitado pela teoria, pode ser que as “vesículas extracelulares patogênicas” sejam caracterizadas pela presença de fosfatidilserina exposta em oposição às vesículas extracelulares saudáveis normais, que não têm fosfatidilserina exposta na superfície.
[0012] Fosfatidilserina pode ser alvejada por componentes GLA que compreendem um domínio GLA, sem a presença de um domínio catalítico. Essas moléculas podem ser empregues para alvejar vesículas derivadas de células apoptóticas, por exemplo, células doentes/infectadas, anormais.
[0013] Ainda mais surpreendentemente, os presentes inventores demonstraram também que os componentes GLA também se ligam a células-tronco (por exemplo, células-tronco saudáveis). Embora não desejem ser limitadas pela teoria, essas células podem apresentar fosfatidilserina em sua superfície, o que pode contribuir para os efeitos imunossupressores e efeitos inflamatórios das células-tronco.
[0014] Vesículas extracelulares derivadas de células com fosfatidilserina exposta na superfície também têm fosfatidilserina exposta na superfície em sua superfície externa. Assim, os componentes GLA também podem ser usados para alvejar vesículas extracelulares de células-tronco.
[0015] O domínio GLA pode ser ligado ou fundido a uma carga útil, por exemplo, uma identificação, microesfera, uma molécula de diagnóstico, um motivo de alvejamento e/ou terapêutico. Isso permite o isolamento, a identificação, o rastreamento e/ou a intervenção terapêutica dessas vesículas extracelulares ou por meio das mesmas.
[0016] Alternativa ou adicionalmente, a carga útil pode ser um agente terapêutico, por exemplo, um fármaco, um agente terapêutico biológico, um polímero ou uma toxina, tal como um vírus terapêutico, um vírus oncolítico, um vetor viral, um fármaco antiviral, fármaco antibacteriano, agente antiparasitário, fármaco anticancerígeno, uma terapia anticancerígena ou um agente quimioterápico, vírus ou vetor viral (tal como um vírus oncolítico).
[0017] Assim, os componentes GLA podem ser empregues para ancorar cargas úteis à superfície das vesículas extracelulares através da fosfatidilserina exposta na superfície de ligação ao domínio GLA.
[0018] Além disso, os presentes inventores têm dados para sugerir que o componente GLA empregado na presente divulgação pode ter capacidade para transportar cargas úteis anexadas ao mesmo dentro da vesícula extracelular. Assim, o componente GLA pode ser empregado para distribuir cargas úteis no interior da vesícula extracelular.
[0019] Isso tem implicações importantes para usos terapêuticos e/ou de diagnóstico, visto que técnicas conhecidas e existentes e moléculas efetoras/repórteres podem ser reorientadas e empregues para monitorar, isolar e intervir terapeuticamente com as vesículas.
[0020] Uma vez identificadas, as vesículas podem ser monitoradas, por exemplo, in vivo, ou isoladas com o uso de técnicas conhecidas, tais como citometria de fluxo, classificação magnética e similares.
[0021] Além disso, começa a parecer que a presença de tipos específicos de vesículas podem ser utilizadas como um diagnóstico não invasivo para certas patologias.
[0022] Além disso, tendo em conta a hipótese de que os cânceres usam as vesículas para semear e promover metástases, então, destruir, remover ou alvejar essas vesículas com terapia pode ser um método para prevenir ou reduzir a metástase, por exemplo, nucleotídeos, tais como o RNAi, podem ser transportados para a vesícula extracelular para realizar knockout dos microRNAs ativos transportados na vesícula.
[0023] As vesículas expelidas de células infectadas, tais como células infectadas por vírus, contêm o material celular, por exemplo, RNA, proteínas, lipídios e carboidratos, a partir da célula infectada e também os ácidos nucleicos de origem viral. Essas vesículas podem ter um papel a desempenhar na infecção de células saudáveis. Altan-Bonnet N. 2016. Extracellular vesicles are the Trojan horses of viral infection. Curr Opin Microbiol 32: 77 a 81; Schorey JS, Cheng Y, Singh PP, Smith VL. 2015, Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions; EMBO Rep 16:24 a 43, Schorey JS, Harding CV. 2016; e Extracellular vesicles and infectious diseases: new complexity to an old story. J Clin Invest 126: 1.181 a 1.189.
[0024] Vesículas, tais como exossomas, têm várias propriedades que as tornam ideais para a entrega de material às células, que incluem seu pequeno tamanho (por exemplo, capacidade para atravessar a barreira hematoencefálica), capacidade natural de se fundir com a membrana plasmática das células para liberar seu conteúdo, ambiente interno estável e sua capacidade para entregar moléculas funcionais para a célula receptora que incluem: ácidos nucléicos (DNA, mRNA e miRNA), lipídios e proteínas.
[0025] Abordagens recentes têm sido destinadas a projetar vesículas extracelulares para aplicações terapêuticas. Essas abordagens incluem a alteração do conteúdo das vesículas ou a manipulação de suas vias migratórias. Em particular, foi demonstrado que as vesículas extracelulares podem servir como vesículas terapêuticas para o tratamento do câncer, diminuindo a invasão, a migração e a proliferação de células tumorais, aumentar a sensibilidade à quimioterapia e podem desencadear respostas imunes melhoradas e morte celular.
[0026] Também parece que as vesículas podem ser adequadas para uso como uma vacina. As vesículas liberadas a partir de células infectadas por vírus representam uma fonte exclusiva de material viral corretamente enovelado e processado, ideal para uso como antígeno em uma vacinação. No entanto, as vacinas geralmente requerem a presença de adjuvante para aumentar a resposta imune ao componente antigênico.
[0027] As tentativas anteriores de manipular o conteúdo da vesícula extracelular com o uso das abordagens clássicas de incubação, eletroporação e transfecção sofreram limitações devido à baixa eficiência da transferência, tamanho limitado da carga útil, presença de excipiente residual na membrana e restrições sobre que tipo de carga útil pode ser usada. Assim, ainda existem alguns desafios para alcançar o potencial dessas vesículas. Portanto, há uma necessidade de novos métodos que possam efetivamente distribuir conteúdo para as vesículas extracelulares e dentro das mesmas.
[0028] A presente divulgação facilita a exploração do potencial de vesículas extracelulares, possibilitando que as mesmas sejam: isoladas, usadas para fins de diagnóstico, alvos para intervenção terapêutica e sejam empregadas para fornecer terapêutica, por exemplo, através de fixação ou fusão genética, incluindo moléculas, tais como nucleotídeos, incluindo RNA e DNA, para as células.
[0029] Além disso, a expressão de fosfatidilserina na superfície da vesícula regula de modo decrescente as respostas imunes à vesícula. Um componente GLA (sem uma carga útil fixada) que se liga à fosfatidilserina na superfície da vesícula extracelular descama a vesícula para o sistema imunológico. Assim, o componente GLA da presente divulgação pode ser empregado para aumentar a visibilidade das vesículas extracelulares para o sistema imunológico.
SUMÁRIO DA DIVULGAÇÃO
[0030] A presente divulgação será agora resumida nos parágrafos abaixo:
[0031] 1a. Um método para alvejar vesículas extracelulares com fosfatidilserina exposta na superfície, sendo que o dito método compreende a etapa de introduzir uma molécula que compreende:
[0032] um componente de ácido gama-
carboxiglutâmico (componente GLA), sendo que o dito componente GLA compreende um domínio GLA ou um fragmento ativo do mesmo e que não compreende um domínio catalítico ativo de uma proteína GLA,
[0033] em um fluido que pode compreender a vesícula extracelular, por exemplo, microvesículas, corpos apoptóticos e exossomas.
[0034] 1b. Uma molécula que compreende uma carga útil ligada a um componente de ácido gama-carboxiglutâmico (componente GLA),
[0035] em que o dito componente GLA compreende um domínio GLA ou um fragmento ativo do mesmo e não compreende um domínio catalítico ativo de uma proteína GLA para uso no tratamento ou diagnóstico de uma vesícula extracelular.
[0036] 1c. Uma molécula que compreende uma carga útil ligada a um componente de ácido gama-carboxiglutâmico (componente GLA),
[0037] em que o dito componente GLA compreende um domínio GLA ou um fragmento ativo do mesmo e não compreende um domínio catalítico ativo de uma proteína GLA para uso na fabricação de um medicamento para tratamento ou diagnóstico de uma vesícula extracelular.
[0038] 2. Um método ou molécula para uso, de acordo com o parágrafo 1a, 1b ou 1c, em que a vesícula extracelular tem um diâmetro na faixa de 10 nm a 1.000 nm.
[0039] 3. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com o parágrafo 1a, 1b, 1c ou 2, em que a vesícula extracelular é um exossoma.
[0040] 4. Um método ou molécula para uso, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 3, em que a vesícula extracelular (tal como um exossoma) tem um diâmetro de 1.000 nm ou menos, por exemplo, 1 nm a 10 µm, tal como 10 nm a 5 µm, em particular, 10 nm a 1 µm, mais especificamente, 20 nm a 100 nm, mais particularmente, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 nm.
[0041] 5. Um método ou molécula para uso, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1a, 1b ou 1c a 4, em que a vesícula tem uma densidade na faixa de 1 a 1,5 g/ml, tal como 1 a 1,2 g/ml, em particular, 1,13 a 1,19 g/ml.
[0042] 6. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1a, 1b, 1c a 5, em que a vesícula compreende uma ou mais proteínas transmembranares selecionadas independentemente dentre Lamp-1, Lamp-2, CD 13, CD86, Flotilina, Sintaxina- 3, CD2, CD36, CD40, CD40L, CD41a, CD44, CD45, ICAM-1, Integrina alfa4, LiCAM, LFA-1, Mac-1 alfa e beta, Vti-IA e B, CD3 épsilon e zeta, CD9, CD18, CD37, CD53, CD63, CD81, CD82, CXCR4, FcR, GluR2/3, HLA-DM (MHC II), imunoglobulinas, componentes MHC-I ou MHC-II, TCR beta, tetraspaninas e combinações de dois ou mais dos mesmos.
[0043] 7. Um método ou molécula para uso, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1a, 1b, 1c a 6, em que a vesícula foi liberada de uma célula não saudável, por exemplo, uma célula apoptótica, uma célula necrótica, uma célula cancerígena, uma célula infectada por patógeno (tal como células infectadas por vírus, células infectadas por bactérias ou células infectadas por parasitas).
[0044] 8. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com o parágrafo 7, em que a célula é uma célula cancerígena.
[0045] 9. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com o parágrafo 8, em que a célula é uma célula-tronco cancerígena.
[0046] 10. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 6, em que a vesícula extracelular é de uma célula-tronco saudável.
[0047] 11. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1a, 1b, 1c a 10, em que o fluido compreende uma amostra de paciente ex vivo, por exemplo, uma amostra de sangue, fluido retirado de um cisto ou tumor, biópsia homogeneizada ou similares.
[0048] 12. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que o componente GLA é administrado in vivo.
[0049] 13. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1a, 1b ou 1c a 12, em que o domínio GLA ou fragmento ativo do mesmo é selecionado independentemente a partir de trombina, fator VII, fator IX, fator X, proteína C, proteína S, proteína Z, Osteocalcina, proteína matriz GLA, GAS6, Transtirretina, Periostina, GLA 1 rico em prolina, GLA 2 rico em prolina, GLA 3 rico em prolina e GLA 4 rico em prolina.
[0050] 14. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1a, 1b ou 1c a 13, em que o domínio GLA ou fragmento ativo do mesmo é selecionado independentemente a partir de trombina, fator VII, fator IX, fator X, proteína C, proteína S, proteína Z e GAS6, por exemplo, proteína S, em particular, compreendendo uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 1.
[0051] 15. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 11, em que o componente do domínio GLA compreende, ainda, um domínio EGF, por exemplo, um domínio EGF de ligação ao cálcio.
[0052] 16. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com o parágrafo 15, em que o construto compreende um domínio EGF selecionado a partir de trombina, fator VII, fator IX, fator X, proteína C, proteína S, proteína Z, Osteocalcina, proteína matriz GLA, GAS6, Transtirretina, Periostina, GLA 1 rico em prolina, GLA 2 rico em prolina, GLA 3 rico em prolina e GLA 4 rico em prolina.
[0053] 17. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com o parágrafo 16, em que o construto compreende um domínio EGF selecionado independentemente a partir de trombina, fator VII, fator IX, fator X, proteína C, proteína S, proteína Z e GAS6, por exemplo, o domínio EGF da proteína S.
[0054] 18. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com um dos parágrafos 1a, 1b ou 1c a 17, em que o componente GLA compreende uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 6 ou um derivado da mesma em que a etiqueta His está ausente, em particular, uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 6.
[0055] 19. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1a, 1b ou 1c a 14, em que o componente do domínio GLA compreende, ainda, um domínio Kringle.
[0056] 20. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com o parágrafo 19, em que o domínio Kringle é de uma proteína selecionada do grupo que compreende o fator de transcrição de ativação 2 (ATF); Fator XII (F12); trombina (F2); Proteína de ligação a hialuronano 2 (HABP2); Fator de crescimento de hepatócitos (HGF); ativador do fator de crescimento de hepatócitos (HGFAC); Proteína Kremen 1 (KREMEN1); KREMEN2; Lipoproteína (a) (LPA); LPAL2; Proteína estimuladora de macrófagos (MSP ou MST1); proteína de interação com fosfoinositida-3-quinase 1 (PIK3IP1); ativador de plasminogênio tecidual (PLAT); uroquinase (PLAU); Plasmina (PLG); PRSS12; receptor transmembranar da proteína tirosina- quinase ROR1 (ROR1); e receptor transmembranar da proteína tirosina-quinase ROR2 (ROR2).
[0057] 21. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1a, 1b ou 1c a 20, em que o componente GLA está ligado a uma carga útil.
[0058] 22. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com o parágrafo 21, em que o componente GLA é conjugado com a carga útil.
[0059] 23. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1a, 1b ou 1c a 22, em que o componente GLA faz parte de uma proteína de fusão.
[0060] 24. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com o parágrafo 23, em que a carga útil compreende uma identificação detectável.
[0061] 25. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com o parágrafo 24, em que a identificação é selecionada a partir de uma molécula fluorescente (incluindo uma sonda fluorescente (tal como corante de rodamina, FITC, FAM, CY5), biotina, uma enzima, uma etiqueta (por exemplo, uma etiqueta HIS, etiqueta FLAG, etiqueta myc), radionuclídeos (particularmente radioiodeto, radioisótopos, tais como 99mTc), identificações ou compostos luminescentes que podem ser detectados por espectroscopia de RMN ou ESR, incluindo quando a identificação detectável está em um sinalizador molecular.
[0062] 26. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1a, 1b ou 1c a 25, em que a carga útil é uma microesfera, placa ou uma etiqueta, por exemplo, uma microesfera isolável, tal como uma microesfera magnética.
[0063] 27. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com os parágrafos 21 a 26, em que a carga útil está ligada ao componente GLA por meio de um ligante.
[0064] 28. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com o parágrafo 27, em que o ligante é clivável.
[0065] 29. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com qualquer um dos parágrafos 21 a 28, em que o componente GLA e a carga útil são um diagnóstico.
[0066] 30. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1a, 1b ou 1c a 29, em que o método compreende uma etapa adicional de fornecer uma população enriquecida das vesículas extracelulares.
[0067] 31. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1a, 1b ou 1c a 30, em que o método compreende a etapa de isolar as vesículas extracelulares.
[0068] 32. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1a, 1b ou 1c a 31, em que o método é realizado in vitro.
[0069] 33. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com qualquer um dos parágrafos 1a, 1b ou 1c a 32, em que a molécula que compreende o componente GLA é um terapêutico.
[0070] 34. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com qualquer um dos parágrafos 21 a 25 e 33, em que a carga útil compreende um fármaco, um agente quimioterapêutico, um peptídeo (incluindo peptídeos grampeados) ou terapêutico biológico, por exemplo: um fármaco antiviral, fármaco antibacteriano, agente antiparasitário, fármaco anticâncer, uma terapia anticâncer.
[0071] 35. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com qualquer um dos parágrafos 21 a 25, 33 e 34, em que a carga útil compreende uma toxina, um polímero (por exemplo, polímeros sintéticos ou de ocorrência natural), proteínas biologicamente ativas (por exemplo, enzimas, outros anticorpos ou fragmentos de anticorpo, por exemplo, intracorpos), um fármaco (molécula pequena (entidade química), c, ácidos nucleicos e fragmentos dos mesmos (por exemplo, DNA, RNA e fragmentos dos mesmos), um agente quelante de metal, nanopartículas ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos.
[0072] 36. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com o parágrafo 35, em que a toxina é selecionada a partir de uma auristatina (por exemplo, MMAE (monometil auristatina E), MMAF (monometil auristatina F)), pirrolobenzodiazepina (PBD), doxorrubicina, duocarmicina, um maitansinoide (por exemplo, N 2'-deacetil-N 2’-(3-mercapto-1-oxopropil)- maitansina (DM1), N 2'-deacetil-N2’-(4-mercapto-1-oxopentil)-maitansina (DM3) e N 2'-deacetil-N 2'(4-metil-4-mercapto-1-oxopentil)-maitansina (DM4)),
caloceamicina, dolastatina, maitansina, α-amanitina, exotoxina de Pseudomonas (PE38), cadeia de ricina A, toxina da difteria, proteína antiviral Pokeweed (PAP), saporina, gelonina e uma tubulisina.
[0073] 37. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com qualquer um dos parágrafos 34 a 36, em que o quimioterápico é selecionado a partir de temozolomida, epotilonas, melfalano, carmustina, bussulfano, lomustina, ciclofosfamida, dacarbazina, polifeprosano, ifosfamida, clorambucila, mecloretamina, bussulfano, ciclofosfamida, carboplatina, cisplatina, tiotepa, capecitabina, estreptozocina, bicalutamida, flutamida, nilutamida, acetato de leuprolida, cloridrato de doxorrubicina, sulfato de bleomicina, cloridrato de daunorrubicina, dactinomicina, citrato de daunorrubicina lipossomal, cloridrato de doxorrubicina lipossomal, cloridrato de epirrubicina, cloridrato de idarrubicina, mitomicina, doxorrubicina, valrubicina, anastrozol, citrato de toremifeno, citarabina, fluorouracila, fludarabina, floxurridina, interferon α-2b, plicamicina, mercaptopurina, metotrexato, interferon α-2a, acetato de medroxiprogersterona, fosfato de estramustina sódico, estradiol, acetato de leuprolida, acetato de megestrol, acetato de octreotídeo, difosfato de deitilstilbestrol, testolactona, acetato de goserelina, fosfato de etoposida, sulfato de vincristina, etoposídeo, vinblastina, etoposídeo, sulfato de vincristina, teniposídeo, trastuzumabe, gentuzumabe ozogamicina, rituximabe, exemestano, cloridrato de irinotecano, asparaginase, cloridrato de gencitabina, altretamina, cloridrato de topotecano, hidroxiureia, cladribina, mitotano, cloridrato de procarbazina, tartarato de vinorelbina, pentrostatina sódica, mitoxantrona, pegaspargase, denileucina diftitix, altretinoína, porfímero, bexaroteno, paclitaxel, docetaxel, trióxido de arsênico, tretinoína e combinações de dois ou mais dos mesmos.
[0074] 38. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com qualquer um dos parágrafos 34 a 37, em que o quimioterápico é selecionado a partir de um agente alquilante, um antimetabólito, incluindo inibidores da timidilato sintase, um taxano, uma antraciclina, um agente antimicrotúbulo, incluindo alcaloides vegetais, e combinações de dois ou mais dos mesmos.
[0075] 39. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com o parágrafo 38, em que o quimioterápico é selecionado a partir de paclitaxel, docetaxel, abraxano, carbazitaxel, derivados de qualquer um dos mesmos e combinações de dois ou mais dos itens acima mencionados.
[0076] 40. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com a reivindicação 38 ou 39, em que o agente alquilante é selecionado a partir de uma mostrada de nitrogênio, uma nitrosoureia, uma tetrazina, uma aziridina, uma platina e derivados dos mesmos, um agente alquilante não clássico e uma combinação de dois ou mais dos mesmos.
[0077] 41. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com o parágrafo 40, em que a platina é selecionada a partir de cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, satraplatina, picoplatina, nedaplatina, triplatina, lipoplatina e uma combinação de duas ou mais das mesmas.
[0078] 42. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com qualquer um dos parágrafos 38 a 41, em que o alquilante é um antimetabólito selecionado dentre anti-folatos (por exemplo, metotrexato e pemetrexedo), análogos de purina (por exemplo, tiopurinas), tais como azatiopurina, mercaptopurina, tiopurina, fludarabina (incluindo a forma fosfato), pentostatina e cladribina, análogos de pirimidina (por exemplo, fluoropirimidinas, tais como 5-fluorouracila e profármacos das mesmas, tais como capecitabina [Xeloda®]), floxuridina, gencitabina, citarabina, decitabina, cloridrato de raltitrexedo (tomudex), cladribina e 6-azauracila e combinação de dois ou mais dos mesmos.
