KR102179530B1 - 광감작제를 포함하는 자기 조립 나노입자 및 이를 포함하는 광역학 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

광감작제를 포함하는 자기 조립 나노입자 및 이를 포함하는 광역학 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 자기 조립 나노입자는 광감작제의 특성을 유지하여, 광역학 치료에 유용하게 사용될 수 있고, 본 발명에 따른 자기 조립 나노입자는 빠른 세포 흡수를 나타내며, 암세포에 대해 선택성 및 특이성을 나타내며, 암세포에 종래 괌감작제 및 약물보다 우수한 항암효과를 세포 독성을 나타내며, 종래 광감작제와 다른 메커니즘으로 암세포의 사멸을 유도하고, 항암제를 봉입할 수 있는 바, 항암제 투여와 동시에 광역학 치료를 수행할 수 있는 병용요법을 사용 가능하므로, 새로운 항암제 및 광역학 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

광감작제를 포함하는 자기 조립 나노입자 및 이를 포함하는 광역학 치료용 조성물{Self-assembled nanoparticles comprising photosensitizer and composition for using photodynamic therapy comprising the same}
광감작제를 포함하는 자기 조립 나노입자 및 이를 포함하는 광역학 치료용 조성물에 관한 것이다.
암은 우리나라를 포함한 대다수 선진국가의 사망원인 1위로, 인류가 극복해야 할 가장 중요한 질환의 하나로서, 현재, 암의 치료 방법으로는 수술, 항암화학요법 및 방사선치료 등 암 치료의 3가지 주요 치료수단 이외에 면역치료, 유전자치료 등과 함께 광역학치료(Photodynamic Therapy, PDT)도 각종 암의 치료의 또 다른 방법으로 발전하고 있다.
광역학치료란 광감작제(photosensitizer)가 빛(light)과 산소(oxygen)에 의해 화학적 반응을 일으킴으로써 단일한 산소(singlet oxygen)와 이에 의해 유발되는 자유라디칼(free radical)이 환자에게 아무런 고통 없이 암세포만 선택적으로 파괴하는 차세대 치료법을 의미한다.
고령자 암의 증가, 조기 및 초기 암의 증가, 삶의 질에 대한 의미의 변화, 보다 저침습적인 치료의 선호 등 앞으로의 의료환경의 변화를 생각하면, 광역학치료는 이론적으로는 정상 조직의 손상 없이 암세포만 선택적으로 파괴하는 가장 이상적인 치료 방법이다.
현재 국내에서 사용 가능한 광감작제는 1세대 porphyrin계인 Photofrin (630nm, Axcan, Canada)과 Photogem(630nm, Lomonosov Institute of Fine Chemicals, Russia)이며, NPe6 (Meiji Pharm., Japan) 등 몇몇 제품들 은 아직 국내에서는 사용할 수 없다. ALA (amino levulinic acid)는 종양조직 내에서 protorphyrin IX로 변환되는 광감작제 전구물질로서 국소 전달에 적합한 차세대 광감작제 중 하나이며, 광역학적 진단에 더 많이 사용되고 현재 피부암에 승인이 난 상태이며 PpIX는 635 nm 흡수파장을 가진다.
광감작제에 다른 화학적 구조를 결합시켜 암과 같은 특정 조직에 잘 결합되도록 하는 다양한 형태의 3세대 광감작제에 대한 연구도 활발히 진행되고 있다.
J Korean Med Assoc 2007; 50(12): 1119 - 1129
본 발명의 일 목적은 광감작제를 포함하는 자기 조립 나노입자 및 이를 포함하는 광역학 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명의 일 측면에 따라, 테트라페닐폴피린(Tetraphenylporphyrin)계 광감작제(photosensitizer); 폴리에틸렌글리콜; 및 종양세포 특이적 리간드;를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물이 제공된다:
[화학식 1]
Figure 112018131209931-pat00001
(상기 화학식 1에 있어서,
R1은 독립적으로, 수소, 할로겐 또는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-10알킬이고;
l은 1 내지 4의 정수이고;
m은 1 내지 5의 정수이고;
n은 1 내지 50000의 정수이고; 및
Figure 112018131209931-pat00002
은 종양세포 특이적 리간드이다).
본 발명의 다른 측면에 따라, 테트라페닐폴피린(Tetraphenylporphyrin)계 광감작제(photosensitizer); 폴리에틸렌글리콜; 및 종양세포 특이적 리간드;를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물로 구성되는 자기 조립 나노입자(self-assembled nanoparticle)가 제공된다:
[화학식 1]
Figure 112018131209931-pat00003
(상기 화학식 1에 있어서,
R1은 독립적으로, 수소, 할로겐 또는 직쇄 또는 분지쇄의 C1- 10알킬이고;
l은 1 내지 4의 정수이고;
m은 1 내지 5의 정수이고;
n은 1 내지 50000의 정수이고; 및
Figure 112018131209931-pat00004
은 종양세포 특이적 리간드이다).
본 발명의 다른 측면에 따라, 상기 자기 조립 나노입자를 포함하는 항암용 약학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 상기 자기 조립 나노입자를 포함하는 암의 광역학 치료용 조성물이 제공된다.
본 발명에 따른 자기 조립 나노입자 및 함암제가 봉입된 자기 조립 나노입자는 광감작제의 특성을 유지하여, 광역학 치료에 유용하게 사용될 수 있고, 본 발명에 따른 자기 조립 나노입자는 빠른 세포 흡수를 나타내며, 암세포에 대해 선택성 및 특이성을 나타내며, 암세포에 종래 괌감작제 및 약물보다 우수한 항암효과를 세포 독성을 나타내며, 종래 광감작제와 다른 메커니즘으로 암세포의 사멸을 유도하고, 항암제를 봉입할 수 있는 바, 항암제 투여와 동시에 광역학 치료를 수행할 수 있는 병용요법을 사용 가능하므로, 새로운 항암제 및 광역학 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 실시예 1의 단계 4에서 얻은 TPP-PEG-biotin 1H NMR 스펙트럼이다.
도 2는 실시예 1의 단계 5에서 얻은 TPP-PEG-biotin SANs의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 3은 실시예 1의 단계 5에서 얻은 TPP-PEG-biotin SANs의 주사 전자 현미경(Scanning electron microscope, SEM) 이미지이다.
도 4a 및 도 4b는 독소루비신(DOX), 실시예 1의 단계 4에서 얻은 TPP-PEG-biotin 유닛, 실시예 1의 단계 5에서 얻은 자기 조립 나노입자(TPP-PEG-biotin SANs) 및 실시예 2에서 얻은 함암제가 봉입된 자기 조립 나노입자(DOX@TPP-PEG-biotin SANs)의 UV-vis 흡수 및 방출 스펙트럼이다.
도 4c 및 도 4d는 실시예 1의 단계 5에서 얻은 자기 조립 나노입자(TPP-PEG-biotin SANs) 및 실시예 2에서 얻은 함암제가 봉입된 자기 조립 나노입자(DOX@TPP-PEG-biotin SANs)의 투과 전자 현미경(Transmission electron microscopy, TEM) 이미지이다.
도 4e 및 도 4f는 실시예 1의 단계 5에서 얻은 자기 조립 나노입자(TPP-PEG-biotin SANs)(도 4e) 및 실시예 2에서 얻은 함암제가 봉입된 자기 조립 나노입자(DOX@TPP-PEG-biotin SANs)(도 4f)의 입자 크기 분포를 나타낸 그래프이다.
도 5a는 실시예 1의 단계 5에서 얻은 자기 조립 나노입자(TPP-PEG-biotin SANs) 및 실시예 2에서 얻은 함암제가 봉입된 자기 조립 나노입자(DOX@TPP-PEG-biotin SANs)의 시간 경과에 따른 입자 크기를 분석한 그래프이다.
도 6은 암 조건 및 명 조건하에서 TPPS(tetraphenylporphyrins), TPP-PEG-biotin, TPP-PEG-biotin SANs 및 DOX@TPP-PEG-biotin SANs와 독소루비신(DOX)의 각각 상이한 농도에서 수행된 MTT 분석 결과를 나타낸다. 도 6a는 암 조건에서의 TPPS(tetraphenylporphyrins), TPP-PEG-biotin 및 TPP-PEG-biotin SANs의 세포 생존율을 나타낸 것이고, 도 6b는 명 조건에서의 TPPS(tetraphenylporphyrins), TPP-PEG-biotin 및 TPP-PEG-biotin SANs의 세포 생존율을 나타낸 것이고, 도 6c는 독소루비신(DOX)의 세포 생존율을 나타낸 것이고, 도 6d는 암 조건 및 명 조건에서의 DOX@TPP-PEG-biotin SANs의 세포 생존율을 나타낸 것이다.
도 7은 TPP-PEG-biotin SANs의 공초점 현미경 이미지이며, 왼쪽 이미지는 명 시야(bright field) 이미지이고, 오른쪽 이미지는 형광 시야(fluorescence field) 이미지이다.
도 8은 세포 내 활성 산소 종(ROS) 생성 검증 결과를 나타낸 것이다. 8a는 다양한 농도(1 μM, 3 μM 및 5 μM)로 TPP-PEG-biotin SANs을 처리한 MCF-7에서 DCF의 명 시야(bright field) 이미지 및 형광 시야(fluorescence field) 이미지를 나타낸 것이고, 도 8b는 레이저 조사 조건하에서 다양한 농도(1 μM, 3 μM 및 5 μM)로 TPP-PEG-biotin SANs을 처리한 MCF-7에서 DCF의 형광 강도를 정량적으로 분석한 결과이다.
