CN117545479A - Pi3k抑制剂、纳米制剂及其用途 - Google Patents

Pi3k抑制剂、纳米制剂及其用途 Download PDF

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Abstract

本公开提供了磷脂酰肌醇3‑激酶(PI3K)抑制剂和组合物、纳米制剂，以及用PI3K抑制剂或其组合物治疗疾病或病症(例如乳腺癌、胰腺癌、肺癌和淋巴瘤)的方法。本文公开了一种组合物，其包含：有效量的PI3K抑制剂或其药学上可接受的盐；和白蛋白纳米颗粒。

Description

PI3K抑制剂、纳米制剂及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年4月20日提交的美国临时专利申请号63/176,930的优先权和权益，所述申请通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开提供了磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂和组合物、纳米制剂，以及用PI3K抑制剂或其组合物治疗疾病或病症(例如乳腺癌、胰腺癌、肺癌、淋巴瘤)的方法。
背景技术
磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号传导途径参与许多细胞功能，包括细胞生长、增殖、迁移、分化和凋亡。PI3K途径是人类癌症中最常被激活的途径之一，影响了近50％的恶性肿瘤。IA类同工型PI3Kα、β和δ与癌症尤其密切相关。尽管迄今为止做出了相当大的努力，但基于PI3K抑制剂的治疗的临床结果取得了有限的成功。原因包括缺乏组织靶向性、耐药性(诸如磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)抑制引起的耐药性)、以及缺乏导致剂量限制毒性的特异性。
发明内容
在一个方面，本文公开了一种组合物，其包含：有效量的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂，或其药学上可接受的盐；和白蛋白纳米颗粒。
在一些实施方案中，PI3K抑制剂为I类PI3K抑制剂。在一些实施方案中，PI3K抑制剂是同工型选择性PI3K抑制剂。在一些实施方案中，PI3K抑制剂选自IPI-549、艾代拉里斯(idelalisib)、可泮利塞(copanlisib)、杜韦利西布(duvelisib)、阿培利司(alpelisib)、莱尼利西布(leniolisib)、厄布利塞(umbralisib)、布帕西布(buparlisib)、他塞利昔布(taselisib)、匹替利司(pictilisib)、PX-886、皮拉利司(pilaralisib)、BEZ235、GSK2126458、GSK2636771、AZD8186、SAR260301、吉达利塞(gedatolisib)、阿培利司(apitolisib)、PQR309、MLN1117和哌立福新(perifosine)。
在一些实施方案中，PI3K抑制剂是式(III)化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
R10选自-C≡C-Rx、C1-C4烷基、C2-C4烯基、C2-C4炔基、卤代、氰基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷基氨基和二C1-C4-烷基氨基；
R11选自C1-C4烷基和氢；
R12是具有1、2或3个氮原子的8至10元双环杂芳基，其中杂芳基任选地被1或2个选自氨基、C1-C4烷基和卤代的取代基取代；并且
Rx选自具有1或2个独立地选自N和S的杂原子的5或6元单环杂芳基、芳基、氢和C1-C4烷基，其中杂芳基和芳基任选地被1或2个选自C1-C4烷基的取代基取代。
在一些实施方案中，R10为-C≡C-Ra，而Ra是具有两个氮原子的5元单环杂芳基，其被一个C1-C4烷基取代。在一些实施方案中，R11是甲基。在一些实施方案中，R12是被一个氨基取代的吡唑并[1,5-a]嘧啶。在一些实施方案中，式(III)化合物是：
在一些实施方案中，纳米颗粒的直径在50至200nm之间。在一些实施方案中，白蛋白纳米颗粒包封PI3K抑制剂。在一些实施方案中，白蛋白是人血清白蛋白或来自动物物种的白蛋白。
在一些实施方案中，组合物还包含化疗剂。在一些实施方案中，白蛋白纳米颗粒包封化疗剂。在一些实施方案中，化疗剂是紫杉醇。
在另一方面，本文公开了一种式(I)化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
Q是CH或N；
A是芳基或具有1、2、3或4个独立地选自N、O、S和P的杂原子的5或6元单环杂芳基；
R1选自氢、卤代、C1-C4烷基、C3-C6环烷基、C1-C4卤代烷基、-ORa1、-N(Rb1)(Rc1)、-SO2Rd1、-SO2N(Re1)(Rf1)和-NHSO2Rg1，其中Ra1、Rb1、Rc1、Rd1、Re1、Rf1和Rg1各自独立地选自氢、C1-C4烷基和C1-C4卤代烷基；
R2选自氢、卤代、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基和式(II)基团：
其中：
D是单环杂芳基或单环杂环基，其各自任选地被C1-C4烷基取代；
X是键、-C(O)-、-NH-或-C(O)NH-；
Y是–(CRa2 2)n-G2–，其中每个Ra2独立地选自H和C1-C4烷基，或其中两个Ra2与它们所连接的一个或多个碳原子一起形成C3-C7环烷基；G2是键、亚环烷基或亚杂环基；并且n是0、1、2或3；
Z是-ORb2、-SRc2、-N(Rd2)(Re2)或-CH3，其中Rb2、Rc2、Rd2和Re2各自独立地选自氢、芳基、芳基烷基、C1-C4烷基、-C(O)-C1-C40烷基、-C(O)-C2-C40烯基和式(IIa)基团：并且
R3选自氢和基团-L3-E，其中：
L3是键、C1-C2亚烷基、-CH＝CH-、-C≡C-、-C(O)-、-O-、-NH-、-S-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-C(O)S-、亚芳基、亚环烷基、亚杂芳基或亚杂环基，或其中L3包含此类基团中的任两个的组合；并且
E为双环杂环基或双环杂芳基，其各自任选地被1、2、3、4或5个独立地选自卤代、C1-C4烷基、C3-C6环烷基、C3-C6-环烷基-C1-4-烷基、C1-C4卤代烷基、氧代、-ORa3、-N(Rb3)(Rc3)、-SO2Rd3、-SO2N(Re3)(Rf3)和-NHSO2Rg3的取代基取代，其中Ra3、Rb3、Rc3、Rd3、Re3、Rf3和Rg3各自独立地选自氢、C1-C4烷基和C1-C4卤代烷基；
L是–(CRa4Rb4)m-G4–，其中：
Ra4和Rb4独立地选自氢和C1-C4烷基；
m是0、1或2；且
G4是键、-NHC(O)-、-NH-、-O-或-S-；并且
B是双环杂芳基或双环杂环基，其各自任选地被1、2、3、4或5个独立地选自卤代、C1-C4烷基、C3-C6环烷基、C1-C4卤代烷基、任选取代的芳基、-ORa5、-N(Rb5)(Rc5)、-SO2Rd5、-SO2N(Re5)(Rf5)和-NHSO2Rg5的取代基取代，其中Ra5、Rb5、Rc5、Rd5、Re5、Rf5和Rg5各自独立地选自氢、C1-C4烷基和C1-C4卤代烷基；
其中当R3是氢时，R2是式(II)基团且Z不是-CH3；并且
其中当R2是氢、卤代、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基或C1-C4卤代烷氧基时，R3是基团-L3-E。
在一些实施方案中，化合物是式(Ia)化合物：
或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，A是苯基并且R1是氢。
在一些实施方案中，化合物是式(Ib)化合物：
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，D是五元单环杂芳基或4至6元单环杂环基，其各自独立地包含1、2、3或4个独立地选自N、O、S和P的杂原子。在一些实施方案中，D选自吡咯、吡唑、咪唑、咪唑啉、噁唑、噁噻唑、噁二唑、氮杂环丁烷、吡咯啉、吡咯烷和哌啶。在一些实施方案中，D具有选自以下的结构：
在一些实施方案中，X是键或-C(O)-。
在一些实施方案中，Y是–(CRa2 2)n-CH2–，其中n是0或1，并且其中每个Ra2是氢，或其中两个Ra2基团与它们所连接的碳原子一起形成亚环丙基环。
在一些实施方案中，基团-X-Y-Z具有选自以下的式：
在一些实施方案中，Z是-ORb2，其中Rb2选自氢、-C(O)-C1-C40烷基、-C(O)-C2-C40烯基和式(IIa)基团。在一些实施方案中，Z是-ORb2，其中Rb2选自氢、-C(O)-C15-C20烷基、-C(O)-C15-C20烯基和式(IIa)基团。
在一些实施方案中，化合物是式(Ic)化合物：
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，R2选自卤代和式(II)基团。在一些实施方案中，R2是卤代。
在一些实施方案中，L3是键、-CH2-CH2-、-CH＝CH-、-C≡C-、-C(O)NH-或具有1、2或3个氮原子的5元亚杂芳基。
在一些实施方案中，E具有下式：
其中R'和R”独立地选自C1-C4烷基、C3-C6-环烷基-C1-4-烷基、C1-C4卤代烷基和-NHSO2Rg3，其中Rg3是C1-C4烷基。在一些实施方案中，R'是C3-C6-环烷基-C1-4-烷基，并且R”选自C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基和-NHSO2Rg3，其中Rg3是C1-C4烷基。
在一些实施方案中，化合物选自：
/>
/>
及其药学上可接受的盐。
在另一方面，本文公开了一种药物组合物，其包含式(I)化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，组合物还包含白蛋白纳米颗粒。在一些实施方案中，白蛋白纳米颗粒包封式(I)化合物。在一些实施方案中，白蛋白纳米颗粒的直径在50至200nm之间。在一些实施方案中，白蛋白是人血清白蛋白或来自动物物种的白蛋白。
在一些实施方案中，组合物还包含脂质体、PLGA或PLA纳米颗粒、脂质纳米颗粒或胶束。
在一些实施方案中，组合物还包含化疗剂组合。在一些实施方案中，化疗剂是紫杉醇。在一些实施方案中，化疗剂被包封在白蛋白纳米颗粒、脂质体、PLGA纳米颗粒、脂质纳米颗粒或胶束中。
在另一方面，本文公开了用于治疗或预防受试者(例如，人)的疾病或病症的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的化合物，或其药学上可接受的盐，或本文公开的组合物。
在一些实施方案中，方法还包括施用免疫疗法。在一些实施方案中，免疫疗法包括施用PD-1或PD-L1抗体。在一些实施方案中，免疫疗法在化合物或组合物的同时、之前或之后施用。在一些实施方案中，免疫疗法通过皮下注射施用。
在一些实施方案中，疾病或病症包括癌症、自身免疫性疾病或病症、或炎症性疾病或病症。在一些实施方案中，疾病或病症是癌症。在一些实施方案中，癌症包括实体瘤或血液学癌症。在一些实施方案中，癌症是转移性癌症。在选定的实施方案中，疾病或病症是乳腺癌、胰腺癌、肺癌或淋巴瘤。在一些实施方案中，所述方法抑制或消除癌症转移、减少肿瘤生长、防止肿瘤复发或其任何组合。在一些实施方案中，化合物或组合物通过皮下注射施用。
本公开的其他方面和实施方案将根据以下详细描述和附图而显而易见。
附图说明
图1A至图1K显示的数据表明，在荷瘤小鼠中，肿瘤和淋巴结中M2巨噬细胞浸润增加，并且IPI-549和PTX的组合增强了M2至M1巨噬细胞复极以抑制MCT生长。图1A和图1B显示了荷瘤小鼠(PyMT-LN)中肿瘤(PyMT-肿瘤)、正常脂肪垫(N-脂肪垫)、正常淋巴结(N-LN)和淋巴结的F4/80+CD11b+(巨噬细胞)、CD80+CD206-(M1表型)、CD80-CD206+(M2表型)的流式细胞术的代表性图像和定量。n＝3。数据表示为平均值±SD。***P<0.001。图1C和图1D显示了PyMT小鼠的肿瘤和淋巴结中具有M2表型(绿色)的巨噬细胞(红色)的共聚焦显微图像。细胞核用DAPI(蓝色)染色。比例尺：100μm。图1E至图1H显示了用PTX(5μM)、IPI(IPI-549，5μM)、DOX(多柔比星(doxorubicin)，5μM)、GEM(吉西他滨(gemcitabine)，5μM)、PI(PTX，2.5μM加IPI-549，2.5μM)、DI(多柔比星，2.5μM加IPI-549，2.5μM)、GI(吉西他滨，2.5μM加IPI-549，2.5μM)处理后，通过ELISA测量的M2巨噬细胞的细胞培养基(来源于骨髓来源的巨噬细胞)中TNF-α、IL-12、IL-10和TGF-β的浓度。n＝3。数据表示为平均值±SD。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。图1I是3D多细胞肿瘤球体(MTC)的示意图。图1J至图1K显示了3D MTC的肿瘤生长曲线和图像，其显示用浓度为5μM的PTX、IPI、DOX或GEM的单一药物治疗和用PI(PTX，2.5μM加IPI-549，2.5μM)、DI(多柔比星，2.5μM加IPI-549，2.5μM)或GI(吉西他滨，2.5μM加IPI-549，2.5μM)的组合治疗的抗癌效果。PBS处理作为对照。n＝3。数据表示为平均值±SD。###P<0.001。与PBS处理组相比有显著差异。(***P<0.001)。
图2A至图2F显示了MMTV-PyMT转基因小鼠中肿瘤和淋巴结中的Nano-PI表征和增强的积累。图2A显示了通过动态光散射检测的Nano-PI(PTX，0.2mg/ml)的大小分布(n＝3)。图2B显示了Nano-PI的透射电子显微镜(TEM)成像。比例尺：200nm。图2C至图2D显示了通过不同稀释度(PTX浓度为2×10-3至2×10-5)的大小分布测量的Nano-PI的稳定性。图2E至图2F显示了向患有自发性乳腺癌的14-15周龄MMTV-PyMT转基因小鼠(每组三只小鼠，对每只小鼠分析10个肿瘤和8个脂肪垫组织)静脉注射游离PTX和IPI-549(PTX/IPI)、静脉注射PTX的白蛋白制剂(Nano-P)加口服或腹膜内注射IPI-549(Nano-P+IPI(P.O.)或Nano-P+IPI(I.P.))和剂量为PTX 5mg/kg和IPI-549 2.5mg/kg的Nano-PI后，血浆、淋巴结、肿瘤和脂肪垫中的PTX和IPI-549浓度。数据显示为平均值±SD。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。与PTX/IPI(游离药物)组相比有显著差异。
图3A至图3H显示了在MMTV-PyMT转基因小鼠的肿瘤和淋巴结中，Nano-PI增强对巨噬细胞的递送。图3A显示了代表性肿瘤共聚焦显微图像和3D MFI图(虚线框内的区域)显示了药物(绿色)分布，以及药物与血管(α-CD31)和巨噬细胞(α-F4/80)共定位的逐像素Pearson相关R值(平均值±SD，n＝4)。在MMTV-PyMT小鼠中静脉注射用荧光PTX-OG488和IPI-549包封的Nano-PI(F-Nano-PI)或游离PTX-OG488加IPI-549(F-PTX/IPI)后4小时收集肿瘤样品。巨噬细胞、血管和细胞核用F4/80(红色)、CD31(青色)和DAPI(蓝色)染色。条形：200μm。虚线框内的区域显示F-PTX/IPI与血管(白色)或巨噬细胞(黄色)的重叠。图3B显示了肿瘤中药物与血管和巨噬细胞重叠的定量。F-PTX/IPI(n＝8)，Nano-PI(n＝7)。图3C显示了在MMTV-PyMT小鼠(n＝4)中静脉注射F-Nano-PI和F-PTX/IPI后4小时收集的肿瘤组织内TAM(F4/80)和肿瘤细胞(CD44)中药物(PTX-OG488)分布的流式细胞术的代表性图像和定量。图3D显示了代表性淋巴结共聚焦图像和3D平均荧光强度(MFI)图显示了药物(绿色)分布，以及药物与血管(α-CD31)和巨噬细胞(α-F4/80)的逐像素Pearson相关R值(平均值±SD，n＝4)。在MMTV-PyMT小鼠中静脉注射F-Nano-PI和F-PTX/IPI后4小时收集淋巴结样品。巨噬细胞、血管和细胞核用F4/80(红色)、CD31(青色)和DAPI(蓝色)染色。条形表示200μm。虚线框内的区域显示F-PTX/IPI与血管(白色)或巨噬细胞(黄色)的重叠。图3E显示了淋巴结中药物与血管(α-CD31)和巨噬细胞(α-F4/80)重叠的定量。(n＝5)。图3F显示了在MMTV-PyMT小鼠中静脉注射F-Nano-PI和F-PTX/IPI后4小时淋巴结内SSM(CD169)和MCM/MSM(F4/80)细胞中药物(PTX-OG488)的流式细胞术的代表性图像和定量。n＝4个单独实验。图3G显示了共聚焦显微图像，显示了淋巴结内的药物(绿色)分布，以及药物与B细胞、T细胞和巨噬细胞共定位(虚线框内的区域)的逐像素Pearson相关R值(平均值±SD，n＝6)。图3H显示了在MMTV-PyMT小鼠(n＝3)中施用F-Nano-PI和F-PTX/IPI后4小时药物与B细胞、T细胞和巨噬细胞共定位的定量。巨噬细胞、B细胞、T细胞和细胞核分别用F4/80和CD169、CD19、CD3和DAPI染色。数据表示为平均值±SD。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图4A至图4J显示，Nano-PI联合α-PD1在MMTV-PyMT小鼠中实现了长期完全缓解并消除了肺转移。图4A是给药方案的图示，其中MMTV-PyMT小鼠在出生后第66天以不同的治疗施用，并在出生后观察183天。图4B显示了通过不同治疗后每只小鼠(n＝10)中所有肿瘤的总和计算的总肿瘤体积变化：小鼠血清白蛋白(媒介物，I.V.)、Nano-P(10mg/kg，I.V.)、Nano-P(10mg/kg，I.V.)加α-PD1、IPI-549(15mg/kg，P.O.)加α-PD1、Nano-P(5mg/kg，I.V.)加IPI549(5mg/kg，P.O.)和α-PD1、Nano-PI(PTX 10mg/kg，IPI-549 5mg/kg)、Nano-PI(PTX10mg/kg，IPI-549 5mg/kg)加α-PD1。药物治疗每三天静脉注射一次，共五剂。α-PD1每三天腹腔内施用一次，共3剂(100μg/小鼠)。图4C显示了出生后第183天肺中转移性结节的H&E和Bouin染色以及定量。红色圆圈显示转移性病变。图4D显示了MMTV-PyMT小鼠治疗后的存活率(n＝10)。数据显示为平均值±SD(n＝3)。#P<0.05，##P<0.01。与Nano-P加α-PD1组相比具有统计学显著性差异(**P<0.01，***P<0.001)。图4E是描述如图4A所述的出生后210天用Nano-PI加a-PD1治疗后肿瘤缓解的MMTV-PyMT小鼠中肿瘤再攻击的治疗方案的示意图，并且野生型FVB/NJ雌性小鼠用作对照。图4F显示了在肿瘤接种后38天测量肿瘤体积的变化。图4G是显示MMTV-PyMT小鼠在出生后80天用不同治疗进行治疗的给药方案的示意图。图4H显示了在静脉注射媒介物、PTX/IPI-549(PTX，5mg/kg，IPI-549 2.5mg/kg，I.V.)加α-PD1和Nano PI(PTX 5mg/kg，IPI-549 2.5mg/kg，I.V.)5次加α-PD1(100μg/小鼠，IP)3次后，通过每只小鼠(n＝10)中所有肿瘤的总和计算的总肿瘤体积变化。图4I显示了H&E和Bouin染色和定量分析显示出生后第113天的肺转移性结节。红色圆圈显示转移性病变。数据显示为平均值±SD(n＝3)。#P<0.05。与PTX/IPI-549加α-PD1组相比具有统计学显著性差异(**P<0.01，***P<0.001)。图4J显示了不同制剂在低剂量下治疗后的存活率(n＝10)。
图5A至图5F显示了Nano-PI加α-PD1重塑了MMTV-PyMT转基因小鼠的肿瘤免疫微环境。图5A显示了在用媒介物(I.V.)、Nano-P(10mg/kg，I.V.)和IPI549(5mg/kg，I.P.)加α-PD1组合、以及Nano-PI(PTX，10mg/kg，IPI-549，5mg/kg)加α-PD1 5次，α-PD1在100μg/小鼠下I.P.3次治疗后10天，MMTV-PyMT转基因小鼠通过飞行时间细胞计量术(CyTOF)测试对肿瘤中所有免疫细胞的tSNE可视化和定量。数据显示为平均值±SD。(n＝3)。相关门控方案如实施例4所述，并且相关组列于表1中。图5B显示了图5A中相同治疗和CyTOF分析后，MMTV-PyMT转基因小鼠肿瘤中CD206、CD115、IL-4和IL10表达的tSNE可视化。图5C至图5E显示了图5A中相同治疗后MMTV-PyMT转基因小鼠的肿瘤中M1(F4/80+CD80+)和M2(F4/80+CD206+)巨噬细胞在总巨噬细胞中的百分比和M1/M2比率的流式细胞术定量。数据显示为平均值±SD(n＝3)。#P<0.05。与媒介物组相比具有统计学显著性差异(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。代表性图像如图19A所示。图5F显示了共聚焦显微图像，显示了图4B中相同治疗后肿瘤组织中巨噬细胞表型的变化。总巨噬细胞、M1巨噬细胞、M2巨噬细胞和细胞核用F4/80(红色)、CD80(青色)、CD206(绿色)和DAPI(蓝色)染色。条形表示400μm。
图6A至图6F显示了，Nano-PI加α-PD1在MMTV-PyMT转基因小鼠的肿瘤中防止T细胞耗竭并激活DC。图6A显示了在与图5A相同的治疗和CyTOF分析后，MMTV-PyMT小鼠肿瘤中T细胞的CTLA-4、PD1、TIM-3、FR4表达的tSNE可视化。图5B显示了在与图4A相同的治疗和CyTOF分析后，MMTV-PyMT小鼠肿瘤中DC中CD103表达的tSNE可视化。图5C显示了MMTV-PyMT小鼠肿瘤中DC(CD11C+CD103+)和激活的DC(CD80+CD86+)的代表性流式细胞术图像和定量。数据显示为平均值±SD，(n＝4)。与媒介物组相比具有统计学显著性差异(**P<0.01，***P<0.001相对于媒介物，&P<0.05)。图5D至图5F显示了ELISA分析数据，显示了使用图6C中相同给药方案的MMTV-PyMT小鼠的肿瘤中的颗粒酶B、IL-12和IFN-γ。数据显示为平均值±SD。(n＝9)。##P<0.01，###P<0.001，与媒介物组相比具有统计学显著性差异(**P<0.01，***P<0.001)。
图7A至图7H显示，Nano-PI联合α-PD1重塑了PyMT小鼠淋巴结中的免疫微环境。图7A显示了在与图6A中相同的治疗之后MMTV-PyMT小鼠的淋巴结中的所有免疫细胞的CyTOF分析。数据显示为平均值±SD。(n＝3)。相关门控方案如实施例4所述。图7A至图7D显示了使用与图6A所述相同的给药方案的MMTV-PyMT转基因小鼠的淋巴结中M1(F4/80+CD80+)和M2(F4/80+CD206+)巨噬细胞群体的流式细胞术定量。数据显示为平均值±SD(n＝3)。#P<0.05，##P<0.01。与媒介物组相比具有显著差异(**P<0.01，***P<0.001)。流式细胞术图像如图19B所示。图7E显示了通过尼康A1si共聚焦显微镜扫描的整个淋巴结，显示了图4B中的治疗后淋巴结中巨噬细胞表型的变化。总巨噬细胞、M1巨噬细胞、M2巨噬细胞和细胞核用F4/80(红色)、CD80(青色)、CD206(绿色)和DAPI(蓝色)染色。条形表示400μm。图7F至图7H显示了ELISA分析数据，显示了图4B中的治疗后的MMTV-PyMT转基因小鼠的淋巴结中的颗粒酶B、IL-12和IFN-γ的量。数据显示为平均值±SD。(n＝4)。(&P<0.05，&&P<0.01)，(##P<0.01，###P<0.001)与媒介物组相比具有显著差异(**P<0.01，***P<0.001)。
图8A至图8E显示了巨噬细胞向M1或M2表型的极化。ELISA分析(图8A)和蛋白质印迹(图8B)显示，由骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)产生的PBS处理(M0)、LPS/IFN-γ处理(M1)和IL-4/IL-13处理(M2)的巨噬细胞的细胞因子(TGF-β、TNF-α和IL-10)的量和细胞表面标志物(CD80和CD206)的表达。值是平均值±SD(n＝3)。$P<0.05，$$$P<0.001。与PBS组相比具有统计学显著性差异(**P<0.01，***P<0.001)。图8C显示了由RAW264.7巨噬细胞产生的PBS处理(M0)、LPS/IFN-γ处理(M1)和IL-4/IL-13处理(M2)的巨噬细胞中的INOS和CD206表达。图8D显示了使用倒置荧光显微镜观察的PBS(M0)、LPS/IFN-γ(M1)和IL-4/IL-13(M2)处理后的巨噬细胞形态。比例尺，20μm。图8E显示了来自transwell侵袭测定的数据，用于测定与RAW264.7巨噬细胞产生的M2巨噬细胞的条件培养基孵育后侵袭4T1乳腺癌细胞。比例尺，100μm。
图9A至图9G显示了PTX和IPI-549治疗对3D肿瘤球体和3DMCT生长的抑制作用。图9A至图9B显示了由单独4T1细胞建立的3D肿瘤球体的生长曲线和图像，显示了浓度为5μM的PTX、IPI-549、多柔比星(DOX)、吉西他滨(GEM)的单一治疗，以及PI(PTX 2.5μM+IPI 2.5μM)、DI(DOX 2.5μM加IPI 2.5μM)、GI(GEM 2.5μM加IPI 2.5μM)的组合治疗的抑制作用。PBS处理作为对照。n＝3。数据表示为平均值±SD。###P<0.001。与PBS治疗组相比具有统计学显著性差异(***P<0.001)。图9C至图9D显示了MCT(4T1细胞和M2巨噬细胞的共培养物)的代表性图像。图9E至图9F显示了MCT的生长曲线，显示了在0.1、1、2、5、10μM浓度下PTX和/或IPI-549的单一药物和组合治疗的抑制作用。PBS和药物溶剂处理作为对照。n＝3。数据表示为平均值±SD。图9G显示了PTX和IPI-549对MCT生长的协同抑制作用(红点)，绘制在笛卡尔轴上，并在等效线图中通过等效线(可加性线)连接。
图10A至图10C显示了PTX和IPI-549促进M2向M1巨噬细胞复极化并抑制癌细胞生长。图10A和图10B显示了ELISA分析，显示了用PTX(1、5和10μM)、IPI(IPI-549，1、5和10μM)以及任两种浓度的PTX与IPI-549之间的组合处理后M2巨噬细胞(来源于BMDM)的培养基上清液中TNF-α和IL-12的量。值是平均值±SD(n＝3)。图10C显示了用PTX(1、5和10μM)、IPI(IPI-549，1、5和10μM)以及任两种浓度的PTX与IPI-549之间的组合处理后通过甲基四唑鎓(MTT)测定检测到的细胞活力。用PBS处理的细胞以100％细胞活力作为对照。值是平均值±SD(n＝3)。
图11A至图11C显示了Nano-PI在体外的稳定性和药物释放。图11A显示了通过动态光散射的大小分布测量的不同稀释度(PTX浓度为2×10-3至2×10-4mg/mL)的Nano-PI的稳定性(n＝3)。用含有10％胎牛血清(FBS)的PBS稀释后立即检测Nano-PI的大小分布。在2×10-3至4×10-4mg/mL(PTX浓度)范围内的大小分布保持不变，主峰为142nm。图11B和图11C显示了在37℃下在血浆中IPI-549(图11B)和PTX(图11C)从Nano-PI的体外累积释放曲线。数据显示为平均值±SD(n＝3)。
图12A至图12E显示了Nano-PI抑制M2巨噬细胞极化、肿瘤生长和侵袭。图12A显示了用PBS(M0巨噬细胞)、LPS/IFN-γ(M1巨噬细胞)或IL-4/IL-13(M2巨噬细胞)处理后RAW274.7来源的巨噬细胞的形态。用IL-4/IL-13预处理的细胞转变成M2巨噬细胞后进行Nano-PI处理。比例尺，20μm。图12B和图12C显示了ELISA测定结果，显示了用PTX、IPI-549(IPI)、PTX加IPI、Nano-P以及PTX和IPI浓度分别为10μM和5μM的Nano-PI处理后M2巨噬细胞的细胞培养基(源自RAW 274.7)中TGF-β(图12B)和IL-12(图12C)的浓度。图12D显示了与PTX、IPI和Nano-PI孵育24小时后通过MTT测定检测到的4T1细胞的细胞活力。图12E显示了来自transwell侵袭测定的数据，用于测定与PTX、IPI和Nano-PI处理的M2巨噬细胞(由RAW264.7巨噬细胞产生)的条件培养基孵育后侵袭4T1乳腺癌细胞。比例尺，100μm。值是平均值±SD(n＝3)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图13A至图13B显示了Nano-PI在PyMT转基因小鼠中的药代动力学和组织分布。对MMTV-PyMT小鼠(n＝3)静脉注射游离PTX和IPI-549组合、紫杉醇(Nano-P)的白蛋白制剂加口服IPI-549以及PTX(5mg/kg)和IPI-549(2.5mg/kg)剂量的Nano-PI后，肝脏、脾脏和肺中的PTX(图13A)和IPI-549(图13B)浓度。数据显示为平均值±SD。