[0079] 43. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com qualquer um dos parágrafos 40 a 42, em que a antraciclina é selecionada dentre daunorrubicina (Daunomicina), daunorrubicina (lipossomal), doxorrubicina (Adriamicina), doxorrubicina (lipossomal), epirrubicina, idarrubicina, mitoxantrona e uma combinação de dois ou mais das mesmas, em particular, doxorrubicina.
[0080] 44. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com qualquer um dos parágrafos 34 a 43, em que o fármaco é um fármaco anticancerígeno, por exemplo, selecionado a partir de um inibidor de topoisomerase, um inibidor de PARP e uma combinação de dois ou mais dos mesmos.
[0081] 45. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com qualquer um dos parágrafos 34 a 44, em que a terapia anticâncer é um radionuclídeo, por exemplo, selecionado dentre Y-90, P-32, I-131, In-111, Sr- 89, Re-186, Sm-153, Sn-117m e uma combinação de dois ou mais dos mesmos.
[0082] 46. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a, 1b ou 1c a 25 e 27 a 45, que compreende administrar a molécula que compreende o componente GLA e a carga útil a um paciente com câncer.
[0083] 47. Um método ou uma molécula para uso, de acordo com o parágrafo 46, em que o câncer é um câncer epitelial, por exemplo, câncer colorretal, câncer testicular, câncer de fígado, câncer de vias biliares, câncer de próstata, câncer de pâncreas, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de colo de útero, câncer uterino, câncer gástrico, câncer esofágico, câncer de tireoide, câncer renal, câncer de bexiga, câncer cerebral, câncer de cabeça e pescoço ou câncer de pulmão ou, alternativamente, o câncer pode ser um câncer hematológico, por exemplo, leucemia, linfoma, mieloma e doenças mieloproliferativas crônicas, tais como AML.
[0084] Em uma modalidade, o método da presente divulgação não tem como alvo um corpo apoptótico.
[0085] Assim, em uma modalidade, as moléculas de acordo com a presente divulgação são empregues no tratamento de um patógeno, por exemplo, infecções virais, bacterianas, por protozoários, parasitárias, incluindo as formas intracelulares das mesmas.
[0086] A presente divulgação também se estende ao uso de um componente GLA que compreende um domínio GLA ou um fragmento ativo do mesmo, em que o dito componente GLA não compreende um domínio catalítico ativo de uma proteína GLA, para alvejamento e entrega intravesicular (incluindo entrega intravesicular da carga útil).
[0087] A presente divulgação também se estende ao uso de um componente GLA que compreende um domínio GLA ou um fragmento ativo do mesmo, em que o dito componente GLA não compreende um domínio catalítico ativo de uma proteína GLA, para a fabricação de um medicamento para alvejamento e entrega intracelular (incluindo entrega intravesicular da carga útil, em particular, quando a carga útil compreende uma entidade/molécula terapêutica).
[0088] Assim, em um aspecto, é fornecido um método in vitro para gerar/isolar vesículas a partir de linhagens de células humanas infectadas por patógenos que emprega o método divulgado no presente documento, por exemplo, células HEp-2, células A549, células Calu-3, células renais HEK e Madin Darby (MDCK), por exemplo, para uso em uma vacina.
[0089] Em uma modalidade, a vesícula gerada/isolada in vitro é carregada com uma carga útil, por exemplo, um oligonucleotídeo ou um polinucleotídeo, tal como um RNA ou DNA, tal como CPG, que emprega um componente de ácido gama-carboxiglutâmico (componente GLA) que compreende um domínio GLA ou um fragmento ativo do mesmo e que não compreende um domínio catalítico ativo de uma proteína GLA.
[0090] Em uma modalidade, a vesícula gerada/isolada in vitro é carregada com uma molécula imunoestimuladora, que emprega um componente de ácido gama-carboxiglutâmico (componente GLA) que compreende um domínio GLA ou um fragmento ativo do mesmo e que não compreende um domínio catalítico ativo de uma proteína GLA.
[0091] Miméticos de vesículas extracelulares podem ser gerados in vitro quebrando-se as células através de extrusão em série, consultar, por exemplo, Jang et al. Nano 2013, 7, 7.698. Esses miméticos terão fosfatidilserina em sua superfície se forem gerados a partir de células apoptóticas ou células-tronco.
[0092] Em uma modalidade, o oligonucleotídeo ou o polinucleotídeo é conjugado com o componente GLA.
[0093] A presente divulgação também se estende a uma composição de vacina que compreende vesículas extracelulares de uma célula infectada por patógeno e carregada com: uma molécula imunoestimuladora exógena, por exemplo, selecionada a partir de um adjuvante, por exemplo, agonista de TLR9, tal como um CPG, C3b, ICAM-1; e um componente GLA de acordo com a presente divulgação.
[0094] As vesículas na vacina podem ter sido geradas in vivo ou in vitro. As vesículas podem ser geradas in vitro em uma linhagem de célula humana infectada por patógeno, por exemplo, selecionada a partir de células HEp-2, células A549, células Calu-3, células renais HEK e Madin Darby (MDCK).
[0095] A molécula imunoestimuladora exógena pode ser carregada: no exterior, no interior da vesícula “derivada de patógeno” ou pode estar localizada em ambos os locais.
[0096] O componente GLA pode ser carregado: no exterior, no interior da vesícula “derivada de patógeno” ou pode estar localizado em ambos os locais.
[0097] Em uma modalidade, a molécula imunoestimuladora não está ligada ao componente GLA, ou seja, elas são carregadas separadamente, por exemplo, a molécula imunoestimuladora pode ser fornecida como um plasmídeo, que pode ser transfectado para a vesícula e o componente GLA é fornecido como uma proteína.
[0098] O carregamento da vesícula tanto com um componente GLA como com as moléculas imunoestimuladoras fornece dois mecanismos distintos de ação, em que o componente GLA se liga à fosfatidilserina na superfície da vesícula, revelando, desse modo, a presença da vesícula para o sistema imunológico. A molécula imunoestimuladora, então, aumenta a resposta do sistema imunológico ao material patogênico na vesícula.
[0099] A molécula imunoestimuladora exógena pode ser ligada ao domínio GLA, por exemplo, conjugada com o componente GLA ou pode ser uma fusão (construto de expressão) com o componente GLA.
[00100] É vantajoso fornecer a molécula imunoestimuladora ligada ao componente GLA, pois o componente GLA pode se ligar à fosfatidilserina na superfície da vesícula, carregando, assim, a si próprio e também a molécula imunoestimuladora na vesícula. Além disso, em alguns casos, o componente GLA pode ser internalizado na vesícula e trazer com ele a molécula imunoestimuladora.
[00101] Em uma modalidade, o patógeno é bacteriana ou viral, por exemplo, como listado no presente documento, em particular, o vírus da gripe, por exemplo, o influenza A, B, C ou D. O influenza A tem os subtipos de hemaglutinina H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17, H18 e os subtipos de neuraminidase N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9, N10, N11, tal como uma cepa selecionada a partir de influenza A: (H1N1) H1N2, H2N1, H911, H3N1, H3N2 e H2N3, um novo vírus influenza A H1N1 (CDC 2009 H1N1 Flu website).
[00102] A tecnologia da presente divulgação pode ser adequada para a preparação de uma vacina universal contra a gripe.
[00103] No entanto, mesmo quando usada para preparar uma vacina contra gripe sazonal, a presente tecnologia provavelmente será mais eficiente e conveniente do que o desenvolvimento de vacinas atualmente disponíveis em ovos.
[00104] A presente divulgação também fornece uma vesícula "derivada de patógeno" de acordo com a presente divulgação para tratamento, em particular, para uso como uma vacina.
[00105] Também é fornecido o uso de uma vesícula "derivada de patógeno" de acordo com a presente divulgação para a fabricação de um medicamento, em particular, para a fabricação de uma vacina.
[00106] Conforme discutido acima, o componente GLA pode ser empregue para transportar uma carga útil, tal como uma carga útil terapêutica para o interior da vesícula extracelular. A carga útil terapêutica pode atuar na própria vesícula ou pode ser entregue a uma célula pela vesícula e atuar na célula, ou uma combinação desses dois cenários.
DIVULGAÇÃO DETALHADA
[00107] Em uma modalidade, 1, 2, 3, 4 ou 5 cargas úteis são ligadas por componente GLA.
[00108] O componente GLA (também denominado no presente documento como componente de ácido gama-carboxiglutâmico) refere- se a um polipeptídeo que compreende um domínio GLA na ausência de um domínio catalítico de uma proteína GLA, tal como a proteína S. O polipeptídeo pode compreender, ainda, um domínio EGF e/ou domínio kringle, por exemplo, da proteína S. Em uma modalidade, o componente GLA compreende 30 a 300 resíduos de aminoácidos, por exemplo 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 ou 300 resíduos. Em uma modalidade, o componente GLA está na faixa de 4,5 a 30 kDa. Em uma modalidade, o componente GLA compreende a sequência mostrada na SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, o componente GLA compreende uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 6 ou um derivado da mesma, excluindo a etiqueta His.
[00109] Os domínios GLA (carboxilação dependente de vitamina K/gama-carboxiglutâmico) conforme empregues no presente documento são domínios de proteínas que foram modificados pela carboxilação pós-translacional dependente de vitamina K de resíduos de glutamato na sequência de aminoácidos para fornecer gama-carboxiglutamato (Gla). Em uma modalidade, o domínio GLA empregado nas moléculas da presente divulgação compreende 30 a 45 resíduos consecutivos de um domínio GLA nativo (do tipo selvagem). Em uma modalidade, o domínio GLA compreende 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,
10, 11, 12, 13, 14 ou 15 resíduos de GLA.
[00110] Em uma modalidade, 30% ou menos do componente GLA trata-se de resíduos de GLA.
[00111] Em uma modalidade, o componente GLA compreende 1 a 5 ligações dissulfeto, por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou 5 ligações dissulfeto.
[00112] O domínio GLA liga íons de cálcio quelando- os entre dois resíduos de ácido carboxílico. Esses resíduos fazem parte de uma região que começa na extremidade de terminal N da forma madura das proteínas GLA e termina com um resíduo aromático conservado. Isso resulta em um motivo conservado de Gla-x(3)-Gla-x-Cys que é encontrado no meio do domínio, o que parece ser importante para o reconhecimento do substrato pela carboxilase.
[00113] Domínios GLA estão contidos em várias proteínas, tais como Trombina, Fator VII, Fator IX, Fator X, Proteína C, Proteína S (PrS), Proteína Z, Osteocalcina, Proteína da matriz GLA, GAS6, Transtirretina, Periostina, GLA 1 rico em prolina, GLA 2 rico em prolina, GLA 3 rico em prolina e GLA 4 rico em prolina.
[00114] O domínio GLA, conforme empregue no presente documento, também se estende a proteínas em que 1 a 10 por cento (tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10%) dos aminoácidos no domínio GLA nativo pode ser substituído e/ou deletado, desde que o domínio modificado retenha pelo menos 70% (tal como 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100%) da atividade nativa do (domínio GLA não modificado) nativo em um ensaio in vitro adequado. Em uma modalidade, o domínio é o domínio nativo de comprimento completo.
[00115] O domínio EGF, conforme empregue no presente documento, refere-se a um domínio conservado de proteínas. O mesmo compreende cerca de 30 a 40 resíduos de aminoácidos e foi encontrado em um grande número de proteínas principalmente animais. A maioria das ocorrências do domínio semelhante a EGF é encontrada no domínio extracelular de proteínas ligadas à membrana ou em proteínas conhecidas por serem secretadas. O domínio semelhante a EGF inclui 6 resíduos de cisteína. A estrutura principal de domínios semelhantes a EGF é uma folha β de duas fitas seguida por uma alça até uma curta folha β de duas fitas do terminal C. Essas duas folhas β são geralmente indicadas como as folhas principais (terminal N) e secundárias (terminal C). Os domínios semelhantes a EGF frequentemente ocorrer em inúmeras cópias em tandem em proteínas: essas repetições tipicamente se enovelam em conjunto para formar um único bloco linear de domínio solenoide, como uma unidade funcional. Em uma modalidade, o domínio empregado é o domínio nativo de comprimento completo.
[00116] O domínio EGF, conforme empregue no presente documento, também se estende a proteínas em que 1 a 10 por cento (tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10%) dos aminoácidos no domínio EGF nativo pode ser substituído e/ou deletado, desde que o domínio modificado retenha pelo menos 70% (tal como 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100%) da atividade nativa do (domínio EGF não modificado) nativo em um ensaio in vitro adequado. Em uma modalidade, o domínio é o domínio nativo de comprimento completo.
[00117] O domínio Kringle, conforme empregue no presente documento, refere-se a domínios de proteínas autônomos que se enovelam em grandes alças estabilizadas por 3 ligações dissulfeto. Os mesmos são caracterizados por uma estrutura em ponte de 3-dissulfeto de alça tripla, cuja conformação é definida por várias ligações de hidrogênio e pequenos pedaços de folha beta antiparalela. Os mesmos são encontrados em toda a coagulação sanguínea e proteínas fibrinolíticas, em um número variável de cópias, em algumas proteínas plasmáticas, incluindo o ativador do plasminogênio do tipo protrombina e uroquinase, que são serina proteases pertencentes à família MEROPS peptidase S1A.
[00118] O domínio Kringle, conforme empregue no presente documento, também se estende a proteínas em que 1 a 10 por cento
(tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10%) dos aminoácidos no domínio Kringle nativo pode ser substituído e/ou deletado, desde que o domínio modificado retenha pelo menos 70% (tal como 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100%) da atividade nativa do (domínio Kringle não modificado) nativo em um ensaio in vitro adequado. Em uma modalidade, o domínio empregado é o domínio nativo de comprimento completo.
[00119] Um fragmento ativo de uma proteína, conforme empregue no presente documento, é menor que a proteína nativa inteira (ou domínio relevante), que retém pelo menos 50% (tal como 60, 70, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100%) da atividade do domínio ou proteína nativa de comprimento completo em um ensaio in vitro relevante.
[00120] O domínio catalítico, conforme empregue no presente documento, é um domínio (ou fragmento) a jusante do domínio EGF na direção do terminal C, por exemplo, conforme ilustrado na Figura 1A.
[00121] In vitro, conforme empregue no presente documento, refere-se a trabalhos de laboratório não realizados em um corpo humano ou animal.
[00122] In vivo, conforme empregue no presente documento, refere-se ao trabalho/teste/tratamento em um organismo vivo, em particular, um humano ou animal, em particular, um humano.
[00123] Vesículas extracelulares (EVs) são mediadores importantes de comunicação intercelular de longa distância e estão envolvidos em uma grande variedade de processos biológicos através de organismos tanto procarióticos como eucarióticos (revisado em Arenaccio e Federico, Adv Exp Med Biol 998:. 3 a 19, 2017, Lu et al., Eur J Pharm Biopharm 119: 381 a 195, 2017, Vader et al., Adv Drug Delivery Rev 106:148 a 156, 2016, Lefebvre e Lecuyer, Front Microbiol 8: 377, 2017).
[00124] Vesículas extracelulares são eliminadas de células infectadas (virais, bacterianas ou parasitárias) e contêm o material desses agentes infecciosos (revisado em Schorey et al., EMBO Rep 16: 24 a 43,
2015, Schorey e Harding, J. Clin Invest. 126: 1.181 a 1.189, 2016). Esse material pode variar de toxinas a fatores de virulência a vírus infecciosos (ambos envelopados e não envelopados; revisado em Altan-Bonnet, N, Curr Opin Microbiol 32: 77 a 81, 2016) e pode ser um meio inovador para distribuir com mais eficácia populações virais em vez de partículas virais únicas (Chen YH et al., Cell 160: 619 a 630, 2015). Consequentemente, seu isolamento poderia fornecer uma rápida visão diagnóstica da doença.
[00125] Vesículas extracelulares é um termo abrangente para descrever todas as vesículas de membrana secretadas. Conforme empregue no presente documento, o termo inclui exossomas, microvesículas (também denominadas micropartículas), ectossomas, vesículas da matriz, vesículas calcificantes, prostassomas, oncossomas, partículas semelhantes a retrovírus, vesículas extracelulares bacterianas, vesículas intraluminais e corpos apoptóticos.
[00126] Além disso, as vesículas extracelulares, que contêm proteínas, RNA e carboidratos específicos para o agente infeccioso, e células podem também ser potencialmente sistemas para vacinação in situ. Nesse cenário, prevê-se que o envolvimento e a neutralização das moléculas de fosfatidilserina de amortecimento imune devido ao domínio GLA possibilitem a detecção e a depuração imune e sirvam como um método inovador e mais eficaz de vacinação específica para a doença infecciosa.
[00127] Vesículas extracelulares, conforme empregue no presente documento, incluem microvesículas, corpos apoptóticos e exossomas. As vesículas extracelulares geralmente têm um diâmetro na faixa de 10 nm a 5.000 nm.
[00128] Microvesículas, conforme empregue no presente documento, referem-se a vesículas liberadas após a formação por brotamento da citomembrana e, por exemplo, geralmente têm um diâmetro na faixa de 100 nm a 1.000 nm.
[00129] Os exossomas são produzidos dentro de corpos multivesiculares e são liberados após a fusão do corpo multivesicular com a citomembrana. Geralmente, os exossomas têm um diâmetro na faixa de 30 a 100 nm.
[00130] Os corpos apoptóticos, conforme empregue no presente documento, referem-se a vesículas lançadas no ambiente extracelular pelas células apoptóticas. Os corpos apoptóticos podem não estar envolvidos na comunicação intracelular. Geralmente, o diâmetro dos corpos apoptóticos está na faixa de 800 nm a 5.000 nm.
[00131] Consultar, por exemplo, Modularized Extracellular Vesicles: The Dawn of Prospective Personalized and Precision Medicine, Tao et al Adv. Sci. 2018, 5, 1700449; Mesenchymal Stem Cell-derived Extracellular Vesicles: Towards Cell-free Therapeutic Applications, Rani et al, www.moleculartherapy.org volume 23 número 5, 812 a 823, maio de 2015; e Achieving the Promise of Therapeutic Extracelluar Vesicles: The Devil is in the Detail of Therapeutic Loading Sutaria et al, Pharma Res. maio de 2017; 34(5)
1.053 a 1.066, incorporados ao presente documento a título de referência.
[00132] Assim, a presente divulgação fornece o uso de vesículas extracelulares para o diagnóstico, por exemplo, de infecção por um patógeno, por exemplo, uma infecção viral, infecção bacteriana e/ou infecção parasitária.
[00133] Assim, a presente divulgação fornece o uso de vesículas extracelulares para o tratamento, por exemplo, de infecção por um patógeno, por exemplo, uma infecção viral, infecção bacteriana e/ou infecção parasitária, em particular, quando a vesícula extracelular é tratada para neutralizar ou eliminar material patogênico e/ou a vesícula extracelular é carregada com material terapêutico para entrega a uma célula-alvo.
[00134] Assim, a presente divulgação fornece o uso de vesículas extracelulares para o diagnóstico de infecção por um patógeno, por exemplo, uma infecção viral, infecção bacteriana e/ou infecção parasitária.
[00135] Assim, a presente divulgação fornece o uso de vesículas extracelulares para o tratamento, por exemplo, de infecção por um patógeno, por exemplo, uma infecção viral, infecção bacteriana e/ou infecção parasitária, em particular, quando a vesícula extracelular é tratada para neutralizar ou eliminar material patogênico e/ou a vesícula extracelular é carregada com material terapêutico para entrega a uma célula.
[00136] Assim, a presente divulgação fornece uso de vesículas extracelulares para o diagnóstico de câncer.
[00137] Assim, a presente divulgação fornece o uso de vesículas extracelulares para o tratamento de um câncer, por exemplo, quando a vesícula extracelular é tratada para neutralizar ou eliminar material patogênico e/ou a vesícula extracelular é carregada com material terapêutico para entrega a uma célula.
[00138] Vesículas extracelulares e métodos de acordo com a presente divulgação também podem ser úteis no diagnóstico e/ou tratamento de doenças autoimunes, especialmente vesículas extracelulares de células-tronco.
[00139] Em uma modalidade, as vesículas extracelulares da divulgação são de uma célula humana.
[00140] Em uma modalidade, as vesículas extracelulares são de células-tronco (em particular, células-tronco saudáveis). Essas vesículas podem ser usadas de maneira semelhante à terapia com células-tronco.
[00141] Em uma modalidade, as vesículas extracelulares da divulgação são de uma célula patogênica, tal como uma célula bacteriana.
[00142] As células podem secretar diferentes tipos de EVs e estas foram classificadas de acordo com a sua origem subcelular (Colombo et ai, Annu Rev Cell Dev Biol. 30: 255 a 289, 2014). Apesar das diferenças de origem e tamanho, não existe nomenclatura uniforme da EV devido à sobreposição nos tamanhos das vesículas e na ausência de marcadores específicos para o subtipo. Como resultado, permanece difícil purificar e, assim, distinguir entre os tipos de vesículas. Por exemplo, os protocolos de purificação de exossomas mais populares usados historicamente na literatura (ultracentrifugação diferencial, filtragem a 220 nm (Thery et al., Curr Protoc Cell Bioil capítulo 3, unidade 3.22, 2006) - e recentemente lançados em kits comerciais - co-isoladam diferentes tipos de EVs (rev. Tkach e Thiery, Cell 164:
1.226 a 1.232, 2016). Assim, termos como “exossoma” são geralmente denominados uma população mista de EVs pequenas e, portanto, para esta invenção, optamos por usar o termo genérico EVs para se referir a todos os subtipos de vesículas.
