CN116249525A - 用于癌症疗法的含有多个可裂解前体药物的纳米颗粒 - Google Patents

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Abstract

描述了靶向低密度脂蛋白受体(LDLR)并且包含酸和/或酶可裂解的缩醛‑或氧基苄氧基‑连接的碳酸酯或氨基甲酸酯键的前体药物。还描述了核‑壳纳米颗粒，包含金属有机框架核或纳米级金属二磷酸酯配位聚合物核，和含有前体药物的脂质涂层。纳米颗粒核可以任选地含有一种或多种亲水性化疗剂。前体药物和纳米颗粒可以在治疗癌症的方法中使用。例如，目前所公开的纳米颗粒可以在方法中用于多种化疗剂的共递送，从而与游离化疗剂的混合物的递送相比，提供了化疗剂对肿瘤的增加的积累。

Description

用于癌症疗法的含有多个可裂解前体药物的纳米颗粒
相关申请
当前所公开的主题要求2020年8月21日提交的美国临时专利申请序列号63/068,800的权益，其公开内容通过引证以其全部并入本文。
政府利益的声明
本发明是在美国国立卫生研究院提供的经费CA223184和CA216436的政府支持下进行的。政府对本发明具有一定权利。
技术领域
当前所公开的主题提供了包含通过可裂解碳酸酯或氨基甲酸酯接头结合至一价脂质部分的一价药物部分(drug moiety)的前体药物(prodrug，前药)(例如，化疗剂的前体药物)。前体药物可以靶向低密度脂蛋白受体(LDLR)。当前所公开的主题还提供了包含前体药物的纳米颗粒。纳米颗粒可以是核壳纳米颗粒，该核壳纳米颗粒包含，例如，(i)含有包含一价脂质部分和可裂解碳酸酯或氨基甲酸酯接头的前体药物的脂质涂层，和(ii)纳米级配位聚合物(NCP)纳米颗粒核，该纳米颗粒核本身可以任选地包含一种或多种化疗剂或其类似物或其前体药物。前体药物和纳米颗粒可以用于治疗癌症。在一些实施方式中，当前所公开的主题的基于纳米颗粒的组合物可以通过组合多种癌症中的多种治疗方式来提供增强的抗癌效果。
缩写
℃＝摄氏度
％＝百分比
μg＝微克
μl或μL＝微升
μM＝微摩尔
5-FU＝5-氟尿嘧啶
ApoB-100＝载脂蛋白B100
AS ODN＝反义寡核苷酸
AUC＝曲线下面积
Bcl-2＝B细胞淋巴瘤2
Ca＝钙
Chol＝胆固醇
CisPt＝顺铂
CPT＝喜树碱
dach＝反式-1,2-二氨基环己烷)
DCM＝二氯甲烷
DHA＝双氢青蒿素
DLS＝动态光散射
DOPA＝二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯
DOPC＝1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸钠盐
DSPE-PEG2k＝1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)2000]
DTX＝多西他赛
ET＝依托泊苷
EtOAc＝乙酸乙酯
EtOH＝乙醇
g＝克
GEM＝吉西他滨
GMP＝吉西他滨单磷酸酯
h＝小时
IC50＝半数抑制浓度
ICP-MS＝电感耦合等离子体质谱
IFN＝干扰素
IL＝白介素
i.v.＝静脉内
Ka＝结合常数
kg＝千克
LDL＝低密度脂蛋白
M＝摩尔
mCRC＝转移性结直肠癌
mg＝毫克
Mg＝镁
min＝分钟
miRNA＝微小RNA
mL＝毫升
mm＝毫米
mM＝毫摩尔
mmol＝毫摩尔
Mn＝锰
MOF＝金属有机框架
NCP＝纳米级配位聚合物
NIR＝近红外
nm＝纳米
NMR＝核磁共振
OA＝油酸
OxPt＝奥沙利铂
PBS＝磷酸盐缓冲盐水
PDI＝多分散性或多分散指数
PD-1＝程序性死亡1
PD-L1＝程序性死亡-配体1
PDT＝光动力学疗法
PEG＝聚乙二醇
P-gp＝P-糖蛋白
PPX＝鬼臼毒素
PS＝光敏剂
Pt＝铂
PTX＝紫杉醇
PVP＝聚乙烯吡咯烷酮
Q3D＝每三天一次
rpm＝转每分钟
SBU＝二级构造单元
siRNA＝小干扰RNA
SN38＝7-乙基-10-羟基喜树碱
THF＝四氢呋喃
TMS＝三甲基甲硅烷基
Zn＝锌
背景技术
三种主要的铂药物-顺铂、奥沙利铂和卡铂-是抑制DNA复制的烷化剂，其中所有肿瘤化疗方案中接近50％包括顺铂(CisPt)。基于铂的双联疗法常在临床上用于治疗卵巢癌、宫颈癌、肺癌和三阴性乳腺癌，并且已作为一线、二线或抢救疗法在多种癌症中进行了进一步研究。这些铂药物通常与拓扑异构酶抑制剂或有丝分裂抑制剂，如紫杉醇(PTX)组合施用。由于肿瘤中细胞的异质性：一些细胞可以是有丝分裂活性的，而其它细胞是衰老的，一些细胞可以耐受一种药物，但不耐受其它药物，因此组合疗法通常是有价值的。例如，奥沙利铂与5-氟尿嘧啶(5-FU)和伊立替康组合用于治疗具有良好身体状态的转移性胰腺癌患者。含有多种药物的其它化疗方案包括FOLFOX(亚叶酸、氟尿嘧啶和奥沙利铂)、FOLFIRI(亚叶酸、氟尿嘧啶和伊立替康)和IROX(伊立替康和奥沙利铂)。然而，这些治疗可以具有窄治疗窗，有时具有严重副作用。例如，30％用IROX方案治疗的转移性结直肠癌(mCRC)患者经历严重的中性粒细胞减少，而18％的患者具有严重的感觉紊乱(Stanculeanu et al.,Journal of Clinical Oncology 2006,24:13541-13541)。这些副作用可以分别归因于药物向骨髓和周围神经的非选择性分布。
纳米颗粒可以通过控制物理性质，如表面电荷，来提供用于化疗递送的平台，从而改善药代动力学行为并改变毒性谱。疏水性分子PTX最初用聚氧乙烯蓖麻油(CremophorEL)/乙醇配制以将药物溶解在水溶液中。然而，聚氧乙烯蓖麻油制剂可以导致“严重过敏性样超敏反应、高脂血症、异常脂蛋白谱、红细胞聚集和周围神经病”。2005年，美国批准了无溶剂白蛋白结合的紫杉醇(白蛋白结合型紫杉醇)纳米颗粒并且改变了对中性粒细胞减少的主要毒性，中性粒细胞减少的严重性与在血流中循环的游离药物的峰值和持续水平相关。然而，目前尚无FDA批准的用于组合疗法的在单一纳米颗粒中递送具有不同物理化学性质的多种化疗剂的方法。
因此，仍需要递送化疗剂的其它组合物和方法，特别是对于具有不同作用机制和/或物理化学性质的试剂的组合。还仍需要提供治疗癌症的其它组合物和方法，该组合物和方法在一种或多种活性试剂的低剂量下提供了改善的抗癌活性和/或降低的副作用水平。
发明内容
本发明内容列出了当前所公开的主题的一些实施方式，并且列出了这些实施方式在多种情况下的变化和排列。本发明内容仅是多种且不同的实施方式的示例。对给定实施方式的一个或多个代表性特征的提及同样是示例性的。这种实施方式通常可以在具有或不具有所提及的特征的情况下存在；同样地，那些特征可以应用于当前所公开的主题的其它实施方式，无论是否在本发明内容中列出。为了避免过度重复，本发明内容未列出或表明这些特征的所有可能组合。
在一些实施方式中，当前所公开的主题提供了包含式D-BL-L的结构的前体药物，其中D是一价药物部分，任选地其中D是抗癌药物化合物的一价衍生物，进一步任选地，其中D是选自包含以下的组的药物化合物的一价衍生物：依托泊苷(ET)、鬼臼毒素(PPX)、紫杉醇(PTX)、多西他赛(DTX)、双氢青蒿素(DHA)、喜树碱(CPT)、7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)、拓扑替康、多柔比星、表柔比星、伊达比星、长春新碱、米托蒽醌、青蒿琥酯、卡培他滨、奥曲肽、亮丙瑞林和戈舍瑞林；L是一价脂质部分；且BL是二价接头，其中D通过碳酸酯或氨基甲酸酯基直接连接至BL，并且其中BL包含缩醛基和取代的氧基苄氧基中的至少一种，其中缩醛基具有以下式之一的结构：
Figure BDA0004189627750000061
其中：n是0至4之间的整数，任选地，其中n是0；R1和R2独立地选自包含以下的组：H、烷基、取代的烷基、芳烷基、取代的芳烷基、芳基和取代的芳基，每个R3独立地选自包含以下的组：烷基、芳烷基、芳基、卤素、烷氧基、芳氧基、羟基、酰基、羧酸酯、磷酸酯、硝基、-N3、B(OH)2和氰基；并且其中缩醛基的氧原子直接连接至碳酸酯或氨基甲酸酯基的碳原子；并且其中取代的氧基苄氧基具有以下学式的结构：
Figure BDA0004189627750000062
其中R'选自包含硝基、N3和-B(OH)2的组，并且其中连接至氧基苄氧基的苄基碳的氧原子直接连接至碳酸酯或氨基甲酸酯基的碳原子。
在一些实施方式中，L是胆固醇、油酸、溶血脂质(lyso-lipid)或磷酸胆碱的一价衍生物。在一些实施方式中，前体药物包含以下式之一的结构：
Figure BDA0004189627750000063
Figure BDA0004189627750000071
在一些实施方式中，BL包含具有以下式的结构的缩醛基：
Figure BDA0004189627750000072
其中R1和R2独立地选自包含以下的组：H、烷基、取代的烷基、芳烷基、取代的芳烷基、芳基和取代的芳基；任选地，其中R1和R2独立地选自包含H、甲基和苯基的组；进一步任选地，其中R1和R2两者均为H。
在一些实施方式中，L是油酸部分(oleic acid moiety)，并且L和BL一起具有以下结构：
Figure BDA0004189627750000081
在一些实施方式中，L是胆固醇衍生物，并且L和BL一起具有以下结构：
Figure BDA0004189627750000082
在一些实施方式中，前体药物选自包含以下的组：
Figure BDA0004189627750000083
Figure BDA0004189627750000091
Figure BDA0004189627750000101
在一些实施方式中，前体药物结合至低密度脂蛋白(LDL)并且通过LDL受体介导的内吞被主动运输至肿瘤，任选地，其中前体药物对LDL的结合常数Ka是前体药物对白蛋白的Ka的至少约1000倍，进一步任选地，其中前体药物对LDL的Ka是前体药物对白蛋白的Ka的至少约2000倍。
在一些实施方式中，当前所公开的主题提供了包含以下的纳米颗粒：(a)包含金属有机基体材料的核，任选地，其中金属有机基体材料包含配位聚合物；和(b)覆盖至少部分核表面的涂层，其中所述涂层包含脂质层或脂质双层(lipid bilayer)，并且其中所述涂层包含含有式D-BL-L的结构的一种或多种前体药物。在一些实施方式中，金属有机基体材料包含含有金属二磷酸酯(bisphosphate，二磷酸盐，二磷酸)的纳米级配位聚合物，该金属二磷酸酯包含多价金属离子和二磷酸酯，任选地，其中多价金属离子选自由以下组成的组：Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+及它们的组合。在一些实施方式中，二磷酸酯包含抗癌剂的前体药物，任选地，其中二磷酸酯包含顺铂、卡铂或奥沙利铂前体药物，进一步任选地，其中二磷酸酯是顺式,顺式-反式-[Pt(NH3)2Cl2(OH)2]的二磷酸酯或者顺式,反式-[Pt(dach)(草酸根)(OH)2](cis,trans-[Pt(dach)(oxalate)(OH)2)的二磷酸酯。
在一些实施方式中，核包含包埋的抗癌剂，任选地包埋的亲水性抗癌剂，进一步任选地，其中包埋的抗癌剂是吉西他滨单磷酸酯(gemcitabine monophosphate，吉西他滨单磷酸盐)(GMP)。在一些实施方式中，核包含至少两种抗癌剂，任选地，其中至少两种抗癌剂包含第一抗癌剂，其中第一抗癌剂为顺铂、卡铂或奥沙利铂前体药物，进一步任选地为顺铂、卡铂或奥沙利铂的二磷酸酯；和第二抗癌剂，其中第二抗癌剂是包埋的亲水性抗癌剂。
在一些实施方式中，纳米颗粒核包含含有多价金属离子(任选地为Zn2+)和二磷酸酯的金属二磷酸酯配位聚合物，其中所述二磷酸酯是具有结构Pt(dach)(草酸根)(双磷酰胺酸)(Pt(dach)(oxalate)(bisphosphoramidic acid))的奥沙利铂前体药物；并且其中涂层是包含具有以下结构的前体药物的脂质双层：
Figure BDA0004189627750000111
在一些实施方式中，纳米颗粒核还包含包埋在纳米颗粒核中的GMP。
在一些实施方式中，涂层包含含有阳离子脂质和/或官能化脂质的脂质双层，其中所述官能化脂质是用可以键合至核酸的基团官能化的脂质，并且其中至少一种核酸共价键合至官能化脂质或者通过静电相互作用连接至阳离子脂质，任选地，其中所述脂质双层包含含有硫醇-或二硫醇-官能化的1,2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，1,2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺)(DSPE)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)(DOPC)中的一种或多种的混合物。在一些实施方式中，至少一种核酸选自包含siRNA、miRNA和AS ODN的组，任选地，其中siRNA选自包含以下的组：存活素siRNA、ERCC-1siRNA、P-糖蛋白siRNA(P-gp siRNA)、Bcl-2siRNA及它们的混合物。
在一些实施方式中，纳米颗粒还包含一种或多种钝化剂，任选地为亲水聚合物；靶向剂，任选地为RGD肽；和免疫治疗剂(immunotherapy agent)。在一些实施方式中，纳米颗粒的直径在约20纳米至约140纳米的范围内。在一些实施方式中，纳米颗粒吸附血浆蛋白，任选地为用于通过LDL受体介导的内吞向肿瘤的主动运输的载脂蛋白B-100。
在一些实施方式中，当前所公开的主题提供了药物制剂，其包含(i)药学上可接受的载体和(ii)包含式D-BL-L的结构的前体药物，或包含(a)核和(b)覆盖至少部分核表面的涂层的纳米颗粒，所述核包含金属有机基体材料，任选地其中金属有机基体材料包含配位聚合物，其中所述涂层包含脂质层或脂质双层，并且其中所述涂层包含含有式D-BL-L的结构的一种或多种前体药物。
在一些实施方式中，当前所公开的主题提供了治疗对其有需要的受试者中癌症的方法，其中方法包括向受试者施用包含式D-BL-L的结构的前体药物；包含(a)核和(b)覆盖至少部分核表面的涂层的纳米颗粒，所述核包含金属有机基体材料，任选地其中所述金属有机基体材料包含配位聚合物，其中所述涂层包含脂质层或脂质双层，并且其中所述涂层包含含有化学式D-BL-L的结构的一种或多种前体药物；或它们的药物制剂。
在一些实施方式中，方法包括向受试者施用选自包含以下的组的另外的癌症治疗：手术、放射疗法、化疗、毒素疗法、免疫疗法、冷冻疗法和基因疗法；任选地其中所述另外的癌症治疗是免疫疗法。在一些实施方式中，免疫疗法包括向受试者施用免疫治疗剂；任选地其中所述免疫治疗剂选自包含以下的组：抗-CD52抗体、抗-CD20抗体、抗-CD47抗体、抗-GD2抗体、细胞因子、多糖K、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、IDO抑制剂、CCR7抑制剂、OX40抑制剂、TIM3抑制剂和LAG3抑制剂。
在一些实施方式中，癌症选自包含以下的组：头部肿瘤、颈部肿瘤、乳腺癌、妇科肿瘤、脑肿瘤、结直肠癌、肺癌、间皮瘤、软组织肉瘤、皮肤癌、结缔组织癌、脂肪癌、肺癌、胃癌、肛门生殖器癌、肾癌、膀胱癌、结肠癌、前列腺癌、中枢神经系统癌、视网膜癌、血癌、成神经细胞瘤、多发性骨髓瘤、淋巴癌和胰腺癌。在一些实施方式中，所述癌症是转移性癌，可选地为转移性结直肠癌。
在一些实施方式中，方法包括向受试者施用纳米颗粒，其中纳米颗粒核包含金属二磷酸酯配位聚合物，所述金属二磷酸酯配位聚合物包含多价金属离子和二磷酸酯，所述多价金属离子任选地选自Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+及它们的组合，其中所述二磷酸酯是顺铂、奥沙利铂或卡铂的二磷酸酯；并且其中涂层包含脂质双层，所述脂质双层包含具有结构D-BL-L的前体药物，其中D是抗癌药物化合物的一价药物部分，任选地其中所述一价药物部分是选自包含以下的组的药物化合物的一价衍生物：ET、PPX、PTX、DTX、DHA、CPT、SN38、拓扑替康、多柔比星、表柔比星、伊柔比星、长春新碱、米托蒽醌、青蒿琥酯、卡培他滨、奥曲肽、亮丙瑞林和戈舍瑞林；L是一价脂质部分，任选地为一价胆固醇部分；并且BL是二价接头部分，其中D通过碳酸酯或氨基甲酸酯键连接至BL，并且其中BL包含缩醛基，其中所述缩醛基具有以下式的结构：
Figure BDA0004189627750000131
其中R1和R2独立地选自包含以下的组：H、烷基、取代的烷基、芳烷基、取代的芳烷基、芳基和取代的芳基；并且其中至少一个缩醛基中的氧原子直接键合至碳酸酯或氨基甲酸酯基的碳原子。在一些实施方式中，纳米颗粒核还包含包埋其中的亲水性抗癌剂，任选地其中所述亲水性抗癌剂为GMP。在一些实施方式中，前体药物具有以下式的结构：
Figure BDA0004189627750000132
任选地，其中二磷酸酯为Pt(dach)(草酸根)(双磷酰胺酸)。
在一些实施方式中，方法还包括向受试者施用免疫治疗剂。在一些实施方式中，相比于施用相等量的至少一种抗癌剂，其中至少一种抗癌剂不与纳米颗粒和/或前体药物结合(associate，缔合)，施用所述纳米颗粒提供了至少一种抗癌剂的肿瘤曲线下面积(AUC)的至少2倍增加，任选地大于4倍增加。
因此，当前所公开的主题的目标在于提供包含含有连接至碳酸酯或氨基甲酸酯的缩醛或氧基苄氧基的接头的前体药物、包含前体药物的纳米颗粒以及前体药物和纳米颗粒的制剂，以及使用前体药物、纳米颗粒和制剂治疗癌症的方法。
在上文中已描述了当前所公开的主题的目标，并且通过当前所公开的主题全部或部分实现了该目标，并且如下文中进行的描述，其它目标将变得显而易见。
附图说明
图1是显示当前所公开的主题的示例性脂质前体药物，即在本文中称为“Chol-SN38”的前体药物的合成路线的合成示意图，其包含基于胆固醇的一价脂质部分和基于还包含三甲基甲硅烷基(TMS)醚的7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)的一价药物部分。
图2是当前所公开的主题的示例性核壳纳米颗粒(在本文中称为“OxPt/SN38”)的两步构建的示意图。纳米颗粒(NP)核包含通过锌离子(Zn2+)和奥沙利铂的双磷酰胺酸衍生物(即OxPt-bp)的共聚所制备的金属-二磷酸酯配位聚合物。除胆固醇、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸钠盐(DOPC)和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)2000](DSPE-PEG2000)之外，NP涂层包含图1中所描述的7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)的脂质前体药物，即Chol-SN38。
图3A-3C是包含锌/奥沙利铂二磷酸酯配位聚合物核但无脂质双层涂层的纳米颗粒，即“裸OxPt”的显微镜图像以及与其表征相关的一对图。图3A是裸OxPt纳米颗粒的透射电子显微镜(TEM)图像。左下角中的比例尺代表50纳米(nm)。图3B是显示通过动态光散射(DLS)所测量的裸OxPt纳米颗粒的数均直径的图。测量的直径以纳米(nm)计。图3C是显示裸OxPt纳米颗粒在四氢呋喃(THF)中在室温下随时间的稳定性的图。实线显示了纳米颗粒的数均纳米颗粒直径(以nm计)相对于时间(以小时计)的数据，而虚线显示了相对于时间的多分散性(PDI)。
图4A-4C是包含锌/奥沙利铂二磷酸酯配位聚合物核且具有包含图1中所描述的7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)的脂质前体药物的脂质双层涂层的纳米颗粒，即OxPt/SN38纳米颗粒的显微镜图以及与其表征相关的一对图。图4A是OxPt/SN38纳米颗粒的透射电子显微镜(TEM)图像。左下角中的比例尺代表100纳米。图4B是显示通过动态光散射(DLS)所测量的OxPt/SN38纳米颗粒的数均直径的图。测量的直径以纳米(nm)计。图4C是显示OxPt/SN38纳米颗粒在37℃下在具有5毫克每毫升(mg/mL)的牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的稳定性的图。实线显示了纳米颗粒的数均纳米颗粒直径(以nm计)相对于时间(以小时计)的数据，而虚线显示了相对于时间的多分散性(PDI)。
图5A-5C是显示包含核和脂质层的纳米颗粒(即OxPt/SN38)将Chol-SN38输送至低密度脂蛋白(LDL)的一系列图，所述核包含奥沙利铂(OxPt)前体药物(即奥沙利铂二磷酸酯)，所述脂质层包含7-乙基-10-羟基喜树碱的胆固醇前体药物(Chol-SN38)。图5A是显示来自分子动力学(MD)模拟的将游离药物(即7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38，实线))和前体药物(Chol-SN38，虚线)从整体水中输送至LDL切片的脂质核的平均力势(PMF)(所测量的以千焦每摩尔(kJ·mol-1)计)的图。将这些图叠加到平衡的LDL切片的快照上。图5B是显示在大鼠血浆中SN38(虚线)或Chol-SN38(实线)对LDL的时间依赖性结合(所测量的以百分比(％)计)以及来自OxPt/SN38的chol-SN38向LDL的时间依赖性输送的图。图5C是在以14.4毫克每千克(mg/kg)的Chol-SN38剂量静脉内注射OxPt/SN38之后，大鼠血浆中来自OxPt/SN38的Chol-SN38的药代动力学谱及其脂蛋白分布(白蛋白(白色)、高密度脂蛋白(HDL，浅灰色)、LDL(深灰色)或者极低密度脂蛋白(VLDL，黑色))。在0.5、1、3、5、8和24小时处，测量Chol-SN38，以微克每毫升(μg/mL)计。
图6是显示载脂蛋白B-100(ApoB-100)与焦磷酸锌纳米级配位聚合物(ZnP NCP)的浓度依赖性结合的图。显示了ZnP NCP(实线)和无胆固醇的ZnP NCP(虚线)的数据，n＝3。在x轴上显示了以毫克(mg)计测量的ZnP NCP浓度。
