KR20240000677A - 나노-바이오 구조 조절을 기반으로 하는 새로운 고리형 펩티드, 이를 포함하는 코어/쉘 구조의 펩티좀 및 이의 용도 - Google Patents

나노-바이오 구조 조절을 기반으로 하는 새로운 고리형 펩티드, 이를 포함하는 코어/쉘 구조의 펩티좀 및 이의 용도 Download PDF

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김효석
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Abstract

본 발명은 나노-바이오 구조 조절을 기반으로 하는 새로운 고리형 펩티드, 이를 포함하는 코어/쉘 구조의 펩티좀 및 이의 용도에 관한 것으로서, 본 발명의 고리형 펩티드는 자기조립을 통해 액상에서 중공형 코어 및 이중층 쉘을 갖는 소포체 구조의 펩티좀을 제조할 수 있고, 이로부터 제조된 펩티좀은 생체 외에서 뿐만 아니라 생체 내에서도 안정적으로 작용하며, 특히 생체 내 단백질 분해효소에 안정적이므로 생체 내에서 실질적인 약물 전달체로써 유용하게 활용될 수 있다.

Description

나노-바이오 구조 조절을 기반으로 하는 새로운 고리형 펩티드, 이를 포함하는 코어/쉘 구조의 펩티좀 및 이의 용도{Novel cyclic peptides based on nano-bio-structural control of peptide assemblies, peptidesomes with core/shell structure comprising thereof and uses thereof}
본 발명은 나노-바이오 구조 조절을 기반으로 하는 새로운 고리형 펩티드, 이를 포함하는 코어/쉘 구조의 펩티좀 및 이의 용도에 관한 것이다.
단백질을 만드는 아미노산이나 펩타이드(peptide)는 스스로 달라붙어 특정한 구조와 형태를 만드는 이른바 '자기조립(self-assembly)' 성질을 갖는데, 최근에는 이를 이용한 자기조립 펩티드 나노구조체(self-assembled peptide nanostructure, SPN)에 대한 관심이 점차 증가하고 있다. SPN은 생체 적합성이 아주 우수하고, 아미노산 서열 변경을 통해 다양한 2D 및 3D 구조를 쉽게 제조할 수 있다는 장점 때문에, 감지 및 촉매분야 뿐만 아니라 치료제에 이르기까지 다양한 분야에서 활용되고 있다. 뿐만 아니라 SPN은 화학적 변경이나 초분자 빌딩 블록 펩티드의 고리화 또는 수지상 구조와 같은 고유한 분자 토폴로지를 채택하는 등의 변형을 통해 나노구조나 기능의 조절이 용이하다.
자기조립 나노구조체 중에서 베시클(Vesicle)은 대표적인 약물 전달체로, 기본 구성단위로는 펩티드보다 지질과 합성 폴리머가 가장 널리 알려져 있다. 현재까지 개발된 나노약물들은 지질을 기반으로 하는 것이 대부분이다. 특히, 최초 FDA 승인된 나노약물인 Doxil®도 지질을 기반으로 하는 것으로 알려져 있다. 이러한 지질은 베시클 외에도 엑소좀과 기타 세포외 베시클의 주요 성분으로 작용하며, 잠재적 약물 운반체로서 큰 영향력을 행사하고 있다.
베시클은 리포좀, 폴리머좀 및 엑소좀과 같은 약물전달체로써 광범위하게 사용되는데, 앞서 설명한 바와 같이 대부분 지질을 기반으로 할 뿐 펩티드를 사용한 베시클에 대한 연구는 거의 이뤄지지 않고 있다. 펩티드는 자기조립 빌딩 블록과 생리활성 기능을 갖는 유닛으로써 이중 역할을 수행할 수 있으나, 생체 외에서는 안정적이라도 생체 내에서는 불안정한 구조를 가져 응집되거나 독성을 띄거나 세포 내로 전달되지 못하는 등의 문제를 갖기 때문에, 펩티드를 기반으로 하는 베시클(이하, '펩티좀(peptidesomes)'이라고도 한다)은 수많은 문제들을 해결하지 않는 이상 실질적인 약물전달 시스템(drug delivery system, DDS)까지 이어지지 못한다. 특히 펩티드는 외부 환경에 민감하게 반응하므로 생체 외에서의 우수한 효과가 있더라도 생체 내에서 제대로 작동하지 않는 문제가 있다.
상술한 문제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 수많은 자기조립 나노구조체를 제조하고, 이에 대한 기능을 평가하였으며, 그 결과 생체 외에서와 생체 내에서 동일한 성능을 유지할 수 있는 자기조립 나노구조체를 제조하기 위해서는, 다음과 같은 다섯가지 문제를 해결해야 한다는 것을 확인하였다: ⅰ. 펩티드 빌딩 블록의 선택과 나노크기 문제; ⅱ. 약물의 함유량에 따른 형태학적 변형 문제; ⅲ. 세포내 전달효율과 세포독성의 반비례 관계 문제; ⅳ. 생체 내 환경에서의 큰 응집체 형성 문제; ⅴ. 생체 내에서 SPN 나노구조체의 구조적 안정성 유지 문제;
상술한 바와 같이, 펩티좀에서 발생하는 문제들을 체계화한 휴리스틱 해결방안(heuristic solution) 전략 순서도를 개발함으로써, 이에 따라 생체 외 및 생체 내에서 동일한 효과를 나타낼 수 있는 새로운 구조를 갖는 펩티좀 및 이를 구성하는 고리형 펩티드를 개발하였기에 이르렀다.
따라서 본 발명에서는 상기 다변수 접근 방식을 통해 나노크기를 가지면서, 약물 로딩에도 입자의 응집이 없고, 독성이 낮으며, 암세포 표적화 기능을 가지면서, 세포내 엔도좀을 통해서가 아닌 직접 세포 내로 전달되며, 단백질 분해효소에 저항성을 가져 생체 내 안정성이 우수한 새로운 구조의 고리형 펩티드 및 이로부터 제조된 펩티좀을 완성하였다.
특허문헌 1. 대한민국 등록특허공보 제10-2353979호
따라서, 본 발명은 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 생체 내 약물의 전달과 안정성이 우수한 펩티좀을 제공할 수 있는 고리형 펩티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 암세포 표적화 기능을 가지면서, 세포내 엔도좀을 통해서가 아닌 직접 세포 내로 전달되어 약물의 효과가 우수하며, 단백질 분해효소에 저항성을 가져 생체 내 안정적으로 존재할 수 있는 펩티좀을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩티좀을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물, 암 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, (a) 2 내지 12개의 L 또는 D형 아르기닌 잔기로 이루어진 친수성 펩티드; (b) 하기 일반식 1로 표시되는 소수성 펩티드;를 포함하고, 상기 (a)와 (b)는 링커에 의해 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 고리형 펩티드를 제공한다.
[일반식 1]
Xaa1-Lys-Xaa2
상기 식 1에서,
Xaa1 및 Xaa2는 서로 독립적으로, 트립토판(W) 또는 페닐알라닌(F)이다.
상기 서열번호 1에서, Xaa1은 라이신기(Lys)의 입실론 아미노기에 결합되어 있는 것일 수 있다.
상기 (a)는 2 내지 10개인 L 또는 D형 아르기닌 잔기로 이루어진 친수성 펩티드일 수 있다.
상기 소수성 펩티드(b)에서 라이신 잔기의 알파 아미노기에 소수성 리간드 또는 소수성 약물이 결합되어 있는 것일 수 있다.
상기 소수성 리간드는 C8 내지 C24의 지방산 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 지방산은 올레산(oleic acid), 라우릭산(lauric acid), 팔미트산(palmitic acid), 리놀레산(linoleic acid) 및 스테아르산(stearic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 소수성 약물은 독소루비신, 파크리탁셀(Paclitaxel), 시스플라틴(Cisplatin), 시로리무스(Sirolimus) 및 에토포시드(etoposide)로 구성된 항암제 또는 프탈로시아닌계(Phthalocyanine) 화합물, 포르피린계(Porphyrins) 화합물, 플루오레세인(Fluorescein)계 화합물 및 클로린계(Chlorins) 화합물로부터 선택되는 어느 하나의 광감작제일 수 있다.
상기 식 1에서, Xaa1 및 Xaa2는 각각 독립적으로 트립토판(W) 또는 페닐알라닌(F)일 수 있다.
상기 링커는 서열번호 8 내지 15의 링커 펩티드, Ebes 및 oligo ethylene glycol(OEG)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 친수성 펩티드(a)의 서열이 서열번호 1 내지 7 중에서 선택되는 어느 하나로 표시되는 것일 수 있다.
상기 고리형 펩티드는 하기 화학식 1 내지 5로 표시되는 화합물로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
상기 고리형 펩티드는 용액 상에서, 소포체 형태의 펩티좀(peptisome)으로 자가조립되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 목적은 적어도 하나 이상의 상기 고리형 펩티드가 액상에서 자가조립하여 형성된 소포체 구조를 갖는 구형의 펩티좀를 제공하는 것이다.
상기 펩티좀은 중공형 코어; 및 상기 고리형 펩티드를 포함하는 이중층 구조를 갖는 쉘;로 구성되는 것일 수 있다.
상기 펩티좀은 코어 부분에 친수성 약물이 포획되고, 쉘 부분에 소수성 약물이 포획되어 다중 약물 방출이 가능한 것일 수 있다.
상기 펩티좀의 평균 직경은 10 내지 150 nm일 수 있다.
상기 펩티좀의 쉘 평균 두께는 1 내지 20 nm일 수 있다.
상기 고리형 펩티드는 친수성 펩티드(a)가 서로 다른 2종류의 고리형 펩티드 혼합일 수 있다.
상기 고리형 펩티드 혼합은 친수성 펩티드가 서열번호 1 내지 5로부터 선택되는 제1 고리형 펩티드와 상기 친수성 펩티드가 서열 6 또는 7인 제2 고리형 펩티드의 혼합일 수 있다.
상기 제1 고리형 펩티드는 하기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 것 중에서 어느 하나이고, 상기 제2 고리형 펩티드 하기 화학식 4로 표시되는 것일 수 있다.
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
상기 고리형 펩티드 혼합은 제1 고리형 펩티드 1 내지 50 몰%와 잔량의 제2 고리형 펩티드로 포함된 것일 수 있다.
상기 액상은 글루코스, 폴리올 및 증류수로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 용액일 수 있다.
상기 액상은 1 내지 10 중량% 글루코스, 10 내지 30 중량% 폴리올 및 잔량의 증류수를 포함하는 용액일 수 있다.
상기 폴리올은 에틸렌글리콜, 프로판디올, 부탄디올, 펜탄디올, 헥산디올, 글리세롤 및 폴리에틸렌글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리올일 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩티좀 및 상기 펩티좀 내에 봉입된 약물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물를 제공한다.
상기 약물은 친수성 약물, 소수성 약물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 펩티좀의 코어에는 친수성 약물이 봉입되고, 상기 펩티좀의 이중층 구조를 갖는 쉘 내부에는 소수성 약물이 봉입되는 것일 수 있다.
상기 소수성 약물은 독소루비신, 파크리탁셀(Paclitaxel), 시스플라틴(Cisplatin), 시로리무스(Sirolimus) 및 에토포시드(etoposide)로 구성된 항암제 또는 프탈로시아닌계(Phthalocyanine) 화합물, 포르피린계(Porphyrins) 화합물, 플루오레세인(Fluorescein)계 화합물 및 클로린계(Chlorins) 화합물로부터 선택되는 어느 하나의 광감작제일 수 있다.
상기 펩티좀은 암 세포의 엔도좀이 아닌 세포 내에 직접 침투되어 소수성 약물을 1차적으로 방출하고, 광역학에 의해 생성된 활성산소종에 반응하여 펩티좀을 붕괴시켜 코어에 포함된 친수성 약물을 2차적으로 모두 방출하는 것일 수 있다.
상기 암은 폐암, 위암, 신경교종, 간암, 흑색종, 신장암, 요로상피암, 두경부암, 메르켈세포종(Merkel-cell carcinoma), 전립선암, 혈액암, 유방암, 유선암, 대장암, 결장암, 직장암, 췌장암, 뇌암, 난소암, 방광암, 기관지암, 피부암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 비인두 선암, 갑상선암, 골암 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 암일 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩티좀 및 조영물질을 포함하는 암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에 따르면, 고리형 펩티드는 자기조립을 통해 액상에서 중공형 코어 및 이중층 쉘을 갖는 소포체 구조의 펩티좀을 제조할 수 있다.
본 발명의 펩티좀은 생체 외에서 뿐만 아니라 생체 내에서도 안정적으로 작용하며, 특히 생체 내 단백질 분해효소에 안정적이므로 생체 내에서 실질적인 약물 전달체로써 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명의 펩티좀은 별도의 리간드 추가없이 암 세포 표적화 및 암 세포 침투 기능을 동시에 가지며, 코어와 쉘에 각각 친수성 약물과 소수성 약물의 로딩이 가능하므로, 한번의 투여로 서로 다른 약물의 전달 효과를 제공할 수 있다.
본 발명의 펩티좀을 구성하는 고리형 펩티드는 저분자 물질로 합성이 쉽고 용이할 뿐만 아니라, 펩티좀 역시 액상에서 자기조립을 통해 형성되므로 제조방법상 경제적 효과를 제공할 수 있다.
도 1은 종래 나노약물 전달체들의 일반적인 형태를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 2a는 실시예 2-1 내지 2-5로부터 제조된 고리형 펩티드를 정제하고, MALDI-TOF MS spectra으로 분석한 결과 그래프이다. 도 2a에서 R2는 실시예 2-1의 고리형 펩티드이고, R3은 실시예 2-2의 고리형 펩티드이며, R6은 실시예 2-3의 고리형 펩티드이며, RGD2는 실시예 2-4의 고리형 펩티드, R6-Pa는 실시예 2-5의 고리형 펩티드이다.
도 2b는 실시예 2-1 내지 2-5로부터 제조된 고리형 펩티드를 정제한 후, HPLC 크로마토그램으로 분석한 결과이다. 도 2b에서 R2는 실시예 2-1의 고리형 펩티드이고, R3은 실시예 2-2의 고리형 펩티드이며, R6은 실시예 2-3의 고리형 펩티드이며, RGD2는 실시예 2-4의 고리형 펩티드, R6-Pa는 실시예 2-5의 고리형 펩티드이다.
도 3은 본 발명의 실시예 2-3으로부터 제조된 고리형 펩티드(R6)의 구조를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 4는 증류수 상에서 실시예 2-1의 고리형 펩티드(R2)의 자가조립 거동에 대한 AFM 이미지이다. 도 4의 상단에는 고리형 펩티드(R2)가 액상에서 자가조립되어 소포체 형태로 제조된 펩티좀(peptisome)의 구조를 도시한 것이다.
도 5는 증류수 상에서 실시예 2-1의 고리형 펩티드(R2)(a) 실시예 2-2의 고리형 펩티드(R3)(b) 및 실시예 2-3의 고리형 펩티드(R6)(c)의 자가조립 거동에 대한 AFM 이미지이다.
도 6은 실시예 2-1 내지 2-3으로부터 제조된 고리형 펩티드의 서로 다른 원뿔의 중심각에 따른 증류수에서의 자가조립 나노구조체인 펩티좀(peptisome)의 구조와 온도별 평균직경을 나타낸 도면이다.
도 7은 실시예 2-1(a), 실시예 2-2(b) 및 실시예 2-3(c)의 고리형 펩티드로부터 제조된 펩티좀(peptisome)의 온도별(20 ℃, 30 ℃, 40 ℃) 평균직경을 DLS로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 실시예 2-3의 고리형 펩티드의 펩티좀(R6)의 TEM 이미지이다. 도 8a는 확대이미지이고, 도 8b는 다수의 펩티좀을 보여주는 이미지이다.
도 9는 약물이 봉입되기 전(R6)과, 초음파로 약물이 봉입된 후의 펩티좀(Peptidesome R6<-Pa)을 AFM으로 촬영한 이미지와 이의 구조를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 10은 실시예 4-3의 약물이 봉입된 펩티좀(R6<-Pa)을 2%(w/v) tween 80을 포함하는 PBS에 보관하였을 때, 37 ℃ 조건 하에서 시간별 Pa 방출양(%)을 분석한 그래프이다.
도 11은 유리 Pa와 실시예 4-6d의 약물이 봉입된 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)의 자외선 흡수 스펙트럼(UV absorption spectra)이다.
도 12는 실시예 2-5의 고리형 펩티드(R6-Pa)로 제조된 펩티좀을 AFM으로 촬영한 이미지이다.