도 9는 세포 내 약물 방출 평가 결과이다. 도 9a는 공초점 레이저 형광 현미경 분석 결과를 나타낸 이미지이고, 도 9b는 독소루비신 방출 형광 강도에 대한 정량 분석 결과을 나타낸 것이다.
도 10은 세포 내 위치 분석 결과이다. 도 10a는 세포 내 라이소좀 위치와 자기 조립 나노입자의 세포 내 위치를 나타낸 형광 이미지이고, 도 10b는 세포 내 미토콘드리아 위치와 자기 조립 나노입자의 세포 내 위치를 나타낸 형광 이미지이고, 도 10c는 세포 내 소포체 위치와 자기 조립 나노입자의 세포 내 위치를 나타낸 형광 이미지이고, 도 10d는 함암제가 봉입된 자기 조립 나노입자와, 라이소좀, 미토콘드리아, 세포체의 위치를 나타낸 형광 이미지이다.
도 11은 세포 내 흡수 평가 결과로서, 세포 내 형광을 측정함으로써 유동 세포 계측법에 의해 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 하이 컨텐츠 세포 사멸 역학 분석 결과로서, TPP-PEG-biotin SANs의 결과를 나타낸 것이다. 도 12a는 AOTF가 장착된 형광 현미경으로 사용하여 얻은 미토콘드리아 막 투과성 변이(membrane permeability transition, MPT), 사이토솔릭 Ca2+(cytosolic Ca2 +), 단백질 분해효소인 caspase-3/7의 하이 컨텐츠 이미지(high-content images)를 나타낸 것이고, 도 12b는 TPP-PEG-biotin SANs 농도에 따른 형광 강도를 나타낸 그래프이다.
도 13은 하이 컨텐츠 세포 사멸 역학 분석 결과로서, DOX@@TPP-PEG-biotin SANs의 결과를 나타낸 것이다. 도 13a는 레이저 조사하여 AOTF가 장착된 형광 현미경으로 사용하여 얻은 미토콘드리아 막 투과성 변이(membrane permeability transition, MPT), 사이토솔릭 Ca2 +(cytosolic Ca2 +), 단백질 분해효소인 caspase-3/7의 하이 컨텐츠 이미지(high-content images)의 하이 컨텐츠 이미지(high-content images)를 나타낸 것이고, 도 13b는 레이저 조사하여 DOX@TPP-PEG-biotin SANs 농도에 따른 형광 강도를 나타낸 그래프이고 도 13c는 레이저 조사 없는 AOTF가 장착된 형광 현미경으로 사용하여 얻은 미토콘드리아 막 투과성 변이(membrane permeability transition, MPT), 사이토솔릭 Ca2 +(cytosolic Ca2 +), 단백질 분해효소인 caspase-3/7의 하이 컨텐츠 이미지(high-content images)를 나타낸 것이고, 도 13d는 레이저 조사하여 DOX@TPP-PEG-biotin SANs 농도에 따른 형광 강도를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 측면은, 테트라페닐폴피린(Tetraphenylporphyrin)계 광감작제(photosensitizer); 폴리에틸렌글리콜; 및 종양세포 특이적 리간드;를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112018131209931-pat00005
(상기 화학식 1에 있어서,
R1은 독립적으로, 수소, 할로겐 또는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-10알킬이고;
l은 1 내지 4의 정수이고;
m은 1 내지 5의 정수이고;
n은 1 내지 50000의 정수이고; 및
Figure 112018131209931-pat00006
은 종양세포 특이적 리간드이다).
본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는 화합물에서,
테트라페닐폴피린 구조에 결합된 R1의 치환기는 자기 조립 나노입자를 형성하는데 중요한 요소가 아닌 바, 페닐이 비치환 또는 할로겐이나 직쇄 또는 분지쇄의 C1-10알킬로 더 치환될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 비치환 형태이나, 이는, 일례일 뿐, 이에 한정되는 것은 아니다.
폴리에틸렌글리콜의 에톡시 반복단위가 1 내지 50000개일 수 있고, 1 내지 40000개 일 수 있고, 1 내지 30000개 일 수 있고, 5 내지 30000개 일 수 있고, 10 내지 20000개 일 수 있고, 20 내지 10000개 일 수 있다. 본 발명에서는 에톡시 반복단위가 70개이나, 이는, 일례일 뿐, 이에 한정되는 것은 아니다.
종양세포 특이적 리간드는 종양세포에 특이적으로 결합할 수 있는 물질이라면 한정되지 않고 도입할 수 있으며, 바이오틴(biotin), 폴릭애시드(folic acid), 트리페닐포스포늄(triphenylphosphonium) 및 ACUPA(S,S-2-[3-[5-amino-1-carboxypentyl]-ureido]-pentanedioic acid)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 종양세포에 과발현된 수용체에 결합할 수 있는 리간드일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 바이오틴이나, 이는 일례일 뿐, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 자기 조립 나노입자를 형성하는 개별 유닛으로 이용될 수 있으며, 구체적으로, 상기 화학식 1로 표시되는 개별 유닛을 용매에 용해시키고, 질소가스 흐름하에 건조하고, 진공하에 건조하여 필름층을 얻고, 필름층을 용매(PBS 및 DMSO 등)로 수화시키고, 초음파처리하여 자리 조립된 나노입자를 얻을 수 있다. 다만, 이는 일례일 뿐, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 측면은, 테트라페닐폴피린(Tetraphenylporphyrin)계 광감작제(photosensitizer); 폴리에틸렌글리콜; 및 종양세포 특이적 리간드;를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물로 구성되는 자기 조립 나노입자(self-assembled nanoparticle)를 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112018131209931-pat00007
(상기 화학식 1에 있어서,
R1은 독립적으로, 수소, 할로겐 또는 직쇄 또는 분지쇄의 C1-10알킬이고;
l은 1 내지 4의 정수이고;
m은 1 내지 5의 정수이고;
n은 1 내지 50000의 정수이고; 및
Figure 112018131209931-pat00008
은 종양세포 특이적 리간드이다).
본 발명에 따른 자기 조립 나노입자의 구조에서, 테트라페닐폴피린 구조가 광감작제의 역할을 하고, 상기 테트라페닐폴피린의 용해도 문제를 해결하기 위하여, 친수성 성분으로서 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 도입하여 페길화를 수행하였으며, 상기 PEG는 친수성기를 제공하여 수용해도를 증가시킬 뿐만 아니라, 방오성능을 나타내게하는 역할을 한다. 또한, 종양세포 특이적 리간드는 종양세포에 결합될 수 있는 리간드를 의미하며, 본 발명의 자기 조립 나노입자가 종양세포에 선택적 및 특이적으로 작용할 수 있도록 하는 역할을 수행한다.
이에, 상기 화학식 1에서, 테트라페닐폴피린 구조에 결합된 R1의 치환기는 자기 조립 나노입자를 형성하는데 중요한 요소가 아닌 바, 페닐이 비치환 또는 할로겐이나 직쇄 또는 분지쇄의 C1-10알킬로 더 치환될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 비치환 형태를 사용하였으나, 이는, 일례일 뿐, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 폴리에틸렌글리콜의 길이 또한, 본 발명의 자기 조립 나노입자를 형성하는데 중요한 요소가 아닌 바, 길이에 제한은 없으며, 에톡시 반복단위가 1 내지 50000개일 수 있고, 1 내지 40000개 일 수 있고, 1 내지 30000개 일 수 있고, 5 내지 30000개 일 수 있고, 10 내지 20000개 일 수 있고, 20 내지 10000개 일 수 있다. 본 발명에서는 에톡시 반복단위가 70개이나, 이는, 일례일 뿐, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 종양세포 특이적 리간드는 종양세포에 특이적으로 결합할 수 있는 물질이라면 한정되지 않고 도입할 수 있으며, 바이오틴(biotin), 폴릭애시드(folic acid), 트리페닐포스포늄(triphenylphosphonium) 및 ACUPA(S,S-2-[3-[5-amino-1-carboxypentyl]-ureido]-pentanedioic acid)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 종양세포에 과발현된 수용체에 결합할 수 있는 리간드일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 바이오틴을 사용하였으나, 이는 일례일 뿐, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 자기 조립 나노입자의 구조에서, 테트라페닐폴피린 구조가 광감작제의 역할을 하고, 상기 테트라페닐폴피린의 용해도 문제를 해결하기 위하여, 친수성 성분으로서 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 도입하여 페길화를 수행하였으며, 상기 PEG는 친수성기를 제공하여 수용해도를 증가시킬 뿐만 아니라, 방오성능을 나타내게하는 역할을 한다. 또한, 종양세포 특이적 리간드는 종양세포에 결합될 수 있는 리간드를 의미하며, 본 발명의 자기 조립 나노입자가 종양세포에 선택적 및 특이적으로 작용할 수 있도록 하는 역할을 수행한다.
