JP5130580B2 - 幹細胞における低線量被ばくの検出マーカー、及び該マーカーを用いる幹細胞での低線量被ばくレベルを推定又は検出する方法 - Google Patents
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即ち、本発明は第一の態様として、幹細胞におけるPPP1CA,BAD及び/又はBCL−XL遺伝子の発現量の増加を測定することにより、該幹細胞での低線量被ばくを判定又は検出する方法に係る。
PPP1CA,BAD及び/又はBCL−XL遺伝子の発現産物から成る、幹細胞における低線量被ばくの検出マーカー。
(a)ポリ(A)RNAを鋳型として一本鎖cDNAを合成する工程であって、該一本鎖cDNAを基準として5'末端にタグ物質が付加された一本鎖cDNAを合成する工程、
(b)工程(a)で合成された一本鎖cDNAを鋳型として二本鎖cDNAを合成する工程であって、該二本鎖cDNAを基準として3'末端側にタグ物質が付加された二本鎖cDNAを得る工程、
(c)工程(b)で得られた二本鎖cDNAを第1の制限酵素Xで切断する工程、
(d)該タグ物質に高親和性を有する物質を用いて、工程(c)で得られた断片から該タグ物質が付加している断片を回収する工程、
(e)工程(d)で回収された断片の第1の制限酵素Xによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列及びXプライマーに相補的な配列を含むXアダプターを結合させて、二本鎖cDNAを基準として5'末端側にXアダプターが結合している断片を得る工程、
(f)工程(e)で回収された断片を、該Xアダプターを切断しない第2の制限酵素Yで切断する工程、
(g)該タグ物質に高親和」性を有する物質を用いて、工程(f)で得られた断片から該タグ物質が結合している断片を取り除くことにより、二本鎖cDNAを基準として3'末端側に第2の制限酵素Yによる切断部位を含む断片を回収する工程、
(h)工程(g)で回収された断片の第2の制限酵素Yによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列及びYプライマーに相補的な配列を含むYアダプターを結合させて、二本鎖cDNAを基準として3'末端側にYアダプターが結合している二本鎖配列の断片を得る工程、
(i)該Xアダプターの配列に相補的な配列を含むXプライマーであって、該Xプライマーを基準として3'末端に2塩基配列であるNlN2(Nl及びN2は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である)を含むXプライマーと、該Yアダプターの配列に相補的な配列を含むYプライマーであって、該Yプライマーを基準として3'末端に2塩基配列であるN3N4(N3及びN4は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である)を含むYプライマーとからなるプライマーセットを用いて、工程(h)で得られた二本鎖配列の断片を鋳型としてPCR反応を行う工程、及び、
(j)得られたPCR産物を電気泳動し、その移動距離及びピークを検出することにより遺伝子発現プロファイルを作製する工程、を含む方法である。
E14細胞(ノックアウトマウス作出用に世界中中で最も広く使用されているES細胞株の一つ。エジンバラ大学のDr. M Hooper 研究室にて保管され、希望により分与可能)は、15% KSR (GIBCO), 6 mM L-glutamine, 100 μM 2-mercaptoethanol (2-ME) 及び500 unitsの白血球阻害因子(LIF, CHEMICON, Temecula, CA) を添加したKO-DMEM (GIBCO, Gaithersburg, MD) で培養した。MG1.19細胞は10% FCS, 4 mM L-glutamate, 非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、100 μM 2-ME 及び1,000 unitsの白血球阻害因子を添加したGMEM (GIBCO)で培養した。マウスpreB46−6細胞は10% FCS及び50 μM 2-ME添加のRPMI1640 (SIGMA, St Louis, MO) で維持した。MEF/3T3細胞はクローンテック社(Palo Alto, CA)から購入し、10% FCS及び 4 mM L-glutamate添加のDMEM培地で培養した。
各艇線量放射線の照射(又は、偽照射)にはX線発生装置(200 kV, 20mA, Pantak HF-320;Shimazu, Kyoto, Japan)を使用した。線量はX線量計model C-110, AE-1321M, OYOGIKEN Co., Japan) を使用して測定した。
