JP2016533497A - 放射線傷害の線量評価のためのバイオマーカーパネルおよびマイクロ血漿フィルター - Google Patents

Abstract

バイオマーカーの量を測定することによって、電離放射線への人の被曝の定性的評価のための材料、システム、および方法が提供され、バイオマーカーの対応する非照射コントロール基準範囲と比較した変化が、評価を提供し、バイオマーカーが、（ｉ）アルファ−１−抗キモトリプシン（ＡＣＴ）（ｉｉ）Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、および（ｉｉｉ）１つ以上のさらなるタンパク質を含む。【選択図】図１

Description

本発明は、厚生省の契約番号ＨＨＳＯ１００２０１０００００７Ｃの下で政府の支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。

関連出願の相互参照

本出願は、２０１３年７月０９日に提出された米国特許出願公開第６１／８４４，３６５号明細書に対する優先権を主張し、本開示は、その全体が参照によって本明細書において組み込まれる。

発明者らは、放射線／核イベントの間に電離放射線（ＩＲ）に曝露されたかもしれない個人の迅速なトリアージのための簡易迅速（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ）（ＰＯＣ）放射線量評価ツールを開発したまたこれを開示する。発明者らのアプローチは、ＢＡＲＤＡ必要条件を満たす生体線量計（ｂｉｏｄｏｓｉｍｅｔｅｒ）ツールの迅速な開発のために、アップコンバーティング蛍光体−レポーター技術（ｕｐｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ＵＰＴ）に基づく、成熟した手持ち型検出技術プラットフォームを、単純で高感度の高速（＜１５分間）アッセイフォーマットおよびバイオマーカーパネルと組み合わせる。発明者らは、初期の放射線被曝を予測する際の精度の強化を提供するための、複数のプロテオミクス標的（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｔａｒｇｅｔ）の使用を実証する。このシステムは、個人のＩＲに対する照射線量の定性的および定量的測定を提供することができる、非侵襲的に収集された血液サンプルのバイオマーカーを検出する。

Ｇｕｉｐａｕｄ ｅｔ ａｌは、マウスモデルにおいてアミラーゼ、Ｆｌｔ３−リガンド、およびシトルリンを含むパネルを提案したのに対して［Ｇｕｉｐａｕｄ ａｎｄ Ｂｅｎｄｅｒｉｔｔｅｒ，２００９］、ＧＡＤＤ４５（Ｇｒｏｗｔｈ ａｒｒｅｓｔ ａｎｄ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅ ４５）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、および唾液アルファアミラーゼ（ＡＭＹ１Ａ）が、Ｏｓｓｅｔｒｏｖａ ｅｔ ａｌ［Ｎ．Ｉ．Ｏｓｓｅｔｒｏｖａ ａｎｄ Ｂｌａｋｅｌｙ，２００９］によって記載されるマウスパネルに含まれる。他の放射線応答性タンパク質が、報告された：血清アミラーゼＡ［Ｂｌａｋｅｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｎ Ｏｓｓｅｔｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｎ．Ｉ．Ｏｓｓｅｔｒｏｖａ ａｎｄ Ｂｌａｋｅｌｙ，２００９；Ｎ．Ｉ．Ｏｓｓｅｔｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｎ．Ｉ．Ｏｓｓｅｔｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｂａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９８２；Ｊｕｎｇｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，１９８６；Ｊｕｎｇｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，１９８６；Ｄｕｂｒａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｂｒａｔｔｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ａｋａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００１］；Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）［Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｐｒａｔ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｐｒａｔ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｂｌａｋｅｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｂｅｒｔｈｏ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｂｅｒｔｈｏ ａｎｄ Ｒｏｙ，２００９］；リポカリン−２（ＬＣＮ２）［Ｃｏｗｌａｎｄ ａｎｄ Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ，１９９７；Ｎｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｒｏｕｄｋｅｎａｒ ｅｔ ａｌ．，２００７；Ｓｈｉｉｂａ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｓｕｇｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１３］；アルファ−１−抗キモトリプシン（ＡＣＴ）［Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｌｉｌｊａ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｓｈａｒｍａ ａｎｄ Ｍｏｕｌｄｅｒ，２０１３］；インターロイキン１５（ＩＬ１５）［Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｌｕｇｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｒｅｉｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８ａ；Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８ｂ］。

