ES2565543T3 - Construcciones de fusión a Fc de unión a fosfatidilserina y su uso terapéutico - Google Patents

Construcciones de fusión a Fc de unión a fosfatidilserina y su uso terapéutico Download PDF

Info

Publication number
ES2565543T3
ES2565543T3 ES06719706.1T ES06719706T ES2565543T3 ES 2565543 T3 ES2565543 T3 ES 2565543T3 ES 06719706 T ES06719706 T ES 06719706T ES 2565543 T3 ES2565543 T3 ES 2565543T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
agents
cells
tumor
virus
binding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES06719706.1T
Other languages
English (en)
Inventor
Philip E Thorpe
Troy A Luster
Steven W. King
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Texas System
Avid Bioservices Inc
Original Assignee
Peregrine Pharmaceuticals Inc
University of Texas System
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Peregrine Pharmaceuticals Inc, University of Texas System filed Critical Peregrine Pharmaceuticals Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2565543T3 publication Critical patent/ES2565543T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/775—Apolipopeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6831—Fungal toxins, e.g. alpha sarcine, mitogillin, zinniol or restrictocin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6891—Pre-targeting systems involving an antibody for targeting specific cells
    • A61K47/6897—Pre-targeting systems with two or three steps using antibody conjugates; Ligand-antiligand therapies
    • A61K47/6898—Pre-targeting systems with two or three steps using antibody conjugates; Ligand-antiligand therapies using avidin- or biotin-conjugated antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0002—General or multifunctional contrast agents, e.g. chelated agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)

Abstract

Una construcción que se une a fosfatidilserina, en la que dicha construcción comprende una región Fc de anticuerpo conectada operativamente a dos polipéptidos de ß2-glucoproteína I (ß2GPI); en la que cada uno de dichos polipéptidos de ß2GPI comprende al menos un dominio V intacto de ß2GPI, y en la que dicho dominio V intacto se une a fosfatidilserina cuando se conecta a dicha región Fc.

