JP6889439B2

JP6889439B2 - 放射線被ばくの判定方法

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Publication number: JP6889439B2
Application number: JP2017030440A
Authority: JP
Inventors: 略孫; 盛武　敬; 敬盛武; 暁平山; 浩一千田
Original assignee: Tohoku University NUC; Tsukuba University of Technology NUC; University of Occupational and Environmental Health Japan
Current assignee: Tohoku University NUC; Tsukuba University of Technology NUC; University of Occupational and Environmental Health Japan
Priority date: 2017-02-21
Filing date: 2017-02-21
Publication date: 2021-06-18
Anticipated expiration: 2037-02-21
Also published as: JP2018136192A

Description

本発明は、放射線被ばくの判定方法に関する。

一般的に、医療従事者や放射線関連の労働者が、どの程度の被ばくをしているかを測定するためには、線量計が用いられており、様々な線量計が開発されている。

一方、一般市民が放射線被ばくに曝されるような放射線事故／災害発生時には、線量計による被ばく線量測定ができないため、生体試料や生理学的試料を材料として被ばく線量を推定し（バイオドシメトリ）、治療優先順位を決める（トリアージする）必要がある。そして、これまでに各種のバイオアッセイによって被ばく線量を推定する手法の開発が試みられている。

γＨ２ＡＸアッセイは、リンパ球のＤＮＡ２本鎖切断部位に集積するγＨ２ＡＸタンパクを指標に線量を推定する手法である（例えば、非特許文献１）。被ばく後２４時間以内であれば、正確に被ばく線量が推定可能である。しかしながら、被ばく後２４時間経つとほとんどのＤＮＡ２本鎖切断が修復されてしまうことと、被ばく後２日以降は放射線の影響を受けやすいリンパ球数が急減するため、被ばく後２４時間以降では本法による線量推計の信頼性は乏しい。そのため、本法による被ばく線量の定量は被ばく後２４時間が限界であり、放射線被ばくの有無の判断についても被ばく後３日程度が限界である。また、この手法では、目視でＤＮＡ２本鎖の切断を判断する必要があり推定時間を要する。

染色体異常分析は、リンパ球の安定型の染色体異常数から被ばく線量を推定する手法である（例えば、非特許文献２）。この方法は被ばく後長期間に亘って高い推定精度を保つが、リンパ球培養を伴うため、検出には時間と熟練した技術が必要である。そのため、大規模な放射線事故／災害発生時の多数の対象者がいる場合に本測定法を実際に適応することは困難といえる。

また、放射線により歯に形成された安定ラジカルをＬ−ＢａｎｄＥＳＲまたはＸ−ＢａｎｄＥＳＲにより測定する手法も知られている。しかしながら、被験者がこれまでに医療目的で頭部付近に浴びた放射線による影響が大きいことと、Ｘ−ＢａｎｄＥＳＲを用いる際には、被験者は歯を抜歯する必要があり、被験者の精神的・身体的負担になる。

Redon, Christophe E., et al., "The use of gamma-H2AX as a biodosimeter for total-body radiation exposure in non-human primates.", PloS one,2010, 5(11), e15544. United Nations Scientific Committee on the Effects of Atomic Radiation., "Sources, effects and risks of ionizing radiation.",1988.

上述のように従来の方法では、放射線量推定に時間や特殊な技術が必要であった。
また、被ばく者の被ばく線量の推定は、放射線被ばく事故発生から１日以内に実施することは困難であると考えられる。したがって、従来の方法では、トリアージが最も必要となる、放射線事故／災害発生から１日〜数日が経過した後に、一定の確かさの範囲内で被ばく線量を推定し、なおかつ多くの対象者に適応するということはできなかった。

かかる状況下、放射線被ばく発生から１日〜数日が経過した後においても、被ばく線量を判別でき、かつ、短時間で推定できる手法の確立が望まれていた。

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、０．５〜数Ｇｙ程度の全身被ばく後に生体の抗酸化能が変化すること、さらに、被ばく線量と生体の抗酸化能の変化が相関することを見出し、本発明に至った。

すなわち、本発明は、以下の発明に係るものである。
＜１＞放射線被ばくした被験者から採取した体液に基づいて得られる被験者の抗酸化能の指標から、被験者が所定の放射線量を超えて被ばくしているか否かを判定する工程（１）を有する、放射線被ばくの判定方法。
＜２＞工程（１）において、前記被験者が所定の放射線量を超えて被ばくしているか否かを判定する方法が、
所定の放射線量の被ばくを受けた既知の被ばく者群の体液を、当該既知の被ばく者群が被ばくを受けた後、所定の日数、定期的に測定することにより得られる抗酸化能の指標に基づいて標準曲線を作成し、当該標準曲線に基づいて、既知の被ばく者群が受けた所定の放射線量に対応する抗酸化能の低下率のしきい値を設定し、
被験者が被ばくを受けた後、所定の日に測定した前記被験者の抗酸化能の低下率が、前記標準曲線に基づく、前記所定の日におけるしきい値を超えている場合に、前記所定の放射線量を超えて被ばくしていると判定する方法である、前記＜１＞に記載の放射線被ばくの判定方法。
＜３＞工程（１）において、被験者の抗酸化能が、放射線被ばくした被験者から採取した血液にＥＳＲを適用して得られるラジカル量である、前記＜１＞または＜２＞に記載の放射線被ばくの判定方法。
＜４＞前記体液が、血液である前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の放射線被ばくの判定方法。
＜５＞被ばくから１日以上経過後に、被験者の測定を行う前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の放射線被ばくの判定方法。
＜６＞前記所定の放射線量が、１Ｇｙである前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の放射線被ばくの判定方法。
＜７＞工程（１）の後に、γＨ２ＡＸアッセイ法または染色体異常分析により放射線被ばくの有無を確認する工程（２）を有する前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の放射線被ばくの判定方法。