[00143] Geralmente, as vesículas extracelulares compreendem uma bicamada lipídica que compreende ceramidas, colesteróis, fosfoglicerídeos e esfingolipídios (Subra et al 2010, Trajkovic et al 2008, Vlassov et al 2012).
[00144] Todas as vesículas extracelulares carregam moléculas de superfície que permitem que sejam alvejadas em células receptoras onde sinalizam e/ou entregam seu conteúdo em seu citosol através de uma variedade de meios (por exemplo, endocitose e/ou fagocitose, fusão etc.), modificando, assim, o estado fisiológico da célula receptora. Por serem veículos de entrega naturais para proteínas, lipídios e material genético, as mesmas representam um biovetor exclusivo que está sendo explorado ativamente em uma série de indicações de doenças para geração de imagens, diagnósticos e/ou para uso como carreadores terapêuticos (revisado em Rufino- Ramos et al., J. Control Release 262: 247 a 258, 2017, Vader et al., Adv Drug Deliv. Rev 106: 148 a 156, 2016, Sutaria et al., Pharm Res. 34: 1.053 a 1.066, 2017, Ingato et al., J. Control Release 241: 174 a 185, 2016).
[00145] Em uma modalidade, a vesícula extracelular é um exossoma. Os exossomas estão geralmente na faixa de 30 a 150 nm, tal como 30 a 100 nm de diâmetro, e, por exemplo, podem carregar um ou mais marcadores de superfície selecionados entre transferrina, CD9, CD63, CD61,
CD81, TSG101, LAMPS e Alix.
[00146] Em uma, a vesícula extracelular é uma microvesícula (também denominada micropartícula) e inclui micropartículas endoteliais. Geralmente, as microvesículas têm um diâmetro na faixa de 50 a
2.000 nm e, por exemplo, podem carregar um ou mais marcadores de superfície, selecionados a partir de VCAMP3 e ARF6.Embora micropartículas endoteliais circulantes possam ser encontradas no sangue de indivíduos normais, um número aumentado de micropartículas endoteliais circulantes foi identificado em indivíduos com certas doenças, incluindo hipertensão e distúrbios cardiovasculares e pré-eclâmpsia e vários formas de vasculite. As micropartículas endoteliais em alguns desses estados de doença demonstraram ter matrizes de moléculas da superfície celular que refletem um estado de disfunção endotelial. Portanto, as micropartículas endoteliais podem ser úteis como um indicador ou índice do estado funcional do endotélio na doença e podem potencialmente desempenhar papéis importantes na patogênese de certas doenças, incluindo artrite reumatoide.
[00147] Em uma modalidade, a vesícula extracelular é um ectossoma. Geralmente, os ectossomas têm um diâmetro na faixa de 100 a
1.000 nm, tal como 350 a 400 nm, e podem, por exemplo, carregar um ou mais marcadores de superfície selecionados a partir de TyA e C1a.
[00148] Em uma modalidade, a vesícula é uma vesícula extracelular calcificante. Essas vesículas são liberadas das células nas placas ateroscleróticas. Recentemente, EVs calcificantes derivadas de macrófagos e células do músculo liso (SMCs) têm recebido maior atenção por seu papel na calcificação vascular. Acredita-se que essas vesículas tenham um papel na mediação da calcificação vascular, um importante preditor de morbimortalidade cardiovascular.
[00149] Em uma modalidade, a vesícula extracelular é uma vesícula de matriz. As vesículas de matriz, conforme referido no presente documento, estão envolvidas no desenvolvimento ósseo, em que as vesículas derivadas de osteoblastos nucleiam cristais de hidroxiapatita ao longo das fibras de colágeno no osso em desenvolvimento. As mesmas também servem como focos de nucleação para a formação de microcalcificações nos caps fibrosos da placa aterosclerótica, o que leva à instabilidade da placa, ruptura e subsequente infarto do miocárdio e acidente vascular cerebral.
[00150] Em uma modalidade, a vesícula extracelular é uma prostassoma. Prostassoma, conforme empregue no presente documento, refere-se a vesículas secretadas pelas células epiteliais da glândula da próstata no fluido seminal. As mesmas geralmente têm um diâmetro na faixa de 40 a 500 nm. As mesmas possuem uma composição lipídica incomum e uma estrutura apertada e altamente ordenada de suas membranas de lipoproteína que se assemelham a balsa lipídica. O papel fisiológico dos prostassomas implica melhoria da motilidade espermática e proteção contra ataques da defesa imunológica feminina durante a passagem para o óvulo. Investigações mostraram que células prostáticas cancerígenas e células prostáticas com baixa diferenciação continuam a produzir e secretar prostassomas. A elevada incidência de câncer de próstata em homens idosos pode tomar vantagem das atividades de proteção imunológica suportadas pelos prostassomas. Proteínas de regulação imunológica encontradas em prostassomas incluem: amino- peptidase N (CD13); dipeptidil-peptidase IV (CD26); encefalinase (endopeptidase neutra, CD10); enzima conversora de angiotensina (ACE, CD143); fator TF tecidual (CD142, tromboplastina); fator de aceleração de decaimento (CD55); protectina (CD59, inibidor de MAC) e proteína cofator de membrana reguladora complementar (CD46). Prostassomas também contêm altos níveis de cátions divalentes: Zn2+, Ca2+ e Mg2+.
[00151] Em uma modalidade, a vesícula extracelular é uma oncossoma. Oncossoma, conforme empregue no presente documento, refere-se a grandes vesículas extracelulares na faixa de 1 µm a 10 µm de diâmetro. No contexto de tumores cerebrais, a existência de EVs liberadas pelas células do glioma e que expressam EGFRvIII, uma forma mutada do receptor.
Demonstrou-se que essas vesículas têm capacidade para transferir a oncoproteína EGFRvIII para a membrana das células tumorais que carecem desse receptor, propagando, assim, o material promotor de tumor e induzindo a transformação. Foi demonstrado que oncossomas grandes positivos para Cav-1 discriminam pacientes com câncer de próstata localmente confinado de pacientes com doença metastática e resistente à castração.
[00152] Em uma modalidade, as partículas extracelulares são partículas semelhantes a retrovírus. Essas geralmente têm um diâmetro na faixa de 75 a 100 nm e podem carregar um marcador de superfície Gag.
[00153] Em uma modalidade, a vesícula extracelular é uma vesícula extracelular bacteriana. Essas vesículas geralmente têm um diâmetro na faixa de 10 a 300 nm e podem ter PAMPs em sua superfície.
[00154] Em uma modalidade, a vesícula extracelular é uma vesícula intraluminal. Conforme empregue no presente documento, isso refere-se a uma vesícula dentro de uma célula.
[00155] Contrafusão é a fusão de vesículas internas (intraluminais) dentro de corpos multivesiculares ou endossomas tardios com a membrana limitadora do endossoma. Acredita-se que o processo seja mediado por ácido lisobifosfatídico (LBPA), fosfatidilinositol-3-fosfato, Alix e uma dependência aparente de um pH ácido. MHC classe 2 e outras proteínas (CD63 e MPR) utilizam tal processo para transporte eficaz para localizações no citosol e de volta para a membrana plasmática. No entanto, patógenos também exploram esse mecanismo para entrar de forma eficiente no citosol da célula (por exemplo, VSV, antraz). Ao contrário da fusão regular na célula entre endossomas e organelas, a contrafusão requer que os folhetos exoplásmicos das vesículas internas e a membrana externa se fundam - semelhante à fusão espermatozóide e óvulo.
[00156] Em uma modalidade, a vesícula extracelular é um corpo apoptótico. Os corpos apoptóticos, conforme empregue no presente documento, geralmente têm um diâmetro na faixa de 500 a 5.000 nm, tal como 500 a 4.000 nm, e são liberados por células que sofrem morte celular programada. CÉLULAS-TRONCO E MARCADORES
[00157] Em uma modalidade, a vesícula extracelular de acordo com a presente divulgação é de uma célula-tronco.
[00158] Em uma modalidade, as células-tronco são células-tronco embrionárias. Em uma modalidade, as células não são células- tronco embrionárias.
[00159] Em uma, a célula-tronco é uma célula-tronco adulta, por exemplo, incluindo células progenitoras, e células-tronco hemotopoiéticas, células-tronco miogênicas, células-tronco osteoprogenitoras, células-tronco neurais, células-tronco mesenquimais, tais como células satélites, células gliais radiais, células estromais da medula óssea, periósteo, células progenitoras pancreáticas, células progenitoras endoteliais, células blásticas e células-tronco trofoblásticas.
[00160] Em uma modalidade, a célula tronco é uma célula-tronco cancerígena.
[00161] Em uma modalidade, o método refere-se a células-tronco de mamífero, por exemplo, células-tronco humanas. As células- tronco no presente documento são principalmente células-tronco humanas. No entanto, o versado na técnica tem capacidade para identificar a população de células-tronco relevante ou correspondente para outros mamíferos, conforme necessário. Por exemplo, SSEA-1 é um marcador para células-tronco embrionárias murinas, células da linhagem germinativa humana e células de carcinoma embrionário; SSEA-3 é um marcador para células-tronco embrionárias de primatas, células da linhagem germinativa embrionária humana, células-tronco embrionárias humanas e células de carcinoma embrionário; SSEA-4 é um marcador para células-tronco embrionárias de primatas, células germinativas embrionárias humanas, células-tronco humanas, células de carcinoma embrionário; CD324 é um marcador para células-tronco embrionárias humanas e murinas, células cancerígenas embrionárias; CD90 é um marcador para células-tronco embrionárias humanas e murinas, células-tronco hematopoiéticas, células de carcinoma embrionário; CD117 é um marcador para células-tronco embrionárias humanas e murinas, células-tronco progenitoras hematopoiéticas, melanócitos derivados de crista neural, células germinativas primordiais, células de carcinoma embrionário; CD326 é um marcador para células-tronco embrionárias humanas e murinas, células de carcinoma embrionário; CD9 é um marcador para células-tronco embrionárias humanas e murinas; CD24 é um marcador para células tronco embrionárias humanas e murinas; CD29 é um marcador para células-tronco embrionárias humanas e murinas; CD59 é um marcador para células-tronco embrionárias humanas e murinas; CD133 é um marcador para células-tronco embrionárias humanas e murinas, células de carcinoma embrionário, células-tronco hematopoiéticas; CD31 é um marcador para células-tronco embrionárias humanas e murinas; TRA-1-60 é um marcador para células-tronco embrionárias humanas, teracarcinoma, células germinativas embrionárias, células de carcinoma embrionário; TRA-1-81 é um marcador para células-tronco embrionárias humanas, teracarcinoma, células germinativas embrionárias, células de carcinoma embrionário; Frizzled5 é um marcador para células-tronco embrionárias humanas e murinas; fator de células-tronco (SCF) é um marcador para células-tronco humanas e embrionárias, células-tronco hematopoiéticas, células-tronco mesenquimais, células de carcinoma embrionário; e Cripto é um marcador para células-tronco embrionárias humanas e murinas, cardiomiócitos e células de carcinoma embrionário.
[00162] Células-tronco hematopoiéticas (HSCs) ou hemocitoblastos são as células-tronco que dão origem a todas as outras células sanguíneas através do processo de hematopoiese. As mesmas são derivadas de mesoderma e estão localizadas namedula óssea vermelha, que está contida no núcleo da maioria dos ossos.
[00163] Célula-tronco cancerígena, conforme empregue no presente documento, refere-se a células tumorigênicas (isto é, células cancerígenas encontradas dentro de tumores ou cânceres hematológicos) que possuem características associada a células-tronco normais, especificamente, a capacidade de dar origem a todos os tipos de células encontrados em uma amostra de câncer específica. Consultar, por exemplo, Identification and Targeting of Cancer Stem Cells, BioessayS, outubro de 2009; 31 (10) 1.038 a 1.049, incorporado ao presente documento a título de referência. As células-tronco cancerígenas são definidas por três propriedades distintas: i) uma capacidade seletiva para iniciar tumores e impulsionar a proliferação neoplásica: ii) uma capacidade de criar infinitas cópias de si mesmas por meio da autorrenovação e iii) o potencial para dar origem a progênie mais madura do câncer de células-não tronco através da diferenciação. As células- tronco cancerígenas não são necessariamente derivadas de uma célula-tronco saudável, mas podem se originar de uma célula diferenciada.
[00164] CD34 também é conhecido como antígeno de células progenitoras hematopoiéticas CD34, tem uma função como fator de adesão célula-célula. O mesmo pode ser empregue como um marcador para enriquecer populações de células-tronco.
[00165] As células-tronco geralmente são negativas para marcadores de superfície positivos para a linhagem (isto é, Lin -ve), por exemplo, a célula-tronco é Lin -ve, CD34 +ve, CD38 -ve, CD45RA -ve, CD90 positivo e CD49f _+ve.
[00166] As células-tronco hemotopoiéticas podem expressar um marcador de superfície de CD48, CD150, CD244, CD34, CD38, SCA-1, Thy1.1, C-kit, lin, CD135, slam1/CD150, Mac-1 (CD11b), CD4, fator de célula-tronco (SCF) e combinações de dois ou mais dos mesmos.
[00167] As células osteoprogenitoras podem expressar um marcador de superfície selecionado a partir de Gremlin-1, TGF- beta, bFGF, BMP-2, ALPP, MCAM, colágeno I, colágeno 1 alfa 1, colágeno II,
RUNX2, Decorina e combinações de duas ou mais dos mesmos (tais como todos os ditos marcadores).
[00168] Os osteoblastos ou um progenitor dos mesmos podem expressar um marcador de superfície selecionado a partir de Runx2, fosfatase alcalina/ALPP/ALPI, osteocalcina, BAP1, OPN, BAP31, colágeno I, SCUBE3, fibronectina, SPARC, IGFBP- 3 e combinações de dois ou mais dos mesmos.
[00169] O osteócito ou progenitor do mesmo pode expressar um marcador de superfície selecionado a partir de: i) TGF beta, RANKL, MCSF, esclerostina, DKK e combinações de dois ou mais dos mesmos (tais como todos os ditos marcadores) e/ou ii) Osterix +ve, CD90 +ve, osteocalcina +ve, colágeno I +ve, sialoproteína óssea +ve e combinações de dois ou mais dos mesmos (tais como todos os ditos marcadores) e/ou iii) fosfatase alcalina/ALPP (fosfatase alcalina placentária)/ALPI +ve, colágeno I +ve, colágeno II +ve, decorina +ve, MCAM/CD146 +ve, MEPE/OF45 +ve, osterix +ve, CD90 +ve, osterix/Sp7 +ve, RUNX2/CBFA1 +ve, trombopoietina/Tpo +ve e combinações de dois ou mais dos mesmos (tais como todos os ditos marcadores).
[00170] As células-tronco miogênicas podem expressar um marcador selecionado dentre CD56, CD146, VE-caderina, actina do músculo liso alfa, FABP3, integrina alfa 7, desmina, cadeia pesada da miosina, receptor UEA-1 e combinações de dois ou mais dos mesmos (tais como todos os ditos marcadores).
[00171] As células-tronco neurais podem expressar um marcador selecionado a partir de: i) CD133, CD15, CD24 baixo ou -ve, GCTM-2, CD45, CD34, Nestina, Sox-2, ABCG2, FGF R4, Frizzled-9 e combinações de dois ou mais dos mesmos (tais como todos os ditos marcadores), e/ou ii) o marcador CD24 é baixo ou -ve, e/ou iii) uma combinação de marcadores de CD133 +ve, 5E12 +ve, CD34 -ve, CD45 -ve e CD24 baixo ou -ve.
[00172] As células-tronco mesenquimais podem expressar um marcador de superfície selecionado a partir de CD10, CD13, CD73, CD105, CD271, CD140b, CD240, frizzled-9, CD29, CD90, CD146, oct4, SSEA4, STRO-1, fator de células-tronco (SCF) e combinações de dois ou mais dos mesmos.
[00173] Uma célula-tronco derivada de adiposa pode expressar um marcador de superfície selecionado dentre: i) K15, CD34, Nestlina, folistatina, p63, integrina alfa 6, teacina C, EGFR, IGFR, fatores de frizzled e combinações de dois ou mais dos mesmos e/ou i) iCD44, ICAM/CD54, CD34, membros da família integrina e combinações de dois ou mais dos mesmos.
[00174] Uma célula-tronco de uma célula-tronco epitelial ovariana e tubária pode expressar um marcador de superfície selecionado a partir de Gremlin 1, Lrig1, Lgr5, Bmi1, Terc, HopX e combinações de dois ou mais dos mesmos.
[00175] As células-tronco embrionárias podem ter um ou mais marcadores de superfície selecionados dentre CD24, CD29, CD31, CD59, CD90, CD117, CD133, CD324, CD326, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, frizzled5, fator de célula-tronco, crypto (TDGF-1).
[00176] Vesículas extracelulares de células-tronco podem ser identificadas com base nos marcadores da célula a partir da qual foram derivadas.
OUTRAS DEFINIÇÕES
[00177] Carga útil, conforme empregue no presente documento, refere-se a uma molécula que é ligado ao domínio GLA, em particular, para entrega à vesícula. As cargas úteis podem compreender um fármaco, uma toxina, um quimioterápico, um polímero, uma proteína biologicamente ativa, um peptídeo (tal como peptídeo estável), um polinucleotídeo (tal como DNA e RNA, incluindo microRNA, shRNA, RNAi e similares, incluindo sinalizadores moleculares), radionuclídeos, um agente quelante de metal, vírus oncolíticos, vetores virais, identificações e/ou um grupo repórter. Ligado, conforme empregue no presente documento, refere-se a qualquer meio de associar a carga útil ao domínio GLA, incluindo proteína de fusão (por exemplo, empregando uma ligação amida) ou uma conjugação química (por exemplo, química da maleimida, química click ou similares). As cargas úteis também podem ser usadas para se referir ao material entregue no interior da vesícula extracelular, em que o material não está ligado ao componente GLA.
[00178] O domínio GLA é uma plataforma de detecção e entrega exclusiva que toma vantagem da exposição de fosfatidilserina (PS), para alvejar e acessar as células selecionadas. A fosfatidilserina é o principal sinal de reconhecimento e engolfamento de células apoptóticas. A apoptose é uma modalidade de morte celular evolutivamente conservada e fortemente regulada (Poon IK et al., Nat Rev Immunol 14: 166 a 180, 2014). O engolfamento e a ingestão de células apoptóticas são conhecidos como eferocitose, que serve para a remoção imediata e eficaz de células apoptóticas antes da perda da integridade da membrana e da liberação do conteúdo inflamatório e, assim, contrabalança os efeitos inflamatórios prejudiciais da apoptose. A expressão de PS atua para inibir as cascatas de sinalização induzidas por TLR e citocinas e a maturação imunogênica de DC (Poon IK et al., Nat Rev Immunol 14: 166 a 180, 2014, Birge RB Celll Death Differ 23: 962 a 978, 2016). Consequentemente, sob condições fisiológicas, a fosfatidilserina externalizada funciona como um sinal imunossupressor dominante e evolutivamente conservado que promove a tolerância e impede a ativação imune local e sistêmica. Patologicamente, o efeito imunossupressor inato da fosfatidilserina foi dominado por inúmeros vírus, outros micro-organismos e parasitas para facilitar a infecção e, em muitos casos,
estabelecer latência (Birge RB et al., Cell Death Differ 23: 962 a 978, 2016, Amara A e Mercer J, Nat Rev Microbiol 13: 461 a 469, 2015, Moller-Tank, S e Maury W, Virology 468-470: 565 a 580, 2014). A fosfatidilserina é desregulada no microambiente tumoral e antagoniza o desenvolvimento da imunidade tumoral, e os exossomas que expressam fosfatidilserina estão agora sendo explorados como diagnóstico precoce na batalha contra o câncer (Birge RB et al., Cell Death Diff. 23: 962 a 978, 2016, Lea et al., Oncotarget 8: 14.395 a
14.407, 2017, Li X e Wang X, Mol Cancer 16: 92, 2017). Embora não desejem estar limitados pela teoria, os presentes inventores acreditam que nem toda a fosfatidilserina é equivalente a partir de uma perspectiva biológica. Os inventores acreditam que a fosfatidilserina exposta pela enzima TMEM16F está envolvida na supressão imunológica e é aquela "vista" pelas moléculas da presente divulgação.
[00179] Vírus oncolítico, conforme empregue no presente documento, refere-se a um vírus que: • infecta e extermina preferencialmente células cancerígenas, ou • se replica seletivamente nas células cancerígenas (por exemplo, visto que sua replicação depende de um gene que é regulado de modo crescente nas células cancerígenas, tal como p53.
[00180] Vetor viral, conforme empregue no presente documento, refere-se a um vírus deficiente de replicação, geralmente codificando um transgene.