图7A-7C是显示纳米颗粒通过低密度脂蛋白受体(LDLR)的吸收的图。图7A是显示包含含有胆固醇-卟啉脂质(cholesterol-pyrolipid)缀合物(Chol-pyro NCP)或荧光标记的低密度脂蛋白(Dil-LDL)的脂质涂层的纳米级配位聚合物颗粒的吸收的图，并且图7B是显示在用1或10微克每毫升(μg/ml)抗-LDLR抗体(a-LDLR)的LDLR阻断后，通过小鼠结肠腺癌(MC38)细胞对包含含有二氢卟酚e6(Ce6-NCP)或Dil-LDL的核的纳米级配位聚合物颗粒的吸收的图。图7C是显示Chol-pyro NCP和Ce6-NCP在野生型(WT)和LDLR敲除(KO)的MC38细胞上的细胞吸收的图。通过相对平均荧光强度(MFI)测量来测量细胞吸收，并且以与对照相比的百分比的形式报告。
图8A和图8B是一对图，其中图8A是显示在用10微克每毫升(μg/ml)非特异性免疫球蛋白G(IgG)或抗低密度脂蛋白受体抗体(a-LDLR)处理后24小时，通过小鼠结肠腺癌(MC38)细胞对来自包含含有缀合物(Chol-pyro NCP)的脂质层的纳米级配位聚合物(NCP)的卟啉脂质(Chol-pyro)的胆固醇缀合物的吸收的共聚焦激光扫描显微术(CLSM)统计分析的图，而图8B是在用1微克(μg)IgG或a-LDLR静脉内(i.v.)注射后24小时(h)和48h的Chol-pyro NCP的肿瘤吸收的平均荧光强度(MFI)的图。
图9A和图9B是显示在瘤内注射或未注射1微克(μg)抗低密度脂蛋白受体抗体(a-LDLR)的具有小鼠结肠腺癌(MC38)的小鼠中，在用游离奥沙利铂(OxPt，3.5毫克每千克(mg/kg))加伊立替康(6.2mg SN38/kg当量)或者用包含含有奥沙利铂(OxPt)前体药物的核和含有SN38(OxPt/SN38；3.5mg OxPt/kg当量，6.2mg SN38/kg当量)的脂质前体药物的脂质层的纳米颗粒静脉内(i.v.)注射后，铂(Pt)(图9A)和7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)(图9B)的时间依赖性积累(以微摩尔(μM)浓度形式表示)的图。
图10A-10C。图10A是显示了通过游离奥沙利铂(OxPt)加伊立替康或者通过包含含有OxPt前体药物的核和含有7-羟基-10-乙基喜树碱(Sn38)的脂质前体药物的脂质涂层的纳米颗粒(即OxPt/SN38)诱导的细胞凋亡的一系列图。在处理后，细胞通过Alexa Fluor488-标记的膜联蛋白V和碘化丙啶(PI)染色并通过流式细胞术分析。图10B是显示通过OxPt/SN38引起的细胞周期阻滞的图。处理的细胞用70％乙醇固定过夜，用RNase A处理，通过PI染色并通过流式细胞术分析，n＝3。图10C是显示用游离OxPt加伊立替康或者用OxPt/SN38处理的MC38细胞的线粒体膜电位的JC-1染色的流式细胞术分析(以平均荧光强度(MFI)形式表示)的图，n＝3。
图11A和图11B是显示在37摄氏度(℃)下，在整个72小时内，在pH＝4.7的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(图11A)和具有10单位/毫升(mL)酯酶的pH＝7.4的PBS(图11B)中，来自包含含有奥沙利铂前体药物的核和含有前体药物(OxPt/SN38)的脂质涂层的纳米颗粒的胆固醇-7-乙基-10-羟基喜树碱前体药物(Chol-SN38)和释放的产物(游离7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)、无三甲基甲硅烷基(TMS)醚的Chol-SN38(Chol-SN38(无TMS))或具有TMS醚的SN38(SN38-TMS))的百分比(％)的一对图。
图12A和图12B是显示当在37摄氏度(℃)下，在整个72小时内，在pH＝4.7(虚线)或者pH＝7.4(实线)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中培育时，来自包含含有奥沙利铂前体药物的核和含有基于SN38的脂质前体药物(OxPt/SN38)的脂质层的纳米颗粒的7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)(图12A)和铂(Pt)(图12B)的积累释放(所测量的以百分比(％)计)的图。
图13是所提出的7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)通过酸催化的水解和酯酶介导的裂解从当前所公开的主题的前体药物中的释放机制的示意图。
图14A和图14B是(图14A)显示来自通过水解锌和OxPt二磷酸酯前体药物的纳米级配位聚合物(NCP)以提供奥沙利铂二氨基甲酸酯(OxPt-bc)，随后通过抗坏血酸(ascorbate，抗坏血酸盐)还原的奥沙利铂(OxPt)的释放的示意图；和(图14B)显示当在37摄氏度(℃)下，在具有pH＝4.7和5毫摩尔(mM)抗坏血酸的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中培育时，来自包含含有对于图14A所述的NCP的核和含有7-乙基-10-羟基喜树碱的脂质前体药物(OxPt/SN38)的脂质层的纳米颗粒的总铂(Pt)OxPt和OxPt-bc的释放谱的图。
图15A和图15B是显示以2毫克每千克(mg/kg)剂量施用包含奥沙利铂(OxPt)前体药物核和含有Chol-SN38的涂层的纳米颗粒的小鼠中，(图15A)随时间(以小时计)的总血浆铂(Pt)浓度(所测量的以微克每毫升(μg/ml)计)；和(图15B)随时间(以小时计)的7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38，虚线)、20-O-三甲基甲硅烷基-SN38(SN38-TMS，虚线)和SN38的胆固醇前体药物(Chol-SN38，实线)的血浆浓度(所测量的以μg/ml计)的一对图。
图16A和图16B是显示在以相当于3毫克每千克(mg/kg)体重的OxPt的纳米颗粒的剂量下，静脉内(i.v.)注射包含含有奥沙利铂(OxPt)前体药物的核和含有SN38的脂质前体药物的脂质涂层的纳米颗粒的具有结直肠癌(CT26)肿瘤的小鼠中随时间(所测量的以小时(h)计)的肿瘤(图16A)和血浆(图16B)的7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)浓度(所测量的以微克每毫升(μg/ml)计)的一对图。
图17是在包含含有奥沙利铂(OxPt)前体药物的核和含有7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)的脂质前体药物的脂质涂层的纳米颗粒的重复剂量之后，Balb/c小鼠体重(所测量的以与剂量施用第一天的体重的百分比(％)计)的图。以每三天一次(Q3D)的时间表并且以相当于3毫克每千克(mg/kg)体重的OxPt的纳米颗粒的剂量向小鼠剂量施用。
图18是显示在以每三天一次(Q3D)的时间表剂量施用多次治疗后，在具有肿瘤的小鼠中小鼠腺癌(MC38)肿瘤的肿瘤生长抑制的图。治疗包括：作为对照的磷酸盐缓冲盐水(PBS，正方形)、游离奥沙利铂(OxPt)和伊立替康的混合物(OxPt+伊立替康，三角形，尖头向上)、具有包含OxPt前体药物的核的纳米颗粒(OxPt NCP，三角形，尖头向下)、具有焦磷酸锌(ZnP)配位聚合物核和含有7-乙基-10-羟基喜树碱的脂质前体药物的涂层的纳米颗粒(ZnP/SN38，菱形)、具有包含OxPt前体药物的核和包含7-乙基-10-羟基喜树碱的脂质前体药物的涂层的纳米颗粒(OxPt/SN38，三角形，尖头向左)或者OxPt/SN38和抗程序性死亡配体1抗体(OxPt/SN38+α-PD-L1，三角形，尖头向右)。以3毫克每千克(mg/kg)体重的OxPt等价剂量每三天施用一次治疗。在治疗第0-18天(从第一次注射当天的第0天开始)测量肿瘤尺寸(以立方毫米(mm3)计)。
图19是显示以每三天一次(Q3D，三角形，尖头向上)或者每周一次/每七天一次(Q7D，三角形，尖头向下)的时间表，在包含含有奥沙利铂(OxPt)前体药物的核和含有7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)的脂质前体药物的脂质涂层的纳米颗粒的重复剂量后，具有肿瘤的小鼠中小鼠腺癌(MC38)肿瘤的肿瘤生长抑制/消退的图。Q3D时间表的每个剂量是3毫克每千克(mg/kg)体重的OxPt等价剂量，而Q7D时间表的每个剂量是以6mg/kg体重的OxPt等价剂量。将磷酸盐缓冲盐水(PBS，正方形)用作对照。在治疗第0-29天(从第一次注射当天的第0天开始)测量肿瘤尺寸(以立方毫米(mm3)计)。
图20A和图20B是显示以每三天一次(Q3D，三角形，尖头向上)或者每周一次/每七天一次(Q7D，三角形，尖头向下)的时间表，在包含含有奥沙利铂(OxPt)前体药物的核和含有7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)的脂质前体药物的脂质涂层的纳米颗粒的重复剂量后，在具有肿瘤的小鼠中，小鼠结直肠癌(CT26)肿瘤(图20A)和人结直肠腺癌(HT29)肿瘤(图20B)的肿瘤生长抑制/消退的一对图。Q3D时间表的每个剂量是以3毫克每千克(mg/kg)体重的OxPt等价剂量，而Q7D时间表的每个剂量是以6mg/kg体重的OxPt等价剂量。将磷酸盐缓冲盐水(PBS，正方形)用作对照。在治疗第0-20天或第0-21天(从第一次注射当天的第0天开始)测量肿瘤尺寸(以立方毫米(mm3)计)。
图21是显示在每三天一次(Q3D)的三次剂量的游离奥沙利铂(OxPt；3.5毫克每千克(mg/kg))加伊立替康(11.7mg/kg 7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)当量)或者Q3D的八次剂量的包含含有OxPt前体药物的核和含有SN38的脂质前体药物的脂质层的纳米颗粒(OxPt/SN38；3.5mg/kg OxPt当量和6.2mg/kg SN38当量)之后，具有小鼠结肠腺癌(MC38)肿瘤的C57BL/6小鼠的绝对中性粒细胞计数(所测量的以千个细胞每微升(103个细胞/μL)计)的图。为了比较，还提供了用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的对照组的中性粒细胞计数。
图22A和图22B是显示在使用磷酸盐缓冲盐水(PBS，正方形)、包含含有奥沙利铂(OxPt)前体药物的核和含有7-乙基-10-羟基喜树碱的脂质前体药物的脂质涂层的纳米颗粒(OxPt/SN38，三角形，尖头向下)，或者游离OxPt加伊立替康(三角形，尖头向上)的每三天一次(Q3D)处理，达到16个剂量后，在裸鼠上的人结直肠腺癌(HT29)模型中的肿瘤生长曲线(图22A)和存活曲线(图22B)的图。测量肿瘤尺寸(以立方厘米(cm3)计)，并且存活率以百分比(％)形式表示。
图23A和图23B是显示在使用磷酸盐缓冲盐水(PBS，正方形)、包含含有奥沙利铂(OxPt)前体药物的核和含有7-乙基-10-羟基喜树碱的脂质前体药物的脂质涂层的纳米颗粒(OxPt/SN38，三角形，尖头向下)，或者游离OxPt加伊立替康(三角形，尖头向上)的每三天一次(Q3D)处理，达到16个剂量后，在裸鼠上的人结直肠腺癌(HCT116)(图23A)和SW480(图23B)模型的肿瘤生长曲线的图。测量肿瘤尺寸(以立方厘米(cm3)计)。
图24A和图24B是显示以下的图：(图24A)通过以3.5毫克(mg)OxPt/千克(kg)当量的剂量(n＝6)在具有小鼠结直肠腺癌(MC38)肿瘤的C57BL/6小鼠上，与瘤内注射的1微克(μg)非特异性免疫球蛋白G(IgG，三角形，尖头向左)或抗-低密度脂蛋白受体抗体(抗-LDLR，三角形，尖头向下)一起，包含含有奥沙利铂(OxPt)前体药物的核和含有7-乙基-10-羟基喜树碱的脂质前体药物的脂质涂层的纳米颗粒(OxPt/SN38)的抗癌效力；和(图24B)在第22天时切下的MC38肿瘤的肿瘤重量(以克(g)计)，n＝6。在图24A中，以正方形显示用磷酸盐缓冲盐水(PBS)和IgG处理的小鼠的数据，并且用尖头向上的三角形显示用PBS和抗-LDLR处理的小鼠的数据，同时测量肿瘤尺寸(以立方厘米(cm3)计)。
图25是显示以3.5毫克(mg)OxPt每千克(kg)当量的剂量，在野生型(WT)和具有低密度脂蛋白受体(LDLR)敲除(KO)的具有小鼠腺癌(MC38)肿瘤的C57BL/6小鼠上，包含含有奥沙利铂(OxPt)前体药物的核和含有7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)的脂质前体药物的脂质涂层的纳米颗粒(即OxPt/SN38)的抗癌效力的图。n＝6。该图显示了在第一次注射之后相对于天数的肿瘤尺寸(以立方厘米(cm3)计)。显示了用PBS(LDLR KO PBS，正方形)或者用纳米颗粒(LDLR KO OxPt/SN38，三角形，尖头向上)处理的LDLR KO小鼠、用PBS(三角形，尖头向下)处理的WT小鼠和用纳米颗粒(WT OxPt/SN38，三角形，尖头向左)处理的WT小鼠的数据。
图26是显示包含含有卡铂(Carbo)前体药物的核和含有鬼臼毒素(PPX)的胆固醇前体药物的脂质涂层的纳米颗粒的动态光散射(DLS)测量的结果的图。测量纳米颗粒直径(以纳米(nm)计)。
图27A和图27B是以每三天一次(Q3D)的时间表，在包含含有奥沙利铂(OxPt)前体药物和吉西他滨(GEM)的核和含有7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)的含二硫化物接头的脂质前体药物的脂质涂层的纳米颗粒，即OxPt/GEM/SN38(Boc)(尖头向左)或其它处理(即磷酸盐缓冲盐水(PBS，正方形)、相同纳米颗粒但无脂质前体药物(OxPt/GEM，三角形，尖头向上)和相同纳米颗粒但无GEM(OxPt/SN38(Boc)，三角形，尖头向下))的重复剂量之后，在具有肿瘤的小鼠中小鼠结直肠癌(CT26)肿瘤的肿瘤生长抑制(图27A)和小鼠体重(图27B)的一对图。图27A中测量的肿瘤尺寸以立方厘米(cm3)计，并且图27B中测量的体重以第0天(治疗第一天)的体重百分比(％)的形式表示。
图28A和图28B是显示以每三天一次(Q3D)的时间表，在用磷酸盐缓冲盐水(PBS，正方形)、当前所公开的主题的具有含奥沙利铂前体药物的核和7-乙基-10-羟基喜树碱的脂质前体药物的纳米颗粒(OxPt/SN38，三角形，尖头向上)或者还包含包埋在纳米颗粒核中的吉西他滨(GEM)的相同纳米颗粒(OxPt/GEM/SN38，三角形，尖头向下)处理后，具有KPC肿瘤的C57bl/6小鼠的体重(图28A)和肿瘤生长曲线(图28B)的一对图。KPC肿瘤是人胰腺导管腺癌模型。图28B中测量的肿瘤尺寸以立方厘米(cm3)计，并且图28A中测量的体重以第0天(治疗第一天)的体重百分比(％)的形式表示。
图29A和图29B是显示以5毫克每千克(mg/kg)的当量Carb剂量，每周一次，共计3个剂量，用磷酸盐缓冲盐水(PBS，圆形)，游离卡铂(Carb)加多西他赛(DTX)(三角形，尖头向下)、包含焦磷酸锌配位聚合物核以及含有DTX的脂质前体药物的脂质涂层的纳米颗粒(ZnP/DTX，正方形)或者包含含有卡铂前体药物的核和含有DTX脂质前体药物的脂质涂层的纳米颗粒(Carb/DTX，菱形)处理的具有小鼠乳腺癌(4T1)肿瘤的balb/c小鼠的体重(图29A)和肿瘤生长曲线(图29B)的一对图。图29B中测量的肿瘤体积以立方厘米(cm3)计，并且图29A中测量的体重以第0天(治疗第一天)的体重百分比(％)的形式表示。
图30A和图30B是显示以5毫克每千克(mg/kg)的当量卡铂剂量，每周一次，共计3个剂量，用磷酸盐缓冲盐水(PBS，圆形)或者包含含有卡铂前体药物的核和含有多西他赛脂质前体药物的脂质涂层的纳米颗粒(Carb/DTX，菱形)处理的具有人非小细胞肺癌(H460)肿瘤的无胸腺裸鼠的体重(图30A)和肿瘤生长曲线(图30B)的一对图。图30B中测量的肿瘤体积以立方厘米(cm3)计，并且图30A中测量的体重以第0天(治疗第一天)的体重百分比(％)的形式表示。
图31A和图31B是显示以2毫克OxPt每千克体重的剂量水平，向大鼠静脉内施用包含含有奥沙利铂(OxPt)的核和含有Chol-SN38(无TMS)的脂质涂层的纳米颗粒后，不具有三甲基甲硅烷基(TMS)醚基的7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)的胆固醇前体药物(Chol-SN38(无TMS))(图31A)和SN38(图31B)随时间(以小时计)的血浆浓度的一对图。测量的血浆浓度以微克每毫升(μg/ml)计。
图32A和图32B是显示以每三天一次(Q3D)的时间表，共计16个剂量(n＝6)，在多种处理(磷酸盐缓冲盐水(PBS，正方形)、游离奥沙利铂(OxPt)和伊立替康的混合物(三角形，尖头向上)或者包含含有OxPt前体药物的核和含有不具有三甲基甲硅烷基(TMS)基团的7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)的胆固醇前体药物的脂质涂层的纳米颗粒(OxPt/SN38(无TMS，三角形，尖头向下))后，具有人结直肠腺癌(HT29)肿瘤的裸鼠的体重(图32A)和肿瘤生长曲线(图32B)的一对图。图32B中测量的肿瘤尺寸以立方厘米(cm3)计，并且图32A中测量的体重以第0天(治疗第一天)的体重百分比(％)的形式表示。
图33是显示当前所公开的主题的一些示例性胆固醇(Chol)前体药物的化学结构的示意图。
图34是显示当前所公开的主题的一些其它示例性胆固醇(Chol)前体药物的化学结构的示意图。
图35A是显示当前所公开的主题的一些示例性前体药物的一般化学结构的示意图，其中示例性前体药物具有多种二价接头结构。
图35B是显示(i)可以用作图35A中的示例性前体药物中的“Chol”的一价胆固醇部分和(ii)可以用作图35A中的示例性前体药物中的“药物”的一价药物部分的化学结构的示意图。
具体实施方式
现将更全面地描述当前所公开的主题。然而，当前所公开的主题可以以不同形式体现，并且不应视为受限于下文和所附实施例中所述的实施方式。然而，提供这些实施方式，从而对于本领域技术人员来说，本公开将是详尽且完整的，并且将全面表达实施方式的范围。
本文所列的所有参考文献，包括但不限于所有专利、专利申请及其公开，以及科学期刊文章，以它们补充、解释、提供本文所使用的方法、技术和/或组合物的背景，或者教导本文所使用的方法、技术和/或组合物的程度，以其全部内容通过引用并入本文。
I.定义
尽管据信本领域的技术人员之一很好地理解了以下术语，但是描述以下定义以便于解释当前所公开的主题。
按照长期存在的专利法惯例，当在本申请，包括权利要求中使用时，术语“一个”和“一种”“该”表示“一个或多个”。因此，例如，对“金属离子”的提及包括多种这些金属离子等。
除非另外说明，否则在本说明书和权利要求中所使用的表示尺寸、反应条件等的量的所有数值将被理解为在一切情况下被术语“约”修饰。因此，除非有相反的说明，否则在本说明书和所附权利要求中所述的数值参数是可以基于通当前所公开的主题所设法获得的所需的性质而不同的近似值。
如本文所使用的，当提及尺寸(即直径)、重量、浓度或百分比的数值或者量时，术语“约”是指与所指定的量，涵盖在一个实例中±20％或±10％的变化，在另一个实例中±5％的变化，在另一个实例中±1％的变化，并且在另一个实例中±0.1％的变化，像这样的变化对于实施所公开的方法是适合的。
本文通过端点所列举的数值范围包括归入该范围内的所有数值和部分(例如，1至5包括但不限于1、1.5、2、2.75、3、3.90、4和5)。
如本文所使用的，当在实体的列举的上下文中使用时，术语“和/或”是指单独或组合存在的实体。因此，例如，短语“A、B、C和/或D”包括单独的A、B、C和D，而且包括A、B、C和D的任何和所有组合和子组合。
作为“包括”、“含有”或“特征在于…”的同义词，术语“包含”是包含性或开端的，并且不排除其它、未列举的要素或方法步骤。“包含”是在权利要求语言中使用的专门术语，其表示所提及的要素存在，但是可以添加其它要素并且仍形成在权利要求范围内的构想或方法。
如本文所使用的，短语“由…组成”排除了在权利要求中未指明的任何元素、步骤或成分。当短语“由…组成”在权利要求的主体条款中出现，而不是紧跟在序言之后时，它仅限制该条款中所描述的要素；其它元素并未排除在整个权利要求之外。
如本文所使用的，短语“基本由…组成”将权利要求的范围限制在所指明的材料或步骤，加上对所要求的主题的基本和新颖性特征不产生实质影响的那些材料或步骤。
对于术语“包含”、“由…组成”和“基本由…组成”，当在本文中使用这三个术语之一时，当前所公开的和所要求的主题可以包括另外两个术语中任何一个的使用。
如本文所使用的术语“烷基”可以表示C1-20(包括两端在内)直链(即“直链”)、支链或环状的饱和或至少部分饱和，并且在一些情况下，完全不饱和的(即烯基和炔基)的烃链，其包括，例如，甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、辛基、乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、辛烯基、丁二烯基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基和丙二烯基基团。“支链的”是指其中低级烷基，如甲基、乙基或丙基，连接至直链烷基链的烷基。“低级烷基”是指具有1至约8个碳原子(即C1-8烷基)，例如，1、2、3、4、5、6、7或8个碳原子的烷基。“高级烷基”是指具有约10至约20个碳原子，例如，10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳原子的烷基。在某些实施方式中，“烷基”具体地是指C1-8直链烷基。在其它实施方式中，“烷基”具体地是指C1-8支链烷基。
烷基可以任选地被一个或多个烷基取代基(可以是相同或不同的)取代(“取代的烷基”)。术语“烷基取代基”包括但不限于，烷基、取代的烷基、卤素、芳氨基、酰基、羟基、芳氧基、烷氧基、烷硫基、芳硫基、芳基烷氧基、芳基烷硫基、羧基、烷氧羰基、氧代(oxo，氧基)和环烷基。在一些实施方式中，沿烷基链可以任选地存在插入的一个或多个氧、硫或者取代的或未取代的氮原子，其中氮取代基是氢、低级烷基(在本文中也称为“烷基氨基烷基”)或芳基。