Description

imagen1
imagen2
imagen3
imagen4
imagen5
imagen6
imagen7
imagen8
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Los agentes de encubrimiento eficaces incluyen una serie de polímeros hidrófilos biocompatibles, tales como poliaminas, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, ácido poliláctico-poliglicólico (PLGA), polipéptidos y materiales relacionados. Un agente de encubrimiento preferido es el polietilenglicol (PEG), donde los liposomas furtivos resultantes se denominan “liposomas PEGilados”.
Los liposomas preferidos de la invención son liposomas furtivos o PEGilados en los que al menos una primera construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención, o un conjugado de los mismos, está asociado operativamente con la membrana externa del liposoma, preferentemente donde el liposoma está “recubierto” con el mismo.
Los liposomas particularmente preferidos son liposomas tales como “recubiertos” y encubiertos o PEGilados en los que al menos un primer agente terapéutico, tal como un agente antivírico o preferentemente un agente anticanceroso, está asociado operativamente con el liposoma o disperso en la formulación liposomal. Preferentemente, el agente terapéutico, antivírico o anticanceroso está asociado operativamente con, o se mantiene dentro, del núcleo central del liposoma. Son agentes anticancerosos ejemplares los radionúclidos y agentes quimioterapéuticos, tales como fármacos antitubulina, docetaxel y paclitaxel, siendo el docetaxel el preferido.
Otras realizaciones de la invención se refieren a kits que comprenden, en al menos una primera composición o recipiente, al menos una primera construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención, o un conjugado de los mismos, en combinación con una cantidad biológica o terapéuticamente eficaz de al menos un segundo agente, componente o sistema biológico.
Los “segundos agentes, componentes o sistemas biológicos” no están limitados a agentes terapéuticos o de diagnóstico. Por ejemplo, los segundos agentes, componentes o sistemas biológicos pueden comprender componentes para la modificación de la construcción y/o para conectar otros agentes. Ciertos segundos agentes, componentes o sistemas biológicos preferidos son profármacos o componentes para fabricar y usar profármacos, incluyendo componentes para fabricar el propio profármaco y componentes para adaptar las construcciones de la invención para que actúen en dichas realizaciones de profármaco o ADEPT.
El al menos un “segundo agente, componente o sistema de diagnóstico” puede ser un agente, componente o sistema de diagnóstico, directa o indirectamente detectable mediante un ensayo de diagnóstico in vitro. Los “agentes indicadores directamente detectables in vitro” incluyen radiomarcadores, agentes indicadores detectables por inmunofluorescencia y luciferasa. Los “agentes indicadores indirectamente detectables in vitro” actúan junto con uno
o más agentes exógenos adicionales, tales como enzimas detectables que producen un producto coloreado cuando entran en contacto con un sustrato cromogénico. Estos incluyen “anticuerpos secundarios”, que están conectados a un agente detectable directo o indirecto, tal como un radiomarcador o enzima, y “sistemas de detección de anticuerpos secundarios y terciarios” en los que el anticuerpo terciario está conectado al agente detectable.
Son kits de diagnóstico preferidos de la invención los que comprenden un agente, componente o sistema de diagnóstico detectable por diagnosis o formación de imágenes in vivo. Una ventaja de las realizaciones de formación de imágenes de la invención es que la misma construcción puede usarse para formar imágenes y para el tratamiento. Por lo tanto, la invención proporciona kits y medicamentos que comprenden:
(a)
una primera composición farmacéutica que comprende una cantidad, eficaz desde el punto de vista del diagnóstico, de una construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención, conectada operativamente a un marcador o agente de diagnóstico detectable; y
(b)
una segunda composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención, preferentemente una cantidad terapéuticamente eficaz de la misma construcción, receptorcuerpo o betacuerpo usado en la primera composición farmacéutica.
Para su uso en realizaciones terapéuticas, los kits comprenderán “al menos un segundo agente terapéutico”. Preferentemente, dichos kits comprenden una cantidad biológica o terapéuticamente eficaz combinada de al menos los dos agentes especificados, tales como cantidades combinadas eficaces para inhibir la proliferación o replicación vírica, o para tratar una enfermedad tal como un cáncer o un infecciones víricas.
En términos del tratamiento de cánceres, los kits de la invención incluyen anticuerpos para su uso en combinación con profármacos y ADEPT. En dichas composiciones, la construcción, el receptorcuerpo o betacuerpo se “modifica para proporcionar una capacidad de conversión o enzimática”. Preferentemente, la construcción, el receptorcuerpo o betacuerpo se asocia operativamente con, preferentemente, se une covalentemente o se conjuga con, al menos un primer agente o enzima de conversión capaz de convertir al menos un profármaco en la forma activa del fármaco.
La construcción enzimática o conjugada con enzimas, el receptorcuerpo o betacuerpo se combinará con una formulación inicialmente distinta del “profármaco”. El profármaco será una forma inactiva o débilmente activa de un fármaco que se convierte en la forma activa del fármaco tras el contacto con la capacidad enzimática, función de conversión o enzima asociada con la construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención.
10 5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Por consiguiente, se proporcionan kits que comprenden, preferentemente en composiciones y/o en envases distintos:
(a)
una cantidad biológicamente eficaz de al menos una primera construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención, donde la construcción, receptorcuerpo o betacuerpo está asociada operativamente con, ligada covalentemente o conjugada con, al menos una primera enzima; y
(b)
una cantidad biológicamente eficaz de al menos un primer profármaco sustancialmente inactivo que se convierte en un fármaco sustancialmente activo mediante la enzima asociada con, ligada a o conjugada con, la construcción, receptorcuerpo o betacuerpo.
Las enzimas adecuadas que escinden un profármaco sustancialmente inactivo para liberar un fármaco sustancialmente activo incluyen arilsulfatasa, serratia proteasa, termolisina, subtilisina, una carboxipeptidasa, una catepsina, D-alanilcarboxipeptidasa, β-galactosidasa, neuraminidasa, β-lactamasa, penicilina amidasa y citosina desaminasa.
Otros agentes distintos de los profármacos, el al menos un segundo agente anticanceroso puede ser cualquiera de los segundos agentes anticancerosos descritos anteriormente en relación con las composiciones anticancerosas combinadas de la invención. Para tratar las infecciones víricas, el al menos un segundo agente antivírico también puede ser cualquiera de los segundos agentes antivíricos descritos anteriormente en relación con las composiciones antivíricas combinadas de la invención. Sin embargo, los “kits” pueden comprender los al menos dos agentes mencionados “en combinación, pero por separado”, proporcionando de esta manera incluso más flexibilidad en la selección de los agentes.
Por tanto, los kits de la invención pueden comprender cantidades biológica o terapéuticamente eficaces combinadas de al menos los dos agentes especificados dentro de un solo envase o medio de envase, o dentro de distintos envases o medios de envase. Los kits también pueden comprender instrucciones para usar los agentes biológicos y terapéuticos incluidos en los mismos. También pueden incluirse en combinación componentes de formación de imágenes, pero por separado, con los kits terapéuticos.
Tratamiento de Tumores y Métodos Relacionados: la presente invención proporciona diversos usos para una construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención, o un conjugado de los mismos. En relación a todos los métodos, los términos “un” y “uno(a)” se usan para hacer referencia a “al menos un, uno(a)”, “al menos un, uno(a) primer(o) (a)”, “uno(a) o más” o “una pluralidad” de etapas en los métodos mencionados, excepto cuando se indique específicamente. Esto es particularmente relevante para las etapas de administración en los métodos de tratamiento. De esta manera, no solo pueden emplearse diferentes dosis con la presente invención, sino diferentes números de dosis, por ejemplo, pueden usarse inyecciones o inhalaciones, hasta e incluyendo múltiples inyecciones o inhalaciones.
Se proporcionan diversos métodos y usos in vitro útiles que tienen implicaciones biológicas importantes. Por tanto se proporcionan métodos de, y usos en, la unión de fosfatidilserina, que generalmente comprenden poner en contacto de manera eficaz una composición que comprende fosfatidilserina con al menos una primera construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención, o un conjugado de los mismos. La “puesta en contacto” se realiza en condiciones eficaces para permitir la formación de complejos unidos, y para detectar cualquiera de los complejos así formados.
Los métodos de detección y usos pueden utilizarse en relación con muestras biológicas, por ejemplo, en diagnóstico para apoptosis, tumores y células infectadas con virus, y también se proporcionan kits de diagnóstico basados en los mismos. Estos métodos y kits proporcionan usos específicos y convincentes para las construcciones, receptorcuerpos, betacuerpos y conjugados de la presente invención. Por ejemplo, actualmente la anexina V se usa en métodos y kits para detectar células apoptóticas. Sin embargo, la anexina V se une a fosfatidiletanolamina así como a fosfatidilserina, mientras que las construcciones, receptorcuerpos y betacuerpos y conjugados de la presente invención se unen a fosfatidilserina con unión no significativa, o preferentemente no detectable, a fosfatidiletanolamina. Por tanto, las construcciones de la invención están más capacitadas para poder detectar específicamente fosfatidilserina en métodos de detección y en ensayos de diagnóstico.
Adicionalmente la invención proporciona muchos métodos y usos útiles in vivo. Por ejemplo, métodos para dirigirse al sistema vascular de tumores, formación de imágenes de tumores y tratamiento basado en la localización de fosfatidilserina, que es un marcador direccionable accesible y estable del sistema vascular de tumores. Las construcciones, receptorcuerpos y betacuerpos de la invención y conjugados de los mismos, se localizan específicamente en el sistema vascular de tumores sólidos después de la administración a un animal con un tumor. Por tanto, la translocación de la fosfatidilserina a la superficie de las células endoteliales vasculares tumorales se produce, al menos en una parte significativa, independientemente de la apoptosis y muerte celular completas, de tal manera que la fosfatidilserina se expone en células endoteliales vasculares morfológicamente intactas.
Los métodos y usos pueden realizarse in vitro e in vivo, encontrándose, en el último caso, los tejidos o las células en un animal y administrándole, al mismo, la construcción, el receptorcuerpo o betacuerpo de la invención, o sus conjugados. Cuando los tejidos o las células se mantienen ex vivo, la presente invención tiene utilidad en programas
11
imagen9
(a) la formación de una imagen de un tumor administrando a un animal o a un paciente que tiene un tumor, una cantidad mínima o eficaz, desde el punto de vista del diagnóstico, de al menos una primera construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención, conectado operativamente a un marcador detectable o a un agente de diagnóstico, formando de este modo una imagen detectable del tumor; y
5 (b) posteriormente administrar al mismo animal o paciente una cantidad terapéuticamente optimizada o eficaz de al menos una primera construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención, o un conjugado de los mismos, causando de este modo un efecto antitumoral.
Dentro de los métodos de tratamiento del cáncer de la invención, ésta proporciona adicionalmente métodos de tratamiento con profármacos, que generalmente comprenden:
10 (a) administrar a un animal o a un paciente con un tumor una primera composición farmacéutica que comprende una primera construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención, asociado operativamente con, ligado mediante enlace covalente, o conjugado con, al menos una primera enzima; en la que la construcción, receptorcuerpo o betacuerpo se localiza en el tumor después de la administración y
15 (b) posteriormente, después de un periodo de tiempo eficaz, administrar al animal o al paciente, al menos una segunda composición farmacéutica que comprende una cantidad biológicamente eficaz de al menos un profármaco sustancialmente inactivo; en el que el profármaco se convierte en un fármaco sustancialmente activo mediante la enzima asociada con, ligada a o conjugada con, la construcción, receptorcuerpo o betacuerpo localizado en el tumor.
20 La presente invención proporciona una serie de métodos de combinación para el tratamiento del cáncer, que comprende administrar a un animal o a un paciente con cáncer una cantidad combinada terapéuticamente eficaz de al menos una primera construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención, o un conjugado de los mismos, y al menos un segundo agente terapéutico o anticanceroso distinto.
En términos generales, el al menos un segundo agente anticanceroso puede administrarse al animal o al paciente
25 antes, durante o después de la administración de la construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención, o conjugado de los mismos. El al menos un segundo agente anticanceroso puede administrarse al animal o al paciente “sustancialmente de manera simultánea” con la construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención, o conjugado de los mismos; tal como a partir de una sola composición farmacéutica o a partir de dos composiciones farmacéuticas administradas estrechamente.
30 Como alternativa, el al menos un segundo agente anticanceroso puede administrarse al animal o al paciente a un tiempo secuencial con respecto a la administración de la construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención,
o conjugado de los mismos. “A un tiempo secuencial”, como se usa en el presente documento, significa “escalonado”, de tal manera que el al menos un segundo agente anticanceroso se administra al animal o al paciente en un tiempo distinto a la administración de la construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención, o
35 conjugado de los mismos.
En la administración secuencial, los dos agentes se administran en tiempos eficazmente separados para permitir que los dos agentes ejerzan sus efectos terapéuticos respectivos, es decir, se administran a “intervalos de tiempo biológicamente efectivos”. El al menos un segundo agente anticanceroso puede administrarse al animal o al paciente a un tiempo biológicamente eficaz antes de la construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención, o
40 conjugado de los mismos, o a un tiempo biológicamente eficaz posterior al del agente terapéutico.
Cualquier agente terapéutico o anticanceroso puede usarse como el segundo agente terapéutico o anticanceroso en los métodos de tratamiento del cáncer combinados de la invención, incluyendo cualquiera de los agentes terapéuticos o anticancerosos descritos anteriormente en relación con las composiciones anticancerosas de la invención. Los agentes preferidos son aquellos que complementan o potencian los efectos terapéuticos de la
45 construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención, o conjugado de los mismos, tales como agentes potenciadores de la permeabilidad vascular, agentes antiangiogénicos, agentes inductores de la apoptosis, agentes inductores del flujo de calcio, citocinas inflamatorias, anticuerpos e inmunotoxinas contra células tumorales y células tumorales necróticas, agentes quimioterapéuticos de la Tabla E o Tabla F, una combretastina, doxorrubicina, etopósido y actinomicina-D.
50 El docetaxel es un agente particularmente preferido para su uso en terapia de combinación. El docetaxel puede administrarse por separado en la construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención, o conjugado de los mismos, bien antes o después. En cuanto a la administración simultánea, el docetaxel puede proporcionarse en formulaciones distintas o en las mismas formulaciones, opcionalmente dentro de un liposoma o liposoma furtivo, y preferentemente dentro del núcleo de un liposoma furtivo recubierto con una construcción, receptorcuerpo o
55 betacuerpo de la invención.
Tratamiento de Infecciones víricas: en otra realización general, la invención proporciona adicionalmente una nueva clase importante de composiciones y su uso en métodos para inhibir la replicación, infección y propagación de
13 5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
virus para su uso en el tratamiento de infecciones víricas y enfermedades. Estos métodos se basan en el uso de una construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención, ya sea conjugado o no con un agente antivírico. Cabe destacar que, una construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención ejercerá un efecto antivírico sin conexión a ningún agente adicional. Si se desea la conexión a agentes adicionales, los agentes citotóxicos y otros agentes serán eficaces en el tratamiento antivírico, así como agentes antivíricos clásicos. Dichas construcciones y conjugados son por tanto ampliamente aplicables en el tratamiento de una serie de infecciones víricas y enfermedades asociadas.
En un primer caso, los métodos antivíricos de la invención se refieren a poner en contacto una composición que comprende, o poblaciones de células o tejidos que contienen o que se sospecha que contienen, una célula infectada por virus, con una cantidad biológicamente eficaz de al menos una primera construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención, o un conjugado de los mismos. La célula infectada por virus es preferentemente una célula eucariota, tal como en la célula animal y preferentemente una célula de mamífero o de ser humano.
Los usos antivíricos pueden realizarse in vitro e in vivo. En las realizaciones in vitro, los métodos tienen importantes utilidades. Por ejemplo, en los programas de descubrimiento de fármacos para el desarrollo de fármacos antivíricos
o combinaciones de los mismos, así como en la delineación de información adicional sobre infección, replicación y propagación de virus. También pueden usarse métodos antivíricos in vitro en la eliminación de virus de muestras biológicas, tales como poblaciones de células y cultivos de tejidos para su uso en laboratorio, de muestras, tejidos, semillas, partes de plantas y plantas para uso agrícola y de muestras de sangre y de tejidos para uso terapéutico.
En los métodos in vivo, cuando las células, poblaciones o tejidos se encuentran en un animal, la construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención, o un conjugado de los mismos, se administra al animal como una terapia antivírica. Una construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención, o un conjugado de los mismos, puede unirse a la fosfatidilserina expuesta en la superficie de las células infectadas con virus, o puede unirse a la fosfatidilserina expuesta en la superficie de las partículas víricas.
En todos los casos, las composiciones, métodos y usos inhiben una o más etapas o fases necesarias para una infección vírica productiva o en curso, incluyendo la inhibición de la entrada de virus. Preferentemente, las composiciones, métodos y usos inhiben la replicación y/o propagación de virus, tal como inhibiendo una o más etapas de transcripción, traducción, ensamblaje, empaquetamiento y/o salida de virus en, o a partir de, una célula hospedadora infectada, tal como una célula de mamífero o de ser humano. La invención por lo tanto se limita preferentemente o se confina sustancialmente a infecciones víricas en células y poblaciones de células inicialmente infectadas, inhibiendo o impidiendo por tanto sustancialmente la infección posterior o en curso de células o tejidos hospedadores adicionales.
Los métodos de tratamiento antivíricos de la invención se refieren preferentemente a administrar, a un animal o a un paciente que tiene, o que se sospecha que tiene, o que tiene un riesgo a desarrollar, una infección vírica o enfermedad asociada, una cantidad biológicamente eficaz de al menos una primera construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención, o un conjugado de los mismos. Los conjugados pueden conectarse operativamente a inhibidores de ATPasa de tipo V, tales como salicilihalamida, concanamicina o bafilomicina; a un inhibidor de la síntesis de proteínas, tal como psimberina, pederina, irciniastatina A; a una toxina de ricina, gelonina, abrina, difteria, pseudomonas o tosferina; o a al menos un segundo agente antivírico distinto. Los agentes antivíricos adecuados para la conexión incluyen los expuestos en la Tabla G, tales como AZT o cidofovir.
Dado que la invención inhibe una o más etapas o fases necesarias para la infección productiva o en curso común a todos los virus, los métodos antivíricos y los usos de la invención, son adecuados para el tratamiento de todos los virus, tanto con envoltura como sin envoltura, incluyendo los que infectan plantas, animales, vertebrados, mamíferos y pacientes humanos. La invención es adecuada para el tratamiento de todos los virus que infectan vertebrados, como los enumerados en la Tabla H del presente documento, particularmente seres humanos, y particularmente virus que son patógenos en animales y en seres humanos. Las infecciones víricas y enfermedades asociadas y resultantes que la invención puede tratar incluyen los virus y las enfermedades que se exponen en la Tabla J, como se ilustra mediante el tratamiento de infecciones por CMV, RSV, arenavirus y VIH y las enfermedades hepatitis, gripe, neumonía, fiebre Lassa y SIDA. Se prefiere particularmente el tratamiento de virus con envoltura.
Los métodos de tratamiento antivíricos de la invención también pueden usarse en combinación con otros agentes terapéuticos o de diagnóstico. Los métodos de tratamiento combinados comprenden administrar a un animal o a un paciente con una infección vírica una cantidad combinada, terapéuticamente eficaz, de al menos una primera construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención, o un conjugado de los mismos, y al menos un agente terapéutico o antivírico, segundo, distinto.
El al menos un agente antivírico “segundo, distinto” es en referencia a la construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención, o un conjugado de los mismos, que es el “primer” agente antivírico. El al menos un segundo agente antivírico puede administrarse al animal o al paciente durante la administración de, o sustancialmente de manera simultánea con, el primer agente antivírico de la invención; o antes o después, es decir, secuencial a la administración del primer agente antivírico de la invención.
14 5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Cualquier agente terapéutico o agente antivírico puede usarse como el segundo agente terapéutico o antivírico en los métodos de tratamiento antivíricos combinados de la invención, incluyendo cualquiera de los agentes antivíricos descritos anteriormente en relación con los conjugados antivíricos, composiciones y kits de la invención.
Los métodos y usos de tratamiento antivíricos y para el cáncer anteriores a menudo implicarán la administración, por vía sistémica, de una composición farmacéuticamente eficaz al animal o paciente, tal como por inyección transdérmica, intramuscular, intravenosa y similar. Para el tratamiento de infecciones víricas, particularmente infecciones víricas respiratorias, la administración en el pulmón es otra realización preferida, y puede realizarse usando un aerosol. Sin embargo, se aceptará cualquier vía de administración que permita al agente terapéutico localizarse en el sitio del tumor o infección vírica. Por lo tanto, otras vías de liberación adecuadas incluyen la vía oral, rectal, nasal, tópica y vaginal. Para los usos y métodos del tratamiento de la artritis, por ejemplo, puede emplearse la administración intrasinovial, como se describe para otros agentes inmunológicos en la Patente de Estados Unidos nº 5.753.230, específicamente incorporada en el presente documento por referencia. Para afecciones asociadas con los ojos, se contemplan las formulaciones oftálmicas y la administración oftálmica.
“Administración”, como se usa en el presente documento, significa suministrar o liberar una construcción receptorcuerpo o betacuerpo de la invención, o un conjugado de los mismos, en una o más cantidades y durante uno
o más periodos de tiempo eficaces para ejercer un efecto terapéutico. La administración pasiva de los agentes terapéuticos proteicos es generalmente la preferida, en parte, por su sencillez y reproducibilidad.
Sin embargo, en el presente documento, el término “administración” se usa con referencia a cualquiera y a todos los medios mediante los cuales se libera el agente terapéutico. Por lo tanto, “administración” incluye el suministro de células que produce la construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención, o conjugados de los mismos, de una manera eficaz. En dichas realizaciones, puede ser deseable formular o empaquetar las células en una membrana, estructura o dispositivo implantable, selectivamente permeable, en general uno que pueda retirarse al finalizar la terapia. La administración exógena seguirá siendo generalmente la preferida, ya que representa un método no invasivo que permite monitorizar y controlar muy de cerca la dosis.
Los métodos y usos terapéuticos de la invención también se amplían al suministro de ácidos nucleicos que codifican una construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención, o un conjugado de los mismos, de una manera eficaz para dar como resultado la expresión in vivo. Cualquier terapia génica puede emplearse, tal como liberación de ADN desnudo, de genes y vectores recombinantes, la liberación basada en células, incluyendo la manipulación ex vivo de las células del paciente y terapias similares. Pueden usarse vectores de virus, tales como los incluidos en un retrovirus recombinante, virus del herpes simple (VHS), adenovirus, adenovirus asociados (AAV, adenoassociated virus), citomegalovirus (CMV) y similares. Los liposomas y los liposomas furtivos serán los preferidos para su uso en algunas realizaciones.
Las composiciones farmacéuticas y los métodos de tratamiento de la invención emplean “cantidades terapéuticamente eficaces” de una construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención, o conjugado de los mismos. Los “efectos terapéuticos” y las “cantidades terapéuticamente eficaces” consiguientes se miden mediante diferentes parámetros en el tratamiento contra el cáncer en comparación con el tratamiento antivírico.
En el tratamiento del cáncer, las cantidades de los agentes son eficaces para destruir o destruir específicamente al menos una parte de las células tumorales, células endoteliales vasculares tumorales o intratumorales; para inducir la apoptosis o inducir específicamente la apoptosis en al menos una parte de las células tumorales, células endoteliales vasculares tumorales o intratumorales; para promover la coagulación o promover específicamente la coagulación en al menos una parte de los vasos sanguíneos tumorales o intratumorales; obstruir o destruir, u obstruir o destruir específicamente al menos una parte de los vasos transportadores de sangre del tumor; inducir la necrosis o inducir específicamente la necrosis en al menos una parte de un tumor; y/o inducir la regresión o remisión tumoral después de la administración a un animal o paciente.
En el tratamiento de infecciones víricas y enfermedades relacionadas, las cantidades de los agentes son eficaces para inhibir uno o más requisitos para la infección vírica en curso, tal como la entrada de virus, y preferentemente, la replicación, salida y propagación de virus de las células hospedadoras infectadas. Las cantidades también pueden destruir o eliminar al menos una parte de las células infectadas con virus de una manera que neutralice la replicación, propagación e infección vírica en curso. En conjunto, las cantidades de los agentes son eficaces para reducir, reducir significativamente o erradicar la infección vírica después de la administración a un animal o a un paciente.
Los términos “preferentemente” y “específicamente”, como se usan en el presente documento, significan que la construcción, el receptorcuerpo o betacuerpo de la invención, o un conjugado de los mismos, consiguen efectos anticancerosos o antivíricos que están sustancialmente confinados al sitio de la enfermedad, y no causan sustancialmente coagulación, destrucción y/o necrosis de tejidos en tejidos normales, sanos del animal o sujeto. La estructura y función de las células y de los tejidos sanos se conservan por lo tanto sustancialmente inalteradas mediante la práctica de la invención.
15 5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Breve descripción de los dibujos
Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente determinados aspectos de la presente invención. La invención puede comprenderse mejor por referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de las realizaciones específicas presentadas en esta memoria. El archivo de esta patente estadounidense contiene al menos un dibujo a color. Las copias de esta patente con uno más dibujos a color las proporcionará la oficina de patentes y marcas registradas tras efectuar su solicitud y pago de la tasa necesaria.
FIG. 1. Leucocitos se infiltran en el tumor en ratones tratados con el anticuerpo 3G4. Ratones desnudos portadores de tumores ortotópicos MDA-MB-231 se trataron 3 veces a la semana con 100 μg/dosis de anticuerpo 3G4 o con la misma dosis de un anticuerpo control del mismo isotipo. Al final del tratamiento, los animales se perfundieron y los tumores se congelaron al instante, se cortaron y se tiñeron para detectar los leucocitos. En la figura se muestra la infiltración de los leucocitos en el tumor.
FIG. 2A, FIG. 2B, FIG. 2C y FIG. 2D. Secuencias de ADN y de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, complementary determining regions) del anticuerpo 3G4 y del anticuerpo 2aG4. Se presentan las secuencias de ADN y de aminoácidos de las cadenas pesada (FIG. 2A; SEC ID Nº: 1 y SEC ID Nº: 2) y ligera (FIG. 2B; SEC ID Nº: 3 y SEC ID Nº: 4) del anticuerpo 3G4 y se muestran los sitios de restricción en las secuencias de ADN. La secuencia líder se diferencia de la proteína madura, que comienza como se muestra mediante la primera flecha en cada una de las FIG. 2A y FIG. 2B. Se exponen medios ejemplares de injerto de cada secuencia variable con una región constante humana, donde la que la primera parte de las secuencias respectivas de la región constante humana (SEC ID Nº: 7 y SEC ID Nº: 8) se muestra mediante la segunda flecha en cada una de las FIG. 2A y FIG. 2B. Las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada de IgG2a y de la cadena ligera (CK) de 3G4 se representan por SEC ID Nº: 10 y SEC ID Nº: 11, respectivamente, como se muestra en las FIG. 2C y FIG. 2D.
FIG. 3. Inhibición de la unión del anticuerpo 3G4 con PS inmovilizada usando liposomas fosfolipídicos competidores. Placas de microtitulación cubiertas con fosfolípidos se trataron con 3G4 a concentraciones que variaban de 0,016 a 33 nM en suero bovino al 10 %. El anticuerpo unido se detectó usando anti-IgG de ratón de cabra conjugado con HRP. Los ensayos de competencia con liposomas preparados a partir de diversos fosfolípidos demuestran que los fosfolípidos aniónicos pueden competir con la unión de 3G4 (6,7 nM) a PS. Las barras representan la DT de mediciones por triplicado.
FIG. 4. Unión de 3G4 a fosfolípidos. Placas de microtitulación cubiertas con fosfolípidos se trataron con 3G4 a concentraciones que variaban de 0,016 a 33 nM en suero bovino al 10 %. El anticuerpo unido se detectó usando anti-IgG de ratón de cabra conjugado con HRP. 3G4 se unió específicamente a fosfolípidos aniónicos incluyendo PS, PI, PA y CL, pero no a lípidos neutros, incluyendo PE, PC y SM.
FIG. 5A, FIG. 5B, FIG. 5C, FIG. 5D y FIG. 5E. Inducción de la unión de 3G4 a células HUVEC y MDA-MB-435 intactas mediante tratamiento con H2O2 como se muestra por FACS (FIG. 5A) e inmunohistoquímica (FIG. 5B, FIG. 5C, FIG. 5D y FIG. 5E). FIG. 5A, las células HUVEC o MDA-MB-435 se trataron con H2O2 (200 μM) durante 1 h a 37 ºC. Las células se lavaron y se separaron de los discos de cultivo con tripsina. Las células se tiñeron con 3G4 (línea continua) o con IgG3 de ratón control (BBG3) (línea discontinua) y se analizaron mediante citofluorometría usando FACS. El instrumento se seleccionó sobre células intactas (negativas a yoduro de propidio). FIG. 5A, parte superior izquierda, HUVEC; parte superior derecha, HUVEC tratadas con H2O2; parte inferior izquierda, MDA-MB435; parte inferior derecha; MDA-MB-435 tratadas con H2O2. FIG. 5B, FIG. 5C, FIG. 5D y FIG. 5E, la morfología de la unión de 3G4 a HUVEC tratadas con H2O2 no permeabilizadas, intactas, se determinó tratando células adherentes con H2O2 como anteriormente, lavando las células y tiñéndolas con 3G4 o con IgG3 de ratón control, BBG3, seguido de anticuerpo anti-IgG de ratón de cabra marcado con FITC (verde). Después, las células se fijaron con paraformaldehído y se permeabilizaron. El citoesqueleto se tiñó con faloidina marcada con rojo Texas (rojo) y los núcleos se tiñeron con tinción de contraste DAPI (azul). 3G4 se unió a regiones distintas de la membrana plasmática, que tenía el aspecto de ampollas membranosas. FIG. 5B, HUVEC teñidas con BBG3; FIG. 5C, HUVEC teñidas con 3G4; FIG. 5D, células MDA-MB-435 teñidas con BBG3; y FIG. 5E, células MDA-MB-435 teñidas con 3G4. Las células que no se trataron con H2O2 no se tiñeron con 3G4. La barra de escala representa 50 μm.
FIG. 6A, FIG. 6B, FIG. 6C y FIG. 6D. Los anticuerpos contra fosfatidilserina y fosfolípidos aniónicos hacen que los monocitos se unan a vasos sanguíneos tumorales y que los macrófagos se infiltren en tumores. Ratones SCID portadores de tumores mamarios humanos ortotópicos se trataron i.p. con 100 μg de anticuerpos control BBG3 (FIG. 6A y FIG. 6C) o con anticuerpos 3G4 (FIG. 6B y FIG. 6D) tres veces a la semana durante dos semanas. Los tumores eran MDA-MB-435 (FIG. 6A y FIG. 6B) o MDA-MB-231 (FIG. 6C y FIG. 6D). Se prepararon secciones tumorales congeladas. Se detectaron macrófagos y monocitos de ratón con anticuerpo anti M1/70 de ratón (Mac-1) de rata seguido de anti-IgG de rata marcado con FITC (verde). Los anticuerpos anti-F4/80 y anti-Fcγr dieron patrones de tinción coincidentes con anticuerpo anti M1/70. Se detectaron vasos sanguíneos con anti CD31 de ratón de hámster seguido de anti-IgG de hámster marcado con rojo Texas (rojo). Los núcleos se visualizaron con DAPI (azul). FIG. 6A, tumor de ratón tratado con BBG3 control mostrando escasa infiltración de macrófagos. FIG. 6B, tumor de ratón tratado con 3G4 mostrando abundante infiltración de macrófagos. FIG. 6C, tumor control de ratón tratado con BBG3
16 5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
mostrando la ausencia de conexión de monocitos a vasos. FIG. 6D, tumor de ratón tratado con 3G4 mostrando la conexión de monocitos a la superficie luminal del endotelio vascular tumoral (flechas). Las barras de escala en la FIG. 6A y FIG. 6B representan 50 μm y en la FIG. 6C y FIG. 6D representan 10 μm.