本発明によれば、従来法では困難であった、放射線被ばく発生から１日〜数日が経過した後においても、被験者が所定の被ばく線量を超えて被ばくしているかを判別できる手法が提供される。

被験者の抗酸化能の低下率および標準曲線から被験者が所定の放射線量を超えて被ばくしているか否かを判定する方法を説明するための図である。被ばくからの日数に対する抗酸化能の低下率をプロットした図である。被ばくからの日数に対するγＨ２ＡＸアッセイ法のｆｏｃｉの数をプロットした図である。

以下に本発明の実施の形態を詳細に説明するが、以下に記載する構成要件の説明は、本発明の実施態様の一例（代表例）であり、本発明はその要旨を変更しない限り、以下の内容に限定されない。

本発明は、放射線被ばくした被験者から採取した体液に基づいて得られる被験者の抗酸化能の指標から、被験者が所定の放射線量を超えて被ばくしているか否かを判定する工程（１）を有する、放射線被ばくの判定方法（以下、「本発明の放射線被ばくの判定方法」または「本発明の判定方法」と記載する場合がある）に関する。

本発明の放射線被ばくの判定方法の特徴は、放射線被ばくの判定のために、被験者の抗酸化能の指標を利用することである。
「抗酸化能」とは、生体内のフリーラジカルや活性酸素を消去する能力のことである。
また、「抗酸化能の指標」とは、様々な測定法により得られる抗酸化能に関係する測定値をそのまま、あるいは換算して得られる指標である。

抗酸化能の指標は、抗酸化能の評価方法によって変化するものであるが、具体例を示すと測定法がＥＳＲの場合は、サンプル（被験者から採取した体液）とラジカルトラップ剤を混合した後に人工的にラジカルを発生させて、ラジカルトラップ剤に補足されたラジカル量が抗酸化能の指標となる。すなわち、人工的に発生させたラジカルは、サンプル中の抗酸化成分とラジカルトラップ剤の競合によって抗酸化成分またはラジカルトラップ剤に捕捉される。サンプル中に抗酸化成分が少なく、抗酸化能が低いほど、ラジカルトラップ剤に多くのラジカルが捕捉され、ＥＳＲにて得られるラジカルトラップ剤のシグナルが大きくなる。
なお、ラジカルトラップ剤とは、ラジカルを補足するとＥＳＲシグナルを発する物質のことで、ＥＳＲシグナルの大きさから補足したラジカル量を定量することができる。ＥＳＲを用いた測定方法について詳しくは、後述する。

なお、抗酸化能に関係する測定値は、ＥＳＲ用いて測定した場合はラジカルとなるが、市販のｋｉｔやＨＰＬＣなどを使用した場合には、吸光度、蛍光強度、発光強度等もありうる。

本発明の判定方法では、被験者の抗酸化能を指標として被験者の被ばく線量を一定の確かさの範囲で推定することで、被験者が所定の放射線量を超えて被ばくしているか否かを判定する。

このように被験者の抗酸化能を指標にして、放射線被ばくを判定するという本発明の判定方法は、本発明者が見出した、被ばく線量と生体の抗酸化能には相関があるという知見に基づくものである。この被ばく線量と抗酸化能との間の相関関係は、被ばくから数十日経過した後まで見られることから、本発明の判定方法は、被ばくから時間が経過しても適応できる。

また、本発明の放射線被ばくの判定方法は、従来の手法よりも短時間で判定が行えるために、多くの対象者に適応することができる。

さらに、本発明の放射線被ばくの判定方法は、被験者の血液等の体液を採取できればよいので、特殊な装置や技術を必要としない。

そのため、本発明の放射線被ばくの判定方法は、１日以内に被験者の被ばくの判定が困難と考えられる、一般市民が放射線に曝されるような大規模放射線事故／災害発生時のトリアージ（１次スクリーニング）に特に有効である。すなわち、緊急被ばくが疑われる被験者が多数いる場合に、多数の被験者の中から所定の放射線量を超えて被ばくしている可能性の高い被験者を選び出す１次スクリーニングとして有用である。

本発明において、「被験者」とは、放射線被ばく線量の推定が必要な対象のことであり、ヒトが対象であるが、ヒト以外のウシ、ウマ、ブタなどの家畜動物や、サル、モルモット、ウサギ、ラット、マウスなどの動物を対象としてもよい。