图14A至图14B显示了IPI-549和PTX分布的质谱(MS)图像。MS图像显示了Nano-PI递送的肿瘤和淋巴结中的药物分布。向MMTV-PyMT小鼠(雌性，10-11周龄)施用PTX 100mg/kg和IPI-54950mg/kg的Nano-PI(IV)，并在治疗后4小时解剖肿瘤和淋巴结并制备用于MS成像的冷冻切片。PTX显示为绿色。IPI-549显示为红色。叠加图像(黄色)表明PTX和IPI-549的共定位。
图15A至图15D显示了淋巴结中的Nano-PI分布。在MMTV-PyMT小鼠中静脉注射用荧光PTX-OG488和IPI-549包封的Nano-PI(F-Nano-PI)后4小时收集淋巴结。共聚焦显微图像显示淋巴结内的药物(绿色)分布，并且逐像素Pearson相关性显示药物与B细胞、T细胞和巨噬细胞的共定位(虚线框内的区域)。巨噬细胞、B细胞、T细胞和细胞核分别用F4/80和CD169、CD19、CD3和DAPI染色。图15A显示了整个淋巴结。比例尺：500μm。图15B显示了淋巴结中药物分布区域的放大图，并且图15C显示了B细胞、T细胞和巨噬细胞的药物分布。比例尺：200μm。图15D显示了施用后4小时淋巴结内B细胞、T细胞和巨噬细胞中药物分布的逐像素Pearson相关R值(平均值±SD，n＝6)。
图16A至图16F显示了Nano-PI对PyMT转基因小鼠的体内抗肿瘤功效。图16A至图16B显示了通过图4A(正文)中相同测试的每组(n＝10只小鼠)中所有肿瘤的总和计算的总肿瘤体积(图16A)和肿瘤数量(图16B)。图16C是给药方案示意图，其中向MMTV-PyMT转基因小鼠施用媒介物(IV)、Nano-P(5mg/kg，I.V.)加IPI-549(15mg/kg，I.P.)和α-PD1、Nano-PI(PTX，10mg/kg，IPI-549，5mg/kg)加α-PD15次。α-PD1每三天I.P.给药一次，共3次，剂量为100μg/小鼠。图16D至图16F显示了通过每只小鼠(n≥10个肿瘤)中所有肿瘤的总和计算的总肿瘤体积变化。
图17A至图17J显示了治疗后的总记忆相关T和B细胞群体，来自肿瘤再攻击试验结束时淋巴结、脾脏、骨髓、血液和肺中的记忆相关T细胞，包括TCM(CD3+CD197+)、TEM(CD3+CD44+)和TRM(CD3+CD103+)(图17A至图17E)以及记忆B(MB)细胞，包括MB1(CD19+CD73+CD80+)、MB2(CD19+CD73+PD-L2+)、MB3(CD19+PD-L2+CD80+)和MB4(CD19+CD73+CD80+PD-L2+)(图17F至图17J)的流式细胞术分析。数据显示为平均值±SD(n＝3)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图18A至图18E显示了Nano-PI对4T1原位乳腺癌模型的体内抗肿瘤功效。图18A是在4T1荷瘤小鼠中3剂治疗的给药方案的示意图。图18B显示了不同治疗后乳腺癌荷瘤小鼠的肿瘤生长曲线：小鼠血清白蛋白(媒介物，I.V.)、Nano-P(PTX，10mg/kg，I.V.)、Nano-P(PTX，10mg/kg，I.V.)加α-PD1、IPI-549(5mg/kg，P.O.)加α-PD1、Nano-P(PTX：5mg/kg，I.V)加IPI549(5mg/kg，P.O.)和α-PD1、Nano-P(PTX：5mg/kg，I.V.)加IPI549(5mg/kg，I.P.)和α-PD1、以及Nano-PI(PTX，10mg/kg，IPI-549，5mg/kg)加α-PD1 3次。α-PD1每三天I.P.给药一次，共3次，剂量为100μg/小鼠。值是平均值±SD(n＝8)。**P<0.01，***P<0.001。图18C显示了肿瘤重量，#P<0.05，##P<0.01与媒介物组相比(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。图18D显示了第24天切除肿瘤的照片。图18E显示了肺组织的H&E切片，其显示了乳腺癌荷瘤小鼠的肺转移。条形表示100μm。
图19A至图19B显示了流式细胞术分析的代表性图像。在用小鼠血清白蛋白(媒介物，I.V.)、Nano-P(10mg/kg，I.V.)和IPI549(5mg/kg，I.P.)加α-PD1组合、以及Nano-PI(PTX，10mg/kg，IPI-549，5mg/kg)加α-PD1 5次，α-PD1在100μg/小鼠下I.P.3次治疗后10天(n＝3)，MMTV-PyMT转基因小鼠的肿瘤和淋巴结中的总巨噬细胞中的M1(F4/80+CD80+)(图19A)和M2(F4/80+CD206+)巨噬细胞(图19B)百分比。
图20A至图20C显示了，Nano-PI联合α-PD1重塑了4T1乳腺癌小鼠和MMTV-PyMT转基因小鼠肿瘤中的免疫微环境。图20A显示了在用小鼠血清白蛋白(媒介物，I.V.)、Nano-P(PTX：10mg/kg，I.V.)、Nano-P(PTX：10mg/kg，I.V.)加α-PD1、IPI-549(5mg/kg，I.P.)加α-PD1、Nano-P(5mg/kg，I.V.)加IPI549(15mg/kg，P.O.)和α-PD1、Nano-P(PTX：5mg/kg，I.V)加IPI549(15mg/kg，I.P.)和α-PD1、以及Nano-PI(PTX，10mg/kg，IPI-549，5mg/kg)加α-PD1 3次治疗后，4T1肿瘤中MHC II+CD206-(M1巨噬细胞)、MHC II-CD206+(M2巨噬细胞)的流式细胞术分析的定量。α-PD1每三天I.P.给药一次，共3次，剂量为100μg/小鼠。数据显示为平均值±SD(n＝3)。图20B至图20C显示了在与(图20A)中所述相同处理后对CD3 T细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞和Treg(CD4+Foxp3+)进行流式细胞术分析的定量。数据显示为平均值±SD(n＝3)。#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。与媒介物组相比具有统计学显著性差异(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。
图21A至图21B显示了来自不同MMTV-PyMT转基因小鼠的每个肿瘤样品的2百万个单细胞中的总免疫细胞(CD45+)以及巨噬细胞(CD45+F4/80+)、T细胞(CD45+CD3+)和B细胞(CD45+CD19)的流式细胞术分析的定量。MMTV-PyMT转基因小鼠用媒介物、Nano-P加IPI549(I.P.)和α-PD1、Nano-PI加α-PD1每3天，共5次，PTX和IPI-549剂量分别为10mg/kg和5mg/kg处理。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图22A至图22B显示了淋巴结中的总免疫细胞群，通过来自不同MMTV-PyMT转基因小鼠的每个肿瘤样品的2百万个单细胞中的总免疫细胞(CD45+)以及巨噬细胞(CD45+F4/80+)、T细胞(CD45+CD3+)、B细胞(CD45+CD19)和NK细胞(CD45+CD335+)的流式细胞术分析来量化。MMTV-PyMT转基因小鼠用小鼠血清白蛋白(媒介物)、Nano-P加IPI549(IP)和α-PD1、Nano-PI加α-PD1每3天，共5次，PTX和IPI-549剂量分别为10mg/kg和5mg/kg处理。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图23显示了，Nano-PI联合α-PD1提高患有转移性胰腺癌的KPC小鼠的存活率。图23显示了患有胰腺癌的KPC小鼠治疗后的存活率(n＝10)：小鼠血清白蛋白(媒介物)、Abraxane(Abrax，IV 10mg/kg)+IPI549(IP，15mg/kg)+α-PD1(PD1，IP，100μg)；和Nano-PI(PTX 10mg/kg，IPI-549 5mg/kg)加α-PD1(PD-1，IP 100μg)。Nano-PI每三天静脉注射一次，共5剂。α-PD1每三天腹腔内施用一次，共3剂(100μg/小鼠)。IPI-549每三天腹膜内给药一次，共5剂。
具体实施方式
本文描述了磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂及其组合物。包含化疗剂的PI3K抑制剂组合物被证明可以重塑淋巴结和肿瘤中的免疫微环境，并且当与αPD-1组合时，在患有自发性转移性乳腺癌和胰腺癌的转基因小鼠中实现100％存活率的完全缓解和完全消除转移(在>200天时)。
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1.定义
本文中使用的术语“包含”、“包括”、“具有(having)”、“具有(has)”、“可以”、“含有”及其变体旨在是不排除额外行为或结构的可能性的开放式过渡短语、术语或词语。除非上下文中另外明确指定，否则单数形式“一种/一个(a)”、“一种/一个(an)”和“所述(the)”包括复数指代物。本公开还考虑了其他实施方案“包含文中提出的实施方案或元素”、“由文中提出的实施方案或元素组成”和“基本上由文中提出的实施方案或元素组成”，无论是否明确阐述。
对于本文中数值范围的叙述，明确地考虑了其间具有相同精确度的每个中间数值。例如，对于6-9的范围，除了6和9之外还考虑数字7和8，并且对于6.0-7.0的范围，明确考虑数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
除非本文另有定义，与本公开相关使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应明确；然而，如果存在任何潜在的歧义，本文提供的定义优先于任何词典或外部定义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用整体并入。
如本文所用，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”等是指在向适当的对照受试者提供本文所述的化合物或组合物时减缓、停止或逆转疾病或病症的进展。所述术语还意指将这种疾病或病症的进展逆转到消除或大大减轻症状的程度。因此，“治疗”是指将本文所述的组合物应用于或施用于受试者，其中受试者患有疾病或疾病的症状，其目的是治愈、疗愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、改良或影响疾病或疾病的症状。
“受试者”或“患者”可以是人类或非人类，并且可以包括，例如，用作研究目的的“模型系统”的动物品系或物种，如本文所述的小鼠模型。同样，患者可以包括成人或青少年(例如儿童)。此外，患者可以指任何活的生物体，优选哺乳动物(例如，人类和非人类)，其可能受益于本文所考虑的组合物的施用。哺乳动物的实例包括但不限于哺乳动物类的任何成员：人类、非人类灵长类动物诸如黑猩猩以及其他类人猿和猴子物种；农场动物，诸如牛、马、绵羊、山羊、猪；家养动物，诸如兔子、狗和猫；实验室动物包括啮齿动物，诸如大鼠、小鼠和豚鼠等。非哺乳动物的实例包括但不限于鸟类、鱼类等。在一个实施方案中，哺乳动物是人类。
如本文所用，术语“提供”、“施用”、“引入”在本文中可互换使用，并且是指通过导致组合物至少部分定位到所需部位的方法或途径将本公开的组合物放置到受试者中。组合物可以通过任何适当的途径进行施用，从而导致递送到受试者中的期望位置。
下面更详细地描述特定官能团和化学术语的定义。出于本公开的目的，根据CAS版本的元素周期表,Handbook of Chemistry and Physics,第75版,内封面来鉴别化学元素，并且特定官能团通常如其中所述来定义。此外，有机化学的一般原理以及特定功能部分和反应性在以下中描述：Sorrell,Organic Chemistry,第2版,University Science Books,Sausalito,2006；Smith,March's Advanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanism,and Structure,第7版,John Wiley&Sons,Inc.,New York,2013；Larock,ComprehensiveOrganic Transformations,第3版,John Wiley&Sons,Inc.,New York,2018；以及Carruthers,Some Modern Methods of Organic Synthesis,第3版,CambridgeUniversity Press,Cambridge,1987；其每一个的全部内容通过引用并入文中。
本文所用的术语“烷基”是指直链或支链饱和烃链。烷基的代表性实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、4,4-二甲基戊-2-基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基和二十烷基。
本文所用的术语“烯基”是指含有至少一个碳-碳双键的直链或支链烃链。双键可以位于烃链的任何位置。烯基的代表性实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、2-甲基-2-丙烯基、3-丁烯基、4-戊烯基、5-己烯基、2-庚烯基、2-甲基-1-庚烯基和3-癸烯基。
本文所用的术语“炔基”是指含有至少一个碳-碳三键的直链或支链烃链。三键可以位于烃链的任何位置。炔基的代表性实例包括但不限于乙炔基、丙炔基和丁炔基。
本文所用的术语“亚烷基”是指源自直链或支链烃的二价基团，例如具有1-10个碳原子。亚烷基的代表性实例包括但不限于–CH2CH2–、–CH2CH2CH2–、–CH2CH(CH3)CH2–、–CH2CH2CH2CH2–、–CH2CH(CH3)CH2CH2–、–CH2CH2CH2CH2CH2–、–CH2CH2CH2CH2CH2CH2–、–CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2–、–CH2(CH2)6CH2–、–CH2(CH2)7CH2–和–CH2(CH2)8CH2–。
本文所用的术语“烷氧基”是指通过氧原子连接到母体分子部分的本文定义的烷基。烷氧基的代表性实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、2-丙氧基、丁氧基和叔丁氧基。
本文所用的术语“氨基”是指-NH2基团。本文所用的术语“烷基氨基”是指基团-NHR，其中R是本文定义的烷基。本文所用的术语“二烷基氨基”是指基团-NR2，其中每个R独立地是本文所定义的烷基。
本文所用的术语“芳基”是指具有单个环(单环)或多个环(双环或三环)(包括稠环系统)和零个杂原子的芳族碳环系统。本文所用的芳基含有6-20个碳原子(C6-C20芳基)、6至14个环碳原子(C6-C14芳基)、6至12个环碳原子(C6-C12芳基)或6至10个环碳原子(C6-C10芳基)。芳基的代表性实例包括但不限于苯基、萘基、蒽基和菲基。
如本文所用，术语“亚芳基”是指二价芳基。亚芳基的代表性实例包括但不限于亚苯基(例如，1,2-亚苯基、1,3-亚苯基和1,4-亚苯基)。
本文所用的术语“芳基烷基”是指本文所定义的烷基，其中至少一个氢原子被本文所定义的芳基替换。代表性芳基烷基包括但不限于苄基、苯乙基、二苯甲基和三苯甲基。
本文所用的术语“氰基”是指-CN基团。
本文所用的术语“环烷基”是指含有3至10个碳原子和0个杂原子的饱和碳环系统。环烷基可以是单环的、双环的、桥接的、稠合的或螺环的。环烷基的代表性实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基、金刚烷基、双环[2.2.1]庚基、双环[3.2.1]辛基和双环[5.2.0]壬基。
本文所用的术语“亚环烷基”是指二价环烷基。
本文所用的术语“卤素”或“卤代”是指F、Cl、Br或I。
本文所用的术语“卤代烷基”是指本文所定义的烷基，其中至少一个氢原子(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个氢原子)被卤素替换。在一些实施方案中，烷基的每个氢原子被卤素替换。卤代烷基的代表性实例包括但不限于氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、2,2,2-三氟乙基和3,3,3-三氟丙基。
本文所用的术语“卤代烷氧基”是指本文所定义的卤代烷基通过氧原子连接到母体分子部分。卤代烷氧基的代表性实例包括但不限于二氟甲氧基、三氟甲氧基和2,2,2-三氟乙氧基。
本文所用的术语“杂芳基”是指具有单个环(单环)或多个环(双环或三环)，并且具有一个或多个独立地选自N、O、S和P的环杂原子的芳族基团。芳族单环是含有至少一个独立地选自N、O、S和P的杂原子(例如，1、2、3或4个独立地选自N、O、S和P的杂原子)的五元或六元环。五元芳族单环有两个双键，并且六元芳族单环有三个双键。双环杂芳基的示例是与如本文定义的单环芳基或如本文定义的单环杂芳基稠合连接的单环杂芳基环。三环杂芳基的示例是与独立地选自如本文定义的单环芳基或如本文定义的单环杂芳基的两个环稠合的单环杂芳基环。单环杂芳基的代表性实例包括但不限于吡啶基(包括吡啶-2-基、吡啶-3-基、吡啶-4-基)、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、吡咯基、苯并吡唑基、1,2,3-三唑基、1,3,4-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,3,4-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、咪唑基、噻唑基、异噻唑基、噻吩基、呋喃基、噁唑基、异噁唑基、1,2,4-三嗪基和1,3,5-三嗪基。双环杂芳基的代表性实例包括但不限于苯并咪唑基、苯并二氧杂环戊烯基、苯并呋喃基、苯并噁二唑基、苯并吡唑基、苯并噻唑基、苯并噻吩基、苯并三唑基、苯并噁二唑基、苯并噁唑基、色烯基、咪唑并吡啶、咪唑并噻唑基、吲唑基、吲哚基、异苯并呋喃基、异吲哚基、异喹啉基、萘啶基、嘌呤基、吡啶并咪唑基、喹唑啉基、喹啉基、喹喔啉基、噻唑并吡啶基、噻唑并嘧啶基、噻吩并吡咯基和噻吩并噻吩基。三环杂芳基的代表性实例包括但不限于二苯并呋喃基和二苯并噻吩基。单环、双环和三环杂芳基通过环内包含的任何碳原子或任何氮原子连接到母体分子部分。
本文所用的术语“亚杂芳基”是指二价杂芳基。
本文所用的术语“杂环(heterocycle)”或“杂环(heterocyclic)”是指具有一个或多个独立地选自N、O、S和P的环杂原子的饱和或部分不饱和的非芳族环基团。是指单环杂环、双环杂环或三环杂环。单环杂环是含有至少一个独立地选自N、O、S和P的杂原子的三元、四元、五元、六元、七元或八元环。三元或四元环含有零个或一个双键和一个选自N、O、S和P的杂原子。五元环含有零个或一个双键和一个、两个或三个选自N、O、S和P的杂原子。六元环含有零个、一个或两个双键以及一个、两个或三个选自N、O、S和P的杂原子。七元环和八元环含有零个、一个、两个或三个双键以及一个、两个或三个选自N、O、S和P的杂原子。单环杂环的代表性实例包括但不限于氮杂环丁基、氮杂环庚基、氮杂环丙烯基、二氮杂环庚基、1,3-二噁烷基、1,3-二氧戊环基、1,3-二硫戊环基、1,3-二噻烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑啉基、异噻唑烷基、异噁唑啉基、异噁唑烷基、吗啉基、噁二唑啉基、噁二唑烷基、噁唑啉基、噁唑烷基、氧杂环丁基、哌嗪基、哌啶基、吡喃基、吡唑啉基、吡唑烷基、吡咯啉基、吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢噻吩基、噻二唑啉基、噻二唑烷基、1,2-噻嗪烷基、1,3-噻嗪烷基、噻唑啉基、噻唑烷基、硫代吗啉基、1,1-二氧硫代吗啉基(硫代吗啉砜)、硫代吡喃基和三噻烷基。双环杂环是稠合到苯基的单环杂环、或稠合到单环环烷基的单环杂环、或稠合到单环环烯基的单环杂环、或稠合到单环杂环的单环杂环、或螺杂环基团、或桥接的单环杂环环系统，其中环的两个不相邻原子通过1、2、3或4个碳原子的亚烷基桥或2、3或4个碳原子的亚烯基桥连接。双环杂环的代表性实例包括但不限于苯并吡喃基、苯并硫代吡喃基、色烷基、2,3-二氢苯并呋喃基、2,3-二氢苯并噻吩基、2,3-二氢异喹啉基、2-氮杂螺[3.3]庚烷-2-基、氮杂双环[2.2.1]庚基(包括2-氮杂双环[2.2.1]庚-2-基)、2,3-二氢-1H-吲哚基、异吲哚啉基、八氢环戊并[c]吡咯基、八氢吡咯并吡啶基和四氢异喹啉基。三环杂环的示例是与苯基稠合的双环杂环，或与单环环烷基稠合的双环杂环，或与单环环烯基稠合的双环杂环，或与单环杂环稠合的双环杂环，或双环杂环，其中双环的两个不相邻原子通过1、2、3或4个碳原子的亚烷基桥或2、3或4个碳原子的亚烯基桥连接。三环杂环的实例包括但不限于八氢-2,5-环氧戊二烯、六氢-2H-2,5-桥亚甲基环戊并[b]呋喃、六氢-1H-1,4-桥亚甲基环戊并[c]呋喃、氮杂-金刚烷(1-氮杂三环[3.3.1.13,7]癸烷)和氧杂-金刚烷(2-氧杂三环[3.3.1.13,7]癸烷)。单环、双环和三环杂环通过环内包含的任何碳原子或任何氮原子连接到母体分子部分。
本文所用的术语“亚杂环基”是指二价杂环基。
本文所用的术语“取代基”是指在所示基团的原子上取代的基团。
当基团或部分可以被取代时，术语“取代的”指示在使用“取代的”的表达中指示的基团上的一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个或6个；在一些实施方案中为1个、2个或3个；并且在其他实施方案中为1个或2个)氢原子可以经一系列所列举的指示基团或经本领域技术人员已知的合适取代基(例如，下面列举的一个或多个基团)替换，条件是不超过指定原子的正常化合价。取代基包括但不限于烷基、烯基、炔基、烷氧基、酰基、氨基、酰胺基、脒基、芳基、叠氮基、氨甲酰基、羧基、羧基酯、氰基、环烷基、环烯基、胍基、卤代、卤代烷基、卤代烷氧基、杂烷基、杂芳基、杂环基、羟基、肼基、亚氨基、氧代、硝基、磷酸酯基、膦酸酯基、磺酸、磺酰胺基、硫醇、硫酮、硫氧基或其组合。
如本文所用，在化学结构中，指示：
表示一个部分与另一个部分的连接点。
在一些情况下，烃基取代基(例如，烷基烯基)中的碳原子数由前缀“Cx-Cy”表示，其中x是取代基中的最小碳原子数，y是最大碳原子数。因此，例如，“C1-C3烷基”是指含有1至3个碳原子的烷基取代基。
对于本文所述的化合物，其基团和取代基可以根据原子和取代基的允许化合价来选择，使得选择和取代产生稳定的化合物，例如，其不会自发地诸如通过重排、环化、消除等发生转化。
在通过从左至右书写的常规化学式指定取代基团的情况下，它们任选地涵盖从右到左书写结构所得到的取代基，例如，-CH2O-旨在涵盖-OCH2-，并且-C(O)NH-旨在涵盖-NHC(O)-。
尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料可用于本公开的实践或测试中，但以下描述了优选的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用整体并入。本文公开的材料、方法和实施例仅为说明性的，而非限制性的。
2.化合物
在一个方面，公开了一种式(I)化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
Q是CH或N；
A是芳基或具有1、2、3或4个独立地选自N、O、S和P的杂原子的5或6元单环杂芳基；
R1选自氢、卤代、C1-C4烷基、C3-C6环烷基、C1-C4卤代烷基、-ORa1、-N(Rb1)(Rc1)、-SO2Rd1、-SO2N(Re1)(Rf1)和-NHSO2Rg1，其中Ra1、Rb1、Rc1、Rd1、Re1、Rf1和Rg1各自独立地选自氢、C1-C4烷基和C1-C4卤代烷基；
R2选自氢、卤代、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基和式(II)基团：
其中：
D是单环杂芳基或单环杂环基，其各自任选地被C1-C4烷基取代；
X是键、-C(O)-、-NH-或-C(O)NH-；
Y是–(CRa2 2)n-G2–，其中每个Ra2独立地选自H和C1-C4烷基，或其中两个Ra2与它们所连接的一个或多个碳原子一起形成C3-C7亚环烷基环；G2是键、亚环烷基或亚杂环基；并且n是0、1、2或3；
Z是-ORb2、-SRc2、-N(Rd2)(Re2)或-CH3，其中Rb2、Rc2、Rd2和Re2各自独立地选自氢、芳基、芳基烷基、C1-C4烷基、-C(O)-C1-C40烷基、-C(O)-C2-C40烯基和式(IIa)基团：并且
R3选自氢和基团-L3-E，其中：
L3是键、C1-C2亚烷基、-CH＝CH-、-C≡C-、-C(O)-、-O-、-NH-、-S-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-C(O)S-、亚芳基、亚环烷基、亚杂芳基或亚杂环基，或其中L3包含此类基团中的任两个的组合；并且
E为双环杂环基或双环杂芳基，其各自任选地被1、2、3、4或5个独立地选自卤代、C1-C4烷基、C3-C6环烷基、C3-C6-环烷基-C1-4-烷基、C1-C4卤代烷基、氧代、-ORa3、-N(Rb3)(Rc3)、-SO2Rd3、-SO2N(Re3)(Rf3)和-NHSO2Rg3的取代基取代，其中Ra3、Rb3、Rc3、Rd3、Re3、Rf3和Rg3各自独立地选自氢、C1-C4烷基和C1-C4卤代烷基；
L是–(CRa4Rb4)m-G4–，其中：
Ra4和Rb4独立地选自氢和C1-C4烷基；
m是0、1或2；且
G4是键、-NHC(O)-、-NH-、-O-或-S-；并且
B是双环杂芳基或双环杂环基，其各自任选地被1、2、3、4或5个独立地选自卤代、C1-C4烷基、C3-C6环烷基、C1-C4卤代烷基、任选取代的芳基、-ORa5、-N(Rb5)(Rc5)、-SO2Rd5、-SO2N(Re5)(Rf5)和-NHSO2Rg5的取代基取代，其中Ra5、Rb5、Rc5、Rd5、Re5、Rf5和Rg5各自独立地选自氢、C1-C4烷基和C1-C4卤代烷基；
其中当R3是氢时，R2是式(II)基团且Z不是-CH3；并且
其中当R2是氢、卤代、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基或C1-C4卤代烷氧基时，R3是基团-L3-E。
在一些实施方案中，L是–(CRa4Rb4)m-G4–，其中m是0、1或2，Ra4和Rb4独立地选自氢和甲基，并且G4是键、-NHC(O)-、-NH-、-O-或-S-。在一些实施方案中，L具有选自以下的式：
在一些实施方案中，B是具有1、2、3或4个独立地选自N、O、S和P的杂原子的九元双环杂芳基或九元双环杂环基。在一些实施方案中，B是具有1、2、3或4个独立地选自N、O和S的杂原子的九元双环杂芳基或九元双环杂环基。在一些实施方案中，B是具有1、2、3或4个氮原子的九元双环杂芳基或九元双环杂环基。在一些实施方案中，B是吡唑并嘧啶。在一些实施方案中，除了-R3，B任选地被1、2、3、4或5个独立地选自卤代、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、-ORa5、-N(Rb5)(Rc5)、-SO2Rd5、-SO2N(Re5)(Rf5)和-NHSO2Rg5的取代基取代，其中Ra5、Rb5、Rc5、Rd5、Re5、Rf5和Rg5各自独立地选自氢、C1-C4烷基和C1-C4卤代烷基。在一些实施方案中，除了-R3，B被一个选自卤代、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、-ORa5、-N(Rb5)(Rc5)、-SO2Rd5、-SO2N(Re5)(Rf5)和-NHSO2Rg5的取代基取代。在一些实施方案中，除了-R3，B被一个选自卤代、甲基、三氟甲基、-ORa5、-N(Rb5)(Rc5)、-SO2Rd5、-SO2N(Re5)(Rf5)和-NHSO2Rg5的取代基取代，其中Ra5、Rb5、Rc5、Rd5、Re5、Rf5和Rg5各自独立地选自氢、甲基、乙基、异丙基、叔丁基和三氟甲基。
在一些实施方案中，化合物是式(Ia)化合物：
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，A是苯基或具有1、2、3或4个独立地选自N、O、S和P的杂原子的单环杂芳基。在一些实施方案中，A是苯基或具有1、2、3或4个独立地选自N、O和S的杂原子的单环杂芳基。在一些实施方案中，A是苯基或具有一个选自N、O和S的杂原子的单环杂芳基。在一些实施方案中，A选自苯基、吡啶基、呋喃和噻吩。在一些实施方案中，R1是氢。在一些实施方案中，A是苯基并且R1是氢。
在一些实施方案中，R2选自氢、卤代、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基和式(II)基团。在一些实施方案中，R2选自氢、氟、氯、溴、甲基、三氟甲基、甲氧基、三氟甲氧基、式(II)基团。在一些实施方案中，R2是氯。在一些实施方案中，R2是式(II)基团。
在一些实施方案中，化合物是式(Ib)化合物：
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，D是五元单环杂芳基或4至6元单环杂环基，其各自独立地包含1、2、3或4个独立地选自N、O、S和P的杂原子。在一些实施方案中，D是五元单环杂芳基或4至6元单环杂环基，其各自独立地包含1、2、3或4个独立地选自N、O和S的杂原子。在一些实施方案中，D选自吡咯、吡唑、咪唑、咪唑啉、噁唑、噁噻唑、噁二唑、氮杂环丁烷、吡咯啉、吡咯烷和哌啶。在一些实施方案中，D具有选自以下的结构：