이에, 상기 화학식 1에서, 테트라페닐폴피린 구조에 결합된 R1의 치환기는 자기 조립 나노입자를 형성하는데 중요한 요소가 아닌 바, 페닐이 비치환 또는 할로겐이나 직쇄 또는 분지쇄의 C1- 10알킬로 더 치환될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 비치환 형태를 사용하였으나, 이는, 일례일 뿐, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 폴리에틸렌글리콜의 길이 또한, 본 발명의 자기 조립 나노입자를 형성하는데 중요한 요소가 아닌 바, 길이에 제한은 없으며, 에톡시 반복단위가 5 내지 50000개일 수 있고, 5 내지 40000개 일 수 있고, 5 내지 30000개 일 수 있고, 50 내지 30000개 일 수 있고, 50 내지 20000개 일 수 있고, 50 내지 10000개 일 수 있다.
또한, 상기 종양세포 특이적 리간드는 종양세포에 특이적으로 결합할 수 있는 물질이라면 한정되지 않고 도입할 수 있으며, 바이오틴(biotin), 폴릭애시드(folic acid), 트리페닐포스포늄(triphenylphosphonium) 및 ACUPA(S,S-2-[3-[5-amino-1-carboxypentyl]-ureido]-pentanedioic acid)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 종양세포에 과발현된 수용체에 결합할 수 있는 리간드일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 바이오틴을 사용하였으나, 이는 일례일 뿐, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 자기 조립 나노입자는 내부에 항암제를 봉입하여 함암제가 봉입된 자기 조립 나노입자로 제조할 수 있으며, 이에 따라, 항암제 전달용으로 사용할 수 있어, 항암제 전달용 조성물로도 사용할 수 있다.
또한, 상기 자기 조립 나노입자는 광감작제의 특성을 유지하는 바, 광역학 치료에 사용할 수 있다.
상기 자기 조립 나노입자의 직경은 50 내지 250 nm일 수 있고, 100 내지 200 nm일 수 있고, 125 내지 175 nm일 수 있다. 나노입자의 직경이 50 nm 미만일 경우, 체내에서 너무 빨리 배출되는 문제가 있을 수 있고, 250 nm이상일 경우, 세포 내 흡수율이 떨어지는 문제가 생길 수 있다.
함암제가 봉입된 자기 조립 나노입자는 직경이 75 내지 350 nm일 수 있고, 100 내지 300 nm일 수 있고, 125 내지 250 nm일 수 있고, 125 내지 225 nm일 수 있고, 150 내지 200 nm일 수 있다. 나노입자의 직경이 75 nm 미만일 경우, 체내에서 너무 빨리 배출되는 문제가 있을 수 있고, 350 nm이상일 경우, 세포 내 흡수율이 떨어지는 문제가 생길 수 있다.
상기 자기 조립 나노입자는 하기 실시예 1에 나타낸 반응식 및 제조과정에 의해 제조될 수 있으나, 이는 일례일 뿐, 이에 한정되는 것은 아니며, 각 단계의 반응 조건은 널리 알려진 대체 조건으로 변경하여 수행할 수 있다.
함암제가 봉입된 자기 조립 나노입자는 하기 실시예 2에 나타낸 반응식 및 제조과정에 의해 제조될 수 있으나, 이는 일례일 뿐, 이에 한정되는 것은 아니며, 각 단계의 반응 조건은 널리 알려진 대체 조건으로 변경하여 수행할 수 있다.
본 발명의 자기 조립 나노입자의 자기 조립은 상기 화학식 1로 표시되는 개별 유닛을 용매에 용해시키고, 질소가스 흐름하에 건조하고, 진공하에 건조하여 필름층을 얻고, 필름층을 PBS 및 DMSO로 수화시키고, 초음파처리하여 자리 조립된 나노입자를 얻을 수 있다. 다만, 이는 일례일 뿐, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 자기 조립 나노입자를 포함하는 항암용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 자기 조립 나노입자는 내부에 항암제를 봉입시켜 암세포 선택적 및 특이적으로 항암제를 전달하고, 세포 내 흡수 및 약물 방출 효과도 우수한 바, 함암용 약학적 조성물로 사용될 수 있다.
상기 자기 조립 나노입자는 암세포 내 미토콘드리아 및 라이소좀을 공-표적화(co-targeting)하는 바, 종래의 광감작제와 다른 메커니즘으로 암세포를 사멸시킬 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어서, 상기 약학적 조성물은 임상 투여시에 직접 피부에 도포하거나, 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충전제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제, 트로키제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘 등과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염 등과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의할 수 있다. 또한, 직접 피부에 도포하는 방법을 통해 투여할 수 있으며, 도포시에는 연고, 스프레이, 화장수, 로션, 크림, 마사지크림, 에센스, 클렌징 제품, 팩, 파우더, 패치, 겔 등의 형태로 제조되어 도포될 수 있으며, 상기 종류에 특별히 제한 받지 않고 통상적인 도포 방법이라면 모두 사용될 수 있다.
이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 약학적 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 약학적 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 Kg인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.1-1000 mg/일이며, 바람직하게는 1-500 mg/일이며, 또한 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 자기 조립 나노입자를 포함하는 암의 광역학 치료용 조성물을 제공한다.
상기 자기 조립 나노입자는 암세포 내 미토콘드리아 및 라이소좀을 공-표적화(co-targeting)하는 바, 종래의 광감작제와 다른 메커니즘으로 암세포를 사멸시킬 수 있다.
상기 광역학 치료용 조성물은 자기 조립 나노입자 내부에 함암제를 봉입시켜 사용할 수 있다.
상기 암은 종래 항암제에 대한 내성이 생긴 암일 수 있다.
본 발명에 따른 광역학 치료용 조성물은 항암제를 봉입시켜 사용함으로써, 암세포에 항암제를 전달함과 동시에, 광역학 치료 효과를 나타낸 바, 병용 치료효과를 나타내며, 광역학 치료를 수행할 수 있는 바, 종래 항암제에 대한 내성이 생긴 암의 치료에도 사용할 수 있다.
이에, 상기 자기 조립 나노입자는 암의 병용 치료용 조성물로도 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 상기 자기 조립 나노입자를 포함하는 약학적 조성물을 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 자기 조립 나노입자를 포함하는 약학적 조성물을 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 병용 치료 방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 암의 치료에 있어서의, 상기 자기 조립 나노입자를 포함하는 약학적 조성물의 용도를 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<재료 및 준비>
하기 실시예 및 실험예 수행을 위한 재료 및 준비는 하기와 같다.
1. 실시예의 합성 재료 및 방법
모든 화합물 및 시약은 Sigma Aldrich, Korea 및 TCI Chemicals에서 구입하여 별도의 정제과정 없이 사용하였다. 실리카 겔 60 (Merck, HF-254, 0.25mm)를 사용하여 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 흡수 스펙트럼(Absorption spectra)은 Evolutiont™ 60 UV-Visible Spectrophotometer(Thermo Fisher Scientific, USA)를 사용하는 1cm quartz cuvettes에서 측정하였다. 방출 스펙트럼(Emission spectra)은 Jasco-FP 6500 spectrofluorometer에서 측정하였다. 1H 및 13C NMR 스펙트럼은 Bruker AVANCE500 및 JEOL 400 Spectrophotometer를 사용하여 내부 표준으로서 0.05 % v/v TMS를 함유하는 중수소 클로로포름 또는 디메틸 설폭사이드(Chambridge Isotope Labs)에서 측정하였다. 피크 다중도의 약어는 다음과 같다: s (singlet), d (doublet), dd (doublet doublet), t (트리plet), q (quartet), m (multiplet) 및 br (broad). 화학적 이동은 내부 TMS와 관련된 값 (ppm)으로 기록 J 값은 Hz로 기록하였다. MALDI-TOF 질량 스펙트럼은 MALDI TOF-TOF 5800 System (AB Sciex, USA)으로 얻었다.
2. 약물 방출 실험(in vitro)
약물 방출 프로파일(Drug release profiles)은 문헌(P. Ju, J. Hu, F. Li, Y. Cao, L. Li, D. Shi, Y. Hao, M. Zhang, J. He and P. Ni, J. Mater. Chem. B, 2018, 6, 7263-.7273.)에 공지된 투석 방법(dialysis method)법에 의해 in vitro로 수행하였다.
구체적으로, 실시예 2의 DOX @ TPP-PEG-biotin 자기 조립 나노입자로부터 화학약물(chemodrug) 독소루비신(DOX)의 방출 프로파일은 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS, pH 7.4 및 pH 6.0)를 사용하여 얻었다. 독소루비신이 담지된 나노입자 용액 (5ml)을 투석 막 백(dialysis membrane bag, MWCO 3500Da)에 넣은 다음 50ml의 완충액에 담근 후. 37 ℃하에 shaking water bath에서 100 rpm로 흔들었다. 이어서, 방출된 샘플(1 ml)을 상이한 시간 간격 (2, 4, 6, 8, 10, 12, 18, 24, 38 및 48 시간)에서 취하고, 동량의 신선한 완충 용액으로 대체 하였다. 다음, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC, Hewlett Packard, 1100 Series)를 사용하여 DOX 방출의 결과를 모니터링하였다. 모든 실험은 어둠속에서 표준 편차로 3 회 수행하였다.