「体液」とは、生体内に存在する液体のことであり、体液を含む水溶液等も含まれる。体液としては、血液、尿、唾液、血清などが挙げられるが、好適には血液である。

本発明の放射線被ばくの判定方法の好適な態様は、工程（１）において、前記被験者が所定の放射線量を超えて被ばくしているか否かを判定する方法が、所定の放射線量の被ばくを受けた既知の被ばく者群の体液を、当該既知の被ばく者群が被ばくを受けた後、所定の日数、定期的に測定することにより得られる抗酸化能の指標に基づいて標準曲線を作成し、当該標準曲線に基づいて、既知の被ばく者群が受けた所定の放射線量に対応する抗酸化能の低下率のしきい値を設定し、被験者が被ばくを受けた後、所定の日に測定した前記被験者の抗酸化能の低下率が、前記標準曲線に基づく、前記所定の日におけるしきい値を超えている場合に、前記所定の放射線量を超えて被ばくしていると判定する方法である。

なお、抗酸化能の低下率とは、非被ばく者群から採取した体液中の抗酸化能成分の量を基準（１００％）として、基準に対する、減少した抗酸化能成分の割合を表すものである。抗酸化能の低下率は、用いる抗酸化能の指標（吸光度、蛍光強度、発光強度、ラジカル量など）により値は変化するものであるが、非被ばく者群（または非被ばく時）の抗酸化能の指標に対して、被ばくを受けた後の抗酸化能の指標がどれだけ変化したかを求めることにより得られる。詳しくは、後述する。

このように判定することにより、被ばくした放射線量が不明な被験者に対しても、既知の被ばく者群から得られる前記標準曲線に基づくしきい値から被験者が所定の放射線量を超えて被ばくしているか否かを判別することができる。詳しくは、実施形態１および実施例にて後述する。

また、工程（１）において、放射線被ばくした被験者から採取した体液から抗酸化能の指標を得る方法は、特に限定されないが、例えば、ＥＳＲ、市販の抗酸化能測定ｋｉｔやＨＰＬＣなどが挙げられる。好適な方法は、ＥＳＲであり、例えば、国際公開公報ＷＯ２００９／１１０５８５号に記載の方法などが適用できる。

ＥＳＲとは、ＥｌｅｃｔｒｏｎＳｐｉｎＲｅｓｏｎａｎｃｅ（電子スピン共鳴）のことであり、物質内のフリーラジカルの不対電子を検出する手法である。血液中にＥＳＲを適用する場合、血液中にラジカルトラップ剤を混合した後に、ラジカル発生剤により人工的にラジカルを発生させて、ラジカルトラップ剤に補足されたラジカル量を測定する。

使用するラジカル発生剤およびラジカルトラップ剤は、特に限定されず、目的に応じて適宜選択可能である。例えば、ラジカル発生剤としては、ｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ、Ｈ₂Ｏ₂、２，２’−Ａｚｏｂｉｓ（２−ａｍｉｄｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ）ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＡＡＰＨ）、Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ、Ｒｏｓｅｂｅｎｇａｌなどを使用すればよい。ラジカルトラップ剤としては、ＤＰｈＰＭＰＯ、ＰＢＮ、ＰＯＢＮ、ＤＭＰＯ、ＤＥＰＭＰＯ、ＢＭＰＯ、ＥＭＰＯなどを使用すればよい。

本発明の判定方法は、０．５Ｇｙ以上の高線量を超えて被ばくしているかの判定に好適である。特に、１Ｇｙを超えた被ばくであれば、被ばくから２０日以上経過した後も本発明の判定方法で、被ばくの判定が可能なので、１Ｇｙを超えて被ばくしているか否かの判定に好適に用いることができる。

なお、旧原子力安全委員会の提言「緊急被ばく医療のあり方について」の中で、１−２Ｇｙで急性放射線症候群が発症すると示されており、１Ｇｙを超えて被ばくしたか否かの判断が特に重要とされている。例えば、被ばく事故時など緊急被ばくの場合に、本発明の判定方法は迅速に被ばくの程度を判断できるため有用である。

また、被ばく事故発生時などは、被ばく者の被ばく線量を事故直後に測定することが困難である場合が多いが、例えば、被ばく線量の推定に一般的に使用されているγＨ２ＡＸアッセイ法では、被ばくから１日経過すると推定精度が著しく低下する。一方、本発明の被ばくの判定方法は、被ばくから１日以上経過後であっても、被験者が所定の放射線量を超えて被ばくしているか否かを判定が可能である。そのため、本発明の被ばくの判定方法は、被ばくから１日以上経過後の被ばくの判定方法として、好適に用いることができる。

以下、工程（１）において、前記被験者が所定の放射線量を超えて被ばくしているか否かを判定する方法として、上述した該既知の被ばく者群の抗酸化能の指標に基づく標準曲線を使用する方法の実施形態について説明する。

図１は、被験者Ａ１〜Ａ３および被験者Ｂ１〜Ｂ３が１Ｇｙを超えて被ばくしているか否かを判断するための説明図である。図１中の標準曲線は、被ばくからの所定の日数における、１Ｇｙの被ばくをした被ばく者群（既知の被ばく者群）の抗酸化能の低下率に基づき作成したものである。抗酸化能の指標は、血液にＥＳＲを適用して得られるラジカル量を用いた。

