JP7090034B2 - 化学療法、標的療法、光線力学療法、免疫療法及びそれらの任意の組み合わせのためのナノ粒子 - Google Patents

化学療法、標的療法、光線力学療法、免疫療法及びそれらの任意の組み合わせのためのナノ粒子 Download PDF

Info

Publication number
JP7090034B2
JP7090034B2 JP2018561060A JP2018561060A JP7090034B2 JP 7090034 B2 JP7090034 B2 JP 7090034B2 JP 2018561060 A JP2018561060 A JP 2018561060A JP 2018561060 A JP2018561060 A JP 2018561060A JP 7090034 B2 JP7090034 B2 JP 7090034B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
ncp
lipid
cancer
particles
dha
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2018561060A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2019523757A (ja
JP2019523757A5 (ja
Inventor
リン ウェンビン
デュアン シャオピン
チャン クリスティーナ
ハン ウェンボ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Chicago
Original Assignee
University of Chicago
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Chicago filed Critical University of Chicago
Publication of JP2019523757A publication Critical patent/JP2019523757A/ja
Publication of JP2019523757A5 publication Critical patent/JP2019523757A5/ja
Priority to JP2022032275A priority Critical patent/JP2022078190A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7090034B2 publication Critical patent/JP7090034B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A61K31/136—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline having the amino group directly attached to the aromatic ring, e.g. benzeneamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/357—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having two or more oxygen atoms in the same ring, e.g. crown ethers, guanadrel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/475—Quinolines; Isoquinolines having an indole ring, e.g. yohimbine, reserpine, strychnine, vinblastine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1277—Processes for preparing; Proliposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