HiCEP法は既報告文献(7)に若干の修正を加え、総RNA量1.0 μgで2回ずつ実施した。即ち、SuperScriptIII First Strand Synthesis System (Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて、該製造者のプロトコールに従い、5.0μl 反応容量で一本鎖DNAを合成した。50 mM Biotin-d(T)18 (0.25μl), 10 mM dNTP(0.25μl)及び2μl RNA溶液を慎重に混合し、その後、65℃で5分間インキュベートした。直ちに、氷上で3分間冷やした。製造者マニュアルに記載されている緩衝混合液2.5μlを加えて十分に混合し、50℃で60分間維持し、その後、85℃で5分間維持した。これらの全ての操作は200μl試験管内で実施した。この一本鎖DNA合成後の反応工程は、上記文献(7)に記載のとおりに実施した。修正点としては、既報告にあるエタノール沈殿工程に代えて、磁気ビーズ技術(Dinabeads M-280 Streptavidin; Veritas, Oslo, Norway)を使用したことである。
リアルタイムPCRは既報告文献(8)の記載に従い実施した。即ち、E14細胞から調製した全RNAをDnase(Invitrogen)で処理し、SuperScriptIII First Strand Synthesis System (Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて、これから一本鎖cDNAを合成した。反応にはオリゴd(T)18 プライマーを使用した。リアルタイムPCRは、FG, SYBER GREEN PCR MASTER MLX (Applied Biosysteems, Foster City, CA) を用いて行い、ABI PRISM 7700(Applied Biosysteems)で分析した。各試料の結果は、グリッセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素(GAPDH)の発現レベルに対して標準化した。PCR条件は、95.0℃で10分間、95.0℃で15秒間を50サイクル、60.0℃で30秒間、及び、78.0℃で40秒間であった。
Ppp1ca: Sense, 5'- AACTACTGTGGAGAGTTTGA -3' (配列番号1)
Antisense, 5'- AGAAGGGCAGCACATGGAAG -3'(配列番号2)
Bad: Sense, 5'- GGGATGGAGGAGGAGCTTAG -3'(配列番号3)
Antisense, 5'- CCCACCAGGACTGGATAATG -3'(配列番号4)
Bcl-xL: Sense, 5'- GCGTGTCTGTATTTATGTGT -3'(配列番号5)
Antisense, 5'- GCACTTTCACCTTCACACAA -3'(配列番号6)
GAPDH: Sense, 5'- GAGGCCGGTGCTGAGTATGTCGT -3'(配列番号7)
Antisense, 5'- GGTGGTGCAGGATGCATTGCTG -3'(配列番号8)
尚、ウェスタンブロット法は既報告文献(9)の記載に従い実施した。即ち、まず、試料を溶解緩衝液(10% グリセロール、5% ドデシル硫酸マトリウム、50 mM DTT、62.5 mM Tris-HCl, pH6.8)中で沸騰処理し、15% SDS-PAGE 上で電気泳動させ、その後、タンパク質をImmunoBlot PVDF 膜(BioRAD, Hercules, CA) に電気的に移動させた。膜を0.1 % Tween 20含有のTris 緩衝食塩水(TBST)で洗浄した。5%非脂肪ミルク含有TBSTで膜を1時間ブロック処理し、第一次抗体(抗PPP1CAウサギポリクローナル抗体、又は、抗カスパーゼ−3ウサギモノクローナル抗体:Cell Signaling, Beverly, MA)と共に、4℃で一晩インキュベートした。尚、第一次抗体は全て、3%ウシ血清アルブミン含有TBSTで1000倍に希釈して使用した。この第一次抗体による処理後、膜をTBSTで3回洗浄し、1000倍に希釈した、抗ラビットIgG−西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合体 (DAKO, Glostrup, Denmark) と反応させてPPP1CA及び抗カスパーゼ−3を検出するか、又は、1000倍に希釈した、抗マウスIgG−西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合体(DAKO, Glostrup, Denmark) と反応させてα-チューブリンを検出した。これら第二次抗体との反応は室温で1時間おこなった。その後、膜をTBSTで3回洗浄し、SuperSignal West Dura Extended duration substrate 試薬(PIERCE, Rockford, IL)を用いてシグナルを検出した。定量的測定はLightCapture(AE-6960, ATTO, Tokyo, Japan)を用いて実施した。
E14細胞は放射線照射の2時間後に回収し、カスパーゼの活性型とのみ結合する蛍光カスパーゼ阻害剤(FITC-VAD-FMK: Promega, Madison, WI)と共に20分間インキュベートした。その後、細胞をPBSで洗浄して余分なプローブを除き、10% 緩衝ホルマリン溶液を用いて30分間固定した。この細胞をLumina Vision ソフトウェアを用いる蛍光顕微鏡(Mitani, Tokyo, Japan)で直接解析した。