図１中のＡは、被ばくから１日後の抗酸化能の低下率のしきい値である。Ａ１〜Ａ３は、それぞれ被験者Ａ１〜Ａ３の被ばくから１日後の抗酸化能の低下率をプロットした点である。

図１中のＢは、被ばくから４日後の抗酸化能の低下率のしきい値である。図１中のＢ１〜Ｂ３は、それぞれ被験者Ｂ１〜Ｂ３の被ばくから４日後の抗酸化能の低下率をプロットした点である。

以下、標準曲線の作成方法および被験者Ａ１〜Ａ３、Ｂ１〜Ｂ３の被ばくの判定方法について説明する。

１．標準曲線の作成
まず、医療被ばくや職業被ばくにより、１Ｇｙの線量を被ばくする予定の者に対して、被ばく前後で経時的に抗酸化能の指標を測定することで、放射線により抗酸化能がどのように変化するか明らかにすることができる。被ばく前後の抗酸化能の指標の変化に基づいて、抗酸化能の低下率を求めることができ、所定の日数に対して抗酸化能の低下率をプロットすることで、図１のような標準曲線を描くことができる。
標準曲線から、所定の日数に対応する抗酸化能の低下率の値を読み取り、その値を抗酸化能の低下率のしきい値として設定する。

次に、抗酸化能の低下率の求め方について説明する。本実施形態では、抗酸化能の指標として、血液にＥＳＲを適用して得られるラジカル量を用いた。具体的には、血液とラジカルトラップ剤を混合した後に人工的にラジカルを発生させて、ラジカルトラップ剤に補足されたラジカル量を抗酸化能の指標とした。上述のように、血液中にラジカルトラップ剤を混合した後に人工的にラジカルを発生させると、ラジカルが抗酸化成分とラジカルトラップ剤の競合によって捕捉される。そのため、血液中に抗酸化成分が少なく、抗酸化能が低いほど、ラジカルトラップ剤に多くのラジカルが捕捉される。ＥＳＲでは、ラジカルトラップ剤に補足されたラジカルを検出しているので、ＥＳＲにより検出されるラジカル量（ラジカルトラップ剤に補足されたラジカル量）が多いほど、血液中に抗酸化成分が少なく、血液中の抗酸化能が低いことを表す。

すなわち、非被ばく時に対して、被ばく後の血液にＥＳＲを適用して得られたラジカル量（ラジカルトラップ剤に補足されたラジカル量）がどの程度増えたかを明らかにすることで、ラジカルトラップ剤と競合する抗酸化成分がどの程度減少したかを明らかにすることができる。
例えば、非被ばく時に対して、被ばく後の血液にＥＳＲを適用して得られたラジカル量が１０％増加している場合、競合する抗酸化成分は１０％減少しているといえる。

抗酸化能の低下率は、非被ばく時の血液中の抗酸化能成分の量を基準（１００％）として、基準に対する、減少した抗酸化能成分の割合を表すものである。そして、上述の通り、血液中の抗酸化成分の減少率は、抗酸化成分と競合するラジカルトラップ剤に補足されたラジカル量の増加率と相関がある。ラジカルトラップ剤に補足されたラジカル量の増加率は、１Ｇｙの線量の被ばくから所定の日数が経過した既知被ばく者から採取した血液にＥＳＲを適用して得られたラジカル量を、非被ばく時に採取した血液にＥＳＲを適用して得られたラジカル量で除した値に基づいて求めることができる。この値に基づいて、抗酸化能の低下率は求められる。すなわち、抗酸化能の低下率は、下記式より求められる。

なお、抗酸化能の低下率は、１Ｇｙの線量の被ばくから所定の日数が経過した既知被ばく者から採取した血液にＥＳＲを適用して得られたラジカル量を、非被ばく群（非被ばくしていない健常者群）から採取した血液にＥＳＲを適用して得られたラジカル量で除した値に基づいて求めてもよい。この場合、上記式において、非被ばく時に採取した血液にＥＳＲを適用して得られたラジカル量のかわりに、非被ばく群（非被ばくしていない健常者群）から採取した血液にＥＳＲを適用して得られたラジカル量を用いて、抗酸化能の低下率を求めればよい。

基準となる非被ばく群の抗酸化能の指標（ラジカルトラップ剤に補足されたラジカル量）は、被ばくしていない健常者群の抗酸化能の指標を予め求めておくことで得られる。基準となる非被ばく群の抗酸化能の指標は性別、年齢、体型により異なる可能性が高いため、複数の群に分けて求めることが望ましい。
同様に、標準曲線は性別、年齢、体型により異なる可能性が高いため、複数の群に分けて求めることが望ましい。

２．被験者の被ばくの判定
被験者Ａ１〜Ａ３、Ｂ１〜Ｂ３の抗酸化能の指標（ラジカルトラップ剤に補足されたラジカル量）を測定した。得られた抗酸化能の指標を、基準となる非被ばく群の抗酸化能の指標で除した値に基づき、被験者の抗酸化能の低下率が求められる。すなわち、抗酸化能の低下率は、下記式より求められる。