因此，如本文所使用的，术语“取代的烷基”包括烷基，如本文所定义的，其中烷基的一个或多个原子或官能团被另一种原子或官能团取代，包括，例如烷基、取代的烷基、卤素、芳基、取代的芳基、烷氧基、羟基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、硫酸酯和巯基。
本文中所用的术语“芳基”是指芳族取代基，其可以是单个芳香环或者是稠合在一起、共价连接或者连接至共同基团(例如但不限于，亚甲基或亚乙基部分)的多个芳香环。共同连接基团还可以是羰基(如苯甲酮中)或者氧(如联苯醚中)或者氮(如二苯胺中)。术语“芳基”具体地涵盖了杂环芳族化合物。芳香环可以包括苯基、萘基、联苯基、联苯醚、二苯胺和苯甲酮等。在具体的实施方式中，术语“芳基”是指环芳烃，其包含约5至约10个碳原子，例如，5、6、7、8、9或10个碳原子，并且包括5-和6-元烃和杂环芳环。
芳基可以任选地被一个或多个芳基取代基(可以是相同或不同的)取代(“取代的芳基”)，其中“芳基取代基”包括烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、羟基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、羧基、酰基、卤素、硝基、烷氧羰基、芳氧羰基、芳烷氧基羰基、酰氧基、酰氨基、芳酰氨基、氨基甲酰基、烷基氨基甲酰基、二烷基氨基甲酰基、芳硫基、烷基硫基、亚烷基和-NR'R”、其中R'和R”可以各自独立地为氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基和芳烷基。
因此，如本文所使用的，术语“取代的芳基”包括芳基，如本文所定义的，其中芳基的一个或多个原子或官能团被另一种原子或官能团取代，包括，例如烷基、取代的烷基、卤素、芳基、取代的芳基、烷氧基、羟基、硝基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、硫酸酯和巯基。
芳基的具体实例包括但不限于，环戊二烯基、苯基、呋喃、噻吩、吡咯、吡喃、吡啶、咪唑、苯并咪唑、异噻唑、异噁唑、吡唑、吡嗪、三嗪、嘧啶、喹啉、异喹啉、吲哚、咔唑等。
如本文所使用的，“杂芳基”是指在环状结构的骨架中含有一个或多个非碳原子(例如，O、N、S、Se等)的芳基。含氮杂芳基部分包括但不限于，吡啶、咪唑、苯并咪唑、吡唑、吡嗪、三嗪、嘧啶等。
“芳烷基”是指烷基芳基基团，任选地，其中烷基和/或芳基部分是取代的。示例性芳烷基为苄基，即-CH2C6H5。
“亚烷基”是指具有1至约20个碳原子，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳原子的直链或支链二价脂肪烃基。亚烷基可以是直链，支链或环状的。任选地，亚烷基还可以是不饱和的和/或被一个或多个“烷基取代基”取代。沿亚烷基可以任选地存在插入的一个或多个氧、硫，或者取代或未取代的氮原子(在本文中也称为“烷基氨基烷基”)，其中氮取代基是如前所述的烷基。示例性的亚烷基包括亚甲基(–CH2–)；亚乙基(–CH2-CH2–)；亚丙基(–(CH2)3–)；亚环己基(–C6H10–)；–CH＝CH—CH＝CH–；–CH＝CH–CH2–；–(CH2)q–N(R)–(CH2)r–，其中q和r中的每一个独立地为0至约20的整数，例如，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，并且R为氢或低级烷基；亚甲基二氧基(-O-CH2-O-)；和亚乙基二氧基(-O-(CH2)2-O-)。亚烷基可以具有约2至约3个碳原子并且还可以具有6-20个碳。
术语“亚芳基”是指二价芳香基团，例如，二价苯基或萘基。任选地，亚芳基可以被一个或多个芳基取代基取代和/或包括一个或多个杂原子。
术语“氨基”是指基团-N(R)2，其中每个R独立地为H、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基或取代的芳烷基。术语“氨基烷基”和“烷基氨基”可以指基团-N(R)2，其中每个R为H、烷基或取代的烷基，并且其中至少一个R为烷基或取代的烷基。“芳基胺”和“氨基芳基”是指基团-N(R)2，其中每个R为H、芳基或取代的芳基，并且其中至少一个R为芳基或取代的芳基，例如苯胺(即，-NHC6H5)。
术语“硫代烷基”可以指基团-SR，其中R选自H、烷基、取代的烷基、芳烷基、取代的芳烷基、芳基和取代的芳基。类似地，术语“硫代芳烷基”和“硫代芳基”是指-SR基团，其中R分别是芳烷基和芳基。
如本文所使用的，术语“卤素(halo)”、“卤素(halide，卤根)”或“卤素(halogen)”是指氟、氯、溴和碘基团。
术语“羟基(hydroxyl)”和“羟基(hydroxy)”是指-OH基团。
术语“巯基”或“硫醇”是指-SH基团。
术语“羧酸酯”和“羧酸”可以分别指基团-C(＝O)O-和-C(＝O)OH。术语“羧基”还可以指-C(＝O)OH基团。在一些实施方式中，“羧酸酯”或“羧基”可以指-C(＝O)O-或者-C(＝O)OH基团中的任一个。
术语“碳酸酯”是指-O-C(＝O)-O-基团。
术语“氨基甲酸酯”是指-NR-C(＝O)-O-基团，其中R可以是H、烷基、取代的烷基、芳烷基、取代的芳烷基、芳基或取代的芳基。
术语“氧基苄氧基”是指-O-CH2-C6H4-O-基团及其取代的衍生物，所述衍生物存在其中氢原子之一被烷基或芳基取代基取代。
术语“缩醛”是指包含-O-C(R)2-O-或由其组成的基团，其中每个R基团独立地为H或烷基取代基，例如，烷基或芳基。在一些实施方式中，R基团可以是亚烷基或亚芳基基团。
如本文所使用的，术语“磷酸酯”是指结构R-P(＝O)(OH)2的化合物或部分，其中R可以独立地为烷基、取代的烷基、芳烷基、取代的芳烷基、芳基或者取代的芳基。因此，磷酸酯是指其中碳原子连接至-P(＝O)(OH)2基团的磷原子的部分。在一些实施方式中，氢原子之一或两者是不存在的并且被负电荷取代。
术语“磷酸酯”是指包含结构-O-P(＝O)(OH)2或-NH-P(＝O)(OH)2的化合物或部分，即其中氧原子或氮原子连接至P(＝O)(OH)2基团的磷原子的化合物或部分。在一些实施方式中，磷酸酯包含结构RO-P(＝O)(OH)2或RNH-P(＝O)(OH)2，其中R是烷基、取代的烷基、芳烷基、取代的芳烷基、芳基或取代的芳基。在一些实施方式中，OH氢原子之一或两者是不存在的并且被负电荷取代。
术语“亲水的”可以指溶解或优先溶解于水和/或含水溶液中的化合物或化学物质或官能团。
术语“疏水的”是指不明显溶于水和/或含水溶液和/或优先溶于脂和/或非含水溶液的化合物、化学物质或官能团。
波浪线，例如以下结构中所示的波浪线：
Figure BDA0004189627750000261
在本文所描述的化学式中用于表示特定结构与另一个化学基团(例如，与药物化合物的一价衍生物或者与脂质的一价衍生物)的连接位点。
化学式中表示键的虚线表示该键可以是存在或不存在的。例如，化学结构：
Figure BDA0004189627750000271
是指其中一个或多个键可以存在或不存在连接至五元环和/或作为五元环的部分的基团。例如，六元环，任选地，可以存在或不存在1、2或3个双键，并且当存在时，其被n个取代基R3取代。当通过虚线表示的键均不存在时，该基团可以具有结构：
Figure BDA0004189627750000272
并且
当通过虚线表示的键全部存在时，该基团可以具有结构：
Figure BDA0004189627750000273
如本文所使用的，术语“单键”是指具有一个对于化学键合至另一个化学部分可用的位点的化学部分。因此，“一价部分”可以是通过在一价部分上的一个位点的连接，连接至整个分子的其余部分的该整个分子的部分。
如本文所使用的，术语“二价”是指具有两个对于化学键合至另一个化学部分可用的位点的化学部分。
如本文所使用的，术语“缀合物”和“缀合的”可以表示两种或更多种组分(例如，化合物、聚合物、生物分子、颗粒等)彼此连接(例如，共价连接)。在一些实施方式中，缀合物可以包含来源于通过二价接头部分(例如，任选地，取代的亚烷基或者亚芳基)共价连接的两个不同的化合物的一价部分。在一些实施方式中，接头可以含有一个或多个生物可降解的键，从而当前体药物暴露于特定生理环境或酶时，接头中的一个或多个键可以裂解。
如本文所使用的，术语“前体药物”可以指一旦向受试者或样本施用，能够(直接或间接)提供具有所需的生物活性(例如，抗癌活性)的另一种化合物(即“母体化合物”)的化合物。在一些但非全部的实施方式中，前体药物化合物具有低于母体化合物的所需的生物活性。在一些实施方式中，前体药物化合物在转化为母体化合物之前不具有可测量的生物活性。在一些实施方式中，前体药物本身具有所需的活性。
前体药物向母体化合物的转化可以在特定酶(例如，酯酶)的存在下和/或在特定生物条件下(例如，在生理学相关pH下或者存在于生理环境中的还原剂的存在下)发生。在一些实施方式中，前体药物最初被转化为另一种前体药物，然后被转化为(有时要慢得多)母体化合物。相对于母体化合物，前体药物可以提供提高的生物利用度和/或向生物区室(例如，癌细胞、溶酶体、脑或淋巴系统等)增强的递送。在一些实施方式中，与母体化合物相比，前体药物可以增强药物在感兴趣的特定载体中的溶解度和/或与特定递送平台或制剂更相容。
术语“键合”或“键合的”及其变化可以指共价、配位或非共价键合。在一些情况下，术语“键合”是指通过配位键键合。在一些实施方式中，术语“键合”是指共价键。术语“缀合”也可以指键合过程，如共价键或配位键的形成。
如本文所使用的，术语“金属有机框架”是指包含金属和有机组分两者的固体二维或三维网络，其中有机组分包括至少一个并且通常不止一个碳原子。在一些实施方式中，材料是晶体。在一些实施方式中，材料是无定形的。在一些实施方式中，材料是多孔的。在一些实施方式中，金属有机基体材料是配位聚合物，其包含含有金属基二级构造单元(SBU)的配位络合物的重复单元，如金属离子或金属络合物和桥接的多齿(例如，二齿或三齿)有机配体。因此，在一些实施方式中，材料含有不止一种类型的SBU或金属离子。在一些实施方式中，材料可以含有不止一种类型有机桥接配体。
术语“纳米级金属有机框架”可以指包含MOF的纳米级颗粒。
“配位络合物”是其中在金属离子和电子对供体、配体或螯合基团之间存在配位键的化合物。因此，配体或螯合基团通常是电子对供体，具有对于向金属离子供电子可用的非共享电子对的分子或分子离子。
术语“配位键”是指电子对供体和金属离子上的配位位点之间的相互作用，从而导致电子对供体和金属离子之间的吸引力。该术语的使用不旨在限制，因为基于金属离子和电子对供体的特征，特定配位键还可以被分类为具有或多或少的共价特性(如果不是完全共价特性)。
如本文所使用的，术语“配体”通常是指以某种方式与另一种物质相互作用(例如，结合)的物质(如分子或离子)。更具体地，如本文所使用的，“配体”可以指结合溶液中的金属离子以形成“配位络合物”的分子或离子。参见Martell,A.E.,和Hancock,R.D.,MetalComplexes in Aqueous Solutions,Plenum:纽约(1996)，该文献以其全部内容通过引用并入本文。术语“配体”和“螯合基团”可以互换使用。术语“桥接配体”可以表示键合至不止一个金属离子或络合物的基团，因此在金属离子或络合物之间提供了“桥”。有机桥接配体可以具有通过，例如亚烷基或亚芳基分隔的非共享电子对的两个或更多个基团。具有非共享电子对的基团包括但不限于-CO2H、-NO2、氨基、羟基、硫代、硫烷基、-B(OH)2、-SO3H、PO3H、磷酸酯和杂环中的杂原子(例如，氮、氧或硫)。术语“配体”还可以指优先结合至另一个，例如抗体及其靶标抗原的生物学相关分子或大分子；优先与它们结合的生物学受体和分子等。
当在本文中使用时，相对于配体，例如桥接配体，术语“配位位点”是指非共享电子对、负电荷，或者能够形成非共享电子对或负电荷(例如，通过在特定pH下的去质子化)的原子或官能团。
术语“纳米级颗粒”、“纳米材料”和“纳米颗粒”是指具有至少一个具有尺寸(例如，长、宽、直径等)小于约1,000nm的区域的结构。在一些实施方式中，尺寸较小(例如，小于约500nm、小于约250nm、小于约200nm、小于约150nm、小于约125nm、小于约100nm、小于约80nm、小于约70nm、小于约60nm、小于约50nm、小于约40nm、小于约30nm或甚至小于约20nm)。在一些实施方式中，尺寸在约20nm至约250nm之间(例如，约20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或250nm)。
在一些实施方式中，纳米颗粒是大致球形的。当纳米颗粒是大致球形的时，特征尺寸可以对应于球的直径。除球形外，纳米材料可以是圆盘形的、板形的(例如，六边形板样的)、长方形的、多面体的、杆状的、立方体的或不规则形状的。
纳米颗粒可以包含核区(即颗粒外部尺寸之间的空间)和外表面(即限定颗粒外部尺寸的表面)。在一些实施方式中，纳米颗粒可以具有围绕或部分围绕纳米颗粒核的一个或多个涂层。因此，例如，球形纳米颗粒可以具有一个或多个同心涂层，每个连续层分布在更接近于颗粒中心的较小的层的外表面上。这些纳米颗粒可以被称为“核-壳”纳米颗粒，其中壳是指涂层或层。
术语“纳米级配位聚合物”或NCP可以指包含配位聚合物，任选地为金属-磷酸酯配位聚合物，即包含在金属离子和单或二磷酸酯配体之间的配位络合物的重复单元的聚合物的纳米级颗粒。
在一些实施方式中，当前所公开的纳米颗粒可以包含固体金属-有机框架(MOF)基体，它是通过桥接配体连接在一起的SBU的二维或三维网络。MOF可以包含一个或多个孔或者中空内部区。MOF基体可以是无定形或者晶体的。在一些实施方式中，纳米颗粒核还包含一个或多个PS、X射线吸收剂、闪烁剂和/或其它治疗剂(例如，抗癌或免疫治疗剂)，它们可以物理截留在基体内，与基体金属离子配位或者通过共价或离子键化学键合(例如，键合至基体中的有机桥接配体或者在纳米颗粒核上分布的层中的化合物)。在一些实施方式中，光敏剂或其衍生物可以是有机桥接配体或者连接至形成纳米颗粒核的金属有机基体材料内的有机桥接配体，而SBU的金属起到闪烁体的作用。替代地，闪烁体、X射线吸收剂和/或PS可以截留在MOF内或者共价连接至MOF。
“包埋的”可以指在颗粒的核的内部结合，例如共价结合或通过配位键结合(例如，结合至桥接配体的配位位点或者SBU的金属离子)的试剂。替代地，试剂可以被“多价螯合”、“截留”或“限制”(即未共价包封)在MOF颗粒的核中的孔、腔或通道内部，或者通过氢键、伦敦分散力或任何其它非共价的相互作用与MOF材料相互作用。
如本文所使用的，术语“小分子”可以指非聚合、天然存在或合成的分子。小分子通常具有约900道尔顿(Da)或更小(例如，约800Da、约750Da、约700Da、约650Da、约600Da、约550Da或约500Da或更小)的分子量。
如本文所使用的，术语“大分子”是指大于约900Da的分子。在一些实施方式中，大分子是聚合物或生物聚合物，例如，蛋白或核酸。
术语“聚合物”和“聚合的”是指具有重复单元(即给定化学亚结构的多个拷贝)的化学结构。聚合物可以由可聚合单体形成。可聚合单体是包含可以反应以与可聚合单体的其它分子上的部分形成键(例如，共价或配位键)的一个或多个部分的分子。在一些实施方式中，每个可聚合单体分子可以键合至两个或更多个其它分子/部分。在一些情况下，可聚合单体将仅键合至一个其它分子，从而形成聚合物材料末端。
聚合物可以是有机或无机的或它们的组合。如本文所使用的，术语“无机的”是指含有除碳、氢、氮、氧、硫、磷或卤素之一以外的至少一些原子的化合物或组合物。因此，例如，无机化合物或组合物可以含有一个或多个硅原子和/或一个或多个金属原子。
如本文所使用的，“有机聚合物”是在它们的重复单元中不包括二氧化硅或金属原子的那些。示例性有机聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮(PVO)、聚酯、聚酰胺、聚醚、聚二烯等。一些有机聚合物含有生物可降解的键，如酯或酰胺，从而它们可以在生物学条件下随时间降解。
如本文所使用的，术语“亲水聚合物”通常是指亲水性有机聚合物，例如但不限于，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯甲醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟丙基噁唑啉、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚羟丙基甲基丙烯酸酯、聚羟基乙基丙烯酸酯、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚乙烯亚胺(PEI)、聚乙二醇(即PEG)或者另一种亲水性的聚(烯基氧化物)、聚甘油和聚天冬酰胺。如上所述，术语“亲水的”是指分子或化学物质与水相互作用的能力。因此，亲水聚合物通常是极性的或者具有可以氢键键合至水的基团。
术语“显像剂”是指辅助样品显像的化学部分。例如，显像剂可以是“造影剂”并且可以指提高待检查的生物组织或结构的对比度的部分(分子、大分子、配位络合物或纳米颗粒的特定部分或全部)。造影剂可以使用，例如磁共振成像(MRI)、光学成像、正电子发射断层(PET)成像、单光子发射计算机断层(SPECT)成像或它们的组合(即造影剂可以是多模式的)提高待检查的结构的对比度。
术语“MRI造影剂”是指在样品中的水质子的诱导驰豫速率(relaxation rates)中引起变化的部分。
术语“光学显像剂”或者“光学造影剂”是指可以基于吸收、反射或发出光(例如，紫外、可见或红外光)的能力被检测的基团。光学显像剂可以基于吸收、反射或荧光的量的变化，或者基于吸收峰数目或它们的最大波长的变化被检测。因此，光学显像剂包括可以基于荧光或发光检测的那些，包括有机和无机染料。
术语“荧光团”和“荧光部分”是指可以通过可见光或非可见光(例如，UV光)激发的物质。荧光团的实例包括但不限于：量子点和掺杂的量子点(例如，半导体CdSe量子点或Mn-掺杂的CdSe量子点)、荧光素、荧光素衍生物和类似物、吲哚菁绿、罗丹明、三苯基次甲基、聚甲炔、菁、酞菁、萘酞菁、部花青素、镧系络合物或穴状化合物、富勒烯、氧杂碲杂唑(oxatellurazoles)、LaJolla蓝、卟啉和卟啉类似物以及天然的发色团/荧光团，如叶绿素、类胡萝卜素、黄酮类、胆红素、植物光敏素、藻胆色素、藻红蛋白、藻蓝蛋白、视黄酸和类似物(如维A酸和维甲酸酯)。
术语“光敏剂(PS)”是指可以通过特定波长的光(通常，可见光和近红外(NIR)光)激发并产生活性氧(ROS)的化学化合物或部分。例如，在其激发态，光敏剂可以经历系统间交叉并转移能量至氧(O2)(例如，在要通过PDT治疗的组织中)以产生ROS，如单线态氧(1O2)。根据当前所公开的主题可以使用任何已知类型的光敏剂。在一些实施方式中，光敏剂是卟啉、叶绿素、染料或它们衍生物或类似物。在一些实施方式中，可以使用卟啉、二氢卟酚、菌绿素或卟啉烯(porphycenes)。在一些实施方式中，光敏剂可以具有一个或多个官能性基团，如羧酸、胺或异硫氰酸酯，例如，用于在将光敏剂连接至另一个分子或部分(如有机桥接配体或SBU)中使用，和/或用于提供其它一个或多个位点以增强配位或与其它一种或多种金属配位。在一些实施方式中，光敏剂是卟啉或其衍生物或类似物。示例性的卟啉包括但不限于，血卟啉、原卟啉和四苯基卟啉(TPP)。示例性卟啉衍生物包括但不限于，焦脱镁叶绿酸、细菌叶绿素、叶绿素a、苯并卟啉衍生物、四羟基苯基二氢卟酚、紫红素、苯并二氢卟酚、萘并二氢卟酚、维尔丁(verdin)、玫红素(rhodin)、氧杂二氢卟酚、氮杂二氢卟酚、菌绿素、甲苯基卟啉(tolyporphyrin)和苯并菌绿素。卟啉类似物包括但不限于，扩展的卟啉家族成员(如德克萨卟啉(texaphyrin)、噻呋啉(sapphyrin)和六元卟啉(hexaphyrin))、卟啉异构体(如卟啉烯、反转的卟啉(inverted porphyrins)和萘酞菁(naphthalocyanines))和被一个或多个官能团取代的TPP。
术语“卟啉脂质”是指脂质和卟啉、卟啉衍生物或卟啉类似物的缀合物。在一些实施方式中，卟啉脂质可以包含脂质缀合物，其中卟啉或其衍生物或类似物共价连接至脂质侧链。卟啉脂质类和卟啉脂质合成描述于，例如在美国专利申请公开号2014/0127763中，该专利申请以其全部内容通过引用并入本文。
术语“溶血脂质”是指其中已除去一个或多个酰基的脂质。
如本文所使用的，术语“癌症”是指由不受控制的细胞分裂和/或细胞转移或在其它位点建立新的生长的能力所引起的疾病。术语“恶性的”、“恶性”、“赘生物”、“肿瘤”、“癌症”及其变化是指癌性细胞或癌性细胞的组。
特定癌症类型包括但不限于，皮肤癌(例如，黑色素瘤)、结缔组织癌(例如，肉瘤)、脂肪癌、乳腺癌、头颈癌、肺癌(例如，间皮瘤)、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫癌、肛门生殖器癌(例如，睾丸癌)、肾癌、膀胱癌、结直肠癌(例如，结肠癌、结直肠腺癌等)、前列腺癌、中枢神经系统(CNS)癌症、视网膜癌、血癌、成神经细胞瘤、多发性骨髓瘤和淋巴癌(例如，霍奇金和非霍奇金淋巴瘤)。
术语“转移性癌”是指从其在患者身体中的初始位点(即原发位点)扩散的癌症。
术语“抗癌药”、“化疗剂”和“抗癌前体药物”是指已知或怀疑能够治疗癌症(即杀死癌细胞、阻止癌细胞增殖或治疗与癌症有关的症状)的药物(即化合物)或前体药物。在一些实施方式中，如本文所使用的，术语“化疗剂”是指用于治疗癌症和/或具有细胞毒性能力的合成或天然存在的小分子(例如，小于1500道尔顿(Da)、小于1250Da、小于1000Da、小于900Da、小于800Da或小于750Da、小于700Da、小于650Da、小于600Da等)。在一些实施方式中，术语“化疗剂”是指铂配位络合物。可以通过作用机制或通过化合物种类描述这些更传统或常规的化疗剂，并且它们可以包括但不限于，烷化剂(例如，美法仑)、蒽环类抗生素(例如，多柔比星)、细胞骨架干扰剂(例如，紫杉醇)、埃博霉素、组蛋白去乙酰化酶抑制剂(例如，伏立诺他)、拓扑异构酶I或II的抑制剂(例如，伊立替康或依托泊苷)、激酶抑制剂(例如，硼替佐米)、核苷酸类似物或其前体(例如，甲氨蝶呤)、肽抗生素(例如，博来霉素)、铂基试剂(例如，铂配位络合物(如顺铂、奥沙利铂或卡铂))、类视黄醇(例如，维甲酸)和长春花生物碱(例如，长春碱)。在一些实施方式中，术语“化疗剂”是指激素或多肽化疗药物。