在一些实施方案中，X是键或-C(O)-。在一些实施方案中，X是键。在一些实施方案中，X是-C(O)-。
在一些实施方案中，Y是–(CRa2 2)n-CH2–，其中n是0或1，并且其中每个Ra2是氢，或其中两个Ra2基团与它们所连接的碳原子一起形成C3-C6环烷基。在一些实施方案中，Y是–(CRa2 2)n-CH2–，其中n是0或1，并且其中每个Ra2是氢，或其中两个Ra2基团与它们所连接的碳原子一起形成亚环丙基环。在一些实施方案中，Y是–(CRa2 2)n-G2–，其中每个Ra2独立地选自H和C1-C4烷基，或其中两个Ra2与它们所连接的一个或多个碳原子一起形成C3-C7亚环烷基环；G2是亚环烷基或亚杂环基，并且n是0、1、2或3。在一些实施方案中，G2是亚环丁基、亚环戊基或亚环己基。
在一些实施方案中，基团-X-Y-Z具有选自以下的式：
在一些实施方案中，Z是-ORb2、-SRc2或-N(Rd2)(Re2)，其中Rb2、Rc2、Rd2和Re2各自独立地选自氢、甲基、乙基、异丙基、叔丁基、苯基、苄基、-C(O)-C1-C40烷基、-C(O)-C2-C40烯基和式(IIa)基团。在一些实施方案中，Z是-ORb2，其中Rb2选自氢、-C(O)-C1-C40烷基、-C(O)-C2-C40烯基和式(IIa)基团。在一些实施方案中，Z是-ORb2，其中Rb2选自氢、-C(O)-C15-C20烷基、-C(O)-C15-C20烯基和式(IIa)基团。
在一些实施方案中，Z是-ORb2，其中Rb2选自C(O)-C1-C40烷基、-C(O)-C2-C40烯基，其中C1-C40烷基或C2-C40烯基对应于饱和或不饱和脂肪酸的脂质尾部，诸如巴豆酸、肉豆蔻酸、棕榈油酸、智人酸、油酸、反油酸、异油酸、钆酸、二十碳烯酸、芥酸、神经酸、二十碳二烯酸、二十二碳二烯酸、亚麻酸、γ-亚麻酸、反亚油酸、皮诺敛酸、桐酸、二十碳三烯酸、二十烯酸、巨头鲸鱼酸、二高-γ-亚麻酸、二十碳三烯酸、硬脂酸、花生四烯酸、二十碳四烯酸、肾上腺酸、伯色五烯酸、二十碳五烯酸、奥唑酸、二十二碳六烯酸、二十二碳四烯酸、二十四烷酸、戊酸(pentanoic acid)、丁酸、戊酸(valeric acid)、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、月桂酸、十三烷酸、肉豆蔻酸、十五烷基酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、十九烷酸、花生酸、二十一烷酸、山嵛酸、二十三烷酸、二十四烷酸、二十五烷酸、蜡酸、二十七烷酸、褐煤酸、二十九烷酸、蜂花酸、三十一烷酸、紫胶蜡酸、三十三烷酸、三十四烷酸、三十五烷酸、三十六烷酸、三十七烷酸、三十八烷酸、三十九烷酸和四十烷酸。
在一些实施方案中，Z是-ORb2，其中Rb2是式(IIa)基团。
在一些实施方案中，-X-Y-Z基团具有选自以下的式：
在一些实施方案中，化合物是式(Ic)化合物：
或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，R2选自氢、卤代、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基和式(II)基团。在一些实施方案中，R2选自氢、氟、氯、溴、甲基、三氟甲基、甲氧基、三氟甲氧基、式(II)基团。在一些实施方案中，R2是氯。在一些实施方案中，R2是式(II)基团。
在一些实施方案中，L3是键、-CH2-CH2-、-CH＝CH-、-C≡C-、-C(O)NH-或具有1、2、3或4个独立地选自N、O、S和P的杂原子的5元单环亚杂芳基。在一些实施方案中，L3是键、-CH2-CH2-、-CH＝CH-、-C≡C-、-C(O)NH-或具有1、2或3个氮原子的5元单环亚杂芳基。在一些实施方案中，L3是键。在一些实施方案中，L3是-CH2-CH2-。在一些实施方案中，L3是-CH＝CH-。在一些实施方案中，L3是-C≡C-。在一些实施方案中，L3是-C(O)NH-。在一些实施方案中，L3是具有1、2或3个氮原子的5元单环亚杂芳基。在一些实施方案中，L3具有下式：
在一些实施方案中，E为8-10元双环杂环基或双环杂芳基，其各自任选地被1、2、3、4或5个独立地选自卤代、C1-C4烷基、C3-C6环烷基、C3-C6-环烷基-C1-4-烷基、C1-C4卤代烷基、氧代、-ORa3、-N(Rb3)(Rc3)、-SO2Rd3、-SO2N(Re3)(Rf3)和-NHSO2Rg3的取代基取代，其中Ra3、Rb3、Rc3、Rd3、Re3、Rf3和Rg3各自独立地选自氢、C1-C4烷基和C1-C4卤代烷基。在一些实施方案中，E是双环杂环基或双环杂芳基，其中双环的一个环是苯基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基或吡嗪基，而双环的另一个环是吡咯烷酮、吡咯烷二酮、哌啶二酮、吡咯、吡唑、咪唑、咪唑啉、噁唑、噁噻唑、噁二唑、吡咯啉、吡咯烷、哌啶或氮杂环丁烷，其中任一个如上所述任选地被取代。在一些实施方案中，E是异吲哚啉酮。
在一些实施方案中，E具有下式：
其中R'和R”独立地选自C1-C4烷基、C3-C6-环烷基-C1-4-烷基、C1-C4卤代烷基和-NHSO2Rg3，其中Rg3是C1-C4烷基。在一些实施方案中，R'是C3-C6-环烷基-C1-4-烷基，并且R”选自C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基和-NHSO2Rg3，其中Rg3是C1-C4烷基。在一些实施方案中，E具有选自以下的式：
在一些实施方案中，化合物选自：
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/>
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及其药学上可接受的盐。
可用于药物组合物(诸如包含白蛋白纳米颗粒的那些)的额外PI3K抑制剂化合物包括式(III)化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
R10选自-C≡C-Rx、C1-C4烷基、C2-C4烯基、C2-C4炔基、卤代、氰基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷基氨基和二C1-C4-烷基氨基；
R11选自C1-C4烷基和氢；
R12是具有1、2或3个氮原子的8至10元双环杂芳基，其中杂芳基任选地被1或2个选自氨基、C1-C4烷基和卤代的取代基取代；并且
Rx选自具有1或2个独立地选自N和S的杂原子的5或6元单环杂芳基、芳基、氢和C1-C4烷基，其中杂芳基和芳基任选地被1或2个选自C1-C4烷基的取代基取代。
在一些实施方案中，R10选自甲基、氟、氯、氰基、甲氧基、甲氨基、二甲氨基和-C≡C-Rx，其中Rx选自吡唑基、噻唑基、吡啶基和苯基，其中每一个任选地被一个甲基取代。在一些实施方案中，R10为-C≡C-Rx，并且Rx是具有两个氮原子的5元单环杂芳基，其被一个C1-C4烷基取代。在一些实施方案中，R10是-C≡C-Rx，并且Rx是甲基取代的吡唑基。
在一些实施方案中，R11是C1-C4烷基。在一些实施方案中，R11是甲基。
在一些实施方案中，R12是具有2或3个氮原子的9或10元双环杂芳基(例如，吡唑并[1,5-a]嘧啶基、吡唑并[1,5-a]吡啶基、喹啉基或萘吡啶基)，其中杂芳基任选地被一个氨基取代。在一些实施方案中，R12是被一个氨基取代的吡唑并[1,5-a]嘧啶。
在一些实施方案中，式(III)化合物选自：
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在一些实施方案中，式(III)化合物是：
化合物可以作为立体异构体存在，其中存在不对称或手性中心。立体异构体为“R”或“S”，这取决于手性碳原子周围取代基的构型。本文使用的术语“R”和“S”是IUPAC1974Recommendations for Section E,Fundamental Stereochemistry,于PureAppl.Chem.,1976,45:13-30中定义的构型。本公开考虑了各种立体异构体及其混合物，并且这些具体包括在本公开的范围内。立体异构体包括对映异构体和非对映异构体，以及对映异构体或非对映异构体的混合物。化合物的单个立体异构体可以由市售的含有不对称或手性中心的起始材料合成制备，或者通过制备外消旋混合物，然后采用本领域普通技术人员所熟知的拆分方法来制备。这些拆分方法的示例如下：(1)将对映异构体的混合物连接到手性助剂，通过重结晶或色谱法分离所得的非对映异构体混合物，以及任选地从助剂中释放光学纯产物，如描述于Furniss,Hannaford,Smith,和Tatchell,“Vogel's Textbook ofPractical Organic Chemistry,”第5版(1989),Longman Scientific&Technical,EssexCM20 2JE,England(或其最新版本)中，或(2)在手性色谱柱上直接分离光学对映异构体的混合物，或(3)分馏重结晶方法。
应当理解，化合物可以具有互变异构形式以及几何异构体，并且这些也构成本公开的实施方案。
本公开还包括同位素标记的化合物，其与式(I)或式(III)中所述的那些相同，但事实是一个或多个原子被具有不同于自然界中通常发现的原子质量或质量数的原子质量或质量数的原子所替换。同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，分别诸如但不限于2H、3H、13C、14C、15N、18O、17O、31P、32P、35S、18F和36Cl。用较重的同位素(诸如氘，例如2H)取代可以提供由更高的代谢稳定性产生的某些治疗优势，例如增加体内半衰期或减少剂量需求，因此在某些情况下可能是优选的。所述化合物可以结合正电子发射同位素，用于医学成像和正电子发射断层扫描(PET)研究，以确定受体的分布。可以结合到化合物中的合适的正电子发射同位素是11C、13N、15O和18F。同位素标记的化合物通常可以通过本领域技术人员已知的传统技术制备，或者通过类似于所附实施例中描述的方法，使用适当的同位素标记试剂代替非同位素标记的试剂制备。
所公开的化合物可以作为药学上可接受的盐存在。术语“药学上可接受的盐”是指化合物的盐或两性离子，其是水溶性或油溶性或可分散的，适用于治疗病症而没有过度的毒性、刺激和过敏反应，与合理的收益/风险比相称，并且对其预期用途有效。盐可以在化合物的最终分离和纯化过程中制备，或通过将化合物的氨基与合适的酸反应来单独制备。例如，化合物可以溶解在合适的溶剂中，诸如但不限于甲醇和水，并用至少一当量的酸(如盐酸)处理。所得盐可能沉淀出来，通过过滤分离并在减压下干燥。替代地，可以在减压下除去溶剂和过量的酸以提供盐。代表性盐包括乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、甲酸盐、羟乙磺酸盐、富马酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、草酸盐、马来酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、三氯乙酸盐、三氟乙酸盐、谷氨酸盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐等。化合物的氨基也可以与烷基氯化物、溴化物和碘化物诸如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、月桂基、肉豆蔻基、硬脂基等进行季铵化。
碱性加成盐可以在所公开化合物的最终分离和纯化过程中通过使羧基与合适的碱诸如金属阳离子(诸如锂、钠、钾、钙、镁或铝)的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐，或有机伯胺、仲胺或叔胺反应来制备。可以制备季胺盐，诸如衍生自甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、二乙胺、乙胺、三丁胺、吡啶、N,N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、二环己胺、普鲁卡因、二苄胺、N,N-二苄基苯乙胺、1-二苯羟甲胺和N,N′-二苄基乙二胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪等的那些。
化合物可以根据多种方法合成，包括实施例中所示的那些。每个单独步骤的反应条件和反应时间可能根据所用的特定反应物和所用反应物中存在的取代基而变化。具体程序在实施例部分中提供。反应可以常规方式，例如通过从残余物中除去溶剂来进行，并根据本领域通常已知的方法进一步纯化，所述方法诸如但不限于结晶、蒸馏、萃取、湿磨和色谱法。除非另有描述，否则起始材料和试剂是市售的或者可以由本领域技术人员使用化学文献中描述的方法从市售材料制备。起始材料，如果不是市售的，可以通过选自标准有机化学技术的程序、类似于已知的结构相似的化合物的合成的技术或类似于上述方案或合成实施例部分中描述的程序的技术来制备。
常规实验，包括对反应条件、试剂和合成路线顺序的适当操作，对与反应条件不相容的任何化学官能团的保护，以及在方法的反应顺序中的适当点的脱保护，都包括在本公开的范围内。合适的保护基以及使用这类合适的保护基保护不同取代基和脱保护的方法是本领域技术人员众所周知的；其实例可见于PGM Wuts和TW Greene,于Greene's booktitled Protective Groups in Organic Synthesis(第4版),John Wiley&Sons,NY(2006)，其通过引用整体并入文中。本公开的化合物的合成可以通过与上文所述的合成方案和具体实施例中描述的那些类似的方法来完成。
当需要所公开化合物的光学活性形式时，其可以通过使用光学活性起始材料(例如通过合适反应步骤的不对称诱导制备)进行本文所述的程序之一或通过使用标准程序(诸如色谱分离、重结晶或酶促拆分)拆分化合物或中间体的立体异构体的混合物来获得。
类似地，当需要化合物的纯几何异构体时，其可以通过使用纯几何异构体作为起始材料进行上述程序之一，或通过使用诸如色谱分离的标准程序拆分化合物或中间体的几何异构体的混合物来获得。
应当理解，所描述的合成方案和具体实施例是说明性的，并且不应被理解为限制所附权利要求中所定义的公开范围。合成方法和具体实施例的所有替代、修改和等同物包括在权利要求的范围内。
3.组合物
所公开的化合物，连同其他PI3K抑制剂化合物，可以掺入到可适于施用于受试者(诸如患者，其可以是人类或非人类)的组合物中。
a.药物组合物
化合物可以掺入到药学上可接受的组合物中。药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的一种或多种化合物。“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段下达到所需治疗效果的有效量。组合物的治疗有效量可由本领域技术人员确定，并可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及组合物在个体中引发所需反应的能力的因素而变化。治疗有效量也是本公开的化合物(例如式(I)化合物)的任何毒性或有害作用被治疗有益作用超过的量。“预防有效量”是指在必要的剂量和时间段下达到所需预防效果的有效量。通常，由于在疾病之前或早期阶段对受试者使用预防剂量，因此预防有效量将小于治疗有效量。
药物组合物和制剂可以包括药学上可接受的载剂。本文所用的术语“药学上可接受的载剂”是指无毒、惰性固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料、表面活性剂、环糊精或任何类型的制剂助剂。可作为药学上可接受的载剂的材料的一些实例是糖，诸如但不限于乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如但不限于玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如但不限于羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；黄蓍粉；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，诸如但不限于可可脂和栓剂蜡；油，诸如但不限于花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；表面活性剂，诸如但不限于cremophor EL、cremophor RH 60、SolutolHS15和聚山梨醇酯80；环糊精，诸如但不限于α-CD、β-CD、γ-CD、HP-β-CD、SBE-β-CD；二醇；诸如丙二醇；酯，诸如但不限于油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如但不限于氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格溶液；乙醇和磷酸盐缓冲溶液，以及其他无毒相容的润滑剂，诸如但不限于十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和增香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于组合物中，这根据配方师的判断。
所公开的化合物的施用途径和组合物的形式将决定所要使用的载剂的类型。组合物可以是多种形式，例如适用于全身施用(例如，口服、直肠、鼻腔、舌下、颊部、植入物或胃肠外注射)或局部施用(例如，真皮、肺、鼻腔、耳部、眼部、脂质体递送系统或离子电渗疗法)。
用于全身施用的载剂通常包括稀释剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、着色剂、香料、甜味剂、抗氧化剂、防腐剂、助流剂、溶剂、悬浮剂、润湿剂、表面活性剂、环糊精及其组合等中的至少一种。所有载剂在组合物中都是任选的。
合适的稀释剂包括糖，诸如葡萄糖、乳糖、右旋糖和蔗糖；二醇，诸如丙二醇；碳酸钙；碳酸钠；糖醇，诸如甘油；甘露醇；和山梨糖醇。全身或局部组合物中的一种或多种稀释剂的量通常为约50％至约90％。
合适的润滑剂包括二氧化硅、滑石、硬脂酸及其镁盐和钙盐、硫酸钙；以及液体润滑剂，诸如聚乙二醇和植物油，诸如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油。全身或局部组合物中的一种或多种润滑剂的量通常为约5％至约10％。
合适的粘合剂包括聚乙烯吡咯烷酮；硅酸镁铝；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；明胶；黄蓍胶；以及纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素和羧甲基纤维素钠。全身组合物中的一种或多种粘合剂的量通常为约5％至约50％。
合适的崩解剂包括琼脂、海藻酸及其钠盐、泡腾混合物、交联羧甲基纤维素、交联聚维酮、羧甲基淀粉钠、乙醇酸淀粉钠、粘土和离子交换树脂。全身或局部组合物中的一种或多种崩解剂的量通常为约0.1％至约10％。
合适的着色剂包括着色剂，诸如FD&C染料。使用时，全身或局部组合物中的着色剂的量通常为约0.005％至约0.1％。
合适的香料包括薄荷醇、薄荷和水果香料。使用时，全身或局部组合物中的一种或多种香料的量通常为约0.1％至约1.0％。
合适的甜味剂包括阿斯巴甜和糖精。全身或局部组合物中的一种或多种甜味剂的量通常为约0.001％至约1％。
合适的抗氧化剂包括丁基化羟基苯甲醚(“BHA”)、丁基化羟基甲苯(“BHT”)和维生素E。全身或局部组合物中的一种或多种抗氧化剂的量通常为约0.1％至约5％。
合适的防腐剂包括苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯和苯甲酸钠。全身或局部组合物中的一种或多种防腐剂的量通常为约0.01％至约5％。
合适的助流剂包括二氧化硅。全身或局部组合物中的一种或多种助流剂的量通常为约1％至约5％。
合适的溶剂包括水、等渗盐水、油酸乙酯、甘油、羟基化蓖麻油、醇诸如乙醇、二甲基亚砜、N-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基乙酰胺和磷酸盐(或其他合适的缓冲液)。全身或局部组合物中的一种或多种溶剂的量通常为约0％至约100％。
合适的悬浮剂包括AVICEL RC-591(来自FMC Corporation of Philadelphia,Pa.)和海藻酸钠。全身或局部组合物中的一种或多种悬浮剂的量通常为约1％至约8％。
合适的表面活性剂包括卵磷脂、聚山梨醇酯80和十二烷基硫酸钠，以及来自AtlasPowder Company of Wilmington,Del的TWEENS。合适的表面活性剂包括C.T.F.A.CosmeticIngredient Handbook,1992,第587-592页；Remington's Pharmaceutical Sciences,第15版1975,第335-337页；以及McCutcheon第1卷,Emulsifiers&Detergents,1994,北美版,第236-239页中公开的那些。全身或局部组合物中的一种或多种表面活性剂的量通常为约0.1％至约5％。
合适的环糊精包括α-CD、β-CD、γ-CD、羟丙基β-环糊精(HP-β-CD)、磺丁基醚β-环糊精(SBE-β-CD)。全身或局部组合物中的环糊精的量通常为约0％至约40％。
尽管全身组合物中组分的量可以根据制备的全身组合物的类型而变化，但一般来说，全身组合物包括0.01％至50％的活性化合物(例如，式(I)或式(III)化合物)和50％至99.99％的一种或多种载剂。用于肠胃外施用的组合物通常包括0.1％至10％的活性物质和90％至99.9％的载剂，包括稀释剂和溶剂。
用于口服施用的组合物可以具有多种剂型。例如，固体形式包括片剂、胶囊剂、颗粒剂和散装粉末。这些口服剂型包括安全有效量，通常至少约5％，更特别地约25％至约50％的活性物质。口服剂型组合物包括约50％至约95％的载剂，更特别地，约50％至约75％。
片剂可以是压缩的、片剂研磨的、肠溶包衣的、糖包衣的、膜包衣的或多重压缩的。片剂通常包括活性组分，以及包含选自稀释剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、着色剂、香料、甜味剂、助流剂及其组合的成分的载剂。特定稀释剂包括碳酸钙、碳酸钠、甘露醇、乳糖和纤维素。特定粘合剂包括淀粉、明胶和蔗糖。特定崩解剂包括海藻酸和交联羧甲基纤维素。特定润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸和滑石。特定着色剂是FD&C染料，可以出于外观而添加。咀嚼片优选含有甜味剂，诸如阿斯巴甜和糖精，或香料，诸如薄荷醇、薄荷、水果香料，或其组合。
胶囊(包括植入物、定时释放和缓释制剂)通常包括活性化合物(例如，式(I)或式(III)化合物)和载剂，所述载剂包括在包含明胶的胶囊中的一种或多种以上公开的稀释剂。颗粒通常包含所公开的化合物，优选助流剂诸如二氧化硅以改善流动特性。植入物可以是可生物降解的或不可生物降解的类型。
口服组合物的载剂中成分的选择取决于次要考虑因素，如味道、成本和货架稳定性，这些因素对于本发明的目的并不重要。
固体组合物可以通过常规方法进行包衣，通常用pH或时间依赖性包衣，使得所公开的化合物在所需施用附近的胃肠道中释放，或在不同的点和时间释放，以延长所需作用。包衣通常包括一种或多种选自由以下组成的组的组分：邻苯二甲酸乙酸纤维素酯、邻苯二甲酸聚乙酸乙烯酯、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素酯、乙基纤维素、包衣(可从Evonik Industries of Essen,Germany获得)、蜡和虫胶。/>
用于口服施用的组合物可以具有液体形式。例如，合适的液体形式包括水溶液、乳液、悬浮液、由非泡腾颗粒复溶的溶液、由非泡腾颗粒复溶的悬浮液、由泡腾颗粒复溶的泡腾制剂、酏剂、酊剂、糖浆等。液体口服施用组合物通常包括公开的化合物和载剂，即选自稀释剂、着色剂、香料、甜味剂、防腐剂、溶剂、悬浮剂和表面活性剂的载剂。口服液体组合物优选包括一种或多种选自着色剂、香料和甜味剂的成分。
可用于实现主题化合物的全身递送的其他组合物包括舌下、颊和鼻腔剂型。此类组合物通常包括一种或多种可溶性填充物质，诸如稀释剂，包括蔗糖、山梨糖醇和甘露醇；以及粘合剂，诸如阿拉伯胶、微晶纤维素、羧甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素。此类组合物还可以包括润滑剂、着色剂、香料、甜味剂、抗氧化剂和助流剂。
所公开的化合物可以局部施用。可以局部应用于皮肤的局部组合物可以是任何形式，包括固体、溶液、油、乳膏、软膏、凝胶、乳液、洗发水、免洗和冲洗护发素、乳剂、清洁剂、保湿剂、喷雾剂、皮肤贴片等。局部组合物包括：所公开的化合物(例如，式(I)或式(III)化合物)和载剂。局部组合物的载剂优选有助于化合物渗透到皮肤中。载剂还可以包括一种或多种任选组分。
与所公开的化合物结合使用的载剂的量足以提供用于每单位剂量化合物施用的实际量的组合物。用于使剂型在本发明方法中有用的技术和组合物在以下参考文献中描述：Modern Pharmaceutics,第9章和第10章,Banker&Rhodes,编辑(1979)；Lieberman等人,Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets(1981)；以及Ansel,Introduction toPharmaceutical Dosage Forms,第2版,(1976)。
载剂可以包括单一成分或两种或更多种成分的组合。在局部组合物中，载剂包括局部载剂。合适的局部载剂包括一种或多种选自磷酸盐缓冲盐水、等渗水、去离子水、单官能醇、对称醇、芦荟凝胶、尿囊素、甘油、维生素A和E油、矿物油、丙二醇、PPG-2肉豆蔻基丙酸酯、异山梨醇二甲酯、蓖麻油及其组合等的成分。更特别地，用于皮肤应用的载剂包括丙二醇、二甲基异山梨醇和水，甚至更特别地，磷酸盐缓冲盐水、等渗水、去离子水、单官能醇和对称醇。
局部组合物的载剂还可以包括一种或多种选自润肤剂、推进剂、溶剂、保湿剂、增稠剂、粉末、香精、颜料和防腐剂的成分，所有这些都是任选的。
合适的润肤剂包括硬脂醇、甘油单蓖麻醇酸酯、甘油单硬脂酸酯、丙-1,2-二醇、丁-1,3-二醇、水貂油、鲸蜡醇、异硬脂酸异丙酯、硬脂酸、棕榈酸异丁酯、硬脂酸异十六烷酯、油醇、月桂酸异丙酯、月桂酸己酯、油酸癸酯、十八烷-2-醇、异十六烷醇、十六烷基棕榈酸酯、癸二酸二正丁酯、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、硬脂酸异丙酯、硬脂酸丁酯、聚乙二醇、三乙二醇、羊毛脂、芝麻油、椰子油、花生油、蓖麻油、乙酰化羊毛脂醇、石油、矿物油、肉豆蔻酸丁酯、异硬脂酸、棕榈酸、亚油酸异丙酯、乳酸月桂酯、肉豆蔻乳酸酯、油酸癸酯、肉豆蔻酸肉豆蔻酯及其组合。皮肤专用润肤剂包括硬脂醇和聚二甲基硅氧烷。基于皮肤的局部组合物中一种或多种润肤剂的量通常为约5％至约95％。
合适的推进剂包括丙烷、丁烷、异丁烷、二甲醚、二氧化碳、一氧化二氮及其组合。局部组合物中一种或多种推进剂的量通常为约0％至约95％。
合适的溶剂包括水、乙醇、二氯甲烷、异丙醇、蓖麻油、乙二醇单乙醚、二乙二醇单丁醚、二乙二醇单乙醚、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、四氢呋喃及其组合。特定溶剂包括乙醇和同位醇。局部组合物中一种或多种溶剂的量通常为约0％至约95％。
合适的保湿剂包括甘油、山梨糖醇、2-吡咯烷酮-5-羧酸钠、可溶性胶原蛋白、邻苯二甲酸二丁酯、明胶及其组合。特定保湿剂包括甘油。局部组合物中一种或多种保湿剂的量通常为0％至95％。
局部组合物中一种或多种增稠剂的量通常为约0％至约95％。
合适的粉末包括β-环糊精、羟丙基环糊精、白垩、滑石、富勒烯土、高岭土、淀粉、树胶、胶体二氧化硅、聚丙烯酸钠、四烷基蒙脱石铵、三烷基芳基蒙脱石铵、化学改性的硅酸镁铝、有机改性的蒙脱石粘土、水合硅酸铝、气相二氧化硅、羧乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、乙二醇单硬脂酸酯及其组合。局部组合物中一种或多种粉末的量通常为0％至95％。
局部组合物中香精的量通常为约0％至约0.5％，特别是约0.001％至约0.1％。
合适的pH调节添加剂包括HCl或NaOH，其量足以调节局部药物组合物的pH。
b.白蛋白纳米颗粒组合物
本公开还提供包含有效量的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂或其药学上可接受的盐和白蛋白纳米颗粒的组合物。多种PI3K抑制剂可与白蛋白纳米颗粒结合使用，以形成合适的组合物。在一些实施方案中，PI3K抑制剂是式(I)化合物，诸如本文公开的式(I)化合物。在一些实施方案中，PI3K抑制剂是式(III)化合物，诸如本文公开的式(III)化合物。在一些实施方案中，PI3K抑制剂选自IPI-549、艾代拉里斯、可泮利塞、杜韦利西布、阿培利司、莱尼利西布、厄布利塞、布帕西布、他塞利昔布、匹替利司、PX-886、皮拉利司、BEZ235、GSK2126458、GSK2636771、AZD8186、SAR260301、吉达利塞、阿培利司、PQR309、MLN1117和哌立福新。如上所述，白蛋白纳米颗粒组合物和制剂还可以包括药学上可接受的载剂。
