JP2023538133A - がん治療のための複数の切断可能なプロドラッグを含むナノ粒子 - Google Patents

がん治療のための複数の切断可能なプロドラッグを含むナノ粒子 Download PDF

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Abstract

低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）を標的とし、酸及び／又は酵素で切断可能なアセタール－又はオキシベンジルオキシ結合カーボネート又はカルバメート結合を含むプロドラッグが記載される。また記載されるのは、金属有機構造体コア又はナノスケールの金属ビスホスフェート配位ポリマーコアと、プロドラッグを含む脂質コーティング層を含むコアシェルナノ粒子である。ナノ粒子コアは、任意選択的に一又は複数種の親水性化学療法剤を含みうる。プロドラッグ及びナノ粒子は、がんを治療する方法において使用できる。例えば、本開示のナノ粒子は、遊離の化学療法剤の混合物の送達と比較して、腫瘍への化学療法剤の増加した蓄積をもたらす方法において、複数の化学療法剤の共送達に使用されうる。【選択図】図２

Description

［関連出願］
本開示の主題は、その開示がその全体について出典明示によりここに援用される、２０２０年８月２１日に出願された米国仮特許出願第６３／０６８８００号の利益を主張する。
［政府の関心の陳述］
この発明は、国立衛生研究所によって授与された認可番号ＣＡ２２３１８４及びＣＡ２１６４３６の下で政府の支援を受けてなされた。政府はこの発明に対して所定の権利を有する。
［技術分野］
本開示の主題は、切断可能なカーボネート又はカルバメートリンカーを介して一価脂質部分に結合された一価薬物部分を含むプロドラッグ（例えば、化学療法剤のプロドラッグ）を提供する。プロドラッグは、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）を標的としうる。本開示の主題は、プロドラッグを含むナノ粒子をまた提供する。ナノ粒子は、例えば、（ｉ）一価脂質部分及び切断可能なカーボネート又はカルバメートリンカーを含むプロドラッグを含む脂質コーティング層と、（ｉｉ）それ自体が任意選択的に一又は複数種の化学療法剤又はその類似体若しくはプロドラッグを含みうる、ナノスケール配位ポリマー（ＮＣＰ）ナノ粒子コアとを含むコアシェルナノ粒子でありうる。プロドラッグ及びナノ粒子を、がんの治療に使用できる。幾つかの実施態様では、本開示の主題のナノ粒子ベースの組成物は、様々ながんにおける複数の治療法を組み合わせることによって、増強された抗がん効果をもたらしうる。
［略語］
℃＝摂氏
％＝パーセント
μｇ＝マイクログラム
μｌ又はμＬ＝マイクロリットル
μＭ＝マイクロモル
５－ＦＵ＝５－フルオロウラシル
ＡｐｏＢ－１００＝アポリポタンパク質Ｂ１００
ＡＳ ＯＤＮ＝アンチセンスオリゴヌクレオチド
ＡＵＣ＝曲線下面積
Ｂｃｌ－２＝Ｂ細胞リンパ腫２
Ｃａ＝カルシウム
Ｃｈｏｌ＝コレステロール
ＣｉｓＰｔ＝シスプラチン
ＣＰＴ＝カンプトテシン
ｄａｃｈ＝トランス－１，２－ジアミノシクロヘキサン）
ＤＣＭ＝ジクロロメタン
ＤＨＡ＝ジヒドロアルテミシニン
ＤＬＳ＝動的光散乱
ＤＯＰＡ＝ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフェート
ＤＯＰＣ＝１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－リン酸ナトリウム塩
ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋ＝１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）２０００］
ＤＴＸ＝ドセタキセル
ＥＴ＝エトポシド
ＥｔＯＡｃ＝酢酸エチル
ＥｔＯＨ＝エタノール
ｇ＝グラム
ＧＥＭ＝ゲムシタビン
ＧＭＰ＝ゲムシタビンモノホスフェート
ｈ＝時間
ＩＣ５０＝５０パーセント阻害濃度
ＩＣＰ－ＭＳ＝誘導結合プラズマ質量分析
ＩＦＮ＝インターフェロン
ＩＬ＝インターロイキン
ｉ．ｖ．＝静脈内
Ｋａ＝結合定数
ｋｇ＝キログラム
ＬＤＬ＝低密度リポタンパク質
Ｍ＝モル濃度
ｍＣＲＣ＝転移性結腸直腸がん
ｍｇ＝ミリグラム
Ｍｇ＝マグネシウム
ｍｉｎ＝分
ｍｉＲＮＡ＝マイクロＲＮＡ
ｍＬ＝ミリリットル
ｍｍ＝ミリメートル
ｍＭ＝ミリモル濃度
ｍｍｏｌ＝ミリモル
Ｍｎ＝マンガン
ＭＯＦ＝金属有機構造体
ＮＣＰ＝ナノスケール配位ポリマー
ＮＩＲ＝近赤外線
ｎｍ＝ナノメートル
ＮＭＲ＝核磁気共鳴
ＯＡ＝オレイン酸
ＯｘＰｔ＝オキサリプラチン
ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水
ＰＤＩ＝多分散性又は多分散性指数
ＰＤ－１＝プログラム死１
ＰＤ－Ｌ１＝プログラム死－リガンド１
ＰＤＴ＝光線力学療法
ＰＥＧ＝ポリエチレングリコール
Ｐ－ｇｐ＝Ｐ－糖タンパク質
ＰＰＸ＝ポドフィロトキシン
ＰＳ＝光増感剤
Ｐｔ＝白金
ＰＴＸ＝パクリタキセル
ＰＶＰ＝ポリビニルピロリドン
Ｑ３Ｄ＝３日に一回
ｒｐｍ＝毎分回転数
ＳＢＵ＝二次構造単位
ｓｉＲＮＡ＝低分子干渉ＲＮＡ
ＳＮ３８＝７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン
ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン
ＴＭＳ＝トリメチルシリル
Ｚｎ＝亜鉛
シスプラチン、オキサリプラチン、及びカルボプラチンの三種の主要な白金剤は、ＤＮＡ複製を阻害するアルキル化剤であり、シスプラチン（ＣｉｓＰｔ）を含む全ての腫瘍化学療法レジメンのほぼ５０％を占めている。白金ベースのダブレット療法は、クリニックで卵巣がん、子宮頸がん、肺がん、トリプルネガティブ乳がんの治療に頻繁に使用されており、多くのがんで第一選択療法、第二選択療法、又は救援療法として更に研究されている。これらの白金剤は、多くの場合、トポイソメラーゼ阻害剤又は有糸分裂阻害剤、例えばパクリタキセル（ＰＴＸ）と組み合わせて投与される。併用療法は、腫瘍内の細胞の不均一性のためにしばしば価値がある：一部の細胞は有糸分裂的に活性である一方、他の細胞は老化細胞である場合があり、一部の細胞はある薬物に耐性があるが他の薬物には耐性がない場合がある。例えば、オキサリプラチンは、良好な活動状態を有する転移性膵臓がん患者の治療に、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）及びイリノテカンと組み合わせて使用される。複数の薬物を含む追加の化学療法レジメンには、ＦＯＬＦＯＸ（フォリン酸、フルオロウラシル、及びオキサリプラチン）、ＦＯＬＦＩＲＩ（フォリン酸、フルオロウラシル、及びイリノテカン）、及びＩＲＯＸ（イリノテカン及びオキサリプラチン）が含まれる。しかしながら、これらの治療法は、治療可能域が狭く、重篤な副作用を伴う場合がある。例えば、ＩＲＯＸレジメンで治療された転移性結腸直腸がん（ｍＣＲＣ）患者の３０％が重度の好中球減少症を経験したのに対し、１８％の患者が重度の感覚障害を経験した（Ｓｔａｎｃｕｌｅａｎｕ等，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２００６，２４：１３５４１－１３５４１）。これらの副作用は、それぞれ骨髄及び末梢神経への薬物の非選択的分布に起因する場合がある。
ナノ粒子は、表面電荷などの物理的特性を制御して薬物動態挙動を改善し、毒性プロファイルを変化させることにより、化学療法剤送達のプラットフォームを提供しうる。疎水性分子であるＰＴＸは、当初、薬物を水溶液に可溶化するためにＣｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ／エタノールと共に製剤化された。しかし、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ製剤は、「重度のアナフィラキシー様過敏症反応、高脂血症、異常なリポタンパク質パターン、赤血球の凝集、及び末梢神経障害」を引き起こす場合がある。２００５年に、無溶媒のアルブミン結合パクリタキセル（ｎａｂ－パクリタキセル）ナノ粒子が合衆国で承認され、主要毒性が、その重症度が血流中を循環する遊離薬物のピーク及び持続レベルと相関する好中球減少症に移行した。しかし、現在のところ、併用療法のために単一ナノ粒子で異なる物理化学的特性の複数の化学療法剤を送達するＦＤＡ承認方法はない。
従って、化学療法剤、特に異なる作用機序及び／又は物理化学的特性を有する薬剤の組み合わせを送達する追加の組成物及び方法が引き続き必要とされている。低用量の一又は複数種の活性剤で、及び／又は副作用のレベルを低下させて、改善された抗がん活性をもたらす、がんを治療するための更なる組成物及び方法を提供することがまた引き続き必要とされている。
この概要は、本開示の主題の幾つかの実施態様を列挙し、多くの場合、これらの実施態様の変形態様及び置換態様を列挙する。この概要は、多数の多様な実施態様の単なる例示である。所与の実施態様の一又は複数の代表的な特徴の言及も同様に例示的である。そのような実施態様は、典型的には、述べられた特徴の有無にかかわらず存在しうる；同様に、それらの特徴は、この概要に列挙されているかどうかにかかわらず、本開示の主題の他の実施態様に適用することができる。過度の繰り返しを避けるため、この概要では、そのような特徴の全ての可能な組み合わせの列挙又は示唆はしていない。
幾つかの実施態様では、本開示の主題は、式Ｄ－ＢＬ－Ｌの構造を含むプロドラッグであって、Ｄは、一価薬物部分であり、任意選択的にＤは抗がん薬化合物の一価誘導体であり、更に任意選択的にＤはエトポシド（ＥＴ）、ポドフィロトキシン（ＰＰＸ）、パクリタキセル（ＰＴＸ）、ドセタキセル（ＤＴＸ）、ジヒドロアルテミシン（ＤＨＡ）、カンプトテシン（ＣＰＴ）、７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ３８）、トポテカン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ビンクリスチン、ミトキサントロン、アルテスネート、カペシタビン、オクトレオチド、ロイプロリド、及びゴセレリンからなる群から選択される薬物化合物の一価誘導体であり；Ｌは一価脂質部分であり；且つＢＬは二価リンカーであり、Ｄはカーボネート又はカルバメート基を介してＢＬに直接結合され、ＢＬはアセタール基と置換オキシベンジルオキシ基のうちの少なくとも一つを含み、アセタール基は、式：
（上式中、
ｎは０から４の間の整数であり、任意選択的にｎは０であり；Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アラルキル、置換アラルキル、アリール、及び置換アリールからなる群から独立して選択され、各Ｒ３は、アルキル、アラルキル、アリール、ハロ、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシ、アシル、カルボキシレート、ホスフェート、ニトロ、－Ｎ３、Ｂ（ＯＨ）２、及びシアノからなる群から独立して選択される）の一つの構造を有し、アセタール基の酸素原子は、カーボネート又はカルバメート基の炭素原子に直接結合され；且つ置換オキシベンジルオキシ基は、式：
（上式中、Ｒ’はニトロ、Ｎ３、及び－Ｂ（ＯＨ）２からなる群から選択される）の構造を有し、オキシベンジルオキシ基のベンジル炭素に結合した酸素原子は、カーボネート又はカルバメート基の炭素原子に直接結合されている、プロドラッグを提供する。
幾つかの実施態様では、Ｌは、コレステロール、オレイン酸、リゾ脂質、又はホスホコリンの一価誘導体である。幾つかの実施態様では、プロドラッグは、式：
の一つの構造を含む。
幾つかの実施態様では、ＢＬは、式：
（上式中、Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アラルキル、置換アラルキル、アリール、及び置換アリールからなる群から独立して選択され；任意選択的に、Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、メチル、及びフェニルからなる群から独立して選択され；更に任意選択的に、Ｒ１とＲ２の両方がＨである）の構造を有するアセタール基を含む。
幾つかの実施態様では、Ｌはオレイン酸部分であり、Ｌ及びＢＬが一緒になって構造：
を有する。
幾つかの実施態様では、Ｌはコレステロール誘導体であり、Ｌ及びＢＬが一緒になって構造：
を有する。
幾つかの実施態様では、プロドラッグは、
を含む群から選択される。
幾つかの実施態様では、プロドラッグは低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）に結合し、ＬＤＬ受容体媒介エンドサイトーシスを介して能動的に腫瘍に輸送され、任意選択的に、プロドラッグは、アルブミンに対するプロドラッグのＫａの少なくとも約１０００倍であるＬＤＬに対する結合定数Ｋａを有し、更に任意選択的に、プロドラッグは、アルブミンに対するプロドラッグのＫａの少なくとも約２０００倍であるＬＤＬに対するＫａを有する。
幾つかの実施態様では、本開示の主題は、（ａ）金属－有機マトリックス材料を含むコアであって、任意選択的に金属－有機マトリックス材料が配位ポリマーを含むコアと；（ｂ）コアの表面の少なくとも一部を覆うコーティング層であって、脂質層又は脂質二重層を含み、且つ式Ｄ－ＢＬ－Ｌの構造を含む一又は複数種のプロドラッグを含む、コーティング層とを含むナノ粒子を提供する。幾つかの実施態様では、金属－有機マトリックス材料が、多価金属イオンとビスホスフェートを含む金属ビスホスフェートを含むナノスケール配位ポリマーを含み、任意選択的に多価金属イオンがＣａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。幾つかの実施態様では、ビスホスフェートは抗がん剤のプロドラッグを含み、任意選択的にビスホスフェートがシスプラチン、カルボプラチン又はオキサリプラチンプロドラッグを含み、更に任意選択的にビスホスフェートがシス，シス－トランス－［Ｐｔ（ＮＨ３）２Ｃｌ２（ＯＨ）２］又はシス，トランス－［Ｐｔ（ｄａｃｈ）（オキサレート）（ＯＨ）２］のビスホスフェートエステルである。
幾つかの実施態様では、コアは、包埋抗がん剤、任意選択的に包埋親水性抗がん剤を含み、更に任意選択的に包埋抗がん剤がゲムシタビンモノホスフェート（ＧＭＰ）である。幾つかの実施態様では、コアは少なくとも二種の抗がん剤を含み、任意選択的に少なくとも二種の抗がん剤が第一の抗がん剤であって、シスプラチン、カルボプラチン又はオキサリプラチンプロドラッグ、更に任意選択的にシスプラチン、カルボプラチン又はオキサリプラチンのビスホスフェートである第一の抗がん剤と；第二の抗がん剤であって、包埋親水性抗がん剤である第二の抗がん剤とを含む。
幾つかの実施態様では、ナノ粒子コアは、多価金属イオン、任意選択的にＺｎ２＋とビスホスフェートを含む金属ビスホスフェート配位ポリマーを含み、前記ビスホスフェートが、構造Ｐｔ（ｄａｃｈ）（オキサレート）（ビスホスホラミド酸）を有するオキサリプラチンのプロドラッグであり；コーティング層が、構造：
を有するプロドラッグを含む脂質二重層である。幾つかの実施態様では、ナノ粒子コアは、ナノ粒子コアに包埋されたＧＭＰを更に含む。
幾つかの実施態様では、コーティング層は、カチオン性脂質及び／又は官能化脂質を含む脂質二重層を含み、前記官能化脂質が、核酸に結合できる基で官能化された脂質であり、少なくとも一種の核酸が、官能化脂質に共有結合されるか、又は静電相互作用を介してカチオン性脂質に結合され、任意選択的に前記脂質二重層が、チオール又はジチオール官能化１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、及び１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）の一又は複数を含む混合物を含む。幾つかの実施態様では、少なくとも一種の核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びＡＳ ＯＤＮからなる群から選択され、任意選択的にｓｉＲＮＡが、サバイビンｓｉＲＮＡ、ＥＲＣＣ－１ ｓｉＲＮＡ、Ｐ－糖タンパク質ｓｉＲＮＡ（Ｐ－ｇｐ ｓｉＲＮＡ）、Ｂｃｌ－２ ｓｉＲＮＡ、及びそれらの混合物からなる群から選択される。
幾つかの実施態様では、ナノ粒子は、一又は複数種の不動態化剤、任意選択的に親水性ポリマー；標的剤、任意選択的にＲＧＤペプチド；及び免疫療法剤を更に含む。幾つかの実施態様では、ナノ粒子は約２０ナノメートルから約１４０ナノメートルの範囲の粒径を有する。幾つかの実施態様では、ナノ粒子は、ＬＤＬ受容体媒介エンドサイトーシスによる腫瘍への能動輸送のために、血漿タンパク質、任意選択的にアポリポタンパク質Ｂ－１００を吸着する。
幾つかの実施態様では、本開示の主題は、（ｉ）薬学的に許容される担体と、（ｉｉ）式Ｄ－ＢＬ－Ｌの構造を含むプロドラッグ或いは（ａ）金属－有機マトリックス材料を含むコアであって、任意選択的に金属－有機マトリックス材料が配位ポリマーを含むコアと（ｂ）コアの表面の少なくとも一部を覆うコーティング層であって、脂質層又は脂質二重層を含み、且つ式Ｄ－ＢＬ－Ｌの構造を含む一又は複数種のプロドラッグを含むコーティング層とを含むナノ粒子とを含む薬学的製剤を提供する。
幾つかの実施態様では、本開示の主題は、治療を必要とする対象においてがんを治療する方法であって、式Ｄ－ＢＬ－Ｌの構造を含むプロドラッグ；（ａ）金属－有機マトリックス材料を含むコアであって、任意選択的に金属－有機マトリックス材料が配位ポリマーを含むコアと、（ｂ）コアの表面の少なくとも一部を覆うコーティング層であって、脂質層又は脂質二重層を含み、且つ式Ｄ－ＢＬ－Ｌの構造を含む一又は複数種のプロドラッグを含むコーティング層とを含むナノ粒子；或いはそれらの薬学的製剤を対象に投与することを含む、方法を提供する。
幾つかの実施態様では、該方法は、手術、放射線療法、化学療法、毒素療法、免疫療法、凍結療法及び遺伝子療法からなる群から選択される追加のがん治療を対象に施すことを更に含み；任意選択的に追加のがん治療が免疫療法である。幾つかの実施態様では、免疫療法は、対象に免疫療法剤を投与することを含み；任意選択的に免疫療法剤は、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ４７抗体、抗ＧＤ２抗体、サイトカイン、ポリサッカライドＫ；ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、ＣＣＲ７阻害剤、ＯＸ４０阻害剤、ＴＩＭ３阻害剤、及びＬＡＧ３阻害剤を含む群から選択される。
幾つかの実施態様では、がんは、頭部腫瘍、頸部腫瘍、乳がん、婦人科腫瘍、脳腫瘍、結腸直腸がん、肺がん、中皮腫、軟部組織肉腫、皮膚がん、結合組織がん、脂肪がん、肺がん、胃がん、肛門性器がん、腎臓がん、膀胱がん、結腸がん、前立腺がん、中枢神経系がん、網膜がん、血液がん、神経芽細胞腫、多発性骨髄腫、リンパ系がん、及び膵臓がんを含む群から選択される。幾つかの実施態様では、がんは転移性がん、任意選択的に転移性結腸直腸がんである。
幾つかの実施態様では、該方法は、ナノ粒子を対象に投与することを含み、ナノ粒子コアは、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋及びそれらの組み合わせから任意選択的に選択される多価金属イオンとビスホスフェートを含む金属ビスホスフェート配位ポリマーを含み、前記ビスホスフェートはシスプラチン、オキサリプラチン又はカルボプラチンのビスホスフェートエステルであり；コーティング層は、構造Ｄ－ＢＬ－Ｌを有するプロドラッグを含む脂質二重層を含み、ここで、Ｄは、抗がん薬化合物の一価薬物部分であり、任意選択的に一価薬物部分は、ＥＴ、ＰＰＸ、ＰＴＸ、ＤＴＸ、ＤＨＡ、ＣＰＴ、ＳＮ３８、トポテカン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ビンクリスチン、ミトキサントロン、アルテスネート、カペシタビン、オクトレオチド、ロイプロリド、及びゴセレリンを含む群から選択される薬物化合物の一価誘導体であり；Ｌは一価脂質部分、任意選択的に一価コレステロール部分であり；ＢＬは二価リンカー部分であり、ここで、Ｄはカーボネート又はカルバメート結合を介してＢＬに結合されており、ＢＬはアセタール基を含み、アセタール基は式：
（上式中、Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アラルキル、置換アラルキル、アリール、及び置換アリールを含む群から独立して選択される）の構造を有し、アセタール基中の酸素原子の少なくとも一つがカーボネート又はカルバメート基の炭素原子に直接結合されている。幾つかの実施態様では、ナノ粒子コアは、その中に包埋された親水性抗がん剤を更に含み、任意選択的に親水性抗がん剤はＧＭＰである。幾つかの実施態様では、プロドラッグは、式：
の構造を有し、任意選択的にビスホスフェートはＰｔ（ｄａｃｈ）（オキサレート）（ビスホスホラミド酸）である。
幾つかの実施態様では、該方法は、対象に免疫療法剤を投与することを更に含む。幾つかの実施態様では、ナノ粒子の投与は、少なくとも一種の抗がん剤の腫瘍曲線下面積（ＡＵＣ）に、少なくとも一種の抗がん剤であって、ナノ粒子及び／又はプロドラッグと関連していない少なくとも一種の抗がん剤の等量の投与と比較して、少なくとも２倍の増加、任意選択的に４倍を超える増加をもたらす。
従って、カーボネート又はカルバメートに結合したアセタール又はオキシベンジルオキシ基を含むリンカーを含むプロドラッグ、プロドラッグを含むナノ粒子、プロドラッグとナノ粒子の製剤、並びにプロドラッグ、ナノ粒子、及び製剤を使用してがんを治療する方法を提供することが、本開示の主題の目的である。
本開示の主題によって全体的又は部分的に達成される、上で述べた本開示の主題の目的、及び他の目的は、以下の説明が進むにつれて明らかになるであろう。
図１は、本開示の主題の例示的な脂質プロドラッグ、すなわち、コレステロールに基づく一価脂質部分と、トリメチルシリル（ＴＭＳ）エーテルを更に含む７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ３８）に基づく一価薬物部分とを含むここで「Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８」と呼ばれるプロドラッグへの合成経路を示す合成図である。 図１（続き） 図２は、本開示の主題の例示的なコアシェルナノ粒子（ここでは「ＯｘＰｔ／ＳＮ３８」と呼ばれる）の二工程構築を示す概略図である。ナノ粒子（ＮＰ）コアは、亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）とオキサリプラチンのビスホスホラミド酸誘導体（すなわち、ＯｘＰｔ－ｂｐ）の共重合によって調製される金属－ビスホスフェート配位ポリマーを含む。ＮＰコーティング層は、コレステロール、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－リン酸ナトリウム塩（ＤＯＰＣ）及び１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）２０００］（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）に加えて、図１に記載された７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ３８）の脂質プロドラッグ、すなわち、Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８を含む。 図３Ａ～３Ｃは、脂質二重層コーティングのない亜鉛／オキサリプラチンビスホスフェート配位ポリマーコアを含むナノ粒子、すなわち「ＯｘＰｔ－ベア」の特徴付けに関連した顕微鏡画像及び一対のグラフである。図３Ａは、ＯｘＰｔ－ベアナノ粒子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像である。左下隅のスケールバーは、５０ナノメートル（ｎｍ）を表す。図３Ｂは、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定されたＯｘＰｔ－ベアナノ粒子の数平均粒径を示すグラフである。粒径はナノメートル（ｎｍ）で測定される。 図３Ｃは、室温におけるテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中のＯｘＰｔ－ベアナノ粒子の安定性を経時的に示すグラフである。実線はナノ粒子の数平均ナノ粒子粒径（ｎｍ）対時間（時間）のデータを示し、破線は多分散性（ＰＤＩ）対時間を示す。 図４Ａ～４Ｃは、亜鉛／オキサリプラチンビスホスフェート配位ポリマーコアを含み、図１に記載された７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ３８）の脂質プロドラッグを含む脂質二重層コーティングを有するナノ粒子、すなわち、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８ナノ粒子の特徴付けに関連する顕微鏡画像及び一対のグラフである。図４Ａは、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８ナノ粒子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像である。左下のスケールバーは１００ナノメートルを表す。 図４Ｂは、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定されたＯｘＰｔ／ＳＮ３８ナノ粒子の数平均粒径を示すグラフである。粒径はナノメートル（ｎｍ）で測定される。図４Ｃは、３７℃において５ミリグラム／ミリリットル（ｍｇ／ｍＬ）でウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中でのＯｘＰｔ／ＳＮ３８ナノ粒子の安定性を示すグラフである。実線はナノ粒子の数平均ナノ粒子粒径（ｎｍ）対時間（時間）のデータを示し、破線は多分散性（ＰＤＩ）対時間を示す。 図５Ａ～５Ｃは、オキサリプラチン（ＯｘＰｔ）プロドラッグ（すなわち、オキサリプラチンビスホスフェート）を含むコアと７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシンのコレステロールプロドラッグ（Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８）を含む脂質層とを含むナノ粒子、すなわちＯｘＰｔ／ＳＮ３８がＣｈｏｌ－ＳＮ３８を低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）に移動させることを示す一連のグラフである。図５Ａは、分子動力学（ＭＤ）シミュレーションからの、バルク水からＬＤＬスライスの脂質コアまで遊離薬物、すなわち７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ３８、実線）とプロドラッグ（Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８、破線）を移動させる（キロジュール／モル（ｋＪ・ｍｏｌ－１）で測定された）平均力ポテンシャル（ＰＭＦ）を示すグラフである。プロットは、平衡化されたＬＤＬスライスのスナップショットに重ねられている。図５Ｂは、ラット血漿中のＳＮ３８（破線）又はＣｈｏｌ－ＳＮ３８（実線）のＬＤＬへの時間依存的結合（パーセンテージ（％）として測定）とＯｘＰｔ／ＳＮ３８からＬＤＬへのｃｈｏｌ－ＳＮ３８の移動を示すグラフである。 図５Ｃは、１４．４ミリグラム／キログラム（ｍｇ／ｋｇ）のＣｈｏｌ－ＳＮ３８用量でのＯｘＰｔ／ＳＮ３８の静脈内注射後の、ラット血漿中のＯｘＰｔ／ＳＮ３８からのＣｈｏｌ－ＳＮ３８の薬物動態プロファイルとそのリポタンパク質分布（アルブミン（白）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ、明るい灰色）、ＬＤＬ（濃い灰色）、又は超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ、黒））である。Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８は、０．５、１、３、５、８、及び２４時間でマイクログラム／ミリリットル（μｇ／ｍＬ）で測定される。 図６は、ピロリン酸亜鉛ナノスケール配位ポリマー（ＺｎＰ ＮＣＰ）に結合する濃度依存性アポリポタンパク質Ｂ－１００（ＡｐｏＢ－１００）を示すグラフである。データはＺｎＰ ＮＣＰ（実線）とコレステロールを含まないＺｎＰ ＮＣＰ（破線）（ｎ＝３）について示される。ＺｎＰ ＮＣＰ濃度は、ミリグラム（ｍｇ）で測定されてｘ軸に示される。 図７Ａ～７Ｃは、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）を介したナノ粒子の取り込みを示すグラフである。図７Ａは、コレステロール－ピロ脂質コンジュゲート（Ｃｈｏｌ－ピロＮＣＰ）又は蛍光標識低密度リポタンパク質（Ｄｉｌ－ＬＤＬ）を含む脂質コーティング層を含むナノスケール配位ポリマー粒子の取り込みを示すグラフであり、図７Ｂは、１又は１０マイクログラム／ミリリットル（μｇ／ｍｌ）の抗ＬＤＬＲ抗体（ａ－ＬＤＬＲ）でのＬＤＬＲ遮断後のマウス結腸腺癌（ＭＣ３８）細胞によるクロリンｅ６（Ｃｅ６－ＮＣＰ）又はＤｉｌ－ＬＤＬを含むコアを含むナノスケール配位ポリマー粒子の取り込みを示すグラフである。 図７Ｃは、野生型（ＷＴ）及びＬＤＬＲノックアウト（ＫＯ）ＭＣ３８細胞でのＣｈｏｌ－ピロＮＣＰ及びＣｅ６－ＮＣＰの細胞取り込みを示すグラフである。細胞取り込みは、相対平均蛍光強度（ＭＦＩ）の測定によって測定され、対照と比較したパーセンテージとして報告される。 