関連出願の相互参照
本発明は、2016年5月20日に出願された米国仮特許出願第62/339,594号の優先権を主張し、本明細書にはその全体が参照により組み込まれる。
本発明は、国立衛生研究所によって付与された助成金番号U01 CA198989の下での米国政府の支援によってなされた。そのため米国政府は本発明に一定の権利を有する。
本発明は、ジスルフィド含有リンカーを介して脂質部分に結合した薬物部分を含むプロドラッグ（例えば、化学療法薬のプロドラッグ）を提供する。本発明はまた、このプロドラッグを含むナノ粒子を提供する。このナノ粒子は、例えば、プロドラッグを含有する脂質コーティング層とナノスケール配位ポリマー（NCP）のナノ粒子コアを含み、任意に、化学療法剤類似体若しくはプロドラッグ、又は２つの化学療法剤類似体若しくはプロドラッグの組み合わせを含むことができることができる。このナノ粒子は、更に、光線力学療法（PDT）用の光増感剤、標的化剤、及び/又は免疫抑制剤などの免疫療法剤と組み合わせることができる。したがって、本発明のナノ粒子ベースの組成物は、様々な癌において複数の治療様式と組み合わせることによって、相乗的な抗癌効果を提供することができる。
光線力学療法（PDT）においては、全身投与又は局所投与された光増感剤（PS）が局所的な光照射によって励起されて活性酸素種（ROS）を生成し、隣接する正常組織を保存しながら腫瘍細胞を選択的に殺すことができる。光線力学療法は、放射線療法や化学療法との交差耐性を生じないので、放射線療法や化学療法に失敗した癌患者の治療に有用である。光線力学療法は、標的部位において、局所的な浮腫として観察される強力な急性炎症反応を引き起こす。光線力学療法によって誘発される炎症は、先天性免疫系によって組織化された腫瘍抗原非特異的プロセスである。光線力学療法は、先天的免疫感知要素によって検出することができる治療部位において、損傷関連分子パターン（DAMP）などの多量の警報/危険信号を迅速に生成する場合に、特に有効である。光線力学療法は、死滅した又は死滅しつつある腫瘍細胞による樹状細胞の刺激を介して抗腫瘍免疫を増強することができ、これは、CD8 +細胞傷害性T細胞（CTL）の動員及び活性化をもたらし、続いて免疫記憶細胞が形成され、腫瘍増殖に対する抵抗が起こる。他の免疫療法剤と併用すると、原発腫瘍の有効な根絶だけでなく、遠隔転移腫瘍又は腫瘍の抑制や根絶を達成することもできる。
オキサリプラチン、パクリタキセル、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ジヒドロアルテミシニン、及びミトキサントロンなどの小分子化学療法剤は、免疫原性細胞死を効率的に引き起こすことができる。いくつかの化学療法剤は免疫刺激性であることが知られている。しかし、多くの小分子化学療法剤は高度に疎水性であり、このことは抗癌剤を腫瘍へ送達することを困難にしている。
従って、その送達（例えば、その標的送達）を改善するために、化学療法剤のためのプロドラッグ及び/又は他の薬物の送達プラットフォームを提供することについて、継続的な必要性がある。また、抗癌療法を増強するために、化学療法剤（例えば、既知の疫原性効果を有する化学療法薬）を他の治療様式（例えば、光線力学療法様式及び/又は免疫療法剤（例えば、免疫抑制治療剤））と組み合わせることが可能な、プロドラッグ及び/又は他の薬物の送達プラットフォームが必要とされている。
いくつかの実施態様において、本発明は、（a）一価薬物部分、（b）一価脂質部分、及び
（c）生分解性結合を含む二価リンカー部分、から成り、該一価薬物部分と該一価脂質部分とが該リンカー部分を介して結合するプロドラッグを提供する。任意に、該一価薬物部分は抗癌剤化合物の一価誘導体である。より任意に該一価薬物部分はエトポシド（ET）、パクリタキセル（PTX）、OTS964、NLG919、OTS167、OTSC41、ジヒドロアルテミシニン、カンプトテシン（CPT）、ドキソルビシン、ドセタキセル、ビンクリスチン、ミトキサントロン、アーテスネート及びカペシタビンから成る群から選択される薬剤化合物の一価誘導体である。任意に該生分解性結合はジスルフィド結合である。
いくつかの実施態様において、この一価脂質部分は、コレステロール、オレイン酸、リゾ脂質又はホスホコリンの一価誘導体である。
いくつかの実施態様において、この一価脂質部分はコレステロール誘導体であり、一価脂質部分と二価リンカー部分とが一緒になって下記の構造を有する。
Figure 0007090034000001
 いくつかの実施態様において、この一価脂質部分はオレイン酸誘導体であり、この一価脂質部分と二価リンカー部分とが一緒になって下記の構造を有する。
Figure 0007090034000002
いくつかの実施態様において、この一価脂質部分はリゾ脂質誘導体であり、この一価脂質部分と二価リンカー部分とが一緒になって下記の構造を有する。
Figure 0007090034000003
 （式中、Ｒは、オレイル、ステアリル又はパルミトレイルから選択される。）
いくつかの実施態様において、この一価脂質部分はホスホコリン誘導体であり、この一価脂質部分と二価リンカー部分とが一緒になって下記の構造を有する。
Figure 0007090034000004
いくつかの実施態様において、本発明は、治療を必要とする患者の疾患を治療する方法であって、（a）一価薬物部分、（b）一価脂質部分、及び（c）生分解性結合を含む二価リンカー部分から成るプロドラッグを患者に投与する段階、任意に該プロドラッグを患者に投与する段階が、該プロドラッグを含むナノ粒子を患者に投与する段階を含み、及び免疫療法剤を患者に投与する段階を含む、方法を提供する。いくつかの実施態様において、このプロドラッグは、このプロドラッグを含むナノ粒子を投与することによって投与され、このナノ粒子はナノスケール配位ポリマーを含む。
いくつかの実施態様において、この方法は、更に、患者に光増感剤及び/又はシンチレータを投与する段階、及び患者の少なくとも一部に光及び/又はX線を照射する段階を含む。いくつかの実施態様において、この光増感剤はナノ粒子光増感剤である。いくつかの実施態様において、このナノ粒子光増感剤は、アップコンバージョンナノ粒子を含む群から選択され、任意に、このアップコンバージョンナノ粒子はNaYF4を含み、さらに任意に、このNaYF4ナノ粒子はY:Yb:Er=78%:20%:2%の比率でドープされ、クロリンe6若しくはMC540；シリカベースのナノ粒子に組込まれた光増感剤（任意に、2-デニル-2-（1-ヘキシルオキシエチル）ピロフェオフォルビド（HPPH）を積載するシリカナノ粒子）；ポリマーミセルに積載された光増感剤（任意に、DSPE-PEG5kポリマーミセルに積載されたZn（II）フタロシアニン）；リポソームベースの光増感剤送達システム（任意に、5,10,15,20-テトラキス（m-ヒドロキシフェニル）クロリンが封入されたリポソーム又は5-アミノレブリン酸（ALA）が封入されたリポソーム）；ヒト血清アルブミン（HSA）ベースの光増感剤送達系（任意に、HSA-フェオフォルビド結合体粒子）；デンドリマーベースの光増感剤送達系（任意に、ローズベンガルとPpIXが積載されたPEG結合ポリ（プロピレンイミン）又はポリ（アミドアミン）；ポルフィリン－、クロリン－、又はバクテリオクロリン－結合リン脂質ベースの二重層送達系；ポルフィリン－脂質結合体（ピロリピド）自己集合ナノ胞（ポルフィゾーム）；ピロリピド（NCP＠Pyrolipid）を含む脂質コーティング層を含むナノスケール配位ポリマー（NCP）粒子；又はピロリン酸亜鉛コアとピロリピド（Zn＠Pyrolipid）を含む脂質コーティング層とを含むナノ粒子、と組み合わされる。
いくつかの実施態様において、この疾患は癌である。いくつかの実施態様において、この疾患は、頭部腫瘍、頸部腫瘍、乳癌、婦人科腫瘍、脳腫瘍、結腸直腸癌、肺癌、中皮腫、軟部組織肉腫、皮膚癌、結合組織癌、脂肪癌、肺癌、胃癌、肛門癌、腎臓癌、膀胱癌、結腸癌、前立腺癌、中枢神経系癌、網膜癌、血液癌、神経芽細胞腫、多発性骨髄腫、リンパ様癌、及び膵臓癌から成る群から選択される。
いくつかの実施態様において、この方法は、更に、追加の治療を患者に施す段階を含む。いくつかの実施態様において、この追加の治療は癌治療であり、この癌治療は、外科手術、放射線療法、化学療法、毒素療法、免疫療法、凍結療法及び遺伝子治療から成る群から選択される。いくつかの実施態様において、この化学療法は、オキサリプラチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ミトキサントロン、パクリタキセル、ジギトキシン、ジゴキシン及びセプタシジンから成る群から選択される薬物を投与する段階を含む。いくつかの実施態様において、この化学療法は、ポリマーミセル配合物、リポソーム配合物、デンドリマー配合物、ポリマーベースのナノ粒子配合物、シリカベースのナノ粒子配合物、ナノスケール配位ポリマー配合物、及び無機ナノ粒子配合物から成る群から選択される薬剤配合物を投与することを含む。
いくつかの実施態様において、この免疫療法剤は、抗CD52抗体、抗CD20抗体、抗CD47抗体、抗GD2抗体、多糖類K及びサイトカインから成る群から選択される。いくつかの実施態様において、この免疫療法剤は、アレムツズマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、ゼヴァリン、アドセトリス、カドサイラ及びオンタクからなる群から選択される。いくつかの実施態様において、この免疫療法剤は、PD-1阻害剤、PD-L1阻害剤、CTLA-4阻害剤、IDO阻害剤、CCR7阻害剤、OX40阻害剤、TIM3阻害剤及びLAG3阻害剤から成る群から選択される。
いくつかの実施態様において、このサイトカインは、インターフェロン及びインターロイキンから成る群から選択される。いくつかの実施態様において、このサイトカインは、IFN-α、IFN-γ、IL-2、IL-12、及びTNF-αから成る群から選択される。
いくつかの実施態様において、この疾患は転移性癌である。
いくつかの実施態様において、本発明は、ピロリン酸亜鉛並びに(a）一価薬物部分、（b）一価脂質部分、及び（c）生分解性結合を含む二価リンカー部分から成るプロドラッグを含む組成物を提供する。いくつかの実施態様において、このピロリン酸亜鉛は、ナノ粒子の形態である。
いくつかの実施態様において、この発明は、(a）一価薬物部分、（b）一価脂質部分、及び（c）生分解性結合を含む二価リンカー部分から成るプロドラッグ並びにナノスケール配位ポリマーを含む組成物であって、該ナノスケール配位ポリマーがシスプラチン及び/又はオキサリプラチンのプロドラッグを含む、組成物を提供する。いくつかの実施態様において、この組成物は、更に、siRNAを含む。
いくつかの実施態様において、本発明は、(a) 金属－有機マトリックス材料を含むコア、任意に該金属－有機マトリックス材料が配位ポリマーを含み、及び(b) プロドラッグを含み、このプロドラッグは(a）一価薬物部分、（b）一価脂質部分、及び（c）生分解性結合を含む二価リンカー部分から成る、治療薬を送達するためのナノスケール粒子を提供する。
いくつかの実施態様において、このナノスケール粒子は、更に、少なくとも１つの核酸化学療法剤を含む。いくつかの実施態様において、この核酸化学療法剤は、siRNA、miRNA、又はAS ODNである。いくつかの実施態様において、この少なくとも１つの核酸化学療法剤は、この核酸上のリン酸基とこのコアの外表面上の金属イオンとの間の配位結合を介して、金属－有機マトリックス材料のコアに結合している。いくつかの実施態様において、この少なくとも１つの核酸化学療法剤は、サバイビンsiRNA、ERCC-1 siRNA、P-糖タンパク質siRNA（P-gp siRNA）、Bcl-2 siRNA、又はこれらの混合物から成る群から選択される。
いくつかの実施態様において、このナノスケール粒子は、更に、少なくとも１つの光増感剤を含む。
いくつかの実施態様において、このナノスケール粒子は、更に、この金属－有機マトリックス材料コアに組み込まれた少なくとも１つの非核酸化学療法剤を含み、任意に、この少なくとも１つの非核酸化学療法剤は、共有結合又は配位結合を介して金属－有機マトリックス材料のコアに組み込まれる。いくつかの実施態様において、この金属－有機マトリックス材料コアに組み込まれた少なくとも１つの非核酸化学療法剤は、シスプラチン又はオキサリプラチンのプロドラッグ、ゲムシタビン、メトトレキセート、ユーコボリン、ペメトレキセド二ナトリウム、ドキソルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、シタラビン、アザチオプリン、メルファラン、イマチニブ、アナストロゾール、レトロゾール、カルボプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド、及びビノレルビンから成る群から選択される。
いくつかの実施態様において、このナノスケール粒子は、この金属－有機マトリックス材料コアに組み込まれた化学療法剤を少なくとも２つ含む。いくつかの実施態様において、この非核酸化学療法剤は、シス、シス、トランス-Pt(NH3)2Cl2(OEt)(O2CCH2CH2COOH)であり、任意に、前記コアが、該非核酸化学療法剤を約10重量％～約50重量％含む。
いくつかの実施態様において、このナノスケール粒子は約20nm～約140nmの間の平均直径を有する。
いくつかの実施態様において、このナノスケール粒子は、更に、金属－有機マトリックス材料コアの外表面の少なくとも一部を覆う１又はそれ以上のコーティング剤又はコーティング層を含み、この１又はそれ以上のコーティング剤又はコーティング層は、金属酸化物、ポリマー、単一脂質層、脂質二重層、及びそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施態様において、この金属－有機マトリックス材料コアは、カチオン性脂質及び/又は官能化脂質を含む脂質二重層で被覆され、この官能化脂質は、核酸に結合することができる基で官能化された脂質であり、少なくとも１つの核酸が、該官能化脂質に共有結合し、及び/又は静電的相互作用を介して該カチオン性脂質に結合している。
いくつかの実施態様において、この脂質二重層は、チオール－又はジチオール－官能化1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DSPE）、1,2-ジオレオイル -3-トリメチルアンモニウムプロパン（DOTAP）、及び1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DOPC）のうちの１又はそれ以上を含む混合物から成る。
いくつかの実施態様において、この１又はそれ以上のコーティング剤又はコーティング層は、更に、不動態化剤（任意に、親水性ポリマー）、標的化剤（任意に、RGDペプチド）、及び/又は造影剤（任意に、蛍光部分）を含む。いくつかの実施態様において、この脂質二重層は、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-リン酸ナトリウム塩（DOPA）、コレステロール及びPEG化DSPEのうちの１又はそれ以上を含む。
いくつかの実施態様において、この金属－有機マトリックス材料コアは、多価金属イオン及びビスホスホネートから成る金属ビスホスホネート配位ポリマーを含む。
いくつかの実施態様において、この多価金属イオンは、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。
いくつかの実施態様において、このビスホスホネートは、化学療法プロドラッグであり、任意に、シスプラチン又はオキサリプラチンのプロドラッグである。いくつかの実施態様において、このプロドラッは、DHAの一価誘導体を含む。いくつかの実施態様において、このビスホスホネートは、シス、シス－トランス－［Pt(NH3)2Cl2(OH)2］（シスプラチンプロドラッグ）又はシス、トランス－［Pt(dach)Cl2(OH)2］のビスホスホネートエステルである。いくつかの実施態様において、この多価金属イオンは、Ｚｎ２＋である。いくつかの実施態様において、この金属－有機マトリックス材料コアは、ビスホスホネートを約４０～約５０重量％含む。
いくつかの実施態様において、このナノスケール粒子は、更に、脂質単一層又は脂質二重層のコーティングを含み、任意に、このコーティングにサバイビンsiRNA、P-gp siRNA、及びBcl-2 siRNAのうちの１又はそれ以上が付着する。いくつかの実施態様において、このナノスケール粒子は、約20nm～約180nmの直径を有する。いくつかの実施態様において、このナノスケール粒子は、約90nm～約180nmの直径を有する。
いくつかの実施態様において、本発明は、ピロリン酸亜鉛及び脂質複合プロドラッグを含む組成物、シスプラチン及び/又はオキサリプラチンのプロドラッグ及び脂質複合プロドラッグを含むナノスケール配位ポリマー、又は金属－有機マトリックス材料を含むコア及び脂質複合プロドラッグを含むナノスケール粒子を含む組成物、を患者に投与する段階を含む、治療を必要とする患者の癌を治療する方法を提供する。いくつかの実施態様において、この癌は、肺癌、膵臓癌、卵巣癌、乳癌、及び結腸癌から選択される。いくつかの実施態様において、この癌は、卵巣癌、任意に、シスプラチン耐性卵巣癌である。
いくつかの実施態様において、この方法は、更に、患者に免疫療法剤を投与する段階を含む。いくつかの実施態様において、この免疫療法剤は、抗CD52抗体、抗CD20抗体、抗CD47抗体、抗GD2抗体、サイトカイン、及び多糖Kから成る群から選択される。いくつかの実施態様において、この免疫療法剤は、アレムツズマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、ゼヴァリン、アドセトリス、カドサイラ及びオンタクから成る群から選択される。いくつかの実施態様において、この免疫療法剤は、PD-1阻害剤、PD-L1阻害剤、CTLA-4阻害剤、IDO阻害剤、CCR7阻害剤、OX40阻害剤、TIM3阻害剤及びLAG3阻害剤から成る群から選択される。
いくつかの実施態様において、この方法は、更に、光増感剤を患者に投与する段階を含む。いくつかの実施態様において、この光増感剤は脂質であり、この脂質は、ポルフィリン又はその誘導体又はその類似体に共有結合した脂質である。
いくつかの実施態様において、本発明は、脂質複合プロドラッグを含む組成物を含む組成物、任意に、ナノスケール粒子及び医薬的に許容される担体を含む組成物、を含む医薬配合物を提供する。
いくつかの実施態様において、本発明は、治療を必要とする患者の癌を治療する方法であって、脂質複合プロドラッグ及び金属－有機マトリックス材料コアを含むナノスケール粒子及び光増感剤を含む組成物を患者に投与する段階と、この光増感剤を活性化するのに適した波長を有する放射線をこの患者又はこの患者の治療領域に照射する段階とを含む方法を提供する。
いくつかの実施態様において、この癌は頭頸部癌であり、任意に、この頭頸部癌はシスプラチン耐性頭頸部癌である。いくつかの実施態様において、この方法は、更に、患者に免疫療法剤を投与する段階を含む。
いくつかの実施態様において、この免疫療法剤は、抗CD52抗体、抗CD20抗体、抗CD47抗体、抗GD2抗体、多糖類K及びサイトカインから成る群から選択される。いくつかの実施態様において、この免疫療法剤は、放射性標識抗体、抗体－薬物複合体、及び新抗原から成る群から選択される。いくつかの実施態様において、この免疫療法剤は、アレムツズマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、ゼヴァリン、アドセトリス、カドサイラ及びオンタクからなる群から選択される。いくつかの実施態様において、この免疫療法剤は、PD-1阻害剤、PD-L1阻害剤、CTLA-4阻害剤、IDO阻害剤、CCR7阻害剤、OX40阻害剤、TIM3阻害剤及びLAG3阻害剤から成る群から選択される。
したがって、本発明の目的は、脂質部分を含むプロドラッグ、ナノ粒子、及びこのプロドラッグを含むナノ粒子配合物、ならびにこのナノ粒子及び配合物を使用して疾患を治療する方法を提供することである。
ここに開示された発明の目的は、本明細書に開示された発明によって全体的又は部分的に達成され、添付の図面や以下で最良に記載された実施例を参照しながら説明が進むにつれて明らかになるであろう。
シスプラチン耐性卵巣癌（A2780/CDDP）の異種移植腫瘍モデルにおける、コレステロール結合エトポシドプロドラッグ及び脂質変性低分子干渉性リボ核酸（すなわち、NCP-1/ET/siRNA）を含む脂質コーティング層を更に含む、本発明のシスプラチン含有ナノスケール配位ポリマー（NCP）粒子の抗腫瘍効力を示すグラフである。NCP粒子で処理した腫瘍モデル（丸）と対照（すなわち、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で処理したモデル、四角）について、処理後の日数に対する腫瘍体積（mm3）を示す。 シスプラチン耐性卵巣癌（SKOV-3）の異種移植片腫瘍モデルにおける、コレステロール結合エトポシドプロドラッグ及び脂質変性低分子干渉性リボ核酸（すなわち、NCP-1/ET/siRNA）を含む脂質コーティング層を更に含む、本発明のシスプラチン含有NCP粒子の抗腫瘍効力を示すグラフである。NCP粒子で処理した腫瘍モデル（丸）と対照（すなわち、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で処理したモデル、四角）について、処理後の日数に対する腫瘍体積（mm3）を示す。 小細胞肺癌（H82）の異種移植片腫瘍モデルにおける、コレステロール結合エトポシドプロドラッグと脂質変性低分子干渉性リボ核酸（すなわち、NCP-1/ET/siRNA ）を含む脂質コーティング層を更に含む、本発明のシスプラチン含有NCP粒子の抗腫瘍効力を示すグラフである。NCP粒子で処理した腫瘍モデル（丸）と対照（すなわち、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で処理したモデル、四角）について、処理後の日数に対する腫瘍体積（mm3）を示す。 フローサイトメトリー分析によって決定された、5マイクロモル濃度（μM）の白金（Pt）及び/又はパクリタキセル（PTX）によって誘発されたCT26ネズミ結腸直腸腺癌細胞の細胞表面へのカルレティキュリン（CRT）の曝露を示す一連のグラフである。細胞は、オキサリプラチン（上段左）、パクリタキセル（上段中央）、パクリタキセルとオキサリプラチンの組み合わせ（上段右）、亜鉛（Zn）とオキサリプラチン類似体を含むNCP（NCP-2、下段左）、Zn及びパクリタキセルの組み合せ（下段中央）、又はコレステロール結合PTXを含む脂質コーティングで被覆されたNCP-2（NCP-2/PTX、下段右）で処理された。各グラフに、対照として、リン酸緩衝食塩水（PBS）で処理した細胞のデータ（灰色）を示す。 CT26ネズミ結腸直腸腺癌腫瘍を生じているマウスにおける静脈内（i.v.）注射（投与用量1mg/kg）後の、亜鉛及びオキサリプラチン類似体コアとコレステロール変性パクリタキセル（NCP-2/PTX）を含む脂質コーティング層とを含むNCP粒子の薬物動態及び体内分布からの白金（Pt）のデータを示すグラフであり、組織のグラム（g）当たりのPtの初期投与量（％ID）として表す。Pt濃度は、5分及び1, 3, 5, 8, 24及び48時間後において誘導結合プラズマ質量分析（ICP-MS）で分析し、マイクログラム（μg）で表す。 遊離オキサリプラチン（観察データ、白抜き円、予測は濃い灰色線）と亜鉛及びオキサリプラチン類似体のコア及びコレステロール変性パクリタキセル（NCP-2/PTX）を含む脂質コーティング層を含むNCP粒子（観察データ、黒四角、予測は明るい灰色線）の、ビーグル犬に静脈内（i.v.）注射(投与用量1mg/kg）した後の薬物動態を示すグラフである。白金（Pt）濃度を、注入後336時間まで、誘導結合プラズマ質量分析（ICP-MS）によって分析した。 亜鉛及びオキサリプラチン類似体のコアとコレステロール変性パクリタキセルを含む脂質コーティング層とを含むNCP粒子（NCP-2/PTX、黒四角）及びNCP-2/PTXと抗プログラム死リガンド1（PD-L1）抗体（Pd-L1 Ab）との組み合わせ（白丸）を、CT26ネズミ結腸直腸腺癌腫瘍を生じているマウスに腹腔内注射したときのインビボ抗癌活性を示すグラフである。矢印で示される日に（すなわち、7,10,15,20,25及び30日目）、オキサリプラチン類似体を用量1mg/kg及びパクリタキセルを用量2.24mg/kgで投与した。腫瘍接種後の異なる日における腫瘍サイズ（mm3）を示す。比較のため、リン酸緩衝食塩水を注射したマウスのデータ（PBS、×印付三角）を示す。 亜鉛及びオキサリプラチン類似体のコアとコレステロール変性パクリタキセルを含む脂質コーティング層とを含むNCP粒子（NCP-2/PTX、黒四角）及びNCP-2/PTXと抗プログラム死リガンド1（PD-L1）抗体（Pd-L1 Ab）との組み合わせ（白丸）を、MC38ネズミ結腸直腸癌腫瘍を生じているマウスに腹腔内注射したときのインビボ抗癌活性を示すグラフである。矢印で示される日に（すなわち、7, 11, 15, 19, 23, 31及び39日目）、オキサリプラチン類似体を用量1mg/kg及びパクリタキセルを用量2.24mg/kgで投与した。腫瘍接種後の異なる日における腫瘍サイズ（mm3）を示す。比較のため、リン酸緩衝食塩水を注射したマウスのデータ（PBS、×印付三角）を示す。 異なる免疫能力のCT26ネズミ結腸直腸腺癌腫瘍を生じているマウス（即ち、無胸腺ヌードマウス（黒四角）；BALB/c Rag-/-マウス（白丸）；及びBALB/cマウス（×印付三角））における、亜鉛及びオキサリプラチン類似体のコアとコレステロール変性パクリタキセルを含む脂質コーティング層とを含むNCP粒子（NCP-2/PTX）のインビボ抗癌活性を示すグラフである。NCP-2/PTXを、矢印で示される日（7, 10, 15日目）に、オキサリプラチン類似体を用量1mg/kgでマウスに腹腔内注射した。 亜鉛及びオキサリプラチン類似体のコアと脂質コーティング層とを含むNCP粒子（NCP-2）を、MC38ネズミ結腸直腸癌腫瘍を生じているマウスに腹腔内注射したときのインビボ抗癌活性を示すグラフである。マウスに、オキサリプラチン類似体を用量2mg/kgで4日ごとに計5回腹腔内注射した。マウスに、NCP-2（白丸）；PTXに対するオキサリプラチン類似体のモル比が2:1の脂質コーティング層にコレステロール変性パクリタキセル（PTX）を含むNCP-2粒子（NCP-2/PTX 2:1、左向き三角）；PTXに対するオキサリプラチン類似体のモル比が1:1の脂質コーティング層にコレステロール変性パクリタキセル（PTX）を含むNCP-2粒子（NCP-2/PTX 1:1、右向き三角）；NCP-2/PTX 2:1及び75μgの抗プログラム死リガンド1（PD-L1）抗体（NCP-2/PTX 2:1 +75μgPD-L1 Ab、上向き三角）；又はNCP-2/PTX 1:1及び75μgPD-L1抗体（NCP-2/PTX1:1 +75μgPD-L1 Ab、下向き三角）を注射した。比較のため、リン酸緩衝生理食塩水を注射したマウスのデータ（黒四角）を示す。 以前にナノ粒子で処理された癌細胞のワクチン接種されたマウスに、腫瘍細胞を再曝露した後の、無腫瘍マウスの生存確率を示すグラフである。亜鉛及びオキサリプラチン類似体コアとコレステロール変性パクリタキセルを含む脂質コーティング層とを含むNCP粒子並びに光照射で処理した、CT26ネズミ結腸直腸腺癌細胞をBALB/cマウスに皮下接種した（NCP-2/PTX、点線）。接種の7日後に、このマウスに生きたCT26細胞を再曝露した。リン酸緩衝生理食塩水で処理した癌細胞を接種したマウスについて、再曝露後の無腫瘍マウスの生存確率も示す（PBS、実線）。 CT26ネズミ結腸直腸腺癌腫瘍を接種し、亜鉛及びオキサリプラチン類似体コアとコレステロール変性パクリタキセルを含む脂質コーティング層とを含むNCP粒子と光照射で処理したマウス（NCP-2/PTX、白抜き丸）と、対照としてリン酸緩衝化生理食塩水で処理したマウス（PBS、黒四角）の、腫瘍再曝露後の腫瘍成長曲線を示すグラフである。 CT26ネズミ結腸直腸腺癌腫瘍を生じているマウスにおける、亜鉛及びオキサリプラチン類似体コアとコレステロール変性ミトキサントロンを含む脂質コーティング層とを含むNCP粒子（MCP-2/MTX）のインビボ抗癌活性のグラフである。リン酸緩衝食塩水で処理したマウス（PBS、黒四角）、用量1 mg/kgのオキサリプラチン類似体及び用量0.58 mg/kgのミトキサントロン（MTX）のNCP粒子（MCP-2/MTX）で処理したマウス（白丸）、又はMCP-2/MTXと抗プログラム死リガンド1（PD-L1）抗体75μgの組み合わせで処理したマウス（MCP-2/MTX + PD-L1 Ab、×印付三角）の、腫瘍サイズデータ（mm3）を示す。処理は、腫瘍接種後7日目に開始し、4日ごとに計6回の投与を実施した。 MC38ネズミ結腸直腸癌腫瘍保有マウスにおける、亜鉛及びオキサリプラチン類似体コアとコレステロール変性ミトキサントロンを含む脂質コーティング層とを含むNCP粒子（MCP-2/MTX）のインビボ抗癌活性のグラフである。リン酸緩衝食塩水で処理したマウス（PBS、下向き三角）、用量2 mg/kgのオキサリプラチン類似体及び用量1.16 mg/kgのミトキサントロン（MTX）のNCP粒子（MCP-2/MTX）で処理したマウス（黒四角）、又はMCP-2/MTXと抗プログラム死リガンド1（PD-L1）抗体75μgの組み合わせで処理したマウス（MCP-2/MTX + PD-L1 Ab、白丸）の、腫瘍サイズデータ（mm3）を示す。処理は、腫瘍接種後12日目に開始し、4日ごとに計５回の投与を実施した。 フローサイトメトリー分析によって測定された濃度1μMのジヒドロアルテミシニン（DHA）によって誘導されたCT26ネズミ結腸直腸腺癌細胞の細胞表面へカルレティキュリン（CRT）の曝露を示すグラフである。対照としてリン酸緩衝食塩水（PBS）処理細胞のデータを各グラフに示す（灰色）。 フローサイトメトリー分析によって測定された濃度1μMのジヒドロアルテミシニン（DHA）によって誘導されたMC38ネズミ結腸直腸癌細胞の細胞表面へカルレティキュリン（CRT）の曝露を示すグラフである。対照としてリン酸緩衝食塩水（PBS）処理細胞のデータを各グラフに示す（灰色）。 CT26ネズミ結腸腺癌腫瘍保有マウスにおける、亜鉛及びオキサリプラチン類似体コアとコレステロール変性ジヒドロアルテミシニンを含む脂質コーティング層とを含むNCP粒子（NCP-2/DHA、三角）のインビボ抗癌活性のグラフである。比較のため、リン酸緩衝生理食塩水（PBS、黒四角）及び亜鉛とジヒドロアルテミシニンの組み合わせ（Zn/DHA、白丸）で処理したマウスのデータを示す。 オキサリプラチン（OX）及びジヒドロアルテミシニン（DHA）の遊離及びナノ粒子薬剤配合物で処理したCT26ネズミ結腸直腸腺癌細胞の細胞生存率（％）を示すグラフである。細胞を以下のうちの1つで処理した：遊離OX（黒四角）；遊離DHA（白丸）；遊離OX及び遊離DHAの組み合わせ（OX + DHA、上向き三角）；亜鉛（Zn）及びオキサリプラチンプロドラッグの配位ポリマーを含む脂質コーティングナノスケールポリマー粒子（NCP-3、下向き三角）；遊離Zn及び遊離DHAの組み合わせ（Zn/DHA、菱形）；脂質コーティング層に脂質変性DHAを含むNCP-3（NCP-3/DHA、左向き×印付三角）。 オキサリプラチン（OX）及びジヒドロアルテミシニン（DHA）の遊離及びナノ粒子薬剤配合物で処理したMC38ネズミ結腸直腸癌細胞の細胞生存率（％）を示すグラフである。細胞を以下のうちの1つで処理した：遊離OX（黒四角）；遊離DHA（白丸）；遊離OX及び遊離DHAの組み合わせ（OX + DHA、上向き三角）；亜鉛（Zn）及びオキサリプラチンプロドラッグの配位ポリマーを含む脂質コーティングナノスケールポリマー粒子（NCP-3、下向き三角）；遊離Zn及び遊離DHAの組み合わせ（Zn/DHA、菱形）；脂質コーティング層に脂質変性DHAを含むNCP-3（NCP-3/DHA、左向き×印付三角）。 細胞のサイトメトリーによって定量された異なる処理後のアポトーシス及びネクローシスの細胞の割合（％）を示す一連のプロットである。この処理には以下が含まれる：リン酸緩衝食塩水（PBS、上段左）；遊離オキサリプラチン（上段左から2番目）；遊離ジヒドロアルテミシニン（DHA、上段右から2番目）；遊離オキサリプラチンと遊離DHAの組み合わせ（オキサリプラチン+ DHA、右上）；亜鉛（Zn）及びオキサリプラチンプロドラッグの配位ポリマーを含む脂質被覆ナノスケールポリマー粒子（NCP-3、下段左）；遊離Zn及び遊離DHAの組み合わせ（Zn/DHA、下段中央）；脂質コーティング層に脂質変性DHAを含むNCP-3粒子（NCP-3/DHA、下段右）。 オキサリプラチン及び/又はジヒドロアルテミシニン（DHA）で処理されたCT26ネズミ結腸直腸腺癌細胞の培地における、高移動度群ボックス-1（HMBG-1）タンパク質放出/発現（ng/mL）を示すグラフである。この処理には以下の処理が含まれる：遊離オキサリプラチン；遊離DHA；コレステロール変性DHA（chol-DHA）；亜鉛（Zn）及びオキサリプラチンプロドラッグの配位ポリマーを含む脂質被覆ナノスケールポリマー粒子（NCP-3）；遊離ZnとDHAとの組合せ（Zn/DHA）；遊離オキサリプラチンと遊離DHAの組合せ（オキサリプラチン+ DHA）；脂質コーティング層にコレステロール変性DHAを含むNCP-3粒子（NCP-3/DHA）；脂質コーティング層にオレイン酸変性DHAを含むNCP-3粒子（NCP-3/OA-DHA）。比較のため、対照として、リン酸緩衝食塩水で処理した細胞の放出データ（PBS）を示す。 ジヒドロアルテミシニンを含む脂質コーティング層を有する亜鉛（Zn）及びオキサリプラチンプロドラッグを含むNCP粒子（NCP-3/DHA）を静脈注射した後の、SD/CDラットの血漿中の白金の薬物動態を、誘導結合血漿質量分析（ICP-MS）で測定したグラフを示す。 ジヒドロアルテミシニンを含む脂質コーティング層を有する亜鉛（Zn）及びオキサリプラチンプロドラッグを含むNCP粒子（NCP-3/DHA）を静脈注射した後の、SD/CDラットの血漿中のコレステロール変性ジヒドロアルテミシン（Chol-DHA）の薬物動態を、液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）で測定したグラフを示す。 ジヒドロアルテミシニンを含む脂質コーティング層を有する亜鉛（Zn）及びオキサリプラチンプロドラッグを含むNCP粒子（NCP-3/DHA）をCT26ネズミ結腸直腸腺癌腫瘍を生じているマウスへ腹腔内注射した後の、NCP粒子（NCP-3/DHA）の生体分布を示すグラフである。オキサリプラチンプロドラッグからの白金（Pt）を、誘導結合プラズマ質量分析（ICP-MS）で分析した。 CT26ネズミ結腸直腸腺癌腫瘍を生じているマウスに対して、免疫チェックポイント阻害療法を行う／行わない場合の、ジヒドロアルテミシニンを含む脂質コーティング層を有する亜鉛（Zn）及びオキサリプラチンプロドラッグを含むNCP粒子（NCP-3/DHA）のインビボ抗癌活性を示すグラフである。データは以下を含む：NCP-3/DHAで処理したマウス（NCP-3/DHA、左向き×印付三角）；脂質コーティング層にDHAを含まない同じ粒子で処理したマウス（NCP-3、下向き三角）；遊離OX、遊離DHA及び抗プログラム死リガンド1（PD-L1）抗体の組み合わせで処理したマウス（遊離OX + DHA + PD-L1、半分黒の六角形）；NCP-3とPD-L1抗体の組み合わせで処理したマウス（NCP-3 + PD-L1、菱形）：NCP-3/DHAとPD-L1抗体の組み合わせで処理したマウス（NCP-3/DHA + PD-L1、星印）；より高い用量（32mg/kg）のNCP-3/DHAで処理したマウス（半分黒の五角形）。対照として、リン酸緩衝食塩水で処理したマウスのデータ（PBS、黒四角）を示す。 図20Bは、MC38ネズミ結腸直腸癌腫瘍を生じているマウスに対して、免疫チェックポイント阻害療法を行う／行わない場合の、ジヒドロアルテミシニンを含む脂質コーティング層を有する亜鉛（Zn）及びオキサリプラチンプロドラッグを含むNCP粒子（NCP-3/DHA）のインビボ抗癌活性を示すグラフである。データは以下を含む：NCP-3/DHAで処理したマウス（NCP-3/DHA、左向き×印付三角）；脂質コーティング層にDHAを含まない同じ粒子で処理したマウス（NCP-3、下向き三角）；遊離OX、遊離DHA及び抗プログラム死リガンド1（PD-L1）抗体の組み合わせで処理したマウス（遊離OX + DHA + PD-L1、半分黒の五角形）；NCP-3とPD-L1抗体の組み合わせで処理したマウス（NCP-3 + PD-L1、菱形）：NCP-3/DHAとPD-L1抗体の組み合わせで処理したマウス（NCP-3/DHA + PD-L1、六角形）；より高い用量（16mg/kg）のNCP-3/DHAとPD-L1抗体で処理したマウス（白丸）。対照として、リン酸緩衝食塩水で処理したマウスのデータ（PBS、黒四角）を示す。 オキサリプラチン（OX）及び/又はジヒドロアルテミシニン（DHA）含有又は非含有組成物で処理し、MC38腫瘍特異的リジン-セリン-プロリンリピート（KSP）ペプチドで刺激した後に採取した、脾細胞で検出されたガンマ－インターフェロン（IFN- γ）生成Ｔ細胞のグラフを示す。処理には以下が含まれる（左から右へ）：リン酸緩衝食塩水（PBS）；抗プログラム死リガンド1抗体（PD-L1）；遊離OX、遊離DHA及びPD-L1抗体の組み合わせ（遊離OX + DHA + PD-L1）；亜鉛（Zn）とDHAの組み合わせ（Zn/DHA）；脂質コーティングされた、亜鉛（Zn）及びオキサリプラチンプロドラッグのコアを含むNCP粒子（NCP-3）；脂質コーティング層に脂質変性DHAを含む同じ粒子（NCP-3/DHA）；NCP-3/DHAとPD-L1抗体の組み合わせ（NCP-3/DHA+ PD-L1）。 4T1トリプルネガティブ乳癌腫瘍を有するマウスに対する、脂質コーティング層に脂質変性ジヒドロアルテミシニンを含み、亜鉛（Zn）及びオキサリプラチンプロドラッグの配位ポリマーを含むコアを有する脂質コーティングされたNCP粒子（NCP-3/DHA）のインビボ抗癌活性を示すグラフである。マウスをPD-L1抗体（上向き三角）；NCP-3/DHA（白丸）；それらの組み合わせ（下向き三角）で処理した。比較のため、対照として、リン酸緩衝生理食塩水で処理したマウスのデータ（PBS、黒四角）を示す。マウスには、10日目から開始して3日ごとに等価用量8mg/kgのオキサリプラチンを腹腔内注射した。 LL/2非小細胞肺癌腫瘍保有マウスに対する、脂質コーティング層に脂質変性ジヒドロアルテミシニンを含み、亜鉛（Zn）及びオキサリプラチンプロドラッグの配位ポリマーを含むコアを有する脂質コーティングされたNCP粒子（NCP-3/DHA）のインビボ抗癌活性を示すグラフである。マウスをPD-L1抗体（白丸）；NCP-3/DHA（△）で処理した。比較のため、対照として、リン酸緩衝生理食塩水で処理したマウスのデータ（PBS、黒四角）を示す。マウスには、12日目から開始して3日ごとに等価用量8mg/kgのオキサリプラチンを腹腔内注射した。 以下を含む組成物と共に72時間インキュベートした非小細胞肺癌（NSCLC）A549細胞における細胞傷害性を示すグラフである：シスプラチン（四角）；エトポシド（ET、丸）；パクリタキセル（PTX、上向き三角）；カンプトテシン（CPT、下向き三角）；コレステロール変性ET（Chol-ET、菱形）；コレステロール変性PTX（Chol-PTX、左向き三角）；オレイン酸変性CPT（OA-CPT、右向き三角）。 以下を含む組成物と共に72時間インキュベートした非小細胞肺癌（NSCLC）A549細胞における細胞傷害性を示すグラフである：シスプラチン類似体を含むNCP粒子（NCP-1、四角）；オレイン酸変性組成物（OA-CPT）及びコレステロール変性エトポシド（Chol-ET）を含む脂質コーティング層を有するNCP粒子（NCP-1/OA-CPT/Chol-Et、丸）；OA-CPT及びコレステロール変性パクリタキセル（Chol-PTX）を含む脂質被覆層を有するNCP-1粒子（NCP-1/OA-CPT/Chol-PTX、上向き三角）；OA-CPT、Chol-ET及びChol-PTXを含む脂質コーティング層を有するNCP-1粒子（NCP-1/OA-CPT/Chol-ET/Chol-PTX、下向き三角）。 左から右へ、オキサリプラチン；亜鉛及びオキサリプラチンプロドラッグを含むNCP粒子（NCP-2）；及び脂質コーティング層にピロリピドを含むNCP-2粒子(NCP-2@Pyrolipid)の、CT26マウス結腸直腸腺癌細胞への細胞摂取を示すグラフである。1、2、4、24時間後に誘導結合プラズマ質量分析法（ICP-MS）によって白金（Pt）濃度（pmol/105細胞）を測定した。 左から右へ、脂質コーティング層にピロリピドを含むNCP-2粒子(NCP-2@Pyrolipid)；及びポルフィゾームの、CT26マウス結腸直腸腺癌細胞への細胞摂取を示すグラフである。1、2、4、24時間後にピロリピド濃度（pmol/105細胞）を紫外可視分光法（UV-Vis）で測定した。 CT26ネズミ結腸直腸腺癌腫瘍を生じているマウスに静脈注射した後の、亜鉛及びオキサリプラチンプロドラッグのコア及びピロリピドを含む脂質コーティング層から成るNCP粒子(NCP-2@Pyrolipid)の薬物動態及び生体内分布からの初期用量（ID）からの白金の残存率（％）を示す。白金（Pt）は、誘導結合プラズマ質量分析（ICP-MS）によって分析した。 図25Aの研究からの、時間に対する初期用量（ID）から残存するピロリピドの割合（％）を示すグラフである。ピロリピドは紫外可視分光法（UV-Vis）により分析した。 CT26ネズミ結腸直腸腺癌腫瘍を生じているマウスにおける、亜鉛及びオキサリプラチン類似体のコア及びピロリピドを含む脂質コーティング層から成る脂質被覆NCP粒子(NCP-2@Pyrolipid)のインビボ抗癌活性を示すグラフである。マウスに、オキサリプラチン類似体用量2mg/kgで、NCP粒子(NCP-2@Pyrolipid)（下向き三角）又はピロリピドなしの同じNCP粒子（NCP-2、丸）を静脈注射した。続いて670nmの光を100mW/cm2で30分間照射し(＋)、注射の24時間後に4日ごとに合計2回の処理を行った。対照として、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS、四角）の処理又は照射なしのNCP粒子(NCP-2@Pyrolipid（－）、上向き三角）で処理したマウスのデータも示す。 HT29ヒト結腸直腸腫瘍を有するマウスにおける、亜鉛及びオキサリプラチン類似体のコア及びピロリピドを含む脂質コーティング層から成る脂質被覆NCP粒子(NCP-2@Pyrolipid)のインビボ抗癌活性を示すグラフである。マウスに、オキサリプラチン類似体用量2mg/kgで、NCP粒子(NCP-2@Pyrolipid)（下向き三角）又はピロリピドなしの同じNCP粒子（NCP-2、丸）を静脈注射した。続いて670nmの光を100mW/cm2で30分間照射し(＋)、注射の24時間後に4日ごとに合計2回の処理を行った。対照として、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS、四角）の処理又は照射なしのNCP粒子(NCP-2@Pyrolipid（－）、上向き三角）で処理したマウスのデータも示す。 腫瘍接種後7,8,9及び10日目のCT26マウス結腸直腸腺癌腫瘍保有マウスにおける血清ガンマインターフェロン（IFN-γ）濃度（1ng/L）のグラフである。このマウスは、（初回の処理後0, 1, 2, 3日目に）図26に記載のように処理した。 腫瘍接種後7,8,9及び10日目のCT26マウス結腸直腸腺癌腫瘍保有マウスにおける血清インターロイキン6（IL-6）濃度（1ng/L）のグラフである。このマウスは、（初回の処理後0, 1, 2, 3日目に）図26に記載のように処理した。 腫瘍接種後7,8,9及び10日目のCT26マウス結腸直腸腺癌腫瘍保有マウスにおける血清腫瘍ネクローシス因子α（TNF-α）濃度（1ng/L）のグラフである。このマウスは、（初回の処理後0, 1, 2, 3日目に）図26に記載のように処理した。 ナノ粒子で処理された癌細胞を用いて予めワクチン接種されたマウスに生存腫瘍細胞を再曝露した後の、腫瘍のないマウスの確率を示すグラフである。CT26ネズミ結腸直腸腺癌細胞を、亜鉛及びオキサリプラチン類似体のコア及びピロリピドを含む脂質コーティング層から成るNCP粒子(NCP-2@Pyrolipid)及び光照射で処理しておき、このCT26ネズミ結腸直腸腺癌細胞をBALB/cマウスに皮下に接種した（NCP-2@Pyrolipid 、点線）。接種後の7日目に、生存CT26細胞をマウスに再曝露した。比較のため、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で処理した癌細胞でワクチン接種したマウスに再曝露した後の、腫瘍のないマウスの確率も示す（実線）。 対照としてリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で処理した癌細胞を接種したマウス（PBS、四角）、及びCT26ネズミ結腸直腸腺癌細胞を、亜鉛及びオキサリプラチン類似体のコア及びピロリピドを含む脂質コーティング層から成るNCP粒子及び光照射で処理しておき、このCT26ネズミ結腸直腸腺癌細胞を接種したマウス（NCP-2@Pyrolipid 、丸）に再再曝露した腫瘍の増殖曲線を示すグラフである。 最初の腫瘍接種の1日後の図30Aのマウスにおける、左から右へ、インターフェロンガンマ（IFN-γ）、インターロイキン6（IL-6）及び腫瘍ネクローシス因子アルファ（TNF-α)の血清濃度（ng/L）を示すグラフである。PBS処理された腫瘍細胞を接種したマウスのデータを「白抜き棒」で示し、ナノ粒子/光照射で処理した腫瘍細胞を接種したマウスのデータを「斜線の棒」で示す。 オキサリプラチン類似体及びピロリピドを含む脂質コーティング層から成るNCP粒子(NCP-2@Pyrolipid)のアブスコパル効果を示すグラフである。このグラフは、左右両脇腹にCT26ネズミ結腸直腸腺癌細胞を接種し、右脇腹を、NCP粒子(NCP-2@Pyrolipid（+）、丸）；光照射なしのNCP粒子(NCP-2@Pyrolipid（－）、下向き三角）；ピロリピド含有脂質コーティング層を有するシスプラチンビスホスホネート含有NCP粒子と光照射有(NCP-1@Pyrolipid（＋）、上向き三角）；リン酸緩衝化生理食塩水及び光照射（PBS（+）、四角）で処理したマウスの、左脇腹の腫瘍の腫瘍増殖曲線を示す。 オキサリプラチン類似体及びピロリピドを含む脂質コーティング層から成るNCP粒子(NCP-2@Pyrolipid)のアブスコパル効果を示すグラフである。このグラフは、左右両脇腹にCT26ネズミ結腸直腸腺癌細胞を接種し、右脇腹を、NCP粒子(NCP-2@Pyrolipid（+）、丸）；光照射なしのNCP粒子(NCP-2@Pyrolipid（－）、下向き三角）；ピロリピド含有脂質コーティング層を有するシスプラチンビスホスホネート含有NCP粒子と光照射有(NCP-1@Pyrolipid（＋）、上向き三角）；リン酸緩衝化生理食塩水及び光照射（PBS（+）、四角）で処理したマウスの、右脇腹の腫瘍の腫瘍増殖曲線を示す。 左右両脇腹にMC38ネズミ結腸直腸癌腫細胞を接種し、右脇腹を、オキサリプラチン類似体及びピロリピドを含む脂質コーティング層から成るNCP粒子(NCP-2@Pyrolipid)及び光照射（NCP-2@Pyrolipid（+）、上向き三角）；光照射なしのNCP粒子(NCP-2@Pyrolipid（－）、丸）；NCP粒子(NCP-2@Pyrolipid)及び光照射及び抗プログラム死リガンド1（PD-L1）抗体（（NCP-2@Pyrolipid（+）+抗PD-L1、菱形）；光照射なしのNCP粒子(NCP-2@Pyrolipid）及びPD-L1抗体（NCP-2@Pyrolipid（－）+抗PD-L1、下向き三角）；リン酸緩衝化生理食塩水及び光照射（PBS（+）、四角）で処理したマウスの、右脇腹の腫瘍の腫瘍増殖曲線を示す。 左右両脇腹にMC38ネズミ結腸直腸癌腫細胞を接種し、右脇腹を、オキサリプラチン類似体及びピロリピドを含む脂質コーティング層から成るNCP粒子(NCP-2@Pyrolipid)及び光照射（NCP-2@Pyrolipid（+）、上向き三角）；光照射なしのNCP粒子(NCP-2@Pyrolipid（－）、丸）；NCP粒子(NCP-2@Pyrolipid)及び光照射及び抗プログラム死リガンド1（PD-L1）抗体（（NCP-2@Pyrolipid（+）+抗PD-L1、菱形）；光照射なしのNCP粒子(NCP-2@Pyrolipid）及びPD-L1抗体（NCP-2@Pyrolipid（－）+抗PD-L1、下向き三角）；リン酸緩衝化生理食塩水及び光照射（PBS（+）、四角）で処理したマウスの、左脇腹の腫瘍の腫瘍増殖曲線を示す。 左右両脇腹にCT26ネズミ結腸直腸腺癌細胞を接種し、右脇腹を、オキサリプラチン類似体及びピロリピドを含む脂質コーティング層から成るNCP粒子(NCP-2@Pyrolipid)及び光照射及び抗プログラム死リガンド1（PD-L1）抗体（NCP-2@Pyrolipid（+）+抗PD-L1、丸）；リン酸緩衝化生理食塩水及び光照射（PBS（+）、四角）で処理したマウスの、右脇腹の腫瘍の腫瘍増殖曲線を示す。 左右両脇腹にCT26ネズミ結腸直腸腺癌細胞を接種し、右脇腹を、オキサリプラチン類似体及びピロリピドを含む脂質コーティング層から成るNCP粒子(NCP-2@Pyrolipid)及び光照射及び抗プログラム死リガンド1（PD-L1）抗体（NCP-2@Pyrolipid（+）+抗PD-L1、丸）；リン酸緩衝化生理食塩水及び光照射（PBS（+）、四角）で処理したマウスの、左脇腹の腫瘍の腫瘍増殖曲線を示す。 ピロリン酸亜鉛コア及びピロリピドを含む脂質コーティング層から成るNCP粒子(NCP-2@Pyrolipid)及び光照射（+）（丸）；NCP粒子(NCP-2@Pyrolipid)及び光照射及び抗プログラム死リガンド1（PD-L1）抗体（下向き三角）；NCP粒子(NCP-2@Pyrolipid)及び抗プログラム死リガンド1（PD-L1）抗体（上向き三角）；リン酸緩衝化生理食塩水及び光照射（PBS（+）、四角）で処理した4T1トリプルネガティブ乳癌異種移植片の腫瘍増殖曲線のグラフである。 図33Aの処理の終了時の腫瘍重量（g）を示す。 左右両脇腹に4T1トリプルネガティブ乳癌細胞を接種し、右脇腹を、ピロリン酸亜鉛コア及びピロリピドを含む脂質コーティング層から成るNCP粒子(NCP-2@Pyrolipid)及び光照射（+）（丸）；NCP粒子(NCP-2@Pyrolipid)及び光照射及び抗プログラム死リガンド1（PD-L1）抗体（下向き三角）；NCP粒子(NCP-2@Pyrolipid)及び抗プログラム死リガンド1（PD-L1）抗体（上向き三角）；リン酸緩衝化生理食塩水及び光照射（PBS（+）、四角）で処理したマウスの、右脇腹の腫瘍の腫瘍増殖曲線を示す。 左右両脇腹に4T1トリプルネガティブ乳癌細胞を接種し、右脇腹を、ピロリン酸亜鉛コア及びピロリピドを含む脂質コーティング層から成るNCP粒子(NCP-2@Pyrolipid)及び光照射（+）（丸）；NCP粒子(NCP-2@Pyrolipid)及び光照射及び抗プログラム死リガンド1（PD-L1）抗体（下向き三角）；NCP粒子(NCP-2@Pyrolipid)及び抗プログラム死リガンド1（PD-L1）抗体（上向き三角）；リン酸緩衝化生理食塩水及び光照射（PBS（+）、四角）で処理したマウスの、左脇腹の腫瘍の腫瘍増殖曲線を示す。 図34A及び34Bに記載のように処理されたマウスの左右の脇腹における腫瘍の、処理期間の終了時における腫瘍重量（g）を示す。 左右両脇腹にTUBO乳癌細胞を接種し、右脇腹を、ピロリン酸亜鉛コア及びピロリピドを含む脂質コーティング層から成るNCP粒子(NCP-2@Pyrolipid)及び光照射（+）（丸）；NCP粒子(NCP-2@Pyrolipid)及び光照射及び抗プログラム死リガンド1（PD-L1）抗体（下向き三角）；NCP粒子(NCP-2@Pyrolipid)及び抗プログラム死リガンド1（PD-L1）抗体（上向き三角）；リン酸緩衝化生理食塩水及び光照射（PBS（+）、四角）で処理したマウスの、右脇腹の腫瘍の腫瘍増殖曲線を示す。 左右両脇腹にTUBO乳癌細胞を接種し、右脇腹を、ピロリン酸亜鉛コア及びピロリピドを含む脂質コーティング層から成るNCP粒子(NCP-2@Pyrolipid)及び光照射（+）（丸）；NCP粒子(NCP-2@Pyrolipid)及び光照射及び抗プログラム死リガンド1（PD-L1）抗体（下向き三角）；NCP粒子(NCP-2@Pyrolipid)及び抗プログラム死リガンド1（PD-L1）抗体（上向き三角）；リン酸緩衝化生理食塩水及び光照射（PBS（+）、四角）で処理したマウスの、左脇腹の腫瘍の腫瘍増殖曲線を示す。 図35A及び35Bに記載のように処理されたマウスの左右の脇腹における腫瘍の、処理期間の終了時における腫瘍重量（g）を示す。 図35A及び35Bに記載のように処理した腫瘍接種後10, 11, 12, 13日目（最初の処理後1, 2, 3日目）のTUBO乳房腫瘍保有マウスにおける血清腫瘍ネクローシス因子α（TNF-α）の濃度（pg/mL）を示す。 図35A及び35Bに記載のように処理した腫瘍接種後10, 11, 12, 13日目（最初の処理後1, 2, 3日目）のTUBO乳房腫瘍保有マウスにおける血清インターフェロンγ（IFN-γ）の濃度（pg/mL）を示す。 図35A及び35Bに記載のように処理した腫瘍接種後10, 11, 12, 13日目（最初の処理後1, 2, 3日目）のTUBO乳房腫瘍保有マウスにおける血清インターロイキン6（IL-6）の濃度（pg/mL）を示す。 左右脇腹TUBO乳房腫瘍マウスモデルの右脇腹を、リン酸緩衝生理食塩水（PBS、白丸）；ピロリピドを含む脂質コーティング層を有するピロリン酸亜鉛NCP粒子の注入及び光照射による光線力学療法（PDT、四角）；抗プログラム死リガンド1（PD-L1）抗体の注入（α-PD-L1、三角）；PDT及び抗体（黒丸）で処理したマウスにおけるCD45+リンパ球の割合を示す。データは最初の処理後12日目に収集した。 左右脇腹TUBO乳房腫瘍マウスモデルの右脇腹を、リン酸緩衝生理食塩水（PBS、白丸）；ピロリピドを含む脂質コーティング層を有するピロリン酸亜鉛NCP粒子の注入及び光照射による光線力学療法（PDT、四角）；抗プログラム死リガンド1（PD-L1）抗体の注入（α-PD-L1、三角）；PDT及び抗体（黒丸）で処理したマウスにおけるCD8+T細胞の割合を示す。データは最初の処理後12日目に収集した。 左右脇腹TUBO乳房腫瘍マウスモデルの右脇腹を、リン酸緩衝生理食塩水（PBS、白丸）；ピロリピドを含む脂質コーティング層を有するピロリン酸亜鉛NCP粒子の注入及び光照射による光線力学療法（PDT、四角）；抗プログラム死リガンド1（PD-L1）抗体の注入（α-PD-L1、三角）；PDT及び抗体（黒丸）で処理したマウスにおけるCD4+T細胞の割合を示す。データは最初の処理後12日目に収集した。 左右脇腹TUBO乳房腫瘍マウスモデルの右脇腹を、リン酸緩衝生理食塩水（PBS、白丸）；ピロリピドを含む脂質コーティング層を有するピロリン酸亜鉛NCP粒子の注入及び光照射による光線力学療法（PDT、四角）；抗プログラム死リガンド1（PD-L1）抗体の注入（α-PD-L1、三角）；PDT及び抗体（黒丸）で処理したマウスにおけるB細胞の割合を示す。データは最初の処理後12日目に収集した。 左右脇腹TUBO乳房腫瘍マウスモデルの右脇腹を、リン酸緩衝生理食塩水（PBS、白丸）；ピロリピドを含む脂質コーティング層を有するピロリン酸亜鉛NCP粒子の注入及び光照射による光線力学療法（PDT、四角）；抗プログラム死リガンド1（PD-L1）抗体の注入（α-PD-L1、三角）；PDT及び抗体（黒丸）で処理したマウスの腫瘍排液リンパ節におけるCD8+T細胞の割合を示す。データは最初の処理後12日目に収集した。 左右脇腹TUBO乳房腫瘍マウスモデルの右脇腹を、リン酸緩衝生理食塩水（PBS、白丸）；ピロリピドを含む脂質コーティング層を有するピロリン酸亜鉛NCP粒子の注入及び光照射による光線力学療法（PDT、四角）；抗プログラム死リガンド1（PD-L1）抗体の注入（α-PD-L1、三角）；PDT及び抗体（黒丸）で処理したマウスの腫瘍排液リンパ節におけるCD4+T細胞の割合を示す。データは最初の処理後12日目に収集した。