在一些实施方案中，白蛋白纳米颗粒包封PI3K抑制剂，例如形成围绕PI3K抑制剂的外壳。在某些实施方案中，纳米颗粒组合物实现了高包封效率(>70-90％)和良好稳定性。
白蛋白包括哺乳动物中最丰富的血浆蛋白，来自大量不同数量的哺乳动物的白蛋白已经通过生化方法和/或序列信息进行了表征。任何天然的、合成的或工程化的白蛋白都可以用于本文所述的纳米颗粒组合物的上下文中。在一些实施方案中，白蛋白为人血清白蛋白或来自动物物种的白蛋白(例如，牛血清白蛋白、猪血清白蛋白等)。在一些实施方案中，白蛋白为人血清白蛋白。
组合物可以含有不同摩尔比的白蛋白和PI3K抑制剂。白蛋白与公开的化合物的摩尔比范围为1:20至20:1。
在一些实施方案中，每个白蛋白纳米颗粒的直径在50至200nm的范围内。纳米颗粒的直径可以是约50nm、约75nm、约100nm、约125nm、约150nm、约175nm或约200nm。
c.额外纳米制剂
在一些实施方案中，将PI3K抑制剂掺入包含聚乳酸(PLA)和/或聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)纳米颗粒、脂质体、脂质纳米颗粒或胶束的组合物中。在一些实施方案中，PI3K抑制剂被包封在PLA或PLGA纳米颗粒、脂质体、脂质纳米颗粒或胶束中。如上所述，纳米制剂还可以包括药学上可接受的载剂。
在一些实施方案中，将所公开的化合物掺入包含一种或多种囊泡形成脂质的脂质体组合物中。制备脂质体组合物的方法包括，例如，脂质膜水合，任选地与超声处理或挤出、溶剂蒸发(例如，乙醇注射、乙醚注射或反相蒸发)或洗涤剂去除方法相结合。所公开的化合物可以在囊泡形成之前(被动负载)或在囊泡形成之后(主动负载)与一种或多种脂质组合。脂质体组合物可以延长体内循环时间，增加化合物的稳定性，并防止血液中的降解。脂质体组合物可以增加化合物在肺、乳腺、胰腺和脾脏内的分布。
可以使用任何天然存在的或合成的囊泡形成脂质或其组合。一种或多种囊泡形成脂质可以选自二脂族链脂质，诸如磷脂；甘油二酯；二脂族糖脂；单一脂质，诸如鞘磷脂或鞘糖脂；甾体脂质；亲水性聚合物衍生脂质；或其混合物。
脂质体可含有其他非囊泡形成脂质或其他部分，包括但不限于两亲性聚合物、聚阴离子、甾醇和表面活性剂。脂质体组合物中所含的脂质体也可以是靶向脂质体，例如，脂质体表面含有一个或多个靶向部分或生物分布改性剂的脂质体。靶向部分可以是能够特异性地与所需靶标结合或相互作用的任何剂，并且是本领域通常已知的，例如配体诸如叶酸、蛋白质、抗体或抗体片段等)。
脂质体可以具有任何脂质体结构，例如，具有通过一个或多个脂质双层与外部介质隔离的内部空间的结构，或具有半渗透膜的任何微胶囊，所述半渗透膜具有亲脂性中心部分，其中膜隔离内部。在一些实施方案中，脂质体可以是单层脂质体，具有单个脂质层。所公开的化合物可以全部或部分位于脂质体的内部空间内，或完全或部分位于脂质体的双层膜内。在一些实施方案中，脂质为胶束。
在一些实施方案中，将所公开的化合物掺入包含PLA和/或PLGA的纳米制剂中。PLA或PLGA纳米制剂可以通过本领域已知的各种方法制备，诸如单/双乳液溶剂蒸发技术、喷雾干燥、喷雾冷冻干燥、超临界流体干燥和纳米沉淀。
d.额外治疗剂
本文公开的组合物还可以包含至少一种额外的治疗剂。在一些实施方案中，至少一种额外的治疗剂包含至少一种化疗剂。本文所用的术语“化疗药物”或“抗癌药物”包括用于癌症治疗或预防的任何小分子或其他药物。化疗药物包括但不限于环磷酰胺、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、多柔比星、多西他赛、柔红霉素、博来霉素、长春碱、达卡巴嗪、顺铂、紫杉醇、盐酸雷洛昔芬、枸橼酸他莫昔芬、阿贝西利、飞尼妥(依维莫司)、阿培利司、阿那曲唑(anastrozole)、帕米膦酸盐、阿那曲唑、依西美坦(exemestane)、卡培他滨(capecitabine)、盐酸表柔比星、甲磺酸艾日布林、托瑞米芬(toremifene)、氟维司群(fulvestrant)、来曲唑(letrozole)、吉西他滨、戈舍瑞林(goserelin)、伊沙匹隆(ixabepilone)、伊姆坦辛(emtansine)、拉帕替尼(lapatinib)、奥拉帕尼(olaparib)、甲地孕酮、奈拉替尼(neratinib)、帕博西尼(palbociclib)、瑞博西林(ribociclib)、他拉唑帕尼(talazoparib)、噻替派、托瑞米芬、甲氨蝶呤和图卡替尼(tucatinib)。在选定的实施方案中，化疗剂是紫杉醇。
在一些实施方案中，将化疗药物添加到包含本文公开的化合物的药物组合物中。在一些实施方案中，将化疗剂的组合物掺入包含PI3K抑制剂和白蛋白纳米颗粒的组合物中。在一些实施方案中，白蛋白纳米颗粒包封化疗剂和PI3K抑制剂，例如形成围绕化疗剂和PI3K抑制剂的外壳。在一些实施方案中，将化疗剂掺入包含PI3K抑制剂和PLGA和/或PLA纳米颗粒、脂质体、脂质纳米颗粒或胶束的组合物中。在一些实施方案中，化疗剂被包封在PLGA和/或PLA纳米颗粒、脂质体、脂质纳米颗粒或胶束中。
4.使用方法
本公开还提供了用于治疗疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用PI3K抑制剂或其组合物。在一些实施方案中，受试者是人。
PI3K抑制剂可以靶向任何类别的PI3K，包括I类(例如IA和IB)、II类或III类。在一些实施方案中，PI3K抑制剂是本文公开的化合物。在一些实施方案中，PI3K抑制剂包含同工型选择性PI3K抑制剂、双泛I类PI3K/m-TOR抑制剂和不具有显著m-TOR活性的泛I类PI3K抑制剂。可用于本发明组合物、纳米制剂和方法的PI3K抑制剂包括但不限于IPI-549、艾代拉里斯、可泮利塞、杜韦利西布、阿培利司、莱尼利西布、厄布利塞、布帕西布、他塞利昔布、匹替利司、PX-886、皮拉利司、BEZ235、GSK2126458、GSK2636771、AZD8186、SAR260301、吉达利塞、阿培利司、PQR309、MLN1117和哌立福新。
疾病或病症可包括癌症、自身免疫性疾病和炎症性疾病。
在一些实施方案中，疾病或病症是炎症性疾病或病症。炎症性疾病的特征是组织或器官中的免疫系统激活到异常水平，这可能导致组织或器官功能异常和/或疾病。可通过本发明方法治疗的炎症性疾病和病症包括但不限于关节炎、类风湿性关节炎、哮喘、炎症性肠病(克罗恩病或溃疡性结肠炎)、慢性阻塞性肺病(COPD)、过敏性鼻炎、血管炎(结节性多动脉炎、颞动脉炎、韦格纳肉芽肿病、大动脉炎或白塞综合征)、炎症性神经病变、牛皮癣、系统性红斑狼疮(SLE)、慢性甲状腺炎、桥本甲状腺炎、艾迪生病、风湿性多肌痛、干燥综合征或Churg-Strauss综合征。在一些重要的实施方案中，炎症性疾病是类风湿性关节炎。
在一些实施方案中，疾病或病症是自身免疫性疾病或病症。自身免疫性疾病和病症是指以受试者对自身细胞、组织和/或器官的免疫反应引起的细胞、组织和/或器官损伤为特征的受试者中的病状。可通过本发明方法治疗的自身免疫性疾病和病症包括但不限于斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森氏病、肾上腺自身免疫性病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎和睾丸炎、自身免疫性血小板减少症、白塞病、大疱性类天疱疮、心肌病、乳糜泻皮炎、慢性疲劳免疫功能异常综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘性多神经病、Churg-Strauss综合征、瘢痕类天疱疮、CREST综合征、冷凝集素病、克罗恩病、盘状狼疮、原发性混合性冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、肾小球肾炎、格雷夫斯氏病、格-巴二氏综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、肠易激综合征(IBD)、IgA神经病、青少年关节炎、扁平苔藓、红斑狼疮、美尼尔氏病、混合型结缔组织病、多发性硬化、1型或免疫介导的糖尿病、重症肌无力、寻常型天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬变、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、雷诺现象、莱特尔氏综合征、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、干燥综合征、全身肌强直综合征、系统性红斑狼疮、红斑狼疮、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞性动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎，诸如疱疹样皮炎血管炎、白癜风和韦格纳肉芽肿病。
一些自身免疫性病症也与炎症性病状有关。也是可以根据本发明的方法预防、治疗或管理的自身免疫性病症的炎症性病症的实例包括但不限于哮喘、脑炎、炎症性肠病、慢性阻塞性肺病(COPD)、过敏性病症、肺纤维化、未分化脊柱关节病、未分化关节病、关节炎、炎症性骨溶解和慢性病毒或细菌感染引起的慢性炎症。可以根据本发明的组合物和方法治疗的银屑病类型的实例包括但不限于斑块型银屑病、脓疱型银屑病、红皮型银屑病、滴状银屑病和反向银屑病。
在一些实施方案中，疾病或病症是癌症。在一些实施方案中，癌症包括实体瘤。在一些实施方案中，癌症包括血癌或淋巴瘤。在一些实施方案中，癌症是转移性癌症。在一些实施方案中，所公开的化合物、组合物或方法导致抑制转移的消除。在一些实施方案中，所公开的化合物、组合物或方法导致肿瘤生长减少。在一些实施方案中，所公开的化合物、组合物或方法防止肿瘤复发。
PI3K抑制剂可用于治疗多种癌症，包括癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤或精原细胞瘤。癌症可能是膀胱癌、血液癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠/直肠癌、子宫内膜癌、头颈部癌、肾癌、肝癌、肺癌、淋巴结癌、肌肉组织、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、脾癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌或子宫癌。在选定的实施方案中，癌症可包括乳腺癌。
PI3K抑制剂或其组合物可以通过多种方法施用给受试者。在本文描述的任何用途或方法中，可以通过本领域技术人员已知的各种途径施用，包括但不限于口服、吸入、静脉内、肌肉内、局部、皮下、全身和/或腹膜内施用给有需要的受试者。在一些实施方案中，本文所公开的PI3K抑制剂或其组合物可以通过肠胃外施用(包括但不限于皮下、肌内、静脉内、腹膜内、心内和关节内注射)来施用。在一些实施方案中，本文所公开的PI3K抑制剂或其组合物可以通过口服施用来施用。
用于治疗或预防所需的本公开的PI3K抑制剂或其组合物的量不仅会随着所选择的特定化合物而变化，而且还会随着施用途径、疾病的性质和/或症状以及患者的年龄和状况而变化，并且最终将由主治医师或临床医生决定。有效剂量水平(即达到预期结果所需的剂量水平)的确定可以由本领域技术人员使用常规方法完成，例如，人体临床试验、体内研究和体外研究。例如，PI3K抑制剂或其组合物的有用剂量可以通过比较它们的体外活性和动物模型中的体内活性来确定。
剂量的量和间隔可以单独调整，以提供足以维持调节作用的活性部分的血浆水平，或最小有效浓度(MEC)。每种化合物的MEC会有所不同，但可以从体内和/或体外数据估计。实现MEC所需的剂量将取决于个体特征和施用途径。然而，FIPLC测定或生物测定可用于确定血浆浓度。剂量间隔也可以使用MEC值确定。组合物应使用一种方案施用，所述方案在10-90％的时间内，优选在30-90％之间，最优选在50-90％之间的时间内将血浆水平维持在MEC以上。在局部施用或选择性摄取的情况下，药物的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。
应注意，主治医师将知道如何以及何时因毒性或器官功能障碍而终止、中断或调整施用。相反，如果临床反应不足(排除毒性)，主治医师也会知道将治疗调整到更高的水平。在管理感兴趣的病症时，施用剂量的大小将随着要治疗的症状的严重程度和施用途径而变化。此外，剂量，也许还有剂量频率，也会根据个体患者的年龄、体重和反应而变化。与上面讨论相当的程序可用于兽医学。
本文公开的PI3K抑制剂或其组合物可以使用已知的方法评估其疗效和毒性。例如，特定化合物、共享某些化学部分的化合物的子集或包含PI3K抑制剂的组合物的毒理学可以通过确定对细胞系(诸如哺乳动物，且优选人类细胞系)的体外毒性来确定。此类研究的结果通常可以预测动物(诸如哺乳动物或更具体地人类)中的毒性。替代地，可以使用已知方法测定特定化合物在动物模型中的毒性，诸如小鼠、大鼠、兔、狗或猴模型。可以使用几种公认的方法确定疗效，诸如体外方法、动物模型或人体临床试验。在选择模型以确定疗效时，本领域技术人员可以在现有技术的指导下选择适当的模型、剂量、施用途径和/或方案。
治疗有效量的本文公开的PI3K抑制剂或化合物，或其组合物，可单独施用或与治疗有效量的至少一种另外的治疗剂组合施用。在一些实施方案中，有效组合疗法是通过包括两种剂的单一组合物或药理制剂，或同时施用的两种不同的组合物或制剂来实现的，其中一种组合物包括本发明的化合物，而另一种包括一种或多种第二剂。
在一些实施方案中，至少一种额外的治疗剂包含至少一种化疗剂。本文所用的术语“化疗药物”或“抗癌药物”包括用于癌症治疗或预防的任何小分子或其他药物。化疗药物包括但不限于环磷酰胺、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、多柔比星、多西他赛、柔红霉素、博来霉素、长春碱、达卡巴嗪、顺铂、紫杉醇、盐酸雷洛昔芬、枸橼酸他莫昔芬、阿贝西利、依维莫司、阿培利司、阿那曲唑、帕米膦酸盐、阿那曲唑、依西美坦、卡培他滨、盐酸表柔比星、甲磺酸艾日布林、托瑞米芬、氟维司群、来曲唑、吉西他滨、戈舍瑞林、伊沙匹隆、伊姆坦辛、拉帕替尼、奥拉帕尼、甲地孕酮、奈拉替尼、帕博西尼、瑞博西林、他拉唑帕尼、噻替派、托瑞米芬、甲氨蝶呤和图卡替尼。在选定的实施方案中，化疗剂包括紫杉醇。
化疗剂(例如紫杉醇)可以与PI3K抑制剂分开或以单一组合物形式提供。在一些实施方案中，将化疗剂的单一组合物同时掺入包含白蛋白纳米颗粒的组合物中。在一些实施方案中，白蛋白纳米颗粒包封化疗剂和PI3K抑制剂，例如形成围绕化疗剂和PI3K抑制剂的外壳。
多种第二疗法可以与本公开的化合物结合使用。第二疗法可以是施用另一种治疗剂，或者可以是不与施用另一种剂相关的第二疗法。此类第二疗法包括但不限于手术、免疫疗法、放疗或额外化疗或抗癌剂。
第二疗法(例如，免疫疗法)可以与初始疗法同时施用，与第一组合物在同一组合物中或在与第一组合物基本上同时施用的单独的组合物中。在一些实施方案中，第二疗法可以在第一疗法的治疗之前或之后从几小时到几个月的时间间隔。
在一些实施方案中，第二疗法包括免疫疗法。免疫疗法包括嵌合抗原受体(CAR)T细胞或T细胞转移疗法、细胞因子疗法、免疫调节剂、癌症疫苗或施用抗体(例如单克隆抗体)。
在一些实施方案中，免疫疗法包括施用抗体。抗体可以靶向肿瘤细胞特异性表达的抗原或与正常细胞共享的抗原。在一些实施方案中，免疫疗法可包括靶向例如以下的抗体：CD20、CD33、CD52、CD30、HER(也称为erbB或EGFR)、VEGF、CTLA-4(也称为CD152)、上皮细胞粘附分子(EpCAM，也称为CD326)和PD-1/PD-L1。合适的抗体包括但不限于利妥昔单抗(rituximab)、博纳吐单抗(blinatumomab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、托西莫单抗(tositumomab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、本妥昔单抗(brentuximab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)等)。在一些实施方案中，额外治疗剂可包含抗PD-1/PD-L1抗体，包括但不限于派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、西米普利单抗(cemiplimab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维单抗(avelumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)和伊匹单抗。抗体也可能与化疗剂连接。因此，在一些实施方案中，抗体是抗体-药物缀合物。
免疫疗法(例如，施用抗体)可以通过多种方法施用给受试者。在本文描述的任何用途或方法中，可以通过本领域技术人员已知的各种途径施用，包括但不限于口服、吸入、静脉内、肌肉内、局部、皮下、全身和/或腹膜内施用给有需要的受试者。在一些实施方案中，免疫疗法可以以与PI3K抑制剂或其组合物相同或不同的方式施用。免疫疗法可以通过肠胃外施用(包括但不限于皮下、肌内、静脉内、腹膜内、心内和关节内注射)来施用。
5.试剂盒
在另一方面，本公开提供了试剂盒，所述试剂盒包含至少一种公开的化合物或其药学上可接受的盐，或包含所述化合物或其药学上可接受的盐的组合物，以及使用所述化合物或组合物的说明书。
试剂盒还可以包含与其他组分共同包装、共同配制和/或共同递送的其他剂和/或产物。例如，药物制造商、药物经销商、医生、药房或药剂师可以提供包含用于递送至患者的公开的化合物和/或产物以及另一种剂(例如，化疗药物、单克隆抗体、止痛药、抗癫痫药物、类固醇、止吐药)的试剂盒。
试剂盒还可以包含使用试剂盒组分的说明书。说明书是与试剂盒有关的相关材料或方法。材料可以包括以下的任何组合：背景信息、组分列表、使用组合物的简要或详细方案、解决难题、参考资料、技术支持和任何其他相关文件。说明书可与试剂盒一起提供或以单独元件组分(作为可在计算机可读存储装置上提供或从互联网网站下载的书面形式或电子形式)，或以记录演示提供。
应理解，公开的试剂盒可以与公开的方法结合使用。试剂盒还可以包含用于与本文公开的方法或组合物一起使用的容器或装置。试剂盒可任选地提供额外组分，诸如缓冲液和一次性设备(例如移液管、细胞培养板或烧瓶)。
本文提供的试剂盒采用合适的包装。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、罐子、软包装等。试剂盒的各成员组分可以物理地包装在一起或单独地包装。
6.实施例
以下方案和实施例中使用的缩写是：AcOH为乙酸；BPO是过氧化苯甲酰；DCM是二氯甲烷；DIPEA是N,N-二异丙基乙胺；DMAP是4-二甲氨基吡啶；DMF是二甲基甲酰胺；DMSO是二甲基亚砜；EDC为1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺；eq是当量；Et3N或NEt3是三乙胺；Et2O是乙醚；EtOAc为乙酸乙酯；EtOH是乙醇；Et3SiH是三乙基硅烷；HATU是1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化六氟磷酸盐，N-[(二甲基氨基)-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶-1-基亚甲基]-N-甲基甲铵六氟磷酸盐N-氧化物；HCl是盐酸；MeOH是甲醇；MsCl是甲磺酰氯；NBS是N-溴代琥珀酰亚胺；ON是过夜；Pd/C是钯碳；PMBNH2是对甲氧基苄胺；RT为室温；TBAF是四正丁基氟化铵；TBAI是碘化四丁铵；THF是四氢呋喃；并且TFA是三氟乙酸。
所有对空气和湿气敏感的操作均使用标准Schlenk技术在氩气或真空下进行。无水溶剂(Et2O、THF、二噁烷、DMSO、DMF、DCM和甲苯)购自Fischer Scientific。所有化学品购自Fischer Scientific、Sigma Aldrich、TCI WUXI Apptec和DC Chemicals Europe，除非另有说明，否则无需进一步纯化即可使用。
分析薄层色谱(TLC)采用Merck SIL G/UV254板进行。通过暴露于紫外光或将板浸入茚三酮或高锰酸钾溶液中，然后加热或在宽罐室中用碘蒸气染色来使化合物可视化。在空气中用硅胶60(Fluka)进行柱色谱。使用Merck Kieselgel 60(200-500mm)进行柱色谱。给出溶剂系统(s/s v:v)。
NMR光谱1H(300MHz)、13C(75MHz)分别记录在ARX 300或Avance II 500Bruker光谱仪上。化学位移(δ，ppm)参考所示溶剂中氘代溶剂的残留1H或13C给出(CDCl3 7.26，77.00；(CD3)2CO 2.05，29.84和206.26，(CD3)2SO 2.50，39.52)。1H和13C-NMR化学位移(δ)相对于TMS标度以百万分率(ppm)为单位。耦合常数J以Hz为单位。以下缩写用于质子光谱多重性：s：单峰，d：双重峰，t：三重峰，q：四重峰，qt：五重峰，m：多重峰，br.：宽峰，dd：双二重峰，dt：双三重峰。耦合常数(J)以赫兹(Hz)为单位报告。一些无法归因的信号将由ArH(芳香氢)表示。
质谱(MS)用具有正(ESI+)或负(ESI-)电喷雾电离(电离张力4.5kV，注射温度240℃)的LCQ-advantage(ThermoFinnigan)质谱仪记录。
实施例1
系列1
系列1构建块的合成：
用于合成系列1构建块的一般合成策略：
4元、5元和6元环是市售的，例如来自DC Chemicals。当在内部合成时，使用以下一般程序1、2、3、4和5。
一般程序1：酰胺偶联
在氩气气氛下，将羧酸(1当量)和HATU(0.95当量)在无水DMF(0.05M)中的溶液在0℃下搅拌0.5小时。然后加入杂环胺(1当量)在DMF(0.1M)中的溶液。将混合物在0℃-RT下搅拌2小时(除非另有说明)。通过使用CH2Cl2-MeOH 9:1混合物作为洗脱液的TLC以及使用ARX300Brucker光谱仪的1H NMR监测反应进展。然后用二氯甲烷(3x)和水提取混合物，用盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，真空浓缩并通过使用CH2Cl2-EtOAc或CH2Cl2-MeOH分级梯度溶剂系统作为洗脱液的手动柱色谱法进行纯化。
一般程序2：酯化
在氩气气氛下，将羧酸(1当量)、EDC.HCl(0.95当量)、DMAP(10mol％)在无水THF(0.05M)中的溶液在0℃下搅拌0.5小时。然后加入醇(1当量)在THF(0.1M)中的溶液。将混合物在0℃至RT下搅拌过夜(除非另有说明)。通过使用CH2Cl2-MeOH 9:1混合物作为洗脱液的TLC以及使用ARX 300Brucker光谱仪的1H NMR监测反应进展。然后除去THF，用二氯甲烷(3x)和水提取混合物，用盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，真空浓缩并通过使用CH2Cl2-EtOAc或CH2Cl2-MeOH分级梯度溶剂系统作为洗脱液的手动柱色谱法进行纯化。
一般程序3：N-烷基化
向胺(1当量)在无水DMF(0.2M)中的溶液中加入碳酸钾(3当量)，将混合物在RT下搅拌5分钟。然后加入卤素衍生物(1.2当量)，并将混合物在80℃下搅拌过夜(当卤素为氯时，向反应介质中加入10mol％的NaI)。通过使用CH2Cl2-MeOH 9:1混合物作为洗脱液的TLC以及使用ARX 300Brucker光谱仪的1H NMR监测反应进展。完成后，用二氯甲烷(3x)和水提取混合物，用盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，真空浓缩并通过使用CH2Cl2-EtOAc或CH2Cl2-MeOH分级梯度溶剂系统作为洗脱液的手动柱色谱法进行纯化。
一般程序4：N-烷基化
将胺(1当量)、KI(1.5当量)、KOH(5当量)和22a(2当量)在甲苯/H2O(0.03M，1:1)中的混合物在80℃下反应16小时。反应完成后，将混合物冷却至rt并用EtOAc提取。将合并的有机相用Na2SO4干燥，真空浓缩，并通过使用CH2Cl2-EtOAc或CH2Cl2-MeOH分级梯度溶剂系统作为洗脱液的柱色谱法进行纯化。
一般程序5：N-烷基化
将胺(1当量)、2-溴乙醇(1.1当量)、Cs2CO3(1.5)和TBAI(0.2当量)的(0.3M)DMF溶液在80℃下加热2小时(除非另有说明)。通过TLC和1H NMR监测反应。然后将反应物稀释到冰水中并用EtOAc(3x)提取。将合并的有机层用水、盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，真空浓缩，并通过使用CH2Cl2-MeOH分级梯度溶剂的手动柱色谱法进行纯化，得到所需产物。
按照一般程序5，将4-溴-1H-吡唑(1.00g，6.80mmol，1当量)与DMF(20mL，0.3M)、2-溴乙醇(0.93g，7.48mmol，1.1当量)、Cs2CO3(3.32g，10.20mmol，1.5当量)和TBAI(0.50g，1.36mmol，0.2当量)反应，在柱纯化(SiO2，CH2Cl2-EtOAc 1:1，然后CH2Cl2-MeOH 9:1)后得到所需产物。
构建块(CAS＝2241142-25-4，[1-(4-溴吡唑-1-基)环丙基]甲醇])从clickchemistry订购。
按照一般程序1，将1-(羟甲基)环丙烷-1-羧酸(1g，8.61mmol，1当量)、DIPEA(2.3mL，13mmol，1.5当量)和HATU(3.1g，8.18mmol，0.95当量)在无水DMF(17mL，0.5M)中的溶液在0℃下搅拌0.5小时。然后加入4-溴-1H-吡唑(1.27g，8.61mmol，1当量)在DMF(17mL，0.5M)中的溶液，然后加入DIPEA(1.5mL，8.61mmol，1当量)。将混合物在0℃至RT下搅拌4小时。通过TLC监测反应的进展。将混合物用二氯甲烷(3x)和冰水提取，用盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，真空浓缩并通过使用CH2Cl2-EtOAc分级梯度溶剂系统作为洗脱液的手动柱色谱法进行纯化，得到所需产物。
按照一般程序5，将4-溴-1H-1,2,3-三唑(1.01g，6.80mmol，1当量)与DMF(20mL，0.3M)、2-溴乙醇(0.93g，7.48mmol，1.1当量)、Cs2CO3(3.32g，10.20mmol，1.5当量)和TBAI(0.50g，1.36mmol，0.2当量)反应，在柱纯化(SiO2，CH2Cl2-EtOAc分级梯度溶剂系统作为洗脱液)后得到所需产物。
根据一般程序5，将4-溴-1H-1,2,3-三唑(1.01g，6.80mmol，1当量)与DMF(20mL，0.3M)、(1-溴环丙基)甲醇(1.13g，7.48mmol，1.1当量)、Cs2CO3(3.32g，10.20mmol，1.5当量)和TBAI(0.50g，1.36mmol，0.2当量)反应，在柱纯化(SiO2，CH2Cl2-EtOAc分级梯度溶剂系统作为洗脱液)后得到呈黄色油状物的所需产物。
按照一般程序1，将1-(羟甲基)环丙烷-1-羧酸(1g，8.61mmol，1当量)、DIPEA(2.3mL，13mmol，1.5当量)和HATU(3.1g，8.18mmol，0.95当量)在无水DMF(17mL，0.5M)中的溶液在0℃下搅拌0.5小时。然后加入4-溴-1H-1,2,3-三唑(1.27g，8.61mmol，1当量)在DMF(17mL，0.5M)中的溶液，然后加入DIPEA(1.5mL，8.61mmol，1当量)。将混合物在0℃至RT下搅拌4小时。通过TLC监测反应的进展。将混合物用二氯甲烷(3x)和冰水提取，用盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，真空浓缩并通过使用CH2Cl2-EtOAc分级梯度溶剂系统作为洗脱液的手动柱色谱法进行纯化，得到所需产物。
将(4-溴-1H-吡咯-2-基)甲醇(1g，5.68mmol，1当量)、K2CO3(2g，14.2mmol，2.5当量)和MeI(0.39mL，6.3mmol，1.1当量)在THF(20mL，0.3M)中的悬浮液在60℃搅拌过夜。然后将反应物过滤并在真空中干燥，得到所需的产物。
配体合成：
炔烃衍生物购自Wuxi Apptec。炔烃与4元环和5元环的偶联使用以下描述的一般程序6进行：
一般程序6：通过Sonogashira偶联合成芳基乙炔基衍生物。
使用Rozhkov及其同事的程序，将卤代芳基衍生物(1当量)、炔烃(2当量)、双(二苯基膦基)二氯化钯(5mol％)、CuI(10mol％)和无水NEt3(8当量)溶解在2mL DMF中，并在RT下搅拌16小时(除非另有说明)。通过使用CH2Cl2-MeOH 9:1混合物作为洗脱液的TLC以及使用ARX 300Brucker光谱仪的1H NMR监测反应进展。反应完成后，将溶剂真空蒸发，并通过使用CH2Cl2-EtOAc或CH2Cl2-MeOH分级梯度溶剂系统作为洗脱液的手动柱色谱法纯化固体残留物。
(S)-2-氨基-N-(1-(8-((1-(2-羟乙基)-1H-吡唑-4-基)乙炔基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