FIG. 7. Fases silenciosa e inflamatoria de la fagocitosis. A partir de estudios de tratamiento de tumores usando el anticuerpo 3G4, se propone que los anticuerpos, tales como 3G4, producen un bloqueo de la señalización de PS a partir de células endoteliales tumorales que expresan PS. Normalmente, la PS en las células endoteliales tumorales suprimirían las respuestas inflamatorias por macrófagos que se unen a los vasos y a las células tumorales (fase silenciosa). Cuando están presentes anticuerpos, tales como 3G4, estos se unen a PS de tal manera que el receptor de PS en el macrófago no tiene un compañero de unión. Después, el macrófago secreta TNF-α, IL-1 y otras citocinas inflamatorias que dañan directamente el endotelio tumoral y reclutan células hospedadoras adicionales en el tumor (fase inflamatoria).
FIG. 8. El fragmento F(ab’)2 del anticuerpo 3G4 es tan eficaz como 3G4 como un agente antitumoral. Los ratones se inocularon con tumores el día 1, y el día 9 se trataron con el anticuerpo 3G4, con el fragmento F(ab’)2 del anticuerpo 3G4 o con un anticuerpo control del mismo isotipo (BBG3). Los tumores en los animales de control continuaron creciendo rápidamente (■), mientras que en los ratones tratados con cualquiera de anticuerpo 3G4 (●) o con el fragmento F(ab’)2 del anticuerpo 3G4 (▼), el crecimiento del tumor se redujo significativamente, siendo el fragmento F(ab’)2 al menos tan eficaz como 3G4.
FIG. 9A y FIG. 9B. La unión de 3G4 a placas de microtitulación cubiertas con PS es dependiente de suero. FIG. 9A, el anticuerpo 3G4 se purificó de células que creían en medios que contenían suero (SCM, serum containing media) bovino o medios aséricos (SFM, serum-free media). Una placa de microtitulación se cubrió con PS y se bloqueó en OVA al 1 %. Se realizaron diluciones en serie de 3G4 en suero bovino fetal (FBS, fetal bovine serum) al 10% o en ovoalbúmina de clara de huevo de pollo (OVA) al 1 %. FIG. 9A, la placa de microtitulacion se cubrió con PS y se bloqueó en OVA al 1 %. Se realizaron diluciones en serie de SFM 3G4 en suero al 10 % de las especies de ratón, rata, ser humano y bovino, como se indica.
FIG. 10A y FIG. 10B. 3G4 se une a la proteína plasmática β2GPI (FIG. 10A) y se une al dominio II de β2GPI (FIG. 10B). FIG. 10A, una placa de microtitulación se cubrió con β2GPI humana (hβ2GPI) purificada de plasma humano y se bloqueó en OVA al 1 %. Se realizaron diluciones en serie de un anti β2GPI humano de ratón comercial (anti β2GPI o “α-β2GPI”), de SFM 3G4, y de una IgG de ratón (mlgG) de control en OVA al 1 %. FIG. 10B, los pocillos de una placa de microtitulación se cubrieron con los péptidos hβ2GPI de longitud completa (dominio I-V) recombinante
o hβ2GPI sin dominio I (II-V), sin dominios I y II (III-V), sin dominios I-III (IV-V) o sin dominios I-IV (V). La placa se bloqueó en OVA al 1 % y se realizaron diluciones en serie de SFM 3G4 en OVA al 1 %.
FIG. 11. ch3G4 y β2GPI deben estar presentes simultáneamente para unirse a células endoteliales (CE) con PS expuesta. Se incubaron células ABAE durante 30 minutos con lisofosfatidilcolina (LPC) 200 μM en DMEM + suero de ratón (MS, mouse serum) normal al 10 %, más (i) hβ2GPI purificada, (ii) ch3G4 o (iii) ch3G4 + hβ2GPI simultáneamente. Después, las células se lavaron y se incubaron durante 30 minutos con (i) ch3G4, (ii) hβ2GPI, o
(iii) DMEM + MS al 10 %, respectivamente. Finalmente, las células se lavaron, se fijaron y se tiñeron con marcadores fluorescentes para detectar la unión de ch3G4. ch3G4 y hβ2GPI se usaron a una concentración de 2 μg/ml. El área píxel de la unión de ch3G4 se cuantificó usando el programa informático MetaVue. Los valores son relativos a la unión de ch3G4 en la condición (i), que se estableció como uno.
FIG. 12A y FIG. 12B. La región de unión a lípidos de β2GPI es necesaria para mediar en la unión de ch3G4 con células endoteliales con PS expuesta. FIG. 12A, se incubaron células ABAE con ch3G4 más (i) una forma de unión no lipídica de β2GPI (hβ2GPI con muesca) o (ii) hβ2GPI intacta. Las incubaciones se realizaron en presencia o en ausencia de LPC 200 μm en DMEM + MS al 10 % durante 30 minutos. Después, las células se lavaron, se fijaron y se tiñeron con marcadores fluorescentes para detectar la unión de ch3G4. Se usó ch3G4, hβ2GPI y hβ2GPI con muesca a una concentración de 2 μg/ml. El área píxel de la unión de ch3G4 se cuantificó usando el programa informático MetaVue. Los valores son relativos a la unión de ch3G4 en la condición (i) sin LPC, que estableció como uno. Fig. 12B, los pocillos de una placa de microtitulación se cubrieron con hβ2GPI o con hβ2GPI con muesca y se bloquearon en OVA al 1 %. Se realizaron diluciones en serie de ch3G4 o de mIgG control en OVA al 1 %.
FIG. 13. El exceso de ch3G4 inhibe la unión de complejos ch3G4/β2GPI con células endoteliales con PS expuesta. Se incubaron células ABAE durante 30 minutos con LPC 200 μM, con hβ2GPI purificada 40 nm y con un título de ch3G4 en DMEM + MS al 10 %. Después, las células se lavaron, se fijaron y se tiñeron con marcadores fluorescentes para detectar la unión de ch3G4. El área píxel de la unión de ch3G4 se cuantificó usando el programa informativo MetaVue. Los valores son relativos a la unión de ch3G4 320 pM, que se estableció como uno.
FIG. 14A, FIG. 14B y FIG. 14C. La divalencia de ch3G4 es necesaria para mediar en la unión de β2GPI con células endoteliales con PS expuesta. FIG. 14A, se incubaron células ABAE durante 30 minutos con 3G4, F(ab’)2 de 3G4 o monómero Fab’ de 3G4 20 nM en presencia o en ausencia de LPC 200 μM en DMEM + FBS al 10 %. Después las células se lavaron, se fijaron y se tiñeron con marcadores fluorescentes para detectar la unión de 3G4 o de los fragmentos de 3G4. El área píxel de la unión del anticuerpo se cuantificó usando el programa informático MetaVue. Los valores son relativos a la unión de 3G4 en ausencia de LPC, que estableció como uno. FIG. 14B, células ABAE
17
imagen10
imagen11
imagen12
imagen13
imagen14
imagen15
imagen16
imagen17
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
aórticas.
Se ha observado que los agentes de direccionamiento vascular que emplean fármacos o coagulantes son muy eficaces, y algunas veces curativos, en ratones con tumores sólidos grandes (Huang et al, 1997; Nilsson et al, 2001; Patentes de Estados Unidos nº 5.660.827, 5.776.427, 5.855.866, 5.863.538, 5.965.132, 6.004.554, 6.051.230, 6.261.535, 6.093.399, 6.004.555, 5.877.289 y 6.036.955). Los autores de la presente invención proporcionan anticuerpos desnudos y agentes de direccionamiento vascular dirigidos contra fosfatidilserina para su uso en el direccionamiento del sistema vascular tumoral y en el diagnóstico y tratamiento del cáncer en seres humanos.
Aunque no es necesario un entendimiento molecular exacto de cómo funcionan los anticuerpos desnudos dirigidos contra fosfatidilserina en el tratamiento tumoral para llevar a la práctica el tratamiento, los autores de la invención han contemplado diversos mecanismos que pueden explicar la destrucción celular endotelial observada. Los mecanismos favorecidos (particularmente para el anticuerpo 3G4 descrito en el presente documento) son funciones inmunoefectoras mediadas por el dominio Fc, tales como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) y fagocitosis mediada por anticuerpos. También pueden estar implicadas la citotoxicidad mediada por células, la lisis y/o la apoptosis mediada por el complemento, la señalización celular inducida por anticuerpos y/o las alteraciones en el citoesqueleto.
La unión de anticuerpos intactos contra fosfatidilserina, particularmente 3G4, en la superficie de las células endoteliales vasculares significa que las partes Fc de los anticuerpos sobresalen hacia el interior del lumen del vaso. Como los fragmentos Fc del anticuerpo activan la ruta del complemento, la destrucción celular observada puede ser un resultado de la lisis dirigida por el complemento. Por tanto, la unión de los anticuerpos activa la cascada de coagulación dependiente del complemento, causando complejos de componentes múltiples para ensamblar y, finalmente, generar un complejo lítico que permeabilice la célula diana. La “ADCC activada por el complemento” también puede ser operativa en la destrucción, en la que el complemento se une a la célula diana cubierta con anticuerpo, y en cuyas células, tales como neutrófilos, que tienen receptores para el complemento, se produce la lisis de la célula diana.
Dado que los anticuerpos desnudos o no conjugados, incluyendo los fragmentos de unión a antígeno de los mismos, se unen a fosfatidilserina en la superficie de las células endoteliales vasculares tumorales, estos formarán un recubrimiento de anticuerpo en la superficie luminal. Este puede funcionar atrayendo células inmunoefectoras, tales como linfocitos T citotóxicos y/o linfocitos citolíticos naturales (NK, Natural Killer), que después ejercen un efecto citotóxico mediado por células en las células endoteliales vasculares.
La unión de los anticuerpos a fosfatidilserina también puede inducir la apoptosis en las células endoteliales vasculares tumorales. Aunque no se conocen informes de que la unión de anticuerpos a PS realmente induzca la apoptosis (siendo más bien la PS un marcador resultante de apoptosis), los autores de la invención consideran que este es otro mecanismo posible para los efectos antitumorales observados.
También es posible que la unión de los anticuerpos a fosfatidilserina en la superficie de las células endoteliales vasculares tumorales pueda ocasionar alteraciones en la organización del citoesqueleto de la célula.
Dado que el citoesqueleto representa una función en la organización de las membranas de superficie, y dado que la unión del anticuerpo puede alterar (o alterar adicionalmente) la membrana, la unión de anticuerpos a fosfatidilserina puede transmitir cambios en las proteínas del citoesqueleto que interaccionan con la bicapa. Ya se sabía que la organización espacial de las proteínas del citoesqueleto controla la estabilidad de la membrana y la forma de la célula, y es posible que la alteración de algún equilibrio del citoesqueleto pueda tener consecuencias de gran repercusión sobre la integridad celular.
Un mecanismo operativo adicional de la invención puede ser que la unión del anticuerpo a fosfatidilserina en la superficie de células endoteliales puede iniciar una transducción de señal mediante rutas, hasta ahora, no definidas. La unión de anticuerpo también puede alterar rutas de transducción de señal conocidas, por ejemplo, modificando la conformación y/o interacciones de los receptores de membrana, proteínas de transducción de señal, canales de membrana y similares. Las señales para la destrucción celular (apoptosis) pueden iniciarse o imitarse, y/o pueden inhibirse señales de preservación/homeostáticas.
Aunque es de interés científico, la determinación de la naturaleza exacta de la destrucción vascular conseguida por los anticuerpos desnudos contra fosfatidilserina no es necesaria para llevar a la práctica el tratamiento. Dado que se muestra que la administración de estos anticuerpos da como resultado ventajosamente efectos antitumorales específicos in vivo, el tratamiento puede utilizarse independientemente del mecanismo molecular subyacente a este fenómeno. Por tanto el uso de anticuerpos desnudos que se unen a fosfatidilserina representa un avance importante en la terapia tumoral, proporcionando ventajas en su preparación y costes.
C. Análisis detallado del anticuerpo 3G4
Como se muestra en el presente documento, 3G4 es un agente antitumoral eficaz y bien tolerado, que actúa dirigiéndose a la fosfatidilserina en vasos sanguíneos tumorales y causando efectos antitumorales mediados por células hospedadoras. Dado que la PS es la misma molécula en el ser humano y en el ratón, y que tiene la misma
26
imagen18
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
unen a complejos de lípido-proteína en suero, incluyendo complejos PS-β2GPI. No se ha observado ninguna de las manifestaciones de APS en ningún tratamiento con 3G4, a diferencia de las observadas con anticuerpos anticardiolipina contra β2GPI (Matzinger, 1998; Fadok et al, 1998; Fadok et al, 2001a;b). Los ratones tratados con 3G4 a altas dosis durante periodos prolongados no mostraron cambios en la capacidad de coagulación, a pesar de que los ratones respondieron con APS cuando recibieron inyección de anticardiolipina o anticuerpos anticoagulantes lúpicos.
La presente invención resuelve esta discrepancia, aclara la interacción de 3G4 y β2GPI necesaria para la unión a células endoteliales con PS expuesta y explica como 3G4 puede unirse a un complejo PS-β2GPI sin sucumbir a las toxicidades asociadas con los anticuerpos patógenos previamente conocidos.
Como se muestra en el Ejemplo XXX, la interacción entre 3G4 y PS es dependiente de β2GPI. Aunque β2GPI se une a fosfolípidos aniónicos débilmente en condiciones fisiológicas, la presente invención muestra que 3G4 potencia enormemente la unión de β2GPI con células endoteliales positivas a PS. Los datos muestran que se requieren complejos divalentes 3G4/β2GPI para potenciar la unión, dado que los fragmentos Fab’ de 3G4 no se unen a células endoteliales con PS expuesta. También demuestran que una construcción β2GPI dimérica artificial se une a células endoteliales con PS expuesta si necesidad de 3G4. En su conjunto, estos datos sugieren que 3G4 actúa sobre células positivas a PS, incluyendo células endoteliales tumorales, aumentando la afinidad de β2GPI por PS mediante la formación de un complejo divalente 3G4/β2GPI.
El Ejemplo XXX también demuestra que 3G4 se une al dominio II de β2GPI. Esto es importante, ya que los anticuerpos de pacientes con APS que reconocen el dominio II de β2GPI no son patógenos. Por otro lado, un estudio reciente significativo demostró que los anticuerpos anti-β2GPI patógenos aislados de pacientes con APS normalmente reconocen el dominio I de β2GPI (de Laat et al, 2005a). La capacidad del anticuerpo 3G4 para unirse a complejos PS-β2GPI sin unirse al dominio I de β2GPI es importante en la falta de toxicidad que presenta el anticuerpo. β2GPI también puede interaccionar con el receptor 2’ de apolipoproteína E (apoER2’) (Lutters et al, 2003). Otro estudio reciente indicó que el dominio V de β2GPI interacciona con apoER2’ y que está implicado en la activación de plaquetas, lo que causa un aumento en la deposición de plaquetas en el colágeno (van Lummel et al, 2005).
Por consiguiente, mediante la unión ni al dominio I ni al dominio V, el anticuerpo 3G4 puede unirse al complejo PSβ2GPI e incluso no mostrar toxicidad después de amplios estudios toxicológicos realizados en diversos modelos animales. A la luz de estos descubrimientos, ahora pueden prepararse otros anticuerpos que se unen a complejos PS-β2GPI y usarse de manera segura en el tratamiento de diversas afecciones, tales como cáncer e infecciones víricas. La selección de anticuerpos que no se unen significativamente al dominio I de β2GPI es normalmente el requisito principal, y se contempla que la selección de anticuerpos que no se unen significativamente al dominio I de β2GPI o al dominio V de β2GPI proporciona ventajas adicionales.
En revisión, los nuevos estudios han caracterizado la interacción entre el anticuerpo 3G4 y su principal diana de fosfolípido aniónico, la fosfatidilserina. Los datos demuestran que la interacción entre 3G4 y PS es dependiente de suero. β2GPI se identificó como el factor sérico necesario para mediar la interacción entre 3G4 y PS.
3G4 se generó originalmente inmunizando ratones con células endoteliales murinas tratadas con H2O2 para inducir la exposición a PS (Ejemplo IV; Ran et al, 2005). Las células se cultivaron en medios que contenían FBS y probablemente inyectados con una pequeña cantidad de β2GPI bovina, lo que conduce a la producción de anticuerpos anti-PS/β2GPI. Se realizaron exploraciones iniciales de anticuerpos con respecto a su reactividad con PS en presencia de suero bovino. Después se realizaron exploraciones en ausencia de suero, pero como se indica en el presente documento, el anticuerpo purificado de SCM se purificó simultáneamente con el antígeno β2GPI. Por lo tanto, el anticuerpo “purificado” puede unirse a PS en ausencia de suero debido a la presencia de β2GPI bovinacontaminante. Únicamente cuando 3G4 se cultivó y se purificó de medios aséricos se identificó la dependencia del suero. Otros grupos han descrito cuestiones similares con respecto a la obtención de preparaciones de anticuerpos anti-β2GPI sin β2GPI (Roubey et al, 1995). Por lo tanto, es muy posible que muchos de los denominados “anticuerpos antifosfolípidos” que se presentan como que se unen directamente a fosfolípidos, realmente reconozcan proteínas séricas con afinidad por fosfolípidos.
La β2GPI es una glucoproteína de 50 kDa que está presente en el plasma a una concentración de ~200 μg/ml (4 μM) (Cleve et al., 1969). La proteína es un miembro de la familia de proteínas de control del complemento (PCC) (Steinkasserer et al., 1991). La β2GPI tiene cinco repeticiones PCC en la que los cuatros primeros dominios son repeticiones regulares que constan de ~60 aminoácidos. El quinto dominio se diferencia de los cuatro dominios restantes ya que tiene 82 aminoácidos, incluyendo un grupo de aminoácidos con carga positiva (282-287) y una región hidrófoba conservada (311-317) responsable de la unión de β2GPI a fosfolípidos aniónicos (Steinkasserer et al., 1992; Huntand Krilis, 1994; Sheng et al., 1996; Mehdi et al., 2000).
Se sabe poco sobre la función biológica normal de β2GPI. Las funciones propuestas incluyen facilitación de la eliminación de células apoptóticas (Balasubramaniam et al., 1997b; Balasubramaniam et al., 2005), modulación de la función plaquetaria (Nimpf et al., 1985; Nimpf et al., 1987) e inhibición de la coagulación (Nimpf ef al., 1986; Schousboe, 1985); sin embargo, no se ha observado un fenotipo definitivo en ratones o en pacientes con déficit de
28
imagen19
imagen20
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Idealmente, cada uno de los posibles mecanismos anteriores deben reconciliarse con la propuesta de que los macrófagos asociados a tumores pueden inducir la angiogénesis tumoral, lo que promueve el crecimiento tumoral (por ejemplo, Sunderkotter et al, 1994). Por lo tanto, los autores de la invención piensan que hay un equilibrio entre los efectos proangiogénicos de los macrófagos y sus efectos citotóxicos directos sobre vasos tumorales y células tumorales que se determina mediante condiciones locales (por ejemplo, hipoxia, TGF-β) en el microambiente tumoral (Breier et al, 2002). Actualmente se contempla que los anticuerpos, tales como 3G4, alteran el microentorno tumoral de una manera que favorece una respuesta citotóxica directa de los macrófagos.
Por lo tanto, considerando la biología de la fosfatidilserina, y opcionalmente la luz de los datos presentados en el presente documento con respecto al comportamiento de los macrófagos en el tratamiento tumoral, los autores de la invención proporcionan una serie de construcciones o “receptorcuerpos” ventajosos que se unen a fosfatidilserina, y opcionalmente a otros fosfolípidos aniónicos, y conjugados relacionados y métodos de uso.
Dicha construcción o receptorcuerpo de la invención comprenderá típicamente una proteína o un polipéptido, receptor, ligando o péptido de unión que reconozca y se una a fosfatidilserina, y opcionalmente a otros fosfolípidos aniónicos, cuya proteína o polipéptido receptor, ligando o péptido de unión, está ligado a un anticuerpo o región Fc de inmunoglobulina o dominio. La región Fc modifica la proteína o el polipéptido, el receptor, el ligando o el péptido de unión para aumentar su semivida biológica, pero lo que es más importante, proporciona la construcción resultante con la capacidad de estimular funciones efectoras del hospedador para potenciar el tratamiento de enfermedades.
Los receptorcuerpos de la invención pueden usarse en cualquiera de las realizaciones en las que puedan usarse anticuerpos contra fosfatidilserina. Dichos receptorcuerpos tienen por tanto múltiples aplicaciones, incluyendo la unión a fosfatidilserina en vasos sanguíneos tumorales y en células tumorales, lo que conduce a efectos anticelulares y antivasculares mediados por células hospedadoras en el tumor, y a la unión de fosfatidilserina en virus o en células infectadas con virus, lo que conduce a un efecto antivírico en animales.
Una de las ventajas de estos aspectos de la invención es que los receptorcuerpos usan proteínas, polipéptidos o receptores de unión a fosfatidilserina natural para conseguir una unión específica. Aunque en el presente documento se muestra que el uso de anticuerpos contra fosfatidilserina es eficaz en muchas realizaciones de tratamiento, los receptorcuerpos podrían tener mayor avidez o especificidad que los anticuerpos anti-PS. La dimerización de proteínas o polipéptidos de unión a fosfatidilserina, particularmente β2GPI, sobre una región de inmunoglobulina Fc, hace que las construcciones obtengan mejor avidez, estabilidad, semividas in vivo más prolongadas, y posiblemente una localización superior en tejidos que expresan fosfatidilserina, así como estimulación de funciones efectoras del hospedador in vivo. En el presente documento se muestra que los anticuerpos anti-PS son eficaces e inocuos cuando se administran a animales, incluyendo monos. Del mismo modo, los receptorcuerpos que contienen los ligandos naturales serán eficaces e inocuos y no causarán síndromes antifosfolípido. Por consiguiente, los receptorcuerpos de la presente invención son agentes terapéuticos sencillos, humanos, específicos e inocuos, que pueden usarse para tratar una serie de tumores e infecciones víricas.
D1. Proteínas de unión a fosfatidilserina
La proteína o polipéptido, receptor, ligando o péptido de unión en los receptorcuerpos de la divulgación puede ser cualquiera de una de las diversas proteínas de unión a fosfatidilserina, incluyendo receptores derivados de células, factor V, protrombina (factor II) y similar. Se prefiere mucho el uso de la β2-glucoproteína I.
Determinados factores en la cascada de coagulación también se unen a fosfatidilserina y por tanto pueden usarse en los receptorcuerpos de la divulgación. Por ejemplo, el factor V y la protrombina (factor II) se unen a fosfatidilserina. En el complejo protrombinasa, la unión del factor Va a una superficie de lípidos anicónicos promueve la unión dependiente de Ca2+ del factor Xa, que convierte la protrombina en trombina. En ambos complejos, la fosfatidilserina es el fosfolípido aniónico más eficaz. Por tanto, en la divulgación pueden usarse proteínas de unión a fosfatidilserina, Proteína C, Proteína S, Factor ll/lla, Factor V/Va, Factor VIl/Vlla, Factor IX/IXa y Factor X/Xa.
Fadok et al. (2000) describieron la clonación de un receptor de PS que unía directamente a células apoptóticas. Este receptor se expresa en muchos tipos de células, incluyendo macrófagos, fibroblastos y células epiteliales. Los estudios usando anticuerpos y vesículas de PS indican que el receptor reconoce la fosfatidilserina en la superficie celular. Por tanto, este es un receptor específico de PS, “el receptor de PS” o “PSr” (Número de Registro AF304118). Este receptor está presente en fagocitos, tales como macrófagos, y también en otros tipos de células. Por tanto, el receptor de PS de Fadok et al. (2000) puede usarse en los receptorcuerpos de la divulgación.
En Balasubramanian y Schroit, 2003, en particular, véase Balasubramanian y Schroit, 2003, Tabla 2, y las referencias citadas en su interior, se describen otras proteínas de unión a fosfatidilserina que podrían usarse en los receptorcuerpos de la divulgación. Estas proteínas de unión a fosfatidilserina incluyen, por ejemplo, CD14; integrinas, tales como α5β3 (vitronectina, CD51/CD61) y α5β3/CD36; diversos receptores eliminadores, tales como SRB (CD36), SRC (LOX-1, SRCL), SRD (CD68, macrosialina) y PSOX; receptores del complemento, tales como CR3 (CD11b/CD18) (Número de Registro NM 000632), CR4 (CD11c/CD18) (Número de Registro NM 000887) y CD93 (cCIqr, calreticulina)/CD91 (receptor de α2-macroglobulina); y otros receptores tales como los compañeros de reconocimiento de fagocitos Mer/Gas 6 para células apoptóticas que expresan PS (Número de Registro AH010001).
31 5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Aunque las anexinas, tal como la anexina V, pueden usarse como una proteína de unión a fosfatidilserina en un receptorcuerpo, su uso no es una parte universal de la presente invención. Por lo tanto, en determinadas realizaciones, la presente invención proporciona construcciones en las que la proteína de unión a fosfatidilserina no es una anexina. Sin embargo, la siguiente información se proporciona para su uso en aquellas realizaciones, en las que se contempla una anexina. Además, la información técnica que aparece en los documentos de patente de anexina, por ejemplo, con respecto a la expresión y conjugación, puede usarse para confirmar las otras construcciones de proteína de unión a fosfatidilserina-Fc de la divulgación.
Se han identificado al menos nueve miembros de la familia de las Anexinas (de la Anexina I a la Anexina IX) en tejidos de mamífero. Actualmente, entre estas, se prefiere la Anexina V (también conocida como PAP-I). Las secuencias de ADN y proteínas de las Anexinas se conocen en la técnica, lo que facilita la producción fácil de proteínas de fusión recombinantes para su uso en estos aspectos de la divulgación.
En la Patente de Estados Unidos nº 5.658.877, se describe la Anexina I, cantidades eficaces de Anexina I y composiciones farmacéuticas de las mismas. También se describen métodos de tratamiento de un animal para prevenir o aliviar los efectos adversos de la endotoxina en el pulmón, que comprende administrar en las vías respiratorias de un animal, una cantidad inocua de un fragmento de Anexina I de 33 kDa.
La Anexina V contiene un grupo sulfhidrilo libre y no tiene ninguna cadena de hidrato de carbono unida. La estructura primaria de la anexina V deducida de la secuencia de ADNc muestra que la anexina V comprende cuatro unidades de repetición internas (Patente de Estados Unidos nº 4.937.324). La Patente de Estados Unidos nº
5.296.467 y el documento WO 91/07187 proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden “anexina”.
El documento WO 91/07187 proporciona derivados y análogos de anexina preparados de manera natural, sintética o genética. Las anexinas particulares constan de 320 aminoácidos que contienen aminoácidos variantes y opcionalmente un puente disulfuro entre la Cys 316 y la Ala 2.
La Patente de Estados Unidos nº 5.296.467 describe adicionalmente anexinas y composiciones farmacéuticas de las mismas. La Patente de Estados Unidos nº 5.296.467 describe la clonación, la expresión recombinante y la preparación de anexina. También se desvelan agregados de dos o más anexinas, por ejemplo, ligados por enlaces disulfuro entre uno o más grupos de cisteína sobre la anexina respectiva. En el documento WO 95/27903 se proporciona otro ejemplo más de materiales de partida de anexina adecuados, que proporciona anexinas para su uso en la detección de células apoptóticas.
La Patente de Estados Unidos nº 6.197.278 también facilita y ofrece una descripción de las anexinas en un sentido genérico, su administración segura y eficaz in vivo y realizaciones de formación de imágenes. Lo siguiente describe materiales de partida de anexina apropiados para la preparación de construcciones, también se identifican cada una de las estrategias de diagnóstico de la Patente de Estados Unidos nº 5.627.036; documentos WO 95/19791; WO 95/27903; WO 95/34315; WO 96/17618; y WO 98/04294. Diversos de estos documentos también se refieren a vectores de expresión recombinante útiles.
La Patente de Estados Unidos nº 5.632.986 también se proporciona con el fin de describir adicionalmente el aislamiento de la anexina de extractos de tejido (Patente de Estados Unidos nº 4.937.324) y la producción de anexina por métodos recombinantes. Por tanto, se identifica cada uno de los clones de ADNc y vectores de expresión de la Patente de Estados Unidos nº 5.632986.
La Patente de Estados Unidos nº 5.632.986 describe adicionalmente mutantes y variantes de la molécula de anexina que se subdividen o modifican en uno o más restos de aminoácidos siempre que la capacidad de unión del fosfolípido no se reduzca sustancialmente. Las anexinas apropiadas para su uso pueden por tanto truncarse, por ejemplo, para incluir uno o más dominios o contener menos restos de aminoácidos que en la proteína nativa, o pueden contener aminoácidos sustituidos. Se acepta cualquier cambio siempre que la muteína o molécula de anexina de segunda generación no contenga sustancialmente menor afinidad por el aminofosfolípido. El mismo razonamiento se aplica a proteínas que no son anexinas.
En la Patente de Estados Unidos nº 5.632.986 también se describe el entrecruzamiento químico de las anexinas y otros agentes. Todas estas técnicas pueden adaptarse para su uso con las mismas sustituyendo simplemente los agentes trombolíticos de las regiones Fc descritas en el presente documento. Por tanto, pueden usarse diaminas alifáticas; ésteres de succinimida, agentes de acoplamiento heterobifuncionales, tales como SPDP; compuestos de maleimida, enlazadores con espaciadores; y similares. Estos agentes también pueden usarse con proteínas que no son anexinas.
La Patente de Estados Unidos nº 5.632.986 se identifica específicamente también con el fin de describir la producción recombinante de los conjugados que contienen anexina. Las secuencias de ácido nucleico apropiadas se unen por tanto para producir secuencias codificantes quiméricas que, a su vez, producen proteínas quiméricas. Los vectores de expresión ejemplares se dice que son pKK233-2 (E. coli), DPOT (levadura) y pDSPI.IBGH (mamífero). Dichas enseñanzas se complementan con información adicional proporcionada en el presente documento.
Cada una de las Patentes de Estados Unidos nº 6.312.694, 6.783.760 y 6.818.213 se identifican con el fin de incluir
32
imagen21
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
documento por referencia), las regiones Fc actualmente preferidas son la IgG1 (γ1) humana y la IgG3 (γ3) humana para su uso clínico y la IgG2a (γ2a) de ratón y la IgG2b (γ2b) de ratón para ensayos preclínicos en ratones. Se piensa que la γ2 es silenciosa y por tanto no debe seleccionarse para proporcionar funciones efectoras, aunque sigue siendo una proteína humana útil para su uso como un dominio de dimerización. Aunque seleccionada para las funciones efectoras, la parte Fc de las inmunoglobulinas también contribuye a prolongar la semivida, que puede resultar de la reabsorción activa de los anticuerpos en los riñones.
Aunque la expresión recombinante de las regiones Fc y de las construcciones de unión es conveniente, dichos fragmentos también pueden obtenerse por proteólisis de toda la inmunoglobulina, preferentemente por la tiol proteasa no específica, papaína. La digestión con papaína produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, denominados “fragmentos Fab”, cada uno de ellos con un solo sitio de unión a antígeno y el “fragmento Fc” residual.
La papaína debe activarse primero reduciendo el grupo sulfhidrilo en el sitio activo con cisteína, 2-mercaptoetanol o ditiotreitol. Los metales pesados en la enzima de reserva deben retirarse por quelación con EDTA (2 mM) para garantizar una actividad enzimática máxima. La enzima y el sustrato normalmente se mezclan juntas en la proporción de 1:100 por peso. Después de la incubación, la reacción puede detenerse por alquilación irreversible del grupo tiol con yodoacetamina o simplemente por diálisis. La finalización de la digestión debe monitorizarse con SDS-PAGE y las diversas fracciones separarse mediante cromatografía de intercambio iónico o con proteína A-Sefarosa.
En determinadas realizaciones, pueden usarse dos fragmentos de Fc, preferentemente dos fragmentos de Fc humanos. En dichos aspectos, pueden combinarse dos proteínas, receptores o ligandos de unión con los dos fragmentos Fc para preparar otro tipo de receptorcuerpo divalente. Los fragmentos Fc humanos se preferirán para fabricar receptorcuerpos para la administración en seres humanos. De hecho, esto es una ventaja de la invención, ya que se produce una construcción terapéutica completamente humana. Por tanto, las construcciones Fc-β2GPI incluyen agentes terapéuticos de betacuerpos completamente humanos.
D3. Otras construcciones y transportadores
Aunque el ligamiento de una región Fc a una proteína o polipéptido de unión a fosfatidilserina es la realización preferida de la invención del receptorcuerpo, las proteínas de unión a fosfatidilserina también pueden ligarse a transportadores inertes para conferir longevidad a las moléculas biológicamente activas. Como tal, la presente invención proporciona adicionalmente construcciones que comprenden al menos una primera proteína de unión a aminofosfolípido, incluyendo β2GPI, conectada operativamente a al menos un primer transportador inerte.
Como se sabe en la técnica, las proteínas transportadoras pueden usarse para aumentar la semivida biológica, y son proteínas ejemplares las albúminas y globulinas, tales como neutravidina y estreptavidina. También pueden usarse transportadores no proteicos para aumentar la semivida biológica, tales como polímeros naturales o sintéticos, incluyendo polisacáridos y PEG. Cualquier transportador inerte de este tipo puede conectarse a cualquiera de las proteínas de unión a fosfatidilserina descritas en el presente documento.
Otros aspectos de la presente invención se refieren a composiciones de dímeros de β2GPI preparados por medios que no sean el uso de una región Fc, y diversos métodos de uso. Particularmente, la invención proporciona métodos de tratamiento del cáncer y métodos para tratamiento de infecciones víricas, que comprenden administrar a un animal que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un dímero de β2GPI.
Otros aspectos más de la invención son los liposomas que comprenden polipéptidos β2GPI, tanto en forma dimérica como no, y que incluyen polipéptidos β2GPI distintos de los que se conectan con una región Fc. Como tal, la invención se refiere a un sistema de liberación de fármaco basado en una nanopartícula, liposoma, transportador de lípidos, complejo, mezcla, agregado multimolecular de estructura supramolecular o en lípido que comprende al menos un primer polipéptido β2GPI. El polipéptido β2GPI puede ser un dímero, pero no es preciso que lo sea. El polipéptido β2GPI puede estar, o no, conectado a un agente terapéutico adicional. Dichos liposomas serán preferentemente liposomas furtivos y pueden contener un agente terapéutico en el núcleo del liposoma.
Otros aspectos adicionales de la presente invención se refieren a composiciones de polipéptidos β2GPI (distintos de los polipéptidos β2GPI conectados a una región Fc) en las que el polipéptido β2GPI está conectado operativamente a al menos un primer agente terapéutico, y a diversos métodos de uso. Se prefieren particularmente composiciones en las que un polipéptido β2GPI está conectado operativamente a al menos una primera citocina, tal como TNFα, IL2 o IFNα. En determinadas realizaciones, el polipéptido β2GPI será un dímero y un polipéptido β2GPI dimérico estará conectado operativamente a al menos un primer agente terapéutico, tal como una citocina. Cualquiera de dichas construcciones o conjugados de citocina -β2GPI se contemplan particularmente para su uso en el tratamiento de enfermedades, incluyendo infecciones víricas.