性別、年齢、体型ごとに作成された基準となる非被ばく群の抗酸化能の指標の中から、被験者Ａ１〜Ａ３、Ｂ１〜Ｂ３の性別、年齢、体型に基づいて、基準として適した被ばく者群の抗酸化能の指標を選択し、被験者の抗酸化能の低下率が求められる。

次に、上記１．で作成した標準曲線に基づいて設定した抗酸化能の低下率のしきい値（図１中のＡまたはＢ）と被験者Ａ１〜Ａ３、Ｂ１〜Ｂ３の抗酸化能の低下率と比較することで、被験者の被ばくを判定できる。

図１では、被ばくから１日経過後において、被験者Ａ１の抗酸化能の低下率は標準曲線より低いので１Ｇｙを超えて被ばくしていないと推定でき、被験者Ａ２、Ａ３の抗酸化能の低下率は標準曲線より高いので、１Ｇｙを超えて被ばくしていると推定できる。

被ばくから４日経過後において、被験者Ｂ１、Ｂ２の抗酸化能の低下率は標準曲線より低いので１Ｇｙを超えて被ばくしていないと推定でき、被験者Ｂ３の抗酸化能の低下率は標準曲線より高いので、１Ｇｙを超えて被ばくしていると推定できる。

なお、上記実施形態では、抗酸化能の指標を、ＥＳＲを適用して得られるラジカル量としたが、ＥＳＲ以外の方法によって抗酸化能の指標を測定してもよい。抗酸化能の低下率は、用いる抗酸化能の指標に応じて算出方法を適宜変更すればよい。

また、被験者が１Ｇｙを超えて被ばくしているか否かの判定は、上述した抗酸化能の低下率のしきい値による判定に限定されず、他の判定方法であってもよい。例えば、図１に示すように、抗酸化能の低下率は、被ばく後から徐々に大きくなり、被ばく後１週間程度で最大となり、その後回復する傾向にある。そのため、経過時間に対応する抗酸化能の低下率の値をしきい値として判定するのではなく、経時的に抗酸化能の低下率を求め、抗酸化能の低下率の変動パターンから被ばく線量を推定してもよい。

また、標準曲線の作成も、所定の日数に対する抗酸化能の低下率をプロットする方法に限らず、例えば、所定の日数に対する既知被ばく者の抗酸化能の指標（吸光度、蛍光強度、発光強度、ラジカル量等）をプロットすることで標準曲線を作成してもよい。標準曲線の作成方法に応じて、所定の日数に対してプロットした項目（抗酸化能の低下率、抗酸化能の指標等）を、設定するしきい値の項目として適宜判定に用いればよい。

以上、抗酸化能の指標から、被験者が基準以上の放射線量を被ばくしているかを判定する方法について説明したが、抗酸化能は、放射線被ばく以外の要因（睡眠不足や食事など）によっても影響を受けるものである。そのため、放射線被ばく以外の要因で抗酸化能が低下している被験者を所定の放射線量を超えて被ばくしていると推定する可能性もある。そこで、抗酸化能の低下率が放射線の被ばく由来であるかをより確かにするために、工程（１）において所定の放射線量を超えて被ばくしていると推定される被験者に対して、工程（１）の後に、抗酸化能を指標にする以外の他の方法により放射線被ばくの有無を確認する工程（２）を行うことが好ましい。すなわち、工程（１）を、多数の被験者の中から所定の放射線量を超えて被ばくしている可能性の高い被験者を選び出す１次スクリーニングとする方法である。

このように、抗酸化能を指標として、被験者が所定の放射線量を超えて被ばくしているか否かをまず工程（１）において判断することで、被ばくしている可能性が高い被験者に工程（２）を優先して行うことができ、放射線被ばくの有無を確実に確認することができる。

工程（２）において、放射線被ばくの有無を確認する方法は任意であるが、γＨ２ＡＸアッセイ法や染色体異常分析などが挙げられる。
γＨ２ＡＸアッセイ法は、被ばく線量とγＨ２ＡＸｆｏｃｉが比例関係にあり、直線性が良いのが、最大の利点である。また、再現性が良く、大量のリンパ球（１００〜１０００個）を解析することで、１００ｍＳｖ程度の低線量被ばくの推定も可能といった利点がある。
また、染色体異常分析は、熟練した作業が求められるが、古くから用いられてきた手法であり、感度、精度、再現性などが良い。また、被ばく後６ヶ月程度は染色体異常が残るため、推定可能である。さらに、これまでに放射線被ばく推定に使われてきたという実績も利点である。

一方、上述のように、γＨ２ＡＸアッセイ法や染色体異常分析は、被ばくから１日以上経過した場合の多くの対象者への被ばくの判定には適応することが困難であった。本発明の判定方法では、工程（１）を１次スクリーニングとすることにより、工程（２）の対象者を減らすことができるため、これらの手法を適用できる。

以上、本発明の放射線被ばくの判定方法について説明したが、今回開示された内容はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。特に、今回開示された内容において、明示的に開示されていない事項、例えば、抗酸化能の指標を得るための測定における条件、各種パラメータなどは、当業者が通常実施する範囲を逸脱するものではなく、通常の当業者であれば、容易に想定することが可能な値を採用している。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、その要旨を変更しない限り以下の実施例に限定されるものではない。