根据一般程序6，将2-(4-溴-1H-吡唑-1-基)乙-1-醇(50mg，0.26mmol，1.2当量)在DMF(2.2mL，0.1M)中的溶液与(S)-2-氨基-N-(1-(8-乙炔基-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(0.1g，0.22mmol，1.0当量)、双(二苯基膦基)二氯化钯(8mg，0.011mmol，5mol％)、CuI(4.2mg，0.022mmol，10mol％)和NEt3(0.25mL，1.76mmol，8当量)反应，然后柱纯化(SiO2，CH2Cl2-MeOH分级梯度作为洗脱液系统)得到所需产物。
(S)-2-氨基-N-(1-(8-((1-(1-(羟甲基)环丙基)-1H-吡唑-4-基)乙炔基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
根据一般程序6，将(1-(4-溴-1H-吡唑-1-基)环丙基)甲醇(57mg，0.26mmol，1.2当量)在DMF(2.2mL，0.1M)中的溶液与(S)-2-氨基-N-(1-(8-乙炔基-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(0.1g，0.22mmol，1.0当量)、双(二苯基膦基)二氯化钯(8mg，0.011mmol，5mol％)、CuI(4.2mg，0.022mmol，10mol％)和NEt3(0.25mL，1.76mmol，8当量)反应，然后柱纯化(SiO2，CH2Cl2-MeOH分级梯度作为洗脱液系统)得到所需产物。
(S)-2-氨基-N-(1-(8-((1-(2-羟乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)乙炔基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
根据一般程序6，将2-(4-溴-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙-1-醇(50mg，0.26mmol，1.2当量)在DMF(2.2mL，0.1M)中的溶液与(S)-2-氨基-N-(1-(8-乙炔基-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(0.1g，0.22mmol，1.0当量)、双(二苯基膦基)二氯化钯(8mg，0.011mmol，5mol％)、CuI(4.2mg，0.022mmol，10mol％)和NEt3(0.25mL，1.76mmol，8当量)反应，然后柱纯化(SiO2，CH2Cl2-MeOH分级梯度作为洗脱液系统)得到所需产物。
(S)-2-氨基-N-(1-(8-((1-(1-(羟甲基)环丙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)乙炔基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
根据一般程序6，将(1-(4-溴-1H-1,2,3-三唑-1-基)环丙基)甲醇(57mg，0.26mmol，1.2当量)在DMF(2.2mL，0.1M)中的溶液与(S)-2-氨基-N-(1-(8-乙炔基-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(0.1g，0.22mmol，1.0当量)、双(二苯基膦基)二氯化钯(8mg，0.011mmol，5mol％)、CuI(4.2mg，0.022mmol，10mol％)和NEt3(0.25mL，1.76mmol，8当量)反应，然后柱纯化(SiO2，CH2Cl2-MeOH分级梯度作为洗脱液系统)得到所需产物。
(S)-2-氨基-N-(1-(8-((1-(1-(羟甲基)环丙烷-1-羰基)-1H-吡唑-4-基)乙炔基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
根据一般程序6，将(4-溴-1H-吡唑-1-基)(1-(羟甲基)-环丙基)甲酮(64mg，0.26mmol，1.2当量)在DMF(2.2mL，0.1M)中的溶液与(S)-2-氨基-N-(1-(8-乙炔基-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(0.1g，0.22mmol，1.0当量)、双(二苯基膦基)二氯化钯(8mg，0.011mmol，5mol％)、CuI(4.2mg，0.022mmol，10mol％)和NEt3(0.25mL，1.76mmol，8当量)反应，然后柱纯化(SiO2，CH2Cl2-MeOH分级梯度作为洗脱液系统)得到所需产物。
(S)-2-氨基-N-(1-(8-((1-(1-(羟甲基)环丙烷-1-羰基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)乙炔基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
根据一般程序6，将(4-溴-1H-1,2,3-三唑-1-基)(1-(羟甲基)-环丙基)甲酮(67mg，0.26mmol，1.2当量)在DMF(2.2mL，0.1M)中的溶液与(S)-2-氨基-N-(1-(8-乙炔基-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(0.1g，0.22mmol，1.0当量)、双(二苯基膦基)二氯化钯(8mg，0.011mmol，5mol％)、CuI(4.2mg，0.022mmol，10mol％)和NEt3(0.25mL，1.76mmol，8当量)反应，然后柱纯化(SiO2，CH2Cl2-MeOH分级梯度作为洗脱液系统)得到所需产物。
(S)-2-氨基-N-(1-(8-((5-(羟甲基)-1-甲基-1H-吡咯-3-基)乙炔基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
根据一般程序6，将(4-溴-1-甲基-1H-吡咯-2-基)甲醇(50mg，0.26mmol，1.2当量)在DMF(2.2mL，0.1M)中的溶液与(S)-2-氨基-N-(1-(8-乙炔基-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(0.1g，0.22mmol，1.0当量)、双(二苯基膦基)二氯化钯(8mg，0.011mmol，5mol％)、CuI(4.2mg，0.022mmol，10mol％)和NEt3(0.25mL，1.76mmol，8当量)反应，然后柱纯化(SiO2，CH2Cl2-MeOH分级梯度作为洗脱液系统)得到所需产物。
实施例2
系列2
构建块的合成：
1.异吲哚啉酮
异吲哚啉酮衍生物是按照下面的一般程序所述合成的。
一般程序8：溴化
向4-卤代/或硝基-2-取代-6-甲基苯甲酸甲酯(1当量)在CCl4(0.2M)中的溶液中加入NBS(1.1当量)和BPO(80重量％，0.1当量)。将所得混合物在回流下搅拌3小时。完成后，将反应混合物冷却至RT并过滤以除去沉淀物。将滤液真空浓缩，以获得直接用于下一步的粗产物。
一般程序9：酰胺偶联
将4-卤代/或硝基-2-取代-6-甲基苯甲酸(1当量)、(S)-1-环丙基乙-1-胺(1.2当量)、HATU(1.2当量)和二异丙基乙胺(3当量)在无水DMF(0.3M)中的混合物在0℃至RT下搅拌3小时。将反应混合物用NH4Cl饱和水溶液淬灭，用EtOAc提取，用Na2SO4干燥，真空浓缩并通过使用CH2Cl2-EtOAc分级梯度溶剂系统作为洗脱液的手动柱色谱法进行纯化，得到所需产物。
一般程序10：从酰胺环化异吲哚啉酮
将来自前一步骤的中间物(1当量)溶于THF(0.2M)中并冷却至-78℃，然后滴加仲丁基锂(1.4M于环己烷中，2.5当量)。将反应混合物在-78℃下搅拌20分钟，然后滴加DMF(5当量)。1小时后，反应用NH4Cl饱和水溶液小心淬灭，并用EtOAc提取。真空浓缩后，将粗产物溶解在DCM(0.32M)中并冷却至0℃。加入Et3SiH(1当量)和TFA(0.62M)，并在RT下搅拌反应混合物20分钟。将反应混合物真空浓缩，用NaHCO3饱和水溶液淬灭，用DCM提取，真空浓缩并通过使用CH2Cl2-EtOAc分级梯度溶剂系统作为洗脱液的手动柱色谱法进行纯化，得到所需产物。
一般程序11：从甲酯环化异吲哚啉酮
在装有回流冷凝器和N2球囊的圆底烧瓶中，将粗品2-(溴甲基)-苯甲酸酯(1当量)与(S)-1-环丙基乙-1-胺盐酸盐(2当量)、K2CO3(3当量)和B(OH)3(0.2当量)在乙腈(0.25M)中的溶液混合。将所得混合物在50℃下搅拌72小时。完成后，将反应混合物冷却至RT，真空除去3/4的溶剂。将混合物在EtOAc和H2O之间分配。分离水相并用额外的EtOAc提取。将合并的有机提取物用水和盐水洗涤。将有机相用Na2SO4干燥，真空浓缩，并通过使用CH2Cl2-EtOAc或CH2Cl2-MeOH分级梯度溶剂系统作为洗脱液的手动柱色谱法进行纯化，得到所需产物。
步骤1：4-溴-2-(溴甲基)-6-甲基苯甲酸甲酯
根据一般程序8，将4-溴-2,6-二甲基苯甲酸甲酯(2g，8.23mmol，1当量)、NBS(1.611g，9.05mmol，1.1当量)、BPO(0.2g，0.823mmol，0.1当量)和CCl4(41mL，0.2M)根据一般程序8一起反应，得到用于下一步而无需进一步纯化的标题产物。
步骤2：(S)-5-溴-2-(1-环丙基乙基)-7-甲基异吲哚啉-1-酮
根据一般程序11，将粗品4-溴-2-(溴甲基)-6-甲基苯甲酸甲酯(2.65g，8.23mmol，1当量)、(S)-1-环丙基乙-1-胺盐酸盐(1.4g，16.46mmol，2当量)、K2CO3(3.41g，24.69mmol，3当量)和B(OH)3(7μL，0.16mmol，0.2当量)在乙腈(35mL，0.25M)中的溶液一起反应，得到标题产物。
步骤3：(S)-2-(1-环丙基乙基)-7-甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)异吲哚啉-1-酮
将(S)-5-溴-2-(1-环丙基乙基)-7-甲基异吲哚啉-1-酮(1g，3.4mmol，1当量)、双(频哪醇合)二硼(1g，4.1mmol)、乙酸钾(1.2g，8.5mmol，2.5当量)和PdCl2(dppf)(0.25g，0.34mmol，0.1当量)在二噁烷(10mL，0.3M)中的净化(3x)悬浮液加热至100℃，持续3小时。冷却至RT后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤，并用15％MeOH/DCM(15mL)洗涤过滤垫。将Et2O(100mL)加入滤液中以沉淀。将固体残留物用于下一步，无需进一步纯化。
步骤1：(S)-4-溴-N-(1-环丙基乙基)-2-氟苯甲酰胺
将4-溴-2-氟苯甲酸(6g，18.4mmol，1当量)、(S)-1-环丙基乙-1-胺(2.82g，33mmol，1.2当量)、HATU(12.3g，33mol，1.2当量)和二异丙基乙胺(14.5mL，82.2mmol，3当量)在无水DMF(37mL，0.5M)中的混合物在0℃至RT下搅拌3小时。将反应混合物用NH4Cl饱和水溶液淬灭，用EtOAc提取，用Na2SO4干燥，真空浓缩并通过使用CH2Cl2-EtOAc分级梯度溶剂系统作为洗脱液的手动柱色谱法进行纯化，得到所需产物。
步骤2：(S)-5-溴-2-(1-环丙基乙基)-7-氟异吲哚啉-1-酮
将(S)-4-溴-N-(1-环丙基乙基)-2-氟苯甲酰胺(6g，20.4mmol，1当量)溶于THF(100mL，0.2M)中并冷却至-78℃，然后滴加仲丁基锂(36mL，1.4M于环己烷中，2.5当量)。将反应混合物在-78℃下搅拌20分钟，然后滴加DMF(7.5mL，102mmol，5当量)。1小时后，反应用NH4Cl饱和水溶液小心淬灭，并用EtOAc提取。真空浓缩后，将粗产物溶解在DCM(60mL，0.32M)中并冷却至0℃。加入Et3SiH(3.3mL，6.8mmol，1当量)和TFA(33mL，0.62M)，并在RT下搅拌反应混合物20分钟。将反应混合物真空浓缩，用NaHCO3饱和水溶液淬灭，用DCM提取，真空浓缩并通过使用CH2Cl2-EtOAc分级梯度溶剂系统作为洗脱液的手动柱色谱法进行纯化，得到所需产物。
步骤3：(S)-5-溴-2-(1-环丙基乙基)-7-((4-甲氧基苄基)氨基)异吲哚啉-1-酮
将(S)-5-溴-2-(1-环丙基乙基)-7-氟异吲哚啉-1-酮(3g，10mmol，1当量)与纯PMBNH2(4mL)合并，并加热至100℃，持续14小时。将反应混合物冷却并分配在10％柠檬酸水溶液和EtOAc之间。分离水层并用额外的EtOAc进行反提取。将有机层合并并用另外10％的柠檬酸水溶液、盐水洗涤，用Na2SO4干燥并真空浓缩，得到(S)-5-溴-2-(1-环丙基乙基)-7-((4-甲氧基苄基)氨基)异吲哚啉-1-酮，其在下一步骤中用作粗品。
步骤4：(S)-7-氨基-5-溴-2-(1-环丙基乙基)异吲哚啉-1-酮
将粗品(S)-5-溴-2-(1-环丙基乙基)-7-((4-甲氧基苄基)氨基)异吲哚啉-1-酮与TFA(15mL)合并，并在40℃下搅拌3小时。将反应混合物减压浓缩，并用NaHCO3饱和水溶液淬灭，并用EtOAc稀释。将合并的有机相用盐水洗涤，并用Na2SO4干燥，真空浓缩并通过使用己烷-EtOAc分级梯度溶剂系统作为洗脱液的手动柱色谱法进行纯化，得到所需产物。
步骤5：(S)-N-(6-溴-2-(1-环丙基乙基)-3-氧代异吲哚啉-4-基)-N-(甲基磺酰基)甲磺酰胺
将(S)-7-氨基-5-溴-2-(1-环丙基乙基)异吲哚啉-1-酮(1.00g，3.38mmol)溶于DCM(10mL)中，并将混合物冷却至0℃。向此溶液中加入DMAP(40mg，0.34mmol)、DIPEA(1.6mL，10.1mmol)和MsCl(0.7mL，8.5mmol)。将反应混合物升温至RT并搅拌1小时。将反应用1M HCl(水溶液)淬灭，并用EtOAc稀释。分离水层并用额外的EtOAc进行反提取。将有机层合并，用盐水洗涤，并用MgSO4干燥。在减压下浓缩，提供双磺酰化产物，将其粗取到下一步骤中。
步骤6：(S)-N-(6-溴-2-(1-环丙基乙基)-3-氧代异吲哚啉-4-基)甲磺酰胺
将来自前一步骤的粗产物溶于THF(5mL)中，并加入TBAF(1.0M于THF中，5.4mL，5.4mmol)。15分钟后加入另一部分的TBAF(1.0M于THF中，3.0mL)，然后在2小时后加入最后一部分TBAF(1.0M于THF中，3.0mL)。将反应混合物再搅拌1小时，然后用1M HCl(水溶液)淬灭并用EtOAc稀释。分离水层并用额外的EtOAc进行反提取。将有机相用Na2SO4干燥，真空浓缩，并通过使用CH2Cl2-EtOAc或CH2Cl2-MeOH分级梯度溶剂系统作为洗脱液的手动柱色谱法进行纯化，得到所需产物。
步骤7：(S)-N-(2-(1-环丙基乙基)-3-氧代-6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)异吲哚啉-4-基)甲磺酰胺
将(S)-N-(6-溴-2-(1-环丙基乙基)-3-氧代异吲哚啉-4-基)甲磺酰胺(0.5g，1.34mmol，1当量)、双(频哪醇合)二硼(0.2g，1.61mmol，1.2当量)、乙酸钾(0.48g，3.4mmol，2.5当量)和PdCl2(dppf)(0.1g，0.13mmol，0.1当量)在二噁烷(5mL，0.3M)中的净化(3x)悬浮液加热至100℃，持续5小时。冷却至RT后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤，并用THF洗涤过滤垫。将Et2O(50mL)加入滤液中以沉淀。将固体残留物用于下一步，无需进一步纯化。
步骤1：(S)-4-溴-N-(1-环丙基乙基)-2-氟苯甲酰胺
将4-溴-2-(三氟甲基)苯甲酸(20g，74.3mmol，1当量)、(S)-1-环丙基乙-1-胺(7.62g，89.2mmol，1.2当量)、HATU(33.2g，89.2mol，1.2当量)和二异丙基乙胺(43.5mL，246.6mmol，3当量)在无水DMF(100mL，0.74M)中的混合物在0℃至RT下搅拌3小时。将反应混合物用NH4Cl饱和水溶液淬灭，用EtOAc提取，用Na2SO4干燥，真空浓缩并通过使用CH2Cl2-MeOH(9:1)作为洗脱液的手动柱色谱法进行纯化，得到所需产物。
步骤2：(S)-5-溴-2-(1-环丙基乙基)-7-(三氟甲基)异吲哚啉-1-酮
将(S)-4-溴-N-(1-环丙基乙基)-2-(三氟甲基)苯甲酰胺(10g，29.7mmol，1当量)溶于THF(100mL，0.3M)中并冷却至-78℃，然后滴加仲丁基锂(14.5mL，1.4M于环己烷中，2.5当量)。将反应混合物在-78℃下搅拌20分钟，然后滴加DMF(11.5mL，148.5mmol，5当量)。1小时后，反应用NH4Cl饱和水溶液小心淬灭，并用EtOAc提取。真空浓缩后，将粗产物溶解在DCM(90mL，0.32M)中并冷却至0℃。加入Et3SiH(4.8mL，29.7mmol，1当量)和TFA(25mL，1.2M)，并在RT下搅拌反应混合物20分钟。将反应混合物真空浓缩，用NaHCO3饱和水溶液淬灭，用DCM提取，真空浓缩并通过使用CH2Cl2-EtOAc分级梯度溶剂系统作为洗脱液的手动柱色谱法进行纯化，得到所需产物。
步骤3：(S)-5-溴-2-(1-环丙基乙基)-7-((4-甲氧基苄基)氨基)异吲哚啉-1-酮
将(S)-5-溴-2-(1-环丙基乙基)-7-(三氟甲基)异吲哚啉-1-酮(4g，11.5mmol，1当量)、双(频哪醇合)二硼(1.7g，13.7mmol，1.2当量)、乙酸钾(4.1g，28.75mmol，2.5当量)和PdCl2(dppf)(0.9g，1.2mmol，0.1当量)在二噁烷(40mL，0.3M)中的净化(3x)悬浮液加热至100℃，持续5小时。冷却至RT后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤，并用THF洗涤过滤垫。将Et2O(100mL)加入滤液中以沉淀。将固体残留物用于下一步，无需进一步纯化。
步骤1：(S)-2-(1-环丙基乙基)-7-(三氟甲基)-5-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)异吲哚啉-1-酮
将(S)-5-溴-2-(1-环丙基乙基)-7-(三氟甲基)异吲哚啉-1-酮(10g，27.4mmol，1当量)、乙炔基三甲基硅烷(7.6mL，54.8mmol，2当量)、双(二苯基膦基)二氯化钯(0.6g，0.78mmol，3mol％)、CuI(0.26g，1.4mmol，5mol％)在无水NEt3(50mL，0.5M)中的混合物在氩气下回流加热16小时。将反应混合物用过滤并用EtOAc洗涤。将滤液真空蒸发，将残留物通过用CH2Cl2-EtOAc分级梯度溶剂系统的混合物作为洗脱液洗脱的硅胶柱色谱法纯化，得到所需产物。
步骤2：(S)-2-(1-环丙基乙基)-5-乙炔基-7-(三氟甲基)异吲哚啉-1-酮
将四丁基氟化铵(1.0M于四氢呋喃中，25mL，1.2当量)加入(S)-2-(1-环丙基乙基)-7-(三氟甲基)-5-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)异吲哚啉-1-酮(7.4g，20.1mmol，1当量)中。将反应物搅拌16小时，然后在真空中除去溶剂，并通过柱色谱法(SiO2，CH2Cl2/-MeOH 9:1)纯化粗残留物以提供所需产物。
步骤3：(S,E)-2-(1-环丙基乙基)-5-(2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)乙烯基)-7-(三氟甲基)异吲哚啉-1-酮
将(S)-2-(1-环丙基乙基)-5-乙炔基-7-(三氟甲基)异吲哚啉-1-酮(2g，6.82mmol，1当量)在无水甲苯(45mL，0.15M)和RuHCl(CO)(PPh3)3(0.32g，0.34mmol，5mol％)中的氩助熔(3x)溶液搅拌5分钟。然后加入4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷(1.32，10.3mmol，1.5当量)。将混合物在50℃下搅拌18小时。将粗反应物真空浓缩，然后用EtOAc和NaHCO3饱和溶液提取。将有机层真空浓缩并用Et2O沉淀。将粗产物在没有额外纯化的情况下用于下一步骤。
步骤1：2-(溴甲基)-4-硝基-6-(三氟甲基)苯甲酸甲酯
根据一般程序8，将2-甲基-4-硝基-6-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(21.7g，82.3mmol，1当量)、NBS(16.11g，90.5mmol，1.1当量)、BPO(2g，82.3mmol，0.1当量)和CCl4(410mL，0.2M)一起反应，得到用于下一步而无需进一步纯化的标题产物。
步骤2：(S)-2-(1-环丙基乙基)-5-硝基-7-(三氟甲基)异吲哚啉-1-酮
根据一般程序11，将粗品2-(溴甲基)-4-硝基-6-(三氟甲基)苯甲酸甲酯(28.2g，82.3mmol，1当量)、(S)-1-环丙基乙-1-胺盐酸盐(14g，164.6mmol，2当量)、K2CO3(34.1g，246.9mmol，3当量)和B(OH)3(70μL，1.6mmol，0.2当量)在乙腈(350mL，0.25M)中的溶液一起反应，得到标题产物。
步骤3：(S)-5-氨基-2-(1-环丙基乙基)-7-(三氟甲基)异吲哚啉-1-酮
向(S)-2-(1-环丙基乙基)-5-硝基-7-(三氟甲基)异吲哚啉-1-酮(15g，47.8mmol，1当量)在H2O-EtOH(1:1，160mL，0.3M)的混合物中的溶液中滴加NH4Cl(2.2g，38.2mmol，0.8当量)和Fe(0)(16g，287mmol，6当量)的悬浮液。将反应混合物回流2小时。冷却后，将所得悬浮液通过垫过滤，并用THF/EtOH溶液洗涤。真空蒸发后，将残留物通过用DCM/MeOH(9:1)洗脱的硅胶柱色谱法纯化，得到所需产物。
步骤4：(S)-5-叠氮基-2-(1-环丙基乙基)-7-(三氟甲基)异吲哚啉-1-酮
在0℃下向(S)-5-氨基-2-(1-环丙基乙基)-7-(三氟甲基)异吲哚啉-1-酮(10g，35.2mmol，1当量)在HCl 17％(100mL)中的溶液中滴加NaNO2(3.6g，52.8mmol，1.5当量)在水(12mL)中的溶液。将反应混合物在此温度下搅拌60分钟，然后滴加NaN3(3.4g，52.8mmol，1.5当量)在水(20mL)中的溶液。将反应混合物升温至室温并再搅拌2小时。将所得悬浮液过滤，然后干燥，得到标题产物。
异喹啉酮构建块的合成：
步骤1：(S)-(1-(8-氯-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯
在0℃至RT下，将(S)-3-(1-氨基乙基)-8-氯-2-苯基异喹啉-1(2H)-酮(10g，33.56mmol，1当量)的无水DCM溶液(70ml，0.5M)用三甲胺(11.7mL，83.9mmol，2.5当量)和(Boc)2O(5.2g，40.3mmol，1.05当量)处理16小时。将混合物用1N HCl水溶液和盐水洗涤，得到固体形式的所需产物(S)-(1-(8-氯-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯。
步骤2：(S)-(1-(1-氧代-2-苯基-8-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯
向二氯双(乙腈)钯(15mol％)、X-Phos(45mol％)、碳酸铯(3.0当量)和(S)-(1-(8-氯-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(4g，10mmol，1.0当量)在丙腈(100mL，0.1M)中的氩助熔(3x)悬浮液中加入乙炔基三甲基硅烷(5.0当量，在5mL丙腈中)。将所得黄色混合物在RT下搅拌20分钟，然后加热至75℃，持续3小时。将棕黑色混合物冷却至RT，通过硅藻土垫过滤。将液相真空浓缩，并通过使用CH2Cl2-EtOAc分级梯度溶剂系统作为洗脱液的手动柱色谱法进行纯化，得到所需产物(S)-(1-(1-氧代-2-苯基-8-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯。
步骤3：(S)-(1-(8-乙炔基-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯
将(S)-(1-(1-氧代-2-苯基-8-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(2.8g，6mmol)和NaOH 10％(14.6mL)在甲醇(61mL)中的溶液回流16小时。冷却后，将反应混合物蒸发至干。将残留物通过用CH2Cl2:MeOH(9:1)洗脱的硅胶快速色谱法纯化，得到固体形式的标题产物(S)-(1-(8-乙炔基-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯。
步骤4：一般程序6：通过Sonogashira偶联合成芳基乙炔基衍生物。
使用Rozhkov及其同事的程序，将卤代芳基衍生物(1当量)、炔烃(2当量)、双(二苯基膦基)二氯化钯(5mol％)、CuI(10mol％)和无水NEt3(8当量)溶解在2mL DMF中，并在RT下搅拌16小时(除非另有说明)。通过使用CH2Cl2-MeOH 9:1混合物作为洗脱液的TLC以及使用ARX 300Brucker光谱仪的1H NMR监测反应进展。反应完成后，将溶剂真空蒸发，并通过使用CH2Cl2-EtOAc或CH2Cl2-MeOH分级梯度溶剂系统作为洗脱液的手动柱色谱法纯化固体残留物。
步骤5：一般程序7：Boc脱保护
在0℃至RT下将Boc保护的胺在HCl(4M于二噁烷中，0.5M)中的溶液搅拌4小时(除非另有说明)。然后将混合物真空干燥，得到标题产物。
配体的合成：
六种类型的接头用于合成系列2化合物：无接头、乙基烷基接头、乙烯基烯基接头、乙炔基炔基接头、酰胺基接头、三唑基接头。
无接头：
无接头类型的配体是其中异喹啉直接结合到氨基嘧啶并吡啶部分的化合物。配体的合成如下所述。
步骤1：一般程序12：Suzuki偶联
将硼酸酯(68mg，0.173mmol，1当量)、芳基溴化物(40mg，0.190mmol，1.1当量)、PdCl2(dppf)(10mol％)、Na2CO3(5当量)在二噁烷/H2O(4:1，0.05M)中的混合物在95℃下加热15分钟。反应完成后，将反应在CH2Cl2和H2O之间分配。分离水层并用额外的CH2Cl2进行反提取。合并有机层，用Na2SO4干燥，真空蒸发，并通过使用CH2Cl2-EtOAc或CH2Cl2-MeOH分级梯度溶剂系统作为洗脱液的手动柱色谱法进行纯化。
步骤2：一般程序1：酰胺偶联
在氩气气氛下，将羧酸(1当量)和HATU(0.95当量)在无水DMF(0.05M)中的溶液在0℃下搅拌0.5小时。然后加入杂环胺(1当量)在DMF(0.1M)中的溶液。将混合物在0℃至RT下搅拌2小时(除非另有说明)。通过使用CH2Cl2-MeOH 9:1混合物作为洗脱液的TLC以及使用ARX 300Brucker光谱仪的1H NMR监测反应进展。然后用二氯甲烷(3x)和水提取混合物，用盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥，真空浓缩并通过使用CH2Cl2-EtOAc或CH2Cl2-MeOH分级梯度溶剂系统作为洗脱液的手动柱色谱法进行纯化。
步骤3：一般程序13Boc脱保护
在0℃至RT下将Boc保护的胺在HCl(4M于二噁烷中，0.05M)中的溶液搅拌4小时(除非另有说明)。然后将混合物真空干燥，得到标题产物。
2-氨基-N-((S)-1-(8-氯-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)-5-(2-((S)-1-环丙基乙基)-7-甲基-1-氧代异吲哚啉-5-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
所需产物按照一般程序12(Suzuki偶联，步骤1)、一般程序1(酰胺偶联，步骤2)和一般程序13(boc脱保护，步骤3)分3步合成
2-氨基-N-((S)-1-(8-氯-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)-5-(2-((S)-1-环丙基乙基)-7-(甲基磺酰胺基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
所需产物按照一般程序12(Suzuki偶联，步骤1)、一般程序1(酰胺偶联，步骤2)和一般程序13(boc脱保护，步骤3)分3步合成
2-氨基-N-((S)-1-(8-氯-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)-5-(2-((S)-1-环丙基乙基)-1-氧代-7-(三氟甲基)异吲哚啉-5-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
所需产物按照一般程序12(Suzuki偶联，步骤1)、一般程序1(酰胺偶联，步骤2)和一般程序13(boc脱保护，步骤3)分3步合成