TUNEL試験はIn Situ Cell Death Detection Kit (Roche Applied Science, Indianapolis,IN)を使用して製造者のプロトコールに従い実施した。この細胞を蛍光顕微鏡で直接解析した。尚、各試料ポイントについて、2,500個以上の細胞を調査した。
HiCEP法を用いることによって、マウスES細胞であるE14において検出される22,000のシグナルの中から、5, 10, 25,50,100, 250 及び500 mGyの低線量域の放射線照射の1時間後に発現が増加する唯一の断片(188bp:配列番号9)を見出し、この断片はPPP1CA遺伝子の塩基配列に由来するものであることを確認した。小文字で書かれた部分がHiCEP法で用いられる共通のアダプター配列であって、大文字部分が実際の遺伝子の配列である。
actcggttcatgacaCGGAGGCCGGCCCATCACTCCACCCCGCAATTCTGCCAAAGCCAAGAAATAGCCTCCATGTGCTGCCCTTCTGCCCCAGATCGTTTGTACAGAAATCATGCTGCCATGGGTCACACTGGCCTCTCAGGCCCACCCGTCACGGGGAACACACAGCGTTAcgcagtaggacgcct
更に、リアルタイムPCR(定量的PCR)を用いて、5mGy〜1000mGyの線量域の照射1時間後のPPP1CA,BAD、BCL−XL、及びp21各遺伝子の発現量を測定した。その結果、5mGyの低線量域において、PPP1CA遺伝子に加えて、BAD遺伝子及びBCL−XL遺伝子の発現も増加していることが確認された(図2)。以上の結果は、低線量の放射線を照射された幹細胞でアポトーシスが誘発されていることを示唆するものである。
そこで、まず、アポトーシスにおいて重要な役割を担うカスパーゼファミリーの一種であるカスパーゼ3(14)の活性型であるペプチド(17kDa)の発現をウェスタンブロット法により測定したところ、5mGy及び10mGyの低線量放射線への被ばくによって、それら活性型ペプチドが発現していることが観察された(図3A)。又、カスパーゼの活性型とのみ結合する蛍光カスパーゼ阻害剤(FITC-VAD-FMK)を用いるin situ アッセイにより測定したところ、同様に、カスパーゼ活性が、5mGy及び10mGyの低線量放射線への被ばくによって有意に増加することが確認された(図3B,C)。
更に、ゲノムDNAの断片化を検出するために、TUNEL(TdT-mediated dUTP nick-end labeling)アッセイ(染色)(15)により、低線量域照射を受けたES細胞である、マウスES細胞である、E14細胞、MG1.19細胞及びR1細胞について検査した。その結果、これら3種類のES細胞に共通して、5mGY及び10mGyの低線量放射線照射においてアポトーシスが観察された(図4、A)。このアポトーシス誘導は250mGyで顕著に低下し、500mGy以上の線量域で再び観察された(図4、A)。
次に、このような低線量域における放射線照射によるアポトーシスの誘導が幹細胞に特異的か否かを検討すべく、マウスpreB(46−6)細胞及びマウス繊維芽細胞(MEF/3T3についても同様な実験を行った。その結果、5mGY〜10mGyの低線量域ではこれら細胞においてアポトーシスの誘導は観察されなかったが、5Gyではアポトーシスの誘導が見られた(図4、B)。これは、以前に報告された結果と一致する(16)。
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Claims (8)
- 胚性幹細胞におけるPPP1CA,BAD及び/又はBCL−XL遺伝子の発現量の増加を測定することにより、該胚性幹細胞での低線量被ばくを判定又は検出する方法。
- 胚性幹細胞におけるPPP1CA,BAD及び/又はBCL−XL遺伝子の発現量の増加を測定することにより、低線量被ばくによる該胚性幹細胞のアポトーシスへの誘導を予測する方法。
- (1)被検物質との共存下で胚性幹細胞に低線量放射線を照射する工程、及び(2)該胚性幹細胞におけるPPP1CA,BAD及び/又はBCL−XL遺伝子の発現の変動を測定する工程を含む、低線量放射線誘導性の細胞アポトーシスを阻害する物質をスクリーニングする方法。
- (1)低線量放射線を照射された胚性幹細胞に被検物質を接触させる工程、及び(2)該胚性幹細胞におけるPPP1CA,BAD及び/又はBCL−XL遺伝子の発現の変動を測定する工程を含む、低線量放射線誘導性の細胞アポトーシスを阻害する物質をスクリーニングする方法。
- PPP1CA,BAD及び/又はBCL−XL遺伝子の発現量の変動を該遺伝子のmRNAの発現量に基づき測定することを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- PPP1CA,BAD及び/又はBCL−XL遺伝子のmRNAの発現量をHiCEP法に基づき作製される遺伝子発現プロファイルから求めることを特徴とする、請求項5記載の方法。
- PPP1CA,BAD及び/又はBCL−XL遺伝子のmRNAの発現量をPCRで測定することを特徴とする、請求項5記載の方法。
- 胚性幹細胞がマウス胚性幹細胞である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
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