[00181] In vitro, conforme empregue no presente documento, refere-se ao trabalho de laboratório não realizada em um corpo humano ou animal.
[00182] In vivo, conforme empregue no presente documento, refere-se ao trabalho/teste/tratamento em um organismo vivo, em particular, um humano ou animal.
[00183] Molécula, conforme empregue no presente documento, é utilizado no sentido mais amplo e inclui uma molécula química sintética, mas também macromoléculas, tais como proteínas, polímeros (naturais ou de outro modo), moléculas de ácido ribonucleico, identificações, etc.
[00184] Um sinalizador molecular é uma sonda de hibridização de oligonucleotídeos que pode relatar a presença de ácidos nucleicos específicos em soluções homogêneas. Os mesmos são moléculas em formato de grampo com um fluoróforo internamente arrefecido bruscamente cuja fluorescência é restaurada quando se ligam a uma sequência-alvo de ácidos nucleicos.
[00185] Peptídeo grampeado, conforme empregue no presente documento, refere-se a múltiplos peptídeos em tandem, retidos por uma cinta sintética, que se destina a melhorar o desempenho farmacológico dos peptídeos.
[00186] Um fármaco, conforme empregue no presente documento, a menos que o contexto indique de outra forma, destina-se a referir- se a uma pequena entidade química, por exemplo, que tenha sido sintetizada por métodos de química orgânica, em particular, uma molécula aprovada ou licenciada ou no processo de ser licenciada para uso terapêutico, especialmente em seres humanos. O fármaco, conforme empregue no presente documento, inclui um composto antiviral, um antibiótico e uma terapia anticâncer.
[00187] Um composto antiviral (agente antiviral), conforme empregue no presente documento, refere-se à classe de medicamentos usados especificamente para o tratamento de infecções virais, incluindo agentes antivirais de amplo espectro e também espectro "estreito" específicos para um vírus específico ou família de vírus específica.
[00188] Antibiótico, conforme empregue no presente documento, refere-se ao medicamento ou agente que inibe o crescimento de bactérias ou destrói as bactérias. Antibacteriano e antibiótico são usados de modo intercambiável no presente documento, a menos que o contexto indique o contrário.
[00189] Antiparasitário, conforme empregue no presente documento, refere-se a um medicamento ou agente que inibe o crescimento do parasita, destrói o parasita ou remove parasitas do hospedeiro.
[00190] A terapia anticâncer é um termo abrangente que inclui os fármacos anticâncer, quimioterapia, radioterapia, terapias imuno- oncológicas, etc.
[00191] Fármaco anticâncer, conforme empregue no presente documento, refere-se geralmente a uma terapia contra câncer de moléculas pequenas.
[00192] Quimioterapia, conforme no presente documento, refere-se geralmente a um agente citotóxico e inclui antineoplásicos.
[00193] Um terapêutico biológico (também denominado um biofarmacêutica, agente biológica ou biológico) é um produto terapêutico “derivado” de uma fonte biológica, por exemplo, uma proteína recombinante e fragmentos, incluindo moléculas de anticorpos, incluindo anticorpos, fragmentos de ligação a anticorpos e moléculas de anticorpos multiespecíficos, polinucleotídeos, vírus terapêuticos, vírus oncolíticos, vetores virais e combinações complexas de tais materiais. Uma proteína biologicamente ativa é um subgrupo de um terapêutico biológico e inclui proteínas recombinantes e fragmentos ativos das mesmas (incluindo moléculas de anticorpo).
[00194] As moléculas de anticorpo, conforme empregue no presente documento, incluem um anticorpo completo que tem cadeias pesadas e leves de comprimento total ou um fragmento do mesmo e uma molécula que compreende qualquer uma das mesmas, por exemplo, um Fab, Fab modificado, Fab’, Fab’ modificado, F(ab’)2, Fv, Fab-Fv, Fab-dsFv, anticorpos de domínio único (por exemplo, VH ou VL ou VHH), anticorpos scFv, anticorpos bi, tri ou tetravalentes, Bis-scFv, diacorpos, triacorpos, tetracorpos e fragmentos de ligação ao apítopo de qualquer um dos supracitados (consultar,
por exemplo, Holliger e Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1.126 a 1.136; Adair e Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209 a 217). Os métodos para criar e fabricar esses fragmentos de anticorpo são bem conhecidos na técnica (consultar, por exemplo, Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165 a 181). Outros fragmentos de anticorpo para uso na presente invenção incluem os fragmentos Fab e Fab’ descritos nos documentos nº WO2005/003169, WO2005/003170 e WO2005/003171. Os anticorpos multivalentes podem compreender múltiplas especificidades, por exemplo, biespecíficos, ou podem ser monoespecíficos (consultar, por exemplo, os documentos nº WO92/22853 e WO05/113605). As variantes de anticorpos biespecíficos e multiespecíficos são especialmente consideradas nesse exemplo, uma vez que o objetivo é neutralizar duas proteínas-alvo independentes. As regiões variáveis dos anticorpos divulgados no presente documento podem ser configuradas de modo a produzir uma única variante de anticorpo com capacidade para se ligar a dois antígenos-alvo e neutralizá-los.
[00195] O anticorpo e fragmentos de ligação do mesmo, em particular, pequenos fragmentos de anticorpo, tais como anticorpos de domínio, VHHs, Fvs de cadeia simples (scFvs), ds-scFv, dsFv e os intracorpos podem ser entregues intracelularmente com o uso da presente tecnologia.
[00196] Em uma modalidade, a molécula de anticorpo é humana ou humanizada.
[00197] Uma toxina é uma substância venenosa, especialmente derivada de uma fonte natural, em particular, uma proteína. Muitas toxinas, tais como a caliqueamicina, são usadas na terapia contra câncer. Além disso, agentes quimioterapêuticos podem ser considerados tóxicos (ou toxinas). Assim, a definição de toxina se sobrepõe a outras definições no presente documento. No entanto, neurotoxinas como veneno de cobra são toxinas, mas não quimioterápicos. No entanto, aqueles versados na técnica estão familiarizados com essas definições técnicas e têm capacidade para compreender o significado do contexto da presente divulgação.
[00198] Diagnóstico, conforme empregue no presente documento, é o agente usado na análise de imagem ou para diagnosticar ou monitorizar ou compreender um estado de doença. Um diagnóstico geralmente compreenderá uma molécula repórter, tal como uma identificação ou similares, que pode ser visualizada, medida ou monitorada de alguma forma.
[00199] Os radionuclídeos adequados para uso na presente divulgação incluem tálio-201, tecnécio-99m, Iodo-123, Iodo 131, Iodo- 125, flúor-18 e oxigênio-15.
[00200] Célula anormal ou célula patogênica, conforme empregue no presente documento, refere-se a uma célula que tem diferenças em relação a uma célula saudável normal, em particular, mutações ou regulação crescente de um marcador ou marcadores, por exemplo, uma anormalidade ligada a uma predisposição ou desenvolvimento de uma afecção ou doenças; ligada a uma afecção ou doença, tal como célula pré-cancerosa, câncer, célula infectada por patógeno, anemia falciforme ou similares.
[00201] Apoptose, conforme empregue no presente documento, é a via de morte celular que ocorre como parte normal e controlada de um crescimento de organismo. A morte celular por apoptose é menos prejudicial para o tecido circundante do que mecanismos de morte celular, tais como a necrose.
[00202] Necrose, conforme empregue no presente documento, é a morte celular a partir de uma doença ou lesão. A mesma libera citocinas e fatores no tecido circundante que podem danificar as células circundantes. Gangrena é um exemplo de morte celular necrótica.
AGENTES QUIMIOTERAPÊUTICOS
[00203] Agente quimioterapêutico e quimioterapia ou agente citotóxico são empregues de modo intercambiável no presente documento, a menos que o contexto indique o contrário.
[00204] A quimioterapia, conforme empregue no presente documento, se refere a agentes ou fármacos antineoplásicos químicos específicos que são "seletivamente" destrutivos para células e tecidos malignos, por exemplo, agentes alquilantes, antimetabólitos, incluindo inibidores da timidilato sintase, antraciclinas, agentes antimicrotúbulos, incluindo alcaloides vegetais, inibidores de topoisomerase, inibidores de PARP e outros agentes antitumorais. Seletivamente, nesse contexto, é usado livremente, visto que obviamente muitos desses agentes têm efeitos colaterais graves.
[00205] A dose preferencial pode ser escolhida pelo praticante com base na natureza do câncer a ser tratado.
[00206] Exemplos de agentes alquilantes que podem ser empregues no método da presente divulgação incluem um agente alquilante mostardas de nitrogênio, nitrosoureias, tetrazinas, aziridinas, platinas e derivados, e agentes alquilantes não clássicos.
[00207] Exemplo de um agente quimioterapêutico contendo platina (também denominado platinas), tal como cisplatina, carboplatina, oxaliplatina, satraplatina, picoplatina, nedaplatina, triplatina e lipoplatina (uma versão lipossomal da cisplatina), em particular, cisplatina, carboplatina e oxaliplatina.
[00208] A dose para cisplatina varia de cerca de 20 a cerca de 270 mg/m2, dependendo do câncer exato. Frequentemente, a dose está na faixa de 70 a 100 mg/m2.
[00209] Mostardas de nitrogênio incluem mecloretamina, ciclofosfamida, melfalano, clorambucila, ifosfamida e bussulfano.
[00210] Nitrosoureias incluem N-nitroso-N-metilureia (MNU), carmustina (BCNU), lomustina (CCNU) e semustina (MeCCNU), fotemustina e estreptozotocina. Tetrazinas incluem dacarbazina, mitozolomida e temozolomida.
[00211] Aziridinas incluem tiotepa, mitomicina e diaziquona (AZQ).
[00212] Exemplos de antimetabólitos que podem ser empregues no método da presente divulgação incluem anti-folatos (por exemplo, metotrexato e pemetrexede), análogos de purina (por exemplo, tiopurinas, tais como azatiopurina, mercaptopurina, tiopurina, fludarabina (incluindo a forma de fosfato), pentostatina e cladribina, análogos de pirimidina (por exemplo, fluoropirimidinas, tais como 5-fluorouracila e profármacos das mesmas, tais como capecitabina [Xeloda ®]), floxuridina, gencitabina, citarabina, decitabina, cloridrato de raltitrexede (Tomudex), cladribina e 6-azauracila.
[00213] Exemplos de antraciclinas que podem ser empregues no método da presente divulgação incluem daunorrubicina (Daunomicina), daunorrubicina (lipossomal), doxorrubicina (Adriamicina), doxorrubicina (lipossomal), epirrubicina, idarrubicina, valrubicina atualmente usada apenas para tratar câncer de bexiga e mitoxantrona, um análogo de antraciclina, em particular, doxorrubicina.
[00214] Exemplos de agentes antimicrotúbulos que podem ser empregues no método da presente divulgação incluem alcaloides da vinca e taxanos.
[00215] Alcaloides da vinca incluem produtos químicos completamente naturais, por exemplo, vincristina e vimblastina e também alcaloides da vinca semissintéticos, por exemplo, vinorrelbina, vindesin e vinflunina.
[00216] Taxanos incluem paclitaxel, docetaxel, Abraxano, carbazitaxel e derivados dos mesmos. Os derivados de taxanos, conforme empregue no presente documento, incluem reformulações de taxanos como taxol, por exemplo, em formulações micelares, os derivados também incluem derivados químicos em que a química sintética é empregada para modificar um material de partida que é um taxano.
[00217] Inibidores da topoisomerase que podem ser empregues em um método da presente divulgação incluem inibidores de topoisomerase tipo I, inibidores da topoisomerase tipo II e venenos de topoisomerase tipo II. Os inibidores do tipo I incluem topotecano, irinotecano, indotecano e indimitecano. Os inibidores do tipo II incluem genisteína e ICRF 193, que tem a seguinte estrutura:
[00218] Venenos do tipo II incluem ansacrina, etoposídeo, fosfato de etoposídeo, teniposídeo e doxorrubicina e fluoroquinolonas.
[00219] Em uma modalidade, o quimioterapêutico é um inibidor de PARP.
VÍRUS ADEQUADOS PARA USO COMO CARGAS ÚTEIS NA PRESENTE DIVULGAÇÃO
[00220] Em uma modalidade, o vírus empregue na presente divulgação é um vírus com envelope, por exemplo, selecionado a partir de um vírus da herpes (tal como herpes simplex 1), um poxvírus (tal como vírus da vaccinia), um hepadnavírus, um flavivírus, um togavírus, um coronavírus, hepatite D, ortomixovírus, paramixovírus (tal como sarampo ou vírus da doença de Newcastle), rabdovírus, buniavírus, filovírus e Rhabdoviridae (tal como o vírus da estomatite vesicular Indiana (VSV)).
[00221] Em uma modalidade, o vírus empregue na presente divulgação é um vírus sem envelope, por exemplo, selecionado a partir de adenoviridae (tal como um adenovírus), papilomaviridae, picornaviridae (tal como o vírus coxsackie ou o vírus do vale do Seneca (por exemplo, senecavírus)), reovírus.
[00222] Em uma modalidade, o vírus é um adenovírus, por exemplo, um adenovírus humano, tal como selecionado a partir de um vírus do grupo B (em particular Ad3, Ad7, Ad11, Ad14, Ad16, Ad21, Ad34, Ad35, Ad51 ou uma quimera dos mesmos, como Enadenotucirev), um vírus do grupo C (em particular Ad1, 2, 5, 6 ou uma quimera dos mesmos), um vírus do grupo D (em particular Ad8, Ad10, Ad13, Ad15, Ad17, Ad19, Ad20, Ad22, Ad30, Ad32, Ad33, Ad36, Ad37, Ad38, Ad39, Ad42, Ad43, Ad44, Ad45, A46, Ad47, Ad48, Ad49, Ad50 ou uma quimera dos mesmos), um vírus do grupo E (em particular, Ad4),
um vírus do grupo F (em particular, Ad40, Ad41 ou uma quimera dos mesmos) e uma quimera de dois ou mais dos vírus do grupo B, C, D, E ou F.
[00223] A grande maioria dos vírus têm proteínas associadas ao reconhecimento da célula-alvo e absorção bem descritas. A modificação de seu tropismo para redirecionar ou possibilitar um alvejamento tumoral mais seletivo em vírus oncolíticos pode ser introduzida com o uso dos métodos descritos na revisão. em Verheije e Rottier, Adv. Virology 2012: 798526,
2012.
[00224] As proteínas da superfície celular viral adicionais não envolvidas no alvejamento viral nativo podem ter motivos de alvejamento modificados geneticamente nelas (por exemplo, Ad virion minor coat protein IX Salisch et al., PLoS One 12: e0174728, 2017).
[00225] Os vírus com envelope têm uma membrana exterior (envelope), que cobre o capsídeo do vírus. O envelope é tipicamente derivado das porções das membranas das células hospedeiras (fosfolipídios e proteínas), mas também inclui algumas proteínas virais. As glicoproteínas na superfície do envelope servem para identificar e se ligar aos sítios receptores na membrana do hospedeiro. O envelope viral, então, funde-se com a membrana do hospedeiro, permitindo que o capsídeo e o genoma viral entrem e infectem o hospedeiro.
[00226] Vários vírus oncolíticos são divulgados no documento nº WO2014/13834, incorporado ao presente documento a título de referência.
[00227] O vírus herpes simplex (HSV) entra nas células por meio de quatro glicoproteínas essenciais - gD, gH/gL, gB, ativadas de um modo em cascata por gD que se liga a um dos seus receptores, nectina- 1 e HVEM. O redirecionamento do HSV foi alcançado pela inserção de ligantes e scFvs na proteína gC e/ou gD ou gH (Campadelli-Fiume, G et al., Rev.em Med Virol 21: 213 a 226, 2011, Gatta, V PLoS Pathog 11: e1004907, 2015). Os vetores do vírus oncolítico da herpes simplex tipo 1 foram desenvolvidos para uso clínico. Esses vírus são competentes para replicação e têm mutações nos genes que afetam a replicação viral, neuropatogenicidade e evasão imunológica e, por exemplo, incluem vírus de primeira geração, tais como NV1020 (R7020), dlsptk, d18.36tk, hrR3, R3616, 1716, vírus de segunda geração, tais como G207 (MGH-1), 3616UB, SUP, NV1023, vírus de terceira geração, tais como G47Δ, vetores de expressão transcricionais, tais como G92A, d12.CALP, Myb34.5, vetores de expressão de transgene, tais como rRP450 e outros vírus, tais como Talimogene laherparepvec (T-Vec). Acredita-se que os vetores de HSV-1 sejam úteis no tratamento de uma ampla variedade de tumores sólidos, por exemplo, incluindo glioma, melanoma, cânceres de mama, próstata, cólon, ovário e pâncreas. O vírus HSV-1 infecta uma ampla faixa de tipos e espécies de células, é citolítico por natureza, o ciclo de vida replicativo do vírus resulta na destruição da célula hospedeira, tem um genoma bem caracterizado e grande (152K), mas contém muitos genes não essenciais que fornecem até 30K de espaço para a inserção de genes terapêuticos. Geralmente, os vírus HSV não são mutados no gene da timidina quinase por questões de segurança. O Talimogene laherparepvec é um vírus da herpes oncolítico que é aprovado para uso no tratamento de melanoma. Outros vírus de herpes-base incluem G207, SEPREHVIR (HSV-1716), da Virttu Biologics, mutante HSV-1 R3616, mutante HSV-1 1716, NV1020 (R7020), mutante R3616 (RL1 deletado), mutante KM100 tem inserções no UL48 (codifica a proteína do tegumento transativador pUL48 [VP16]) e os genes RL2, G92A, mutantes, Myb34.5 e rQNestin34.5.
[00228] Poxvírus - Vírus vaccinia, tal como Vaccinia Ancara modificado (MVA), pode ser empregue (Galmiche MC et ai, J Gen Virol 78: 3.019 a 3.027., 1997), o MVA pode ser substituído por uma molécula de fusão p14 de transporta um scFv inserido direcionado contra o antígeno associado ao tumor MUC-1 (Paul, S et al., Viral Immunol 20: 664 a 671, 2007). Consultar também a revisão em Liang L et ai., Viruses 6: 3.787 a 3.808, 2014, Hsiao JC et al., J. Virol 73: 8.750 a 8.761, 1999, a revisão em Chen TL e Roffler S, Med Res. Rev. 28: 885 a 928, 2008 e Kinoshita T et al., J. Biochem 144: 287 a 294, 2008.
JX-594, da Jennerex, vírus vaccinia deletado por timidina-quinase mais GM- CSF. GL-ONC1 é um vírus vaccinia atenuado (cepa Lister), que provoca regressão de eliminação e uma ampla gama de tumores sólidos em modelos de camundongo pré-clínicos.
[00229] Paramixovírus (tal como sarampo ou vírus da doença de Newcastle).
[00230] O vírus do sarampo (MeV) é um vírus RNA de fita simples, de sentido negativo envelopado (não segmentado) do gênero Morbillivirus, dentro da família Paramyxoviridae. O vírus do sarampo tem duas glicoproteínas com envelope: a proteína de fixação a hemaglutina (H) e a proteína de fusão (F). A fixação, a entrada e a subsequente fusão célula-célula são mediadas por meio de 2 receptores de sarampo, CD46 e a molécula de ativação de linfócitos sinalizadores (SLAM). Consultar, por exemplo, a revisão em Msaouel P et al., Methods Mol Biol 797: 141 a 162, 2012, Robinson S. e Galanis, E. Expert Opin Biol Ther. 17: 353 a 363, 2017, Aref S et al., Viruses 8. Pii: E294, 2016); (a revisão em Chen TL e Roffler S, Med Res. Rev. 28: 885 a 928, 2008 e Kinoshita T et al., J Biochem 144: 287 a 294, 2008) e (Russell SJ e Peng KW, Curr Topic Microbiol. Immunol 330: 213 a 241, 2009, Robinson S e Galanis, E Expert Opin Biol. Ther 17: 353 a 363, 2017, Aref S et al., Viruses 8. Pii: E294, 2016). O vírus do sarampo que codifica o simulador de iodeto de sódio tireoidiano humano ou MV-NIS é uma cepa oncolítica atenuada de Edmonston (Ed) do vírus do sarampo. O imageamento radioativo de iodo fornece uma técnica inovadora para o monitoramento da expressão do gene NIS.
[00231] O vírus da doença de Newcastle também pode ser empregue.
[00232] Adenoviridae Os adenovírus estão entre os vírus estudados mais extensivamente que são utilizados como agentes oncolíticos. Um arranjo de peptídeos e proteínas foi manipulado geneticamente em proteínas virais associadas ao virion para alterar o tropismo nativo do vírus (revisão em Verheije MH e Rottier PJM Adv Virol 2012: 798526, 2012). No entanto, tudo isso depende da montagem viral no núcleo, que apresenta desafios significativos.