いくつかの実施態様において、本発明は、ジスルフィド結合などの生分解性結合を含む薬物－脂質結合体を含むプロドラッグを提供する。このプロドラッグは、小分子化学療法剤から調製することができ、この小分子化学療法剤は、免疫細胞死を引き起こす能力のような免疫学的効果を有することが知られているものを含むが、これに限定されるものではない。このプロドラッグの脂質部分は、無機及び/又は金属有機マトリックスナノ粒子又は他のナノスケール薬物送達プラットフォームの脂質コーティング層へのプロドラッグの取り込みを促進することができる。
したがって、いくつかの実施態様において、本発明は、免疫原性細胞死を引き起こすこと又は免疫刺激性であることが知られているような化学療法剤を含むナノ粒子を提供する。いくつかの実施態様において、このナノ粒子は、複数のタイプの癌を治療するための複数の化学療法剤を含むことができる。このナノ粒子は、光線力学療法(PDT)と組み合わせて、又は単独使用されて免疫刺激を引き起こして、効果的な癌療法をもたらすことができる。このようなナノ粒子は、更に免疫療法剤と組み合わせることができる。この免疫療法剤には、例えば、CTLA-4、PD-1/PD-L1、IDO、LAG-3、CCR-7又は他の経路などを標的とする免疫抑制剤や、これらの複数の経路の組み合わせを標的として全身性抗腫瘍免疫を誘発する免疫抑制阻害剤などがある。
ここで開示される発明は、代表的な実施態様が示されている実施例を参照して、以下でより完全に説明される。しかしながら、本明細書に開示された発明は、異なる形態で具体化されてもよく、本明細書に記載の実施態様に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施態様は、本開示が完全かつ完全であるために、またこれらの実施態様の範囲を当業者に完全に伝えるために提供される。
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似又は等価な任意の方法、デバイス、及び材料は、ここに開示される発明の実施又は試験に使用することができるが、ここで開示されているのでは代表的な方法、デバイス及び材料である。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。
本明細書及び特許請求の範囲において、記載された化学式又は化学名は、すべての光学異性体及び立体異性体、ならびにそのような異性体及び混合物が存在するラセミ混合物を包含する。
本明細書では以下の略語を用いる：
℃=摂氏；％=パーセンテージ；μｌ=マイクロリットル；μM=マイクロモル；Chol =コレステロール；cm =センチメートル；CPT =カンプトテシン；CRT =カルレティキュリン；DCM =ジクロロメタン；DHA =ジヒドロアルテミシニン；DLS =動的光散乱；DMF =ジメチルホルムアミド；DOPA =ジオレオイル-sn-グリセロ-3-リン酸；DOPC = 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-リン酸ナトリウム塩；DSPE-PEG2k = 1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N- [アミノ（ポリエチレングリコール）2000]；ET =エトポシド；EtOH =エタノール；g =グラム；h =時間；IC50 = 50％阻害濃度；ICP-MS =誘導結合プラズマ質量分析法；kg =キログラム；M =モル；mg =ミリグラム；min=分；mL =ミリリットル；mM =ミリモル；mmol =ミリモル；MOF =金属－有機骨格；MTX =ミトキサントロン；MW =分子量；NCP =ナノスケール配位ポリマー；NIR =近赤外線；nm =ナノメートル；nmol =ナノモル；NMR =核磁気共鳴；OA =オレイン酸；OX =オキサリプラチン；PBS =リン酸緩衝食塩水；PDI =多分散指数；PD-L1 =プログラム死リガンド1；PDT =光線力学療法；PEG =ポリエチレングリコール；pmol =ピコモル；PS =光増感剤；Pt =白金；PTX =パクリタキセル；PVP =ポリビニルピロリドン；RES =細網内皮系；rpm =回転数/分；SBU =二次建築単位；sec=秒；SOSG =一重項酸素センサー緑；TEM =透過型電子顕微鏡；TFA =トリフルオロ酢酸；THF =テトラヒドロフラン；Zn =亜鉛
Ｉ．定義
以下の用語は、当業者によってよく理解されると考えられるが、以下の定義は、本発明の説明を促進するために説明される。
長年の特許法慣習に従って、特許請求の範囲を含む本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その」は、使用される場合、「１つ以上」を指す。したがって、例えば、「１つの金属イオン」への言及は、複数のそのような金属イオンを含む、などである。
別段示されない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される、サイズ、反応条件などの量を表す全ての数は、全ての場合において、「約」という用語によって修飾されるものとして理解されたい。したがって、それに反して示されない限り、本明細書及び添付の特許請求の範囲において説明される数的パラメータは、本発明によって得ることが求められる所望される特性によって変動し得る近似値である。
本明細書で使用される場合、値、又はサイズ（すなわち、直径）、重量、濃度、もしくはパーセンテージの量を指す時、「約」という用語は、明記される値から、一例において±２０％又は±１０％、別の例において±５％、別の例において±１％、及び更に別の例において±０．１％の変動を網羅することが意図されるが、これは、そのような変動が開示される方法を実行するのに適切なものであるためである。
本明細書で使用される場合、実体を列挙する文脈で使用される時、「及び／又は」という用語は、単独又は組み合わせで存在する実体を指す。したがって、例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、及び／又はＤ」という語句は、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤを個々に含むが、また、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤの任意ならびに全ての組み合わせ及び部分組み合わせも含む。
本明細書で両端によって示される数値範囲は、その範囲内に包含される全ての数及び分数を含む。（例えば、1～5の数値範囲は、1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.90, 4及び5を含むが、これに限定されない。）
「を含む（including）」、「を含有する」、又は「によって特徴付けられる」と同義である「を含む（comprising）」という用語は、包括的又は無制限であり、引用されない追加の要素又は方法ステップを除外しない。「を含む」は、特許請求の言語で使用される専門用語であり、名前を挙げた要素が存在するが、他の要素が追加されてもよく、依然として特許請求の範囲内の構築物又は方法を形成することを意味する。
本明細書で使用される場合、「からなる」という語句は、特許請求の範囲内に明記されないいかなる要素、ステップ、又は成分も除外する。「からなる」という語句が、前文の直後ではなく、特許請求の範囲の本文の条項に出現する場合、それは、その条項内に説明される要素のみを限定し、他の要素は特許請求の範囲全体からは除外されない。
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という語句は、特許請求の範囲を、明記される材料又はステップ、ならびに主張される主題の基本的及び新規の特徴（複数可）に実質的な影響を与えないものに限定する。
「を含む」、「からなる」、及び「から本質的になる」という用語に関して、これら３つの用語のうちの１つが本明細書で使用される場合、本開示の主張される主題は、その他の２つの用語のいずれかの使用を含むことができる
本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、オクチル基、エテニル基、プロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、オクテニル基、ブタジエニル基、プロピニル基、ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基、ヘプチニル基、及びアレニル基を含む、直鎖（ｌｉｎｅａｒ）（すなわち、「直鎖（ｓｔｒａｉｇｈｔ－ｃｈａｉｎ）」）、分岐、又は環状、飽和、もしくは少なくとも部分的に及び場合によっては完全に不飽和（すなわち、アルケニル及びアルキニル）の炭化水素鎖を含む、Ｃ１－２０を指し得る。「分岐」は、メチル、エチル、又はプロピルなどの低級アルキル基が直鎖アルキル鎖に結合したアルキル基を指す。「低級アルキル」は、１～約８個の炭素原子、例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８個の炭素原子を有するアルキル基（すなわち、Ｃ１－８アルキル）を指す。「高級アルキル」は、約１０～約２０個の炭素原子、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個の炭素原子を有するアルキル基を指す。特定の実施形態において、「アルキル」は、Ｃ１－８直鎖アルキルを指す。他の実施形態において、「アルキル」は、特に、Ｃ１－８分岐鎖アルキルを指す。
アルキル基は、任意で、同一であっても、異なってもよい１つ以上のアルキル基置換基で置換されることができる（「置換アルキル」）。「アルキル基置換基」という用語は、アルキル、置換アルキル、ハロ、アリールアミノ、アシル、ヒドロキシル、アリールオキシル、アルコキシル、アルキルチオ、アリールチオ、アラルキルオキシル、アラルキルチオ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、オキソ、及びシクロアルキルを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、任意で、アルキル鎖に沿って、１つ以上の酸素原子、硫黄原子、又は置換もしくは非置換窒素原子が挿入されてもよく、窒素置換基は、水素、低級アルキル（本明細書では「アルキルアミノアルキル」とも呼ばれる）、又はアリールである。
したがって、本明細書で使用される場合、「置換アルキル」という用語は、本明細書で定義される、アルキル基の１つ以上の原子又は官能基が別の原子又は官能基（例えば、アルキル基、置換アルキル基、ハロゲン基、アリール基、置換アリール基、アルコキシル基、水酸基、ニトロ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、硫酸基、及びメルカプト基を含む）で置換される、アルキル基を含む。
「アリール」という用語は、本明細書では、ともに融合された、共有結合された、又は共通の基（メチレン部分もしくはエチレン部分などであるが、これらに限定されない）に連結された、芳香族単環もしくは芳香族多環であり得る、芳香族置換基を指すために使用される。共通の連結基はまた、ベンゾフェノンにおけるようにカルボニルであっても、ジフェニルエーテルにおけるように酸素であっても、ジフェニルアミンにおけるように窒素であってもよい。「アリール」という用語は、ヘテロ環状芳香族化合物を特に網羅する。芳香族環（複数可）は、他の中でも、フェニル、ナフチル、ビフェニル、ジフェニルエーテル、ジフェニルアミン、及びベンゾフェノンを含むことができる特定の実施形態において、「アリール」という用語は、５員炭化水素及び６員炭化水素芳香族環ならびにヘテロ環状芳香族環を含む、約５～約１０個の炭素原子、例えば、５、６、７、８、９、又は１０個の炭素原子を含む環状芳香族を意味する。
アリール基は、任意で、同一であっても、異なってもよい１つ以上のアリール基置換基で置換され得（「置換アリール」）、「アリール基置換基」は、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アリールオキシル、アラルキルオキシル、カルボキシル、アシル、ハロ、ニトロ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アラルコキシカルボニル、アシルオキシル、アシルアミノ、アロイルアミノ、カルバモイル、アルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、アリールチオ、アルキルチオ、アルキレン、ならびに－ＮＲ'Ｒ''（Ｒ'及びＲ''はそれぞれ独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、及びアラルキルであり得る）を含む。
したがって、本明細書で使用される場合、「置換アリール」という用語は、本明細書で定義される、アリール基の１つ以上の原子又は官能基が別の原子又は官能基（例えば、アルキル基、置換アルキル基、ハロゲン基、アリール基、置換アリール基、アルコキシル基、水酸基、ニトロ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、硫酸基、及びメルカプト基を含む）で置換される、アリール基を含む。
アリール基の具体的な例としては、シクロペンタジエニル、フェニル、フラン、チオフェン、ピロール、ピラン、ピリジン、イミダゾール、ベンズイミダゾール、イソチアゾール、イソキサゾール、ピラゾール、ピラジン、トリアジン、ピリミジン、キノリン、イソキノリン、インドール、カルバゾールなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール」は、環構造の骨格中に１つ以上の非炭素原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｓｅなど）を含有するアリール基を指す。窒素含有ヘテロアリール部分は、ピリジン、イミダゾール、ベンズイミダゾール、ピラゾール、ピラジン、トリアジン、ピリミジンなどを含むが、これらに限定されない。
「アラルキル」は－アルキル－アリール基を指し、任意で、アルキル部分及び／又はアリール部分は置換される。
「アルキレン」は、約１～約２０個の炭素原子、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖の二価脂肪族炭化水素基を指す。アルキレン基は、直鎖であっても、分岐鎖であっても、環状であってもよい。アルキレン基はまた、任意で、１つ以上の「アルキル基置換基」で不飽和及び／又は置換されることができる。任意で、アルキレン基に沿って、１つ以上の酸素原子、硫黄原子、又は置換もしくは非置換窒素原子が挿入されてもよく（本明細書では「アルキルアミノアルキル」とも呼ばれる）、窒素置換基は、既述のようにアルキルである。例示的なアルキレン基としては、メチレン（－ＣＨ２－）；エチレン（－ＣＨ２－ＣＨ２－）；プロピレン（－（ＣＨ２）３－）；シクロヘキシレン（－Ｃ６Ｈ１０－）；－ＣＨ＝ＣＨ－ＣＨ＝ＣＨ－；－ＣＨ＝ＣＨ－ＣＨ２－；－（ＣＨ２）ｑ－Ｎ（Ｒ）－（ＣＨ２）ｒ－（式中、ｑ及びｒのそれぞれは独立して、０～約２０、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０の整数であり、Ｒは、水素又は低級アルキルである）；メチレンジオキシル（－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－）；及びエチレンジオキシル（－Ｏ－（ＣＨ２）２－Ｏ－）が挙げられる。アルキレン基は、約２～約３個の炭素原子を有してもよく、６～２０個の炭素原子を更に有してもよい。
「アリーレン」という用語は、二価芳香族基、例えば、二価フェニル基又はナフチル基を指す。アリーレン基は、任意で、１つ以上のアリール基置換基で置換されることができる、かつ／又は１つ以上のヘテロ原子を含むことができる
「アミノ」という用語は、基－Ｎ（Ｒ）２を指し、式中、各Ｒは独立して、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、又は置換アラルキルである。「アミノアルキル」及び「アルキルアミノ」という用語は、－Ｎ（Ｒ）２基を指し得、式中、各Ｒは、Ｈ、アルキル、又は置換アルキルであり、かつ少なくとも１つのＲは、アルキル又は置換アルキルである。「アリールアミン」及び「アミノアリール」は、基－Ｎ（Ｒ）２を指し、式中、各Ｒは、Ｈ、アリール、又は置換アリールであり、かつ少なくとも１つのＲは、アリール又は置換アリール、例えば、アニリン（すなわち、－ＮＨＣ６Ｈ５）である。
「チオアルキル」という用語は、基－ＳＲを指し得、式中、Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アラルキル、置換アラルキル、アリール、及び置換アリールから選択される。同様に、「チオアラルキル」及び「チオアリール」という用語は、－ＳＲ基を指し、式中、Ｒはそれぞれ、アラルキル及びアリールである。
「ジスルフィド」という用語は、-S-S-基を指す。
本明細書で使用される場合、「ハロ」、「ハロゲン化物」、又は「ハロゲン」という用語は、フルオロ基、クロロ基、ブロモ基、及びヨード基を指す。
「ヒドロキシル」及び「ヒドロキシ」という用語は、－ＯＨ基を指す。
「メルカプト」又は「チオール」という用語は、－ＳＨ基を指す。
「カルボキシレート」及び「カルボン酸」という用語はそれぞれ、基－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－及び基－Ｃ（＝Ｏ）ＯＨを指し得る。「カルボキシル」という用語もまた、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ基を指し得る。いくつかの実施形態において、「カルボキシレート」又は「カルボキシル」は、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－基又は－Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ基のいずれかを指し得る。
「ホスホネート」という用語は、－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ）２基を指し、式中、各Ｒは独立して、Ｈ、アルキル、アラルキル、アリール、又は負電荷（すなわち、酸素原子に結合するＲ基が実質的に存在せず、酸素原子上に非共有電子対の存在をもたらすもの）であり得る。したがって、換言すると、各Ｒは、存在しても、不在であってもよく、存在する場合、Ｈ、アルキル、アラルキル、又はアリールから選択される。
「ホスフェート」は、－ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲ'）２基を指し、式中、Ｒ'は、Ｈ又は負電荷である。
「結合する」又は「結合される」という用語、及びこれらの派生語は、共有結合又は非共有結合のいずれかを指し得る。場合によっては、「結合する」という用語は、配位結合を介した結合を指す。「共役」という用語は、共有結合又は配位結合の形成などの結合プロセスも指し得る。
本明細書に記載されている化学式における下記構造に示されているような波線は、特定された構造の別の化学基（例えば、薬物化合物の一価誘導体）への結合部位を示すために使用される。
Figure 0007090034000005
本明細書で使用される「一価」という用語は、別の化学部分への化学結合に利用可能な１つの部位を有する化学成分を指す。したがって、「一価部分」は、この一価部分の１つの部位における結合を介して分子全体の残りの部分に結合している分子全体の一部であることができる。
本明細書で使用される「二価」という用語は、別の一つの化学的部分また複数の化学部分へ化学結合するために利用可能な２つの部位を有する化学的部分を指す。
本明細書で使用される「結合体／接合体」及び「結合した／接合した」という用語は、２又はそれ以上の成分（例えば、化学化合物、ポリマー、生体分子、粒子など）の互いの結合（例えば、共有結合）を指すことができる。いくつかの実施形態において、１つの結合体は、２つの異なる化合物に由来する２つの一価部分が、二価リンカー部分（例えば、場合により置換されたアルキレン又はアリーレン）を介して共有結合したものを含むことができる。いくつかの実施態様において、プロドラッグが特定の生理学的環境又は酵素に暴露されたときにこのリンカー中の１又は複数の結合が切断されるように、このリンカーは１又は複数の生分解性結合を含むことができる。
本明細書で使用される「プロドラッグ」という用語は、患者又はサンプルに投与した際に、所望の生物学的活性（例えば、抗癌活性）を有する別の化合物（すなわち、親化合物）を（直接的又は間接的に）提供することができる化合物を指す。全てではないがいくつかの実施態様において、このプロドラッグ化合物は、親化合物よりも所望の生物学的活性が低い。いくつかの実施態様において、このプロドラッグ化合物は、親化合物への変換前に測定可能な生物活性を有さない。いくつかの実施態様において、プロドラッグ自体が所望の活性を有する。
プロドラッグの親化合物への変換は、特定の酵素（例えば、エステラーゼ）の存在下又は特定の生物学的条件下（例えば、生理学的に関連するpH、又は生理学的環境に存在する還元剤の存在下）で行うことができる。いくつかの実施態様において、プロドラッグはまず別のプロドラッグに変換され、その後、親化合物に変換される（しばしばはるかにゆっくりと）。プロドラッグは、親化合物に比べて、バイオ利用可能性が広く、及び/又は生物学的区画（例えば、リソソーム、脳又はリンパ系など）への送達が促進されることが可能である。いくつかの実施形態において、プロドラッグは、親化合物よりも、特定の送達プラットフォームや配合物により適合することができる。
「結合する」又は「結合された」という用語及びこれらの派生語は、共有結合、配位結合又は非共有結合を指し得る。場合によっては、「結合する」という用語は、配位結合を介した結合を指す。「接合」という用語は、共有結合又は配位結合などの結合プロセスも指し得る。
「配位錯体」とは、金属イオンと、電子対供与体、配位子、又はキレート基との間に配位結合が存在する化合物である。したがって、配位子又はキレート基は一般に、金属イオンへの供与に利用可能な非共有電子対を有する、電子対供与体、分子、又は分子イオンである。
「配位結合」という用語は、電子対供与体と金属イオン上の配位部位との間の相互作用を指し、これは、電子対供与体と金属イオンとの間の引力をもたらす。この用語の使用は、特定の配位結合もまた、金属イオン及び電子対供与体の特徴によって（完全な共有結合的特徴を有さない場合）多かれ少なかれ共有結合的特徴を有するものとして分類されることができる程度まで、限定的であることが意図されない。
本明細書で使用される場合、「配位子」という用語は一般に、何らかの方法で別の種に相互作用する、例えば、結合する、分子又はイオンなどの種を指す。より具体的には、本明細書で使用される場合、「配位子」は、溶液中で金属イオンに結合して、「配位錯体」を形成する分子又はイオンを指し得る。その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Martell, A. E., and Hancock, R. D., Metal Complexes in Aqueous Solutions, Plenum: New York(1996)を参照されたい。「配位子」及び「キレート基」は、互換的に使用されることができる。「架橋配位子」は、２つ以上の金属イオン又は錯体に結合するため、金属イオン間又は錯体間に「架橋」をもたらす基を指し得る。有機架橋配位子は、例えば、アルキレン基又はアリーレン基によって分離される、非共有電子対を有する２つ以上の基を有し得る。非共有電子対を有する基としては、－ＣＯ２Ｈ基、－ＮＯ２基、アミノ基、水酸基、チオ基、チオアルキル基、－Ｂ（ＯＨ）２基、－ＳＯ３Ｈ基、ＰＯ３Ｈ基、ホスホネート基、及びヘテロ環中のヘテロ原子基（例えば、窒素、酸素、又は硫黄）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で、配位子、例えば、架橋配位子に関して使用される場合、「配位部位」という用語は、非共有電子対、負電荷、又は（例えば、特定のｐＨ下での脱プロトン化を介して）非共有電子対もしくは負電荷を形成することができる原子もしくは官能基を指す。
本明細書で使用される用語「金属有機マトリックス材料」は、金属成分と有機成分の両方を含む固体材料を指し、この有機成分は、少なくとも1つ、典型的には1つより多くの炭素原子を含む。この材料は、結晶質又は非晶質であってもよい。いくつかの実施態様において、このマトリックス材料は多孔質である。いくつかの実施態様において、この金属有機マトリックス材料は、金属イオン及び架橋多座（例えば、二座）配位子（例えば、有機配位子）を含む配位錯体の反復単位を含む、配位ポリマー（例えば、ナノスケール配位ポリマー（NCP））である。いくつかの実施態様において、このマトリックス材料は２種以上の金属イオンを含む。いくつかの実施態様において、このマトリックス材料は複数の金属クラスターを含んでもよい。いくつかの実施態様において、このマトリックス材料は、架橋有機配位子を含む配位複合体ネットワークを含む金属－有機骨格（MOF）である。
「金属－有機骨格」又は「ＭＯＦ」という用語は、金属成分及び有機成分の両方を含む固体の２次元又は３次元ネットワークを指すことができ、この有機成分は、少なくとも１つ、典型的には１より多くの炭素原子を含む。いくつかの実施態様において、この材料は結晶質である。いくつかの実施態様において、この材料はアモルファスである。いくつかの実施態様において、この材料は多孔質である。いくつかの実施態様において、この金属有機マトリックス材料は配位ポリマーであり、この配位ポリマーは配位錯体の反復単位を含み、この配位錯体は、金属系二次構造単位（ＳＢＵ）（例えば、金属イオン又は金属錯体）及び架橋多座配位（例えば、二座又は三座）有機配位子を含む。いくつかの実施態様において、この材料は１種より多種のＳＢＵ又は金属イオンを含む。いくつかの実施態様において、この材料は１種より多種の有機架橋配位子を含んでもよい。本明細書では、金属－有機骨格（ＭＯＦ）は、典型的には、金属成分が金属クラスター又は金属オキソクラスターである金属有機マトリックス材料を指し、一方、ナノスケール配位ポリマー（ＮＣＰ）は、金属成分が金属イオンである金属有機マトリックス材料を指すことができる。さらに、本明細書で使用されるＮＣＰは、典型的には金属有機マトリックス材料を指すが、いくつかの実施態様において、ＮＣＰは、炭素含有配位子を含まない配位ポリマーを指す。例えば、ＮＣＰはピロリン酸亜鉛を指すことができる。
「ナノスケール粒子」、「ナノ材料」、及び「ナノ粒子」は、約１，０００ｎｍ未満の寸法（例えば、長さ、幅、直径など）を有する少なくとも１つの領域を有する構造を指す。いくつかの実施形態において、この寸法は、より小さい（例えば、約５００ｎｍ未満、約２５０ｎｍ未満、約２００ｎｍ未満、約１５０ｎｍ未満、約１２５ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約８０ｎｍ未満、約７０ｎｍ未満、約６０ｎｍ未満、約５０ｎｍ未満、約４０ｎｍ未満、約３０ｎｍ、又は更には約２０ｎｍ未満）。いくつかの実施形態において、寸法は、約２０ｎｍ～約２５０ｎｍの間（例えば、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、又は２５０ｎｍ）である。
いくつかの実施形態において、ナノ粒子はおよそ球状である。ナノ粒子がおよそ球状である場合、特徴寸法は、球の直径に対応し得る。球状の形状に加えて、ナノ材料は、ディスク形状、プレート形状（例えば、六角形プレート様）、長方形、多面体、ロッド形状、立方、又は不規則な形状であってもよい。
ナノ粒子は、コア領域（すなわち、粒子の外部寸法間の空間）と、外部表面（すなわち、粒子の外部寸法を画定する表面）とを含むことができるいくつかの実施形態において、ナノ粒子は、ナノ粒子コアを囲むか、又は部分的に囲む、１つ以上のコーティング層を有し得る。したがって、例えば、球状ナノ粒子は、それぞれの連続する層が、粒子の中心により近いより小さい層の外部表面上に分散される、１つ以上の同心円状コーティング層を有し得る。
「埋め込まれた」とは、粒子のコアの表面の内部又は表面に（例えば、架橋配位子の配位部位又は金属イオンに）結合される、例えば、共有結合されるか、又は配位結合を介して結合される、薬剤を指し得る。あるいは、薬剤は、ＮＣＰ又はＭＯＦ粒子の金属-有機コア中の細孔、空洞、もしくはチャネルの内側に「捕捉（sequester）」、「捕捉（entrap）」、又は「捕捉（trap）」（すなわち、非共有結合的に被包）されても、水素結合、ロンドン分散力、もしくは任意の他の非共有結合的相互作用を介してＮＣＰ又はＭＯＦ材料と相互作用してもよい。
「ポリマー」及び「ポリマーの」という用語は、反復単位（すなわち、所与の化学構造の複数の複製）を有する化学構造を指す。ポリマーは、重合性モノマーから形成されることができる。重合性モノマーは、反応して、重合性モノマーの他の分子上の部分との結合（例えば、共有結合又は配位結合）を形成し得る１つ以上の部分を含む分子である。いくつかの実施形態において、各重合性モノマー分子は、２つ以上の他の分子／部分に結合し得る。場合によっては、重合性モノマーは、１つの他の分子のみに結合し、ポリマー材料の終端を形成するであろう。
ポリマーは、有機であっても、無機であっても、これらの組み合わせであってもよい。本明細書で使用される場合、「無機」という用語は、炭素、水素、窒素、酸素、硫黄、亜リン酸塩、又はハロゲン化物のうちの１つ以外の、少なくともいくつかの原子を含有する化合物もしくは組成物を指す。したがって、例えば、無機化合物もしくは組成物は、１つ以上のケイ素原子及び／又は１つ以上の金属原子を含有し得る。
本明細書で使用される場合、「有機ポリマー」は、それらの反復単位中にシリカ又は金属原子を含まないものである。例示的な有機ポリマーとしては、ポリビニルピロリドン（ＰＶＯ）、ポリエステル、ポリアミド、ポリエーテル、ポリジエンなどが挙げられる。いくつかの有機ポリマーは、それらが生物学的条件下で経時的に分解し得るように、エステル又はアミドなどの生分解性連結を含有する。
本明細書で使用される場合、「親水性ポリマー」という用語は一般に、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシ－プロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシルプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシ－エチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレン－イミン（ＰＥＩ）、ポリエチレングリコール（すなわち、ＰＥＧ）などであるが、これらに限定されない親水性有機ポリマー、又は別の親水性ポリ（アルキレンオキシド）、ポリグリセリン、及びアスパルトアミドを指す。「親水性」という用語は、分子又は化学種が水と相互作用する能力を指す。したがって、親水性ポリマーは、典型的には極性であるか、又は水に結合し得る基を有する。
「造影剤／イメージング剤」という用語は、試料の視覚化を助ける化学的部分を指す。例えば、造影剤は「コントラスト剤」であってもよく、検査される生物学的組織又は構造体のコントラストを増加させる部分（分子、高分子、配位複合体又はナノ粒子の全体の内の特定部分）を指すことができる。この造影剤は、例えば、磁気共鳴イメージング（MRI）、光学イメージング、陽電子放出断層撮影（PET）イメージング、単一光子放出コンピュータ断層撮影（SPECT）イメージング、又はそれらの組み合わせ（即ち、造影剤は多モードであってもよい。）を使用して検査される構造のコントラストを増加させることができる。
「MRI造影剤」という用語は、試料中の水プロトンの誘導緩和速度の変化をもたらす部分を指す。
「光学造影剤」又は「光学コントラスト剤」という用語は、光（例えば、紫外光、可視光又は赤外光）を吸収、反射又は放出する能力に基づいて検出することができるグループを指す。光学造影剤は、吸光度、反射率又は蛍光量の変化、又は吸光度ピークの数又はそれらの波長の最大値の変化に基づいて検出することができる。したがって、光学造影剤には、蛍光又はルミネセンスに基づいて検出されることができるものが含まれ、有機又は無機の染料が含まれる。
「フルオロフォア」及び「蛍光部分」という用語は、可視光又は非可視光（例えば、紫外光）によって励起されることができる種を指す。フルオロフォアの例には、量子ドット及びドープド量子ドット（例えば、半導体CdSe量子ドット又はMnドープCdSe量子ドット）、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体及び類似体、インドシアニングリーン、ローダミン、トリフェニルメチン類、ポリメチン類、シアニン類、ファロシアニン類、ナフトシアニン類、メロシアニン類、ランタニド錯体又はクリプタート、フラーレン、オキサチュラゾール、ラホヤブルー、ポルフィリン類及びポルフィリン類縁体並びに天然発色団/発蛍光団（例えば、クロロフィル）、カロテノイド、フラボノイド、ビリン、フィトクロム、フィコビリン、フィコエリトリン、フィコシアニン、レチノイン酸及び類似体（例えば、レチノイン及びレチネート）が含まれるが、これらに限定されない。
「光増感剤（PS）」という用語は、特定の波長の光（典型的には。可視光又は近赤外（NIR）光）によって励起され、活性酸素種（ROS）を生成することができる化学化合物又は部分を指す。例えば、光増感剤は、その励起状態において、系間交差を受けて、エネルギーを酸素（O2）に移転し（例えば、光線力学療法（PDT）によって治療される組織において）、一重項酸素（1O2）のような活性酸素種（ROS）を生成する。任意の既知の種類の光増感剤が、本明細書に開示される発明に従って使用されることができる。いくつかの実施態様において、この光増感剤は、ポルフィリン、クロロフィル、色素、又はそれらの誘導体もしくは類似体である。いくつかの実施態様において、ホフィリン、クロリン、バクテリオクロリン又はポルフィセンを使用することができる。いくつかの実施態様において、この光増感剤は、例えば有機架橋配位子のような別の分子又は部分に光増感剤を結合させるための、及び/又は光増感剤を提供するために、カルボン酸、アミン又はイソチオシアネートなどの１又はそれ以上の官能基を有することができる。この光増感剤は、例えば、光増感剤を有機架橋リガンドのような別の分子又は部分に結合する際に使用するために、及び／又は、配位を強化するため、又は追加の１又は複数の金属を配位させるための追加の１又は複数の部位を設けるために、カルボン酸、アミン又はイソチオシアネートなどの１又はそれ以上の官能基を有することができる。いくつかの実施態様において、この光増感剤は、ポルフィリン又はその誘導体又は類似体である。ポルフィリンの例としては、ヘマトポルフィリン、プロトポルフィリン及びテトラフェニルポルフィリン（TPP）が挙げられるが、これらに限定されない。ポルフィリン誘導体の例には、ピロフェオホルビド、バクテリオクロロフィル、クロロフィルa、ベンゾポルフィリン誘導体、テトラヒドロキフェニルクロリン、パープリン、ベンゾクロリン、ナフタロリン、ヴェルジン、ロージン、オキソクロリン、アザクロリン、バクテリオクロリン、トリパルフィリン及びベンゾバクテリオクロリンが挙げられるが、これらに限定されない。ポルフィリン類似体には、拡張ポルフィリンファミリーメンバー（例えば、テキサフィリン、サピルリン及びヘキサフィリン）、ポルフィリン異性体（ポルフィセン、逆ポルフィリン、フタロシアニン、ナフタロシアニンなど）、及び1又はそれ以上の官能基で置換されたテトラフェニルポルフィリン（TPP）が挙げられるが、これらに限定されない。
「ピロリピド」という用語は、脂質とポルフィリン、ポルフィリン誘導体又はポルフィリン類似体との結合体を指す。いくつかの実施態様において、このピロリピドは、ポルフィリン又はその誘導体又は類似体が脂質側鎖に共有結合している脂質結合体を含むことができる。ピロリピド及びピロリピドの合成方法は、例えば、米国特許出願公開第2014/0127763号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
「リゾ脂質」という用語は、１又はそれ以上のアシル基が除去された脂質を指す。
本明細書で使用される場合、「癌」という用語は、制御されない細胞分裂、及び／又は細胞が転移する能力もしくは追加の部位において新たな増殖を確立する能力によって引き起こされる疾患を指す。「悪性の」、「悪性度」、「腫瘍（neoplasm）」、「腫瘍（tumor）」、「癌」及びこれらの派生語は、癌性細胞又は癌性細胞のグループを指す。
癌の具体的な種類としては、皮膚癌（例えば、黒色腫）、結合組織癌（例えば、肉腫）、脂肪癌、乳癌、頭頸部癌、肺癌（例えば、中皮腫）、胃癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮癌、肛門生殖器癌（例えば、精巣癌）、腎臓癌、膀胱癌、結腸癌、前立腺癌、中枢神経系（ＣＮＳ）癌、網膜癌、血液、神経芽細胞腫、多発性骨髄腫、及びリンパ癌（例えば、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫）が挙げられるが、これらに限定されない。
「転移性癌」という用語は、患者の体内のその初期部位（すなわち、一次部位）から伝播している癌を指す。
「抗癌薬」、「化学療法剤」、及び「抗癌プロドラッグ」という用語は、癌を治療する（すなわち、癌細胞を死滅させるか、癌細胞の増殖を制止するか、もしくは癌に関連する症状を治療する）ことが既知であるか、又は癌を治療することができると考えられる薬物（すなわち、化学化合物）もしくはプロドラッグを指す。いくつかの実施形態において、本明細書で使用される場合、「化学療法剤」という用語は、癌を治療するのに使用される、かつ／又は細胞傷害能力を有する非ＰＳ分子を指す。そのようなより伝統的もしくは従来の化学療法剤は、活性の機構によって、又は化学化合物の分類によって記載することができ、それらには、アルキル化剤（例えば、メルファラン）、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン）、細胞骨格破壊剤（例えば、パクリタキセル）、エポチロン、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（例えば、ボリノスタット）、トポイソメラーゼＩ又はＩＩの阻害剤（例えば、イリノテカンもしくはエトポシド）、キナーゼ阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）、ヌクレオチド類似体又はそれらの前駆体（例えば、メトトレキサート）、ペプチド抗生剤（例えば、ブレオマイシン）、白金系薬剤（例えば、シスプラチン又はオキサリプラチン）、レチノイド（例えば、トレチノイン）、及びビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン）を挙げることができるが、これらに限定されない。
「シンチレーター」という用語は、Ｘ線などのイオン化放射線によって励起されたときに、ルミネセンスを呈する（例えば、可視又はＮＩＲ範囲内の光などを発光する）部分もしくは化合物を指す。
ＩＩ．一般的考察
ナノスケール配位ポリマー（NCP）は、自己集合した複合ナノ物質の新興クラスであり、その特性は、分子構築ブロックを変化させることによって調整可能である。NCPは、疾患を治療するための望ましい薬物送達プラットフォームを提供することができる。例えば、PCT国際公開WO2013/009701及びWO2015/069926を参照されたい。これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、ナノスケール配位ポリマー（NCP）は、腫瘍における漏出性血液血管系及び減少したリンパ排液を利用して、高い透過性及び保持（EPR）効果により、小分子薬物及び生物製剤の腫瘍部位への送達を促進するために使用することができる。ナノスケール配位ポリマー（NCP）は、粒子の金属－有機マトリックスコア材料の一部として薬物化合物又は類似体を組み込むことによって（例えば、マトリックス成分への共有結合又は配位によって、又は、追加的若しくは代替的に、薬物又は薬物類似体をマトリックス材料コア中の細孔に埋め込むことによって）、薬物送達を提供することができる。いくつかの実施態様において、この粒子は、この粒子のコアの全部又は一部を囲むコーティング層を含むことができ、このコーティング層に、治療剤（例えば、治療用小分子又は生物剤、例えば核酸又はタンパク質又は抗体）、光増感剤、標的化剤、不働態化剤、及び/又は検出/造影剤を組み込むことができる。
一つの観点では、本発明は、例えば、対応する親薬物の送達を促進し、親薬物を含むナノスケール配位ポリマー(NCP)併用療法を提供するために、NCP粒子脂質コーティング層に組み込むのに適したプロドラッグを提供するためのアプローチに基づく。このプロドラッグはまた、ポリマーミセル、リポソーム、デンドリマー、ポリマーベースのナノ粒子、シリカベースのナノ粒子、ナノスケールの金属－有機骨格(MOF)、及び無機ナノ粒子（例えば、金ナノ粒子、酸化鉄ナノ粒子など）のような、他のナノ粒子薬物送達プラットフォームへの組み込みに有用であり得る。
ＩＩＡ．プロドラッグ
例えば、いくつかの実施態様において、インビボで分解する結合を介して薬物化合物を脂質部分に結合させることによって、適切なプロドラッグを提供することができる。いくつかの実施態様において、この結合はジスルフィド結合である。したがって、いくつかの実施態様において、このプロドラッグは薬物－脂質結合体であり、この薬物－脂質結合体はジスルフィドを含むリンカー部分を含む。いくつかの実施態様において、この薬物化合物は、化学療法剤又は免疫療法のための小分子阻害剤である。いくつかの実施態様において、この薬物化合物は水酸基又はフェノール基を含み、この薬物化合物は水酸基又はフェノール基の酸素原子を含む結合を介してリンカーに共有結合することができる。あるいは、この薬物化合物は、プロドラッグを形成する一部としてリンカー基への結合部位として使用することができるチオール、1級若しくは2級のアミン、又はカルボン酸基を含むことができる。
いくつかの実施態様において、このプロドラッグは、リンカー（例えば、ジスルフィド含有リンカー）を介して、コレステロール（Chol）、オレイン酸（OA）、リゾ脂質、又はホスホコリンなどの脂質に結合されている、エトポシド（ET）、カンプトテシン（CPT）、ジヒドロアルテミシニン（DHA）、パクリタキセル（PTX）、OTSC41、OTS964、OTS167（Matsuo et al., Science Translational Medicine, 22 Oct 2014: 259ra145を参照）、ドキソルビシン、ドセタキセル、ビンクリスチン、ミトキサントロン（MTX）、アーテスネート（ART）、カペシタビン、及びNLG919（米国特許出願公開第2014/0066625号を参照されたい。この開示はその全体が参考として援用される）を含む（但し、これらに限定されない）群から選択される薬剤化合物を含む。このプロドラッグは、脂質コーティングのプロセス中に、プロドラッグ脂質成分（例えば、Chol又はOA）と脂質コーティング中のリン脂質との間の疎水性相互作用によって駆動されて、ナノスケール配位ポリマー(NCP)粒子に容易に積載することができる。このプロドラッグは、細胞内の還元環境下で活性な親薬物の細胞内放出により、対応する親薬物の抗腫瘍活性を保持する。
Figure 0007090034000006
 スキーム１：OTSC41, OTS964, 及びNLG919の構造
したがって、いくつかの実施態様において、本発明は、脂質結合治療薬親薬物を含むプロドラッグを提供する。いくつかの実施態様において、このプロドラッグは、（a）一価薬物部分、（b）一価脂質部分、及び（c）インビボで分解する結合を含む二価リンカー部分を含み、この二価リンカー部分は、例えば、ジスルフィド結合を含み、この一価薬物部分と一価脂質部分とはこのリンカー部分を介して結合（例えば、共有結合）する。この一価薬物部分及び一価脂質部分は、それぞれ薬物化合物及び脂質の一価誘導体であってもよい。この一価誘導体は、例えば、水酸基、チオール基、アミノ基、又はカルボン酸基を含む薬物化合物又は脂質の脱プロトン化誘導体であってもよい。
いくつかの実施態様において、この一価薬物部分は、化学療法剤及び/又は免疫療法のための小分子阻害剤の一価誘導体である。いくつかの実施態様において、この薬物は、免疫原性細胞死を引き起こすか又は免疫刺激性であることが知られている化学療法化合物である。このような化合物として、ET、PTX、OTS964、NLG919、OTS167、OTSC41、DHA、CPT、ドキソルビシン、ドセタキセル、ビンクリスチン、MTX、ART及びカペシタビンが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、この一価脂質部分は、コレステロール、オレイン酸、リゾ脂質又はホスホコリンの一価誘導体である。いくつかの実施態様において、この二価リンカー部分は、ジヒドロキシ置換ジスルフィドの誘導体であってもよい。このジヒドロキシ置換ジスルフィドの誘導体として、例えば、ビス（2-ヒドロキシエチル）ジスルフィド、ジヒドロキシジフェニルジスルフィド、ビス（2-ヒドロキシプロピル）ジスルフィド等が挙げられるが、これらに限定されない。このようなリンカーは、例えば、クロロホルメート基を提供するために、ホスゲン又はトリホスゲンとの反応によって活性化されて薬物又は脂質に結合することができる。
いくつかの実施態様において、この一価脂質部分はコレステロール誘導体であり、一価脂質部分及び二価リンカー部分は一緒になって以下の構造を有する：
Figure 0007090034000007
いくつかの実施態様において、この一価脂質部分はオレイン酸誘導体であり、一価脂質部分及び二価リンカー部分は一緒になって以下の構造を有する：
Figure 0007090034000008
いくつかの実施態様において、この一価脂質部分はリゾ脂質誘導体であり、一価脂質部分及び二価リンカー部分は一緒になって以下の構造を有する：
Figure 0007090034000009
 式中、Ｒは飽和又は不飽和のアシル基である。いくつかの実施態様において、ＲはC8～26（例えば、C8、C10、C12、C14、C16、C18、C20、C22、C24又はC26）の飽和又は不飽和アシル基である。いくつかの実施態様において、Ｒは、オレイル、ステアリル又はパルミトレイルから選択される。
いくつかの実施態様において、この一価脂質部分はホスホコリン誘導体であり、一価脂質部分及び二価リンカーは一緒になって以下の構造を有する：
Figure 0007090034000010
いくつかの実施態様において、一価薬物部分及び一価脂質部分は、それぞれ、ビス－（2-ヒドロキシエチル）ジスルフィドリンカー（又は2つの水酸基を含む別のリンカー）の水酸基に、カーボネート結合を介して、結合する。代替として、この薬物部分及び脂質部分の一方又は両方を、カルバメート、チオエステル、エステル、アミド、エーテル又はアミン結合を介してリンカーに結合させることができる。
Figure 0007090034000011
 スキーム２：例示的プロドラッグ結合
本発明のプロドラッグには、ジヒドロキシ置換ジスルフィドに基づくリンカーに加えて、生分解性結合を含む任意の他の適切なリンカーを使用することができる。上記のスキーム２は、本発明のプロドラッグに適した更なる例示的な生分解性リンカーを示す。これらのリンカーは、脂質及び/又は薬物部分とフェノールエステル（又はカーボネート又はカルバメート）を形成することができる一つ又は複数のフェノール基を含むリンカーに基づく。また、適切なリンカーには、脂質又は薬物部分と一緒にベンジルエステル（又はカーボネート又はカルバメート）を形成することができるリンカーが含まれる。したがって、いくつかの実施態様において、適切なリンカーは、フェノール又はベンジルアルコールから調製されることができる。更なる適切な生分解性リンカーには、ヒドラゾン、チアゾリジン、チオ置換スクシンイミド（例えば、マイケル付加によりチオールをマレイミドに付加して生成する）、他のジスルフィド（すなわち、ジヒドロキシ置換ジスルフィド以外のジスルフィド）、ジカルボン酸、3-（ヒドロキシフェニル）プロピオン酸などが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施態様において、本発明は、その治療を必要とする患者において疾患を治療する際に使用するための、本明細書に記載した脂質結合プロドラッグを含む組成物を提供する。いくつかの実施態様において、疾患を治療するための組成物は、更に、プロドラッグ（例えば、ナノ粒子コアの表面の少なくとも一部をコーティングする１又はそれ以上のコーティング層として存在する脂質コーティング層の成分として存在する）を含むナノ粒子を含む。いくつかの実施態様において、疾患を治療する際の組成物又は使用法は、更に、１又はそれ以上の追加の治療剤（例えば、１又はそれ以上の化学療法剤（又はその類似体もしくはプロドラッグ）、１又はそれ以上の免疫療法剤、１又はそれ以上の標的化剤、１又はそれ以上の造影剤、１又はそれ以上のシンチレータ、１又はそれ以上の光増感剤、又はそれらの任意の混合物を含む。