2-氨基-5-(2-((S)-1-环丙基乙基)-1-氧代-7-(三氟甲基)异吲哚啉-5-基)-N-((S)-1-(8-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)乙炔基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
所需产物按照一般程序12(Suzuki偶联，步骤1)、一般程序1(酰胺偶联，步骤2)和一般程序13(boc脱保护，步骤3)分3步合成
2-氨基-5-(2-((S)-1-环丙基乙基)-1-氧代-7-(三氟甲基)异吲哚啉-5-基)-N-((S)-1-(8-((1-(2-羟乙基)-1H-吡唑-4-基)乙炔基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
所需产物按照一般程序12(Suzuki偶联，步骤1)、一般程序1(酰胺偶联，步骤2)和一般程序13(boc脱保护，步骤3)分3步合成
炔烃、烯烃、烷烃、三唑和酰胺接头：
2-氨基-N-((S)-1-(8-氯-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)-5-((2-((S)-1-环丙基乙基)-1-氧代-7-(三氟甲基)异吲哚啉-5-基)乙炔基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
所需产物按照一般程序6(Sonogashira偶联，步骤1)、一般程序1(酰胺偶联，步骤2)和一般程序13(boc脱保护，步骤3)分3步合成
2-氨基-N-((S)-1-(8-氯-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)-5-((E)-2-(2-((S)-1-环丙基乙基)-1-氧代-7-(三氟甲基)异吲哚啉-5-基)乙炔基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
所需产物按照一般程序12(Suzuki偶联，步骤1)、一般程序1(酰胺偶联，步骤2)和一般程序13(boc脱保护，步骤3)分3步合成
2-氨基-N-((S)-1-(8-氯-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)-5-(2-(2-((S)-1-环丙基乙基)-1-氧代-7-(三氟甲基)异吲哚啉-5-基)乙基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
2-氨基-N-((S)-1-(8-氯-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)-5-((E)-2-(2-((S)-1-环丙基乙基)-1-氧代-7-(三氟甲基)异吲哚啉-5-基)乙烯基)吡唑[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(1当量)在THF(0.05M)中的溶液用Pd/C(20mol％)滴定。然后将混合物通过硅藻土垫过滤。将液体层真空浓缩，并通过使用CH2Cl2-MeOH分级梯度溶剂系统作为洗脱液的手动柱色谱法进行纯化，得到所需产物。
2-氨基-N-((S)-1-(8-氯-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)-5-(1-(2-((S)-1-环丙基乙基)-1-氧代-7-(三氟甲基)异吲哚啉-5-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
步骤1：2-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸乙酯
将5-溴-2-((叔丁氧基羰基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸乙酯(1当量)、乙炔基三甲基硅烷(2当量)、双(二苯基膦基)二氯化钯(3mol％)、CuI(5mol％)在无水NEt3(0.5M)中的混合物在氩气下回流加热16小时。将反应混合物用过滤并用EtOAc洗涤。将滤液真空蒸发，将残留物通过用CH2Cl2-MeOH分级梯度溶剂系统的混合物作为洗脱液洗脱的硅胶柱色谱法纯化，得到所需产物。
步骤2：2-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-乙炔基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸乙酯
将四丁基氟化铵(1.0M于四氢呋喃中，25mL，1.2当量)加入2-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸乙酯(1当量)中。将反应物搅拌16小时，然后在真空中除去溶剂，并通过柱色谱法(SiO2，CH2Cl2/-MeOH 9:1)纯化粗残留物以提供所需产物。
步骤3：(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-(1-(2-(1-环丙基乙基)-1-氧代-7-(三氟甲基)异吲哚啉-5-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸
将(S)-5-叠氮基-2-(1-环丙基乙基)-7-(三氟甲基)异吲哚啉-1-酮(1当量)，2-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-乙炔基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸乙酯(1.2当量)和CuI(10mol％)溶解在脱气的DMSO(0.5M)中，并在氩气下在60℃搅拌16小时。反应完成后，加入水，并通过过滤去除所得悬浮液。将残留物通过使用CH2Cl2-MeOH分级梯度溶剂系统作为洗脱液的快速色谱法进行纯化，得到标题产物。
步骤4：(3-(((S)-1-(8-氯-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)氨基甲酰基)-5-(1-(2-((S)-1-环丙基乙基)-1-氧代-7-(三氟甲基)异吲哚啉-5-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-基)氨基甲酸叔丁酯
根据一般程序1，将(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-(1-(2-(1-环丙基乙基)-1-氧代-7-(三氟甲基)异吲哚啉-5-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸(1当量)、(S)-3-(1-氨基乙基)-8-氯-2-苯基异喹啉-1(2H)-酮(1当量)和HATU(0.95当量)在无水DMF(0.05M)中的溶液一起反应，得到所需产物。
步骤5：2-氨基-N-((S)-1-(8-氯-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)-5-(1-(2-((S)-1-环丙基乙基)-1-氧代-7-(三氟甲基)异吲哚啉-5-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
将(3-(((S)-1-(8-氯-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)氨基甲酰基)-5-(1-(2-((S)-1-环丙基乙基)-1-氧代-7-(三氟甲基)异吲哚啉-5-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-基)氨基甲酸叔丁酯在HCl(4M于二噁烷中，0.05M)中的溶液在0℃至RT下搅拌4小时。然后将混合物真空干燥，得到标题产物。
2-氨基-N-((S)-1-(8-氯-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)-5-(2-((S)-1-环丙基乙基)-1-氧代-7-(三氟甲基)异吲哚啉-5-甲酰胺基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
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步骤1：5-氨基-2-((叔丁氧基羰基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸乙酯
将5-溴-2-((叔丁氧基羰基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸乙酯在氨(7M于MeOH中，0.05M)中的溶液在100℃下回流16小时，得到所需产物。
步骤2：(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-(2-(1-环丙基乙基)-1-氧代-7-(三氟甲基)异吲哚啉-5-甲酰胺基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸
根据一般程序1，将(S)-2-(1-环丙基乙基)-1-氧代-7-(三氟甲基)异吲哚啉-5-羧酸(1当量)、5-氨基-2-((叔丁氧基羰基)氨基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸乙酯(1当量)和HATU(0.95当量)在无水DMF(0.05M)中的溶液一起反应，得到所需产物。
步骤3：(3-(((S)-1-(8-氯-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)氨基甲酰基)-5-(2-((S)-1-环丙基乙基)-1-氧代-7-(三氟甲基)异吲哚啉-5-甲酰胺基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-基)氨基甲酸叔丁酯
根据一般程序1，将(S)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-(2-(1-环丙基乙基)-1-氧代-7-(三氟甲基)异吲哚啉-5-甲酰胺基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸(1当量)、乙基(S)-3-(1-氨基乙基)-8-氯-2-苯基异喹啉-1(2H)-酮(1当量)和HATU(0.95当量)在无水DMF(0.05M)中的溶液一起反应，得到所需产物。
步骤5：2-氨基-N-((S)-1-(8-氯-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)-5-(2-((S)-1-环丙基乙基)-1-氧代-7-(三氟甲基)异吲哚啉-5-甲酰胺基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺
将(3-(((S)-1-(8-氯-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)氨基甲酰基)-5-(2-((S)-1-环丙基乙基)-1-氧代-7-(三氟甲基)异吲哚啉-5-甲酰胺基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-2-基)氨基甲酸叔丁酯在HCl(4M于二噁烷中，0.05M)中的溶液在0℃至RT下搅拌4小时。然后将混合物真空干燥，得到标题产物。
实施例3
系列3和4
一般程序7：酯化
在氮气气氛下，将亚油酸/或Nα-(叔丁氧基羰基)-1-甲基-D-色氨酸(1.5当量)、EDC盐酸盐(1.4当量)和DMAP(0.5当量)在无水THF(0.1M)中的溶液在0℃下搅拌0.5小时。随后，通过注射器缓慢加入芳基乙炔基吡唑(或吡咯)(1当量)在无水THF(0.1M)中的溶液。将溶液在0℃至RT下搅拌16小时(除非另有说明)。通过使用CH2Cl2-MeOH 10:1混合物作为洗脱液的TLC以及使用ARX 300Brucker光谱仪的1H NMR监测反应进展。反应完成后，用二氯甲烷(3x)提取混合物。合并有机层并分别用0.2M HCl水溶液、NaHCO3饱和水溶液和盐水洗涤。然后，将固体残留物通过使用CH2Cl2-EtOAc或CH2Cl2-MeOH分级梯度溶剂系统作为洗脱液的手动柱色谱法进行纯化。使用此程序制备化合物8、9、10和11。
一般程序13Boc脱保护
在0℃至RT下将Boc保护的胺在HCl(4M于二噁烷中，0.05M)中的溶液搅拌4小时(除非另有说明)。然后将混合物真空干燥，得到标题产物。
2-(4-((3-((S)-1-(2-氨基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)乙基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-8-基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)乙基(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酸酯
根据一般程序7从(S)-2-氨基-N-(1-(8-((1-(2-羟乙基)-1H-吡唑-4-基)乙炔基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(40mg，0.072mmol，1当量)、亚油酸(34mL，0.107mmol，1.5当量)、EDC盐酸盐(19mg，0.101mmol，1.4当量)和DMAP(5mg，0.036mmol，0.5当量)在无水DMF(2.4mL，0.03M)中的溶液获得所需产物。
(1-(4-((3-((S)-1-(2-氨基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)乙基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-8-基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)环丙基)甲基(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酸酯
根据一般程序7从(S)-2-氨基-N-(1-(8-((1-(1-(羟甲基)环丙基)-1H-吡唑-4-基)乙炔基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(42mg，0.072mmol，1当量)、亚油酸(34mL，0.107mmol，1.5当量)、EDC盐酸盐(19mg，0.101mmol，1.4当量)和DMAP(5mg，0.036mmol，0.5当量)在无水DMF(2.4mL，0.03M)中的溶液获得固体形式的所需产物。
2-(4-((3-((S)-1-(2-氨基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)乙基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-8-基)乙炔基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙基(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酸酯
根据一般程序7从(S)-2-氨基-N-(1-(8-((1-(2-羟乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)乙炔基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(41mg，0.072mmol，1当量)、亚油酸(34mL，0.107mmol，1.5当量)、EDC盐酸盐(19mg，0.101mmol，1.4当量)和DMAP(5mg，0.036mmol，0.5当量)在无水DMF(2.4mL，0.03M)中的溶液获得固体形式的所需产物。
(1-(4-((3-((S)-1-(2-氨基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)乙基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-8-基)乙炔基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)环丙基)甲基(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酸酯
根据一般程序7从(S)-2-氨基-N-(1-(8-((1-(1-(羟甲基)环丙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)乙炔基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(42mg，0.072mmol，1当量)、亚油酸(34mL，0.107mmol，1.5当量)、EDC盐酸盐(19mg，0.101mmol，1.4当量)和DMAP(5mg，0.036mmol，0.5当量)在无水DMF(2.4mL，0.03M)中的溶液获得固体形式的所需产物。
(1-(4-((3-((S)-1-(2-氨基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)乙基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-8-基)乙炔基)-1H-吡唑-1-羰基)环丙基)甲基(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酸酯
根据一般程序7从(S)-2-氨基-N-(1-(8-((1-(1-(羟甲基)环丙烷-1-羰基)-1H-吡唑-4-基)乙炔基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(44mg，0.072mmol，1当量)、亚油酸(34mL，0.107mmol，1.5当量)、EDC盐酸盐(19mg，0.101mmol，1.4当量)和DMAP(5mg，0.036mmol，0.5当量)在无水DMF(2.4mL，0.03M)中的溶液获得固体形式的所需产物。
(1-(4-((3-((S)-1-(2-氨基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)乙基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-8-基)乙炔基)-1H-1,2,3-三唑-1-羰基)环丙基)甲基(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酸酯
根据一般程序7从(S)-2-氨基-N-(1-(8-((1-(1-(羟甲基)环丙烷-1-羰基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)乙炔基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(44mg，0.072mmol，1当量)、亚油酸(34mL，0.107mmol，1.5当量)、EDC盐酸盐(19mg，0.101mmol，1.4当量)和DMAP(5mg，0.036mmol，0.5当量)在无水DMF(2.4mL，0.03M)中的溶液获得固体形式的所需产物。
(4-((3-((S)-1-(2-氨基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)乙基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-8-基)乙炔基)-1-甲基-1H-吡咯-1-基)乙基(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酸酯
根据一般程序7从(S)-2-氨基-N-(1-(8-((5-(羟甲基)-1-甲基-1H-吡咯-3-基)乙炔基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(40mg，0.072mmol，1当量)、亚油酸(34mL，0.107mmol，1.5当量)、EDC盐酸盐(19mg，0.101mmol，1.4当量)和DMAP(5mg，0.036mmol，0.5当量)在无水DMF(2.4mL，0.03M)中的溶液获得固体形式的所需产物。
2-(4-((3-((S)-1-(2-氨基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)乙基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-8-基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)乙基1-甲基-D-色氨酸酯
步骤1：根据一般程序7从(S)-2-氨基-N-(1-(8-((1-(2-羟乙基)-1H-吡唑-4-基)乙炔基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(40mg，0.072mmol，1当量)、Nα-(叔丁氧基羰基)-1-甲基-D-色氨酸(35mg，0.107mmol，1.5当量)、EDC盐酸盐(19mg，0.101mmol，1.4当量)和DMAP(5mg，0.036mmol，0.5当量)在无水DMF(2.4mL，0.03M)中的溶液获得固体形式的所需产物。
步骤2：根据一般程序13从2-(4-((3-((S)-1-(2-氨基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)乙基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-8-基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)乙基Nα-(叔丁氧基羰基)-1-甲基-D-色氨酸酯在HCl(4M于二噁烷中，0.05M)中搅拌4小时后获得固体形式的所需产物。
(1-(4-((3-((S)-1-(2-氨基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)乙基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-8-基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)环丙基)甲基1-甲基-D-色氨酸酯
步骤1：根据一般程序7将(S)-2-氨基-N-(1-(8-((1-(1-(羟甲基)环丙基)-1H-吡唑-4-基)乙炔基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(42mg，0.072mmol，1当量)与Nα-(叔丁氧基羰基)-1-甲基-D-色氨酸(35mg，0.107mmol，1.5当量)、EDC盐酸盐(19mg，0.101mmol，1.4当量)和DMAP(5mg，0.036mmol，0.5当量)在无水DMF(2.4mL，0.03M)中的溶液反应。
步骤2：根据一般程序13从(1-(4-((3-((S)-1-(2-氨基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)乙基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-8-基)乙炔基)-1H-吡唑-1-基)环丙基)甲基Nα-(叔丁氧基羰基)-1-甲基-D-色氨酸酯在HCl(4M于二噁烷中，0.05M)中搅拌4小时后获得固体形式的所需产物。
2-(4-((3-((S)-1-(2-氨基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)乙基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-8-基)乙炔基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙基1-甲基-D-色氨酸酯
步骤1：根据一般程序7将(S)-2-氨基-N-(1-(8-((1-(2-羟乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)乙炔基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(41mg，0.072mmol，1当量)与Nα-(叔丁氧基羰基)-1-甲基-D-色氨酸(35mg，0.107mmol，1.5当量)、EDC盐酸盐(19mg，0.101mmol，1.4当量)和DMAP(5mg，0.036mmol，0.5当量)在无水DMF(2.4mL，0.03M)中的溶液反应。
步骤2：根据一般程序13从2-(4-((3-((S)-1-(2-氨基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)乙基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-8-基)乙炔基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙基Nα-(叔丁氧基羰基)-1-甲基-D-色氨酸酯在HCl(4M于二噁烷中，0.05M)中搅拌4小时后获得固体形式的所需产物。
(1-(4-((3-((S)-1-(2-氨基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)乙基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-8-基)乙炔基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)环丙基)甲基1-甲基-D-色氨酸酯
步骤1：根据一般程序7将(S)-2-氨基-N-(1-(8-((1-(1-(羟甲基)环丙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)乙炔基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(42mg，0.072mmol，1当量)与Nα-(叔丁氧基羰基)-1-甲基-D-色氨酸(35mg，0.107mmol，1.5当量)、EDC盐酸盐(19mg，0.101mmol，1.4当量)和DMAP(5mg，0.036mmol，0.5当量)在无水DMF(2.4mL，0.03M)中的溶液反应。
步骤2：根据一般程序13从(1-(4-((3-((S)-1-(2-氨基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)乙基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-8-基)乙炔基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)环丙基)甲基Nα-(叔丁氧基羰基)-1-甲基-D-色氨酸酯在HCl(4M于二噁烷中，0.05M)中搅拌4小时后获得固体形式的所需产物。
(1-(4-((3-((S)-1-(2-氨基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)乙基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-8-基)乙炔基)-1H-吡唑-1-羰基)环丙基)甲基1-甲基-D-色氨酸酯
步骤1：根据一般程序7将(S)-2-氨基-N-(1-(8-((1-(1-(羟甲基)环丙烷-1-羰基)-1H-吡唑-4-基)乙炔基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(44mg，0.072mmol，1当量)与Nα-(叔丁氧基羰基)-1-甲基-D-色氨酸(35mg，0.107mmol，1.5当量)、EDC盐酸盐(19mg，0.101mmol，1.4当量)和DMAP(5mg，0.036mmol，0.5当量)在无水DMF(2.4mL，0.03M)中的溶液反应。
步骤2：根据一般程序13从(1-(4-((3-((S)-1-(2-氨基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)乙基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-8-基)乙炔基)-1H-吡唑-1-羰基)环丙基)甲基Nα-(叔丁氧基羰基)-1-甲基-D-色氨酸酯在HCl(4M于二噁烷中，0.05M)中搅拌4小时后获得固体形式的所需产物。
(1-(4-((3-((S)-1-(2-氨基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)乙基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-8-基)乙炔基)-1H-1,2,3-三唑-1-羰基)环丙基)甲基1-甲基-D-色氨酸酯