図８Ａ及び８Ｂは一対のグラフであり、図８Ａは、１０マイクログラム／ミリリットル（μｇ／ｍｌ）の非特異的免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）又は抗低密度リポタンパク質受容体抗体（ａ－ＬＤＬＲ）での処置から２４時間後のマウス結腸腺癌（ＭＣ３８）細胞によるコンジュゲート（Ｃｈｏｌ－ピロＮＣＰ）を含む脂質層を含むナノスケール配位ポリマー（ＮＣＰ）からのピロリピドのコレステロールコンジュゲート（Ｃｈｏｌ－ピロ）の取り込みの共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）統計分析を示すグラフであり、図８Ｂは、１マイクログラム（μｇ）のＩｇＧ又はａ－ＬＤＬＲの静脈内（ｉ．ｖ．）注射の２４時間（ｈ）後及び４８時間後のＣｈｏｌ－ピロＮＣＰの腫瘍取り込みの平均蛍光強度（ＭＦＩ）のグラフである。 図９Ａ及び９Ｂは、腫瘍内に１マイクログラム（μｇ）の抗低密度リポタンパク質受容体抗体（ａ－ＬＤＬＲ）を注射した場合と注射していない場合のマウス結腸腺癌（ＭＣ３８）を有するマウスにおける、遊離オキサリプラチン（ＯｘＰｔ、３．５ミリグラム／キログラム（ｍｇ／ｋｇ））＋イリノテカン（６．２ｍｇのＳＮ３８／ｋｇ相当）、又はオキサリプラチン（ＯｘＰｔ）プロドラッグを含むコアとＳＮ３８の脂質プロドラッグを含む脂質層を含むナノ粒子（ＯｘＰｔ／ＳＮ３８；３．５ｍｇ ＯｘＰｔ／ｋｇ相当、６．２ｍｇ ＳＮ３８／ｋｇ相当）の静脈内（ｉ．ｖ．）注射後の、白金（Ｐｔ）（図９Ａ）及び７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ３８）（図９Ｂ）の時間依存性蓄積（マイクロモル（μＭ）濃度として提示）を示すグラフである。 図１０Ａは、遊離オキサリプラチン（ＯｘＰｔ）＋イリノテカン、又はＯｘＰｔプロドラッグを含むコアと、７－ヒドロキシ－１０－エチルカンプトテシン（Ｓｎ３８）の脂質プロドラッグを含む脂質コーティング層とを含むナノ粒子、すなわち、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８によって誘導されるアポトーシスを示す一連のグラフである。処置後、細胞をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色し、フローサイトメトリーで分析した。 図１０Ｂは、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８によって引き起こされた細胞周期停止を示すグラフである。処理した細胞を７０％のエタノールで一晩固定し、ＲＮａｓｅ Ａで処理し、ＰＩで染色し、フローサイトメトリーで分析した（ｎ＝３）。図１０Ｃは、遊離ＯｘＰｔ＋イリノテカン又はＯｘＰｔ／ＳＮ３８で処理したＭＣ３８細胞のミトコンドリア膜電位のＪＣ－１染色と共に、フローサイトメトリー解析を示すグラフ（平均蛍光強度（ＭＦＩ）として提示）である（ｎ＝３）。 図１１Ａ及び１１Ｂは、摂氏３７度（℃）において７２時間にわたってｐＨ＝４．７のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中（図１１Ａ）及び１０単位／ミリリットル（ｍＬ）エステラーゼを含むｐＨ＝７．４のＰＢＳ中（図１１Ｂ）におけるオキサリプラチンプロドラッグを含むコアとプロドラッグを含む脂質コーティング層を含むナノ粒子（ＯｘＰｔ／ＳＮ３８）からの、コレステロール－７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシンプロドラッグ（Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８）及び放出された生成物（遊離７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ３８）、トリメチルシリル（ＴＭＳ）エーテルを含まないＣｈｏｌ－ＳＮ３８（Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８（ＴＭＳなし））又はＴＭＳエーテルを含むＳＮ３８（ＳＮ３８－ＴＭＳ））のパーセンテージ（％）を示す一対のグラフである。 上記 図１２Ａ及び１２Ｂは、ｐＨ＝４．７（破線）又はｐＨ＝７．４（実線）のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で７２時間、摂氏３７度（℃）でインキュベートした場合の、７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ３８）（図１２Ａ）及び白金（Ｐｔ）（図１２Ｂ）の、オキサリプラチンプロドラッグを含むコアとＳＮ３８ベース脂質プロドラッグを含む脂質層を含むナノ粒子（ＯｘＰｔ／ＳＮ３８）の累積放出量（パーセンテージ（％）として測定）を示すグラフである。 図１３は、酸触媒加水分解及びエステラーゼ媒介切断による、本開示の主題のプロドラッグからの提案された７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ３８）放出機序の概略図である。 図１４Ａ及び１４Ｂは、（図１４Ａ）オキサリプラチンビスカルバメート（ＯｘＰｔ－ｂｃ）をもたらす加水分解と続くアスコルベートによる還元を介して亜鉛及びＯｘＰｔビスホスフェートプロドラッグのナノスケール配位ポリマー（ＮＣＰ）からのオキサリプラチン（ＯｘＰｔ）の放出を示す概略図であり；（図１４Ｂ）摂氏３７度（℃）においてｐＨ＝４．７で５ミリモル（ｍＭ）のアスコルベートを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でインキュベートした場合の、図１４Ａに対して記載したＮＣＰを含むコアと、７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシンの脂質プロドラッグを含む脂質層とを含むナノ粒子（ＯｘＰｔ／ＳＮ３８）からの全白金（Ｐｔ）ＯｘＰｔ、及びＯｘＰｔ－ｂｃ放出プロファイルを示すグラフである。 上記 図１５Ａ及び１５Ｂは、オキサリプラチン（ＯｘＰｔ）プロドラッグコアとＣｈｏｌ－ＳＮ３８を含むコーティング層を含むナノ粒子の２ミリグラム／キログラム（ｍｇ／ｋｇ）を投与されたマウスにおける、（図１５Ａ）経時的（時間）な全血漿白金（Ｐｔ）濃度（マイクログラム／ミリリットル（ｍｇ／ｍｌ）で測定）、及び（図１５Ｂ）経時的（時間）な７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ３８、点線）、２０－Ｏ－トリメチルシリル－ＳＮ３８（ＳＮ３８－ＴＭＳ、破線）、及びＳＮ３８のコレステロールプロドラッグ（Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８、実線）の血漿濃度（μｇ／ｍｌで測定）を示す一対のグラフである。 図１６Ａ及び１６Ｂは、３ミリグラム／キログラム（ｍｇ／ｋｇ）体重ＯｘＰｔに相当するナノ粒子の用量でオキサリプラチン（ＯｘＰｔ）プロドラッグ含有コアとＳＮ３８の脂質プロドラッグを含む脂質コーティング層を含むナノ粒子を静脈内（ｉ．ｖ．）注射した結腸直腸癌（ＣＴ２６）腫瘍担持マウスにおいて経時的（時間（ｈ）で測定）な腫瘍（図１６Ａ）及び血漿（図１６Ｂ）の７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ３８）濃度（マイクログラム／ミリリットル（μｇ／ｍｌ）で測定）を示す一対のグラフである。 図１７は、オキサリプラチン（ＯｘＰｔ）プロドラッグ含有コアと７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ３８）の脂質プロドラッグを含む脂質コーティング層を含むナノ粒子の反復投与後の、Ｂａｌｂ／ｃマウスの体重（投与の初日の体重の割合（％）として測定）のグラフである。マウスには、３日に一回（Ｑ３Ｄ）のスケジュールで、３ミリグラム／キログラム（ｍｇ／ｋｇ）体重ＯｘＰｔに相当するナノ粒子の用量で投与がなされた。 図１８は、３日に一回（Ｑ３Ｄ）のスケジュールで投与された様々な処置後の、腫瘍担持マウスにおけるマウス腺癌（ＭＣ３８）腫瘍の腫瘍増殖阻害を示すグラフである。処置内容：対照としてのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、四角形）、遊離オキサリプラチン（ＯｘＰｔ）とイリノテカンの混合物（ＯｘＰｔ＋イリノテカン、上向きの三角形）、ＯｘＰｔプロドラッグを含むコアを有するナノ粒子（ＯｘＰｔ ＮＣＰ、下向きの三角形）、ピロリン酸亜鉛（ＺｎＰ）配位ポリマーコアと、７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシンの脂質プロドラッグを含むコーティング層とを含むナノ粒子（ＺｎＰ／ＳＮ３８、菱形）、ＯｘＰｔプロドラッグを含むコアと、７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシンの脂質プロドラッグを含むコーティング層とを含むナノ粒子（ＯｘＰｔ／ＳＮ３８、左向きの三角形）、又はＯｘＰｔ／ＳＮ３８及び抗プログラム死リガンド１抗体（ＯｘＰｔ／ＳＮ３８＋α－ＰＤ－Ｌ１、右向きの三角形）。処置は、３ミリグラム／キログラム（ｍｇ／ｋｇ）体重のＯｘＰｔ相当用量で、３日に一回施された。初回の注射の日を０日目として開始して、処置の０～１８日目に腫瘍サイズを立方ミリメートル（ｍｍ３）で測定した。 図１９は、３日に一回（Ｑ３Ｄ、上向きの三角形）又は毎週／７日に一回（Ｑ７Ｄ、下向きの三角形）のスケジュールで、オキサリプラチン（ＯｘＰｔ）プロドラッグ含有コアと７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ３８）の脂質プロドラッグを含む脂質コーティング層とを含むナノ粒子を反復投与した後の、腫瘍担持マウスにおけるマウス腺癌（ＭＣ３８）腫瘍の腫瘍増殖阻害／退縮を示すグラフである。Ｑ３Ｄスケジュールのための各用量は、３ミリグラム／キログラム（ｍｇ／ｋｇ）体重のＯｘＰｔ相当用量であり、Ｑ７Ｄスケジュールのための各用量は、６ｍｇ／ｋｇ体重のＯｘＰｔ相当用量であった。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、四角形）を対照として使用した。初回の注射の日を０日目として開始して、処置の０～２９日目に腫瘍サイズを立方ミリメートル（ｍｍ３）で測定した。 図２０Ａ及び２０Ｂは、３日に一回（Ｑ３Ｄ、上向きの三角形）又は毎週／７日に一回（Ｑ７Ｄ、下向きの三角形）のスケジュールで、オキサリプラチン（ＯｘＰｔ）プロドラッグ含有コアと７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ３８）の脂質プロドラッグを含む脂質コーティング層とを含むナノ粒子を反復投与した後の、腫瘍担持マウスにおけるマウス結腸直腸癌（ＣＴ２６）腫瘍（図２０Ａ）及びヒト結腸直腸腺癌（ＨＴ２９）腫瘍（図２０Ｂ）の腫瘍増殖阻害／退縮を示す一対のグラフである。Ｑ３Ｄスケジュールのための各用量は、３ミリグラム／キログラム（ｍｇ／ｋｇ）体重のＯｘＰｔ相当用量であり、Ｑ７Ｄスケジュールのための各用量は、６ｍｇ／ｋｇ体重のＯｘＰｔ相当用量であった。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、四角形）を対照として使用した。初回の注射の日を０日目として開始して、処置の０～２０日目又は０～２１日目に腫瘍サイズを立方ミリメートル（ｍｍ３）で測定した。 図２１は、遊離オキサリプラチン（ＯｘＰｔ；３．５ミリグラム／キログラム（ｍｇ／ｋｇ））＋イリノテカン（１１．７ｍｇ／ｋｇの７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ３８）相当）を３日に一回（Ｑ３Ｄ）で３回用量を、又はＯｘＰｔプロドラッグを含むコアとＳＮ３８の脂質プロドラッグを含む脂質層とを含むナノ粒子（ＯｘＰｔ／ＳＮ３８；３．５ｍｇ／ｋｇのＯｘＰｔ相当及び６．２ｍｇ／ｋｇのＳＮ３８相当）をＱ３Ｄで８回用量を投与した後の、マウス結腸腺癌（ＭＣ３８）腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウスについて、好中球の絶対数（千細胞／マイクロリットル（１０３細胞／μＬ）で測定）を示すグラフである。比較のために、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で処置された対照群に対する好中球数もまた提供される。 図２２Ａ及び２２Ｂは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、四角形）、オキサリプラチン（ＯｘＰｔ）プロドラッグを含むコアと、７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシンの脂質プロドラッグを含む脂質コーティング層とを含むナノ粒子（ＯｘＰｔ／ＳＮ３８、下向きの三角形）、又は遊離ＯｘＰｔ＋イリノテカン（上向きの三角形）で最大１６用量まで、３日に一回（Ｑ３Ｄ）処置した後の、ヌードマウスのヒト結腸直腸腺癌（ＨＴ２９）モデルにおける腫瘍増殖曲線（図２２Ａ）及び生存率曲線（図２２Ｂ）を示すグラフである。腫瘍サイズは立方センチメートル（ｃｍ３）で測定され、生存率はパーセンテージ（％）として測定される。 図２３Ａ及び２３Ｂは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、四角形）、オキサリプラチン（ＯｘＰｔ）プロドラッグを含むコアと、７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシンの脂質プロドラッグを含む脂質コーティング層とを含むナノ粒子（ＯｘＰｔ／ＳＮ３８、下向きの三角形）、又は遊離ＯｘＰｔ＋イリノテカン（上向きの三角形）で最大１６用量まで、３日に一回（Ｑ３Ｄ）処置した後の、ヌードマウスのヒト結腸直腸腺癌（ＨＣＴ１１６）（図２３Ａ）及びＳＷ４８０（図２３Ｂ）モデルの腫瘍増殖曲線を示すグラフである。腫瘍サイズは立方センチメートル（ｃｍ３）で測定される。 図２４Ａ及び２４Ｂは、マウス結腸直腸腺癌（ＭＣ３８）腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、１マイクログラム（μｇ）の非特異的免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ、左向きの三角形）又は抗低密度リポタンパク質受容体抗体（抗ＬＤＬＲ、下向きの三角形）を腫瘍内注射した場合の、３．５ミリグラム（ｍｇ）ＯｘＰｔ／キログラム（ｋｇ）相当の用量（ｎ＝６）での、オキサリプラチン（ＯｘＰｔ）プロドラッグを含むコアと、７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシンの脂質プロドラッグを含む脂質コーティング層とを含むナノ粒子（ＯｘＰｔ／ＳＮ３８）の（図２４Ａ）抗がん効果；及び（図２４Ｂ）２２日目に切除した（ｎ＝６）ＭＣ３８腫瘍の腫瘍重量（グラム（ｇ））を示すグラフである。図２４Ａに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及びＩｇＧで処置したマウスのデータを四角形で示し、ＰＢＳ及び抗ＬＤＬＲで処置したマウスのデータを上向きの三角形で示し、腫瘍サイズは立方センチメートル（ｃｍ３）で測定される。 図２５は、野生型（ＷＴ）及び低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）ノックアウト（ＫＯ）マウス腺癌（ＭＣ３８）腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対する３．５ミリグラム（ｍｇ）のＯｘＰｔ／キログラム（ｋｇ）相当の用量（ｎ＝６）での、オキサリプラチン（ＯｘＰｔ）プロドラッグを含むコアと、７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ３８）の脂質プロドラッグを含む脂質コーティング層とを含むナノ粒子（すなわち、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８）の抗癌効果を示すグラフである。グラフは、腫瘍サイズ（立方センチメートル（ｃｍ３））対初回注射後の日数を示す。データは、ＰＢＳ（ＬＤＬＲ ＫＯ ＰＢＳ、正方形）又はナノ粒子（ＬＤＬＲ ＫＯ ＯｘＰｔ／ＳＮ３８、上向きの三角形）で処置されたＬＤＬＲ ＫＯマウス、ＰＢＳで処置されたＷＴマウス（下向きの三角形）、及びナノ粒子で処置されたＷＴマウス（ＷＴ ＯｘＰｔ／ＳＮ３８、左向きの三角形）について示される。 図２６は、カルボプラチン（Ｃａｒｂｏ）プロドラッグ含有コアと、ポドフィロトキシン（ＰＰＸ）のコレステロールプロドラッグを含む脂質コーティング層とを含むナノ粒子の動的光散乱（ＤＬＳ）測定の結果を示すグラフである。ナノ粒子の粒径は、ナノメートル（ｎｍ）で測定される。 図２７Ａ及び２７Ｂは、オキサリプラチン（ＯｘＰｔ）プロドラッグ及びゲムシタビン（ＧＥＭ）を含むコアと、７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ３８）のジスルフィドリンカー含有脂質プロドラッグを含む脂質コーティング層とを含むナノ粒子、すなわち、ＯｘＰｔ／ＧＥＭ／ＳＮ３８（Ｂｏｃ）（左向きの矢印）、又は他の処置（すなわち、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、四角形）、脂質プロドラッグを含まない同じナノ粒子（ＯｘＰｔ／ＧＥＭ、上向きの三角形）、及びＧＥＭを含まない同じナノ粒子（ＯｘＰｔ／ＳＮ３８（Ｂｏｃ）、下向きの三角形））を３日に一回（Ｑ３Ｄ）のスケジュールで反復投与した後の、腫瘍担持マウスにおけるマウス結腸直腸癌（ＣＴ２６）腫瘍の腫瘍増殖阻害（図２７Ａ）及びマウス体重（図２７Ｂ）の一対のグラフである。図２７Ａの腫瘍サイズは立方センチメートル（ｃｍ３）で測定され、図２７Ｂの体重は０日目（処置の初日）の体重のパーセンテージ（％）として測定される。 図２８Ａ及び２８Ｂは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、四角形）、本開示の主題のオキサリプラチンプロドラッグ含有コアと７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシンの脂質プロドラッグとを含むナノ粒子（ＯｘＰｔ／ＳＮ３８、上向きの三角形）、又はナノ粒子コアに包埋されたゲムシタビン（ＧＥＭ）を更に含む同じナノ粒子（ＯｘＰｔ／ＧＥＭ／ＳＮ３８、下向きの三角形）を用いて３日に一回（Ｑ３Ｄ）のスケジュールで処置した後の、ＫＰＣ腫瘍担持Ｃ５７ｂｌ／６マウスの体重（図２８Ａ）及び腫瘍増殖曲線（図２８Ｂ）を示す一対のグラフである。図２８Ｂの腫瘍サイズは立方センチメートル（ｃｍ３）で測定され、図２８Ａの体重は０日目（処置の初日）の体重のパーセンテージ（％）として測定される。 図２９Ａ及び２９Ｂは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、円）、遊離カルボプラチン（Ｃａｒｂ）＋ドセタキセル（ＤＴＸ）（下向きの三角形）、ＤＴＸの脂質プロドラッグを含む脂質コーティング層を有するピロリン酸亜鉛配位ポリマーコアを含むナノ粒子（ＺｎＰ／ＤＴＸ、四角）、又はカルボプラチンプロドラッグを含むコアとＤＴＸの脂質プロドラッグを含む脂質コーティング層とを含むナノ粒子（Ｃａｒｂ／ＤＴＸ、菱形）を、１週間に一回、５ミリグラム／キログラム（ｍｇ／ｋｇ）の相当Ｃａｒｂ用量で３用量分、処置されたマウス乳がん（４Ｔ１）腫瘍担持ｂａｌｂ／ｃマウスの体重（図２９Ａ）及び腫瘍増殖曲線（図２９Ｂ）を示す一対のグラフである。図２９Ｂの腫瘍体積は立方センチメートル（ｃｍ３）で測定され、図２９Ａの体重は０日目（処置の初日）の体重のパーセンテージ（％）として測定される。 上記 図３０Ａ及び３０Ｂは、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、円）又はカルボプラチンプロドラッグを含むコアとドセタキセルの脂質プロドラッグを含む脂質コーティング層とを含むナノ粒子（Ｃａｒｂ／ＤＴＸ、菱形）の毎週１回、５ミリグラム／キログラム（ｍｇ／ｋｇ）の同等のカルボプラチン用量の３用量分で処置されたヒト非小細胞肺がん（Ｈ４６０）腫瘍担持無胸腺ヌードマウスの体重（図３０Ａ）及び腫瘍増殖曲線（図３０Ｂ）を示す一対のグラフである。図３０Ｂの腫瘍体積は立方センチメートル（ｃｍ３）で測定され、図３０Ａの体重は０日目（処置の初日）の体重のパーセンテージ（％）として測定される。 図３１Ａ及び３１Ｂは、オキサリプラチン（ＯｘＰｔ）を含むコアとＣｈｏｌ－ＳＮ３８（ＴＭＳなし）を含む脂質コーティング層とを含むナノ粒子を、２ミリグラムＯｘＰｔ／キログラム体重の用量レベルでラットに静脈内投与した後の経時的（時間単位）な、トリメチルシリル（ＴＭＳ）エーテル基を含まない７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ３８）（Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８（ＴＭＳなし））（図３１Ａ）及びＳＮ３８（図３１Ｂ）のコレステロールプロドラッグ血漿中濃度を示す一対のグラフである。血漿中濃度は、マイクログラム／ミリリットル（μｇ／ｍｌ）で測定される。 図３２Ａ及び３２Ｂは、３日に一回（Ｑ３Ｄ）のスケジュールの１６用量（ｎ＝６）での様々な処置（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、四角）、遊離オキサリプラチン（ＯｘＰｔ）とイリノテカンの混合物（上向きの三角形）、又はＯｘＰｔプロドラッグを含むコアと、トリメチルシリル（ＴＭＳ）基を含まない７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ３８）のコレステロールプロドラッグを含む脂質コーティング層とを含むナノ粒子（ＯｘＰｔ／ＳＮ３８（ＴＭＳなし）、下向きの三角形））後のヒト結腸直腸腺癌（ＨＴ２９）腫瘍担持ヌードマウスの体重（図３２Ａ）及び腫瘍増殖曲線（図３２Ｂ）を示す一対のグラフである。図３２Ｂの腫瘍サイズは立方センチメートル（ｃｍ３）で測定され、図３２Ａの体重は、０日目（処置の初日）の体重のパーセンテージ（％）として測定される。 上記 図３３は、本開示の主題の幾つかの例示的コレステロール（Ｃｈｏｌ）プロドラッグの化学構造を示す概略図である。 図３３（続き） 図３３（続き） 図３３（続き） 図３３（続き） 図３４は、本開示の主題の幾つかの追加の例示的コレステロール（Ｃｈｏｌ）プロドラッグの化学構造を示す概略図である。 図３４（続き） 図３５Ａは、本開示の主題の幾つかの例示的なプロドラッグの一般的化学構造を示す概略図であり、例示的なプロドラッグは様々な二価リンカー構造を有する。 図３５Ａ（続き） 図３５Ｂは、（ｉ）図３５Ａの例示的なプロドラッグにおける「Ｃｈｏｌ」として使用できる一価コレステロール部分と、（ｉｉ）図３５Ａの例示的なプロドラッグにおける「薬物」として使用できる一価薬物部分の化学構造を示す概略図である。 図３５Ｂ（続き） 図３５Ｂ（続き）
本開示の主題は、以下に更に十分に説明される。しかしながら、本開示の主題は、異なる形態で具体化することができ、以下にここでまた添付の実施例に示す実施態様に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施態様は、この開示が徹底的かつ完全になり、実施態様の範囲が当業者に十分に伝えられるように提供される。
限定されないが、全ての特許、特許出願及びその刊行物、並びに科学的学術論文を含むここに記載の全ての参考文献は、それらが、ここで用いられる方法論、技術、及び／又は組成物を補足し、説明し、その背景を提供し、又は教示する範囲で、その全体が出典明示によりここに援用される。
Ｉ．定義
次の用語は当業者によって十分に理解されると思われるが、次の定義は、本開示の主題の説明を容易にするために記載される。
長年にわたる特許法の慣習に従い、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という用語は、特許請求の範囲を含むこの出願において使用される場合、「一又は複数」を指す。而して、例えば、「金属イオン（ａ ｍｅｔａｌ ｉｏｎ）」への言及は、複数のそのような金属イオンを含む等々である。
別段の指示がない限り、本明細書及び特許請求の範囲において使用されるサイズ、反応条件などの量を表す全ての数は、全ての場合において「約」という用語によって修飾されていると理解されるべきである。従って、反対のことが示されない限り、この明細書及び添付の特許請求の範囲に示される数値パラメータは、本開示の主題によって得られることが求められる所望の性質に応じて変化しうる近似値である。
ここで使用される場合、「約」という用語は、サイズ（すなわち、直径）、重量、濃度又はパーセンテージの値又は量に言及する場合、特定された量から、一例では±２０％又は±１０％、別の例では±５％、別の例では±１％、更に別の例では±０．１％の変動を包含することを意味し、そのような変動は開示方法を実施するのに適切である。
端点によってここに列挙される数値範囲は、その範囲内に含まれる全ての数値及び分数を含む（例えば、１から５には、限定されないが、１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４、及び５が含まれる）。
ここで使用される場合、エンティティのリストの文脈で使用される「及び／又は」という用語は、単独で又は組み合わせて存在するエンティティを指す。従って、例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、及び／又はＤ」という語句は、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤを個別に含むが、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤの任意かつ全ての組み合わせ及び部分的組み合わせをまた含む。
「含む（including）」、「含む（containing）」、又は「を特徴とする」と同義である「含む（comprising）」という用語は、包括的又はオープンエンドであり、追加の非列挙の要素又は方法工程を排除しない。「含む（comprising）」は、指定された要素が存在することを意味するが、他の要素を追加することができ、特許請求の範囲内の構成又は方法をなお形成することができる、クレーム用語において使用される専門用語である。
ここで使用される場合、「からなる」という語句は、特許請求の範囲において特定されていない任意の要素、工程、又は成分を除外する。「からなる」という語句が、前段部の直後ではなく、特許請求の範囲の特徴部の条項に現れる場合、その条項に記載されている要素のみを限定し；他の要素は、全体として特許請求の範囲から除外されない。
ここで使用される場合、「から本質的になる」という語句は、特許請求の範囲を、特定された材料又は工程と、加えて請求項記載の主題の基本的で新規の特徴に実質的に影響を与えないものに限定する。
「含む」、「からなる」、及び「から本質的になる」という用語に関して、これらの三つの用語のうちの一つがここで使用されている場合、本開示の請求項記載の主題は、他の二つの用語の何れかの使用を含みうる。
ここで使用される場合、「アルキル」という用語は、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、オクテニル、ブタジエニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、及びアレニル基を含む、Ｃ１－２０の、直鎖状（すなわち「直鎖」）、分岐した、又は環状、飽和又は少なくとも部分的、場合によっては完全に不飽和の（すなわち、アルケニル及びアルキニル）炭化水素鎖を指しうる。「分岐した」とは、メチル、エチル又はプロピルなどの低級アルキル基が直鎖状アルキル鎖に結合しているアルキル基を指す。「低級アルキル」は、１個から約８個の炭素原子、例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８個の炭素原子を有するアルキル基（すなわち、Ｃ１－８アルキル）を指す。「高級アルキル」は、約１０から約２０個の炭素原子、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個の炭素原子を有するアルキル基を指す。所定の実施態様では、「アルキル」は、特に、Ｃ１－８直鎖アルキルを指す。他の実施態様では、「アルキル」は、特に、Ｃ１－８分岐鎖アルキルを指す。
アルキル基は、同一又は異なっていてもよい一又は複数のアルキル基置換基で任意選択的に置換されうる（「置換アルキル」）。「アルキル基置換基」という用語には、限定されないが、アルキル、置換アルキル、ハロ、アリールアミノ、アシル、ヒドロキシル、アリールオキシル、アルコキシル、アルキルチオ、アリールチオ、アラルキルオキシル、アラルキルチオ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、オキソ、及びシクロアルキルが含まれる。幾つかの実施態様では、アルキル鎖に沿って、一又は複数の酸素、硫黄、又は置換若しくは非置換の窒素原子を任意選択的に挿入することができ、窒素置換基は、水素、低級アルキル（ここでは「アルキルアミノアルキル」とも呼ばれる）、又はアリールである。
従って、ここで使用される場合、「置換アルキル」という用語は、アルキル基の一又は複数の原子又は官能基が、例えば、アルキル、置換アルキル、ハロゲン、アリール、置換アリール、アルコキシル、ヒドロキシル、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、サルフェート、及びメルカプトを含む、別の原子又は官能基で置換された、ここで定義されたアルキル基を含む。