术语“闪烁体”是指当通过电离辐射(如x射线)激发时，显示发光(发光，例如，在可见或NIR范围内的光)的部分或化合物。
在本文的含义内，“治疗”或“疗法”是指减轻与病症或疾病有关的症状，或抑制那些症状的进一步发展或恶化，或防止或预防疾病或病症，或治愈疾病或病症。类似地，如本文所使用的，当前所公开的主题的化合物的“有效量”或“治疗有效量”是指完全或部分减轻与病症或病况有关的症状，或者停止或减缓那些症状的进一步发展或恶化，或者防止或提供病症或病况的预防的化合物的量。具体地，“治疗有效量”是指以所必需的剂量和持续时间，对于实现所需的治疗结果的有效量。治疗有效量还是其中本发明的化合物的治疗有益效果大于任何毒性或不利影响的量。
II.通常考虑
在一些方面，当前所公开的主题涉及基于脂质的前体药物的设计并且涉及用于递送前体药物的纳米颗粒(例如，核-壳纳米级配位聚合物(NCP)或其它纳米级金属有机框架(MOF))。在一些实施方式中，纳米颗粒可以用于药物组合的共递送，如亲水性和疏水性药物组合。可以将亲水性药物(如顺铂、卡铂、奥沙利铂和吉西他滨和/或它们的前体药物)引入NCP颗粒的核中。例如，可以制备金属配位络合物顺铂、卡铂和奥沙利铂的二磷酸酯并与金属离子共聚以提供包含可以形成纳米颗粒核的金属二磷酸酯配位聚合物的NCP，或者亲水性药物可以包括在用于制备NCP颗粒(例如，通过金属离子和非治疗性磷酸酯的共聚)的溶液中，从而产生包埋在NCP核内的亲水性药物(例如，物理截留在NCP核中的孔内)。
当前所公开的主题的基于脂质的前体药物可以是疏水性药物(例如，疏水性化疗药物)的前体药物。可以合成这些前体药物以包括可裂解碳酸酯或氨基甲酸酯键。例如，可裂解键可以包含缩醛基，其中缩醛基的氧原子之一也是碳酸酯或氨基甲酸酯键的部分(即直接连接至碳酸酯或氨基甲酸酯基团的碳原子)。还可以使用氧基苄氧基制备前体药物，其中直接连接至苄基碳原子的氧也直接连接至碳酸酯或氨基甲酸酯基团的碳原子。这些前体药物可以对癌细胞的酸性环境以及对酯酶敏感，从而增强药物部分在癌细胞中的释放。
根据当前所公开的主题的一些方面，亲水性和疏水性药物的前体药物自组装成核-壳NCP以允许每种药物的缓慢和触发释放。这些纳米颗粒可以改善每种药物的药效谱，从而提高药物对癌细胞的暴露，同时防止过早降解。血液、脾脏和肝脏中有限的游离药物暴露和代谢以及活性药物在肿瘤中积累的同时提高和维持可以提供优良的抗癌效力。在一些实施方式中，基于脂质的前体药物可以靶向低密度脂蛋白受体(LDL)和/或纳米颗粒可以吸附载脂蛋白B-100(ApoB-100)，从而导致纳米颗粒以及与之结合的任何前体药物向癌细胞的增强递送，从而导致癌细胞药物暴露的提高。
一些小分子化疗剂，包括奥沙利铂(OxPt)、紫杉醇(PTX)、柔红霉素、多西他赛、多柔比星、环磷酰胺、双氢青蒿素和米托蒽醌可以有效引起免疫原性细胞死亡。这些化疗剂可以是免疫刺激性的。在一些实施方式中，这些NCP颗粒的组合化疗方案可以通过免疫疗法(如免疫检查点抑制剂)增效。例如，当前所公开的核-壳NCP与免疫检查点抑制剂的组合可以激活肿瘤微环境以引起全身性抗肿瘤免疫应答，进一步增强抗癌效力。
因此，在一些实施方式中，当前所公开的主题提供了包含化学式D-BL-L的结构的前体药物，其中B是一价药物部分，BL是二价接头，并且L是一价脂质部分。D可以是包含羟基或氨基的任何感兴趣的药物的一价衍生物。去质子化的羟基的氧原子或去质子化的氨基的氮原子可以用作碳酸酯(即-O-C(＝O)-O-)或者氨基甲酸酯(即-NR-C(＝O)-O-，其中R为H或烷基、芳烷基或芳基)键的原子。在一些实施方式中，BL不含二硫键。在一些实施方式中，前体药物不含二硫键。
在一些实施方式中，D是抗癌药物(例如，抗癌小分子或多肽)的一价衍生物。在一些实施方式中，D是疏水性药物(例如，疏水性抗癌药物)的一价部分。在一些实施方式中，D是选自以下组的药物化合物的一价衍生物，所述组包括但不限于，依托泊苷(ET)、鬼臼毒素(PPX)、紫杉醇(PTX)、多西他赛(DTX)、双氢青蒿素(DHA)、喜树碱(CPT)、7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)、拓扑替康、多柔比星、表柔比星、伊达比星、长春新碱、米托蒽醌、青蒿琥酯、卡培他滨、奥曲肽、亮丙瑞林和戈舍瑞林。
BL是二价接头，其中D通过碳酸酯或氨基甲酸酯基团直接连接至BL，并且其中BL包含缩醛基和取代的氧基苄氧基中的至少一种，其中缩醛基的氧原子或者氧基苄氧基的苄基氧原子直接连接至碳酸酯或氨基甲酸酯基团的碳原子(任选地，碳酸酯或氨基甲酸酯基团直接连接至药物部分)。在一些实施方式中，缩醛基具有以下式之一的结构：
Figure BDA0004189627750000351
Figure BDA0004189627750000361
其中：通过虚线表示的键可以存在或不存在，n是0至4之间的整数；R1和R2独立地选自包含以下的组：H、烷基、取代的烷基、芳烷基、取代的芳烷基、芳基和取代的芳基，每个R3是芳基取代基，例如独立地选自烷基、取代的烷基、芳烷基、取代的芳烷基、芳基、取代的芳基、卤素(例如，Cl、Br、I或F)、烷氧基、芳氧基、羟基、酰基、羧酸酯、磷酸酯、硝基、-N3、B(OH)2和氰基；并且其中缩醛基中的氧原子中的至少一个直接键合至碳酸酯或氨基甲酸酯基团的碳原子。
在一些实施方式中，BL还包含一种或多种其它亚烷基或亚芳基部分(例如，直接连接到不直接连接至碳酸酯或氨基甲酸酯基团的缩醛基的氧原子，或者直接连接到也连接至苯环的氧基苄氧基的氧原子)。例如，其它亚烷基基团可以具有结构-C(＝O)-(CH)m-C(＝O)-O-，其中m是1至12之间的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)。在一些实施方式中，BL包含缩醛基和氧基苄氧基两者。在一些实施方式中，前体药物可以包含不止一种一价药物部分D，其中每个药物部分D通过氨基甲酸酯或碳酸酯键连接至BL。例如，在一些实施方式中，前体药物可以包含两个或三个药物部分D，它们可以是相同或不同的。
在一些实施方式中，缩醛基具有结构：
Figure BDA0004189627750000362
其中n是0至4之间的整数(即0、1、2、3或4)；R1和R2独立地选自包含以下的组：H、烷基、取代的烷基、芳烷基、取代的芳烷基、芳基和取代的芳基，每个R3是芳基取代基，例如独立地选自包含以下的组：烷基、取代的烷基、芳烷基、取代的芳烷基、芳基、取代的芳基、卤素(例如，Cl、Br、I或F)、烷氧基、芳氧基、羟基、酰基、羧酸酯、磷酸酯、硝基、-N3、B(OH)2或氰基；并且其中缩醛基中的氧原子中的至少一个直接键合至碳酸酯或氨基甲酸酯基团的碳原子。在一些实施方式中，n是0并且缩醛基具有以下化学式的结构：
Figure BDA0004189627750000371
在一些实施方式中，取代的氧基苄氧基具有以下化学式的结构：
Figure BDA0004189627750000372
其中R'是芳基取代基，并且其中连接至氧基苄氧基的苄基碳的氧原子直接键合至碳酸酯或氨基甲酸酯基团的碳原子。在一些实施方式中，R'选自包含硝基、-N3和-B(OH)2的组。
在一些实施方式中，L是胆固醇、油酸、溶血脂质或者磷酸胆碱的一价衍生物。
在一些实施方式中，前体药物包含图35A中所示的结构。在一些实施方式中，前体药物包含以下化学式之一的结构：
Figure BDA0004189627750000373
Figure BDA0004189627750000381
其中D是一价药物部分(例如，一价化疗药物部分，如图35B中所示的一价化疗药物部分)，并且L是一价脂质部分(例如，图35B中所示的一价胆固醇部分)。
图1显示了包含直接连接至碳酸酯键的缩醛基的当前所公开的主题的前体药物的示例性合成路线。尽管图1更具体地显示了SN38的基于胆固醇的前体药物的合成，但是可以使用其它脂质和/或药物替代胆固醇和/或SN38。还参见以下方案1中的合成途径1。通常，具有羟基的脂质可以在空间位阻碱(如三烷基胺(例如，二异丙基乙胺(DIPEA))和亲核催化剂(如二甲基氨吡啶(DMAP))的存在下，在非质子溶剂中与琥珀酸酐反应，以提供具有连接至亚烷基的酯键的脂质部分，其中亚烷基终止于末端羧酸部分。如果需要不同的亚烷基长度，则琥珀酸酐可以被另一种酸酐或二羧酸取代。替代地，琥珀酸酐可以被具有适合的可以在其它步骤中转化为羧酸部分的化学官能团的羧酸取代。例如，可以使具有连接羧酸和保护的末端羟基的亚烷基部分的羧酸的保护的末端羟基脱保护并与氧化剂反应以提供羧酸。
在任何情况下，然后，新添加至脂质的部分的末端羧酸基团可以与卤甲基4-硝基苯基碳酸酯(例如，碘甲基4-硝基苯基碳酸酯)或其包含连接至亚甲基碳原子的一种或多种取代基(例如，甲基或苯基)和/或代替4-硝基苯基的不同离去基团的类似物反应。例如，为了制备具有连接至亚甲基碳原子的甲基的缩醛，1-氯乙基氯甲酸酯可以在空间位阻碱的存在下与4-硝基苯基碳酸酯反应，并且然后，如果需要，使用NaI，转化为相应碘代化合物(即1-碘乙基4-硝基苯基碳酸酯)，例如，使用相转移催化剂，如四丁基溴化铵(TBAB)，以提供具有更好的卤化物离去基团的试剂。具有末端羧酸基团的脂质与卤甲基4-硝基苯基碳酸酯的反应的4-硝基苯基碳酸酯产物然后可以在空间位阻碱(例如，DIPEA)的存在下与包含羟基或氨基的药物反应以提供新的碳酸酯或氨基甲酸酯键，其中药物部分取代了4-硝基苯基基团。
包含羧酸基团的脂质可以与卤甲基4-硝基苯基碳酸酯(例如，碘甲基4-硝基苯基碳酸酯)或其类似物直接反应以提供具有直接连接至碳酸酯的缩醛基的含脂质接头4-硝基苯基碳酸酯的中间体。然后，该中间体可以与包含氨基或羟基的药物反应以提供新的碳酸酯或氨基甲酸酯键，其中药物部分取代了4-硝基苯基基团。
可以使用以下实施例8中所描述的路线制备包含氧基苄氧基的前体药物(单独或与缩醛基组合)。还参见以下方案1中的合成途径2。尽管4-羟基苄醇用于与从脂质部分制备的酰氯或者与实施例8中含有脂质-缩醛接头的中间体的4-硝基苯基碳酸酯反应，但是4-羟基苄醇的取代的类似物还可以用于提供具有芳基取代的氧基苄氧基的接头。
可以如以下方案1的合成途径3所示的制备具有包含稠环结构的缩醛基的前体药物。例如，适合的苯二甲酸可以与包含羧酸的脂质部分在三氟乙酸(TFA)的存在下反应以提供还包含稠环体系的中间体醇。然后，可以使用4-硝基苯基氯甲酸酯将中间体醇转化为4-硝基苯基碳酸酯以提供4-硝基苯基碳酸酯。然后，4-硝基苯基碳酸酯可以与药物的羟基反应以提供含有碳酸酯的前体药物。替代地，4-硝基苯基碳酸酯可以与药物的氨基反应以提供含有氨基甲酸酯的前体药物。
合成途径1
Figure BDA0004189627750000401
合成途径2
Figure BDA0004189627750000402
合成途径3
Figure BDA0004189627750000403
方案1.前体药物合成途径。
在一些实施方式中，BL包含具有以下化学式的结构的缩醛基：
Figure BDA0004189627750000404
其中R1和R2独立地选自包含以下的组：H、烷基(例如，C1-C6烷基)、取代的烷基、芳烷基(例如，苄基)、取代的芳烷基(例如，取代的苄基)、芳基(例如，苯基)和取代的芳基(例如，取代的苯基)。在一些实施方式中，R1和R2是相同的。在一些实施方式中，R1和R2是不同的。在一些实施方式中，R1和R2独立地选自包含H、甲基和苯基的组。在一些实施方式中，R1和R2中的至少一个是H。在一些实施方式中，R1和R2两者均为H。
在一些实施方式中，L是油酸部分，并且L和BL一起具有结构：
Figure BDA0004189627750000411
在一些实施方式中，L是胆固醇衍生物，并且L和BL一起具有结构：
Figure BDA0004189627750000412
在一些实施方式中，前体药物是选自如图33或图34所示的前体药物之一的前体药物。在一些实施方式中，前体药物选自包含以下的组：
Figure BDA0004189627750000413
Figure BDA0004189627750000421
Figure BDA0004189627750000431
在一些实施方式中，前体药物结合至低密度脂蛋白(LDL)(例如，在血浆中)并通过LDL受体(LDLR)介导的内吞被主动运输至肿瘤。在一些实施方式中，与白蛋白相比，前体药物优先结合至LDL。在一些实施方式中，前体药物对LDL的结合常数Ka是前体药物对白蛋白的Ka的至少约5、10、25、50、100、250、500或750倍或以上。在一些实施方式中，前体药物对LDL的Ka是前体药物对白蛋白的Ka的至少约1000倍。在一些实施方式中，前体药物对LDL的Ka是前体药物对白蛋白的Ka的至少约2000倍。
在一些实施方式中，当前所公开的主题提供了包含以下的纳米颗粒：(a)包含金属有机基体材料的核，和(b)覆盖至少部分核表面的涂层，其中涂层包含脂质层或脂质双层，其中所述脂质层或脂质双层还包含如本文所公开的化学式D-BL-L的前体药物。在一些实施方式中，金属有机基体材料包含纳米级配位聚合物(NCP)。在一些实施方式中，NCP包含金属二磷酸酯或含有多价金属离子和二磷酸酯(bisphosphate)或二膦酸酯(bisphosphonate)的金属二膦酸酯配位聚合物。在一些实施方式中，NCP包含含有多价金属离子和二磷酸酯的金属二磷酸酯配位聚合物。在一些实施方式中，NCP核包含约40至约50重量％之间的二磷酸酯(例如，约40、42、44、46、48或约50重量％的二磷酸酯)。在一些实施方式中，多价金属离子是选自包含Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+以及它们的组合的组的离子。在一些实施方式中，多价金属离子是Zn2+。
在一些实施方式中，二磷酸酯或二膦酸酯包含药物或前体药物，或者由它们组成。在一些实施方式中，二磷酸酯或二膦酸酯是抗癌剂的前体药物。在一些实施方式中，二磷酸酯或二膦酸酯是顺铂、奥沙利铂或卡铂的前体药物。在一些实施方式中，二磷酸酯或二膦酸酯是顺式,顺式-反式-[Pt(NH3)2Cl2(OH)2](即顺铂前体药物)、顺式,反式-[Pt(dach)(草酸根)(OH)2](即奥沙利铂前体药物)或者[Pt(环丁烯二甲酸)(NH3)2(OH)2](即卡铂前体药物)的二磷酸酯或二膦酸酯或其它前体药物。在一些实施方式中，二磷酸酯包含来源于氨基磷酸的配体，例如二磷酸酯，其中铂配位络合物(如顺式,顺式-反式-[Pt(NH3)2Cl2(OH)2]、顺式,反式-[Pt(dach)(草酸根)(OH)2]或者[Pt(环丁烯二甲酸)(NH3)2(OH)2])的两个OH配体被包含结构-O-C(＝O)-NH-P(＝O)(OH)2的配体取代。因此，在一些实施方式中，纳米颗粒包含含有通过配位键连接至核的抗癌剂前体药物的核。如本文所使用的，短语“包含OxPt的核”或“包含卡铂的核”可以指可以递送OxPt或卡铂的核，即包含OxPt前体药物或卡铂前体药物的纳米颗粒核和/或包含OxPt或卡铂的纳米颗粒核。
在一些实施方式中，纳米颗粒核包含包埋的抗癌剂(例如，物理或化学多价螯合在纳米颗粒核中的孔中)。在一些实施方式中，包埋的抗癌剂是包埋的亲水性抗癌剂。在一些实施方式中，包埋的抗癌剂是吉西他滨(GEM)或吉西他滨单磷酸酯(GMP)。在一些实施方式中，包埋的抗癌剂是阿糖胞苷单磷酸酯或砷酸。
在一些实施方式中，纳米颗粒核包含至少两种抗癌剂(例如，二、三、四、五或更多种抗癌剂)。在一些实施方式中，至少两种抗癌剂包含第一抗癌剂，其中第一抗癌剂是顺铂、卡铂或奥沙利铂前体药物，和第二抗癌剂，其中第二抗癌剂是包埋的亲水性抗癌剂。在一些实施方式中，第一抗癌剂是顺铂、卡铂或奥沙利铂二磷酸酯前体药物。在一些实施方式中，第一抗癌剂与多价金属离子共聚以形成NCP，所述NCP形成了纳米颗粒核的全部或部分。
在一些实施方式中，纳米颗粒核包含含有多价金属离子和二磷酸酯的金属二磷酸酯配位聚合物，其中所述二磷酸酯是具有结构Pt(dach)(草酸根)(双磷酰胺酸)的奥沙利铂前体药物；并且其中涂层是包含SN38的前体药物(例如，SN38的胆固醇前体药物)的脂质双层。在一些实施方式中，SN38的前体药物具有结构：
Figure BDA0004189627750000451
在一些实施方式中，多价金属离子是Zn2+。在一些实施方式中，纳米颗粒核还包含第二抗癌剂(例如，除奥沙利铂前体药物之外)。在一些实施方式中，纳米颗粒核包含包埋在纳米颗粒核中的GMP。
在一些实施方式中，涂层还包含胆固醇、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸钠盐(DOPA)、1,2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)和/或它们的聚乙二醇化衍生物(例如，DSPE-PEG2000)中的一种或多种。在一些实施方式中，涂层包含(除基于脂质的前体药物之外)胆固醇、DOPC和DSPE-PEG2000的混合物。
在一些实施方式中，涂层包含脂质双层，脂质双层包含阳离子脂质和/或官能化脂质。在一些实施方式中，所述官能化脂质是被可以键合至核酸的基团官能化的脂质。在一些实施方式中，至少一种核酸共价键合至官能化脂质或者通过静电相互作用连接至阳离子脂质。在一些实施方式中，脂质双层包含含有硫醇-或二硫醇-官能化的1,2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)中的一种或多种的混合物。在一些实施方式中，至少一种核酸选自包含siRNA、miRNA和AS ODN的组。在一些实施方式中，siRNA选自包含以下的组：存活素siRNA、ERCC-1siRNA、P-糖蛋白siRNA(P-gp siRNA)、Bcl-2siRNA以及它们的混合物。
在一些实施方式中，纳米颗粒还包含一种或多种钝化剂，任选地为亲水聚合物；靶向剂，任选地为RGD肽；和免疫治疗剂。
在一些实施方式中，纳米颗粒的直径为约20纳米(nm)至约300nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的直径为约20nm至约200nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的直径为约20nm至约140nm(例如，约20、约40、约60、约80、约100、约120或约140nm)。
在一些实施方式中，纳米颗粒吸附血浆蛋白(如载脂蛋白B-100(apo B-100))用于通过LDL受体介导的内吞向肿瘤的主动运输。
在一些实施方式中，当前所公开的主题提供了包含以下的药物制剂：(i)药学上可接受的载体，和(ii)具有如本文以上所述的结构D-BL-L的当前所公开的主题的前体药物，或者如本文以上所述的当前所公开的主题的纳米颗粒(例如，核-壳纳米颗粒，其中核包含金属有机框架(例如，NCP)，并且壳包含含有具有如本文所描述的结构D-BL-L的前体药物的脂质或脂质双层涂层)。在一些实施方式中，药学上可接受的载体在人中是药学上可接受的。
在一些实施方式中，当前所公开的主题提供了治疗对其有需要的受试者(例如，已诊断患有癌症或其复发的受试者)中癌症的方法。在一些实施方式中，受试者是哺乳动物。在一些实施方式中，受试者是人。在一些实施方式中，当前所公开的方法包括向受试者施用如本文所描述的结构D-BL-L的前体药物、如本文所描述的纳米颗粒(即包含(a)含有金属有机基体材料的核和(b)覆盖至少部分核表面的涂层的纳米颗粒，其中涂层包含脂质层或脂质双层，其中所述脂质层或脂质双层还包含如本文所公开的化学式D-BL-L的前体药物)，或者所述前体药物或所述纳米颗粒的药学上可接受的制剂。
在一些实施方式中，方法还包括向受试者施用另外的癌症治疗。在一些实施方式中，另外的癌症治疗选自包含以下的组：手术、放射疗法、化疗、毒素疗法、免疫疗法、冷冻疗法和基因疗法。在一些实施方式中，另外的癌症治疗是免疫疗法。在一些实施方式中，免疫疗法包括向受试者施用免疫治疗剂；任选地，其中免疫治疗剂选自包含以下的组：抗-CD52抗体、抗-CD20抗体、抗-CD47抗体、抗-GD2抗体、细胞因子、多糖K；PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、IDO抑制剂、CCR7抑制剂、OX40抑制剂、TIM3抑制剂和LAG3抑制剂。在一些实施方式中，细胞因子选自包含干扰素和白介素的组。在一些实施方式中，细胞因子选自包含IFN-α、IFN-γ、IL-2、IL-12和TNF-α的组。
在一些实施方式中，癌症选自头部肿瘤、颈部肿瘤、乳腺癌、妇科肿瘤、脑肿瘤、结直肠癌、肺癌、间皮瘤、软组织肉瘤、皮肤癌、结缔组织癌、脂肪癌、肺癌、胃癌、肛门生殖器癌、肾癌、膀胱癌、结肠癌、前列腺癌、中枢神经系统癌、视网膜癌、血癌、成神经细胞瘤、多发性骨髓瘤、淋巴癌和胰腺癌。在一些实施方式中，癌症是转移性癌。在一些实施方式中，转移性癌是转移性结直肠癌(mCRC)。
在一些实施方式中，方法包括向受试者施用纳米颗粒，其中纳米颗粒核包含金属二磷酸酯或金属二膦酸酯配位聚合物，所述金属二膦酸酯配位聚合物包含多价金属离子(例如，Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+或它们的任意组合)和二磷酸酯或二膦酸酯，其中所述二磷酸酯或二膦酸酯是顺铂、奥沙利铂或卡铂的二磷酸酯或二膦酸酯前体药物；并且其中涂层包含含有具有结构D-BL-L的前体药物的脂质层或脂质双层，其中D是抗癌药物化合物的一价药物部分；L是一价脂质部分；并且BL是二价接头部分，其中D通过可裂解的碳酸酯或氨基甲酸酯键连接至BL，并且其中BL包含缩醛基，其中缩醛基的氧原子直接连接至碳酸酯或氨基甲酸酯的碳原子。在一些实施方式中，纳米颗粒核包含金属二磷酸酯配位聚合物。在一些实施方式中，D是抗癌药物化合物的一价衍生物，例如，疏水性药物化合物，如选自包含以下的组的药物化合物：ET、PPX、PTX、DTX、DHA、CPT、SN38、拓扑替康、多柔比星、表柔比星、伊达比星、长春新碱、米托蒽醌、青蒿琥酯、卡培他滨、奥曲肽、亮丙瑞林和戈舍瑞林。在一些实施方式中，BL包含具有以下化学式的结构的缩醛：
Figure BDA0004189627750000471
其中R1和R2独立地选自包含以下的组：H、烷基(例如，C1-C6烷基)、取代的烷基、芳烷基、取代的芳烷基、芳基和取代的芳基。在一些实施方式中，R1和R2选自H、甲基和苯基。在一些实施方式中，R1和R2是相同的。在一些实施方式中，R1和R2是不同的。在一些实施方式中，R1和R2分别为H。