도 13은 실시예 3-3의 펩티좀(peptisome R6), 실시예 3-4의 펩티좀(peptisome RGD2) 및 실시예 3-6의 공종조립 펩티좀(R6:RGD2)에 대한 세포 생존율을 농도별로 분석한 그래프이다.
도 14는 Pa 몰농도를 서로 다르게 혼합하여 제조된 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(실시예 4-6b 내지 4-6h)의 형광스펙트럼이다. excitation 파장은 507 nm이다.
도 15는 실시예 4-6a의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(0.5:9.5), 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9), 실시예 4-6i의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1.5:8.5)에 대한 세포 생존율을 분석한 그래프이다.
도 16 및 도 17은 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)을 TEM으로 촬영한 사진이다.
도 18은 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)에 대한 AFM 이미지이다.
도 19는 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)에 대한 구조를 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 20은 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)을 HeLa 세포에 처리한 후, Pa 형광(적색)을 CLSM(Confocal laser scanning microscopy)로 확인한 결과이다.
도 21은 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)을 HeLa 세포에 처리한 후, Pa 형광(적색)과 LysoTracker(초록색)의 형광을 공동분석한 형광 이미지(a)와 이를 확대한 형광 이미지(b)이다.
도 22는 레이저를 조사한 후 SCC7 세포의 생존율을 MTT로 분석하여 나타낸 그래프이다.
도 23은 SCC7 세포에 유리 Pa와 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)를 처리한 후, 레이저를 조사하여 광역학에 의한 항암효과를 분석하기 위해 세포 생존율을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 24는 SOSG(Singlet Oxygen Sensor Green)으로 측정한 유리 Pa와 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)의 단일항 산소(singlet oxygen)를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 25는 세럼이 없는 RPMI 1640 배지에 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)을 첨가한 후, 이의 AFM 이미지이다.
도 26은 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)의 AFM 이미지로, 도 26a는 NIR을 조사하기 전에 촬영한 것이고, 도 26b는 NIR을 조사한 후에 촬영한 것이다.
도 27은 혈청 단백질 존재하에서 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)의 평균 직경을 측정하여 나타낸 크기 분포도이다.
도 28은 유리 Pa(a), 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(DW)(b) 및 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(G&G)(c)을 처리한 각각의 SCC7 세포를 CLSM으로 촬영한 사진이다. 도 28에서 적색은 Pa이고, 청색은 핵(nucleus)을 나타낸다.
도 29는 유리 Pa, 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(DW) 및 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(G&G)을 처리한 각각의 SCC7 세포를 유세포분석(FACS)으로 분석한 결과 그래프이다.
도 30은 유리 Pa, 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(DW) 및 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(G&G)을 처리한 각각의 SCC7 세포에 대한 생존율을 분석한 결과이다. 에러바는 평균 ± 표준편차(mean ± standard deviation)이고(n=3), 통계학적 유의성 검증은 two-sample Student's t-test 사용하였으며, p 값이 0.005 미만인 경우 유의한 것으로 판정하였다(*** P < 0.001).
도 31은 유리 Pa, 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(DW) 및 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(G&G)를 처리한 SSC7 세포로부터, DCFDA를 사용하여 분석한 ROS 생산 분석결과 그래프이다. 에러바는 평균 ± 표준편차(mean ± standard deviation)이다(n=3).
도 32는 유리 Pa 비교군, 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(DW) 투여군 및 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(DW) 투여군에 대한 시간별 전신 NIR 형광 이미지이다. 검은점은 종양영역을 의미한다.
도 32는 유리 Pa 비교군, 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(DW) 투여군 및 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(DW) 투여군에 대한 시간별 전신 NIR 형광 이미지이다. 검은점은 종양영역을 의미한다.
도 33은 유리 Pa 비교군, 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(DW) 투여군 및 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(DW) 투여군으로부터 분리한 각 장기를 형광 현미경으로 촬영한 이미지이다.
도 34는 도 33에서의 데이터로부터 형광세기를 정량화하여 나타낸 그래프이다. 에러바는 평균 ± 표준편차(mean ± standard deviation)이다(n=3).
도 35는 유리 Pa 비교군, 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(DW) 투여군 및 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(DW) 투여군로부터 채취한 혈액을 형광 현미경으로 촬영한 이미지(상)와 이를 정량화한 그래프(하)이다(n=3).
도 36은 유리 Pa 비교군, 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(DW) 투여군 및 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(DW) 투여군로부터 채취한 저온절단 암조직 시료를 형광 현미경으로 측정한 이미지이다.
도 37은 14일째 대조군(saline), 유리 Pa 비교군 및 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(G&G) 투여군으로부터 분리한 암 조직을 촬영한 사진이다.
도 38은 대조군(saline), 유리 Pa 비교군 및 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(G&G) 투여군에서 시간별 암 크기를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 39는 14일째 대조군(saline), 유리 Pa 비교군 및 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(G&G) 투여군으로부터 분리한 암 조직의 무게를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 40은 14일째 대조군(saline), 유리 Pa 비교군 및 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(G&G) 투여군으로부터 분리한 암 조직을 H&E로 염색하여 형광 현미경으로 촬영한 이미지이다.
도 41은 대조군(saline), 유리 Pa 비교군 및 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(G&G) 투여군의 시간별 체중변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 42는 14일째 대조군(saline), 유리 Pa 비교군 및 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(G&G) 투여군으로부터 분리한 주요 장기(심장, 폐, 간, 비장, 신장)을 H&E로 염색하고 형광 현미경으로 촬영한 이미지이다.
도 43은 단백질 분해효소 trypsin의 존재 하에서, 실시예 3-4의 펩티좀(peptisome RGD2)의 HPLC 분석 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
일반적으로 지질, 고분자, 펩티드 및 초분자 빌딩 블록은 구형 미셀, 원통형 미셀 및 베시클과 같은 일반적인 형태로 조립된다. 이중에서도 소포체(vesicle)는 약물전달체로서 가장 광범위하게 사용되었다. 세포내 수송시스템, 엑소좀, 외피 바이러스 등도 자가조립된 모폴로지의 형태를 갖는 소포체이다. 이러한 소포체의 가장 큰 이점은 서로 다른 약물의 로딩이 가능하다는 점이다.
도 1에 자가조립 나노구조체에서 저분자 약물이 로딩되는 일반적인 3가지 형태를 개략적으로 도시하였다. 소포체는 비극성 약물(Nonpolar drug)은 캡슐화 과정(encapsulation mechanism)을 통해 쉘의 소수성 공간에 봉입할 수 있고, 극성 약물(polar drug)은 봉입 과정(entrapment mechanism)을 통해 소포체의 코어에 포획할 수 있다. 그러나 구형 및 원통형 미셀은 오직 하나의 약물만을 포획할 수 있다는 단점이 있다. 따라서 소포체의 유용성과 초분자 빌딩 블록으로서 펩티드의 다기능성을 모두 확보할 수 있는 새로운 펩티드를 설계하고자 노력한 바 완성하였다. 본 발명은 새롭게 설계된 펩티드만으로 구성되는 새로운 형태의 자가조립 나노구조체인 펩티좀을 확보하였으며, 이를 통해 세포 내 전달 효율과 약물의 봉입 효율이 모두 우수한 약물 전달체 등의 용도로 활용할 수 있다.
본 발명의 일 측면은 (a) 2 내지 12개의 L 또는 D형 아르기닌 잔기로 이루어진 친수성 펩티드; 및 (b) 하기 일반식 1로 표시되는 소수성 펩티드;를 포함하고, 상기 (a)와 (b)는 링커에 의해 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 고리형 펩티드에 관한 것이다.
[일반식 1]
Xaa1-Lys-Xaa2
상기 식 1에서,
Xaa1 및 Xaa2는 서로 독립적으로, 트립토판(W) 또는 페닐알라닌(F)이다.
본 발명에 따른 고리형 펩티드는 자가조립을 통해 우수한 약물전달효율과 봉입효율 및 구조적 안정성을 갖는 펩티좀을 형성할 수 있는 것으로, 하기와 같은 장점들을 갖는다.
1) 본 발명에 따른 고리형 펩티드는 선형이 아닌 고리형 구조를 가지므로, 자가조립을 통해 소포체 구조의 펩티좀을 형성하려는 강한 성향을 갖는다. 따라서 동일한 양의 펩티드를 액상에 분산하였을 때, 얻을 수 있는 펩티좀의 수율이 높으므로, 각각 별도의 용기에 담았다가 혼합하여 약물 전달체로 사용하는 키트로써의 활용 가능성도 우수하다.
2) 본 발명에 따른 고리형 펩티드는 세포 표면 표적화와 막 전위에 주요한 역할을 하는 아르기닌 잔기를 2 내지 12개 포함함으로써, 효율적인 세포 내 전위를 확보할 수 있다.
3) 본 발명에 따른 고리형 펩티드는 생체 내에서 세포내 전달효율이 우수한 200 nm 미만, 바람직하게 150 nm 미만, 더욱 바람직하게는 100 nm 미만의 펩티좀을 자기조립을 통해 형성할 수 있다.
4) 본 발명에 따른 고리형 펩티드는 구조가 단순하고 분자량이 낮아 합성과정이 쉬울 뿐만 아니라 합성수율도 우수하다는 장점이 있다.
상기 (a)는 2 내지 10개인 L 또는 D형 아르기닌 잔기로 이루어진 친수성 펩티드일 수 있으며, 보다 바람직하게는 2 내지 6개의 L 또는 D형 아르기닌 잔기로 이루어진 친수성 펩티드일 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 3 내지 6개의 L 또는 D형 아르기닌 잔기로 이루어진 친수성 펩티드일 수 있으며, 가장 바람직하게는 2개 또는 6개의 L 또는 D형 아르기닌 잔기로 이루어진 친수성 펩티드인 것이 20 내지 40 ℃의 온도 조건 하에서 100 nm 미만의 평균 직경을 갖는 펩티좀을 자가조립을 통해 형성할 수 있다.
본 발명에 따른 고리형 펩티드는 상기 친수성 펩티드(a)의 서열이 서열번호 1 내지 7 중에서 선택되는 어느 하나로 표시되는 것일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 1, 2, 5, 7 중에서 선택되는 어느 하나로 표시되는 것일 수 있다.
[서열 1]
RR
[서열 2]
RRR
[서열 3]
RRRR
[서열 4]
RRRRR
[서열 5]
RRRRRR
[서열 6]
RGD
[서열 7]
RGDRGD
상기 식 1에서, Xaa1은 라이신기(Lys)의 입실론 아미노기에 결합되어 있는 것일 수 있는데, Xaa1이 라이신기(Lys)의 입실론 아미노기에 결합되어 있는 경우, 본 발명의 고리형 펩티드의 고리구조의 안정화에 더 유리하다.
상기 식 1에서, Xaa1 및 Xaa2는 각각 독립적으로 트립토판(W) 또는 페닐알라닌(F)인 것이 바람직한데, 보다 바람직하게는 트립토판(W)일 수 있다.
상기 일반식 1로 표시되는 소수성 펩티드는 서열번호 8 내지 11로 표시되는 것 중에서 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 7 내지 10일 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 10일 수 있다.
[서열 8]
WKQ
[서열 9]
QKW
[서열 10]
WKW
[서열 11]
QKQ
상기 링커는 펩티드 결합에 유연한 구조를 가지는 당업계에 널리 알려진 링커라면 특별히 제한되지 않고 사용할 수 있으며, 예를 들어 서열번호 8 내지 15의 링커 펩티드, Ebes 및 oligo ethylene glycol(OEG)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 가장 바람직하게는 Ebes일 수 있다.
[서열 12]
GS
[서열 13]
GSG
[서열 14]
GGGS
[서열 15]
GSGG
[서열 16]
GSGGG
[서열 17]
GSGGS
[서열 18]
GSGSG
[서열 19]
GGSGS
상기 Ebes는 하기 구조식 a로 표시되는 것일 수 있다.
[화학식 a]
상기 소수성 펩티드(b)에서 라이신 잔기의 알파 아미노기에 소수성 리간드 또는 소수성 약물이 결합되어 있을 수 있는데, 소수성 리간드가 결합되어 있는 경우에는 펩티좀 형성시 약물 전달체로써 작용하고, 소수성 약물이 결합되어 있는 경우에는 약물 전달체와 동시에 전구약물로써 작용할 수 있다. 다만 소수성 약물이 결합되어 있는 경우에는 콩깍지(peapod)와 같은 나노구조를 형성한다. 따라서 바람직하게는 상기 소수성 펩티드(b)의 라이신 잔기의 알파 아미노기에 소수성 리간드가 결합되는 것일 수 있다.
상기 소수성 리간드는 C8 내지 C24의 지방산 중에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 C8 내지 C24 지방산은 바람직하게 C12 내지 C20의 포화 또는 불포화 지방산일 수 있으며, 보다 바람직하게 상기 지방산은 올레산(oleic acid), 라우릭산(lauric acid), 팔미트산(palmitic acid), 리놀레산(linoleic acid) 및 스테아르산(stearic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 가장 바람직하게는 올레산(oleic acid) 또는 라우릭산(lauric acid)을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 소수성 약물은 독소루비신, 파크리탁셀(Paclitaxel), 시스플라틴(Cisplatin), 시로리무스(Sirolimus) 및 에토포시드(etoposide)로 구성된 항암제 또는 프탈로시아닌계(Phthalocyanine) 화합물, 포르피린계(Porphyrins) 화합물, 플루오레세인(Fluorescein)계 화합물 및 클로린계(Chlorins) 화합물로부터 선택되는 어느 하나의 광감작제일 수 있다.
상기 광감각제는 프탈로시아닌계(Phthalocyanine) 화합물, 포르피린계(Porphyrins) 화합물, 플루오레세인(Fluorescein)계 화합물 및 클로린계(Chlorins) 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 프탈로시아닌(phthalocyanine), 아연-프탈로시아닌(Zinc-phthalocyanine), 구리-프탈로시아닌(Copper-phthalocyanine), 포토프린(Photofrin), 포토젬(Photogem), 라다클로린(Radachlorin), 클로린 e6(Chlorin e6), 페오포르바이드 A (Pheophorbide A) 및 로즈벵갈(Rose Bengal)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 광감각제는 페오포르바이드 A 또는 로즈벵갈을 사용하는 것이, 심부 조직에서의 암세포를 보다 효과적으로 손상 또는 사멸을 일으킬 수 있으며, 광역학 치료 효율에 있어서 상승효과를 나타낼 수 있어 더욱 바람직하다.
상기 고리형 펩티드는 하기 화학식 1 내지 5로 표시되는 화합물로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 바람직하게는 하기 화학식 3 또는 4로 표시되는 화합물로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
상기 고리형 펩티드는 용액 상에서, 소포체 형태의 펩티좀(peptisome)으로 자가조립되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 적어도 하나 이상의 상기 고리형 펩티드가 수상에서 자기조립하여 형성된 소포체 구조를 갖는 구형의 펩티좀에 관한 것이다.
상기 펩티좀은 중공형 코어; 및 상기 고리형 펩티드를 포함하는 이중층 구조의 쉘;로 구성될 수 있다.
상기 펩티좀은 코어 부분에 친수성 약물이 포획되고, 쉘 부분에 소수성 약물이 포획되어 다중 약물 방출이 가능하다. 상기 이중층 쉘은 상기 고리형 펩티드 복수 개가 나란히 줄을 서 한층을 이루고, 상기 고리형 펩티드 층 두 개가 모여 이중층이라 불리는 구조가 될 수 있다(도 4 및 도 8a 참조). 상기 고리형 펩티드는 극성인 고리의 머리부분(친수성 펩티드 부분)은 친수성을 가지고 무극성인 고리의 밑부분과 꼬리부분(소수성 펩티드 및/또는 소수성 리간드(또는 소수성 약물) 부분)은 소수성을 가지기 때문에 인지질 이중층과 같은 이중층 구조를 가질 수 있다.
상기 이중층 쉘은 상기 고리형 펩티드 층 두 개가 모여 형성된 이중막 구조로, 상기 고리형 펩티드의 고리의 머리부분이 쉘의 외부방향으로 향해있고, 밑부분과 꼬리부분이 쉘의 내부방향으로 항하도록 배열되어 있으며, 배열된 고리형 펩티드 간의 상호작용을 통해 이중층 구조가 단단하게 유지될 수 있다. 일반적인 인지질 이중층은 소수성 구조의 유동성으로 쉽게 생체 내에서 분해되나, 본 발명에 따른 펩티좀은 상술한 과정을 통해 설계된 고리형 펩티드를 포함함으로써, 이들의 분자 배열 및 분자 정렬을 통해 생체 내 외에서도 모두 안정적인 구조를 제공할 수 있다.