［実施例１］
１．ＥＳＲによる放射線曝露マウスの血液中抗酸化能の定量を利用した判定
（１−１）ＥＳＲ測定サンプルの調製
ＥＳＲ測定サンプルは、下記１〜６の手順で調整した。なお、試薬は特級以上の等級のものを使用した。濃度は特に断らない限り終濃度である。

〔１〕８週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６マウス（日本エスエルシー株式会社産）にＸ線照射装置（株式会社日立パワーソリューションズ製）で０、０．５、１、２、３Ｇｙ照射した。線量率は０．８８Ｇｙ／分を採用した。
〔２〕Ｘ線照射１時間、１日、２日、４日、６日、９日、１６日、２４日後に、あらかじめヘパリンナトリウム（和光純薬工業株式会社製）を入れてあるエッペンチューブにマウス血液を採取した。
〔３〕採取した血液１００μＬに生理食塩水１００μＬを加え、ｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ（ＴＢＨＰ）（株式会社同仁化学研究所製）１０ｍＭ及び、ｄｉｐｈｅｎｙｌ−ＰＭＰＯ（ＤＰｈＰＭＰＯ）（株式会社同仁化学研究所製）５ｍＭを加え、室温で３０分インキュベートした。
〔４〕インキュベート後、クロロホルム（和光純薬工業株式会社製）とメタノール（和光純薬工業株式会社製）が容量比２：１で混合された溶媒を１ｍＬ加え、１０分間ボルテックスで撹拌した。
〔５〕ボルテックス後、あらかじめ４度に設定した遠心機の中に入れ、５分間サンプルを冷却後、３０００ｇで１０分間遠心した。
〔６〕水層を除去し、有機層をピペットで吸い出し、硫酸カルシウムが入ったエッペンチューブに入れた。氷上で１５分間放置し、−８０度でＥＳＲ測定時まで保存した。

なお、ｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅは血液中のヘモグロビンと反応してｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌラジカルを生じるラジカル発生剤である。ＤＰｈＰＭＰＯは、ラジカルトラップ剤である。ｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌラジカルは血液中の抗酸化成分とＤＰｈＰＭＰＯの競合によって補足され、ＤＰｈＰＭＰＯによってｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌラジカルが補足された場合にスピンアダクト（ｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ由来ラジカルアダクト）が形成され、ＥＳＲでスペクトルとして観察される。すなわち、血液中の抗酸化成分が少なく、抗酸化能が低いほど、ＤＰｈＰＭＰＯによって多くのｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌラジカルが捕捉され、ＥＳＲで観察されるスペクトルが大きくなる。

（１−２）ＥＳＲ測定
ＥＳＲ測定にはＥＳＲ装置ＪＥＳ−ＴＥ２００（日本電子株式会社製）を使用した。
ＥＳＲ測定では、まず、（１−１）で調整したサンプルを室温まで戻し、１６０μＬのセルに入れて、ＥＳＲ装置に挿入した。測定条件は、マイクロ波周波数：９．４２２ＧＨｚ、中心磁場：３３２．０±１０ｍＴ、マイクロ波出力：２ｍＷ、磁場変調幅：０．３ｍＴ、増幅比：１０００、応答時間：０．３秒、掃引時間：４分を採用した。
その結果、ｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ由来ラジカルアダクトのＥＳＲスペクトルが観察された。得られたスペクトルは基準となるＭｎスペクトルにより校正した。

（１−３）標準曲線の作成
抗酸化能の低下率は、非被ばく時の血液中の抗酸化能成分の量を基準（１００％）として、基準に対して抗酸化能成分がどれだけ減少したかを表すものである。上述のように、血液中では、抗酸化成分とＤＰｈＰＭＰＯ（ラジカルトラップ剤）が競合するため、血液中の抗酸化成分が少なく、抗酸化能が低いほど、ＤＰｈＰＭＰＯによって多くのｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌラジカルが捕捉され、多くのｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ由来ラジカルアダクトが形成される。そのため、観察されるＥＳＲスペクトル（ｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ由来ラジカルアダクトのＥＳＲスペクトル）が大きくなる。すなわち、抗酸化能の低下率と、ＤＰｈＰＭＰＯによって補足されたｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌラジカルの増加率には相関がある。

そこで、抗酸化能の低下率は、被ばくマウスのＥＳＲ測定サンプル中のＤＰｈＰＭＰＯによって補足されたｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌラジカルの量を、非被ばくマウスのＥＳＲ測定サンプル中のＤＰｈＰＭＰＯによって補足されたｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌラジカルの量で除することにより、下記式より求めた。

なお、非被ばく（０Ｇｙの放射線量を照射の）マウスのＥＳＲ測定サンプルを測定して得られたＥＳＲスペクトルの大きさから、ＤＰｈＰＭＰＯによって補足されたｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌラジカルの量を算出した。用いたＥＳＲスペクトルは、基準となるＭｎスペクトルにより校正したものである。
また、被ばく（０．５Ｇｙ、１Ｇｙ、２Ｇｙ、３Ｇｙの放射線量を照射の）マウスのＥＳＲ測定サンプルを測定して得られたＥＳＲスペクトルの大きさから、ＤＰｈＰＭＰＯによって補足されたｔｅｒｔ−Ｂｕｔｙｌラジカルの量を算出した。用いたＥＳＲ測定スペクトルは、基準となるＭｎスペクトルにより校正したものである。