3. 자가 조립 나노입자의 안정성 평가(in vitro)
실시예 1의 TPP-PEG-biotin 자가 조립 나노입자와 실시예 2의 DOX@TPP-PEG-biotin 자가 조립 나노입자를 동적 광산란(dynamic light scattering, DLS) 및 전기 영동 광산란(electrophoretic light scattering ,ELS) 분광계로 측정하였다. ㄱ구체적으로, 나노입자 용액을 2 ml의 PBS (pH 7.4)에 혼합하고, 37 ℃에서 배양하였다. 그 후, 상기 나노입자 용액을 각각 상이한 간격(0, 1, 2, 3, 4, and 5 days)으로 회수하고, DLS를 사용하여 분석하였다.
4. 세포배양
인간 유방암 세포주 MCF-7은 한국 세포주 은행(Korean Cell Line Bank (KCLB, Korea))으로부터 입수하였다. 정상 인간 일차 유방 상피 세포주 HMEC (ATCC PCS-600-010)는 American Type Culture Collection (ATCC)으로부터 수득하였다. 세포주는 10 % (v / v)의 열에 의해 비활성화된 소태아 혈청(heat-inactivated fetal bovine serum (FBS; GIBCO, USA))과 100 IU/ml의 페니실린 및 100 mg/ml 스트렙토마이신(GIBCO, USA)을 첨가한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM; GIBCO, USA)에서 37 ℃, 5 % CO2 대기에서 배양하였다.
5. 세포독성 분석
약 5.0 × 104 개의 MCF-7 세포를 96-웰 플레이트에 접종하고, 5 % CO2에서 37 ℃하에 밤새 배양하였다. 상기 세포를 상이한 농도의 광감작제(photosensitizers, PSs)(TPPS(tetraphenylporphyrins), TPP-PEG-biotin, TPP-PEG-biotin SANs 및 DOX@TPP-PEG-biotin SANs)(0 내지 12 mM)로 처리하고 밤새 배양하였다. 순차적으로 각 웰을 660 nm 다이오드 레이저를 사용하여 30 mW에서 20 분 동안 조사하였다. 조사 후, 세포를 이전과 동일한 조건하에 밤새 배양하였다. 광감작제를 함유하는 배지를 100 ml의 0.5 mg/ml MTT 용액(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide, Sigma-Aldrich, USA)으로 대체하고 암(dark) 조건에서 5 % CO2 대기하에 37 ℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 75 ml의 MTT 용액을 제거한 후, 75 ml의 DMSO(Sigma-Aldrich, USA)를 각 웰에 첨가하여 MTT의 환원에 의해 형성된 불용성 포르마잔 결정(formazan crystals)을 용해시켰다. 540 nm에서 포르마잔/DMSO 용액의 흡광도를 multiplate reader (Gemini XS, Molecular Devices, USA)를 사용하여 측정하였다. 상대적 세포생존능(relative cell viability)을 측정된 흡광도에 기초하여 분석 하였다.
6. 세포 내 위치 분석(Subcellular localization assay)
약 1.0 X 106 개의 MCF-7 세포를 6-웰 플레이트에서 커버 슬립 상에 플레이 팅하고 5 % CO2에서 37 ℃하에 24 시간 동안 배양하였다. 상기 세포를 3시간 동안 20 μM 농도에서 다양한 광감작제(TPPS(tetraphenylporphyrins), TPP-PEG-biotin, TPP-PEG-biotin SANs 및 DOX@TPP-PEG-biotin SANs)로 처리하였다. 이때, TPPS는 8시간동안 처리하였다. 이 후, 처리된 용액을 제거하고, 세포를 1 X PBS로 세척하였다. 세척 후, 상기 세포를 4 % 파라포름알데히드 용액 (Abel Bio, Korea)으로 실온에서 15 분 동안 고정시켰다. 이 후, 각 웰을 1 X PBS로 세척하고, 0.2 % 사포닌 용액(Sigma-Aldrich, USA)과 함께 실온에서 10분 동안 배양하여 MCF-7의 세포막을 투과시켜 세포 내 소기관의 염색이 가능하게 하였다. 1 X PBS를 사용하여 세포를 다시 한번 세척하고, Hoechst 33342, LysoTracker, MitoTracker 및 ER-Tracker (Invitrogen, USA)와 같은 세포 내 소기관에 특이적으로 염색되는 형광 프로브로 20 분간 어두운 곳에서 염색하였다. 염색된 세포를 1X PBS로 세척하고, 커버 슬립을 형광 모니터링 용액(Dako, USA)을 사용하여 유리 슬라이드 상에 장착하였다. 이어서 상기 세포를 공 초점 현미경(confocal microscope (TCS SP8, Leica, Germany))을 사용하여 관찰하고 영상화하였다.
7. 유세포분석을 통한 세포내 흡수 평가(Evaluation of the intracellular uptake by flow cytometry)
약 1.0 × 106 개의 MCF-7 세포를 6-웰 플레이트 상에 플레이팅하고 5 % CO2하에 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 세포를 37 ℃에서 DOX(1.5 μM) 및 광감작제인 TPPS(5 μM), TPP-PEG-biotin(5 μM) 및 TPP-PEG-biotin SANs(5 μM)으로 서로 다른시간 (30 분, 60 분, 120 분) 동안 처리하였다. 처리 후, 37 ℃에서 3 분 동안 트립신(GIBCO, USA)을 사용하여 플레이트로부터 세포를 분리하였다. 분리된 세포를 1X PBS로 세척하고 230 X g에서 3 분간 원심분리하였다. 원심분리 후, 상등액을 제거하고 세포를 다시 1X PBS로 세척한 다음, 3 분 동안 원심 분리 하였다. 수득된 세포 펠릿(pellet)을 500 μl의 1X PBS에 재현 탁시켰다. 이어서, MCF-7에서의 광감작제의 형광 강도를 FACSCaliburt™ (BD Biosciences, USA)를 사용하여 유세포 분석에 의해 측정하였다.
8. 세포내 약물 방출(Intracellular drug release)
페니실린(50 IU/ml) 및 스트렙토마이신(50 IU/ml)이 보충된 10 % 소태아 혈청(fetal bovine serum)을 함유하는 1.0 ml의 완전한 RPMI의 confocal dish(SPL Life Sciences)에 MCF-7 세포를 1 dish 당 104 세포 밀도로 접종하였다. 24시간 동안 배양한 후, 배양 배지를 제거하고 DOX@TPP-PEG-biotin SANs 및 DOX를 단독으로 포함하는 배양배지를 보충하였다. 이어서, 각 dish를 1X PBS로 세척 하였다. 핵을 염색하기 위해, 세포를 40.6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)와 함께 5 분 동안 배양 하였다. 염색 된 세포를 1 PBS로 다시 세척하고, 공 초점 현미경(confocal microscope) (TCS SP8, Leica, Germany)을 사용하여 세포를 영상화하였다.
9. 세포 내 활성 산소 종(reactive oxygen species) 생성 검출
세포 내 ROS 검출 실험은 제조사의 DCFDA kit 프로토콜을 따라 수행하였다. 약 1.0 X 105 개의 MCF-7 세포를 48-웰 플레이트에 접종하고, 5 % CO2 및 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 상이한 농도(1 μM, 3 μM 및 5 μM)의 TPP-PEG-biotin SANs로 암(dark) 조건 및 명(light) 조건하에 37 ℃에서 4 시간 동안 처리하였다. 처리 후, 상기 세포를 1X PBS로 세척하고, 2',7'-디클로로플루오레신 디아세테이트(2',7'-dichlorofluorescin diacetate)(DCFDA; Abcam, UK) 용액(20 μM)으로 암 조건하에, 30분 동안 처리하였다. 이후, 상기 세포를 660 nm 다이오드 레이저를 사용하여 30 mW에서 10 분 동안 조사하였다. DCFDA 용액을 제거하고 세포를 1X PBS로 세척 하였다. 마지막으로, 형광 현미경(IX73, Olympus, Japan)을 사용하여 세포를 관찰하고 영상화하였다. 여기 및 방출 파장은 각각 495 nm / 529 nm였다.
10. 하이 컨텐츠 스크리닝 분석(High-content screening assay)
MCF-7 세포를 12- 웰 플레이트에 플레이팅하고, 5 % CO2 및 37 ℃에서 배양하였다. 배양된 세포를 상이한 농도(1 μM, 4 μM 및 10 μM)의 TPP-PEG-biotin SANs 및 DOX@TPP-PEG-biotin SANs로 24 시간 동안 처리하였다. 이후, 상기 세포를 660 nm 다이오드 레이저를 사용하여 30 mW에서 30 분 동안 조사하였다. 1X PBS로 완전히 세척한 후, 세포를 calcium indicator orange solution (Invitrogen, USA)으로 즉시 처리하고, 상온에서 암(dark) 조건하에 45 분 동안 배양하였다. 상기 세포를 1X PBS로 세척하고 MitoProbe Transition Pore Assay kit (Invitrogen, USA)에 함유된 calcein acetoxymethyl ester(calcein-AM) solution으로 처리하였다. 이후, 세포를 암(dark) 조건하에 37 ℃에서 Magic Red™ caspase-3/7 substrate solution(Immuno-Chemistry Technologies, USA)로 6분동안 처리하였다. 이어서, 상기 세포를 CoCl2로 처리하고, 암(dark) 조건하에 37 ℃에서 10분 동안 배양하였다. 마지막으로, 염색된 세포를 1X PBS로 세척한 후, 488 nm에서 여기시키면서 acousto-optic tunable filter (AOTF; TEAF10-0.45-0.7-s, Brimrose Corporation, USA)를 사용하여 영상화하였다.