Por tanto, adicionalmente la invención proporciona métodos de tratamiento del cáncer y métodos de tratamiento de infecciones víricas, que comprende administrar a un animal que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de una construcción que comprende un polipéptido β2GPI conectado operativamente a al menos una primera citocina, preferentemente a TNFα, IL-2 o IFNα. El polipéptido β2GPI puede ser un polipéptido β2GPI dimérico.
34 5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
D4. Conjugados de Agentes Adicionales
Las construcciones y receptorcuerpos de la invención también pueden usarse para suministrar agentes terapéuticos conectados con dianas específicas, tales como el sistema vascular tumoral e intratumoral, células tumorales, células infectadas con virus y partículas víricas. Aunque no refiriéndose a construcciones con regiones Fc, cada una de las Patentes de Estados Unidos nº 6.312.694, 6.783.760 y 6.818.213 está identificada específicamente por sus enseñanzas generales con respecto a proteínas de unión a aminofosfolípidos conectadas con agentes terapéuticos. Al igual que las construcciones y receptorcuerpos de la presente invención que también pueden usarse en terapia antivírica segura y eficaz, estas construcciones también pueden ligarse ventajosamente con una serie de agentes antivíricos conocidos.
En estos aspectos de la invención, cualquier construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención puede usarse para preparar un conjugado. Los agentes para su uso en dichos conjugados incluyen preferentemente un agente anticelular o citotóxico, una citocina, quimiocina, un inhibidor de ATPasa de tipo V, inhibidor de la síntesis de proteínas, agente quimioterapéutico, agente antiangiogénico, agente inductor de apoptosis, fármaco antitubulina, radioisótopo, agente coagulante o antivírico. En los conjugados antivíricos, no hay ninguna necesidad de usar un segundo agente antivírico como el agente conectado.
E1. Agentes anticelulares y citotóxicos
Para determinadas aplicaciones, los agentes terapéuticos serán agentes citotóxicos o farmacológicos, particularmente citotóxicos, citoestáticos o, de otra manera, agentes anticelulares que tienen la capacidad de destruir
o suprimir el crecimiento o la división celular de las células, particularmente células endoteliales tumorales, células tumorales o células infectadas con virus.
Los agentes anticelulares ejemplares incluyen agentes terapéuticos, así como citotoxinas. Los agentes quimioterapéuticos que pueden usarse incluyen: hormonas, tales como esteroides; antimetabolitos, tales como citosina arabinósido, fluorouracilo, metotrexato o aminopterina; antraciclinas; mitomicina C; alcaloides de la vinca; democolcina; etopósido, mitramicina; agentes alquilantes antitumorales, tales como clorambucilo o melfalán. Otras realizaciones pueden incluir agentes tales como citocinas. Básicamente puede usarse cualquier agente anticelular siempre que pueda conjugarse satisfactoriamente con una construcción de una manera que permita su direccionamiento, internalización, liberación y/o presentación a los componentes sanguíneos en el sitio de las células diana, tales como células endoteliales.
Puede haber circunstancias, tales como cuando el antígeno diana no se internaliza mediante una ruta de acuerdo con una intoxicación eficaz por el compuesto tóxico, en la que se deseará dirigir agentes quimioterapéuticos, tales como fármacos antitumorales, citocinas, antimetabolitos, agentes alquilantes, hormonas y similares. Diversos agentes quimioterapéuticos y otros agentes farmacológicos se han conjugado ahora satisfactoriamente y demuestran que funcionan desde un punto de vista farmacológico, incluyendo doxorrubicina, daunomicina, metotrexato, vinblastina, neocarcinostatina, macromicina, trenimón y α-amanitina.
En otras circunstancias, cualquiera de los posibles efectos secundarios de la terapia basada en citotoxinas puede eliminarse mediante el uso de inhibidores de la síntesis de ADN, tales como daunorrubicina, doxorrubicina, adriamicina y similares. Estos agentes son por tanto ejemplos preferidos de agentes anticelulares para su uso en determinados aspectos de la presente invención. En términos de agentes citoestáticos, dichos compuestos generalmente alteran el ciclo celular natural de una célula diana, preferentemente de tal manera que la célula se elimina del ciclo celular.
Se conoce una gran diversidad de agentes citotóxicos que pueden conjugarse. Como ejemplos se incluyen numerosas toxinas obtenidas de plantas, hongos o bacterias que, como ejemplo, incluyen diversas toxinas de cadena A, particularmente cadena A de ricina; proteínas inactivadoras de ribosomas, tales como saporina o gelonina; α-sarcina; aspergilina; restrictocina; ribonucleasas, tal como ribonucleasa placentaria; toxina diftérica y exotoxina de pseudomonas, por nombrar sólo unas cuantas.
El libro de toxinas, muy conocido, de 1992 “Genetically Engineered Toxins”, editado por Arthur E. Frankel, incluyendo el anexo, que incluye las secuencias primarias de aminoácidos de una gran cantidad de toxinas, se incorpora específicamente en el presente documento por referencia, con la finalidad de describir adicionalmente y permitir el uso de toxinas en construcciones diana.
De las toxinas, se prefiere el uso de las cadenas A de gelonina y ricina. El uso de la gelonina como la parte efectora o toxina de inmunoconjugados que se unen a marcadores expresados, accesible para unirse, adsorberse o localizarse en vasos sanguíneos intratumorales de un tumor vascularizado se describe en la Patente de Estados Unidos nº 6.051.230, específicamente incorporada en el presente documento por referencia, y en la Patente de Estados Unidos nº 6.451.312, que se refiere particularmente a la gelonina ligada a VEGF como un agente diana.
Al igual que las cadenas A de ricina, un resto de toxina adicionalmente preferido es la cadena A de toxina que se ha tratado para modificar o retirar restos de hidratos de carbono, denominada cadena A desglucosilada (dgA). La cadena A de ricina desglucosilada se prefiere por su extrema fuerza, semivida más prolongada y porque es
35 5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
económicamente fácil de fabricarla a un grado y a una escala clínicos.
Puede ser deseable desde un punto de vista farmacológico emplear la molécula más pequeña posible que sin embargo proporcione una respuesta biológica apropiada. Se puede desear por tanto emplear péptidos de cadena A más pequeños que proporcionen una respuesta anticelular adecuada. Para esta finalidad, se ha descubierto que la cadena A de ricina puede “truncarse” retirando 30 aminoácidos N terminales por Nagarasa (Sigma) y conservar aún una actividad de toxina adecuada. Se propone que, cuando se desee, esta cadena A truncada pueda emplearse en conjugados de acuerdo con la invención.
Como alternativa, se puede encontrar que la aplicación de la tecnología de ADN recombinante para el resto de la cadena A de toxina proporcione beneficios adicionales de acuerdo con la invención. Dado que se ha conseguido la clonación y expresión de la cadena A de ricina biológicamente activa, ahora es posible identificar y preparar péptidos más pequeños, o de otra manera variantes, que no obstante presenten una actividad de toxina apropiada. Además, el hecho de que la cadena A de ricina se haya clonado ahora, permite la aplicación de la mutagénesis dirigida, a través de la cual se pueden preparar y explorar fácilmente péptidos derivados de cadena A y obtener restos útiles adicionales para su uso junto con la presente invención.
E2. Citocinas
Las citocinas y quimiocinas son ejemplos particulares de agentes para la unión a una construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la presente invención. Pueden usarse diversas citocinas, incluyendo IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-13, TGF-β, M-CSF, G-CSF, TNFβ, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, IFN-α, IFN-β. Las citocinas más preferidas incluyen IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-10, GM-CSF, IFN-γ, proteína-1 quimioatrayente de monocitos (MCP-1), factor BB de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) y proteína C reactiva (CRP) y similares. Los ejemplos particularmente preferidos son TNFα, inductores de TNFα, IL-2, IL-12, IFN-β, IFN-γ y LEC.
El TNFα aumenta la permeabilidad vascular. Este agente se contempla para la conexión a una construcción receptorcuerpo o betacuerpo de la invención, particularmente cuando el conjugado resultante se usa en terapia de combinación para el tratamiento del cáncer. La construcción suministrará el TNFα unido al entorno tumoral, y la permeabilidad vascular potenciada causada en el tumor facilitará la penetración de un segundo agente anticanceroso en el tumor, amplificando de este modo el efecto antitumoral global.
La IL-12, por ejemplo, puede unirse a una construcción, receptorcuerpo o betacuerpo y usarse para redirigir defensas del hospedador para atacar los vasos tumorales. La quimiocina LEC (quimiocina expresada en el hígado, también conocida como NCC-4, HCC-4 o LMC) es otro componente preferido (Gioaerelli et al., 2000). LEC es quimiotáctica para células dendríticas, monocitos, linfocitos T, células MK y neutrófilos y por lo tanto puede mejorar las respuestas antitumorales mediadas por el hospedador.
E3. Factores de coagulación
Una construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención puede ligarse a un componente que sea capaz de estimular directa o indirectamente la coagulación, para formar un coaguligando. Las Patentes de Estados Unidos nº 6.093.399, 6.004.555, 5.877.289 y 6.036.955 se identifican específicamente por referencia con el fin de describir adicionalmente la conexión operativa de coagulantes para formar coaguligandos.
Una construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención puede ligarse directamente al coagulante o factor de coagulación, o puede ligarse a una segunda región de unión que se une y después libera el coagulante o factor de coagulación. Como se usa en el presente documento, cada uno de los términos “coagulante” y “factor de coagulación” se usa para referirse a un componente que sea capaz de estimular directa o indirectamente la coagulación en condiciones apropiadas, preferentemente cuando se proporciona en un entorno in vivo específico, tal como el sistema vascular tumoral.
Los factores de coagulación preferidos son composiciones de Factor Tisular, tales como moléculas de TF truncado (tTF), moléculas de TF diméricas, multiméricas y mutantes. “TF truncado” (tTF) se refiere a construcciones de TF cuya unión a membranas se vuelve deficitaria por la retirada de secuencias de aminoácidos suficientes para efectuar este cambio correctamente. Una “cantidad suficiente” en este contexto es una cantidad de secuencias de aminoácidos transmembrana originalmente suficiente para introducir la molécula de TF en la membrana, o de otra manera, mediar en la unión funcional de la membrana de la proteína TF. Por tanto, la retirada de dicha “cantidad suficiente de la secuencia del tramo transmembrana” crea una proteína o un polipéptido del Factor Tisular truncado con déficit en cuanto a la capacidad de unión a membranas fosfolipídicas, de tal manera que la proteína es sustancialmente una proteína soluble que no se une significativamente a membranas fosfolipídicas. El TF truncado por tanto no convierte sustancialmente el Factor VII a Factor VIIa en un ensayo de TF estándar, e incluso conserva la actividad denominada catalítica, incluyendo la activación del Factor X en presencia del Factor VIIA.
Las Patentes de Estados Unidos nº 5.504.067, 6.156.321, 6.132.729 y 6.132.730 se identifican específicamente con la finalidad de describir adicionalmente dichas proteínas de Factor Tisular truncado. Preferentemente, los Factores Tisulares para su uso en estos aspectos de la presente invención generalmente carecerán de las regiones transmembrana y citosólicas (aminoácidos 220-263) de la proteína. Sin embargo, no existe la necesidad de que las
36
imagen22
imagen23
combinación con la presente invención.
E5. Agentes antiangiogénicos
Los agentes antiangiogénicos son útiles para la conexión a una construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención. Muchos agentes anticancerosos tienen un efecto antiangiogénico como parte de su mecanismo de 5 acción. Cualquiera de uno o más de dichos agentes descritos para su uso en terapias de combinación, incluyendo los que se indican en la Tabla E, pueden conjugarse con una construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención, como se describe en el presente documento. Se han descubierto, diseñado o seleccionado determinados otros agentes, que tienen un efecto antiangiogénico como un mecanismo de acción primaria. Los ejemplos de dichos agentes se describen más adelante, pudiendo usarse cualquiera de ellos para preparar un conjugado o usarse por
10 separado en terapia de combinación con la invención.
Ahora se conocen numerosos inhibidores de tirosina quinasa útiles para el tratamiento de la angiogénesis, como se manifiesta en diversas patologías. Estos incluyen, por ejemplo, las 4-aminopirrolo[2,3-d]pirimidinas de la Patente de Estados Unidos nº 5.639.757, que también pueden usarse en combinación con la presente invención. Otros ejemplos de moléculas orgánicas capaces de modular la transducción de señal de la tirosina quinasa mediante el
15 receptor VEGFR2 son los compuestos de quinazolina y las composiciones de la Patente de Estados Unidos nº 5.792.771, que se identifica con la finalidad de describir combinaciones adicionales para su uso con la presente invención en el tratamiento de enfermedades angiogénicas.
Los compuestos de otras clases químicas también se ha mostrado que inhiben la angiogénesis y que pueden usarse en combinación con la presente invención. Por ejemplo, los esteroides tales como los esteroides angioestáticos 20 4,9(11) y esteroides C21 oxigenados, como se describe en la Patente de Estados Unidos nº 5.972.922, pueden emplearse en terapia combinada. Las Patentes de Estados Unidos nº 5.712.291 y 5.593.990 describen talidomida y compuestos, precursores análogos, metabolitos y productos de hidrólisis relacionados, que también pueden usarse en combinación con presente invención para inhibir la angiogénesis. Los compuestos de las Patentes de Estados Unidos nº 5.721.291 y 5.593.990 pueden administrarse por vía oral. En la Tabla B se indican otros agentes
25 antiangiogénicos ejemplares que son útiles junto con terapia combinada. Cada uno de los agentes indicados en el presente documento es ejemplar y no significa que sea limitante.
TABLA B
Inhibidores y reguladores negativos de la angiogénesis
Sustancias
Referencias
Angiostatina
O’Reilly et al., 1994
Endostatina
O’Reilly et al., 1997
Fragmento de prolactina de 16 kDa
Ferrara et al, 1991; Clapp et al, 1993; D'Angelo et al, 1995; Lee et al, 1998
Péptidos de laminina
Kleinman et al, 1993; Yamamura et al, 1993; Iwamoto et al, 1996; Tryggvason, 1993
Péptidos de fibronectina
Grant et al, 1998; Sheu et al, 1997
Inhibidores de metaloproteinasa tisular (TIMP 1, 2, 3,4)
Sang, 1998
Inhibidores del activador de plasminógeno (PAI-1, -2)
Soff et al., 1995
Factor α de necrosis tumoral (altas dosis in vitro)
Frater-Schrodere et al., 1987
TGF-β1
RayChadhury y D'Amore, 1991; Tada et al, 1994
Interferones (IFN-α, -β, γ)
Moore et al, 1998; Lingen et al, 1998
Quimiocinas ELR-CXC: IL-12; SDF-1; MIG; factor 4 plaquetario (PF-4); IP-10
Moore et al, 1998; Hiscox y Jiang, 1997; Coughlin et al, 1998; Tanaka et al., 1997
Trombospondina (TSP)
Good et al, 1990; Frazier, 1991; Bornstein, 1992; Tolsma et al, 1993; Sheibani y Frazier, 1995; Volpert et al., 1998
39
Sustancias
Referencias
SPARC
Hasselaar y Sage, 1992; Lane et al, 1992; Jendraschak y Sage, 1996
2-Metoxioestradiol
Fotsis et al., 1994
Proteína relacionada con proliferina
Jackson et al., 1994
Suramina
Gagliardi et al, 1992; Takano et al, 1994; Waltenberger et al., 1996; Gagliardi et al, 1998; Manetti et al., 1998
Talidomida
D'Amato et al, 1994; Kenyon et al, 1997 Wells, 1998
Cortisona
Thorpe et al., 1993 Folkman et al, 1983 Sakamoto et al, 1986
Linomida
Vukanovic et al, 1993; Ziche et al, 1998; Nagler et al, 1998
Fumagilina (AGM-1470; TNP-470)
Sipos et al, 1994; Yoshida et al, 1998
Tamoxifeno
Gagliardi y Collins, 1993; Linder y Borden, 1997; Haran et al, 1994
Extracto de Korean mistletoe (Viscum album coloratum)
Yoon et al., 1995
Retinoides
Oikawa et al, 1989; Lingen et al, 1996; Majewski et al 1996
CM101
Hellerqvist et al., 1993; Quinn et al., 1995; Wamil et al, 1997; DeVore et al, 1997
Dexametasona
Hori et al, 1996; Wolff et al, 1997
Factor inhibidor de leucemia (LIF)
Pepper et al., 1995
Determinados componentes preferidos para su uso en la inhibición de la angiogénesis son angiostatina, endostatina, vasculostatina, canstatina y maspina. La proteína denominada “angiostatina” se desvela en las Patentes de Estados Unidos 5.776.704; 5.639.725 y 5.733.876, cada una de ellas incorporada en el presente documento por referencia.
5 La angiostatina es una proteína que tiene un peso molecular de entre aproximadamente 38 kD y aproximadamente 45 kD, determinado mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones reductoras, que contiene aproximadamente de 1 a 4 regiones Kringle de una molécula de plasminógeno. Generalmente la angiostatina tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente similar a la de un fragmento de plasminógeno murino que comienza en el aminoácido número 98 de una molécula de plasminógeno murino intacta.
10 La secuencia de aminoácidos de la angiostatina varía ligeramente entre las especies. Por ejemplo, en la angiostatina humana, la secuencia de aminoácidos es sustancialmente similar a la secuencia del fragmento de plasminógeno murino descrito anteriormente, aunque una secuencia de angiostatina humana activa puede comenzar en cualquier número de aminoácido 97 o 99 de una secuencia de aminoácidos de plasminógeno humano intacta. Además, el plasminógeno humano puede usarse ya que tiene actividad antiangiogénica similar, como se muestra en un modelo
15 de tumor de ratón.
Determinadas terapias antiangiogénicas ya se han mostrado que causan regresiones tumorales y la angiostatina es uno de estos agentes. La endostatina, un fragmento COOH-terminal de 20 kDa de colágeno XVIII, el polisacárido bacteriano CM101 y el anticuerpo LM609 también tienen actividad antiangiogénica. Sin embargo, a la luz de sus otras propiedades, se denominan terapias antivasculares o toxinas de vasos tumorales, ya que no solo inhiben la
20 angiogénesis sino también inician la destrucción de vasos tumorales a través de gran parte de mecanismos indefinidos.
La angiostatina y la endostatina se han convertido en el centro de intensos estudios, ya que son los primeros inhibidores de la angiogénesis que han demostrado la capacidad de inhibir no solo el crecimiento tumoral sino también causar regresiones tumorales en ratones. Hay múltiples proteasas que se ha observado que producen
25 angiostatina a partir de plasminógeno incluyendo elastasa, metaloelastasa de macrófagos (MME), matrilisina (MMP7) y gelatinasa B de 92 kDa/colagenasa de tipo IV (MMP-9).
La MME puede producir angiostatina a partir de plasminógeno en tumores y el factor de estimulación de colonias de
40 5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
granulocitos y macrófagos (GMCSF) regula positivamente la expresión de MME por macrófagos induciendo la producción de angiostatina. La función de la MME en la generación de la angiostatina está confirmada por el hallazgo de que, en efecto, la MME se expresa en muestras clínicas de carcinomas hepatocelulares de pacientes. Otra proteasa que se piensa que puede producir angiostatina es la estromelisina-1 (MMP-3). Se ha observado que la MMP-3 produce fragmentos similares a los de la angiostatina a partir de plasminógeno in vitro. El mecanismo de acción de la angiostatina es actualmente incierto, se crea la hipótesis de que se une a un receptor no identificado de la superficie celular o a células endoteliales induciendo que las células endoteliales sufran muerte celular programada o parada mitótica.
La endostatina parece ser un agente antiangiogénesis y antitumoral incluso más poderoso aunque su biología es menos clara. La endostatina es eficaz causando regresiones en diversos modelos de tumores en ratones. Los tumores no desarrollan resistencia a endostatina y, después de múltiples ciclos de tratamiento, los tumores entran en un estado inactivo durante el cual no aumentan de volumen. En este estado inactivo, el porcentaje de células tumorales que sufre apoptosis aumentó, produciendo una población que conserva esencialmente el mismo tamaño. Se piensa que la endostatina se une a un receptor de superficie de células endoteliales no identificado que actúa como mediador en este efecto.
La Patente de Estados Unidos nº 5.854.205, de Folkman y O'Reilly, se refiere a la endostatina y a su uso como un inhibidor de proliferación y angiogénesis de células endoteliales. La proteína endostatina corresponde a un fragmento C terminal de colágeno de tipo XVIII y la proteína puede aislarse de diversas fuentes. La Patente de Estados Unidos nº 5.854.205 también enseña que la endostatina puede tener una secuencia de aminoácidos de un fragmento de colágeno de tipo XVIII, de un colágeno de tipo XV, o de una esterasa pregástrica BOVMPE 1. También se describen combinaciones de endostatina con otras proteínas antiangiogénicas, particularmente angiostatina, en la Patente de Estados Unidos nº 5.854.205, de tal manera que las composiciones combinadas pueden disminuir la masa de un tumor dependiente de angiogénesis.
CM101 es un polisacárido bacteriano que se ha caracterizado bien en cuanto a su capacidad de inducir inflamación neovascular en tumores. CM101 se une y se entrecruza con receptores expresados en endotelio desdiferenciado que estimula la activación del sistema del complemento. También inicia una respuesta inflamatoria impulsada por citocinas que se dirige selectivamente al tumor. Este es un agente antipatoangiogénico exclusivo que regula por disminución la expresión de VEGF y sus receptores. CM101 está actualmente en ensayos clínicos como un fármaco contra el cáncer, y puede usarse en combinación con la presente invención.
La trombospondina (TSP-1) y el factor plaquetario 4 (PF4) también pueden usarse en la presente invención. Ambos son inhibidores de la angiogénesis que se asocian con heparina y se encuentran en gránulos α plaquetarios. La TSP-1 es una glucoproteína multidominio grande de 450 kDa que es un constituyente de la matriz extracelular. La TSP-1 se une a muchas de las moléculas de proteoglucano encontradas en la matriz extracelular incluyendo las HSPG, fibronectina, laminina y diferentes tipos de colágeno. La TSP-1 inhibe la migración y proliferación de células endoteliales in vitro y la angiogénesis in vivo. La TSP-1 también suprime el fenotipo maligno y la tumorogénesis de células endoteliales transformadas. Se ha demostrado que el gen supresor tumoral p53 regula directamente la expresión de TSP-1 de tal manera que, la pérdida de actividad de p53 causa una reducción drástica en la producción de TSP-1 y un aumento simultáneo en la angiogénesis iniciada por tumor.
El PF4 es una proteína de 70aa que es un miembro de la familia de quimiocinas CXC ELR que puede inhibir fuertemente la proliferación de células endoteliales in vitro y la angiogénesis in vivo. PF4 se administra por vía intratumoral o se suministra mediante un vector adenovírico que puede causar una inhibición del crecimiento tumoral.
Los interferones y los inhibidores de metaloproteinasa son dos clases distintas de inhibidores angiogénicos de origen natural que pueden suministrarse de acuerdo con la presente invención. La actividad antiendotelial de los interferones se conoce desde el inicio del año 1980, sin embargo, el mecanismo de inhibición aún no se conoce. Se sabe que pueden inhibir la migración de células endoteliales y que tienen alguna actividad antiangiogénica in vivo que está posiblemente mediada por su capacidad de inhibir la producción de promotores angiogénicos por células tumorales. Los tumores vasculares son, en particular, sensibles a interferón, por ejemplo, la proliferación de hemangiomas puede tratarse satisfactoriamente con IFNα.
Los inhibidores tisulares de las metaloproteinasas (TIMP) son una familia de inhibidores de origen natural de metaloproteasas de la matriz (MMP) que también pueden inhibir la angiogénesis y que pueden usarse en los protocolos de tratamiento de la presente invención. Las MMP desempeñan un papel clave en el proceso angiogénico ya que degradan la matriz a través de lo cual las células endoteliales y los fibroblastos migran cuando se extiende o remodela la red vascular. De hecho, se ha observado que, un miembro de las MMP, la MMP-2, se asocia con endotelio activado a través de la integrina αvβ3 supuestamente para esta finalidad. Si esta interacción se altera por un fragmento de MMP-2, entonces la angiogénesis se regula por disminución y se inhibe el crecimiento en los tumores.
Existen diversos agentes farmacológicos que inhiben la angiogénesis, pudiendo usarse uno cualquiera o más de los mismos como parte de la presente invención. Estos incluyen AGM-1470/TNP-470, talidomida y carboxiamidotriazol
41 5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
(CAI). En 1990 se descubrió que la fumagilina era un fuerte inhibidor de la angiogénesis y desde entonces se han desarrollado los análogos sintéticos de la fumagilina, AGM-1470 y TNP-470. Estos dos fármacos inhiben la proliferación de las células endoteliales in vitro y la angiogénesis in vivo. TNP-470 se ha estudiado exhaustivamente en ensayos clínicos en seres humanos con datos que sugieren que la administración prolongada es óptima.
La talidomida se usó originalmente como un sedante pero se descubrió que era un fuerte teratógeno y se suspendió. En 1994 se descubrió que la talidomida era un inhibidor de la angiogénesis. La talidomida está actualmente en ensayos clínicos como un agente anticanceroso así como en un tratamiento de enfermedades oculares vasculares.
El CAI es un inhibidor sintético de angiogénesis de bajo peso molecular que actúa como un bloqueador del canal de calcio que impide la reorganización de la actina, la migración y propagación de las células endoteliales en colágeno
IV. CAI inhibe la neovascularización a concentraciones fisiológicas asequibles y los pacientes con cáncer lo toleran bien por vía oral. Ensayos clínicos con CAI han producido una estabilización de la enfermedad en el 49 % de los pacientes con cáncer que tienen enfermedad progresiva antes del tratamiento.
La cortisona en presencia de heparina o de fragmentos de heparina se demostró que inhibía el crecimiento tumoral en ratones bloqueando la proliferación celular endotelial. El mecanismo implicado en el efecto inhibidor aditivo del esteroide y heparina es incierto aunque se piensa que la heparina puede aumentar la captación del esteroide mediante células endoteliales. Se ha observado que la mezcla aumenta la disolución de la membrana basal por debajo de los capilares recién formados y esto es también una posible explicación del efecto angiostático aditivo. Los conjugados de heparina-cortisol también tienen fuerte actividad con efectos angiostáticos y antitumorales in vivo.
Usando los métodos de direccionamiento tumoral de la presente invención se pueden suministrar a los tumores otros inhibidores de angiogénesis específicos. Estos incluyen, pero sin limitación, factor antiinvasivo, ácido retinoico y paclitaxel (Patente de Estados Unidos nº 5.716.981); AGM-1470 (Ingber et al., 1990); extracto de cartílago de tiburón (Patente de Estados Unidos nº 5.618.925); poliamida aniónica u oligómeros de poliurea (Patente de Estados Unidos nº 5.593.664); derivados de oxindol (Patente de Estados Unidos nº 5.576.330); derivados de estradiol (Patente de Estados Unidos nº 5.504.074); y derivados de tiazolopirimidina (Patente de Estados Unidos nº 5.599.813) también se contemplan para su uso como composiciones antiangiogénicas para los usos combinados de la presente invención.
Las composiciones que comprenden un antagonista de una αvβ3 integrina también pueden usarse para inhibir la angiogénesis como parte de la presente invención. Como se desvela en la Patente de Estados Unidos nº 5.766.591 los polipéptidos que contienen RGD y sales de los mismos, incluyendo polipéptidos cíclicos, son ejemplos adecuados de antagonistas de αvβ3 integrina.
Como las angiopoyetinas son ligandos de Tie2, también puede usarse otros métodos de intervención terapéutica basados en la alteración de la señalización a través del receptor de Tie2 en combinación con las mismas. Por ejemplo, puede emplearse un receptor de Tie2 soluble capaz de bloquear la activación de Tie2 (Lin et al., 1998a). Se ha observado que la administración de dicha construcción, usando terapia génica adenovírica recombinante, es eficaz en el tratamiento del cáncer y en la reducción de la metástasis (Lin et al., 1998a).
Las angiopoyetinas, en común con los miembros de la familia del VEGF, son factores de crecimiento específicos del endotelio vascular (Davis y Yancopoulos, 1999; Holash et al., 1999).
Las primeras angiopoyetinas descritas eran un activador o agonista del receptor de origen natural, la angiopoyetina 1 (Ang-1) y un antagonista del receptor de origen natural, la angiopoyetina 2 (Ang-2), actuando las dos mediante el receptor de tirosina quinasa de células endoteliales, Tie2.
También se han identificado dos nuevas angiopoyetinas, angiopoyetina-3 (ratón) y angiopoyetina-4 (ser humano) (Valenzuela et al, 1999). La angiopoyetina 3 parece actuar como un antagonista (al igual que Ang-2), mientras que la angiopoyetina 4 parece actuar como un agonista (al igual que Ang-1) (Valenzuela et al, 1999). También se clonó una proteína denominada angiopoyetina 3 de corazón humano y se describió que no tenía efectos mitogénicos sobre las células endoteliales (Kim et al, 1999).
Mientras que el VEGF es necesario para las etapas iniciales del desarrollo vascular, generalmente la angiopoyetina1 se requiere para las fases de vascularización posteriores. Por tanto VEGF actúa para promover la diferenciación, proliferación y formación de vasos primitivos de las células endoteliales. La angiopoyetina-1 actúa, mediante el receptor de Tie2, para promover el mantenimiento y estabilización de vasos maduros. Por tanto la angiopoyetina-1 es un factor de maduración o estabilización, que se piensa que transforma los vasos inmaduros en vasos maduros promoviendo interacciones entre células endoteliales y células de soporte circundantes (Holash et al, 1999).
E6. Agentes inductores de apoptosis
La presente invención también puede usarse para suministrar agentes que inducen apoptosis en cualquier célula, incluyendo células tumorales, células endoteliales vasculares tumorales y células infectadas con virus. Muchos agentes anticancerosos tienen, como parte de su mecanismo de acción, un efecto inductor de apoptosis. Uno cualquiera o más de dichos agentes descritos para su uso en terapias de combinación, incluyendo los indicados en la Tabla F, también pueden conjugarse con una construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención, como se
42
imagen24
TABLA G Virus causantes de enfermedades comunes y fármacos antivíricos
Virus Causantes de Enfermedades
Categorías de Fármaco Fármacos antivíricos ejemplares
Virus del herpes
Cidofovir, aciclovir, penciclovir (famciclovir), ganciclovir (ganciclovir), desoxiguanosina, foscarnet, idoxuridina, trifluorotimidina, vidarabina, sorivudina
Retrovirus
Inhibidores nucleosídicos de transcriptasa inversa (RT) Zidovudina, didanosina, zalcitabina, lamivudina, estavudina, abacavir, resistencia A multinucleósido, resistencia B multinucleósido
Inhibidores no nucleosídicos de RT
Nevirapina, delavirdina, efavirenz, Adefovir, Dipivoxil
Inhibidores de Proteasa
Indinavir, ritonavir, saquinavir, nelfinavir, amprenavir
Antineoplásicos específicos de fases del ciclo celular
Hidroxiurea (Hydrea, Bristol Myers-Squibb)
Hepatitis B
Trifosfato de desoxicitosina, trifosfato de lamivudina, trifosfato de emticitabina, difosfato de adefovir, trifosfato de penciclovir, trifosfato de lobucavir
Hepatitis C
Interferón alfa, ribavirina
Gripe A y B
Amantadina, rimantadina, zanamivir, oseltamivir
Dentro de la serie de gentes y fármacos antivíricos, normalmente se refieren AZT y cidofovir. Independientemente
5 del fármaco antivírico seleccionado, el conjugado antivírico se unirá a macrófagos en los pulmones, a células infectadas con virus y también puede unirse a partículas de virus. Dependiendo del enlazador o de la tecnología de conjugación que se utilice, el fármaco antivírico puede liberarse en la superficie de la célula diana y después introducirse en su interior. Preferentemente, el propio conjugado se introduce en la célula, tal como un macrófago o una célula infectada con virus. La introducción puede producirse bien de forma natural o puede mediarse por virus.
10 Una vez dentro de la célula, al igual que ocurre con un conjugado de anticuerpo, la hidrólisis del enlazador libera el agente antivírico activo.
Pueden usarse otros enlazadores que contengan enlaces biológicamente lábiles, tales como, por ejemplo, enlaces disulfuro, ácido lábiles, enzimáticamente escindibles o hidrolizables. Por consiguiente, junto con los antivíricos de la presente invención, puede usarse cualquier enlace biológicamente liberable o selectivamente hidrolizable descrito
15 para su uso en relación con agentes terapéuticos.
F. Equivalentes biológicamente funcionales
Equivalentes, o incluso mejoras, de una construcción, receptorcuerpo o betacuerpo pueden ahora prepararse, generalmente usando los materiales proporcionados anteriormente como punto de partida. Pueden efectuarse modificaciones y cambios en la estructura de dicha construcción, receptorcuerpo o betacuerpo y seguir obteniendo
20 una molécula que tenga las mismas características, o de otro modo, deseables. Por ejemplo, determinados aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos en una estructura proteica sin pérdida apreciable de capacidad de unión interactiva. Estas consideraciones también se aplican a toxinas, a agentes antiangiogénicos, a agentes inductores de apoptosis, a coagulantes y similares.
Dado que es la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína lo que define la actividad funcional biológica de
25 las proteínas, pueden hacerse determinadas sustituciones en la secuencia de aminoácidos en una secuencia proteica (o por supuesto, en la secuencia de ADN subyacente) y sin embargo obtener una proteína con propiedades parecidas (agonistícas). Por tanto se contempla que puedan hacerse diversos cambios en la secuencia de los
44 5
10
15
20
anticuerpos o agentes terapéuticos (o secuencias de ADN subyacentes) sin pérdida apreciable de su utilidad o actividad biológica. Los equivalentes funcionales biológicos preparados a partir de mutación de una secuencia de ADN subyacente pueden prepararse usando la información de codones proporcionada en la Tabla A del presente documento y los detalles técnicos probatorios sobre la mutagénesis específica de sitio.
TABLA A
Aminoácidos Codones
Alanina
Ala A GCA GCC GCG GCU
Cisteína
Cys C UGC UGU
Ácido aspártico
Asp D GAC GAU
Ácido glutámico
Glu E GAA GAG
Fenilalanina
Phe F UUC UUU
Glicina
Gly G GGA GGC GGG GGU
Histidina
His H CAC CAU
Isoleucina
Ile I AUA AUC AUU
Lisina
Lys K AAA AAG
Leucina
Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU
Metionina
Met M AUG
Asparagina
Asn N AAC AAU
Prolina
Pro P CCA CCC CCG CCU
Glutamina
Gln Q CAA CAG
Arginina
Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU
Serina
Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU
Treonina
Thr T ACA ACC ACG ACU
Valina