得られた抗酸化能の低下率に基づき、放射線被ばく線量０．５Ｇｙ、１Ｇｙ、２Ｇｙ、３Ｇｙにおける標準曲線を作成した。

図２に、結果を示す。図２に示すように、抗酸化能は被ばく後から徐々に低下し、１週間程度で低下率が最大となった。

図２において、１Ｇｙ被ばくした場合の被ばく後３日目の抗酸化能の低下率を標準曲線から読み取ると、１６％である。この値を、１Ｇｙ被ばくした場合の被ばく後３日目の抗酸化能の低下率のしきい値とした。被ばく後３日後に採血し求めた被験者Ｘの抗酸化能の低下率が１６％以上である場合、被験者Ｘは１Ｇｙを超えて被ばくしていると判断できる。

［実施例２］
２．放射線曝露マウスのリンパ球に形成されるγＨ２ＡＸのｆｏｃｉ数の定量との組合せによる判定
試薬は特級以上の等級のものを使用した。濃度は特に断らない限り終濃度である。

（２−１）γＨ２ＡＸ用サンプルの調製
〔１〕８週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６マウス（日本エスエルシー株式会社産）にＸ線照射装置（株式会社日立パワーソリューションズ製）で０、０．５、１、３Ｇｙ照射した。線量率は０．８８Ｇｙ／分を採用した。
〔２〕Ｘ線照射１時間、１、３、７日後に、ヘパリンナトリウム（和光純薬工業株式会社製）の入ったエッペンチューブにマウス血液を採取した。
〔３〕採取した血液とリンパ球分離試薬（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製；商品名：Ｆｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＰＬＵＳ）を１：１で混合し、Ｌｅｕｃｏｓｅｐリンパ球分離チューブ（株式会社グライナー・ジャパン社製）に投入後、室温７００ｇ２５分遠心した。
〔４〕リンパ球層をピペッティングで吸い出して、チューブに入れ、等量のＰＢＳで懸濁した。
〔５〕３００ｇ１０分遠心し、上清を捨てて、１ｍＬのＰＢＳで懸濁した。これを３回繰り返した。
〔６〕１ｍＬの４％のパラフォルムアルデヒド（和光純薬工業株式会社製）を入れ、室温で２０分放置した。
〔７〕３００ｇ１０分遠心し、上清を捨てて、１ｍＬのＰＢＳで懸濁した。これを３回繰り返した。

〔８〕上記〔７〕で得られたリンパ球の懸濁液を細胞塗抹遠心機を用いてスライドガラス（松浪硝子工業株式会社製）上に塗沫した。
〔９〕ＰＢＳ−ＴＴ（ＰＢＳｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０ａｎｄ０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）をスライドガラスに乗せ、室温で１０分インキュベートした。
〔１０〕スライドガラスを５分間ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０）に浸した。これを３回繰り返した。
〔１１〕２％のヤギ血清をスライドガラスに乗せ、４度で一晩インキュベートした。
〔１２〕１／５００に希釈したｒａｂｂｉｔｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉ−γ−Ｈ２ＡＸ（Ｃａｔ＃ＮＢ１００−３８４，ＮｏｖｕｓＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）抗体をスライドガラスに乗せ、４度で一晩インキュベートした。
〔１３〕スライドガラスを５分間ＰＢＳ−Ｔに浸した。これを３回繰り返した。
〔１４〕１／５０００に希釈したＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｇｏａｔａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔＩｇＧ（Ｃａｔ．＃Ａ１１０３４，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）抗体をスライドガラスに乗せ、室温で１時間インキュベートした。
〔１５〕スライドガラスを５分間ＰＢＳ−Ｔに浸した。これを３回繰り返した。
〔１６〕０．５ｍｇ／ｍＬＲＮａｓｅＡ（和光純薬工業社製）をスライドに乗せ、３７度で２０分インキュベートした。
〔１７〕スライドガラスを５分間ＰＢＳ−Ｔに浸した。これを３回繰り返した。
〔１８〕１ｍｇ／ｍＬのｐｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）（Vector Laboratories, Burlingame, CA）を含んだ封入液でサンプルを封入した。

（２−２）γＨ２ＡＸのｆｏｃｉ数の定量
（２−１）で調整したサンプルを蛍光顕微鏡で観察し、１つの核あたりに形成されているγＨ２ＡＸのｆｏｃｉ数を目視により数えた。１００細胞（核）のｆｏｃｉ数を数え、平均を求めた。

図３に結果を示す。図３に示すように、γＨ２ＡＸｆｏｃｉの数は被ばく後１時間程度で最大となるが、その後はＤＮＡの二重鎖切断が修復されるに伴って、γＨ２ＡＸｆｏｃｉの数が減少し、約３日後にはバックグランドまで戻った。