「アリール」という用語は、ここでは、一緒に縮合し、共有結合し、又は共通の基、例えば、限定されないが、メチレン又はエチレン部分に結合した、単一の芳香環、又は複数の芳香環でありうる芳香族置換基を指すために使用される。共通の結合基はまた、ベンゾフェノンにおけるようにカルボニル、又はジフェニルエーテルにおけるように酸素、又はジフェニルアミンにおけるように窒素でありうる。「アリール」という用語は、特に複素環式芳香族化合物を包含する。芳香環は、とりわけ、フェニル、ナフチル、ビフェニル、ジフェニルエーテル、ジフェニルアミン及びベンゾフェノンを含みうる。特定の実施態様では、「アリール」という用語は、約５から約１０個の炭素原子、例えば、５、６、７、８、９、又は１０個の炭素原子を含み、５員及び６員の炭化水素及び複素環式芳香環を含む環状芳香族を意味する。
アリール基は、同じ又は異なっていてもよい一又は複数のアリール基置換基で任意選択的に置換されていてもよく（「置換アリール」）、ここで、「アリール基置換基」には、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アリールオキシル、アラルキルオキシル、カルボキシル、アシル、ハロ、ニトロ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アラルコキシカルボニル、アシルオキシル、アシルアミノ、アロイルアミノ、カルバモイル、アルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、アリールチオ、アルキルチオ、アルキレン、及び－ＮＲ’Ｒ”（式中、Ｒ’及びＲ”は、それぞれ独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、及びアラルキルでありうる）が含まれる。
従って、ここで使用される場合、「置換アリール」という用語は、アリール基の一又は複数の原子又は官能基が、例えば、アルキル、置換アルキル、ハロゲン、アリール、置換アリール、アルコキシル、ヒドロキシル、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、サルフェート、及びメルカプトを含む、別の原子又は官能基で置換されている、ここで定義されるアリール基を含む。
アリール基の特定の例には、限定されないが、シクロペンタジエニル、フェニル、フラン、チオフェン、ピロール、ピラン、ピリジン、イミダゾール、ベンズイミダゾール、イソチアゾール、イソオキサゾール、ピラゾール、ピラジン、トリアジン、ピリミジン、キノリン、イソキノリン、インドール、カルバゾール等が含まれる。
ここで使用される「ヘテロアリール」は、環構造の主鎖に一又は複数の非炭素原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｅなど）を含むアリール基を指す。窒素含有ヘテロアリール部分には、限定されないが、ピリジン、イミダゾール、ベンズイミダゾール、ピラゾール、ピラジン、トリアジン、ピリミジンなどが含まれる。
「アラルキル」は、－アルキル－アリール基を指し、任意選択的にアルキル及び／又はアリール部分は置換される。例示的なアラルキル基は、ベンジル、すなわち－ＣＨ２Ｃ６Ｈ５である。
「アルキレン」は、１から約２０個の炭素原子、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個の炭素原子を有する直鎖又は分岐の二価脂肪族炭化水素基を指す。アルキレン基は、直鎖、分岐又は環状でありうる。アルキレン基はまた、任意選択的に不飽和であり、及び／又は一又は複数の「アルキル基置換基」で置換されうる。アルキレン基に沿って、一又は複数の酸素、硫黄、又は置換若しくは非置換の窒素原子（ここでは「アルキルアミノアルキル」とも呼ばれる）を任意選択的に挿入することができ、窒素置換基は既述のようにアルキルである。例示的なアルキレン基には、メチレン（－ＣＨ２－）；エチレン（－ＣＨ２－ＣＨ２－）；プロピレン（－（ＣＨ２）３－）；シクロヘキシレン（－Ｃ６Ｈ１０－）；－ＣＨ＝ＣＨ－ＣＨ＝ＣＨ－；－ＣＨ＝ＣＨ－ＣＨ２－；－（ＣＨ２）ｑ－Ｎ（Ｒ）－（ＣＨ２）ｒ－（式中、ｑ及びｒのそれぞれは独立して０から約２０までの整数、例えば０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０であり、Ｒは水素又は低級アルキルである）；メチレンジオキシル（－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－）；及びエチレンジオキシル（－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－）が含まれる。アルキレン基は、約２から約３個の炭素原子を有することができ、更に６～２０個の炭素を有することができる。
「アリーレン」という用語は、二価の芳香族基、例えば、二価のフェニル基又はナフチル基を指す。アリーレン基は、任意選択的に、一又は複数のアリール基置換基で置換され、及び／又は一又は複数のヘテロ原子を含みうる。
「アミノ」という用語は、基－Ｎ（Ｒ）２（式中、各Ｒは、独立して、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、又は置換アラルキルである）を指す。「アミノアルキル」及び「アルキルアミノ」という用語は、基－Ｎ（Ｒ）２（式中、それぞれのＲはＨ、アルキル又は置換アルキルであり、少なくとも一つのＲがアルキル又は置換アルキルである）を指す。「アリールアミン」及び「アミノアリール」は、基－Ｎ（Ｒ）２｛上式中、各ＲはＨ、アリール、又は置換アリールであり、少なくとも一つのＲはアリール又は置換アリール、例えばアニリン（すなわち、－ＮＨＣ６Ｈ５）である｝を指す。
「チオアルキル」という用語は、基－ＳＲ（式中、ＲはＨ、アルキル、置換アルキル、アラルキル、置換アラルキル、アリール、及び置換アリールから選択される）を指しうる。同様に、「チオアラルキル」及び「チオアリール」という用語は、Ｒがそれぞれアラルキル及びアリールである－ＳＲ基を指す。
ここで使用される「ハロ」、「ハライド」、又は「ハロゲン」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨード基を指す。
「ヒドロキシル」及び「ヒドロキシ」という用語は、－ＯＨ基を指す。
「メルカプト」又は「チオール」という用語は、－ＳＨ基を指す。
「カルボキシレート」及び「カルボン酸」という用語は、それぞれ基－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－及び－Ｃ（＝Ｏ）ＯＨを指しうる。「カルボキシル」という用語は、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ基をまた指しうる。幾つかの実施態様では、「カルボキシレート」又は「カルボキシル」は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－又は－Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ基の何れかを指しうる。
「カーボネート」という用語は、－ＯＣ（＝Ｏ）－Ｏ－基を指す。
「カルバメート」という用語は、－ＮＲ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－基（式中、Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アラルキル、置換アラルキル、アリール又は置換アリールでありうる）を指す。
「オキシベンジルオキシ」という用語は、－Ｏ－ＣＨ２－Ｃ６Ｈ４－Ｏ－基、及び水素原子の一つがアルキル又はアリール基置換基によって置換されているその置換誘導体を指す。
「アセタール」という用語は、－Ｏ－Ｃ（Ｒ）２－Ｏ－（式中、各Ｒ基は独立してＨ又はアルキル基置換基、例えば、アルキル又はアリールである）を含むか、又はこれからなる基を指す。幾つかの実施態様では、Ｒ基は、アルキレン又はアリーレン基でありうる。
ここで使用される「ホスホネート」という用語は、構造Ｒ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２（式中、Ｒは独立して、アルキル、置換アルキル、アラルキル、置換アラルキル、アリール、又は置換アリールでありうる）の化合物又は部分を指す。従って、ホスホネートは、炭素原子が－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２基のリン原子に結合している部分を指す。幾つかの実施態様では、水素原子の一方又は両方が存在せず、負電荷によって置き換えられる。
「ホスフェート」という用語は、構造－Ｏ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２又は－ＮＨ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２を含む化合物又は部分、すなわち、酸素原子又は窒素原子が、－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２基のリン原子に結合している化合物又は部分を指す。幾つかの実施態様では、ホスフェートは構造ＲＯ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２又はＲＮＨ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２を含み、ここでＲはアルキル、置換アルキル、アラルキル、置換アラルキル、アリール、又は置換アリールである。幾つかの実施態様では、ＯＨ水素原子の一方又は両方が存在せず、負電荷によって置き換えられる。
「親水性」という用語は、水及び／又は水溶液に溶解するか又は優先的に溶解する化合物又は化学種又は官能基を指しうる。
「疎水性」という用語は、水及び／又は水溶液に有意には溶解せず、及び／又は脂肪及び／又は非水溶液に優先的に溶解する化合物、化学種又は官能基を指す。
構造：
に示されている波線のような波線は、ここに記載の化学式において、特定の構造の別の化学基への、例えば、薬物化合物の一価誘導体又は脂質の一価誘導体への結合部位を示すために使用される。
化学式における結合を表す破線は、結合が存在する場合と存在しない場合があることを示している。例えば、化学構造：
は、一又は複数の結合が、５員環に結合して、及び／又はその一部として存在しうるか又は存在しない基を指す。例えば、任意選択的に１、２又は３個の二重結合を持つ６員環は、存在しても存在しなくてもよく、存在する場合、ｎ個の置換基Ｒ３によって置換される。破線で表される結合が存在しない場合、その基は構造：
を有し得、破線で表される全ての結合が存在する場合、その基は構造：
を有しうる。
ここで使用される「一価」という用語は、別の化学部分への化学結合に利用可能な一つの部位を有する化学部分を指す。従って、「一価部分」は、一価部分上の一つの部位での結合を介して分子全体の残りに結合している分子全体の一部でありうる。
ここで使用される「二価」という用語は、別の化学部分又は複数の化学部分への化学結合に利用可能な二つの部位を有する化学部分を指す。
ここで使用される「コンジュゲート（複合体）」及び「コンジュゲート（結合）された」は、二つ以上の成分（例えば、化合物、ポリマー、生体分子、粒子など）の相互の結合（例えば、共有結合）を指しうる。幾つかの実施態様では、コンジュゲートは、二価リンカー部分（例えば、任意選択的に置換されたアルキレン又はアリーレン）を介して共有結合した二つの異なる化合物に由来する一価部分を含みうる。幾つかの実施態様では、リンカーは、プロドラッグが特定の生理学的環境又は酵素に曝露されたときにリンカー中の一又は複数の結合が破壊されうるように、一又は複数の生分解性結合を含みうる。
ここで使用される「プロドラッグ」という用語は、対象又はサンプルへの投与時に、所望の生物学的活性（例えば、抗がん作用）を有する別の化合物（すなわち、「親化合物」）を（直接的又は間接的に）提供することができる化合物を指しうる。全てではないが幾つかの実施態様では、プロドラッグ化合物は、親化合物よりも所望の生物学的活性が少ない。幾つかの実施態様では、プロドラッグ化合物は、親化合物への変換前に測定可能な生物学的活性を有していない。幾つかの実施態様では、プロドラッグ自体が所望の活性を有する。
プロドラッグの親化合物への変換は、特定の酵素（例えば、エステラーゼ）の存在下及び／又は特定の生物学的条件下（例えば、生理学的に適切なｐＨ又は生理学的環境に存在する還元剤の存在下）で起こりうる。幾つかの実施態様では、プロドラッグは、最初に別のプロドラッグに変換され、その後、（時には、かなりゆっくりと）親化合物に変換される。プロドラッグは、親化合物と比較して、バイオアベイラビリティの増加及び／又は生物学的コンパートメント（例えば、がん細胞、リソソーム、脳又はリンパ系など）への送達の増強をもたらしうる。幾つかの実施態様では、プロドラッグは、目的の特定の担体における薬物の溶解度を高めることができ、及び／又は親化合物よりも特定の送達プラットフォーム又は製剤とより適合性がありうる。
「結合」又は「結合した」という用語及びその変形は、共有結合、配位結合、又は非共有結合の何れかを指しうる。ある場合には、「結合」という用語は、配位結合を介した結合を指す。幾つかの実施態様では、「結合」という用語は、共有結合を指す。「コンジュゲーション」という用語は、共有結合又は配位結合の形成などの結合プロセスを指しうる。
ここで使用される場合、「金属有機構造体」という用語は、金属成分と有機成分の両方を含む固体の二次元又は三次元ネットワークを指し、有機成分は、少なくとも一つ、典型的には一を超える炭素原子を含む。幾つかの実施態様では、材料は結晶性である。幾つかの実施態様では、材料は非晶質である。幾つかの実施態様では、材料は多孔性である。幾つかの実施態様では、金属有機マトリックス材料は配位ポリマーであり、これは、金属イオン又は金属錯体などの金属ベースの二次構築単位（ＳＢＵ）と、架橋多座（例えば、二座又は三座）有機配位子を含む配位錯体の繰り返し単位を含む。従って、幾つかの実施態様では、材料は、一を超えるタイプのＳＢＵ又は金属イオンを含む。幾つかの実施態様では、材料は、一を超えるタイプの有機架橋配位子を含みうる。
「ナノスケール金属有機構造体」という用語は、ＭＯＦを含むナノスケール粒子を指しうる。
「配位錯体」は、金属イオンと電子対供与体、配位子、又はキレート基との間に配位結合がある化合物である。従って、配位子又はキレート基は、一般に、金属イオンへの供与に利用可能な非共有電子対を有する電子対供与体、分子又は分子イオンである。
「配位結合」という用語は、電子対供与体と金属イオン上の配位部位との間の相互作用により、電子対供与体と金属イオンとの間に引力が生じることを指す。この用語の使用は、所定の配位結合が、金属イオン及び電子対供与体の特性に応じて、（完全に共有結合の性質ではないとしても）多かれ少なかれ共有結合の性質を有しているものとして分類することもできるため、限定することを意図するものではない。
ここで使用される場合、「配位子」という用語は、一般に、何らかの方法で別の種と相互作用、例えば結合する、分子又はイオンなどの種を指す。より特定的には、ここで使用される場合、「配位子」は、溶液中の金属イオンに結合して「配位錯体」を形成する分子又はイオンを指しうる。その全体が出典明示によりここに援用される、Ｍａｒｔｅｌｌ，Ａ．Ｅ．及びＨａｎｃｏｃｋ，Ｒ．Ｄ．，Ｍｅｔａｌ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｉｎ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９６）を参照のこと。「配位子」及び「キレート基」という用語は、互換的に使用されうる。「架橋配位子」という用語は、一を超える金属イオン又は錯体に結合して、金属イオン又は錯体間に「架橋」を提供する基を指しうる。有機架橋配位子は、例えば、アルキレン又はアリーレン基によって分離された非共有電子対を有する二つ以上の基を有しうる。非共有電子対を持つ基には、限定されないが、－ＣＯ２Ｈ、－ＮＯ２、アミノ、ヒドロキシル、チオ、チオアルキル、－Ｂ（ＯＨ）２、－ＳＯ３Ｈ、ＰＯ３Ｈ、ホスホネート、及び複素環中のヘテロ原子（例えば、窒素、酸素、又は硫黄）が含まれる。「配位子」という用語はまた、例えば抗体とその標的抗原など、別のものに優先的に結合する生物学的に関連する分子又は巨大分子；生物学的受容体及びそれに優先的に結合する分子などを指しうる。
配位子、例えば架橋配位子に関してここで使用される場合、「配位部位」という用語は、非共有電子対、負電荷、又は（例えば、特定のｐＨでの脱プロトン化により）非共有電子対若しくは負電荷を形成することができる原子若しくは官能基を指す。
「ナノスケール粒子」、「ナノ材料」、及び「ナノ粒子」という用語は、約１０００ｎｍ未満の寸法（例えば、長さ、幅、直径など）を有する少なくとも一領域を有する構造を指す。幾つかの実施態様では、寸法はより小さい（例えば、約５００ｎｍ未満、約２５０ｎｍ未満、約２００ｎｍ未満、約１５０ｎｍ未満、約１２５ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約８０ｎｍ未満、約７０ｎｍ未満、約６０ｎｍ未満、約５０ｎｍ未満、約４０ｎｍ未満、約３０ｎｍ未満、又は更には約２０ｎｍ未満である）。幾つかの実施態様では、寸法は、約２０ｎｍから約２５０ｎｍの間（例えば、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、又は２５０ｎｍ）である。
幾つかの実施態様では、ナノ粒子はほぼ球状である。ナノ粒子がほぼ球状である場合、特性寸法は球の直径に対応しうる。球形に加えて、ナノ材料は、ディスク形、プレート形（例えば、六角形プレート様）、長方形、多面体、ロッド形、立方体、又は不規則な形状でありうる。
ナノ粒子は、コア領域（すなわち、粒子の外側寸法間の空間）と外表面（すなわち、粒子の外側寸法を規定する表面）を含みうる。幾つかの実施態様では、ナノ粒子は、ナノ粒子コアを取り囲むか又は部分的に取り囲む一又は複数のコーティング層を有しうる。従って、例えば、球状ナノ粒子は、一又は複数の同心コーティング層を有し得、各連続層は、粒子の中心により近いより小さい層の外表面上に分散される。そのようなナノ粒子は、「コアシェル」ナノ粒子と呼ぶことができ、ここでシェルは一又は複数のコーティング層を指す。
「ナノスケール配位ポリマー」又はＮＣＰという用語は、配位ポリマー、任意選択的に金属－ホスフェート配位ポリマー、すなわち、金属イオンとモノ－又はビス－ホスフェート配位子との間の配位錯体の繰り返し単位を含むポリマーを含むナノスケール粒子を指しうる。
幾つかの実施態様では、本開示のナノ粒子は、架橋配位子によって一緒に連結されたＳＢＵの二次元又は三次元ネットワークである固体金属有機構造体（ＭＯＦ）マトリックスを含みうる。ＭＯＦは、一又は複数の細孔又は中空の内部領域を含みうる。ＭＯＦマトリックスは、非晶質又は結晶質でありうる。幾つかの実施態様では、ナノ粒子コアは、一又は複数のＰＳ、Ｘ線吸収剤、シンチレーション剤、及び／又は他の治療剤（例えば、抗がん剤又は免疫療法剤）を更に含み、これらはマトリックス内に物理的に捕捉され、マトリックスの金属イオンに配位され、又は共有結合又はイオン結合を介して（例えば、マトリックス中の有機架橋配位子又はナノ粒子コア上に分散した層中の化合物に）化学的に結合されうる。幾つかの実施態様では、光増感剤又はその誘導体は、有機架橋配位子であるか、又はナノ粒子のコアを形成する有機金属マトリックス材料内の有機架橋配位子に結合される一方、ＳＢＵの金属はシンチレーターとして作用する。あるいは、シンチレーター、Ｘ線吸収剤及び／又はＰＳは、ＭＯＦ内に取り込まれるか、又はＭＯＦに共有結合されうる。
「包埋された」は、粒子のコアの内側で（例えば、架橋配位子の配位部位又はＳＢＵの金属イオンに）結合され、例えば、共有的に結合され又は配位結合を介して結合された薬剤を指しうる。あるいは、薬剤は、ＭＯＦ粒子のコアの細孔、空洞、又はチャネル内に「隔離」、「封入」、又は「捕捉」（すなわち、非共有的にカプセル化）されるか、水素結合、ロンドン分散力、又は任意の他の非共有相互作用を介してＭＯＦ材料と相互作用しうる。
ここで使用される「小分子」という用語は、非ポリマーの天然に存在する分子又は合成分子を指しうる。小分子は、典型的には、約９００ダルトン（Ｄａ）以下（例えば、約８００Ｄａ、約７５０Ｄａ、約７００Ｄａ、約６５０Ｄａ、約６００Ｄａ、約５５０Ｄａ、又は約５００Ｄａ以下）の分子量を有する。
ここで使用される「巨大分子」という用語は、約９００Ｄａより大きい分子を指す。幾つかの実施態様では、巨大分子は、ポリマー又はバイオポリマー、例えば、タンパク質又は核酸である。
「ポリマー」及び「ポリマーの」という用語は、反復単位を有する化学構造（すなわち、所与の化学的部分構造の複数のコピー）を指す。ポリマーは、重合性モノマーから形成することができる。重合性モノマーは、反応して重合性モノマーの他の分子上の部分と結合（例えば、共有結合又は配位結合）を形成することができる一又は複数の部分を含む分子である。幾つかの実施態様では、各重合性モノマー分子は、二つ以上の他の分子／部分に結合しうる。場合によっては、重合性モノマーは一つの他の分子のみに結合し、ポリマー材料の末端を形成する。
ポリマーは、有機、又は無機、又はそれらの組み合わせでありうる。ここで使用される場合、「無機」という用語は、炭素、水素、窒素、酸素、硫黄、リン、又はハロゲン化物の一つ以外の少なくとも幾つかの原子を含む化合物又は組成物を指す。従って、例えば、無機化合物又は組成物は、一又は複数のケイ素原子及び／又は一又は複数の金属原子を含みうる。
ここで使用される場合、「有機ポリマー」は、その繰り返し単位にシリカ又は金属原子を含まないものである。例示的な有機ポリマーには、ポリビニルピロリドン（ＰＶＯ）、ポリエステル、ポリアミド、ポリエーテル、ポリジエンなどが含まれる。一部の有機ポリマーは、エステル又はアミドなどの生分解性結合を含むため、生物学的条件下で経時的に分解しうる。
ここで使用される「親水性ポリマー」という用語は、一般に親水性有機ポリマー、例えば限定されないが、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシ－プロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシルプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシ－エチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレン－イミン（ＰＥＩ）、ポリエチレングリコール（すなわち、ＰＥＧ）又は別の親水性ポリ（アルキレンオキシド）、ポリグリセリン、及びポリアスパルトアミドを指す。上述のように、「親水性」という用語は、分子又は化学種が水と相互作用する能力を指す。従って、親水性ポリマーは典型的には極性であるか、水に水素結合できる基を有している。
「造影剤（imaging agent）」という用語は、サンプルの視覚化を助ける化学部分を指す。例えば、造影剤は「造影剤（contrast agent）」であり得、検査される生物組織又は構造のコントラストを高める部分（分子、高分子、配位錯体、又はナノ粒子の特定の部分又は全体）を指す場合がある。造影剤は、例えば、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、光学画像法、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）画像法、単一光子放出コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）画像法、又はそれらの組み合わせを使用して、検査されている構造のコントラストを高めうる（すなわち、造影剤はマルチモーダルでありうる）。
「ＭＲＩ造影剤」という用語は、サンプル中の水プロトンの誘導緩和速度に変化をもたらす部分を指す。
「光学造影剤（optical imaging agent）」又は「光学造影剤（optical contrast agent）」という用語は、光（例えば、紫外光、可視光、又は赤外光）を吸収、反射、又は放出する能力に基づいて検出できる基を指す。光学造影剤は、吸光度、反射率、又は蛍光の量の変化、又は吸光度ピークの数若しくはそれらの最大波長に基づいて検出できる。従って、光学造影剤には、有機及び無機染料を含む、蛍光又はルミネセンスに基づいて検出できるものが含まれる。
「フルオロフォア」及び「蛍光部分」という用語は、可視光又は非可視光（例えば、ＵＶ光）によって励起されうる種を指す。フルオロフォアの例には、限定されないが、量子ドット及びドープ量子ドット（例えば、半導体ＣｄＳｅ量子ドット又はＭｎドープＣｄＳｅ量子ドット）、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体及び類似体、インドシアニングリーン、ローダミン、トリフェニルメチン、ポリメチン、シアニン、ファロシアニン、ナフトシアニン、メロシアニン、ランタニド錯体又はクリプテート、フラーレン、オキサテルラゾール、ラホヤブルー、ポルフィリン及びポルフィリン類似体、並びに天然の発色団／フルオロフォア、例えばクロロフィル、カロテノイド、フラボノイド、ビリン、フィトクロム、フィコビリン、フィコエリトリン、フィコシアニン、レチノイン酸、及びレチノイン及びレチネートなどの類似体が含まれる。
「光増感剤」（ＰＳ）という用語は、特定の波長の光、典型的には可視光又は近赤外（ＮＩＲ）光によって励起され、活性酸素種（ＲＯＳ）を生成する化合物又は部分を指す。例えば、その励起状態では、光増感剤は項間交差を起こし、（例えば、ＰＤＴで処置されている組織内で）エネルギーを酸素（Ｏ２）に移動させて、一重項酸素（１Ｏ２）などのＲＯＳを生成することができる。本開示の主題に従って、任意の既知のタイプの光増感剤を使用することができる。幾つかの実施態様では、光増感剤は、ポルフィリン、クロロフィル、色素、又はその誘導体若しくは類似体である。幾つかの実施態様では、フォフィリン（phophyrins）、クロリン、バクテリオクロリン、又はポルフィセンを使用することができる。幾つかの実施態様では、光増感剤は、例えば、有機架橋配位子又はＳＢＵなどの別の分子又は部分に光増感剤を結合させる際に使用するために、及び又は配位を増強する又は追加の金属又は複数の金属を配位させるために追加の部位又は複数の部位を提供するために、カルボン酸、アミン、又はイソチオシアネートなどの一又は複数の官能基を有しうる。幾つかの実施態様では、光増感剤は、ポルフィリン又はその誘導体若しくは類似体である。例示的なポルフィリンには、限定されないが、ヘマトポルフィリン、プロトポルフィリン、及びテトラフェニルポルフィリン（ＴＰＰ）が含まれる。例示的なポルフィリン誘導体には、限定されないが、ピロフェオホルバイド、バクテリオクロロフィル、クロロフィルａ、ベンゾポルフィリン誘導体、テトラヒドロキシフェニルクロリン、プルプリン、ベンゾクロリン、ナフトクロリン、ベルジン、ロジン、オキソクロリン、アザクロリン、バクテリオクロリン、トリポルフィリン及びベンゾバクテリオクロリンが含まれる。ポルフィリン類似体には、限定されないが、拡張ポルフィリンファミリーメンバー（テキサフィリン、サフィリン、及びヘキサフィリンなど）、ポルフィリン異性体（ポルフィセン、反転ポルフィリン、フタロシアニン、及びナフタロシアニンなど）、及び一又は複数の官能基で置換されたＴＰＰが含まれる。
「ピロリピド」という用語は、脂質とポルフィリン、ポルフィリン誘導体、又はポルフィリン類似体とのコンジュゲートを指す。幾つかの実施態様では、ピロリピドは、ポルフィリン又はその誘導体若しくは類似体が脂質側鎖に共有結合している脂質コンジュゲートを含みうる。ピロリピドとピロリピド合成は、例えば、その全体が出典明示によりここに援用される米国特許出願公開第２０１４／０１２７７６３号に記載されている。
「リゾ脂質」という用語は、一又は複数のアシル基が除去された脂質を指す。
ここで使用される「がん」という用語は、制御されない細胞分裂及び／又は細胞が転移するか、若しくは追加の部位で新たな成長を確立する能力によって引き起こされる疾患を指す。「悪性」、「悪性腫瘍」、「新生物」、「腫瘍」、「がん」という用語及びそれらの変形は、がん細胞又はがん細胞群を指す。
がんの特定のタイプには、限定されないが、皮膚がん（例えば、メラノーマ）、結合組織がん（例えば、肉腫）、脂肪がん、乳がん、頭頸部がん、肺がん（例えば、中皮腫）、胃がん、膵臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮がん、肛門性器がん（例えば、精巣がん）、腎臓がん、膀胱がん、結腸直腸がん（例えば、結腸がん、結腸直腸腺癌等々）、前立腺がん、中枢神経系（ＣＮＳ）がん、網膜がん、血液、神経芽細胞腫、多発性骨髄腫、及びリンパ系がん（例えば、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫）が含まれる。
「転移性がん」という用語は、患者の体内のその最初の部位（すなわち、原発部位）から広がったがんを指す。