ＩＩＢ．光線力学療法及び/又は化学療法及び/又は免疫療法の組み合わせ
光線力学療法（PDT）は、３つの非毒性成分（光増感剤（PS）、光源、及び組織酸素）を組み合わせて、悪性細胞及び他の疾患細胞に対する毒性を引き起こす光線療法である。最も広く受け入れられている光線力学療法のメカニズムは、光で励起された光増感剤（PS）から組織中の酸素分子へエネルギーを移転して、細胞内毒性を誘発する反応性酸素種（ROS）、特に一重項酸素（1O2）を生成することを含む。光線力学療法（PDT）は、光増感剤（PS）の選択的取り込み及び/又は光への局所曝露を介して疾患組織の局在的破壊をもたらし、低侵襲癌治療を提供することができる。
化学療法を成功させるためには、化学療法剤を選択的に腫瘍へ送達することが好ましい。同様に、光増感剤（PS）を腫瘍に局在化することは、有効な光線力学療法にとって好ましい。しかし、多くの光増感剤（PS）はその性質上疎水性であり、腫瘍の局在化が不十分になるだけでなく、光増感剤（PS）凝集が光線力学療法の有効性を低下させる。したがって、これらの光増感剤（PS）をインビボでのより有効な光線力学療法剤にするために、顕著な合成改変が典型的に採用される。
代替の手法は、ナノキャリヤーを用いて、浸透及び保持効果（EPR）を増強することによって、場合によっては癌の過剰発現レセプターに結合する小分子又は生物学的配位子を用いて活性腫瘍を標的とすることによって、腫瘍に治療剤又は光線力学療法剤を選択的に送達することである。
ナノスケール配位ポリマー(NCP)から構築され、脂質又は他のコーティング層を含むようなナノスケール粒子は、治療剤及び光線力学療法剤のためのナノキャリアープラットフォームとして使用することができる。ナノスケール配位ポリマー(NCP)は、他のナノキャリアと比較して、単一の送達プラットフォームに多くの有益な特徴を組み合わせることができる。この特徴には、化学組成及び結晶構造が調整可能であること、高い気孔率、生分解性等が含まれる。
光線力学療法（PDT）は隣接する正常組織を維持しながら選択的に腫瘍細胞を殺すことができる。光線力学療法は、放射線療法又は化学療法との交差耐性を生じないので、伝統的な放射線療法及び/又は化学療法に有意に反応しなかった癌患者の治療に有用である。光線力学療法は、標的部位において、局所的な浮腫として強力な急性炎症反応を誘発することができる。光線力学療法によって誘発される炎症は、先天性免疫系によって調整された腫瘍抗原非特異的プロセスである。光線力学療法は、先天的免疫感知要素によって検出することができる治療部位において、損傷関連分子パターン（DAMP）などの豊富な警報/危険信号を迅速に生成している場合に、特に有効である。光線力学療法によって媒介される抗腫瘍免疫の増強は、死んだ又は死につつある腫瘍細胞による樹状細胞の刺激のためと考えられ、CD8+細胞傷害性T細胞（CTL）の動員及び活性化を伴う可能性があり、これに続いて免疫メモリー細胞が形成され、腫瘍増殖に対する抵抗が生じる。
したがって、いくつかの実施態様において、本発明は、光線力学療法（又はX線力学療法）を免疫療法と組み合わせる方法を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、治療を必要とする患者の疾患を治療する方法であって、患者にナノ粒子光増感剤又はシンチレータを投与する段階、患者の少なくとも一部に光及び/又はX線を照射する段階、及び患者に免疫療法剤を投与する段階を含む。いくつかの実施態様において、このナノ粒子光増感剤はナノスケール配位ポリマー(NCP)を含む。いくつかの実施態様において、このナノ粒子は、本発明の脂質結合プロドラッグを含む。
多くの無機、有機、及び複合材料が、近赤外光を強く吸収して一重項酸素を生成することが知られている。このような光線力学療法材料の治療的使用を、免疫チェックポイント阻害剤療法と組み合わせることができる。現在開示されている方法で使用される典型的な光増感剤として、クロリンe6又はMC540と組み合わせたNaYF4（例えば、Y:Yb:Er = 78%:20%:2%の比でドープされた）などのアップコンバージョンナノ粒子；2-デニル-2-（1-ヘキシルオキシエチル）ピロフェオフォルビド（HPPH）充填シリカナノ粒子などのシリカ系ナノ粒子に埋め込まれた光増感剤：DSPE-PEG5kポリマーミセルに積載されたZn（II）フタロシアニンのようなポリマーミセル積載光増感剤；リポソームに包摂された5,10,15,20-テトラキス（m-ヒドロキシフェニル）クロリンや5-アミノレブリン酸（ALA）をカプセル化されたリポソームなどのリポソームベースの光増感剤送達系；ヒト血清アルブミン（HSA）ベースの光増感剤送達系（例えば、HSA-フェオフォルビドa結合体粒子）；ローズベンガル及びPpIXが積載されたPEG結合ポリ（プロピレンイミン）又はポリ（アミドアミン）などのデンドリマーベースの光増感剤送達系；ポルフィリン－脂質結合体（ピロリピド）自己集合ナノ胞（ポルフィゾーム）のようなポルフィリン－、クロリン－、又はバクテリオクロリン－結合リン脂質ベースの二層送達系；ピロリピド（NCP＠ Pyrolipid）を含む脂質コーティング層を含むNCP粒子；及びピロリン酸亜鉛コアとピロリピド（Zn＠Pyrolipid）を含む脂質コーティング層とを含むナノ粒子、が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施態様において、疾患は癌である。この癌は、例えば、頭部腫瘍、頚部腫瘍、乳癌、婦人科腫瘍、脳腫瘍、結腸直腸癌、肺癌、中皮腫、軟部組織肉腫、皮膚癌、結合組織癌、脂肪癌、肺癌、胃癌、肛門癌、腎臓癌、膀胱癌、結腸癌、前立腺癌、中枢神経系癌、網膜癌、血液癌、神経芽細胞腫、多発性骨髄腫、リンパ性癌、及び膵臓癌から選択されるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、癌は転移性である。
任意の適切な免疫療法剤を使用することができる。この免疫療法剤は、例えば、プログラム細胞死タンパク質1（PD-1）、プログラム死リガンド1（PD-L1、CD274としても知られている）、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4（CTLA- 4）、インドアミン2,3-デオキシゲナーゼ（I）（IDO）、又はCCケモカイン受容体タイプ7（CCR7）の小分子阻害剤ある。小分子IDO阻害剤として、例えば、INCB24360及びNLG919が挙げられる。いくつかの実施態様において、この小分子阻害剤は、脂質結合プロドラッグとして提供されることができる。いくつかの実施態様において、この免疫療法剤は、抗体又は抗体断片であり得る。腫瘍のための免疫療法抗体には、抗CD51抗体（例えば、アレムツズマブ）、抗CD20抗体（例えば、オファツムマブ及びリツキシマブ）、抗CD47抗体、及び抗GD2抗体が含まれるが、これらに限定されない。免疫療法剤にはまた、例えば、ブレンツキシマブ ベドチン（Adcetris）、アド－トラスツズマブ エムタンシン（Kadcyla）、denileukin diftitox（Ontak）など、放射性標識抗体（例えば、イブリツモマブ・チウセタン（Zevalin）など）及び化学標識抗体（抗体－薬物結合体（ADC）としても知られる）等（但し、これらに限定されない）の結合モノクローナル抗体が含まれ得る。他の免疫療法剤には、インターフェロン（すなわち、IFN-α、INF-γ）、インターロイキン（すなわちIL-2、IL-12）、及び腫瘍ネクローシス因子α（TNF-α）など（但し、来られに限定されない）のサイトカインが含まれる。さらに適切な免疫療法剤としては、例えば、多糖-K、新抗原などが挙げられる。
したがって、いくつかの実施態様において、この免疫療法剤は、抗CD52抗体、抗CD20抗体、抗CD47抗体、抗GD2抗体、多糖類K及びサイトカインから成る群から選択される。いくつかの実施態様において、この免疫療法剤は、アレムツズマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、ゼヴァリン、アドセトリス、カドシルア及びオンタクから成る群から選択される。いくつかの実施態様において、この免疫療法剤は、PD-1阻害剤、PD-L1阻害剤、CTLA-4阻害剤、IDO阻害剤、CCR7阻害剤、OX40阻害剤、TIM3阻害剤、及びLAG3阻害剤から成る群から選択される。いくつかの実施態様において、この免疫療法剤は、小分子阻害剤免疫療法剤のプロドラッグ（例えば、脂質結合プロドラッグ）である。いくつかの実施態様において、このサイトカインは、インターフェロン及びインターロイキンから成る群から選択される。いくつかの実施態様において、このサイトカインは、IFN-α、IFN-γ、IL-2、IL-12及びTNF-αから成る群から選択される。
いくつかの実施態様において、本発明は、ナノ粒子光増感剤（PS）に基づく光線力学療法と複数のタイプの癌の治療のための免疫療法との組み合わせを提供する。
いくつかの実施態様において、この方法は、患者に（すなわち、光増感剤又はシンチレータ及び免疫療法剤に加えて）追加の治療を施す段階を含む。例えば、いくつかの実施態様において、この追加の治療は、癌の副作用のための癌治療又は処置（例えば、鎮痛薬）である。いくつかの実施態様において、この追加の治療又は追加の癌治療は、手術、放射線療法、化学療法、毒素療法、免疫療法、凍結療法及び遺伝子療法から選択されるが、これらに限定されない。この化学療法は、オキサリプラチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ミトキサントロン、パクリタキセル、ジギトキシン、ジゴキシン、ジヒドロアルテミシニン、及びセプタシジンから成る群から選択される薬物を投与する段階を含むことができる。いくつかの実施態様において、この化学療法は、ポリマーミセル配合物、リポソーム配合物、デンドリマー配合物、ポリマーベースのナノ粒子配合物、シリカベースのナノ粒子配合物、ナノスケール配位ポリマー(NCP)製剤、及び無機ナノ粒子配合物などの薬物配合剤で投与することができる。したがって、いくつかの実施態様において、本発明は、複数のタイプの癌の治療のための、ナノ粒子光増感剤（PS）に基づく光線力学療法、化学療法及び免疫療法の組み合わせを提供する。
いくつかの実施態様において、光を照射する段階は、可視光又は近赤外光を照射する段階を含むことができる。いくつかの実施態様において、この光は、約630nm～約1400nmの間の波長（例えば、約670nm）を有することができる。いくつかの実施態様において、この光は、約630nm～約740nmの間の波長（例えば、630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730又は約740nm）を有することができる。
本発明のいくつかの実施態様によれば、適応免疫応答（例えば、細胞傷害性T細胞）を用いて確立された腫瘍を全身拒絶させるために、光線力学療法を、阻害剤ベースの免疫療法及び/又は他の免疫療法と組み合わせることができる。免疫療法剤と併用すると、ナノ粒子（例えば、NCP粒子）に基づく光線力学療法効果を利用して、原発腫瘍の有効な根絶だけでなく、遠隔転移腫瘍又は腫瘍の抑制/根絶をも達成することができる。いくつかの実施態様において、免疫原性細胞死を引き起こすことが知られている化学療法剤を追加することによって、抗腫瘍効率を増強することができる。
多くの無機材料が、Ｘ線を強く吸収し、吸収したＸ線エネルギーを可視光及び近赤外光に変換することが知られている。これらＸ線シンチレーションナノ材料から放出された近赤外光は、近接する光増感剤により吸収され、Ｘ線誘導光線力学療法効果を可能にする。他のタイプの材料も、Ｘ線誘導光線力学療法を達成することができる。このＸ線誘発光線力学療法を免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせると、優れた放射免疫療法が得られる。Ｘ線シンチレーションナノ物質の例には、LnO3:Ln'ナノ粒子、LnO2SLn'ナノ粒子又はLnX3:Ln'ナノ粒子（式中、LnはY, La, Ce, Pr, Nd, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Luであり、Ln'はCe, Pr, Eu, Tb等であり、XはF, Cl, Br, 及びIである。）；M6(μ3-O)4(μ3-OH)4L6（式中、MはHf、Zr、又はCeであり、Lは9,10-アントラセニルビス安息香酸及び重金属二次構造単位を含むMOFの他の配合物である。）のようなX線シンチレータ金属－有機骨格(MOF)；ランタニドベースのMOF（SBUは、Ln4(μ4-OH2)(CO2)8(SO4)4、[Ln(OH2)(CO2)3]n（無限1-D鎖）、[Ln(OH2)(CO2)4]n（無限1-D鎖）、[Ln(CO2)3-Ln(OH2)2(CO2)3]n（無限1-D鎖）（式中、LnはLa、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu及び/又はこれらの組み合わせであり、架橋リガンドとしては、[2,5-ジメトキシ-1,4-ベンゼンジカルボキシレート]、[1,3,5-安息香酸トリカルボキシレート]、[1,3,5-ベンゼントリスベンゾエート]、[5-（ピリジン-2-イル）イソフタル酸]、[4,4'、4''-S-トリアジン-2,4,6-トリイルトリベンゾエート]、[ビフェニル-3,4'、5-トリカルボキシレート]、[4,4'-[（2,5-ジメトキシ-1,4-フェニレン）ジ-2,1-エテンジイル]ビス-安息香酸]などが挙げられるが、これらに限定されない。）；ZnS:M量子ドット（式中、MはCu、Co、Mn、Euなど）又はカーボンドットなどの量子ドット；金ナノ粒子、又は白金又は他の第３列の金属粒子；及びSrAl2O4:Eu2+、NaYF4:Tb3+、及びEr3+のような他のＸ線シンチレータ、が挙げられるが、これらに限定されない。
シンチレータを含むナノ粒子が使用される場合、医学的又は獣医学的設定でＸ線を送達するために現在使用されているような、任意の適切な方法で及び／又は任意の適切な装置を用いて、患者にＸ線を照射することができる。いくつかの実施態様において、このＸ線源及び／又は出力を改善して疾患治療を強化することができる。例えば、Ｘ線照射による患者のDNA損傷を最小限にし、シンチレータによるＸ線吸収を最大にするように選択されたピーク電圧、電流、及び／又はオプションとして、フィルタを使用して、Ｘ線を発生させることができる。
いくつかの実施態様において、本発明は、患者を１又はそれ以上の免疫療法剤、１又はそれ以上の化学療法剤、又は１又はそれ以上の免疫療法剤と１又はそれ以上の化学療法剤との組み合わせを用いて治療する段階と、患者に脂質結合プロドラッグの形態の少なくとも１つの薬剤を投与する段階とを組み合わせた方法を提供する。いくつかの実施態様において、この方法は、脂質結合プロドラッグを患者に投与する段階及び免疫療法剤を患者に投与する段階を含む。この免疫療法剤は、光線力学療法を含む併用療法に関して上記の免疫療法剤のうちの１つのような、任意の適切な免疫療法剤であってもよい。この脂質結合プロドラッグは、例えば、脂質結合プロドラッグが、ナノスケール配位ポリマー(NCP)粒子などのナノ粒子の脂質コーティング層中に存在するナノ粒子の形態で投与することができる。
いくつかの実施態様において、この方法は、プロドラッグ（例えば、ナノ粒子の一部として）、免疫療法剤、及び少なくとも１つのさらなる治療（例えば、癌治療（例えば、外科手術、放射線療法、化学療法、毒素療法、免疫療法、凍結療法及び遺伝子療法）が挙げられるが、これらに限定されない。）を施すことを含む。この化学療法は、オキサリプラチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ミトキサントロン、パクリタキセル、ジギトキシン、ジゴキシン、ジヒドロアルテミシニン、及びセプタシジンから成る群から選択される薬物を投与する段階を含むことができる。この化学療法は、光線力学療法(PDT)を含む併用療法に関して上記で述べた化学療法薬配合物の1つのような薬物配合物を投与する段階を含むことができる。
ＩＩＣ．脂質結合プロドラッグを含む粒子及び他の組成物
本発明の脂質に基づくプロドラッグは、任意の適切な追加の薬物送達プラットフォームと組み合わせることができる。いくつかの実施態様において、本発明は、ピロリン酸亜鉛（すなわち、Zn2+カチオン及びピロリン酸陰イオンを含む無機化合物）及び脂質結合プロドラッグ（例えば、ジスルフィド結合を含むリンカーを介して脂質部分に結合した薬物部分を含むプロドラッグ）を含む組成物を提供する。いくつかの実施態様において、このピロリン酸亜鉛は、ナノ粒子の形態で提供されることができる。いくつかの実施態様において、このピロリン酸亜鉛ナノ粒子は、脂質コーティング層で被覆され、この脂質コーティング層が脂質結合プロドラッグを含むことができる。
いくつかの実施態様において、本発明は、シスプラチン及び/又はオキサリプラチン類似体又はプロドラッグ（例えば、NCP中の架橋配位子として）及び脂質結合プロドラッグを含むナノスケール配位ポリマー（NCP）を含む組成物を提供する。このナノスケール配位ポリマー（NCP）は、ピロリン酸亜鉛と同様に、ナノ粒子の形態で提供することができる。いくつかの実施態様において、このNCP粒子は、プロドラッグを含む脂質コーティング層で被覆することができる。いくつかの実施態様において、この組成物は、更にsiRNA、miRNA又はAS ODNのような核酸治療剤を含むことができる。
いくつかの実施態様において、本発明は、治療薬を送達するためのナノスケール粒子を提供し、このナノスケール粒子は、金属－有機マトリックス材料を含むコアと、薬物－脂質結合体を含むプロドラッグとを含む。いくつかの実施態様において、このプロドラッグは、粒子コアの表面の全部又は一部を取り囲む脂質コーティング層中に存在することができる。いくつかの実施態様において、この薬物－脂質結合体は、一価薬物部分、一価脂質部分、及び生分解性結合（例えば、ジスルフィド結合）を含む二価リンカー部分を含む。この一価薬物部分は、例えば、抗癌剤及び/又は小分子免疫療法剤の一価誘導体であってもよい。いくつかの実施態様において、この一価薬物部分は、ET、PTX、OTS964、NLG919、OTS167、OTSC41、DHA、CPT、ドキソルビシン、ドセタキセル、ビンクリスチン、MTX、ART及びカペシタビンなどの（但し、これらに限定されない）薬物の一価誘導体であってもよい。いくつかの実施態様において、この脂質部分は、CHOL、OA、リゾ脂質、又はホスホコリンの一価誘導体である。いくつかの実施態様において、この二価リンカーは、ビス（2-ヒドロキシエチル）ジスルフィド又はこれと同様の化合物の二価誘導体である。
このナノ粒子は、任意の適切な金属－有機マトリックスを含むことができる。いくつかの実施態様において、この金属－有機マトリックスは、配位ポリマー（例えば、ナノスケール配位ポリマー(NCP)）を含む。
新生細胞は、宿主環境の背景内で増殖し、多くの物理的、化学的及び細胞的な課題に応答することができる。したがって、これらの細胞は、腫瘍－宿主相互作用を制御するために複数の戦略を開発する。新生物が増殖して広がるためには、周囲の組織に侵入して転移し、宿主の免疫応答を回避するために、細胞外マトリックス（ECM）を破壊するのに十分な酸素及び栄養素を得る必要がある。癌治療のために、血管形成、浸潤/転移、及び免疫回避に関与する分子を標的化するためにRNA干渉（RNAi）技術を使用することができる。この標的遺伝子には、（1）成長因子（例えば、VEGF、EGF、FGF、PDGF、IL-8、及びIGF-1）；（2）プロテアーゼ及びプロテアーゼ阻害剤（例えば、カテプシン、MMP2、ストロメリシン及びuPA）；（3）癌遺伝子（例えば、c-myc、ras、c-src、v-raf、c-jun及びVEGFR）；（4）シグナル伝達（例えば、チミジン及びホスホリラーゼ）；（5）酵素（例えば、RAS-ファルネシル、トランスフェラーゼ、ゲラニル、及びトランスフェラーゼ）；（6）サイトカイン（例えば、IL-1、IL-6、及びIL-8）；（7）内因性刺激物質（例えば、Ang-1、アンギオスタチンII、エンドセリン、iNOS、PAF、及びCox-2）が含まれる。
癌細胞による抗アポトーシスタンパク質の発現は、癌細胞が化学療法又は放射線照射に対して耐性を発揮する１つのメカニズムである。化学療法、光線力学療法及び放射線療法と併用して、抗アポトーシスタンパク質を標的とするRNAiを用いることは癌治療のための有望な戦略である。化学抵抗性又は放射線耐性に寄与するいくつかの追加的メカニズムもあり、これらのメカニズムに関連する分子はRNAi介入の機会を提供することができる。例えば、多剤耐性（MDR）遺伝子（例えば、ABCB1、ABCB4、及びABCB5）を標的とするRNAiは、MDR遺伝子媒介性薬物耐性の治療のためのアプローチであり得る。DNA修復メカニズムはゲノムの安定性維持にとって重要であり、したがって癌の治療標的の可能性がある。癌細胞は、化学療法又は放射線療法によるストレスを受けた際に、治療によって引き起こされたDNA損傷を回復するために、DNA修復に関連するタンパク質を過剰発現することができる。これらの標的遺伝子として、切除修復補体1（ERCC1）、X線修復交差補完タンパク質1（XRCC1）、リボヌクレオチドレダクターゼ、二本鎖切断シグナル/修復タンパク質ATM、及びDNA依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニットが挙げられる。
マイクロRNA（miRNA）は、mRNAの翻訳及び安定性を転写後制御する、小非コードRNAの一群である。miRNAは、増殖、分化、及び細胞死を含む様々な生物学的プロセスの適切なバランスを維持する責任がある。癌において、腫瘍抑制性miRNAの喪失は、標的癌遺伝子の発現を促進するが、発癌性miRNAの発現の増加は、標的腫瘍抑制遺伝子を抑制することができる。癌関連miRNAは、発癌性遺伝子（miR-155、miR-21、miR-17～29など）、腫瘍抑制性遺伝子（miR-15、miR-16、LIN28、DICERなど）、及び環境依存性遺伝子 （miR-146及びmiR-29などの）に分類されてきた。腫瘍抑制性miRNAの送達及び発癌性miRNAのサイレンシングは、様々なマウスモデルにおいて成功している。
miRNAは、癌においてしばしば混乱されるシグナル伝達経路を標的とする能力を持っているので、miRNAもまた耐性細胞を検知する可能性がある。多剤耐性（MDR）は、通常、ATP結合カセット（ABC）トランスポーターを介した薬剤の排泄増加を伴う。これらのABCトランスポーターのうちの2つ（ABCC3及びABCC6）は、SOX2によって直接誘導される。miR-9はSOX2の負の調節因子として同定されている。化学療法抵抗性神経膠腫幹細胞株におけるmiR-9の強制発現は、SOX2発現を抑制し、ABCトランスポーター発現の低下をもたらし、したがって薬物保持をもたらす。
オリゴヌクレオチドは、未修飾又は化学的に修飾された一本鎖DNA分子である。一般に、それらは比較的短く（13～25ヌクレオチド）、細胞中に存在する標的の全プール中の特有の配列にハイブリダイズする。アンチセンスオリゴヌクレオチド（AS ODN）は、mRNA翻訳を阻害することができることが知られている一本鎖DNAフラグメントである。抗腫瘍AS ODNは、Bcl-2、Survivin、MDM2、Bcl-XL、RelA、RAS、RAF、BCR-ABL、JNK1,2、TERT、c-myc、及びc-mybなどのアポトーシスシグナルの存在下で、細胞分裂、血管新生、転移及び細胞生存に関与する遺伝子を標的とする。大部分の癌細胞は、遺伝子発現プロファイルが正常細胞とは異なるので、AS ODNを用いて、正常細胞に対する影響を最小限に抑えて、腫瘍増殖を特異的に抑制することができる。例えば、Genta Inc. (Berkeley Heights, New Jersey, USA)は、GenasenseTMとして知られているBcl-2に相補的な18-merホスホチオエートAS ODNを開発した。さらに、MDM2を標的とするAS ODNは、いくつかの化学療法剤による増殖阻害、p53活性化及びp21誘導の効果を増強することが示されている。
したがって、いくつかの実施態様において、本発明のナノ粒子は、更に、少なくとも1つの核酸治療薬（例えば、核酸化学療法薬）を含むことができる。この核酸化学療法剤は、小干渉性リボ核酸（siRNA）、miRNA、又はAS ODNであり得る。この核酸化学療法剤は、静的相互作用を介して脂質分子に共有結合及び/又は付加することができ、この脂質分子は、ナノ粒子コアの表面の全部又は一部を取り囲む脂質コーティング層の一部を形成することができる。これに加えて又はこれに代えて、少なくとも1つの核酸を、核酸上のリン酸基とコアの外表面上の金属イオンとの間の配位結合を介して、金属－有機マトリックス材料のコアに結合させることができる。いくつかの実施態様において、siRNA、miRNA及びAS ODNのような核酸は、ナノスケール配位ポリマー(NCP)の外表面上の金属イオンと核酸上のリン酸基との間の配位結合を介して、NCPの表面に直接的に積載されることができる。
このナノ粒子は、例えば、単一のsiRNA又はプールされたsiRNA（異なる抗癌経路を標的とするいくつかのsiRNAを含む）を含むことができる。このようなsiRNAには、EGFR/ErbB1 siRNA、ErbB2/HER2/Neu siRNA、IGF-1R siRNA、K-ras siRNA、R-ras siRNA、BRAF siRNA、ABL siRNA、c-Src siRNA、Met siRNA、c-Myc siRNA、N-Myc siRNA、サイクリン-D1 siRNA、PI3K siRNA、AKT siRNA、NF-κβsiRNA、EWS/FLI-1 siRNA、HIF siRNA、HPV E7 siRNA、E2F4 siRNA、HPV E6 siRNA、Hdmx siRNA、Notch-1 siRNA、デルタ様1 siRNA、FLIP siRNA、BCL-2 siRNA、BCL-XL siRNA、サバイビンsiRNA、XIAP siRNA、テロメラーゼsiRNA、ID1 siRNA、Cks-1 siRNA、Skp-2 siRNA、カテプシンL siRNA、VEGF siRNA、EGF siRNA、FGF siRNA、PDGF siRNA、IL-8 siRNA、IGF-1 siRNA、カテプシンsiRNA、MMP2 siRNA、ストロメライシンsiRNA、uPA siRNA、c-myc siRNA、ras siRNA、c-src siRNA、v-raf siRNA、c-jun siRNA、VEGFR siRNA、チミジンsiRNA、ホスホリラーゼsiRNA、RAS-ファルネシルsiRNA、トランスフェラーゼsiRNA、ゲラニルsiRNA、トランスフェラーゼsiRNA、IL-1 siRNA、IL-6 siRNA、IL-8 siRNA、Ang-1 siRNA、アンギオスタチンII siRNA、エンドセリンsiRNA、iNOS siRNA、PAF siRNA、Cox-2 siRNA、ABCB1 siRNA、ABCB4 siRNA、ABCB5 siRNA、P糖タンパク質siRNA、ERCC1 siRNA、及びATM siRNAが含まれるが、これらに限定されない。このmiRNAには、miR-9、miR-15、miR-16、miR-34、miR-181、miR-200、miR 200c、miR-342、miR-630、let -7、LIN28、及びDICERが含まれるが、これらに限定されない。この粒子はまた、１又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチド（AS ODN）を含むことができる。使用されるAS ODNの遺伝子標的には、Bcl-2、Survivin、MDM2、Bcl-XL、RelA、RAS、RAF、BCR-ABL、JNK1,2、TERT、c-myc 、及びc-mybが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、この核酸は、免疫療法標的を抑制するために使用されることができる。したがって、いくつかの実施態様において、この核酸は、例えば、PD-1/PD-L1を標的とするsiRNA、IDOを標的とするsiRNA、又はCCR7を標的とするsiRNAであってもよい。いくつかの実施態様において、1つの核酸が使用される。他の実施態様では、2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10又はそれ以上の異なる核酸の組み合わせが使用される。いくつかの実施態様において、このナノ粒子は、サバイビンsiRNA、ERCC-1 siRNA、P-糖タンパク質siRNA（P-gp siRNA）、Bcl-2 siRNA、Bcl-2 siRNA又はこれらの混合から成る群から選択される少なくとも1つの核酸薬剤を含むことができる。
いくつかの実施態様において、このナノ粒子は、更に、少なくとも１つの光増感剤（PS）を含むことができる。いくつかの実施態様において、この光増感剤（PS）は、ナノ粒子のコア（例えば、細孔又は中空内部空洞）に埋め込まれ又は隔離され、又はナノスケール配位ポリマー(NCP)マトリックス内の有機部分に共有結合される。いくつかの実施態様において、この光増感剤（PS）は、ナノ粒子コアの外表面の一部を取り囲む単一又は複数の脂質コーティング層（すなわち、単一の脂質層、脂質二重層、又はそれらの組み合わせ）に共有結合又は非共有結合する。ポルフィリン、クロロフィル染料、又はそれらの誘導体もしくは類似体など（但し、これらに限定されない）の任意の適切な光増感剤（PS）を使用することができる。いくつかの実施態様において、この単一又は複数のコーティング層は、ピロリピド（すなわちポルフィリン又はその誘導体又は類似体に共有結合した脂質）を含む脂質単一層又は脂質二重層を含む。
いくつかの実施態様において、このナノ粒子は、更に、金属－有機マトリックス材料コアに組み込まれた少なくとも１つの非核酸化学療法剤を含むことができる。例えば、この少なくとも１つの非核酸化学療法剤は、共有結合又は配位結合を介して金属－有機マトリックス材料コアに組み込むことができる。代替として、この薬剤を、コア内の細孔又は中空空洞に埋め込む又は隔離することができる。任意の適切な非核酸化学療法剤を使用することができる。いくつかの実施態様において、この非核酸化学療法剤は、シスプラチン又はオキサリプラチンのプロドラッグ、ゲムシタビン、メトトレキセート、ロイコボリン、ペメトレキセド二ナトリウム、ドキソルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、シタラビン、アザチオプリン、メルファラン、イマチニブ、アナストロゾール、レトロゾール、カルボプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド、及びビノレルビンから成る群から選択されるが、これらに限定されない。この粒子は、金属－有機マトリックスのコアに組み込まれた単一の非核酸化学療法剤を含むことができ、又は金属－有機マトリックス材料のコアに組み込まれた2, 3, 4, 5, 6又はそれ以上の非核酸化学療法剤の組み合わせを含むことができる。したがって、本発明は、いくつかの実施態様において、複数のタイプの癌の治療のために、ナノ粒子に基づく複数の化学療法の組み合わせを提供することができ、又は複数のタイプの癌の治療のために、ナノ粒子に基づく化学療法と免疫療法との組み合わせを提供することができる。
いくつかの実施態様において、この非核酸化学療法剤は、オキサリプラチン又はシスプラチンの類似体又はプロドラッグである。例えば、適切なシスプラチン類似体又はプロドラッグは、2個のNH3白金配位子及び2個のクロロ配位子（すなわち、シスプラチンに典型的に存在する4個のPt配位子）及び少なくとも1個又は2個の追加の配位子（例えば、全部で5又は6個のPt配位子を含む）を含み、この少なくとも1個の追加のPt配位子又は複数の配位子は、金属イオンに配位することのできる少なくとも2個の置換基を含む。したがって、この白金配位錯体の少なくとも1個の金属配位子は、この白金配位錯体の白金イオンと第2の配位錯体（例えば、別のPt配位錯体）の金属イオンの両方に配位することができる。このような配位子は、2又はそれ以上の、アミノ基、水酸基及び/又はカルボキシレート基、又はこれらの基の組み合わせを含むことができる。いくつかの実施態様において、この非核酸化学療法剤は、シス、シス、トランス－Pt(NH3)2Cl2(OEt)(O2CCH2CH2COOH)である。
いくつかの実施態様において、このナノ粒子コアは、約10重量％～約50重量％の非核酸化学療法剤（例えば、約10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45又は約50重量％の非核酸化学療法剤）を含むことができる。
いくつかの実施態様において、このナノスケール粒子は、約500nm未満又は約250nm未満の平均直径を有する。いくつかの実施態様において、この粒子は、約20nm～約200nmの平均直径を有する。いくつかの実施態様において、このナノスケール粒子は、約20nm～約140nm (例えば、約20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 及び約140 nm)の平均直径を有する。
いくつかの実施態様において、このナノスケール粒子は、更に、金属－有機マトリックス材料コアの外表面の少なくとも一部を覆う１又はそれ以上のコーティング剤又はコーティング層を含み、この１又はそれ以上のコーティング剤又はコーティング層は、金属酸化物、ポリマー、単一の脂質層、脂質二重層、及びそれらの組み合わせから選択される。したがって、例えば、球状ナノ粒子は、１又はそれ以上の同心コーティング層を有することができ、各連続層は、それぞれ粒子の中心により近くより小さい層の外表面上に配置される。いくつかの実施態様において、この金属－有機マトリックス材料コアは、カチオン性脂質及び/又は官能化脂質を含む脂質二重層で被覆され、この官能化脂質は、核酸に結合することができる置換基で官能化された脂質であり、少なくとも1つの核酸は、この官能化脂質に共有結合するか、及び/又は静電的相互作用を介してこのカチオン性脂質に結合する。いくつかの実施態様において、この脂質二重層は、チオール－又はジチオール－官能化1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DSPE）、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン（ DOTAP）、及び1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DOPC）の１又はそれ以上を含む混合物を含む。いくつかの実施態様において、この脂質二重層又は脂質単一層は、コレステロール、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン（DSPE）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DSPC）、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウムプロパン（DOTAP）、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DOPC）、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-リン酸ナトリウム塩（DOPA）、及びペグ化-DSPEの１又はそれ以上を含む混合物を含む、又は更に含むことができる。いくつかの実施態様において、この脂質二重層は、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-リン酸ナトリウム塩（DOPA）、コレステロール、及びペグ化-DSPEの１又はそれ以上を含む混合物を含む、又は更に含むことができる。いくつかの実施態様において、この１又はそれ以上のコーティング剤又はコーティング層は、更に、親水性ポリマー（例えば、PEG）などの（但し、これらに限定されない）不動態化剤；RGDペプチド、アプタマー、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、抗体又は抗体フラグメント、又は多糖類などの（但し、これらに限定されない）標的化剤；及び/又は光学造影剤（例えば、蛍光部分）などの（但し、これらに限定されない）造影剤を含む。
いくつかの実施態様において、この金属－有機マトリックス材料コアは、多価金属イオン及びビスホスホネートを含む金属ビスホスホネート配位ポリマーを含む。この多価金属イオンは、任意の好適な多価金属イオンであってもよい。いくつかの実施態様において、この多価金属イオンは、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、及びこれらの組み合わせなどの（但し、これらに限定されない）二価金属イオンである。いくつかの実施態様において、この多価金属イオンはZn2+である。
いくつかの実施態様において、このビスホスホネートは、それ自体が、2つの金属配位子がホスホネート含有基であり、このホスホネート基が多価金属イオンに配位可能である、金属錯体である。このビスホスホネート金属錯体は、他の配位子（すなわち、ホスホネート基を含まない配位子）を含むことができ、この配位子は一価及び二価の金属配位子を含むことができ、この一価及び二価の金属配位子として、ハロゲン原子（例えば、Cl、Br、F、又はI）、NH3、アルキルアミノ、ヒドロキシル、アルコキシ、ジオール及びジアミン（例えば、ジアミノシクロヘキサン）が挙げられるが、これらに限定されない。このビスホスホネートは、2つのヒドロキシル配位子を有する金属錯体のような適切な金属錯体を提供する段階、及びこの金属錯体を、例えば、ジエトキシホスフィニルイソシアネート、ジエトキシホスフィニルイソチオシアネート、ジエトキシホスフィニル含有カルボン酸無水物、又はジエトキシホスフィニル含有塩化アシルと接触させる段階によって製造されることができ、さらなる配位結合に利用可能なホスホネート基を提供することができるような金属配位子を形成する。いくつかの実施態様において、このビスホスホネートは、白金金属錯体（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン又は類似の錯体）であり、2つの白金配位子が、白金に配位することに関与しないホスホン酸含有基で置換され又はこれに結合している。いくつかの実施態様において、この金属ビスホスホネート配位ポリマー粒子は、ジヒドロアルテミシニン（DHA）のプロドラッグを含む脂質コーティング層を含むことができる。
したがって、例えば、いくつかの実施形態において、このビスホスホネートは、シス、シス－トランス－[Pt(dach)Cl2(OH)2]のビスホスホネートエステルなどの（但し、これに限定されない）化学療法プロドラッグ、任意に、シスプラチン又はオキサリプラチンプロドラッグである。ビスホスホネートエステルを提供するために、この2つのヒドロキシル配位子を、式-O(C=X)-R'-P(=O)(OR)2（式中、各Rは、独立して、水素原子、アルキル、置換アルキル、アラルキル、置換アラルキル、アリール、置換アリール及び負電荷であり、R 'は、-NH-又はアルキレン部分などの二価部分であり、XはO又はSである。）で置き換えることができる。いくつかの実施形態において、このビスホスホネートは、化学式PtLx-2[-O-C(=O)-NH-P(=O)(OR)2]2（式中、xは3以上の整数（例えば、3, 4, 5又は6）である。）で表される。
いくつかの実施態様において、この金属－有機マトリックス材料コアは、約40～約50重量％のビスホスホネート（例えば、約40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49又は50重量％のビスホスホネート）を含む。いくつかの実施態様において、この粒子は、１又はそれ以上のコーティング層をさらに含むことができる。いくつかの実施態様において、この１又はそれ以上のコーティング層は、脂質単一層又は脂質二重層コーティングを含む。いくつかの実施態様において、サービビンsiRNA、P-gp siRNA、及びBcl-2 siRNAのうちの１又はそれ以上などの１又はそれ以上の核酸治療剤がこのコーティングに結合する。
いくつかの実施態様において、このナノスケール粒子は、約20nm～約180nmの直径を有する。いくつかの実施態様において、このナノスケール粒子は、約90nm～約180nm（例えば、約90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 又は約180nm）の直径を有する。
いくつかの実施態様において、本明細書中に開示される組成物は、単独で、又は１又はそれ以上の更なる治療剤、例えば、１又は複数の化学療法剤（又はその類似体又はプロドラッグ）、１又は複数の化学療法剤１又はそれ以上の標的剤、１又はそれ以上の造影剤、１又はそれ以上のシンチレータ、１又はそれ以上の光増感剤、又はそれらの任意の混合物と組み合わせて使用するために提供される。
ＩＩＤ．ナノ粒子を用いて癌を治療する方法
いくつかの実施態様において、本発明は、本明細書に記載のナノスケール粒子を含む組成物を患者に投与する段階を含む、治療を必要とする患者の癌を治療する方法を提供する。いくつかの実施態様において、この癌を治療する方法は、金属－有機マトリックス材料を含むコアと、薬物－脂質結合体を含むプロドラッグとを含むナノスケール粒子を含む組成物を患者に投与する段階を含む。
この癌は、皮膚癌（例えば、黒色腫）、結合組織癌（例えば、肉腫）、脂肪癌、乳癌、頭頸部癌、肺癌（例えば、中皮腫）、胃癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮癌、肛門癌（例えば、精巣癌）、腎臓癌、膀胱癌、結腸癌、前立腺癌、前立腺癌、中枢神経系（CNS）癌、網膜癌、血液癌、神経芽腫、多発性骨髄腫、又はリンパ系癌（例えば、ホジキン又は非ホジキンリンパ腫）などの（但し、これらに限定されない）治療が必要な如何なる癌であってもよい。いくつかの実施態様において、この癌は、肺癌、膵臓癌、卵巣癌、乳癌又は結腸癌である。いくつかの実施態様において、この癌は、転移性癌及び/又は化学療法耐性癌及び/又は放射線耐性癌である。いくつかの実施態様において、この癌は卵巣癌である。いくつかの実施態様において、この卵巣癌はシスプラチン耐性癌である。
いくつかの実施態様において、この方法は、更に、患者に免疫療法剤を投与する段階を含む。いくつかの実施態様において、この免疫療法剤は、抗体、小分子阻害剤、小分子阻害剤プロドラッグ、サイトカイン、及び多糖Kから選択される。例えば、いくつかの実施態様において、この免疫療法剤は、抗CD52抗体、抗CD20抗体、抗CD47抗体、抗GD2抗体、サイトカイン、及び多糖類Kから成る群から選択されるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、この免疫療法剤は、アレムツズマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、ゼヴァリン、アドセトリス、カデシル及びオンタクから成る群から選択されるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、この免疫療法剤は、PD-1阻害剤、PD-L1阻害剤、CTLA-4阻害剤、IDO阻害剤、CCR7阻害剤、OX40阻害剤、TIM3阻害剤、及びLAG3阻害剤阻害剤から成る群から選択されるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、複数（例えば、2, 3, 4, 5, 6又はそれ以上）の免疫療法剤を投与することができる。
いくつかの実施態様において、このナノスケール粒子は、更に光増感剤（PS）を含む。このナノスケール粒子は、任意の適切な光増感剤（PS）を含むことができる。いくつかの実施態様において、この光増感剤（PS）は、ピロリピドであり、このピロリピドはポルフィリン又はその誘導体又は類似体に共有結合した脂質である。
ナノ粒子が光増感剤（PS）を含む場合、この癌を治療する方法は、更に、光増感剤を活性化するのに適した波長を有する放射線（例えば、可視光又は近赤外光）で患者又は患者の治療領域を照射する段階を含むことができる。例えば、このナノ粒子がピロリピドを含む場合、この方法は、約630nm～約740nm（例えば、630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730,又は約740 nm）の波長の光を患者に照射する段階を含むことができる、
この光増感剤（PS）含有ナノ粒子は、上記の癌のうちの1つのような、任意の癌を治療するために使用することができる。いくつかの実施態様において、この癌は頭頸部癌、任意にシスプラチン耐性頭頸部癌である。
いくつかの実施態様において、この化学療法及び光線力学療法は、更に、免疫療法と組み合わせることができ、光増感剤（PS）含有ナノ粒子に加えて、又はその一部として、患者に免疫療法剤を投与することができる。いくつかの実施態様において、この免疫療法剤は、抗CD52抗体、抗CD20抗体、抗CD20抗体、抗CD47抗体、抗GD2抗体、多糖類Kサイトカインから成る群から選択されるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、この免疫療法剤は、放射性標識抗体、抗体－薬物結合体、及び新抗原から選択される。いくつかの実施態様において、この免疫療法剤は、アレムツズマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、ゼヴァリン、アドセトリス、カドシルア及びオンタクから成る群から選択される。いくつかの実施態様において、この免疫療法剤は、PD-1阻害剤、PD-L1阻害剤、CTLA-4阻害剤、IDO阻害剤、CCR7阻害剤、OX40阻害剤、TIM3阻害剤、及びLAG3阻害剤などの（但し、これらに限定されない）小分子阻害剤である。
いくつかの実施態様において、本発明は、本明細書に記載のナノスケール粒子（例えば、配位ポリマーを含む金属有機マトリックス材料と脂質－薬物結合体を含むプロドラッグとを含み、任意に更に光増感剤（PS）及び/又は免疫療法剤を含むナノスケール粒子）と薬学的に許容される担体とを含む医薬配合物を提供する。この薬学的に許容される担体は、ヒトに対して薬学的に許容可能であってもよい。
したがって、本発明は、複数の化学療法剤を、単独で、又は１又はそれ以上の免疫療法剤と組み合わせて含むことができるナノ粒子を提供する。本発明はまた、単独の、又は１又はそれ以上の免疫療法剤及び/又は１又はそれ以上の化学療法剤と組み合わせる、光線力学療法に使用するための光増感剤（PS）を含むナノ粒子を提供する。これらナノ粒子に基づく治療法は、複数のタイプの癌を治療し、複数の経路を標的とすることにより癌をより効果的に治療するために使用することができる。
ＩＩＩ．配合物
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、薬学的に許容される担体を含む組成物を含む。任意の好適な医薬製剤を使用して、患者に投与するための組成物を調製することができる。いくつかの実施形態において、組成物及び／又は担体は、ヒトにおいて薬学的に許容される。
例えば、好適な配合物としては、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、殺菌性抗生物質、及び患者の体液によって配合物を等張にする溶質を含有し得る水溶性又は非水溶性無菌注射溶液、ならびに懸濁剤及び増粘剤を含み得る水溶性又は非水溶性無菌懸濁液を挙げることができる。配合物は、単位用量又は複数用量容器（例えば、密封アンプル及びバイアル）中に存在し得、使用直前に無菌液体担体（例えば、注射用水）の添加のみを必要とする、凍結又はフリーズドライ（凍結乾燥）条件で貯蔵され得る。いくつかの例示的な成分は、一例において０．１～１０ｍｇ／ｍｌ、別の例において約２．０ｍｇ／ｍｌの範囲内のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、及び／又は例えば１０～１００ｍｇ／ｍｌ、別の例において約３０ｍｇ／ｍｌの範囲内のマンニトールもしくは別の糖、及び／又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。
具体的に上述される成分に加えて、本発明の配合物は、当該配合物の種類に関して当該技術分野において慣習的である他の薬剤を含み得ることを理解されたい。例えば、無菌無発熱物質水溶液及び非水溶液が使用されてもよい。
ＩＶ．患者
本明細書に開示される方法及び組成物は、インビトロ（例えば、単離された細胞もしくは組織上）又は患者においてインビボ（すなわち、患者などの生きた生物）のいずれかで、試料上で使用することができる。いくつかの実施形態において、本発明の原理は、本発明が、「患者」及び「対象」という用語に含まれる、全ての脊椎動物種（哺乳動物を含む）に関して有効であることを示すことが理解されるものの、患者又は対象は、ヒト患者である。更に、哺乳動物は、本明細書に開示される組成物及び方法を用いることが望ましい、任意の哺乳動物種、特に農業及び家畜哺乳動物種を含むことが理解される。
したがって、本発明の方法は、温血脊椎動物種において特に有用である。したがって、本発明は、哺乳動物及び鳥類に関する。より具体的には、ヒトなどの哺乳動物、ならびにヒトにとって、絶滅の危機に瀕しているために重要である（シベリアトラなど）、経済的に重要である（ヒトによる消費のために農場で飼育される動物）、及び／又は社会的に重要である（ペットとして、もしくは動物園で飼育される動物）哺乳動物、例えば、ヒト以外の肉食動物（ネコ及びイヌなど）、ブタ類（ブタ、オスブタ、及びイノシシ）、反芻動物（ウシ、オスウシ、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソン、及びラクダなど）、ならびにウマのための方法及び組成物が提供される。絶滅の危機に瀕している、動物園でもしくはペットとして飼育される（例えば、オウム）種類の鳥類、ならびに家禽、及びより具体的には家畜家禽（例えば、シチメンチョウ、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ホロホロチョウなどの家禽類であるが、これは、それらもまた、ヒトにとって経済的に重要であるためである）の治療を含む、鳥類の治療もまた、提供される。したがって、家畜ブタ類（ブタ及びオスブタ）、反芻動物、ウマ、家禽類などを含むが、これらに限定されない家畜の治療もまた、提供される。
Ｖ．投与
本発明の組成物の投与のための好適な方法としては、静脈内及び腫瘍内注射、経口投与、皮下投与、腹腔内注射、頭蓋内注射、ならびに直腸投与が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、組成物は、任意の他の様式で、例えば、肺経路内に組成物を噴霧することによって、治療を必要とする部位に堆積され得る。本発明の組成物を投与する具体的な様式は、治療される細胞の分布及び存在量、ならびに組成物のその投与部位からの代謝又は除去の機構を含む様々な要因に依存する。例えば、比較的表在性の腫瘍は、腫瘍内注射され得る。対照的に、内部腫瘍は、静脈内注射に従って治療され得る。
一実施形態において、投与方法は、領域化された送達又は治療される部位での集積の特徴を網羅する。いくつかの実施形態において、組成物は、腫瘍内に送達される。いくつかの実施形態において、標的への組成物の選択的送達は、組成物の静脈内注射、その後、標的の光線力学治療（光照射）によって達成される。
組成物を肺経路に送達するために、本発明の組成物は、エアロゾル又は粗噴霧として製剤化されてもよい。エアロゾル又は噴霧配合物の調製及び投与の方法は、例えば、米国特許第5,858,784号、同第6,013,638号、同第6,022,737号、及び同第6,136,295号に見出すことができる。