상기 펩티좀의 평균 직경은 10 내지 150 nm일 수 있는데, 바람직하게 상기 펩티좀의 평균 직경은 50 내지 130 nm이며, 온도에 따라 100 nm 이하의 나노크기를 갖는데, 구체적으로 20 내지 30 ℃에서 50 내지 90 nm의 평균 직경을 갖는 것을 특징으로 한다. 즉 저온에서는 평균 직경이 더 작아지는 것으로 저온 보관시 펩티좀의 구조가 더 밀접해져 더욱 견고해지므로 저온 보관에 매우 용이하다는 것을 알 수 있다.
상기 펩티좀의 쉘 평균 두께는 1 내지 20 nm일 수 있고, 바람직하게는 1 내지 15 nm, 5 내지 15 nm, 8 내지 13 nm, 9 내지 12 nm, 9 내지 11 nm일 수 있다.
상기 고리형 펩티드는 친수성 펩티드(a)가 서로 다른 2종류의 고리형 펩티드 혼합일 수 있는데, 한 종류의 고리형 펩티드로만 사용한 경우에 비해 2종류의 고리형 펩티드로 구성되는 것이 구조적 형태적 변화없이 기능을 상호보완할 수 있다는 장점을 갖는다. 본 발명에 따른 고리형 펩티드는 모두 양친매성 펩티드이고, 전체 구조가 원뿔형태로 동일하므로 혼합하더라도 펩티좀을 용이하게 형성할 수 있다. 다만 본 발명에 따른 친수성 펩티드와 다른 서열이 추가 되거나 삭제되거나 치환되는 경우에는 2차원 구조가 달라질 수 있으므로, 고리형 펩티드의 서열은 본 발명에 따른 서열 중에서 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 펩티좀의 약물전달체로써 전체적인 형태나, 구조 및 기능에 전혀 악영향을 미치지 않으면서 기능의 개선만을 도모하기 위해서 바람직하게 상기 고리형 펩티드 혼합은 친수성 펩티드(a)가 서열번호 1 내지 5로부터 선택되는 제1 고리형 펩티드와 상기 친수성 펩티드(b)가 서열 6 또는 7인 제2 고리형 펩티드의 혼합일 수 있다.
보다 바람직하게 상기 제1 고리형 펩티드는 하기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 것 중에서 어느 하나이고, 상기 제2 고리형 펩티드 하기 화학식 4로 표시되는 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 하기 화학식 3으로 표시되는 제1 고리형 펩티드와 화학식 4로 표시되는 제2 고리형 펩티드의 혼합을 사용할 수 있다.
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
세포내 전달효율과 안정성, 생체적합성 등이 현저히 우수하도록 하기 위해서는, 바람직하게 상기 고리형 펩티드 혼합에서, 제1 고리형 펩티드와 제2 고리형 펩티드가 적절한 비율로 혼합된 것일 수 있다. 구체적으로 상기 고리형 펩티드 혼합은 제1 고리형 펩티드 1 내지 50 몰%와 잔량의 제2 고리형 펩티드로 포함된 것일 수 있고, 보다 바람직하게는 제1 고리형 펩티드 1 내지 50 몰%와 50 내지 99 몰%의 제2 고리형 펩티드로 포함된 것일 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 제1 고리형 펩티드 1 내지 30 몰%와 잔량의 제2 고리형 펩티드로 포함된 것일 수 있으며, 보다 더욱 바람직하게는 제1 고리형 펩티드 1 내지 30 몰%와 70 내지 99 몰%의 제2 고리형 펩티드로 포함된 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 5 내지 15 몰%의 제1 고리형 펩티드와 잔량의 제2 고리형 펩티드 또는 85 내지 95 몰%의 제2 고리형 펩티드가 혼합되는 것일 수 있다. 상기 혼합비를 만족하는 것이 세포내 전달효율이 우수하고 독성이 전혀 없어서 생체 내 안정성이 가장 우수하다.
본 발명의 펩티좀이 자기조립되는 액상 조건은 본 발명에 따른 고리형 펩티드가 자기조립을 통해 펩티좀을 형성하는 용액이라면 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 글루코스, 폴리올 및 증류수로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 용액일 수 있다. 구체적으로 본 발명에 따른 펩티좀의 평균 직경은 용액에 상관없이 150 nm 평균 직경을 유지하며, 이는 다양한 기능을 수행함에 문제되지 않는다. 특히 세포 내 전달 효율에 입자의 크기는 큰 영향을 미치지 않으므로, 150 nm의 평균 직경이라면 특별히 제한되지 않는다. 다만, 펩티좀의 사용 목적에 따라 평균 직경이 110 nm 미만으로 유지해야할 경우에는 글루코스 수용액 또는 폴리올 수용액을 사용하는 것이 바람직하다. 글루코스는 생체적합성 분자로 주사용 제제로 널리 사용되는 안정한 물질이다.
후술하는 실시예에서 펩티좀을 글루코스, 폴리올 및 증류수를 포함하는 용액에서 자기조립화 또는 보관하는 경우, 100 nm의 평균 직경을 갖는 것을 확인한 바, 본 발명에 따른 펩티좀의 구조 안정화를 위해 글루코스, 폴리올 및 증류수를 포함하는 용액이 가장 바람직하다.
폴리올(polyol)은 본 발명에 따른 펩티좀의 콜로이드 안정성을 증가시키고, 펩티좀 주입에 의한 생체 내 삼투압농도(osmolarity)와 긴장성(tonicity)을 유지하는 역할을 하는 것이라 여겨진다. 따라서 본 발명에 따른 펩티좀은 글루코스, 폴리올 및 증류수로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 용액 내에서 응집체를 형성하지 않으면서 150 nm 미만, 140 nm 미만, 130 nm 미만, 120 nm 미만의 펩티좀을 얻을 수 있다는 것을 확인하였다. 보다 바람직하게는 글루코스, 폴리올 및 증류수의 혼합액일 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 1 내지 10 중량% 글루코스, 10 내지 30 중량% 폴리올 및 잔량의 증류수를 포함하는 것일 수 있으며, 2 내지 7 중량% 글루코스, 15 내지 25 중량% 폴리올 및 잔량의 증류수, 4 내지 6 중량% 글루코스, 17 내지 22 중량% 폴리올 및 잔량의 증류수를 포함하는 것일 수 있다. 상기 범위를 만족하는 경우 펩티좀의 평균직경이 100 nm 미만을 유지할 수 있다.
상기 폴리올은 생체적합성이 우수한 물질이라면 특별히 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 에틸렌글리콜, 프로판디올, 부탄디올, 펜탄디올, 헥산디올, 글리세롤 및 폴리에틸렌글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리올일 수 있고, 보다 바람직하게는 에틸렌글리콜, 글리세롤 및 폴리에틸렌글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리올일 수 있으며, 가장 바람직하게는 글리세롤일 수 있다.
본 발명에 따른 펩티좀은 5 중량% 글루코스, 20 중량% 글리세롤 및 잔량의 증류수 혼합액(이하 'G&G'라고도 한다)에서 보관하는 것이 응집을 억제할 수 있고, 100 nm 미만의 평균직경으로 유지할 수 있다.
상기와 같은 구조를 갖는 상기 펩티좀은 생체 내 목적하는 세포 내부로 전달되어 약물을 목적 세포 내에 직접적으로 전달할 수 있으며, 상기 목적 세포는 암세포 또는 염증세포 등 질병과 관련된 세포일 수 있으며, 구체적으로 암세포일 수 있다.
상기 암세포는 하기 종양 질환과 관련된 세포일 수 있다: 종양 질환; 신생물; 외투세포 림프종; 다발성 골수종(예컨대 전이성 다발성 골수종); 폐암; 비소세포 폐암(예컨대 전이성 비소세포 폐암, 비소세포 폐암종 또는 전이성 비소세포 폐암); 소세포 폐암종; 고형 종양; 림프종(예컨대 림프형질세포성 림프종, 미만성 거대 B세포 림프종, 비호지킨 림프종, 여포성 림프종 또는 말초 T세포 림프종); 만성 림프성 백혈병; T세포 전림프구성 백혈병; 유방암(예컨대 전이성 유방암); 자궁경부암; 결장직장암; 결장암; 흑색종; 전립선암(예컨대 호르몬 불응성 전립선암); 췌장암(예컨대 전이성 췌장암); 난소암; 교모세포종(예컨대 다형성 교모세포종); 두부 편평세포암종; 경부 편평세포암종; 아밀로이드증(예컨대 원발성 전신 아밀로이드증); 뼈 질환; 혈액암; 이식편대숙주병, 발덴슈트룀(Waldenstrom) 거대글로불린혈증, 무증상 골수종(Smoldering Myeloma) 및 의미불명 단일클론성 감마병증(MGUS)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 펩티좀은 세포내에 전달될 때, 암 세포의 엔도좀이 아닌 세포 내에 직접 침투되어 전달되므로, 약물의 약효를 그대로 또는 증가시켜 구현할 수 있다.
상기 약물은 친수성 약물, 소수성 약물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 상기 펩티좀의 코어에는 친수성 약물이 봉입되고, 상기 펩티좀의 이중층 구조를 갖는 쉘 내부에는 소수성 약물이 봉입되는 것일 수 있다.
상기 친수성 약물은 친수성을 띄는 약물이라면 특별히 제한되지 않고 본 발명에 따른 펩티좀의 코어 내에 봉입할 수 있으며, 예를 들어 이온, 저분자물질 약물, 유전자 약물, 단백질 약물 또는 이의 혼합물일 수도 있고, 암 세포를 진단 또는 검출하기 위하여 조영물질을 포함하는 것일 수 있다.
상기 저분자물질 약물은 친수성을 띄는 저분자물질이라면 특별히 제한되지 않으며, 예를들어 안티피린(antipyrin), 안티페브린(antifebrin), 아스피린(aspyrin) 또는 살리피린(salipyrin)일 수 있고, 항염증제로서 아스피린(aspirin), 살리실레이트(salicylates), 이부프로펜(ibuprofen), 플루르비프로펜(Flurobiprofen), 피록시캄(pyroccikam), 나프로센(naproxen), 페노프로펜(fenoprofen), 인도메타신(indomethacin), 페닐부타존(phenyltazone), 메소트렉세이트(methotrexate), 메클로에타민(mechlorethamine), 덱사메타손(dexamethasone), 프레드니솔론(prednisolone), 셀레콕시브(celecoxib), 발데콕시브(valdecoxib), 니메슐리드(nimesulide), 코르티손(cortisone) 또는 코르티코스테로이드(corticosteroid)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유전자(gene) 약물은 작은 간섭 리보핵산(small interfering RNA, siRNA), 작은 헤어핀 리보핵산(small hairpin RNA, shRNA), 마이크로 리보핵산(microRNA, miRNA) 또는 플라스미드 데옥시리보핵산(plasmid DNA)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 단백질(protein) 약물은 단일클론 항체(monoclonal antibody)계열의 트라스트주맵(trastuzumab), 리투시맵(rituximab), 베바시주맵(bevacizumab), 세투시맵(cetuximab), 보테조밉(bortezomib), 엘로티닙(erlotinib), 제피티닙(gefitinib), 이매티닙 메실레이트(imatinib mesylate), 수니티닙(sunitinib); 효소(enzyme)계열의 L-아스파라지나제(L-asparaginase); 호르몬(hormone)계의 트리톨레린 아세테이트(triptorelin acetate), 메제스트롤 아세테이트(megestrol acetate), 플루타미드(flutamide), 비카루타마이드(bicalutamide), 고세레린(goserelin); 시토크롬 씨(cytochrome c) 또는 p53 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 소수성 약물은 독소루비신, 파크리탁셀(Paclitaxel), 시스플라틴(Cisplatin), 시로리무스(Sirolimus) 및 에토포시드(etoposide)로 구성된 항암제 또는 프탈로시아닌계(Phthalocyanine) 화합물, 포르피린계(Porphyrins) 화합물, 플루오레세인(Fluorescein)계 화합물 및 클로린계(Chlorins) 화합물로부터 선택되는 어느 하나의 광감작제일 수 있다.
상기 광감각제는 프탈로시아닌계(Phthalocyanine) 화합물, 포르피린계(Porphyrins) 화합물, 플루오레세인(Fluorescein)계 화합물 및 클로린계(Chlorins) 화합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 프탈로시아닌(phthalocyanine), 아연-프탈로시아닌(Zinc-phthalocyanine), 구리-프탈로시아닌(Copper-phthalocyanine), 포토프린(Photofrin), 포토젬(Photogem), 라다클로린(Radachlorin), 클로린 e6(Chlorin e6), 페오포르바이드 A (Pheophorbide A) 및 로즈벵갈(Rose Bengal)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 상기 광감각제는 페오포르바이드 A 또는 로즈벵갈을 사용하는 것이, 심부 조직에서의 암세포를 보다 효과적으로 손상 또는 사멸을 일으킬 수 있으며, 광역학 치료 효율에 있어서 상승효과를 나타낼 수 있어 더욱 바람직하다.
본 발명의 또 다른 측면은 펩티좀 및 상기 펩티좀 내에 봉입된 약물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, 전체 펩티좀을 100 몰부로 하였을 때, 펩티좀 내에 봉입되는 약물은 200 몰부 미만 혼합되는 것일 수 있고, 바람직하게는 1 몰부 내지 100 몰부 미만 혼합되는 것일 수 있고, 보다 바람직하게는 1 몰부 내지 50 몰부 미만 혼합되는 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 1 몰부 내지 25 몰부 미만일 수 있다. 상기 약물이 200몰부를 초과하면 결정성이 충분히 발현되지 않으므로 200 몰부 미만인 것이 바람직하다. 25 몰부를 초과하면 자가조립을 통해 약물을 봉입하는 나노구조체를 형성하긴 하지만 연장 및 응집되어 콩깍지 구조의 나노구조체를 형성하므로, 상기 25 몰부 미만으로 약물이 포함되는 것이 자가조립시 구형의 소포체 구조를 펩티좀을 얻을 수 있으므로 가장 바람직하다. 하한범위의 경우 1몰부 이상이면 바람직하나, 0 몰부로 포함되어도 지장은 없다(약물이 포함되지 않는 경우를 의미한다.).
상기 약물은 친수성 약물, 소수성 약물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 상기 펩티좀의 코어에는 친수성 약물이 봉입되고, 상기 펩티좀의 이중층 구조를 갖는 쉘 내부에는 소수성 약물이 봉입되는 것일 수 있다.
상기 소수성 약물은 독소루비신, 파크리탁셀(Paclitaxel), 시스플라틴(Cisplatin), 시로리무스(Sirolimus) 및 에토포시드(etoposide)로 구성된 항암제 또는 프탈로시아닌계(Phthalocyanine) 화합물, 포르피린계(Porphyrins) 화합물, 플루오레세인(Fluorescein)계 화합물 및 클로린계(Chlorins) 화합물로부터 선택되는 어느 하나의 광감작제일 수 있으며, 보다 구체적인 것은 상기 '펩티좀'에 기재된 사항을 참고하기로 한다.
상기 친수성 약물은 상기 '펩티좀'에 기재된 사항을 참고하기로 한다.
상기 펩티좀은 암 세포의 엔도좀이 아닌 세포 내에 직접 침투되어 소수성 약물을 1차적으로 방출하고, 광역학에 의해 생성된 활성산소종에 반응하여 펩티좀을 붕괴시켜 코어에 포함된 친수성 약물을 2차적으로 모두 방출할 수 있다.
본 발명에서 '암 세포(tumor cell)'는 암 조직, 양성 또는 악성 타입의 세포를 의미하며, 종양세포와 혼용하여 사용할 수 있다.
본 발명에서, '암'은, 악성 종양 또는 신생물로도 불리는 세포의 사멸 조절과 관련된 질병으로서, 정상적 인 세포 사멸 균형이 무너져 세포가 과다 증식하게 됨으로써 생기는 상태 또는 질병을 지칭한다. 이러한 비정상 적 과다 증식 세포들은 경우에 따라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴를 형성하고, 체내 정상적인 구조를 파괴하거나 변형시키게 된다.
상기 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있고, 원발성암 또는 전이암일 수 있다. 상기 암은 폐암, 위암, 신경교종, 간암, 흑색종, 신장암, 요로상피암, 두경부암, 메르켈세포종(Merkel-cell carcinoma), 전립선암, 혈액암, 유방암, 유선암, 대장암, 결장암, 직장암, 췌장암, 뇌암, 난소암, 방광암, 기관지암, 피부암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 비인두 선암, 갑상선암, 골암 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 암은 특정 유전자가 돌연변이된 암일 수 있다.