Val V GUA GUC GUG GUU
Triptófano
Trp W UGG
Tirosina
Tyr Y UACUAU
También entenderá bien el experto en la técnica que, inherente en la definición de una proteína o péptido “equivalente funcional desde el punto de vista biológico”, es el concepto de que dentro de una parte definida de la molécula puede realizarse un número de cambios limitado y seguirá resultando ser una molécula con un nivel aceptable de actividad biológica equivalente. Las proteínas y péptidos equivalentes funcionales desde el punto de vista biológico se definen por tanto en el presente documento como aquellas proteínas y péptidos en los que determinados aminoácidos, sino la mayoría o todos, pueden sustituirse. Por supuesto, una pluralidad de distintas proteínas/péptidos con diferentes sustituciones pueden prepararse fácilmente y usarse de acuerdo con la invención.
Generalmente las sustituciones de aminoácidos se basan en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral de aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y similares. Un análisis del tamaño, forma y tipo de los sustituyentes de la cadena lateral de aminoácidos revela que la arginina, la lisina y la histidina son restos con carga positiva; que la alanina, la glicina y la serina son todas de tamaño similar y que la fenilalanina, el triptófano y la tirosina tienen una forma generalmente similar. Por lo tanto, basándose en estos aspectos, la arginina, la lisina y la histidina; la alanina, la glicina y la serina; y la fenilalanina, el triptófano y la tirosina, se definen en el presente documento como equivalentes funcionales desde el punto de vista biológico.
Al hacer cambios más cuantitativos, puede considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático según su hidrofobicidad y características de carga; estos son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cisteína (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2);
45 5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).
La importancia del índice hidropático de los aminoácidos confiriendo una función biológica interactiva sobre una proteína generalmente se entiende en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982). Se sabe que determinados aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tienen un índice hidropático o puntuación similar y siguen conservando una actividad biológica similar. Al hacer cambios según el índice hidropático, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de ±2, prefiriéndose en particular los que están dentro de ±1 y los que están dentro de ±0,5 son incluso más particularmente preferidos.
Por tanto se entiende que un aminoácido puede sustituirse por otro que tenga un valor de hidrofilicidad similar y seguir obteniendo una proteína equivalente desde el punto de vista biológico. Como se detalla en la Patente de Estados Unidos nº 4.554.101, se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a los restos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ±1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4).
Al hacer cambios según los valores de hidrofilicidad, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ±2, prefiriéndose en particular los que están dentro de ±1 y los que están dentro de ±0,5 son incluso más particularmente preferidos.
G. Conjugación
Una región Fc de anticuerpo está conectada operativamente, asociada con o conjugada a, al menos una primera proteína de unión a fosfatidilserina para proporcionar una construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención. Dicha construcción, receptorcuerpo o betacuerpo puede conjugarse o conectarse adicionalmente, por ejemplo, a agentes anticelulares y citotóxicos, coagulantes y agentes antivíricos.
Aunque se prefieren los enlaces covalentes, también pueden usarse otros medios de conexión operativa. Por ejemplo, puede generarse cualquier construcción ligada usando puentes de avidina:biotina. Además del conocimiento de que disponen los expertos habituales en la técnica, la Patente de Estados Unidos del mismo propietario que la presente nº 6.093.399 se identifica específicamente con la finalidad de describir y permitir incluso adicionalmente el uso de avidina:biotina en la conexión operativa de agentes de direccionamiento con agentes biológicos y terapéuticos.
Cualquiera de dos o tres agentes también pueden unirse a través de una segunda región de unión, preferentemente una región de unión de anticuerpo o antígeno de los mismos. Esto se ilustra mediante coaguligandos en los que el agente de direccionamiento está ligado al coagulante a través de una segunda región de unión (Patentes de Estados Unidos nº 6.093.399, 6.004.555, 5.877.289, y 6.036.955), que se han preparado allí y usado satisfactoriamente en el tratamiento del cáncer.
La tecnología con inmunoconjugados es ahora generalmente conocida en la técnica. Sin embargo, pueden conseguirse determinadas ventajas a través de la aplicación de determinada tecnología preferida, tanto en la preparación como en la purificación para administración clínica posterior. Además, aunque se conocen numerosos tipos de enlazadores que contienen enlaces disulfuro que pueden emplearse satisfactoriamente en conjugación, generalmente se preferirán determinados enlazadores sobre otros, basándose en las diferentes características y capacidades farmacológicas. Por ejemplo, pueden preferirse enlazadores que contienen un enlace disulfuro que está “estéricamente” oculto, debido a su mayor estabilidad in vivo, impidiendo así la liberación antes de la unión en el sitio de acción.
Cada tipo de agente de entrecruzamiento, así como el modo en el que se realiza el entrecruzamiento, tenderá a variar la farmacodinámica del conjugado resultante. Puede desearse tener un conjugado que permanezca intacto en condiciones encontradas en cualquier parte del organismo excepto en el sitio de acción deseado, punto en el cual es deseable que el conjugado tenga buenas características de “liberación”. Por lo tanto, el esquema de entrecruzamiento particular, incluyendo el reactivo de entrecruzamiento usado y las estructuras que estén entrecruzadas, tendrán cierto significado.
Dependiendo de los agentes específicos que se vayan a conjugar, puede ser necesario o deseable proporcionar un espaciador peptídico conectado operativamente a los agentes. Determinados espaciadores peptídicos pueden plegarse en una estructura en forma de bucle unido por enlace disulfuro. La escisión proteolítica dentro del bucle podría por tanto dar lugar a un polipéptido heterodimérico en el que los agentes están únicamente ligados por un solo enlace disulfuro. Un ejemplo de dicha toxina es la toxina de la cadena A de ricina.
Cuando se utilizan otros compuestos de toxinas determinados, puede proporcionarse un espaciador peptídico no escindible para conectar operativamente el compuesto de toxina de la proteína de fusión. Las toxinas que pueden usarse junto con espaciadores peptídicos no escindibles son aquellas que pueden, en sí mismas, transformarse mediante escisión proteolítica, en una forma citotóxica unida por enlace disulfuro. Un ejemplo de dicho compuesto de toxina es un compuesto exotoxina de Pseudonomas.
46
Ahora se han conjugado satisfactoriamente diversos agentes quimioterapéuticos y otros agentes farmacológicos y se demuestra que funcionan desde el punto de vista farmacológico. Los agentes antineoplásicos ejemplares que se han investigado incluyen doxorrubicina, daunomicina, metrotexato, vinblastina y diversos otros. Además, se ha descrito la conexión de otros agentes, tales como neocarcinostatina, macromicina, trenimón y α-amanitina. Estos métodos de
5 conexión pueden adaptarse para su uso con los mismos.
Cualquier enlace covalente debe prepararse idealmente en un sitio distinto del sitio (o sitios) funcional. Por tanto las composiciones están “ligadas” de cualquier manera operativa que se permite que cada región se realice y pretenden actuar sin alterarse significativamente, en particular, de manera que la construcción resultante aún se una a la PS deseada y por tanto que el uno o más agentes unidos mantengan sustancialmente la actividad biológica y/o recupere
10 la actividad biológica cuando se libere de la construcción.
También se contempla la conexión de agentes biológicos mediante restos de hidratos de carbono en regiones Fc. La glucosilación, tanto ligada a O como a N, se produce naturalmente en anticuerpos. Los anticuerpos recombinantes pueden modificarse para volver a crear o crear sitios de glucosilación adicionales si se desea, que se realiza simplemente modificando por ingeniería genética las secuencias de aminoácidos apropiadas (tales como Asn-X-Ser,
15 Asn-X-Thr, Ser o Thr) en la secuencia primaria del anticuerpo.
G1. Agentes de entrecruzamiento bioquímicos
Además de la información general proporcionada anteriormente, pueden usarse determinados agentes de entrecruzamiento bioquímicos preferidos. Los reactivos de entrecruzamiento se usan para formar puentes moleculares que unen entre sí grupos funcionales de dos moléculas diferentes. Para ligar dos proteínas diferentes
20 de una manera gradual, pueden usarse agentes de entrecruzamiento heterobifuncionales que eliminen la formación de homopolímeros no deseada. En la Tabla C se indican ejemplos de agentes de entrecruzamiento heterobifuncionales.
TABLA C
AGENTES DE ENTRECRUZAMIENTO HETEROBIFUNCIONALES
Enlazador
Reactivo hacia Ventajas y Aplicaciones Longitud del Brazo Espaciador después del entrecruzamiento
SMPT
Aminas primarias Sulfhidrilos • Mayor estabilidad 11,2 A
SPDP
Aminas primarias Sulfhidrilos • Tiolación • Entrecruzamiento escindible 6,8 A
LC-SPDP
Aminas primarias Sulfhidrilos • Brazo espaciador extendido 15,6 A
Sulfo-LC-SPDP
Aminas primarias Sulfhidrilos • Brazo espaciador extendido • Hidrosoluble 15,6 A
SMCC
Aminas primarias Sulfhidrilos • Grupo reactivo de maleimida estable • Conjugación enzima -anticuerpo • Conjugación proteína transportadora-hapteno 11,6 A
Sulfo-SMCC
Aminas primarias Sulfhidrilos • Grupo reactivo de maleimida estable • Hidrosoluble • Conjugación enzima-anticuerpo 11,6 A
MBS
Aminas primarias Sulfhidrilos • Conjugación enzima-anticuerpo • Conjugación proteína transportadora-hapteno 9,9 A
Sulfo-MBS
Aminas primarias Sulfhidrilos • Hidrosoluble 9,9 A
47 5
10
15
20
25
30
35
Enlazador
Reactivo hacia Ventajas y Aplicaciones Longitud del Brazo Espaciador después del entrecruzamiento
SIAB
Aminas primarias Sulfhidrilos • Conjugación enzima-anticuerpo 10,6 A
Sulfo-SIAB
Aminas primarias Sulfhidrilos • Hidrosoluble 10,6 A
SMPB
Aminas primarias Sulfhidrilos • Brazo espaciador extendido • Conjugación enzima-anticuerpo 14,5 A
Sulfo-SMPB
Aminas primarias Sulfhidrilos • Brazo espaciador extendido • Hidrosoluble 14,5 A
EDC/Sulfo-NHS
Aminas primarias Grupos carboxilo • Conjugación hapteno-transportador 0
ABH
Hidratos de carbono No selectivos • Reacciona con grupos azúcar 11,9 A
Los agentes de entrecruzamiento heterobifuncionales contienen dos grupos reactivos: uno que generalmente reacciona con grupos amina primarios (por ejemplo N-hidroxi succinimida) y el otro que generalmente reacciona con un grupo tiol (por ejemplo, piridil disulfuros, maleimidas, halógenos, etc.). A través del grupo reactivo amina primario, el agente de entrecruzamiento puede reaccionar con el resto (o restos) de lisina de una proteína y a través del grupo reactivo tiol, el agente de entrecruzamiento, ya unido a la primera proteína, reacciona con el resto de cisteína (grupo sulfihidrilo libre) de la otra proteína.
Por lo tanto, generalmente las composiciones tienen, o se derivatizan para que tengan, un grupo funcional disponible para el entrecruzamiento. Este requisito no se considera limitante ya que de esta manera puede usarse una amplia variedad de grupos. Por ejemplo, pueden usarse grupos amina primarios o secundarios, grupos hidrazida o hidrazina, alcohol carboxílico, fosfato, carbamato o grupos alquilantes para la unión o el entrecruzamiento.
El brazo espaciador entre los dos grupos reactivos de un agente de entrecruzamiento puede tener diversas longitudes y composiciones químicas. Un brazo espaciador más largo permite una mejor flexibilidad de los componentes conjugados aunque algunos componentes particulares en el puente (por ejemplo, grupo benceno) pueden conducir a una estabilidad extra en el grupo reactivo o a una resistencia aumentada del enlace químico con respecto a la acción de diversos aspectos (por ejemplo resistente a enlace disulfuro para agentes reductores). También se contempla el uso de espaciadores peptídicos, tales como L-Leu-L-Ala-L-Leu-L-Ala.
Se prefiere emplear un agente de entrecruzamiento que tenga una estabilidad razonable en sangre. Se conocen numerosos tipos de enlazadores que contienen enlaces disulfuro que pueden emplearse satisfactoriamente en la conjugación. Los enlazadores que contienen un enlace disulfuro que está estéricamente oculto pueden proporcionar una mayor estabilidad in vivo, prevenir la liberación del agente antes de la unión en el sitio de acción. Estos enlazadores son por tanto un grupo de agentes enlazadores preferido.
Uno de los agentes de entrecruzamiento más preferidos es SMPT, que es un agente de entrecruzamiento bifuncional que contiene un enlace disulfuro que está “estéricamente oculto” mediante un anillo de benceno adyacente y grupos metilo. Se piensa que el impedimento estérico del enlace disulfuro hace la función de proteger el enlace del ataque de aniones de tiolato tales como glutatión que pueden estar presentes en los tejidos y en la sangre, y por lo tanto ayudar en la prevención desacoplando el conjugado antes de la liberación del agente unido al sitio del tumor. Se contempla que el agente SMPT también pueda usarse junto con los conjugados de la presente invención.
El reactivo de entrecruzamiento SMPT, así como muchos otros agentes de entrecruzamiento conocidos, ofrecen la capacidad de entrecruzar grupos funcionales tales como el SH de la cisteína o aminas primarias (por ejemplo, el grupo amino épsilon de lisina). Otros tipos posibles de agentes de entrecruzamiento incluyen las fenilazinas fotorreactivas heterobifuncionales que contienen un enlace disulfuro escindible tal como sulfosuccinimidil-2-(p-azido salicilamido) etil-1-3’-ditiopropionato. El grupo N-hidroxisuccinimidilo reacciona con grupos amino primarios y la fenilazida (después de fotolisis) reacciona no selectivamente con cualquier resto de aminoácido.
48
imagen25
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
plasmina, tales como las escindibles por prouroquinasa, TFGβ, plasminógeno y estafiloquinasa; secuencias escinsibles por Factor Xa; secuencias escindibles por MMP, tales como las escindibles por gelatinasa A; secuencias escindibles por colagenasa, tales como las escindibles por colágeno de piel de ternero (cadena α1(I)), colágeno de piel de ternero (cadena α2(I)), colágeno de cartílago de bovino (cadena α1(II)), colágeno de hígado humano (cadena α1(III)), α2M humana, PZP humana, α1M de rata, α2M de rata, α1I3(2J) de rata, α1I3(27J) de rata y sitios de escisión autolítica de colagenasa de fibroblastos humanos. Además del conocimiento disponible para los expertos habituales en la técnica, el texto y las secuencias de la Tabla B2 en las Patentes de Estados Unidos del mismo propietario que la presente nº 6.342.219, 6.524.583, 6.342.221 y 6.416.758 se identifican específicamente con la finalidad de describir también adicionalmente y permitir el uso de dichas secuencias escindibles.
G3. Proteínas de fusión y expresión recombinante
Una construcción, receptorcuerpo o betacuerpo puede prepararse como una proteína de fusión usando técnicas de biología molecular. Cualquier proteína de fusión puede diseñarse y prepararse usando cualquier construcción, receptorcuerpo o betacuerpo y segundos agentes terapéuticos desvelados en el presente documento y los conocidos en la técnica. La tecnología de proteínas de fusión es fácilmente adaptable para preparar proteínas de fusión con otras modificaciones, tales como enlace mediante una secuencia peptídica selectivamente escindible y similar.
El uso de técnicas de ADN recombinante para conseguir dichos fines es ahora una práctica convencional para los expertos en la técnica. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación in vivo/recombinación genética. Además, la síntesis de ADN y ARN puede realizarse usando sintetizadores automatizados (véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al, 1989).
La preparación de dicha proteína de fusión generalmente conlleva la preparación de una primera y una segunda región codificante de ADN y el ligamiento funcional o unión de dichas regiones, en fase, para preparar una sola región codificante que codifique la proteína de fusión deseada. Una vez que se ha producido la región codificante deseada, se crea un vector de expresión. Los vectores de expresión contienen uno o más promotores cadena arriba de las regiones de ADN insertadas que actúan para promover la transcripción del ADN y por tanto promover la expresión de la proteína recombinante codificada. Este es el significado de “expresión recombinante”.
Para obtener una versión denominada “recombinante” de una construcción, receptorcuerpo o betacuerpo, el vector se expresa en una célula recombinante. La modificación por ingeniería genética de uno o más segmentos de ADN para la expresión en un sistema procariota o eucariota puede realizarse por técnicas generalmente conocidas por los expertos en la expresión recombinante. Se piensa que prácticamente cualquier sistema de expresión puede emplearse en la expresión.
Una construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención puede expresarse satisfactoriamente en sistemas de expresión eucariotas, por ejemplo, células CHO, sin embargo, se contempla que los sistemas de expresión bacterianos, tal como pQE-60 de E. coli sean particularmente útiles para la preparación a gran escala y posterior purificación de las construcciones. Los ADNc también pueden expresarse en sistemas bacterianos, expresándose las proteínas codificadas como fusiones con β-galactosidasa, ubiquitina, glutatión S-transferasa de Schistosoma japonicum y similares. Se piensa que la expresión bacteriana tendrá ventajas sobre la expresión eucariota en términos de facilidad de uso y cantidad de materiales obtenidos mediante la misma.
En términos de expresión microbiana, las Patentes de Estados Unidos nº 5.583.013; 5.221.619; 4.785.420; 4.704.362; y 4.366.246 se identifican con la finalidad de complementar adicionalmente la presente divulgación junto con la expresión de genes en las células hospedadoras recombinantes.
Una construcción, receptorcuerpo o betacuerpo producido de manera recombinante puede purificarse y formularse para su administración en seres humanos. Como alternativa, los ácidos nucleicos que codifican una construcción, receptorcuerpo o betacuerpo pueden suministrarse mediante terapia génica. Aunque puede emplearse ADN recombinante desnudo o plásmidos, se prefiere el uso de liposomas o vectores. La capacidad de determinados virus para introducirse en células mediante endocitosis mediada por receptores y de integrarse en el genoma de la célula hospedadora y expresar genes de virus de manera estable y eficaz, los ha convertido en candidatos atractivos para la transferencia de genes extraños en células de mamífero. Los vectores de terapia génica preferidos para su uso en la presente invención serán generalmente vectores de virus.
Los retrovirus son prometedores como vectores de liberación de genes debido a su capacidad para integrar sus genes en el genoma hospedador, transferir una gran cantidad de material genético extraño, infectar un amplio espectro de especies y tipos de células y de empaquetarse en líneas celulares especiales. Otros virus, tales como adenovirus, virus del herpes simple (HSV), citomegalovirus (CMV) y adenovirus asociados (AAV), tales como los descritos en la Patente de Estados Unidos 5.139.941, también pueden modificarse por ingeniería genética para servir como vectores para transferencia génica.
Aunque algunos virus que pueden aceptar material genético extraño están limitados en el número de nucleótidos estos pueden acomodarse y en la serie de células que infectan, estos virus han demostrado que efectúan satisfactoriamente la expresión génica. Sin embargo, los adenovirus no integran su material genético en el genoma
50 5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
del hospedador y por lo tanto no requieren la replicación del hospedador para la expresión génica, haciendo que sean idealmente adecuados para una expresión génica rápida, eficaz y heteróloga. Las técnicas para preparar virus infecciosos con replicación defectuosa se conocen bien en la materia.
En determinadas realizaciones adicionales, el vector de terapia génica será el HSV. Un factor que hace que el HSV sea un vector atractivo es el tamaño y organización del genoma. Dado que el HSV es grande, la incorporación de genes múltiples o casetes de expresión es menos problemática que en otros sistemas víricos más pequeños. Además, la disponibilidad de diferentes secuencias de control víricas con diverso redimiento (por ejemplo temporal, fuerza) hace que sea posible controlar la expresión a un mayor grado que en otros sistemas. También es una ventaja que el virus tenga relativamente pocos mensajes cortados y empalmados, facilitando adicionalmente las manipulaciones genéticas. El HSV también es relativamente fácil de manipular y puede desarrollarse a elevados títulos.
Por supuesto, en el uso de sistemas de liberación de virus, se deseará purificar el virión suficientemente para producirlo esencialmente libre de contaminantes no deseables, tales como partículas víricas de interferencia defectuosas o pirógenos de tal manera que no causen ninguna reacción adversa en la célula, animal o individuo que recibe la construcción vectorial. Un medio de purificación preferido del vector implica el uso de gradientes de densidad boyante, tal como centrifugación en gradiente con cloruro de cesio.
H. Composiciones farmacéuticas
Los agentes terapéuticos de la presente invención se formularán generalmente como composiciones farmacéuticas. Las composiciones farmacéuticas comprenderán una cantidad biológica o terapéuticamente eficaz de al menos un primer agente terapéutico de la invención, disuelto o disperso en un transportador o medio acuoso farmacéuticamente aceptable. Los agentes terapéuticos combinados también se contemplan, y puede emplearse el mismo tipo de composiciones farmacéuticas fundamentales para medicamentos tanto simples como combinados.
Las frases “farmacéutica o farmacológicamente aceptables” se refieren a entidades moleculares y a composiciones que no producen una reacción adversa alérgica o de cualquier otro tipo no deseado, cuando se administra a un animal, o a un ser humano, según sea apropiado. Igualmente se incluyen los usos veterinarios en la invención y las formulaciones “farmacéuticamente aceptables” incluyen formulaciones para uso tanto clínico como veterinario.
Como se usa en el presente documento, “transportador farmacéuticamente aceptable” incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticas activas es muy conocido en la técnica. En la medida en la que cualquier medio o agente convencional sea compatible con el principio activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. Para la administración en seres humanos, las preparaciones deben cumplir con los estándares de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza requeridos por la FDA Office of Biological Standards. En las composiciones también pueden incorporarse principios activos complementarios.
Las formulaciones de “dosificación unitaria” son aquellas que contienen una dosis o subdosis del principio administrado que se adapta para una liberación particular en el tiempo. Por ejemplo, las formulaciones de “dosificación unitaria” ejemplares son aquellas que contienen una dosis o unidad diaria o una subdosis diaria o una dosis o unidad semanal o una subdosis semanal y similar.
H1. Formulaciones inyectables
Los agentes terapéuticos de la invención se formularán frecuentemente para administración parenteral, particularmente para el tratamiento de tumores, por ejemplo, formulados para inyección mediante vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, transdérmica u otras de este tipo, incluyendo la administración peristáltica y la instilación directa en un tumor o un sitio enfermo (administración intracavidad). La preparación de una composición acuosa que contenga un anticuerpo, inmunoconjugado o conjugado peptídico como un principio activo será conocida por los expertos en la técnica a la luz de la presente divulgación. Típicamente dichas composiciones pueden prepararse como inyectables, bien como soluciones o suspensiones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para su uso para preparar soluciones o suspensiones después de la adición de un líquido antes de inyección; y las preparaciones también pueden emulsionarse.
Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles; formulaciones que incluyen aceite de sésamo, aceite de cacahuete, o propilenglicol acuoso; y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y fluida en la medida que puedan utilizarse con una jeringa. Debe ser estable en condiciones de fabricación y conservación y debe preservarse contra la acción de microorganismos contaminantes, tales como bacterias y hongos.
Los agentes terapéuticos pueden formularse en una composición acuosa estéril en una forma neutra o salina. Las soluciones de agentes terapéuticos como bases libres o sales farmacológicamente aceptables pueden prepararse en agua mezcladas adecuadamente con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las sales farmacéuticamente
51 5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
aceptables, incluyen las sales de adición de ácidos (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y las que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico y fosfórico o ácidos orgánicos tales como ácido acético, trifluoroacético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden proceder de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxido de sodio, potasio, amoniaco, calcio o hierro, y de bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares.
Los transportadores adecuados incluyen medios disolventes y de dispersión que contienen, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similar), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, manteniendo el tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y/o mediante el uso de tensioactivos.
En condiciones habituales de almacenamiento y uso, todas estas preparaciones deben contener un conservante para impedir el crecimiento de microorganismos. La prevención de la acción de microorganismos puede realizarse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede realizarse mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Antes o después de la formulación, los agentes terapéuticos deben dializarse ampliamente para retirar moléculas no deseadas de bajo peso molecular y/o liofilizarse para una formulación más fácil en un vehículo deseado, cuando sea apropiado. Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando los agentes activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con varios de los otros principios indicados anteriormente, según se desee, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, se preparan dispersiones incorporando los varios principios activos esterilizados en un vehículo estéril que contenga el medio de dispersión básico y los otros principios requeridos de los indicados anteriormente.
En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son las técnicas de secado al vacío y criodesecación que producen un polvo del principio activo, más cualquier principio deseado adicional a partir de una solución previamente esterilizada y filtrada de la misma.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas de acuerdo con la invención generalmente incluirán una cantidad del agente terapéutico mezclada con un diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como una solución acuosa estéril, para proporcionar una serie de concentraciones finales, dependiendo del uso que quiera darse. Las técnicas de preparación son generalmente muy conocidas en la técnica, como las que se ilustran en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª Ed. Mack Publishing Company, 1980. Para la administración en seres humanos, las preparaciones deben cumplir los estándares de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza requeridos por la FDA Office of Biological Standards. Después de la formulación, los agentes terapéuticos se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz.
H2. Formulaciones de liberación sostenida
Las formulaciones se administran fácilmente en diversas formas de dosificación, tales como los tipos de soluciones inyectables descritos anteriormente, pero también se contemplan otras formas farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, comprimidos, píldoras, cápsulas u otros sólidos para administración oral, supositorios, pesarios, soluciones nasales o pulverizadores, aerosoles, inhalantes, formulaciones tópicas, formulaciones liposomales y similares. Los tipos de forma para la administración tendrán correspondencia con la enfermedad o trastorno que se vaya a tratar.
También se pueden usar cápsulas de “liberación lenta” o composiciones o preparaciones farmacéuticas de “liberación sostenida”. Las formulaciones de liberación lenta se diseñan generalmente para ofrecer un nivel de fármaco constante sobre un periodo prolongado y pueden usarse para suministrar los agentes terapéuticos de acuerdo con la presente invención. Las formulaciones de liberación lenta se implantan típicamente cerca del sitio enfermo, por ejemplo, en el sitio de un tumor o infección vírica.
Como ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida se incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen agentes terapéuticos, cuyas matrices están en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres; hidrogeles, por ejemplo, poli(2-hidroxietiI-metacrilato) o poli(alcohol vinílico); polilactidas, por ejemplo, Patente de Estados Unidos nº 3.773.919; copolímeros de ácido L-glutámico y γ etil-L-glutamato; acetato de etilen vinilo no degradable; copolímeros degradables de ácido láctico -ácido glicólico, tales como Lupron Depot™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida); y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
Aunque polímeros tales como acetato de etilen vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, determinados hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el organismo durante un largo periodo de tiempo, estos pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37 ºC, reduciendo de
52 5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
este modo la actividad biológica y/o cambiando la inmunogenicidad. Se dispone de estrategias lógicas para la estabilización dependiendo del mecanismo que esté implicado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación implica la formación de enlaces S-S intermoleculares a través de intercambio tio-disulfuro, la estabilización se realiza modificando restos de sulfihidrilo, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos apropiados, desarrollando composiciones de matrices poliméricas específicas y estrategias similares.
H3. Liposomas y nanocápsulas
En determinadas realizaciones, los liposomas y/o nanocápsulas también pueden emplearse con los agentes terapéuticos. La formación y uso de liposomas es generalmente conocida por los expertos en la técnica, como se resume más adelante. La presente invención proporciona combinaciones particulares de anticuerpos, liposomas de agentes quimioterapéuticos, que se describen más adelante. Además, puede usarse una formación liposomal como un componente habitual de cualquiera de los agentes terapéuticos de la invención en general.
Los liposomas se forman a partir de fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas bicapa concéntricas multilaminares (también denominadas vesículas multilaminares (MLV). Generalmente, las MLV tienen diámetros de 25 nm a 4 μm. El tratamiento con ultrasonido de las MLV da como resultado la formación de vesículas unilaminares pequeñas (SUV) con diámetros en el intervalo de 200 a 500 Å, que contienen una solución acuosa en el núcleo.
Los fosfolípidos pueden formar diversas estructuras que no son liposomas cuando se dispersan en agua, dependiendo de la proporción molar de lípido con respecto a agua. A bajas proporciones el liposoma es la estructura preferida. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, de la fuerza iónica y de la presencia de cationes divalentes. Los liposomas pueden presentar baja permeabilidad con respecto a sustancias iónicas y polares, pero a elevadas temperaturas experimentan una fase de transición que altera notablemente su permeabilidad. La fase de transición implica un cambio de una estructura fuertemente empaquetada, ordenada, conocida como estado gel, a una estructura laxamente empaquetada, menos ordenada, conocida como estado fluido. Esto se produce a una temperatura de transición característica y da como resultado el aumento de la permeabilidad a iones, azúcares y fármacos.
Los liposomas interaccionan con células mediante cuatro mecanismos diferentes: endocitosis por células fagocíticas, tales como macrófagos y neutrófilos, del sistema retículoendotelial; adsorción en la superficie celular, mediante fuerzas hidrófobas o electroestáticas débiles no específicas, o mediante interacciones específicas con componentes de la superficie celular; fusión con la membrana celular plasmática por inserción de la bicapa lipídica del liposoma en la membrana plasmática, con liberación simultánea del contenido liposomal en el citoplasma; y por transferencia de lípidos liposomales a las membranas celulares o subcelulares, o viceversa, sin ninguna asociación del contenido del liposoma. La variación de la formulación del liposoma, cuyo mecanismo es operativo, puede alterare, aunque más de uno puede ser operativo al mismo tiempo.
Las nanocápsulas pueden generalmente atrapar compuestos de una manera estable y reproducible. Para impedir efectos secundarios debido a la sobrecarga polimérica intracelular, dichas partículas ultrafinas (de un tamaño de aproximadamente 0,1 μm) deben diseñarse usando polímeros que puedan degradarse in vivo. Las nanopartículas de polialquil cianoacrilato biodegradables que cumplen estos requisitos se contemplan para su uso en la presente invención y dichas partículas pueden prepararse fácilmente.
H4. Formulaciones oftálmicas
Muchas enfermedades oculares, particularmente aquellas que tienen un componente angiogénico, pueden tratarse con la presente invención. Por ejemplo, enfermedad neovascular ocular, degeneración macular relacionada con la edad, retinopatía diabética, retinopatía del prematuro, rechazo de injerto de córnea, glaucoma neovascular, fibroplasias retrolentales y otras enfermedades asociadas con neovascularización de la córnea o neovascularización de la retinal/coroides, como se describe más adelante en el presente documento.
Los agentes terapéuticos de la presente invención pueden emplearse por tanto de manera ventajosa en la preparación de composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso como soluciones oftálmicas, incluyendo aquellas para administración intravítrea y/o intracámara. Para el tratamiento de cualquiera de las enfermedades anteriores u otros trastornos, los agentes terapéuticos se administran a uno, o a ambos ojos, del sujeto que necesite el tratamiento en forma de una preparación oftálmica preparada de acuerdo con la práctica farmacéutica convencional, véase por ejemplo “Remington's Pharmaceutical Sciences”, 15ª edición, páginas 1488 a 1501 (Mack Publishing Co., Easton, PA).