ＶＩ．用量
有効な用量の本発明の組成物が患者に投与される。「有効な量」とは、検出可能な治療をもたらすのに十分な組成物の量である。本発明の構成物の実際の投薬レベルは、特定の患者及び／又は標的に所望の果を達成するのに有効な組成物の量を投与するように変更することができる。選択される投薬レベルは、組成物の活性（例えば、細胞傷害性又は光線力学療法（PDT）活性又は化学療法の積載量）及び投与経路に依存し得る。
本明細書における本発明についての開示を概観した後、当業者は、具体的な配合物、本組成物に使用される投与方法、及び治療される標的の性質を考慮して、個々の患者に対して投薬を適合させることができる。そのような調節又は変動、及びいつどのようにしてそのような調節又は変動を行うかについて評価することは、当業者にとって良く知られたことである。
以下の実施例は、本発明の代表的な実施形態を実施するためのガイダンスを当業者に提供するために含まれている。本開示及び当該技術の一般的レベルに照らして、当業者は、以下の実施例は例示的なものにすぎず、本発明の範囲から逸脱することなく、多数の変化、修正及び変更が用いられ得ることが意図されることを理解することができる。
実施例１
プロドラッグの合成
エトポシド（ET）、パクリタキセル（PTX）、ジヒドロアルテミシニン（DHA）、及びNLG919などのいくつかの抗癌剤をコレステロールに結合させ、カンプトテシン（CPT）をジスルフィドリンカーを介してオレイン酸（OA）に結合させた。このプロドラッグの合成は、脂質（Chol）又は抗癌剤（CPT）中のいずれかの水酸基を塩化アシルに変換し、続いてまた水酸基を有する薬物（ET、PTX、NLG919）又は脂質（OA ）と直接反応させることを含む。このジスルフィド結合は、まず抗癌剤（CPT）をビス（2-ヒドロキシエチル）ジスルフィド（OH-SS-OH）で官能化し、続いて脂質結合（Chol-ET、Chol-PTX、及びChol-NLG919）させ、又はこの脂質(OA)をOH-SS-OHで変性させることにより、プロドラッグに導入することができ、続いて抗癌剤結合（OA-CPT）を行うことができる。
Figure 0007090034000012
 スキーム3：Chol-S-S-OHの合成
Chol-S-S-OH
上記のスキーム3に示すように、氷浴上で、無水ジクロロメタン（DCM）中のコレステロール（1当量）及び4-N、N-ジメチルアミノピリジン（DMAP、4当量）の混合物に、無水DCM中のトリホスゲン（0.35当量）の溶液を、撹拌しながら滴下した。得られた溶液を室温まで温め、さらに20分間撹拌し、次いで氷浴上で無水DCM中のビス（2-ヒドロキシエチル）ジスルフィド（2当量）の溶液に滴加した。次いで、この反応混合物を室温まで温め、12時間撹拌した。溶媒を除去した後、残留物を酢酸エチル/ヘキサン（1：2、v/v）を用いてシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより精製した。典型的な収率：60％、1H-NMR (500MHz, CDCl3): 0.65 (s, 3H), 0.83 (d, 3H), 0.84-1.15 (m, 13H), 1.22-1.66 (m, 13H), 1.75-2.02 (m, 5H), 2.37 (m, 2H), 2.85 (m, 3H), 2.92 (t, 2H), 3.83 (t, 2H), 4.34 (t, 2H), 4.44 (m, 1H), 5.37 (d, 1H).
Figure 0007090034000013
Figure 0007090034000014
 スキーム4.プロドラッグの合成
Chol-ET
上記のスキーム4に示すように、氷浴上で、無水ジクロロメタン（DCM）中のChol-SS-OH（1当量）及び4-N、N-ジメチルアミノピリジン（DMAP、4当量）の混合物に、無水DCM中のトリホスゲン（0.35当量）の溶液を撹拌しながら滴下した。得られた溶液を室温まで温め、さらに1時間撹拌し、次いで氷浴上で無水DCM中のET（3当量）の溶液に滴下した。次いで、この反応混合物を室温まで温め、12時間撹拌した。溶媒を除去した後、残留物をメタノール/DCM（3:97、v/v）を用いてシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーにより精製し、収率65％でChol-ETを得た。1H-NMR (500MHz, CDCl3): 0.66 (s, 3H), 0.84-1.65 (m, 32H), 1.75-2.02 (m, 6H), 2.37 (m, 2H), 2.85 (s, 2H), 2.95 (t, 2H), 2.98 (t, 2H), 3.21 (s, 2H), 3.30 (m, 3H), 3.38 (t, 1H), 3.54 (t, 1H), 3.64 (m, 3H), 3.67 (s, 6H), 4.15 (d, 1H), 4.22 (t, 1H), 4.35 (t, 2H), 4.39 (d, 1H), 4.45 (t, 2H), 4.58 (m, 2H), 4.72 (d, 1H), 4.91 (s, 1H), 5.37 (d, 1H), 5.97 (d, 2H), 6.25 (s, 2H), 6.52 (s, 1H), 6.82 (s, 1H), 7.95 (s, 1H).
Figure 0007090034000015
Figure 0007090034000016
 スキーム５、様々なプロドラッグの化学構造
Chol-PTX
氷浴上で、無水ジクロロメタン（DCM、6mL）中のChol-SS-OH（362mg、0.64mmol、1当量）（上記スキーム5中の構造を参照されたい）及び4-N、N-ジメチルアミノピリジン（DMAP、140mg、1.2mmol 2当量）の混合物に、無水DCM（3mL）中のトリホスゲン（65mg、0.21mmol、0.33当量）の溶液を撹拌しながら滴下した。得られた溶液を室温まで温め、さらに1時間撹拌し、次いで氷浴上でこれを無水DCM（15mL）中のPTX（500mg、0.59mmol、0.9当量）の溶液に滴加した。次いで、この反応混合物を室温まで温め、12時間撹拌した。溶媒を除去した後、残留物をメタノール/ DCM（3:97、v/v）を用いてシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより精製して、408mgのChol-PTXを得た。1H-NMR (500MHz, CDCl3): 0.65 (s, 3H), 0.87-2.01 (m, 53H), 2.25-2.49 (m, 11H), 2.95 (m, 4H), 3.82 (d, 1H), 4.25 (q, 1H), 4.34 (m, 3H), 4.43 (m, 3H), 4.97 (d, 1H), 5.38 (d, 1H), 5.42 (s, 1H), 5.70 (d, 1H), 6.01 (d, 1H), 6.32 (m, 2H), 7.04 (d, 1H), 7.43 (m, 7H), 7.54 (m, 3H), 7.63 (m, 1H), 7.77 (d, 2H), 8.16 (d, 2H). ESI-MS: m/z=1468.8 ([M+Na]+)．
Chol-CPT
氷浴上で、無水ジクロロメタン（DCM、6mL）中のChol-SS-OH（480mg、0.84mmol、1当量）及び4-N、N-ジメチルアミノピリジン（DMAP、140mg、1.2mmol、1.5当量）の混合物に、無水DCM（3mL）中のトリホスゲン（85mg、0.28mmol、0.33当量）の溶液を攪拌しながら滴下した。得られた溶液を室温まで温め、さらに1時間撹拌し、次いで氷浴上でこれを無水DCM（50mL）中のCPT（200mg、0.57mmol、0.7当量）の懸濁液に滴加した。次いで、この反応混合物を室温まで温め、12時間撹拌した。溶媒を除去した後、残留物をヘキサン/酢酸エチル/トリエチルアミン（1:2:0.03、v/v）を用いてシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより精製して、150mgのChol-CPTを得た。1H-NMR (500MHz, CDCl3): 0.65 (s, 3H), 0.85-1.21 (m, 12H), 1.25-1.65 (m, 13H), 1.85-2.05 (m, 6H), 2.13 (m, 1H), 2.32 (m, 1H), 2.36 (d, 1H), 2.95 (m, 4H), 4.29 (d, 2H), 4.36 (t, 2H), 4.42 (m, 1H), 5.28 (d, 2H), 5.38 (d, 2H), 5.70 (d, 1H), 7.34 (s, 1H), 7.67 (dd, 1H), 7.83 (dd, 1H), 7.93 (d, 1H), 8.22 (d, 1H), 8.40 (s, 1H). ESI-MS: m/z=941.6 ([M+H]+).
Chol-DHA
氷浴上で、無水ジクロロメタン（DCM、2mL）中のChol-SS-OH（83.5mg、0.15mmol、1当量）及び4-N、N-ジメチルアミノピリジン（DMAP、54mg、0.44mmol 3当量）の混合物に、無水DCM（1mL）中のトリホスゲン（15mg、0.05mmol、0.33当量）の溶液を攪拌しながら滴下した。得られた溶液を室温まで温め、さらに1時間撹拌し、次いでこれを氷浴上で無水DCM（5mL）中のDHA（50mg、0.17mmol、1.1当量）の溶液に滴下して加えた。次いで、この反応混合物を室温まで温め、12時間撹拌した。溶媒を除去した後、残留物をヘキサン/酢酸エチル（7:1、v/v）を用いてシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより精製して53mgのChol-CPTを得た。1H-NMR (500MHz, CDCl3): 0.65 (s, 3H), 0.88-1.20 (m, 29H), 1.30-1.75 (m, 20H), 1.80-2.08 (m, 8H), 2.37 (m, 3H), 2.61 (m, 1H), 3.00 (m, 4H), 4.41 (m, 4H), 4.52 (m, 1H), 5.42 (d, 1H), 5.47 (s, 1H), 5.60 (d, 1H). ESI-MS: m/z=899.5 ([M+Na]+).
Chol-NLG919
氷浴上で、無水ジクロロメタン（DCM、2mL）中のChol-SS-OH（109mg、0.19mmol、1当量）及び4-N、N-ジメチルアミノピリジン（DMAP、45mg、0.38mmolの2当量）の混合物に、無水DCM（1mL）中のトリホスゲン（20mg、0.07mmol、0.35当量）の溶液を攪拌しながら滴下した。得られた溶液を室温まで温め、さらに1時間撹拌し、次いでこれをNLG919（100mg、0.38mmol、2当量）の無水DCM（5mL）溶液を氷浴上で滴下した。次いで、この反応混合物を室温まで温め、12時間撹拌した。溶媒を除去した後、残留物をヘキサン/酢酸エチル（2:1、v/v）を用いてシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより精製して96mgのChol-NLG919を得た。1H-NMR (500MHz, CDCl3): 0.65 (s, 3H), 0.85-1.75 (m, 43H), 1.85-2.05 (m, 6H), 2.20 (m, 1H), 2.42(m, 3H), 2.96 (m, 4H), 4.28 (m, 2H), 4.38 (t, 2H), 4.81 (m, 1H), 5.23 (m, 1H), 5.41 (d, 2H), 7.28 (t, 2H), 7.40 (t, 1H), 7.55 (dd, 2H), 7.75 (s, 1H). ESI-MS: m/z=875.6 ([M+H]+).
Chol-OTS167
氷浴上で、無水N、N-ジメチルホルムアミド（DMF、2mL）中のChol-SS-OH（35mg、0.06mmol、1当量）及び4-N、N-ジメチルアミノピリジン（DMAP、16mg、0.12mmol 2当量）の混合物に、無水DMF（1mL）中のトリホスゲン（8mg、0.02mmol、0.33当量）の溶液を撹拌しながら滴下した。得られた溶液を室温まで温め、さらに1時間撹拌し、次いでこれを無水DMF（5mL）中のOTS167（20mg、0.04mmol、0.67当量）の溶液に滴加した。次いで、この反応混合物を室温まで温め、12時間撹拌した。次いで、この溶液を酢酸エチル30mlで希釈し、飽和塩化アンモニウム溶液（20mL×3）で洗浄した。真空下で溶媒を除去した後、残留物をDCM /メタノール（10:1、v/v）を用いてシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより精製し、20mgのChol-OTS167を得た。1H-NMR (500MHz, CDCl3, 1対の回転異性体): 0.65 (s, 3H), 0.86-1.65 (m, 35H), 1.75-2.05 (m, 6H), 2.17-2.40 (m, 8H), 2.70 (d, 3H), 2.95 (m, 9H), 3.02 (d, 2H), 3.10 (d, 2H), 4.40 (m, 2H), 4.45 (m, 1H), 4.61 (m, 2H), 5.38 (m, 1H), 7.96 (m, 2H), 8.07 (m, 2H), 8.23 (d, 1H), 8.98 (s, 1H), 11.22 (s, 1H). ESI-MS: m/z=1079.6 ([M+H]+).
Chol-OTSC41
氷浴上で、無水N、N-ジメチルホルムアミド（DMF、2mL）中のChol-SS-OH（45mg、0.08mmol、1当量）及び4-N、N-ジメチルアミノピリジン（DMAP、20mg、0.16mmol 2当量）の混合物に、無水DMF（1mL）中のトリホスゲン（6mg、0.02mmol、0.33当量）の溶液を撹拌しながら滴下した。得られた溶液を室温まで温め、さらに1時間撹拌し、次いでこれを無水DMF（5mL）中のOTSC41（20mg、0.04mmol、0.5当量）の溶液に氷浴上で滴加した。次いで、この反応混合物を室温まで温め、12時間撹拌した。次いで、この溶液を酢酸エチル30mlで希釈し、飽和塩化アンモニウム溶液（20mL×3）で洗浄した。真空下で溶媒を除去した後、残留物をDCM /メタノール/トリエチルアミン（200:10:2、v/v）を用いてシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより精製し、20mgのChol-OTSC41を得た。1H-NMR (500MHz, CDCl3): 0.65 (s, 3H), 0.88-1.62 (m, 36H), 1.78-2.05 (m, 9H), 2.40 (m, 2H), 2.89 (m, 4H), 3.13 (m, 3H), 3.27 (m, 2H), 3.44 (t, 2H), 3.67 (s, 1H), 4.05 (dd, 2H), 4.33 (t, 1H), 4.40 (t, 2H), 4.49 (m, 1H), 5.40 (d, 2H), 5.95 (s, 1H), 6.02 (s, 1H), 6.25 (s, 1H), 7.35 (t, 3H), 7.62 (d, 2H), 7.78 (s, 1H), 7.89 (d, 2H).
DHA-S-S-OH
氷浴上で、無水テトラヒドロフラン（THF、4ml）中のDHA（200mg、0.7mmol、1当量）及び4-N、N-ジメチルアミノピリジン（DMAP、200mg、1.64mmol、2.3当量）の混合物に、無水DMF（1mL）中のトリホスゲン（70mg、0.24mmol、0.34当量）の溶液を撹拌しながら滴下した。得られた溶液を室温まで温め、さらに0.5時間撹拌し、次いでこれを無水DCM（5mL）中のビス（2-ヒドロキシエチル）ジスルフィド（215mg、1.4mmol、2当量）の溶液に氷浴上で滴加した。次いで、この反応混合物を室温まで温め、12時間撹拌した。溶媒を除去した後、残渣をヘキサン/酢酸エチル（2:1、v/v）を用いてシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより精製して80mgのDHA-S-S-OHを得た。1H-NMR (500MHz, CDCl3): 0.93 (d, 3H), 0.98 (d, 3H), 1.25-1.55 (m, 6H), 1.62-1.95 (m, 6H),2.07 (m, 1H), 2.38 (td, 1H), 2.65 (m, 1H), 2.93 (m, 4H), 3.73 (m, 1H), 3.90 (m, 2H), 4.11 (m, 1H), 4.85 (s, 1H), 5.32 (s, 1H), 5.51 (s, 1H). ESI-MS: m/z=465.2 ([M+H]+).
オレイル-PC-S-S-DHA
氷浴上で、無水ジクロロメタン（DCM、4ml）中のDHA-SS-OH（500mg、1.07mmol、1当量）及び4-N、N-ジメチルアミノピリジン（DMAP、160mg、1.2mmol、1.1当量）の混合物に、無水DCM（1mL）中のトリホスゲン（110mg、0.36mmol、0.33当量）の溶液を撹拌しながら滴下した。得られた溶液を室温まで温め、さらに0.5時間撹拌し、次いで、これを無水DCM（2mL）、無水DMF（3mL）及びトリエチルアミン（0.2mL）の混合物中のオレイル-lyso-PC（500mg、0.96mmol、0.9当量）の溶液に氷浴上で滴加した。次いで、この反応混合物を室温まで温め、12時間撹拌した。溶媒を除去した後、残留物をDCM/タノール（10:1、v/v）を用いてジオールシリカでのカラムクロマトグラフィーにより精製して、215mgのオレイル-PC-S-S-DHAを得た。1H-NMR (500MHz, CDCl3): 0.90 (t, 3H), 0.93 (d, 3H), 0.98 (d, 3H), 1.20-1.33 (m, 22H), 1.45-1.70 (m, 9H), 1.75-1.95 (m, 4H), 2.03 (m, 4H), 2.36 (m, 3H), 2.66 (m, 1H), 2.97 (m, 4H), 3.46 (s, 9H), 3.50 (d, 1H), 3.73 (m, 1H), 4.10 (m, 3H), 4.27 (m, 3H), 4.39 (dd, 1H), 4.44 (t, 2H), 4.65 (s, 2H), 4.85 (d, 1H), 5.11 (t, 1H), 5.37 (m, 1H), 5.46 (s, 1H). ESI-MS: m/z=1012.5 ([M+H]+).
PC-S-S-DHA
氷浴上で、5mLの無水トルエン及び0.2mLのトリエチルアミン中のDHA-SS-OH（200mg、0.43mmol、1当量）の溶液に、エチレングリコールクロロホスフェート（80mg、0.56mmol、1.3当量）の溶液を攪拌しながら滴下した。得られた溶液を室温まで温め、さらに2時間撹拌し、次いで真空下で乾燥した。この生成物を2mLの無水THFにより圧力管に移し、ドライアイス－アセトン浴で冷却した。この溶液に無水トリメチルアミン0.5mLを添加し、圧力管を密閉し、70℃で24時間加熱した。真空下で溶媒を除去した後、DCM /メタノール（5:1、v/v）を用いてジオールシリカでのカラムクロマトグラフィーにより精製して、生成物PC-S-S-DHA を50％収率（137mg）で得た。1H-NMR (500MHz, CDCl3): 0.93 (d, 3H), 0.98 (d, 3H), 1.25-1.55 (m, 6H), 1.62-1.95 (m, 6H),2.07 (m, 1H), 2.38 (td, 1H), 2.65 (m, 1H), 2.93 (m, 4H), 3.45 (s, 9H), 3.73 (m, 1H), 3.95 (m, 2H), 4.15 (m, 1H), 4.20 (m, 2H), 4.45 (m, 2H), 4.85 (s, 1H), 5.32 (s, 1H), 5.44 (s, 1H). ESI-MS: m/z=630.2 ([M+H]+).
Chol-ART
アーテスネート（500mg、1.3mmol、1当量）、コレステロール（1g、2.6mmol、2当量）、4-N、N-ジメチルアミノピリジン（DMAP、16mg、0.13mmol、0.1当量）及び1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・HCl（EDCI、350mg、1.8mmol、1.4当量）を、乾燥DCM（6mL）に溶解し、12時間撹拌した。次いで、この混合物を50mLのEtOAcで希釈し、1M HCl（50mL、2回）及びブライン（50mL）で洗浄した。その有機層を無水硫化ナトリウム上で乾燥させた。真空下で溶媒を除去した後、得られた生成物を、更に、EtOAc/ヘキサン（1:5、v/v）を用いてシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより精製した。収量：832mg、83％。1H-NMR (500MHz, CDCl3): 0.65 (s, 3H), 0.88-1.20 (m, 29H), 1.30-1.75 (m, 20H), 1.80-2.08 (m, 8H), 2.37 (m, 3H), 2.72 (m, 5H), 4.52 (m, 1H), 5.39 (d, 1H), 5.46 (s, 1H), 5.83 (d, 1H). ESI-MS: m/z=753.5 ([M+H]+).
Boc-MTX
下記のスキーム6に示すように、ミトキサントロン（MTX、300mg、0.68mmol、1当量）を2mLのNa2CO3溶液（2mg/mL）に溶解し、4mLの1,4-ジオキサン中のジ-tert-ブチルジカーボネート（Boc2O、500mg、2.3mmol、3.3当量）の溶液と混合した。この混合物を室温で12時間撹拌し、次いでDCM（20mL×3）により抽出した。その有機相を合わせて濃縮した。その残渣をDCM/メタノール（20:1、v/v）を用いてシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより精製して、435mgのBoc-MTXを得た。1H-NMR (500MHz, CDCl3): 1.51 (s, 18H), 3.45 (d, 4H), 3.56 (s, 8H), 3.79 (s, 4H), 7.05 (s, 3H), 7.12 (s, 2H), 10.32 (s, 1H), 13.36 (s, 2H). ESI-MS: m/z=645.4 ([M+H]+).
Figure 0007090034000017
 スキーム６、Boc-MTXの合成
Chol-Boc-MTX
氷浴上で、無水ジクロロメタン（DCM、10ml）中のChol-SS-OH（500mg、0.88mmol、1当量）及び4-N、N-ジメチルアミノピリジン（DMAP、430mg、3.5mmol、4当量）の混合物に、無水DCM（5mL）中のトリホスゲン（90mg、0.3mmol、0.34当量）の溶液を撹拌しながら滴下した。得られた溶液を室温まで温め、さらに1時間撹拌し、次いでこれを無水DCM（20mL）中のBoc-MTX（435mg、0.68mmol、0.77当量）の溶液に氷浴上で滴下した。次いで、この反応混合物を室温まで温め、12時間撹拌した。真空下で溶媒を除去した後、残留物をDCM/メタノール/トリエチルアミン（200:10:2、v/v）を用いてシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより精製し、410mgのChol-Boc-MTXを得た。1H-NMR (500MHz, CDCl3): 0.65 (s, 3H), 0.87-1.65 (m, 53H), 1.75-2.40 (m, 10H), 2.93 (m, 6H), 3.03 (m, 4H), 3.58 (m, 4H), 3.64 (m, 4H), 4.37 (m, 4H), 4.42 (m, 1H), 5.70 (d, 1H) 7.15 (d, 2H), 7.28 (d, 2H), 10.45 (s, 2H), 13.35 (s, 2H). ESI-MS: m/z=1237.8 ([M+H]+).
Chol-MTX
以下のスキーム7に示すように、Chol-Boc-MTX（410mg、0.33mmol）を20mLのトリフルオロ酢酸（TFA）に溶解し、室温で30分間撹拌した。過剰のTFAを窒素流により除去した。残渣をテトラヒドロフラン/ヘキサン中で再結晶して300mg のChol-MTX TFA塩を得た。更に、この塩をDCMに溶解し、飽和NaHCO3溶液1M HClで洗浄し、溶媒を除去することによって、この塩をHCl塩に変換することができた。1H-NMR (500MHz, CDCl3): 0.65 (s, 3H), 0.87-1.65 (m, 35H), 1.75-2.40 (m, 12H), 2.93 (m, 6H), 3.03 (m, 4H), 3.45 (dd, 4H), 3.72 (m, 4H), 4.37 (m, 4H), 4.42 (m, 1H), 5.33 (d, 1H), 6.90 (m, 2H), 7.05 (m, 2H), 10.34 (d, 2H), 13.42 (s, 2H). ESI-MS: m/z=1037.6 ([M+H]+).
Figure 0007090034000018
 スキーム7. TFA中のChol-Boc-MTXの脱保護によるChol-MTXの合成
OA-CPT
以下のスキーム8に示すように、オレイン酸（OA、1当量）をOH-SS-OH（2当量）、N、N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC、1.2当量）及び4-ジメチルアミノピリジン（DMAP）と一晩反応させ、OA-SS-OHを生成し、酢酸エチル/ヘキサン（2:3、v/v）で精製した。1H-NMR (CDCl3, 500MHz): 0.87 (t, 3H), 1.23-1.30 (m, 20H), 1.60 (t, 2H), 1.98 (q, 4H), 2.30 (t, 2H), 2.35 (t, 1H), 2.86 (t, 2H), 2.91 (t, 2H), 3.87 (t, 2H), 4.33 (t, 2H), 5.33 (m, 2H).
氷浴上で、無水ジクロロメタン（DCM）中のカンプトテシン（CPT）（1当量）及び4-N、N-ジメチルアミノピリジン（DMAP、4当量）の混合物に、無水DCM中のトリホスゲン（0.35当量）の溶液を撹拌しながら滴下した。得られた溶液を室温まで温め、さらに1時間撹拌し、次いでこれを無水DCM中のOA-S-S-OH（2当量）の溶液に氷浴上で滴加した。次いで、この反応混合物を室温まで温め、12時間撹拌した。溶媒を除去した後、残渣をメタノール/DCM（3:97、v/v）を用いてシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーにより精製して、収率65％でOA-CPTを得た。1H-NMR (CDCl3, 500MHz): 0.88 (t, 3H), 1.02 (t, 3H), 1.23-1.31 (m, 20H), 1.59 (t, 2H), 2.00 (q, 4H), 2.17 (m, 1H), 2.27 (m, 3H), 2.88 (t, 2H), 2.95 (t, 2H), 4.27 (t, 2H), 4.38 (m, 2H), 5.32 (m, 2H), 5.34 (m, 2H), 5.40 (d, 1H), 5.61 (d, 1H), 7.35 (s, 1H), 7.69 (t, 1H), 7.85 (t, 1H), 7.96 (d, 1H), 8.24 (d, 1H), 8.42 (s, 1H).
Figure 0007090034000019
 スキーム８. OA-CPTの合成
実施例２
小細胞肺癌の治療のためのエトポシド（ET）を担持するナノスケール配位ポリマー(NCP)コア－シェルナノ粒子
Zn-ピロリン酸塩粒子の合成
まず、2つの別個の界面活性剤系の混合物（100mL、シクロヘキサン中の0.3M TritonX-100と1.5Mヘキサノール）に、4mLのNa4P2O7・10H2O（25mg/mLの水溶液）と4mLのZn(NO3)2・6H2O（100mg/mLの水溶液）とを添加して、２つのマイクロエマルションを形成した。この別個のマイクロエマルションを室温で15分間激しく撹拌し、Na4P2O7・10H2O溶液にDOPA溶液（CHCl3中に200mg/mL）400μLを加え、透明な溶液が形成されるまで15分間撹拌を続けた。次に、Zn(NO3)2・6H2O溶液を攪拌しながらNa4P2O7・10H2O溶液にゆっくりと加え、これらを合わせた溶液を室温で30分間反応させた。400mLのエタノールを加えた後に粒子を沈殿させ、12000rpmで30分間遠心分離した。得られたペレットをさらに50％EtOH/シクロヘキサンで1回、50％EtOH/THFで2回洗浄し、THFに再分散させた。粒子を、200nmのシリンジフィルターによる濾過により精製した。
Zn/ET粒子の調製とキャラクタリゼーション
60℃で、500μLの30％（v/v）EtOH/H2Oに、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DSPC）、コレステロール、Chol-ET（モル比1:1:0.3, 1:1:0.5又は1:1:1）、DSPE-PEG2k（20mol%）及びZn-ピロリン酸粒子のTHF溶液80μLを加えて、Zn/ETを得た。THF及びEtOHを蒸発させ、溶液を室温に冷却して、次で使用した。粒径及び分布を動的光散乱(DLS)により決定し、エトポシドの積載を、紫外－可視分光器（UV-Vis)により決定した（表1参照）。
Figure 0007090034000020
小細胞肺癌細胞に対するインビトロ細胞毒性
H82細胞を2000細胞/ウェルの密度で96ウェルプレート上に播種し、Zn/ET及び遊離エトポシド（ET）により、様々なエトポシド濃度で、96時間処理した。細胞生存率をMTSアッセイ(Promega, Madison, Wisconsin, USA)により検出し、それに応じてIC50値を算出した。96時間のインキュベーション後に、エトポシドはH82細胞に対して8.83±0.13μMのIC50値を示し、Zn/ETは9.50±0.63μMのIC50を示した。エトポシドは、下記のスキーム9に示すように、内因性チオール基による細胞内還元を介してZn/ETから放出されるようである。
Figure 0007090034000021
 スキーム9. 細胞内還元によるChol-ETからエトポシド（ET）の放出
実施例３
非小細胞肺癌の治療のためのパクリタキセル（PTX）を担持したナノスケール配位ポリマー(NCP)コア－シェルナノ粒子
Zn/PTXの調製とキャラクタリゼーション
60℃で、500μLの30％（v/v）EtOH/H2Oに、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DSPC）、コレステロール、Chol-PTX（モル比1:1:0.3）、DSPE-PEG2k（20mol％）及びZn-ピロリン酸粒子のTHF溶液80μLを加えて、Zn/PTXを得た。THF及びEtOHを蒸発させ、溶液を室温に冷却して、次で使用した。粒径及び分布を動的光散乱(DLS)により決定し、Z－平均直径は94.15±0.61nm、数－平均直径は55.83±6.20nm、多分散指数(PDI)は0.119±0.01、ゼータ電位は-0.67±1.02mVであった。このZn/PTX粒子の薬物積載量は7.14％である。
非小細胞肺癌細胞に対するインビトロ細胞毒性
2000細胞/ウェルの密度で96ウェルプレート上に播種したH460細胞及びA549細胞を、Zn/PTX及び遊離パクリタキセルにより、種々のエトポシド濃度で、72時間処理した。次いで、細胞生存率をMTSアッセイ（Promega、USA）によって検出し、それに応じてIC50値を算出した。72時間のインキュベーション後に、パクリタキセル（PTX）は、H460細胞及びA549細胞に対して、それぞれIC50が10.79±0.44μM及び10.09±0.06μMであった。Zn/PTXは、それぞれ12.03±0.43μM及び11.07±0.13μMであり、遊離PTXと同様のIC50を示した。
実施例４
卵巣癌治療のためのナノスケール配位ポリマー(NCP)コア－シェルナノ粒子ジヒドロアルテミシニン（DHA）
Zn/DHA粒子の合成とキャラクタリゼーション
まず、2つの別個の界面活性剤系の混合物（5mL、シクロヘキサン中の0.3M TritonX-100と1.5Mヘキサノール）に、0.2mLのNa4P2O7・10H2O（25mg/mLの水溶液）と0.2mLのZn(NO3)2・6H2O（100mg/mLの水溶液）とを添加して、２つのマイクロエマルションを形成した。この別個のマイクロエマルションを室温で15分間激しく撹拌し、Na4P2O7・10H2O溶液にDOPA溶液（CHCl3中に200mg/mL）20μLを加え、透明な溶液が形成されるまで15分間撹拌を続けた。次に、Zn(NO3)2・6H2O溶液を攪拌しながらNa4P2O7・10H2O溶液にゆっくりと加え、これらを合わせた溶液を室温で30分間反応させた。20mLのエタノールを加えた後に粒子を沈殿させ、12000rpmで30分間遠心分離した。得られたペレットをさらに50％EtOH/シクロヘキサンで1回、50％EtOH/THFで2回洗浄し、THFに再分散させた。粒子を、200nmのシリンジフィルターによる濾過により精製した。
50℃で、500μLの30％（v/v）EtOH/H2Oに、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DSPC）、コレステロール、20mol％DSPE-PEG2k及びZn-ピロリン酸粒子のTHF溶液80μLを添加して、Zn/DHAを得た。THF及びEtOHを蒸発させ、溶液を室温に冷却して、次で使用した。粒径及び分布を動的光散乱(DLS)により決定した。表２を参照されたい。
Figure 0007090034000022
卵巣癌細胞におけるZn/DHAのインビトロ細胞毒性
A2780、A2780/CDDP及びSKOV-3細胞を、2000細胞/ウェルで96ウェルプレートに24時間播種した。その後、細胞を様々な濃度の遊離ジヒドロアルテミシニン（DHA）又はZn/DHAで処理し、さらに72時間インキュベートした。次いで、細胞生存率を、マイクロプレートリーダーによるMTSアッセイによって決定した。DHAは、高い細胞傷害性を示し、特にA2780細胞に対して高かった。ジヒドロアルテミシニン（DHA）は、A2780、A2780/CDDP及びSKOV-3において、それぞれ0.30±0.11、2.61±0.18及び9.90±0.34μMのIC50を示した。Zn/DHAは、A2780、A2780/CDDP及びSKOV-3について、それぞれ0.96±0.15、3.71±0.55及び11.88±3.22のIC50値を示した。
実施例５
小細胞肺癌の治療のためのシスプラチンとエトポシドを組み合わせたナノスケール配位ポリマー(NCP)コア－シェルナノ粒子
NCP-1/ET及びNCP-1/ET/siRNAの調製とキャラクタリゼーション
NCP-1の固体コアは、ジオレイル-sn-グリセロ-3-リン酸（DOPA）キャッピング層を有し、シクロヘキサン中の0.3M TritonX-100及び1.5Mヘキサノールの混合物中の逆相マイクロエマルション中で、1,2-シス,シス,トランス-[Pt(NH3)2Cl2(OCONHP(O)(OH)2)2] (PtBp)及びZn2+イオンから形成された。1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-リン酸ナトリウム塩（DOPA）は、裸のNCP-1上に脂質層を提供し、他のリン脂質又は脂質含有薬物の取り込みを促進する。
NCP-1/ETは、0.25mgの裸のNCP粒子に、84μLの1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン（DOPC）（5mg/mL）、42μLのChol（5mg/mL）、16μLのChol-ET（15mg/mL）及び150μLの1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[アミノ（ポリエチレングリコール）2000]（DSPE-PEG2K）（5mg/mL）を塗工することにより自己集合を介して形成され、シスプラチン対ETのモル比は1:1であった。動的光散乱（DLS）測定により、NCP-1/ETのZ平均直径及び多分散指数(PDI)はそれぞれ106.8±1.05nm及び0.121±0.01であった。
NCP-1/ETにsiRNAを効果的に積載するために、チオール化siRNAをDSPE-SPDPに結合してDSPE-siRNAを生成させた。アンチセンス鎖上の潜在的阻害を回避するために、チオール化siRNA中のジスルフィド結合を、siRNA二重鎖のセンス鎖の5 '末端に配置した。その外側脂質層に、シスプラチン対siRNA重量比4:1で、DSPE-siRNAを、DOPC、Chol、Chol-ET、及びDSPE-PEG2Kと共に自己集合によって結合させ、NCP-1/ET/siRNAを形成した。Bcl-2、サバイビン、及びERCC-1 siRNAを、複数の薬剤耐性経路を標的とするsiRNAカクテルのモデルとして選択した。NCP-1/ET/siRNAに、Bcl-2、サバイビン、及びERCC-1 siRNAが等量で存在する。NCP-1/ET/siRNAのZ平均直径及び多分散指数(PDI)は、それぞれ100.2±1.10nm及び0.159±0.01であった。下の表3を参照されたい。siRNAは、PEGの遮蔽効果のために、生理学的環境におけるヌクレアーゼ分解からを保護されることができた。Chol-ETと同様に、siRNA放出は、グルタチオン(GSH)の存在下などのような還元環境下でジスルフィド結合を切断することによって引き起こされることができる。
Figure 0007090034000023
小細胞肺癌におけるNCP-1/ET/siRNAのインビトロ細胞毒性
小細胞肺癌（SCLC）細胞系のH82細胞及びH69細胞を、2000細胞/ウェルで96ウェルプレートに24時間播種した。その後、様々な濃度のシスプラチン、エトポシド（ET）、シスプラチン+ ET、NCP-1、NCP-1/ET、及びNCP-1/ET/siRNAで細胞を処理し、さらに72時間インキュベートした。次いで、細胞生存率を、マイクロプレートリーダーによるMTSアッセイによって決定した。SCLC細胞上のNCP-1/ET/siRNAのIC50を下表4に示す。
Figure 0007090034000024
NCP-1/ET/siRNAのインビボ抗腫瘍活性
2つのシスプラチン耐性卵巣癌（A2780/CDDP及びSKOV-3）、2つの非小細胞肺癌（H460及びA549）並びに1つの小細胞肺癌（H82）の5つの腫瘍モデルについて、NCP-1/ET/siRNAのインビボ抗腫瘍活性を評価した。NCP-1/ET/siRNAは、5つの腫瘍モデルのすべてにおいて、特にSKOV-3、A549及びH82腫瘍モデルにおいて、有意な阻害効果を示した。図1A～1Cを参照されたい。腫瘍は第1段階で完全に阻害されたが、治療を停止した後の最終段階では腫瘍が増殖し始めた。
実施例６
シスプラチンとパクリタキセル(PTX)とを組み合わせたナノスケール配位ポリマー(NCP)コア－シェルナノ粒子
NCP-1含有Chol-PTX（NCP-1/Chol-PTX）のキャラクタリゼーション
シスプラチン－ビスホスホネート、Zn2+イオン及びジオレオイル-sn-グリセロ-3-リン酸（DOPA）を含む裸のNCP-1は、シクロヘキサン中の0.3MのTritonX-100及び1.5Mのヘキサノールの混合物中で調製され、DOPAはこの溶媒中に出る。これにより、裸のNCP上に脂質層が形成され、他のリン脂質又は脂質含有薬物の取り込みを容易にする。次いで、この裸のNCP-1粒子を2倍量のEtOHと混合し、12000rpmで30分間遠心分離して溶媒を除去する。この粒子ペレットをさらに50％EtOH /シクロヘキサンで1回、50％EtOH/THFで2回洗浄して過剰量のDOPAを除去し、THFに再分散させる。最後に、裸のNCP-1粒子を、更に200nmシリンジフィルターで濾過して、次で使用する。
30％（v/v）EtOH/H2Oに、DOPC（0.5mg）、Chol（0.25mg）及びChol-PTX（146μg）、DSPE-PEG2K（20mol％）（0.9mg）及び裸のNCP-1粒子(0.25mg)の混合物を，激しく攪拌しながら添加することにより、NCP-1/Chol-PTX粒子を得た。THF及びEtOHを蒸発させ、溶液を室温に冷却して、次で使用した。この配合物（シスプラチン/PTX = 2.1:1（モル比））において、積載した薬物は、パクリタキセル(PTX)（4.3％、853g/mol、Chol-PTXについて7.3％）とシスプラチン（3.13％、300g/mol）である。NCP-1/Chol-PTXのz平均サイズは94.1±1.2nmであり、多分散指数(PDI)は0.164であり、リン酸緩衝食塩水中で中性電荷（-1.5mV）である。このNCP-1/Chol-PTX粒子は、リン酸緩衝食塩水(PBS)中及びPBS含有10％FBS溶液中の両方において10日間安定であった。この優れた製剤安定性は、そのコア内部の強い配位結合及びコレステロールとリン脂質との間の疎水性相互作用から生じ得る。
実施例７
シスプラチンとOTS167を組み合わせたナノスケール配位ポリマー(NCP)コア－シェルナノ粒子
NCP-1/OTS167の調製とキャラクタリゼーション
シスプラチン－ビスホスホネート、Zn2+イオン及びジオレオイル-sn-グリセロ-3-リン酸（DOPA）を含む裸のNCP-1は、シクロヘキサン中の0.3MのTritonX-100及び1.5Mのヘキサノールの混合物中で調製され、DOPAはこの溶媒中に出る。これにより、裸のNCP上に脂質層が形成され、他のリン脂質又は脂質含有薬物の取り込みを容易にする。30％（v/v）EtOH/H2Oに、DOPC、Chol及びChol-OTS167、DSPE-PEG2K（20mol％）及び裸のNCP-1粒子の混合物を，激しく攪拌しながら添加することにより、NCP-1/ OTS167粒子を得た。THF及びEtOHを蒸発させ、溶液を室温に冷却して、次で使用した。OTS167に対するシスプラチンのモル比が1:1、5:1及び10:1の粒子が作製された。このNCP-1/OTS167のz平均サイズは、モル比が異なる異なる配合物について同様であり、110～120nmであり、多分散指数(PDI)は0.15～0.18の範囲であった。表5を参照されたい。
Figure 0007090034000025
卵巣癌細胞株に対するインビトロ細胞毒性
まず、単独又は組み合わせて、遊離薬物細胞毒性を比較することによって、シスプラチン耐性卵巣癌細胞株A2780/CDDPに対する、シスプラチンとOTS167との相乗効果を調べた。シスプラチンのIC50は、10:1及び100:1のモル比でOTS167と組み合わせると有意に減少した。表6を参照されたい。
Figure 0007090034000026
次いで、異なるモル比のNCP-1/OTS167の細胞傷害性を評価した。遊離シスプラチン：OTS167のモル比が100:1の場合、最も有望な組合せ指数を示したので、薬物比が50:1及び100:1のNCP配合物を選択した。表7を参照されたい。
Figure 0007090034000027
実施例８
シスプラチンとOTSC41を組み合わせたナノスケール配位ポリマー(NCP)コア－シェルナノ粒子
NCP-1/OTSC41の調製とキャラクタリゼーション
シスプラチン－ビスホスホネート、Zn2+イオン及びジオレオイル-sn-グリセロ-3-リン酸（DOPA）を含む裸のNCP-1は、シクロヘキサン中の0.3MのTritonX-100及び1.5Mのヘキサノールの混合物中で調製され、DOPAは、この媒体は、裸のNCP上に脂質層を提供し、他のリン脂質又は脂質含有薬物の取り込みを容易にする。シスプラチン－ビスホスホネート、Zn2+イオン及びジオレオイル-sn-グリセロ-3-リン酸（DOPA）を含む裸のNCP-1は、シクロヘキサン中の0.3MのTritonX-100及び1.5Mのヘキサノールの混合物中で調製され、DOPAはこの溶媒中に出る。これにより、裸のNCP上に脂質層が形成され、他のリン脂質又は脂質含有薬物の取り込みを容易にする。30％（v/v）EtOH/H2Oに、DOPC、Chol及びChol-OTSC41、DSPE-PEG2K（20mol％）及び裸のNCP-1粒子の混合物を，激しく攪拌しながら添加することにより、NCP-1/OTSC41粒子を得た。THF及びEtOHを蒸発させ、溶液を室温に冷却して、次で使用した。シスプラチンに対するOTSC41モル比1:1、5:1及び10:1を有する粒子を作製した。NCP-1/OTSC41のz平均サイズは、異なるモル比を有する異なる配合物について同様であり、これは約100nmであり、多分散指数(PDI)は0.14～0.16の範囲であった。表8を参照されたい。
Figure 0007090034000028
卵巣癌細胞株に対するインビトロ細胞毒性
まず、単独又は組み合わせて、遊離薬物細胞毒性を比較することによって、
シスプラチン感受性A2780細胞及びシスプラチン耐性A2780/CDDP細胞の2つの卵巣癌細胞に対する、シスプラチンとOTSC41との相乗効果を調べた。シスプラチンOTSC41の単独又は組み合わせのIC50を表9に示す。
Figure 0007090034000029
実施例９
卵巣癌の治療のためのシスプラチンとジヒドロアルテミシニンを組み合わせたナノスケール配位ポリマー(NCP)コア－シェルナノ粒子
これまでの研究により、ジヒドロアルテミシニン（DHA）及び他のアルテミシニンベースのエンドペルオキシド化合物は、鉄によって媒介されるフェントン反応で切断され、フリーラジカル反応性酸素種（ROS）を産生して腫瘍細胞を損傷させることが示唆されている。ジヒドロアルテミシニン（DHA）は、様々な癌細胞及び異種移植腫瘍の増殖を阻害し、シスプラチン耐性卵巣癌におけるシスプラチンの抗癌効果を増強することが報告されている。ここでは、シスプラチン耐性卵巣癌を治療するために、シスプラチン及びDHAを同時送達するためのナノスケール配位ポリマー(NCP)ベースのコア－シェルナノ粒子を調製した。
NCP-1/DHA粒子の調製とキャラクタリゼーション
先の報告と同様にして、シスプラチンプロドラッグを担持するNCP-1粒子を調製した。簡単に述べると、Zn(NO3)2とシスプラチンプロドラッグ（1,2-シス,シス,トランス-[Pt(NH3)2Cl2(OCONHP(O)(OH)2)2] (PtBp)）との混合物を、室温で1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-リン酸ナトリウム塩（DOPA）と共に、Triton X-100/1-ヘキサノール/シクロヘキサン/水の逆マイクロエマルジョン中で30分間激しく撹拌して、球状DOPA被覆NCP -1粒子を得た。このNCP-1粒子の、誘導結合プラズマ質量分析法（ICP-MS）によって測定された、シスプラチン積載量は25重量％であった。
次いで、このDOPA-NCP-1粒子を、コレステロール、DOPC、Chol-DHA結合体、及び20mol％DSPE-PEG2kでコーティングして、シスプラチンを担持する固体コア及びDHAを含む脂質層を有するコア－シェルナノ構造を得た。脂質コーティング中のDHAの量を変化させることによって、シスプラチンとDHAとのモル比が異なる粒子を調整した。表10を参照されたい。
Figure 0007090034000030
卵巣癌細胞株に対するインビトロ細胞毒性
A2780、A2780/CDDP及びSKOV-3細胞を、2000細胞/ウェルで96ウェルプレートに24時間播種した。その後、これらの細胞を様々な濃度の異なる配合物で処理し、さらに72時間インキュベートした。次いで、細胞生存率を、マイクロプレートリーダーによるMTSアッセイによって決定した。DHAと併用すると、IC50が有意に減少したことに示されるように、シスプラチンの細胞傷害性は有意に低下した。これらの粒子は、遊離薬物と比較して、同様の細胞傷害性を示した。表11を参照されたい。
Figure 0007090034000031
実施例１０
大腸癌の治療のためのオキサリプラチン類似体及びパクリタキセルを組み合わせたナノスケール配位ポリマー(NCP)コア－シェルナノ粒子
免疫原性細胞死の2つの化学療法阻害剤を担持するナノスケール配位ポリマー(NCP)ベースのコア－シェルナノ粒子は、結腸直腸癌の治療において実質的な抗癌効果を示すことが示されている。2つの同系ネズミ結腸直腸癌モデルCT26及びMC38に対して、NCP-2/PTXの有効な抗癌治療が実証された。効率的な抗腫瘍免疫がNCP-2/PTXにより引き起こされ、細胞表面上の早期カルレティキュリン（CRT）曝露、抗腫瘍ワクチン接種、及び腫瘍成長の遅延により示された。
調製とキャラクタリゼーション
先の報告と同様にして、オキサリプラチンプロドラッグを担持するNCP-2粒子を調製した。簡単に述べると、Zn(NO3)2とオキサリプラチン類似体プロドラッグ（Pt(dach)Cl2(OH)2 (式中、dachはR, R-ジアミノシクロヘキサンを表す。）との混合物を、室温で1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-リン酸ナトリウム塩（DOPA）と共に、Triton X-100/1-ヘキサノール/シクロヘキサン/水の逆マイクロエマルジョン中で30分間激しく撹拌して、球状DOPA被覆NCP -2粒子を得た。動的光散乱(DLS)によるこのNCP-2粒子のZ平均は55.33±0.18nmであり、誘導結合プラズマ質量分析法（ICP-MS）により測定したこのNCP-2粒子のオキサリプラチン積載量は27.6重量％であった。
NCP-2粒子のコアにchol-PTX及びPEGを含有する非対称脂質二重層をコーティングすることにより、NCP-2/PTXナノ粒子を調製した。Pt（dach）Cl2：パクリタキセルのモル比が1:1又は2:1の粒子を調製し、キャラクタリゼーションを行った。1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DOPC）、コレステロール、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N- [メトキシ（ポリエチレングリコール）-2000]（DSPE-PEG2k）、chol-PTX（オキサリプラチン：パクリタキセルの比が2:1及び1:1の製剤であって、DOPC：コレステロール：chol-PTX：-DSPE-PEG2kの比が 2:2:0.26:1又は2:2:0.52:1）、及びDOPAでキャップされたNCP-2のTHF溶液を、500μLの30％（v/v）エタノール/水に加え、50℃で1700rpmで1分間攪拌した。このナノ粒子懸濁液中のTHF及びエタノールを完全に蒸発させ、その後のインビトロ及びインビボ実験で使用した。
TEM画像は、NCP-2/PTXの両配合物が球状ナノ粒子であることを示した。緩衝生理食塩水（PBS）中に再懸濁したもののDLS測定により、モル比が1:1のNCP-2/PTXの、Z平均直径、数平均直径及び多分散指数（PDI）は、それぞれ121.7±0.95nm、81.98±4.45nm及び0.139±0.01であった。モル比が2:1の粒子について、これらはそれぞれ112.0±0.51nm、74.26±3.60nm及び0.151±0.01であり、類似の特性を示した。
大腸癌細胞株に対するインビトロ細胞毒性
マウス結腸直腸腺癌CT26及びネズミ結腸直腸癌MC38の2つの結腸直腸癌細胞に対するNCP-2/PTXの細胞傷害性を評価した。NCP-2/PTXは、大幅に異なる溶解度要件を持つ2つの化学療法剤と組み合わせることにより、これら薬物の相乗効果により実質的な抗癌効果を示した。
まず、遊離薬物の細胞傷害性を単独又は組み合わせて比較することにより、オキサリプラチンとパクリタキセルの相乗効果を調べた。オキサリプラチンのMTSアッセイによるIC50は、パクリタキセルが疎水性であるため、パクリタキセルのIC50よりも実質的に低かった。パクリタキセルは、遊離薬物用量を調製するために希釈する前に、1mg/mlのエタノール：水の比3:1の原液中で調製された。2つの薬剤の併用指数（IC 50）は、モル比2:1と比較して、オキサリプラチン用量が等しいモル比1:1の方がはるかに有利であった。オキサリプラチン類似体又はオキサリプラチン類似体及びパクリタキセルをモル比1:1で含むNCP配合物（NCP-2）は、遊離薬物と同様の細胞死滅効果を示した。表12を参照されたい。