（２−３）抗酸化能測定（実施例１）との組み合わせによる判定
実施例１の結果とあわせて、表１に示すような、被験者の被ばく線量を推定するための早見表を作成した。

表１は、被験者の被ばく線量を推定するための早見表である。
例えば、被ばく後、３日目で抗酸化能の低下率が１６％以上、２７％未満であった場合、１〜３Ｇｙ被ばくしたと推定される。その後、γＨ２ＡＸ解析を実施し、早見表に照らし合わせて、細胞核１個あたり０．３９個のγＨ２ＡＸｆｏｃｉがあれば、１Ｇｙ被ばくと確定できる。
なお、γＨ２ＡＸｆｏｃｉ数は被ばく線量と比例関係にあるため、表１のデータを線形補間することで、推定線量を詳細に算出できる。

上述のように、γＨ２ＡＸ解析による推定は比較的正確であるが、ＤＮＡが修復されるため、被ばく後数日以内に実施する必要がある。抗酸化能測定より労力と時間がかかることも欠点と言える。しかしながら、抗酸化能測定を１次スクリーニングとすることで、γＨ２ＡＸ解析の対象者を減らしたうえで、γＨ２ＡＸ解析にて、被ばく線量を詳細に算出できる。

上述のように、被ばく者の被ばく線量の推定は、放射線被ばく事故発生から１日以内に実施することは困難であると考えられる。そのため、放射線事故／災害発生から１日〜数日が経過した後に、被ばく線量の推定ができるバイオドシメトリ手法が望まれる。
図２または表１に示すように、抗酸化能測定による被ばく量の推定は、被ばく後２〜７日で最も線量効果がはっきりするため、この期間において、最も精度良く被ばく線量が推定可能である。そのため、被ばくしているか否かを判定する１次スクリーニングとして有用である。また、抗酸化能測定は、他の手法に比べ短時間で、大量解析が可能であるとう利点を持つ。さらに、他の測定方法では全自動化の実現が困難であるが、抗酸化能測定では他の測定方法と比較して全自動化を実現しやすいという点も利点である。

本発明の判定方法は、被ばくから時間が経過しても適応できる。そのため、大規模放射線事故／災害発生時など被ばく後すぐの被ばく線量の推定が困難な場合にも適応でき、高線量の被ばくの可能性の高い被ばく者に迅速に適切な治療を施すことが可能となる。

Claims

放射線被ばくした被験者から採取した体液に基づいて得られる被験者の抗酸化能の指標が、前記被験者が所定の放射線量を超えて被ばくしているか否かを評価するために用いられる方法であり、
前記被験者の抗酸化能の指標が、
放射線被ばくした被験者から採取した体液とラジカルトラップ剤とラジカル発生剤とを混合することでラジカル発生剤により人工的にラジカルを発生させた後、電子スピン共鳴法を適用して得られるラジカルトラップ剤に捕捉されたラジカル量である方法。
所定の放射線量の被ばくを受けた既知の被ばく者群の体液を、当該既知の被ばく者群が被ばくを受けた後、所定の日数、定期的に測定することにより得られる抗酸化能の指標に基づいて標準曲線を作成し、当該標準曲線に基づいて、既知の被ばく者群が受けた所定の放射線量に対応する抗酸化能の低下率のしきい値を設定し、
前記被験者が被ばくを受けた後、所定の日に測定した前記被験者の抗酸化能の低下率を、前記標準曲線に基づく、前記所定の日におけるしきい値と比較する工程を有し、
前記既知の被ばく者群が受けた所定の放射線量に対応する抗酸化能の低下率が、
前記既知の被ばく者群から採取した体液とラジカルトラップ剤とラジカル発生剤とを混合することでラジカル発生剤により人工的にラジカルを発生させた後、電子スピン共鳴法を適用して得られるラジカルトラップ剤に捕捉されたラジカル量を、非被ばく者群から採取した体液とラジカルトラップ剤とラジカル発生剤とを混合することでラジカル発生剤により人工的にラジカルを発生させた後、電子スピン共鳴法を適用して得られるラジカルトラップ剤に捕捉されたラジカル量で除した値から１を引いて、１００を乗ずることで算出される値であり、
前記被験者の抗酸化能の低下率が、
前記被験者から採取した体液とラジカルトラップ剤とラジカル発生剤とを混合することでラジカル発生剤により人工的にラジカルを発生させた後、電子スピン共鳴法を適用して得られるラジカルトラップ剤に捕捉されたラジカル量を、前記非被ばく者群から得られる前記ラジカルトラップ剤に捕捉されたラジカル量で除した値から１を引いて、１００を乗ずることで算出される値である請求項１に記載の方法。
前記体液が、血液である請求項１又は２に記載の方法。
被ばくから１日以上経過後に、前記被験者の測定を行う請求項１から３のいずれかに記載の方法。
前記所定の放射線量が、１Ｇｙである請求項１から４のいずれかに記載の方法。
前記被験者の抗酸化能の低下率が、前記標準曲線に基づく、前記所定の日におけるしきい値を超えている場合に、γＨ２ＡＸアッセイ法または染色体異常分析を行う、請求項２に記載の方法。