< 실시예 1> 자기 조립 나노입자(self-assembled nanoparticle )의 제조
Figure 112018131209931-pat00009
상기 반응식에서, n는 70이다.
단계 1: 5,10,15,20-테트라페닐폴피린(TPP)의 제조
TPP는 문헌(A. D. Adler, F. R. Longo, J. D. Finarelli, J. Goldmacher, J. Assour and L. Korsakoff, J. Org. Chem., 1967, 32, 476.)에 공지된 방법으로 제조하였다. 구체적으로, 벤즈알데히드 및 갓 증류된 피롤을 환류중인 프로피오닉 애시드에 천천히 첨가하엿다. 상가 반응 혼합물을 130 ℃에서 30분간 교반시킨 후, 상온으로 냉각시키고, 고체를 천천히 여과하여 메탄올:아세톤(1 : 1, v:v) 혼합용액으로 세척하여 얻은 보라색 고체를 다시 뜨거운 물로 여러번 세척하여 흡착된 프로피오닉 애시드를 제거하였다. 상기 고체를 건조기(desiccator)에서 하룻동안 건조시키고, 최종적으로 진공 펌프에서 건조하여 순수한 TPP를 얻었다.
수율: 200 mg; 1H NMR (500 MHz, chloroform-d) δ 8.84 (s, 3H), 8.21 (dt, J = 6.3, 1.7 Hz, 3H), 7.74 (qd, J = 8.8, 7.9, 3.9 Hz, 5H), -2.78 (s, 1H); 13C NMR (126 MHz, chloroform-d) δ 142.17, 134.54, 127.69, 126.66, 120.12; MALDI-TOF MS: m/z 615.4 [M]+.
단계 2: 5-(4-니트로페닐)-10,15,20-트리페닐폴피린(TPP-NO 2 )의 제조
10 ml의 트리플루오로아세틱 애시드를 RB flask에 넣고, 5,10,15,20-테트라페닐폴피린 (200 mg, 0.32 mmol)을 상온에서 천천히 첨가하고 교반시켜 고체를 용해시켰다. 이후, 소듐 니트라이트(40 mg, 0.58 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 3분간 교반시키고, 즉시 얼음물에 붓고 DCM(dichloromethane)으로 추출하였다. DCM층을 소듐 바이카보네이트 및 물로 세번 세척하였다. 합친 DCM 층을 소듐 설페이트로 건조하였다. 용매를 rotary evaporator를 사용하여 제거한 후, 미정제 물질을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(이동상: 에틸 아세테이트:헥산)를 사용하여 정제하여 TPP-NO2를 얻었다.
수율: 230 mg; 1H NMR(500 MHz, chloroform-d) δ 8.88 (d, J = 4.7 Hz, 1H), 8.85 (s, 2H), 8.83 (s, 1H), 8.72 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 8.62 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.38 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 8.23-8.17 (m, 3H), 7.82-7.69 (m, 5H), -2.79 (s, 1H); 13C NMR (126 MHz, chloroform-d) δ 141.89 (d, J = 4.6Hz), 135.11, 134.52, 127.87, 126.74 (d, J = 3.8 Hz), 121.84; MALDI-TOF MS: m/z 662.4 [M + 3]+.
단계 3: 4-(10,15,20-트리페닐폴피린-5-일)아닐린(TPP-NH 2 )의 제조
conc.HCl(15 ml)를 RB flask에 넣고 5-(4-니트로페닐)-10,15,20-트리페닐폴피린 (195mg, 0.29 mmol)을 첨가하였다. 5분간 교반시킨 후, 맑은 용액을 얻었고, 틴(II) 클로라이드(stannous chloride dihydrate)(400 mg, 1.77 mmol)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 N2 대기하에, 65 ℃에서 1시간 환류시켰다. 상기 반응 혼합물을 상온으로 냉각시키고, 얼음 용액에 천천히 첨가하고, 암모늄 하이드록사이드로 중성화 하였다. DCM(2 X 100ml)으로 추출하여 분홍색 용액을 얻었다. 상기 용액을 rotary evaporator로 증류하여 고체(TPP-NH2)를 얻었다.
수율: 150 mg; 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8.97 (d, J = 4.8 Hz, 2H), 8.83 (s, 2H), 8.80 (s, 6H), 8.22 (td, J = 6.3, 5.5, 2.8 Hz, 9H), 7.90-.7.78 (m, 16H), 7.01 (d, J = 8.0Hz, 2H), 5.61 (s, 2H), -2.86 (s, 2H); 13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) d 148.68, 141.33, 135.56, 134.19, 128.24, 128.01, 126.98, 126.95, 121.94, 120.01, 119.73, 119.26, 112.52; MALDI-TOF MS: m/z 630.3 [M]+.
단계 4: TPP-PEG-biotin의 제조
TPP-PEG-biotin 화합물은 biotin-PEG-COOH 및 TPP-NH2 간의 애시드-아민 커플링 반응에 의해 합성되었다. 구체적으로, 에톡시 반복단위가 70개인 biotin-PEG-COOH(1 mmol), DMAP(4-Dimethylaminopyridine), EDCI(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) 및 CH2Cl2(3 ml)을 glass vial에 넣고, 0 ℃에서 3시간 교반시켰다. 이후, TPP-NH2 (1 mmol)을 첨가하여 N2 대기하에, 상온에서 36시간 연속적으로 교반시켰다. 비공액(unconjugated) TPP-NH2 및 EDCI 부가생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피ㄹ로 제거하였다. 최종적으로 동결건조기(lyophilizer)를 사용하여 건조한 순수한 TPP-PEG-biotin 화합물을 얻었으며, 분광법(spectroscopy methods)으로 생성을 확인하였다. 분광법으로 확인한 1H NMR 스펙트럼을 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타난 바와 같이, TPP-PEG-biotin 화합물이 정상적으로 생성되었음을 알 수 있다.
MALDI-TOF MS: m/z 4169.3 [M]+.
단계 5: TPP-PEG-biotin 자기 조립 나노입자(TPP-PEG-Biotin self-assembled nanoparticles(SANs))의 제조
나노입자(nanoparticles, NPs)는 문헌(Y. Lee, S. Lee, D. Y. Lee, B. Yu, W. Miao and S. Jon, Angew. Chem., 2016, 128, 10834-10838.)에 공지된 방법으로 제조하였다. 구체적으로, 단계 4의 TPP-PEG-biotin 화합물(50 mg)을 클로로포름(5 ml)에 용해시키고, 질소가스 흐름 하에 건조하고, 진공하에 추가적으로 건조하여 TPP-PEG-biotin 필름층(film layer)을 얻었다. 나노입자의 생성을 위하여, TPP-PEG-biotin 필름층을 PBS (pH 7.4)(900 ml) 및 DMSO(100 ml)로 수화시키고, 용액 혼합물을 15분간 초음파처리한 후, 균일한 크기의 TPP-PEG-biotin 자기 조립 나노입자를 천천히 얻었다. 상기 나노입자를 TJ-25 centrifuge (Beckman Coulter)를 사용하여 15 000 rpm에서 원심분리하여 수집하였다. 분광법으로 확인한 1H NMR 스펙트럼을 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타난 바와 같이, TPP-PEG-biotin SANs이 정상적으로 생성되었음을 알 수 있다. 또한, TPP-PEG-Biotin SANs의 특징을 투과 전자 현미경(Transmission electron microscopy, TEM) 및 주사 전자 현미경(Scanning electron microscope, SEM)을 통해 확인하였다. 생성된 TPP-PEG-Biotin SANs은 PBS (pH 7.4)에 희석하여 in vitro 실험에 사용하였다.
< 실시예 2> 함암제가 봉입 된 자기 조립 나노입자(self-assembled nanoparticle)의 제조
본 실시예 2는 본 발명에 따른 광감작제(photosensitizer); 폴리알킬렌글리콜; 및 바이오틴(biotin)으로 구성되는 자기 조립 나노입자(self-assembled nanoparticle)를 항암제 전달용 조성물 또는 광역학 치료용 조성물로 사용할 수 있음을 확인하기 위하여, 실시예 1에서 제조한 자기 조립 나노입자 내부에 함암제가 봉입된 나노입자로 제조한 것이다. 본 실시예 2에서는 약물로서 독소루비신(doxorubicin, DOX)를 사용하여, 독소루비신이 봉입된 TPP-PEG-biotin 자기 조립 나노입자(DOX@TPP-PEG-biotin SANs)를 제조하였다.
Figure 112018131209931-pat00010
상기과 같은 반응식에 따라 함암제가 봉입된 자기 조립 나노입자(self-assembled nanoparticle)를 제조할 수 있으며, 구체적인 제조방법은 하기와 같다.
상기 실시예 1의 단계 4에서 얻은 TPP-PEG-biotin (2 mmol)로 제조한 TPP-PEG-biotin 필름층을 20 μl의 독소루비신(DOX) (1 mg/ml)을 함유한 PBS (pH 7.4)로 수화시켰다. 15분간 초음파처리한 후, 상기 용액을 24시간 숙성시켜 최종적으로 독소루비신이 봉입된 TPP-PEG-biotin 자기 조립 나노입자(DOX@TPP-PEG-biotin SANs)이 형성되었다. 봉입되지 않은 독소루비신을 Ultra-15 centrifugal filter tube (3 kDa, Merck Millipore, South Korea)를 사용하여 15 000 rpm에서 원심분리하여 제거하였다. 봉입 효율(encapsulation efficiency) 및 약물 담지 효율(drug loading efficiency)을 하기 식으로 계산하였다.