Las preparaciones oftálmicas contendrán un agente terapéutico en una concentración de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1 % en peso, preferentemente de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,5 % en una solución, suspensión o pomada farmacéuticamente aceptable. Será necesario variar algo la concentración, dependiendo del compuesto particular empleado, de la afección del sujeto a tratar y similar, y la persona responsable del tratamiento determinará la concentración más adecuada para el paciente individual. La preparación oftálmica estará preferiblemente en forma de una solución acuosa estéril que contenga, si se desea, ingredientes
53
imagen26
imagen27
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
J. Kits de diagnóstico y terapéuticos
La presente invención también proporciona kits de diagnóstico y terapéuticos que comprenden al menos una primera construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la presente invención, para su uso en métodos de tratamiento, métodos de tratamiento combinados y/o en realizaciones de formación de imágenes y tratamientos. Dichos kits generalmente contendrán, en al menos un primer envase (o medio de envase) adecuado, una formulación farmacéuticamente aceptable de al menos una construcción, receptorcuerpo o betacuerpo de la invención. Los kits pueden incluir instrucciones por escrito o electrónicas para su uso, por ejemplo, en realizaciones preclínicas, clínicas y/o veterinarias.
Los kits también pueden contener otras composiciones, formulaciones farmacéuticamente aceptables y segundos agentes biológicos y terapéuticos incluyendo aquellos para terapia combinada y/o para el diagnóstico y formación de imágenes. Por ejemplo, dichos kits pueden contener uno cualquiera o más de una serie de agentes quimioterapéuticos, radioterapéuticos o antiangiogénicos, células antitumorales, anticuerpos contra el sistema vascular tumoral o contra estroma tumor, inmunotoxinas o coaguligandos, agentes antivíricos y/o componentes o agentes de diagnóstico. También pueden incluirse instrucciones por escrito o electrónicas para su uso en terapia combinada y/o para el diagnóstico y formación de imágenes.
Los kits pueden tener un solo envase que contenga la primera construcción, receptorcuerpo o betacuerpo, con o sin ningún componente adicional, o pueden tener distintos envases para cada agente deseado. Cuando se proporcionan agentes terapéuticos combinados, puede mezclarse previamente una sola solución, bien en una combinación equivalente molar, o con un componente en exceso con respecto al otro. Como alternativa, en el kit, el primer agente terapéutico de la invención y el segundo agente biológico o terapéutico, tal como un segundo agente anticanceroso o antivírico, se mantendrán por separado dentro de distintos envases del kit antes de la administración al paciente.
Los componentes de diagnóstico se mantendrán más frecuentemente en al menos un segundo envase, distinto del otro o un primer envase que comprenda uno o más agentes terapéuticos. Los kits de diagnóstico pueden incluir anticuerpos marcados o péptidos que se unen a PS, o cualquier otro agente adecuado para el diagnóstico de la enfermedad a tratar. Los kits pueden incluir agentes de diagnóstico para su uso in vitro, para su uso in vivo, o ambas cosas de dicho agente. Los kits pueden incluir instrucciones por escrito o electrónicas para su uso, por ejemplo, en realizaciones preclínicas, clínicas y/o de diagnóstico veterinario.
Para la inmunodetección in vitro, una construcción, receptorcuerpo o betacuerpo puede estar unido a un soporte sólido, tal como un pocillo de una placa de microtitulación. Los kits de inmunodetección comprenden preferentemente al menos un primer reactivo de inmunodetección. Los reactivos de inmunodetección del kit pueden tener cualquiera de una diversidad de formas, incluyendo aquellos marcadores detectables que están asociados con
o ligados con el anticuerpo determinado, tal como se usa in vivo. También se contemplan marcadores detectables que están asociados o conectados a un ligando de unión secundario. Los ligandos secundarios ejemplares son aquellos anticuerpos secundarios que tienen afinidad de unión por el primer anticuerpo.
Otros reactivos de inmunotinción, adecuados para su uso en los presentes kits, incluyen el reactivo de dos componentes que comprende un anticuerpo secundario, que tiene afinidad de unión por el primer anticuerpo, junto con un tercer anticuerpo, que tiene afinidad de unión por el segundo anticuerpo, estando el tercer anticuerpo ligado a un marcador detectable. En la técnica se conocen diversos marcadores ejemplares y todos dichos marcadores pueden emplearse junto con la presente invención. Estos kits pueden contener conjugados de anticuerpo-marcador bien en forma completamente conjugada, en forma de productos intermedios o como restos separados que los conjugará el usuario del kit. Los kits de formación de imágenes comprenderán preferentemente un agente o anticuerpo de direccionamiento que ya está conectado con un marcador detectable in vivo. Sin embargo, el marcador y los medios de conexión pueden proporcionarse individualmente.
Cualquier forma de kit para diagnóstico puede comprender adicionalmente agentes de control, tal como composiciones biológicas adecuadamente divididas en alícuotas, marcadas o no, como las pueden usarse para preparar una curva patrón para un ensayo de detección. Los componentes de los kits pueden envasarse en medios acuosos o en forma liofilizada.
Cuando los componentes del kit se proporcionan en una o más soluciones líquidas, la solución líquida es preferentemente una solución acuosa, prefiriéndose en particular una solución acuosa estéril. Sin embargo, los componentes del kit pueden proporcionarse como uno o más polvos secos. Cuando los reactivos o componentes se proporcionan como un polvo seco, el polvo puede reconstituirse mediante la adición de un disolvente adecuado. El disolvente puede proporcionarse también en otro envase dentro del kit.
Los envases de los kits terapéuticos y de diagnóstico generalmente incluirán al menos un vial, tubo de ensayo, matraz, frasco, jeringa u otro envase o medio de envase, en el que se coloca el agente terapéutico o cualquier otro agente deseado y, preferentemente dividido adecuadamente en alícuotas. Como al menos se prefieren dos componentes distintos, los kits incluirán preferentemente al menos dos de dichos envases. Los kits también pueden comprender un tercer o cuarto envase que contenga un tampón u otro diluyente, estéril, farmacéuticamente aceptable.
56
imagen28
imagen29
imagen30
imagen31
imagen32
imagen33
imagen34
imagen35
imagen36
imagen37
dosis intravenosa por vía oral.
También pueden usarse agentes que alteran la síntesis y fidelidad de precursores polinucleotídicos. Son particularmente útiles los agentes que se han sometido a ensayos exhaustivos y están fácilmente disponibles. Como tales, los agentes tales como 5-fluorouracilo (5-FU) se usan preferentemente por el tejido neoplásico, haciendo que
5 este agente sea particularmente útil para el direccionamiento a células neoplásicas. Aunque es bastante tóxico, el 5-FU es aplicable en una amplia variedad de transportadores, incluyendo administración tópica, aunque se usa comúnmente la administración intravenosa con dosis que varían de 3 a 15 mg/kg/día.
Los agentes quimioterapéuticos ejemplares que son útiles junto con la terapia combinada se indican en la Tabla D. Cada uno de los agentes indicados en el presente documento son ejemplares y en modo alguno limitantes. El
10 experto en la técnica se dirige a “Remington's Pharmaceutical Sciences” 15ª Edición, capítulo 33, en particular páginas 624-652. Alguna variación en la dosificación será necesaria que se produzca dependiendo de la afección del sujeto a tratar. El médico responsable de la administración podrá determinar la dosis apropiada para el sujeto individual.
TABLA D
15 Agentes quimioterapéuticos útiles en enfermedad neoplásicas
Clase
Tipo de agente Denominaciones comunes (otros nombres) Enfermedad
Agentes Alquilantes
Mostazas de Nitrógeno Mecloretamina (HN2) Enfermedad de Hodgkin, linfomas no Hodgkin
Ciclofosfamida Ifosfamida
Leucemias linfocíticas aguda y crónica, enfermedad de Hodgkin, linfomas no Hodgkin, mieloma múltiple, neuroblastoma, mama, ovario, pulmón, tumor de Wilms, cuello uterino, testículos, sarcomas de tejido blando
Melfalán (L-sarcolisina)
Mieloma múltiple, mama, ovario
Clorambucilo
Leucemia linfocítica crónica, macroglobulinemia primaria, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin
Etileniminas y Metilmelaminas
Hexametilmelamina Ovario
Tiotepa
Vejiga, mama, ovario
Alquil Sulfonatos
Busulfán Leucemia granulocítica crónica
Nitrosoureas
Carmustina (BCNU) Enfermedad de Hodgkin, linfomas no Hodgkin, tumores cerebrales primarios, mieloma múltiple, melanoma maligno
Lomustina (CCNU)
Enfermedad de Hodgkin, linfomas no Hodgkin, tumores cerebrales primarios, pulmón microcítico
Semustina (metil-CCNU)
Tumores cerebrales primarios, estómago, colon
Estreptozocina (estreptozotocina)
Insulinoma pancreático maligno, carcinoide maligno
Triacinas
Dacarbazina (DTIC; dimetiltriazonoimidazolcarbo xamida) Melanoma maligno, enfermedad de Hodgkin, sarcomas de tejido blando
67 68
Clase
Tipo de agente Denominaciones comunes (otros nombres) Enfermedad
Antimetabolitos Antimetabolitos, continúa
Análogos delÁcido Fólico Metotrexato (ametopterina) Leucemia linfocítica aguda, coriocarcinoma, micosis fungoide, mama, cabeza y cuello, pulmón, sarcoma osteogénico
Análogos de Pirimidina
Fluouracilo (5-fluorouracilo; 5-FU) Floxuridina (fluorodesoxiuridina; FUdR) Mama, colon, estómago, páncreas, ovario, cabeza y cuello, vejiga urinaria, lesiones dérmicas premalignas (tópicas)
Citarabina (arabinósido de citoxina)
Leucemias granulocítica aguda y linfocítica aguda
Mercaptopurina (6mercaptopurina; 6-MP)
Leucemia linfocítica aguda, granulocítica aguda y leucemia granulocítica crónica
Análogos de Purina e Inhibidores Relacionados
Tioguanina (6-tioguanina; TG) Leucemia granulocítica aguda linfocítica aguda y granulocítica aguda,
Pentostatina (2desoxicoformicina)
tricoleucemia, micosis fungoide, leucemia linfocítica crónica,
Productos Naturales
Alcaloides de la Vinca Vinblastina (VLB) enfermedad de Hodgkin, linfomas no Hodgkin, mama, testículos
Vincristina
Leucemia linfocítica aguda, neuroblastoma, tumor de Wilms, rabdomiosarcoma, enfermedad de Hodgkin, linfomas no Hodgkin, pulmón microcítico
Epipodofilotoxinas
Etopósido Tertipósido Testículos, pulmón microcítico y otros pulmón, mama, enfermedad de Hodgkin, linfomas no Hodgkin, leucemia granulocítica aguda, sarcoma de Kaposi
Antibióticos
Dactinomicina (actinomicina D) Coriocarcinoma, tumor de Wilms, rabdomiosarcoma, testículos, sarcoma de Kaposi
Daunorrubicina (daunomicina; rubidomicina)
Leucemia granulocítica aguda y linfocítica aguda
Doxorrubicina
Sarcoma de tejido blando osteogénico y otros sarcomas; enfermedad de Hodgkin, linfomas no Hodgkin, leucemias agudas, mama, genitourinario, tiroides, pulmón, estómago, neuroblastoma
Bleomicina
Testículo, cabeza y cuello, piel, esófago, pulmón y tracto genitourinario; enfermedad de Hodgkin, linfomas no Hodgkin
Clase
Tipo de agente Denominaciones comunes (otros nombres) Enfermedad
Productos Naturales, continuados
Antibióticos, continuados Plicamicina (mitramicina) Testículos, hipercalcemia maligna
Mitomicina (mitomicina C)
Estómago, cuello uterino, colon, mama, páncreas, vejiga, cabeza y cuello
Enzimas
L-Asparaginasa Leucemia linfocítica aguda
Modificadores de la Respuesta Biológica
Interferón alfa Tricoleucemia, sarcoma de Kaposi, melanoma, carcinoide, células renales, ovario vejiga, linfomas no Hodgkin, micosis fungoides, mieloma múltiple, leucemia granulocítica crónica
Mezclas de Agentes
Complejos de Coordinación de Platino Cisplatino (cis-DBP) Carboplatino Testículos, ovario, vejiga, cabeza y cuello, pulmón, tiroides, cuello uterino, endometrio, neuroblastoma, sarcoma osteogénico
Antracenodiona
Mitoxantrona Leucemia granulocítica aguda, mama
Urea Sustituida
Hidroxiurea Leucemia granulocítica crónica, policitemia vera, trombocitosis esencial, melanoma maligno
Derivado de Metil Hidrazina
Procarbazina (Nmetilhidrazina, MIH) Enfermedad de Hodgkin
Supresor Adrenocortical
Mitotano(o,p’-DDD) Corteza adrenal
Aminoglutetimida
Mama
Hormonas y Antagonistas
Adrenocorticoeste roides Prednisona (diversas otras preparaciones equivalentes disponibles) Leucemia linfocítica crónica y aguda, linfoma no Hodgkin, enfermedad de Hodgkin y mama
Progestinas
Caproato de Hidroxiprogesterona Acetato de Medroxiprogesterona Acetato de Megestrol Endometrio, mama
Estrógenos
Dietilstilbestrol Etinil estradiol (otras preparaciones disponibles) Mama, próstata
Antiestrógeno
Tamoxifeno Mama
Andrógenos
Propionato de testoreona Fluoximesterona (otras preparaciones disponibles) Mama
Antiandrógeno
Flutamida Próstata
Análogo de la hormona liberadora de gonadotropina
Leuprolida Próstata
M6. Antiangiogénesis
El término “angiogénesis” se refiere a la generación de nuevos vasos sanguíneos, generalmente en un tejido u 69
imagen38
imagen39
TABLA F Agentes contra el cáncer que inducen apoptosis
Clases o Tipos de Agente
Ejemplos
Antimetabolitos
Citarabina, fludarabina, 5-fluoro-29-desoxiuridina, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato
Agentes reticulantes de ADN
Clorambucilo, cisplatino, ciclofosfamida, mostaza de nitrógeno
Agentes Intercalantes
Adriamicina (doxorrubicina), mitoxantrona
Venenos de Topoisomerasa II
Etopósido, tenipósido
Agentes Dirigidos a Microtúbulos
Colcemid, colchicina, docetaxel, vincristina
Inhibidores de Quinasa
Flavoperidol, estaurosporina, ST571 (CPG 57148B), UCN-01 (7hidroxiestaurosporina)
Inhibidores de Farnesil Transferasa
L-739749, L-744832
Hormonas
Glucocorticoides, fenretinida
Agentes de Fragmentación de ADN
Bleomicina
Antagonistas Hormonales
Tamoxifeno, finasterida, agonistas de LHRH
Agentes biológicos
TNF-α,TRAIL, anti-CD20
Inhibidores de la Síntesis de Proteínas
L-asparaginasa, cicloheximida, puromicina, toxina de la difteria
Venenos de Topoisomerasa II
Camptotecina, topotecán
M9. Inmunotoxinas y Coaguligandos
5 La presente invención también puede usarse en combinación con otras inmunotoxinas o coaguligandos en los que la parte de direccionamiento se dirige a un marcador de células tumorales, vasculatura tumoral o extremo tumoral. Cualquier agente de dirección puede usarse en el direccionamiento a una célula, vasculatura tumoral o estroma tumoral en estas realizaciones. En las inmunotoxinas, los agentes unidos incluyen agentes anticelulares o citotóxicos, citocinas, agentes radioterapéuticos, agentes antiangiogénicos, agentes inductores de apoptosis y
10 fármacos antitubulina. En los coaguligandos, los agentes unidos son coagulantes. Las Patentes de Estados Unidos nº 5.855.866, 5.965.132, 6.261.535, 6.051.230, 6.451.312 (inmunotoxinas), 6.093.399, 6.004.555, 5.877.289 y
6.036.955 (coaguligandos) se identifican específicamente para ilustrar dichas construcciones.
M10. ADEPT y terapia con profármacos
Una construcción receptorcuerpo o betacuerpo de la presente invención también puede usarse junto con
15 profármacos, en los que la construcción receptorcuerpo o betacuerpo está asociada operativamente a un componente activador de profármaco, tal como una enzima activadora de profármaco que convierte un profármaco en una forma más activa solo después de ponerse en contacto con el anticuerpo. Esta tecnología generalmente se denomina “ADEPT” y se describe por ejemplo en los documentos WO 95/13095; WO 97/26918, WO 97/24143, y las Patentes de Estados Unidos nº 4.975.278 y 5.658.568.
20 El término “profármaco”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una forma precursora o derivada de una sustancia biológica farmacéuticamente activa que ejerce efectos anticelulares citotóxicos o de otra manera anticelulares reducidos sobre células diana, incluyendo células endoteliales vasculares tumorales en comparación con el fármaco parental sobre el cual se basa. Preferentemente, el profármaco o precursor ejerce un efecto citotóxico o anticelular significativamente reducido o más preferentemente insignificante en comparación con la
25 forma “nativa” o parental. Estos “profármacos” son capaces de activarse o convertirse para producir la forma parental más activa del fármaco.
La capacidad técnica para preparar y usar profármacos existe dentro de la capacidad del experto habitual. Willman et al., (1986) y Stella et al., (1985) cada uno de ellos se identifican especialmente para fines de complementar adicionalmente la descripción y enseñanzas que se refieren a cómo preparar y usar diversos profármacos. Las
72
construcciones de profármacos ejemplares que pueden usarse en el contexto de la presente invención incluyen, pero sin limitación, profármacos que contienen fosfato (Patente de Estados Unidos nº 4.975.278), profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos basados en péptidos (Patentes de Estados Unidos nº 5.600.829; 5.587.161; 5.405.990; documento WO 97/07118), profármacos modificados con D aminoácidos, profármacos glucosilados (Patentes de Estados Unidos nº 5.561.119; 5.646.298; 4.904.768, 5.041.424), profármacos que contienen β-lactama, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituidos (Patente de Estados Unidos nº 4.975.278), profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituidos e incluso profármacos de 5-fluorocitosina (Patente de Estados Unidos nº 4.975.278) y de 5-fluorouridina y similares.
El tipo de agente terapéutico o farmacocitotóxico que puede usarse en la forma profarmacológica es virtualmente ilimitado. Se preferirán los agentes más citotóxicos para dicha forma de administración, sobre por ejemplo la administración de coagulantes, que es menos preferida para su uso como profármacos. Todo lo que requiere en la formación del profármaco es diseñar la construcción de tal manera que el profármaco esté sustancialmente inactivo y que el fármaco “liberado” o activado tenga una actividad sustancial o al menos suficiente para el fin previsto.
También se conocen y contemplan diversas mejoras de los profármacos originales para su uso con la misma, tal como se desvela en los documentos WO 95/03830; EP 751.144 (antraciclinas); WO 97/07097 (ciclopropilindoles); y documento WO 96/20169. Por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos nº 5.621.002 se describen profármacos con Km reducida que pueden usarse en el contexto de la presente invención. También se conocen la terapia con profármacos que puede realizarse intracelularmente, tal como se ilustra mediante el documento WO 96/03151 y puede llevarse a la práctica con la misma.
Para su uso en ADEPT, el agente que activa o convierte el profármaco en el fármaco más activo está unido operativamente a un anticuerpo de la invención. El anticuerpo por lo tanto localiza el profármaco que convierte la capacidad dentro del sitio angiogénico o tumoral, de manera que el fármaco activo se produce solamente en dichas regiones y no en la circulación o en tejidos sanos.
Las enzimas que pueden unirse a los anticuerpos de la invención para funcionar en la activación de profármacos incluyen, pero sin limitación, fosfatasa alcalina para su uso en combinación con profármacos que contienen fosfato (Patente de Estados Unidos nº 4.975.278); arilsulfatasa para su uso en combinación con profármacos que contienen sulfato (Patente de Estados Unidos nº 5.270.196); peptidasas y proteasas, tales como proteasa de serratina, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasa (Patentes de Estados Unidos nº 5.660.829; 5.587.161; 5.405.990) y catepsinas (incluyendo catepsinas B y L), para su uso en combinación con profármacos basados en péptidos; Dalanilcarboxipeptidasas para su uso en combinación con profármacos modificados con D-aminoácidos; enzimas que escinden hidratos de carbono tales como β-galactosidasa y neuraminidasa para su uso en combinación con profármacos glucosilados (Patentes de Estados Unidos nº 5.561.119; 5.646.298); β-lactamasa para su uso en combinación con profármacos que contienen β-lactama; amidasas de penicilina tal como amidasa de penicilina V (Patente de Estados Unidos nº 4.975.278) o amidasa de penicilina G, para su uso en combinación con fármacos derivatizados en sus nitrógenos amino con fenoxiacetamida o grupos fenilacetamida y desaminasa citosina (Patentes de Estados Unidos nº 5.338.678; 5.545.548) para su uso en combinación con profármacos basados en 5fluorocitosina (Patente de Estados Unidos nº 4.975.278).
K. Liposomas y agentes terapéuticos recubiertos con anticuerpos
Las formulaciones liposomales se usan con frecuencia en agentes terapéuticos y farmacéuticos. Sin embargo, la biodistribución de liposomas en estudios iniciales dio a entender que dichas formulaciones no son generalmente aplicables para su uso en seres humanos. Los liposomas se captan rápidamente por las células fagocíticas del sistema retículoendotelial (RES), incluyendo las células fagocíticas mononucleares en circulación y las localizadas en el hígado y bazo. Por tanto, las semividas de circulación sanguínea pueden ser tan cortas como de algunos minutos.
Por lo tanto, se desarrolló la tecnología de liposomas y formulaciones “sigilosos o de sigilo”, lo que permitió a los liposomas evadir la captación del RES y circular durante más tiempo (Hristova y Needham, 1993). Un agente preferido para su uso en los liposomas sigilosos es el polietilenglicol (PEG), y los liposomas resultantes también denominados liposomas PEGilados. Otros agentes sigilosos incluyen poli(2-metil-2-oxazolina) y conjugados de poli(2-etil-2-oxazalina) (Woodle et al., 1994). Se describe una serie de liposomas sigilosos mejorados en la Patente de Estados Unidos nº 6.284.267, que pueden usarse en combinación con la presente invención.
Los liposomas con un diámetro menor que la fenestra de los capilares salen de la circulación por filtración. El diámetro promedio de la fenestra en tumores que se desarrollan rápidamente es mayor que en tejidos normales y por lo tanto los liposomas más pequeños de aproximadamente 100 nm de diámetro migran a los tumores. Los liposomas sigilosos se han propuesto por tanto para su uso en la administración de agentes citotóxicos a tumores en pacientes con cáncer. Se han incorporado diversos fármacos en liposomas furtivos, incluyendo cisplatino (Rosenthal et al., 2002), TNFα (Kim et al., 2002), doxorrubicina (Symon et al., 1999) y adriamicina (Singh et al., 1999). Sin embargo, recientes informes han indicado inesperadamente una baja ineficacia de la doxorrubicina y vinorrelbina liposomal sigilosa en el tratamiento de cáncer de mama metastásico (Timassa et al., 2003).
73
imagen40
imagen41
imagen42
De manera natural, las construcciones y conjugados de la invención actúan en virus con envoltura, particularmente aquellos virus que tienen fosfolípidos aniónicos, particularmente PS en la superficie externa de la envoltura, en la que las construcciones y conjugados causan la eliminación y/o la inhibición de la entrada de los virus en las células diana.
5 Un importante aspecto de la presente invención es por lo tanto que es universalmente aplicable, siendo adecuada para el tratamiento de virus recombinantes modificados por ingeniería genética, y sintéticos, por ejemplo, creados como parte de bioterrorismo. De hecho, la invención no se limita al tratamiento de animales y seres humanos. Dado que la categoría de los hospedadores encontrados en los taxones de virus incluyen algas, arqueas, bacterias, hongos, invertebrados, micoplasma, plantas, protozoos, espiroplasma y vertebrados, la invención puede usarse para
10 inhibir infección vírica y replicación en cualquiera de estas configuraciones, incluyendo en virus de importancia agrícola. Actualmente se prefiere el tratamiento de infección vírica y enfermedades asociadas en vertebrados y uno cualquiera o más de los virus de la Tabla H, que infectan a animales vertebrados, puede inhibirse y la infección resultante tratarse usando la presente invención.
TABLA H
15 Virus de vertebrados
Familia
Género Especies Tipo
Adenoviridae
Mastadenovirus Aviadenovirus Virus Similares a la Fiebre Porcina Africana Adenovirus humano 2 Adenovirus Fowl 1 Virus de la fiebre porcina africana
Arenaviridae
Arenavirus Arterivirus Virus de la coriomengitis linfocítica Virus de la artritis Equina
Astroviridae
Astrovirus Astrovirus humano 1
Birnaviridae
Aqabirnavirus Avibirnavirus Virus de la necrosis pancreática infecciosa Virus de la enfermedad bursal infecciosa
Bunyaviridae
Bunyavirus Hantavirus Nairovirus Phlebovirus Virus de Bunyamwera Virus de Hantaan Virus de la enfermedad de la oveja de Nairobi Virus Siciliano de la fiebre de Sandfly
Caliciviridae
Calicivirus Exantema vesicular de virus porcino
Circoviridae
Circovirus Virus de la anemia de pollo
Coronaviridae
Coronavirus Torovirus Deltavirus Virus de la bronquitis infecciosa aviar Virus de Berne Delta virus de la Hepatitis
Filoviridae
Filovirus Virus Marburg
Flaviviridae
Flavivirus Pestivirus Virus similares a la Hepatitis C Virus de la fiebre amarilla Virus de la diarrea bovina Virus de la hepatitis C
Hepadnaviridae
Orthophepadnavirus Avihepadnavirus Virus de la hepatitis B Virus de la hepatitis B de pato
Herpesviridae Subfamilia Alphaherpesvirinae Subfamilia: Betaherpesvirinae Subfamilia Gammaherpesvirinae
Simplexvirus Varicellovirus Cytomegalovirus Muromegalovirus Roseolovirus Lymphocryptovirus Rhadinovirus Herpesvirus 1 humano Herpesvirus 3 humano Herpesvirus 5 humano Citomegalovirus de ratón 1 Herpesvirus humano 6 Herpesvirus humano 4 Herpesvirus ateline 2
Iridoviridae
Ranavirus Lymphocystivirus Virus similares al virus del Pececillo de plata Virus de rana 3 Virus Flounder Virus del pececillo de plata 1
Orthomyxoviridae
Influenzavirus A, B Influenzavirus C Virus similares a togoto Virus de la gripe A Virus de la gripe C Togoto virus
Papovaviridae
Polyomavirus Papillomavirus Poliomavirus murino Papilomavirus del conejo de Rabo de algodón (Shope)
77
Familia
Género Especies Tipo
Paramyxoviridae Subfamilia Paramyxovirinae Subfamilia Pneumovirinae
Parayxovirus Morbillivirus Rubulavirus Pneumovirus Virus 1 paragripal humano Virus de las paperas Virus del sarampión Virus sincitial respiratorio humano
Parvoviridae Subfamilia Parovirinae
Parvovirus Erythovirus Dependovirus Virus de Mice minute Virus B19 Virus 2 adenoasociado
Picornaviridae
Enterovims Rhinovirus Hepatovirus Cardiovirus Aphthovirus Poliovirus 1 Rinovirus humano 1A Virus de la hepatitis A Virus de la encefalomiocarditis Virus O de la enfermedad de pie y boca
Poxviridae Subfamilia Chordopoxvirinae
Orthopoxvirus Parapoxyvirus Avipoxvirus Capripoxvirus Leporipoxvirus Suipoxvints Molluscipoxvirus Yatapoxvirus Virus de la vacuna Virus Orf Fowlpox virus Sheeppox virus Myxoma virus Swinepox virus Virus contagioso de molusco Virus del tumor de mono Yaba
Reoviridae
Orthoreovirus Orbivirus Rotavirus Coltivirus Aquareovirus Reovirus 3 Virus de la lengua azul 1 Rotavirus de simio SA11 Virus de la fiebre de la garrapata de colorado Virus de la carpa dorada
Retroviridae
Retrovirus de tipo B de mamíferos Retrovirus de tipo C de mamíferos Retrovirus de tipo C de aves Retrovirus de tipo D Retrovirus Blv-htlv Lentivirus Spumavirus Virus del tumor mamario de ratón Virus de la leucemia murina Virus de la leucosis aviar Virus del mono Mason-Pfizer Virus de la leucemia bovina Virus 1 de la inmunodeficiencia humana Espumavirus humano
Rhabdoviridae
Vesiculovirus Lyssavirus Ephemerovirus Virus Indiana de la estomatitis vesicular Virus de la rabia Fiebre efemeral bovina
Togaviridae
Alphavirus Rubivirus Virus Sindbis Virus de la rubéola
El uso de la invención en tratamiento de infecciones víricas y enfermedades asociadas en mamíferos se prefiere, particularmente en términos de animales valiosos o con valor, tales como caballos de carreras y animales domésticos y animales y pájaros usados para producir directamente (por ejemplo comer) o indirectamente producir
5 (por ejemplo leche y huevos) alimento para consumo humano. Además del tratamiento en seres humanos, las realizaciones ejemplares de la invención incluyen el tratamiento de caballos, perros, gatos y similares; el tratamiento de vacas, cerdos, ganado, ovejas, cabras, búfalos, bisontes, llamas, ciervos, alces, y otros animales más grandes así como sus crías, incluyendo terneros y corderos.
El tratamiento de seres humanos se prefiere particularmente, ya sean virus de origen natural o aquellos creados
10 para bioterrorismo. En términos de virus de origen natural y las enfermedades resultantes, la invención está de nuevo no limitada en sus aplicaciones. Por consiguiente cualquiera de uno o más de los virus de la Tabla J pueden inhibirse usando la presente invención y las infecciones y enfermedades resultantes por tanto pueden tratarse.
78
TABLA J Enfermedades víricas en seres humanos
Enfermedad
Virus Tipos de Virus
SIDA
Virus de inmunodeficiencia humana (VIH) Retrovirus
Bronquiolitis y neumonía víricas
Virus sincitial respiratorio Paramyxovirus
Bronquiolitis
Virus paragripal Paramyxovirus
Cáncer de cuello uterino
Virus del papiloma humano Papovavirus
Viruela del pollo
Virus Zoster Varicela Herpesvirus
Dengue
Virus del Dengue Flavivirus
Fiebre hemorrágica del Ébola
Virus de Ébola Filovirus
Herpes Genital
Herpes virus Simple 2 Herpesvirus
Fiebre hemorrágica hantavirus
Hantavirus Bunyavirus
Hepatitis
Hepatitis A Picornavirus
Hepatitis B
Hepadavirus
Hepatitis C
Flavivirus
Hepatitis D
Deltavirus
Hepatitis E
Calcivirus
Gripe
Virus gripal A, B y C Orthomyxovirus
Fiebre Hemorrágica Argentina Junín
Virus Junin Arenavirus
Fiebre hemorrágica Lassa
Virus Lassa Arenavirus
Fiebre hemorrágica de Machupo
Virus Machupo Arenavirus
Paperas
Virus Rubéola Paramyxovirus
Mononucleosis
Virus de Epstein Barr Herpesvirus
Enfermedad CMV (neumonía vírica, síndrome similar a mononucleosis)
Citomegalovirus Herpesvirus
Síndrome Respiratorio Agudo Grave (SARS)
Coronavirus humano Coronavirus
Herpes
virus Varicela zoster Herpesvirus
Viruela
Virus de la viruela Poxvirus
Fiebre amarilla
Virus de la fiebre amarilla Flavivirus
Enfermedad del Nilo Oriental
Virus del Nilo O riental
Encefalitis equina Occidental
Virus EE Occidental Togavirus
Neumonía, Hepatitis, enfermedad respiratoria aguda
Adenovirus Adenovirus
Gastroenteritis
Rotavirus Rotavirus
Encefalitis
Virus del Bosque de Semliki Alphavirus
Viruela bovina
Virus Vaccinia Poxvirus
Encefalitis
EE venezolana Alphavirus
Meningitis, encefalitis, meningoencefalitis
Coriomeningitis linfocítica Arenavirus
Fiebre hemorrágica de Venezuela
Virus Guanarito Arenavirus
Fiebre del valle de Rift (fiebre hemorrágica, encefalitis)
Virus de la fiebre del valle de Rift Bunyavirus
79 5
Enfermedad
Virus Tipos de Virus
Fiebre Hemorrágica de Marburg
Virus Marburg Filovirus
Encefalitis transmitida por garrapatas
Virus de la encefalitis transmitida por garrapata (TBEV) Flavivirus
Encefalitis
Virus del Hendra Paramyxovirus
Encefalitis
Virus Nipah Paramyxovirus
Fiebre hemorrágica de Crimea-Congo
Virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo Bunyavirus
Fiebre hemorrágica de Brasil
Virus Sabia Arenavirus
10
15
20
25
30
35
40
45
La invención se contempla particularmente para su uso en el tratamiento de enfermedades relacionadas con el CMV tal como neumonía vírica, síndrome similar a mononucleosis y malformaciones congénitas asociadas (sordera y retraso mental); enfermedades respiratorias, tales como las causadas por RSV, incluyendo bronquiolitis y neumonía vírica, gripe, el resfriado común y SARS; SIDA; hepatitis; cánceres asociados con infecciones víricas; mononucleosis y viruela.
En otras realizaciones, los inventores contemplan particularmente la inhibición de arenavirus, que son patógenos en seres humanos. Los arenavirus incluyen los virus del Viejo Mundo son responsables de la fiebre Lassa (virus Lassa)y coriomeningitis linfocítica (LCMV). La fiebre de Lassa es endémica en el África Oriental afectando a 300.000 personas anualmente y causando hasta 3000 muertes. La infección con el virus de Lassa conduce a fiebre y malaria al cabo de aproximadamente 10 días. El dolor abdominal, náuseas, vómitos y diarreas son comunes. Pueden desarrollarse faringitis y resfriado. Los síntomas neurológicos son normalmente leves. Los síndromes de filtración vascular, tal como edema y derrames pleurales están presentes en la mayoría de los casos severos. El sangrado se observa aproximadamente en un cuarto de los pacientes. La enfermedad puede ocasionar cambios en el sistema cardiovascular que culminan en choque y muerte.
Los arenavirus también se incluyen y los virus del Nuevo Mundo antigénicamente distintos responsables de la fiebre hemorrágica de Argentina (Junin virus), fiebre hemorrágica Boliviana (Machupo virus) y fiebre hemorrágica de Venezuela (Guanarito virus). Todos estos virus están en la Categoría CDC A de la lista de posibles armas bioterroristas.
Las dosis que son adecuadas para las realizaciones antitumorales también son adecuadas para los tratamientos antivíricos. De manera similar, la administración múltiple puede usarse para infecciones crónicas, y altas dosis pueden usarse para infecciones agudas. Cualquier vía de administración adecuada puede emplearse, de nuevo como se desvela para los aspectos y el tratamiento del cáncer, incluyendo IV, IM, SC, como un aerosol a los pulmones o a las vías respiratorias y similares.
Los agentes terapéuticos proporcionados por la invención son agentes valiosos que tiene un amplio espectro de actividad antivírica. Además de ser eficaces contra una gran cantidad de virus posiblemente letales, los agentes también pueden administrarse después de la exposición a los virus, incluso en entornos en los que la naturaleza exacta del virus no se conoce. Por tanto, los agentes terapéuticos antivíricos de la presente invención no requieren un periodo de tiempo prolongado entre la identificación del patógeno y la administración de la terapia, en notable contraste con el tiempo y el gasto que conlleva el desarrollo, producción o administración de vacunas específicas.
Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones preferidas de la invención. Debe apreciarse por los expertos en la técnica que las técnicas desveladas en los ejemplos que siguen a continuación representan técnicas descubiertas por el inventor que funcionan bien en la práctica de la invención y por tanto pueden considerarse que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la técnica deben apreciar, a la luz de la presente descripción, que pueden realizarse muchos cambios en las realizaciones específicas que se desvelan y aún obtener un resultado similar o idéntico sin salirse del espíritu y alcance de la invención.
Ejemplo I
Tratamiento tumoral con coaguligando anti-VCAM-1-tTF
El presente ejemplo muestra la coagulación específica de la vasculatura tumoral in vivo que resulta después de la administración de un coagulando dirigido a la vasculatura tumoral (“coaguligando”) a animales portadores de tumor y los efectos antitumorales resultantes. En este coaguligando, un anticuerpo dirigido contra VCAM-1 (molécula 1 de adhesión endotelial vascular VCAM-1) se usa como un agente de direccionamiento para administrar el factor tisular truncado (tTF), una forma modificada de un coagulante humano, a la vasculatura tumoral.
El hibridoma MK2.7, que secreta un anticuerpo IgG1 de rata contra VCAM-1 murino se obtuvo de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Rockville, MD; ATCC CRL 1909). El hibridoma R187, que secreta un anticuerpo
80
imagen43
imagen44
PS unido.
Ejemplo III
La anexina V bloquea la actividad de coaguligando
El presente ejemplo proporciona una evidencia adicional de la función de la expresión de PS en la superficie en la actividad coaguligando de estudios usando el ligando de unión a PS de alta afinidad, la anexina V, que bloquea la función de PS in vitro e in vivo.