본 발명에서 예방은 본 발명의 약학 조성물의 투여로 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, 치료란, 본 발명의 약학 조성물의 투여로 인해 이미 유발된 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어 '치료 또는 예방'은 질환(예를 들어, 암 질환 또는 장애)의 증상, 합병증, 또는 생화학적 징후의 발생을 예방하거나 지연시킴으로써, 질환, 병태, 또는 장애의 증상을 완화시키거나 질환, 병태, 또는 장애가 추가로 발생하는 것을 막거나 억제하는 것을 포함한다. 치료는 질환이 나타난 후 증상의 예방적 억제(질환의 발병을 예방하거나 지연시키거나, 이의 임상적 또는 준임상적 증상의 발현을 예방하기 위한) 또는 치료적 억제 또는 완화일 수 있다.
본 발명에서 상기 약학 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 본 발명의 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose), 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 의도한 투여 방법에 적합한 임의의 형태일 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 있어서 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 약학 조성물의 투여경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 경구 또는 비경구일 수 있으며, 상기 비경구 투여는 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 피내, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 두개골내, 뇌혈관내(intracerebroventricular), 자궁내, 자궁내 경막, 설하 또는 직장을 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 유효성분이 표적 부위로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
상기 약학 조성물 내의 유효성분의 함량은 약학 조성물의 사용 목적, 제형의 형태 등에 따라서 적절하게 조절 가능하며, 예컨대, 약학 조성물의 전체 중량 기준으로 0.001 내지 99중 량%, 0.001 내지 90중량%, 0.001 내지 50중량%, 0.01 내지 50중량%, 0.1 내지 50중량%, 또는 1 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다
본 발명의 약학 조성물은 사용되는 유효성분의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 펩티좀 및 조영물질을 포함하는 암의 검출 및 진단용 조성물에 관한 것이다.
상기 펩티좀은 암 세포 표적 지향성을 가질 뿐만 아니라 세포 내 전달효율이 우수하므로, 표적 세포 외에서는 안정적으로 존재하다가 표적 세포 내에 조영 물질을 정확하게 전달하기 때문에, 암 세포의 정확한 검출 및 진단이 가능하다. 일 예로 암 조직 내부, 특히 암세포 내로 침투하여 조영 물질을 방출하므로, 다양한 종류의 암을 진단하기 위한 조영제로서 활용될 수 있다.
상기 조영물질은 MRI 조영제로서 상자성 물질, 가돌리늄과 망간의 착화합물 형태로서, Gd-DTPA, Gd-DTPA-BMA, GdDOTA, Gd-DO3A 및 초상자성 물질인 산화철로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있고, PET 조영제로서 방사성 동위원소 18F, 124I, 64Cu, 99mTc 및 11In으로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으며, 킬레이트 DOTA 및 DTPA 착화합물 형태로서 상기 펩티좀의 코어 또는 쉘 내부에 친수성 또는 소수성에 따라 봉입시킬 수 있다. 구체적으로 본 발명에 따른 펩티좀의 코어에는 친수성 조영물질이 봉입될 수 있고, 이중층 구조의 쉘 내부에는 소수성 조영물질이 봉입될 수 있다. 이는 자가조립을 통해 자동적으로 봉입되므로 별도의 과정이 없으므로 제조 과정이 쉽고 간편하며 합성 수율이 높다. 또한 상기 조영물질은 별도의 담체 없이 목적하는 세포 내로 효율적으로 전달될 수 있으므로 정확하게 암을 진단 및 검출할 수 있다는 장점이 있다.
본 발명에 따른 암 진단용 조성물을 생체 또는 시료에 투여하고, 상기 생체 또는 시료로부터 형광신호를 감지하여 영상을 수득할 수 있으며, 생체 또는 시료 내에서 발광되는 형태를 분석하여 암세포의 위치 또는 암에 대한 정보를 제공하기 위한 판단자료 혹은 암을 진단하기 위한 판단자료로 활용할 수 있다.
본 발명에서 "시료" 는 진단하고자 하는 대상으로부터 분리한 조직 또는 세포를 의미한다. 또한 상기 암 진단용 조성물을 생체 또는 시료에 주입하는 단계는 의약 분야에서 통상적으로 이용되는 경로를 통해 투여될 수 있으며, 예를 들어 경구; 또는 정맥내, 복강내, 근육내, 피하 및 국부 경로 등의 비경구 투여를 이용할 수 있다.
이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
실험재료
일반 화학 물질은 Sigma-Aldrich(USA) 및 Merck(Germany)에서 구입하여 사용하였다. Fmoc-아미노산 및 커플링 시약은 Novabiochem(Germany) 및 Anaspec(USA)에서 구입하여 사용하였다. Fmoc-PEG2-Suc-OH(cat number : AS-61924-1)는 Anaspec으로부터 구입하여 사용하였다. Fmoc-PEG2-Suc-OH는 Fmoc-Ebes-OH(oligoethylene glycol - based linker N-(Fmoc-8-amino-3,6-dioxaoctyl)succinamic acid)라고도 한다. HPLC 용매와 배지는 Fisher Scientific(USA)에서 구입하였고, 페오포바이드(Pheophorbide)는 Cayman(USA)에서 구입하였으며, MTT(Thiazoyl blue tetrazolium bromide)는 Biosesang(Seongnam, Gyeonggi-do, Korea)에서 구입하였으며, Hoechst 33342는 Thermo Fisher Scientific(Waltham, MA, USA)에서 구입한 것을 사용하였다.
자기조립 나노입자의 크기는 1 cm 경로 길이를 갖는 UV-투명 큐벳을 사용하여 동적 광산란 크기 분배기(dynamic light scattering size distributor)(Particle Size & Zeta Potential Analyzer, ELS-1000ZS, Otsuka Electronics, Japan)로 분석하였다. SPN의 고리형 펩티드의 2차 구조는 Peltier 온도 컨트롤러가 장착된 Chirascan circular dichroism spectrometer(Applied Photophysics, UK)를 사용하여 분석하였다. 샘플의 CD(circular dichroism) 스펙트럼은 2mm 경로 길이를 갖는 큐벳을 사용하여 190 내지 260nm 범위에서 분석하였다. 샘플의 몰 잔기 타원율(molar residue ellipticity)은 아미노산 잔기당 계산하였다. 모든 마우스 실험은 가톨릭대학교 동물실험실에서 승인한 동물 프로토콜(2020-0359-05)에 따라 수행하였다.
<실험방법>
원자력 현미경(Atomic force microscopy, AFM)
5 μl 샘플을 절단된 운모(mica) 표면에 놓고 건조하여 시편을 제조하였다. 상기 시편에 염이 존재할 경우에는, 증류수(DW) 3 mL로 세척하여 과잉 염을 제거하였다. 다음, 과잉의 증류수를 제거하고, 아르곤 분위기하에서 시편을 빠르게 건조하였다. 건조된 시편은 비접촉 모드에서 NX10 AFM instrument(Park Systems, Korea)를 사용하여 분석하였다. 스캔 속도는 1.0Hz로 설정하였다. 데이터는 XEN 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
투과 전자 현미경(Transmission Electron Microscopy, TEM)
3 μl 샘플을 탄소 코팅된 구리 그리드에 놓고, 1분이 지난 후, 초과 샘플을 여과지로 제거하였다. 음성 염색을 위해 0.1%(w/v) uranyl acetate/distilled water 1~2 mL 방울을 그리드에 첨가하고, 1분이 지난 후, 과도한 염색용액을 여과지로 제거하였다. 염색 시편은 가속전압 200kV에서 JEM-F200 field emission transmission electron microscope(JEOL, Japan)을 이용하여 분석하였다. 데이터 분석을 위해 GATAN 소프트웨어를 사용하였다.
생체 외( in vitro )에서의 세포내 전달효율 및 FACS 분석
SCC7 세포에서 물질의 세포 흡수는 CLSM(LSM700, Carl Zeiss, Germany) 및 유세포 분석(FACS Canto II, BD Biosciences, Bedford, MA, USA)을 통한 Pa의 고유 형광을 기반으로 분석하였다. SCC7 세포를 24웰 플레이트에 5×104의 밀도로 분주하고 밤새 배양하였다. 다음, 시료 200 mL를 각 웰의 800 mL 배양배지에 첨가하였다. 4시간 동안 처리한 다음 시료를 제거하고 세척하였다. 세포 이미징을 위해, 핵(nuclei)을 Hoechst 33342로 염색하였다.
ROS 생성분석(Detection of ROS generation)
생체 내(in vivo) 및 생체 외(In vitro)에서의 ROS 생산은 DCFDA(2',7'-dichlorofluorescin diacetate)를 사용하여 측정하였다. SCC7 세포에 2 μg/ml의 시료로 처리하고 1시간 배양하고, 세척하였다, 세척된 세포에 PBS에 용해된 20 μM DCFDA를 30분 동안 처리하고, 레이저를 조사하였다. 세포의 DCFDA 형광은 유세포 분석을 통한 FITC 파장으로 측정하였다. 생체 내 ROS 측정을 위해 50 mg/kg의 DCFDA를 종양 동물모델의 종양 조직 내에 주사를 통해 투여하고, 이전 문헌의 PDT 측정방식을 참고하여 PDT를 수행하였다[S. Uthaman, S. Pillarisetti, A.P. Mathew, Y. Kim, W.K. Bae, K.M. Huh, I.K. Park, Long circulating photoactivable nanomicelles with tumor localized activation and ROS triggered self-accelerating drug release for enhanced locoregional chemo-photodynamic therapy, Biomaterials 232 (2020)]. 종양 동물모델에서 종양 조직을 적출하고 10 μm 두께로 동결절편을 제작한 후 inverted fluorescence microscopy으로 DCFDA의 형광을 검출하였다.
생체 내에서(in vivo) 생체분포(biodistribution) 분석
종양 동물모델은 C3H/HeN 마우스의 왼쪽 허벅지에 30 mL의 식염수(saline)에 2×106 SCC7 종양세포를 피하 주사를 통해 주입하여 개발하였다. 종양의 크기가 200~250 mm3에 도달하면, 100 mL의 샘플용액을 꼬리 정맥을 통해 투여하였다. IVIS Lumina XRMS(PerkinElmer, Inc., Waltham, MA, USA)를 사용하여 샘플을 주입하고. 3 시간, 6 시간, 12 시간 및 24 시간에서 전신 생체분포(biodistribution)를 관찰하였다. 이때 꼬리 정맥에서 30 μL의 혈액도 채취한 후, IVIS 시스템으로 형광 이미징을 측정하였다. 24시간에서는 혈액 뿐만 아니라 종양 및 주요 장기(심장, 폐, 간, 비장, 신장)를 절개 및 회수하고 IVIS로 생체외 형광 이미지를 얻었다. IVIS 이미징은 Cy5.5의 파장에서 수행되었다. 각각의 동물모델로부터 회수한 종양을 4% 파라포름알데히드에서 24시간 동안 고정하고, 10% sucrose에서 20% sucrose로 농도를 점차 증가하면서 처리하였다. 이후 종양 조직을 OCT(optimal cutting temperature) 화합물에서 동결시키고, 10 μm 두께로 절단하였다. 절단된 조직을 유리 슬라이드에 부착하고 건조시켰다. 건조된 조직을 PBS로 여러 번 세척하고, 실온에서 20분 동안 Hoechst 33342 2 μg/mL로 염색하였다. 조직의 형광은 Observer.Z1 inverted fluorescence microscope(Carl Zeiss, Jena, Germany)으로 관찰하였다.
생체 내(In vivo) 종양 치료 효과 분석
종양 동물모델(SCC7 종양)은 생체분포 분석과 동일하게 준비하였다. 종양 부피가 약 50 mm3에 도달했을 때 샘플을 마우스(xenograft mouse)에 정맥내로 투여하였다. 시료 주입 3시간 후 종양 부위에 NIR 레이저(671 nm)를 0.53 W/cm2의 파워로 15분간 조사하고, 다음날에도 동일한 샘플을 동일한 부위에 투여하고 근적외선을 조사하는 과정을 반복하였다. 동물모델의 종양 부피와 체중은 2일마다 기록하였다. 치료가 끝나면 조직학적 분석을 위해 주요 장기와 종양을 절개하고 회수하였다. 상기 장기와 종양조직을 고정하고 절단한 후, 헤마톡실린과 에오신(H&E) 염색하였고, 이를 현미경(AxioImager A1, Zeiss, Germany)으로 관찰하였다.
통계 분석
두 그룹 간의 차이를 비교하기 위해 Student's t-test을 사용하였다, 일원 분산 분석(ANOVA)과 Tukey's post hoc analysis을 사용하여 여러 그룹 간의 차이를 비교하였다. P < 0.05의 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 1-1 내지 1-4. 선형 펩티드 합성
첫 번째 잔기(Fmoc-Ebes-OH)를, 1 M의 DIPEA/MC(diisopropylethylamid/methylene chloride)에서 2-chlorotrityl resin(Novabiochem, Germany)에 로딩하였다. 다음 Tribute 펩티드 합성기(Protein Technologies, USA)를 사용한 표준 Fmoc 프로토콜에 따라 아미노산 결합을 수행하였다. 합성단계에서 Dde-Lys(Fmoc)-OH를 제외하고 표준 아미노산 보호그룹을 사용하였다. 보호된 단편을 제조하기 위해, N-말단 Fmoc 그룹을 제거하고, 펩티드가 로딩된 수지를 절단용액(cleavage cocktail)(아세트산/TFE(2,2,2-trifluoroethanol)/MC(2:2:6, v/v/v))에 1??2시간 동안 처리한 다음 여과 및 수집하였다(4 mL × 2 cycles). 헥산과 공비 혼합물(azeotrope)인 아세트산을 제거하여 백색 분말의 구조식 1 내지 4로 표시되는 선형의 펩티드를 회수하였다.
[구조식 1]
W-ε-KW-linker-RR-linker
[구조식 2]
W-ε-KW-linker-RRR-linker
[구조식 3]
W-ε-KW-linker-RRRRRR-linker
[구조식 4]
W-ε-KW-linker-RGDRGD-linker
상기 서열에서, 링커는 하기 화학식 a로 표시되는 화합물(ebes)이고, ε은 라이신 잔기의 엡실론-아미노기(epsilon-amino group)를 의미한다.
[화학식 a]
실시예 2-1. 고리형 펩티드(R 2 ) 합성
실시예 1-1의 선형 펩티드를 사용하여 고리형 펩티드를 제조하였다. 먼저, 머리와 꼬리가 고리화되도록 유사고희석 조건(Pseudo-high-dilution condition)을 이중 주사기 방법을 사용하여 달성하였다. 실시예 1-1 내지 1-4 중에서 어느 하나의 선형 펩티드(20 μmol, 1 당량)와 DIPEA(4당량)를 DMF(20 mL)에 넣어 각각 혼합액을 제조하고, 이를 제1 주사기에 각각 넣었다. 제2 주사기에는 DMF(20 mL)에 용해된HCTU(2-(6-chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate, 1 당량)를 넣었다. DMF(20 mL)에 용해된 HCTU(0.1 당량) 및 HOBt(hydroxybenzotriazole, 1당량)을 함유하는 둥근 바닥 플라스크를 준비하고, 상기 플라스크에 두 주사기의 용액을 주사기 펌프를 사용하여 0.06 mL/분의 속도로 첨가하였다. 주사기의 용액이 모두 플라스크에 투여되고 나면, 반응 혼합물을 55 ℃에서 밤새 교반하였다. 다음, 회전 증발기로 DMF를 제거하고, MC, TBME(tert-butyl methyl ether) 및 헥산을 첨가하여 고리화된 펩티드를 침전시켰다. 라이신의 Dde 그룹은 2%(v/v) hydrazine/DMF(2 min × 4 cycles)를 사용하여 탈보호하였다.
상술한 과정을 통해 제조된 고리형 펩티드에 지방산(lauric acid) 꼬리를 결합시키기 위해, 고리화된 펩티드 단편(20 μmol, 1 당량), lauric acid(5 당량) 및 DIPEA(10 당량)를 DMF(2 mL)에 용해시키고 밤새 교반하였다. 생성물을 증류수(DW)로 침전시키고 원심분리를 통해 회수하였다. 최종 탈보호는 절단용액(TFA/TIS/물; 95:2.5:2.5, v/v/v)을 사용하여 3시간동안 수행되었고, TBME로 분쇄(trituration)하여, 화학식 1로 표시되는 지방산이 결합된 고리형 펩티드(R2)를 제조하였다.
[화학식 1]
제조된 고리형 펩티드는 용리액으로 물(0.1% TFA) 및 아세토니트릴(0.1% TFA)을 사용하는 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 정제하였다.