「抗がん剤」、「化学療法剤」、及び「抗がんプロドラッグ」という用語は、がんを治療できる（すなわち、がん細胞を死滅させ、がん細胞の増殖を阻害し、又はがんに関連する症状を治療する）ことが知られているか又は思われる薬物（すなわち、化合物）又はプロドラッグを指す。幾つかの実施態様では、ここで使用される「化学療法剤」という用語は、合成又は天然に存在する小分子（例えば、１５００ダルトン（Ｄａ）未満、１２５０Ｄａ未満、１０００Ｄａ未満、９００Ｄａ未満、８００Ｄａ未満、又は７５０Ｄａ未満、７００Ｄａ未満、６５０Ｄａ未満、６００Ｄａ未満など）、又はがんを治療するために使用され、及び／又は細胞傷害能を有するその誘導体を指す。幾つかの実施態様では、「化学療法剤」という用語は、白金配位錯体を指す。そのようなより伝統的な又は一般的な化学療法剤は、作用機序又は化合物クラスによって記述することができ、限定されないが、アルキル化剤（例えば、メルファラン）、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン）、細胞骨格破壊剤（例えば、パクリタキセル）、エポチロン、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（例えば、ボリノスタット）、トポイソメラーゼＩ又はＩＩの阻害剤（例えば、イリノテカン又はエトポシド）、キナーゼ阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）、そのヌクレオチド類似体又は前駆体（例えば、メトトレキサート）、ペプチド抗生物質（例えば、ブレオマイシン）、白金ベースの薬剤（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、又はカルボプラチンなどの白金配位錯体）、レチノイド（例えば、トレチノイン）、及びビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン）が含まれうる。幾つかの実施態様では、「化学療法剤」という用語は、ホルモン又はポリペプチド化学療法剤を指す。
「シンチレーター」という用語は、Ｘ線などの電離放射線によって励起されるときにルミネセンスを示す（例えば、可視又はＮＩＲ範囲の光などの光を発する）部分又は化合物を指す。
ここでの意味における「治療する（処置する）」又は「治療（処置）」は、障害又は疾患に関連する症状の緩和、又はそれらの症状の更なる進行又は悪化の阻害、或いは疾患又は障害の防止又は予防、又は疾患又は障害の治癒を指す。同様に、ここで使用される場合、本開示の主題の化合物の「有効量」又は「治療有効量」は、障害又は状態に関連する症状を全体的又は部分的に軽減し、又はそれらの症状の更なる進行又は悪化を停止させ又は遅延させるか、又は障害又は状態を防止し又はその予防を提供する化合物の量を指す。特に、「治療有効量」とは、所望の治療結果を達成するのに必要な投与量及び期間で有効な量を指す。治療有効量はまた本発明の化合物の任意の毒性又は有害な効果を、治療的に有益な効果が上回る量である。
ＩＩ．一般的な考慮事項
本開示の主題は、幾つかの態様では、脂質ベースのプロドラッグの設計、及びプロドラッグの送達のためのナノ粒子（例えば、コアシェルナノスケール配位ポリマー（ＮＣＰ）又は他のナノスケール金属有機構造体（ＭＯＦ））に関する。幾つかの実施態様では、ナノ粒子は、親水性及び疎水性薬物の組み合わせなどの薬物の組み合わせの共送達に使用することができる。シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、及びゲムシタビンなどの親水性薬物、及び／又はそれらのプロドラッグをＮＣＰ粒子のコア内に取り込むことができる。例えば、金属配位錯体シスプラチン、カルボプラチン及びオキサリプラチンのビスホスフェートを調製し、金属イオンと共重合させて、ナノ粒子コアを形成することができる金属ビスホスフェート配位ポリマーを含むＮＣＰを提供することができ、又は（例えば、金属イオンと非治療用ホスホネートの共重合を介して）ＮＣＰ粒子を調製するために使用される溶液中に親水性薬物を含めることができ、それにより親水性薬物がＮＣＰコア内に包埋される（例えば、ＮＣＰコアの細孔内に物理的に捕捉される）。
本開示の主題の脂質ベースのプロドラッグは、疎水性薬物（例えば、疎水性化学療法剤）のプロドラッグでありうる。これらのプロドラッグは、切断可能なカーボネート又はカルバメート結合を含むように合成されうる。例えば、切断可能な結合は、アセタール基の酸素原子の一つがカーボネート又はカルバメート結合の一部でもある（すなわち、カーボネート又はカルバメート基の炭素原子に直接結合されている）アセタール基を含みうる。プロドラッグは、オキシベンジルオキシ基を使用して調製することもでき、そこでは、ベンジル炭素原子に直接結合された酸素が、カーボネート又はカルバメート基の炭素原子にまた直接結合される。これらのプロドラッグは、がん細胞の酸性環境、並びにエステラーゼに感受性であり得、がん細胞内での薬物部分の放出が促進される。
本開示の主題の幾つかの態様によれば、親水性及び疎水性薬物のプロドラッグがコアシェルＮＣＰ中に自己集合して、各薬物の徐放及び誘発放出を可能にする。これらのナノ粒子は、早期の分解を防ぎながら、各薬物の薬力学的プロファイルを改善し、がん細胞への薬物曝露を増加させることができる。腫瘍における活性薬物の蓄積の同時の増加及び維持と共に血液、脾臓、及び肝臓での制限された遊離薬物の曝露と代謝が、優れた抗がん効果をもたらしうる。幾つかの実施態様では、脂質ベースのプロドラッグは低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬ）を標的とすることができ、及び／又はナノ粒子はアポリタンパク質Ｂ－１００（ＡｐｏＢ－１００）を吸着することができ、ナノ粒子及びそれに付随する任意のプロドラッグのがん細胞への送達を増強して、がん細胞薬物曝露を増加させる。
オキサリプラチン（ＯｘＰｔ）、パクリタキセル（ＰＴＸ）、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ジヒドロアルテミシニン、及びミトキサントロンを含む幾つかの小分子化学療法剤は、免疫原性細胞死を効率的に引き起こしうる。これらの化学療法剤は免疫刺激性でありうる。幾つかの実施態様では、これらのＮＣＰ粒子の併用化学療法レジメンは、免疫チェックポイント阻害剤などの免疫療法と相乗効果を発揮しうる。例えば、本開示のコアシェルＮＣＰと免疫チェックポイント阻害剤の組み合わせは、腫瘍の微小環境を活性化して全身の抗腫瘍免疫応答を誘発し、抗がん効果を更に高めうる。
従って、幾つかの実施態様では、本開示の主題は、式Ｄ－ＢＬ－Ｌ（式中、Ｂは一価薬物部分であり、ＢＬは二価リンカーであり、Ｌは一価脂質部分である）の構造を含むプロドラッグを提供する。Ｄは、ヒドロキシル又はアミノ基を含む任意の目的の薬物の一価誘導体でありうる。脱プロトン化ヒドロキシル基の酸素原子又は脱プロトン化アミノ基の窒素原子は、カーボネート（すなわち、－ＯＣ（＝Ｏ）－Ｏ－）又はカルバメート（すなわち、－ＮＲ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－）（式中、ＲはＨ又はアルキル、アラルキル又はアリール基である）結合の原子として作用しうる。幾つかの実施態様では、ＢＬはジスルフィド結合を含まない。幾つかの実施態様では、プロドラッグはジスルフィド結合を含まない。
幾つかの実施態様では、Ｄは、抗がん剤（例えば、抗がん小分子又はポリペプチド）の一価誘導体である。幾つかの実施態様では、Ｄは、疎水性薬物（例えば、疎水性抗がん剤）の一価部分である。幾つかの実施態様では、Ｄは、限定されないが、エトポシド（ＥＴ）、ポドフィロトキシン（ＰＰＸ）、パクリタキセル（ＰＴＸ）、ドセタキセル（ＤＴＸ）、ジヒドロアルテミシン（ＤＨＡ）、カンプトテシン（ＣＰＴ）、７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ３８）、トポテカン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ビンクリスチン、ミトキサントロン、アルテスネート、カペシタビン、オクトレオチド、ロイプロリド、及びゴセレリンを含む群から選択される薬物化合物の一価誘導体である。
ＢＬは、Ｄがカーボネート又はカルバメート基を介してＢＬに直接結合されている二価リンカーであり、ＢＬは、アセタール基及び置換オキシベンジルオキシ基のうちの少なくとも一つを含み、アセタール基の酸素原子又はオキシベンジルオキシ基のベンジル酸素原子は、カーボネート又はカルバメート基（任意選択的に、薬物部分に直接結合されているカーボネート又はカルバメート基）の炭素原子に直接結合されている。幾つかの実施態様では、アセタール基は、式：
｛上式中、破線で表される結合は、存在してもしなくてもよく、ｎは０と４の間の整数であり；Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アラルキル、置換アラルキル、アリール、及び置換アリールを含む群から独立して選択され、各Ｒ３は、例えば、アルキル、置換アルキル、アラルキル、置換アラルキル、アリール、置換アリール、ハロ（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、又はＦ）、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシ、アシル、カルボキシレート、ホスフェート、ニトロ、－Ｎ３、Ｂ（ＯＨ）２、及びシアノから独立して選択される、アリール基置換基であり；アセタール基の酸素原子の少なくとも一つは、カーボネート又はカルバメート基の炭素原子に直接結合されている｝の一つの構造を有する。
幾つかの実施態様では、ＢＬは、（例えば、カーボネート又はカルバメート基に直接結合されていないアセタール基の酸素原子に直接結合されているか、又はフェニル環に結合しているオキシベンジルオキシ基の酸素原子に直接結合されている）一又は複数の追加のアルキレン又はアリーレン部分を更に含む。例えば、追加のアルキレン基は、構造－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ）ｍ－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－｛式中、ｍは１と１２の間の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２）である｝を有しうる。幾つかの実施態様では、ＢＬは、アセタール基とオキシベンジルオキシ基の両方を含む。幾つかの実施態様では、プロドラッグは、一を超える一価薬物部分Ｄを含むことができ、各薬物部分Ｄは、カルバメート又はカーボネート結合を介してＢＬに結合している。例えば、幾つかの実施態様では、プロドラッグは、同じ又は異なっていてもよい二つ又は三つの薬物部分Ｄを含みうる。
幾つかの実施態様では、アセタール基は、構造：
｛上式中、ｎは０と４の間の整数（すなわち、０、１、２、３、又は４）であり；Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アラルキル、置換アラルキル、アリール、及び置換アリールを含む群から独立して選択され、各Ｒ３は、例えば、アルキル、置換アルキル、アラルキル、置換アラルキル、アリール、置換アリール、ハロ（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、又はＦ）、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシ、アシル、カルボキシレート、ホスフェート、ニトロ、－Ｎ３、Ｂ（ＯＨ）２、又はシアノから独立して選択される、アリール基置換基であり；アセタール基の酸素原子の少なくとも一つは、カーボネート又はカルバメート基の炭素原子に直接結合されている｝を有する。幾つかの実施態様では、ｎは０であり、アセタール基は、式：
の構造を有する。
幾つかの実施態様では、置換オキシベンジルオキシ基は、式：
（上式中、Ｒ’はアリール基置換基であり、オキシベンジルオキシ基のベンジル炭素に結合した酸素原子は、カーボネート又はカルバメート基の炭素原子に直接結合されている）の構造を有する。幾つかの実施態様では、Ｒ’は、ニトロ、－Ｎ３、及び－Ｂ（ＯＨ）２を含む群から選択される。
幾つかの実施態様では、Ｌは、コレステロール、オレイン酸、リゾ脂質、又はホスホコリンの一価誘導体である。
幾つかの実施態様では、プロドラッグは、図３５Ａに示される構造を含む。幾つかの実施態様では、プロドラッグは、式：
｛上式中、Ｄは一価の薬物部分（例えば、図３５Ｂに示される一価の化学療法剤部分などの一価の化学療法剤部分）であり、Ｌは一価脂質部分（例えば、図３５Ｂに示される一価のコレステロール部分）である｝の一つの構造を含む。
図１は、カーボネート結合に直接結合されたアセタール基を含む本開示の主題のプロドラッグへの例示的な合成経路を示す。図１は、ＳＮ３８のコレステロールベースのプロドラッグの合成をより具体的に示しているが、コレステロール及び／又はＳＮ３８の代わりに、他の脂質及び／又は薬物を使用することができる。以下のスキーム１の合成経路１をまた参照のこと。一般に、ヒドロキシル基を有する脂質を、非プロトン性溶媒中で、トリアルキルアミン（例えば、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ））などの立体障害塩基、及びジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）などの求核触媒の存在下で、無水コハク酸と反応させ、アルキレン基が末端カルボン酸部分で終わる、アルキレン基へのエステル結合を有する脂質部分を提供することができる。異なるアルキレン長が望まれる場合、無水コハク酸を別の無水物又はジカルボン酸で置き換えることができる。あるいは、無水コハク酸は、更なる工程でカルボン酸部分に変換することができる適切な化学官能基を有するカルボン酸で置き換えることができる。例えば、カルボン酸と保護末端ヒドロキシル基を連結するアルキレン部分を有するカルボン酸の保護末端ヒドロキシル基を脱保護し、オキシダントと反応させてカルボン酸を得ることができる。
何れにせよ、脂質に新たに付加された部分の末端カルボン酸基を、その後、炭酸ハロメチル（４－ニトロフェニル）（例えば、炭酸ヨードメチル（４－ニトロフェニル））又は置換基（例えば、メチル又はフェニル）又はメチレン炭素原子に結合した置換基及び／又は４－ニトロフェニル基の代わりの異なる脱離基を含むその類似体と反応させることができる。例えば、メチレン炭素原子にメチル基が結合したアセタールを調製するには、クロロギ酸１－クロロエチルを、立体障害塩基の存在下で炭酸４－ニトロフェニルと反応させ、ついでＮａＩを使用し、例えば、より良いハライド脱離基を試薬に提供するために臭化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＢｒ）などの相間移動触媒を使用して、必要に応じて、対応するヨード化合物（すなわち、炭酸１－ヨードエチル（４－ニトロフェニル））に変換することができる。ついで、脂質と末端カルボン酸基と４－ニトロフェニル炭酸ハロメチルとの反応の炭酸４－ニトロフェニル生成物を、立体障害塩基（例えば、ＤＩＰＥＡ）の存在下でヒドロキシル又はアミノ基を含む薬物と反応させて、新しいカーボネート又はカルバメート結合を得ることができ、４－ニトロフェニル基が薬物部分に置き換えられる。
カルボン酸基を含む脂質を、４－ニトロフェニル炭酸ハロメチル（例えば、４－ニトロフェニル炭酸ヨードメチル）又はその類似体と直接反応させて、カーボネートに直接結合されたアセタール基を含む脂質－リンカー炭酸４－ニトロフェニル含有中間体を得ることができる。次に、この中間体を、アミノ又はヒドロキシル基を含む薬物と反応させて、新しいカーボネート又はカルバメート結合を得ることができ、４－ニトロフェニル基が薬物部分に置き換えられる。
（単独で、又はアセタール基と組み合わせて）オキシベンジルオキシ基を含むプロドラッグを、以下の実施例８に記載した経路を使用して調製することができる。以下のスキーム１の合成経路２をまた参照のこと。実施例８では４－ヒドロキシベンジルアルコールを使用して、脂質部分から調製された塩化アシル又は脂質－アセタール含有リンカー中間体の炭酸４－ニトロフェニルと反応させているが、４－ヒドロキシベンジルアルコールの置換類似体を使用して、アリール置換オキシベンジルオキシ基を有するリンカーを提供することもできる。
縮合環構造を含むアセタール基を有するプロドラッグを、以下のスキーム１の合成経路３に示されるようにして調製することができる。例えば、適切なベンゼンジカルボン酸を、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の存在下でカルボン酸を含む脂質部分と反応させて、縮合環系を更に含む中間体アルコールを提供することができる。次に、中間体アルコールを、クロロギ酸４－ニトロフェニルを使用して炭酸４－ニトロフェニルに変換し、炭酸４－ニトロフェニルを得ることができる。ついで、炭酸４－ニトロフェニルを薬物のヒドロキシル基と反応させて、カーボネート含有プロドラッグを得ることができる。あるいは、炭酸４－ニトロフェニルを薬物のアミノ基と反応させて、カルバメート含有プロドラッグを得ることができる。
幾つかの実施態様では、ＢＬは、式：
｛上式中、Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、アルキル（例えば、Ｃ１－Ｃ６アルキル）、置換アルキル、アラルキル（例えば、ベンジル）、置換アラルキル（例えば、置換ベンジル）、アリール（例えば、フェニル）、及び置換アリール（例えば、置換フェニル）を含む群から独立して選択される｝の構造を有するアセタール基を含む。幾つかの実施態様では、Ｒ１及びＲ２は同じである。幾つかの実施態様では、Ｒ１及びＲ２は異なる。幾つかの実施態様では、Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、メチル、及びフェニルを含む群から独立して選択される。幾つかの実施態様では、Ｒ１及びＲ２の少なくとも一方はＨである。幾つかの実施態様では、Ｒ１及びＲ２の両方がＨである。
幾つかの実施態様では、Ｌはオレイン酸部分であり、Ｌ及びＢＬは一緒に構造：
を有する。
幾つかの実施態様では、Ｌはコレステロール誘導体であり、Ｌ及びＢＬは一緒に構造：
を有する。
幾つかの実施態様では、プロドラッグは、図３３又は図３４に示されるプロドラッグの一つから選択されるプロドラッグである。幾つかの実施態様では、プロドラッグは、
を含む群から選択される。
幾つかの実施態様では、プロドラッグは（例えば、血漿中で）低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）に結合し、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）媒介エンドサイトーシスを介して腫瘍に能動的に輸送される。幾つかの実施態様では、プロドラッグはアルブミンと比較してＬＤＬに優先的に結合する。幾つかの実施態様では、プロドラッグは、アルブミンに対するプロドラッグのＫａの少なくとも約５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、又は７５０倍以上である結合定数ＫａをＬＤＬに対して有する。幾つかの実施態様では、プロドラッグは、アルブミンに対するプロドラッグのＫａの少なくとも約１０００倍であるＫａをＬＤＬに対して有する。幾つかの実施態様では、プロドラッグは、アルブミンに対するプロドラッグのＫａの少なくとも約２０００倍であるＫａをＬＤＬに対して有する。
幾つかの実施態様では、本開示の主題は、（ａ）金属有機マトリックス材料を含むコアと、（ｂ）コアの表面の少なくとも一部を覆うコーティング層とを含むナノ粒子を提供し、コーティング層は、脂質層又は脂質二重層を含み、前記脂質層又は脂質二重層は、ここに開示される式Ｄ－ＢＬ－Ｌのプロドラッグを更に含む。幾つかの実施態様では、金属有機マトリックス材料は、ナノスケール配位ポリマー（ＮＣＰ）を含む。幾つかの実施態様では、ＮＣＰは、多価金属イオンとビスホスフェート又はビスホスホネートを含む金属－ビスホスフェート又は金属－ビスホスホネート配位ポリマーを含む。幾つかの実施態様では、ＮＣＰは、多価金属イオンとビスホスフェートを含む金属－ビスホスフェート配位ポリマーを含む。幾つかの実施態様では、ＮＣＰコアは、約４０から約５０重量％のビスホスフェート（例えば、約４０、４２、４４、４６、４８、又は約５０重量％のビスホスフェート）を含む。幾つかの実施態様では、多価金属イオンは、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋及びそれらの組み合わせを含む群から選択されるイオンである。幾つかの実施態様では、多価金属イオンはＺｎ２＋である。
幾つかの実施態様では、ビスホスフェート又はビスホスホネートは、薬物又はプロドラッグを含むか又はそれらからなる。幾つかの実施態様では、ビスホスフェート又はビスホスホネートは、抗がん剤のプロドラッグである。幾つかの実施態様では、ビスホスフェート又はビスホスホネートは、シスプラチン、オキサリプラチン、又はカルボプラチンのプロドラッグである。幾つかの実施態様では、ビスホスフェート又はビスホスホネートは、ビスホスフェート又はビスホスホネートエステル、又はシス，シス－トランス－［Ｐｔ（ＮＨ３）２Ｃｌ２（ＯＨ）２］（すなわち、シスプラチンプロドラッグ）、シス，トランス－［Ｐｔ（ｄａｃｈ）（オキサレート）（ＯＨ）２］（すなわち、オキサリプラチンプロドラッグ）又は［Ｐｔ（シクロブテンジカルボン酸）（ＮＨ３）２（ＯＨ）２］（すなわち、カルボプラチンプロドラッグ）の他のプロドラッグである。幾つかの実施態様では、ビスホスフェートは、ホスホルアミド酸由来の配位子、例えば、シス，シス－トランス－［Ｐｔ（ＮＨ３）２Ｃｌ２（ＯＨ）２］、シス，トランス－［Ｐｔ（ｄａｃｈ）（オキサレート）（ＯＨ）２］、又は［Ｐｔ（シクロブタンジカルボン酸）（ＮＨ３）２（ＯＨ）２］などの白金配位錯体の２つのＯＨ配位子が構造－ＯＣ（＝Ｏ）－ＮＨ－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２を含む配位子によって置き換えられたビスホスフェートを含む。従って、幾つかの実施態様では、ナノ粒子は、配位結合を介してコアに結合した抗がん剤プロドラッグを含むコアを含む。ここで使用される場合、「ＯｘＰｔを含むコア」又は「カルボプラチンを含むコア」という語句は、ＯｘＰｔ又はカルボプラチンを送達できるコア、すなわち、ＯｘＰｔプロドラッグ又はカルボプラチンプロドラッグを含むナノ粒子コア、及び／又はＯｘＰｔ又はカルボプラチンを含むナノ粒子コアを指しうる。
幾つかの実施態様では、ナノ粒子コアは、包埋された抗がん剤を含む（例えば、ナノ粒子コアの細孔に物理的又は化学的に隔離されている）。幾つかの実施態様では、包埋された抗がん剤は、包埋された親水性抗がん剤である。一部では、包埋された抗がん剤はゲムシタビン（ＧＥＭ）又はゲムシタビンモノホスフェート（ＧＭＰ）である。幾つかの実施態様では、包埋された抗がん剤は、シタラビンモノホスフェート又はヒ酸である。
幾つかの実施態様では、ナノ粒子コアは、少なくとも二種の抗がん剤（例えば、二種、三種、四種、五種以上の抗がん剤）を含む。幾つかの実施態様では、少なくとも二種の抗がん剤は、第一の抗がん剤であって、シスプラチン、カルボプラチン又はオキサリプラチンプロドラッグである第一の抗がん剤と、第二の抗がん剤であって、包埋された親水性抗がん剤である第二の抗がん剤とを含む。幾つかの実施態様では、第一の抗がん剤は、シスプラチン、カルボプラチン又はオキサリプラチンビスホスフェートプロドラッグである。幾つかの実施態様では、第一の抗がん剤は、多価金属イオンと共重合して、ナノ粒子のコアの全部又は一部を形成するＮＣＰを形成する。
幾つかの実施態様では、ナノ粒子コアは、多価金属イオンとビスホスフェートを含む金属ビスホスフェート配位ポリマーを含み、前記ビスホスフェートは、構造Ｐｔ（ｄａｃｈ）（オキサレート）（ビスホスホラミド酸）を有するオキサリプラチンプロドラッグであり；コーティング層は、ＳＮ３８のプロドラッグ（例えば、ＳＮ３８のコレステロールプロドラッグ）を含む脂質二重層である。幾つかの実施態様では、ＳＮ３８のプロドラッグは構造：
を有する。
幾つかの実施態様では、多価金属イオンはＺｎ２＋である。幾つかの実施態様では、ナノ粒子コアは、（例えば、オキサリプラチンプロドラッグに加えて）第二の抗がん剤を更に含む。幾つかの実施態様では、ナノ粒子コアは、ナノ粒子コアに包埋されたＧＭＰを含む。
幾つかの実施態様では、コーティング層は、コレステロール、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスフェートナトリウム塩（ＤＯＰＡ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、及び１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）及び／又はそれらのペグ化誘導体（例えば、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）の一又は複数を更に含む。幾つかの実施態様では、コーティング層は、（脂質ベースのプロドラッグに加えて）、コレステロール、ＤＯＰＣ、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００の混合物を含む。
幾つかの実施態様では、コーティング層は、カチオン性脂質及び／又は官能化脂質を含む脂質二重層を含む。幾つかの実施態様では、前記官能化脂質は、核酸に結合できる基で官能化された脂質である。幾つかの実施態様では、少なくとも一種の核酸が、官能化脂質に共有結合されるか、又は静電相互作用を介してカチオン性脂質に結合される。幾つかの実施態様では、脂質二重層は、チオール又はジチオール官能化１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、及び１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）の一又は複数を含む混合物を含む。幾つかの実施態様では、少なくとも一種の核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びＡＳ ＯＤＮを含む群から選択される。幾つかの実施態様では、ｓｉＲＮＡは、サバイビンｓｉＲＮＡ、ＥＲＣＣ－１ ｓｉＲＮＡ、Ｐ－糖タンパク質ｓｉＲＮＡ（Ｐ－ｇｐ ｓｉＲＮＡ）、Ｂｃｌ－２ ｓｉＲＮＡ、及びそれらの混合物を含む群から選択される。
幾つかの実施態様では、ナノ粒子は、一又は複数の不動態化剤、任意選択的に親水性ポリマー；標的剤、任意選択的にＲＧＤペプチド；及び免疫療法剤を更に含む。
幾つかの実施態様では、ナノ粒子は、約２０ナノメートル（ｎｍ）から約３００ｎｍの粒径を有する。幾つかの実施態様では、ナノ粒子は、約２０ｎｍから約２００ｎｍの粒径を有する。幾つかの実施態様では、ナノ粒子は、約２０ｎｍから約１４０ｎｍ（例えば、約２０、約４０、約６０、約８０、約１００、約１２０、又は約１４０ｎｍ）の粒径を有する。
幾つかの実施態様では、ナノ粒子は、ＬＤＬ受容体媒介エンドサイトーシスを介した腫瘍への能動輸送のために、アポリポタンパク質Ｂ－１００（ａｐｏ Ｂ－１００）などの血漿タンパク質を吸着する。
幾つかの実施態様では、本開示の主題は、（ｉ）薬学的に許容される担体と、（ｉｉ）ここで上記された構造Ｄ－ＢＬ－Ｌを有する本開示の主題のプロドラッグ又はここで上記された本開示の主題のナノ粒子（例えば、コアが金属有機構造体（例えば、ＮＣＰ）を含み、シェルが、ここに記載の構造Ｄ－ＢＬ－Ｌを有するプロドラッグを含む脂質又は脂質二重層コーティングを含む、コアシェルナノ粒子）を含む薬学的製剤を提供する。幾つかの実施態様では、薬学的に許容される担体は、ヒトにおいて薬学的に許容される。
幾つかの実施態様では、本開示の主題は、治療を必要とする対象（例えば、がん又はその再発と診断された対象）においてがんを治療する方法を提供する。幾つかの実施態様では、対象は哺乳動物である。幾つかの実施態様では、対象はヒトである。幾つかの実施態様では、本開示の方法は、ここに記載の構造Ｄ－ＢＬ－Ｌのプロドラッグ、ここに記載のナノ粒子（すなわち、（ａ）金属有機マトリックス材料を含むコアと（ｂ）コアの表面の少なくとも一部を覆うコーティング層を含むナノ粒子であって、コーティング層が脂質層又は脂質二重層を含み、前記脂質層又は脂質二重層がここに開示の式Ｄ－ＢＬ－Ｌのプロドラッグを更に含むナノ粒子）、又は前記プロドラッグ又は前記ナノ粒子の薬学的に許容される製剤を対象に投与することを含む。
幾つかの実施態様では、本方法は、対象に追加のがん治療を施すことを更に含む。幾つかの実施態様では、追加のがん治療は、手術、放射線療法、化学療法、毒素療法、免疫療法、凍結療法、及び遺伝子療法を含む群から選択される。幾つかの実施態様では、追加のがん治療は免疫療法である。幾つかの実施態様では、免疫療法は、対象に免疫療法剤を投与することを含み；任意選択的に、免疫療法剤は、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ４７抗体、抗ＧＤ２抗体、サイトカイン、ポリサッカライドＫ；ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、ＣＣＲ７阻害剤、ＯＸ４０阻害剤、ＴＩＭ３阻害剤、及びＬＡＧ３阻害剤を含む群から選択される。幾つかの実施態様では、サイトカインは、インターフェロン及びインターロイキンを含む群から選択される。幾つかの実施態様では、サイトカインは、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２及びＴＮＦ－αを含む群から選択される。
幾つかの実施態様では、がんは、頭部腫瘍、頸部腫瘍、乳がん、婦人科腫瘍、脳腫瘍、結腸直腸がん、肺がん、中皮腫、軟部組織肉腫、皮膚がん、結合組織がん、脂肪がん、肺がん、胃がん、肛門性器がん、腎臓がん、膀胱がん、結腸がん、前立腺がん、中枢神経系がん、網膜がん、血液がん、神経芽細胞腫、多発性骨髄腫、リンパ系がん、及び膵臓がんを含む群から選択される。幾つかの実施態様では、がんは転移性がんである。幾つかの実施態様では、転移性がんは転移性結腸直腸がん（ｍＣＲＣ）である。