[00233] Outros vírus sem envelope incluem coxsackievírus, poliovírus e reovírus. Consultar, por exemplo, revisão em Altan- Bonnet, N, Curr Opin Microbiol 32: 77 a 81, 2016 e Chen YH et al., Cell 160: 619 a 630, 2015, revisão em Chen TL e Roffler S, Med Res. Rev. 28: 885 a 928, 2008 e Kinoshita T et al., J. Biochem 144: 287 a 294, 2008 e revisão em Verheije MH e Rottier PJM Adv Virol 2012: 798526, 2012).
[00234] Existem numerosos adenovírus, por exemplo, Ad5-YCD/mutTKSR39rep-hIL12, tal como foi iniciado o tratamento de câncer da próstata, CGTG-102 (Ad5/3-D24-GMCSF), da Oncos Therapeutics, por exemplo, para o tratamento de sarcomas de tecidos moles, Oncorine (H101), CG0070, Enadenotucirev (EnAd) WO2005/118825, OvAd1 e OvAd2 divulgados no documento nº WO2008/080003, ONCOS-102, por exemplo, para mesotelioma pleural maligno não ressecável, e DNX-2401 , por exemplo, para glioma.
[00235] Cavatak é o nome comercial para uma preparação de coxsackievírus A21 do tipo selvagem, útil no tratamento de melanoma maligno. O vírus do vale do Seneca (NTX-010) e (SVV-001), por exemplo, para câncer de pulmão de células pequenas e neuroblastoma.
[00236] Reovírus- Reolysin® (pelareorep; reovírus de tipo selvagem; serotipo 3 Dearing; Oncolytics Biotech), por exemplo, para o tratamento de vários cânceres e distúrbios celulares proliferativos.
[00237] Vírus da Estomatite Vesicular (VSV) VSV é um outro vírus envelopado que é explorado como um agente oncolítico. Consultar, por exemplo, Betancourt D et al., J Virol 89: 11.786 a 11.800, 2015) e revisão em Hastie E e Grdzelishvili VZ J. Gen Virol 93: 2.529 a 2.545, 2012).
PROTEÍNAS CODIFICADAS POR UM VÍRUS
[00238] Em uma modalidade, um vírus ou vetor empregado no método da presente divulgação compreende um transgene, por exemplo, em que o transgene deve substituir o material genético defeituoso na célula para fornecer uma função nova ou aumentada na célula, sensibilizar a célula para o tratamento, bloquear uma função na célula ou expressar uma proteína ou peptídeo terapêutico. Em uma modalidade, o vírus empregado como a carga útil de acordo com as presentes divulgações compreende um transgene ou transgenes, por exemplo, que codificam um agente selecionado independentemente a partir de uma sequência de RNAi, uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo (por exemplo, uma molécula de anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo, uma quimiocina, uma citocina, um imunomodulador, uma etiqueta fluorescente ou uma enzima).
[00239] Isso inclui, porém sem limitação, formatos exclusivos que mostraram promessa pré-clínica, mas carecem de meios eficazes e econômicos para a entrega, por exemplo, peptídeos, intracorpos e arcabouços alternativos (revisão em Boldicke T, Protein Sci 26: 925 a 945, 2017, Marschall e Dubel, Comput Struct Biotechnol J 14: 304 a 308, 2016, Miersch e Sidhu F1000Res 5.pii.F1000 Faculty Rev. 1947, 2016, Peptides, Tsomaia Eur J Med Chem 94:459 a 470, 2015, Marschall ALJ et al, Mabs 7: 1.010 a 1.035, 2015, AlDeghaither D et al., J Clin Pharmacol. 55: S4–S20, 2015))) e inclui agentes com efeitos terapêuticos nas células tumorais, células-tronco tumorais, endotélio associado ao tumor e estroma associado ao tumor. São de interesse especial moléculas que podem servir a múltiplas funções, por exemplo, terapêutica, biomarcadores e/ou diagnóstico. O gene timidina quinase do vírus herpes simplex (HSV-TK) é uma enzima de conversão de profármaco bem estabelecida com um profármaco clinicamente aprovado (ganciclovir-GCV), consultar, por exemplo, Holder et al., Cancer Res. 53: 3.475 a 3.485, 1993, Touraine RL et al., Gene Therapy 5: 1.705 a 1.711, 1998).
[00240] Além disso, a expressão da proteína timidina quinase também pode ser explorada para a imagem e rastreio da atividade da viroterapia durante o curso do tratamento. A tomografia por emissão de pósitrons e a tomografia computadorizada por emissão de fóton único são, ambas,
métodos rotineiramente usados para a detecção e o monitoramento de câncer e terapias contra o câncer e são, ambas, meios viáveis para detectar a expressão da proteína timidina quinase quando um substrato de timidina quinase adequado é administrado (Wang JQ et al., Bioorg Med Chem 13: 549 a 556, 2005, Tjuvajev JG et al., J. Nucl Med 43: 1.072 a 1.083, 2002). Alternativamente, o gene NIS pode ser usado e tem sido explorado como um agente para fins diagnósticos e terapêuticos em vírus oncolíticos, assim como TK (Miller A e Russell S Expert Opin Biol Ther 16: 15 a 32, 2016, Ravera S et al., Annu Rev Physiol 79: 261 a 289, 2017, Portulano et al., Endocr Rev. 35: 106 a 149, 2014).
[00241] Em uma modalidade, os anticorpos que interagem e inibem o RAS ou proteínas na via de sinalização de RAS são codificados no vírus da presente divulgação, por exemplo, como uma proteína de fusão com o componente GLA. Os genes RAS constituem uma família multigênica que inclui HRAS, NRAS e KRAS. Consultar, por exemplo, Bos JL, Cancer Res. 49: 4.682 a 4.689, 1989; e Cetin M et al., J Mol Biol . 429: 562 a 573, 2017.
IDENTIFICAÇÕES
[00242] Em uma modalidade, a carga útil compreende uma identificação fluorescente, uma identificação quimioluminescente, uma radioidentificação, uma enzima, um corante ou um ligante.
[00243] Uma identificação de acordo com a presente divulgação é definida como qualquer porção química que possa ser detectada com o uso de um ensaio. Exemplos não limitativos de moléculas repórteres incluem enzimas, radioidentificações, haptenos, identificações fluorescentes, moléculas fosforescentes, moléculas quimioluminescentes, cromóforos, moléculas de fotoafinidade, partículas coloridas ou ligantes, tais como biotina. A identificação, conforme empregue no presente documento, inclui etiquetas, por exemplo, etiquetas His, etiquetas Flag e similares. As identificações incluem biotina, que é o substrato para avidina.
[00244] As identificações podem ser ligadas aos componentes GLA por conjugação ou fusão. A identificação é a única carga útil ou em adição a outra entidade, como uma carga útil terapêutica.
[00245] Conjugados de identificação são adequados para utilização como agentes de diagnóstico. Os agentes de diagnóstico geralmente se enquadram em duas classes, aqueles para uso em diagnósticos in vitro e aqueles para uso em protocolos de diagnóstico in vivo, geralmente conhecidos como “imageamento direcionado". Muitos agentes de imageamento apropriados são conhecidos na técnica, assim como os métodos para sua fixação a peptídeos e polipeptídeos (consultar, por exemplo, as patentes US nº
5.021.236, 4.938.948 e 4.472.509). As porções químicas de imageamento podem ser íons paramagnéticos, isótopos radioativos, fluorocromos, substâncias detectáveis por RMN e agentes de imagem de raios X.
[00246] No caso de íons paramagnéticos, pode-se mencionar, a título de exemplo, íons, tais como o cromo (III), manganês (II), ferro (III), ferro (II), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), neodímio (III), samário (III), itérbio (III), gadolínio (III), vanádio (II), térbio (III), disprósio (III), hólmio (III) e/ou érbio (III), sendo que o gadolínio é particularmente preferencial. Os íons úteis em outros contextos, tais como imageamento por raios x, incluem, porém sem limitação, lantânio (III), ouro (III), chumbo (II) e, especialmente, bismuto (III).
[00247] No caso de isótopos radioativos para aplicação terapêutica e/ou diagnóstico, pode-se mencionar astatine211, 14carbono, 51cromo, 36cloro, 57cobalto, 58cobalto, cobre67, 152Eu, gálio67, 3hidrogênio, iodo123, iodo125, iodo131, índio111, 59ferro, 32fósforo, rênio186, rênio188, 75selênio, 35enxofre, tecnécio99m e/ou ítrio90. 125I é adequado para uso em certas modalidades, e o tecnécio99m e/ou índio111 são particularmente adequados devido a sua baixa energia e adequação para detecção de longo alcance. Os peptídeos e polipeptídeos identificados radioativamente podem ser produzidos de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, peptídeos e polipeptídeos podem ser iodados por contato com iodeto de sódio e/ou potássio e um agente oxidante químico, tal como hipoclorito de sódio, ou um agente oxidante enzimático, tal como lactoperoxidase. Os peptídeos podem ser identificados com tecnécio99m por processo de troca de ligantes, por exemplo, reduzindo-se o pertecnato com solução estanosa, quelando-se o tecnécio reduzido em uma coluna Sephadex e aplicando-se o peptídeo a essa coluna. Alternativamente, podem ser usadas técnicas de identificação direta, por exemplo, incubando-se o pertecnato, um agente redutor, tal como SNCl 2, uma solução tampão, tal como solução de ftalato de sódio-potássio, e o peptídeo. Grupos funcionais intermediários que são frequentemente usados para ligar radioisótopos que existem como íons metálicos ao peptídeo são o ácido dietilenotriaminopenta-acético (DTPA) ou o ácido etileno diaminotetracético (EDTA).
[00248] Identificações fluorescentes adequadas para uso como cargas úteis incluem Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, Azul em cascata, Cy3, Cy5,6-FAM, Isotiocianato de Fluoresceína, HEX, 6-JOE, Verde Oregon 488, Verde Oregon 500, Verde Oregon 514, Azul Pacífico, REG, Verde de Rodamina, Vermelho de Rodamina, Renografina, ROX, TAMRA, TET, Tetrametilrodamina e/ou Vermelho Texas.
[00249] Um outro tipo de carga útil é o adequado para uso in vitro, é o local em que um peptídeo está ligado a um ligante de ligação secundária e/ou a uma enzima (uma etiqueta enzimática) que gerará um produto colorido mediante o contato com um substrato cromogênico. Exemplos de enzimas adequadas incluem urease, fosfatase alcalina, hidrogênio peroxidase (rábano silvestre) ou glicose oxidase. Os ligantes de ligação secundária adequados são biotina e avidina e compostos de estreptavidina. O uso de tais identificações é bem conhecido por aqueles versados na técnica e é descrito, por exemplo, nas Patentes US nº 3.817.837, 3.850.752, 3.939.350, 3.996.345,
4.277.437, 4.275.149 e 4.366.241.
[00250] Outros métodos são conhecidos na técnica para a fixação para ligação de um peptídeo ao seu “parceiro conjugado”. Alguns métodos de fixação envolvem o uso de um complexo de quelato de metal que emprega, por exemplo, um agente quelante orgânico, tal como um ácido dietilenotriaminopentacético anidro (DTPA); ácido etilenotriaminotetra-acético; N-cloro-p-toluenossulfonamida; e/ou tetracloro-3-6-difenilglicouril-3 fixado ao anticorpo (Patentes U.S. n º 4.472.509 e 4.938.948). Os peptídeos ou polipeptídeos também podem reagir com uma enzima na presença de um agente de acoplamento, tal como glutaraldeído ou periodato. Os conjugados com marcadores de fluoresceína são preparados na presença desses agentes de acoplamento ou por reação com um isotiocianato.
[00251] Em uma modalidade, a identificação tem capacidade para manchar ou identificar o núcleo de uma célula-tronco.
TERAPIA COMBINADA
[00252] Em uma modalidade, uma combinação de agentes quimioterapêuticos empregue é, por exemplo, uma platina e 5-FU ou um profármaco dos mesmos, por exemplo, cisplatina ou oxaplatina e capecitabina ou a gencitabina, tal como FOLFOX.
[00253] Em uma modalidade, a quimioterapia compreende uma combinação de agentes de quimioterapia, em particular, agentes quimioterapêuticos citotóxicos.
[00254] Em uma modalidade, a combinação de quimioterapias compreende uma platina, tal como cisplatina, e fluorouracila ou capecitabina.
[00255] Em uma modalidade, a combinação de quimioterapias em capecitabina e oxaliplatina (Xelox).
[00256] Em uma modalidade, a quimioterapia é uma combinação de ácido folínico e 5-FU, opcionalmente em combinação com oxaliplatina.
[00257] Em uma modalidade, a quimioterapia é uma combinação de ácido folínico, 5-FU e irinotecano (FOLFIRI), opcionalmente em combinação com oxaliplatina (FOLFIRINOX). O regime consiste em: irinotecano
(180 mg/m² IV durante 90 minutos) simultaneamente com ácido folínico (400 mg/m² [ou 2 x 250 mg/m²] IV durante 120 minutos); seguido de fluorouracila (bolus IV de 400 a 500 mg/m²), então, fluorouracila (infusão intravenosa de 2.400 a 3.000 mg/m² durante 46 horas). Esse ciclo geralmente é repetido a cada duas semanas. As dosagens mostradas acima podem variar de ciclo para ciclo.
[00258] Em uma modalidade, a combinação de quimioterapias emprega um inibidor de microtúbulos, por exemplo, sulfato de vincristina, epotilona A, N-[2-[(4-Hidroxifenil)amino]-3-piridinil]-4- metoxibenzenossulfonamida (ABT-751), um agente quimioterapêutico derivado de taxol, por exemplo, paclitaxel, abraxano ou docetaxel, ou uma combinação dos mesmos.
[00259] Em uma modalidade, a combinação de quimioterapias emprega um inibidor de mTor. Exemplos de inibidores de mTor incluem: everolimus (RAD001), WYE-354, KU-0063794, papamicina (Sirolimus), Temsirolimus, Deforolimus (MK-8669), AZD8055 e BEZ235 (NVP-BEZ235).
[00260] Em uma modalidade, a terapia de combinação emprega um inibidor de MEK. Exemplos de inibidores de MEK incluem: AS703026, CI-1040 (PD184352), AZD6244 (Selumetinibe), PD318088, PD0325901, AZD8330, PD98059, U0126-EtOH, BIX 02189 ou BIX 02188.
[00261] Em uma modalidade, a combinação de quimioterapias emprega um inibidor de AKT. Exemplos de inibidores de AKT incluem: MK-2206 e AT7867.
[00262] Em uma modalidade, a combinação emprega um inibidor de aurora quinase. Exemplos de inibidores da aurora quinase incluem: Inibidor I de Aurora A, VX-680, AZD1152-HQPA (Barasertibe), Mesilato de SNS-314, PHA-680632, ZM-447439, CCT129202 e Hesperadina.
[00263] Em uma modalidade, a terapia de combinação emprega um inibidor de p38, por exemplo, como divulgado no documento nº WO2010/038086, tal como N-[4-({4-[3-(3-terc-butil-1-p-tolil-1H-pirazol-5- il)ureido]naftalen-1-iloxi}metil)piridin-2-il]-2-metoxiacetamida.
[00264] Em uma modalidade, a combinação emprega um inibidor de Bcl-2. Exemplos de inibidores de Bcl-2 incluem: mesilato de obatoclax, ABT-737, ABT-263 (navitoclax) e TW-37.
[00265] Em uma modalidade, a combinação de quimioterapias compreende um antimetabólito, tal como capecitabina (xeloda), fosfato de fludarabina, fludarabina (fludara), decitabina, raltitrexede (tomudex), cloridrato de gencitabina e cladribina.
[00266] Em uma modalidade, a terapia de combinação compreende ganciclovir que pode auxiliar no controle das respostas imunológicas e/ou da vascularização do tumor.
[00267] Em uma modalidade, a quimioterapia inclui um inibidor de PARP.
[00268] Em uma modalidade, a terapia de combinação inclui um inibidor do metabolismo do câncer com inibição específica da atividade da enzima DHODH.
[00269] Em uma modalidade, uma ou mais terapias empregadas no método no presente documento são metronômicas, isto é, um tratamento contínuo ou frequente com baixas doses de fármacos anticancerosos, frequentemente administrados concomitantemente com outros métodos de terapia.
[00270] Em uma modalidade, é fornecido o uso de múltiplos ciclos de tratamento (tais como quimioterapia), por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8.
[00271] Em uma modalidade, a quimioterapia é empregada em um ciclo de 28 dias.