[수학식 1]
봉입 효율(Encapsulation efficiency) (%) = (amount of DOX drug in NP solution/total weight of drug added initially) X 100
[수학식 2]
약물 담지 효율(Drug loading percentage) (%) = [amount of DOX drug in NP solution/(amount of DOX drug in NP solution + amount of TPP-PEG-biotin added initially)] X 100
< 실험예 1> 자기 조립 나노입자(self-assembled nanoparticle )의 제조 확인
본 발명에 따른 자기 조립 나노입자가 정상적으로 형성되었는지 확인하였다. 구체적으로, 자외선 가시광선 분광법(UV-vis absorption spectroscopy), 주사 전자 현미경(Scanning electron microscope, SEM), 투과 전자 현미경(Transmission electron microscopy, TEM), 및 1H NMR를 통하여 제조를 확인하였다.
1-1. 1 H NMR 분석
실시예 1의 단계 4에서 얻은 TPP-PEG-biotin 및 단계 5에서 얻은 TPP-PEG-biotin SANs의 1H NMR을 각각 도 1(TPP-PEG-biotin) 및 도 2(TPP-PEG-biotin SANs)에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 단계 4에서 TPP-PEG-biotin 화합물이 정상적으로 생성되었음을 알 수 있다.
도 2에 나타난 바와 같이,
실시예 1의 단계 5에서 얻은 자기 조립 나노입자(TPP-PEG-biotin SANs)의 1H NMR에서, -2.81 ppm의 피크는 TPP 단위의 피롤 고리의 NH 양성자를 나타내며, 약 7.49-8.83 ppm에서 나타나는 피크는 TPP 단위의 방향족 양성자를 나타낸다. 또한, 3.62 ppm에서의 -OCH2 피크는 PEG 유닛에서의 에톡시를 나타낸다. 또한, 4.51-4.54 ppm에서 나타나는 피크는 바이오틴의 두개의 -CH 양성자를 나타낸다. 또한, 2.54 ppm에서의 싱글렛 피크는 바이오틴의 -SCH2 양성자를 나타내고, 3.0 ppm,에서의 피크는 바이오틴의 -SH 양성자를 나타낸다. 또한, 1.10-2.06 ppm에서 나타나는 피크는 바이오틴의 -CH2 피크를 나타낸다. 또한, 6.57 및 6.59 ppm의 피크는 바이오틴 유닛의 NH 양성자를 나타낸다.
상기 결과로부터, 단계 4에서 얻은 TPP-PEG-biotin 개별 유닛이 자기 조립되어 자기 조립 나노입자(TPP-PEG-biotin SANs)를 정상적으로 형성하였음을 알 수 있다.
1-2. 주사 전자 현미경(Scanning electron microscope, SEM) 분석
실시예 1의 단계 5에서 얻은 자기 조립 나노입자(TPP-PEG-biotin SANs)의 주사 전자 현미경 이미지를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 단계 4에서 얻은 TPP-PEG-biotin 개별 유닛이 자기 조립되어 자기 조립 나노입자(TPP-PEG-biotin SANs)를 정상적으로 형성하였음을 알 수 있다.
1-3. 자외선 가시광선 분광법 분석
자외선 가시광선 분광법을 통해 독소루비신(DOX), 실시예 1의 단계 4에서 얻은 TPP-PEG-biotin 유닛, 실시예 1의 단계 5에서 얻은 자기 조립 나노입자(TPP-PEG-biotin SANs) 및 실시예 2에서 얻은 함암제가 봉입된 자기 조립 나노입자(DOX@TPP-PEG-biotin SANs)에 대하여, UV-vis 흡수 및 방출 스펙트럼을 도 4a 및 도 4b에 나타내었다.
도 4a 및 도 4b에서 나타난 바와 같이,
약물(독소루비신, DOX)이 봉입된 DOX@TPP-PEG-biotin SANs의 UV-vis 스펙트럼은 TPP-PEG-biotin 및 TPP-PEG-biotin SANs와 비교하여, Soret 밴드(421 nm - 450 nm)와 Q 밴드(522 nm - 526 nm)에서 흡수 극대파장이 장파장 쪽으로 이동(red shift)가 근소하게 일어남을 명백히 나타내었다. 상기 결과는, 약물이 TPP-PEG-biotin SANs 내부에 봉입되었음을 입증한다.
1-4. 투과 전자 현미경(Transmission electron microscopy, TEM ) 및 나노입자 크기 분석
실시예 1의 단계 5에서 얻은 자기 조립 나노입자(TPP-PEG-biotin SANs) 및 실시예 2에서 얻은 함암제가 봉입된 자기 조립 나노입자(DOX@TPP-PEG-biotin SANs)의 투과 전자 현미경(Transmission electron microscopy, TEM) 이미지를 도 4c 및 도 4d에 나타내었으며, 실시예 1의 단계 5에서 얻은 자기 조립 나노입자(TPP-PEG-biotin SANs)(도 4e) 및 실시예 2에서 얻은 함암제가 봉입된 자기 조립 나노입자(DOX@TPP-PEG-biotin SANs)(도 4f)의 입자 크기 분포를 도 4e 및 도 4f에 나타내었다.
도 4c, 도 4d, 도 4e 및 도 4f에 나타난 바와 같이,
함암제가 봉입되지 않은 실시예 1의 단계 5에서 얻은 자기 조립 나노입자(TPP-PEG-biotin SANs)는 150 ± 25 nm의 입자크기를 나타내며, 실시예 2에서 얻은 함암제가 봉입된 자기 조립 나노입자(DOX@TPP-PEG-biotin SANs)는 175 ± 25 nm의 입자크기를 나타냄을 확인하였다.
< 실험예 2> 자기 조립 나노입자(self-assembled nanoparticle ) 의 안정성 평가
본 발명에 따른 자기 조립 나노입자의 안정성을 평가하였다.
2-1. 시간 경과에 따른 입자크기 변화 측정
실시예 1의 단계 5에서 얻은 자기 조립 나노입자(TPP-PEG-biotin SANs) 및 실시예 2에서 얻은 함암제가 봉입된 자기 조립 나노입자(DOX@TPP-PEG-biotin SANs)의 시간 경과에 따른 입자 크기를 분석하여 그 결과를 도 5a에 나타내었다.
도 5a에 나타난 바와 같이,
시간이 경과하여도, 자기 조립 나노입자는 약물의 봉입 유무에 관계 없이, 일정한 입자크기를 유지하는 것을 알 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 자기 조립 나노입자는 시간 경과에도, 형태를 유지하는 바, 안정한 물질임을 알 수 있다.
2-2. 시간 경과에 따른 zeta potential 측정
실시예 1의 단계 5에서 얻은 자기 조립 나노입자(TPP-PEG-biotin SANs) 및 실시예 2에서 얻은 함암제가 봉입된 자기 조립 나노입자(DOX@TPP-PEG-biotin SANs)의 시간 경과에 따른 제타 포텐셜 변화를 측정하여 그 결과를 도 5b에 나타내었다.
도 5b에 나타난 바와 같이,
시간이 경과하여도, 자기 조립 나노입자는 약물의 봉입 유무에 관계 없이, 일정한 제타 포텐셜 값을 유지하는 것을 알 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 자기 조립 나노입자는 안정한 물질임을 알 수 있다.
2-3. 약물 방출 평가
실시예 2에서 얻은 함암제가 봉입된 자기 조립 나노입자(DOX@TPP-PEG-biotin SANs)의 시간 경과에 따른 약물의 누적 방출량(cumulative release)을 측정하여 그 결과를 도 5c에 나타내었다. DOX@TPP-PEG-biotin SANs으로부터 독소루비신(DOX)의 방출 패턴을 dialysis method를 통하여 분석하였다. HPLC를 사용하여 서로 상이한 시간에서 방출을 측정하였다. 서로 상이한 PBS 배지(pH 7.4 및 pH 6.0)에서 37 ℃하에 나노입자로부터의 약물의 방출은 함암제가 봉입된 자기 조립 나노입자(DOX@TPP-PEG-biotin SANs)의 안정성을 나타낸다.
도 5c에 나타난 바와 같이,
약 24시간 후, 독소루비신의 방출이 pH 6.0 PBS에서 65.4 ± 2.0%인 것과 비교하여, pH 7.4 PBS 배지에서 30.0 ± 1.8%를 나타내었다. 상기 결과는 독소루비신이 산성 조건하에서 세포 외부로 방출되는 것을 의미한다.
2-4. 투과율 측정
실시예 1에서 얻은 자기 조립 나노입자(TPP-PEG-biotin SANs)의 시간 경과에 따른 투과율을 측정하여 그 결과를 도 5d에 나타내었다. 본 결과는 자기조립 나노입자의 안정성을 나타낸다. SANs의 안정성은 10 % 인산염 완충 식염수(PBS) 단독, 50% 소태아혈청(FBS)(v / v)의 Dulbecco 's modified Eagle 's medium(DMEM) 및 10% 소태아혈청(FBS)(v / v)의 Dulbecco 's modified Eagle 's medium(DMEM)을 사용하는 생리적 조건하에서, 37 ℃에서 3일간 배양하여 분석하였다.