상술한 과정을 통해 제조된 고리형 펩티드의 분자량을 MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight) 질량 분석으로 확인하여 도 2a에 나타내었으며, 순도는 분석용 HPLC과 동일하게 >95%인 것을 확인하였다. HPLC 분석 결과는 도 2b에 나타내었다. 고리형 펩티드 농도는 Rn 또는 R6-Pa에 대해 667 nm에서 Pa(44,500 M-1cm-1)와 280 nm에서 트립토판(5,502 M-1cm-1)의 몰 흡광 계수(molar extinction coefficient)를 사용하여 물/아세토니트릴(1:1)에서 분광광도계로 결정하였다.
실시예 2-2. 고리형 펩티드(R 3 ) 합성
실시예 1-1 대신 실시예 1-2의 선형 펩티드를 사용한다는 것을 제외하고는 모두 실시예 2-1와 동일하게 수행하여, 화학식 2로 표시되는 지방산이 결합된 고리형 펩티드(R3)를 제조하였다.
[화학식 2]
제조된 고리형 펩티드는 용리액으로 물(0.1% TFA) 및 아세토니트릴(0.1% TFA)을 사용하는 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 정제하였다.
상술한 과정을 통해 제조된 고리형 펩티드의 분자량을 MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight) 질량 분석으로 확인하여 도 2a에 나타내었으며, 순도는 분석용 HPLC과 동일하게 >95%인 것을 확인하였다. HPLC 분석 결과는 도 2b에 나타내었다. 고리형 펩티드 농도는 Rn 또는 R6-Pa에 대해 667 nm에서 Pa(44,500 M-1cm-1)와 280 nm에서 트립토판(5,502 M-1cm-1)의 몰 흡광 계수(molar extinction coefficient)를 사용하여 물/아세토니트릴(1:1)에서 분광광도계로 결정하였다.
실시예 2-3. 고리형 펩티드(R 6 ) 합성
실시예 1-1 대신 실시예 1-3의 선형 펩티드를 사용한다는 것을 제외하고는 모두 실시예 2-1와 동일하게 수행하여, 화학식 3으로 표시되는 지방산이 결합된 고리형 펩티드(R6)를 제조하였다.
[화학식 3]
제조된 고리형 펩티드는 용리액으로 물(0.1% TFA) 및 아세토니트릴(0.1% TFA)을 사용하는 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 정제하였다.
상술한 과정을 통해 제조된 고리형 펩티드의 분자량을 MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight) 질량 분석으로 확인하여 도 2a에 나타내었으며, 순도는 분석용 HPLC과 동일하게 >95%인 것을 확인하였다. HPLC 분석 결과는 도 2b에 나타내었다. 고리형 펩티드 농도는 Rn 또는 R6-Pa에 대해 667 nm에서 Pa(44,500 M-1cm-1)와 280 nm에서 트립토판(5,502 M-1cm-1)의 몰 흡광 계수(molar extinction coefficient)를 사용하여 물/아세토니트릴(1:1)에서 분광광도계로 결정하였다.
실시예 2-4. 고리형 펩티드(RGD 2 ) 합성
실시예 1-1 대신 실시예 1-4의 선형 펩티드를 사용한다는 것을 제외하고는 모두 실시예 2-1와 동일하게 수행하여, 화학식 4로 표시되는 지방산이 결합된 고리형 펩티드(RGD2)를 제조하였다.
[화학식 4]
제조된 고리형 펩티드는 용리액으로 물(0.1% TFA) 및 아세토니트릴(0.1% TFA)을 사용하는 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 정제하였다.
상술한 과정을 통해 제조된 고리형 펩티드의 분자량을 MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight) 질량 분석으로 확인하여 도 2a에 나타내었으며, 순도는 분석용 HPLC과 동일하게 >95%인 것을 확인하였다. HPLC 분석 결과는 도 2b에 나타내었다. 고리형 펩티드 농도는 Rn 또는 R6-Pa에 대해 667 nm에서 Pa(44,500 M-1cm-1)와 280 nm에서 트립토판(5,502 M-1cm-1)의 몰 흡광 계수(molar extinction coefficient)를 사용하여 물/아세토니트릴(1:1)에서 분광광도계로 결정하였다.
실시예 2-5. 고리형 펩티드(R 6 -Pa) 합성
실시예 1-1 대신 실시예 1-3의 선형 펩티드를 사용하고, lauric acid 대신 PDT 광역학 치료제인 Pa를 결합시킨다는 것을 제외하고는 모두 실시예 2-1와 동일하게 수행하였다.
실시예 1-3의 선형 펩티드로부터 제조된 고리형 펩티드를 준비하고(실시예 2-1 참조), 여기에 지방산 대신 Pa(pheophorbide a)를 결합시키기 위해 다음의 과정을 수행하였다. Pa의 NHS 에스테르(succinimidyl ester)를 먼저 제조하였다. Pa의 NHS 에스테르는 Pa(20 mg, 1 당량), NHS(N-hydroxysuccinimide)(1.7 당량), EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)(1.7 당량) 및 DMAP(4-dimethylaminopyridine)(0.4 당량)을 MC(6 mL)에 용해한 후, 어둠 속에서 밤새 반응시켜 제조하였다. 고리화된 펩티드 단편(25 μmol, 1 당량), Pa의 NHS 에스테르(7 당량), 트리에틸아민(14 당량), EDC(14 당량) 및 DMAP(14 당량)을 MC(5 mL)에 용해시킨 후, 2일 동안 반응시켰다. 다음 반응액으로부터 MC를 증발시켜 분말을 얻고, 상기 분말을 소량의 MC에 재용해시킨 후, TBME와 헥산의 혼합물을 사용하여 침전시켰다. 최종 탈보호는 절단용액(TFA/TIS/물; 95:2.5:2.5, v/v/v)을 사용하여 3시간동안 수행되었고, TBME로 분쇄(trituration)하여, 화학식 5로 표시되는 지방산이 결합된 고리형 펩티드(R6-Pa)를 제조하였다.
[화학식 5]
제조된 고리형 펩티드는 용리액으로 물(0.1% TFA) 및 아세토니트릴(0.1% TFA)을 사용하는 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 정제하였다.
상술한 과정을 통해 제조된 고리형 펩티드의 분자량을 MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight) 질량 분석으로 확인하여 도 2a에 나타내었으며, 순도는 분석용 HPLC과 동일하게 >95%인 것을 확인하였다. HPLC 분석 결과는 도 2b에 나타내었다. 도 2에서 제조예 2-5의 R6-Pa는 두가지 피크가 검출되었으나, 이는 다른 형태의 동일한 화합물인 것으로 여겨진다. 고리형 펩티드 농도는 Rn 또는 R6-Pa에 대해 667 nm에서 Pa(44,500 M-1cm-1)와 280 nm에서 트립토판(5,502 M-1cm-1)의 몰 흡광 계수(molar extinction coefficient)를 사용하여 물/아세토니트릴(1:1)에서 분광광도계로 결정하였다.
실시예 3-1 내지 3-5. 펩티좀(peptisome R 2 , R 3 , R 6 , RGD 2 , R 6 -Pa) 제조
실시예 2-1 내지 실시예 2-5로부터 제조된 고리형 펩티드 각각의 분해(disassembly) 및 분자 혼합을 촉진하기 위해, 각각 30%(v/v)농도의 HFIP(hexafluoroisopropanol) 수용액에 용해하였다. 상기 혼합액에서 용매를 증발시킨 후, 고리형 펩티드를 적절한 용매 또는 완충액으로 재수화하여 자가조립을 유도하였으며, 이를 통해 소포체 형태의 각각의 펩티좀(순서대로 실시예 3-1 내지 35)(peptisome R2, R3, R6, RGD2, R6-Pa)을 제조 및 보관하였다.
실시예 3-6. 공동조립 펩티좀(R 6 :RGD 2 )(1:1) 제조
50 mol% : 50 mol%로 실시예 2-3으로부터 제조된 고리형 펩티드, 실시예 2-4로부터 제조된 고리형 펩티드를 30%(v/v) HFIP 수용액에 용해하였다. 상기 혼합액에서 용매를 증발시킨 후, 고리형 펩티드를 적절한 용매 또는 완충액으로 재수화하여 공동 자가조립을 유도하였으며, 이를 통해 소포체 형태의 펩티좀(R6:RGD2)(1:1)을 제조 및 보관하였다.
실시예 4-1 내지 4-4. 약물이 봉입된 펩티좀(R 2 <-Pa, R 3 <-Pa, R 6 <-Pa, RGD 2 <-Pa) 제조
실시예 2-1 내지 실시예 2-4로부터 제조된 고리형 펩티드와 Pa를 30%(v/v) HFIP 수용액에 용해하고, 용매를 증발시킨 다음 재수화하여, 약물이 봉입된 소포체형태의 펩티좀(순서대로 실시예 4-1의 R2<-Pa; 실시예 4-2 R3<-Pa; 실시예 4-3의 R6<-Pa, 실시예 4-4의 RGD2<-Pa)을 제조하였다.
실시예 4-6. 약물이 봉입된 공동조립 펩티좀(R 6 :RGD 2 <-Pa) 제조
다양한 비율로 실시예 2-3으로부터 제조된 고리형 펩티드, 실시예 2-4로부터 제조된 고리형 펩티드 및 Pa을 30%(v/v) HFIP 수용액에 용해하였다[표 1]. 상기 혼합액에서 용매를 증발시킨 후, 고리형 펩티드를 적절한 용매 또는 완충액으로 재수화하여 공동 자가조립을 유도하였으며, 별도의 표기가 없다면 상기 용매는 증류수(DW)이다. 이를 통해 소포체 형태의 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:1 내지 1:9)을 제조 및 보관하였다.
구분 펩티좀 혼합비(mol%) 전체 펩티좀 100 몰부에 대하여 첨가되는 Pa의 몰부
실시예 2-3의 고리형 펩티드 실시예 2-4의 고리형 펩티드 Pa
실시예 4-6a 5 95 12
실시예 4-6b 10 90 3.125
실시예 4-6c 6.25
실시예 4-6d 12
실시예 4-6e 25
실시예 4-6f 50
실시예 4-6g 100
실시예 4-6h 200
실시예 4-6i 15 85 12
실시예 4-6j 50 50 12
실험예 1. 고리형 펩티드의 구조 분석
본 발명에 따른 고리형 펩티드는 아르기닌 잔기로 구성된 친수성 부분과 2개의 트립포판 잔기와 C12의 탄화수소 화합물로 구성된 소수성 영역으로 이루어져 있다. 도 3에 고리형 펩티드(R6)의 구조를 개략적으로 도시하였다.
가장 먼저, 실시예 2-1로부터 제조된 2개의 아르기닌 잔기를 포함하는 고리형 펩티드의 자가조립 거동을 살펴보았고, 뒤이어 실시예 2-1 내지 2-3의 고리형 펩티드의 자가조립 거동도 살펴보았다. 구체적으로 각각의 고리형 펩티드(R2, R3, R6)을 증류수(DW)에 용해한 다음, 프로브 초음파(probe sonication)을 사용하여 분석하였다.
도 4는 증류수 상에서 실시예 2-1의 고리형 펩티드(R2)의 자가조립 거동에 대한 AFM 이미지이다. 도 4의 상단에는 자가조립되어 소포체 형태로 제조된 펩티좀의 구조를 도시한 것이다. 도 4에 나타난 바와 같이, 고리형 펩티드(R2)는 증류수 내에서 구형의 소포체 형태로 자기조립되어 존재한다는 것을 알 수 있다.
도 5는 증류수 상에서 실시예 2-1의 고리형 펩티드(R2)(a) 실시예 2-2의 고리형 펩티드(R3)(b) 및 실시예 2-3의 고리형 펩티드(R6)(c)의 자가조립 거동에 대한 AFM 이미지이다.
도 5에 나타난 바와 같이, 실시예 2-2 및 실시예 2-3의 고리형 펩티드는 실시예 2-1 고리형 펩티드의 기존구조는 유지하면서 친수성 부분의 부피분율을 증가시키기 위해 아르기닌 잔기를 추가한 것이다. 이로부터 형성된 펩티좀(R3, R6)의 형태를 AFM로 측정한 결과. 본 발명에 따른 고리형 펩티드는 아르기닌 잔기의 길이에 상관없이 모두 자기조립 나노구조체의 형태가 펩티좀(소포체)인 것을 알 수 있다.
실험예 2. 펩티좀(peptidesome)의 평균직경
앞선 실험을 통해 실시예 2-1 내지 2-3으로부터 제조된 고리형 펩티드를 증류수(DW)에 보관하였을 때, 소포체 형태의 자가조립 구조체를 형성한다는 것을 확인하였다. 이에 해당 자가조립 구조체의 직경을 확인하기 위하여, 동적 광산란(DLS)로 평균 유체역학적 직경(average hydrodynamic diameter, Dh)을 온도별(20 ℃, 30 ℃, 40 ℃)로 확인하였다.
도 6은 실시예 2-1 내지 2-3으로부터 제조된 고리형 펩티드의 서로 다른 원뿔의 중심각에 따른 증류수에서의 자가조립 나노구조체인 펩티좀(peptisome)의 구조와 온도별 평균직경을 나타낸 도면이다. 도 7은 실시예 2-1(a), 실시예 2-2(b) 및 실시예 2-3(c)의 고리형 펩티드로부터 제조된 펩티좀(peptisome)의 온도별(20 ℃, 30 ℃, 40 ℃) 평균직경을 DLS로 측정하여 나타낸 그래프이다.
본 발명의 고리형 펩티드는 자가조립에 의해 나노구조체를 형성할 때, 패킹 변수(packing parameter, P)와 분자 모양에 의해 영향을 받는다. 따라서 본 발명에서는 펩티좀을 형성하는 빌딩블록으로써 고리형 펩티드를 설계하고, 상기 고리형 펩티드의 형태를 원뿔형으로 단순화하였다. 따라서 본 발명에 따른 고리형 펩티드는 액상에서 자가조립에 의해 나노구조체를 형성할 때, 이중층 구조의 쉘을 갖는 소포체 형태일 것으로 예상하였고, 이를 펩티좀이라 명명하였다.
본 발명에 따른 고리형 펩티드의 원뿔구조의 중심각은 펩티좀의 최종 크기에 영향을 미칠 것으로 예상되었다. 이를 확인하기 위하여 DLS로 온도별 평균직경을 측정하고 개략적으로 도시화 하였다(도 6).
도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 고리형 펩티드는 유체내에서 하나의 빌딩블록으로 거동하여 소포체 형태의 구형 자가조립 나노구조체인 펩티좀(ppetisome)를 형성한다는 것을 확인하였다. 각각의 고리형 펩티드는 서로 다른 중심각을 갖는 원뿔 형태로 존재하므로, 이로부터 제조된 펩티좀은 서로 다른 평균직경을 갖게 된다는 것을 확인하였다.
도 6 및 도 7에 나타난 바와 같이 실시예 2-1의 고리형 펩티드로 형성된 증류수에서의 펩티좀은 20 내지 40 ℃의 조건하에서 99 nm 내지 127 nm의 평균 직경을 갖는 것을 알 수 있다. 일반적인 구형 미셀은 크기가 균질하고 직경이 분자 길이의 2배이다. 그러나 본 발명에 따른 고리형 펩티드(R2)의 분자길이가 4.5 nm이라는 점을 고려한다면, 이로부터 제조된 펩티좀(R2)은 미셀이 아닌 소포체 형태라는 것을 알 수 있다. 또한 실시예 2-1 내지 2-3의 고리형 펩티드는 증류수 내에서 펩티좀으로 형성될 때 균일하게 100 nm이하의 크기로 외부의 특정조건없이 자가조립되므로, 제조가 용이하다는 것을 확인하였다.
종합하면 본 발명에 따른 고리형 펩티드는 자가조립을 통해 소포체 구조를 갖는 펩티좀을 형성하며, 빌딩블록 내에 아르기닌 잔기의 부피분율이 증가할수록 펩티좀의 크기가 감소한다는 것을 알 수 있다. 특히 아르기닌 잔기 6개를 갖는 고리형 펩티드로 제조된 펩티좀(R6)은 모든 온도에서 100 nm 미만을 유지하였다.
실험예 3. 펩티좀의 구조분석
실시예 2-3으로부터 제조된 고리형 펩티드를 증류수(DW)에 넣은 후, 이로부터 제조된 펩티좀(R6)의 구조를 분석하고자 TEM으로 촬영하였다.
도 8은 실시예 2-3의 고리형 펩티드의 펩티좀(R6)의 TEM 이미지로, 이에 따르면 펩티좀(R6)은 구형이고, 이중층 구조의 쉘층과 중공형의 코어를 갖는 소포체 구조라는 것을 확인하였다. 쉘층의 두께는 10.26 ± 0.68 nm이고, 이는 고리형 펩티드(R6)로부터 예측한 이중층 모델(~9.92 nm)과 도식적으로 동일하였다.