Figure 0007090034000032
インビトロ免疫原性細胞死
NCP-2/PTXによって誘発された免疫原性細胞死を、免疫蛍光法及びフローサイトメトリーによって評価した。
免疫蛍光分析のために、6ウェルプレートにCT26細胞を5×105細胞/ウェルで播種し、さらに24時間培養した。この培養培地を、10％FBSを含有する2mLの新鮮培地で置換した。細胞にオキサリプラチン、パクリタキセル、chol-PTX、NCP-2、及びNCP-2/PTX（1:1）をそれぞれ5μMの等価オキサリプラチン及びパクリタキセル用量で添加した。対照としてリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）と共にインキュベートした細胞を用いた。4時間のインキュベーションの後、細胞をPBSで3回洗浄し、4％パラホルムアルデヒドで固定し、AlexaFluor 488-カルレティキュリン（CRT）抗体と共に2時間インキュベートし、DAPIで染色し、405nm及び488nmのレーザーを用いた共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)で、核を可視化し、細胞膜上のCRT発現を観察した。
フローサイトメトリー分析のために、6ウェルプレートにCT26細胞を1×106細胞/ウェルで播種し、さらに24時間培養した。培養培地を、10％FBSを含有する2mLの新鮮培地で置換した。細胞に、それぞれ5μMの等価Pt及び/又はパクリタキセル用量で、オキサリプラチン、パクリタキセル、chol-PTX、NCP-2及びNCP-2/PTX（1:1）を添加した。対照としてリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）と共にインキュベートした細胞を用いた。4時間のインキュベーション後、細胞を回収し、A6lexaFluor 488-CRT抗体とともに2時間インキュベートし、ヨウ化プロピジウム（PI）で染色した。これらのサンプルを、フローサイトメーター(LSRII Orange, BD, Franklin Lakes, New Jersey, USA)で分析し、細胞表面のCRTを同定した。染色した細胞の蛍光強度をPI陰性細胞についてゲーティングを行った。図2を参照されたい。
薬物動態及び生体内分布
NCP-2/PTXの薬物動態学的（pK）及び体内分布の研究を、腹腔内注射後のCT26腫瘍を有するBALB/cマウスで行った。誘導結合プラズマ質量分析（ICP-MS）によりオキサリプラチン分布を定量した。さらに、亜鉛及びオキサリプラチン類似体コア及びコレステロール変性パクリタキセルを含む脂質コーティング層を含むNCP粒子（NCP-2/PTX）の、CT26ネズミ結腸直腸腺癌腫瘍を有するマウスに用量1mg/kgで静脈内（iv）注射した後の、薬物動態及び生体内分布を調べたところ、肝臓、肺、脾臓、腎臓、膀胱及び腫瘍と比較して、血液中により多く存在していることが分かった。5分、1, 3, 5, 8, 24及び48時間後に、誘導結合血漿質量分析（ICP-MS）により白金（Pt）濃度（μg）を分析した。薬物動態及び生体内分布の結果を、初期用量に対する割合（％ID）で表した。図3を参照されたい。
ナノ粒子の投与量と動物の大きさとの関係をよりよく理解するために、ビーグル犬についてNCP-2/PTXの静脈注射による薬物動態学的研究を行った。誘導結合プラズマ質量分析（ICP-MS）によりオキサリプラチン分布を定量した。図4を参照されたい。
インビボ有効性
結腸直腸腺癌CT26を有するBALB/cマウス及び結腸直腸癌MC38を有するC57Bl/6マウスの2つの結腸直腸マウスモデルを用いて、NCP-2/PTXのインビボ抗癌活性を評価した。図5及び6を参照されたい。5×106細胞を右脇腹に注射し、全ての腫瘍の大きさが100～150mm3に達した後、7日目に処理を開始した。CT26及びMC38を有するマウスに、（1）PBS、（2）NCP-2/PTX、又は（3）NCP-2/PTX+ PD-L1抗体を、2.24mg/kgパクリタキセル用量と1mg/kgの等価オキサリプラチン用量で腹腔内注射することを、指示された日に合計6～10回行った。
一定したオキサリプラチン類似体低用量のNCP-2/PTXの投与は、CT26及びMC38マウスマウスモデルの両方において腫瘍増殖を有意に遅延させた。
NCP-2/PTXの抗癌効果における異なる免疫細胞の役割を調べるために、成熟T細胞を欠損した免疫無防備状態の無胸腺ヌードマウス又はT細胞及びB細胞の両方を欠損したRag-/-BALB/cマウスの右脇腹領域に5×106個のCT26細胞を移植した。図7を参照されたい。オキザリプラチン類似体用量1mg/kg及びパクリタキセル用量2.24mg/kgのNCP-2/PTX投与は、免疫応答性BALB/cマウスに対して抗癌効果を顕著に増強したのに比べて、免疫無防備状態モデルのいずれにおいてもCT26の治療に対して効果的ではなかった。
結腸直腸癌のより代表的なマウスモデルを確立するために、C57BL/6マウスの右脇腹領域により少ない細胞（1×106個のMC38細胞）を注入し、治療を開始する前に、免疫抑制腫瘍環境を確立するために長期間増殖させた。MC38腫瘍を有するマウスに、（1）PBS、（2）NCP-2、（3）NCP-2/PTX（1:1）、（4）NCP-2/PTX（2:1）、（5）NCP-2/PTX（1:1）+PD-L1抗体、又は（6）NCP-2/PTX（2:1）+PD-L1抗体を、2mg/kgの等価オキサリプラチン類似体用量及び75gの抗体用量で腹腔内注射することを、4日毎に計5回行った。図8を参照されたい。
抗腫瘍予防接種
NCP-2/PTXにより誘発された強力な免疫原性応答を考慮して、更に、NCP-2/PTXの抗腫瘍ワクチン接種能力を評価した。PBS又はNCP-2/PTXで処理された合計5×105個のCT26細胞を、BALB/cマウスの右脇腹領域に皮下接種した。更に、1週間後、これらのマウスの反対側の脇腹に1×105個のCT26細胞を注射した（再曝露）。これらのマウスについて、ノギスを用いて腫瘍の進展と体重の変化を毎日調べた。図9A及び9Bを参照されたい。PBS群の右腫瘍サイズが2cm3を超えたとき、全てのマウスを殺処分した。
実施例１１
大腸癌の治療のためのオキサリプラチン類似体及びミトキサントロンを組み合わせたナノスケール配位ポリマー(NCP)コア－シェルナノ粒子
2つの免疫原性細胞死の化学療法阻害剤を担持するノスケール配位ポリマー(NCP)ベースのコア－シェルナノ粒子が、結腸直腸癌の治療において実質的な抗癌効果を示すことを示す。
調製とキャラクタリゼーション
これまでと同様にして、オキサリプラチンプロドラッグを担持するNCP-2粒子を調製した。NCP-2コアを、chol-MTX及びPEGを含有する非対称脂質二重層でコーティングすることにより、NCP-2/MTXナノ粒子を調製した。モル比2:1又は1:1のオキサリプラチン：ミトキサントロンを含む粒子を調製して、キャラクタリゼーションを行った。1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DOPC）、コレステロール、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N- [メトキシ（ポリエチレングリコール）-2000]（DSPE-PEG2k）、chol-PTX（オキサリプラチン類似体：ミトキサントロンのモル比が2:1及び1:1であって、DOPC：コレステロール：chol-PTX：-DSPE-PEG2kの比が 2:2:0.30:1又は2:2:0.60:1）、及びDOPAでキャップされたNCP-2のTHF溶液を、500μLの30％（v/v）エタノール/水に加え、50℃で1700rpmで1分間攪拌した。このナノ粒子懸濁液中のTHF及びエタノールを完全に蒸発させ、その後のインビトロ及びインビボ実験で使用した。粒径及び分布を動的光散乱(DLS)により決定した。表13を参照されたい。
Figure 0007090034000033
細胞株に対するインビトロ細胞傷害性
結腸直腸腺癌CT26及び結腸直腸癌腫MC38の2つの同系の癌細胞系に対して、NCP-2/MTXの細胞傷害性を評価した。NCP-2/MTXは、大幅に異なる溶解度要件を有する2つの化学療法剤と組み合わせることにより、これら薬物間の相乗効果により実質的な抗癌効果を引き起こした。まず、オキサリプラチンとミトキサントロンとの相乗効果を、遊離薬物の細胞傷害性について、単独で又は組み合わせて比較することにより、調べた。2つの薬物の併用指数（CI50）は、Ptの投与量が等しい場合に、モル比1:1のものよりモル比2:1のもののほうがはるかに有利であった。モル比1:1でオキサリプラチン類似体（NCP-2）又はオキサリプラチン類似体及びミトキサントロンを含むNCP製剤（NCP-2/MTX）は、遊離薬物と同様の細胞死滅効果を示した。表14を参照されたい。
Figure 0007090034000034
インビボ有効性
ネズミ結腸直腸腺癌CT26の結腸直腸マウスモデルを用いて、NCP-2/MTXのインビボ抗癌活性を評価した。5×106個のCT26細胞を右脇腹に注射し、全ての腫瘍の大きさが100～150mm3に達した後、7日目に処理を開始した。CT26腫瘍を有するマウスに、(1)PBS、（2）NCP-2/MTX（2:1）、又は（3）NCP-2/MTX（2:1）+75μgのPD-L1抗体を、等価オキサリプラチン類似体用量1mg/kg及びパクリタキセル用量0.58mg/kgで、4日毎に計6回腹腔内注射した。NCP-2/MTXによる一定の低用量化学療法剤の投与は、CT26マウスモデルにおける腫瘍増殖を有意に遅延させ、腫瘍成長阻害を維持するために免疫チェックポイント阻害療法との相乗作用を示した。図10を参照されたい。
ネズミ結腸直腸癌MC38の結腸直腸マウスモデルを用いて、NCP-2/MTXのインビボ抗癌活性を評価した。1×106個のMC38細胞を右脇腹に注射し、全ての腫瘍のサイズが50～70mm3に達した後、12日目に処理を開始した。MC38腫瘍を有するマウスに、(1)PBS、（2）NCP-2/MTX（2:1）、又は（3）NCP-2/MTX（2:1）+75μgのPD-L1抗体を、等価オキサリプラチン用量2mg/kg及びミトキサントロン用量1.16mg/kgで、4日毎に計5回腹腔内注射した。図11を参照されたい。
実施例１２
オキサリプラチン類似体とジヒドロアルテミシニン（DHA）とを組み合わせたナノスケール配位ポリマー(NCP)コア－シェルナノ粒子
NCP-2/DHAの調製とキャラクタリゼーション
オキサリプラチン－ビスホスホネート、Zn2+イオン、及びジオレオイル-sn-グリセロ-3-リン酸（DOPA）を含む裸のNCP-2を、シクロヘキサン中の0.3MのTritonX-100及び1.5Mのヘキサノールの混合物中で調製し、媒体にDOPAを出した。これにより、裸のNCP上に脂質層が形成され、他のリン脂質又は脂質含有薬物の取り込みを容易にする。次いで、この裸のNCP-2粒子を2倍量のEtOHと混合し、12000rpmで30分間遠心分離して溶媒を除去する。この粒子ペレットをさらに50％EtOH/シクロヘキサンで1回、50％EtOH/THFで2回洗浄して過剰量のDOPAを除去し、THFに再分散させた。最後に、この裸のNCP-2粒子を、200nmシリンジフィルターで濾過して、次段で使用した。このNCP-2粒子のZ平均直径は78.56±1.03nmであり、多分散指数(PDI)は0.147±0.01である。30％（v/v）のEtOH/H2Oに、DOPC、Chol、Chol-DHA、DSPE-PEG2K及び裸のNCP-2粒子の混合物を、激しく攪拌しながら添加することにより、NCP-2/DHAを処方した。THF及びEtOHを蒸発させ、この溶液を室温に冷却して、次段で使用した。オキサリプラチン/DHA = 1:2（モル比）を有するこの配合物において、このNCP-2/DHA粒子は数平均直径、Z平均直径、及び多分散指数(PDI)は、それぞれ51.90±1.06nm、80.74nm±0.79nm、及び0.152である。
大腸癌細胞株に対するインビトロ細胞毒性
2つの結腸癌細胞株CT26及びMC38に対するNCP-2/DHAの細胞傷害性を評価した。まず、オキサリプラチンとジヒドロアルテミシニン（DHA）との相乗効果を、遊離薬物の細胞傷害性について、単独で又は組み合わせて比較することにより、調べた。2つの薬物の併用指数（CI50）は、いくつかの薬物効果レベルにおいて1未満であり、2つの薬物間の相乗効果を示している。オキサリプラチン類似体（NCP-2）、DHA又はオキサリプラチン及びDHAを1:1のモル比で含むNCP配合物は、遊離薬物と同様の細胞死滅効果を示した。表15を参照されたい。
Figure 0007090034000035
インビトロ免疫原性細胞死
ジヒドロアルテミシニン（DHA）により誘発された免疫原性細胞死を、免疫蛍光及びフローサイトメトリーにより評価した。
免疫蛍光分析のために、6ウェルプレートにCT26及びMC38細胞を5×105細胞/ウェルで播種し、さらに24時間培養した。この培養培地を、10％FBSを含有する2mLの新鮮培地で置換した。細胞にジヒドロアルテミシニン（DHA）を1μMの用量で添加した。対照としてリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）と共にインキュベートした細胞を用いた。24時間のインキュベーションの後、細胞をPBSで3回洗浄し、4％パラホルムアルデヒドで固定し、AlexaFluor 488-カルレティキュリン（CRT）抗体と共に2時間インキュベートし、DAPIで染色し、405nm及び488nmのレーザーを用いた共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)で、核を可視化し、細胞膜上のCRT発現を観察した。
フローサイトメトリー分析のために、6ウェルプレートにCT26及びMC38細胞を1×106細胞/ウェルで播種し、さらに24時間培養した。培養培地を、10％FBSを含有する2mLの新鮮培地で置換した。細胞にジヒドロアルテミシニン（DHA）を1μMの用量で添加した。対照としてリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）と共にインキュベートした細胞を用いた。24時間のインキュベーション後、細胞を回収し、A6lexaFluor 488-CRT抗体とともに2時間インキュベートし、ヨウ化プロピジウム（PI）で染色した。これらのサンプルを、フローサイトメーター(LSRII Orange, BD, USA)で分析し、細胞表面のCRTを同定した。染色した細胞の蛍光強度をPI陰性細胞についてゲーティングを行った。
フローサイトメトリー及び共焦点画像の両方とも、DHAが有意な免疫原性細胞死を引き起こしたことを示した。図12A及び12Bを参照されたい。
インビボ有効性
ネズミ結腸直腸腺癌CT26の結腸直腸マウスモデルを用いて、NCP-2/DHAのインビボ抗癌活性を評価した。5×106個のCT26細胞を右脇腹に注射し、全ての腫瘍の大きさが100～150mm3に達した後、7日目に処理を開始した。CT26を有するマウスに、オキサリプラチン類似体用量2mg/kgでNCP-2/DHAを腹腔内注射した。NCP-2/DHA粒子は、CT26腫瘍モデルの増殖を阻害した。図13を参照されたい。
実施例１３
オキサリプラチンとジヒドロアルテミシニン（DHA）とを組み合わせたナノスケール配位ポリマー(NCP)コア－シェルナノ粒子
ホスホコリン結合DHA（PC-DHA）の合成
氷浴上で、5mLの無水トルエン及び0.2mLのトリエチルアミン中のDHA-SS-OH（200mg、0.43mmol、1当量）の溶液に、エチレングリコールクロロホスフェート（80mg、0.56mmol、1.3当量）の溶液を攪拌しながら滴下して加えた。得られた溶液を室温まで温め、さらに2時間撹拌し、次いで真空下で乾燥させた。その生成物を2mLの無水THFにより圧力管に移し、ドライアイス－アセトン浴で冷却した。この溶液に無水トリメチルアミン0.5mLを添加し、圧力管を密閉し、70℃で24時間加熱した。真空下で溶媒を除去した後、DCM/メタノール（5:1、v/v）を用いたジオールシリカでのカラムクロマトグラフィー精製により生成物を50％収率（137mg）で得た。1H-NMR (500MHz, CDCl3): 0.93 (d, 3H), 0.98 (d, 3H), 1.25-1.55 (m, 6H), 1.62-1.95 (m, 6H),2.07 (m, 1H), 2.38 (td, 1H), 2.65 (m, 1H), 2.93 (m, 4H), 3.45 (s, 9H), 3.73 (m, 1H), 3.95 (m, 2H), 4.15 (m, 1H), 4.20 (m, 2H), 4.45 (m, 2H), 4.85 (s, 1H), 5.32 (s, 1H), 5.44 (s, 1H). ESI-MS: m/z=630.2 ([M+H]+).
オレイン酸結合DHA（OA-DHA）の合成
氷浴上で、無水ジクロロメタン（DCM、4ml）中のDHA-SS-OH（500mg、1.07mmol、1当量）及び4-N、N-ジメチルアミノピリジン（DMAP、160mg、1.2mmol、1.1当量）に、無水DCM（1mL）中のトリホスゲン（110mg、0.36mmol、0.33当量）の溶液を撹拌しながら滴下した。得られた溶液を室温まで温め、さらに0.5時間撹拌し、次いで、
氷浴上で、これを、無水DCM（2mL）、無水DMF（3mL）及びトリエチルアミン（0.2mL）の混合物中のOleyl-lyso-PC（500mg、0.96mmol、0.9当量）の溶液に加えた。次いで、この反応混合物を室温まで温め、12時間撹拌した。溶媒を除去した後、残渣をDCM/タノール（10:1、v/v）を用いるジオールシリカのカラムクロマトグラフィーにより精製して、215mgのオレイル-PC-S-S-DHAを得た。1H-NMR (500MHz, CDCl3): 0.90 (t, 3H), 0.93 (d, 3H), 0.98 (d, 3H), 1.20-1.33 (m, 22H), 1.45-1.70 (m, 9H), 1.75-1.95 (m, 4H), 2.03 (m, 4H), 2.36 (m, 3H), 2.66 (m, 1H), 2.97 (m, 4H), 3.46 (s, 9H), 3.50 (d, 1H), 3.73 (m, 1H), 4.10 (m, 3H), 4.27 (m, 3H), 4.39 (dd, 1H), 4.44 (t, 2H), 4.65 (s, 2H), 4.85 (d, 1H), 5.11 (t, 1H), 5.37 (m, 1H), 5.46 (s, 1H). ESI-MS: m/z=1012.5 ([M+H]+).
調製とキャラクタリゼーション
オキサリプラチンプロドラッグを有するNCP-3粒子を調製した。簡単に説明すると、
Zn(NO3)2とオキサリプラチン類似体プロドラッグ（Pt(dach)（シュウ酸塩）Cl2(OH)2 (式中、dachはR, R-ジアミノシクロヘキサンを表す。）との混合物を、室温で1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-リン酸ナトリウム塩（DOPA）と共に、Triton X-100/1-ヘキサノール/シクロヘキサン/水の逆マイクロエマルジョン中で30分間激しく撹拌して、球状DOPA被覆NCP -3粒子を得た。動的光散乱(DLS)によるこのNCP-3粒子のZ平均は60.53±0.69nm であり、誘導結合プラズマ質量分析法（ICP-MS）により測定したこのNCP-3粒子のオキサリプラチン積載量は28.2重量％であった。
この裸のNCP-3粒子は、使用する前に、200nmのシリンジフィルターによりさらに濾過される。30％（v/v）のEtOH/H2Oに、DSPC、Chol、DHA結合体、DSPE-PEG2K及び裸のNCP-3粒子の混合物を、激しく攪拌しながら添加することにより、NCP-3/DHAを処方した。THF及びEtOHを蒸発させ、この溶液を室温に冷却して、次段で使用した。この配合物はオキサリプラチン/DHA = 1:2（モル比）を有する。多分散指数(PDI) 0.156を有する小さいサイズの粒子（92.94nm±0.30）が観察された。このNCP-3/DHAは今後、NCP-3/chol-S-S-DHAとして参照される。NCP-3/DHA-OA-DHAは、chol-S-S-DHAとOA-DHA結合体の1：1混合物を指す。この粒子のキャラクタリゼーションを表16に示す。
Figure 0007090034000036
大腸癌細胞株に対するインビトロ細胞毒性
2つの結腸癌細胞株CT26及びMC38に対するNCP-3/DHAの細胞傷害性を評価した。ジヒドロアルテミシニン（DHA）、chol-S-S-DHA、OA-DHA、及びPC-DHAは、かなり近似のIC50値を示した。まず、オキサリプラチンとジヒドロアルテミシニン（DHA）との相乗効果を、遊離薬物の細胞傷害性を単独で又は組み合わせて比較することにより調べた。オキサリプラチン含有NCP（NCP-3）、DHA又はオキサリプラチン及びDHAをモル比1:1で含むNCP配合物は、これらの遊離薬物と同様の細胞死滅効果を示した。表17及び図14, 15を参照されたい。
Figure 0007090034000037
アポトーシス
まず、24ウェルプレートに1×105細胞/ウェルで播種したCT26細胞を、NCP-3/DHA又は適当な対照と共に24時間、10μMのオキサリプラチン濃度でインキュベートした。浮遊細胞及び接着細胞を回収し、Alexa Fluor 488 AnnexinV/死細胞アポトーシスキット（Invitrogen、USA）で製造元の指示に従って染色した。このアポトーシス及びネクローシスをフローサイトメトリー(LSRII Blue, BD, Franklin Lakes, New Jersey, USA)により調べた。個々のオキサリプラチンとジヒドロアルテミシニン（DHA）の両方ともネクローシスを引き起こしたが、併用療法は高レベルのアポトーシスを誘発した。図16を参照されたい。
インビトロ免疫原性細胞死
NCP-3/DHAにより誘発された免疫原性細胞死を、フローサイトメトリー及びELISAにより評価した。
フローサイトメトリー分析のために、6ウェルプレートにCT26細胞を1×106細胞/ウェルで播種し、さらに24時間培養した。培養培地を、10％FBSを含有する2mLの新鮮培地で置換した。細胞に、それぞれ10μM及び20μMの等価オキサリプラチン及び/又はDHA用量で、オキサリプラチン、ジヒドロアルテミシニン（DHA）、chol-DHA、オキサリプラチン+DHA、NCP-3、Zn/DHA及びNCP-3/DHAを添加した。対照としてリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）と共にインキュベートした細胞を用いた。24時間のインキュベーション後、細胞を回収し、A6lexaFluor 488-CRT抗体とともに2時間インキュベートし、ヨウ化プロピジウム（PI）で染色した。これらのサンプルを、フローサイトメーター(LSRII Orange, BD, Franklin Lakes, New Jersey, USA)で分析し、細胞表面のCRTを同定した。染色した細胞の蛍光強度をPI陰性細胞についてゲーティングを行った。オキサリプラチン及びジヒドロアルテミシニン（DHA）は両方とも、細胞表面CRT発現を引き起こし、NCP-3/DHAで処理した細胞におけるCRT曝露は、Zn/DHAの処理と比較して僅かに多かった。
ICD後の高移動度群ボックス-1（HMGB-1）タンパク質の放出をELISAにより評価した。CT26細胞を、6ウェルプレートにウェルあたり1×106細胞で播種し、さらに24時間培養した。この培養培地を、10％FBSを含有する2mLの新鮮培地で置換した。細胞に、それぞれ10μM及び20μMの等価オキサリプラチン及び/又はDHA用量で、オキサリプラチン、ジヒドロアルテミシニン（DHA）、chol-DHA、オキサリプラチン+DHA、NCP-3、Zn/DHA、NCP-3/DHA及びNCP-3/OA-DHAを添加した。対照としてリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）でインキュベートした細胞を用いた。48時間のインキュベーション後、上清を回収し、マイクロプレートリーダーによりELISAキット(Chondrex, Inc., Redmond, Washington, USA)により分析した。オキサリプラチンとDHAの両方ともICDにより引き起こされたHMGB-1放出をもたらし、Zn/DHAで処理した細胞は顕著な放出を示した。図17を参照されたい。
薬物動態
NCP-3/DHAのpK試験をSD/CDラットで行った。オキサリプラチン分布を誘導結合プラズマ質量分析（ICP-MS）により定量し、血中のchol-DHA濃度をTHF抽出後に液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）により定量した。時間に対するオキサリプラチン及びchol-DHAの血液中の濃度は、1-コンパートメントモデルに適合した。オキサリプラチン及びchol-DHAの血液循環半減期は、それぞれ11.8±0.6時間及び13.3±1.2時間であり、統計的に有意な差は認められなかった。図18A及び図18Bを参照されたい。NCP-3/OA-DHAに適合した1-コンパートメントモデルは、オキサリプラチンについて18.1±3.1時間の血液循環半減期を示した。
生体分布
NCP-3/DHAの予備生体内分布試験をCT26腫瘍を有するBALB/cマウスで行った。図19を参照されたい。オキサリプラチン分布を誘導結合プラズマ質量分析（ICP-MS）により定量した。単核食細胞系（MPS）によるNCP-3/DHAの取り込みは低く、これは 肝臓（<2.7±0.3％）、脾臓（<7.6±2.2％）、及び腎臓（<3.0±1.0％）における低％ID/g（組織1g当たりの注入用量％）によって証明される。
毒性
腹腔内（i.p.）注射によるNCP-3/DHAの毒性試験を、BALB/c及びC57BL/6マウスに対して行った。50及び60mgのオキサリプラチン/ kgのNCP-3/DHAの単回用量の注射は、BALB/c及びC57BL/6マウスにおいてそれぞれ最小の体重減少を示した。C57BL/6マウスへの1週間に1回の60mgオキサリプラチン/kgのNCP-3/DHAの反復投与は、マウスが顕著な毒性を示さずに少なくとも4回の反復投与に耐えることができることを示した。C57BL/6マウスにオキサリプラチン24mg/kgのNCP-3/OA-DHAを3日に1回合計8回腹腔内注射したところ、体重減少及び毒性は最小限であった。
インビボ有効性
ネズミ結腸直腸腺癌CT26及びMC38の2つの結腸直腸マウスモデルを用いて、NCP-3/DHAのインビボ抗癌活性を評価した。1×106個のCT26又はMC38細胞を右脇腹に注射し、全ての腫瘍が80～100mm3の大きさに達した後、12日目に処理を開始した。CT26又はMC38腫瘍保有マウスを、NCP-3/DHA及び適切な対照を腹腔内注射した。NCP-3/DHA粒子は、CT26及びMC38腫瘍モデルの両方の増殖を阻害した。図20A及び図20Bを参照されたい。免疫チェックポイント阻害療法と組み合わせて、NCP-3/DHAは、8mg/kgのオキサリプラチン用量でCT26腫瘍モデルを有する全てのマウスを効果的に根絶することができた。16mg/kgのオキサリプラチン用量でNCP-3/DHAで処理したMC38担癌マウスは、最大60％の腫瘍撲滅を示した。8mg/kgの等価オキサリプラチン用量のNCP-3/DHAもまた、LL/2腫瘍を有するマウスで腫瘍増殖阻害を引き起こすことができた。
ELISPOTによる免疫アッセイ
最初の処理後12日目に、脾臓を回収し、単細胞懸濁液に粉砕した。この脾細胞をACK溶解緩衝液で処理し、次いで、酵素結合ImmunoSpot (ELISPOT, eBioscience, San Diego, California, USA)で分析した。化学療法及び免疫療法の単独では、腫瘍特異的T細胞は増加したが、NCP-3/DHA及びNCP-3/DHA+PD-L1は腫瘍特異的免疫応答の最大の増加を示した。図21を参照されたい。
他の癌に対する抗癌活性
免疫療法と組み合わせたNCP-3/DHAのインビボ有効性を評価するために、更にトリプルネガティブ乳癌4T1及び非小細胞肺癌LL/2腫瘍モデルを使用した。図22A及び22Bを参照されたい。全ての腫瘍が80～100mm3の大きさに達した後、2×104個の4T1細胞又は1.5×106個のLL/2細胞を右脇腹に注射し、それぞれ10日目又は12日目に処理を開始した。マウスに、8mg/kgの等価オキサリプラチン用量で腹腔内注射した。反復投与量のNCP-3/DHAは、4T1及びLL/2腫瘍モデルの両方の腫瘍増殖を有意に阻害した。等価のオキサリプラチン及びDHA用量でのNCP-3/OA-DHAもまた、LL/2腫瘍を有するマウスで腫瘍増殖阻害を引き起こすことができた。
実施例１４
オキサリプラチン類似体及びIDO阻害剤NLG919を組み合わせたナノスケール配位ポリマー(NCP)コア－シェルナノ粒子
コレステロール結合NLG919（Chol-NLG919）の化学合成
まず、室温でDCM中でコレステロール（1当量）、トリホスゲン（0.35当量）、及び4-N、N-ジメチルアミノピリジン（DMAP、4当量）を20分間攪拌しながら混合することにより、コレステロール中の水酸基を塩化アシルに変換した。次いで、得られたChol-COCl（1当量）をDCM中のOH-SS-OH（2当量）中に滴下し、その反応混合物を一晩撹拌してChol-SS-OHを生成し、これをこれを酢酸エチル/ヘキサン（1:2、v/v）を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製した。次いで、DCM中のトリホスゲン（0.35当量）及びDMAP（4当量）と20分間反応させることによりChol-SS-OH（1当量）中の水酸基部分をさらに塩化アシルに変換し、Chol-SS-COClを得た。次いで、この混合物をDCM中のNLG919（1.7当量）中に滴下して、Chol-NLG919を生成させ、続いてこれをメタノール/DCM（3:97、v/v）を用いたカラムクロマトグラフィーにかけた。収率は62.2％であった。Chol-NLG919は、1H-NMR、13C-NMR及びエレクトロスプレーイオン化MS(ESI-MS)によって確認した。活性NLG919は、GSH及び/又はシステインによる細胞内のジスルフィド結合の切断後に容易に放出されるであろう。
NCP-2/Chol-NLG919のキャラクタリゼーション
シスプラチン－ビスホスホネート、Zn2+イオン及びジオレオイル-sn-グリセロ-3-リン酸（DOPA）を含む裸のNCP-2は、シクロヘキサン中の0.3MのTritonX-100及び1.5Mのヘキサノールの混合物中で調製され、DOPAはこの溶媒中に出る。これにより、裸のNCP上に脂質層が形成され、他のリン脂質又は脂質含有薬物の取り込みを容易にする。次いで、この裸のNCP-1粒子を2倍量のEtOHと混合し、12000rpmで30分間遠心分離して溶媒を除去する。この粒子ペレットをさらに50％EtOH /シクロヘキサンで1回、50％EtOH/THFで2回洗浄して過剰量のDOPAを除去し、THFに再分散させる。最後に、裸のNCP-2粒子を、更に200nmシリンジフィルターで濾過して、次で使用する。30％（v/v）EtOH/H2Oに、DOPC（0.5mg）、Chol（0.25mg）及びChol- NLG919（62μg）、DSPE-PEG2K（20mol％）（0.9mg）及び裸のNCP-2粒子(0.25mg)の混合物を，激しく攪拌しながら添加することにより、NCP-1/Chol- NLG919粒子を得た。THF及びEtOHを蒸発させ、溶液を室温に冷却して、次で使用した。
この配合物において、オキサリプラチン/NLG919のモル比は2.18:1、薬物積載量はNLG919（1.02％、282.17g/mol、Chol-NLG919について3.16％）；オキサリプラチン（3.13％、397.3g/mol）であった。多分散指数(PDI)が0.152でほぼ中性の電荷（-2.1mV）を有する小サイズの粒子（85.2nm±0.8）が観察された。さらに、このNCP-2/Chol-NLG919粒子は、PBS及びPBS含有10％FBS溶液の両方において14日間、顕著なサイズ、多分散指数(PDI)及びゼータ電位に変化がなく、安定であった。この配合物の増強された安定性は、コア内部の強い配位結合及びコレステロールとリン脂質との間の疎水性相互作用に起因するようである。
実施例１５
シスプラチン、カンプトテシン、エトポシド、及びパクリタキセルを組み合わせたナノスケール配位ポリマー(NCP)コア－シェルナノ粒子
オレイン酸結合カンプトテシン（OA-CPT）の合成
OA-CPTは以下のようにして合成した。まず、オレイン酸（OA、1当量）をDCM中でOH-SS-OH（2当量）と一晩反応させて、OA-SS-OHを生成し、これを酢酸エチル/ヘキサン（2:3、v/v）で精製した。これと並行して、室温でDCM中でCPT（1当量）、トリホスゲン（0.35当量）及びDMAP（4当量）を20分間攪拌して、CPT中の水酸基を塩化アシルに変換した。次いで、得られたCPT-COCl（1当量）をDCM中のOA-S-S-OH（2当量）に滴下し、その反応混合物を一晩撹拌してOA-CPTを得た。OA-CPTの構造を以下のスキーム10に示す。メタノール/ DCM（3:97、v/v）を用いたカラムクロマトグラフィーにより、OA-CPTを精製した。収率は65％であった。OA-CPTは、1H-NMR、13C-NMR及びエレクトロスプレーイオン化MS(ESI-MS)によって確認した。活性CPTは、GSH及び/又はシステインによる細胞内のジスルフィド結合の切断後に容易に放出されるであろう。
Figure 0007090034000038
 スキーム10：OA-CPTの構造
NCP-1/OA-CPT/Chol-PTX、NCP-1/OA-CPT/Chol-ET、及びNCP-1/OA-CPT/Chol-ET/Chol-PTXのキャラクタリゼーション
シスプラチン－ビスホスホネート、Zn2+イオン及びジオレオイル-sn-グリセロ-3-リン酸（DOPA）を含む裸のNCP-2は、シクロヘキサン中の0.3MのTritonX-100及び1.5Mのヘキサノールの混合物中で調製され、DOPAはこの溶媒中に出る。これにより、裸のNCP上に脂質層が形成され、他のリン脂質又は脂質含有薬物の取り込みを容易にする。次いで、この裸のNCP-1粒子を2倍量のEtOHと混合し、12000rpmで30分間遠心分離して溶媒を除去する。この粒子ペレットをさらに50％EtOH /シクロヘキサンで1回、50％EtOH/THFで2回洗浄して過剰量のDOPAを除去し、THFに再分散させる。最後に、裸のNCP-2粒子を、更に200nmシリンジフィルターで濾過して、次で使用する。30％（v/v）EtOH/H2Oに、DOPC（0.5mg）、Chol（0.25mg）、OA-CPT（57.2μg）及びChol-PTX（106.2μg）、DSPE-PEG2K（20mol％）（0.9mg）及び裸のNCP-1粒子(0.25mg)の混合物を，激しく攪拌しながら添加することにより、NCP-1/OA-CPT/Chol-PTX粒子を得た。THF及びEtOHを蒸発させ、溶液を室温に冷却して、次で使用した。
この粒子は、サイズが71.2±0.6nm 、多分散指数(PDI)が0.113、及びPBS中でゼータ電位が0.15mVであることが判明した。この配合物において、シスプラチン積載量は3.38％、CPT積載量は1.25％、OA-CPT積載量は2.86％、ET積載量は2.14％及びChol-ET積載量は5.49％、PTX積載量は3.13％、Chol-PTXについては5.31％であった。TEMにより球形及び単分散ナノ粒子が確認された。このNCP-1/OA-CPT/Chol-PTXは、PBS及びPBS含有10％FBS溶液の両方において10日間安定であり、有意なサイズ、多分散指数(PDI)及びゼータ電位の変化はなかった。
30％（v/v）EtOH/H2Oに、DOPC（0.5mg）、Chol（0.25mg）、OA-CPT（57.2μg）及びChol-ET（109.8μg）、DSPE-PEG2K（20mol％）（0.9mg）及び裸のNCP-1粒子（0.25mg）の混合物を激しく攪拌しなが添加することにより、NCP-1/OA-CPT/Chol-ETを得た。THF及びEtOHを蒸発させ、溶液を室温に冷却して、次で使用した。この配合物では、シスプラチン積載量は3.38％、CPT積載量は1.25％、OA-CPT積載量は2.86％、ET積載量は2.14％及びChol-ETは5.49％であった。この粒子は、サイズが56.4±0.7nm、多分散指数(PDI)が0.152、PBS中のゼータ電位が0.12mVであることが判明した。球形及び単分散ナノ粒子がTEMにおいて確認された。NCP-1/OA-CPT/Chol-ETは、PBS及びPBS含有10％FBS溶液の両方で10日間安定であり、有意なサイズ、多分散指数(PDI)及びゼータ電位の変化はなかった。
30％（v/v）EtOH/H2Oに、DOPC（0.5mg）、Chol（0.25mg）、OA-CPT（57.2μg）、Chol-ET（109.8μg）、Chol-PTX（106.2μg）、DSPE-PEG2K（20mol％）（0.9mg）及び裸のNCP-1粒子（0.25mg）の混合物を激しく撹拌しながら添加して、NCP-1/OA-CPT/Chol-ET/Chol-PTXを得た。THF及びEtOHを蒸発させ、溶液を室温に冷却して、次で使用した。この配合物では、シスプラチン積載量は3.38％、CPT積載量は1.25％、OA-CPTでは2.86％、ET積載量は2.14％及びChol-ETは5.49％、PTX積載量は3.13％、Chol-PTXについては5.31％であった。この粒子は、サイズが64.2±0.9nm、多分散指数(PDI)が0.183、PBS中ゼータ電位が1.02mVであることが判明した。球形及び単分散ナノ粒子がTEMにおいて確認された。NCP-1/OA-CPT/Chol-ET/Chol-PTX粒子は、PBS及びPBS含有10％FBS溶液の両方で7日間安定であり、有意なサイズ、多分散指数(PDI)及びゼータ電位の変化はかった。NCPコア内部の強い配位結合及びChol及び/又はOAとリン脂質との間の相互作用により、配合物の安定性がもたらされた。
A549 NSCLC細胞におけるNCP-1/OA-CPT/Chol-ET/Chol-PTXの細胞毒性
A549細胞を96ウェルプレートに2000細胞/ウェルで播種し、24時間インキュベートした。その後、細胞をシスプラチン、エトポシド（ET）及びChol-ET、パクリタキセル（PTX）及びChol-PTX、カンプトテシン（CPT）及びOA-CPT、NCP-1、NCP-1/OA-CPT/Chol-PTX、NCP-1/OA-CPT/Chol-ET、及びNCP-1/OA-CPT/Chol-ET/Chol-PTXを様々な濃度で加、さらに72時間インキュベートした。次いで、細胞生存率を、マイクロプレートリーダーによるMTSアッセイにより決定した。図23A及び23Bに示されるように、Chol-ET、Chol-PTX及びOA-CPTは、A549細胞において遊離ET、PTX及びCPTと同様の細胞傷害性を示した。これは、活性ET、PTX及びCPTが、脂質結合プロドラッグから容易に遊離され得ることを示唆している。シスプラチン、OA-CPT及びChol-ETの組み合わせは、そのCI50が0.73であることで証明されるように、有意な相乗効果をもたらした。同様に、CP-1/OA-CPT/Chol-ET/Chol-PTXは、そのCI50は0.41であり、強力な相乗効果が得られた。しかし、最高の相乗効果は、シスプラチン、OA-CPT、Chol-ET及びChol-PTXを組み合わせて単一のナノ粒子配合物とすることにより達成された（CI50 = 0.28）。これらのデータは、ジスルフィド結合を含むリンカーを用いて抗癌剤を脂質（Chol又はOA）と結合させることを含むプロドラッグ戦略が、活性が親薬物と同程度のままであるプロドラッグをもたらすことを明確に示している。
実施例１６
強力な抗腫瘍免疫を引き出すための化学療法と光線力学療法を組み合わせたナノスケール配位ポリマー(NCP)コア－シェルナノ粒子
米国では毎年約15万人の患者が結腸直腸癌と診断され、その3分の1が転移性疾患で死亡する。局在化した結腸直腸癌の5年生存率は約89％であるが、肝臓、肺、又は腹膜に転移した癌では約12％にしかすぎない。進行した結腸直腸癌に対する有効な治療法は、初期段階では検出され得ない原発腫瘍及び転移性腫瘍の両方の治療を必要とする。多くの研究により、宿主免疫系の刺激が、転移性腫瘍増殖を制御することができる抗腫瘍免疫応答の生成をもたらし得ることが示されている。進行結腸直腸癌患者の結腸直腸癌の転移性が高いこと及び5年生存率が低いことを考慮すると、原発性腫瘍増殖を制御し、転移性疾患及びその後の腫瘍増殖を制御するための抗腫瘍免疫を刺激する、結腸直腸癌の有効な治療法の開発に明確な臨床的関心がもたれている。
ナノスケール配位ポリマー（NCP）は、自己集合を介して金属連結点及び有機架橋配位子から構築された複合ナノ材料を含むことができる。NCPは、組成及び構造の高い同調性、1つのナノプラットフォームに複数の治療剤又は理学療法を組み合わせる多用途性、及び不安定な金属－有機配位子結合による固有の生分解性、のような生物医学的用途における既存のナノキャリアよりもいくつかの利点を有する。近年、化学療法と光線力学療法（PDT）との組み合わせとして、シスプラチンと光増感剤ピロリピドを高い有効積載量で担持するNCPベースのコア－シェルナノ粒子（NCP@Pyrolipid）が開示されている。このNCP@Pyrolipidは、シスプラチン耐性ヒト頭頸部癌SQ20B異種移植マウスモデルにおいて、腫瘍退縮に対して優れた効力及び有効性を示した。光線力学療法（PDT）は、米国食品医薬品局(FDA)で承認された抗癌理学療法であり、抗腫瘍免疫を増強することが示されている。Kroemerとその共同研究者らは、マウス結腸直腸癌モデルにおいて、免疫原性細胞死がオキサリプラチンにより誘発されたことを実証した。最近の研究はまた、残存癌細胞に引き起された免疫応答が、微小転移巣及び癌幹細胞の完全な根絶に寄与し得ることを示した。したがって、光線力学療法及びオキサリプラチンの両方により引き起こされる有効なアポトーシス/ネクローシスと共に、オキサリプラチン及び光線力学療法の併用療法は特に有効であり、腫瘍細胞を殺し、腫瘍細胞に対する免疫応答を刺激することを同時に引き起こすことができる。これは、原発腫瘍部位だけでなく、遠隔転移腫瘍においても、腫瘍阻害/退縮を引き起こすことができる。
ここでは、結腸直腸癌における優れた抗癌効果を達成するための、オキサリプラチンと光増感剤ピロリピドとを担持するNCPベースのコア－シェルナノ粒子（NCP-2@Pyrolipid）が示され、これは転移性結腸直腸癌の治療に使用することができる。NCP-2@Pyrolipidは、高薬物積載、静脈注射による長期にわたる全身循環、及び理想的な生体適合性を含むNCPベースのナノ粒子の利点を引き継いで、オキサリプラチンと光線力学療法（PDT）の2つの治療法を組み合わせる。これらは癌細胞を殺すだけでなく、転移性腫瘍結節の制御及び根絶のための免疫原性応答を引き起こす。同系のCT26ネズミ結腸直腸癌モデル及びHT29ヒト結腸直腸癌異種移植片を含む2つの結腸直腸癌モデルに対して、NCP-2@Pyrolipidによる効果的な抗癌治療を実証する。細胞表面へのカルレティキュリン（CRT）の早期曝露、効果的な抗腫瘍ワクチン接種及びアブスコパル効果（照射部位と離れた別の病巣も同時に縮小する現象）などのNCP-2@Pyrolipidによって誘発される効率的な抗腫瘍免疫も実証される。
調製とキャラクタリゼーション
先の報告と同様にして、オキサリプラチン類似体プロドラッグを担持するNCP-2粒子を調製した。簡単に述べると、Zn(NO3)2とオキサリプラチンプロドラッグ（Pt(dach)Cl2(OH)2 (式中、dachはR, R-ジアミノシクロヘキサンを表す。）との混合物を、室温で1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-リン酸ナトリウム塩（DOPA）と共に、Triton X-100/1-ヘキサノール/シクロヘキサン/水の逆マイクロエマルジョン中で30分間激しく撹拌して、球状DOPA被覆NCP -2粒子を得た。動的光散乱(DLS)によるこのNCP-2粒子のZ平均は55.33±0.18nmであり、誘導結合プラズマ質量分析法（ICP-MS）により測定したこのNCP-2粒子のオキサリプラチン類似体積載量は27.6重量％であった。
NCP-2粒子のコアにピロリピド及びPEGを含有する非対称脂質二重層をコーティングすることにより、NCP-2@Pyrolipidナノ粒子を調製した。ピロリピド、コレステロール、1,2-ジステアリル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DSPC）、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N- [メトキシ（ポリエチレングリコール）-2000]（DSPE-PEG2k）(DSPC：コレステロール：ピロリピド：DSPE-PEG2kの比が 2:2:0.8:1）、及びDOPAでキャップされたNCP-2のTHF溶液(80μL)を、500μLの30％（v/v）エタノール/水に加え、60℃で1700rpmで1分間攪拌した。このナノ粒子懸濁液中のTHF及びエタノールを完全に蒸発させ、その後のインビトロ及びインビボ実験で使用した。
NCP-2@Pyrolipidは、固体コアとしてオキサリプラチン類似体を担持し、シェルとして自己集合した対称脂質二重層を有する、DOPAでキャップされた配位ポリマーNCP-2を有するコア－シェルナノ構造である。このNCP-2コアは、Zn2+とオキサリプラチン類似体プロドラッグのリン酸基との間の配位から構築され、これはさらに、NCPとDOPA分子との間のZn-リン酸相互作用及びDOPA分子間の疎水性－疎水性相互作用により、DOPAの単層でキャップされている。この脂質コアは、光線力学療法の光増感剤としてピロリピドを含み、全身注射後の単核食細胞系（MPS）摂取を最小限に抑え、血液循環を延長させるために、20モル％のPEGコーティングを含む。このコア－シェル構造のNCP-2@Pyrolipidは、化学療法及び光線力学療法により誘発される効率的な癌細胞の死滅作用と、原発性及び転移性の両方の結腸直腸癌に有効な治療を可能にするためのオキサリプラチン類似体及び光線力学療法により誘発される抗腫瘍免疫の利点を持つことができる。
NCP-2@Pyrolipidの透過型電子顕微鏡(TEM)像は、均一で球形のナノ粒子の形成を示した。動的光散乱(DLS)測定により、PBS中のNCP-2@Pyrolipid分散物のZ平均直径、数平均直径、多分散指数(PDI)、及びゼータ電位は、それぞれ83.00±0.98nm、51.19±0.11nm、0.143±0.011及び-3.67±0.85mVであった。NCP-2@Pyrolipidのサイズが小さいこと及び表面電荷が中性付近であることは、それのインビボ適用の可能性を示唆している。
NCP-2ピロリピドの脂質二重層は、THF中に分散された場合、溶解し、ピロリピドは、約400nmの広いソレットバンド及び669nmの明瞭なQバンドを示す。
Zheng及び共同研究者により報告された手順に従ってポルフィゾームを調製した。先に報告したように、ピロリピドは高積載で高度に配向した非対称脂質二重層に取り込まれることができる。この脂質二重層が無傷の場合、励起状態のピロリピドは高度に消光され、三重項酸素へのエネルギー移動は観察されず、このことは、一重項酸素センサー緑（SOSG）試薬により決定される1O2発生が少量であることにより証明された。NCP-2@Pyrolipid 及びポルフィゾームにTriton X-100を添加して脂質二重層を破壊した後には、ピロリピドはその蛍光を回復し、SOSGによる同様量の1O2を効率的に生成した。
細胞取り込み
インキュベーション時間を1～24時間として、CT26細胞におけるNCP-2@Pyrolipidの取り込みの時間依存性を評価した。遊離オキサリプラチン、ポルフィゾーム、及びシスプラチンプロドラッグを担持し1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DOPC）で被覆されたオリジナルのNCP-2、コレステロール、及びDSPE-PEG2kを比較した。NCP粒子、オキサリプラチン、又はポルフィゾームと共にインキュベートした後の細胞中のPt及びピロリピド濃度を、それぞれ誘導結合プラズマ質量分析（ICP-MS）及び蛍光測定法により測定した。図24A及び24Bに示されるように、オキサリプラチン類似体及びピロリピドの両方に関してNCP-2@Pyrolipidの細胞取り込みは迅速であり、大部分は1時間以内に完了する。これは、24時間までの時間にわたってオキサリプラチン類似体及びピロリピドの取り込み量が一定であることによって証明される。細胞摂取量が時間と共に著しく低下した遊離オキサリプラチンを除いて、オキサリプラチン類似体及びピロリピドの細胞取り込みは、24時間の実験を通して安定しており、これは、いずれかの理論に拘束されることを望むものではないが、NCP-2@Pyrolipidの内部移行が、細胞膜の動態、多孔性及び透過性を変化させて、オキサリプラチン類似体の流出を減少させることを示唆する。
インビトロの光線力学療法細胞毒性
マウス結腸直腸腺癌CT26及びヒト結腸直腸腺癌HT29細胞を含む2つの結腸直腸癌細胞に対するNCP-2@Pyrolipidの細胞傷害性を評価した。NCP-2@Pyrolipidは、オキサリプラチンの化学療法と光線力学療法を1つの単一ナノ粒子に組み合わせることにより、アポトーシス/ネクローシスを誘発し、LED光照射時に免疫原性細胞死を誘発する。表18に示されるように、遊離オキサリプラチン、NCP-2、及びNCP-2@PyrolipidのオキサリプラチンIC50は、両細胞系において有意差を示さない。これは、理論に縛られることなく、ピロリピドは、光による活性化なしでは、細胞毒性を引き起こさないことを示唆する。しかし、54J/cm2の光照射（670nm）すると、NCP-2@PyrolipidのオキサリプラチンIC50は、CT26細胞及びHT29細胞でそれぞれ約4倍及び約5倍減少した。ピロリピドIC50値も、それに応じて照射されたNCP-2@Pyrolipidについて有意に低下した。ポルフィゾームについては、試験されたピロリピド濃度範囲では、両方の細胞株において、光照射の有り無しで、毒性は観察されなかった。
Figure 0007090034000039
インビトロ光線力学療法誘発免疫原細胞死
カルレティキュリン（CRT）は、免疫原性細胞死（ICD）の細胞の表面に露出する明瞭なバイオマーカーである。NCP-2@Pyrolipidにより誘発された免疫原性細胞死を、免疫蛍光法及びフローサイトメトリーにより評価した。
免疫蛍光分析のために、6ウェルプレートにCT26細胞を5×105細胞/ウェルで播種し、さらに24時間培養した。この培養培地を、10％FBSを含有する2mLの新鮮培地で置換した。細胞にオキサリプラチン、NCP-2、NCP-2@Pyrolipid及びポルフィゾームをそれぞれ5μMのPt用量及び1.6μMのピロリピド用量で添加した。対照としてリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）と共にインキュベートした細胞を用いた。24時間のインキュベーションの後、細胞に100mW/cm2のLED光（670nm）を15分間照射した（90J/cm2）。4時間の更なるインキュベーション後、細胞をPBSで3回洗浄し、4％パラホルムアルデヒドで固定し、AlexaFluor 488-カルレティキュリン（CRT）抗体と共に2時間インキュベートし、DAPIで染色し、405nm及び488nmのレーザーを用いた共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)で、核を可視化し、細胞膜上のCRT発現を観察した。
フローサイトメトリー分析のために、6ウェルプレートにCT26細胞を1×106細胞/ウェルで播種し、さらに24時間培養した。培養培地を、10％FBSを含有する2mLの新鮮培地で置換した。細胞にオキサリプラチン、NCP-2、NCP-2@Pyrolipid及びポルフィゾームをそれぞれ5μMのPt用量及び1.6μMのピロリピド用量で添加した。対照としてリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）と共にインキュベートした細胞を用いた。24時間のインキュベーションの後、細胞に100mW/cm2のLED光（670nm）を15分間照射した（90J/cm2）。4時間の更なるインキュベーション後、4時間のインキュベーション後、細胞を回収し、A6lexaFluor 488-CRT抗体とともに2時間インキュベートし、ヨウ化プロピジウム（PI）で染色した。これらのサンプルを、フローサイトメーター(LSRII Orange, BD, Franklin Lakes, New Jersey, USA)で分析し、細胞表面のCRTを同定した。染色した細胞の蛍光強度をPI陰性細胞についてゲーティングを行った。
CT26ネズミ結腸直腸腺癌細胞を、光照射有り無しで、リン酸緩衝食塩水（PBS)、遊離オキサリプラチン、亜鉛（Zn）及びオキサリプラチン類似体を含むNCP（NCP-2）、ポルフィゾーム、又は脂質コーティング層中にピロリピドを含むNCP-2（NCP-2@Pyrolipid)で処理した。細胞上に発現するカルレティキュリン（CRT）をフローサイトメトリー分析で測定した。光照射なしでPBSで処理した細胞及びポルフィゾームは表面CRTを発現しなかったが、光照射有り又は無しで、オキサリプラチン、NCP-2及びNCP-2@Pyrolipidで処理した細胞と、光照射有りのポルフィゾームで処理した細胞は、細胞の表面に顕著な量のCRTが検出された。
この結果は、オキサリプラチンと光線力学療法の両方とも、免疫原性細胞死（ICD）を効果的に誘発することを示唆する。
薬物動態及び生体内分布
CT26腫瘍を有するBALB/cマウスにおいて、NCP-2@Pyrolipidの薬物動態（pK）及び生体分布の研究を行った。Pt分布は、誘導結合プラズマ質量分析（ICP-MS）により定量し、血中のピロリピド濃度は、以前に報告したように、メタノール抽出後、UV-vis分光法により定量した。図25A及び図25Bを参照されたい。時間に対する血液中のPt濃度及びピロリピド濃度の両方を1-コンパートメントモデルに適合させた。Ptとピロリピドの血液循環半減期は、それぞれ11.8±1.9時間、8.4±2.6時間であり、統計的に有意な差は認められなかった。NCP-2@Pyrolipidは、血液循環が長いことに加えて、単核食細胞系（MPS）による低い摂取を示し、肝臓（<7.1±2.5％）、脾臓（<10.4±4.3%）及び腎臓（<9.1±2.5％）において低％ID/g（1g組織当たりの注射された投与量％）であった。
インビボ光線力学療法の有効性及び免疫原性応答
ネズミ結腸直腸癌CT26を有するBALB/cマウス及びヒト結腸直腸癌HT29の皮下異種移植を有するヌードマウスの2つの結腸直腸腺癌マウスモデルを用いて、NCP-2@Pyrolipidのインビボ抗癌活性を評価した。すべての用量は、遊離オキサリプラチン又はピロリピド相当量である。CT26又はHT29腫瘍保有マウスに、オキサリプラチン類似体用量2mg/kgで（1）PBS、（2）NCP-2@Pyrolipidを、また、オキサリプラチン用量2mg/kgで（3）及び（4）NCP-2@Pyrolipidを4日ごとに、CT26モデルでは合計2回、HT29モデルでは4回、静脈内注射した。注射の24時間後、（1）～（3）群のマウスを2％（v/v）イソフルランで麻酔し、腫瘍に670nmのLEDを100mW/cm2の放射照度で30分間照射した。図26及び27に示すように、光照射と組み合わせたNCP-2@Pyrolipidは、CT26及びHT29皮下腫瘍マウスモデルの両方において効率的な腫瘍阻害をもたらした。
NCP-2@Pyrolipid及び光線力学療法の処理を受けたCT26腫瘍を有するマウスにおける免疫原性応答を評価するために、7, 8, 9及び10日目に血液を採取し、血清TNF-α、IFN-γ及びIL-6産生をELISA(R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA)により測定して、
この処理により誘発された免疫原性応答を評価した。NCP-2@Pyrolipid及び光線力学療法で処理したマウスの血清中のTNF-α、IFN-γ及びIL-6レベルは、有意に上昇し、処理により誘発された強い免疫原性応答を確認した。図28A～図28Cを参照されたい。いずれの理論にも拘束されることは望まないが、NCP-2（+）及びNCP-2@Pyrolipid（-）で処理したマウスにおける炎症誘発性サイトカイン産生レベルのわずかな増加は、オキサリプラチン類似体により誘発された免疫原性応答による可能性がある。
抗腫瘍予防接種
インビボのNCP-2@Pyrolipid及び光線力学療法により誘発された強力な免疫原性応答に影響されて、更に、NCP-2@Pyrolipidの抗腫瘍ワクチン接種能力を評価した。PBS又はNCP-2@Pyrolipidで処理し光照射した計5×105のCT26細胞を、6週齢雄BALB/cマウスの右脇腹領域に皮下接種した。1週間後、反対側の脇腹に1×105個のCT26細胞を注射した（再曝露）。これらのマウスについて、ノギスを用いて腫瘍の進展と体重の変化を毎日調べた。最初の腫瘍注射の1日後に血液を採取し、ELISA (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA)により血清TNF-α、IFN-γ及びIL-6産生を測定して、免疫原性応答を評価した。PBS群の右腫瘍サイズが2cm3を超えたとき、全てのマウスを殺処分した。図29A～29Cに示すように、NCP-2@Pyrolipid及び光線力学療法は、健康な腫瘍細胞の再曝露に対する抗腫瘍ワクチン接種において100％の成功を達成した。
NCP-2@Pyrolipidのアブスコパル効果
光照射したNCP-2@Pyrolipidのアブスコパル効果を、BALB/cマウスを有する皮下CT26腫瘍について評価した。CT26細胞懸濁液を右脇腹領域に皮下接種し（1マウスあたり2×106個の細胞）、同じマウスの左脇腹領域にCT26細胞懸濁液を皮下接種することにより（1マウスあたり4×105細胞）、腫瘍保有マウスを確立した。（1）リン酸緩衝食塩水(PBS)+光照射、（2）NCP-2@Pyrolipid+光照射、（3）NCP-1@Pyrolipid（シスプラチン及びピロリピドを担持するNCP）+光照射、（4）対照として光照射なしのNCP-2@Pyrolipidの４グループを比較した。右の腫瘍が約100mm3に達したとき、これらのナノスケール配位ポリマーを2mg/kgのオキサリプラチン類似体用量で腫瘍内注射した。注射の12時間後、マウスを2％（v/v）イソフルランで麻酔し、腫瘍にLED光を100mW/cm2で30分間照射した（180J/cm2）。これらのナノスケール配位ポリマーは3日ごとに合計2回注射した。LED光照射は6日連続して毎日行った。治療効果を評価するために、腫瘍増殖をモニターした。腫瘍の大きさを毎日デジタルキャリパーで測定した。腫瘍体積は次のように計算した：（幅2×長さ）/ 2。
NCP-2@Pyrolipidの局所注射に加えてLED光照射を行った場合、治療された右腫瘍の腫瘍退縮/根絶をもたらしただけでなく、遠隔左腫瘍の増殖をも阻害した。このことは、いずれかの理論に縛られることを望むものではないが、この併用療法が結腸直腸癌の免疫適合性マウスモデルにおいて免疫応答を首尾よく引き起こすことを示唆する。NCP-1@Pyrolipidによる治療は、右腫瘍を首尾よく抑制/根絶したが、左腫瘍の増殖に対しては限定された阻害しか示さなかった。図30A及び30Bを参照されたい。この結果は、オキサリプラチン類似体及び光線力学療法により誘発された複合免疫原性応答は、アブスコパル効果を誘発することを示す。
実施例１７
抗腫瘍免疫のための化学療法、光線力学療法及びPD-L1抗体を組み合わせたナノスケール配位ポリマー(NCP)コア－シェルナノ粒子
光活性化存在下のNCP-2@Pyrolipidの免疫療法効果をさらに高めるために、発明者らは、その治療計画に免疫チェックポイント阻害剤を加えた。NCP-2@Pyrolipidと光照射によるアブスコパル効果に、チェックポイント遮断PD-L1抗体を組み合わせて、皮下MC38腫瘍を生じているマウスについて評価した。C57BL/6マウスに対して、5×105個のMC38細胞をその右脇腹（原発腫瘍）に、そして1×105個のMC38細胞をその左脇腹（二次腫瘍）に皮下（s.c.）移植した。原発腫瘍が約100mm3に達したとき、マウスを無作為に5群（n = 6）に分けた。その５群とは、即ち、対照としての光照射ありのPBS；光照射なしのNCP@Pyrolipid；光照射ありのNCP @Pyrolipid；光照射なしのNCP@Pyrolipid+抗PD-L1；光照射ありのNCP@Pyrolipid+抗PD-L1である。マウスに、NCP @Pyrolipidを2mg/kgのオキサリプラチン類似体用量で、3日ごとに合計3回の腹腔内（i.p.）注射した。注射から24時間後、マウスに2％（v/v）イソフルランで麻酔をかけ、原発腫瘍に670nmのLEDを180mJ/cm2の光量で照射した（100mW/cm2）。照射後直ちに、マウスにPD-L1抗体を50μg/マウスの用量で腹腔内（i.p.）注射した。一次及び二次腫瘍サイズを、デジタルキャリパーで測定し、次のように計算した：（幅2×長さ）/ 2。
PD-L1抗体と組み合わせて全身に注射したNCP-2@Pyrolipid+ LED光照射は、治療した右腫瘍の腫瘍退縮/根絶につながっただけでなく、遠隔の左腫瘍の増殖をも抑制/根絶した。図31A及び31Bを参照されたい。いずれかの理論に拘束されることを望むものではないが、この併用療法は、原発性及び遠隔/転移性結腸直腸癌の両方の有効な治療のための強力な免疫応答を誘発することを示唆する。チェックポイント封鎖PD-L1抗体をこの治療に組み込むことにより、NCP-2@Pyrolipid＋光線力学療法のアブスコパル効果及び抗癌効力が有意に高められた。
結腸直腸癌CT26の別の両側同系マウスモデルでのNCP@ pyrolipid+光線力学療法と抗PD-L1との組み合わせによりもたらされるアブスコパル効果もまた研究された。原発腫瘍が約100mm3に達したとき、マウスに、2mg/kgのオキサリプラチン用量でNCP@Pyrolipidを、1日おきに計2回ip注射した。注射の24時間後に、原発腫瘍を180J/cm2の光量で照射した（670nm、100mW/cm2）。照射後直ちに、マウスに抗PD-L1を75μg/マウスの用量で腹腔内（i.p.）注射した。この併用療法は、2回の治療後に、原発腫瘍だけでなく、遠隔腫瘍の有効な腫瘍退縮を再び引き起こした。図32A及び図32Bを参照されたい。
実施例１８
抗腫瘍免疫のための光力学療法とPD-L1抗体とを組み合わせたZn-ピロリン酸コア－シェルナノ粒子
ピロリピド積載Zn-ピロリン酸粒子（Zn@Pyrolipid）の調製
500μLの30％（v/v）EtOH/H2Oに、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DSPC）、コレステロール、ピロリピド（モル比1：1：0.5）、DSPE-PEG2k（20mol％）及びZn-ピロリン酸粒子のTHF溶液80μLを加えて（60℃）、ピロリピド積載Zn-ピロリン酸粒子（Zn@Pyrolipid）を得た。THF及びEtOHを蒸発させ、溶液を室温に冷却して、次で使用した。粒径及び分布を動的光散乱(DLS)により決定した。表19を参照されたい。
Figure 0007090034000040
ピロリピド積載量
ピロリピド積載量を、UV-Vis分光光度計（UV-2401PC、株式会社島津製作所）を用いて定量した。脂質コーティングの後、Zn@Pyrolipidを13000rpmで30分間遠心分離した。Zn@Pyrolipidの沈殿物をテトラヒドロフラン（THF）に再分散させ、669nmにおけるUV-Vis吸収によりナノ粒子懸濁液中のピロリピド量を決定した。ピロリピド積載量は、10.6±0.8重量％であった。
Zn@Pyrolipidの蛍光消光
無傷の又は破壊された脂質層を有するZn@Pyrolipid の蛍光を測定して、蛍光消光効率を計算した。Zn@Pyrolipidをリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）に希釈して無傷のサンプルとし、これを0.5％Triton X-100を含有するPBSに希釈して脂質層を破壊した。これらのサンプルを分光蛍光光度計（RF-5301PC、株式会社島津製作所）にかけて、蛍光測定（励起：427nm、発光：600～750nm）を行った。無傷の脂質層を有するZn@Pyrolipidの675nmにおける蛍光強度を、脂質層を破壊したZn@Pyrolipidに対して正規化して、消光効率を計算した。無傷のZn@Pyrolipidの蛍光強度は、脂質層を破壊したZn@Pyrolipidの蛍光強度の2.7％であった。
一重項酸素の生成
一重項酸素センサー緑（SOSG）試薬（Life Technologies、USA）を用いて、Zn@Pyrolipidにより生成された一重項酸素（1O2）を検出した。脂質をコーティングした後、Zn@Pyrolipidを13000rpmで30分間遠心分離した。その上清を捨て、ペレットをPBSに再懸濁した。新たに調製したメタノール（5mM）中のSOSG溶液5μlを、PBS中の無傷のZn@Pyrolipid 2mg又は0.5％TritonX-100で脂質層を破壊したZn@Pyrolipid 2mgと混合した。Zn @ pyrolipidと同じピロリピド濃度の遊離ピロリピドを対照とした。これらのサンプルを、波長660nm及びエネルギー放射照度60mW/cm2のLEDで、10秒、20秒、30秒、40秒、50秒、75秒、100秒及び250秒処理し、504nmで励起し、525nmで発光させて、SOSG蛍光を測定した。この発光には、ピロリピドの蛍光寄与はなかった。脂質二重層が無傷である場合には、Zn@Pyrolipidは一重項酸素をほとんど生成しなかった。これはおそらく、ピロリピドの励起状態が高度に消光され、三重項酸素にエネルギーを移動しなかったことによるものである。脂質二重層を破壊するためにTriton X-100を添加した後、Zn@Pyrolipid の1O2生成効率は、同じ濃度の遊離ピロリピドの1O2生成効率と同様であった。
Zn@Pyrolipidの細胞内取り込み及び流出
4T1トリプルネガティブ乳癌細胞及びB16F10ネズミ黒色腫細胞を24ウェルプレートに1×105細胞/ウェルの密度で播種し、24時間インキュベートした。Zn@Pyrolipid及び遊離ピロリピドをそれぞれ2μMのピロリピド用量で細胞に添加した。1, 2, 4及び24時間インキュベートした後、細胞を回収し、PBSで3回洗浄し、血球計数器で計数した。これらの細胞を3,000rpmで5分間遠心分離し、細胞ペレットを0.5％（w/v）SDS（pH8.0）で溶解した。ピロリピドの蛍光強度を蛍光測定法（励起波長：427nm、発光波長：675nm）により決定した。結果を、105細胞あたりのピロリピドの量（pmol）として表す。両方の細胞株におけるZn@Pyrolipidの細胞内取り込みは迅速であり、1時間以内に大部分が完了した。これは24時間まで脂質の取り込み量が安定していることにより示される。
ピロリピドの流出は、次のようにして定量した。Zn@Pyrolipidを遊離ピロリピドと共に4時間インキュベートした後、培地を捨て、細胞をPBSで3回洗浄した。5μLの新鮮培地を各ウェルに添加し、細胞をさらに1, 2, 4及び24時間インキュベートした。0.5％Triton X-100を添加した後、培養液中のピロリピド量を蛍光測定法（励起波長：427nm、発光波長：675nm）により定量した。結果を、4時間の細胞摂取量に対する、流出したピロリピドの量の割合(%)として表す。Zn@Pyrolipidは、両方の細胞株で24時間のインキュベーションの間に無視できる流出（<2％）を示した。遊離ピロリピドの流出は時間とともに少し増加したが、依然として3％未満であった。
細胞毒性
4T1及びB16F10細胞を2500細胞/ウェルの密度で96ウェルプレート上に播種し、様々なピロリピド濃度のZn@Pyrolipid 及び遊離ピロリピドで処理した。24時間のインキュベーション後、細胞に60mW/cm2のLED光（660nm）を15分間照射した（54J/cm2）。照射処理をしていない細胞を対照とした。さらに48時間のインキュベーション後、細胞生存率を3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-5-（3-カルボキシメトキシフェニル）-2-（4-スルホフェニル）-2H-テトラゾリウムを用いて測定し（MTSアッセイ、Promega, Madison, Wisconsin, USA）、それに応じてIC50値を算出した。照射された又は照射されなかったZn粒子は、両方の細胞株に毒性を示さず、Zn粒子が薬物送達のための安全で信頼性のあるナノキャリアとして働くことができることを示唆している。照射なしのZn@Pyrolipid 及び遊離ピロリピドは、両方の細胞に細胞傷害性を誘導せず、Zn@Pyrolipidが安全であり、この粒子が毒性に関して懸念することなく注入できることを示した。照射後、IC50値の顕著な低下により示されるように、Zn@Pyrolipid及び遊離ピロリピドは非常に高い細胞傷害性を示した。表20を参照されたい。
Figure 0007090034000041
アポトーシス
4T1及びB16F10細胞を24ウェルプレートに1×105細胞/ウェルで播種し、まずZn@Pyrolipid及び遊離ピロリピドとともに、0.2μMのピロリピド濃度で24時間インキュベートし、次にこれら細胞にLED光（660nm）を60mW/cm2で15分間照射した（54J/cm2）。48時間の更なるインキュベーション後、浮遊細胞及び接着細胞を回収し、Alexa Fluor 488 AnnexinV/死細胞アポトーシスキット(Invitrogen, Carlsbad, California, USA)で製造者の指示に従って染色した。アポトーシス及びネクローシスをフローサイトメトリー(LSRII Blue, BD, Franklin Lakes, New Jersey, USA)で調べた。Zn@Pyrolipid及び遊離ピロリピドは、照射なしではアポトーシスを誘導しなかったが、照射ありでは、照射なしと比較して、高レベルのアポトーシスを誘発した。照射後のZn@Pyrolipid及び遊離ピロリピドは、4T1細胞でそれぞれ71.61％及び90.18％のアポトーシスを誘導し、B16F10細胞でそれぞれ63.72％及び85.79％のアポトーシスを誘導した。
薬物動態及び生体内分布
Balb/c雌マウスの乳房脂肪パッドに5×104細胞の同所性注射して、4T1腫瘍モデルとし、腫瘍を100mm3まで増殖させた後、それらに6mg/kgのピロリピド用量でZn@Pyrolipidを静脈内投与した。投与の5分後、3時間後及び24時間後にマウスを殺処分し（n = 3）、その血液、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、膀胱及び腫瘍を採取した。その血液を直ちに5000rpmで10分間遠心分離して、血漿サンプルを採取した。メタノールを用いた脱蛋白により血漿からピロリピドを抽出し、13000rpmで10分間遠心分離した。器官及び腫瘍をメタノール1mL中でホモジナイズし、続いて13000rpmで10分間遠心分離した。次にその上清中のピロリピド含量を蛍光マイクロプレートリーダー（励起波長：427nm、発光波長：675nm）で測定した。この方法の有効性を確認するために、ブランクマウスから摘出した血液、器官及び腫瘍を上記と同じ抽出方法を用いて処理した。同じ励起波長でブランクの血液、器官及び腫瘍の発光スペクトル（600～750nm）を分光蛍光光度計（RF-5301PC、株式会社島津製作所）に記録した。
時間に対する血液中のピロリピドの濃度は、非線形消去を伴う1-コンパートメントモデルに最も良く適合した。ピロリピドの血液循環半減期は、14.8±1.9時間であった。血液循環時間が長いことに加えて、Zn@Pyrolipidは肝臓、脾臓、及び腎臓において低い分布を示し、Zn@Pyrolipidが単核食細胞系（MPS）による取り込みを回避できることを示唆した。血液クリアランスが遅いこと及びMPS摂取が低いことは、高い腫瘍蓄積をもたらし、静脈内（i.v.）投与の24時間後に、15.6％±2.5ID/gの最も高い腫瘍摂取を示した。
4T1同所性モデルにおけるインビボ効果
4T1腫瘍を有するマウスを無作為に4群（n = 6）に分けた。この4群とは、対照として照射ありのリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）；照射なしのZn@Pyrolipid +抗PD-L1；照射ありのZn@Pyrolipid； 照射ありのZn@Pyrolipid + PD-L1、である。マウスに、Zn@Pyrolipidを6mg / kgのピロリピド用量で2日ごとに合計3回の静脈内（i.v.）注射を行った。注射の24時間後、マウスを2％（v/v）イソフルランで麻酔し、腫瘍に670nmのLEDを180mJ/cm2の光量で照射した（100mW/cm2）。照射後直ちに、マウスにPD-L1抗体を50μg/マウスの用量で腹腔内（i.p.）注射した。腫瘍サイズを毎日デジタルキャリパーで測定し、次のように計算した：（幅2×長さ）/2。最後にマウスを殺処分し、腫瘍を摘出し、秤量し（図33B）、写真撮影した。
また、肺を採取し、10μm厚で切片にし、ヘマトキシリン・エオジン（H＆E）染色し、光学顕微鏡で転移の組織学的検査を行った。図33Aに示すように、原発性腫瘍はZn@Pyrolipid (+)+ PD-L1抗体による処理後13日目に消失し、再発しなかった。Zn@Pyrolipid+光照射で処理した腫瘍の増殖は、最初の数日間は阻害されたが、腫瘍は最後の数日で急速に増殖し始めた。PD-L1抗体で処理したものの腫瘍体積は、PBS対照群と比較して、少しの減少を示したが、有意差はなかった。
肺への転移を、腫瘍結節の肉眼所見により、調べた。リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）；照射ありのZn@Pyrolipid；及び照射なしのZn@Pyrolipid+PD-L1抗体で処理した肺には、多くの腫瘍結節が観察された。照射ありのZn@Pyrolipid + PD-L1抗体処理群では、わずか1～2の腫瘍結節しか観察されず、光線力学療法（PDT）とPD-L1抗体との組み合わせが乳癌の肺転移を有意に防ぐことができることを示す。この肺をさらに切開し、ヘマトキシリン・エオジン（H＆E）染色し、全肺領域における転移領域の割合(%)を計算した。リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）、照射ありのZn@Pyrolipid 及び照射なしのZn@Pyrolipid+PD-L1抗体の処理群においては、それぞれ肺の約36.8％、30.7％及び26.4％が腫瘍結節により占められた．照射ありのZn@Pyrolipid+ PD-L1抗体処理群については、肺のわずか0.4％のみが腫瘍結節により占められた。
4T1及びTUBOモデルにおけるアブスコパル効果
Balb/cマウスに対して、右脇腹（原発腫瘍）に5×104個の4T1細胞又は1×106個のTUBO細胞、及び左脇腹（二次腫瘍）に1×104個の4T1細胞又は2×105個のTUBO細胞を皮下（s.c.）注入した。原発腫瘍が約100mm3に達したとき、マウスを無作為に4群（n = 6）に分けた。その４群とは、対照としての照射ありのPBS；照射なしのZn@Pyrolipid +抗PD-L1；照射ありのZn@Pyrolipid；照射ありのZn@Pyrolipid +抗PD-L1である。マウスに、Zn@Pyrolipidを6mg/kgのピロリピド用量で2日毎に合計3回静脈内（i.v.）注射した。注射の24時間後、マウスを2％（v/v）イソフルランで麻酔し、原発腫瘍に、670nmのLEDを180mJ/cm2の光量でで照射した（100mW/cm2）。照射後直ちに、マウスにPD-L1抗体を50μg/マウスの用量で腹腔内注射した。原発腫瘍及び二次腫瘍の大きさを毎日デジタルキャリパーで測定し、次のように計算した：（幅2×長さ）/ 2。対照群の原発腫瘍の大きさが2cm3を超えたとき全てのマウスを殺処分し、腫瘍を摘出して撮影して秤量した。
処理後、右腫瘍の増殖曲線は、4T1の同所性モデルのものと同様であった。照射ありのZn@Pyrolipid + PD-L1で処理した左腫瘍は有意に阻害され、明らかな増殖を示さなかった。照射ありのZn@Pyrolipidは最初の数日は右腫瘍の成長を阻害したが、最後の数日で急速に腫瘍が成長し始めた。照射ありのZn@Pyrolipidは左腫瘍に対して何の阻害作用も示さなかった。PD-L1抗体自体は、腫瘍増殖に対していくらかの効果を有していた。即ち、左右の腫瘍の両方はPBS群と比較すると増殖が少し遅かった。図34A～図34Cを参照されたい。TUBOモデルにおける照射ありのZn@Pyrolipid + PD-L1抗体のアブスコパル効果は、4T1モデルの場合と同様であり（図35A～35C参照）、PD-L1遮断が、Zn @ pyripidの光線力学療法（PDT）によって引き起こされるアブスコパル腫瘍特異的免疫応答を改善することが確かめられた。
血清サイトカイン濃度
血清接種後10日目（最初のZn@Pyrolipid注射を受けた日）から13日目まで、TUBO腫瘍保有マウスから採血した。血清を分離し、ELISAで分析し、IL-6、TNF-α、及びIFN-γのサイトカイン産生を測定した。
このようなサイトカインの放出は、抗腫瘍免疫を誘導する重要な機序である急性炎症を示す。12日目に照射ありのZn@Pyrolipid+ PD-L1抗体で処理したマウスでは、有意に高いIL-6、TNF-α及びIFN-γレベルが認められ、生存免疫応答及び急性炎症の活性化が成功したことを示唆する。照射ありのZn@Pyrolipid、及び照射なしのZn@Pyrolipid +PD-L1もまた、PBS群と比較して、サイトカインレベルが上昇したが、照射ありのZn@Pyrolipid+ PD-L1抗体よりも有意に低かった。図36A～図36Cを参照されたい。
フローサイトメトリーによる免疫アッセイ
最初の治療後12日目に、腫瘍排液リンパ節を採取し、注射器のゴム端を用いて粉砕した。腫瘍を採取し、1mg/mLのコラゲナーゼＩ(GIBCOTM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA)を用いて1時間処理し、注射器のゴム端を用いて粉砕した。細胞をナイロンメッシュフィルターで濾過し、PBSで洗浄した。この単一細胞懸濁液を抗CD16/32 (clone 93; eBiosciences, San Diego, California, USA)と共にインキュベートし、Fc受容体(FcR)への非特異的結合を減少させた。更に、細胞を、CD45（30-F11）、CD3e（145-2C11）、CD4（GK1.5）、CD8（53-6.7）、Foxp3（FJK-16s）、CD11b（M1/70）、Ly6C（HK1.4）、Ly6G（RB6-8C5）、F4/80（BM8）、B220（RA3-6B2）及びPI染色溶液（いずれもeBiosciences, San Diego, California, USA）などの蛍光色素結合抗体で染色した。細胞獲得にLSR FORTESSA (BD Biosciences, Franklin Lakes, New Jersey, USA)を用い、データ解析をFlowJoソフトウェア(TreeStar, Ashland, Oregon, USA)を用いて行った。
抗PD-L1と組み合わせて照射ありのZn@Pyrolipidは、左腫瘍に浸潤するCD8+T細胞の割合を有意に増加させた。これは、アブスコパル効果を誘導するための必須工程である、左腫瘍に浸潤するCD45+白血球、CD4+T細胞、及びB細胞の割合も有意に増加した。図37A～図37Dを参照されたい。興味深いことに、リンパ節におけるCD8+及びCD4+ T細胞は、最初の処理後12日目に減少した（図38A及び38B参照）。これは、おそらくCD8+及びCD4+ T細胞が腫瘍細胞を殺すためにリンパ節から腫瘍部位に移動したためである。これらの全ての結果は、光線力学療法とPD-L1遮断との併用療法により免疫系が活性化されたことを示す。
ここに開示される発明の様々な詳細は、本発明の範囲から逸脱することなく変更可能であることが理解されるであろう。さらに、上記の説明は、説明のためのものであって、限定を目的とするものではない。