在一些实施方式中，纳米颗粒核还包含包埋其中的亲水性抗癌剂。在一些实施方式中，亲水性抗癌剂是GMP。
在一些实施方式中，脂质双层中的前体药物是SN38的前体药物。在一些实施方式中，前体药物具有以下化学式的结构：
Figure BDA0004189627750000481
在一些实施方式中，纳米颗粒核中的二磷酸酯是Pt(dach)(草酸根)(双磷酰胺酸)。
在一些实施方式中，方法还包括向受试者施用免疫治疗剂。在一些实施方式中，免疫治疗剂选自包含以下的组：抗-CD52抗体、抗-CD20抗体、抗-CD47抗体、抗-GD2抗体、多糖K和细胞因子。在一些实施方式中，免疫治疗剂选自包含以下的组：放射性标记的抗体、抗体-药物缀合物和新抗原。在一些实施方式中，免疫治疗剂选自包含以下的组：阿仑珠单抗(Alemtuzumab)、奥法木单抗(Ofatumumab)、利妥昔单抗(Rituximab)、替伊莫单抗(Zevalin)、本妥昔单抗(Adcetris)、曲妥珠单抗(Kadcyla)和地尼白介素(Ontak)。在一些实施方式中，免疫治疗剂选自包含以下的组：PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、IDO抑制剂、CCR7抑制剂、OX40抑制剂、TIM3抑制剂和LAG3抑制剂。在一些实施方式中，细胞因子选自包含干扰素和白介素的组。在一些实施方式中，细胞因子选自包含IFN-α、IFN-γ、IL-2、IL-12和TNF-α的组。
在一些实施方式中，与至少一种抗癌剂的相等量的施用相比，纳米颗粒的施用提供了至少一种抗癌剂的肿瘤曲线下面积(AUC)的至少2倍增加，其中至少一种抗癌剂不与当前所公开的主题的纳米颗粒和/或前体药物结合(例如，与游离抗癌剂的施用相比)。在一些实施方式中，相比于施用相等量的至少一种抗癌剂，其中至少一种抗癌剂不与当前所公开的主题的纳米颗粒和/或前体药物结合，纳米颗粒的施用提供了肿瘤AUC的至少4倍增加或者肿瘤AUC的大于4倍增加。
在一些实施方式中，当前所公开的主题提供了治疗对其有需要的受试者中癌症的方法，其中方法包括向受试者施用包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包含含有可裂解碳酸酯键的脂质-缀合物前体药物和金属有机基体材料核(任选地NCP核)。在一些实施方式中，纳米级颗粒还包含光敏剂，并且方法还包含用适合于激活光敏剂的波长的辐射辐照受试者或受试者的治疗区。
III.制剂
因此，在一些实施方式中，当前所公开的主题的组合物包含包括药学上可接受的载体的组合物。任何适合的药物制剂可以用于制备用于向受试者施用的组合物。在一些实施方式中，组合物和/或载体可以是在人中药学上可接受的。
例如，适合的制剂可以包括含水和无水无菌注射溶液，所述含水和无水无菌注射溶液可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、杀菌性抗菌素和使制剂与受试者体液等渗的溶质；以及可以包括助悬剂和增稠剂的含水和无水无菌混悬液。制剂可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如，密封的安瓿瓶和小瓶中，并且可以在冷冻或冻干(冷冻干燥)条件下保存(在将要使用之前，仅需要添加无菌液体载体，例如注射用水)。一些示例性成分是十二烷基硫酸钠(SDS)，在一个实例中为在0.1至10mg/ml的范围内，在另一个实例中为约2.0mg/ml；和/或甘露糖醇或另一种糖，例如在10至100mg/ml的范围内，在另一个实例中为约30mg/ml；和/或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
应理解除以上具体提及的成分之外，当前所公开的主题的制剂可以包括考虑所讨论的制剂类型的本领域中的常规其它试剂。例如，可以使用无菌无热原的含水和无水溶液。
IV.受试者
本文所公开的方法和组合物可以用于受试者中的体外(例如，对分离的细胞或组织)或体内(即生物机体，如患者)样品。在一些实施方式中，受试者或患者是人受试者，尽管应理解当前所公开的主题的原理表示对于旨在包含在术“受试者”和“患者”内的所有脊椎动物种类(包括哺乳动物)，当前所公开的主题是有效的。此外，应理解哺乳动物包括任何哺乳动物种类(对其使用本文所公开的组合物和方法是所需的)，特别是农业和驯养的哺乳动物种类。
照此，当前所公开的主题的方法在恒温脊椎动物中是特别有用的。因此，当前所公开的主题与哺乳动物和鸟类有关。更具体地，提供了用于哺乳动物，例如人，以及对于人来说，由于濒危而重要的(如东北虎)、具有重要经济价值的(用于人类消费的农场饲养的动物)和/或具有重要社会价值的(作为宠物或在动物园中饲养的动物)的那些哺乳动物，例如，除人以外的食肉动物(如猫和狗)、猪(猪、肉猪和野猪)、反刍动物(如牛、黄牛、绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛和骆驼)和马的方法和组合物。还提供了鸟类的治疗，包括濒危的、在动物园或作为宠物饲养的(例如，鹦鹉)的那些鸟类以及家禽，并且更具体地为驯养的家禽(例如，禽类，如火鸡、鸡、鸭、鹅、珍珠鸡等)的治疗，因为它们对于人类来说也具有重要经济价值。因此，还提供了家畜的治疗，所述家畜包括但不限于，驯养的猪(猪和肉猪)、反刍动物、马类、禽类等。
V.施用
适合于施用当前所公开的主题的组合物的方法包括但不限于，静脉内和瘤内注射、口服施用、皮下施用、腹膜内注射、颅内注射和直肠施用。替代地，可以以任何其它方式将组合物沉积在需要治疗的位点，例如，通过在肺部途径内喷组合物。施用当前所公开的主题的组合物的具体模式取决于多种因素，包括要治疗的细胞的分布和丰度以及组合物从其施用位点的代谢或去除机制。例如，可以瘤内注射相对浅表的肿瘤。相反，可以按照静脉内注射治疗内部肿瘤。
在一个实施方式中，施用方法涵盖了在要治疗的位点区域化递送或积累的特性。在一些实施方式中，瘤内递送组合物。在一些实施方式中，组合物向靶标的选择性递送伴随着组合物的静脉内注射，以及随后靶标的光动力学治疗(光辐照)。
对于组合物向肺部途径的递送，可以将当前所公开的主题的组合物配制成气溶胶或粗喷雾剂。用于制备和施用气溶胶或喷雾剂制剂的方法可见于，例如，美国专利号5,858,784；6,013,638；6,022,737；和6,136,295。
VI.剂量
将有效剂量的当前所公开的主题的组合物施用于受试者。“有效量”是足以产生可检测的治疗的组合物的量。可以改变当前所公开的主题的组合物的成分的真实剂量水平，以施用对于特定受试者和/或靶标实现所需的效果有效的组合物的量。所选的剂量水平可以取决于组合物的活性(例如，细胞毒性或PDT活性或者化疗负荷)和施用路径。
在回顾本文中当前所公开的主题的公开内容后，本领域普通技术人员可以调整个体受试者的剂量、考虑具体制剂、用于组合物的施用方法和要治疗的靶标性质。这些调整或改变，以及何时和如何做出这些调整或改变的评价对本领域那些普通技术人员是公知的。
实施例
包括以下实施例，以为本领域普通技术人员提供实践当前所公开的主题的代表性实施方式的指导。根据当前公开内容和本领域的一般技术水平，技术人员可以理解以下实施例旨在仅是示例性的，并且在不背离当前所公开的主题的范围的情况下，可以使用多种改变、修改和变化。
实施例1
纳米级配位聚合物核-壳纳米颗粒共递送奥沙利铂和SN38
胆固醇-缀合的SN38(Chol-SN38)的合成：
图1总结了chol-SN38的合成。将胆固醇与琥珀酸偶联，然后偶联至作为离去基团的对硝基苯酚。通过三甲基甲硅烷基保护SN-38的羟基。然后，在碱的存在下混合两种化合物以获得Chol-SN38。
氯甲基4-硝基苯基碳酸酯的合成：
Figure BDA0004189627750000511
在氮气保护下，在500mL圆底烧瓶中，将10g(72mmol)4-硝基苯酚溶于200ml无水二氯甲烷(DCM)。然后，将20mL(115mmol，1.6当量)二异丙基乙胺(DIPEA)添加至烧瓶并将烧瓶在冰浴中冷却。将10mL(14.5g，115mmol，1.6当量)氯甲基氯甲酸酯滴加至所述溶液。然后，将溶液在室温下搅拌2h。2h反应后，浅黄色消失并且最终溶液转变为深红粉色。用200mL水清洗溶液两次，随后用200mL 1M HCl和另外200mL水清洗，再用200mL饱和NaCl清洗。然后，将有机相用无水Na2SO4干燥2h。在旋转蒸发仪上浓缩溶液以除去DCM并获得作为粗产物的深红色的油。
将600mL 10:1己烷:异丙醚添加至粗产物并加热至沸腾以获得浅黄色或无色溶液和深红色沉淀。将溶液转移至另一个烧瓶并在-20℃冰箱冷却过夜。在冰箱中形成无色或浅黄色针状晶体并作为纯产物收集。可以将己烷/异丙醚溶液进一步浓缩以获得更多产物。产率：13.5g(58mmol，81％)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3):δ＝5.85(s,2H),7.42(d,J＝8Hz,2H),8.30(d,J＝9Hz,2H)。这些NMR数据与文献报道一致(J.Org.Chem.1997,62,5,1356–1362)。
胆甾醇琥珀酸单酯的合成：
Figure BDA0004189627750000521
将8g(20mmol)胆固醇、6g琥珀酸酐(60mmol，3当量)、400mg N,N-二甲基吡啶(DMAP，3.25mmol，作为催化剂)、6mL DIPEA(35mmol，1.75当量)在250mL无水THF中混合并在氮气下回流48h以获得深黄色/红色溶液。然后，在旋转蒸发仪上蒸发所有溶剂以获得作为粗产物的白色-褐色固体。
使用100mL四氢呋喃(THF)，将粗产物转移至500mL烧瓶。将150mL饱和NaHCO3溶液加入至烧瓶并将混合物搅拌3h直到不再产生气泡。然后，用1M HCl中和混合物直至pH<5，以获得具有气泡的浅棕色液体-固体混合物。用200mL乙酸乙酯(EtOAc)萃取混合物三次，并且通过200mL 1M HCl进一步清洗合并的有机相两次和用200mL饱和NaCl清洗。用无水Na2SO4干燥EtOAc溶液2h并蒸发以获得浅棕色固体。将固体溶于100mL沸腾的EtOAc并在-20℃冰箱冷却过夜。形成白色晶体并作为纯产物收集。产率：9.8g(20mmol，100％)。
1H-NMR(500MHz,CDCl3):δ＝0.5–2.35(m,43H),2.62(t,2H),2.69(t,2H),4.63(m,1H),5.38(d,1H,J＝4.4Hz)。HRMS:m/z＝504.4040([M+NH4]+)。这些光谱数据与文献报道一致(J.Med.Chem.2010,53,21,7632–7638)。
碘甲基4-硝基苯基碳酸酯的合成：
Figure BDA0004189627750000522
将7g(30mmol)氯甲基4-硝基苯基碳酸酯和14g(90mmol，3当量)NaI溶于300mL无水乙腈并在50℃，在氮气下搅拌24h。溶液转变为浅黄色并形成白色沉淀(NaCl)。用旋转蒸发仪除去溶剂并将固体进一步真空干燥2h。将300mL DCM加入至干固体以提取产物。过滤DCM溶液以除去NaCl和NaI固体并浓缩以获得作为粗产物的淡黄色油或固体。在随后的步骤中使用粗产物而未进一步纯化。
20-O-三甲基甲硅烷基SN38的合成：
Figure BDA0004189627750000531
将5g(12.7mmol)SN38与25mL无水DCM和25mL N,O-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺混合。将混合物在氮气下回流72h。在反应期间，SN38逐渐溶解以形成深红色溶液。通过TLC监测反应(3:1DCM:EtOAc，在UV光下可见)以确定所有SN38被转化为双-TMS-SN38。使用旋转蒸发仪干燥溶液，然后进一步真空干燥。将褐色固体(双-TMS-SN38)溶于100mL DCM和100mL甲醇并在室温下搅拌6h，通过TLC监测反应直至所有双-TMS-SN38被转化为20-O-TMS-SN38。然后，干燥溶液以获得作为粗产物的深黄色/棕色固体。在高真空下进一步干燥粗产物以除去甲醇，然后直接用于随后步骤而未进一步纯化。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ9.74(s,1H),8.13(d,J＝9.1Hz,1H),7.57(s,1H),7.51(dd,J＝9.1,2.6Hz,1H),7.47(d,J＝2.6Hz,1H),5.70(d,J＝16.4Hz,1H),5.28(d,J＝16.3Hz,1H),5.23(s,2H),3.05(d,J＝7.6Hz,2H),1.85(dd,J＝7.3,2.3Hz,2H),1.32(t,J＝7.6Hz,3H),0.88(t,J＝7.3Hz,3H),0.21(s,11H)。13C NMR(126MHz,CDCl3)δ172.26,157.87,156.81,152.37,148.83,146.71,144.42,143.87,131.68,129.00,128.77,126.95,122.98,117.92,105.61,98.53,77.33,77.07,76.82,75.90,65.84,49.57,32.55,23.20,13.60,7.78,2.15,1.91,1.67。HRMS:m/z＝465.1850([M+H]+的预期值：465.1767)。
胆甾基-5-烯-3-醇((((4-硝基苯氧基)羰基)氧)甲基)琥珀酸酯(胆固醇接头)的合成：
Figure BDA0004189627750000532
将粗碘甲基4-硝基苯基碳酸酯(来自7g，30mmol氯甲基4-硝基苯基碳酸酯，1.5当量)溶于250mL无水甲苯中，然后将9.8g(20mmol，1当量)胆甾醇琥珀酸单酯加入至该溶液。将混合物边加热边搅拌直至所有固体溶解。然后，将5.6g(20mmol，1当量)Ag2CO3添加至溶液并将溶液在80℃，在氮气保护下避光搅拌24h。用硅藻土过滤具有黑色沉淀的所得浅黄色溶液并浓缩以获得淡黄色油。使用二氧化硅，通过柱色谱法进一步纯化产物。将30％己烷的DCM溶液用于洗脱前两个斑点，然后改变为纯DCM以分离产物。产率：7g(10mmol，50％)。1HNMR(500MHz,氯仿-d)δ8.32–8.27(m,2H),7.47–7.41(m,2H),5.90(s,2H),5.35(dt,J＝5.3,1.7Hz,1H),4.66–4.57(m,1H),2.75(ddd,J＝7.3,5.8,1.2Hz,2H),2.67(ddd,J＝7.3,6.0,1.2Hz,2H),2.32(dd,J＝7.3,1.8Hz,2H),2.05–1.92(m,2H),1.89–1.80(m,3H),1.65–0.79(m,40H),0.68(s,3H)。13C NMR(126MHz,CDCl3)δ171.27,170.91,155.08,151.45,145.64,139.48,125.39,122.83,121.78,82.49,77.34,77.09,76.83,74.69,56.66,56.14,50.01,42.32,39.72,39.55,38.03,36.97,36.59,36.21,35.82,31.91,31.86,29.13,28.99,28.26,28.04,27.72,24.31,23.87,22.87,22.61,21.05,19.31,18.75,11.88。ESI-MS:m/z＝699.4226([M+NH4]+的预期值：699.4221)。
7-乙基-10-(((((胆甾基-5-烯-3-氧)-4-氧基丁酰基)氧)甲氧基)-羰基)氧基-20-O-三甲基甲硅烷基喜树碱(Chol-SN38)的合成：
Figure BDA0004189627750000541
将7g(10mmol)胆固醇接头和来自5g SN38(12.7mmol，1.27当量)的粗20-O-TMS-SN38溶于250mL无水DCM。将10mL(60mmol，6当量)DIPEA加入至该溶液并在氮气保护下将溶液在室温下搅拌24h。用500mL DCM稀释所得深红色溶液，并用饱和NaHCO3清洗三次，随后用1M HCl和饱和NaCl清洗。然后，用无水Na2SO4干燥有机层2h并通过旋转蒸发仪浓缩。使用二氧化硅，通过柱色谱法进一步纯化产物。用15:1DCM:EtOAc洗脱产物。得率：8g(8mmol，80％)。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ8.28(d,J＝9.2Hz,1H),7.96(d,J＝2.6Hz,1H),7.68(dd,J＝9.2,2.6Hz,1H),7.52(s,1H),5.93(s,2H),5.68(d,J＝16.6Hz,1H),5.34–5.19(m,5H),4.61(dt,J＝7.8,2.2Hz,1H),3.16(d,J＝7.7Hz,2H),2.79–2.73(m,2H),2.70–2.63(m,2H),2.30(d,J＝7.7Hz,2H),2.02–1.73(m,8H),1.63–0.74(m,50H),0.63(s,3H)。13C NMR(126MHz,CDCl3)δ171.92,171.24,170.93,157.59,152.34,152.28,151.76,149.47,147.58,146.26,145.47,139.43,132.45,127.43,127.35,124.34,122.74,119.00,114.08,98.27,82.44,77.30,77.05,76.79,75.82,74.64,65.93,56.65,56.16,49.96,49.32,42.27,39.71,39.49,38.00,36.92,36.53,36.16,35.79,32.75,31.84,31.79,29.70,29.13,29.01,28.22,28.01,27.70,24.26,23.88,23.21,22.83,22.57,20.98,19.28,18.70,14.02,11.83,7.89,2.11,1.87,1.63。ESI-MS:m/z＝1007.5456([M+NH4]+的预期值：1007.5375)。
OxPt/SN38核-壳纳米颗粒的合成和表征：
将强效拓扑异构酶1抑制剂SN38通过酸敏感和酶促可裂解的缩醛接头缀合至胆固醇以形成Chol-SN38。将大但酸敏感的三甲基甲硅烷基(TMS)基团在SN38的O-20位加入至Chol-SN38以破坏二维SN38部分的强π-π堆叠并驱使稳定脂质涂层在NCP核上的形成。以两步制备核-壳NCP颗粒OxPt/SN38。参见图2。首先，将Pt(dach)(草酸根)(双磷酰胺酸)(OxPt-bp)(Duan,X.；et al.Nat.Commun.2020,10:1899)首先与Zn2+离子在DOPA的存在下在含有Triton X-100/己醇/环己烷的反相微乳液中共聚以形成DOPA-封端的裸NCP颗粒(裸OxPt)。将裸OxPt颗粒在四氢呋喃中单分散，如在透射电子显微镜术(TEM)下所观察的。参见图3A。动态光散射(DLS)测量显示裸OxPt的Z均直径为49.0±3.0nm并且多分散指数(PDI)为0.17±0.03。参见图3B。裸OxPt显示出高稳定性，而且在室温下在四氢呋喃中，在24h内无粒径和PDI变化。参见图3C。
然后，将Chol-SN38与胆固醇、DOPC和DSPE-PEG2000一起引入裸OxPt表面上的脂质层以形成核-壳NCP颗粒OxPt/SN38。将0.21mg胆固醇、0.42mg DOPC、0.75mg DSPE-PEG2k、0.2mg chol-SN38和0.5mg裸OxPt NCP颗粒(Duan,X.；et al.Nat.Commun.2020,10:1899)在80uL THF中混合并50℃下以1700rpm搅拌添加至500μL 30％EtOH。将混合物浓缩至100μL以获得OxPt/SN38核-壳纳米颗粒。将OxPt/SN38颗粒在水溶液中单分散，如在TEM下所观察的。参见图4A。通过DLS，OxPt/SN38颗粒的Z均直径和PDI为111.6nm和0.138。参见图4B。OxPt/SN38颗粒与5mg/mL牛血清白蛋白(BSA)在PBS中稳定，而且在37℃下24h无尺寸或PDI变化。参见图4C。
OxPt/SN38将Chol-SN38输送至LDL
LDL是胆固醇和胆固醇酯向外周细胞的关键转运体。假设LDL将强结合至Chol-SN38以增强其通过LDLR介导的内吞向肿瘤的递送。等温滴定量热法(ITC)测量显示Chol-SN38与LDL强结合，结合常数(Ka)为(4.97±0.24)×105M-1，它比Chol-SN38和白蛋白之间的结合亲和力高>2000倍。参见下表1。有趣地，用OxPt/SN38滴定LDL也导致放热结合，表观Ka为(3.34±1.30)×104M-1。OxPt/SN38对白蛋白显示出低亲和力，表观Ka为27.5±1.8M-1。参见下表1。据信OxPt/SN38与LDL的明显的高亲和力是由于chol-SN38从OxPt/SN38向LDL的输送。
表1.Chol-SN38和颗粒与血浆蛋白的结合常数。
Figure BDA0004189627750000561
确定了两个对照颗粒，无chol的OxPt NCP和Chol-SN38胶束(无NCP核)的表观LDL结合亲和力以理解这些颗粒的哪些组分结合至LDL。尽管Chol-SN38胶束颗粒显示出与OxPt/SN38颗粒几乎相同的对LDL的结合亲和力，但是无chol的OxPt NCP显示出对LDL低一个数量级的结合亲和力。参见上表1。这些结果支持以下观点：Chol和Chol-SN38可以从NCP和胶束颗粒输送至LDL。
使用具有其体积10％的球状LDL颗粒切片进行分子动力学(MD)模拟以阐明LDL和Chol-SN38或SN38之间的原子水平的相互作用。计算了将Chol-SN38或SN38从整体水向LDL脂质核输送的平均力势。Chol-SN38的平均力势在LDL中的几乎每个位置显著降低并且在POPC和溶血PC的疏水核和亲水壳的界面处(距疏水核中心～4nm)降低最多达～80KJ/mol。参见图5A。相反，SN38的平均力势不降低直至接近LDL的疏水核的中心(<2nm)。因此，MD模拟结果确认了Chol-SN38和LDL核之间的强吸引疏水/疏水相互作用。