[00272] Os componentes GLA da presente divulgação podem ser adaptados para tratar uma ou mais das seguintes infecções tendo como alvo vesículas extracelulares derivadas de células infectadas: infecções por Acinetobacter (Acinetobacter baumannii), Actinomicose (Actinomyces israelii, Actinomyces gerencseriae e Propionibacterium propionicus), doença do sono africano, também conhecida como tripanossomíase africana (Trypanosoma brucei), síndrome da imunodeficiência adquirida por AIDS (HIV (vírus da imunodeficiência humana)), amebíase (Entamoeba histolytica), Anaplasmose (espécie Anaplasma), angiostrongilíase (Angiostrongylus), anisaquiase (Anisakis), antraz (Bacillus anthracis), infecção por Arcanobacterium haemolyticum (Arcanobacterium haemolyticum), febre hemorrágica argentina (vírus Junin), ascaridíase (Ascaris lumbricoides), aspergilose (espécie Aspergillus), infecção por Astrovírus (família Astroviridae), Babesiose (espécie Babesia), infecção por Bacillus cereus (Bacillus cereus), pneumonia bacteriana (múltiplas bactérias), vaginose bacteriana (microbiota da vaginose bacteriana), infecção por Bacteroides (Bacteroides), Balantidíase (Balantidium coli), Bartonelose (Bartonella), infecção por Baylisascaris (Baylisascaris), infecção por vírus BK (vírus BK), piedra preta (Piedraia hortae), Blastocistose (Blastocystis), Blastomicose (Blastomyces dermatitidis), febre hemorrágica boliviana (vírus Machupo), botulismo e botulismo infantil (Clostridium botulinum; Nota: Botulismo não é uma infecção por Clostridium botulinum, mas causada pela ingestão de toxina botulínica), febre hemorrágica brasileira (vírus Sabiá), Brucelose (Brucella), peste bubônica (Enterobacteriaceae), infecção por Burkholderia (Burkholderia), úlcera de Buruli (Mycobacterium ulcerans), infecção por calcivírus (Caliciviridae (Norovírus e Sapovírus)), Campilobacteriose (Campylobacter), candidíase, também conhecida como tordo (Candida), capilariose (doença intestinal por Capillaria philippinensis, doença hepática por Capillaria hepatica e doença pulmonar por Capillaria aerophila), doença de Carrion (Bartonella bacilliformis), doença da arranhadura do gato (Bartonella henselae), celulite (normalmente Streptococcus e Staphylococcus do grupo A), doença de Chagas, também conhecida como tripanossomíase americana (Trypanosoma cruzi), chancroide (Haemophilus ducreyi), varicela (vírus Varicella zoster), Chikungunya (Alfavírus), clamídia (Chlamydia trachomatis), infecção por Chlamydophila pneumoniae, também conhecida como TWAR (Chlamydophila pneumoniae), cólera (Vibrio cholerae), cromoblastomicose (Fonsecaea pedrosoi), quitridiomicose (Batrachochytrium dendrabatidis), clonorquíase (Clonorchis sinensis), colite por Clostridium difficile (Clostridium difficile), Coccidioidomicose (Coccidioides immitis e Coccidioides posadasii), febre do carrapato do Colorado (vírus da febre do carrapato do Colorado), resfriado comum/rinofaringite viral aguda/coriza aguda (normalmente rinovírus e coronavírus), febre hemorrágica da Crimeia-Congo (vírus da febre hemorrágica da Crimeia-Congo), criptococose (Cryptococcus neoformans), criptosporidiose (Cryptosporidium), larva migrans cutânea (normalmente Ancylostoma braziliense e múltiplos outros parasitas), ciclosporíase (Cyclospora cayetanensis), cisticercose (Taenia solium), infecção por citomegalovírus (Cytomegalovirus), dengue (vírus da Dengue, tais como DEN-1, DEN-2, DEN-3 e DEN-4), dientamoebíase (Dientamoeba fragilis), difteria (Corynebacterium diphtheriae), difilobotríase (Diphyllobothrium), dracunculíase (Dracunculus medinensis), febre hemorrágica do ebola (vírus Ebola), equinococose (Echinococcus), Erliquiose (Ehrlichia), Enterobacteriaceae (Enterobacteriaceae resistente a carbapenem), enterobíase (Enterobius vermicularis), infecção por Enterococcus (Enterococcus), Enterovírus (Enterovirus), tifo epidêmica (Rickettsia prowazekii), eritema infeccioso (Parvovírus B19), roséola (vírus da herpes humano 6 (HHV- 6) e vírus da herpes humano 7 (HHV-7)), fasciolíase (Fasciola hepatica e Fasciola gigantica), fasciolopsíase (Fasciolopsis buski), filariose (Filarioidea), intoxicação alimentar por Clostridium perfringens (Clostridium perfringens), infecção amebiana de vida livre (vários patógenos), infecção por Fusobacterium (Fusobacterium), gangrena gasosa (normalmente Clostridium, tal como perfringens), geotricose (Geotrichum candidum), giardíase (Giardia lamblia), mormo (Burkholderia mallei), gnatostomíase (Gnathostoma spinigerum e Gnathostoma hispidum), gonorreia (Neisseria gonorrhoeae), granuloma inguinal (Klebsiella granulomatis), infecção estreptocócica do grupo A (Streptococcus pyogenes), infecção estreptocócica do grupo B (Streptococcus agalactiae), infecção por Haemophilus influenzae (Haemophilus influenzae), doença da mão, pé e boca (Enterovírus, principalmente vírus Coxsackie A e Enterovírus 71
(EV71)), síndrome pulmonar por hantavírus (vírus Sin Nombre), doença do vírus Heartland (vírus Heartland), infecção por Helicobacter pylori (Helicobacter pylori), síndrome hemolítico-urêmica (Escherichia coli, tai como O157:H7, O111 e O104:H4), febre hemorrágica com síndrome renal (família Bunyaviridae), hepatite A (vírus da hepatite A), hepatite B (vírus da hepatite B), hepatite C (vírus da hepatite C), hepatite D (vírus da hepatite D), hepatite E (vírus da hepatite E), Herpes simplex (vírus Herpes simplex 1 e 2 (HSV-1 e HSV-2)), histoplasmose (Histoplasma capsulatum), infecção por ancilostomíase (Ancylostoma duodenale e Necator americanus), infecção por bocavírus humano (bocavírus humano), erliquiose ewingii humana (Ehrlichia ewingii), anaplasmose granulocítica humana (Anaplasma phagocytophilum), infecção por metapneumovírus humano (metapneumovírus humano), erliquiose monocítica humana (Ehrlichia chaffeensis), infecção por papilomavírus humano (papilomavírus humano), infecção por vírus parainfluenza humano (vírus parainfluenza humano), himenolepíase (Hymenolepis nana e Hymenolepis diminuta), mononucleose infecciosa por vírus Epstein–Barr (vírus Epstein–Barr), Influenza (Orthomyxoviridae), Isosporíase (Isospora belli), doença de Kawasaki, ceratite (vários patógenos), infecção por Kingella kingae (Kingella kingae), febre de Lassa (vírus Lassa), legionelose, também conhecida como doença dos legionários (Legionella pneumophila), legionelose, também conhecida como febre de Pontiac (Legionella pneumophila), leishmaniose (Leishmania), Lepra (Mycobacterium leprae e Mycobacterium lepromatosis), leptospirose (Leptospira), listeriose (Listeria monocytogenes), doença de Lyme (Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii e Borrelia afzelii), filariose linfática (Wuchereria bancrofti e Brugia malayi), coriomeningite linfocítica (vírus da coriomeningite linfocítica), malária (Plasmodium), febre hemorrágica de Marburg (vírus Marburg), sarampo (vírus do sarampo), síndrome respiratória do oriente médio (coronavírus da síndrome respiratória do oriente médio), Melioidose (Burkholderia pseudomallei), meningite (várias), doença meningocócica (Neisseria meningitidis), metagonimíase (normalmente Metagonimus yokagawai), microsporidiose (Microsporidia phylum), molusco contagioso (vírus do molusco contagioso), varíola dos macacos (vírus Monkeypox), caxumba (vírus da caxumba), tifo murino (Rickettsia typhi), pneumonia por micoplasma (Mycoplasma pneumoniae), micetoma (Actinomycetoma) e fungos Eumycetoma, miíase (larvas das moscas dípteras parasitas), conjuntivite neonatal (mais comumente Chlamydia trachomatis e Neisseria gonorrhoeae), infecção por norovírus (Norovírus), nocardiose (Nocardia, tal como N. asteroides), oncocercose (Onchocerca volvulus), opistorquíase (Opisthorchis viverrini e Opisthorchis felineus), paracoccidioidomicose (Paracoccidioides brasiliensis), paragonimíase (Paragonimus, tal como westermani), pasteurelose (Pasteurella), doença inflamatória pélvica (vários patógenos), coqueluche (Bordetella pertussis), peste (Yersinia pestis), infecção por pneumocócica (Streptococcus pneumoniae), pneumonia por Pneumocystis (Pneumocystis jirovecii), pneumonia (vários patógenos), poliomielite (Poliovírus), infecção por Prevotella (Prevotella), meningoencefalite amebiana primária (normalmente Naegleria fowleri), leucoencefalopatia multifocal progressiva (vírus JC), psittacose (Chlamydophila psittaci), febre Q (Coxiella burnetii), raiva (vírus Rabies), febre relapsa (Borrelia, tal como B. hermsii e B. recurrentis), infecção por vírus sincicial respiratório (vírus sincicial respiratório), rinosporidiose (Rhinosporidium seeberi), infecção por rinovírus (Rhinovirus), infecção rickettsial (espécie Rickettsia), varicela por rickettsia (Rickettsia akari), febre do vale do rift (vírus da febre do vale do rift), febre maculosa das montanhas rochosas (Rickettsia rickettsii), infecção por rotavírus (Rotavírus), rubéola (Rubella virus), salmonelose (Salmonella), síndrome respiratória aguda grave (coronavírus SARS), esquistossomose (Schistosoma), sepse (vários patógenos), shigelose (Shigella), cobreiro (vírus Varicella zoster), varíola (Variola major ou Variola minor), esporotricose (Sporothrix schenckii), intoxicação alimentar por estafilococos (Staphylococcus), infecção estafilocócica (Staphylococcus), estrongiloidíase (Strongyloides stercoralis), panencefalite esclerosante subaguda (vírus do sarampo), sífilis (Treponema pallidum), teníase (Taenia), tétano (Clostridium tetani), tinea da barba (normalmente Trichophyton), tinea do couro cabeludo (Trichophyton tonsurans), tinea corporal (normalmente Trichophyton), coceira de jóquei (normalmente Epidermophyton floccosum, Trichophyton rubrum e Trichophyton mentagrophytes), tinea das mãos (Trichophyton rubrum), tinea negra (normalmente Hortaea werneckii), pé de atleta (normalmente Trichophyton), micose de unha (normalmente Trichophyton), micose de praia (Malassezia), toxocaríase (Toxocara canis ou Toxocara cati), tracoma (Chlamydia trachomatis), toxoplasmose (Toxoplasma gondii), triquinose (Trichinella spiralis), tricomoníase (Trichomonas vaginalis), tricuríase (Trichuris trichiura), turbeculose (normalmente Mycobacterium tuberculosis), tularemia (Francisella tularensis), febre tifoide (Salmonella enterica subsp. enterica, serovar typhi), febre do tifo (Rickettsia), infecção por Ureaplasma urealyticum (Ureaplasma urealyticum), febre do vale (Coccidioides immitis ou Coccidioides posadasii), encefalite equina venezuelana (vírus da encefalite equina venezuelana), febre hemorrágica venezuelana (vírus Guanarito), infecção por Vibrio vulnificus (Vibrio vulnificus), enterite por Vibrio parahaemolyticus (Vibrio parahaemolyticus), pneumonia viral (vários vírus), febre do Nilo ocidental (vírus do Nilo ocidental), piedra branca (Trichosporon beigelii), infecção por Yersinia pseudotuberculosis (Yersinia pseudotuberculosis), Yersiniose (Yersinia enterocolitica), febre amarela (vírus da febre amarela) e zigomicose (Zygomycetes).
PATÓGENOS INTRACELULARES
[00273] Patógenos celulares intracelulares podem ser alguns dos mais difíceis de tratar, visto que uma vez que o patógeno esteja dentro da célula, um certo nível de proteção pode ser fornecido para o patógeno pelo ambiente celular.
[00274] Patógenos podem ser virais, bacterianos, fúngicos, protozoários, etc. As moléculas da presente divulgação são particularmente úteis para o tratamento de patógenos intracelulares, em particular, aqueles divulgados no presente documento.
[00275] Bactérias intracelulares notáveis incluem Bartonella henselae, Francisella tularensis, Listeria monocytogenes, Salmonell typhi, Brucella, Legionella, Mycobacterium (tal como Mycobacterium tuberculosis), Nocardia, Rhodococcus equi, Yersinia, meninggitidis Neisseria.
[00276] Um ou mais antibióticos selecionados a partir de eritromicina, doxiciclina, azitromicina, rifampicina, estreptomicina, gentamicina, doxiciclina, ciprofloxacina, ampicilina, trimetoprim-sulfametoxazol, cloranfenicol, TMP-SMZ (trimetoprim-sulfametoxazol), levofloxacina, moxifloxacina, claritromicina, tetraciclinas, glicilciclinas, etambutol, rifabutina, imipenem, cefotaxima, amicacina, vancomicina, minociclina, penicilina G, ampicilina, fluoroquinolona, aztreonam e combinações de dois ou mais dos mesmos.
[00277] Mycobacterium tuberculosis é notoriamente difícil de tratar. Em um aspecto independente, a presente divulgação fornece uma molécula para o tratamento de TB latente e/ou ativa, em que um ou mais fármacos para TB são conjugados como uma carga útil com o componente GLA descrito no presente documento.
[00278] As moléculas da presente divulgação podem ter capacidade para aumentar amplamente a eficácia dos medicamentos atuais, distribuindo-os dentro da célula, onde a micobactéria está localizada.
[00279] O tratamento para TB depende de vários fatores, incluindo se a TB está latente ou ativa, se o paciente é um adulto, é uma criança, está grávida, é HIV-positivo ou uma combinação dos itens acima. Os detalhes abaixo referem-se a todos os aspectos da invenção, por exemplo, quais moléculas preparar e como usá-las para tratar pacientes.
[00280] O tratamento de TB latente em pacientes com HIV e crianças na faixa etária de 2 a 11 anos é isoniazida diariamente durante 6 a 9 meses. As pacientes grávidas podem ser tratadas duas vezes por semana, em vez de diariamente.
[00281] Assim, em uma modalidade, na molécula da presente divulgação, o componente GLA está ligado a uma carga útil que compreende isoniazida ou um equivalente da mesma.
[00282] O tratamento da TB latente em pacientes com 12 anos ou mais sem fatores complicadores pode ser a administração com isoniazida e rifapentina, uma vez por semana, durante 3 meses. Alternativamente, a rifampicina pode ser administrada diariamente por 4 meses.
[00283] Assim, em uma modalidade, a carga útil compreende, ainda, rifapentina.
[00284] Alternativamente, pode ser fornecida uma molécula em que o domínio GLA, conforme descrito no presente documento, está ligado à carga útil que compreende rifapentina. Uma combinação de moléculas de acordo com a presente divulgação pode ser fornecida para uso no tratamento.
[00285] A primeira linha de tratamento para TB ativa é frequentemente selecionada dentre isoniazida, rifampicina, etambutol, pirazinamida e combinações de dois ou mais dos mesmos.
[00286] Assim, é fornecida uma molécula de acordo com a presente divulgação que compreende um componente GLA, conforme descrito no presente documento, ligado a uma carga útil que compreende rifampicina.
[00287] Também é fornecida uma molécula de acordo com a presente divulgação que compreende um componente GLA, conforme descrito no presente documento, ligado a uma carga útil que compreende etambutol.
[00288] Em uma outra modalidade, é fornecida uma molécula de acordo com a presente divulgação que compreende um componente GLA, conforme descrito no presente documento, ligado a uma carga útil que compreende pirazinamida.
[00289] Como explicitamente previsto, as cargas úteis usadas no tratamento de TB que empregam vesículas extracelulares, conforme divulgado no presente documento, podem compreender dois ou mais, tal como três fármacos ou quatro fármacos, tais como: isoniazida e rifamicina, isoniazida e piraxinamida, isoniazida e etambutol, rifamicina e piraxinamida, rifamicina e etambutol, piraxinamida e etambutol, isoniazida e rifamicina e piraxinamida, isoniazida e rifamicina e etambutol, e isoniazida e piraxinamida e etambutol.
[00290] Patógenos virais incluem influenza, vírus da imunodeficiência humana, vírus da dengue, vírus do Nilo Ocidental, vírus da varíola, vírus sincicial respiratório, vírus da febre hemorrágica coreana, varicela, vírus zoster da varicela, vírus herpes simplex 1 ou 2, vírus Epstein-Barr, vírus Marburg, hantavírus, vírus da febre amarela, hepatite A, B, C ou E, vírus Ebola, vírus do papiloma humano, rinovírus, vírus Coxsackie, vírus da poliomielite, vírus do sarampo, vírus da rubéola, vírus da raiva, Vírus da doença de Newcastle, rotavírus, HIV (como HTLV-1 e -2).
[00291] Fármacos antivirais podem ser ligados ao componente GLA e podem ser independentemente selecionados a partir de um ou mais dentre os seguintes: abacavir, Aciclovir, aciclovir, adefovir, Amantadina, amprenavir, Ampligem, Arbidol, Atazanavir, Atripla, Boceprevirertet, Cidofovir, Combivir, Darunavir, Delavirdina, Didanosina, Docosanol, Edoxudina, Efavirenz, Entricitabina, Enfuvirtida, Entecavir, Inibidores da entrada, Fanciclovir, Fomivirsem, Fosamprevanir, Foscarnet, Fosfonet, Ganciclovir, Ibacitabina, Imunovir, Idoxuridina, Imiquimode, Indinavir, Inosina, inibidor de Integrase, Interferon tipo III, Interferon tipo II, Interferon tipo I, Interferon, Lamivudina, Lopinavir, Lovirida, Maraviroc, Moroxidina, Metisazona, Nelfinavir, Nevirapina, Nexavir, análogos de nucleospídeo, Oseltamivir, Peginterferon alfa-2a, Penciclovir, Peramivir, Pleconaril, Podofilotoxina, inibidor de Protease, Raltegravir, inibidor de transcriptase reversa, Ribavirina, Rimantadina, Ritonavir, Piramidina, Saquinavir, estavudina, acentuador sinérgico (antirretroviral), óleo da árvore do chá, Telaprevir, Tenofovir, Tenofovir disoproxila, Tipranavir, Trifluridina, Trizivir, Tromantadina, Truvada, Valaciclovir, Valganciclovir, Vicriviroc, Vidarabina, Viramidina, Zalcitabina, Zanamivir e Zidovudina.
[00292] É bem conhecido no campo da técnica que os fármacos antivirais podem ser usados em combinações, por exemplo, para aumentar a eficácia.
[00293] Assim, em uma modalidade, a molécula da presente invenção é fornecida com uma carga útil para o tratamento de uma doença por protozoários, por exemplo, malária, doença do sono africano e semelhantes.
[00294] Parasitas protozoários notáveis incluem parasitas do tipo plasmodium, tais como malária. O fármaco usado para tratar malária, tal como quinina e agentes relacionados, coloroquina, amodiaquina, pirimetamina, proguanila, sulfonamidas, mefloquina, atovaquona, primaquina, aremisinina e derivados dos mesmos, halofantrina, doxiciclina, clindamicina, sulfadiazina e combinação de dois ou mais dos mesmos.
[00295] Em uma modalidade, as moléculas da presente divulgação são fornecidas em uma composição farmacêutica que compreende um excipiente, diluente e/ou carreador. Em uma modalidade, a composição é como uma formulação parentérica.
[00296] Formulação parentérica significa uma formulação projetada para não ser entregue através do trato GI. As rotas de entrega parenterais típicas incluem injeção, implantação ou infusão.
[00297] Em uma modalidade, a formulação parentérica está sob a forma de uma injeção. A injeção inclui injeção intravenosa, subcutânea, instracraniana, intratecal, intratumoral ou intramuscular. Injeção, conforme empregue no presente documento, significa a inserção de líquido no corpo através de uma seringa.
[00298] Em uma modalidade, a formulação parentérica está sob a forma de uma infusão.
[00299] Infusão, conforme empregue no presente documento, significa a administração de fluidos a uma taxa mais lenta por gotejamento, bomba de infusão, acionador de seringa ou dispositivo equivalente.
Em uma modalidade, a infusão é administrada ao longo de um período na faixa de 1,5 minuto a 120 minutos, tal como cerca de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 15, 16 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110 ou 115 minutos.
[00300] Em uma modalidade, a formulação é para administração intravenosa (iv). Essa rota é particularmente eficaz, visto que permite acesso rápido a maior parte dos órgãos e tecido e é particularmente útil para o tratamento de metástases, por exemplo, metástases estabelecidas, especialmente aquelas localizadas em regiões altamente vascularizadas, tais como o fígado e os pulmões.
[00301] As formulações terapêuticas serão tipicamente estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma ou outra formulação parentérica adequada para administração a um ser humano e pode ser formulada como um dispositivo preenchido, tal como uma seringa ou frasco, particularmente como uma dose única.
[00302] Conforme discutido acima, a formulação compreenderá geralmente um diluente ou carreador farmaceuticamente aceitável, por exemplo, um carreador isotônico não tóxico que seja compatível com o vírus e no qual o vírus seja estável durante o período de tempo requerido.
[00303] O carreador pode ser um solvente ou meio de dispersão que contém, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido e semelhantes) e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, com uso de um dispersante ou tensoativo, tal como lecitina, ou um tensoativo não iônico, tal como o polissorbato 80 ou 40. Em dispersões, a manutenção do tamanho de partícula exigido pode ser assistida pela presença de um tensoativo. Exemplos de agentes isotônicos incluem açúcares, poliálcoois, tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição.
[00304] Assim, na modalidade, é fornecida uma molécula de acordo com a presente divulgação, em que o componente GLA, descrito no presente documento, é ligado a uma carga útil que compreende um ou mais fármacos antimalária.
[00305] “Compreendendo” no contexto do presente relatório descritivo pretende significar “incluindo”.
[00306] Quando tecnicamente apropriado, as modalidades da invenção podem ser combinadas.
[00307] As modalidades são descritas no presente documento como compreendendo certas características/elementos. A divulgação também se estende a modalidades separadas que consistem ou consistem essencialmente nas ditas características/elementos.
[00308] Referências técnicas, tais como patentes e pedidos, são incorporadas ao presente documento a título de referência.
[00309] Os antecedentes da técnica fazem parte da divulgação técnica do presente relatório descritivo e podem ser usados como base para emendas, visto que a discussão nos mesmos não se limita a discutir a arte anterior, pois também inclui uma discussão dos problemas da técnica encontrados no campo e na aplicação da presente invenção.
[00310] Quaisquer modalidades recitadas específica e explicitamente no presente documento podem formar a base de uma declaração de responsabilidade, isoladamente ou em combinação com uma ou mais modalidades adicionais.
[00311] O presente pedido reivindica prioridade dos documentos U.S. de números de série: 62/554530, 62/569.403, 62/554533, 62/569.411, 62/584.565 e 62/593.014. Cada um desses pedidos está incorporado a título de referência. Esses pedidos podem ser empregues como base para uma correção no presente relatório descritivo.
[00312] A invenção será agora descrita com referência aos exemplos a seguir, que são meramente ilustrativos e não devem de modo algum ser interpretados como limitativos do escopo da presente invenção.
EXEMPLOS
[00313] As Figuras 1A a 1D mostram várias representações das estruturas de proteína GLA.
[00314] A Figura 1E mostra uma modalidade de um componente GLA de acordo com a presente divulgação.
[00315] A Figura 2 mostra o manchamento da proteína S (PrS) e anexina de linhagens celulares de câncer de mama tratadas com peróxido para induzir apoptose. A, células MDA-231 humanas tratadas com peróxido e manchadas com FITC-PrS. B, células MDA-231 não tratadas manchadas como em A. C, células MDA-231 tratadas manchadas com anexina. D, células MCF-7 humanas tratadas com peróxido e manchadas com PrS. E, células MET-1 murinas, como em D. F, células 4T1 murinas, como em D.
[00316] A Figura 3 mostra a localização celular sobreposta, mas distinta, de PrS e anexina. A, células 4T1 murinas tratadas com peróxido e manchadas com Cy5 PrS (VERMELHO) e FITC anexina (VERDE). Seta clara, sinais colocalizados; setas vermelhas, manchamento de células com PrS e não anexina; seta verde, manchamento celular relativamente mais brilhante com anexina, mas menos brilhante com PrS, indicando padrões de ligação distintos (as inserções mostram manchamento com PrS e anexina separadamente). B, células 4T1 tratadas manchadas com FITC PrS e Cy5 anexina. Setas verdes, manchamento de células com PrS e não anexina. C, manchamento com Cy5 anexina de células 4T1 tratadas pré-incubadas com excesso de 1.000 vezes de anexina fria.
[00317] A Figura 4 mostra o manchamento de células COS-1 apoptóticas com PrS e anexina. As células foram tratadas com t- BHP conforme descrito e manchadas com FITC anexina (esquerda) e Cy5 PrS (direita). As setas indicam estruturas subcelulares presumidas como corpos apoptóticos.
[00318] A Figura 5 mostra o manchamento diferencial de vesículas extracelulares com PrS e anexina. As vesículas extracelulares foram preparadas a partir de células 4T1 e manchadas com FITC PrS (VERDE) e Cy5 anexina (VERMELHO). As setas indicam manchamento de vesículas com apenas anexina (seta VERMELHA), apenas PrS (seta VERDE) e ambas as proteínas (seta clara).