幾つかの実施態様では、本方法は、対象にナノ粒子を投与することを含み、ナノ粒子コアは、多価金属イオン（例えば、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、又はそれらの任意の組み合わせ）とビスホスフェート又はビスホスホネートを含む金属ビスホスフェート又は金属ビスホスホネート配位ポリマーを含み、前記ビスホスフェート又はビスホスホネートは、シスプラチン、オキサリプラチン又はカルボプラチンのビスホスフェート又はビスホスホネートプロドラッグであり；コーティング層は、構造Ｄ－ＢＬ－Ｌを有するプロドラッグを含む脂質層又は脂質二重層を含み、ここで、Ｄは、抗がん薬化合物の一価薬物部分であり；Ｌは一価脂質部分であり；ＢＬは二価リンカー部分であり、Ｄは切断可能なカーボネート又はカルバメート結合を介してＢＬに結合しており、ＢＬはアセタール基を含み、アセタール基の酸素原子はカーボネート又はカルバメートの炭素原子に直接結合されている。幾つかの実施態様では、ナノ粒子コアは、金属ビスホスフェート配位ポリマーを含む。幾つかの実施態様では、Ｄは、抗がん薬化合物の一価誘導体、例えば、ＥＴ、ＰＰＸ、ＰＴＸ、ＤＴＸ、ＤＨＡ、ＣＰＴ、ＳＮ３８、トポテカン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ビンクリスチン、ミトキサントロン、アルテスネート、カペシタビン、オクトレオチド、ロイプロリド、及びゴセレリンを含む群から選択される薬物化合物のような疎水性薬物化合物である。幾つかの実施態様では、ＢＬは、式：
｛上式中、Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、アルキル（例えば、Ｃ１－Ｃ６アルキル）、置換アルキル、アラルキル、置換アラルキル、アリール、及び置換アリールを含む群から独立して選択される｝の構造を有するアセタール基を含む。幾つかの実施態様では、Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、メチル、及びフェニルから選択される。幾つかの実施態様では、Ｒ１とＲ２は同じである。幾つかの実施態様では、Ｒ１とＲ２は異なる。幾つかの実施態様では、Ｒ１とＲ２はそれぞれＨである。
幾つかの実施態様では、ナノ粒子コアは、その中に包埋された親水性抗がん剤を更に含む。幾つかの実施態様では、親水性抗がん剤はＧＭＰである。
幾つかの実施態様では、脂質二重層中のプロドラッグはＳＮ３８のプロドラッグである。幾つかの実施態様では、プロドラッグは、式：
の構造を有する。
幾つかの実施態様では、ナノ粒子コア中のビスホスフェートは、Ｐｔ（ｄａｃｈ）（オキサレート）（ビスホスホラミド酸）である。
幾つかの実施態様では、本方法は、対象に免疫療法剤を投与することを更に含む。幾つかの実施態様では、免疫療法剤は、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ４７抗体、抗ＧＤ２抗体、ポリサッカライドＫ及びサイトカインを含む群から選択される。幾つかの実施態様では、免疫療法剤は、放射性標識抗体、抗体－薬物コンジュゲート、及びネオ抗原を含む群から選択される。幾つかの実施態様では、免疫療法剤は、アレムツズマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、ゼバリン、アドセトリス、カドサイラ、及びオンタックを含む群から選択される。幾つかの実施態様では、免疫療法剤は、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、ＣＣＲ７阻害剤、ＯＸ４０阻害剤、ＴＩＭ３阻害剤、及びＬＡＧ３阻害剤を含む群から選択される。幾つかの実施態様では、サイトカインは、インターフェロン及びインターロイキンを含む群から選択される。幾つかの実施態様では、サイトカインは、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２及びＴＮＦ－αを含む群から選択される。
幾つかの実施態様では、ナノ粒子の投与は、少なくとも一種の抗がん剤であって、本開示の主題のナノ粒子及び／又はプロドラッグと関連していない少なくとも一種の抗がん剤の等量の投与と比較して（例えば、遊離抗がん剤の投与と比較して）、少なくとも一種の抗がん剤の腫瘍曲線下面積（ＡＵＣ）の少なくとも２倍の増加をもたらす。幾つかの実施態様では、ナノ粒子の投与は、少なくとも一種の抗がん剤であって、本開示の主題のナノ粒子及び／又はプロドラッグと関連していない少なくとも一種の抗がん剤の等量の投与と比較して、腫瘍ＡＵＣの少なくとも４倍の増加、又は腫瘍ＡＵＣの４倍を超える増加をもたらす。
幾つかの実施態様では、本開示の主題は、治療を必要とする対象においてがんを治療する方法を提供し、該方法は、切断可能なカーボネート結合を含む脂質コンジュゲートプロドラッグと金属－有機マトリックス材料コア、任意選択的にＮＣＰコアを含むナノスケール粒子を含む組成物を対象に投与することを含む。幾つかの実施態様では、ナノスケール粒子は光増感剤を更に含み、該方法は、光増感剤を活性化するのに適した波長を有する放射線を対象又は対象の治療領域に照射することを更に含む。
ＩＩＩ．製剤
而して、本開示の主題の組成物は、幾つかの実施態様では、薬学的に許容される担体を含む組成物を含む。対象に投与するための組成物を調製するために、任意の適切な薬学的製剤を使用することができる。幾つかの実施態様では、組成物及び／又は担体は、ヒトにおいて薬学的に許容されうる。
例えば、適切な製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、殺菌性抗生物質、及び製剤を対象の体液と等張にする溶質を含みうる水性及び非水性の無菌注射溶液；並びに懸濁剤及び増粘剤を含みうる水性及び非水性滅菌懸濁液が含まれうる。製剤は、単位用量又は複数用量の容器、例えば密封されたアンプル及びバイアルで提供することができ、使用直前に滅菌液体担体、例えば注射用水の添加だけを必要とする、凍結又はフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することができる。幾つかの例示的な成分は、一例では０．１から１０ｍｇ／ｍｌの範囲であり、別の例では約２．０ｍｇ／ｍｌであるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；及び／又は例えば１０から１００ｍｇ／ｍｌの範囲、別の例では約３０ｍｇ／ｍｌであるマンニトール又は別の糖、及び／又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。
特に上で述べられた成分に加えて、本開示の主題の製剤は、問題の製剤のタイプを考慮して、当該技術分野で慣用の他の薬剤を含むことができることを理解すべきである。例えば、発熱物質を含まない滅菌水溶液及び非水溶液を使用することができる。
ＩＶ．対象
ここに開示される方法及び組成物は、インビトロでサンプルに（例えば、単離された細胞又は組織に）、又はインビボで対象に（すなわち、患者などの生きている生物）使用されうる。幾つかの実施態様では、対象又は患者はヒト対象であるが、本開示の主題の原理は、本開示の主題が、「対象」及び「患者」という用語に含まれることが意図される、哺乳動物を含む全ての脊椎動物種に関して有効であることを示していることを理解すべきである。更に、哺乳動物は、ここに開示される組成物及び方法を用いることが望ましい任意の哺乳動物種、特に農業及び家畜の哺乳動物種を含むと理解される。
而して、本開示の主題の方法は、温血脊椎動物において特に有用である。従って、本開示の主題は、哺乳動物及び鳥類に関する。より特定的に提供されるのは、ヒトなどの哺乳動物、並びに絶滅の危機に瀕しているために重要な哺乳動物（シベリアトラなど）、経済的に重要な哺乳動物（ヒトによる消費のために飼育場で飼育されている動物）、及び／又はヒトにとって社会的に重要な哺乳動物（ペットとして又は動物園で飼育されている動物）、例えばヒト以外の肉食動物（ネコ及びイヌなど）、イノシシ属動物（ブタ、雄ブタ、イノシシ）、反芻動物（ウシ、雄ウシ、ヒツジ、キリン、シカヤギ、バイソン、及びラクダ）、及びウマのための方法及び組成物である。また提供されるのは、ヒトにとって経済的にも重要であるため、絶滅の危機に瀕しており、動物園で又はペットとして飼育されている種類の鳥（例えば、オウム）、並びに家禽、より特定的には家畜化された家禽、例えば、シチメンチョウ、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ホロホロチョウなどの治療を含む鳥類の治療である。従って、また提供されるのは、限定されないが家畜化されたイノシシ属動物（ブタ及び雄ブタ）、反芻動物、ウマ、家禽などを含む家畜の治療である。
Ｖ．投与
本開示の主題の組成物の投与に適した方法には、限定されないが、静脈内及び腫瘍内注射、経口投与、皮下投与、腹腔内注射、頭蓋内注射、及び直腸投与が含まれる。あるいは、組成物は、他の任意の方法、例えば、肺経路内に組成物を噴霧することによって、治療を必要とする部位に沈着させることができる。本開示の主題の組成物を投与する特定の態様は、治療される細胞の分布及び存在量、並びにその投与部位からの組成物の除去又は代謝の機序を含む、様々な要因に依存する。例えば、比較的表在性の腫瘍は、腫瘍内に注射することができる。対照的に、内部腫瘍は静脈内注射後に治療されうる。
一実施態様では、投与方法は、治療される部位での領域化された送達又は蓄積のための特徴を包含する。幾つかの実施態様では、組成物は腫瘍内に送達される。幾つかの実施態様では、組成物の標的への選択的送達は、組成物の静脈内注射とそれに続く標的の光線力学的治療（光照射）によって達成される。
組成物を肺経路に送達するために、本開示の主題の組成物は、エアロゾル又は粗いスプレーとして製剤化することができる。エアロゾル又はスプレー製剤の調製及び投与のための方法は、例えば、米国特許第５８５８７８４号；第６０１３６３８号；第６０２２７３７号；及び第６１３６２９５号に見出すことができる。
ＶＩ．用量
本開示の主題の組成物の有効用量が対象に投与される。「有効量」は、検出可能な治療を作り出すのに十分な組成物の量である。本開示の主題の組成物の成分の実際の投与量レベルは、特定の対象及び／又は標的に対して所望の効果を達成するのに有効な量の組成物を投与するように変えることができる。選択される投与量レベルは、組成物の活性（例えば、細胞傷害活性又はＰＤＴ活性又は化学療法剤負荷）及び投与経路に依存しうる。本開示の主題のここでの開示を検討した後、当業者は、特定の製剤、組成物を用いて使用される投与方法、及び治療される標的の性質を考慮に入れて、個々の対象への投与量を調整することができる。そのような調整又は変更、並びにそのような調整又は変更を行う時期及び方法の評価は、当業者にはよく知られている。
次の実施例は、当業者が本開示の主題の代表的な実施態様を実施するための手引きを提供するために含められている。本開示及び当業者の一般的なレベルに照らして、当業者であれば、次の実施例が単なる例示であることを意図していること、及び本開示の主題の範囲から逸脱することなく数多くの変形、修正、及び改変を採用できることを理解できよう。
実施例１
ナノスケール配位ポリマーコアシェルナノ粒子はオキサリプラチン及びＳＮ３８を共送達する
コレステロール結合ＳＮ３８（Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８）の合成：
ｃｈｏｌ－ＳＮ３８の合成を図１にまとめる。コレステロールをコハク酸とカップリングさせ、ついで脱離基としてのｐ－ニトロフェノールとカップリングさせた。ＳＮ－３８のヒドロキシル基をトリメチルシリル基によって保護した。ついで、二つの化合物を塩基の存在下で混合して、Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８を得た。
炭酸クロロメチル（４－ニトロフェニル）の合成：
１０ｇ（７２ｍｍｏｌ）の４－ニトロフェノールを、窒素保護下で５００ｍＬの丸底フラスコ内で２００ｍＬの無水ジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解させた。ついで、２０ｍＬ（１１５ｍｍｏｌ、１．６当量）のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）をフラスコに加え、フラスコを氷浴で冷却した。１０ｍＬ（１４．５ｇ、１１５ｍｍｏｌ、１．６当量）のクロロギ酸クロロメチルを溶液に滴下して加えた。ついで溶液を室温において２時間撹拌した。黄色がかった色が消え、２時間の反応後に最終溶液は濃い赤ピンク色になった。溶液を２００ｍＬの水で二回洗浄し、続いて２００ｍＬの１Ｍ ＨＣｌと更なる２００ｍＬの水で洗浄し、ついで２００ｍＬの飽和ＮａＣｌで洗浄した。ついで、有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で２時間乾燥させた。溶液をロータリーエバポレーターで濃縮してＤＣＭを除去し、深い赤色の油を粗生成物として得た。
６００ｍＬの１０：１のヘキサン：イソプロピルエーテルを粗生成物に添加し、加熱して沸騰させて、淡黄色又は無色の溶液と深い赤色の沈殿物を得た。溶液を別のフラスコに移し、－２０℃のフリーザーで一晩冷却した。フリーザーで無色又は淡黄色の針状結晶が生成され、純粋な生成物として収集した。より多くの生成物を得るためにヘキサン／イソプロピルエーテル溶液を更に濃縮することができる。収量：１３．５ｇ（５８ｍｍｏｌ、８１％）。
１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝５．８５（ｓ、２Ｈ）、７．４２（ｄ、Ｊ＝８Ｈｚ、２Ｈ）、８．３０（ｄ、Ｊ＝９Ｈｚ、２Ｈ）。これらのＮＭＲデータは、文献の報告（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９７，６２，５，１３５６－１３６２）と一致している。
コハク酸水素コレステリルの合成：
８ｇ（２０ｍｍｏｌ）のコレステロール、６ｇの無水コハク酸（６０ｍｍｏｌ、３当量）、４００ｍｇのＮ，Ｎ－ジメチルピリジン（ＤＭＡＰ、触媒として３．２５ｍｍｏｌ）、６ｍＬのＤＩＰＥＡ（３５ｍｍｏｌ、１．７５当量）を２５０ｍＬの無水ＴＨＦ中で混合し、窒素下で４８時間還流して、深い黄色／赤色の溶液を得た。ついで、全ての溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発させて、白褐色の固体を粗生成物として得た。
粗生成物を、１００ｍＬのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を使用して５００ｍＬのフラスコに移した。１５０ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３溶液をフラスコに加え、泡が発生しなくなるまで混合物を３時間撹拌した。ついで、混合物を１ＭのＨＣｌでｐＨ＜５まで中和して、気泡を伴う薄茶色の液体－固体混合物を得た。混合物を２００ｍＬの酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）で３回抽出し、一緒にした有機相を２００ｍＬの１Ｍ ＨＣｌ（二回）と２００ｍＬの飽和ＮａＣｌによって更に洗浄した。ＥｔＯＡｃ溶液を無水Ｎａ２ＳＯ４で２時間乾燥させ、蒸発させて、薄茶色の固形物を得た。固形物を１００ｍＬの沸騰ＥｔＯＡｃに溶解させ、－２０℃のフリーザーで一晩冷却した。白色の結晶が形成され、純粋な生成物として収集した。収量：９．８ｇ（２０ｍｍｏｌ、１００％）。
１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ＝０．５－２．３５（ｍ、４３Ｈ）、２．６２（ｔ、２Ｈ）、２．６９（ｔ、２Ｈ）、４．６３（ｍ、１Ｈ）、５．３８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝４．４Ｈｚ）。ＨＲＭＳ：ｍ／ｚ＝５０４．４０４０（［Ｍ＋ＮＨ４］＋）。これらの分光データは、文献の報告（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１０，５３，２１，７６３２－７６３８）と一致している。
炭酸ヨードメチル（４－ニトロフェニル）の合成：
７ｇ（３０ｍｍｏｌ）の炭酸クロロメチル（４－ニトロフェニル）と１４ｇ（９０ｍｍｏｌ、３当量）のＮａＩを３００ｍＬの無水アセトニトリルに溶解し、窒素下で５０℃において２４時間撹拌した。溶液は淡黄色になり、白色沈殿物（ＮａＣｌ）が形成された。ロータリーエバポレーターで溶媒を除去し、固形物を更に真空下で２時間乾燥させた。３００ｍＬのＤＣＭを乾燥固形物に添加して、生成物を抽出した。ＤＣＭ溶液を濾過してＮａＣｌ及びＮａＩ固形物を除去し、濃縮して淡黄色の油又は固体を粗生成物として得た。粗生成物を更に精製することなく次の工程で使用した。
２０－Ｏ－トリメチルシリルＳＮ３８の合成：
５ｇ（１２．７ｍｍｏｌ）のＳＮ３８を、２５ｍＬの無水ＤＣＭ及び２５ｍＬのＮ，Ｏ－ビス（トリメチルシリル）アセトアミドと混合した。混合物を窒素下で７２時間還流した。ＳＮ３８は反応中に徐々に溶解し、深い赤色の溶液を形成した。反応をＴＬＣ（３：１のＤＣＭ：ＥｔＯＡｃ、ＵＶ光下で可視）によってモニターして、全てのＳＮ３８がビス－ＴＭＳ－ＳＮ３８に変換されたことを確認した。ロータリーエバポレーターを使用して溶液を乾燥させ、ついで真空下で更に乾燥させた。茶色の固形物（ビス－ＴＭＳ－ＳＮ３８）を１００ｍＬのＤＣＭと１００ｍＬのメタノールに溶解させ、室温において６時間撹拌し、全てのビス－ＴＭＳ－ＳＮ３８が２０－Ｏ－ＴＭＳ－ＳＮ３８に変換されるまで反応をＴＬＣによってモニターした。その後、溶液を乾燥させて粗生成物として深い黄色／茶色の固形物を得た。粗生成物を高真空下で更に乾燥させてメタノールを除去し、ついで更に精製することなく次の工程で直接使用した。１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）：δ９．７４（ｓ、１Ｈ）、８．１３（ｄ、Ｊ＝９．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．５７（ｓ、１Ｈ）、７．５１（ｄｄ、Ｊ＝９．１、２．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．４７（ｄ、Ｊ＝２．６Ｈｚ、１Ｈ）、５．７０（ｄ、Ｊ＝１６．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．２８（ｄ、Ｊ＝１６．３Ｈｚ、１Ｈ）、５．２３（ｓ、２Ｈ）、３．０５（ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、１．８５（ｄｄ、Ｊ＝７．３、２．３Ｈｚ、２Ｈ）、１．３２（ｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、３Ｈ）、０．８８（ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、３Ｈ）、０．２１（ｓ、１１Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ、ＣＤＣＬ３）δ１７２．２６、１５７．８７、１５６．８１、１５２．３７、１４８．８３、１４６．７１、１４４．４２、１４３．８７、１３１．６８、１２９．００、１２８．７７、１２６．９５、１２２．９８、１１７．９２、１０５．６１、９８．５３、７７．３３、７７．０７、７６．８２、７５．９０、６５．８４、４９．５７、３２．５５、２３．２０、１３．６０、７．７８、２．１５、１．９１、１．６７。ＨＲＭＳ：ｍ／ｚ＝４６５．１８５０（［Ｍ＋Ｈ］＋の予想値４６５．１７６７）。
コレスト－５－エン－３－オール（（（（４－ニトロフェノキシ）カルボニル）オキシ）メチル）スクシネート（コレステロールリンカー）の合成：
粗炭酸ヨードメチル（４－ニトロフェニル）（７ｇ、３０ｍｍｏｌの炭酸クロロメチル（４－ニトロフェニル）、１．５当量から）を２５０ｍＬの無水トルエンに溶解し、ついで９．８ｇ（２０ｍｍｏｌ、１当量）のコハク酸水素コレステリルを溶液に加えた。全ての固形物が溶解するまで混合物を加熱しながら撹拌した。ついで、５．６ｇ（２０ｍｍｏｌ、１当量）のＡｇ２ＣＯ３を溶液に加え、溶液を窒素保護下で８０℃において暗所で２４時間撹拌した。黒色沈殿物を含む得られた淡黄色溶液をセライトで濾過し、濃縮して淡黄色の油を得た。シリカを使用するカラムクロマトグラフィーにより生成物を更に精製した。ＤＣＭ中の３０％のヘキサンを使用して最初の２つのスポットを溶出させ、ついで純粋なＤＣＭに変更して生成物を分離した。収量：７ｇ（１０ｍｍｏｌ、５０％）。１Ｈ－ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）：δ８．３２－８．２７（ｍ、２Ｈ）、７．４７－７．４１（ｍ、２Ｈ）、５．９０（ｓ、２Ｈ）、５．３５（ｄｔ、Ｊ＝５．３、１．７Ｈｚ、１Ｈ）、４．６６－４．５７（ｍ、１Ｈ）、２．７５（ｄｄｄ、Ｊ＝７．３、５．８、１．２Ｈｚ、２Ｈ）、２．６７（ｄｄｄ、Ｊ＝７．３、６．０、１．２Ｈｚ、２Ｈ）、２．３２（ｄｄ、Ｊ＝７．３、１．８Ｈｚ、２Ｈ）、２．０５－１．９２（ｍ、２Ｈ）、１．８９－１．８０（ｍ、３Ｈ）、１．６５－０．７９（ｍ、４０Ｈ）、０．６８（ｓ、３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ、ＣＤＣＬ３）δ１７１．２７、１７０．９１、１５５．０８、１５１．４５、１４５．６４、１３９．４８、１２５．３９、１２２．８３、１２１．７８、８２．４９、７７．３４、７７．０９、７６．８３、７４．６９、５６．６６、５６．１４、５０．０１、４２．３２、３９．７２、３９．５５、３８．０３、３６．９７、３６．５９、３６．２１、３５．８２、３１．９１、３１．８６、２９．１３、２８．９９、２８．２６、２８．０４、２７．７２、２４．３１、２３．８７、２２．８７、２２．６１、２１．０５、１９．３１、１８．７５、１１．８８。ＥＳＩ－ＭＳ：ｍ／ｚ＝６９９．４２２６（［Ｍ＋ＮＨ４］＋の予想値６９９．４２２１）。
７－エチル－１０－（（（（（コレスト－５－エン－３－オキシ）－４－オキソブタノイル）オキシ）メトキシ）－カルボニル）オキシル－２０－Ｏ－トリメチルシリルカンプトテシン（Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８）の合成：
７ｇ（１０ｍｍｏｌ）のコレステロールリンカーと５ｇのＳＮ３８からの粗２０－Ｏ－ＴＭＳ－ＳＮ３８（１２．７ｍｍｏｌ、１．２７当量）を２５０ｍＬの無水ＤＣＭに溶解させた。１０ｍＬ（６０ｍｍｏｌ、６当量）のＤＩＰＥＡを溶液に加え、溶液を窒素保護下で室温において２４時間撹拌した。得られた深い赤色の溶液を５００ｍＬのＤＣＭで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３で３回、続いて１ＭのＨＣｌ及び飽和ＮａＣｌで洗浄した。ついで、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で２時間乾燥させ、ロータリーエバポレーターで濃縮した。シリカを使用するカラムクロマトグラフィーにより生成物を更に精製した。生成物を１５：１のＤＣＭ：ＥｔＯＡｃで溶出させた。収量：８ｇ（８ｍｍｏｌ、８０％）。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、クロロホルム－ｄ）：δ８．２８（ｄ、Ｊ＝９．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．９６（ｄ、Ｊ＝２．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．６８（ｄｄ、Ｊ＝９．２、２．６Ｈｚ、１Ｈ）、７．５２（ｓ、１Ｈ）、５．９３（ｓ、２Ｈ）、５．６８（ｄ、Ｊ＝１６．６Ｈｚ、１Ｈ）、５．３４－５．１９（ｍ、５Ｈ）、４．６１（ｄｔ、Ｊ＝７．８、２．２Ｈｚ、１Ｈ）、３．１６（ｄ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、２．７９－２．７３（ｍ、２Ｈ）、２．７０－２．６３（ｍ、２Ｈ）、２．３０（ｄ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、２．０２－１．７３（ｍ、８Ｈ）、１．６３－０．７４（ｍ、５０Ｈ）、０．６３（ｓ、３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ、ＣＤＣＬ３）δ１７１．９２、１７１．２４、１７０．９３、１５７．５９、１５２．３４、１５２．２８、１５１．７６、１４９．４７、１４７．５８、１４６．２６、１４５．４７、１３９．４３、１３２．４５、１２７．４３、１２７．３５、１２４．３４、１２２．７４、１１９．００、１１４．０８、９８．２７、８２．４４、７７．３０、７７．０５、７６．７９、７５．８２、７４．６４、６５．９３、５６．６５、５６．１６、４９．９６、４９．３２、４２．２７、３９．７１、３９．４９、３８．００、３６．９２、３６．５３、３６．１６、３５．７９、３２．７５、３１．８４、３１．７９、２９．７０、２９．１３、２９．０１、２８．２２、２８．０１、２７．７０、２４．２６、２３．８８、２３．２１、２２．８３、２２．５７、２０．９８、１９．２８、１８．７０、１４．０２、１１．８３、７．８９、２．１１、１．８７、１．６３。ＥＳＩ－ＭＳ：ｍ／ｚ＝１００７．５４５６（［Ｍ＋ＮＨ４］＋の予想値１００７．５３７５）。
ＯｘＰｔ／ＳＮ３８コアシェルナノ粒子の合成と特徴付け：
強力なトポイソメラーゼ１阻害剤ＳＮ３８を、酸感受性で酵素的に切断可能なアセタールリンカーを介してコレステロールに結合させて、Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８を形成した。嵩張るが酸感受性のトリメチルシリル（ＴＭＳ）基をＳＮ３８のＯ－２０位でＣｈｏｌ－ＳＮ３８に加え、二次元ＳＮ３８部分の強力なπ－πスタッキングを破壊し、ＮＣＰコア上の安定した脂質コーティングの形成を促進した。コアシェルＮＣＰ粒子ＯｘＰｔ／ＳＮ３８を二工程で調製した。図２を参照のこと。最初に、Ｐｔ（ｄａｃｈ）（オキサレート）（ビスホスホラミド酸）（ＯｘＰｔ－ｂｐ）（Ｄｕａｎ，Ｘ．等 Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０２０，１０：１８９９）を、最初に、トリトンＸ－１００／ヘキサノール／シクロヘキサンを含む逆マイクロエマルジョン中、ＤＯＰＡの存在下でＺｎ２＋イオンと共重合させて、ＤＯＰＡでキャッピングされたベアＮＣＰ粒子（ＯｘＰｔ－ベア）を形成した。ＯｘＰｔ－ベア粒子は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察された場合、テトラヒドロフラン中に単分散していた。図３Ａを参照のこと。動的光散乱（ＤＬＳ）測定は、ＯｘＰｔ－ベアに対して４９．０±３．０ｎｍのＺ平均粒径と０．１７±０．０３の多分散指数（ＰＤＩ）を示した。図３Ｂを参照のこと。ＯｘＰｔ－ベアは、室温において２４時間にわたってテトラヒドロフラン中で粒径とＰＤＩが変化しない高い安定性を示した。図３Ｃを参照のこと。
次に、Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８をＯｘＰｔ－ベアの表面上でコレステロール、ＤＯＰＣ及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００と一緒に脂質層に取り込み、コアシェルＮＣＰ粒子ＯｘＰｔ／ＳＮ３８を形成した。０．２１ｍｇのコレステロール、０．４２ｍｇのＤＯＰＣ、０．７５ｍｇのＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋ、０．２ｍｇのｃｈｏｌ－ＳＮ３８及び０．５ｍｇのＯｘＰｔベアＮＣＰ粒子（Ｄｕａｎ，Ｘ．等 Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０２０，１０：１８９９）を８０ｕＬのＴＨＦ中で混合し、５０℃において１７００ｒｐｍで撹拌しながら５００μＬの３０％ ＥｔＯＨに加えた。混合物を１００μＬまで濃縮して、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８コアシェルナノ粒子を得た。ＯｘＰｔ／ＳＮ３８粒子は、ＴＥＭで観察された場合、水溶液中で単分散していた。図４Ａを参照のこと。ＯｘＰｔ／ＳＮ３８粒子のＺ平均粒径及びＰＤＩは、ＤＬＳによって１１１．６ｎｍ及び０．１３８であった。図４Ｂを参照のこと。ＯｘＰｔ／ＳＮ３８粒子は、５ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ中で安定しており、３７℃において２４時間、粒径又はＰＤＩに変化はなかった。図４Ｃを参照のこと。
ＯｘＰｔ／ＳＮ３８はＣｈｏｌ－ＳＮ３８をＬＤＬに移動させる
ＬＤＬは、末梢細胞へのコレステロール及びコレステロールエステルの重要な輸送体である。ＬＤＬはＣｈｏｌ－ＳＮ３８に強く結合して、ＬＤＬＲ媒介エンドサイトーシスによって腫瘍へのその送達を促進すると仮定された。等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）法では、Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８とアルブミンの間の結合親和性より＞２０００倍高い、（４．９７±０．２４）×１０５Ｍ－１の結合定数（Ｋａ）でＣｈｏｌ－ＳＮ３８がＬＤＬに強く結合することが示された。以下の表１を参照のこと。興味深いことに、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８でのＬＤＬの滴定がまた、（３．３４±１．３０）×１０４Ｍ－１の見かけのＫａで発熱結合をもたらした。ＯｘＰｔ／ＳＮ３８はアルブミンとの親和性が低く、見かけのＫａは２７．５±１．８Ｍ－１であった。以下の表１を参照のこと。ＬＤＬに対するＯｘＰｔ／ＳＮ３８の明らかに高い親和性は、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８からＬＤＬへのｃｈｏｌ－ＳＮ３８の移動によるものであると考えられる。