然后，在大鼠血浆中，在37℃，确定了Chol-SN38、OxPt/SN38和SN38对LDL的结合动力学。尽管在血浆中，Chol-SN38在1h内快速结合至LDL并以74.5±3.6％的chol-SN38结合至LDL达到平衡(参见图5B)，但是OxPt/SN38显示出chol-SN38向LDL的缓慢输送，而且在3h达到了类似相当的78.6±3.1％的Chol-SN38结合至LDL。相反，仅17.1±1.5％的SN38显示出结合至LDL。这些结果证实了在血浆中，Chol-SN38与LDL的强结合以及Chol-SN38从OxPt/SN38向LDL的输送。
在37℃，在大鼠血浆中培育3h后，通过LC-MS定量了SN38、Chol-SN38和OxPt/SN38在多种脂蛋白中的分布。通过NaBr梯度超速离心法，基于它们的密度分离脂蛋白。SN38主要分布在白蛋白部分(69％)并且仅在LDL部分(17％)和HDL(14％)中稍有分布，而Chol-SN38主要分布在LDL部分(86％)中，不到1％的Chol-SN38分布在白蛋白部分中，9％的Chol-SN38分布在VLDL中并且5％分布在HDL中。有趣地，OxPt/SN38中的Chol-SN38被有效输送至脂蛋白，其中74％在LDL中，19％在VLDL中并且7％在HDL中。据观察OxPt/SN38中不到1％的Chol-SN38处于白蛋白部分中。由于超速离心程序，有可能一些OxPt/SN38颗粒被分离至VLDL部分。
OxPt/SN38在SD大鼠上的体内药代动力学显示出长Chol-SN38血液循环，其半衰期(t1/2)为9.7±1.0h且曲线下面积(AUC0→t)为1874.6±44.9μg/ml*h。参见图5C。测定了每个时间点不同血浆蛋白中Chol-SN38的分布并且对于LDL结合的Chol-SN38，发现AUC0→t为871.6±30.8μg/ml*h，其占总AUC0→t的46.5±0.5％。参见图5C。因此，LDL显著有助于Chol-SN38在OxPt/SN38颗粒中延长的循环。ITC分析、MD模拟、脂蛋白分离和体内PK研究一起显示在血浆中，Chol-SN38与LDL的强结合和Chol-SN38从OxPt/SN38颗粒向LDL的有效输送，从而表明操纵LDL用于高亲脂性药物和前体药物向肿瘤的增强递送的潜力。
LDLR介导的内吞决定了肿瘤细胞对OxPt/SN38的吸收
LDL中的Apo B-100蛋白是LDLR的强配体并且负责胆固醇通过LDLR介导的内吞向外周细胞的有效输送。为了确认NCP吸附Apo B-100的能力，将ZnP NCP与Apo B-100蛋白培育3h。通过0.01M乙酸沉淀未结合的Apo B-100，而NCP结合的Apo B-100保持在溶液中。在离心后，通过BCA测定测量了上清液中Apo B-100的量。随着NCP浓度增加，NCP结合的Apo B-100的量升高。参见图6。通过10mg ZnP颗粒捕获了80.7±2.5％的Apo B-100。对于无胆固醇的ZnP颗粒，Apo B-100结合能力降低至26.4±4.5％。这些结果支持胆固醇调节NCP结合至Apo B-100及其向肿瘤的潜在主动吸收的作用。
使用荧光标记的LDL(Dil-LDL)和在壳中具有作为Chol-SN38替代物的Chol-pyro并且在核中具有作为OxPt替代物的Ce6的NCP颗粒，确认了肿瘤细胞通过LDLR介导的内吞对NCP颗粒的吸收。MC38细胞对Chol-pyro NCP和Ce6 NCP两者的吸收水平随着抗LDLR抗体(a-LDLR)的LDLR阻断以剂量成比例的方式降低。参见图7A和图7B。通过LDLR阻断，通过MC38细胞的Dil-LDL吸收以与Chol-pyro NCP和Ce6 NCP相同的百分比降低，从而表明LDLR介导的内吞在NCP的细胞吸收中起主要作用。与野生型MC38细胞相比，LDLR敲除(KO)MC38细胞显示出低得多的Chol-pyro NCP(5％)和Ce6 NCP(15％)的吸收。参见图7C。这些结果表明LDLR介导的内吞在NCP的细胞吸收中起主要作用。
通过CLSM显像并确定了Chol-pyro NCP和LysoTracker的共定位以及Chol-pyro的细胞吸收水平。参见图8A。在24h培育后，Chol-pyro(红色)与核内体/溶酶体共定位，皮尔逊R值(Pearson’s R value)＝0.91。
为了研究药物通过LDLR介导的内吞在肿瘤内的积累，在静脉内注射200μg Chol-pyro NCP并且在瘤内注射和不注射1μg a-LDLR后24h或48h，确定了来自具有MC38的C57BL/6小鼠的肿瘤切片的Chol-pyro荧光信号。在24和48h时间点，a-LDLR的施用将chol-pyro信号分别降低了52.9±1.5％和60.2±6.2％。对于与LDLR阻断有关的胞内chol-pyro信号的流式细胞术分析，还将肿瘤消化成单细胞混悬液。流式细胞结果显示在LDLR阻断的肿瘤细胞中，在24和48h时间点，Chol-pyro水平分别降低67.7±1.1％和69.0±0.4％。参见图8B。
在同时瘤内注射和不注射1μg a-LDLR的情况下，在静脉内注射3.5mg/kg OxPt/SN38(基于OxPt当量)后，定量确定了MC38肿瘤中的药物积累。参见图9A和图9B。在无LDLR阻断的情况下，OxPt/SN38在肿瘤中显示出290.3±13.4h·μg/ml的Pt AUC 0→t和50.8±4.2h·μg/mL的SN38AUC 0→t，它是在当量OxPt和/或SN38剂量下的游离OxPt的4.9倍并且是游离伊立替康的6倍。通过LDLR阻断，OxPt AUC 0→t降低72％并且SN38 AUC 0→t降低90％，从而提供了分别与OxPt和伊立替康相当的药物积累水平。尽管OxPt/SN38将肿瘤内药物浓度维持在多种结肠癌细胞系(CT26、MC38、HT29、HCT116和SW480)的IC50值以上达72h，但是LDLR阻断的OxPt/SN38或者游离药物不能将肿瘤内药物浓度维持在IC50值以上超过24h。这些结果证实通过Apo B-100吸附至NCP颗粒靶向LDLR并将chol-SN38体内输送至LDL，OxPt/SN38显著提高了肿瘤内OxPt和SN38浓度。
OxPt-SN38在结肠癌细胞系中的体外细胞毒性：
将小鼠结直肠癌CT26和MC 38细胞以2500个细胞/孔接种到96孔板中24h。将奥沙利铂、SN38、伊立替康、SN38-TMS、chol-SN38、OxPt/SN38以多种浓度剂量施加剂量至每个孔中并将细胞培育另外的48h。通过MTS测定测量细胞存活力。
如下表2所列，OxPt和SN38两者对CT26和MC38细胞具有高毒性，而伊立替康具有IC50接近80uM的较低毒性。Chol-SN38和SN38-TMS比SN38毒性低，因为它们需要释放SN38以发挥毒性。OxPt/SN38颗粒显示出低IC50值，从而表明在颗粒上的OxPt和chol-SN38之间存在协同作用。
表2.OxPt和SN38在CT26和MC38细胞中的IC50值(μM)。
Figure BDA0004189627750000591
a括号中的数字表示SN38 IC50值。
OxPt/SN38在HT29、HCT116和SW480的人CRC细胞中显示出类似的协同细胞毒性。OxPt/SN38也比OxPt或伊立替康具有更强的细胞毒性。Chol-SN38的细胞毒性比伊立替康强5-10倍，但是由于SN38通过酸和酯酶引发的水解过程的缓慢释放，其比SN38的细胞毒性低。有趣地，尽管SN38-TMS显示出强细胞毒性，对于CT26和MC38细胞的IC50值分别为8.01±1.73和7.60±0.20μM，但是这种细胞毒性可能来自SN38-TMS原位水解产生的SN38，因为在高至300μM的浓度，类似的SN38衍生物20-O-叔丁基-SN38(SN38-tBu)和20-O-Boc-SN38(SN38-Boc)未显示细胞毒性。
还通过流式细胞术对OxPt和/或SN38处理的细胞实施了细胞凋亡/坏死分析。OxPt/SN38颗粒处理的细胞显示出高得多的细胞凋亡百分比(47.8％，分别相比于OxPt和SN38的12.1％和34.8％)，这支持颗粒上OxPt和chol-SN38之间的协同作用。类似的趋势还存在于游离药物组，这支持两种协同药物从组合纳米颗粒的体外释放。
通过对于细胞凋亡的膜联蛋白V-FITC染色和对于细胞坏死的PI染色，评价了OxPt/SN38诱导的细胞死亡的机制。参见图10A。OxPt和SN38两者诱导了通过细胞凋亡/坏死的程序性细胞死亡。OxPt和SN38的组合提高了早期凋亡的膜联蛋白V+/PI-细胞(28.4±1.2％，相比于OxPt的8.0±0.6％和SN38的25.7±1.5％)。类似地，OxPt/SN38提高了晚期凋亡/坏死膜联蛋白V+/PI+细胞的百分比(34.5±3.8％，分别相比于OxPt NCP的4.9±0.6％和ZnP/SN38的16.4±0.9％)。
分析了处理的MC38细胞的细胞周期分布以评价DNA破坏。用OxPt NCP和ZnP/SN38处理的MC38细胞分别显示出32.6±0.2％和53.9±4.9％的S期阻滞。参见图10B。相比之下，对于PBS对照，25.3±3.1％的细胞处于S-期。OxPt/SN38显示出63.8±3.8％的更强的S期阻滞。因此，对于抗增殖作用，OxPt/SN38颗粒有效引起DNA破坏并抑制DNA复制。
通过JC-1染色的流式细胞分析显示与PBS对照相比，用OxPt/SN38处理MC38细胞24h导致线粒体膜电位去极化升高5倍。参见图10C。线粒体膜完整性丧失将细胞色素C释放到胞液中以用于激活半胱天冬氨酸酶-9和半胱天冬氨酸酶-3，从而引起细胞凋亡。分别用以商品名MITOTRACKERTM出售的染料(Molecular Probes,Eugene,Oregon,美国)(红色荧光)和FITC缀合的抗细胞色素C抗体(绿色荧光)对处理的MC38细胞的线粒体和细胞色素C进行染色。CLSM成像显示OxPt/SN38处理引起了MITOTRACKERTM染料和抗细胞色素C抗体信号的明显分离，皮尔逊R值为0.27，表明细胞色素C从线粒体的显著释放。
SN38从chol-SN38和SN38-TMS的释放：
为了确认OxPt/SN38颗粒负载的chol-SN38可以体内释放SN38，在PBS或大鼠血浆中稀释OxPt/SN38颗粒以制备200ppm chol-SN38的溶液并将溶液在37℃培育。在1h、5h和24h收集样品并用乙酸乙酯萃取。使用LC-HRMS分析有机层以确定SN38、TMS-SN38和chol-SN38的百分比。当在PBS中培育时，发现在24h后SN38无显著释放，而利用大鼠血浆中的酯酶，约53.86％chol-SN38分解成TMS-SN38或SN38。参见下表3。该实验证实SN38-TMS和SN38可以体内释放。
表3.SN38-TMS和SN38从OxPt/SN38颗粒的释放。
Figure BDA0004189627750000601
将SN38-TMS在模拟内涵体的酸性条件中在37℃培育。在pH＝5.5，70％的SN38-TMS在24h内被转化为SN38，并且92％的SN38-TMS在48h内被转化为SN38。该结果显示当吸收到内涵体中时，由于内涵体中的低pH，SN38-TMS可以容易地被转化为SN38。SN38从SN38-TMS的释放在生理学pH(7.4)下较缓慢：培育24h释放26％的SN38，而培育48h释放63％的SN38。
OxPt和SN38从OxPt/SN38的肿瘤反应性释放
在pH＝4.7，在20-OTMS和碳酸酯键两者处水解来自OxPt/SN38的chol-SN38，从而以95％的得率在72h内释放SN38。参见图11A。然而，在pH＝7.4，在72h从OxPt/SN38释放可忽略的量的SN38。参见图11B。还参见图12A。另一方面，已知肿瘤细胞中的羧酸酯酶有助于SN38从伊立替康的释放。在具有10单位/mL酯酶的PBS中测试了SN38从OxPt/SN38的释放。在0.5h，28％的Chol-SN38水解为SN38-TMS。72h后，仅13％的Chol-SN38保留，而分别以80％和7％的得率产生了SN38-TMS和SN38。这些结果表明了SN38从核内体/溶酶体中内吞的OxPt/SN38的释放的双重激活机制：在低pH，20-OTMS快速水解以生产无TMS的Chol-SN38，其在碳酸酯键进一步水解以提供SN38。参见图13。同时，癌细胞中的酯酶水解碳酸酯键以提供SN38-TMS，其通过质子/TMS交换被转化为SN38。chol-SN38的肿瘤反应性可以使强效SN38的血液暴露潜在最小化，因此减轻与伊立替康治疗有关的常见不良事件，如中性粒细胞减少。
已知通过Zn2+离子和OxPt-bp所形成的NCP核在酸性环境中崩解。参见图14A。在pH＝7.4和37℃，OxPt/SN38在48h的过程中释放小于6％的Pt。在pH＝4.7和37℃，OxPt/SN38颗粒以5h内82％的得率和48h内95％的得率快速崩解以释放Pt(dach)(草酸根)(双氨基甲酸酯)(OxPt-bc)。参见图12B。在5mM抗坏血酸的存在下，所释放的OxPt-bc被有效还原以形成OxPt。在pH＝4.7，在具有5mM抗坏血酸的PBS中，OxPt/SN38中的OxPt-bp前体药物被还原，从而在5h中以70％的得率提供OxPt。参见图14B。这些结果证实了SN38和OxPt两者在癌细胞中的引发释放。
Sprague Dawley大鼠中的药代动力学(PK)：
以2.0mg OxPt/kg剂量，通过尾静脉将OxPt/SN38静脉内(i.v.)注射至三只Sprague Dawley大鼠，并在5min、0.5h、1h、3h、5h、8h、24h和48h从每只大鼠收集400uL血液样品。将血液样品以10000rpm离心10min并收集血浆用于分析。将200μL不含金属的浓硝酸加入至50μL血浆并培育48h用于完全消化。通过ICP-MS测量消化血浆的Pt浓度。参见图2A。通过100μL饱和NaCl溶液和100μL 0.5％triton X-100水溶液稀释另外的50μL血浆，然后用200μL乙酸乙酯萃取。然后，使用LC-HRMS分析有机层的chol-SN38、SN38-TMS和SN38浓度。
如图15A和图15B以及下表4所示，颗粒核中的OxPt显示出长循环，t1/2大于30h并且Pt AUC0→∞为574μg/ml*h，而颗粒表面层上的chol-SN38显示t1/2为8h并且AUC0→∞为1924μg/ml*h。在血浆中检测到TMS-SN38和SN38，半衰期分别为5.3h和2.2h，并且AUC0→∞值分别为19μg/ml*h和4.4μg/ml*h。因此，Chol-SN38可以在循环期间缓慢释放TMS-SN38和SN38以将SN38的有效浓度维持持续的一段时间。
表4.OxPt/SN38在Sprague Dawley大鼠中的药代动力学
Figure BDA0004189627750000621
具有肿瘤的小鼠中的PK和生物分布(BD)
将100万个CT26细胞接种至6周大的balb/c小鼠的右侧腹，并且当肿瘤尺寸达到大于200mm3(约14天)时，以4mg OxPt/kg的剂量静脉内注射OxPt/SN38，在注射后1h、8h、24h、48h和72h收集小鼠的肿瘤。以与以上对于大鼠PK所描述的相同方式分析血液样品。将肿瘤切成小于1mm3的碎片并搅拌以良好混合，然后称量约20mg肿瘤碎片并用于分析。为了确定OxPt分布，将20mg肿瘤样品加入至200μL不含金属的浓硝酸并在80℃培育1h并在室温下培育72h。然后，将6.8mL去离子水加入至每个样品以将其稀释成2％的硝酸溶液，然后进行ICP-MS分析。为了确定SN38、SN38-TMS和chol-SN38浓度，用100μL饱和NaCl溶液和100μL0.5％triton X-100水溶液将每种20mg样品均质化，然后用200μL乙酸乙酯萃取。收集乙酸乙酯层进行LC-HRMS分析以确定SN38、SN38-TMS和chol-SN38浓度。
在注射后24h，肿瘤具有9.7％ID/g的最高Pt浓度。参见图16A和图16B。在注射后24h，Chol-SN38具有～5％ID/g的最高肿瘤积累。Chol-SN38通过TMS-SN38中间体缓慢释放SN38。在注射后48h，肿瘤中的SN38浓度维持在130ng/ml，其高于SN38的IC50(86ng/ml)。对于静脉内注射3mg/kg OxPt剂量的OxPt/SN38的具有肿瘤的小鼠，血浆中SN38的AUC0→∞为约12μg/ml*h并且肿瘤中达到8.09±0.12μg/ml*h。参见下表5。
表5.以3mg OxPt/kg剂量静脉内注射OxPt/SN38的小鼠中的血浆和肿瘤的药代动力学。
Figure BDA0004189627750000631
体内毒性和效力
以多种剂量水平对大鼠和小鼠静脉内注射OxPt/SN38并且监测它们的体重以确定药物可耐受性。参见图17。
对于以3mg/kg OxPt，每三天一次(Q3D)剂量施用OxPt/SN38的小鼠，在重复处理期间无体重减轻，表示这种剂量方案良好耐受。为了确定对结肠癌模型的效力，将100万个MC38细胞接种到6周大C57bl/6小鼠的右侧腹，并且当肿瘤尺寸达到约100mm3时，在第7天开始处理。以Q3D时间表，以3mg/kg的等价OxPt剂量，对小鼠剂量施用OxPt/SN38、OxPt NCP(在核中仅有OxPt前体药物的颗粒)、ZnP/SN38(在壳上仅具有Chol-SN38的颗粒)和OxPt加伊立替康。还在OxPt/SN38组之一中，腹膜内剂量施用75μg抗-PD-L1抗体。如图18所示，OxPt NCP和ZnP/SN38两者延缓肿瘤生长。OxPt/SN38显示显著更好的抗肿瘤效力。抗-PD-L1抗体向OxPt/SN38处理的添加进一步增强了抗肿瘤效力以有效控制肿瘤。该结果显示了在免疫检查点阻断剂和OxPt/SN38处理之间的协同作用。
在用以Q3D时间表，3mg/kg OxPt和Q7D时间表，6mg/kg OxPt的另一个实验中，确认了OxPt/SN38对MC38肿瘤的抗癌效力。两种方案有效控制MC38肿瘤的生长。参见图19。对于植入Balb/c小鼠的CT26肿瘤观察到了类似的肿瘤生长抑制。参见图20A。显著地，具有HT29肿瘤的裸鼠的OxPt/SN38处理显示以Q3D时间表，以3mg/kg的OxPt剂量，肿瘤持续消退。参见图20B。在所有这些处理的小鼠中未观察到显著体重减轻，表明以Q3D时间表，3mg/kg OxPt或者以Q7D时间表，3mg/kg OxPt的重复OxPt/SN38剂量是小鼠良好耐受的。
对皮下MC38和CT26小鼠和HT29、HCT116和SW480人结直肠腺癌模型实施了对OxPt/SN38的其它体内抗癌研究。当肿瘤体积达到80-120mm3时，每三天一次(Q3D)对小鼠静脉内注射不同处理。分别以3.5mg OxPt/kg当量和15.9mg Chol-SN38/kg(相当于6.2mg/kgSN38)、3.5mg OxPt/kg和20.2mg/kg伊立替康(11.7mg/kg SN38当量)、3.5mg OxPt/kg当量和15.9mg Chol-SN38/kg(相当于6.2mg/kg SN38)剂量施用OxPt/SN38、OxPt加伊立替康、OxPt NCP和ZnP/SN38。在所有测试的模型中，OxPt/SN38导致了显著更好的肿瘤生长抑制/消退以及根据体重、主要器官组织学以及肝和肾功能测试判断的最小毒性。
在OxPt/SN38的8次静脉内注射后，具有MC38肿瘤的C57BL/6小鼠显示出92.2％的肿瘤生长抑制(TGI，定义为1-(RTVt/RTVc)，其中RTV＝终点肿瘤体积)。尽管有1.9倍更高的SN38等价剂量，但是OxPt加伊立替康提供了22.3％的适度的TGI。OxPt NCP和ZnP/SN38分别以66.9％和16.4％的TGI值适当地抑制肿瘤生长。对于所有组，小鼠以稳定的体重良好耐受处理。
通常，中性粒细胞减少是IROX方案的最严重的副作用，其中30％mCRC患者在OxPt加伊立替康重复剂量之后经历严重的中性粒细胞减少。在8次PBS或OxPt/SN38静脉内注射或者3次OxPt加伊立替康静脉内注射后，从具有MC38肿瘤的C57BL/6小鼠采集血液样品。流式细胞术分析显示与PBS对照相比，用OxPt加伊立替康处理的小鼠中绝对中性粒细胞计数(ANC)减少，但是与PBS对照相比，用OxPt/SN38处理的小鼠稍微升高。参见图21。因此，OxPt/SN38处理克服了IROX方案中严重中性粒细胞减少的剂量限制性毒性。
通过在PBS或OxPt/SN38的8和15次剂量后，测量C57BL/6小鼠血清中的丙氨酸转氨酶(ALT)水平、天冬氨酸转氨酶(AST)水平和血清肌酐水平，确定了肝和肾功能。用OxPt/SN38处理的小鼠的AST和ALT水平比PBS对照稍微升高，但是正处于正常范围内。肌酐水平在用OxPt/SN38处理的小鼠(0.24±0.07mg/dL)和用PBS处理的那些小鼠(0.22±0.01mg/dL)之间保持不变。这些结果表明OxPt/SN38的重复剂量不会在小鼠中引起肝脏毒性和肾毒性。
在小鼠结直肠癌(CT26)模型中，OxPt/SN38、OxPt加伊立替康、OxPt NCP和ZnP/SN38分别显示出90.9±7.1％、27.6±9.9％、51.6±18.7％和29.1±19.7％的TGI值。因此，OxPt/SN38在两种药物之间显示出强协同作用，从而提供了超过其它组的增强了很多的抗癌效力。所有小鼠良好耐受处理，无明显体重降低。
OxPt/SN38还对人结直肠腺癌的小鼠异种移植模型显示出抗癌效力。对具有肿瘤的小鼠静脉内注射PBS、OxPt/SN38或OxPt加伊立替康达到16个剂量。对于HT29模型，OxPt/SN38使肿瘤消退，从而在PBS组的终点提供了99.4±0.4％的TGI。参见图22A。OxPt加伊立替康仅稍微抑制肿瘤以提供32.2±22.5％的TGI。在第45天停止OxPt/SN38处理后，HT29肿瘤又被抑制了12天，但是最终在第57天后再次生长。OxPt/SN38和OxPt加伊立替康的处理将中值存活期从PBS对照的33天分别延长至97和36天。参见图22B。以36mg Chol-SN38的剂量的ZnP/SN38还以87.0±3.9％的TGI有效抑制HT29肿瘤生长。所有组中的小鼠良好耐受处理。