Claims (8)

  1. 癌を治療する方法に使用するための、組成物と免疫療法剤との組み合わせであって、該組成物が、ナノスケール粒子を含み、該ナノスケール粒子が、(ｉ) 金属－有機マトリックス材料を含むコア、及び(ii) プロドラッグを含み、
    該金属－有機マトリックス材料が、多価金属イオン及びビスホスホネートから成る金属ビスホスホネート配位ポリマーを含み、該ビスホスホネートが、シスプラチン又はオキサリプラチンのプロドラッグであり、
    該(ii)プロドラッグが、
    （a）一価薬物部分、
    （b）一価脂質部分、及び
    （c）生分解性結合を含む二価リンカー部分、
    から成り、
    該一価薬物部分が、エトポシド（ET）、パクリタキセル（PTX）、OTS964、NLG919、OTS167、OTSC41、ジヒドロアルテミシニン（DHA）、カンプトテシン（CPT）、ドキソルビシン、ドセタキセル、ビンクリスチン、ミトキサントロン（MTX）、アーテスネート及びカペシタビンから成る群から選択される抗癌剤化合物の一価誘導体であり、
    該一価薬物部分と該一価脂質部分とが該リンカー部分を介して結合し、該生分解性結合がジスルフィド結合であり、該一価脂質部分が、コレステロール、オレイン酸、リゾ脂質又はホスホコリンの一価誘導体であり、
    該免疫療法剤が、PD-1阻害剤、PD-L1阻害剤、CTLA-4阻害剤、IDO阻害剤、CCR7阻害剤、OX40阻害剤、TIM3阻害剤及びLAG3阻害剤から成る群から選択される、
    組み合わせ。
  2. (i) 前記一価脂質部分がコレステロール誘導体であり、前記一価脂質部分と前記二価リンカー部分とが一緒になって下記の構造を有する、又は
    Figure 0007090034000042
     (ii) 前記一価脂質部分がオレイン酸誘導体であり、前記一価脂質部分と前記二価リンカー部分とが一緒になって下記の構造を有する、又は
    Figure 0007090034000043
     (iii) 前記一価脂質部分がリゾ脂質誘導体であり、前記一価脂質部分と前記二価リンカー部分とが一緒になって下記の構造を有する、又は
    Figure 0007090034000044
     （式中、Ｒは、オレイル、ステアリル又はパルミトレイルから選択される。）
    (iv)前記一価脂質部分がホスホコリン誘導体であり、前記一価脂質部分と前記二価リンカー部分とが一緒になって下記の構造を有する、請求項１に記載の組み合わせ。
    Figure 0007090034000045
  3. 更に、siRNAを含む、請求項１又は２に記載の組み合わせ。
  4. 更に、少なくとも１つの核酸化学療法剤を含む、請求項１又は２に記載の組み合わせ。
  5. 前記少なくとも１つの核酸化学療法剤が、該核酸化学療法剤上のリン酸基と前記金属－有機マトリックス材料コアの外表面上の金属ビスホスホネート配位ポリマーの多価金属イオンとの間の配位結合を介して、前記金属－有機マトリックス材料のコアに結合している、請求項４に記載の組み合わせ。
  6. 前記ナノスケール粒子が、更に、金属－有機マトリックス材料コアの外表面の少なくとも一部を覆う１又はそれ以上のコーティング剤又はコーティング層を含み、該１又はそれ以上のコーティング剤又はコーティング層が、 金属酸化物、ポリマー、単一脂質層、脂質二重層、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項４又は５に記載の組み合わせ。
  7. 前記金属－有機マトリックス材料コアが、ビスホスホネートを４０～５０重量％含む、請求項４～６のいずれか一項に記載の組み合わせ。
  8. 請求項１～７のいずれか一項に記載の組み合わせ、及び医薬的に許容される担体を含む、癌治療用の医薬配合物。
JP2018561060A 2016-05-20 2017-05-22 化学療法、標的療法、光線力学療法、免疫療法及びそれらの任意の組み合わせのためのナノ粒子 Active JP7090034B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022032275A JP2022078190A (ja) 2016-05-20 2022-03-03 治療薬を送達するためのナノスケール粒子