粒子のどの成分がＬＤＬに結合するかを理解するために、二種の対照粒子、ｃｈｏｌを含まないＯｘＰｔ ＮＣＰとＣｈｏｌ－ＳＮ３８ミセル（ＮＣＰコアを含まない）の見かけのＬＤＬ結合親和性を定量した。Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８ミセル粒子はＯｘＰｔ／ＳＮ３８粒子とほぼ同じＬＤＬに対する結合親和性を示したが、Ｃｈｏｌを含まないＯｘＰｔ ＮＣＰはＬＤＬに対して一桁低い結合親和性を示した。上記の表１を参照のこと。これらの結果は、Ｃｈｏｌ及びＣｈｏｌ－ＳＮ３８をＮＣＰ及びミセル粒子からＬＤＬに移動させることができるという考えを裏付けている。
ＬＤＬとＣｈｏｌ－ＳＮ３８又はＳＮ３８の間の原子レベルの相互作用を解明するために、球状ＬＤＬ粒子のその体積の１０％のスライスを使用して分子動力学（ＭＤ）シミュレーションを実施した。Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８又はＳＮ３８をバルク水からＬＤＬの脂質コアに移動させる平均力ポテンシャルを計算した。Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８の平均力ポテンシャルは、ＬＤＬのほぼ全ての位置で有意に減少し、ＰＯＰＣとリゾＰＣの疎水性コアと親水性シェルの界面（疎水性コアの中心から約４ｎｍ）において最大約８０ＫＪ／ｍｏｌ減少した。図５Ａを参照のこと。対照的に、ＳＮ３８の平均力ポテンシャルは、ＬＤＬの疎水性コアの中心（＜２ｎｍ）に近づくまで減少しなかった。従って、ＭＤシミュレーションの結果は、Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８とＬＤＬコアの間の強力な誘引性の疎水性／疎水性相互作用を確認する。
ついで、３７℃でのラット血漿中におけるＬＤＬに対するＣｈｏｌ－ＳＮ３８、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８、及びＳＮ３８の結合動態を定量した。Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８は直ぐに血漿のＬＤＬに結合し、１時間以内に７４．５±３．６％のｃｈｏｌ－ＳＮ３８がＬＤＬに結合して平衡に達した（図５Ｂを参照）一方、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８はＬＤＬへのｃｈｏｌ－ＳＮ３８のより遅い移動を示したが、３時間で同等の７８．６±３．１％のＣｈｏｌ－ＳＮ３８のＬＤＬへの結合に達した。対照的に、ＳＮ３８はＬＤＬへの結合を１７．１±１．５％しか示さなかった。これらの結果は、Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８のＬＤＬへの強い結合と、血漿中におけるＣｈｏｌ－ＳＮ３８のＯｘＰｔ／ＳＮ３８からＬＤＬへの移動を裏付けている。
ラット血漿中で３７℃において３時間インキュベートした後の、様々なリポタンパク質中のＳＮ３８、Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８、及びＯｘＰｔ／ＳＮ３８の分布を、ＬＣ－ＭＳによって定量した。リポタンパク質は、ＮａＢｒ勾配超遠心分離によりその密度に基づいて分離した。ＳＮ３８は主にアルブミン画分（６９％）に分布し、ＬＤＬ画分（１７％）とＨＤＬ（１４％）には僅かだけ分布していたが、Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８はＬＤＬ画分（８６％）に殆ど分布しており、アルブミン画分に１％未満のＣｈｏｌ－ＳＮ３８、ＶＬＤＬ中に９％のＣｈｏｌ－ＳＮ３８、ＨＤＬ中に５％であった。興味深いことに、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８中のＣｈｏｌ－ＳＮ３８は、効率的にリポタンパク質に移動させられ、ＬＤＬ中に７４％、ＶＬＤＬ中に１９％、ＨＤＬ中に７％であった。ＯｘＰｔ／ＳＮ３８中に１％未満のＣｈｏｌ－ＳＮ３８がアルブミン画分中で観察された。超遠心分離手順により、一部のＯｘＰｔ／ＳＮ３８粒子がＶＬＤＬ画分に分画される可能性がある。
ＳＤラットにおけるＯｘＰｔ／ＳＮ３８のインビボ薬物動態は、９．７±１．０時間の半減期（ｔ１／２）及び１８７４．６±４４．９μｇ／ｍｌ＊ｈの曲線下面積（ＡＵＣ０→ｔ）で、Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８の長い血液循環を示した。図５Ｃを参照のこと。各時点での異なる血漿タンパク質中のＣｈｏｌ－ＳＮ３８の分布をアッセイし、ＬＤＬ結合Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８に対して８７１．６±３０．８μｇ／ｍｌ＊ｈのＡＵＣ０→ｔが見出され、これは全ＡＵＣ０→ｔの４６．５±０．５％に相当する。図５Ｃを参照のこと。従って、ＬＤＬは、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８粒子中のＣｈｏｌ－ＳＮ３８の長期の循環に大きく貢献する。ＩＴＣ分析、ＭＤシミュレーション、リポタンパク質分画、及びインビボＰＫ研究が合わせて、Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８のＬＤＬへの強い結合と、Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８のＯｘＰｔ／ＳＮ３８粒子から血漿中のＬＤＬへの効率的な移動を示し、高度に親油性の薬物及びプロドラッグの腫瘍への送達の促進のためのＬＤＬハイジャックの可能性を示唆している。
ＬＤＬＲ媒介エンドサイトーシスは、腫瘍細胞によるＯｘＰｔ／ＳＮ３８の取り込みを決定する
ＬＤＬ中のＡｐｏ Ｂ－１００タンパク質は、ＬＤＬＲの強力なリガンドであり、ＬＤＬＲ媒介エンドサイトーシスによる末梢細胞へのコレステロールの効率的な移動に関与している。Ａｐｏ Ｂ－１００を吸着するＮＣＰの能力を確認するために、ＺｎＰ ＮＣＰをＡｐｏ Ｂ－１００タンパク質と共に３時間インキュベートした。非結合のＡｐｏ Ｂ－１００は０．０１Ｍの酢酸によって沈殿したが、ＮＣＰに結合したＡｐｏ Ｂ－１００は溶液中に残った。遠心分離後、上清中のＡｐｏ Ｂ－１００の量をＢＣＡアッセイにより測定した。ＮＣＰ濃度が増加するにつれて、ＮＣＰに結合したＡｐｏ Ｂ－１００の量が増加した。図６を参照のこと。Ａｐｏ Ｂ－１００の８０．７±２．５％が１０ｍｇのＺｎＰ粒子によって捕捉された。Ａｐｏ Ｂ－１００結合能は、コレステロールを含まないＺｎＰ粒子では２６．４±４．５％に減少した。これらの結果は、ＮＣＰのＡｐｏ Ｂ－１００への結合の媒介におけるコレステロールの役割と、腫瘍へのその潜在的な能動的取り込みを裏付けている。
ＬＤＬＲ媒介エンドサイトーシスを介した腫瘍細胞によるＮＣＰ粒子の取り込みを、蛍光標識ＬＤＬ（Ｄｉｌ－ＬＤＬ）及びシェル中にＣｈｏｌ－ＳＮ３８の代替としてＣｈｏｌ－ピロを含み、コア中にＯｘＰｔの代替としてＣｅ６を含むＮＣＰ粒子を使用して確認した。ＭＣ３８細胞によるＮＣＰとＣｅ６ ＮＣＰの両方の取り込みレベルは、抗ＬＤＬＲ抗体（ａ－ＬＤＬＲ）によるＬＤＬＲ遮断により、用量に比例する形で減少した。図７Ａ及び７Ｂを参照のこと。ＬＤＬＲ遮断により、ＭＣ３８細胞によるＤｉｌ－ＬＤＬの取り込みは、Ｃｈｏｌ－ピロＮＣＰ及びＣｅ６ ＮＣＰと同じ割合で減少し、これは、ＬＤＬＲ媒介エンドサイトーシスがＮＣＰの細胞取り込みに主要な役割を果たしていることを示唆している。野生型ＭＣ３８細胞と比較して、ＬＤＬＲノックアウト（ＫＯ）ＭＣ３８細胞は、Ｃｈｏｌ－ピロＮＣＰ（５％）及びＣｅ６ ＮＣＰ（１５％）の遥かに低い取り込みを示した。図７Ｃを参照のこと。これらの結果は、ＬＤＬＲ媒介エンドサイトーシスがＮＣＰの細胞取り込みに主要な役割を果たしていることを示唆している。
Ｃｈｏｌ－ピロＮＣＰとＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒの共局在化、及びＣｈｏｌ－ピロの細胞取り込みレベルを可視化し、ＣＬＳＭによって決定した。図８Ａを参照のこと。２４時間のインキュベーション後、Ｃｈｏｌ－ピロ（赤）はエンド／リソソームと共局在し、ピアソンのＲ値＝０．９１であった。
ＬＤＬＲ媒介エンドサイトーシスによる腫瘍内の薬物蓄積を調べるために、１μｇのａ－ＬＤＬＲの腫瘍内注射と共に且つ該注射なしでの、２００μｇのＣｈｏｌ－ピロＮＣＰの静脈内注射の２４時間後又は４８時間後の、ＭＣ３８担持Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの腫瘍スライスのＣｈｏｌ－ピロ蛍光シグナルを決定した。ａ－ＬＤＬＲの投与により、ｃｈｏｌ－ピロシグナルが２４時間及び４８時間の時点でそれぞれ５２．９±１．５％及び６０．２±６．２％減少した。腫瘍は、ＬＤＬＲ遮断の機能としての細胞内ｃｈｏｌ－ピロシグナルのフローサイトメトリー分析のために、単一細胞懸濁液中にまた消化された。フローサイトメトリーの結果は、Ｃｈｏｌ－ピロレベルが、２４時間及び４８時間の時点で、ＬＤＬＲ遮断を伴う腫瘍細胞でそれぞれ６７．７±１．１％及び６９．０±０．４％減少したことを示した。図８Ｂを参照のこと。
ＭＣ３８腫瘍における薬物蓄積を、１μｇのａ－ＬＤＬＲの同時の腫瘍内注射と共に及び該注射なしで、３．５ｍｇ／ｋｇのＯｘＰｔ／ＳＮ３８（ＯｘＰｔ相当量に基づく）の静脈内注射後に定量的に決定した。図９Ａ及び９Ｂを参照のこと。ＬＤＬＲ遮断なしでは、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８は腫瘍において２９０．３±１３．４ｈ・μｇ／ｍＬのＰｔ ＡＵＣ０→ｔと５０．８±４．２ｈ・μｇ／ｍＬのＳＮ３８ ＡＵＣ０→ｔを示し、これは遊離ＯｘＰｔの４．９倍で、同等のＯｘＰｔ及び／又はＳＮ３８用量での遊離イリノテカンの６倍である。ＬＤＬＲ遮断により、ＯｘＰｔ ＡＵＣ０→ｔは７２％減少し、ＳＮ３８ ＡＵＣ０→ｔは９０％減少し、それぞれＯｘＰｔ及びイリノテカンに対する匹敵するレベルの薬物蓄積が得られた。ＯｘＰｔ／ＳＮ３８は様々な結腸がん細胞株（ＣＴ２６、ＭＣ３８、ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６及びＳＷ４８０）のＩＣ５０値を超える腫瘍内薬物濃度を７２時間維持したが、ＬＤＬＲ遮断を伴うＯｘＰｔ／ＳＮ３８又は遊離薬物は、ＩＣ５０値を超える腫瘍内薬物濃度を２４時間を超えて維持できなかった。これらの結果は、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８が、ＮＣＰ粒子へのＡｐｏ Ｂ－１００の吸着を介してＬＤＬＲを標的とし、インビボでｃｈｏｌ－ＳＮ３８をＬＤＬに移動させることにより、腫瘍内ＯｘＰｔ及びＳＮ３８濃度を有意に増加させることを示している。
結腸がん細胞株におけるＯｘＰｔ－ＳＮ３８のインビトロ細胞傷害性：
マウス結腸直腸がんＣＴ２６及びＭＣ３８細胞を９６ウェルプレートに２５００細胞／ウェルで２４時間播種した。オキサリプラチン、ＳＮ３８、イリノテカン、ＳＮ３８－ＴＭＳ、ｃｈｏｌ－ＳＮ３８、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８を様々な濃度で各ウェルに加え、細胞を更に４８時間インキュベートした。細胞生存率を、ＭＴＳアッセイによって測定した。
以下の表２に列挙されるように、ＯｘＰｔとＳＮ３８は両方ともＣＴ２６及びＭＣ３８細胞に対して高い毒性を有しているが、イリノテカンは毒性が低く、ＩＣ５０は約８０ｕＭである。Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８及びＳＮ３８－ＴＭＳは、毒性を発揮するためにはＳＮ３８を放出する必要があるため、ＳＮ３８よりも毒性が低い。ＯｘＰｔ／ＳＮ３８粒子は低いＩＣ５０値を示し、粒子に対するＯｘＰｔとｃｈｏｌ－ＳＮ３８の間に相乗効果があることを示している。
ＯｘＰｔ／ＳＮ３８は、ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６、及びＳＷ４８０ヒトＣＲＣ細胞において同様の相乗的細胞傷害性を示した。また、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８は、ＯｘＰｔ又はイリノテカンよりも細胞傷害性が高かった。Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８はイリノテカンより５～１０倍多い細胞傷害性であったが、酸及びエステラーゼによって引き起こされる加水分解プロセスによるＳＮ３８の遅い放出のため、ＳＮ３８よりも細胞傷害性が低かった。興味深いことに、ＳＮ３８－ＴＭＳは、ＣＴ２６細胞及びＭＣ３８細胞に対してそれぞれ８．０１±１．７３及び７．６０±０．２０μＭのＩＣ５０値で強力な細胞傷害性を示したが、この細胞傷害性は、類似のＳＮ３８誘導体２０－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチル－ＳＮ３８（ＳＮ３８－ｔＢｕ）及び２０－Ｏ－Ｂｏｃ－ＳＮ３８（ＳＮ３８－Ｂｏｃ）が３００μＭまでの濃度で細胞傷害性を示さなかったので、インサイツでＳＮ３８－ＴＭＳの加水分解から生成されたＳＮ３８から生じた可能性が高い。
フローサイトメトリーにより、ＯｘＰｔ及び／又はＳＮ３８処理細胞に対してアポトーシス／ネクローシス分析をまた実施した。ＯｘＰｔ／ＳＮ３８粒子で処理された細胞は、遥かに高い割合のアポトーシスを示した（ＯｘＰｔ及びＳＮ３８に対してそれぞれ１２．１％及び３４．８％と比較して４７．８％）が、これは、粒子に対するＯｘＰｔとｃｈｏｌ－ＳＮ３８の間の相乗効果を裏付けている。同様の傾向は遊離薬物群においてもまた見出され、これは、インビトロでの組み合わせナノ粒子からの二種の相乗的薬物の放出を裏付けている。
ＯｘＰｔ／ＳＮ３８が誘導した細胞死のメカニズムを、細胞アポトーシスについてはアネキシンＶ－ＦＩＴＣ染色で、細胞ネクローシスについてはＰＩ染色で評価した。図１０Ａを参照のこと。ＯｘＰｔとＳＮ３８の両方が、アポトーシス／ネクローシスによるプログラム細胞死を誘導した。ＯｘＰｔとＳＮ３８の組み合わせは、初期アポトーシスのアネキシンＶ＋／ＰＩ－細胞を増加させた（ＯｘＰｔの８．０±０．６％及びＳＮ３８の２５．７±１．５％と比較して、２８．４±１．２％）。同様に、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８は、後期アポトーシス／ネクローシスアネキシンＶ＋／ＰＩ＋細胞の割合を増加させた（それぞれ、ＯｘＰｔ ＮＣＰの４．９±０．６％及びＺｎＰ／ＳＮ３８の１６．４±０．９％と比較して、３４．５±３．８％）。
ＤＮＡ損傷を評価するために、処理したＭＣ３８細胞について細胞周期分布を分析した。ＯｘＰｔ ＮＣＰ及びＺｎＰ／ＳＮ３８で処理したＭＣ３８細胞は、それぞれ３２．６±０．２％及び５３．９±４．９％のＳ期停止を示した。図１０Ｂを参照のこと。対照的に、ＰＢＳ対照では２５．３±３．１％の細胞がＳ期にあった。ＯｘＰｔ／ＳＮ３８は、６３．８±３．８％のより強いＳ期停止を示した。従って、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８粒子は効果的にＤＮＡ損傷を引き起こし、抗増殖効果のためにＤＮＡ複製を阻害した。
ＪＣ－１染色を用いたフローサイトメトリー分析により、ＭＣ３８細胞をＯｘＰｔ／ＳＮ３８で２４時間処理すると、ミトコンドリア膜電位の脱分極がＰＢＳ対照と比較して５倍増加することが示された。図１０Ｃを参照のこと。ミトコンドリア膜の完全性が失われると、チトクロムｃがサイトゾルに放出され、カスパーゼ９及びカスパーゼ３が活性化されてアポトーシスが誘導される。処理したＭＣ３８細胞のミトコンドリア及びチトクロムｃを、それぞれ、商品名ＭＩＴＯＴＲＡＣＫＥＲ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）で販売されている色素（赤色蛍光）及びＦＩＴＣ結合抗チトクロムｃ抗体（緑色蛍光）で染色した。ＣＬＳＭイメージングは、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８処理が、０．２７のピアソンのＲ値で、ＭＩＴＯＴＲＡＣＫＥＲ（商標）色素と抗チトクロムｃ抗体シグナルの明らかな分離を誘導し、ミトコンドリアからのチトクロムｃの有意な放出を示している。
ｃｈｏｌ－ＳＮ３８及びＳＮ３８－ＴＭＳからのＳＮ３８の放出：
ＯｘＰｔ／ＳＮ３８粒子に負荷されたｃｈｏｌ－ＳＮ３８がインビボでＳＮ３８を放出できることを確認するために、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８粒子をＰＢＳ又はラット血漿で希釈して、ｃｈｏｌ－ＳＮ３８の２００ｐｐｍ溶液を作製し、溶液を３７℃においてインキュベートした。サンプルを１時間、５時間及び２４時間で収集し、酢酸エチルで抽出した。ＬＣ－ＨＲＭＳを使用して有機層を分析し、ＳＮ３８、ＴＭＳ－ＳＮ３８、及びｃｈｏｌ－ＳＮ３８のパーセンテージを決定した。ＰＢＳでインキュベートした場合、２４時間後にＳＮ３８の有意な放出は見出されなかったが、約５３．８６％のｃｈｏｌ－ＳＮ３８がラット血漿中でエステラーゼの助けを借りてＴＭＳ－ＳＮ３８又はＳＮ３８に分解された。以下の表３を参照のこと。この実験は、ＳＮ３８－ＴＭＳとＳＮ３８がインビボで放出されうることを証明している。
ＳＮ３８－ＴＭＳを、３７℃においてエンドソームを模倣する酸性条件でインキュベートした。ｐＨ＝５．５では、７０％のＳＮ３８－ＴＭＳが２４時間でＳＮ３８に変換し、９２％の７０％ＳＮ３８－ＴＭＳが４８時間でＳＮ３８に変換した。この結果は、エンドソームに取り込まれると、エンドソーム中のｐＨが低いため、ＳＮ３８－ＴＭＳがＳＮ３８に容易に変換されうることを示している。ＳＮ３８－ＴＭＳからのＳＮ３８の放出は、生理学的ｐＨ（７．４）ではより遅い：２４時間のインキュベーションは２６％のＳＮ３８を放出し、４８時間のインキュベーションは６３％のＳＮ３８を放出した。
ＯｘＰｔ／ＳＮ３８からのＯｘＰｔ及びＳＮ３８の腫瘍応答性放出：
ｐＨ＝４．７において、ＯｘＰｔ／ｓｎ３８からのｃｈｏｌ－ＳＮ３８は２０－ＯＴＭＳ及びカーボネート結合の両方で加水分解され、７２時間でＳＮ３８を９５％の収率で放出した。図１１Ａを参照のこと。しかし、ｐＨ＝７．４において７２時間では無視できる量のＳＮ３８がＯｘＰｔ／ｓｎ３８から放出された。図１１Ｂを参照のこと。図１２Ａもまた参照のこと。他方、腫瘍細胞中のカルボキシエステラーゼは、イリノテカンからのＳＮ３８の放出に寄与することが知られている。ＯｘＰｔ／ＳＮ３８からのＳＮ３８の放出を、１０ユニット／ｍＬのエステラーゼを含むＰＢＳ中で試験した。２８％のＣｈｏｌ－ＳＮ３８が０．５時間でＳＮ３８－ＴＭＳに加水分解された。７２時間後、ＳＮ３８－ＴＭＳとＳＮ３８がそれぞれ８０％と７％の収量で生成された一方、Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８は１３％しか残っていなかった。これらの結果は、エンド／リソソームのエンドサイトーシスＯｘＰｔ／ＳＮ３８からのＳＮ３８の放出に対する二重活性化メカニズムを示している：低ｐＨでは、２０－ＯＴＭＳが迅速に加水分解されて、ＴＭＳなしのＣｈｏｌ－ＳＮ３８を生成し、これがカーボネート結合において更に加水分解されて、ＳＮ３８が得られる。図１３を参照のこと。その一方で、がん細胞中のエステラーゼがカーボネート結合を加水分解してＳＮ３８－ＴＭＳをもたらし、これがプロトン／ＴＭＳ交換によってＳＮ３８に変換される。ｃｈｏｌ－ＳＮ３８の腫瘍応答性は、非常に強力なＳＮ３８の血液曝露を潜在的に最小限に抑えることができ、従って、好中球減少症などのイリノテカン治療に伴う一般的な有害事象を緩和する。
Ｚｎ２＋イオンとＯｘＰｔ－ｂｐによって形成されるＮＣＰコアは、酸性環境で崩壊することが知られている。図１４Ａを参照のこと。ｐＨ＝７．４及び３７℃において、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８は４８時間の過程で６％未満のＰｔを放出した。ｐＨ＝４．７及び３７℃において、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８粒子は直ぐに崩壊し、Ｐｔ（ｄａｃｈ）（オキサレート）（ビスカルバメート）（ＯｘＰｔ－ｂｃ）を５時間で８２％の収率で、４８時間で９５％の収率で放出した。図１２Ｂを参照のこと。５ｍＭのアスコルベートの存在下で、放出されたＯｘＰｔ－ｂｃは効率的に還元されてＯｘＰｔを形成した。ｐＨ＝４．７の５ｍＭのアスコルベートを含むＰＢＳ中では、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８中のＯｘＰｔ－ｂｃプロドラッグは還元されて、５時間で７０％の収率でＯｘＰｔを生成した。図１４Ｂを参照のこと。これらの結果は、がん細胞におけるＳＮ３８とＯｘＰｔの両方のトリガーされた放出を示している。
スプラーグドーリーラットにおける薬物動態（ＰＫ）：
２．０ｍｇのＯｘＰｔ／ｋｇの用量でのＯｘＰｔ／ＳＮ３８を、尾静脈を介して３匹のスプラーグドーリーラットに注射し、各ラットから４００ｕＬの血液サンプルを５分、０．５時間、１時間、３時間、５時間、８時間、２４時間、４８時間で採取した。血液サンプルを１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、分析のために血漿を収集した。２００μＬの金属を含まない濃硝酸を５０μＬの血漿に加え、完全な消化のために４８時間インキュベートした。消化された血漿を、Ｐｔ濃度についてＩＣＰ－ＭＳによって測定した。図２Ａを参照のこと。別の５０μＬの血漿を、１００μＬの飽和ＮａＣｌ溶液と１００μＬの０．５％のトリトンＸ－１００水溶液で希釈し、ついで２００μＬの酢酸エチルで抽出した。次に、有機層を、ｃｈｏｌ－ＳＮ３８、ＳＮ３８－ＴＭＳ、及びＳＮ３８濃度についてＬＣ－ＨＲＭＳを使用して分析した。
図１５Ａ及び１５Ｂ並びに以下の表４に示されるように、粒子コア中のＯｘＰｔは、３０時間超のｔ１／２を有する長い循環と５７４μｇ／ｍｌ＊ｈのＰｔ ＡＵＣ０→∞を示し、粒子表層上のｃｈｏｌ－ＳＮ３８は、８時間のｔ１／２と１９２４μｇ／ｍｌ＊ｈのＡＵＣ０→∞を示した。ＴＭＳ－ＳＮ３８及びＳＮ３８は、それぞれ５．３時間及び２．２時間の半減期と、それぞれ１９μｇ／ｍｌ＊ｈ及び４．４μｇ／ｍｌ＊ｈのＡＵＣ０→∞値で血漿中で検出された。従って、Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８は、循環中にＴＭＳ－ＳＮ３８及びＳＮ３８をゆっくりと放出して、長期にわたってＳＮ３８の有効濃度を維持できる。
腫瘍担持マウスにおけるＰＫ及び体内分布（ＢＤ）
６週齢のｂａｌｂ／ｃマウスの右側腹部に１００万個のＣＴ２６細胞を播種し、腫瘍が２００ｍｍ３のサイズより大きくなったときに（約１４日）、４ｍｇのＯｘＰｔ／ｋｇの用量でＯｘＰｔ／ＳＮ３８を静脈内注射し、マウスの腫瘍を注射の１時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間後に採取した。ラットＰＫについて上に記載した同じ方法で血液サンプルを分析した。腫瘍を１ｍｍ３よりも小片に切断し、撹拌してよく混合した後、約２０ｍｇの腫瘍片を量り、分析に使用した。ＯｘＰｔ分布を決定するために、２０ｍｇの腫瘍サンプルを２００μＬの金属を含まない濃硝酸に加え、８０℃において１時間、室温において７２時間インキュベートした。次に、ＩＣＰ－ＭＳ分析の前に、６．８ｍＬの脱イオン水を各サンプルに加えてそれを２％の硝酸溶液に希釈した。ＳＮ３８、ＳＮ３８－ＴＭＳ、及びｃｈｏｌ－ＳＮ３８濃度を決定するために、各２０ｍｇのサンプルを１００μＬの飽和ＮａＣｌ溶液と１００μＬの０．５％のトリトンＸ－１００水溶液で均質化し、ついで２００μＬの酢酸エチルで抽出した。ＬＣ－ＨＲＭＳ分析のために酢酸エチル層を収集して、ＳＮ３８、ＳＮ３８－ＴＭＳ、及びｃｈｏｌ－ＳＮ３８濃度を決定した。
腫瘍は、注射後２４時間で９．７％ＩＤ／ｇの最も高いＰｔ濃度を有していた。図１６Ａ及び１６Ｂを参照のこと。Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８は、注射後２４時間で約５％ＩＤ／ｇの最も高い腫瘍蓄積を有していた。Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８は、ＴＭＳ－ＳＮ３８中間体を通してＳＮ３８をゆっくりと放出した。腫瘍中のＳＮ３８濃度は、注射後４８時間で１３０ｎｇ／ｍＬに維持され、これは、ＳＮ３８のＩＣ５０（８６ｎｇ／ｍｌ）よりも高い。３ｍｇ／ｋｇのＯｘＰｔの用量でＯｘｐｔ／Ｓｎ３８を静脈内注射した腫瘍担持マウスの場合、血漿中のＳＮ３８のＡＵＣ０→∞は約１２μｇ／ｍｌ＊ｈで、腫瘍中では８．０９±０．１２μｇ／ｍｌ＊ｈに達した。以下の表５を参照のこと。
インビボ毒性と効果
ラットとマウスに様々な用量レベルでＯｘＰｔ／ＳＮ３８を静脈内注射し、その体重をモニターして薬物耐性を決定した。図１７を参照のこと。
３ｍｇ／ｋｇのＯｘｐｔ／ＳＮ３８を３日に一回（Ｑ３Ｄ）投与したマウスでは、繰り返し処置中に体重の損失はなく、この用量レジメンが十分に耐容性があることを示している。結腸がんモデルでの効果を決定するために、１００万個のＭＣ３８細胞を６週齢のＣ５７ｂｌ／６マウスの右側腹部に接種し、腫瘍のサイズが約１００ｍｍ３に達した７日目に処置を開始した。マウスにＯｘＰｔ／ＳＮ３８、ＯｘＰｔ ＮＣＰ（コアにＯｘＰｔプロドラッグのみを含む粒子）、ＺｎＰ／ＳＮ３８（シェルにＣｈｏｌ－ＳＮ３８のみを含む粒子）、及びＯｘＰｔ＋イリノテカンをＱ３Ｄスケジュールで３ｍｇ／ｋｇの相当ＯｘＰｔ用量で投与した。７５μｇの抗ＰＤ－Ｌ１抗体を、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８群の一つで腹腔内にもまた投与した。図１８に示されるように、ＯｘＰｔ ＮＣＰ及びＺｎＰ／ＳＮ３８の両方が腫瘍増殖を遅らせた。ＯｘＰｔ／ＳＮ３８は、著しく優れた抗腫瘍効果を示した。抗ＰＤ－Ｌ１抗体をＯｘＰｔ／ＳＮ３８治療に追加すると、腫瘍を効果的に制御するための抗腫瘍効果が更に向上した。この結果は、免疫チェックポイントの遮断とＯｘＰｔ／ＳＮ３８治療の相乗効果を示している。
ＭＣ３８腫瘍に対するＯｘＰｔ／ＳＮ３８の抗がん効果を、Ｑ３Ｄスケジュールで３ｍｇ／ｋｇのＯｘＰｔを、Ｑ７Ｄスケジュールで６ｍｇ／ｋｇのＯｘＰｔを用いた別の実験で確認した。両方のレジメンが、ＭＣ３８腫瘍の増殖を効果的に制御した。図１９を参照のこと。Ｂａｌｂ／ｃマウスに移植されたＣＴ２６腫瘍について、同様の腫瘍増殖阻害を観察した。図２０Ａを参照のこと。驚くべきことに、ＨＴ２９腫瘍担持ヌードマウスのＯｘＰｔ／ＳＮ３８治療は、Ｑ３Ｄスケジュールで３ｍｇ／ｋｇのＯｘＰｔ用量で持続的な腫瘍退縮を示した。図２０Ｂを参照のこと。これらの処置されたマウスの全てで有意な体重減少は観察されず、Ｑ３Ｄスケジュールで３ｍｇ／ｋｇのＯｘＰｔ、又はＱ７Ｄスケジュールで３ｍｇ／ｋｇのＯｘＰｔの、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８の反復投与がマウスによって十分に許容されることを示唆している。
ＯｘＰｔ／ＳＮ３８の追加のインビボ抗がん研究を、皮下ＭＣ３８及びＣＴ２６マウス及びＨＴ２９、ＨＣＴ１１６及びＳＷ４８０ヒト結腸直腸腺癌モデルで実施した。腫瘍が体積８０～１２０ｍｍ３に達したときに、マウスに３日に一回（Ｑ３Ｄ）静脈内に異なる治療剤を注射した。ＯｘＰｔ／ＳＮ３８、ＯｘＰｔ＋イリノテカン、ＯｘＰｔ ＮＣＰ、及びＺｎＰ／ＳＮ３８を、それぞれ、３．５ｍｇのＯｘＰｔ／ｋｇ相当及び１５．９ｍｇのＣｈｏｌ－ＳＮ３８／ｋｇ（６．２ｍｇ／ｋｇのＳＮ３８に相当）、３．５ｍｇのＯｘＰｔ／ｋｇ及び２０．２ｍｇ／ｋｇのイリノテカン（１１．７ｍｇ／ｋｇのＳＮ３８相当）、３．５ｍｇのＯｘＰｔ／ｋｇ相当、及び１５．９ｍｇのＣｈｏｌ－ＳＮ３８／ｋｇ（６．２ｍｇ／ｋｇのＳＮ３８相当）で投与した。全ての試験モデルにおいて、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８は、体重、主要臓器の組織検査、並びに肝機能及び腎機能検査の両方で判断される最小限の毒性で有意に良好な腫瘍増殖阻害／退縮に至った。
ＯｘＰｔ／ＳＮ３８の８回の静脈内注射後のＭＣ３８腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、９２．２％の腫瘍増殖阻害（１－（ＲＴＶＴ／ＲＴＶＣ）として定義されるＴＧＩ（ここで、ＲＴＶ＝エンドポイント腫瘍体積））を示した。ＳＮ３８相当用量が１．９倍高いにもかかわらず、ＯｘＰｔ＋イリノテカンは２２．３％の中程度のＴＧＩをもたらした。ＯｘＰｔ ＮＣＰ及びＺｎＰ／ＳＮ３８は、それぞれ６６．９％及び１６．４％のＴＧＩ値で中程度に腫瘍増殖を阻害した。マウスは、全ての群で安定した体重で治療をよく許容した。
好中球減少症が、典型的にはＩＲＯＸレジメンの場合の最も深刻な副作用であり、３０％のｍＣＲＣ患者が、ＯｘＰｔ＋イリノテカンの反復投与後に重症の好中球減少症を経験する。ＰＢＳ又はＯｘＰｔ／ＳＮ３８の８回の静脈内注射或いはＯｘＰｔ＋イリノテカンの３回の静脈内注射の後、ＭＣ３８腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウスから血液サンプルを収集した。フローサイトメトリー分析では、ＰＢＳ対照と比較してＯｘＰｔ＋イリノテカンで処置したマウスにおいて絶対好中球数（ＡＮＣ）が減少したが、ＰＢＳ対照と比較してＯｘＰｔ／ＳＮ３８で処置したマウスでは僅かに増加したことが示された。図２１を参照のこと。よって、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８処置は、ＩＲＯＸレジメンにおける重症の好中球減少症の用量制限毒性を克服した。