OxPt/SN38还对HCT116和SW480肿瘤模型显示出抗肿瘤效力。对于HCT116模型，OxPt/SN38使肿瘤消退，从而在第18天在PBS组的终点提供了98.7±0.8％的TGI。OxPt加伊立替康在第18天显示出72.4±9.7％的TGI。参见图23A。OxPt/SN38和OxPt加伊立替康将小鼠存活期从PBS组的18天分别延长至106和40天。对于SW480模型，OxPt/SN38使肿瘤消退，从而在第17天在PBS组的终点处提供了96.9±1.0％的TGI，而OxPt加伊立替康提供了57.9±12.8％的中等TGI。参见图23B。OxPt/SN38和OxPt加伊立替康将小鼠存活期从PBS组的17天分别延长至109和32天。因此，OxPt/SN38具有独特的作用方式，对5种CRC肿瘤模型具有优良的抗肿瘤效力和优良的安全性谱。
LDLR介导的内吞决定了OxPt/SN38的抗癌效力：
研究了以Q3D时间表，静脉内注射的OxPt/SN38以及通过瘤内注射1μg a-LDLR的同时LDLR阻断的肿瘤生长抑制以确定LDLR介导的内吞对抗癌效力的作用。参见图24A。尽管相对于IgG对照，a-LDLR以40.2±19.4％的TGI减缓了肿瘤生长，但是与同时IgG注射的OxPt/SN38处理的91.2±3.8％的TGI相比，OxPt/SN38处理以及同时LDLR阻断具有51.6±5.5％的TGI的显著减弱的抗肿瘤作用。通过终点时的肿瘤重量证实了这些结果：同时IgG注射的OxPt/SN38处理显示出92％的TGI，而同时LDLR阻断的OxPt/SN38处理显示出57％的TGI。参见图24B。通过使用LDLR敲除的MC38肿瘤细胞建立皮下肿瘤确认这些LDLR阻断结果。在LDLR敲除的肿瘤中，OxPt/SN38的抗癌效力接近消除，其中在OxPt/SN38和PBS组之间无显著性差异。参见图25。
通过组织病理学分析进一步检验了对肿瘤细胞的体内细胞毒性。H&E染色显示在用OxPt/SN38处理的MC38肿瘤中坏死严重，但是在用OxPt/SN38和a-LDLR处理的MC38肿瘤中坏死更少。TUNEL和半胱天冬氨酸酶3IHC染色显示通过OxPt/SN38引起强细胞凋亡，而且当阻断LDLR时细胞凋亡急剧降低。这些结果显示LDLR介导的内吞参与OxPt/SN38体内肿瘤吸收并且对抗肿瘤效力起作用。
讨论：
数十年来，已用亲水基团修饰有机细胞毒性抗癌药(如SN38(LogP＝3.37))以使它们在水溶液中可溶或微溶。水不溶性的SN38向水溶性伊立替康盐酸盐的转化(LogP＝-0.45)代表了有机抗癌药物设计的最成功的实例之一。疏水性化疗剂与血浆蛋白的结合提供了替代方法并且可以主动靶向高表达受体。例如，白蛋白结合型紫杉醇(白蛋白-紫杉醇纳米颗粒)，在一些肿瘤中推测其通过靶向内皮细胞中的Gp60内吞转运途径并且结合至肿瘤胞外基体中酸性且富含半胱氨酸的分泌蛋白(SPARC)显示出比紫杉醇更优的效力。根据当前所公开的主题的一个方面，公开了通过主动靶向肿瘤内LDLR来共递送组合化疗的新策略。在本文中，将SN38通过不稳定的缩醛键缀合至高疏水性胆固醇(logp＝7.02)以操纵负责快速生长的肿瘤细胞所必需的胆固醇和相关衍生物的输送的脂蛋白LDL。Chol-SN38中的缩醛接头在肿瘤内通过酸和酯酶催化的水解两者选择性裂解以释放SN38。当前所公开的策略使得有可能设计通过LDRD介导的内吞进行肿瘤靶向的疏水性前体药物。
长期显示全身注射的纳米治疗剂相对于它们的母体药物延长了血液循环。先前据信由于EPR作用，长循环纳米颗粒优先积累在肿瘤内。在本文中，已表明合理设计的核-壳NCP颗粒不仅提供了亲水性OxPt-bp和疏水性Chol-SN38前体药物两者的负载，而且还主动靶向LDLR以显著增强药物在肿瘤内的吸收。Chol-SN38强烈键合至LDL，从而对于通过LDLR介导的内吞向肿瘤的主动运输，导致Chol-SN38从OxPt/SN38的壳向LDL的有效输送。SN38通过酸和酯酶催化的水解在肿瘤细胞内部选择性释放。另一方面，在血浆中OxPt/SN38吸附的Apo B-100的NCP核允许通过LDLR途径的肿瘤靶向，并且优先通过在核内体/溶酶体中酸引发的崩解和通过抗坏血酸及其它胞内还原剂的还原在肿瘤内释放OxPt。因此，在等价剂量，OxPt/SN38相对于OxPt和SN38将OxPt的肿瘤沉积显著提高了4.9倍，相对于伊立替康显著提高了6倍。
由于OxPt和SN38对CRC细胞的协同作用，IROX是mCRC的标准化疗方案之一。通过提高肿瘤内OxPt和SN38浓度，OxPt/SN38使得OxPt和SN38之间对于小鼠和人CRC细胞的体外和体内协同作用最大化。OxPt/SN38同时将DNA与OxPt交联并通过SN38抑制拓扑异构酶1，从而导致严重的DNA破坏、DNA复制抑制和线粒体膜破环。OxPt/SN38对MC38和CT26小鼠CRC肿瘤模型实现>92％的肿瘤生长抑制，并且对HT29、HCT116和SW480 CRC肿瘤模型实现>97％的肿瘤生长抑制。与PBS对照相比，对于HT29、HCT116和SW480 CRC肿瘤模型，OxPt/SN38还将小鼠的存活期分别延长了64、88和92天，并且与OxPt加伊立替康相比，分别延长了61、66和77天。OxPt/SN38在多个小鼠CRC模型中实现了优良的抗肿瘤效力而不导致严重的副作用，如中性粒细胞减少和肝和肾功能损伤。
实施例2
纳米级配位聚合物核-壳纳米颗粒共递送奥沙利铂和紫杉醇
胆固醇-紫杉醇(Chol-PTX)的合成：
Figure BDA0004189627750000671
将1g(1.5mmol)胆固醇接头和紫杉醇(1.3g，1.5mmol，1当量)溶于50mL无水DCM。将1mL(6mmol，4当量)DIPEA加入至该溶液并在氮气下将溶液在室温下搅拌24h。用100mL DCM稀释所得深黄色溶液，并用饱和NaHCO3清洗三次，随后用1M HCl和饱和NaCl清洗。然后，用无水Na2SO4干燥有机层2h并通过旋转蒸发仪浓缩。使用硅胶，通过柱色谱法进一步纯化产物。用1.5:1己烷:EtOAc洗脱产物。产率：0.36g(0.26mmol，17％)。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ8.13(d,2H),7.75(d,2H),7.53(m,1H),7.37-7.43(m,10H),7.08(d,1H),6.29(s,2H),6.02(d,1H),5.78(dd,2H),5.73(d,1H)5.47(d,1H),5.38(d,1H),4.95(d,1H),4.62(m,1H),4.45(m,1H),4.28(dd,2H),3.85(d,1H),2.10-2.90(m,16H),0.80-2.10(m,52H),0.67(s,3H)。ESI-MS:m/z＝1413.7263([M+NH4]+的预期值：1413.7255)。
确定Chol-PTX的IC50值为3.95μM，相比之下LL/2肺癌细胞的IC50为0.24μM。
OxPt/PTX核-壳纳米颗粒的合成和表征：
将0.21mg胆固醇、0.42mg DOPC、0.75mg DSPE-PEG2k、0.25mg chol-PTX和0.5mgOxPt裸NCP颗粒在80μL THF中混合并在50℃，在1700rpm搅拌下添加至500μL 30％EtOH中。将混合物浓缩至100μL以获得OxPt/PTX核-壳纳米颗粒。通过DLS，OxPt/SN38颗粒的Z均直径和PDI为101.1nm和0.093。
实施例3
纳米颗粒递送鬼臼毒素
胆固醇-鬼臼毒素(Chol-PPX)的合成：
Figure BDA0004189627750000691
将PPX(0.41g)和DIPEA(0.13g)在无水DCM(100mL)中混悬。在冰水浴中，将氯甲基氯甲酸酯(0.13g)加入至PPX混悬液，并将所得混合物在室温下搅拌24h。用水(3×20mL)和盐水(3×20mL)清洗溶液，然后用无水Na2SO4干燥。减压蒸发有机溶剂并将所得PPX-Cl真空干燥过夜(得率：0.33g，65％)。
将PPX-Cl(0.51g)溶于无水丙酮(75mL)。然后，添加NaI(0.15g)。将混合物在50℃避光搅拌24h。除去有机溶剂，将产物重新溶于乙醚(150.0mL)。用10％Na2SO3(3×20mL)、水(3×20mL)和盐水(3×20mL)清洗溶液，然后用无水Na2SO4干燥。减压蒸发有机溶剂并将所得PPX-I真空干燥过夜(得率：0.50g，83％)。
将胆固醇-COOH(0.49g)溶于乙腈(20mL)。在冰水浴中，将溶于乙腈(50mL)的PPX-I(0.60g)滴加至胆固醇-COOH溶液，随后添加过量碳酸银(2.76g)。将混合物在80℃搅拌36h。在过滤除去沉淀后，除去有机溶剂。将残余物重新溶于乙酸乙酯(100.0mL)，并用10％NaHCO3(3×20mL)、水(3×20mL)和盐水(3×20mL)清洗溶液，然后用无水Na2SO4干燥。减压蒸发有机溶剂，并使用DCM:乙酸乙酯(3:1)作为洗脱液通过硅胶快速柱色谱纯化粗产物以提供chol-PPX(产率：0.29g，30％)。1H NMR(500MHz,CDCl3):0.66-2.05(m,41H,胆固醇),2.30(d,2H,CH2),2.64(t,2H,CH2),2.72(t,2H,CH2),2.94(m,2H,CH,CH),3.74(s,6H,CH3,CH3),3.80(s,3H,CH3),4.23(t,1H,CHH),4.49(t,1H,CH),4.60(m,2H,CH,CHH),5.34(m,1H,OCH),5.82(m,3H,CH,OCH2O),5.99(d,2H,OCH2O),6.37(s,2H,CH,CH),6.54(s,1H,CH),6.87(t,1H,CH)。[M+NH4]+的m/z确定为974.5275(预期m/z＝974.5266)。
PPX-NP的合成：
将0.21mg胆固醇、0.42mg DOPC、0.75mg DSPE-PEG2k、0.2mg chol-PPX和0.5mg卡铂裸NCP颗粒在80μL THF中混合，并在50℃，以1700rpm搅拌添加至500uL 30％EtOH。将混合物浓缩至100μL以获得Carbo/PPX核壳纳米颗粒。通过动态光散射(DLS)，Carbo/PPX颗粒的Z均直径和多分散性(PDI)为98.9nm和0.111。参见图26。
实施例4
纳米颗粒共递送奥沙利铂、吉西他滨和SN38
具有多种Chol-SS-SN38(二硫化物接头)的纳米颗粒的合成：
Figure BDA0004189627750000701
将0.21mg胆固醇、0.42mg DOPC、0.75mg DSPE-PEG2k、0.2mg Chol-SS-SN38和0.5mg OxPt/吉西他滨(GEM)裸NCP颗粒(C.Poon et al.Journal of Controlled Release201(2015)90–99)在80μL THF中混合并在50℃，以1700rpm搅拌添加至500uL 30％EtOH。将混合物浓缩至100μL以获得OxPt/GEM/Chol-SS-SN38核-壳纳米颗粒。通过DLS，OxPt/GEM/Chol-SS-SN38颗粒(在本文中也称为“OxPt/GEM/SN38-Boc”，用Chol-SS-SN38-Boc合成)的Z均直径和PDI为96.79nm和0.211。通过Chol-SS-SN38和Chol-SS-CPT制备的纳米颗粒显示出较大尺寸。参见下表6。
表6.通过多种Chol-二硫化物前体药物制备的纳米颗粒的DLS数据
Figure BDA0004189627750000711
OxPt/GEM/Chol-SS-SN38-Boc的体内效力：
为了确定对小鼠结肠癌模型的效力，将100万个CT26细胞接种到6周大的Balb/c小鼠的右侧腹，并且当肿瘤尺寸达到约100mm3时，在第7天开始处理。以Q3D时间表，以3mg/kgOxPt剂量，以4:1:1的摩尔比对小鼠剂量施用OxPt/GEM/Chol-SS-SN38-Boc。将具有相等活性剂的量的OxPt/GEM和OxPt/Chol-SS-SN38-Boc用作对照。在两种药物组合组中，OxPt/GEM和OxPt/Chol-SS-SN38-Boc两者显示明显的肿瘤生长延迟。参见图27A。对于3种药物组合，OxPt/GEM/Chol-SS-SN38-Boc显示出86.7％的肿瘤生长抑制。在多个小鼠处理组中，未观察到明显的重量减轻。参见图27B。
实施例5
NCP核-壳颗粒共递送奥沙利铂、吉西他滨单磷酸酯和SN38
两步合成了在核中具有OxPt-bp和吉西他滨单磷酸酯(GMP)并且在壳上具有Chol-SN38的OxPt/GEM/SN38核-壳纳米颗粒NCP颗粒(称为“OxPt/GMP/SN38”)的合成和表征。根据我们先前报道的方法并稍加修改，合成了OxPt/GMP-裸颗粒(Duan,X.；etal.Nat.Commun.2020,10:1899)。简要地，将OxPt-bp(30mg，150mg/mL)和GMP(8mg，40mg/mL)的水溶液加入至5mL 0.3M Triton X-100/1.5M 1-己醇的环己烷溶液，并在DOPA(30mg，200mg/mL，在CHCl3中)的存在下剧烈搅拌15min。将Zn(NO3)2(60mg，600mg/mL)的水溶液加入至5mL 0.3M Triton X-100/1.5M 1-己醇的环己烷溶液并剧烈搅拌5min。将含Zn(NO3)2的微乳剂滴加至含OxPt-bp的微乳剂，并在室温下剧烈搅拌30min。在加入10mL乙醇后，通过以11,628×g离心获得裸OxPt。用THF/乙醇清洗所得小粒两次并最终分散在THF中。在用硝酸消化后，通过ICP-MS(Agilent 7700×，Agilent Technologies，Santa Clara，加利福尼亚，美国)确定颗粒中OxPt的负载。使用Zetasizer(Nano ZS，Malvern，英国)通过动态光散射确定粒径和ζ电位。通过DLS，OxPt/SN38-裸颗粒的Z均直径和PDI为55.4nm和0.147。
通过在室温下将DOPC、胆固醇、DSPE-PEG2k、Chol-SN38和OxPt/GEM的THF溶液(80μL)添加至500μL 30％(v/v)乙醇/水中制备OxPt/GMP/SN38。DOPC:Chol:DSPE-PEG:Chol-SN38的摩尔比为3:3:1.5:1。将混合物以1700rpm搅拌1min。将THF和乙醇完全蒸发并使溶液冷却至室温。通过DLS，OxPt/GMP/SN38颗粒的Z均直径和PDI为77.94nm和0.145。
胰腺细胞系中OxPt/GMP/SN38的体外细胞毒性：
将小鼠胰腺KPC和Panc02细胞以2500个细胞/孔接种到96孔板中24h。将奥沙利铂、SN38、Chol-SN38、吉西他滨(GEM)、GMP、OxPt NCP(单一药物)、ZnP/SN38(单一药物)、GMPNCP(单一药物)、OxPt/SN38(两种药物)和OxPt/GMP/SN38(三种药物)以不同浓度剂量施用至每个孔中，并将细胞培育另外48h。通过MTS测定测量细胞存活力。
如下表7和表8所列，OxPt、SN38和GEM对KPC和Panc02细胞显示出高细胞毒性。作为活性吉西他滨三磷酸酯的关键代谢产物，GMP对KPC和Panc02分别显示出0.30±0.07μM和0.06±0.02μM的最低IC50。尽管SN38向Chol-SN38以及OxPt向OxPt NCP的修饰稍微降低了它们的细胞毒性，但是两种或三种药物的组合显示出强协同作用，从而分别将它们的IC50值降低了1.2-1.8倍或者8.5-20倍。
表7.KPC细胞中OxPt、GMP和SN38的IC50值(μM)a
Figure BDA0004189627750000721
aOxPt/SN38的摩尔比具有1:2的OxPt:SN38摩尔比，并且OxPt/GMP/SN38具有2:1:4的OxPt:GMP:SN38摩尔比。
b基于OxPt计算IC50值。
表8.Panc02细胞中OxPt、GMP和SN38 IC50值(μM)a
Figure BDA0004189627750000731
aOxPt/SN38的摩尔比具有1:2的OxPt:SN38摩尔比，并且OxPt/GMP/SN38具有2:1:4的OxPt:GMP:SN38摩尔比。
b基于OxPt计算IC50值。
体内毒性和效力：
首先，以Q3D剂量施用时间表，对C57bl/6小鼠测试吉西他滨单磷酸酯纳米颗粒(GMP NCP)的一般毒性。小鼠以2mg/kg良好耐受GMP NCP 15个剂量。将GMP NCP的最大耐受剂量确定为>2mg/kg。
为了研究三联药物纳米颗粒的一般毒性，同时对C57bl/6小鼠以3.5mg OxPt/kg剂量施用OxPt/SN38并且以1、1.25、1.5和2mg/kg GMP剂量施用GMP NCP。小鼠耐受高达1.5mg/kg剂量的GMP NCP 10个剂量，而发现以2mg/kg的GMP NCP的3个剂量后小鼠死亡。将chol-SN38:OxPt:GMP摩尔比为4:2:1的OxPt/GMP/SN38用于后续抗癌效力研究。
为了确定对胰腺癌模型的效力，将1×106个KPC细胞接种到6周大的C57bl/6小鼠的右侧腹，并且当肿瘤尺寸达到约100mm3时，在第7天开始处理。以Q3D时间表，以3.5mg/kg的当量OxPt剂量，对小鼠剂量施用PBS、OxPt/SN38、OxPt/GEM/SN38连续剂量，直至达到安乐死终点。处理对体重的影响如图28A所示。如图28B所示，在PBS终点OxPt/SN38以74.4％的TGI适度抑制肿瘤生长。OxPt/GEM/SN38显示出具有95.6％的TGI的高得多的抗肿瘤效力。该结果显示OxPt/GEM/SN38中的三种药物之间的强协同作用。
实施例6
NCP核-壳颗粒共递送卡铂和多西他赛
胆固醇-多西他赛(Chol-DTX)的合成：
Figure BDA0004189627750000741
将200mg DTX(2.5mmol，1当量)和250mg胆固醇接头(0.37mmol，1.5当量)溶于20mL小瓶中的20mL乙腈中。将500mg K2CO3(3.6mmol，15当量)加入至小瓶并将混合物搅拌3天直至DTX完全消失。用150mL EtOAc稀释混合物并用1M HCl和饱和NaCl清洗，用Na2SO4干燥并在旋转蒸发仪上蒸发以获得无色油。使用2:1己烷:EtOAc通过柱色谱法纯化油以除去对硝基酚，随后用1:1的己烷:EtOAc洗脱产物。产率：180mg(72％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.18–8.11(m,2H),7.53(t,J＝7.6Hz,2H),7.47–7.37(m,3H),7.37–7.30(m,3H),6.29(s,1H),5.82–5.69(m,3H),5.52–5.36(m,3H),4.39–4.10(m,5H),2.73–2.55(m,5H),2.46(s,3H),2.34(t,J＝9.4Hz,2H),2.09–1.89(m,7H),1.89–1.82(m,3H),1.78(s,3H),1.52(dt,J＝14.5,7.4Hz,6H),1.45–1.37(m,4H),1.36(s,9H),1.29(d,J＝7.2Hz,2H),1.27(s,4H),1.21–0.97(m,13H),0.91(ddd,J＝17.3,6.5,2.3Hz,9H),0.71(d,J＝8.6Hz,3H)。HRMS:m/z＝1367.7151([M+NH4]+的预期值：1367.7417)。
Carb/DTX核-壳纳米颗粒的合成和表征：
将0.21mg胆固醇、0.42mg DOPC、0.75mg DSPE-PEG2k、0.25mg chol-DTX和0.5mg裸Carb NCP颗粒(Poon.；et al.Mol.Pharmaceutics 2016,13,3665-3675)在80uL THF中混合并以1700rpm搅拌添加至500μL 30％EtOH。将混合物浓缩至100μL以获得Carb/DTX核-壳纳米颗粒。通过DLS，Carb/DTX颗粒的Z均直径和PDI为101.1nm和0.093。
Carb/DTX在肺和乳腺细胞系中的体外细胞毒性：
将人NSCLC H460和小鼠乳腺癌4T1细胞以2500个细胞/孔接种到96孔板中24h。将卡铂(Carb)、DTX、Chol-DTX、Carb NCP(单一药物)、ZnP/DTX(单一药物)、Carb/DTX(两种药物，Carb:DTX摩尔比＝1:1)以多种浓度剂量施用至每个孔中并将细胞培育另外48h。通过MTS测定测量细胞存活力。
如下表9所列，Carb和DTX对H460和4T1细胞具有高细胞毒性，同时由于需要释放DTX以发挥毒性，Chol-DTX的毒性小于DTX。Carb/DTX颗粒显示出低IC50值，从而表明在颗粒上的Carb和Chol-DTX之间存在协同作用。
表9.Carb和DTX的H460和4T1细胞的IC50值(μM)
Figure BDA0004189627750000751
还通过流式细胞术，对用10μM Carb和/或DTX处理的细胞实施了细胞凋亡/坏死分析。用Carb/DTX(摩尔比＝1:1)处理的细胞显示出高得多的细胞凋亡百分比(17.3％，分别相比于Cab和DTX的2.90％和3.30％)，这支持了通过颗粒递送的Carb和DTX之间的协同作用。
Carb/DTX的体内抗肿瘤效力：
为了确定体内抗肿瘤效力，将1×106个4T1细胞接种到6周大的BALB/c小鼠的右侧腹，并且当肿瘤尺寸达到约100mm3时，在第7天开始处理。每周一次，以5mg/kg的当量Carb剂量向小鼠剂量施用PBS、游离Carb加DTX、ZnP/DTX或Carb/DTX达到3个剂量。如图29A和图29B所示，ZnP/DTX和Carb加DTX在PBS终点分别以49.0％和63.6％的TGI值适度抑制肿瘤生长。Carb/DTX显示出具有87.5％的TGI的好得多的抗肿瘤效力。该结果显示了通过核-壳纳米颗粒递送的Carb和DTX的协同作用。如图30A和30B所示，Carb/DTX还是H460肿瘤生长的非常有效的抑制剂。
实施例7
NCP核-壳颗粒共递送奥沙利铂和chol-SN38(无TMS)
Sprague Dawley大鼠中的药代动力学(PK)：
以与OxPt/SN38类似的方式制备了OxPt与chol-SN38(无TMS)的摩尔比为3:1的OxPt/SN38(无TMS)颗粒。以2.0mg OxPt/kg的剂量，将OxPt/SN38(无TMS)通过尾静脉静脉内(i.v.)注射至三只Sprague Dawley大鼠。在5min、0.5h、1h、3h、5h、8h、24h和48h收集400uL血液样品。将血液样品以10000rpm离心10min并收集血浆用于分析。将200μL不含金属的浓硝酸加入至50μL血浆并培育48h用于完全消化。通过ICP-MS测量消化血浆的Pt浓度。通过100μL饱和NaCl溶液和100μL 0.5％triton X-100水溶液稀释另外50μL血浆，然后用200μL乙酸乙酯萃取。通过LC-HRMS分析有机层以确定chol-SN38(无TMS)和SN38的浓度。参见图31A和图31B。