실험예 4. 약물로딩 방법에 따른 펩티좀 구조분석
약물의 유사성을 평가하는 Lipinski의 다섯가지 법칙에 따르면, 대부분의 약물은 친유성(lipophilic)이다. 이에 본 발명의 펩티좀 역시 약물전달체로써의 효과를 평가하는데 있어서, 친유성 약물인 Pa(pheophorbid a)를 사용하였다. 상기 Ps는 0.014g/l의 낮은 수용해도를 갖는 소수성 물질로 알려져 있다. Pa는 식물 클로로필의 포르피린 유도체로, PDT(photodynamic therapy)를 위한 감광제로 주로 사용된다.
펩티좀(R6)에 비공유 약물 로딩을 위해, 실시예 2-3의 고리형 펩티드와 Pa를 증류수에서 혼합하고, 강한 초음파를 1 분간 처리하여, 약물이 봉입된 펩티좀(Peptidesome R6<-Pa)를 제조하였다. 초음파 처리 전후를 AFM으로 촬영하여 비교하였다.
도 9는 약물이 봉입되기 전(R6)과, 약물이 봉입된 후의 펩티좀(Peptidesome R6<-Pa)을 AFM으로 촬영한 이미지와 이의 구조를 개략적으로 도시한 도면으로, 이에 따르면 펩티좀(R6)은 용액 상에 구형을 유지하고 있었으나, Pa의 로딩과정 후 연장된 상부구조로 형태학적 변형이 발생한 것을 확인할 수 있다.
약물이 봉입된 후의 펩티좀(Peptidesome R6<-Pa)은 인근 펩티좀(R6)과의 융합에 의해 표면이 고르지 않은 완두콩 형태의 연장된 상부구조를 가지며, 이들 소포체의 두께는 이전과 유사하게 유지되는 것을 확인하였다.
소수성 약물인 Pa는 대부분 이중층 구조인 쉘층 내에 캡슐화되어 있었고, 이외에 소량의 용매화된 Pa 분자는 친수성인 코어 내부에 봉입되어 존재하는 것을 확인하였다.
실험예 4. 실시예 4-3의 약물이 봉입된 펩티좀(R 6 <-Pa)의 안정성
도 10은 실시예 4-3의 약물이 봉입된 펩티좀(R6<-Pa)을 2%(w/v) tween 80을 포함하는 PBS에 보관하였을 때, 37 ℃ 조건 하에서 시간별 Pa 방출양(%)을 분석한 그래프이다.
도 10에 나타난 바와 같이, 생체 외(in vitro)에서 실시예 4-3의 약물이 봉입된 펩티좀(R6<-Pa)은 24 시간동안 약물의 방출없이 안정적으로 존재하는 것을 확인하였다. 본 발명에 따른 펩티좀은 약물을 봉입한 상태로 약물의 방출없이 상온에서 장기간 보관할 수 있다는 것을 알 수 있다.
실험예 5. 약물이 봉입된 펩티좀(R 6 <-Pa)의 자외선 흡수 스펙트럼 분석
펩티좀(R6)에 비공유 약물 로딩을 위해, 실시예 4-6d의 약물이 봉입된 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)과 유리 Pa를 준비하고, AFM으로 촬영하여 비교하였다. 실시예 4-6d의 약물이 봉입된 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)은 증류수에 용해하였고, 유리 Pa는 DMSO에 용해하여 측정항ㅆ다.
도 11은 유리 Pa와 실시예 4-6d의 약물이 봉입된 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)의 자외선 흡수 스펙트럼(UV absorption spectra)이다.
도 11에 나타난 바와 같이, 유리 Pa의 Q-밴드에서 적색편이와 흡수강도 증가가 관찰되었다. 실시예 4-6d의 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)은 이중층 구조를 갖는 쉘 내부에서 Pa의 헤드-to-테일 J 응집(head-to-tail J-aggregation)이 관찰되었다. 즉 실시예 4-6d의 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)은 Pa 분자의 헤드-to-테일 stacking에 의해 서로 연결되므로, 입자간 융합이 발생하는 것을 알 수 있다.
실험예 6. 실시예 2-5의 고리형 펩티드(R 6 -Pa)로 제조된 펩티좀의 구조분석
본 발명에 따른 펩티좀(Peptidesome)이 입자간 응집되어 연장되는 이유를 확인하기 위하여, 고리형 펩티드의 소수성 영역에 Pa가 화학적으로 결합된 고리형 펩티드(실시예 2-5; R6-Pa)에 대한 분석을 수행하였다. 구체적으로 실시예 2-5의 고리형 펩티드(R6-Pa)를 증류수 상에 분산한 후, 자가조립에 의해 펩티좀을 형성한 다음 AFM으로 촬영하였다.
도 12는 실시예 2-5의 고리형 펩티드(R6-Pa)로 제조된 펩티좀를 AFM으로 촬영한 이미지로, 이에 따르면, 실시예 2-5의 고리형 펩티드(R6-Pa)는 증류수 내에서 표면이 고르지않은 콩깍지(peapod) 같은 나노구조체와 유사한 모양을 갖는 것으로 확인되었다. 본 발명에 따른 고리형 펩티드는 약물 로딩에 따라 상부구조 형성 유무를 제어할 수 있다는 것을 확인하였다.
실험예 7. 본 발명에 따른 펩티좀의 생체 안정성
약물전달체는 세포 내 전달 효율이 높으면서 생체내 부작용과 같은 독성은 낮아하는데, 일반적으로 상기 두 성질은 반비례 관계이다. 예를 들어 약물전달체가 세포내로 진입하기 위한 우수한 세포내 전달효율을 얻기 위해서는 세포의 특정 부분을 비정상적으로 파괴해아 한다. 이로 인해 약물전달체들은 대부분 부작용을 안고 있다. 생체 내 독성은 1상 임상시험의 1차 평가기준이기 때문에, 독성이 있다면 해당 약물전달체는 사용에 제한을 받을 수 밖에 없다. 종래 세포투과 펩티드는 여러개의 아르기닌 잔기를 기반으로 설계되어왔으나, 이 경우 세포 독성도 함께 증가하여 정상세포의 사멸을 유발하는 부작용도 증가하는 것으로 확인되었다.
이에, 본 발명에 따른 펩티좀(R6)을 세포에 처리하였을 때, 세포의 생존율을 분석하여 세포 독성을 확인하고자 하였다. 아르기닌 잔기에 의한 독성을 완화하기 위한 설계전략으로, 양쪽이온성(zwitterionic) RGD를 친수성 영역으로 포함한 고리형 펩티드(실시예 2-5, RGD2)과 혼합하여 공동조립된 펩티좀을 개발하였다. 이를 사용하여 세포의 생존율을 분석하였다.
구체적으로 SCC7 세포에 실시예 3-3의 펩티좀(peptisome R6), 실시예 3-4의 펩티좀(peptisome RGD2) 및 실시예 3-6의 공종조립 펩티좀(R6:RGD2)을 각각 다양한 농도(1 μM, 3 μM, 6 μM, 9 μM, 15 μM, 30 μM)로 처리하고, 4 시간 동안 배양하였다. 각각의 배양액을 채취하고 MTT assay 방법으로 세포 생존율을 측정하였다.
도 13은 실시예 3-3의 펩티좀(peptisome R6), 실시예 3-4의 펩티좀(peptisome RGD2) 및 실시예 3-6의 공종조립 펩티좀(R6:RGD2)에 대한 세포 생존율을 농도별로 분석한 그래프이다. 이에 따르면 실시예 3-3의 펩티좀(peptisome R6)과 실시예 3-6의 공종조립 펩티좀(R6:RGD2)은 10 μM 이상에서는 세포 독성을 나타내는 것을 확인할 수 있다. 반면 실시예 3-4의 펩티좀(peptisome RGD2)은 고농도에서도 세포 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다.
실험예 8. 본 발명에 따른 공동조립 펩티좀의 생체 안정성
실험예 7의 결과를 바탕으로 R6와 RGD2을 혼합하여 공동조립 펩티좀을 제조하는 경우, 세포독성의 조절이 가능하다는 것을 확인하였다. 따라서 다양한 비율로 R6와 RGD2의 혼합으로 제조된 공동조립 펩티좀을 제조한 후, 이에 대한 세포독성과 세포내 전달 효율을 확인하였다. 이에 앞서 Pa 캡슐화(Pa encapsulation)에 의한 응집체 형성을 방지하기 위하여, Pa 로딩 농도를 달리하여 형광 스펙트럼으로 분석하였다.
도 14는 Pa 몰농도를 서로 다르게 혼합하여 제조된 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(실시예 4-6b 내지 4-6h)의 형광스펙트럼이다. excitation 파장은 507 nm이다.
도 14에 나타난 바와 같이, 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(실시예 4-6e)의 스펙트럼은 청색편이(674 nm → 698 nm)하였고, 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(실시예 4-6f)의 스펙트럼은 완전히 이동하는 것을 확인할 수 있다. 즉 약물(Pa)이 전체 펩티좀 100몰부에 대하여 50 몰부 이상 첨가되는 경우 J-응집을 형성한다는 것을 알 수 있다.
약물(Pa)이 전체 펩티좀 100몰부에 대하여 200 몰부를 포함하는 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(실시예 4-6h)은 침전하였기 때문에, Pa 로딩 용량(loading capacity)은 전체 펩티좀 100몰부에 대하여 200몰부 이상도 가능하나, J-응집에 의해 펩티좀의 형태가 콩깍지와 같은 구조로 형성되므로, 이를 피하기 위해서는 약물(Pa)이 전체 펩티좀 100몰부에 대하여 25 몰부 미만으로 로딩하는 것이 바람직하다.
Pa는 강한 소수성을 가지기 때문에 펩티좀의 코어가 아닌 쉘층 내부에 봉입된다. 따라서 본 발명에 따른 펩티좀은 소수성 약물의 로딩 효율이 거의 100%에 가깝다고 할 수 있다.
실험예 9. 공동조립 펩티좀(R 6 :RGD 2 <-Pa)의 세포 생존율 분석
실시예 4-6a의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(0.5:9.5), 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9), 실시예 4-6i의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1.5:8.5)을 준비하고, SCC7 세포에 각각 30 μM씩 첨가한 후, 4 시간 동안 배양하였다. 각각의 배양액을 채취하고 MTT saasy 방법으로 세포 생존율을 측정하였다.
또한, 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)의 펩티좀 구조를 파악하기 위하여, TEM 및 AFM으로 촬영하였다.
도 15는 실시예 4-6a의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(0.5:9.5), 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9), 실시예 4-6i의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1.5:8.5)에 대한 세포 생존율을 분석한 그래프이다.
도 15에 나타난 바와 같이 실시예 4-6a, 실시예 4-6d, 실시예 4-6i의 공종조립 펩티좀 모두 90%~100%의 세포 생존율을 나타내었고, 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)이 100% 이상의 가장 우수한 세포 생존율을 나타낸다는 것을 확인하였다.
도 16 및 도 17은 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)을 TEM으로 촬영한 사진으로, 도 17은 도 16을 확대한 이미지이다.
도 16 및 도 17에 나타난 바와 같이, 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)의 모폴로지는 공동조립 후에도 이중층 구조의 쉘을 갖는 소포체 구조를 유의하게 유지한다는 것을 확인하였다.
특히, 도 17에 따르면 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)의 평균 직경이 149.6 ± 70.6 nm이고, 상기 쉘층의 두께가 10.86 ± 2.1 nm인 것을 확인하였다. 이는 고리형 펩티드로부터 계산된 펩티좀의 이론적 모델(~10.35 nm)과 도식적으로 일치한다는 것을 알 수 있다.
도 18은 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)에 대한 AFM 이미지이다. 이에 따르면 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)의 구조는 Pa 캡슐화/봉입에 의해 변형되지 않는다는 것을 확인할 수 있다. 또한 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)의 크기가 113 ± 68.5 nm인 것을 확인할 수 있다.
상술한 실험결과들을 통해 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)의 구조를 개략적으로 모델링하여 도 19에 나타내었다.
실험예 10. 공동조립 펩티좀(R 6 :RGD 2 <-Pa)의 세포내 전달 효율
실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)을 Hela 세포 배양액 0.5 ml에 각각 30 μM씩 첨가한 후, 4 시간 동안 배양하였다. 각각의 배양액을 채취하고 Lab-Tek Chambered Coverglass에서 직접 관찰하는 방법으로 세포를 회수한 후, LysoTracker을 처리하여 염색한 다음 CLSM(Confocal laser scanning microscopy)로 촬영하였다.
도 20은 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)을 HeLa 세포에 처리한 후, Pa 형광(적색)을 CLSM(Confocal laser scanning microscopy)로 확인한 결과이고, 도 21은 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)을 HeLa 세포에 처리한 후, Pa 형광(적색)과 LysoTracker(초록색)의 형광을 공동분석한 형광 이미지(a)와 이를 확대한 형광 이미지(b)이다.
도 20 및 도 21에 나타난 바와 같이 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)은 Pa의 세포내 전달에 매우 효율적인 것을 알 수 있다. Lyso Tracker를 사용한 최소 공동국소화(Minimal colocalization)를 통해 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)이 직접 침투 매커니즘을 통해 세포로 들어가기 때문에, 세포의 엔도좀(endosome)에 갇히지 않는다는 것을 확인할 수 있었다. 즉 본 발명에 따른 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)은 세포의 세포질과 핵으로 효율적인 전달을 매개하면서, 무독성이라는 장점을 갖는다는 것을 알 수 있다. 게다가 RGD 서열을 포함함으로써 RGD-인테그린 상호작용을 통해 암 표적화 효능을 가지며, RGD의 양쪽이온성 특성으로 인해 우수한 생체내 성능을 나타내는 것으로 확인된다.
실험예 11. 생체 내 조건에서 응집 형성 억제 조건
본 발명에 따른 펩티좀이 생체 내에서도 응집되지 않고, 세포 내 전달 효율은 우수하면서, 생체 안정적으로 존재하도록 제어하기 위하여, 암세포의 광역학 치료효과를 분석하였다.
SSC7(Squamous cell carcinoma 7, SCC7) 세포에 유리 Pa(free Pa) 30 μM 또는 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9) 30 μM 을 24시간 동안 처리한 후, 1.59 J/cm2 적외선(IR) 레이저(671 nm)를 조사하였다. 암세포의 광역학적 사멸의 척도로서 세포독성을 MTT 분석을 사용하여 분석하였다.
도 22는 레이저를 조사한 후 SCC7 세포의 생존율을 MTT로 분석하여 나타낸 그래프로, 레이저만 조사한 세포의 생존율은 약 97.6%인 것으로 확인된 바, 레이저는 세포 생존에 큰 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.
도 23은 SCC7 세포에 유리 Pa와 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)을 처리한 후, 레이저를 조사하여 광역학에 의한 항암효과를 분석하기 위해 세포 생존율을 측정하여 나타낸 그래프이다. 도 23에 나타난 바와 같이, 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)로 처리된 세포는 PDT 효과가 없었고, 유리 Pa로 처리된 세포는 용량 의존적으로 PDT 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
도 23에서 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)의 광역학 항암 효과가 나타나지 않은 이유를 분석하기 위하여 다음 실험을 수행하였다. 우선, 10% fetal bovine serum을 포함하는 RPMI 1640 배지에 유리 Pa(free Pa) 30 μM 또는 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9) 30 μM를 첨가한 후, IR 레이저 조사를 시간(10초, 30초)별로 수행한 다음 단일항 산소(SO)의 함량을 ROS 생성분석(Detection of ROS generation)에 따라 정량화하였다.
도 24는 SOSG(Singlet Oxygen Sensor Green)으로 측정한 유리 Pa와 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)의 단일항 산소(singlet oxygen)를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 24에 나타난 바와 같이, 단일항 산소(SO)는 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)보다 유리 Pa에서 더 높은 것을 확인하였다.
생리학적 조건에서 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)의 구조를 분석하고자 하였다. 이를 위해 10% fetal bovine serum을 포함하지 않는 RPMI 1640 배지에 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9) 30 μM 을 첨가하고, IR 레이저로 30초 조사한 후, AFM으로 촬영하였다.
도 25는 세럼이 없는 RPMI 1640 배지에 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)을 첨가한 후, 이의 AFM 이미지로, 이에 따르면, 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)은 생리학적 조건에서 응집되지 않은 단일 펩티좀과 응집된 펩티좀이 공존(coexistence)한다는 것을 확인하였다. 펩티좀의 응집은 세럼을 포함하는 세포 배양배지에서 더 심해지는 것을 확인하였다. 본 발명에 따른 펩티좀은 생리학적 조건에서 비특이적 응집이 발생하며, 이로 인해 SO 생성의 감소 및 PDT 효과 부족이 발생할 수 있다는 것을 알 수 있다. 따라서 펩티좀의 응집을 감소시키는 것이 필요하다.