８及び１５用量のＰＢＳ又はＯｘＰｔ／ＳＮ３８の後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）のレベル、及び血清クレアチニンレベルを測定することにより、肝機能及び腎機能を定量した。ＯｘＰｔ／ＳＮ３８で処置されたマウスのＡＳＴ及びＡＬＴレベルは、ＰＢＳ対照に対して僅かに増加したが、十分に正常な範囲内である。クレアチニンレベルは、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８で処置されたマウス（０．２４±０．０７ｍｇ／ｄＬ）とＰＢＳで処置されたマウス（０．２２±０．０１ｍｇ／ｄＬ）間で変化がなかった。これらの結果は、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８の反復投与がマウスの肝毒性と腎毒性を引き起こさないことを示している。
マウス結腸直腸癌（ＣＴ２６）モデルにおいて、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８、ＯｘＰｔ＋イリノテカン、ＯｘＰｔ ＮＣＰ、及びＺｎＰ／ＳＮ３８は、それぞれ、９０．９±７．１％、２７．６±９．９％、５１．６±１８．７％、及び２９．１±１９．７％のＴＧＩ値を示した。従って、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８は、二種の薬物間で強力な相乗効果を示し、他の群に対して大きく増強された抗がん効果をもたらした。全てのマウスは、体重の明らかな減少なしで処置をよく許容した。
ＯｘＰｔ／ＳＮ３８は、ヒト結腸直腸腺癌のマウス異種移植モデルに対する抗がん効果をまた示した。腫瘍担持マウスに、１６用量についてＰＢＳ、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８、又はＯｘＰｔ＋イリノテカンを静脈内注射した。ＨＴ２９モデルの場合、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８は腫瘍を退縮させ、ＰＢＳ群のエンドポイントで９９．４±０．４％のＴＧＩをもたらした。図２２Ａを参照のこと。ＯｘＰｔ＋イリノテカンは腫瘍を僅かだけ阻害し、３２．２±２２．５％のＴＧＩをもたらした。４５日目にＯｘＰｔ／ＳＮ３８処置を中止した後、ＨＴ２９腫瘍は更に１２日間阻害されたが、最終的には５７日目以降に再増殖した。ＯｘＰｔ／ＳＮ３８及びＯｘＰｔ＋イリノテカン処置は、ＰＢＳ対照の３３日からそれぞれ９７日及び３６日間まで、生存期間中央値を延長した。図２２Ｂを参照のこと。３６ｍｇのＣｈｏｌ－ＳＮ３８の用量でのＺｎＰ／ＳＮ３８はまた、８７．０±３．９％のＴＧＩでＨＴ２９腫瘍の増殖を効果的に阻害した。全ての群のマウスは、処置をよく許容した。
ＯｘＰｔ／ＳＮ３８は、また、ＨＣＴ１１６及びＳＷ４８０腫瘍モデルに対して抗腫瘍効果を示した。ＨＣＴ１１６モデルの場合、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８は腫瘍を退縮させ、１８日目にＰＢＳ群のエンドポイントで９８．７±０．８％のＴＧＩをもたらした。ＯｘＰｔ＋イリノテカンは、１８日目に７２．４±９．７％のＴＧＩを示した。図２３Ａを参照のこと。ＯｘＰｔ／ＳＮ３８及びＯｘＰｔ＋イリノテカンは、ＰＢＳ群に対して１８日間からそれぞれ１８日間から１０６日及び４０日にマウス生存期間を延ばした。ＳＷ４８０モデルの場合、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８は腫瘍を退縮させ、１７日目にＰＢＳ群のエンドポイントで９６．９±１．０％のＴＧＩをもたらし、ＯｘＰｔ＋イリノテカンは５７．９±１２．８％の中程度のＴＧＩを与えた。図２３Ｂを参照のこと。ＯｘＰｔ／ＳＮ３８及びＯｘＰｔ＋イリノテカンは、それぞれＰＢＳ群の１７日から１０９日及び３２日にマウスの生存期間を延ばした。従って、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８は、独特の作用機序、５種のＣＲＣ腫瘍モデルでの優れた抗腫瘍効果、及び優れた安全性プロファイルを有している。
ＬＤＬＲ媒介エンドサイトーシスはＯｘＰｔ／ＳＮ３８の抗がん効果を決定する：
Ｑ３Ｄスケジュールで１μｇのａ－ＬＤＬＲを腫瘍内投与することにより、同時のＬＤＬＲ遮断を伴う静脈内注射ＯｘＰｔ／ＳＮ３８の腫瘍増殖阻害を研究して、抗がん効果に対するＬＤＬＲ媒介エンドサイトーシスの役割を決定した。図２４Ａを参照のこと。ａ－ＬＤＬＲはＩｇＧ対照に対して４０．２±１９．４％のＴＧＩで腫瘍増殖を示したが、同時のＬＤＬＲ遮断を伴うＯｘＰｔ／ＳＮ３８処置は、同時のＩｇＧ注射を伴うＯｘＰｔ／ＳＮ３８処置に対する９１．２±３．８％のＴＧＩと比較して５１．６±５．５％のＴＧＩで抗腫瘍効果を有意に弱めた。結果はエンドポイントでの腫瘍重量によって実証された：同時のＩｇＧ注射によるＯｘＰｔ／ＳＮ３８処置では、９２％のＴＧＩが示されたが、同時のＬＤＬＲ遮断を伴うＯｘＰｔ／ＳＮ３８処置では、５７％のＴＧＩが示された。図２４Ｂを参照のこと。これらのＬＤＬＲ遮断結果は、ＬＤＬＲノックアウトＭＣ３８腫瘍細胞を使用して皮下腫瘍を確立することにより確認された。ＯｘＰｔ／ＳＮ３８の抗がん効果は、ＬＤＬＲノックアウト腫瘍ではほぼ消失し、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８群とＰＢＳ群の間に有意差はなかった。図２５を参照のこと。
腫瘍細胞に対するインビボ細胞傷害性を、組織病理学的分析を通じて更に調べた。Ｈ＆Ｅ染色は、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８で処置されたＭＣ３８腫瘍において重度のネクローシスを示したが、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８及びａ－ＬＤＬＲで処置されたＭＣ３８腫瘍では遥かに少ないネクローシスを示した。ＴＵＮＥＬ及びカスパーゼ３ＩＨＣ染色は、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８によって誘導された強力なアポトーシスを示したが、ＬＤＬＲが遮断されたときにはアポトーシスが大きく減少した。これらの結果は、ＬＤＬＲ媒介エンドサイトーシスがインビボでのＯｘＰｔ／ＳＮ３８の腫瘍取り込みに関与しており、抗腫瘍効果に役割を果たすことを示している。
考察：
何十年もの間、ＳＮ３８（ＬｏｇＰ＝３．３７）などの有機細胞傷害性抗がん剤は親水性基で修飾されて、水溶液中で可溶性又は僅かに可溶性にされている。水不溶性ＳＮ３８の水溶性イリノテカン塩酸塩（ＬｏｇＰ＝－０．４５）への変換は、有機抗がん剤デザインの最も成功した例の一つである。疎水性化学療法剤の血漿タンパク質への結合は、代替アプローチを提示し、高度に発現した受容体を能動的に標的としうる。例えば、ｎａｂ－パクリタキセル（アルブミン－パクリタキセルナノ粒子）は、おそらく内皮細胞のＧｐ６０トランスサイトーシス経路を標的とし、腫瘍細胞外マトリクス中の酸性でシステインリッチの分泌タンパク質（ＳＰＡＲＣ）に結合することにより、幾つかの腫瘍でパクリタキセルよりも優れた効果を示した。本開示の主題の一態様によれば、腫瘍におけるＬＤＬＲの能動的標的化を介して併用化学療法剤を共送達する新しい戦略が開示される。ここでは、ＳＮ３８を、急速に増殖する腫瘍細胞に不可欠なコレステロール及び関連誘導体の移動に関与するリポタンパク質であるＬＤＬをハイジャックする不安定なアセタール結合を通して高度に疎水性のコレステロール（ＬｏｇＰ＝７．０２）にコンジュゲートさせた。Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８内のアセタールリンカーは、腫瘍内で選択的に切断されて、酸性及びエステラーゼ触媒加水分解の両方を介してＳＮ３８を放出した。本開示の戦略により、ＬＤＲＤ媒介エンドサイトーシスを介した腫瘍標的化のために疎水性プロドラッグを設計することが可能になる。
全身性に注入されたナノ治療剤は、その親薬物よりも血液循環を延長することが長い間示されてきた。長く循環するナノ粒子がＥＰＲ効果の結果として腫瘍中に優先的に蓄積されると以前は考えられていた。ここでは、合理的に設計されたコアシェルＮＣＰ粒子が、親水性ＯｘＰｔ－ｂｐ及び疎水性Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８プロドラッグの両方の充填をもたらしただけでなく、腫瘍中での薬物取り込みを有意に向上させるためにＬＤＬＲを能動的に標的としたことが示されている。Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８はＬＤＬに強く結合し、ＬＤＬＲ媒介エンドサイトーシスを介した腫瘍への能動輸送のために、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８のシェルからＬＤＬへのＣｈｏｌ－ＳＮ３８の効率的な移動をもたらした。ＳＮ３８は、酸性及びエステラーゼ触媒加水分解を介して腫瘍細胞内で選択的に放出された。他方、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８のＮＣＰコアは、血漿中のＡｐｏ Ｂ－１００を吸着し、ＬＤＬＲ経路を介して腫瘍標的化を可能にし、エンド／リソソームでの酸性トリガー型崩壊とアスコルベート及び他の細胞内還元剤による還元を介して腫瘍内にＯｘＰｔを優先的に放出した。その結果、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８は、同等の用量でＯｘＰｔに対して４．９倍、イリノテカンに対して６倍、ＯｘＰｔの腫瘍沈着を有意に増加させた。
ＩＲＯＸは、ＣＲＣ細胞でのＯｘＰｔとＳＮ３８の相乗作用のため、ｍＣＲＣに対する標準化学療法レジメンの一つである。腫瘍内ＯｘＰｔ及びＳＮ３８濃度を増加させることにより、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８は、マウス及びヒトＣＲＣ細胞についてインビトロ及びインビボでＯｘＰｔとＳｎ３８の間の相乗効果を最大化した。ＯｘＰｔ／ＳＮ３８は、ＤＮＡをＯｘＰｔと同時に架橋し、ＳＮ３８でトポイソメラーゼ１を阻害し、重度のＤＮＡ損傷、ＤＮＡ複製の阻害、ミトコンドリア膜の破壊を引き起こした。ＯｘＰｔ／ＳＮ３８は、ＭＣ３８及びＣＴ２６マウスＣＲＣ腫瘍モデルで＞９２％の腫瘍増殖阻害を、ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６、及びＳＷ４８０ ＣＲＣ腫瘍モデルで＞９７％の腫瘍増殖阻害を達成した。ＯｘＰｔ／ＳＮ３８は、それぞれ、ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６、及びＳＷ４８０ ＣＲＣ腫瘍モデルについて、ＰＢＳ対照と比較して６４、８８、及び９２日まで、ＯｘＰｔ＋イリノテカンと比較して６１、６６、及び７７日まで、マウスの生存率をまた延長した。ＯｘＰｔ／ＳＮ３８は、ＣＲＣの複数のマウスモデルにおいて、好中球減少症及び肝機能及び腎機能障害などの深刻な副作用を引き起こすことなく、優れた抗腫瘍効果を達成した。
実施例２
ナノスケール配位ポリマーコアシェルナノ粒子はオキサリプラチンとパクリタキセルを共送達する
コレステロール－パクリタキセル（Ｃｈｏｌ－ＰＴＸ）の合成：
１ｇ（１．５ｍｍｏｌ）のコレステロールリンカーとパクリタキセル（１．３ｇ、１．５ｍｍｏｌ、１当量）を５０ｍＬの無水ＤＣＭに溶解させた。１ｍＬ（６ｍｍｏｌ、４当量）のＤＩＰＥＡを溶液に加え、溶液を窒素下で室温において２４時間撹拌した。得られた深い黄色の溶液を１００ｍＬのＤＣＭで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３で３回、続いて１ＭのＨＣｌ及び飽和ＮａＣｌで洗浄した。ついで、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で２時間乾燥させ、ロータリーエバポレーターで濃縮した。シリカゲルを使用するカラムクロマトグラフィーにより生成物を更に精製した。生成物を１．５：１のヘキサン：ＥｔＯＡｃで溶出させた。収量：０．３６ｇ（０．２６ｍｍｏｌ、１７％）。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、クロロホルム－ｄ）δ８．１３（ｄ、２Ｈ）、７．７５（ｄ、２Ｈ）、７．５３（ｍ、１Ｈ）、７．３７－７．４３（ｍ、１０Ｈ）、７．０８（ｄ、１Ｈ）、６．２９（ｓ、２Ｈ）、６．０２（ｄ、１Ｈ）、５．７８（ｄｄ、２Ｈ）、５．７３（ｄ、１Ｈ）５．４７（ｄ、１Ｈ）、５．３８（ｄ、１Ｈ）、４．９５（ｄ、１Ｈ）、４．６２（ｍ、１Ｈ）、４．４５（ｍ、１Ｈ）、４．２８（ｄｄ、２Ｈ）、３．８５（ｄ、１Ｈ）、２．１０－２．９０（ｍ、１６Ｈ）、０．８０－２．１０（ｍ、５２Ｈ）、０．６７（ｓ、３Ｈ）。ＥＳＩ－ＭＳ：ｍ／ｚ＝１４１３．７２６３（［Ｍ＋ＮＨ４］＋の予想値１４１３．７２５５）。
Ｃｈｏｌ－ＰＴＸのＩＣ５０値は、ＬＬ／２肺がん細胞に対しての０．２４μＭであるＩＣ５０と比較して、３．９５μＭであると定量された。
ＯｘＰｔ／ＰＴＸコアシェルナノ粒子の合成と特徴付け：
０．２１ｍｇのコレステロール、０．４２ｍｇのＤＯＰＣ、０．７５ｍｇのＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋ、０．２５ｍｇのｃｈｏｌ－ＰＴＸ及び０．５ｍｇのＯｘＰｔベアＮＣＰ粒子を８０ｕＬのＴＨＦに混合し、５０℃において１７００ｒｐｍで撹拌しながら５００μＬの３０％のＥｔＯＨに加えた。混合物を１００ｕＬに濃縮して、ＯｘＰｔ／ＰＴＸコアシェルナノ粒子を得た。ＯｘＰｔ／ＳＮ３８粒子のＺ平均粒径及びＰＤＩは、ＤＬＳによって１０１．１ｎｍ及び０．０９３であった。
実施例３
ナノ粒子はポドフィロトキシンを送達する
コレステロール－ポドフィロトキシン（Ｃｈｏｌ－ＰＰＸ）の合成：
ＰＰＸ（０．４１ｇ）及びＤＩＰＥＡ（０．１３ｇ）を無水ＤＣＭ（１００ｍＬ）に懸濁させた。クロロギ酸クロロメチル（０．１３ｇ）を氷水浴中のＰＰＸ懸濁液に加え、得られた混合物を室温において２４時間撹拌した。溶液を水（３×２０ｍＬ）及びブライン（３×２０ｍＬ）で洗浄し、ついで無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。有機溶媒を減圧下で蒸発させ、得られたＰＰＸ－Ｃｌを真空下で一晩乾燥させた（収量：０．３３ｇ、６５％）。
ＰＰＸ－Ｃｌ（０．５１ｇ）を無水アセトン（７５ｍＬ）に溶解させた。次にＮａＩ（０．１５ｇ）を添加した。混合物を暗所で５０℃において２４時間撹拌した。有機溶媒を除去し、生成物をエーテル（１５０．０ｍＬ）に再溶解させた。溶液を１０％のＮａ２ＳＯ３（３×２０ｍＬ）、水（３×２０ｍＬ）、及びブライン（３×２０ｍＬ）で洗浄し、ついで無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。有機溶媒を減圧下で蒸発させ、得られたＰＰＸ－Ｉを真空下で一晩乾燥させた（収量：０．５０ｇ、８３％）。
コレステロール－ＣＯＯＨ（０．４９ｇ）をアセトニトリル（２０ｍＬ）に溶解させた。アセトニトリル（５０ｍＬ）に溶解させたＰＰＸ－Ｉ（０．６０ｇ）を氷水浴中でコレステロール－ＣＯＯＨ溶液に滴下して加え、続いて過剰の炭酸銀（２．７６ｇ）を加えた。混合物を８０℃において３６時間撹拌した。沈殿物を濾過して除去した後、有機溶媒を除去した。残留物を酢酸エチル（１００．０ｍＬ）に再溶解させ、溶液を１０％のＮａＨＣＯ３（３×２０ｍＬ）、水（３×２０ｍＬ）、及びブライン（３×２０ｍＬ）で洗浄し、ついで無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。有機溶媒を減圧下で蒸発させ、溶出剤としてＤＣＭ：酢酸エチル（３：１）を使用するシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーにより粗生成物を精製して、ｃｈｏｌ－ＰＰＸを得た（収量：０．２９ｇ、３０％）。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：０．６６－２．０５（ｍ、４１Ｈ、コレステロール）、２．３０（ｄ、２Ｈ、ＣＨ２）、２．６４（ｔ、２Ｈ、ＣＨ２）、２．７２（ｔ、２Ｈ、ＣＨ２）、２．９４（ｍ、２Ｈ、ＣＨ、ＣＨ）、３．７４（ｓ、６Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ３）、３．８０（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、４．２３（ｔ、１Ｈ、ＣＨＨ）、４．４９（ｔ、１Ｈ、ＣＨ）、４．６０（ｍ、２Ｈ、ＣＨ、ＣＨＨ）、５．３４（ｍ、１Ｈ、ＯＣＨ）、５．８２（ｍ、３Ｈ、ＣＨ、ＯＣＨ２Ｏ）、５．９９（ｄ、２Ｈ、ＯＣＨ２Ｏ）、６．３７（ｓ、２Ｈ、ＣＨ、ＣＨ）、６．５４（ｓ、１Ｈ、ＣＨ）、６．８７（ｔ、１Ｈ、ＣＨ）。［Ｍ＋ＮＨ４］＋のｍ／ｚは９７４．５２７５であると決定された（予想ｍ／ｚ＝９７４．５２６６）。
ＰＰＸ－ＮＰの合成：
０．２１ｍｇのコレステロール、０．４２ｍｇのＤＯＰＣ、０．７５ｍｇのＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋ、０．２ｍｇのｃｈｏｌ－ＰＰＸ、及び０．５ｍｇのカルボプラチンベアＮＣＰ粒子を８０ｕＬのＴＨＦに混合し、５０℃において１７００ｒｐｍで撹拌しながら５００ｕＬの３０％のＥｔＯＨに加えた。混合物を１００ｕＬに濃縮して、Ｃａｒｂｏ／ＰＰＸコアシェルナノ粒子を得た。Ｃａｒｂｏ／ＰＰＸ粒子のＺ平均粒径及び多分散性（ＰＤＩ）は、動的光散乱（ＤＬＳ）により９８．９ｎｍ及び０．１１１であった。図２６を参照のこと。
実施例４
ナノ粒子はオキサリプラチン、ゲムシタビン及びＳＮ３８を共送達する
様々なＣｈｏｌ－ＳＳ－ＳＮ３８（ジスルフィドリンカー）を用いたナノ粒子の合成：
０．２１ｍｇのコレステロール、０．４２ｍｇのＤＯＰＣ、０．７５ｍｇのＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋ、０．２ｍｇのＣｈｏｌ－ＳＳ－ＳＮ３８及び０．５ｍｇのＯｘＰｔ／ゲムシタビン（ＧＥＭ）ベアＮＣＰ粒子（Ｃ．Ｐｏｏｎ等 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ２０１（２０１５）９０－９９）を８０μＬのＴＨＦに混合し、５０℃において１７００ｒｐｍで撹拌しながら５００μＬの３０％ＥｔＯＨに加えた。混合物を１００μＬに濃縮して、ＯｘＰｔ／ＧＥＭ／Ｃｈｏｌ－ＳＳ－ＳＮ３８コアシェルナノ粒子を得た。Ｃｈｏｌ－ＳＳ－ＳＮ３８－Ｂｏｃで合成された（ここでは「ＯｘＰｔ／ＧＥＭ／ＳＮ３８－Ｂｏｃ」とも呼ばれる）ＯｘＰｔ／ＧＥＭ／Ｃｈｏｌ－ＳＳ－ＳＮ３８粒子のＺ平均粒径及びＰＤＩは、ＤＬＳにより９６．７９ｎｍ及び０．２１１であった。Ｃｈｏｌ－ＳＳ－ＳＮ３８及びＣｈｏｌ－ＳＳ－ＣＰＴで作製されたナノ粒子は、より大きな粒径を示す。以下の表６を参照のこと。
ＯｘＰｔ／ＧＥＭ／Ｃｈｏｌ－ＳＳ－ＳＮ３８－Ｂｏｃのインビボ効果：
マウス結腸がんモデルでの効果を定量するために、１００万個のＣＴ２６細胞を６週齢のＢａｌｂ／ｃマウスの右側腹部に接種し、腫瘍サイズが約１００ｍｍ３に達した７日目に処置を開始した。マウスに、Ｑ３Ｄスケジュールで３ｍｇ／ｋｇのＯｘＰｔの用量で４：１：１のモル比でＯｘＰｔ／ＧＥＭ／Ｃｈｏｌ－ＳＳ－ＳＮ３８－Ｂｏｃ）を投与した（図１０）。等しい活性剤量のＯｘＰｔ／ＧＥＭ及びＯｘＰｔ／Ｃｈｏｌ－ＳＳ－ＳＮ３８－Ｂｏｃを対照とした。二剤併用群では、ＯｘＰｔ／ＧＥＭとＯｘＰｔ／Ｃｈｏｌ－ＳＳ－ＳＮ３８－Ｂｏｃの両方が明らかな腫瘍増殖遅延を示した。図２７Ａを参照のこと。三剤併用では、ＯｘＰｔ／ＧＥＭ／Ｃｈｏｌ－ＳＳ－ＳＮ３８－Ｂｏｃが８６．７％の腫瘍増殖阻害を示した。様々なマウス処置群で有意な体重減少は観察されなかった。図２７Ｂを参照のこと。
実施例５
ＮＣＰコアシェル粒子はオキサリプラチン、ゲムシタビンモノホスフェート、及びＳＮ３８を共送達する
ＯｘＰｔ／ＧＥＭ／ＳＮ３８コアシェルナノ粒子の合成と特徴付け。「ＯｘＰｔ／ＧＭＰ／ＳＮ３８」と呼ばれる、ＯｘＰｔ－ｂｐとゲムシタビンモノホスフェート（ＧＭＰ）をコアに、Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８をシェルに含むＮＣＰ粒子を二工程で合成した。ＯｘＰｔ／ＧＭＰベア粒子を、以前に報告した我々の方法に少し変更を加えて合成した（Ｄｕａｎ，Ｘ．等 Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０２０，１０：１８９９）。簡単に説明すると、ＯｘＰｔ－ｂｐ（３０ｍｇ、１５０ｍｇ／ｍＬ）とＧＭＰ（８ｍｇ、４０ｍｇ／ｍＬ）の水溶液を、５ｍＬのシクロヘキサン中０．３ＭのトリトンＸ－１００／１．５Ｍの１－ヘキサノールに加え、ＤＯＰＡ（３０ｍｇ、ＣＨＣｌ３中２００ｍｇ／ｍＬ）の存在下で１５分間激しく撹拌した。Ｚｎ（ＮＯ３）２（６０ｍｇ、６００ｍｇ／ｍＬ）の水溶液を５ｍＬのシクロヘキサン中０．３ＭのトリトンＸ－１００／１．５Ｍの１－ヘキサノールに加え、５分間激しく撹拌した。Ｚｎ（ＮＯ３）２含有マイクロエマルジョンをＯｘＰｔ－ｂｐ含有マイクロエマルジョンに滴下して加え、室温において３０分間激しく撹拌した。１０ｍＬのエタノールを加えた後、１１６２８×ｇで遠心分離してＯｘＰｔ－ベアを得た。得られたペレットをＴＨＦ／エタノールで二回洗浄し、最後にＴＨＦに再分散させた。粒子中のＯｘＰｔの負荷量を、硝酸での消化後、ＩＣＰ－ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ ７７００ｘ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）によって定量した。粒径とゼータ電位は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｎａｎｏ ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用する動的光散乱によって定量した。ＯｘＰｔ／ＳＮ３８ベア粒子のＺ平均粒径とＰＤＩは、ＤＬＳにより５５．４ｎｍと０．１４７であった。
ＯｘＰｔ／ＧＭＰ／ＳＮ３８を、ＤＯＰＣ、コレステロール、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋ、Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８、及びＯｘＰｔ／ＧＥＭのＴＨＦ溶液（８０μＬ）を５００μＬの３０％（ｖ／ｖ）エタノール／水に室温において添加することによって調製した。ＤＯＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＳＰＥ－ＰＥＧ：Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８のモル比は３：３：１．５：１であった。混合物を１７００ｒｐｍで１分間撹拌した。ＴＨＦ及びエタノールを完全に蒸発させ、溶液を室温まで冷却させた。ＯｘＰｔ／ＧＭＰ／ＳＮ３８粒子のＺ平均粒径とＰＤＩは、ＤＬＳにより７７．９４ｎｍと０．１４５であった。
膵臓細胞株におけるＯｘＰｔ／ＧＭＰ／ＳＮ３８のインビトロ細胞傷害性：
マウス膵臓ＫＰＣ及びＰａｎｃ０２細胞を２５００細胞／ウェルで２４時間９６ウェルプレートに播種した。オキサリプラチン、ＳＮ３８、Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８、ゲムシタビン（ＧＥＭ）、ＧＭＰ、ＯｘＰｔ ＮＣＰ（単剤）、ＺｎＰ／ＳＮ３８（単剤）、ＧＭＰ ＮＣＰ（単剤）、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８（二剤）、及びＯｘＰｔ／ＧＭＰ／ＳＮ３８（三剤）を様々な濃度で各ウェルに付与し、細胞を更に４８時間インキュベートした。細胞生存率を、ＭＴＳアッセイによって測定した。
以下の表７及び８に列挙されるように、ＯｘＰｔ、ＳＮ３８及びＧＥＭは、ＫＰＣ及びＰａｎｃ０２細胞に対して高い細胞傷害性を示した。活性なゲムシタビントリホスフェートの重要な代謝物として、ＧＭＰはＫＰＣとＰａｎｃ０２に対してそれぞれ０．３０±０．０７μＭと０．０６±０．０２μＭという最低のＩＣ５０を示した。ＳＮ３８をＣｈｏｌ－ＳＮ３８に、ＯｘＰｔをＯｘＰｔ ＮＣＰに変更すると、細胞傷害性を僅かに低下させたが、二剤又は三剤の組み合わせは、それらのＩＣ５０値をそれぞれ１．２～１．８倍又は８．５～２０倍低下させる強い相乗効果を示した。
インビボ毒性及び効果：
ゲムシタビンモノホスフェートナノ粒子（ＧＭＰ ＮＣＰ）の一般毒性を、Ｑ３Ｄ投与スケジュールでＣ５７ｂｌ／６マウスで最初に試験した。マウスは２ｍｇ／ｋｇのＧＭＰ ＮＣＰに１５用量について良好に耐えた。ＧＭＰ ＮＣＰの最大耐用量は、＞２ｍｇ／ｋｇであると決定された。
三剤ナノ粒子の一般毒性を調査するために、Ｃ５７ｂｌ／６マウスにＯｘＰｔ／ＳＮ３８を３．５ｍｇのＯｘＰｔ／ｋｇで、ＧＭＰ ＮＣＰを１、１．２５、１．５、及び２ｍｇ／ｋｇ ＧＭＰで同時に投与した。マウスは１０用量分について最大１．５ｍｇ／ｋｇのＧＭＰ ＮＣＰに耐えたが、２ｍｇ／ｋｇのＧＭＰ ＮＣＰの３用量分の投与後、マウスは死亡した。ｃｈｏｌ－ＳＮ３８：ＯｘＰｔ：ＧＭＰのモル比が４：２：１であるＯｘＰｔ／ＧＭＰ／ＳＮ３８を、その後の抗がん効果研究に対して使用した。
膵臓がんモデルでの効果を定量するために、１×１０６のＫＰＣ細胞を６週齢のＣ５７ｂｌ／６マウスの右側腹部に接種し、腫瘍サイズが約１００ｍｍ３に達した７日目に処置を開始した。マウスにＰＢＳ、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８、ＯｘＰｔ／ＧＥＭ／ＳＮ３８をＱ３Ｄスケジュールで３．５ｍｇ／ｋｇの相当ＯｘＰｔ用量で投与し、安楽死エンドポイントに到達するまで連続投与した。体重に対する処置の効果を図２８Ａに示す。図２８Ｂに示されるように、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８は、ＰＢＳエンドポイントで７４．４％のＴＧＩで腫瘍増殖を中程度に阻害した。ＯｘＰｔ／ＧＥＭ／ＳＮ３８は、９５．６％のＴＧＩで遥かに高い抗腫瘍効果を示した。この結果は、ＯｘＰｔ／ＧＥＭ／ＳＮ３８の三剤間の強い相乗効果を示している。
実施例６
ＮＣＰコアシェル粒子はカルボプラチン及びドセタキセルを共送達する
コレステロール－ドセタキセル（Ｃｈｏｌ－ＤＴＸ）の合成：
２００ｍｇのＤＴＸ（２．５ｍｍｏｌ、１当量）と２５０ｍｇのコレステロールリンカー（０．３７ｍｍｏｌ、１．５当量）を２０ｍＬのバイアル中において２０ｍＬのアセトニトリルに溶解させた。５００ｍｇのＫ２ＣＯ３（３．６ｍｍｏｌ、１５当量）をバイアルに加え、ＤＴＸが完全に消失するまで３日間混合物を撹拌した。混合物を１５０ｍＬのＥｔＯＡｃで希釈し、１ＭのＨＣｌ及び飽和ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ロータリーエバポレーターで蒸発させて、無色の油を得た。２：１のヘキサン：ＥｔＯＡｃを使用してｐ－ニトロフェノールを除去し、続いて１：１のヘキサン：ＥｔＯＡｃを使用して生成物を溶出させるカラムクロマトグラフィーによって、油を精製した。収量：１８０ｍｇ（７２％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ８．１８－８．１１（ｍ、２Ｈ）、７．５３（ｔ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．４７－７．３７（ｍ、３Ｈ）、７．３７－７．３０（ｍ、３Ｈ）、６．２９（ｓ、１Ｈ）、５．８２－５．６９（ｍ、３Ｈ）、５．５２－５．３６（ｍ、３Ｈ）、４．３９－４．１０（ｍ、５Ｈ）、２．７３－２．５５（ｍ、５Ｈ）、２．４６（ｓ、３Ｈ）、２．３４（ｔ、Ｊ＝９．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．０９－１．８９（ｍ、７Ｈ）、１．８９－１．８２（ｍ、３Ｈ）、１．７８（ｓ、３Ｈ）、１．５２（ｄｔ、Ｊ＝１４．５、７．４Ｈｚ、６Ｈ）、１．４５－１．３７（ｍ、４Ｈ）、１．３６（ｓ、９Ｈ）、１．２９（ｄ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、２Ｈ）、１．２７（ｓ、４Ｈ）、１．２１－０．９７（ｍ、１３Ｈ）、０．９１（ｄｄｄ、Ｊ＝１７．３、６．５、２．３Ｈｚ、９Ｈ）、０．７１（ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ、３Ｈ）。ＨＲＭＳ：ｍ／ｚ＝１３６７．７１５１（［Ｍ＋ＮＨ４］＋の予想値１３６７．７４１７）。
Ｃａｒｂ／ＤＴＸコアシェルナノ粒子の合成と特徴付け：
０．２１ｍｇのコレステロール、０．４２ｍｇのＤＯＰＣ、０．７５ｍｇのＤＳＰＥ－ＰＥＧ２ｋ、０．２５ｍｇのｃｈｏｌ－ＤＴＸ、及び０．５ｍｇのベアＣａｒｂ ＮＣＰ粒子（Ｐｏｏｎ．等 Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２０１６，１３，３６６５－３６７５）を８０ｕＬのＴＨＦ中で混合し、１７００ｒｐｍで撹拌しながら５００μＬの３０％のＥｔＯＨに加えた。混合物を１００ｕＬに濃縮して、Ｃａｒｂ／ＤＴＸコアシェルナノ粒子を得た。Ｃａｒｂ／ＤＴＸ粒子のＺ平均粒径及びＰＤＩは、ＤＬＳによって、１０１．１ｎｍ及び０．０９３であった。
肺及び乳房細胞株におけるＣａｒｂ／ＤＴＸのインビトロ細胞傷害性：
ヒトＮＳＣＬＣ Ｈ４６０及びマウス乳がん４Ｔ１細胞を、２５００細胞／ウェルで２４時間、９６ウェルプレートに播種した。カルボプラチン（Ｃａｒｂ）、ＤＴＸ、Ｃｈｏｌ－ＤＴＸ、Ｃａｒｂ ＮＣＰ（単剤）、ＺｎＰ／ＤＴＸ（単剤）、Ｃａｒｂ／ＤＴＸ（二剤、Ｃａｒｂ：ＤＴＸモル比＝１：１）をそれぞれのウェルに様々な濃度で加え、細胞を更に４８時間インキュベートした。細胞生存率を、ＭＴＳアッセイによって測定した。
以下の表９に列挙されるように、ＣａｒｂとＤＴＸは、Ｈ４６０及び４Ｔ１細胞に対して高い細胞傷害性を有する一方、Ｃｈｏｌ－ＤＴＸは、毒性を発揮するにはＤＴＸを放出する必要があるため、ＤＴＸよりも毒性が低い。Ｃａｒｂ／ＤＴＸ粒子は低いＩＣ５０値を示し、粒子上のＣａｒｂとＣｈｏｌ－ＤＴＸの間に相乗効果があることを示している。