도 5d에 나타난 바와 같이,
자기 조립 나노입자는 3일 동안 투과율이 거의 변화되지 않았으며, 입자의 응집이 없음을 확인하였다. 이로부터, 본원 발명의 자기 조립 나노입자는 안정한 물질임을 확인하였다.
< 실험예 3> 세포 독성 평가
MCF-7 유방암 세포주에서 TPPS(tetraphenylporphyrins), TPP-PEG-biotin, TPP-PEG-biotin SANs 및 DOX@TPP-PEG-biotin SANs와 독소루비신(DOX)의 세포 독성을 MTT 분석으로 평가하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이,
암 조건에서, TPPS(tetraphenylporphyrins), TPP-PEG-biotin 및 TPP-PEG-biotin SANs는 세포 생존율에 유의미한 변화가 없었으며(도 6a), 명 조건에서는 농도 의존적으로, MCF-7의 세포 생존력을 현저하게 감소시켰다(도 6b). 이는, 본 발명의 자기 조립 나노입자가 광활성화 특성으로, 광역학 치료가 가능함을 나타낸다.
또한, 함암제가 봉입된 자기 조립 나노입자는 함암제가 봉입된 바, 농도 의존적으로 MCF-7의 세포 생존력을 감소시키며, 명 조건에서의 MCF-7의 세포 생존력 감소 효과가 보다 우수한 것을 알 수 있다. 이로부터, 본 발명의 함암제가 봉입된 자기 조립 나노입자는 약물의 효과와 더불어, 광역학 치료가 가능한 것을 알 수 있다.
< 실험예 4> IC 50 값 측정
독소루비신(DOX), TPPS, TPP-PEG-biotin, TPP-PEG-biotin SANs 및 DOX@TPP-PEG-biotin SANs의 IC50 값을 계산하여 하기 표 1에 나타내었다.
IC50 값은 명 조건에서 MTT 분석에 근거하여 계산하였으며, DOX@TPP-PEG-biotin SANs은 명 조건 및 암 조건 모두에서 측정하였다.
IC50 (μM)
TPPS(tetraphenylporphyrins) 5.12
TPP-PEG-biotin 3.31
TPP-PEG-biotin SANs 4.74
DOX@TPP-PEG-biotin SANs(dark) 1.07
DOX@TPP-PEG-biotin SANs(light) 0.71
chemodrug DOX 1.56
상기 표 1에 나타난 바와 같이,
TPPS 자체보다 TPP-PEG-biotin이 IC50 값이 감소되었으며, 이는, TPP에 PEG 및 바이오틴이 결합되고, 특히, 표적 부분으로서 바이오틴이 결합됨으로써, 보다 효율적인 광역학 치료 효과를 나타내기 때문이다. 또한, TPP-PEG-biotin SANs은 명 조건하에서 TPP-PEG-biotin보다 높은 IC50 값을 나타내었다.
반면, 독소루비신(DOX)가 봉입된 자기 조립 나노입자 DOX@TPP-PEG-biotin SANs는, 명 조건 및 암 조건에서 모두 현저하게 낮은 IC50값을 나타내며, 특히, 독소루비신 자체가 나타내는 IC50값 보다도 낮은 값을 나타내어, 항암효과가 상승되었음을 알 수 있다.
< 실험예 5> 표적화 능력 평가
본 발명의 자기 조립 나노입자의 표적화 능력(targeting ability)를 평가하기위하여 공초점 현미경(CLFM) 분석을 수행하였다.
구체적으로, 생체 내에서의 TPP-PEG-biotin SANs의 표적화 능을 평가하기 위하여, 바이오틴 수용체 양성 세포주 MCF-7과 바이오틴 수용체 음성 세포주 HMEC(정상 세포주)를 사용하였다. MCF-7 및 HMEC 세포주를 5 μM의 TPP-PEG-biotin SANs로 처리하여 공초점 현미경 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이,
동일한 실험 조건하에서 비오틴 수용체 음성 세포주(HMEC)보다 비오틴 수용체 양성 세포주(MCF-7)에서 강한 형광 강도가 관찰되었다. 상기 결과는, TPP-PEG-biotin SANs이 비오틴 표적 부분에 기인한 수용체 매개 세포내이입(receptor mediated endocytosis)을 통해 정상 세포주와 비교하여 바이오틴 양성 세포주에 흡수되었음을 입증한다.
이는, 상기 실험예 4의 빛 조건에서 DOX@TPP-PEG-biotin SANs이 가장 낮은 IC50 값을 나타낸 것과 일치하는 결과이다.
< 실험예 6> 세포 내 활성 산소 종( ROS ) 생성 검증
특정 파장에서 광감작제의 광활성화는 세포 내에서 ROS를 생성하여 암세포에 세포 독성을 나타내는 바, 본 발명의 자기 조립 나노입자의 광역학 치료 효과를 검증하기 위하여, 자기 조립 나노입자 처리에 따른 세포 내 활성 산소 종 생성을 검증하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이,
명 조건에서 TPP-PEG- 바이오틴 SANs으로 처리한 MCF-7 세포에서의 ROS 생성이 형광 현미경에 의해 명확하게 검출되었다.
또한, 레이저 조사 조건하에서 TPP-PEG-biotin SANs에 의해 농도 의존적으로 세포 내 ROS 생산이 적절히 유도되었음을 알 수 있다.
상기 결과로부터, 본 발명의 자기 조립 나노입자는 광역학 치료 효과를 나타냄을 확인하였다.
< 실험예 7> 약물 담지량 및 세포 내 약물 방출 평가(In vitro)
본 발명에 따른 함암제가 봉입된 자기 조립 나노입자의 약물 담지량(drug loading content) 및 세포 내 약물 방출을 in vitro 수준에서 평가하였다.
7-1. 약물 담지량 측정
구체적으로, 약물 담지량은 하기 수학식 2로 계산된 일련의 약물(독소루비신, DOX) 농도에서 얻어진 표준 곡선으로부터 얻어졌다.
[수학식 2]
약물 담지 효율(Drug loading percentage) (%) = [amount of DOX drug in NP solution/(amount of DOX drug in NP solution + amount of TPP-PEG-biotin added initially)] X 100
계산 결과, DOX@TPP-PEG-biotin의 독소루비신 담지량은 25.03 %로 계산되었다.
7-2. 세포 내 약물 방출 평가
공초점 레이저 형광 현미경 (confocal laser fluorescence microscopy, CLFM) 분석을 통해 세포 내 약물 방출을 평가하였다. 구체적으로, CLFM 분석을 통해 DOX@TPP-PEG-biotin SANs의 세포 내 독소루비신 약물 방출/전달 양상을 평가하였다. MCF-7 세포에 독소루비신(DOX) 및 DOX@TPP-PEG-biotin SANs를 각각 처리한 후, 37 ℃에서 배양하고, 상이한 시간 간격(12 시간 및 24 시간)에서 DOX@TPP-PEG-biotin SANs의 독소루비신 방출 프로파일을 평가 하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이,
24 시간 경과 시점에서, DOX@TPP-PEG-biotin SANs는 12 시간 시간 경과 시점보다, DOX의 강한 형광 강도를 나타냈다. 반면, 독소루비신 단독 처리군에서는 TPP-PEG-biotin SANs에 담지된 독소루비신과 비교하여 MCF-7 세포에 천천히 분포/전달된 것을 알 수 있다.
즉, 본 발명의 함암제가 봉입된 자기 조립 나노입자를 처리하는 것이, 약물 자체를 단독 처리하였을 때보다, 약물 전달 능력이 보다 우수함을 알 수 있다.
< 실험예 8> 세포 내 위치 분석
광역학 치료에 의해 생성된 세포 내 ROS의 수명이 매우 짧기 때문에 ROS가 세포 내의 다른 영역으로 이동하는 것이 어렵다. 이에, 광감작제가 세포에 축적되는 위치를 파악하는 것이 중요한 바, 본 발명의 자기 조립 나노입자의 세포 내 축적 위치를 파악하기 위하여, 세포 내 위치 분석을 수행하였다.
구체적으로, TPPS(tetraphenylporphyrins), TPP-PEG-biotin, TPP-PEG-biotin SANs 및 DOX@TPP-PEG-biotin SANs의 세포 내 소기관에 특이적으로 염색되는 형광 프로브를 사용하여 공초점 현미경 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10a에 나타난 바와 같이,
TPPS와 LysoTracker Green의 형광 이미지가 중첩되는 것으로부터, TPPS의 축적 위치가 MCF-7의 라이소좀에 국한되어 있음을 알 수 있다. 즉, TPPS는 세포 내 라이소좀에 국한되어 있음을 알 수 있다.
반면, TPP-PEG-biotin 및 TPP-PEG-biotin SANs의 형광 이미지는 LysoTracker Green와 부분적으로 중첩되는 것을 알 수 있다.
도 10b에 나타난 바와 같이,
TPP-PEG-biotin 및 TPP-PEG-biotin SANs와 LysoTracker Green의 형광 이미지가 중첩되는 것으로부터, TPP-PEG-biotin 및 TPP-PEG-biotin SANs이 미토콘드리아에 위치함을 알 수 있다.