[00319] A Figura 6 mostra a localização subcelular de PrS e anexina. A, B, células 4T1 apoptóticas foram manchadas com FITC PrS (setas VERDES) e Cy5 anexina (setas VERMELHAS); setas claras, colocalização. C, Possíveis corpos apoptóticos.
[00320] A Figura 7 mostra a internalização do PrS em 5 minutos. As células 4T1 apoptóticas foram manchadas com FITC PrS (verde) e Cy5 anexina (vermelho) e imageadas dentro de 10 minutos após a adição das proteínas. A, imagem mesclada. B, mancha nuclear Hoescht isolada.
[00321] A Figura 8 mostra imagens BLI de tumores 4T1 em camundongos.
[00322] A Figura 9 mostra imageamento SPECT do efeito da doxorrubicina em tumores 4T1, com o uso de PrS e anexina radioidentificadas. Camundongos com tumores de câncer de mama 4T1 foram imageados com 99mTc PrS (A e B), ou anexina (C e D), antes (A e C) e 24 horas após a doxorrubicina (B e D).
[00323] A Figura 10 mostra o imageamento SPECT de camundongos tratados com ciclo-hexamida. Cinco camundongos por painel são mostrados antes (A e C) e 24 horas após o tratamento (B e D). Os camundongos foram imageados com 99mTc PrS (A e B) ou anexina (C e D). As setas indicam aumento do sinal hepático.
[00324] A Figura 11 mostra a localização de Cy5 PrS no baço infectado. Camundongos CD1 foram infectados com Listeria bioluminescente e imageados no dia 2 após a infecção. Os camundongos foram injetados com Cy5 PrS 30 minutos antes do sacrifício, e os baços foram removidos e congelados. São mostrados camundongos modestamente infectados (A) e de controle não infectados (C). São mostradas seções dos baços infectados (B) e não infectados (D) de cada camundongo no canal Cy5, fundidas com imagens de contraste de fase.
[00325] A Figura 12 mostra a localização de Cy5 PrS para tumores tratados com doxorrubicina. Os camundongos implantados com tumores de câncer de mama 4T1 foram tratados com doxorrubicina (painéis da direita) ou deixados sem tratamento (painéis da esquerda). 24 horas depois, os camundongos foram injetados por via intravenosa com Cy5 PrS e sacrificados 30 minutos depois. Os tumores foram removidos, congelados e seccionados para microscopia de fluorescência. São mostradas imagens mescladas de contraste de Cy5/fase de quatro camundongos diferentes.
[00326] A Figura 13 mostra diferenciação de TSCs. As TSCs foram cultivadas na presença (esquerda) ou ausência (direita) de fatores de crescimento. As setas no painel direito indicam células gigantes características de diferenciação.
[00327] A Figura 14 mostra manchamento com PrS de células-tronco trofoblásticas e trofoblastos diferenciados. As células-tronco trofoblásticas (esquerda) foram diferenciadas em células gigantes trofoblásticas (direita) pela retirada dos fatores de crescimento. As células foram manchadas com Cy5 PrS e imageadas.
[00328] A Figura 15 mostra a diferenciação de MSC. MSCs foram tratadas conforme descrito no texto, para diferenciação em adipócitos (painéis superiores) ou osteoblastos (painéis inferiores). As células diferenciadas exibiram a morfologia esperada em cada caso.
[00329] A Figura 16 mostra MSCs manchadas com PrS (verde), anexina (vermelho) e Hoechst (azul). As células foram imageadas dentro de 10 minutos após a adição da mistura de manchamento.
[00330] A Figura 17 mostra TSCs manchadas com PrS (verde, área mais clara), anexina (vermelho, claro ao redor da membrana celular) e Hoechst (azul). As células foram imageadas dentro de 5 minutos após a adição da mistura de manchamento.
[00331] A Figura 18 mostra manchamento diferencial de vesículas de TSC. As TSCs foram manchadas como na Figura 17. O grupo de células secreta grandes vesículas manchadas com anexina (vermelha) e não PrS (verde).
[00332] A Figura 19 mostra o manchamento com PrS das células progenitoras neurais C17.2. As células foram manchadas com PrS-FITC e imageadas com microscopia padrão (não confocal).
[00333] A Figura 20 mostra a internalização do PrS na TSC em 4C. FITC PrS (verde) e Cy5 anexina (vermelho) foram adicionadas à TSC em 4C e imageadas com microscopia confocal.
[00334] A Figura 21 mostra células de manchamento SCA-1/c-kit de linhagem negativa da medula óssea de camundongo. As células não foram manchadas com PI (iodeto de propídio, para detectar células mortas) ou PrS nesse ponto na análise. Ausência de manchamento para linhagens hematopoiéticas (painel esquerdo) e manchamento de c-kit e SCA1 (painel direito) define a população de HSC, mostrada em verde (áreas mais claras).
[00335] A Figura 22 mostra o manchamento com PrS de HSC a longo prazo. Os HSCs foram isolados como na Figura 1 e manchados com FITC PrS. O padrão SLAM foi determinado com Cy7 (eixo geométrico x).
[00336] A Figura 23 mostra o manchamento com PrS de HSC a curto prazo. Os HSCs foram isolados como na Figura 1 e manchados com FITC PrS. O padrão SLAM foi determinado com Cy7 (eixo geométrico x).
[00337] A Figura 24 mostra a internalização de PrS em HSC a longo prazo. Os HSC foram preparados conforme descrito, manchados para PrS e examinados com microscopia confocal. Verde (áreas mais claras), FITC PrS; mancha nuclear Hoescht azul; vermelho, PI. Observe que a mancha de PI é excluída do núcleo, indicando que as células estão vivas.
[00338] A Figura 25 mostra um exemplo de HSC morto exibindo PI nuclear.
[00339] A Figura 26 mostra que a entrega mediada por GLA não é tóxica para as células.
[00340] Este relatório descritivo também inclui as sequências 1 a 6, na listagem de sequências associada.
[00341] Este projeto iniciou o teste do PrS recombinante identificado como um agente de imageamento in vivo para SPECT (Tomografia Computadorizada de Fóton Único). Surpreendentemente, verificou- se que a molécula internalizou rapidamente em células apoptóticas. Essa constatação inesperada nos levou a explorar o fenômeno ainda mais, e verificamos que a PrS também era internalizada em um subconjunto de células- tronco não apoptóticas de vários tipos.
[00342] PrS é o domínio GLA da proteína S e o domínio EGF da proteína S, conforme mostrado na SEQ ID NO: 6.
MÉTODO
[00343] Para fluorescência, a conjugação de Cy5 e FITC foi alcançada com o uso dos kits de identificação Amersham (GE Heathcare) e Molecular Probes (Invitrogen), respectivamente, de acordo com as instruções dos fabricantes. Ambos os kits fornecem colunas para a remoção de fluoróforo não conjugado. Inicialmente, 0,77 mg de PrS (Fração 2) em 1 ml e 0,77 mg de anexina em 1 ml foram identificados com FITC para testar a especificidade da ligação a células apoptóticas. Para estudos de colocalização e competição, 0,68 mg de PrS (Fração 3) em 1 ml e 0,68 mg de anexina foram identificados com Cy5. Para microscopia confocal, 0,76 mg de PrS da segunda remessa foi identificado com FITC e foi usada a anexina conjugada com Cy5 previamente identificada. Deve-se notar que a eficiência precisa da identificação não foi determinada e a recuperação das colunas foi assumida em 85%, de acordo com as instruções dos fabricantes dos kits de identificação. Assim, a intensidade de manchamento relativa das duas proteínas em qualquer caso pode refletir essas contingências. As células foram manchadas por 30 minutos inicialmente, mas foi subsequentemente determinado que menos de 5 minutos era suficiente. Para testar a PrS quanto à especificidade celular apoptótica, foram inicialmente empregadas quatro linhagens celulares de câncer de mama; MDA- 231 e MCF7 humanos e 4T1 e MET-1 murinos. Posteriormente, também foram utilizadas células renais de macaco COS-1. A apoptose foi induzida com peróxido de hidrogênio ou hidroperóxido de butila terciário (t-BHP). As células foram plaqueadas em placas de 24 poços a 6x10 4 células por poço ou em lâminas da câmara Eppendorf a 1x104 células por poço, e a apoptose foi induzida no dia seguinte, usando H2O2 2 mM ou t-BHP para períodos de 30 min a 2 horas. Após a indução, os poços foram lavados com tampão de ligação à anexina (AB; Santa Cruz Biotech) e manchados com a proteína identificada. A partir de experiências anteriores e da literatura, foram utilizados 5,5 g/ml de proteína anexina para o manchamento. Essa quantidade foi ajustada para adição equimolar de PrS, assumindo-se os pesos moleculares de anexina como sendo 36 kD e de PrS recombinante como sendo 30 kD, com base nas imagens em gel fornecidas. As células foram manchadas por 15 min. O corante Hoechst 33342 foi utilizado para visualizar o ácido nucleico. Os poços foram, então, lavados com AB e observados com o uso do microscópio de fluorescência EVOS enquanto ainda viável. Para microscopia confocal, o microscópio Leica SP8 no Stanford Cell Sciences Imaging Facility foi empregado. Os poços foram, então, lavados com AB e observados com o uso do microscópio Leica sp8. O corante Hoechst 33342 foi usado para visualizar núcleos. Para estudos de toxicidade, PrS foi adicionada às células-tronco dos trofoblastos (TSCs) e a viabilidade foi testada com azul de tripano com o uso de um celômetro Nexcelom.
[00344] Para testar as proteínas identificadas quanto à capacidade de detectar tumores, 5x104 células 4T1-luc foram implantadas em grupos de 5 camundongos BALB/c machos, na almofada de gordura axilar esquerda. Os camundongos foram imageados com imageamento de bioluminescência in vivo (BLI) todos os dias para monitorar o crescimento do tumor, começando 1 semana após o implante. Os camundongos foram, então, tratados no dia 11 após o implante com 13 mg/kg de peso corporal de doxorrubicina intraperitoneal (IP), e BLI foi realizado no dia seguinte. Camundongos de controle portadores de tumores foram deixados sem tratamento com doxorrubicina. 48 horas após o tratamento, os camundongos foram imageados 1 hora após a injeção intravenosa do traçados (anestesia 1,3 g/kg de uretano IP), com uma câmera gama A-SPECT de cabeça única (Gamma Medica); Colimador com orifício de 1 mm, 128 etapas em uma matriz de imageamento 128 x 128, 15 segundos por etapa, ROR de 2,7 cm; FOV = parte superior do peito/pescoço. A dose injetada de cada proteína foi de 160 µl (800 µCi). Os animais foram, então, sacrificados e a biodistribuição foi realizada. Para o experimento de tratamento com ciclo-hexamida, grupos de 5 camundongos Swiss Webster machos jovens (7 semanas de idade) foram anestesiados (1,3 g/kg de uretano IP) e injetados por via intravenosa com 50 mg/kg de ciclo- heximida. 1 hora e 45 minutos após a injeção de ciclo-heximida, o traçador foi injetado (PrS = 180 ul/1,2 mCi por dose; anexina V = 170 µl/1,05 mCi por dose). 45 minutos após a injeção do traçador, os camundongos foram imageados com 10 minutos de imagens estáticas de corpo inteiro com o uso de um colimador de orifício paralelo de cabeça única (matriz 128 x 128) na câmera gama A-SPECT.
[00345] Para testar a localização específica de PrS fluorescente em sítios apoptóticos devido à infecção em animais vivos, os camundongos CD1 foram injetados por via intravenosa com Listeria monocytogenes bioluminescente. Esse patógeno bacteriano infecta muitos órgãos, incluindo o baço, nos quais ocorre extensa apoptose de monócitos e granulócitos. Em certos momentos após a infecção, o baço é o principal sítio de replicação bacteriana e, portanto, os sinais BLI esplênicos das bactérias podem ser correlacionados com a localização das sondas para apoptose. Os camundongos foram infectados e imageados a cada dia. Quando os sinais esplênicos foram evidentes (dia 2 após a infecção para 2x10 5 unidades formadoras de colônias de bactérias em camundongos CD1 fêmeas de 8 semanas de idade), 300 mg/kg de massa corporal de Cy5 PrS foram injetados nos camundongos, os animais foram sacrificados 30 min mais tarde, e os baços foram removidos, congelados em OCT e seccionados para microscopia de fluorescência. Camundongos de controle não infectados foram empregados.
[00346] A citometria de fluxo foi realizada. Empregou- se FITC PrS recentemente identificada, preparada conforme descrito acima. As células-tronco hematopoiéticas murinas (HSCs) são rotineiramente purificadas nesse laboratório. As células foram isoladas da medula óssea de camundongo normal por manchamento para células de linhagem negativa c-Kit+. Para caracterizar ainda mais as células, também foi realizada o manchamento com marcador SLAM. Esses marcadores mancham as células que se renovam e se diferenciam, enquanto as HSCs sem manchamento só podem se diferenciar. Um manchamento subsequente com FITC PrS revelou a porcentagem positiva nas células de manchamento SLAM, conforme mostrado nos resultados. As células foram, então, classificadas para FITC e examinadas com microscopia confocal, com o uso de Hoechst 33342 para visualização nuclear.
RESULTADOS
[00347] Para avaliar a especificidade de ligação à PrS no contexto da apoptose na cultura celular, empregou-se várias linhagens celulares de câncer de mama humano e murino. A apoptose foi induzida com peróxido conforme descrito acima, e a ligação à FITC PrS foi avaliada. Exemplos dessas experiências são mostrados na Figura 2. As células não tratadas exibiram ligação mínima, tal como mostrado no painel B da Figura 2. As concentrações de peróxido e os tempos de incubação foram escolhidos de modo que apenas uma minoria de células fosse afetada, visto que em concentrações mais altas e/ou em períodos de incubação mais longos, as células destacadas, o manchamento e a microscopia não eram possíveis. Além disso, a presença de muitas células não afetadas serviu como um controle negativo interno dentro de cada campo. A FITC-anexina mostrou especificidade para apoptose semelhante à PrS, servindo como um controle positivo interno.
Em seguida, testou-se as duas proteínas quanto à colocalização e ligação competitiva.
Para colocalização, foram preparadas PrS e anexina identificadas com FITC e Cy5. As células 4T1 foram tratadas com peróxido e manchadas com PrS e anexina identificadas com Cy5 e FITC, com o uso de ambas as combinações de fluoróforos.
As células foram, então, visualizadas no microscópio de fluorescência EVOS.
Os resultados são mostrados na Figura 3. Sob as condições testadas, todas as células com manchamento brilhante exibiram manchamento com ambas as proteínas.
No entanto, seja usando Cy5 ou FITC, a PrS pareceu manchar algumas células que a anexina não manchou, embora fracamente (Figura 3). A intensidade relativa do manchamento de células diferentes por cada proteína diferiu algumas vezes entre as duas sondas, ou seja, às vezes a anexina manchou duas células com intensidade igual e a PrS não, e vice-versa (Figura 3A, seta verde e inserção). Assim, embora ambas as sondas geralmente manchassem as mesmas células, as mesmas pareciam exibir diferenças sutis.
No ensaio de competição, quantidades excessivas crescentes de anexina não identificada foram pré- incubadas com células apoptóticas 4T1 por 15 min, e as células foram, então, manchadas com Cy5 PrS.
Surpreendentemente, o manchamento de PrS não foi bloqueada pelo excesso de 1.000 vezes de anexina, a maior quantidade excedente testada (Figura 3C), embora acredite-se que essas proteínas se liguem à mesma molécula-alvo, a PS exposta.
O comanchamento de anexina e PrS foi observado com muitos tipos de células.
Embora as duas proteínas geralmente manchassem as mesmas células em cada tipo de célula, outras diferenças se tornaram aparentes.
Em particular, alguns objetos menores que as células foram diferencialmente manchados (Figura 4). Esses objetos, que estavam presentes em maior número após o tratamento com peróxido, foram interpretados como corpos apoptóticos; fragmentos celulares ligados à membrana produzidos durante a fragmentação das células apoptóticas.
Conforme mostrado na Figura 4, a PrS manchou essas entidades, enquanto a anexina não, embora alguns desses objetos tenham manchados com ambas as proteínas. Essa observação foi inesperada. Para explorar ainda mais o manchamento diferencial de entidades subcelulares, vesículas extracelulares (EVs) foram preparadas a partir de células tumorais murinas 4T1 com o uso de um protocolo padrão de centrifugação. As duas proteínas também mancharam diferencialmente essas vesículas (Figura 5), um resultado que pode ter implicações biológicas e terapêuticas.
[00348] Presume-se que as EVs, especificamente exossomas, microvesículas (MVs) e corpos apoptóticos (ABs), desempenhem papéis-chave na comunicação célula a célula via transferência de biomoléculas entre as células. A biogênese desses tipos de EVs difere, e as mesmas se originam das membranas endossômicas (exossomas) ou plasmáticas (VM) ou são produtos da morte celular programada (ABs). Acredita-se que todas as células de mamíferos secretam EVs. Cada tipo de EV pode transferir carga molecular para células vizinhas e distantes, afetando comportamentos celulares, tais como os envolvidos no desenvolvimento e na progressão do tumor. De fato, as EVs podem desempenhar um papel em quase todas as características do câncer, incluindo sustentar a sinalização proliferativa, evitar a supressão do crescimento, resistir à morte celular, reprogramar o metabolismo energético, adquirir instabilidade genômica e desenvolver o microambiente do tumor. As mesmas também foram implicadas na indução da angiogênese, controle da invasão, iniciação de nichos pré-metastáticos, sustentação da inflamação e fuga da vigilância imunológica. Parece que as células imunes também se comunicam através das EVs e podem reconhecer Evs como sinais de células tumorais, tecidos infectados e feridas. Uma compreensão mais profunda da biologia das EVs e sua contribuição para as características do câncer está levando a novas possibilidades de diagnóstico e tratamento do câncer. O desenvolvimento de marcadores de superfície de EV adicionais é essencial para avançar nesse campo e a PrS pode ser um determinante.
[00349] Após esses estudos com microscopia de fluorescência, a localização subcelular do manchamento por PrS e anexina foi,
então, avaliada por microscopia confocal. Células 4T1 murinas (que carecem de repórteres Luc-GFP) foram plaqueadas em lâminas de câmara com 8 partes a 1 x 104 células por câmara, e a apoptose foi induzida com H 2O2 2 mM ou t-BHP (2 h de exposição) no dia seguinte. As células foram, então, lavadas e manchadas por 15 min com PrS e anexina. O corante Hoechst 33342 foi utilizado para manchar o ácido nucleico. Em todos os casos, as células com manchamento mais brilhante foram manchadas com ambas as sondas. No entanto, em muitas células, a PrS identificada foi observada no citoplasma, enquanto a anexina identificada não foi (Figura 6). Embora a anexina tenha sido internalizada e apareça nas vesículas de algumas células, a anexina internalizada juntamente com a PrS localizada na superfície na mesma célula não foi observada. Esses resultados foram inesperados, pois presume-se que as duas proteínas se liguem a PS.
[00350] Claramente, no entanto, as duas proteínas responderam diferentemente aos inibidores testados. Para estudar ainda mais a internalização da PrS, foi realizado um experimento no curso do tempo. As células apoptóticas 4T1 foram manchadas por 5 minutos com Cy5 anexina e FITC PrS e observadas dentro de 5 minutos após a adição das sondas. A PrS foi observada no citoplasma dessas células imediatamente, indicando internalização em 5 minutos (Figura 7). As imagens do curso do tempo também mostraram que a PrS e a anexina nem sempre mancham as mesmas células igualmente nos primeiros momentos. As células da Figura 7 parecem estar em diferentes estágios de apoptose, pois a célula da esquerda mostra um núcleo não condensado cercado por uma membrana nuclear aparentemente intacta, enquanto a célula da direita exibe o forte manchamento, muitas vezes característico da condensação de cromatina que ocorre mais tarde no processo apoptótico. Padrões de manchamento, tais como esses, podem indicar que a PrS se liga mais cedo na apoptose do que a anexina. Embora seja puramente conjectura nesse momento, essa preferência explicaria muitas das diferenças entre essas proteínas que foram observadas até agora. Por exemplo, o manchamento de algumas células por PrS e não por anexina, tal como nas Figuras 3A e 3B, pode ser devido à ligação de PrS anteriormente no processo de apoptose. Para examinar a localização de PrS em animais vivos, foram realizadas várias experiências. Esses estudos empregaram indução química e infecciosa de apoptose in vivo, bem como a localização de PrS em tumores tratados com doxorrubicina, que é conhecida por induzir apoptose. O imageamento SPECT com o uso de PrS e anexina identificadas com HYNIC foi realizado em animais que receberam tumores de mama 4T1luc e tratados com doxorrubicina. Como os tumores 4T1 foram identificados com luciferase, os mesmos podem ser imageados em camundongos com o uso de imageamento de bioluminescência in vivo (BLI). Uma das imagens dessa experiência é mostrada na Figura 8. Esse método pode ser usado para avaliar a implantação tumoral e acompanhar a progressão em animais individuais ao longo do tempo. PrS e anexina identificadas com 99mTc foram, então, empregadas para imageamento SPECT de animais tratados com doxorrubicina e controles. Um exemplo dos resultados é mostrado na Figura 9. As imagens da cabeça e do tórax dos dois animais mostram acúmulo não específico da sonda PrS na glândula salivar e uma baixa relação sinal/ruído com o uso dessa sonda. Portanto, o limiar da tela nas imagens PrS mostradas foi reduzido para revelar mais o plano de fundo, resultando em cores falsas mais brilhantes das imagens. A baixa relação sinal/ruído é provavelmente devido à identificação com HYNIC de apenas 1 mg de proteína, o que é subideal, e também devido à incapacidade de realizar estudos controlados da razão de identificação HYNIC:proteína.