アポトーシス／ネクローシス分析を、フローサイトメトリーによって１０μＭのＣａｒｂ及び／又はＤＴＸで処理された細胞でまた実施した。Ｃａｒｂ／ＤＴＸ（モル比＝１：１）で処理された細胞は、遥かに高い割合のアポトーシスを示し（Ｃａｂ及びＤＴＸのそれぞれに対して２．９０％及び３．３０％と比較して１７．３％）、粒子によって送達されるＣａｒｂとＤＴＸの間の相乗効果を裏付けている。
Ｃａｒｂ／ＤＴＸのインビボ抗腫瘍効果：
インビボ抗腫瘍効果を定量するために、１×１０６の４Ｔ１細胞を６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの右側腹部に接種し、腫瘍サイズが約１００ｍｍ３に達した７日目に処置を開始した。マウスにＰＢＳ、遊離Ｃａｒｂ＋ＤＴＸ、ＺｎＰ／ＤＴＸ又はＣａｒｂ／ＤＴＸを５ｍｇ／ｋｇの相当Ｃａｒｂ用量で３用量分、週１回投与した。図２９Ａ及び２９Ｂに示すように、ＺｎＰ／ＤＴＸ及びＣａｒｂ＋ＤＴＸは、ＰＢＳエンドポイントでそれぞれ４９．０％及び６３．６％のＴＧＩ値で腫瘍増殖を中程度に阻害した。Ｃａｒｂ／ＤＴＸは８７．５％のＴＧＩで、更に優れた抗腫瘍効果を示した。この結果は、コアシェルナノ粒子によって送達されるＣａｒｂとＤＴＸの相乗効果を示している。図３０Ａ及び３０Ｂに示されるように、Ｃａｒｂ／ＤＴＸはまたＨ４６０腫瘍の増殖に対して非常に有効な阻害剤であった。
実施例７
ＮＣＰコアシェル粒子はオキサリプラチン及びｃｈｏｌ－ＳＮ３８（ＴＭＳなし）を共送達する
スプラーグドーリーラットにおける薬物動態（ＰＫ）：
３：１のモル比でＯｘＰｔ対ｃｈｏｌ－ＳＮ３８（ＴＭＳなし）を含むＯｘＰｔ／ＳＮ３８（ＴＭＳなし）粒子を、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８と同様の方法で作製した。ＯｘＰｔ／ＳＮ３８（ＴＭＳなし）を２．０ｍｇのＯｘＰｔ／ｋｇの用量で尾静脈を介して３匹のスプラーグドーリーラットに静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。４００ｕＬの血液サンプルを５分、０．５時間、１時間、３時間、５時間、８時間、２４時間及び４８時間で採取した。血液サンプルを１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、分析のために血漿を収集した。２００μＬの金属を含まない濃硝酸を５０μＬの血漿に添加し、完全な消化のために４８時間インキュベートした。消化された血漿のＰｔ濃度をＩＣＰ－ＭＳで測定した。別の５０μＬの血漿を１００μＬの飽和ＮａＣｌ溶液と１００μＬの０．５％のトリトンＸ－１００水溶液で希釈し、ついで２００μＬの酢酸エチルで抽出した。有機層をＬＣ－ＨＲＭＳによって分析して、ｃｈｏｌ－ＳＮ３８（ＴＭＳなし）及びＳＮ３８濃度を定量した。図３１Ａ及び３１Ｂを参照のこと。
以下の表１０に示されるように、粒子表層のｃｈｏｌ－ＳＮ３８は、３．４ｈのｔ１／２と５７．９μｇ／ｍｌ＊ｈのＡＵＣ０→∞を示した。ＳＮ３８は血漿中に検出され、半減期は２．５ｈ、ＡＵＣ０→∞値は１．９５μｇ／ｍｌ＊ｈであった。従って、Ｃｈｏｌ－ＳＮ３８（ＴＭＳなし）はＳＮ３８を迅速に放出し、遊離イリノテカンからのＳＮ３８（半減期約１．８ｈ）と比較して薬物曝露を延長した。
ＯｘＰｔ／ＳＮ３８（ＴＭＳなし）のインビボ効果：
ＯｘＰｔ／ＳＮ３８（ＴＭＳなし）の抗がん効果を定量するために、１０×１０６のＨＴ２９細胞を８週齢の無胸腺ヌードマウスの右側腹部に接種し、腫瘍サイズが約１００ｍｍ３に達した７日目に処置を開始した。マウスにＰＢＳ、ＯｘＰｔ＋イリノテカン（３．５ｍｇ／ｋｇのＯｘＰｔと２０．２ｍｇ／ｋｇのイリノテカン）、又はＯｘＰｔ／ＳＮ３８（ＴＭＳなし）（３．５ｍｇ／ｋｇのＯｘＰｔ相当及び１．０９ｍｇ／ｋｇのＳＮ３８相当）を、１６用量についてＱ３Ｄ投与スケジュールで投与した。図３２Ａ及び３２Ｂに示されるように、ＯｘＰｔ＋イリノテカンは、ＰＢＳエンドポイントで１３．４％のＴＧＩで腫瘍増殖の最小阻害を示した。ＯｘＰｔ／ＳＮ３８（ＴＭＳなし）は、８７．９％のＴＧＩで更に高い抗腫瘍効果を示した。特に、イリノテカン中のＳＮ３８含有量は、ＯｘＰｔ／ＳＮ３８（ＴＭＳなし）中のものの１０．８倍である。この結果は、コアシェル粒子によって送達されるＯｘＰｔとＳＮ３８の間の強い相乗効果を示している。
実施例８
追加のコレステロール結合パクリタキセル（ＰＴＸ）プロドラッグの合成
Ｃｈｏｌ－ＨＢＡ－ＰＴＸ－１の合成：
Ｃｈｏｌ－ＨＢＡ－ＰＴＸ－１を、以下に示すように、コレステロールリンカーから始まる三工程で合成した。４－ヒドロキシルベンジルアルコールを、最初にフェノール基を介してコレステロールリンカーとカップリングさせ、次にクロロギ酸ｐ－ニトロフェノールとカップリングさせた。次に、新しいＣｈｏｌ－ＨＢＡリンカーを塩基の存在下でＰＴＸと反応させて、Ｃｈｏｌ－ＨＢＡ－ＰＴＸ－１を得た。
０．６８ｇ（１ｍｍｏｌ）のコレステロールリンカーと０．１８６ｇの４－ヒドロキシベンジルアルコール（ＨＢＡ、１．５ｍｍｏｌ、１．５当量）を２０ｍＬの無水ＤＣＭに溶解させた。２．５ｍＬ（３ｍｍｏｌ、３当量）のＤＩＰＥＡを溶液に加え、溶液を窒素保護下で室温において２４時間撹拌した。得られた溶液を２０ｍＬのＤＣＭで希釈し、飽和ＮＨ４Ｃｌ、飽和ＮａＨＣＯ３、及び飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄した。ついで、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ロータリーエバポレーターで濃縮した。生成物を、１：１のヘキサン：ＥｔＯＡｃで溶出させるシリカカラムクロマトグラフィーにより更に精製した。収量：０．５１ｇ（０．７７ｍｍｏｌ、７７％）。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、クロロホルム－ｄ）δ７．４０（ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．２０（ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、２Ｈ）、５．８７（ｓ、２Ｈ）、５．４１－５．３２（ｍ、１Ｈ）、４．７０（ｓ、２Ｈ）、４．６３（ｄｄｑ、Ｊ＝１１．２、７．７、４．１Ｈｚ、１Ｈ）、２．７３（ｄｄ、Ｊ＝７．０、５．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．６５（ｄｄ、Ｊ＝６．９、５．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．３５－２．２９（ｍ、２Ｈ）、２．０９－０．６１（ｍ、４３Ｈ）。
０．２０ｇ（０．３ｍｍｏｌ、１当量）のＣｈｏｌ－ＨＢＡ、１５０μＬのＤＩＰＥＡ（０．９ｍｍｏｌ、３当量）、及び７ｍｇのＤＭＡＰ（０．０６ｍｍｏｌ、０．２当量）を５ｍＬの無水ＴＨＦに溶解させた。５ｍＬの無水ＴＨＦ中の１８０ｍｇのクロロギ酸４－ニトロフェニルを０℃において上記の溶液に滴下して加え、溶液を窒素保護下で室温において２時間撹拌した。得られた溶液を酢酸エチル５ｍＬで希釈し、飽和ＮＨ４Ｃｌ、飽和ＮａＨＣＯ３、及び飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄した。ついで、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ロータリーエバポレーターで濃縮した。生成物を、４：１のヘキサン：ＥｔＯＡｃで溶出させるシリカカラムクロマトグラフィーにより更に精製した。収量：０．１２５ｇ（０．１５ｍｍｏｌ、５０％）。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、クロロホルム－ｄ）δ８．３３－８．２１（ｍ、２Ｈ）、７．５２－７．４４（ｍ、２Ｈ）、７．４２－７．３４（ｍ、２Ｈ）、７．２６（ｄ、Ｊ＝８．６Ｈｚ、２Ｈ）、５．８８（ｓ、２Ｈ）、５．３８－５．３４（ｍ、１Ｈ）、５．２９（ｓ、２Ｈ）、４．６３（ｔｄ、Ｊ＝１５．３、１３．３、７．７Ｈｚ、１Ｈ）、２．７６－２．７０（ｍ、２Ｈ）、２．６６（ｄｄ、Ｊ＝７．０、５．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．３２（ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、２Ｈ）、２．０６－０．６５（ｍ、４３Ｈ）。
０．１０ｇ（０．１５ｍｍｏｌ）のＣｈｏｌ－ＨＢＡリンカーと０．１２５ｇのＰＴＸ（０．１５ｍｍｏｌ、１．０当量）を１０ｍＬの無水ＣＨ３ＣＮに溶解させた。０．３ｇのＫ２ＣＯ３（４．５ｍｍｏｌ、３０当量）を溶液に加え、溶液を窒素保護下で室温において４８時間撹拌した。得られた溶液を２０ｍＬの酢酸エチルで希釈し、飽和ＮＨ４Ｃｌ、飽和ＮａＨＣＯ３、及び飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄した。ついで、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ロータリーエバポレーターで濃縮した。生成物を、１：１のヘキサン：ＥｔＯＡｃで溶出させるシリカカラムクロマトグラフィーにより更に精製した。収量：５５ｍｇ（０．０３６ｍｍｏｌ、２４％）。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、クロロホルム－ｄ）δ８．１８－８．１２（ｍ、２Ｈ）、７．７８－７．６９（ｍ、３Ｈ）、７．６１（ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）、７．５５－７．４５（ｍ、４Ｈ）、７．４３－７．３３（ｍ、６Ｈ）、７．２３－７．１９（ｍ、２Ｈ）、６．２９（ｄ、Ｊ＝４．８Ｈｚ、３Ｈ）、５．９９（ｄｄ、Ｊ＝９．３、２．７Ｈｚ、１Ｈ）、５．８７（ｓ、２Ｈ）、５．６９（ｄ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、１Ｈ）、５．４４（ｄ、Ｊ＝２．７Ｈｚ、１Ｈ）、５．３６（ｄ、Ｊ＝５．１Ｈｚ、１Ｈ）、５．１６（ｄ、Ｊ＝４．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．９７（ｔ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、４．５０－４．３８（ｍ、１Ｈ）、４．３２（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、２Ｈ）、４．２２（ｓ、１Ｈ）、３．８１（ｔ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、１Ｈ）、２．７３（ｔ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．６５（ｔ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．６１－０．６５（ｍ、６７Ｈ）。ＨＲＭＳ：ｍ／ｚ＝１５４６．７３３０（［Ｍ＋Ｈ］＋）。
Ｃｈｏｌ－ＨＢＡ－ＰＴＸ－２の合成：
乾燥させた丸底フラスコにおいて、コハク酸水素コレステリル（０．４８６ｇ、１ｍｍｏｌ、１当量）を２０ｍＬの無水ＣＨ２Ｃｌ２に溶解させ、続いて塩化オキサリル（３当量）をゆっくりと加えた。反応混合物を不活性雰囲気下で室温において２時間撹拌した。溶液を真空下で濃縮して溶媒を除去し、追加の無水ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ×３）で更に乾燥させて、未反応の塩化オキサリルを除去した。次に、粗コハク酸コレステリル塩化物を２０ｍＬの無水ＴＨＦに溶解させ、続いて４－ヒドロキシルベンジルアルコール（０．１８６ｇ、１．５ｍｍｏｌ、１．５当量）を溶液に加えた。混合溶液を室温で一晩撹拌し続け、ＴＬＣでモニターした。反応が完了した後、得られた溶液を２０ｍＬの酢酸エチルで希釈し、飽和ＮＨ４Ｃｌ、飽和ＮａＨＣＯ３、及び飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄した。ついで、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ロータリーエバポレーターで濃縮した。ヘキサン／ＥｔＯＡｃで溶出させるシリカカラムクロマトグラフィーにより、生成物を更に精製した。収量：０．４５ｇ（０．７７ｍｍｏｌ、７７％）。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、クロロホルム－ｄ）δ７．３２（ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．０５（ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、２Ｈ）、５．３６（ｄｄ、Ｊ＝４．７、２．０Ｈｚ、１Ｈ）、４．７２－４．５５（ｍ、３Ｈ）、２．８４（ｄｄ、Ｊ＝７．５、６．０Ｈｚ、２Ｈ）、２．６９（ｄｄ、Ｊ＝７．６、６．０Ｈｚ、２Ｈ）、２．３９（ｓ、１Ｈ）、２．３２（ｄ、Ｊ＝７．９Ｈｚ、２Ｈ）、２．０６－０．６１（ｍ、４１Ｈ）。
０．１８ｇ（０．３ｍｍｏｌ、１当量）のコレステリルコハク酸４－ヒドロキシルベンジルアルコールエステル、１５０μＬのＤＩＰＥＡ（０．９ｍｍｏｌ、３当量）、及び７ｍｇのＤＭＡＰ（０．０６ｍｍｏｌ、０．２当量）を５ｍＬの無水ＴＨＦに溶解させた。５ｍＬの無水ＴＨＦ中の１８０ｍｇのクロロギ酸４－ニトロフェニルを０℃において上記の溶液に滴下して加え、溶液を窒素保護下で室温において２時間撹拌した。得られた溶液を５ｍＬの酢酸エチルで希釈し、飽和ＮＨ４Ｃｌ、飽和ＮａＨＣＯ３、及び飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄した。ついで、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ロータリーエバポレーターで濃縮した。ヘキサン／ＥｔＯＡｃで溶出させるシリカカラムクロマトグラフィーにより、生成物を更に精製した。収量：０．１５０ｇ（０．２ｍｍｏｌ、６７％）。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、クロロホルム－ｄ）δ８．２４－８．２０（ｍ、２Ｈ）、７．４７－７．４２（ｍ、２Ｈ）、７．４０－７．３４（ｍ、２Ｈ）、７．１８－７．０７（ｍ、２Ｈ）、５．３６（ｄｄ、Ｊ＝４．９、１．８Ｈｚ、１Ｈ）、５．２７（ｓ、２Ｈ）、２．８８（ｄｄ、Ｊ＝７．６、５．８Ｈｚ、２Ｈ）、２．７２（ｄｄ、Ｊ＝７．６、５．８Ｈｚ、２Ｈ）、２．３８－２．２８（ｍ、２Ｈ）、２．０５－０．６２（ｍ、４１Ｈ）。
０．１１ｇ（０．１５ｍｍｏｌ）のＣｈｏｌ－ＨＢＡリンカー２と０．１２５ｇのＰＴＸ（０．１５ｍｍｏｌ、１．０当量）を１０ｍＬの無水ＣＨ２Ｃｌ２に溶解させた。１７ｍｇのＤＭＡＰ（０．１５ｍｍｏｌ、１当量）を溶液に加え、溶液を窒素保護下で室温において４８時間撹拌した。 得られた溶液を２０ｍＬの酢酸エチルで希釈し、飽和ＮＨ４Ｃｌ、飽和ＮａＨＣＯ３、及び飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄した。ついで、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ロータリーエバポレーターで濃縮した。生成物を、１：１のヘキサン：ＥｔＯＡｃで溶出させるシリカカラムクロマトグラフィーにより更に精製した。収量：１０２ｍｇ（０．０７ｍｍｏｌ、４７％）。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、クロロホルム－ｄ）δ８．１８－８．０８（ｍ、２Ｈ）、７．７７－７．７０（ｍ、２Ｈ）、７．６１（ｔ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．５４－７．４５（ｍ、３Ｈ）、７．４２－７．３４（ｍ、８Ｈ）、７．１０（ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ、２Ｈ）、６．９０（ｄ、Ｊ＝９．３Ｈｚ、１Ｈ）、６．３０（ｓ、１Ｈ）、５．９９（ｄｄ、Ｊ＝９．３、２．７Ｈｚ、１Ｈ）、５．６９（ｄ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、１Ｈ）、５．４６－５．３６（ｍ、２Ｈ）、５．１５（ｄ、Ｊ＝３．４Ｈｚ、２Ｈ）、４．９８（ｄ、Ｊ＝９．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４４（ｓ、１Ｈ）、４．３９－４．３２（ｍ、２Ｈ）、４．２１（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、３．８２（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、１Ｈ）、２．８８（ｔ、Ｊ＝６．７Ｈｚ、２Ｈ）、２．７２（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．６６－０．５８（ｍ、６７Ｈ）。
脂質結合プロドラッグの追加の例を、図３３、３４、３５Ａ、及び３５Ｂに示す。
本開示の主題の様々な詳細は、本開示の主題の範囲から逸脱することなく変更されてもよいことが理解されるであろう。更に、前述の説明は、例証のみを目的としており、限定を目的とするものではない。

Claims (31)

  1. 式Ｄ－ＢＬ－Ｌの構造を含むプロドラッグであって、
    Ｄは、一価薬物部分であり、任意選択的にＤは抗がん薬化合物の一価誘導体であり、更に任意選択的にＤはエトポシド（ＥＴ）、ポドフィロトキシン（ＰＰＸ）、パクリタキセル（ＰＴＸ）、ドセタキセル（ＤＴＸ）、ジヒドロアルテミシン（ＤＨＡ）、カンプトテシン（ＣＰＴ）、７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ３８）、トポテカン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ビンクリスチン、ミトキサントロン、アルテスネート、カペシタビン、オクトレオチド、ロイプロリド、及びゴセレリンからなる群から選択される薬物化合物の一価誘導体であり；
    Ｌは一価脂質部分であり；且つ
    ＢＬは二価リンカーであり、Ｄはカーボネート又はカルバメート基を介してＢＬに直接結合され、ＢＬはアセタール基と置換オキシベンジルオキシ基のうちの少なくとも一つを含み、アセタール基は、式：
    （上式中、
    ｎは０から４の間の整数であり、任意選択的にｎは０であり；
    Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アラルキル、置換アラルキル、アリール、及び置換アリールからなる群から独立して選択され、
    各Ｒ３は、アルキル、アラルキル、アリール、ハロ、アルコキシ、アリールオキシ、ヒドロキシ、アシル、カルボキシレート、ホスフェート、ニトロ、－Ｎ３、Ｂ（ＯＨ）２、及びシアノからなる群から独立して選択される）の一つの構造を有し、
    アセタール基の酸素原子は、カーボネート又はカルバメート基の炭素原子に直接結合され；且つ
    置換オキシベンジルオキシ基は、式：
    （上式中、Ｒ’はニトロ、Ｎ３、及び－Ｂ（ＯＨ）２からなる群から選択される）の構造を有し、オキシベンジルオキシ基のベンジル炭素に結合した酸素原子は、カーボネート又はカルバメート基の炭素原子に直接結合されている、プロドラッグ。
  2. Ｌが、コレステロール、オレイン酸、リゾ脂質、又はホスホコリンの一価誘導体である、請求項１に記載のプロドラッグ。
  3. プロドラッグが、式：
    の一つの構造を含む、請求項１又は２に記載のプロドラッグ。
  4. ＢＬが、式：
    （上式中、Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アラルキル、置換アラルキル、アリール、及び置換アリールからなる群から独立して選択され；任意選択的に、Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、メチル、及びフェニルからなる群から独立して選択され；更に任意選択的に、Ｒ１とＲ２の両方がＨである）の構造を有するアセタール基を含む、請求項１又は２に記載のプロドラッグ。
  5. Ｌがオレイン酸部分であり、Ｌ及びＢＬが一緒になって構造：
    を有する、請求項４に記載のプロドラッグ。
  6. Ｌがコレステロール誘導体であり、Ｌ及びＢＬが一緒になって構造：
    を有する、請求項４に記載のプロドラッグ。
  7. プロドラッグが、
    からなる群から選択される、請求項６に記載のプロドラッグ。
  8. プロドラッグが低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）に結合し、ＬＤＬ受容体媒介エンドサイトーシスを介して能動的に腫瘍に輸送され、任意選択的に、プロドラッグは、アルブミンに対するプロドラッグのＫａの少なくとも約１０００倍であるＬＤＬに対する結合定数Ｋａを有し、更に任意選択的に、プロドラッグは、アルブミンに対するプロドラッグのＫａの少なくとも約２０００倍であるＬＤＬに対するＫａを有する、請求項１から７の何れか一項に記載のプロドラッグ。
  9. （ａ）金属－有機マトリックス材料を含むコアであって、任意選択的に金属－有機マトリックス材料が配位ポリマーを含むコアと；
    （ｂ）コアの表面の少なくとも一部を覆うコーティング層であって、脂質層又は脂質二重層を含み、且つ請求項１から８の何れか一項に記載の一又は複数種のプロドラッグを含む、コーティング層と
    を含むナノ粒子。
  10. 金属－有機マトリックス材料が、多価金属イオンとビスホスフェートを含む金属ビスホスフェートを含むナノスケール配位ポリマーを含み、任意選択的に多価金属イオンがＣａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項９に記載のナノ粒子。
  11. ビスホスフェートが抗がん剤のプロドラッグを含み、任意選択的にビスホスフェートがシスプラチン、カルボプラチン又はオキサリプラチンプロドラッグを含み、更に任意選択的にビスホスフェートがシス，シス－トランス－［Ｐｔ（ＮＨ３）２Ｃｌ２（ＯＨ）２］又はシス，トランス－［Ｐｔ（ｄａｃｈ）（オキサレート）（ＯＨ）２］のビスホスフェートエステルである、請求項１０に記載のナノ粒子。
  12. コアが、包埋抗がん剤、任意選択的に包埋親水性抗がん剤を含み、更に任意選択的に包埋抗がん剤がゲムシタビンモノホスフェート（ＧＭＰ）である、請求項９から１１の何れか一項に記載のナノ粒子。
  13. コアが少なくとも二種の抗がん剤を含み、任意選択的に少なくとも二種の抗がん剤が、第一の抗がん剤であって、シスプラチン、カルボプラチン又はオキサリプラチンプロドラッグ、更に任意選択的にシスプラチン、カルボプラチン又はオキサリプラチンのビスホスフェートである第一の抗がん剤と、第二の抗がん剤であって、包埋親水性抗がん剤である第二の抗がん剤とを含む、請求項９から１２の何れか一項に記載のナノ粒子。
  14. ナノ粒子コアが、多価金属イオン、任意選択的にＺｎ２＋とビスホスフェートを含む金属ビスホスフェート配位ポリマーを含み、前記ビスホスフェートが、構造Ｐｔ（ｄａｃｈ）（オキサレート）（ビスホスホラミド酸）を有するオキサリプラチンプロドラッグであり；コーティング層が、構造：
    を有するプロドラッグを含む脂質二重層である、請求項９から１１の何れか一項に記載のナノ粒子。
  15. ナノ粒子コアが、ナノ粒子コアに包埋されたＧＭＰを更に含む、請求項１４に記載のナノ粒子。
  16. コーティング層が、カチオン性脂質及び／又は官能化脂質を含む脂質二重層を含み、前記官能化脂質が、核酸に結合できる基で官能化された脂質であり、少なくとも一種の核酸が、官能化脂質に共有結合されるか、又は静電相互作用を介してカチオン性脂質に結合され、任意選択的に前記脂質二重層が、チオール又はジチオール官能化１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、及び１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）の一又は複数を含む混合物を含む、請求項９から１５の何れか一項に記載のナノ粒子。
  17. 少なくとも一種の核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びＡＳ ＯＤＮからなる群から選択され、任意選択的にｓｉＲＮＡが、サバイビンｓｉＲＮＡ、ＥＲＣＣ－１ ｓｉＲＮＡ、Ｐ－糖タンパク質ｓｉＲＮＡ（Ｐ－ｇｐ ｓｉＲＮＡ）、Ｂｃｌ－２ ｓｉＲＮＡ、及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１６に記載のナノ粒子。
  18. 一又は複数種の不動態化剤、任意選択的に親水性ポリマー；標的剤、任意選択的にＲＧＤペプチド；及び免疫療法剤を更に含む、請求項９から１７の何れか一項に記載のナノ粒子。
  19. 約２０ナノメートルから約１４０ナノメートルの範囲の粒径を有する、請求項９から１８の何れか一項に記載のナノ粒子。
  20. ＬＤＬ受容体媒介エンドサイトーシスによる腫瘍への能動輸送のために、血漿タンパク質、任意選択的にアポリポタンパク質Ｂ－１００を吸着する、請求項９から１８の何れか一項に記載のナノ粒子。
  21. （ｉ）薬学的に許容される担体と（ｉｉ）請求項１から８の何れか一項に記載のプロドラッグ又は請求項９から２０の何れか一項に記載のナノ粒子とを含む薬学的製剤。
  22. 治療を必要とする対象においてがんを治療する方法であって、請求項１から８の何れか一項に記載のプロドラッグ；請求項９から２０の何れか一項に記載のナノ粒子；又は請求項２１に記載の薬学的製剤を対象に投与することを含む、方法。
  23. 手術、放射線療法、化学療法、毒素療法、免疫療法、凍結療法及び遺伝子療法からなる群から選択される追加のがん治療を対象に施すことを更に含み、任意選択的に追加のがん治療が免疫療法である、請求項２２記載の方法。
  24. 免疫療法が、対象に免疫療法剤を投与することを含み；任意選択的に免疫療法剤が、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ４７抗体、抗ＧＤ２抗体、サイトカイン、ポリサッカライドＫ；ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ－４阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、ＣＣＲ７阻害剤、ＯＸ４０阻害剤、ＴＩＭ３阻害剤、及びＬＡＧ３阻害剤からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
  25. がんが、頭部腫瘍、頸部腫瘍、乳がん、婦人科腫瘍、脳腫瘍、結腸直腸がん、肺がん、中皮腫、軟部組織肉腫、皮膚がん、結合組織がん、脂肪がん、肺がん、胃がん、肛門性器がん、腎臓がん、膀胱がん、結腸がん、前立腺がん、中枢神経系がん、網膜がん、血液がん、神経芽細胞腫、多発性骨髄腫、リンパ系がん、及び膵臓がんからなる群から選択される、請求項２２から２４の何れか一項に記載の方法。
  26. がんが転移性がん、任意選択的に転移性結腸直腸がんである、請求項２２から２４の何れか一項に記載の方法。
  27. 請求項９に記載のナノ粒子を対象に投与することを含み、ナノ粒子コアが、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋及びそれらの組み合わせから任意選択的に選択される多価金属イオンとビスホスフェートを含む金属ビスホスフェート配位ポリマーを含み、前記ビスホスフェートがシスプラチン、オキサリプラチン又はカルボプラチンのビスホスフェートエステルであり；
    コーティング層が、構造Ｄ－ＢＬ－Ｌを有するプロドラッグを含む脂質二重層を含み、ここで、Ｄは、抗がん薬化合物の一価薬物部分であり、任意選択的に一価薬物部分は、ＥＴ、ＰＰＸ、ＰＴＸ、ＤＴＸ、ＤＨＡ、ＣＰＴ、ＳＮ３８、トポテカン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ビンクリスチン、ミトキサントロン、アルテスネート、カペシタビン、オクトレオチド、ロイプロリド、及びゴセレリンからなる群から選択される薬物化合物の一価誘導体であり；Ｌは一価脂質部分、任意選択的に一価コレステロール部分であり；ＢＬは二価リンカー部分であり、ここで、Ｄはカーボネート又はカルバメート結合を介してＢＬに結合しており、ＢＬはアセタール基を含み、アセタール基は式：
    （上式中、Ｒ１及びＲ２は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アラルキル、置換アラルキル、アリール、及び置換アリールからなる群から独立して選択される）の構造を有し；アセタール基中の酸素原子の少なくとも一つがカーボネート又はカルバメート基の炭素原子に直接結合されている、請求項２２に記載の方法。
  28. ナノ粒子コアが、その中に包埋された親水性抗がん剤を更に含み、任意選択的に親水性抗がん剤がＧＭＰである、請求項２７に記載の方法。
  29. プロドラッグが、式：
    の構造を有し、任意選択的にビスホスフェートがＰｔ（ｄａｃｈ）（オキサレート）（ビスホスホラミド酸）である、請求項２７又は２８に記載の方法。
  30. 対象に免疫療法剤を投与することを更に含む、請求項２７から２９の何れか一項に記載の方法。
  31. ナノ粒子の投与が、少なくとも一種の抗がん剤の腫瘍曲線下面積（ＡＵＣ）に、少なくとも一種の抗がん剤であって、ナノ粒子及び／又はプロドラッグと関連していない少なくとも一種の抗がん剤の等量の投与と比較して、少なくとも２倍の増加、任意選択的に４倍を超える増加をもたらす、請求項２７から３０の何れか一項に記載の方法。
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