도 10c에 나타난 바와 같이,
DOX@TPP-PEG-biotin SANs이 세포 내에서 라이소좀과 미토콘들이라에 위치하며, 부분적으로 핵 속에도 위치함을 알 수 있다. 자기 조립 나노입자에서의 독소루비신은 세포 내 핵속에 위치할 수 있게 하는 중요한 요인이다.
도 10d에 나타난 바와 같이,
TPP-PEG-biotin 및 TPP-PEG-biotin SANs의 형광이 ER-Tracker와 중첩되지 않는 것을 알 수 있으며, 이로부터, TPP-PEG-biotin 및 TPP-PEG-biotin SANs는 소포체(endoplasmic reticulum)에는 위치하지 않는 것을 알 수 있다.
상기 실험 결과로부터, 본 발명에 따른 TPP-PEG-biotin, TPP-PEG-biotin SANs 및 DOX@TPP-PEG-biotin SANs은 라이소좀과 미토콘드리아 및 세포 핵에 침투됨을 알 수 있으며, 이는 종래 사용되던 광감작제인 TPPS(tetraphenylporphyrins)가 라이소좀에만 위치하는 것과 차이가 있음을 알 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 TPP-PEG-biotin, TPP-PEG-biotin SANs 및 DOX@TPP-PEG-biotin SANs은 종래 광감작제와 다른 세포 사멸 메커니즘을 통해 암 세포 사멸을 유도하는 것을 알 수 있다.
< 실험예 9> 세포 내 흡수 평가
암세포에서의 광감작제의 세포 내 흡수는 항암 효과를 결정하는 가장 중요한 요인중 하나인 바, 본 발명에 따른 TPP-PEG-biotin, TPP-PEG-biotin SANs 및 DOX@TPP-PEG-biotin SANs의 세포 내 흡수를 평가하였다. 구체적으로, MCF-7에 5 μM 농도로 TPPS(tetraphenylporphyrins), TPP-PEG-biotin, TPP-PEG-biotin SANs 및 DOX@TPP-PEG-biotin SANs를 처리하여 각각 30 분, 60 분 및 120 분 동안 배양하였으며, 독소루비신(DOX)을 단독으로 1.5 μM로 동일한 시간동안 처리하였다. 세포 내 흡수는 세포 내 형광을 측정함으로써 유동 세포 계측법에 의해 평가되었다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타난 바와 같이,
배양 시간이 증가할수록 TPPS(tetraphenylporphyrins), TPP-PEG-biotin, TPP-PEG-biotin SANs 및 DOX@TPP-PEG-biotin SANs과 DOX 모두의 형광 강도가 증가함을 알 수 있다.
또한, 유세포분석을 통한 세포내 흡수 평가(Evaluation of the intracellular uptake by flow cytometry) 분석의 결과는 TPP-PEG-biotin의 세포 내 흡수가 TPPS의 세포 내 흡수에 비해 현저하게 빠르다는 것을 알 수 있다.
이는, 본 발명에 따른 TPP-PEG-biotin, TPP-PEG-biotin SANs 및 DOX@TPP-PEG-biotin SANs에 바이오틴이 도입됨으로써, Biotin 수용체를 과발현하는 MCF-7 세포에서 세포 내 흡수가 촉진되었기 때문으로 예상된다.
반면, 자기 조립 나노입자인 TPP-PEG-biotin SANs의 세포 흡수는 화학적 형태인 개별유닛 TPP-PEG-biotin에 비해 느린 속도로 세포 내에 흡수되는 결과를 나타내었다.
상기 결과로부터, 본 발명의 자기 조립 나노입자는 종래 광감작제를 대체하여 광역학 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
< 실험예 10> 하이 컨텐츠 세포 사멸 역학(High-content cell death dynamics) 분석
하이 컨텐츠 세포 사멸 역학을 분석하기 위하여, 하이 컨텐츠 스크리닝 분석(High-content screening assay)을 수행하였다. 구체적으로, MCF-7 세포에 TPP-PEG-biotin SANs 및 DOX@TPP-PEG-biotin SANs를 각각 처리하여, 하이 컨텐츠 스크리닝 분석을 수행하였으며, TPP-PEG-biotin SANs의 결과를 도 12에, DOX@TPP-PEG-biotin SANs의 결과를 도 13에 나타내었다. TPP-PEG-biotin SANs 처리는 명 조건에서 수행하였으며, DOX@TPP-PEG-biotin SANs 처리는 명 조건 및 암 조건에서 수행하였다.
도 12 및 도 13에 나타난 바와 같이,
TPP-PEG-biotin SANs 및 DOX@TPP-PEG-biotin SANs으로 처리한 MCF-7 세포에서, 미토콘드리아 막 파괴, 사이토솔릭 Ca2 +의 양 증가 및 caspase-3의 활성화가 동시에 관찰되었다.
구체적으로, 명 조건에서, 1 μM 농도의 TPP-PEG-biotin SANs 및 DOX@TPP-PEG-biotin SANs를 처리할 경우, ROS로 인한 미토콘드리아의 손상으로 인해 미토콘드리아 막 투과성 변이(mitochondrial membrane permeability transition (MPT))가 나타나고, 이로 인하여, 미토콘드리아에 축적된 calcein-AM의 형광 강도가 급격히 감소되었다. 이와 함께, 사이토솔릭 Ca2 +의 양도 급격하게 증가하였다. 반면, caspase-3의 활성화는 TPP-PEG-biotin SANs 및 DOX@TPP-PEG-biotin SANs에 농도 의존적으로 지속적으로 증가하는 것을 알 수 있다.
한편, 암 조건에서, DOX@TPP-PEG-biotin SANs를 처리할 경우, 미토콘드리아 손상, 사이토솔릭 Ca2 +의 양의 증가 및 spase-3의 활성화가 명 조건에서보다 적은 것을 알 수 있다.
이는, 독소루비신이 TPP-PEG-biotin SANs내에 봉입되어 있어, 명 조건에서 많이 방출되기 때문이다.
따라서, 본 발명에 따른 자기 조립 나노입자 및 함암제가 봉입된 자기 조립 나노입자를 성공적으로 합성하였으며, 상기 자기 조립 나노입자 및 함암제가 봉입된 자기 조립 나노입자는 광감작제의 특성을 유지하여, 광역학 치료에 유용하게 사용될 수 있고, 본 발명에 따른 자기 조립 나노입자는 빠른 세포 흡수를 나타내며, 암세포에 대해 선택성 및 특이성을 나타내며, 암세포에 종래 괌감작제 및 약물보다 우수한 항암효과를 세포 독성을 나타내며, 종래 광감작제와 다른 메커니즘으로 암세포의 사멸을 유도하고, 항암제를 봉입할 수 있는 바, 항암제 투여와 동시에 광역학 치료를 수행할 수 있는 병용요법을 사용 가능하므로, 새로운 항암제 및 광역학 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (12)

  1. 테트라페닐폴피린(Tetraphenylporphyrin) 광감작제(photosensitizer); 폴리에틸렌글리콜; 및 종양세포 특이적 리간드;를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물:
    [화학식 1]
    Figure 112020039757658-pat00028

    (상기 화학식 1에 있어서,
    n은 1 내지 50000의 정수이고; 및
    Figure 112020039757658-pat00012
    은 종양세포 특이적 리간드이다).
  2. 테트라페닐폴피린(Tetraphenylporphyrin) 광감작제(photosensitizer); 폴리에틸렌글리콜; 및 종양세포 특이적 리간드;를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물로 구성되는 자기 조립 나노입자(self-assembled nanoparticle):
    [화학식 1]
    Figure 112020039757658-pat00029

    (상기 화학식 1에 있어서,
    n은 1 내지 50000의 정수이고; 및
    Figure 112020039757658-pat00014
    은 종양세포 특이적 리간드이다).
  3. 제2항에 있어서,
    상기 자기 조립 나노입자는 항암제 전달용으로 사용할 수 있는 것을 특징으로 하는 자기 조립 나노입자.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 자기 조립 나노입자 내부에 항암제가 봉입될 수 있는 것을 특징으로 하는 자기 조립 나노입자.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 종양세포 특이적 리간드는 바이오틴(biotin), 폴릭애시드(folic acid), 트리페닐포스포늄(triphenylphosphonium) 및 ACUPA(S,S-2-[3-[5-amino-1-carboxypentyl]-ureido]-pentanedioic acid)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 종양세포에 과발현된 수용체에 결합할 수 있는 리간드인 것을 특징으로 하는 자기 조립 나노입자.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 자기 조립 나노입자는 광역학 치료에 사용될 수 있는 것을 특징으로 하는 자기 조립 나노입자.
  7. 제2항에 있어서,
    상기 나노입자의 직경이 50 내지 250 nm인 것을 특징으로 하는 자기 조립 나노입자.
  8. 제2항의 자기 조립 나노입자를 포함하는 항암용 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 제2항의 자기 조립 나노입자 내부에 함암제가 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  10. 제2항의 자기 조립 나노입자를 포함하는 암의 광역학 치료용 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 광역학 치료용 조성물은 미토콘드리아 및 라이소좀을 공-표적화(co-targeting)하는 것을 특징으로 하는 광역학 치료용 조성물.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 암은 약물에 대한 내성이 생긴 암인 것을 특징으로 하는 광역학 치료용 조성물.
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