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662339594P 2016-05-20 2016-05-20
US62/339,594 2016-05-20
PCT/US2017/033822 WO2017201528A1 (en) 2016-05-20 2017-05-22 Nanoparticles for chemotherapy, targeted therapy, photodynamic therapy, immunotherapy, and any combination thereof

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022032275A Division JP2022078190A (ja) 2016-05-20 2022-03-03 治療薬を送達するためのナノスケール粒子

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2019523757A JP2019523757A (ja) 2019-08-29
JP2019523757A5 JP2019523757A5 (ja) 2020-06-25
JP7090034B2 true JP7090034B2 (ja) 2022-06-23

Family

ID=60326621

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2018561060A Active JP7090034B2 (ja) 2016-05-20 2017-05-22 化学療法、標的療法、光線力学療法、免疫療法及びそれらの任意の組み合わせのためのナノ粒子
JP2022032275A Pending JP2022078190A (ja) 2016-05-20 2022-03-03 治療薬を送達するためのナノスケール粒子

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022032275A Pending JP2022078190A (ja) 2016-05-20 2022-03-03 治療薬を送達するためのナノスケール粒子

Country Status (5)

Country Link
US (1) US11246877B2 (ja)
EP (1) EP3439666A4 (ja)
JP (2) JP7090034B2 (ja)
CN (1) CN109310702A (ja)
WO (1) WO2017201528A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11826426B2 (en) 2017-08-02 2023-11-28 The University Of Chicago Nanoscale metal-organic layers and metal-organic nanoplates for x-ray induced photodynamic therapy, radiotherapy, radiodynamic therapy, chemotherapy, immunotherapy, and any combination thereof
US11872311B2 (en) 2011-07-08 2024-01-16 The University Of North Carolina At Chapel Hill Metal bisphosphonate nanoparticles for anti-cancer therapy and imaging and for treating bone disorders

Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109310702A (zh) 2016-05-20 2019-02-05 芝加哥大学 用于化学疗法、靶向疗法、光动力疗法、免疫疗法和它们的任何组合的纳米颗粒
WO2018213631A1 (en) * 2017-05-18 2018-11-22 The Regents Of The University Of California Nano-enabled immunotherapy in cancer
US11433143B2 (en) 2017-05-18 2022-09-06 The Regents Of The University Of California Nano-enabled immunotherapy in cancer
CN111954519A (zh) * 2017-12-06 2020-11-17 新南创新私人有限公司 用于药物递送的脂质体系统
US20190314324A1 (en) 2018-04-13 2019-10-17 The University Of Chicago Combination of micheliolide derivatives or nanoparticles with ionizing radiation and checkpoint inhibitors for cancer therapy
CN112512507A (zh) * 2018-04-19 2021-03-16 得克萨斯州大学系统董事会 使用外排体对肿瘤抑制因子的治疗性调节
CN108619511B (zh) * 2018-04-20 2020-12-15 山东大学 一种基于阿糖胞苷小分子前药的金属有机框架载药系统的制备方法和应用
CN108840896A (zh) * 2018-04-23 2018-11-20 上海大学 刺激响应型双亲大分子及其制备方法
CN108774264A (zh) * 2018-05-18 2018-11-09 东北林业大学 卵磷脂类似物、制备方法及用途
CN108794532A (zh) * 2018-05-18 2018-11-13 东北林业大学 脑磷脂类似物、制备方法及用途
CN110872324B (zh) * 2018-08-29 2021-09-14 中国科学院上海药物研究所 奥沙利铂偶联前药、其制备方法及用途
CN109336857A (zh) * 2018-11-13 2019-02-15 南方医科大学 一种含取代联苯的黄酮及其应用
AU2020226216A1 (en) * 2019-02-21 2021-08-05 Pharma In Silica Laboratories Inc. Direct nanoemulsion process for the synthesis of spheroidal organosiloxane sub-micron/nanoparticles
EP3934642A4 (en) * 2019-03-07 2022-11-02 Virginia Commonwealth University LIPIDIC ANALOGUES OF STEM CELL ANTI-CANCER AGENTS
CN111840228A (zh) * 2019-04-09 2020-10-30 中国科学院上海药物研究所 肿瘤免疫脂质体，其制备方法和用途
WO2020217472A1 (ja) * 2019-04-26 2020-10-29 株式会社Jimro 治療抵抗性がんの予防又は治療用の医薬組成物
EP3747467A3 (en) * 2019-06-03 2021-03-03 Nanobacterie A cryosystem comprising nanoparticles for treating a body part of an individual by cryotherapy
CN110201162B (zh) * 2019-06-14 2021-09-07 中山大学附属第八医院（深圳福田） 光治疗剂在打破肿瘤免疫抑制微环境中的应用
CN110507613A (zh) * 2019-07-29 2019-11-29 苏州大学 一种脂质体制剂及其制备方法与应用
CA3147790A1 (en) * 2019-08-13 2021-02-18 Reynold Homan Palm for the treatment of chemotherapy-induced peripheral neuropathy incidental to the treatment of cancer
CN110862546B (zh) * 2019-10-12 2021-07-09 厦门大学 一种甲氨蝶呤金属配位聚合物及其制备方法和应用
AU2020367786A1 (en) * 2019-10-14 2022-05-26 The Regents Of The University Of California Nano-enabled immunotherapy in cancer
CN111214646B (zh) * 2019-12-30 2023-08-01 中山大学·深圳 Pd-l1/ctla-4在制备免疫抑制剂中的应用
CN111423497B (zh) * 2020-03-16 2021-12-24 山东大学 拮抗肽、其共聚物及纳米组装体、及其制备方法和应用
JP2023526501A (ja) * 2020-05-22 2023-06-21 ザ・ユニバーシティ・オブ・シカゴ 金属有機構造体が癌免疫療法の為の低分子及びバイオ高分子を送達する
WO2022009788A1 (ja) * 2020-07-08 2022-01-13 コニカミノルタ株式会社 細胞の殺傷方法、シンチレーター粒子
CN114053223B (zh) * 2020-08-07 2023-04-07 中国科学院上海药物研究所 复合脂质体、其制备方法及用途
WO2022049867A1 (ja) * 2020-09-02 2022-03-10 国立大学法人東京大学 がん免疫微小環境の調節物質およびそれによる予防・診断・治療的利用
JP2023541389A (ja) 2020-09-11 2023-10-02 ナミ セラピューティクス， インコーポレイテッド がんの処置において有用なｐｄ－１アンタゴニストプロドラッグを含有する製剤化および／または共製剤化リポソーム組成物ならびにその方法
CN112353948B (zh) * 2020-10-21 2021-08-27 四川大学 响应酸性微环境实现粒径减小和表面电荷翻转的载药胶束及其制备方法
CN112321615B (zh) * 2020-10-30 2021-11-09 华中科技大学 一种基于喜树碱的二聚体化合物、其制备和应用
WO2022088679A1 (zh) * 2020-10-30 2022-05-05 华中科技大学 一种清除肿瘤干细胞的方法、抗癌药物、载药系统及其应用
US20220202952A1 (en) * 2020-12-28 2022-06-30 Industrial Technology Research Institute Immunostimulatory lipoplex, pharmaceutical composition including immunostimulatory lipoplex, and uses thereof
CN115154462B (zh) * 2021-04-01 2024-04-09 首都医科大学附属北京朝阳医院 双氢青蒿素在预防和/或治疗多发性骨髓瘤中的应用
CN113230401A (zh) * 2021-04-26 2021-08-10 上海大学 一种核壳上转换MOFs光敏复合材料、制备方法及其应用
CN113384696A (zh) * 2021-06-07 2021-09-14 深圳大学 一种纳米光敏剂、制备方法及其应用
CN113975392A (zh) * 2021-10-29 2022-01-28 成都大学 一种光动力介导抗肿瘤免疫应答的二氢青蒿素纳米制剂及其制备方法与应用
CN114224823B (zh) * 2021-11-02 2023-12-05 南京医科大学 一种集化疗/光动力治疗/化学动力治疗“三位一体”的脑胶质瘤递药系统及其制备方法
CN114601972B (zh) * 2022-02-08 2022-10-18 山东科技大学 以镁/镁合金/锌/锌合金为基体的光热、光动力、金属离子协同抗菌材料及其制备方法
CN114588268B (zh) * 2022-03-25 2023-05-26 清华大学 提高激活sting通路和抗肿瘤t细胞应答的方法
CN114949208B (zh) * 2022-05-06 2023-07-04 温州医科大学 纳米光动力材料及其脉络膜新生血管的治疗的应用
CN114983943A (zh) * 2022-06-16 2022-09-02 苏州卫生职业技术学院 一种青蒿琥酯纳米靶向制剂及其制备方法与应用
KR20240107310A (ko) * 2022-12-29 2024-07-09 가톨릭대학교 산학협력단 면역관문 억제제의 항암 효과 증진용 약학적 조성물
CN117442601B (zh) * 2023-10-31 2024-05-28 上海市东方医院（同济大学附属东方医院） 一种磷酸酶抑制剂类似物BX-金属NPs及其制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015069926A1 (en) 2013-11-06 2015-05-14 The University Of Chicago Nanoscale carriers for the delivery or co-delivery of chemotherapeutics, nucleic acids and photosensitizers
WO2016061256A1 (en) 2014-10-14 2016-04-21 The University Of Chicago Nanoparticles for photodynamic therapy, x-ray induced photodynamic therapy, radiotherapy, chemotherapy, immunotherapy, and any combination thereof

Family Cites Families (96)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL61351A (en) 1980-10-27 1983-12-30 Yeda Res & Dev Organometallic polymers,their preparation and compositions of co-ordination compounds containing them
US5147806A (en) 1988-04-29 1992-09-15 Igen, Inc. Method and apparatus for conducting electrochemiluminescence measurements
US5213788A (en) 1988-09-29 1993-05-25 Ranney David F Physically and chemically stabilized polyatomic clusters for magnetic resonance image and spectral enhancement
ES2053333T3 (es) 1990-07-26 1994-07-16 Searle & Co Sistema polimerico para la administracion de farmacos.
US6013638A (en) 1991-10-02 2000-01-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adenovirus comprising deletions on the E1A, E1B and E3 regions for transfer of genes to the lung
US5858784A (en) 1991-12-17 1999-01-12 The Regents Of The University Of California Expression of cloned genes in the lung by aerosol- and liposome-based delivery
US5871710A (en) 1992-09-04 1999-02-16 The General Hospital Corporation Graft co-polymer adducts of platinum (II) compounds
US5591730A (en) 1993-10-12 1997-01-07 The Regents Of The University Of California Inhibition of urinary calculi growth
US20010003647A1 (en) 1995-06-07 2001-06-14 Ji Sun Coreatant-including electrochemiluminescent compounds, methods, systems and kits utilizing same
US5641623A (en) 1995-01-04 1997-06-24 Martin; Mark T. Electrochemiluminescence assay
US6022737A (en) 1995-11-02 2000-02-08 Amgen Inc. Formulations for non-viral in vivo transfection in the lungs
US5648508A (en) 1995-11-22 1997-07-15 Nalco Chemical Company Crystalline metal-organic microporous materials
US5874064A (en) 1996-05-24 1999-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Aerodynamically light particles for pulmonary drug delivery
HU224918B1 (en) 1997-01-24 2006-04-28 Conpharma As Gemcitabine derivatives, process for their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US6180082B1 (en) 1997-11-24 2001-01-30 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Method to enhance tissue accumulation of radiolabeled compounds
US6984400B2 (en) 1998-07-14 2006-01-10 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Method of treating restenosis using bisphosphonate nanoparticles
US6818227B1 (en) 1999-02-08 2004-11-16 Alza Corporation Liposome composition and method for administration of a radiosensitizer
EP1161226B1 (en) * 1999-02-18 2004-05-26 SuperGen, Inc. Phosphocholine linked prodrug derivatives
US20020064520A1 (en) * 1999-08-19 2002-05-30 Yanina Rozenberg Targeted artificial gene delivery
US6602932B2 (en) 1999-12-15 2003-08-05 North Carolina State University Nanoparticle composites and nanocapsules for guest encapsulation and methods for synthesizing same
CN1446093A (zh) 2000-04-07 2003-10-01 得克萨斯系统大学董事会 两性离子型磷脂和双膦酸酯的独特组合物及其作为降低肠胃毒性的双膦酸酯释放系统的应用
US6548264B1 (en) 2000-05-17 2003-04-15 University Of Florida Coated nanoparticles
US6565873B1 (en) * 2000-10-25 2003-05-20 Salvona Llc Biodegradable bioadhesive controlled release system of nano-particles for oral care products
US20020127224A1 (en) 2001-03-02 2002-09-12 James Chen Use of photoluminescent nanoparticles for photodynamic therapy
ATE334992T1 (de) 2001-04-30 2006-08-15 Univ Michigan Isoretikuläre organometallische grundstrukturen, verfahren zu deren bildung und systematische entwicklung von deren porengrösse und funktionalität, mit anwendung für die gasspeicherung
WO2003094767A1 (en) 2002-03-25 2003-11-20 The General Hospital Corporation Methods of adjuvant photodynamic therapy to enhance radiation sensitization
RU2005108576A (ru) 2002-09-28 2005-09-20 МакНЕЙЛ-ППС, ИНК. (US) Полимерная композиция и соднржащие ее лекарственные формы
WO2004041203A2 (en) 2002-11-04 2004-05-21 Xenoport, Inc. Gemcitabine prodrugs, pharmaceutical compositions and uses thereof
KR100401335B1 (en) 2003-03-08 2003-10-10 Mijitech Co Ltd Metal nanoparticle surface-coated with silicon oxides and preparation thereof
US6878838B2 (en) 2003-03-24 2005-04-12 The University Of North Carolina At Chapel Hill Chiral porous metal phosphonates for heterogeneous asymmetric catalysis
JP2006521367A (ja) 2003-03-26 2006-09-21 株式会社Ｌｔｔバイオファーマ ターゲッティングと徐放を目的とした静脈注射用ナノ粒子
WO2004089345A1 (en) 2003-04-03 2004-10-21 Semafore Pharmaceuticals Inc. Bone targeting of biodegradable drug-containing nanoparticles
ES2345716T3 (es) 2003-05-09 2010-09-30 The Regents Of The University Of Michigan Mof con una elevada area superficial y procedimientos para producirlos.
KR20060056354A (ko) 2003-07-31 2006-05-24 쓰리엠 이노베이티브 프로퍼티즈 컴파니 트리아진을 포함하는 생체활성 조성물
US20050227929A1 (en) 2003-11-13 2005-10-13 Masferrer Jaime L Combination therapy comprising a Cox-2 inhibitor and an antineoplastic agent
US20050147963A1 (en) 2003-12-29 2005-07-07 Intel Corporation Composite organic-inorganic nanoparticles and methods for use thereof
JP4487032B2 (ja) 2004-03-29 2010-06-23 独立行政法人放射線医学総合研究所 ヒール効果補正フィルタ、ｘ線照射装置、ｘ線ｃｔ装置及びｘ線ｃｔ撮像方法
US20070259966A1 (en) 2004-04-22 2007-11-08 Allos Therapeutics, Inc. Coadministration of Radiation, Efaproxiral Sodium, and Supplemental Oxygen for the Treatment of Cancer
FR2869803B1 (fr) 2004-05-10 2006-07-28 Nanobiotix Sarl Particules activables, preparation et utilisations
FR2874016B1 (fr) 2004-06-30 2006-11-24 Centre Nat Rech Scient Cnrse Nanoparticules de derives de la gemcitabine
US7964571B2 (en) 2004-12-09 2011-06-21 Egen, Inc. Combination of immuno gene therapy and chemotherapy for treatment of cancer and hyperproliferative diseases
US20070218049A1 (en) 2006-02-02 2007-09-20 Wei Chen Nanoparticle based photodynamic therapy and methods of making and using same
US8257742B2 (en) 2005-02-17 2012-09-04 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Bisphosphonates for treating endometriosis
CN1305937C (zh) 2005-02-25 2007-03-21 复旦大学 一种金属配位聚合物纳米结构材料的制备方法
NZ561666A (en) 2005-03-17 2010-05-28 Elan Pharma Int Ltd Nanoparticulate biphosphonate compositions
NO322682B1 (no) 2005-03-18 2006-11-27 Clavis Pharma Asa Anvendelse av gemcitabinderivater for fremstilling av orale doseringsformer ved kreftbehandling, samt slike orale doseringsformer
PE20070360A1 (es) 2005-09-01 2007-04-19 Novartis Ag Composiciones de liposomas
US20080095699A1 (en) 2006-10-20 2008-04-24 Shiying Zheng Imaging contrast agents using nanoparticles
US7263170B2 (en) 2005-09-30 2007-08-28 Pellegrino Anthony J Radiation therapy system featuring rotatable filter assembly
US20070088161A1 (en) 2005-10-19 2007-04-19 Stockel Richard F Novel chelated bisphosphonates for use as pharmaceutical agents
WO2007090295A1 (en) 2006-02-09 2007-08-16 Simon Fraser University Birefringent metal-containing coordination polymers
US20100189222A1 (en) 2006-02-16 2010-07-29 Steller Micro Devices Panoramic irradiation system using flat panel x-ray sources
KR100943923B1 (ko) 2006-03-17 2010-02-24 홍순해 킬레이팅 유기 고분자와 생물학적 금속으로 이루어진 나노입자, 그리고 ｅｐｒ 효과를 이용한 새로운 광범위 무독성항암제 및 그 제조 방법
US20090317335A1 (en) 2006-04-20 2009-12-24 Wenbin Lin Hybrid Nanomaterials as Multimodal Imaging Contrast Agents
WO2008016172A1 (fr) 2006-08-04 2008-02-07 Kurume University Inhibiteur de métastase
US7985868B1 (en) 2006-11-01 2011-07-26 Sandia Corporation Hybrid metal organic scintillator materials system and particle detector
US20080124281A1 (en) 2006-11-29 2008-05-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Nanotubular probes as ultrasensitive mr contrast agent
WO2008102632A1 (ja) 2007-02-21 2008-08-28 Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. Ｘ線バンドパスフィルタ、ｘ線照射システム及びｘ線撮影システム
WO2008124632A1 (en) 2007-04-04 2008-10-16 Massachusetts Institute Of Technology Amphiphilic compound assisted nanoparticles for targeted delivery
US8486452B2 (en) 2007-07-20 2013-07-16 Mylan Pharmaceuticals Inc. Stabilized tolterodine tartrate formulations
ES2713194T3 (es) 2007-09-25 2019-05-20 Univ California Entramados organometálicos comestibles y biocompatibles
FR2921838A1 (fr) 2007-10-05 2009-04-10 Guerbet Sa Nouveau procede de preparation de nanoparticules recouvertes d'une couche stabilisatrice gem-bisphosphonate couplee a des ligands de biodistribution hydrophile
WO2009139939A2 (en) 2008-02-22 2009-11-19 The University Of North Carolina At Chapel Hill Hybrid nanoparticles as anti-cancer therapeutic agents and dual therapeutic/imaging contrast agents
WO2009114476A1 (en) 2008-03-12 2009-09-17 Intradigm Corporation Compositions comprising survivin sirna and methods of use thereof
GB0807862D0 (en) 2008-04-29 2008-06-04 Uni I Oslo Compounds
US8968705B2 (en) 2008-08-22 2015-03-03 Colorado School Of Mines Gold/lanthanide nanoparticle conjugates and uses thereof
WO2010065751A2 (en) 2008-12-03 2010-06-10 Synergy Pharmaceuticals, Inc. Formulations of guanylate cyclase c agonists and methods of use
WO2010121368A1 (en) 2009-04-24 2010-10-28 Socpra - Sciences Santé Et Humaines Compositions comprising a radiosensitizer and an anti-cancer agent and methods of uses thereof
KR20120104491A (ko) 2009-05-25 2012-09-21 메르크 파텐트 게엠베하 암 치료를 위한 실렌기티드의 연속 투여
CN102574879B (zh) 2009-06-05 2016-11-02 新加坡南洋理工大学 递送至骨的靶向药物
GB0914287D0 (en) 2009-08-14 2009-09-30 Pci Biotech As Compositions
WO2011049743A1 (en) 2009-10-06 2011-04-28 Stellarray, Inc. Self contained irradiation system using flat panel x-ray sources
CA2776796C (en) 2009-10-16 2018-11-13 University Health Network Porphyrin nanovesicles
KR20120086729A (ko) 2009-11-20 2012-08-03 클라비스 파마 에이에스에이 젬시타빈 유도체의 비경구적 제제
GB201013307D0 (en) 2010-08-09 2010-09-22 Univ St Andrews Anti-microbial metal organic framework
IT1401882B1 (it) 2010-10-01 2013-08-28 Rosa De Nanoparticelle autoassemblanti per il rilascio di bifosfonati nel trattamento di tumori.
WO2012138419A1 (en) 2011-04-04 2012-10-11 Georgia Tech Research Corporation Mof nanocrystals
NO2694640T3 (ja) 2011-04-15 2018-03-17
US20120301537A1 (en) 2011-05-23 2012-11-29 Delta-Fly Pharma, Inc. LIPOSOME CONTAINING shRNA MOLECULE TARGETING A THYMIDYLATE SYNTHASE AND USE THEREOF
WO2012167350A1 (en) 2011-06-06 2012-12-13 University Health Network Method for the synthesis of porphyrin-phospholipid conjugates
WO2012174379A2 (en) 2011-06-16 2012-12-20 University Of South Florida Polyhedral cage-containing metalloporphyrin frameworks, methods of making, and methods of using
US9693957B2 (en) 2011-07-08 2017-07-04 The University Of North Carolina At Chapel Hill Metal bisphosphonate nanoparticles for anti-cancer therapy and imaging and for treating bone disorders
WO2013012628A2 (en) 2011-07-15 2013-01-24 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Immune-stimulating photoactive hybrid nanoparticles
CN102432654A (zh) 2011-09-26 2012-05-02 宋云龙 吉西他滨酰胺衍生物及其制备方法和用途
WO2013068965A2 (en) 2011-11-11 2013-05-16 Koninklijke Philips Electronics N.V. Lighting apparatus and manufacturing method for manufacturing the lighting apparatus
KR102025743B1 (ko) 2011-12-16 2019-09-26 나노비오?스 금속성 및 산화하프늄 소재를 포함하는 나노입자, 이의 제조 및 용도
CN104582732A (zh) 2012-06-15 2015-04-29 布里格姆及妇女医院股份有限公司 治疗癌症的组合物及其制造方法
ES2721168T3 (es) 2013-01-11 2019-07-29 Dingfu Biotarget Co Ltd Agentes para tratar tumores, uso y método de los mismos
US10350275B2 (en) 2013-09-21 2019-07-16 Advantagene, Inc. Methods of cytotoxic gene therapy to treat tumors
US10118169B2 (en) 2014-03-28 2018-11-06 The University Of Chicago Chiral ligand-based metal-organic frameworks for broad-scope asymmetric catalysis
US10647733B2 (en) 2014-03-28 2020-05-12 The University Of Chicago Metal-organic frameworks containing nitrogen-donor ligands for efficient catalytic organic transformations
US10806694B2 (en) 2014-10-14 2020-10-20 The University Of Chicago Nanoparticles for photodynamic therapy, X-ray induced photodynamic therapy, radiotherapy, radiodynamic therapy, chemotherapy, immunotherapy, and any combination thereof
WO2017023667A1 (en) * 2015-07-31 2017-02-09 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Immunostimulatory nanocarrier
US10953393B2 (en) 2015-10-12 2021-03-23 The University Of Chicago Stabilization of active metal catalysts at metal-organic framework nodes for highly efficient organic transformations
CN105457038A (zh) 2015-11-09 2016-04-06 东南大学 一种速释型药物磷脂化合物及其药物组合物
CN109310702A (zh) 2016-05-20 2019-02-05 芝加哥大学 用于化学疗法、靶向疗法、光动力疗法、免疫疗法和它们的任何组合的纳米颗粒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015069926A1 (en) 2013-11-06 2015-05-14 The University Of Chicago Nanoscale carriers for the delivery or co-delivery of chemotherapeutics, nucleic acids and photosensitizers
WO2016061256A1 (en) 2014-10-14 2016-04-21 The University Of Chicago Nanoparticles for photodynamic therapy, x-ray induced photodynamic therapy, radiotherapy, chemotherapy, immunotherapy, and any combination thereof

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bioconjugate Chemistry，2012年，Vol.23, No.6，p.1091-1104
Biomacromolecules，2015年，Vol.16, No.7，p.1886-1914
Eur.J.Biomed.Res.，2016年01月31日，Vol.2, No.1，p.8-15
Journal of Controlled Release，2015年，Vol.208，p.25-41
Nature Com.，2014年，Vol.5, Article number: 4182，p.1-11
Theranotics，2016年04月28日，Vol.6, No.7，p.1065-1074

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11872311B2 (en) 2011-07-08 2024-01-16 The University Of North Carolina At Chapel Hill Metal bisphosphonate nanoparticles for anti-cancer therapy and imaging and for treating bone disorders
US11826426B2 (en) 2017-08-02 2023-11-28 The University Of Chicago Nanoscale metal-organic layers and metal-organic nanoplates for x-ray induced photodynamic therapy, radiotherapy, radiodynamic therapy, chemotherapy, immunotherapy, and any combination thereof

Also Published As

Publication number Publication date
WO2017201528A1 (en) 2017-11-23
JP2022078190A (ja) 2022-05-24
JP2019523757A (ja) 2019-08-29
US20190269706A1 (en) 2019-09-05
US11246877B2 (en) 2022-02-15
CN109310702A (zh) 2019-02-05
EP3439666A4 (en) 2019-12-11
EP3439666A1 (en) 2019-02-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7090034B2 (ja) 化学療法、標的療法、光線力学療法、免疫療法及びそれらの任意の組み合わせのためのナノ粒子
US10780045B2 (en) Nanoparticles for photodynamic therapy, X-ray induced photodynamic therapy, radiotherapy, chemotherapy, immunotherapy, and any combination thereof
US10806694B2 (en) Nanoparticles for photodynamic therapy, X-ray induced photodynamic therapy, radiotherapy, radiodynamic therapy, chemotherapy, immunotherapy, and any combination thereof
JP6590802B2 (ja) 化学療法用薬剤、核酸及び光増感剤の送達又は共送達のためのナノスケール輸送体
CN111194232B (zh) 纳米级金属有机层和金属有机纳米片
US20230293698A1 (en) Metal-organic frameworks deliver small molecules and biomacromolecules for cancer immunotherapy
WO2013009701A9 (en) Metal bisphosphonate nanoparticles for anti-cancer therapy and imaging and for treating bone disorders
US20240042045A1 (en) Nanoparticles containing multiple cleavable produgs for cancer therapy
Liu et al. Research progress of tumor targeted drug delivery based on PD-1/PD-L1
US20170332910A1 (en) Modified paramagnetic nanoparticles for targeted delivery of therapeutics and methods thereof
Qu et al. Drug-drug conjugates self-assembled nanomedicines triggered photo−/immuno-therapy for synergistic cancer treatments
JP2021535258A (ja) シアニンベースをベースとするテロデンドリマー及び癌治療のための使用
CN114746124A (zh) 包含活性剂沉淀物的递送系统复合物和使用方法
Valcourt Treating triple-negative breast cancer through nanoparticle-mediated photothermal therapy and gene regulation
Nasser et al. Concluding remarks and future perspective of combination drug delivery systems
Chenab et al. Intertumoral and intratumoral barriers as approaches for drug delivery and theranostics to solid tumors using stimuli-responsive materials
CN116744909A (zh) 金属有机框架递送小分子和生物大分子用于癌症免疫治疗

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20200515

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20200515

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20200625

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20210405

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210624

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20211108

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220303

C60 Trial request (containing other claim documents, opposition documents)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60

Effective date: 20220303

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220303

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20220408

C21 Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21

Effective date: 20220411

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20220425

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220425

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20220516

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20220613

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7090034

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

RD02 Notification of acceptance of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R3D02