步骤1：根据一般程序7将(S)-2-氨基-N-(1-(8-((1-(1-(羟甲基)环丙烷-1-羰基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)乙炔基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(44mg，0.072mmol，1当量)与Nα-(叔丁氧基羰基)-1-甲基-D-色氨酸(35mg，0.107mmol，1.5当量)、EDC盐酸盐(19mg，0.101mmol，1.4当量)和DMAP(5mg，0.036mmol，0.5当量)在无水DMF(2.4mL，0.03M)中的溶液反应。
步骤2：根据一般程序13从(1-(4-((3-((S)-1-(2-氨基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)乙基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-8-基)乙炔基)-1H-1,2,3-三唑-1-羰基)环丙基)甲基Nα-(叔丁氧基羰基)-1-甲基-D-色氨酸酯在HCl(4M于二噁烷中，0.05M)中搅拌4小时后获得固体形式的所需产物。
(4-((3-((S)-1-(2-氨基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)乙基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-8-基)乙炔基)-1-甲基-1H-吡咯-2-基)甲基1-甲基-D-色氨酸酯
步骤1：根据一般程序7将(S)-2-氨基-N-(1-(8-((5-(羟甲基)-1-甲基-1H-吡咯-3-基)乙炔基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-3-基)乙基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺(40mg，0.072mmol，1当量)与Nα-(叔丁氧基羰基)-1-甲基-D-色氨酸(35mg，0.107mmol，1.5当量)、EDC盐酸盐(19mg，0.101mmol，1.4当量)和DMAP(5mg，0.036mmol，0.5当量)在无水DMF(2.4mL，0.03M)中的溶液反应。
步骤2：根据一般程序13从(4-((3-((S)-1-(2-氨基吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酰胺基)乙基)-1-氧代-2-苯基-1,2-二氢异喹啉-8-基)乙炔基)-1-甲基-1H-吡咯-2-基)甲基Nα-(叔丁氧基羰基)-1-甲基-D-色氨酸酯在HCl(4M于二噁烷中，0.05M)中搅拌4小时后获得固体形式的所需产物。
实施例4
PI3Kγ抑制剂联合αPD-1治疗癌症的纳米药物
材料和方法
小鼠和细胞系。雌性小鼠，包括BALB/c小鼠和FVB/NJ小鼠购自Jackson实验室(BarHarbor,ME,USA)。转基因MMTV多瘤中间T癌蛋白(PyMT)小鼠通过将FVB/NJ雌性(库存号001800)与半合子FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J雄性(库存号002374)杂交来产生。所有动物实验均按照密歇根大学使用和护理动物委员会的指导原则(批准参考号为PRO00009633)进行。
RAW 264.7(TIB-71TM)和4T1细胞系(CRL-2539TM)购自美国模式培养物保藏所(Rockville,DS,USA)。将所有细胞类型在37℃和5％CO2下维持在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，Gibco,NY,USA)中。
Nano-PI的制备与表征。将PTX(12mg)和IPI-549(8mg)溶于1mL氯仿中，然后滴加到溶于20mL milli-Q水中的100mg小鼠血清白蛋白中，使用转子定子均质器生成乳状乳液。Nano-PI纳米悬浮液是在4℃的高压均质器(Nano DeBEE)上以30000psi运行5-6个循环后获得的。在25℃下使用旋转蒸发器除去有机溶剂。过滤(0.22μm)后，将Nano-PI悬浮液冻干并储存在-20℃下。按照相同的程序制备Nano-P，但PTX与小鼠白蛋白的比率为1:5。通过动态光散射(DLS)和JEOL2010F透射电子显微镜(TEM)测量大小分布和形态。通过LC-MS/MS检测Nano-PI中的药物浓度。包封效率(EE)、载药量(DL)和药物回收率(Y)通过以下公式计算。
其中Wd表示Nano-PI悬浮液中的药物量；Wf表示游离药物的量；Wn表示Nano-PI悬浮液的量；Wt表示加工后Nano-PI悬浮液中药物的总量；Wa表示添加的总药物。通过Nanosep离心装置(MWCO 3KDa)以10,000rpm/min的离心速度将游离药物从Nano-PI制剂中分离10分钟。
巨噬细胞极化。从BALB/c小鼠(雌性，7周龄)的股骨和胫骨中分离BMDM。简而言之，在对小鼠实施安乐死后，收集后腿的股骨和胫骨，并用预冷的RIPA 1640轻轻冲洗骨髓细胞。离心后，将细胞重悬于含有2mM L-谷氨酰胺、10％ FBS、10ng/mL巨噬细胞集落刺激因子(M-SF)(PeproTech Inc.)、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的完全DMEM中，并以5×106个细胞/培养皿的密度接种到无菌塑料培养皿(10mL)中。在第3天和第7天更换培养基，收获BMDM细胞并用于进一步实验。分别用LPS(100ng/mL)、IFNγ(50ng/mL)、IL-4(20ng/mL)和IL-13(10ng/mL)刺激BMDM和RAW 264.7细胞，生成M1/M2巨噬细胞。使用倒置荧光显微镜(Olympus)观察巨噬细胞形态。此外，收集各孔中的细胞和上清液培养基，采用蛋白质印迹分别测定CD80、INOS和CD206的表达，并通过ELISA检测细胞因子，包括TNF-α、TGF-β、IL-12和IL-10的分泌。
3D多细胞肿瘤球体(MTC)。将4T1细胞和来源于RAW264.7细胞的M2巨噬细胞以7:3的比率混合，然后以5,000个细胞/孔的密度接种到超低附着96孔板(Corning)中，培养30小时以形成肿瘤球体。将这些肿瘤球体分别与补充有PTX(5μM)、吉西他滨(5μM)、多柔比星(5μM)和IPI-549(5μM)以及IPI-549和PTX(2.5μM+2.5μM)、IPI-549和吉西他滨(2.5μM+2.5μM)以及IPI-549和多柔比星(2.5μM+2.5μM)的组合的300μL完全培养基孵育14天。每隔一天使用具有cellSens Dimension软件(Olympus)的Olympus IX83电动倒置显微镜监测MTC的体积([长轴]×[短轴]2/2)，并使用CellInsight CX5高含量筛选(HCS)平台(Thermo Fisher)以4倍放大率捕获图像。
Nano-PI递送的PTX和IPI-549在MMTV-PyMT小鼠中的药代动力学和组织分布。将每只具有10-16个自发性肿瘤的PyMT小鼠(雌性，14-15周龄)随机分为三组(n＝12)，并施用以下制剂：PTX/IPI-54(IV)、Nano-P(IV)加IPI-549(PO)、Nano-P(IV)加IPI-549(IP)或Nano-PI(IV)，PTX和IPI-549剂量分别为5mg/kg和2.5mg/kg。将PTX和/或IPI-549溶解在10％二甲基亚砜(DMSO)的聚乙烯(PEG)400中，并与50％无菌盐水(0.9％，重量/体积)混合，并将Nano-P和Nano-PI悬浮在无菌盐水中。在施用后0.5、4、7和24小时收集血液，离心(13,300rpm，10分钟)后分离血浆。随后，对小鼠实施安乐死，并收集包括肝脏、脾脏、肺、淋巴结、脂肪垫和肿瘤的主要器官、对其进行称重和匀浆。为了准确检测药物分布，我们从每只小鼠的不同位置随机解剖了10个肿瘤和8个脂肪垫。随后，使用带有电喷雾电离源的ABI-5500Qtrap(Sciex)质谱仪，通过LC-MS检测组织匀浆和血浆中PTX和IPI-549的含量，所述质谱仪与带有Xbridge C18柱(50×2.1mm ID，3.5μm)的岛津HPLC系统连接。结果表示为按g/ml组织标准化的PTX或IPI-549量。
MMTV-PyMT转基因小鼠中的抗癌功效。将具有自发性肿瘤的PyMT小鼠(9-10周龄)随机分为6组(n＝17)，每组的总肿瘤大小在80-110mm3范围内。然后用媒介物、Nano-P、Nano-P加α-PD1、IPI-549加α-PD1、Nano-P加IPI-549和α-PD1、Nano-PI和Nano-PI加α-PD1处理小鼠。将IPI-549溶于10％ DMSO的40％ PEG 400中，与50％无菌盐水混合，每天以15mg/kg口服施用或以5mg/kg每三天腹膜内注射。悬浮在无菌盐水中的Nano-P和Nano-PI分别以10mg/kg和5mg/kg的PTX和IPI-549剂量静脉内施用。α-PD1(100μg/小鼠)在出生后第66、69和72天施用(IP)。为了评估Nano-PI介导的肿瘤治疗的高级特性，将平均肿瘤大小为150mm3的PyMT小鼠(11-12周龄)随机分为3组(n＝17)，然后分别静脉内施用媒介物、PTX/IPI-549(溶解在10％ DMSO+40％ PEG 400+50％无菌盐水中)和Nano-PI，PTX和IPI-549剂量为5mg/kg和2.5mg/kg。每三天测量并记录一次体重、肿瘤数量和肿瘤体积。最后一次施用后3天(正常剂量批次)/4天(半剂量批次)，对每组中的3只小鼠实施安乐死，并且收集肿瘤和淋巴结进行流式细胞术分析。在第85天(正常剂量批次)和第111天(半剂量批次)，对每组中的另外4只小鼠实施安乐死，并且收集、清洗肺部并固定在Bosin固定剂(Sigma)中。反复冲洗后，对有转移性肿瘤结节的肺器官进行拍照。然后将切除的肺器官固定、切片并用H&E染色，然后使用倒置荧光显微镜成像以研究对肿瘤肺转移的进一步抑制。
4T1原位乳腺癌小鼠中的抗肿瘤功效。在雌性BALB/c小鼠中建立原位乳腺癌模型。简而言之，将4T1细胞和来源于RAW264.7细胞的M2巨噬细胞(活力>96％)混合(3:1，大鼠)，并注射到小鼠的乳腺脂肪垫中(5×107个细胞/mL)。当肿瘤大小达到约120mm3时，将小鼠随机分为7组(n＝11)并接受不同的治疗。施用作为单一治疗或与以下方案组合进行，每种药物三次。将IPI-549溶于10％ DMSO的40％ PEG 400中，与50％无菌盐水混合，以5mg/kg每天口服施用或腹膜内注射。将Nano-P和Nano-PI溶解在无菌盐水中，并以10mg/kg和5mg/kg的PTX和IPI-549剂量静脉内施用。在肿瘤接种后第5、8和11天施用(IP)抗PD1抗体(α-PD1)(100μg/小鼠)。每三天测量并记录一次体重和肿瘤体积([长轴]×[短轴]2/2)。最后一次施用后3天，对每组中的3只小鼠实施安乐死，并且收集肿瘤和淋巴结进行流式细胞术。最后一次施用后13天，处死所有小鼠，并且解剖肿瘤，称重，拍照，并在-80℃下储存。使用以下公式计算肿瘤抑制率(TIR)：(1-Wa/Wv)×100％，其中Wa和Wv分别表示施用组和媒介物组的平均肿瘤重量。对于组织学测试，收获肺组织，固定在4％多聚甲醛(PFA，重量/体积)中，并制备石蜡包埋切片(5μm)。苏木精和伊红(H&E)染色后，通过倒置荧光显微镜分析乳腺癌肺转移。
肿瘤和淋巴结中免疫细胞的荧光激活细胞分选(FACS)。对具有10个以上肿瘤的PyMT小鼠(15周龄)实施安乐死，并按照上述方法解剖肿瘤以制备单细胞悬浮液。然后洗涤、计数细胞，并在室温下在黑暗中与SYTOX Green(30nM)孵育30分钟。然后，使用配备有488nm激发和530/30带通的激光器的Sony MA900分选机分选和收集活细胞(阴性)。
肿瘤缓解的PyMT转基因小鼠中的肿瘤再攻击研究。使用FACS从分离自PyMT小鼠肿瘤的单细胞悬浮液中分选活细胞。然后，在最后一次施用Nano-PI联合α-PD1后132天(出生后210天)，将100μL单细胞悬浮液(5×106个细胞/mL)植入FVB/NJ雌性小鼠和PyMT小鼠的乳腺脂肪垫中。8天后，前3次每4天测量并记录一次肿瘤体积，然后在随后几天每3天改变一次。最后，对小鼠实施安乐死，并且收集淋巴结、脾脏、肺、BM和血液，采用上述方法制备单细胞悬浮液。通过流式细胞仪分析检测PyMT小鼠和FVB/NJ小鼠的淋巴结、脾脏、肺、BM和血液中的记忆T细胞和B细胞。
流式细胞仪分析。将从PyMT小鼠、FVB/NJ小鼠和BALB/c小鼠的脂肪垫、淋巴结、肿瘤、脾脏、肺、血液和骨髓获得的单细胞悬浮液与FcR阻断试剂(BD Biosciences)在4℃下孵育15分钟，然后在冰上用包括以下的具有适当稀释度的荧光标记抗体染色30分钟：抗CD44-Alexa647、抗F4/80-Pacifice Blue、抗CD31-Spark YGTM570、抗CD45-Spark blue550、抗CD45-Pacific blue、抗F4/80-PE、抗CD169-PE、抗CD3-Alexa/>488、抗CD3-Spark blue 550、抗CD19-PE、抗CD103-Pacific blue、抗CD103-Alexa/>-647、抗CD19-Alexa/>488、抗CD335-PE/DazzleTM594、抗CD103-Alexa/>488、抗CD11C-Pacificblue、抗CD80-Alexa/>-647、抗CD80-Spark blue 550、抗F4/80-Alexa/>-647、抗CD11b-Alexa/>594、抗CD169-Alexa/>-647、抗CD206-Alexa/>488、抗CD80-Alexa/>488、抗CD206-Alexa/>-647、抗CD86-PE/DazzleTM、抗CD3-Alexa/>488、抗CD19-PE、抗CD197-Alexa/>-647、抗CD44-Pacifice Blue、抗CD80-Alexa-594、抗CD103-Alexa/>-594、抗CD73-Pacific Blue、抗PD-L2-APC-633、抗CD3-Spark YGTM570、抗CD19-Brilliant violet 421TM、抗CD8-Alexa/>-594、抗CD4-Alexa/>-532和抗CD3-Alexa/>-594。所有抗体均购自/>eBioscienceTM和R&D Systems。对于细胞内染色，将细胞固定，用透化染色缓冲液(eBioscience)透化，然后与抗FoxP3-Alexa/>-647一起孵育。使用BD FACSDiva软件(BD Biosciences)在配备有四个激光器(405nm、488nm、561nm和640nm)和21个荧光检测器的Bio-Rad ZE5流式细胞仪上采集染色细胞。所有数据分析均使用流式细胞仪分析程序FCSExpress 7(De Novo软件)进行。基于正向和侧向散射以及可固定活力染料排除死细胞和双联体。
共聚焦显微镜。从PyMT小鼠(14周龄)中解剖肿瘤和淋巴结，并制备冷冻切片(10μm厚)用于M2巨噬细胞染色。随后，将切片固定并在室温下与5％ FBS预孵育30分钟，在4℃下与抗F4/80-Alexa-647和抗CD206-FITC一起孵育12小时，固定在含DAPI的ProLongTM金刚石抗淬灭封片剂(Molecular ProbesTM，P36971)中，并使用配备有405nm、488nm、561nm和640nm激光器的Nikon A1Si共聚焦显微镜成像。按照类似的药物分配方法制备包封Oregon Green488标记的PTX和IPI-549的Nano-PI。PyMT小鼠(13周龄)分别以50mg/kg和25mg/kg的Oregon Green 488标记的PTX和IPI-549剂量静脉内施用Nano-PI。施用后5小时，解剖肿瘤和淋巴结以获得冷冻切片，并在4℃下与以下抗体一起孵育12小时：抗F4/80-Alexa/>-647、CD206-Alexa/>-488、抗CD80-Alexa/>-594、抗CD31-SparkYGTM570、抗CD3-Spark YGTM570、抗CD19-Brilliant Violet 421TM和抗CD45R/B220-Brilliant Violet 421TM。将肿瘤和淋巴结切片分别固定在含DAPI的ProLongTM金刚石抗淬灭封片剂(Molecular ProbesTM)和ProLongTM金刚石抗淬灭封片剂(Molecular ProbesTM，P36961)中。使用Nikon A1Si共聚焦显微镜分析Nano-PI介导的药物分布。
肿瘤组织和淋巴结中所有免疫细胞的CyTOF分析。使用CyTOF分析检测肿瘤和淋巴结的免疫谱。制备用不同制剂处理的PyMT小鼠的肿瘤和淋巴结的单细胞悬浮液(300万个细胞)，然后固定并染色用于CyTOF分析，如前所述，使用设计用于鉴定肿瘤和淋巴结内细胞亚群的变化的40种金属缀合抗体的优化混合物。CyTOF抗体缀合和数据采集如前所述。简而言之，使用Maxpar抗体标记试剂盒(Fluidigm)将抗体缀合到镧系金属(Fluidigm)。如上所述制备由PyMT小鼠肿瘤和淋巴结样品制备的单细胞悬浮液。用无重金属PBS洗涤未刺激的细胞悬浮液一次，并在室温下用1.25μM Cel1-ID Cisplatin-195Pt(Fluidigm)染色5分钟。用TruStain FcX(抗小鼠CD16/32，Biolegend)阻断Fc受体，并在含有0.1％BSA、2mM EDTA和0.05％叠氮化钠的无重金属PBS中在冰上进行表面染色60分钟。然后用1.6％多聚甲醛在室温下固定细胞20分钟，然后用Invitrogen透化缓冲液(Thermo Fisher Scientific)在室温下透化30分钟，然后在室温下在透化缓冲液中进行细胞内抗体染色60分钟。将细胞在62.5nM Cel1-ID插层铱-191/193(Fluidigm)的1.6％多聚甲醛的PBS中在4℃下过夜，直到准备在CyTOF Helios系统(Fluidigm)上采集。基于校准磁珠信号的信号校正算法用于校正检测器灵敏度的任何时间变化。在CyTOF Helios系统(Fluidigm)上采集数据，并通过使用FlowJo/FCS Express软件门控来分析细胞群体。通过使用FlowJo/FCS Express软件门控来分析细胞群体。使用SPADE/tSNE进行全局分析，基于免疫细胞不同亚群中标记基因的表达进行无监督聚类分析。
CyTOF门控方案显示免疫细胞群体。对患有自发性转移性乳腺癌的PyMT转基因小鼠实施安乐死，并在图16D至图16F中的最后一轮治疗后3天分离肿瘤和淋巴结。从细胞群体中选出单细胞悬浮液，并排除死细胞。选择CD45+CD3+T细胞，并将亚型T细胞(CD4和CD8)从CD3 T细胞中剔除。将TEM(CD62L-CD44+)和TCM(CD62L+CD44+)从CD4+5CD3+CD4+T细胞或CD45+CD3+CD4+T细胞中剔除。从总CD3 T细胞中选出免疫抑制性IIM-3T细胞(CD3+TIM-3+)。NK细胞(CD3-CD49b+)是与T细胞不同的群体，并且CD3+CD49b+细胞群体被门控为NKT细胞。从总免疫细胞中选出B细胞(CD45+CD19+CD45R-B220+)。此外，选择巨噬细胞(CD11b-Ly-6G+F4/80+)，然后将其分为M1表型(CD80+CD206-)和M2表型(CD80-CD206+)巨噬细胞。激活的DC(CD103+CD11b-)选自总DC(CD11C+IA-IE+)。对所有免疫细胞群体进行分析和定量。相关组列于表1中。
表1.用于CyTOF分析的重金属标记抗体组。
统计学分析。除非另有特别说明，否则所有实验均一式三份进行，并且所有结果均表示为平均值±SD。使用Student非配对t检验进行统计分析，用于两组之间的比较，并使用单因素方差分析(ANOVA)与Bonferroni检验(SPSS软件，12.0版，SPSS Inc.)进行多重比较。所有统计学分析均使用GraphPad Prism 8和OriginPro 8软件计算，并且统计学显著性为P<0.05。
药物释放测试。将溶解在DMSO(400μL，PTX 6.6mg/mL，IPI 3.7mg/mL)中的Nano-PI和游离药物密封在透析袋(MWCO，3.5kDa)中，并在37℃下振荡浸入20mL血浆中。在预定的时间间隔下，取出600μL样品并用等体积的新鲜释放培养基替换。通过LC-MS/MS测定样品中PTX和IPI-549的浓度。据此计算PTX和IPI-549的累积释放量。
质谱(MS)成像。在PyMT小鼠(雌性，10-11周龄)中以PTX 100mg/kg和IPI-54950mg/kg的剂量静脉内施用Nano-PI。4小时后，对小鼠实施安乐死，并解剖肿瘤和淋巴结，以制备用于MS成像的冷冻切片。使用低温恒温器(Leica CM 1950)制备10μm厚的切片，并将其固定在氧化铟锡(ITO)涂覆的载玻片(Fisher Scientific)上，然后在干燥器中干燥约30分钟。然后使用HTX TM喷雾器(HTX Technologies，LLC)用基质(在90:10(体积/体积)乙腈/水+0.1％LC-MS级三氟乙酸(TFA)中的10mg/mL 2′,5′-二羟基苯乙酮)喷雾切片，并干燥15分钟。通过与Orbitrap IDX(Thermo Fisher)质谱仪偶联的MALDI源(MassTech Inc，Columbia，MD)对应用基质的组织切片进行分析。使数据可视化，并且图像由Bruker SCiLSLab软件生成。
Nano-PI在肿瘤和淋巴结中的细胞药物分布。将具有6-10个自发性肿瘤的PyMT小鼠(雌性，13周龄)随机分为两组(n＝4)，并分别以100mg/kg(PTX-OG488，10mg/kg)和30mg/kg的PTX和IPI-549剂量静脉内施用游离药物组合PTX/IPI-549或Nano-PI。将PTX和IPI-549溶解在10％二甲基亚砜(DMSO)的聚乙烯(PEG)400中，并与50％无菌盐水(0.9％，重量/体积)混合，并将Nano-PI悬浮在无菌盐水中。解剖肿瘤和淋巴结组织，并制备单细胞悬浮液或厚10μm的冷冻切片。将来自不同小鼠的单细胞悬浮液与具有适当稀释度的荧光标记抗体一起孵育，包括抗F4/80-Pacifice Blue、抗CD44-Alexa647和抗CD169-Alexa-647。使用BD FACSDiva软件(BD Biosciences)在配备有四个激光器(405nm、488nm、561nm和640nm)和21个荧光检测器的Bio-Rad ZE5流式细胞仪上采集染色细胞。所有数据分析均使用流式细胞仪分析程序FCS Express 7(De Novo软件)进行。基于正向和侧向散射以及可固定活力染料排除死细胞和双联体。并且将来自不同小鼠的切片固定，并在室温下与5％ FBS预孵育30分钟，然后与抗F4/80-Alexa/>-647和抗CD31-Spark YGTM570在4℃下进一步孵育12小时。然后将切片固定在含DAPI的ProLongTM金刚石抗淬灭封片剂(Molecular ProbesTM，P36971)中，并使用配备有405nm、488nm、561nm和640nm激光器的Nikon A1si共聚焦成像。
流式细胞术以分析肿瘤和淋巴结中的免疫细胞浸润。当总肿瘤大小在80-110mm3范围内时，将MMTV-PyMT转基因小鼠(9-10周龄)随机分为3组(n＝4)。在出生后第66天，然后小鼠用媒介物、Nano-P加IPI549(IP)和α-PD1、Nano-PI加α-PD1每3天，共5次，PTX和IPI-549剂量分别为10mg/kg和5mg/kg处理。将IPI-549溶于10％DMSO的40％ PEG 400中，与50％无菌盐水混合，并以5mg/kg腹腔注射。悬浮在无菌盐水中的Nano-P和Nano-PI分别以10mg/kg和5mg/kg的PTX和IPI-549剂量静脉内施用。α-PD1(100μg/小鼠)在出生后第66、69和72天施用(IP)。最后一次施用后3天，对每组中的3只小鼠实施安乐死，收集肿瘤和淋巴结进行流式细胞术分析。将来自肿瘤和淋巴结的单细胞悬浮液与抗CD45-Spark blue 550、抗CD45-Pacific blue、抗F4/80-Alexa-647、抗F4/80-PE、抗CD169-PE、抗CD3-Alexa/>488、抗CD3-Spark blue 550、抗CD19-PE、抗CD103-Pacific blue、抗CD103-Alexa/>-647、抗CD19-Alexa/>488、抗CD335-PE/DazzleTM594在冰上孵育30分钟。使用BDFACSDiva软件(BD Biosciences)在配备有四个激光器(405nm、488nm、561nm和640nm)和21个荧光检测器的Bio-Rad ZE5流式细胞仪上采集染色细胞。对于每个样品，将200万个细胞导入流式细胞仪。所有数据分析均使用流式细胞仪分析程序FCS Express 7(De Novo软件)进行。基于正向和侧向散射以及可固定活力染料排除死细胞和双联体。
对治疗后的肿瘤和淋巴结进行免疫荧光染色，以鉴定巨噬细胞表型变化。当总肿瘤大小在80-110mm3范围内时，将具有转基因自发性肿瘤的MMTV-PyMT转基因小鼠(9-10周龄)随机分为7组(n＝4)。在出生后第66天，然后小鼠用媒介物、Nano-P、Nano-P加α-PD1、IPI-549(15mg/kg，PO)加α-PD1、Nano-P加IPI-549(IP)和α-PD1、Nano-PI、Nano-PI加α-PD1每3天，共5次处理。将IPI-549溶于10％DMSO的40％ PEG 400中，与50％无菌盐水混合，并以5mg/kg腹腔注射。悬浮在无菌盐水中的Nano-P和Nano-PI分别以10mg/kg和5mg/kg的PTX和IPI-549剂量静脉内施用。α-PD1(100μg/小鼠)在出生后第66、69和72天施用(IP)。最后一次施用后3天，对每组中的3只小鼠实施安乐死，并且收集肿瘤和淋巴结，固定并在室温下与5％FBS预孵育30分钟，然后在4℃下与抗F4/80-Alexa-647、CD206-Alexa/>-488和抗CD80-Alexa/>-594进一步孵育12小时。然后将切片固定在含DAPI的ProLongTM金刚石抗淬灭封片剂(Molecular ProbesTM，P36971)中，并使用配备有405nm、488nm、561nm和640nm激光器的Nikon A1si共聚焦成像。
为了验证用于雾化治疗的化合物和制剂的稳定性，将化合物或其制剂(例如，纳米制剂冻干粉末)用盐水重悬以制得用于测试的溶液。将溶液分别在4℃、20℃和37℃下孵育0、2、5、10、15和20分钟。在不同的温度和时间点取出每个样品的一小滴，并以体积比1:4与含有5-(2-氨丙基)吲哚(5-IT，20nM)的10％水的甲醇/乙腈混合物(1:1，体积/体积)混合。将对化合物或任何分解产物的浓度进行分析检测(例如，使用LC-MS)。
为了验证用于静脉注射的化合物和制剂的稳定性，将化合物或其制剂(例如，纳米颗粒或脂质体组合物)与血浆(例如，来自小鼠、大鼠、仓鼠和人)在37℃下分别孵育0、5、10、30、60分钟和2小时。在指定的时间点后，在对任何分解产物的化合物进行分析之前，将样品过滤、干燥和复溶。
患有自发性转移性乳腺癌的PyMT转基因小鼠的肿瘤和淋巴结显示M2巨噬细胞浸润增加。
我们监测了患有自发性乳腺癌和肺转移的MMTV-PyMT转基因小鼠(FVB/NJ)的肿瘤和淋巴结中的总巨噬细胞群体、M1和M2巨噬细胞频率。与正常脂肪垫(6.2±1.0％)相比，乳腺肿瘤病变中观察到巨噬细胞浸润(25.1±0.5％)，而肿瘤中的M2表型(82.0±5.3％)是对照小鼠的脂肪垫(27.3±2.8％)的3倍(图1A)。此外，荷瘤小鼠淋巴结中的M2巨噬细胞是幼稚小鼠的3.9倍(83.2±2.5％相对于21.5±1.6％，P＝0.001)，但荷瘤小鼠和正常小鼠淋巴结中的巨噬细胞总数相似(图1B)。这些结果通过免疫荧光染色得到验证，其显示肿瘤和淋巴结中M2巨噬细胞的量更高(图1C至图1D)。在PyMT自发性转移性乳腺癌模型中，肿瘤和淋巴结中M2巨噬细胞的增加与乳腺癌患者的临床观察结果一致。因此，我们的观察结果表明，肿瘤和淋巴结中M2巨噬细胞的调节可能会导致转移性乳腺癌的更好治疗结果。
IPI-549与PTX组合增强M2向M1巨噬细胞复极和抑制肿瘤球体生长。
由于先前的研究报道化疗可以增加M2巨噬细胞的募集或诱导M2向M1巨噬细胞极化，因此对IPI-549和化疗药物的最佳组合进行了筛选，所述组合可以有效地将M2巨噬细胞复极化为M1表型(图8)。骨髓源性巨噬细胞(BMDM)用IL-4和IL-13预处理，使其极化为M2巨噬细胞，然后用各种药物组合处理。如图1E至图1H所示，与单独IPI-549或PTX相比，IPI-549与PTX组合增强了M2向M1巨噬细胞极化，如M1标志物(TNF-α和IL-12)的增加和M2标志物(IL-10和TGFβ)的减少所描述。然而，IPI-549与其他化疗药物(多柔比星和吉西他滨)组合没有显示出这种效果。
我们还通过将乳腺癌4T1细胞与来源于RAW264.7细胞的M2巨噬细胞以7:3的比率共培养来建立三维(3D)多细胞肿瘤球体(MCT)，以进一步研究在M2巨噬细胞存在下IPI-549和PTX对癌细胞生长的协同作用(图1I)。IPI-549和PTX的组合完全抑制了3D MCT生长(图1J至图1K)，而与单一药物治疗相比，IPI-549与多柔比星和吉西他滨的组合没有显示出任何明显的改善。此外，单独单一药物，诸如IPI-549、PTX、多柔比星或吉西他滨，显示出对3DMCT生长的有限抑制(图1J至图1K)。此外，与不同浓度下单独的单一药物治疗相比，PTX和IPI-549在4T1癌细胞和M2巨噬细胞的共培养物中显示出抑制MCT生长的协同作用，如0.7的组合指数(CI)所示(图9C至图9G)。然而，与单一药物治疗相比，IPI-549与不同的化疗药物(诸如PTX、多柔比星和吉西他滨)的组合在抑制3D肿瘤球体(由单独4T1细胞在没有巨噬细胞的情况下建立)方面没有显示出改善(图9A至图9B)。这些数据表明，IPI549和PTX的协同抗肿瘤作用是巨噬细胞依赖性的。