[00351] Também foi realizado um imageamento SPECT de camundongos tratados com ciclo-hexamida, que induz apoptose no fígado (Figura 10). Na Figura 10, as imagens de corpo inteiro de 5 camundongos são mostradas em cada painel. Tal como acontece com muitas sondas radioidentificadas, o plano de fundo é visto nos rins. O tratamento dos camundongos com ciclo-hexamida aumentou o sinal SPECT da anexina no fígado. Novamente, a PrS mostrou sinal baixo em comparação com a anexina.
A anexina teve capacidade para detectar o fígado apoptótico de camundongos tratados com ciclo-hexamida, enquanto a PrS mostrou apenas um ligeiro aumento do sinal no fígado devido ao tratamento. Para testar a localização de PrS em tecidos apoptóticos e tumores tratados independentemente do imageamento SPECT e as complicações concomitantes da identificação com HYNIC, camundongos infectados com bactérias que induzem respostas apoptóticas e camundongos portadores de tumor foram injetados com Cy5 PrS. Para a infecção, empregou-se Listeria monocytogenes, um patógeno bacteriano identificado com luciferase e bem caracterizado para BLI. Os sinais característicos de BLI do baço fornecem excelentes estudos de colocalização. Os camundongos CD1 foram infectados conforme descrito acima e foram imageados com BLI no dia 2 após a infecção. Os camundongos foram, então, injetados, com Cy5 PrS e 30 minutos mais tarde sacrificados, e os baços removidos para seccionamento e microscopia de fluorescência (Figura 11). Em todos os casos, as seções esplênicas de camundongos infectados mostraram sinais de fluorescência Cy5 muito maiores que os controles. Na Figura 11, o camundongo infectado mostrado exibiu baixa contagem de fótons, indicando que a infecção ainda não havia progredido muito nesse animal. Muitos camundongos exibem 10 vezes essa intensidade de sinal do baço nesse dia. No entanto, a fluorescência do canal Cy5 ainda era muito forte em relação ao controle não infectado mostrado. Esse resultado pode refletir a resposta imune inata contínua à infecção, já que os granulócitos e macrófagos demonstraram ser a principal fonte de sinal de anexina nesses animais (essas células são programadas para apoptose para limitar a destruição dos tecidos).
[00352] A localização de tumores fluorescentes de PrS 4T1 tratados com doxorrubicina foi, então, testada. Os camundongos implantados com tumores foram tratados com doxorrubicina conforme descrito acima e Cy5 PrS foi injetada por via intravenosa 30 min antes do sacrifício e da remoção dos tumores para seccionamento e microscopia de fluorescência. Os resultados são mostrados na Figura 12. Áreas de manchamento intenso foram observadas nos animais tratados, enquanto um sinal mais modesto foi observado nas seções de tumor não tratadas. Embora alguns tumores não tratados tenham exibido pequenas áreas com sinal mais alto que o plano de fundo, não foram observados sinais de intensidade semelhante aos tumores tratados em nenhuma das seções não tratadas.
[00353] As células-tronco são distintas no fenótipo das células diferenciadas e podem expressar PS não apoptoticamente para evitar a indução de respostas imunes. As células-tronco dos trofoblastos (TSCs) diferenciam-se em vários tipos de trofoblastos na cultura. As TSCs são preparadas a partir de raspagens uterinas de camundongo cultivadas na presença de fator de crescimento de fibroblastos, activina e heparina. As TSCs se diferenciam espontaneamente em células gigantes quando esses fatores são removidos do meio (Figura 13). As TSCs se mancharam com PrS, enquanto os trofoblastos diferenciados derivados dessas células em cultura não mancharam (Figura 14). Também se determinou que a PrS é internalizada em células-tronco sem indução apoptótica. Esse resultado confirma as observações feitas em linhagens de células tumorais, nas quais a apoptose foi induzida. Sem indução de apoptose, foi observado manchamento mínimo nas células tumorais. Para testar a internalização em células-tronco, empregou-se células-tronco mesenquimais (MSCs) e TSCs. As MSCs foram preparadas a partir da medula óssea de camundongo. A medula óssea de camundongos foi lavada e cultivada por 6 dias na ausência de fatores de crescimento. Durante essa incubação, as MSC e as células-tronco hematopoiéticas (HSCs) se replicam, enquanto os fibroblastos aderem, mas não se multiplicam além de algumas gerações. Após 6 dias, uma monocamada é visível. Após a passagem por tripsinização, as MSCs aderentes são mantidas, enquanto as HSCs, que crescem em suspensão, são perdidas. Os fibroblastos não persistem devido à ausência de fatores de crescimento e também não são retidos. Assim, esse procedimento simples resulta em uma população quase homogênea de MSCs. Para confirmar a identidade dessas células, tratou-se as culturas separadamente com dexametasona e fosfato de glicerol (para induzir diferenciação em osteoblastos) ou dexametasona e indometacina (para induzir diferenciação em adipócitos). Os resultados são mostrados na Figura 15. Em resposta aos tratamentos acima, as células diferenciadas mostraram a aparência das respectivas células. Os adipócitos continham grandes vesículas gordurosas e os osteoblastos eram escuros com colágeno intracelular e mineralização distintos.
[00354] Para avaliar o padrão de manchamento subcelular, as MSC não diferenciadas foram manchadas com PrS e anexina, bem como o reagente de manchamento nuclear Hoechst, e observadas em microscopia confocal. Os resultados das observações são mostrados na Figura
16. A PrS foi rapidamente internalizada. No caso de MSC, cerca de 1 em 20 células manchadas com PrS, consistente com dados anteriores, no entanto, a porcentagem manchada exata não foi determinada. A morfologia das MSCs é heterogênea, e as células secretam material abundante no meio, algumas das quais aderem à superfície da lâmina da câmara, resultando em plano de fundo em algumas das imagens. No entanto, os dados mostram claramente a PrS internalizada, dentro de 5 minutos após a adição, e o anexina na superfície. As TSCs também foram manchadas e imageadas, conforme foi feito com as MSCs. As observações confirmam a internalização também nessas células, o que também ocorre dentro de 5 minutos após a adição da proteína. Os resultados são mostrados na Figura 17. As TSCs são morfologicamente bastante variáveis e podem ser multinucleadas na ausência de diferenciação, conforme pode ser visto na Figura. Como nas MSCs, essas células primárias liberam material abundante no meio, algumas das quais estabelecidas como vesículas extracelulares (dados anteriores). Esse material novamente dificulta o imageamento. Algumas EVs mancham com anexina e não PrS, e esse fenômeno pode ser visto em TSCs, na Figura 18. Nessa imagem de um agrupamento de TSCs, as vesículas liberadas pelas células são manchadas com anexina e não PrS, que é internalizada. Esses padrões levantam questões interessantes sobre a especificidade e os alvos de ligação da PrS e da anexina. As duas proteínas têm a reputação de se ligar a PS. No entanto, a ligação diferencial a EVs, bem como padrões de localização subcelular distintos, sugerem que as mesmas não se ligam exatamente da mesma maneira. Outros estudos serão necessários para estabelecer a base dessa distinção, que pode ser significativa. Também se observou o manchamento com PrS da linhagem celular progenitora neural C17.2 (Figura 19), que é uma linhagem celular transformada com capacidade para diferenciação in vitro em astrócitos e outras células neuronais. Aproximadamente 5% dessas células transformadas foram manchadas, embora essa porcentagem seja uma estimativa. Notavelmente, a entrada em TSCs ocorreu mesmo quando as células foram resfriadas a 4 °C (Figura 20). No entanto, deve-se notar que a câmara não pode ser continuamente resfriada uma vez colocada no microscópio. No entanto, a temperatura não poderia ter aumentado muito dentro do período de 5 minutos do procedimento de imageamento. Esse resultado, embora provocador, deve ser claramente repetido sob condições mais controladas. Se a constatação fosse substanciada, o mecanismo teria que ser realmente muito interessante.
[00355] Obteve-se sucesso no manchamento de células-tronco hematopoiéticas (HSC) com PrS. Com o uso de citometria de fluxo, determinou-se que a HSC é manchada com PrS, e observou-se a internalização de PrS nessas células com microscopia confocal. As HSCs foram identificadas e isoladas com o uso de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS). As células foram identificadas na medula óssea como células negativas para linhagem, positivas para SCA/c-kit (Figura 21). Estas foram, então, manchadas com FITC-PrS. Duas populações de HSC, a curto e a longo prazo, podem ser identificadas com o padrão de manchamento do marcador SLAM. Os marcadores CD48, CD150, CD229 e CD244 da SLAM (Molécula de Ativação de Linfócitos de Sinalização) mancham diferencialmente a HSC com padrões distintos, de modo que o manchamento positivo do padrão SLAM seja indicativo da capacidade de se autorrenovar e diferenciar, enquanto a HSC negativa para o padrão SLAM só pode se diferenciar. A PrS manchou um subconjunto de HSC a longo prazo (Figura 22) e também de HSC a curto prazo (Figura 23). As células mostradas são negativas para iodeto de propídio (PI), o que significa que todas são células vivas. Esse resultado confirma experimentos anteriores que demonstram que um subconjunto de células-tronco é manchado com PrS sem a indução de apoptose.
[00356] Em seguida, prosseguiu-se para o teste quanto à internalização de PrS em HSC. Esse experimento foi complicado por muitos fatores. Talvez o mais difícil tenha sido a sobrevivência na cultura de HSC, que morre em grande número em meio durante a noite. Portanto, foi necessário cronometrar o experimento para que a análise por citometria de fluxo e a microscopia confocal ocorressem no mesmo dia. Além disso, as células não são aderentes, tornando a microscopia abaixo do ideal. Para tornar a microscopia mais eficiente, as células foram ressuspensas em uma pequena gota de meio. Finalmente, precisou-se garantir que as células manchadas com PrS analisadas por microscopia ainda estivessem vivas. Muitas HSC morreram durante os processos de análise e isolamento. Portanto, PI foi adicionado e escaneado, além da mancha nuclear Hoescht, e um outro canal foi empregado. A presença de núcleos de PI-brilhantes indicou células mortas. Apesar dessas dificuldades e das complexidades de temporização, pode-se realizar o experimento e confirmar a internalização do PrS em HSC vivas (Figura 24). As células foram confirmadas como vivas por carência de manchamento de PI nuclear. No entanto, algumas células estavam mortas ou morrendo, conforme mostrado na Figura 25. Apesar da complexidade e duração do experimento mostrado, os resultados mostram internalização.
[00357] Finalmente, na Figura 26, realizou-se estudos preliminares de toxicidade em TSC e determinou-se que, em uma concentração de 135 µg/ml, a viabilidade foi reduzida apenas em uma extensão muito mínima após 30 minutos, de 78% para 74%, em relação a PBS. Considerando que, nesse nível, 10% do volume de cultura era uma solução contendo PrS, esse resultado confirmou as observações qualitativas de que a PrS é basicamente não-tóxica para as células-tronco, e a menor toxicidade observada poderia muito bem ser devido à contaminação do conteúdo. da própria preparação. Concentrações mais baixas de PrS não mostraram efeito na viabilidade. O nível mais alto de proteína testado foi mais de 1.000 vezes a concentração usada para o manchamento. Embora estudos completos de toxicidade, que não faziam parte formalmente deste projeto, exijam testes muito mais extensos, em nossas mãos o PrS exibe muito pouca toxicidade.
SUMÁRIO
[00358] Os resultados acima mostraram que a PrS é rapidamente internalizada em um arranjo de células que expressam PrS, incluindo células-tronco de muitos tipos, o que sugere que a PrS possui características únicas passíveis de manipulação com o objetivo de desenvolver um agente terapêutico. Além disso, a diferença de especificidade entre PrS e anexina, tal como visto nas Figuras 3 e 7, sugere que a ligação em si é diferente entre essas duas proteínas. O simples fato de a anexina ser um tetrâmero e a PrS ser um monômero não pode explicar essas diferenças, e esses dados sugerem que algum outro componente na superfície celular pode estar envolvido na ligação de PrS. O mecanismo de ligação, a especificidade e a internalização do PrS, bem como a capacidade de manipulação modular, fornecem inúmeras possibilidades. EXEMPLO 2
[00359] As células-tronco são distintas no fenótipo de células diferenciadas e podem expressar PS não apoptoticamente para evitar a indução de respostas imunes. As células-tronco foram manchadas com uma molécula do domínio GLA da presente divulgação que compreende uma carga útil de uma identificação fluorescente, sem a indução de apoptose.
[00360] Células-tronco de trofoblastos, (Figura 14) que se diferenciam em vários tipos de trofoblastos na placenta, foram manchadas com proteína S, enquanto os trofoblastos diferenciados derivados dessas células na cultura não foram manchados. A mancha teve capacidade para distinguir entre células-tronco diferenciadas in vivo e células diferenciadas in vitro.
[00361] Esses dados mostram que as moléculas da presente divulgação podem ser empregadas para alvejar células in vivo ou em amostras ex vivo.
CONCLUSÕES
[00362] Vesículas extracelulares representam uma excelente oportunidade para o diagnóstico e tratamento de uma variedade de enfermidades. Os presentes inventores demonstraram que o domínio Gla reconhece a expressão de fosfatidilserina. Essa propriedade pode ser utilizada para: identificação de vesículas extracelulares que expressam fosfatidilserina, isolamento de vesículas extracelulares, alvejamento de vesículas extracelulares e/ou carregamento das vesículas com, por exemplo, materiais terapêuticos. Isso é surpreendente porque as vesículas extracelulares são entidades subcelulares minúsculas.
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Claims (33)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para alvejar vesículas extracelulares com fosfatidilserina exposta na superfície, sendo que o dito método é caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de introduzir uma molécula que compreende: um componente de ácido gama-carboxiglutâmico (componente GLA), sendo que o dito componente GLA compreende um domínio GLA ou um fragmento ativo do mesmo e que não compreende um domínio catalítico ativo de uma proteína GLA, em um fluido que pode compreender a vesícula extracelular.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a vesícula extracelular é um exossoma.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o exossoma tem um diâmetro na faixa de 30 nm a 100 nm.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a vesícula tem uma densidade na faixa de 1 a 1,5 g/ml, tal como 1 a 1,2 g/ml, em particular, 1,13 a 1,19 g/ml.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a vesícula compreende uma ou mais proteínas transmembranares selecionadas independentemente a partir de Lamp-1, Lamp-2, CD 13, CD86, Flotilina, Sintaxina-3, CD2, CD36, CD40, CD40L, CD41a, CD44, CD45, ICAM-1, Integrina alfa4, LiCAM, LFA-1, Mac-1 alfa e beta, Vti-IA e B, CD3 épsilon e zeta, CD9, CD18, CD37, CD53, CD63, CD81, CD82, CXCR4, FcR, GluR2/3, HLA-DM (MHC II), imunoglobulinas, componentes MHC-I ou MHC-II, TCR beta, tetraspaninas e combinações de dois ou mais dos mesmos.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a vesícula foi liberada a partir de uma célula não saudável, por exemplo, uma célula apoptótica, uma célula necrótica, uma célula cancerígena, uma célula infectada por patógenos (tal como uma célula infectada por vírus, uma célula infectada por bactérias ou células infectadas por um parasita).
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula cancerígena.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula-tronco cancerígena.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o fluido compreende uma amostra de paciente ex vivo, por exemplo, uma amostra sanguínea, fluido retirado de um cisto ou tumor, biópsia homogeneizada ou similares.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o domínio GLA ou fragmento ativo do mesmo é selecionado independentemente a partir de trombina, fator VII, fator IX, fator X, proteína C, proteína S, proteína Z, Osteocalcina, proteína de matriz GLA, GAS6, Transtirretina, Periostina, GLA 1 rico em prolina, GLA 2 rico em prolina, GLA 3 rico em prolina e GLA 4 rico em prolina.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o domínio GLA ou fragmento ativo do mesmo é proveniente da proteína S, por exemplo, compreende uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 1.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o componente do domínio GLA compreende, ainda, um domínio EGF, por exemplo, um domínio EGF de ligação ao cálcio.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o construto compreende um domínio EGF selecionado a partir de trombina, fator VII, fator IX, fator X, proteína C, proteína
S, proteína Z, Osteocalcina, proteína de matriz GLA, GAS6, Transtirretina, Periostina, GLA 1 rico em prolina, GLA 2 rico em prolina, GLA 3 rico em prolina e GLA 4 rico em prolina.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o construto compreende um domínio EGF selecionado a partir da proteína S.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o componente GLA compreende uma sequência mostrada na SEQ ID NO: 6 ou um derivado da mesma, em que a etiqueta His está ausente, em particular, a SEQ ID NO: 6.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o componente do domínio GLA compreende, ainda, um domínio Kringle.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o domínio Kringle é proveniente de uma proteína selecionada a partir do grupo compreendendo o fator de transcrição de ativação 2 (ATF); fator XII (F12); trombina (F2); proteína de ligação a hialuronano 2 (HABP2); fator de crescimento de hepatócitos (HGF); ativador do fator de crescimento de hepatócitos (HGFAC); proteína Kremen 1 (KREMEN1); KREMEN2; lipoproteína (a) (LPA); LPAL2; proteína estimuladora de macrófagos (MSP ou MST1); proteína de interação com fosfoinositídeo-3-quinase 1 (PIK3IP1); ativador de plasminogênio tecidual (PLAT); uroquinase (PLAU); plasmina (PLG); PRSS12; receptor transmembranar da proteína tirosina-quinase ROR1 (ROR1); e receptor transmembranar da proteína tirosina-quinase ROR2 (ROR2).
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que o componente GLA está ligado a uma carga útil.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o componente GLA é conjugado com a carga útil.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o componente GLA faz parte de uma proteína de fusão.
21. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a carga útil compreende uma identificação detectável.
22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a identificação é selecionada a partir de uma proteína fluorescente, incluindo uma sonda fluorescente (tal como corante de rodamina, FITC, FAM, CY5), biotina, uma enzima, uma etiqueta (por exemplo, uma etiqueta HIS, etiqueta FLAG, etiqueta myc), radionuclídeos (particularmente radioiodeto, radioisótopos, tais como 99mTc), identificações luminescentes ou compostos que podem ser detectados por espectroscopia de RMN ou ESR, incluindo quando a identificação detectável está em sinalizadores moleculares.
23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que a carga útil é uma microesfera, uma placa ou uma etiqueta, por exemplo, uma microesfera isolável, tal como uma microesfera magnética.
24. Método, de acordo com as reivindicações 18 a 23, caracterizado pelo fato de que a carga útil está ligada ao componente GLA por meio de um ligante.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o ligante é clivável.
26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, sendo que o método é caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa adicional de fornecer uma população enriquecida das vesículas.
27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, sendo que o caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de isolar as vesículas.
28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que a molécula que compreende o componente GLA é um terapêutico.
29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 21 e 29, caracterizado pelo fato de que a carga útil compreende um fármaco, um agente quimioterapêutico, um peptídeo (incluindo peptídeos grampeados) ou terapêutico biológico, por exemplo, um fármaco antiviral, fármaco antibacteriano, agente antiparasitário, fármaco anticâncer, uma terapia anticâncer ou um vírus oncolítico ou vetor viral.
30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, 29 e 30, caracterizado pelo fato de que a carga útil compreende uma toxina, um polímero (por exemplo, polímeros sintéticos ou de ocorrência natural), proteínas biologicamente ativas (por exemplo, enzimas, outros anticorpos ou fragmentos de anticorpos), um fármaco (molécula pequena (entidade química)), c, ácidos nucleicos e fragmentos dos mesmos (por exemplo, DNA, RNA e fragmentos dos mesmos) um agente quelante de metal, nanopartículas ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos.
31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22 e 24 a 30, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a molécula que compreende o componente GLA e a carga útil a um paciente com câncer.
32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o câncer é um câncer epitelial, por exemplo, câncer colorretal, câncer testicular, câncer de fígado, câncer do trato biliar, câncer de próstata, câncer de pâncreas, câncer de mama, câncer de ovário, câncer de colo de útero, câncer de útero, câncer gástrico, câncer de esôfago, câncer de tireoide, câncer renal, câncer de bexiga, câncer cerebral, câncer de cabeça e pescoço ou câncer de pulmão ou, alternativamente, o câncer pode ser um câncer hematológico, por exemplo, leucemia, linfoma, mieloma e doenças crônicas mieloproliferativas, tais como AML, CML, ALL e CLL.
33. Vesícula ou população de vesículas caracterizada pelo fato de que é obtida a partir de um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32.
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