도 26은 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)의 AFM 이미지로, 도 26a는 NIR(근적외선)을 조사하기 전에 촬영한 것이고, 도 26b는 NIR(근적외선)을 조사한 후에 촬영한 것이다.
도 26을 통해 NIR(근적외선) 조사 전 후의 펩티좀 모폴로지를 AFM으로 분석하였다. 그 결과 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)의 크기는 근적외선 조사 전후 차이가 있었으나, 전체 크기 분포나 소포체 구조는 유의한 차이없이 그대로 유지하는 것을 확인하였다.
실험예 5. 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R 6 :RGD 2 <-Pa)(1:9)의 DLS
용액 조건에 따른 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)의 평균 직경을 분석하였다. DLS 분석은 생리학적으로 적절한 염 및 완충액(예를 들어 PBS), 무혈청배지(serum-gree medium) 및 0.9% 식염수를 포함하는 용액에 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)를 첨가하여 수행하였다. 용액 조건과 측정된 각각의 DLS를 하기 표 2에 나타내었다.
Solution condition Diameter (D h) a
Distilled water (DW) 104 nm
Phosphate-buffered saline (PBS) ca. 400~700 nm
Serum-free medium ca. 500~1600 nm
5 중량% glucose 117 nm
5 중량% glucose + 0.9 중량% saline 410 nm
5 중량% glucose + 20 중량% glycerol 100 nm
5 중량% glucose + 20 중량% glycerol + 0.9 중량% saline 310 nm
a Dh was measured using DLS.
표 2에 나타난 바와 같이, 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)의 심각한 응집을 재확인하였다. 혈청의 존재하에서 응집이 더 심해지는 것으로 확인되었다. 또한, 염이온도 콜로이드 안정성을 감소시켜 펩티좀이 큰 응집체(coagulation)로 형성되도록 유도한다는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명에 따른 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)은 높은 이온강도 조건하에서 소수성 강도가 증가하여, 서로 결합되어 응집되어 연장된 구조를 갖게되는 것을 알 수 있다.
다양한 생리학적 조건에서 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)의 응집체의 형성 여부를 분석하였고, 그 결과 150 nm 미만, 바람직하게는 100 nm 미만의 평균직경을 유지할 수 있는 최적의 조건을 확인하였다.
우선, 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)은 증류수에서 104 nm 평균 직경을 유지한다는 것을 확인하였고, 다음 5 중량% 글루코스 수용액에서 117 nm 평균 직경을 유지한다는 것을 확인하였다. 글루코스는 생체적합성 분자로 주사용 제제로 널리 사용된다.
다음 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)은 글리세롤을 추가한 5 중량% glucose + 20 중량% glycerol 수용액에서 100 nm의 평균 직경을 갖는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명에 따른 펩티좀의 구조 안정화를 위해 폴리올을 사용하는 것이 가장 바람직하다는 것을 확인하였다.
폴리올(polyol)은 본 발명에 따른 펩티좀의 콜로이드 안정성을 증가시키고, 펩티좀 주입에 의한 생체 내 삼투압농도(osmolarity)와 긴장성(tonicity)을 유지하는 역할을 하는 것이라 여겨진다. 따라서 본 발명에 따른 펩티좀은 글루코스, 폴리올 및 증류수로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 용액 내에서 응집체를 형성하지 않으면서 150 nm 미만, 140 nm 미만, 130 nm 미만, 120 nm 미만의 펩티좀을 얻을 수 있다는 것을 확인하였다. 보다 바람직하게는 글루코스, 폴리올 및 증류수의 혼합액일 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 1 내지 10 중량% 글루코스, 10 내지 30 중량% 폴리올 및 잔량의 증류수를 포함하는 것일 수 있으며, 2 내지 7 중량% 글루코스, 15 내지 25 중량% 폴리올 및 잔량의 증류수, 4 내지 6 중량% 글루코스, 17 내지 22 중량% 폴리올 및 잔량의 증류수를 포함하는 것일 수 있다. 상기 범위를 만족하는 경우 펩티좀의 평균직경이 100 nm 미만을 유지할 수 있다.
상기 폴리올은 생체적합성이 우수한 물질이라면 특별히 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 에틸렌글리콜, 프로판디올, 부탄디올, 펜탄디올, 헥산디올, 글리세롤 및 폴리에틸렌글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리올일 수 있고, 보다 바람직하게는 에틸렌글리콜, 글리세롤 및 폴리에틸렌글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리올일 수 있으며, 가장 바람직하게는 글리세롤일 수 있다.
본 발명에 따른 펩티좀은 5 중량% 글루코스, 20 중량% 글리세롤 및 잔량의 증류수 혼합액(이하 'G&G'라고도 한다)에서 보관하는 것이 응집을 억제할 수 있고, 100 nm 미만의 평균직경으로 유지할 수 있다.
상술한 과정에서 확인한 바와 같이, 5 중량% 글루코스, 20 중량% 글리세롤 및 잔량의 증류수 혼합액(GG)에서 펩티좀이 응집되지 않고 작은 크기를 안정적으로 유지한다는 것을 재차 확인하고자 하였다.
10%(v/v) fetal bovine serum을 포함하는 RPMI 1640 배지에 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9) 30 μM을 첨가하고, 1 시간 후에 DLS를 사용하여 평균 직경을 분석하였다.
도 27은 혈청 단백질 존재하에서 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)의 평균 직경을 측정하여 나타낸 크기 분포도이다. 도 27에 따르면 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)은 혈청 단백질이 존재함에도 불구하고 응집되지 않고, 100 nm 크기를 유지하는 것으로 확인하였다. 도 27에서 10 nm의 피크는 혈청 단백질의 피크이다.
실험예 6. 세포내 전달 효율 분석
SCC7 세포를 24웰 플레이트에 5×104의 밀도로 분주하고 밤새 배양하였다. 다음, 시료 200 mL를 각 웰의 800 mL 배양배지에 첨가하였다. 4시간 동안 처리한 다음 시료를 제거하고 세척하였다. 세포 이미징을 위해, 핵(nuclei)을 Hoechst 33342로 염색하였다. SCC7 세포에서 물질의 세포 흡수는 CLSM(LSM700, Carl Zeiss, Germany) 및 유세포 분석(FACS Canto II, BD Biosciences, Bedford, MA, USA)을 통한 Pa의 고유 형광을 기반으로 분석하였다.
이때 시료는 2 μg/ml 유리 Pa, 2 μg/ml 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(G&G) 및 2 μg/ml 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(DW)를 사용하였다. DW는 G&G 용액 대신 증류수를 사용한 것을 의미한다.
도 28은 유리 Pa(a), 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(DW)(b) 및 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(G&G)(c)을 처리한 각각의 SCC7 세포를 CLSM으로 촬영한 사진이다. 도 28에서 적색은 Pa이고, 청색은 핵(nucleus)을 나타낸다.
도 29는 유리 Pa, 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(DW) 및 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(G&G)을 처리한 각각의 SCC7 세포를 유세포분석(FACS)으로 분석한 결과 그래프이다.
도 30은 유리 Pa, 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(DW) 및 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(G&G)을 처리한 각각의 SCC7 세포에 대한 생존율을 분석한 결과이다.
에러바는 평균 ± 표준편차(mean ± standard deviation)이고(n=3), 통계학적 유의성 검증은 two-sample Student's t-test 사용하였으며, p 값이 0.005 미만인 경우 유의한 것으로 판정하였다(*** P < 0.001).
도 28 및 도 29에 나타난 바와 같이, 유리 Pa는 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)보다 세포 내재화 효율(cell internalization efficiency)이 5배 더 높은 것을 알 수 있다. 유리 Pa의 친유성(lipophilicity)이 세포내 전달에 유리하게 작용하는 것으로 여겨진다.
앞선 실험에서 용액에 따라 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)은 응집체 발생 정도가 달라진다는 것을 확인하였으나. 실제 세포내재화(cell internalization efficiency)에서는 유의적 차이가 관찰되지 않는다는 것을 확인하였다. 즉 세포 내에서 펩티좀의 세포내 전달효율은 펩티좀의 응집상태가 중요한 요인이 아니라는 것을 알 수 있다. 본 발명에 따른 펩티좀은 응집 여부에 상관없이 세포내 전달 효율이 우수하다는 것을 확인하였다.
도 30에 나타난 바와 같이, 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(DW)보다 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(G&G)가 2배 이상 PDT 효과를 나타낸다는 것을 확인하였다. 다시 말해 본 발명에 따른 펩티좀의 세포내 전달효율은 응집여부와 상관없이 우수하나, 세포내에서의 항암효과에서는 응집여부가 영향을 미친다는 것을 알 수 있다. 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(DW)보다 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(G&G)가 2 배 이상 우수한 항암효과를 나타낸다는 것을 알 수 있다.
도 31은 유리 Pa, 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(DW) 및 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(G&G)를 처리한 SSC7 세포로부터, DCFDA를 사용하여 분석한 ROS 생산 분석결과 그래프이다. 에러바는 평균 ± 표준편차(mean ± standard deviation)이다(n=3).
도 31에 나타난 바와 같이 DCFDA(2',7'-dichlorofluorescin diacetate)과 ROS 검출 시료를 사용하여 생체외에서 PDT-유도된 ROS 생산을 분석한 결과, 생체 외에서 대조군(아무것도 처리하지 않은 SSC7 세포) 대비 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(G&G)으로 처리된 SCC7 세포의 DCFDA 형광은 레이저 조사에 의해 유의하게 증가하는 것을 확인하였다. 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(G&G)의 광역학적 효과에 의해 ROS 생산이 증가하며, 이로 인해 암세포가 사멸한다는 것을 확인할 수 있다.
실험예 7. 생체 내에서 펩티좀의 항암 효과 분석-1
본 발명에 따른 펩티좀의 생체 내에서 항암효과를 분석하고자 하였다. 이를 위해 SCC7 세포유래 암을 접종한 xenograft mouse 모델을 사용하여 생체 내(In vivo) 종양 치료 효과 분석하였다.
편평상피암 세포인 SSC7 세포를 RPMI 1640 배양액에 10% FBS, 1% L-glutamine, 1% penicillin과 streptomycin 등을 첨가한 뒤, 5% 이산화탄소가 유지되는 37°C 배양기에서 배양하였다. 배양된 세포주는 trypsin/EDTA를 이용하여 flask바닥에서 떼어낸 뒤, trypan blue exclusion을 이용하여 생존해있는 세포를 평가한 후 배양액에 최종 농도 1×106 cells/ml이 되도록 하였다.
실험동물은 7-8주령 암컷 또는 수컷 xenograft mouse(OrientBio, Korea)를 대상으로 하였다. 실험전 마우스는 2주간 순화과정을 거쳤다. 마우스는 실험동안 온도 22 ± 2 ℃, 습도는 40-60%로 유지되는 사육실에서 자유식이로 사육되었으며, 명암 주기(Light and dark cycle)는 12시간 간격으로 조절하였다. 1주일간 적응시킨 후, 앞서 준비된 SSC7 세포를 왼쪽 허벅지 정맥내로 한 마리 당 1×106 개씩 주사하고, 주사 후 암의 부피가 50 mm3에 도달할 때까지 사육하여 암 동물모델을 제조하였다.
상기 암 동물모델을 무작위로 1군당 3마리가 되도록 나누었다. 실험군은 유리 Pa 2 mg/kg 비교군(유리 Pa, n=3), 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(DW) 2 mg/kg 투여군(peptidesome-Pa(saline), n=3) 및 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(DW) 2 mg/kg 투여군(peptidesome-Pa(G&G), n=3)으로 나누어 실험하였다. 상기 시료는 암 동물모델의 꼬리 정맥을 통해 주사하였으며, 시료를 주입하고 3시간 후 암 위치에 NIR 레이저(671 nm)를 0.53 W/cm2의 파워로 15분간 조사하였다. 다음날에도 동량의 시료를 동일한 부위에 조사한 후 NIR 레이저(671 nm)를 0.53 W/cm2의 파워로 15분간 조사하는 과정을 반복하였다.
각 군에 시료를 주입한 후, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간마다 IVIS Lumina XRMS 시스템을 통해 전신 NIR 형광 이미지를 분석하고, 각 시간별로 꼬리로부터 혈액을 회수하여 형광 현미경으로 촬영하였다. 24시간이 지난 후, 각각의 동물모델을 안락사한 다음 주요 장기(심장, 폐, 간, 비장, 신장)와 암조직을 절개하여 회수하였다. 상기 장기와 암 조직을 고정하고 동결건조 절편을 제조한 후, 형광 현미경으로 측정하였다.
본 연구는 연세대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받았으며, 모든 실험은 연세대학교 동물실험윤리위원회의 규정에 의거하여 수행하였다.
도 32는 유리 Pa 비교군, 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(DW) 투여군 및 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(G&G)에 대한 시간별 전신 NIR 형광 이미지이다. 검은점선은 종양영역을 의미한다.
도 33은 유리 Pa 비교군, 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(DW) 투여군 및 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(G&G) 투여군으로부터 분리한 각 장기를 형광 현미경으로 촬영한 이미지이다.
도 34는 도 33에서의 데이터로부터 형광세기를 정량화하여 나타낸 그래프이다. 에러바는 평균 ± 표준편차(mean ± standard deviation)이다(n=3).
도 35는 유리 Pa 비교군, 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(DW) 투여군 및 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(G&G) 투여군로부터 채취한 혈액을 형광 현미경으로 촬영한 이미지(상)와 이를 정량화한 그래프(하)이다(n=3).
도 36은 유리 Pa 비교군, 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(DW) 투여군 및 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(G&G) 투여군로부터 채취한 저온절단 암조직 시료를 형광 현미경으로 측정한 이미지이다.
도 32에 나타난 바와 같이, 전신 형광 분석을 통해 암 위치에 약물(Pa)가 축적되는지 여부를 분석하였다. 유리 Pa 비교군 및 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(DW) 투여군보다 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(G&G) 투여군이 유의적으로 더 강한 Pa 형광 세기가 관찰되었다. 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(DW)은 생체 내 주입을 위해 0.9% saline을 더 첨가하는데, 이로 인해 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(DW)이 강하게 응집되는 것을 확인하였다.
도 33 내지 도 35에 나타난 바와 같이, 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(G&G)은 다른 약물에 비해 종양 축적 효율도 유의적으로 가장 우수하였다. 혈액에서도 유의적으로 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(G&G)가 유의적으로 가장 높았다.
도 36에 나타난 바와 같이, 종래 다른 치료방법이나 약물보다 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(G&G)을 투여한 경우가 종양 축적 효율 및 항암효과가 매우 우수하다는 것을 알 수 있다. 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(G&G)은EPR(Enhanced Permeability and Retention) 효과와 RGD-integrin 상호작용으로 인해, 암 표적화에 유의적으로 우수한 효과를 갖는다는 것을 알 수 있다.
게다가 본 발명에 따른 펩티좀은 펩티좀의 응집을 억제, 방해 및 예방함으로써, 종양특이적 표적화 효율이 높을 뿐만 아니라, 암세포내 약물 축적 효율도 유의적으로 높다는 것을 알 수 있는 바, 단순 증류수가 아닌 G&G 용액을 첨가제로 투여하는 것이 가장 바람직하다는 것을 알 수 있다.
실험예 8. 생체 내에서 펩티좀의 항암 효과 분석-2
본 발명에 따른 펩티좀의 생체 내에서 항암효과를 분석하고자 하였다. 이를 위해 SCC7 세포유래 암을 접종한 xenograft mouse 모델을 사용하여 생체 내(In vivo) 종양 치료 효과 분석하였다.
편평상피암 세포인 SSC7 세포를 RPMI 1640 배양액에 10% FBS, 1% L-glutamine, 1% penicillin과 streptomycin 등을 첨가한 뒤, 5% 이산화탄소가 유지되는 37°C 배양기에서 배양하였다. 배양된 세포주는 trypsin/EDTA를 이용하여 flask바닥에서 떼어낸 뒤, trypan blue exclusion을 이용하여 생존해있는 세포를 평가한 후 배양액에 최종 농도 1×106 cells/ml이 되도록 하였다.