A. La anexina V bloquea la activación de coaguligando del factor X in vitro
La capacidad de Anexina V para afectar en la formación del Factor Xa inducida por coaguligando se determinó mediante un ensayo cromogénico. Se incubaron células de bEnd.3 estimuladas con IL-1α con anti-VCAM-•tTF y se permeabilizaron con saponina. Se añadió Anexina V a concentraciones que variaban de 0,1 a 10 μg/ml y las células se incubaron durante 30 minutos antes de la adición de Proplex T diluido. Se determinó la cantidad de Factor Xa generado en presencia o ausencia de Anexina V. Cada tratamiento se realizó por duplicado y se repitió al menos dos veces.
La necesidad de la expresión PS en la superficie en la acción del coaguligando se indica adicionalmente mediante el hallazgo de los inventores de que la anexina V, que se une a PS con alta afinidad, bloquea la afinidad del antiVCAM-1•tTF unido a las células bEnd.3 para generar el factor Xa in vitro.
La anexina V añadida a células permeabilizadas preincubadas con anti-VCAM-1•tTF inhibió la formación de factor Xa de una manera dependiente de la dosis. En ausencia de Anexina V, el coaguligando unido a las células produjo 95 ng de factor Xa por 10.000 células por 60 minutos. La adición de cantidades crecientes de Anexina V (en el intervalo de μg por ml) inhibió la producción del factor Xa. A 10 μg o ml, la Anexina V inhibió la producción del factor Xa un 58 %. No se observó inhibición adicional aumentando la concentración de Anexina V durante el ensayo, lo que indicaba que la anexina V saturaba todos los sitios de unión disponibles a 10 μg por ml.
B. La anexina bloquea la actividad de coaguligando in vivo
La capacidad de la Anexina V para inhibir la trombosis inducida por coaguligando in vivo se examinó en ratones SCID portadores de Hodgkin L540. Los tumores se desarrollaron en ratones y se inyectó a dos ratones por grupo (tamaño de tumor 0,5 cm de diámetro) por vía intravenosa a través de la vena caudal con uno de los siguientes reactivos: a) solución salina; b) 100 μg de Anexina V; c) 40 μg de anti-VCAM-1•tTF; d) 100 μg de Anexina V seguido de 2 horas después mediante 40 μg de anti-VCAM-1•tTF.
Cuatro horas después de la última inyección se anestesió y perfundió a los ratones con solución salina heparinizada. Los tumores se extirparon, se fijaron con formalina al 4 %, se incluyeron en parafina y se tiñeron con hematoxilina eosina. Se contó el número de vasos sanguíneos trombosados y no trombosados y se calculó el porcentaje de trombosis.
La Anexina V también bloquea la actividad del coaguligando anti-VCAM-1•tTF in vivo. Los grupos de ratones portadores de tumores se trataron con uno de los siguientes reactivos de control o ensayo. Los ratones recibieron (a) solución salina; (b) 100 μg de Anexina V; (c) 40 μg de coaguligando anti-VCAM-1•tTF; o (d) 100 μg de Anexina V seguido de 2 horas después por 40 μg de coaguligando anti-VCAM-1•tTF. Se obtuvieron idénticos resultados en los dos ratones por grupo.
No se observaron trombosis espontánea, hemorragias o necrosis en los tumores procedentes de ratones inyectados con solución salina. El tratamiento solo con Anexina V no alteró la morfología del tumor.
De acuerdo con otros datos presentados en el presente documento, 40 μg de coaguligando anti-VCAM-1•tTF causó trombosis en el 70 % de los vasos sanguíneos tumorales totales. La mayoría de los vasos sanguíneos se ocluyeron con eritrocitos y coágulos empaquetados y las células tumorales se separaron entre sí. Ambos efectos antitumorales inducidos por coaguligando, es decir, trombosis intravascular y cambios en la morfología celular tumoral, se anularon por completo tratando previamente los ratones con Anexina V.
Estos hallazgos confirman que los efectos antitumorales de los coaguligandos están mediados a través del bloqueo de la vasculatura tumoral. Estos datos también demuestran que PS es esencial para trombosis inducida por coaguligando in vivo.
Ejemplo IV
Generación de anticuerpos contra aminofosfolípidos, fosfolípidos aniónicos y complejos
Este ejemplo describe un protocolo de inmunización diseñado por los inventores a la luz de sus observaciones sobre la traslocación de aminofosfolípidos y fosfolípidos aniónicos en células endoteliales vasculares tumorales, y descubrir que funcionan bien en la generación de anticuerpos contra aminofosfolípidos y fosfolípidos aniónicos. Se
83
imagen45
imagen46
TABLA 2 Isotipo y dependencia de suero de los anticuerpos anti-PS
Nombre
Origen Especie/Isotipo ¿Cofactor en suero?
3SB
Rote et al, 1993 IgM Kappa de Ratón No
D11
N. Rote IgM Kappa de Ratón
BA3
Rote et al, 1993 IgM Kappa de Ratón
3G4
Este estudio IgG3 Kappa de Ratón Sí, β2-glucoproteína I
2aG4
Este estudio IgG2a de ratón Si
Ch3G4
Este estudio IgG1 quimérica humana Sí
9D2
Este estudio IgM Kappa de Rata No
P2D9
Este estudio IgG3 de ratón
1B12
Este estudio IgG1Kappa de ratón
1B9
Este estudio IgG1Kappa de ratón Sí
3B10
Este estudio IgG3Kappa de ratón Sí, al menos β2glucoproteína I
2G7
Este estudio IgG1Kappa de ratón Sí
7C5
Este estudio IgG1Kappa de ratón Sí
3F8
Este estudio IgG3 de ratón
Anexina V
No
D. Protocolo ELISA y caracterización inicial de anticuerpo
5 Adicionalmente los anticuerpos se estudiaron mediante ELISA y se compararon con 3SB y D11. El ELISA anti PS usado en ejemplos de los presentes estudios se realizó de la siguiente manera. Salvo que se especifiquen diferencias particulares, este es el formato de ELISA usado en todos los estudios de la presente solicitud. Posteriormente se desarrollaron otros tipos de ELISA y los resultados de estos estudios se exponen en el Ejemplo
XXX.
10 El ELISA del presente ejemplo se ilustra usando el antígeno PS (P-6641 25 mg 10 mg/ml (el disolvente es cloroformo:MeOH 95:5) en un frasco de 2,5 ml). Usando el mismo protocolo pueden usarse otros fosfolípidos. La solución madre de PS (u otros fosfolípidos deben dividirse en alícuotas y conservarse en un envase herméticamente cerrado a -30 °C. Las placas de 96 pocillos preferidos son Immulon 1 de fondo en forma de U de Dynatech (de Laboratorios Dynatech, nº de Catálogo 011-010-3550).
15 El tampón de bloqueo convencional usado en el presente ejemplo es suero bovino al 10 % disuelto en PBS. Son idóneas otras soluciones de bloqueo, pero cualquier detergente debe excluirse de las soluciones de bloqueo y lavado. El anticuerpo primario es la muestra de ensayo o mezcla. El anticuerpo secundario preferido es IgG de cabra anti-ratón conjugada a HRP. Las soluciones de revelado fueron: 10 ml de Na2PO4 0,2 M, 10 ml de ácido cítrico 0,1 M, un comprimido de OPD de 10 mg y 10 μl de peróxido de hidrógeno. La solución de terminación es H2SO4 0,18 M.
20 El protocolo del presente ejemplo conlleva el recubrimiento de una placa de 96 pocillos con PS de la siguiente manera: se diluye la solución madre de PBS en n-hexano a 10 μg/ml y se mezcla bien. Se añaden 50 μl a cada pocillo y se deja evaporar durante una hora. Se añaden 200 μl de suero al 10 % (u otro tampón de bloqueo) a cada pocillo, se cubre y se mantiene a temperatura ambiente durante 2 horas o durante una noche a 4 °C. Se lava la placa tres veces con PBS. Se añade un anticuerpo primario (diluido en tampón de bloqueo) y se incuba durante 2
25 horas a 37 °C. Se lava tres veces con PBS. Se añaden 100 μl/pocillo de anticuerpo secundario (típicamente IgG de cabra anti-ratón conjugada a HRP u otro anticuerpo secundario apropiado) y se incuba durante 1 hora a 37 °C. Se lava la placa tres veces con PBS. Se revela el ELISA añadiendo 100 μl de solución de revelado a cada uno de los pocillos, se revela durante 10 minutos y después se añaden 100 μl de solución de determinación a cada placa y se lee la D.O. a 490 nm.
30 Los siguientes resultados se presentan para 9D2, 1B12, 3G4 y 1B9. La afinidad de estos anticuerpos por PS se determinó y se comparó con la de 3SB. Algunas de las afinidades relativas de los nuevos anticuerpos están mucho más mejoradas en comparación con la 3SB (Tabla 3).
86
imagen47
imagen48
imagen49
TABLA 5 Externalización de PS detectada en tumores de tamaño mediano y grande
Tamaño del Tumor (mm3)
nº de Tumores Positivos/Total* % de Vasos Positivos a PS/Total†
350-800
3/5 10-20
850-1.600
4/4 20-40
*Los ratones portadores de tumores Cy L540 se dividieron en tres grupos de acuerdo con el tamaño del tumor. Se inyectaron 20 μg de anticuerpo anti-PS i.v. y se dejó circular durante 1 hora. Los anticuerpos de ratón se detectaron en secciones congeladas usando anti-IgM de ratón conjugado con peroxidasa.
†Número total de vasos sanguíneos se determinó usando el Ab panendotelial Meca 32. Los vasos positivos a PS y positivos a Meca se contaron en 4 campos por sección transversal de tumor. Se muestra el intervalo del % de vasos positivos a PS dentro del mismo grupo.
C. Tumores L540, H358, HT29, Colo26, B16 y 3LL
5 Usando los mismos anticuerpos anti-PS (3SB) y anti-CL (D11), la exposición de PS sobre endotelio tumoral y normal vascular se examinó en estudios adicionales usando modelos de tres tumores animales adicionales (seis en total): linfoma de Hodgkin humano L540, carcinoma de pulmón no microcítico humano NCIH358 (NSCLC), carcinomas colorrectales humanos HT29, carcinomas de colon de ratón Colo26, melanomas de ratón B16 y tumores de pulmón murino de ratón 3LL.
10 En estos estudios, los tumores se desarrollaron por vía subcutánea en ratones SCID y se dejaron alcanzar a un volumen de 0,4-0,7 cm3. Tres o más ratones se usaron por grupo. Se inyectaron anticuerpos IgM anti-PS o anti-CL de ratón (30 μg/ratón) por vía intravenosa en 200 μl de solución salina. Treinta minutos después, los ratones se sacrificaron, se exsanguinaron y su circulación sanguínea se perfundió con solución salina heparinizada. Los órganos principales y los tumores se recogieron y se congelaron al instante para la preparación de criosecciones. El
15 IgM de ratón se detectó usando IgM de cabra anti-rata (específica μ) conjugada con HRP, seguido por el desarrollo con carbazol.
Las secciones en serie de los tumores se tiñeron con un anticuerpo monoclonal, MECA 32, dirigido contra un marcador panendotelial de vasos de ratón. Se identificaron vasos positivos a PS morfológicamente y mediante su tinción coincidente con anti-IgM de ratón y MECA 32. Se examinaron al menos 10 campos al azar por sección (0,317
20 mm2/campo) de una manera oculta mediante dos observadores independientes. El porcentaje de vasos positivos a MECA 32 que se tiñó positivamente para PS se calculó. Se examinaron tres tumores de cada tipo en cada uno de dos estudios distintos. Se calcularon los valores medios y los errores típicos (TE). La variación intertumoral en el número de vasos totales y positivos a PS en cada grupo de aproximadamente 10 %.
Los seis tumores en este estudio contenían vasos positivos a PS (Tabla 6A). La detección de PS por 3SB fue
25 específica ya que no se observó tinción de endotelio tumoral con el anticuerpo anti-CL (Tabla 6A). No se observó localización vascular de los anticuerpos anti-PS o anti-CL en órganos normales distintos de riñones (tinción de los túbulos en receptores tanto anti-PS como anti-CL refleja la secreción de IgM a través de este órgano).
TABLA 6A
Localización específica de anticuerpos anti-PS en vasos tumorales
Tejido
Anti-PS* Anti-CL
Tumor L540
19,3 ± 3,3 0
Tumor H358
15,6 ± 4,1 0
Tumor HT29
4,2 ± 1,6 0
Tumor B16
40,6 ± 5,4 0
Tumor 3LL
5,3 ± 3,7 0
Tumor Colo26
12,4 ± 2,4 0
Adrenal Cerebro Corazón Riñón Intestino
0 0 0 0† 0 0 0 0 0† 0
90
imagen50
imagen51
imagen52
imagen53
imagen54
imagen55
imagen56
imagen57
imagen58
imagen59
imagen60
imagen61
imagen62
Tratamiento
Concentración 125I-Anexina V (% de unión máx.)
Células ABAE
Células bEnd.3
IL-8
20 ng/ml 0 0
IL-6
20 ng/ml 0 0
IL-1
10 ng/ml 6,4 7,5
IL-1
10 ng/ml 5,8 5,5
Interferón
40 ng/ml 8,6 2,8
TNF
20 ng/ml 7,4 13,7
Trombina
50 nM 8,8 17,4
Hipoxia
O2 al 1 % 15,0 a 17,5 22,5
Hipoxia + IL-1
Igual que el anterior 26,0 31,0
Hipoxia + TNF
Igual que el anterior 33,0 36,0
pH 6,6
N/D 20,2 18,9
Peróxido de hidrógeno
200 M 95,5 98,4
5
10
15
20
25
30
35
En la Tabla 11, las concentraciones de las citocinas, factores de crecimiento y trombina usados se seleccionaron de los valores de la bibliografía para tener un efecto estimulador máximo en células endoteliales cultivadas. Estas concentraciones no causaron toxicidad durante el periodo del ensayo (24 h) juzgado por el aspecto morfológico, una ausencia de desprendimiento y una ausencia de captación de azul tripano. La concentración de H2O2 empleada fue la concentración máxima que no causó citotoxicidad en las condiciones seleccionadas.
La unión basal de 125I-anexina V se determinó en presencia de medio de crecimiento solo. La exposición máxima de PS se determinó después de la inducción de la apoptosis mediante tratamiento combinado con actinomicina D y TNF . Se presenta el promedio de duplicados de tres estudios separados. El error típico es menor del 5 %.
Las células no tratadas estaban ampliamente desprovistas de PS externalizada, según se juzga por anexina V o unión de anticuerpo anti-PS (9D2) (Tabla 11). La unión basal en presencia de medio de crecimiento de cultivo solo fue de 0,44 y 0,68 pmoles de 125I-anexina V para células ABAE y células bEnd.3, respectivamente. Esto se corresponde con aproximadamente 7,1 % y 10,9 % de la unión máxima para células ABAE y bEnd.3, respectivamente, que se correlaciona bien con el hallazgo de que aproximadamente el 10 % de las células se unían a anexina V biotinilada en las mismas condiciones.
VEGF, HGF, FGF, TGF1, PDGF, IL-6, IL-8 e IL-10 no aumentaron la unión de 125I-anexina V por encima del nivel basal para células no tratadas (Tabla 11), ni tampoco lo hizo GM-CSF. Los mediadores inflamatorios (IL-1, IL-1, TNF e interferón) causaron un pequeño aumento aunque reproducible en la translocación de PS y fosfolípidos aniónicos ya que varía de 5 a 8 % del nivel máximo para células ABAE y de 3 a 14 % para las células bEnd3.
La hipoxia/reoxigenación, trombina o condiciones externas ácidas (pH 6,8-6,6) indujo una externalización moderadamente alta de PS y de fosfolípido aniónico que varió de 8 a 20 % del nivel máximo de células ABAE y de 17 a 22 % del nivel máximo para células bend.3. El mayor aumento en la translocación de PS y fosfolípidos aniónicos se observó después del tratamiento con 100 a 200 M de peróxido de hidrógeno. Este tratamiento causó la externalización casi completa (95 %) de PS en ambos tipos de células considerado por la unión de 125I-anexina V (Tabla 11). Más del 70 % de las células ABAE y bEnd.3 unidas a anexina V biotinilada, como se considera inmunohistoquímicamente.
Las células endoteliales en las que la translocación de PS y de fosfolípido aniónico se generó por tratamiento con hipoxia/reoxigenación, trombina, acidez, TNF, IL-1 o H2O2 permanecieron unidas a la matriz durante un periodo del tiempo del ensayo (24 h), se mantuvo el contacto de célula a célula y se mantuvo su capacidad para excluir el colorante azul de tripano. La orientación de PS y fosfolípido aniónico normal se reestableció 24 a 48 h después en la mayoría de las células después de retirar el factor de inducción o de que las condiciones de cultivo volviesen a las normales. Estos resultados indican que un estrés oxidativo leve, creado por una aplicación directa de H2O2 o indirectamente mediante hipoxia/reoxigenación, acidez, trombina o citocinas inflamatorias, desencadena una translocación transitoria de PS y fosfolípidos aniónicos sobre células endoteliales viables.
4. Efectos combinados de citocinas inflamatorias e hipoxia/reoxigenación
Se observó exposición potenciada de PS y fosfolípidos aniónicos cuando se sometieron células ABAE y bEnd.3 a hipoxia/reoxigenación en presencia de IL-1 o TNF. En ausencia de las citocinas, la hipoxia/reoxigenación
104
imagen63
imagen64
imagen65
imagen66
imagen67
imagen68
imagen69
imagen70
imagen71
imagen72
imagen73
una noche a 4 ºC. El péptido se purificó en una columna de sílice. El eluente se recogió y se concentró por centrifugación a presión reducida.
Ejemplo XVI
Los derivados de duramicina se unen específicamente a PE
El presente ejemplo muestra que los derivados de duramicina sintetizados en el ejemplo XV son específicos de PE y por lo tanto pueden usarse según su diseño, ligándose a agentes impermeables para células, de direccionamiento o antivíricos y usarse en el tratamiento de enfermedades tumorales y víricas.
Para ensayar la especificidad de los derivados de duramicina, particularmente la unión a PE en preferencia a otros fosfolípidos, se realizó una serie de ensayos ELISA de competencia. La capacidad de los derivados de duramicina para competir con cualquiera de DIB o DLB por la unión con PE se ensayó en el siguiente método.
Se disolvieron PE y PC por separado en etanol. La concentración final fue de 5 g/ml. Se añadieron 100 l a cada pocillo de placas ELISA de 96 pocillos (DYNEX lMMULON®1B). Estas placas se evaporaron a 4 ºC en una cámara frigorífica. Se añadieron 250 l de caseína al 2,5 % a cada pocillo, se cubrieron y se bloquearon a 37 ºC durante 1 hora. El tampón de bloqueo se desechó y a cada pocillo se añadieron 100 l de caseína al 2.5 %. El compuesto de duramicina se añadió como diluciones en serie a través de la placa, tal como (DIM)nHIgG, (DIB)4NA, (DLB)4NA, DS, duramicina y DIB.
Las concentraciones de partida de (DIM)nHIgG fueron de 1,4 mg/ml, la concentración de partida de (DIB)4NA fue de 800 g/ml y la concentración de partida de (DLB)4NA fue de 800 g/ml. Estas se incubaron a 37 ºC durante 1 hora y se lavaron 5 veces con PBS. Se añadieron 100 l de estreptavidina-HRP (dilución 1:5000) a cada pocillo, se incubaron a 37 ºC durante 1 hora y se lavaron 5 veces con PBS. Se añadieron 100 l de OPD al 0,05 % a cada pocillo y se desarrollaron durante 5 minutos. Se añadieron 100 l de H2SO4 0,18 M para detener la reacción y se leyó a una D.O. 490.
Los datos resultantes se tabularon y después se representaron gráficamente. Concentraciones en aumento de los derivados de duramicina disminuyen la absorbancia a 490 nm, mostrando que los derivados de duramicina compiten con DIB y DLB por la unión a fosfatidiletanolamina.
Los perfiles de unión de fosfolípidos de las construcciones de duramicina se confirmaron usando ensayos ELISA posteriores. Los lípidos de ensayo respectivos PS, PE, PI, CL, PC, PG, SM, y colesterol se disolvieron por separado en etanol y se usaron para recubrir placas ELISA. Los compuestos de duramicina se añadieron como diluciones en serie a través de las placas. Después de las etapas de incubación y de lavado, se añadió un reactivo secundario de detección a cada pocillo y se determinó la reactividad usando el ensayo colorimétrico descrito anteriormente.
Los perfiles de unión de fosfolípidos representativos para los derivados de biotina duramicina, DIB y DLB se representaron gráficamente. Se observó que DIB y DLB eran específicos para PE, siendo la unión a cada uno de PS, PI, CL, PC, PG y SM insignificante o no detectable. (DIM)nHlgG-B y [(DIM)nHIgG]2-B tuvieron esencialmente los mismos perfiles de unión que DLB. Aunque se observó unión mínima a PS a altas concentraciones de DIB, esto no era significativo en el contexto de este estudio, ya que la unión a PS no era detectable a concentraciones de DIB que fueron saturantes y la concentración semimáxima para la unión de PE. Por lo tanto, las construcciones de duramicina se unen específicamente a fosfatidiletanolamina.
También se observó que el suero no tenía un efecto significativo sobre la unión a PE por los derivados de duramicina. Esto se ilustra a través de la unión del derivado de biotina duramicina DLB a placas ELISA recubiertas con PE en presencia y en ausencia de suero (BSA), en el que los perfiles de unión no muestran diferencias significativas.
Ejemplo XVII
Efectos antivíricos de los derivados peptídicos de unión a PE
Además de los efectos antivíricos mediados por anticuerpos anti PS, como se muestra en el Ejemplo XII y el Ejemplo XIII, el ejemplo presente demuestra que los efectos antivíricos de los derivados peptídicos que se unen específicamente a cualquier otro aminofosfolípido común, PE.
A. Métodos
1. Tratamiento de células infectadas con CMV in vitro
Se infectaron monocapas confluentes de fibroblastos de prepucio diploide humano (HHF-R2) en placas de 6 pocillos con CMV humano AD169 que expresaba proteína fluorescente verde (GFP) a una MOI = 0,01 como se describe en el Ejemplo XII (Bresnahan et al, 1996). Las células se incubaron con virus en un volumen total de 1,5 ml por pocillo a 37 ºC durante 90 minutos. Durante la infección, las placas se balancearon suavemente cada 30 minutos. Después
116
imagen74
imagen75
imagen76
cambios en los recuentos de las células sanguíneas, incluyendo eritrocitos, plaquetas, leucocitos, recuentos absolutos de linfocitos o recuentos absolutos de neutrófilos.
La celularidad y composición de la médula ósea eran normales. Para analizar la celularidad de la médula ósea, se examinaron secciones de parafina de médula ósea procedente de ratones tratados con 3G4 o BBG3 (seis inyecciones, 100 g) para la composición celular y celularidad total. Las médulas en los animales tratados eran básicamente completamente celulares (como podría esperarse para un mamífero joven). Los progenitores eritroides, granulocíticos, linfocíticos y megacariocitos estaban presentes en cantidades normales. Otra toxicidad en órganos estaba ausente, como se evaluó mediante un examen histológico post mortem del pulmón, hígado, corazón, cerebro, intestino, estómago y riñón.
En resumen, no se observaron casos de toxicidad en más de 200 ratones tratados con altas dosis de 3G4 (0,1 mg) tres veces a la semana durante 2-4 semanas o en ratas. Incluso cuando se proporcionaban dosis tan altas como 2 mg, no se observaron signos de toxicidad. Los ratones conservaban síntomas físicos normales, celularidad de médula ósea, recuentos de leucocitos, histología y funciones de coagulación. En estudios posteriores, grupos de cinco ratones no portadores de tumores recibieron una sola inyección i.p. de 2 mg de 3G4, o inyecciones repetidas
i.p. de 0,5 mg de 3G4 diariamente durante 14 días (dosis total 7 mg), no mostraron síntomas físicos de toxicidad.
También se realizaron estudios cinéticos de eliminación sanguínea en ratones. El 3G4 se marcó con radioyodo usando el reactivo de Bolton Hunter y recibieron una inyección intravenosa en los ratones (25 g). Las muestras de sangre se extrajeron a través de la vena de la cola en diversos momentos posteriores. La tasa de eliminación sanguínea de 3G4 era típicamente la de una IgG de ratón en el ratón. La semivida en la fase  de eliminación fue de 3 horas mientras que en la fase  fue de 5 días. El volumen de distribución fue normal (100 ml/kg). Estos estudios indican que 3G4 no interacciona con tejidos hospedadores normales, lo que conduce a su eliminación acelerada.
El anticuerpo 3G4 humanizado también se administró a conejos ateroescleróticos y mostró que era inocuo.
3. Estudios de seguridad en monos
El anticuerpo 3G4 humanizado (véase el Ejemplo XIX, más adelante) también se administró a monos en estudios de seguridad y no se observaron efectos secundarios significativos. El anticuerpo 3G4 humanizado se administró IV como un solo bolo hasta 100 mg/kg a monos cinomolgos. Esto es 100 veces la dosis terapéutica calculada (1 mg/kg).
El nivel de efecto no adverso (NOAEL) fue de aproximadamente 10 mg/kg/semana en dosificación repetida. Hubo una prolongación transitoria en APTT y PT a las dosis de 10-100 mg/kg. No hubo cambios significativos en los recuentos de células sanguíneas, incluyendo leucocitos, eritrocitos y plaquetas, u otros compuestos químicos clínicos.
E. Efectos antivíricos
El anticuerpo 3G4 también ejerce efectos antivíricos significativos. Como se muestra en el Ejemplo XIII, el tratamiento de células infectadas con VSR con 3G4 fue superior al efecto observado usando 3SB. Por lo tanto estos resultados destacan otra ventaja del anticuerpo 3G4 sobre el anticuerpo anti-PS prominente en la bibliografía, 3SB (Rote et al. (1993)).
También se observó que el anticuerpo 3G4 era muy eficaz inhibiendo el CMV, tanto in vitro (Ejemplo XII) como potenciando la supervivencia de ratones infectados con mCMV in vivo (Ejemplo XXI). Además, se demuestra adicionalmente que el anticuerpo 3G4 inhibe la infección por el virus Pichinde, el agente infeccioso de la fiebre Lassa (Ejemplo XXIV). La exposición de PS en la superficie celular en el presente documento que se ha mostrado que sigue la infección vírica y la capacidad del anticuerpo 3G4 para unirse a células infectadas con el virus Vaccinia (Ejemplo XXIII), muestra que el anticuerpo 3G4 tiene enorme potencial como un agente antivírico de amplio espectro.
Ejemplo XIX
Anticuerpo 3G4, secuencias CDR, construcciones quiméricas y relacionadas
El anticuerpo 3G4 por tanto posee las propiedades combinadas de un agente antiangiogénico, antitumoral vascular y antivírico. Las actividades inhibidoras de 3G4 sobre la división celular, angiogénesis, crecimiento tumoral, infectividad vírica, junto con la ausencia de toxicidad aparente, muestran indicaciones terapéuticas amplias para este anticuerpo, incluyendo en el tratamiento de trastornos angiogénicos, cáncer, diabetes e infecciones víricas.
Los anticuerpos que reconocen sustancialmente el mismo epítopo que el anticuerpo 3G4 pueden generarse para su uso en una o más de las siguientes terapias antiangiogénicas, antitumorales vasculares y antivíricas, por ejemplo, por inmunización y confirmada por estudios de competición de anticuerpos. Los anticuerpos que se unen a esencialmente el mismo epítopo que el anticuerpo 3G4 también pueden generarse a partir de un conocimiento de las secuencias del anticuerpo 3G4 proporcionadas en el presente documento. Este ejemplo proporciona las secuencias
120
imagen77
imagen78
imagen79
imagen80
de modalidades de tratamiento, es decir, irradiación y el anticuerpo 3G4, mostraron el mayor efecto antitumoral.
I. El direccionamiento de 3G4 de células tumorales apoptóticas a FcR en células dendríticas
Los tumores de ratones tratados con 3G4 más docetaxel también contenían cantidades inusuales de linfocitos, en comparación con los tumores de control. Aunque este fenómeno podría representar quimioatracción típica de las células inmunitarias disgregando células tumorales, también podría reflejar la activación del sistema inmunitario mediante la unión de Fc a través de 3G4 a FcR en células efectoras inmunitarias.
Para caracterizar los efectos de la administración de 3G4 y de docetaxel en el infiltrado celular inmunitario intratumoral, pueden identificarse los tipos de células presentes en estos infiltrados por inmunotinción de secciones congeladas y/o secciones en parafina de tejidos tumorales usando anticuerpos dirigidos contra marcadores específicos de macrófagos, neutrófilos, granulocitos, células NK y linfocitos activados (Pharmingen, San Diego, CA). El grado, fenotipo y estado de activación de este infiltrado puede graduarse. La producción de citocinas a través de la infiltración de células inmunitarias, incluyendo IL-2 e INF, también puede analizarse mediante técnicas inmunohistoquímicas. Los niveles de citocinas en suero pueden evaluarse por ELISA y tinción intracelular pueden usarse para identificar los compartimentos celulares específicos responsables de la producción de citocinas. Los efectos de las células inmunitarias infiltrantes en la proliferación celular tumoral y apoptosis pueden por tanto evaluarse sistemáticamente.
A la luz de los datos anteriores, los autores de la invención contemplaron adicionalmente métodos que potenciaban la fuerza de la inmunoterapia del cáncer de mama mediante el direccionamiento de células tumorales apoptóticas mediado por 3G4 al receptor Fc gamma (Fc()R) en células dendríticas. La presentación eficiente del antígeno, que induce respuestas inmunitarias celulares y humorales eficaces, es importante para el desarrollo de vacunas tumorales e inmunoterapias. Las células dendríticas (CD) son las células presentadoras del antígeno (CPA) más fuertes, que sensibilizan a los linfocitos T citotóxicos contra antígenos asociados a tumores. La mejora de la presentación antigénica tumoral mediante las células dendríticas (CD) podría conducir al desarrollo de vacunas tumorales más fuertes.
La presentación antigénica mediante la internalización mediada por el receptor Fc()R de las CD puede potenciarse hasta 1.000 veces en comparación con la pinocitosis antigénica en fase fluida. Las células tumorales apoptóticas (CTA) son una excelente fuente de antígenos para la carga de células dendríticas porque pueden presentarse de un modo eficaz múltiples antígenos específicos de tumor (tanto conocidos como desconocidos) a linfocitos T sin tratar, lo que hace que aparezcan variantes de escape inmunitarias menos probablemente debido al bloqueo de determinados epítopos. En estudios con animales, se ha demostrado que las CD impulsadas con CTA producen una potente inmunidad antitumoral in vitro e in vivo. Sin embargo, datos recientes han demostrado que las CTA en solitario fueron algo menos eficaces para activar la inmunidad antitumoral, posiblemente debido a su capacidad insuficiente e incapaz para inducir la maduración de CD.
Recientes estudios también han demostrado que el complejo CTA-inmunitario, formado por la unión de anticuerpo antitumoral contra células tumorales apoptóticas, puede dirigirse a Fc()R en CD. En comparación con las CTA en solitario, los complejos CTA-inmunitarios se internalizaban de un modo más eficaz mediante CD, más eficaz en la inducción de la activación de CD y maduración, y lo que es más importante, los complejos CTA-inmunitarios pueden potenciar significativamente tanto la presentación antigénica limitada de MHC I y II, por lo tanto inducir una potente inmunidad CTL y auxiliares T antitumorales.
Los inventores por tanto consideran el uso de anticuerpos anti-PS de la presente invención para potenciar inmunidad antitumoral tanto hormonal como celular, y reforzar la eficacia de vacunas tumorales con CD basadas en CTA. Como PS es un marcador específico universal y el más abundante de las células tumorales apoptóticas, el panel de anticuerpos de la invención, particularmente 3G4, puede unirse a PS en CTA. Los inventores han demostrado ya que 3G4 puede potenciar la captación de CD en células tumorales apoptóticas un 300 % a través de la internalización mediada por Fc()R de complejos 3G4-CTA. Potenciando la captación de CTA por CD mediante Fc()R, se razona por lo tanto que los anticuerpos 3G4 y similares puedan potenciar enormemente la presentación antigénica limitada tanto a MHC I como a II, inducir tanto la inmunidad antitumoral hormonal como celular fuerte y reforzar la eficacia de las vacunas tumorales de CD basadas en CTA. Esto puede demostrarse estableciendo la eficacia de CD cargadas con complejos inmunitarios 3G4-CTA en la inducción de T h1, CTL y respuesta de anticuerpos in vivo y determinando la fuerza de la inmunidad antitumoral inducida por la inmunización de CD cargada con complejos inmunitarios 3G4-CTA in vivo.
EJEMPLO XXI
Los anticuerpos anti-PS tratan infecciones CMV in vivo
Después de los efectos antivíricos contra CMV in vitro mostrados en el Ejemplo XII, el presente ejemplo demuestra la supervivencia potenciada de ratones infectados con la versión murina de virus CMV, mCMV.
Se infectaron ratones Balb/C (de 6 semanas de vida, cinco ratones por grupo) por vía i.p. con 5 x 105 ufp de mCMV
125
imagen81
imagen82
imagen83
imagen84
imagen85
imagen86
imagen87
imagen88
imagen89
imagen90
imagen91
imagen92
imagen93
imagen94
imagen95
de Laat, Derksen, Urbanus, Roest, de Groot, "beta(2)-glycoprotein I-dependent lupus anticoagulant highly correlates with thrombosis in the antiphospholipid syndrome," Blood, 104:3598-3602, 2004b.
de Laat, Derksen, Urbanus, de Groot, "IgG antibodies that recognize epitope Gly40-Arg43 in domain I of beta(2)glycoprotein I cause LAC, and their presence correlates strongly with thrombosis," Blood, 105:1540-1545, 2005a.
de Laat, Derksen, van Lummel, Pennings, de Groot, "Pathogenic anti-beta(2)-glycoprotein I antibodies recognize domain I of beta(2)-glycoprotein I only after a conformational change," Blood, published online: DOI 10.1182/blood20, 2005b.
Deleze, Alarconsegovia, Valdesmacho, Oria, Deleon, "Relationship between antiphospholipid antibodies and recurrent fetal loss in patients with systemic lupus-erythematosus and apparently healthy women, J". Rheumatol., 16:768-772, 1989.
Denekamp, "Vascular attack as a therapeutic strategy for cancer," Cancer Metastasis Rev., 9:267-282, 1990.
Devaux, "Protein involvement in transmembrane lipid asymmetry," Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 21:417-439, 1992.
Devitt, Pierce, Oldreive, Shingler, Gregory, "CD14-dependent clearance of apoptotic cells by human macrophages: the role of phosphatidylserine," Cell Death Differ., 10:371-382, 2003.
DeVore et al., "Phase I study of the antineovascularization drug CM101," Clin. Cancer Res., 3(3):365-372, 1997.
Diehl, Pfreundschuh, Fonatsch, Stein, Falk, Burrichter, Schaadt, "Phenotypic genotypic analysis of Hodgkin's disease derived cell lines: histopathological and clinical implications," Cancer Surveys, 4:399-416, 1985,
Dillon, Mancini, Rosen, et al., "Annexin V binds to viable B cells and colocalizes with a marker of lipid rafts upon B cell receptor activation," J. Immunol., 164(3):1322-1332, 2000.
Donati y Falanga, "Pathogenic mechanisms of thrombosis in malignancy," Acta Haematol., 106(1-2):18-24, 2001.
Drouvalakis y Buchanan, "Phospholipid specificity of autoimmune and drug induced lupus anticoagulants; association of phosphatidylethanolamine reactivity with thrombosis in autoimmune disease," J. Rheumatol., 25(2):290-295, 1998.
Droz, Patey, Paraf, Chretien, Gogusev, "Composition of extracellular matrix and distribution of cell adhesion molecules in renal cell tumors," Lab. Invest., 71:710-718, 1994.
Dvorak, Nagy, Dvorak, "Structure of solid tumors and their vasculature: implications for therapy with monoclonal antibodies," Cancer Cells, 3(3):77-85, 1991.
Edgington, Mackman, Brand, Ruf, "The structural biology of expression and function of tissue factor," Thromb. Haemost., 66(1):67-79, 1991.
Emoto, Kobayashi, Yamaji, Aizawa, Yahara, Inoue y Umeda, "Redistribution of phosphatidylethanolamine at the cleavage furrow of dividing cells during cytokinesis," Proc. Natl. Acad. Sci., 93:12867-12872, 1996.
Emoto, Toyama-Sorimachi, Karasuyama, Inoue y Umeda, "Exposure of phosphatidylethanolamine on the surface of apoptotic cells," Exp. Cell Res., 232:430-434, 1997.
Fadok, Bratton, Konowal, Freed, Westcott, Henson, "Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/paracrine mechanisms involving TGF-beta, PGE2, and PAF,"
J. Clin. Invest., 101:890-898, 1998.
Fadok, Bratton, Rose, Pearson, Ezekewitz, Henson, "A receptor for phosphatidylserinespecific clearance of apoptotic cells," Nature, 405:85-90, 2000.
Fadok, de Cathelineau, Daleke, Henson, Bratton, "Loss of phospholipid asymmetry and surface exposure of phosphatidylserine is required for phagocytosis of apoptotic cells by microphages and fibroblasts," J. Biol. Chem., 276:1071-1077, 2001a.
Fadok, Bratton, Guthrie, Henson, "Differential effects of apoptotic versus lysed cells on macrophage production of cytokines: role of proteases," J. Immunol., 166:6847-6854, 2001b.
Ferrara, Clapp, Weiner, "The 16K fragment of prolactin specifically inhibits basal or fibroblast growth factor stimulated growth of capillary endothelial cells," Endocrinology, 129(2):896-900, 1991.
Folkman et al., "Angiogenesis inhibition and tumor regression caused by heparin or a heparin fragment in the presence of cortisone," Science, 221:719-725, 1983.
141
imagen96
imagen97
imagen98
imagen99
imagen100
imagen101
imagen102
imagen103
imagen104
imagen105
imagen106
imagen107