如下表10所示，颗粒表面层上的chol-SN38显示出3.4h的t1/2和57.9μg/ml*h的AUC0→∞。在血浆中检测到SN38，半衰期为2.5h且AUC0→∞值为1.95μg/ml*h。因此，当与来自游离伊立替康的SN38(半衰期～1.8h)相比时，Chol-SN38(无TMS)快速释放SN38并延长药物暴露。
表10.OxPt/SN38(无TMS)在Sprague Dawley大鼠中的药代动力学
Figure BDA0004189627750000761
OxPt/SN38(无TMS)的体内效力
为了确定OxPt/SN38(无TMS)的抗癌效力，将10×106个HT29细胞接种到8周大的无胸腺裸鼠的右侧腹，并且当肿瘤尺寸达到约100mm3时，在第7天开始处理。以Q3D剂量施用时间表，对小鼠剂量施用PBS、OxPt加伊立替康(3.5mg/kg OxPt和20.2mg/kg伊立替康)或者OxPt/SN38(无TMS)(3.5mg/kg OxPt当量和1.09mg/kg SN38当量)达到16个剂量。如图32A和32B所示，OxPt加伊立替康在PBS终点处显示出最小肿瘤生长抑制，TGI为13.4％。OxPt/SN38(无TMS)显示出高得多的抗肿瘤效力，TGI为87.9％。值得注意地，伊立替康中的SN38含量是OxPt/SN38(无TMS)中的10.8倍。该结果显示了通过核壳颗粒递送的OxPt和SN38之间的强协同作用。
实施例8
其它胆固醇缀合的紫杉醇(PTX)前体药物的合成
Chol-HBA-PTX-1的合成：
如下所示，从胆固醇接头开始，三步合成了Chol-HBA-PTX-1。首先，将4-羟苄醇通过酚基与胆固醇接头偶联，然后与对硝基苯酚氯甲酸酯偶联。然后，在碱的存在下，将新的Chol-HBA接头与PTX反应以获得Chol-HBA-PTX-1。
Figure BDA0004189627750000771
将0.68g(1mmol)胆固醇接头和0.186g 4-羟苄醇(HBA，1.5mmol，1.5当量)溶于20mL无水DCM。将2.5mL(3mmol，3当量)DIPEA加入至该溶液并在氮气保护下将溶液在室温下搅拌24h。用20mL DCM稀释所得溶液并用饱和NH4Cl、饱和NaHCO3和饱和NaCl溶液清洗。然后，用无水Na2SO4干燥有机层并通过旋转蒸发仪浓缩。用1:1己烷：EtOAc洗脱，通过二氧化硅柱色谱法进一步纯化产物。产率：0.51g(0.77mmol，77％)。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ7.40(d,J＝8.5Hz,2H),7.20(d,J＝8.5Hz,2H),5.87(s,2H),5.41–5.32(m,1H),4.70(s,2H),4.63(ddq,J＝11.2,7.7,4.1Hz,1H),2.73(dd,J＝7.0,5.5Hz,2H),2.65(dd,J＝6.9,5.5Hz,2H),2.35–2.29(m,2H),2.09–0.61(m,43H)。
Figure BDA0004189627750000772
将0.20g(0.3mmol，1当量)Chol-HBA、150μL DIPEA(0.9mmol，3当量)和7mg DMAP(0.06mmol，0.2当量)溶于5mL无水THF。在0℃，将180mg 4-硝基苯基氯甲酸酯在5mL无水THF中的溶液滴加至上述溶液，并将溶液在氮气保护下在室温下搅拌2h。用5mL乙酸乙酯稀释所得溶液并用饱和NH4Cl、饱和NaHCO3和饱和NaCl溶液清洗。然后，用无水Na2SO4干燥有机层并通过旋转蒸发仪浓缩。用4:1己烷:EtOAc洗脱，通过二氧化硅柱色谱法进一步纯化产物。产率：0.125g(0.15mmol，50％)。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ8.33–8.21(m,2H),7.52–7.44(m,2H),7.42–7.34(m,2H),7.26(d,J＝8.6Hz,2H),5.88(s,2H),5.38–5.34(m,1H),5.29(s,2H),4.63(td,J＝15.3,13.3,7.7Hz,1H),2.76–2.70(m,2H),2.66(dd,J＝7.0,5.4Hz,2H),2.32(d,J＝7.8Hz,2H),2.06–0.65(m,43H)。
Figure BDA0004189627750000781
将0.10g(0.15mmol)Chol-HBA接头和0.125g PTX(0.15mmol，1.0当量)溶于10mL无水CH3CN。将0.3g K2CO3(4.5mmol，30当量)加入至该溶液并在氮气保护下将溶液在室温下搅拌48h。用20mL乙酸乙酯稀释所得溶液并用饱和NH4Cl、饱和NaHCO3和饱和NaCl溶液清洗。然后，用无水Na2SO4干燥有机层并用旋转蒸发仪浓缩。用1:1己烷:EtOAc洗脱，通过二氧化硅柱色谱法进一步纯化产物。产率：55mg(0.036mmol，24％)。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ8.18–8.12(m,2H),7.78–7.69(m,3H),7.61(t,J＝7.3Hz,2H),7.55–7.45(m,4H),7.43–7.33(m,6H),7.23–7.19(m,2H),6.29(d,J＝4.8Hz,3H),5.99(dd,J＝9.3,2.7Hz,1H),5.87(s,2H),5.69(d,J＝6.9Hz,1H),5.44(d,J＝2.7Hz,1H),5.36(d,J＝5.1Hz,1H),5.16(d,J＝4.4Hz,1H),4.97(t,J＝7.7Hz,2H),4.50–4.38(m,1H),4.32(d,J＝8.4Hz,2H),4.22(s,1H),3.81(t,J＝8.7Hz,1H),2.73(t,J＝6.4Hz,2H),2.65(t,J＝6.4Hz,2H),2.61–0.65(m,67H)。HRMS:m/z＝1546.7330([M+H]+)。
Chol-HBA-PTX-2的合成：
Figure BDA0004189627750000791
在干燥的圆底烧瓶中，将胆甾醇琥珀酸单酯(0.486g，1mmol，1当量)溶于20mL无水CH2Cl2，随后缓慢加入草酰氯(3当量)。将反应混合物在惰性气氛下，在室温下搅拌2h。真空浓缩溶液以除去溶剂，并用额外的无水CH2Cl2(20ml×3)进一步干燥以除去未反应的草酰氯。然后，将粗胆甾醇基琥珀酸酯氯化物溶于20mL无水THF，并随后将4-羟苄醇(0.186g，1.5mmol，1.5当量)加入至该溶液。将混合物溶液在室温下保持搅拌过夜并通过TLC监测。在反应完成后，用20mL乙酸乙酯稀释所得溶液并用饱和NH4Cl、饱和NaHCO3和饱和NaCl溶液清洗。然后，用无水Na2SO4干燥有机层并通过旋转蒸发仪浓缩。用己烷/EtOAc洗脱，通过二氧化硅柱色谱法进一步纯化产物。产率：0.45g(0.77mmol，77％)。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ7.32(d,J＝8.5Hz,2H),7.05(d,J＝8.5Hz,2H),5.36(dd,J＝4.7,2.0Hz,1H),4.72–4.55(m,3H),2.84(dd,J＝7.5,6.0Hz,2H),2.69(dd,J＝7.6,6.0Hz,2H),2.39(s,1H),2.32(d,J＝7.9Hz,2H),2.06–0.61(m,41H)。
Figure BDA0004189627750000792
将0.18g(0.3mmol，1当量)胆甾醇基琥珀酸酯4-羟苄醇酯、150μLDIPEA(0.9mmol，3当量)和7mg DMAP(0.06mmol，0.2当量)溶于5mL无水THF。在0℃，将180mg 4-硝基苯基氯甲酸酯在5mL无水THF中的溶液滴加至上述溶液，并将溶液在氮气保护下在室温下搅拌2h。用5mL乙酸乙酯稀释所得溶液并用饱和NH4Cl、饱和NaHCO3和饱和NaCl溶液清洗。然后，用无水Na2SO4干燥有机层并通过旋转蒸发仪浓缩。用己烷/EtOAc洗脱，通过二氧化硅柱色谱法进一步纯化产物。产率：0.150g(0.2mmol，67％)。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ8.24–8.20(m,2H),7.47–7.42(m,2H),7.40–7.34(m,2H),7.18–7.07(m,2H),5.36(dd,J＝4.9,1.8Hz,1H),5.27(s,2H),2.88(dd,J＝7.6,5.8Hz,2H),2.72(dd,J＝7.6,5.8Hz,2H),2.38–2.28(m,2H),2.05–0.62(m,41H)。
Figure BDA0004189627750000801
将0.11g(0.15mmol)Chol-HBA接头2和0.125g PTX(0.15mmol，1.0当量)溶于10mL无水CH2Cl2。将17mg DMAP(0.15mmol，1当量)加入至该溶液并将溶液在氮气保护下，在室温下搅拌48h。用20mL乙酸乙酯稀释所得溶液并用饱和NH4Cl、饱和NaHCO3和饱和NaCl溶液清洗。然后，用无水Na2SO4干燥有机层并通过旋转蒸发仪浓缩。用1:1己烷：EtOAc洗脱，通过二氧化硅柱色谱法进一步纯化产物。产率：102mg(0.07mmol，47％)。1H NMR(500MHz,氯仿-d)δ8.18–8.08(m,2H),7.77–7.70(m,2H),7.61(t,J＝7.4Hz,1H),7.54–7.45(m,3H),7.42–7.34(m,8H),7.10(d,J＝8.5Hz,2H),6.90(d,J＝9.3Hz,1H),6.30(s,1H),5.99(dd,J＝9.3,2.7Hz,1H),5.69(d,J＝7.1Hz,1H),5.46–5.36(m,2H),5.15(d,J＝3.4Hz,2H),4.98(d,J＝9.5Hz,1H),4.44(s,1H),4.39–4.32(m,2H),4.21(d,J＝8.4Hz,1H),3.82(d,J＝7.0Hz,1H),2.88(t,J＝6.7Hz,2H),2.72(t,J＝6.5Hz,2H),2.66–0.58(m,67H)。
脂质缀合的前体药物的其它实施例如图33、图34、图35A和图35B所示。
将理解在不背离当前所公开的主题的范围的情况下，可以改变当前所公开的主题的多个细节。此外，以上描述仅出于说明的目的，而不是出于限制的目的。

Claims (31)

1.一种包含式D-BL-L的结构的前体药物，其中
D是一价药物部分，任选地，其中，D是抗癌药物化合物的一价衍生物，进一步任选地，其中，D是选自由以下组成的组的药物化合物的一价衍生物：依托泊苷(ET)、鬼臼毒素(PPX)、紫杉醇(PTX)、多西他赛(DTX)、双氢青蒿素(DHA)、喜树碱(CPT)、7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)、拓扑替康、多柔比星、表柔比星、伊达比星、长春新碱、米托蒽醌、青蒿琥酯、卡培他滨、奥曲肽、亮丙瑞林、以及戈舍瑞林；
L是一价脂质部分；并且
BL是二价接头，其中，D通过碳酸酯基或氨基甲酸酯基直接连接至BL，并且其中，BL包含缩醛基和取代的氧基苄氧基中的至少一种，其中，所述缩醛基具有以下式中的一个的结构：
Figure FDA0004189627740000011
其中：
n是0至4的整数，任选地，其中，n是0；
R1和R2独立地选自由以下组成的组：H、烷基、取代的烷基、芳烷基、取代的芳烷基、芳基、以及取代的芳基，
每个R3独立地选自由以下组成的组：烷基、芳烷基、芳基、卤素、烷氧基、芳氧基、羟基、酰基、羧酸酯、磷酸酯、硝基、-N3、B(OH)2、以及氰基；并且
其中，所述缩醛基的氧原子直接连接至碳酸酯基或氨基甲酸酯基的碳原子；并且
其中，所述取代的氧基苄氧基具有以下式的结构：
Figure FDA0004189627740000021
其中，R’选自由以下组成的组：硝基、N3、以及-B(OH)2，并且其中，连接至所述氧基苄氧基的苄基碳的氧原子直接连接至碳酸酯基或氨基甲酸酯基的碳原子。
2.根据权利要求1所述的前体药物，其中，L是胆固醇、油酸、溶血脂质、或磷酸胆碱的一价衍生物。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的前体药物，其中，所述前体药物包含以下式中的一个的结构：
Figure FDA0004189627740000022
Figure FDA0004189627740000031
Figure FDA0004189627740000032
以及
Figure FDA0004189627740000033
4.根据权利要求1或权利要求2所述的前体药物，其中，BL包含具有以下式的结构的缩醛基：
Figure FDA0004189627740000034
其中，R1和R2独立地选自由以下组成的组：H、烷基、取代的烷基、芳烷基、取代的芳烷基、芳基、以及取代的芳基；任选地，其中，R1和R2独立地选自由以下组成的组：H、甲基、以及苯基；
进一步任选地，其中，R1和R2两者均为H。
5.根据权利要求4所述的前体药物，其中，L是油酸部分，并且其中，L和BL一起具有以下结构：
Figure FDA0004189627740000041
6.根据权利要求4所述的前体药物，其中，L是胆固醇衍生物，并且其中，L和BL一起具有以下结构：
Figure FDA0004189627740000042
7.根据权利要求6所述的前体药物，其中，所述前体药物选自由以下组成的组：
Figure FDA0004189627740000043
Figure FDA0004189627740000051
、
以及
Figure FDA0004189627740000061
8.根据权利要求1-7中任一项所述的前体药物，其中，所述前体药物结合至低密度脂蛋白(LDL)并且通过LDL受体介导的内吞被主动运输至肿瘤，任选地，其中，所述前体药物对LDL的结合常数Ka是所述前体药物对白蛋白的Ka的至少约1000倍，进一步任选地，其中，所述前体药物对LDL的Ka是所述前体药物对白蛋白的Ka的至少约2000倍。
9.一种纳米颗粒，包含：
(a)包含金属有机基体材料的核，任选地，其中，所述金属有机基体材料包括配位聚合物；和
(b)覆盖所述核的表面的至少一部分的涂层，其中，所述涂层包括脂质层或脂质双层，并且其中，所述涂层包含一种或多种权利要求1-8中任一项所述的前体药物。
10.根据权利要求9所述的纳米颗粒，其中，所述金属有机基体材料包括纳米级配位聚合物，所述纳米级配位聚合物包括金属二磷酸酯，所述金属二磷酸酯包含多价金属离子和二磷酸酯，任选地，其中，所述多价金属离子选自由以下组成的组：Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、以及它们的组合。
11.根据权利要求10所述的纳米颗粒，其中，所述二磷酸酯包括抗癌剂的前体药物，任选地，其中，所述二磷酸酯包括顺铂、卡铂或奥沙利铂的前体药物，进一步任选地，其中，所述二磷酸酯是顺式,顺式-反式-[Pt(NH3)2Cl2(OH)2]或顺式,反式-[Pt(dach)(草酸根)(OH)2]的二磷酸酯。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的纳米颗粒，其中，所述核包含包埋的抗癌剂，任选地为包埋的亲水性抗癌剂，进一步任选地，其中，所述包埋的抗癌剂是吉西他滨单磷酸酯(GMP)。
13.根据权利要求9-12中任一项所述的纳米颗粒，其中，所述核包含至少两种抗癌剂，任选地，其中，所述至少两种抗癌剂包括：第一抗癌剂，其中，所述第一抗癌剂为顺铂、卡铂或奥沙利铂的前体药物，进一步任选地为顺铂、卡铂或奥沙利铂的二磷酸酯；和第二抗癌剂，其中，所述第二抗癌剂是包埋的亲水性抗癌剂。
14.根据权利要求9-11中任一项所述的纳米颗粒，其中，所述纳米颗粒的核包含金属二磷酸酯配位聚合物，所述金属二磷酸酯配位聚合物包含：多价金属离子，任选地为Zn2+；和二磷酸酯，其中，所述二磷酸酯是具有结构Pt(dach)(草酸根)(双磷酰胺酸)的奥沙利铂前体药物；并且其中，所述涂层是包含具有以下结构的前体药物的脂质双层：
Figure FDA0004189627740000081
15.根据权利要求14所述的纳米颗粒，其中，所述纳米颗粒的核还包含包埋在所述纳米颗粒的核中的GMP。
16.根据权利要求9-15中任一项所述的纳米颗粒，其中，所述涂层包括脂质双层，所述脂质双层包含阳离子脂质和/或官能化脂质，其中，所述官能化脂质是用可以键合至核酸的基团官能化的脂质，并且其中，至少一种核酸共价键合至所述官能化脂质或通过静电相互作用连接至所述阳离子脂质，任选地，其中，所述脂质双层包含混合物，所述混合物包含以下中的一种或多种：硫醇官能化的或二硫醇官能化的1,2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、以及1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)。
17.根据权利要求16所述的纳米颗粒，其中，所述至少一种核酸选自由以下组成的组：siRNA、miRNA、以及AS ODN，任选地，其中，所述siRNA选自由以下组成的组：存活素siRNA、ERCC-1siRNA、P-糖蛋白siRNA(P-gp siRNA)、Bcl-2siRNA、以及它们的混合物。
18.根据权利要求9-17中任一项所述的纳米颗粒，其中，所述纳米颗粒还包含：一种或多种钝化剂，任选地为亲水聚合物；靶向剂，任选地为RGD肽；以及免疫治疗剂。
19.根据权利要求9-18中任一项所述的纳米颗粒，其中，所述纳米颗粒的直径在约20纳米至约140纳米的范围内。
20.根据权利要求9-18中任一项所述的纳米颗粒，其中，所述纳米颗粒吸附血浆蛋白，任选地为载脂蛋白B-100，用于通过LDL受体介导的内吞向肿瘤主动运输。
21.一种药物制剂，包含(i)药学上可接受的载体、以及(ii)权利要求1-8中任一项所述的前体药物或权利要求9-20中任一项所述的纳米颗粒。
22.一种治疗对其有需要的受试者中的癌症的方法，其中，所述方法包括向所述受试者施用权利要求1-8中任一项所述的前体药物、权利要求9-20中任一项所述的纳米颗粒、或权利要求21所述的药物制剂。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述方法还包括向所述受试者施用另外的癌症治疗，所述另外的癌症治疗选自由以下组成的组：手术、放射疗法、化疗、毒素疗法、免疫疗法、冷冻疗法以及基因疗法；任选地，其中，所述另外的癌症治疗是免疫疗法。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述免疫疗法包括向所述受试者施用免疫治疗剂；任选地，其中，所述免疫治疗剂选自由以下组成的组：抗-CD52抗体、抗-CD20抗体、抗-CD47抗体、抗-GD2抗体、细胞因子、多糖K、PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、IDO抑制剂、CCR7抑制剂、OX40抑制剂、TIM3抑制剂、以及LAG3抑制剂。
25.根据权利要求22-24中任一项所述的方法，其中，所述癌症选自由以下组成的组：头部肿瘤、颈部肿瘤、乳腺癌、妇科肿瘤、脑肿瘤、结直肠癌、肺癌、间皮瘤、软组织肉瘤、皮肤癌、结缔组织癌、脂肪癌、肺癌、胃癌、肛门生殖器癌、肾癌、膀胱癌、结肠癌、前列腺癌、中枢神经系统癌、视网膜癌、血癌、成神经细胞瘤、多发性骨髓瘤、淋巴癌、以及胰腺癌。
26.根据权利要求22-24中任一项所述的方法，其中，所述癌症是转移性癌，任选地为转移性结直肠癌。
27.根据权利要求22所述的方法，其中，所述方法包括向所述受试者施用权利要求9所述的纳米颗粒，其中，所述纳米颗粒的核包含金属二磷酸酯配位聚合物，所述金属二磷酸酯配位聚合物包含：多价金属离子，任选地选自Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+以及它们的组合；和
二磷酸酯，其中，所述二磷酸酯是顺铂、奥沙利铂或卡铂的二磷酸酯；并且
其中，所述涂层包括脂质双层，所述脂质双层包含具有结构D-BL-L的前体药物，其中，D是抗癌药物化合物的一价药物部分，任选地，其中，所述一价药物部分是选自由以下组成的组的药物化合物的一价衍生物：ET、PPX、PTX、DTX、DHA、CPT、SN38、拓扑替康、多柔比星、表柔比星、伊达比星、长春新碱、米托蒽醌、青蒿琥酯、卡培他滨、奥曲肽、亮丙瑞林、以及戈舍瑞林；L是一价脂质部分，任选地为一价胆固醇部分；并且BL是二价接头部分，其中，D通过碳酸酯或氨基甲酸酯键连接至BL，并且其中，BL包含缩醛基，其中，所述缩醛基具有以下式的结构：
Figure FDA0004189627740000111
其中，R1和R2独立地选自由以下组成的组：H、烷基、取代的烷基、芳烷基、取代的芳烷基、芳基、以及取代的芳基；并且其中，所述缩醛基中的氧原子中的至少一个直接键合至碳酸酯基或氨基甲酸酯基的碳原子。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述纳米颗粒的核还包含包埋在所述核中的亲水性抗癌剂，任选地，其中，所述亲水性抗癌剂是GMP。
29.根据权利要求27或28所述的方法，其中，所述前体药物具有以下式的结构：
Figure FDA0004189627740000112
任选地，其中，所述二磷酸酯是Pt(dach)(草酸根)(双磷酰胺酸)。
30.根据权利要求27-29中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括向所述受试者施用免疫治疗剂。
31.根据权利要求27-30中任一项所述的方法，其中，相比于施用相等量的至少一种抗癌剂，其中，所述至少一种抗癌剂不与纳米颗粒和/或前体药物结合，施用所述纳米颗粒提供了所述至少一种抗癌剂的肿瘤曲线下面积(AUC)的至少2倍增加，任选地大于4倍增加。
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