IPI549和PTX的纳米制剂(Nano-PI)增强了IPI-549和PTX在位于肿瘤和淋巴结中的巨噬细胞中的累积。
为了使免疫抑制性巨噬细胞复极，应将小分子递送到淋巴结和肿瘤中的巨噬细胞。游离IPI-549和PTX在肿瘤和淋巴结中的累积有限，因此在这些组织中具有低巨噬细胞分布。以前，我们已经证明PTX的白蛋白纳米颗粒(Abraxane，Nano-P)可以特异性地累积在TAM中。因此，我们设计了与IPI-549和PTX共包封的白蛋白纳米颗粒(Nano-PI)。我们假设，由于PTX和白蛋白之间存在高结合亲和力，两种药物之间的分子相互作用可能有助于将它们包封在一起，而单独的IPI-549不能包封在白蛋白纳米颗粒中。Nano-PI的表征显示直径为143.5±2.0nm，多分散指数(PDI)为0.125±0.0158，并且具有球形形态(图2A至图2B)。Nano-PI悬浮液的载药量为8.1±0.04％(PTX)和4.3±0.04％(IPI-549)；而Nano-PI的包封效率为88.0±2.8％(PTX)和83.8±5.4％(IPI-549)。加工后的药物回收率为90.7±4.7％(PTX)和73.3±11.9％(IPI-549)。Nano-PI的最终药物比率为2:1(紫杉醇:IPI-549重量/重量)，其对巨噬细胞复极和肿瘤生长抑制具有联合作用(图9至图10)。Nano-PI在稀释至PTX浓度分别为2×10-4mg/ml(在PBS中)和4×10-4mg/ml(在含有10％胎牛血清(FBS)的PBS中)是稳定的(图2C至图2D和图11A)。在37℃下，Nano-PI在血浆中的体外药物释放曲线显示，与游离药物相比，PTX和IPI-549的释放更慢(图11B至图11C)。此外，Nano-PI促进巨噬细胞从M2向M1表型复极，导致比单独PTX或IPI-549更有效地抑制癌细胞迁移(图12)。
接下来，我们评估了静脉施用Nano-PI是否可以增强患有自发性乳腺癌的MMTV-PyMT转基因小鼠中肿瘤和淋巴结中的药物累积。进行液相色谱串联质谱法(LC-MS)以量化组织中的药物浓度(图2E至图2F，图13)。如图2E至图2F和表2所示，与游离药物(PTX/IPI，IV)相比，Nano-PI导致PTX和IPI-549在肿瘤和淋巴结中的累积增加。与游离药物相比，肿瘤中PTX和IPI-549的曲线下面积(AUC组织)增加了2.4倍和2.2倍，淋巴结中的AUC组织增加了2.0倍和2.2倍，证明了这一点。此外，与临床上使用的PTX白蛋白纳米制剂(Nano-P，I.V.)和IPI-549(P.O.)(Nano-P/IPI，P.O.)或Nano-P(I.V.)加IPI-549(I.P.)的组合相比，Nano-PI将IPI-549在肿瘤和淋巴结中的累积增加了2.3倍和2.5倍(AUC组织)(图2E至图2F和表2)。
表2.根据图2E中的数据计算的不同组织中PTX和IPI-549的AUC0-24h(血浆为ng*h/ml或组织为ng*h/g)
为了评估Nano-PI是否有效地将药物递送到肿瘤和淋巴结中的巨噬细胞，我们制备了用荧光OG488标记的PTX和IPI549包封的Nano-PI(F-Nano-PI)。然后，我们通过共聚焦成像和流式细胞术可视化静脉施用后肿瘤和淋巴结中不同类型细胞中的药物分布。F-Nano-PI(绿色)主要分布在肿瘤中的巨噬细胞中，如与巨噬细胞(红色)共定位所示(图3A至图3B，图13)。流式细胞术分析进一步证明，与游离药物(F-PTX/IPI)相比，F-Nano-PI增加了肿瘤中的药物累积(从6.9±1.5％增加到17.3±2.8％)。游离药物均匀分布在肿瘤细胞(39.88％)和TAM(38.94％)中；而F-Nano-PI在TAM中的分布(67.75％)多于在肿瘤细胞中的分布(23.06％)(图3C，图14)。
在淋巴结中，Nano-PI还增强了药物在巨噬细胞中的累积，如F-Nano-PI(绿色)与巨噬细胞(红色)而不是与B或T细胞的强共定位所示(图3D至图3G，图15)。此外，F-Nano-PI在髓窦巨噬细胞(MSM)和髓索巨噬细胞(MCM)中的分布比在包膜下窦巨噬细胞(SSM)中的分布更多(图3F至图3H)。相比之下，游离药物(PTX-OG488)在淋巴结中的分布较低，并且在巨噬细胞中的共定位较少。总之，我们的数据表明，与游离药物相比，Nano-PI增强了PTX和IPI-549向淋巴结和肿瘤的递送，尤其是向这些组织中的巨噬细胞的递送。
Nano-PI与α-PD1组合在PyMT转基因小鼠中导致完全长期缓解并消除肺转移
在患有自发性乳腺癌和肺转移的转基因MMTV-PyMT小鼠中评估了Nano-PI与α-PD1治疗组合的抗肿瘤功效(32,38-40)。MMTV-PyMT小鼠在8-10周内生长出1-15个乳腺肿瘤病灶，并出现多个肺转移病灶。当最大的肿瘤病灶直径达到2cm时，将它们处死。当小鼠9-10周龄时，此时所有病变的多灶性乳腺癌的总体积达到80-110mm3时，药物治疗开始(图4A)。Nano-PI(PTX 10mg/kg和IPI-549 5mg/kg，I.V.给药5次)和α-PD1抗体[100μg/小鼠，腹膜内(I.P.)注射3剂]的组合治疗根除肿瘤生长，并在出生后183天内实现肿瘤完全缓解(100％完全应答，CR)(图4B和图16A至图16B)，消除肺转移(图4C)，并导致100％小鼠存活率(图4D)。媒介物组中每只小鼠的平均总肿瘤体积在出生后平均88天达到12020.4±2404.1mm3，并且中位存活时间为88天(50％小鼠死亡或按照预先确定的方式处死以达到终点)(图4B)。目前的临床测试方案IPI-549(P.O.)与Nano-P(I.V.)和α-PD1(I.P.)组合导致肿瘤生长延迟，并且中位存活期为123天，但未实现完全癌症缓解(0％ CR)。其他治疗组包括Nano-P(IV)、Nano-P(I.V.)加α-PD1、IPI-549(P.O.)加α-PD1和仅Nano-PI(I.V.)，没有实现完全肿瘤缓解(图4A至图4D)。与Nano-P、IPI-549(I.P.)和α-PD1的三种药物组合相比，使用上述相同的给药方案再次证实了Nano-PI加α-PD1的抗肿瘤功效(图16C)。Nano-PI加α-PD1表现出完全肿瘤缓解(>130天)，而Nano-P与IPI-549(I.P.)和α-PD1组合仅显示出部分应答(图16D至图16)。
为了测试Nano-PI加α-PD1在肿瘤缓解小鼠中的长期疗效，我们接下来在出生后第210天对肿瘤缓解的PyMT小鼠进行肿瘤再攻击植入，方法是将5×106个细胞/mL PyMT癌细胞植入(S.C.)乳腺脂肪垫中，而不进行进一步治疗(图4E)。最初用Nano-IP和α-PD1治疗的具有长期肿瘤缓解的小鼠完全排斥植入的PyMT癌细胞的肿瘤生长38天，而幼稚小鼠(FVB/NJ小鼠，对照组)显示出约400m3的肿瘤生长(图4F)。值得注意的是，这些数据并不表明Nano-PI与α-PD1组合治疗治愈PyMT自发性乳腺癌，因为我们观察到内源性肿瘤病变在出生后200天左右开始生长。此外，我们在肿瘤再攻击实验结束时(出生后248天)检测了外周血、骨髓、淋巴结、脾脏和肺中的总记忆T和B细胞群体。与对照组相比，具有长期肿瘤缓解和既往治疗的小鼠具有更高的中枢记忆T细胞(TCM，CD3+CD62L+CD44+)和效应记忆T细胞(TEM，CD3+CD62L-CD44+)(图17A至图17E)。此外，我们还测量了四个记忆相关的B细胞亚群：MB1(CD19+CD73+CD80+)、MB2(CD19+CD73+PD-L2+)、MB3(CD19+PD-L2+CD80+)和MB4(CD19+CD73+CD80+PD-L2+)(图17F至图17J)。具有长期肿瘤缓解的小鼠在淋巴结、脾脏、骨髓、外周血和肺中也具有较高量的这四种B细胞亚型。这些数据表明，Nano-PI与α-PD1组合可能诱导了更高的总记忆细胞，这可能有助于其长期抗癌功效。然而，值得注意的是，由于此模型中的未知抗原，我们只测量了总免疫记忆细胞，而没有测量抗原特异性记忆细胞。
与静脉施用(五剂)游离PTX和IPI-549组合相比，我们进一步测试了较低剂量的Nano-PI的抗肿瘤功效。将Nano-PI(PTX 5mg/kg，IPI-549 2.5mg/kg，I.V.)加α-PD1(100μg/小鼠，三剂，I.P.)或游离PTX(5mg/kg，I.V.)和IPI-549(2.5mg/kg，I.V.)加α-PD1(100μg/小鼠，三剂，I.P.)的组合施用于MMTV-PyMT小鼠(图4G)。与游离PTX和IPI-549的组合相比，Nano-PI抑制肿瘤生长(图4H)、肺转移(图4I)，并在观察结束时导致100％存活率(图4J)。最后，我们还通过将4T1细胞植入BALB/c小鼠的乳腺脂肪垫中，评估了Nano-PI和α-PD1在原位转移性乳腺肿瘤模型中的抗癌功效。与Nano-P或IPI-549的单次施用或组合施用相比，Nano-PI(三剂，每三天一次，10mg/kg PTX，5mg/kg IPI-549)与α-PD1组合对肿瘤生长和肺转移表现出最大的抗癌功效(图18)。
Nano-PI与α-PD1组合通过促进M2向M1巨噬细胞复极，增加CD4+和CD8+T细胞，减少Treg和防止肿瘤中T细胞耗竭来重塑肿瘤免疫微环境
为了探索Nano-PI如何重塑肿瘤免疫微环境的细节，我们首先利用飞行时间细胞计量术(CyTOF)监测MMTV-PyMT自发性乳腺癌中最后一次治疗后10天的肿瘤免疫细胞谱。与静脉注射Nano-P加IPI-549和α-PD1(M1：24.37％，M2：16.4％)或媒介物组(M1：8.4％，M2：22.55％)相比，Nano-PI加α-PD1改变了M1和M2频率，导致M2巨噬细胞减少5倍，M1巨噬细胞群体增加2倍(M1：15.87％，M2 3.2％)(图5A)。Nano-PI加ɑ-PD-1降低免疫细胞中免疫抑制性M2巨噬细胞标志物(CD206、CD115)的表达，并降低抗炎细胞因子IL-10和IL-4的表达(图5B)。此外，来自同一小鼠实验的流式细胞术分析表明，Nano-PI加α-PD1治疗使肿瘤组织中的M2巨噬细胞减少4倍，使M1巨噬细胞增加3至4倍(图5C至图5E，图19A)。免疫荧光染色进一步证明，与其他治疗组相比，Nano-PI加α-PD1诱导最有效的肿瘤中M2向M1巨噬细胞复极，其中Nano-PI加α-PD1治疗的肿瘤具有非常低的M2巨噬细胞，如M2巨噬细胞标志物的最小染色所示，但肿瘤中M1巨噬细胞增加(图5F)。此外，较低剂量的Nano-PI(Nano-PI，PTX 5mg/kg，IPI-549 2.5mg/kg)也被证实使用4T1乳腺癌小鼠(图20A)和MMTV-PyMT(图19A)将原位乳腺癌中的巨噬细胞从M2复极化为M1。
此外，我们还在最后一次治疗后10天通过流式细胞术(每个样品200万个细胞)分析PyMT小鼠肿瘤中的免疫细胞浸润。虽然药物治疗没有改变肿瘤中浸润的免疫细胞(CD45+)总数，但Nano-PI加α-PD-1组和Nano-P加IPI-549和α-PD1组将巨噬细胞浸润分别降低到20％和17％，而媒介物治疗组中巨噬细胞浸润为27％。此外，Nano-PI加α-PD-1治疗组和Nano-P加IPI-549和α-PD1治疗组将T细胞浸润分别提高到14％和7.4％，而媒介物治疗组为2％。最后，Nano-PI加α-PD-1治疗组和Nano-P加IPI-549和α-PD1治疗组将B细胞浸润分别提高到8.9％和6.8％，而媒介物治疗组为3.2％(图21)。
为了研究Nano-PI加α-PD1治疗如何改变PyMT小鼠(图6A)和4T1原位乳腺癌小鼠(图20B至图20C)肿瘤中的T细胞免疫，我们首先通过CyTOF对T细胞亚型进行分析。结果显示，与Nano-P联合IPI-549、α-PD1和媒介物治疗组相比，Nano-PI加α-PD1治疗分别使CD4+T细胞增加6.6倍和11倍，使CD8+T细胞增加2.5倍和3.4倍(图6A)。此外，与PyMT小鼠中的媒介物组(19.5％)相比，Nano-PI加α-PD1治疗使肿瘤中的Treg减少20倍(0.8％)。在使用4T1细胞的原位乳腺癌中也观察到了类似的流式细胞术分析结果(图20C)。最后，Nano-PI加α-PD1治疗防止肿瘤组织中的T细胞耗竭，这通过耗竭标志物(CTLA-4、PD-1、TIM-3和FR4)的表达降低来证实(图6A)。
此外，Nano-PI加α-PD1治疗还增加了免疫细胞中的DC细胞百分比(图5A)和CD103+阳性DC，这有助于诱导CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫(图6B)。通过流式细胞术对肿瘤中树突状细胞的进一步表征显示，Nano-PI加α-PD1治疗使总DC(CD11C+CD103+)群体增加8.9±2.0％，而媒介物治疗组为3.2±0.5％。与Nano-P加IPI-549和α-PD1和媒介物组相比，这种治疗还将激活的DC(CD80+CD86+)百分比提高1.7至3.8倍，这对T细胞激活是至关重要的。(图6B)。最后，Nano-PI和α-PD1治疗也增加了肿瘤中颗粒酶B、IL-12和IFN-γ的浓度，表明大量激活的抗原呈递细胞(DC或巨噬细胞)和细胞毒性T细胞(图6D至图6F)。
Nano-PI联合α-PD1通过促进M2向M1巨噬细胞极化，增加CD4+和CD8+T细胞，增加B细胞、减少TIM 3+T细胞来重塑淋巴结中的免疫微环境
我们接下来通过CyTOF和流式细胞术分析MMTV-PyMT小鼠治疗后10天淋巴结中的免疫细胞亚群变化。CyTOF分析显示，与媒介物组相比，Nano-PI加α-PD1治疗使M2巨噬细胞频率降低3倍，并使M1巨噬细胞频率提高2.5倍(图7A)。流式细胞术分析进一步证实了这些发现，并显示与Nano-P加游离IPI-549治疗组和媒介物对照治疗组相比，M2巨噬细胞减少5至14倍，并且M1巨噬细胞增加2至3倍(图7B至图7D，图19B)。此外，与Nano-P与IPI-549和α-PD1治疗组和媒介物治疗组相比，Nano-PI加α-PD1治疗增加淋巴结中CD4+T和CD8+T细胞频率，并降低TIM-3阳性T细胞频率(图7A)。此外，与其他组相比，Nano-PI加α-PD1治疗还使淋巴结中的B细胞频率增加2倍以上(图7A)。
此外，还使用流式细胞术监测PyMT小鼠在治疗后10天淋巴结中每个免疫细胞亚群的总数，每个样品中使用200万个细胞。数据显示，与Nano-P加IPI-549和α-PD1或媒介物治疗组相比，Nano-PI加α-PD1治疗后淋巴结中每个免疫细胞亚群的总数发生变化(图22)。淋巴结中的巨噬细胞浸润(作为总细胞的百分比)从18.2％(对照)略微下降到16.4％(Nano-P，IPI和α-PD1)和12.2％(Nano-PI加α-PD1)。淋巴结中的T细胞浸润(作为总细胞的百分比)从13.4％(对照)增加到18.9％(Nano-P，IPI和α-PD1)和24.4％(Nano-PI加α-PD1)。此外，淋巴结中的B细胞浸润也从8.7％(对照)增加到13.9％(Nano-P，IPI和α-PD1)和16.5％(Nano-PI加α-PD1)。最后，淋巴结中的NK细胞浸润(作为总细胞的百分比)从1.3％(对照)增加到4.0％(Nano-P，IPI和α-PD1)和5.0％(Nano-PI加α-PD1)(图22)。
此外，整个淋巴结的共聚焦显微镜图像显示，与其他治疗组和媒介物治疗组相比，Nano-PI加α-PD1治疗组减少M2巨噬细胞，并增加M1巨噬细胞(图7E)。最后，与其他治疗组相比，Nano-PI加α-PD1治疗组增加淋巴结中抗肿瘤细胞因子产生(颗粒酶B、IL-12和IFN-γ)(图7F至图7H)。这些结果表明，Nano-PI与α-PD1治疗成功地重塑了淋巴结的微环境，这有助于其在PyMT小鼠中的抗癌功效。
药代动力学数据
血浆药代动力学参数见表3。
表3.不同制剂的血浆药代动力学参数。
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Nano-PI联合α-PD1提高患有转移性胰腺癌的KPC小鼠的存活率。
图23显示了患有胰腺癌的KPC小鼠治疗后的存活率(n＝10)：小鼠血清白蛋白(媒介物)、Abraxane(Abrax，IV 10mg/kg)+IPI549(IP，15mg/kg)+α-PD1(PD1，IP，100μg)；和Nano-PI(PTX 10mg/kg，IPI-549 5mg/kg)加α-PD1(PD-1，IP 100μg)。Nano-PI每三天静脉注射一次，共5剂。α-PD1每三天腹腔内施用一次，共3剂(100μg/小鼠)。IPI-549每三天腹膜内给药一次，共5剂。
应当了解，前面的详细描述和所附的实施例仅仅是说明性的，不应当被认为是对本公开的范围的限制，本公开的范围仅由所附的权利要求书及其等同形式来限定。
公开实施方案的各种变化和修改对本领域技术人员将是显而易见的且在不偏离其精神和范围的情况下进行。

Claims (53)

1.一种组合物，其包含：有效量的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂，或其药学上可接受的盐；和白蛋白纳米颗粒。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述PI3K抑制剂是I类PI3K抑制剂。
3.如权利要求2所述的组合物，其中所述PI3K抑制剂是同工型选择性PI3K抑制剂。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述PI3K抑制剂是式(III)化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
R10选自-C≡C-Rx、C1-C4烷基、C2-C4烯基、C2-C4炔基、卤代、氰基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷基氨基和二C1-C4-烷基氨基；
R11选自C1-C4烷基和氢；
R3是具有1、2或3个氮原子的8至10元双环杂芳基，其中杂芳基任选地被1或2个选自氨基、C1-C4烷基和卤代的取代基取代；并且
Rx选自具有1或2个独立地选自N和S的杂原子的5或6元单环杂芳基、芳基、氢和C1-C4烷基，其中杂芳基和芳基任选地被1或2个选自C1-C4烷基的取代基取代。
5.如权利要求4所述的组合物，其中R10为-C≡C-Rx，并且Rx是具有两个氮原子的5元单环杂芳基，其被一个C1-C4烷基取代。
6.如权利要求4或权利要求5所述的组合物，其中R11是甲基。
7.如权利要求4-6中任一项所述的组合物，其中R12是被一个氨基取代的吡唑并[1,5-a]嘧啶。
8.如权利要求4-7中任一项所述的组合物，其中所述式(III)化合物是：
9.如权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中所述纳米颗粒的直径在50至200nm之间。
10.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中所述白蛋白纳米颗粒包封所述PI3K抑制剂。
11.如权利要求1-10中任一项所述的组合物，其中所述白蛋白是人血清白蛋白或来自动物物种的白蛋白。
12.如权利要求1-11中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含化疗剂。
13.如权利要求12所述的组合物，其中所述白蛋白纳米颗粒包封所述化疗剂。
14.如权利要求12或13所述的组合物，其中所述化疗剂是紫杉醇。
15.一种式(I)化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
Q是CH或N；
A是芳基或具有1、2、3或4个独立地选自N、O、S和P的杂原子的5或6元单环杂芳基；
R1选自氢、卤代、C1-C4烷基、C3-C6环烷基、C1-C4卤代烷基、-ORa1、-N(Rb1)(Rc1)、-SO2Rd1、-SO2N(Re1)(Rf1)和-NHSO2Rg1，其中Ra1、Rb1、Rc1、Rd1、Re1、Rf1和Rg1各自独立地选自氢、C1-C4烷基和C1-C4卤代烷基；
R2选自氢、卤代、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基和式(II)基团：
其中：
D是单环杂芳基或单环杂环基，其各自任选地被C1-C4烷基取代；
X是键、-C(O)-、-NH-或-C(O)NH-；
Y是–(CRa2 2)n-G2–，其中每个Ra2独立地选自H和C1-C4烷基，或其中两个Ra2与它们所连接的一个或多个碳原子一起形成C3-C7环烷基；G2是键、亚环烷基或亚杂环基；并且n是0、1、2或3；
Z是-ORb2、-SRc2、-N(Rd2)(Re2)或-CH3，其中Rb2、Rc2、Rd2和Re2各自独立地选自氢、芳基、芳基烷基、C1-C4烷基、-C(O)-C1-C40烷基、-C(O)-C2-C40烯基和式(IIa)基团：并且
R3选自氢和基团-L3-E，其中：
L3是键、C1-C2亚烷基、-CH＝CH-、-C≡C-、-C(O)-、-O-、-NH-、-S-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-C(O)S-、亚芳基、亚环烷基、亚杂芳基或亚杂环基，或其中L3包含此类基团中的任两个的组合；并且
E为双环杂环基或双环杂芳基，其各自任选地被1、2、3、4或5个独立地选自卤代、C1-C4烷基、C3-C6环烷基、C3-C6-环烷基-C1-4-烷基、C1-C4卤代烷基、氧代、-ORa3、-N(Rb3)(Rc3)、-SO2Rd3、-SO2N(Re3)(Rf3)和-NHSO2Rg3的取代基取代，其中Ra3、Rb3、Rc3、Rd3、Re3、Rf3和Rg3各自独立地选自氢、C1-C4烷基和C1-C4卤代烷基；
L是–(CRa4Rb4)m-G4–，其中：
Ra4和Rb4独立地选自氢和C1-C4烷基；
m是0、1或2；且
G4是键、-NHC(O)-、-NH-、-O-或-S-；并且
B是双环杂芳基或双环杂环基，其各自任选地被1、2、3、4或5个独立地选自卤代、C1-C4烷基、C3-C6环烷基、C1-C4卤代烷基、任选取代的芳基、-ORa5、-N(Rb5)(Rc5)、-SO2Rd5、-SO2N(Re5)(Rf5)和-NHSO2Rg5的取代基取代，其中Ra5、Rb5、Rc5、Rd5、Re5、Rf5和Rg5各自独立地选自氢、C1-C4烷基和C1-C4卤代烷基；
其中当R3是氢时，R2是式(II)基团且Z不是-CH3；并且
其中当R2是氢、卤代、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基或C1-C4卤代烷氧基时，R3是基团-L3-E。
16.如权利要求15所述的化合物，其中所述化合物是式(Ia)化合物：
或其药学上可接受的盐。
17.如权利要求16所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中A是苯基并且R1是氢。
18.如权利要求15所述的化合物，其中所述化合物是式(Ib)化合物：
或其药学上可接受的盐。
19.如权利要求15-4中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中D是五元单环杂芳基或4至6元单环杂环基，其各自独立地包含1、2、3或4个独立地选自N、O、S和P的杂原子。
20.如权利要求5所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中D选自吡咯、吡唑、咪唑、咪唑啉、噁唑、噁噻唑、噁二唑、氮杂环丁烷、吡咯啉、吡咯烷和哌啶。
21.如权利要求5所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中D具有选自以下的结构：
22.如权利要求15-7中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中X是键或-C(O)-。
23.如权利要求15-8中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Y是–(CRa2 2)n-CH2–，其中n是0或1，并且其中每个Ra2是氢，或其中两个Ra2基团与它们所连接的碳原子一起形成亚环丙基环。
24.如权利要求9所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中基团-X-Y-Z具有选自以下的式：
25.如权利要求10所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Z是-ORb2，其中Rb2选自氢、-C(O)-C1-C40烷基、-C(O)-C2-C40烯基和式(IIa)基团。
26.如权利要求11所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中Z是-ORb2，其中Rb2选自氢、-C(O)-C15-C20烷基、-C(O)-C15-C20烯基和式(IIa)基团。
27.如权利要求15所述的化合物，其中所述化合物是式(Ic)化合物：
或其药学上可接受的盐。
28.如权利要求13所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R2选自卤代和式(II)基团。
29.如权利要求14所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R2是卤代。
30.如权利要求13-15中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中L3是键、-CH2-CH2-、-CH＝CH-、-C≡C-、-C(O)NH-或具有1、2或3个氮原子的5元亚杂芳基。
31.如权利要求13-16中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中E具有下式：
其中R'和R”独立地选自C1-C4烷基、C3-C6-环烷基-C1-4-烷基、C1-C4卤代烷基和-NHSO2Rg3，其中Rg3是C1-C4烷基。
32.如权利要求17所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R'是C3-C6-环烷基-C1-4-烷基，并且R”选自C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基和-NHSO2Rg3，其中Rg3是C1-C4烷基。
33.如权利要求15所述的化合物，其中所述化合物选自：
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及其药学上可接受的盐。
34.一种药物组合物，其包含有效量的如权利要求15-33中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐。
35.如权利要求34所述的药物组合物，其中所述组合物还包含白蛋白纳米颗粒。
36.如权利要求35所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒的直径在50至200nm之间。
37.如权利要求35或36所述的药物组合物，其中所述白蛋白纳米颗粒包封所述化合物。
38.如权利要求35-37中任一项所述的药物组合物，其中所述白蛋白是人血清白蛋白或来自动物物种的白蛋白。
39.如权利要求34-38中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物还包含化疗剂。
40.如权利要求39所述的药物组合物，其中所述化疗剂是紫杉醇。
41.一种治疗或预防受试者的疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的如权利要求1-14中任一项所述的组合物，或如权利要求15-40中任一项所述的化合物，或其药学上可接受的盐。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述方法还包括施用免疫疗法。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述免疫疗法包括施用PD-1或PD-L1抗体。
44.如权利要求41-43中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症包括癌症、自身免疫性疾病或病症、或炎症性疾病或病症。
45.如权利要求41-44中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症。
46.如权利要求44或45所述的方法，其中所述癌症包括实体瘤或血液学癌症。
47.如权利要求44-46中任一项所述的方法，其中所述癌症是转移性癌症。
48.如权利要求44-47中任一项所述的方法，其中所述疾病或病症是乳腺癌、胰腺癌、肺癌、淋巴瘤。
49.如权利要求44-48中任一项所述的方法，其中所述方法抑制或消除癌症转移、减少肿瘤生长、防止肿瘤复发或其任何组合。
50.如权利要求41-49中任一项所述的方法，其中所述化合物或所述组合物通过皮下注射施用。
51.如权利要求42-50中任一项所述的方法，其中所述免疫疗法在所述化合物或所述组合物的同时、之前或之后施用。
52.如权利要求42-51中任一项所述的方法，其中所述免疫疗法通过皮下注射施用。
53.如权利要求41-52中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
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