Claims (1)

  1. imagen1
    imagen2
    imagen3
ES06719706.1T 2005-01-24 2006-01-24 Construcciones de fusión a Fc de unión a fosfatidilserina y su uso terapéutico Active ES2565543T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US64633305P 2005-01-24 2005-01-24
US646333P 2005-01-24
PCT/US2006/002964 WO2006079120A2 (en) 2005-01-24 2006-01-24 Fc-fusion constructs binding to phosphatidylserine and their therapeutic use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2565543T3 true ES2565543T3 (es) 2016-04-05

Family

ID=36693034

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES06719706.1T Active ES2565543T3 (es) 2005-01-24 2006-01-24 Construcciones de fusión a Fc de unión a fosfatidilserina y su uso terapéutico

Country Status (14)

Country Link
US (3) US8956616B2 (es)
EP (1) EP1853631B1 (es)
JP (2) JP5127043B2 (es)
CN (3) CN104277117A (es)
AU (1) AU2006206187B2 (es)
CA (1) CA2591914C (es)
DK (1) DK1853631T3 (es)
ES (1) ES2565543T3 (es)
HK (2) HK1198255A1 (es)
IL (1) IL184406A (es)
NZ (1) NZ556065A (es)
SG (1) SG158919A1 (es)
SI (1) SI1853631T1 (es)
WO (1) WO2006079120A2 (es)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2727261A1 (es) * 2018-04-12 2019-10-15 Fundacion Para La Investig Biomedica Del Hospital 12 De Octubre INMUNOCOMPLEJOS ARTIFICIALES Y SU USO COMO CALIBRES EN SISTEMAS DE DETECCION DE INMUNOCOMPLEJOS CIRCULANTES B2GP1-aB2GP1

Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050222030A1 (en) * 2001-02-21 2005-10-06 Anthony Allison Modified annexin proteins and methods for preventing thrombosis
US20090291086A1 (en) * 2001-02-21 2009-11-26 Alavita Pharmaceuticals, Inc. Compositions and Methods for Treating Cerebral Thrombosis and Global Cerebral Ischemia
GB0707034D0 (en) 2007-04-12 2007-05-23 St Andrews The Compounds
EP2164992B1 (en) * 2007-05-30 2016-05-04 Lpath, Inc. Compositions and methods for binding lysophosphatidic acid
US20110064744A1 (en) * 2007-05-30 2011-03-17 Sabbadini Roger A Prevention and treatment of pain using antibodies to lysophosphatidic acid
US9163091B2 (en) * 2007-05-30 2015-10-20 Lpath, Inc. Compositions and methods for binding lysophosphatidic acid
WO2009049089A1 (en) 2007-10-09 2009-04-16 Washington University In St. Louis Ligand directed toroidal nanoparticles for therapy and diagnostic imaging
US9446150B2 (en) 2007-10-09 2016-09-20 Washington University Particles for imaging
EP2222277A4 (en) * 2007-11-15 2014-10-15 Biolitec Pharma Ip & Invest Ltd PGEYLATED LIPOSOMAL FORMULATIONS FOR THE PHOTODYNAMIC TREATMENT OF INFLAMMATORY DISEASES
GB0723797D0 (en) * 2007-12-05 2008-01-16 Immunosolv Ltd Method
WO2009089098A1 (en) * 2008-01-03 2009-07-16 Musc Foundation For Research Development Methods for the treatment of cancers
CA2719567A1 (en) * 2008-03-26 2009-10-01 University Of Oxford Endoplasmic reticulum targeting liposomes
GB0819287D0 (en) 2008-10-22 2008-11-26 Univ Bradford Compounds
JP5580329B2 (ja) 2008-12-05 2014-08-27 アブラクシス バイオサイエンス リミテッド ライアビリティー カンパニー Ｓｐａｒｃ結合ペプチド及びその使用
WO2011036467A1 (en) * 2009-09-24 2011-03-31 Russell David Keenan Products useful in the treatment of haemophilia
WO2011069090A1 (en) * 2009-12-04 2011-06-09 Alavita Pharmaceuticals, Inc. Inhibition of the activation of coagulation factor xii by ligands of phosphatidylserine
US9808500B2 (en) 2009-12-17 2017-11-07 Washington University Antithrombotic nanoparticle
EP2512452B1 (en) 2009-12-17 2018-09-19 The Washington University Antithrombotic nanoparticle
EP2369551B1 (en) * 2010-03-25 2019-10-30 Emory University Imaging system and method
CA2796435C (en) * 2010-04-15 2019-05-07 The Washington University Prodrug compositions, prodrug nanoparticles, and methods of use thereof
EP2571992B1 (en) * 2010-05-21 2018-04-25 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Bi-specific fusion proteins
CN105524176B (zh) * 2010-05-21 2021-03-19 银溪制药股份有限公司 双特异性融合蛋白
WO2012030949A2 (en) * 2010-09-01 2012-03-08 Kansas State University Research Foundation B2-glycoprotein i peptide inhibitors
WO2013033513A1 (en) 2011-08-31 2013-03-07 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Apoptosis-targeting nanoparticles
US9463217B1 (en) * 2012-02-10 2016-10-11 Institut National De La Santé Et De La Recherche Médicale (Inserm) Methods and pharmaceutical compositions for treatment of retinal occlusion
JP6356614B2 (ja) 2012-02-17 2018-07-11 ユニバーシティ・オブ・ジョージア・リサーチ・ファウンデイション・インコーポレイテッド 薬剤のミトコンドリア輸送のためのナノ粒子
EP2877211A4 (en) * 2012-07-25 2016-02-10 Salk Inst For Biological Studi REGULATION OF THE INTERACTION BETWEEN TAM LIGANDS AND LIPID MEMBRANES CONTAINING PHOSPHATIDYLSERIN
US20140287024A1 (en) * 2013-03-08 2014-09-25 Shu Wang Nanoparticle-based delivery system with oxidized phospholipids as targeting ligands for the prevention, diagnosis and treatment of atherosclerosis
ES2945994T3 (es) * 2013-03-15 2023-07-11 Gladiator Biosciences Inc Dominios Gla como agentes de direccionamiento
GB2516882A (en) 2013-08-02 2015-02-11 Univ Bradford Tumour-targeted theranostic
AU2014365838B2 (en) 2013-12-16 2021-01-14 The University Of North Carolina At Chapel Hill Depletion of plasmacytoid dendritic cells
US10398663B2 (en) 2014-03-14 2019-09-03 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Mitochondrial delivery of 3-bromopyruvate
AU2015274367B2 (en) 2014-06-13 2020-11-26 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Products and methods to isolate mitochondria
US11000603B2 (en) 2015-04-14 2021-05-11 Benhealth Biopharmaceutic (Shenzhen) Co., Ltd. Multi-specific binding conjugate, related pharmaceutical compositions and use
US20180154012A1 (en) * 2015-05-05 2018-06-07 Rubicon Biotechnology Llc Cancer immunotherapeutic
US10345310B2 (en) 2015-06-09 2019-07-09 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Diagnostic test for early stage cancer
US10040840B2 (en) * 2015-10-02 2018-08-07 Silver Creek Pharmaceuticals, Inc. Bi-specific annexin A5/IGF-1 proteins and methods of use thereof to promote regeneration and survival of tissue
WO2017106372A1 (en) 2015-12-15 2017-06-22 Oncoimmune, Inc. Chimeric and humanized anti-human ctla4 monoclonal antibodies and uses thereof
CN109152795A (zh) * 2016-01-15 2019-01-04 儿童医学中心公司 线粒体和组合的线粒体试剂的治疗用途
WO2017133018A1 (zh) * 2016-02-06 2017-08-10 法玛科技顾问股份有限公司 重组β2-糖蛋白胜肽及其于抗肿瘤的应用
EP3450460B1 (en) * 2016-04-29 2023-07-12 Benhealth Biopharmaceutic (Shenzhen) Co. Ltd. Multi-specific binding conjugate, related pharmaceutical compositions and use
CN109689692B (zh) 2016-06-22 2021-11-12 本康生物制药（深圳）有限公司 用于肿瘤治疗的双特异性抗体和抗体偶联物及其应用
EA038617B1 (ru) * 2016-07-06 2021-09-23 Онкоиммьюн, Инк. Химерные и гуманизированные античеловеческие ctla-4 моноклональные антитела и их использование
KR20190054094A (ko) 2016-09-27 2019-05-21 세로 테라퓨틱스, 인코포레이티드 키메라 포식작용 수용체 분자
CA3037008A1 (en) 2016-09-27 2018-04-05 Oncologie, Inc. Methods for treating cancer with bavituximab based on levels of .beta.2-glycoprotein 1, and assays therefor
JP2020515637A (ja) * 2017-04-03 2020-05-28 オンコロジー、インコーポレイテッド 免疫腫瘍剤を伴うｐｓ標的化抗体を用いる癌の治療方法
CN108727489B (zh) * 2017-04-19 2021-02-09 广州市第八人民医院 一种单克隆抗体zk2c2及应用
WO2019023156A1 (en) * 2017-07-24 2019-01-31 Rutgers, The State University Of New Jersey PHOSPHATIDYLSERIN-TARGETING FUSION MOLECULES AND METHODS OF USE
US11661447B2 (en) 2017-08-03 2023-05-30 The Cleveland Clinic Foundation Human β2-glycoprotein I expression
SG11202001535RA (en) * 2017-09-05 2020-03-30 Gladiator Biosciences Inc Method of targeting exosomes
CN111386284A (zh) 2017-09-26 2020-07-07 森罗治疗公司 嵌合吞噬受体分子和使用方法
CN108021784B (zh) * 2017-12-01 2021-05-11 大连理工大学 纳米金属氧化物光致产生活性氧物种的预测方法
EP3876909A4 (en) * 2018-11-08 2022-09-28 Nasr, Mahmoud NANODISCS FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF PATHOGENIC INFECTIONS AND METHODS OF USE THEREOF
WO2020115281A1 (en) 2018-12-07 2020-06-11 Baxalta GmbH Proteinaceous molecules binding factor ixa and factor x
WO2020114614A1 (en) 2018-12-07 2020-06-11 Baxalta GmbH Proteinaceous molecules binding factor ixa and factor x
EP3711772A1 (en) * 2019-03-20 2020-09-23 Oslo Universitetssykehus HF Recombinant proteins and fusion proteins
US20220395578A1 (en) * 2019-06-28 2022-12-15 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Therapeutic annexin-drug conjugates and methods of use
US20220033426A1 (en) * 2020-07-28 2022-02-03 Yale University Transition Metal Macrocyclics as MRI Contrast Agents for Molecular Imaging
CN116249525A (zh) * 2020-08-21 2023-06-09 芝加哥大学 用于癌症疗法的含有多个可裂解前体药物的纳米颗粒
JP2024512207A (ja) * 2021-02-05 2024-03-19 ヴィクィ インク． 細胞の形態学的変化の早期検出のための機械学習
CN114002133B (zh) * 2021-10-25 2023-01-24 南京大学 血清中ps阳性外泌体作为乳腺癌化疗敏感性标志物的应用
WO2023141524A2 (en) * 2022-01-19 2023-07-27 Lyndra Therapeutics, Inc. Dosage forms for gastric retention
CN114288399B (zh) * 2022-01-20 2023-10-27 武汉科技大学 一种嵌合抗原受体联合抗肿瘤药物组合物及其应用
US20230324382A1 (en) * 2022-02-01 2023-10-12 Trustees Of Tufts College Antiphospholipid antibodies for the diagnosis of lyme disease
WO2023150672A1 (en) * 2022-02-04 2023-08-10 Duke University Compositions for and methods of treating hematological cancers

Family Cites Families (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5245015A (en) * 1991-04-26 1993-09-14 Tanox Biosystems, Inc. Monoclonal antibodies which neutralize HIV-1 through reaction with a conformational epitope in vitro
EP0474849B1 (en) 1990-04-06 1995-09-13 Yamasa Shoyu Co., Ltd. Methods for determining antiphospholipid antibodies
EP0600088B1 (en) 1992-02-05 1998-12-30 Yamasa Corporation Solid-phase reagent and assay of antibody using the same
WO1994013323A1 (en) 1992-12-04 1994-06-23 The Liposome Company, Inc. Method of inhibiting the clearance of liposomes from the circulation
FR2701319B1 (fr) 1993-02-09 1995-04-21 Elie Stefas Procédé de détection et/ou de dosage de composés viraux et support portant une glycoprotéine.
FR2701263B1 (fr) 1993-02-09 1995-04-21 Elie Stefas Procédé d'obtention d'une composition aqueuse protéinique, composition correspondante, glycoprotéine contenue et son utilisation pour la stabilisation de l'albumine et la détection ou le dosage d'anticorps.
WO1995009363A1 (fr) 1993-09-29 1995-04-06 Yamasa Corporation Procede de titrage de lipoproteine oxydee et applications de ce procede
US5998223A (en) 1993-11-16 1999-12-07 Yamasa Corporation Method of assaying autoimmune anticardiolipin antibody and kit therefor
FR2722991B1 (fr) 1994-08-01 1996-10-11 Orstom Utilisation de la beta2-glycoproteine i sous au moins une de ses formes comme agent anti-infectueux et composition pharmaceutique corrrespondante
EP0775315B1 (fr) 1994-08-01 2002-09-25 Institut de Recherche pour le Développement ( IRD) Procede de separation et/ou de detection et/ou de quantification de compose(s) infectieux et support pour la mise en oeuvre du procede
US5817789A (en) 1995-06-06 1998-10-06 Transkaryotic Therapies, Inc. Chimeric proteins for use in transport of a selected substance into cells
US5874409A (en) 1995-06-07 1999-02-23 La Jolla Pharmaceutical Company APL immunoreactive peptides, conjugates thereof and methods of treatment for APL antibody-mediated pathologies
US6203980B1 (en) 1998-02-02 2001-03-20 University Of Pittsburgh Identification of apolipoprotein H mutations and their diagnostic uses
US6858210B1 (en) 1998-06-09 2005-02-22 La Jolla Pharmaceutical Co. Therapeutic and diagnostic domain 1 β2GPI polypeptides and methods of using same
IL125262A0 (en) 1998-07-07 1999-03-12 Yeda Res & Dev Synthetic peptides and pharmaceutical compositions comprising them
JP2000028607A (ja) 1998-07-10 2000-01-28 Iatron Lab Inc 新規なモノクローナル抗体及びニックβ２グリコプロテインＩの免疫学的分析方法
US6818213B1 (en) 1998-07-13 2004-11-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Cancer treatment compositions comprising therapeutic conjugates that bind to aminophospholipids
ES2188202T3 (es) 1998-07-13 2003-06-16 Univ Texas Metodos de tratamiento para el cancer usando conjugados terapeuticos que se enlazan con aminofosfolipidos.
JP4743672B2 (ja) 1998-07-13 2011-08-10 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム アミノリン脂質に対する抗体を用いる癌処置方法
US6406693B1 (en) 1998-07-13 2002-06-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Cancer treatment methods using antibodies to aminophospholipids
US20050197283A1 (en) 1998-10-04 2005-09-08 Vascular Biogenics Ltd. Compositions containing beta 2-glycoprotein I for the prevention and/or treatment of vascular disease
IL126447A (en) 1998-10-04 2004-09-27 Vascular Biogenics Ltd An immune preparation that confers tolerance in oral administration and its use in the prevention and / or treatment of atherosclerosis
US20050148499A1 (en) 1998-10-04 2005-07-07 Dror Harats Compositions containing beta 2-glycoprotein I for the prevention and/or treatment of atherosclerosis
AUPQ272699A0 (en) 1999-09-09 1999-09-30 Unisearch Limited Use of beta2GPI in diagnostic tests for autoimmune diseases
US7600039B2 (en) * 2000-02-16 2009-10-06 Motorola, Inc. Label-based multiplexing
NZ521509A (en) 2000-03-08 2005-10-28 Nat Jewish Med & Res Center Phosphatidylserine receptor from human, mouse, drosophila and caenorhabditis, its homologue or antibody for reducing inflammation, treating autoimmune disease and increasing anti-tumour immunity
WO2001093914A2 (en) 2000-06-08 2001-12-13 La Jolla Pharmaceutical Company Multivalent platform molecules comprising high molecular weight polyethylene oxide
WO2002060919A2 (en) * 2000-12-12 2002-08-08 Medimmune, Inc. Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
US20020127698A1 (en) * 2001-01-26 2002-09-12 Ralf Geiben Lynn Serpin drugs for treatment of HIV infection and method of use thereof
EP1404412B1 (en) * 2001-06-13 2012-03-21 The University of Sydney Protein C for wound healing
FR2827047B1 (fr) 2001-07-03 2003-09-26 Apoh Technollgies Sa Procede de separation et/ou detection et/ou identification et/ou quantification de proteines prions
JP4681175B2 (ja) 2001-09-28 2011-05-11 三菱化学メディエンス株式会社 播種性血管内凝固症候群及びその発症前段階を検出する方法
JP4070443B2 (ja) 2001-10-11 2008-04-02 株式会社三菱化学ヤトロン 脳梗塞を検出する方法
US20030100036A1 (en) 2001-11-08 2003-05-29 Aristo Vojdani Saliva immunoassay for detection of antibodies for cardiovascular disease
WO2003044482A2 (en) 2001-11-16 2003-05-30 The University Of Tennessee Research Corporation Recombinant antibody fusion proteins and methods for detection of apoptotic cells
WO2003099833A2 (en) * 2002-05-17 2003-12-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Beta-2-glycoprotein 1 is an inhibitor of angiogenesis
US7455833B2 (en) 2002-07-15 2008-11-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for treating viral infections using antibodies and immunoconjugates to aminophospholipids
US7790159B2 (en) 2002-07-15 2010-09-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods, combinations and kits for treating viral infections using immunoconjugates and antibodies to aminophospholipids
US7615223B2 (en) 2002-07-15 2009-11-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Selected immunoconjugates for binding to aminophospholipids
US7678386B2 (en) 2002-07-15 2010-03-16 Board Of Regents The University Of Texas Liposomes coated with selected antibodies that bind to aminophospholipids
US7572448B2 (en) 2002-07-15 2009-08-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Combined cancer treatment methods using selected antibodies to aminophospholipids
US7625563B2 (en) 2002-07-15 2009-12-01 Board Of Regents, The University Of Texas System Cancer treatment methods using selected immunoconjugates for binding to aminophospholipids
US7714109B2 (en) 2002-07-15 2010-05-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Combinations and kits for cancer treatment using selected antibodies to aminophospholipids
US7247303B2 (en) 2002-07-15 2007-07-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Selected antibody CDRs for binding to aminophospholipids
US7906115B2 (en) 2002-07-15 2011-03-15 Thorpe Philip E Combinations kits and methods for treating viral infections using antibodies and immunoconjugates to aminophospholipids
US7611704B2 (en) 2002-07-15 2009-11-03 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods for treating viral infections using antibodies and immunoconjugates to aminophospholipids
US7622118B2 (en) 2002-07-15 2009-11-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Cancer treatment methods using selected antibodies to aminophospholipids
NZ596825A (en) 2002-07-15 2013-06-28 Univ Texas Duramycin peptides and their use in imaging
AU2003251238A1 (en) 2002-08-07 2004-02-25 Umc Utrecht Holding B.V. Modulation of platelet adhesion based on the surface exposed beta-switch loop of platelet glycoprotein ib-alpha
EP3552627A1 (en) * 2003-05-06 2019-10-16 Bioverativ Therapeutics Inc. Clotting factor-fc chimeric proteins to treat hemophilia
US8198020B2 (en) 2003-08-22 2012-06-12 Potentia Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhancing phagocytosis or phagocyte activity
WO2006109312A2 (en) 2005-04-15 2006-10-19 Vascular Biogenics Ltd. Compositions containing beta 2-glycoprotein i-derived peptides for the prevention and/or treatment of vascular disease
EP1872132B1 (en) 2005-04-18 2013-09-18 Bio-Rad Laboratories, Inc. Solid phase immobilization of phospholipids and cofactor proteins via covalent attachment

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2727261A1 (es) * 2018-04-12 2019-10-15 Fundacion Para La Investig Biomedica Del Hospital 12 De Octubre INMUNOCOMPLEJOS ARTIFICIALES Y SU USO COMO CALIBRES EN SISTEMAS DE DETECCION DE INMUNOCOMPLEJOS CIRCULANTES B2GP1-aB2GP1

Also Published As

Publication number Publication date
WO2006079120A2 (en) 2006-07-27
US20160015826A1 (en) 2016-01-21
JP2012111783A (ja) 2012-06-14
CN101146826A (zh) 2008-03-19
CA2591914C (en) 2017-04-25
SG158919A1 (en) 2010-02-26
DK1853631T3 (en) 2016-03-29
CN104277117A (zh) 2015-01-14
CN104109209A (zh) 2014-10-22
US20160311886A1 (en) 2016-10-27
HK1205133A1 (en) 2015-12-11
AU2006206187B2 (en) 2011-03-10
CA2591914A1 (en) 2006-07-27
IL184406A (en) 2014-11-30
CN104109209B (zh) 2016-06-08
NZ556065A (en) 2009-04-30
IL184406A0 (en) 2008-12-29
HK1198255A1 (zh) 2015-03-20
SI1853631T1 (sl) 2016-04-29
JP2008528521A (ja) 2008-07-31
WO2006079120A3 (en) 2007-07-19
US20060228299A1 (en) 2006-10-12
AU2006206187A1 (en) 2006-07-27
US8956616B2 (en) 2015-02-17
EP1853631B1 (en) 2016-03-09
EP1853631A2 (en) 2007-11-14
JP5127043B2 (ja) 2013-01-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2565543T3 (es) Construcciones de fusión a Fc de unión a fosfatidilserina y su uso terapéutico
CN100506846C (zh) 与阴离子磷脂和氨基磷脂结合的选定抗体和耐久霉素肽以及它们在治疗病毒感染和癌症中的用途
ES2893249T3 (es) Inmunoconjugados que comprenden IL-2, anticuerpo anti-fibronectina y TNF-alfa mutante
ES2373966T3 (es) Composiciones y procedimientos para el tratamiento de la angiogénesis en lesiones patológicas.
ES2382058T3 (es) Combinación de una proteína de fusión de un anticuerpo dirigido contra el EDB de la fibronectina-IL-2, y una molécula de unión a los linfocitos B, progenitores de los linfocitos B y/o sus homólogos cancerosos
JP2019526578A (ja) キャリアー−ｐｄ−ｌ１結合剤組成物及び癌を処置する為にそれを使用する方法
EA009955B1 (ru) Слияние цитокинов и опухоленацеливающих белков
KR20020019905A (ko) Ｖｅｇｆ를 선택적으로 억제하여 암을 치료하는 조성물 및방법
US20070178104A1 (en) Methods and means for treating solid tumors
BR112020018196A2 (pt) Métodos e composições para tratar câncer com peptídeos de afinidade com ecm ligados a citocinas
US20220143130A1 (en) Peptides Having Immunomodulatory Properties
EP1601330A2 (en) Antitumor agents comprising a targeting portion and an immune response triggering portion
ES2946073T3 (es) Conjugados anticuerpo-fármaco dirigidos a uPARAP
US20220298225A1 (en) Methods and compositions for treating cancer with collagen binding drug carriers
WO2023097111A2 (en) Methods and compositions for treating calcinosis associated conditions
KR20240024816A (ko) 우로키나제 유형 플라스미노겐 활성제 수용체 관련 단백질(uparap)을 표적으로 하는 인간화 항체를 포함하는 항체-약물 접합체
JP2023539369A (ja) 抗体－ナノ粒子複合体、ならびにその作製および使用方法
US20070179105A1 (en) Method and means for treating solid tumors