실험동물은 7-8주령 암컷 또는 수컷 xenograft mouse(OrientBio, Korea)를 대상으로 하였다. 실험전 마우스는 2주간 순화과정을 거쳤다. 마우스는 실험동안 온도 22 ± 2 ℃, 습도는 40-60%로 유지되는 사육실에서 자유식이로 사육되었으며, 명암 주기(Light and dark cycle)는 12시간 간격으로 조절하였다. 1주일간 적응시킨 후, 앞서 준비된 SSC7 세포를 왼쪽 허벅지 정맥내로 한 마리 당 1×106 개씩 주사하고, 주사 후 암의 부피가 50 mm3에 도달할 때까지 사육하여 암 동물모델을 제조하였다.
상기 암 동물모델을 무작위로 1군당 4마리가 되도록 나누었다. 실험군은 saline 2 mg/kg만 투여한 대조군(saline, n=4), 유리 Pa 2 mg/kg 비교군(유리 Pa, n=4) 및 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(DW) 2 mg/kg 투여군(peptidesome-Pa(G&G), n=4)으로 나누어 실험하였다. 상기 시료는 암 동물모델의 꼬리 정맥을 통해 주사하였으며, 시료를 주입하고 3시간 후 암 위치에 NIR 레이저(671 nm)를 0.53 W/cm2의 파워로 15분간 조사하였다. 다음날에도 동량의 시료를 동일한 부위에 조사한 후 NIR 레이저(671 nm)를 0.53 W/cm2의 파워로 15분간 조사하는 과정을 반복하였다. 본 발명에서의 레이저 강도는 암 세포의 생존율에 어떠한 영향도 주지 않는 범위로, 레이저 조사로 인해 암은 손상되지 않는다.
각 군에 시료를 주입한 후, 2일, 4일, 6일, 8일, 10일, 12일, 14일마다 종양 부피와 체중을 측정하여 기록하였다. 14일째에 각각의 동물모델을 안락사한 다음 주요 장기(심장, 폐, 간, 비장, 신장)와 암조직을 절개하여 회수하였다. 상기 장기와 암 조직을 고정하고 동결건조 절편을 제조한 후, 헤마톡실린과 에오신(H&E) 염색하였고, 현미경(AxioImager A1, Zeiss, Germany)으로 관찰하였다.
본 연구는 연세대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받았으며, 모든 실험은 연세대학교 동물실험윤리위원회의 규정에 의거하여 수행하였다.
도 37은 14일째 대조군(saline), 유리 Pa 비교군 및 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(G&G) 투여군으로부터 분리한 암 조직을 촬영한 사진이다. 점선(적색)은 종양의 완전한 퇴행을 나타낸다.
도 38은 대조군(saline), 유리 Pa 비교군 및 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(G&G) 투여군에서 시간별 암 크기를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 39는 14일째 대조군(saline), 유리 Pa 비교군 및 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(G&G) 투여군으로부터 분리한 암 조직의 무게를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 40은 14일째 대조군(saline), 유리 Pa 비교군 및 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(G&G) 투여군으로부터 분리한 암 조직을 H&E로 염색하여 형광 현미경으로 촬영한 이미지이다.
도 41은 대조군(saline), 유리 Pa 비교군 및 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(G&G) 투여군의 시간별 체중변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 42는 14일째 대조군(saline), 유리 Pa 비교군 및 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(G&G) 투여군으로부터 분리한 주요 장기(심장, 폐, 간, 비장, 신장)을 H&E로 염색하고 형광 현미경으로 촬영한 이미지이다.
도 38, 도 39 및 도 41에서 에러바는 평균 ± 표준편차(mean ± standard deviation)이다(n=4). 통계학적 유의성 검증은 도 38은 one-way ABOVA 및 post hoc Tukey test를 사용하였고, 도 39는 two-sample Student's t-test 사용하였다. * P < 0.05, **P<0.01.
도 37에 나타난 바와 같이 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(G&G)은 다른 군에 비해 암 성장을 유의적으로 억제하는 것을 확인하였다. 대조군은 암의 크기가 너무 심하게 커졌기 때문에, 동물 윤리를 고려하여 12일째에 안락사하였다.
도 38에 나타난 바와 같이, 14일째에 펩티좀<-Pa(G&G)으로 처리된 동물모델의 암 크기는 유리 Pa로 처리한 동물모델보다 4.2배 이상 작은 것으로 확인되었다. 본 발명에 따른 펩티좀은 약물을 단독으로 처리하였을 때보다 4.2 배 이상의 현저히 유의한 약물 상승 효과를 얻을 수 있게 한다는 것을 알 수 있다.
도 39에 나타난 바와 같이, 14일 동안의 치료가 종료되었을 때 유리 Pa 처리군의 절제된 암 무게(1,222 mg)는 펩티좀<-Pa(G&G) 처리군의 암 무게(406 mg)보다 약 3배 더 큰 것으로 확인되었다.
도 40에 나타난 바와 같이, 14일의 치료기간동안 모든 군은 체중에 유의한 변화가 관찰되지 않았다. 본 발명에 따른 펩티좀<-Pa는 전신독성과 같은 부작용을 나타내지 않는 안정한 약물임을 알 수 있다.
도 41에 나타난 바와 같이, 실시예 4-6d의 공동조립 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)(1:9)(G&G) 투여군으로부터 채취한 암 조직을 H&E으로 분석한 결과, 대조군 또는 유리 Pa 비교군의 암 조직에 비해 유의적으로 현저히 손상되어 있다는 것을 확인하였다. 본 발명에 따른 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)은 약물의 단독 투여보다 항암 효과를 2~4배 이상 증폭하는 것을 알 수 있다.
도 42에 나타난 바와 같이, 모든 군의 주요 장기(심장, 폐, 간, 비장 및 신장)는 심각한 손상이 발생하지 않았다. 즉 본 발명에 따른 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)은 생체 안정하며, 부작용을 나타내지 않는다.
실험예 9. 펩티좀의 생체 내 안정성 분석
본 발명에 따른 펩티좀(R6:RGD2<-Pa)이 단백질 분해효소 조건 하에서 안정적으로 존재할 수 있는지 분석하고자 하였다. 우선, PBS 완충액 하에서, 실시예 3-4의 펩티좀(peptisome RGD2)(50 μM, 300 μL)와 bovine pancreas의 trypsin(0.39 μg)을 혼합한 다음 37 ℃에서 반응시켰다. 시간별(0 분, 1 분, 5 분, 15 분, 30 분, 1 시간, 2 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간)으로 시료를 채취하고, 0.2% TFA(v/v)를 첨가한 후, HPLC로 분석하였다. HPLC 분석 전, 상기 시료에 아세토니트릴을 최종 농도가 50%(v/v)가 되도록 첨가하여 반응 혼합물을 제조하였다. 상기 반응 혼합물을 C4 컬럼을 사용하는 역상 HPLC로 분석하였다.
도 43은 단백질 분해효소 trypsin의 존재 하에서, 실시예 3-4의 펩티좀(peptisome RGD2)의 HPLC 분석 그래프이다.
도 43에 나타난 바와 같이, 생리학적 조건의 생체 외에서 실시예 3-4의 펩티좀(peptisome RGD2)은 단백질 분해에 대해 높은 저항성을 갖는 것을 확인하였다. 구체적으로 실시예 3-4의 펩티좀(peptisome RGD2)은 1시간부터 미량 분해되기 시작하나 6 시간까지 완전히 분해되지 않고 형태를 유지하는 실시예 3-4의 펩티좀(peptisome RGD2)이 존재하는 것을 확인할 수 있다. 이외 다른 펩티좀(epetisome) 역시 단백질 분해효소에 대해 우수한 안정성을 갖는다.
이처럼, 본 발명에 따른 펩티좀(peptisome)은 2 개 이상의 아르기닌 잔기를 포함하는 저분자 구조의 고리형 펩티드로 형성되었음에도, 단단한 분자 어셈블리를 형성함으로써, 단백질 분해에 대해 우수한 안정성을 갖는다는 것을 확인하였다. 일반적으로 대부분의 약물전달체, 특히 펩티드로 제조된 약물전달체들은 생체 내에서 급격한 단백질 분해로 인해 약물이 목적하는 세포 내에 전달되기 전에 분해되는 치명적 약점이 있으나, 본 발명에 따른 펩티좀은 단백질 분해에 대해 매우 안정적이므로, 약물의 효과적인 전달을 제공할 수 있다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Novel cyclic peptides based on nano-bio-structural control of peptide assemblies, peptidesomes with core/shell structure comprising thereof and uses thereof <130> HPC10615 <160> 19 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hydrophilic peptide <400> 1 Arg Arg 1 <210> 2 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hydrophilic peptide <400> 2 Arg Arg Arg 1 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hydrophilic peptide <400> 3 Arg Arg Arg Arg 1 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hydrophilic peptide <400> 4 Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hydrophilic peptide <400> 5 Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 6 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hydrophilic peptide <400> 6 Arg Gly Asp 1 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hydrophilic peptide <400> 7 Arg Gly Asp Arg Gly Asp 1 5 <210> 8 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> The peptide is designed so that the tryptophan (W) in the first position binds to the alpha amino group or the epsilon amino group of lysine (Lys). <400> 8 Trp Lys Phe 1 <210> 9 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> The peptide is designed so that the phenylalanine (F) in the first position binds to the alpha amino group or the epsilon amino group of lysine (Lys). <400> 9 Phe Lys Trp 1 <210> 10 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> The peptide is designed so that the tryptophan (W) in the first position binds to the alpha amino group or the epsilon amino group of lysine (Lys). <400> 10 Trp Lys Trp 1 <210> 11 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> The peptide is designed so that the phenylalanine (F) in the first position binds to the alpha amino group or the epsilon amino group of lysine (Lys). <400> 11 Phe Lys Phe 1 <210> 12 <211> 2 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hydrophobic peptide <400> 12 Gly Ser 1 <210> 13 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hydrophobic peptide <400> 13 Gly Ser Gly 1 <210> 14 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hydrophobic peptide <400> 14 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 15 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hydrophobic peptide <400> 15 Gly Ser Gly Gly 1 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hydrophobic peptide <400> 16 Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hydrophobic peptide <400> 17 Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 <210> 18 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hydrophobic peptide <400> 18 Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hydrophobic peptide <400> 19 Gly Gly Ser Gly Ser 1 5

Claims (30)

  1. (a) 2 내지 12개의 L 또는 D형 아르기닌 잔기로 이루어진 친수성 펩티드;
    (b) 하기 일반식 1로 표시되는 소수성 펩티드;를 포함하고,
    상기 (a)와 (b)는 링커에 의해 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 고리형 펩티드.
    [일반식 1]
    Xaa1-Lys-Xaa2
    상기 식 1에서,
    Xaa1 및 Xaa2는 서로 독립적으로, 트립토판(W) 또는 페닐알라닌(F)이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 1에서, Xaa1은 라이신기(Lys)의 입실론 아미노기에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 고리형 펩티드.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (a)는 2 내지 10개인 L 또는 D형 아르기닌 잔기로 이루어진 친수성 펩티드인 것을 특징으로 하는 고리형 펩티드.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 소수성 펩티드(b)에서 라이신 잔기의 알파 아미노기에 소수성 리간드 또는 소수성 약물이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 고리형 펩티드.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 소수성 리간드는 C8 내지 C24의 지방산 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 고리형 펩티드.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 지방산은 올레산(oleic acid), 라우릭산(lauric acid), 팔미트산(palmitic acid), 리놀레산(linoleic acid) 및 스테아르산(stearic acid)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 고리형 펩티드.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 소수성 약물은 독소루비신, 파크리탁셀(Paclitaxel), 시스플라틴(Cisplatin), 시로리무스(Sirolimus) 및 에토포시드(etoposide)로 구성된 항암제 또는 프탈로시아닌계(Phthalocyanine) 화합물, 포르피린계(Porphyrins) 화합물, 플루오레세인(Fluorescein)계 화합물 및 클로린계(Chlorins) 화합물로부터 선택되는 어느 하나의 광감작제인 것을 특징으로 하는 고리형 펩티드.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 링커는 서열번호 8 내지 15의 링커 펩티드, Ebes 및 oligo ethylene glycol(OEG)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 고리형 펩티드.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 친수성 펩티드(a)의 서열이 서열번호 1 내지 7 중에서 선택되는 어느 하나로 표시되는 것을 특징으로 하는 고리형 펩티드.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 고리형 펩티드는 하기 화학식 1 내지 5로 표시되는 화합물로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 고리형 펩티드.
    [화학식 1]

    [화학식 2]

    [화학식 3]

    [화학식 4]

    [화학식 5]
  11. 제1항에 있어서,
    상기 고리형 펩티드는 용액 상에서, 소포체 형태의 펩티좀(peptisome)으로 자가조립되는 것을 특징으로 하는 고리형 펩티드.
  12. 적어도 하나 이상의 제1항에 따른 고리형 펩티드가 액상에서 자가조립하여 형성된 소포체 구조를 갖는 구형의 펩티좀.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 펩티좀은 중공형 코어; 및 상기 고리형 펩티드를 포함하는 이중층 구조를 갖는 쉘;로 구성되는 것을 특징으로 하는 펩티좀.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 펩티좀은 코어 부분에 친수성 약물이 포획되고, 쉘 부분에 소수성 약물이 포획되어 다중 약물 방출이 가능한 것을 특징으로 하는 펩티좀.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 펩티좀의 평균 직경은 10 내지 150 nm인 것을 특징으로 하는 펩티좀.
  16. 제12항에 있어서,
    상기 펩티좀의 쉘 평균 두께는 1 내지 20 nm인 것을 특징으로 하는 펩티좀.
  17. 제12항에 있어서,
    상기 고리형 펩티드는 친수성 펩티드(a)가 서로 다른 2종류의 고리형 펩티드 혼합인 것을 특징으로 하는 펩티좀.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 고리형 펩티드 혼합은 친수성 펩티드가 서열번호 1 내지 5로부터 선택되는 제1 고리형 펩티드와 상기 친수성 펩티드가 서열 6 또는 7인 제2 고리형 펩티드의 혼합인 것을 특징으로 하는 펩티좀.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 제1 고리형 펩티드는 하기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 것 중에서 어느 하나이고, 상기 제2 고리형 펩티드 하기 화학식 4로 표시되는 것을 특징으로 하는 펩티좀:
    [화학식 1]

    [화학식 2]

    [화학식 3]

    [화학식 4]
  20. 제18항에 있어서,
    상기 고리형 펩티드 혼합은 제1 고리형 펩티드 1 내지 50 몰%와 잔량의 제2 고리형 펩티드로 포함된 것을 특징으로 하는 펩티좀.
  21. 제12항에 있어서,
    상기 액상은 글루코스, 폴리올 및 증류수로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 용액인 것을 특징으로 하는 펩티좀.
  22. 제12항에 있어서,
    상기 액상은 1 내지 10 중량% 글루코스, 10 내지 30 중량% 폴리올 및 잔량의 증류수를 포함하는 용액인 것을 특징으로 하는 펩티좀.
  23. 제21항에 있어서,
    상기 폴리올은 에틸렌글리콜, 프로판디올, 부탄디올, 펜탄디올, 헥산디올, 글리세롤 및 폴리에틸렌글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 폴리올인 것을 특징으로 하는 펩티좀.
  24. 제12항에 따른 펩티좀 및 상기 펩티좀 내에 봉입된 약물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 약물은 친수성 약물, 소수성 약물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  26. 제24항에 있어서,
    상기 펩티좀의 코어에는 친수성 약물이 봉입되고, 상기 펩티좀의 이중층 구조를 갖는 쉘 내부에는 소수성 약물이 봉입되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 소수성 약물은 독소루비신, 파크리탁셀(Paclitaxel), 시스플라틴(Cisplatin), 시로리무스(Sirolimus) 및 에토포시드(etoposide)로 구성된 항암제 또는 프탈로시아닌계(Phthalocyanine) 화합물, 포르피린계(Porphyrins) 화합물, 플루오레세인(Fluorescein)계 화합물 및 클로린계(Chlorins) 화합물로부터 선택되는 어느 하나의 광감작제인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  28. 제24항에 있어서,
    상기 펩티좀은 암 세포의 엔도좀이 아닌 세포 내에 직접 침투되어 소수성 약물을 1차적으로 방출하고, 광역학에 의해 생성된 활성산소종에 반응하여 펩티좀을 붕괴시켜 코어에 포함된 친수성 약물을 2차적으로 모두 방출하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  29. 제24항에 있어서,
    상기 암은 폐암, 위암, 신경교종, 간암, 흑색종, 신장암, 요로상피암, 두경부암, 메르켈세포종(Merkel-cell carcinoma), 전립선암, 혈액암, 유방암, 유선암, 대장암, 결장암, 직장암, 췌장암, 뇌암, 난소암, 방광암, 기관지암, 피부암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 비인두 선암, 갑상선암, 골암 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 암인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  30. 제12항에 따른 펩티좀 및 조영물질을 포함하는 암 진단용 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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