Ｇｕｉｐａｕｄ ａｎｄ Ｂｅｎｄｅｒｉｔｔｅｒ，２００９］、 Ｎ．Ｉ．Ｏｓｓｅｔｒｏｖａ ａｎｄ Ｂｌａｋｅｌｙ，２００９ Ｂｌａｋｅｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｎ Ｏｓｓｅｔｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｎ．Ｉ．Ｏｓｓｅｔｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｎ．Ｉ．Ｏｓｓｅｔｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｂａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９８２ Ｊｕｎｇｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，１９８６ Ｄｕｂｒａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｂｒａｔｔｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ａｋａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９ Ｐｒａｔ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｐｒａｔ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｂｌａｋｅｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ｂｅｒｔｈｏ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｂｅｒｔｈｏ ａｎｄ Ｒｏｙ，２００９ Ｃｏｗｌａｎｄ ａｎｄ Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ，１９９７ Ｎｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｒｏｕｄｋｅｎａｒ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｓｈｉｉｂａ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｓｕｇｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１３ Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３ Ｌｉｌｊａ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｓｈａｒｍａ ａｎｄ Ｍｏｕｌｄｅｒ，２０１３ Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｌｕｇｅｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｒｅｉｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８ａ Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８ｂ

本発明は、バイオマーカーの量を測定することによって、電離放射線への人の被曝の定性的評価のための材料、システム、および方法を提供し、バイオマーカーの対応する非照射コントロール基準範囲と比較した、量における著しい増加もしくは減少または相対的な差異のパターンであってもよい変化が、評価を提供する。

バイオマーカーは、（ｉ）アルファ−１−抗キモトリプシン（ＡＣＴ）（ｉｉ）Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、および（ｉｉｉ）

からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のさらなるタンパク質を含む、またはこれ（ら）からなるまたはこれ（ら）から本質的になる（「から本質的になる」は、評価が、列挙されるバイオマーカーに由来するが、他のものが付随的に存在してもよいことを意味する）。

好ましいさらなるタンパク質は、ＡＭＹ１Ａ、ＮＧＡＬ、ＡＰＯＡ４、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＭＣＰ１、およびＨＰＸである。

特定の実施形態では、バイオマーカーが、（ｉ）ＡＣＴ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＡＭＹ１Ａ、およびＩＬ１５；または（ｉｉ）ＡＣＴ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＮＧＡＬ、およびＡＭＹ１Ａ；（ｉｉｉ）ＡＣＴ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＮＧＡＬ、およびＭＣＰ１などのような、バイオマーカー、特に好ましいバイオマーカー、およびさらなるタンパク質の組み合わせを含む、またはこれからなる、またはこれから本質的になる。

特定の実施形態では、方法が、測定ステップを容易にするために、人の血液サンプルのバイオマーカーを分離するステップを含む。

特定の実施形態では、測定ステップが、ラテラルフローイムノアッセイ（ｌａｔｅｒａｌ ｆｌｏｗ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＥＬＩＳＡ、マイクロスフェアベースのイムノアッセイ、ウェスタンブロット、免疫ドットブロット、定量的質量分析などのようなアフィニティアッセイによって達成される。

典型的に、測定ステップは、放射線被曝の１〜７または１〜１４日後に行われる。

特定の実施形態では、放射線被曝が、＞２Ｇｙである。

特定の実施形態では、方法が、評価、特に、２Ｇｙなどのような所定の照射線量閾値以上または以下に基づいて、放射線照射曝露または非曝露として人を分類するステップをさらに含む。

特定の実施形態では、方法が、放射線被曝について人を処置するステップをさらに含み、処置が、療法、モニタリング、またはさらなる評価の指示であってもよい。

本発明はまた、本発明の方法に適合されており、かつ基質中にまたは上に含有される、バイオマーカーに特異的なアフィニティ捕捉分子を含むキットであって、特に、基質が、複数のラテラルフローストリップ（ｌａｔｅｒａｌ ｆｌｏｗ ｓｔｒｉｐ）を含み、それぞれが、異なる所定のタンパク質捕捉特異性を有するキットをも提供する。

特定の実施形態では、キッドが、本発明の方法に特別に適合されており、（ａ）キャピラリー血液収集デバイス、（ｂ）血球から血漿を分離する血液フィルター、（ｃ）血漿およびバッファー溶液の混合物を形成するミキサー、（ｄ）単一のカセットケース中に保持されたラテラルフローストリップ（または１組のストリップ）に混合物を適用するアプリケーター、ならびに（ｅ）（１または複数の）ラテラルフローストリップをスキャンし、結果を出力して、バイオマーカーの量または電離放射線への人の被曝の評価を報告するコンパクトリーダーシステムを含む。

特定の実施形態では、キットのリーダーシステムが、励起レーザー、ウィックセレクター（ｗｉｃｋ ｓｅｌｅｃｔｏｒ）、放射フィルター、収集光学装置類、および強度センサーを含み、特に、センサーが、光電子増倍管、電荷結合素子（ＣＣＤ）、または相補性金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）を含む。

本発明はまた、入口、それぞれが、血球ではなく血漿を通過させるのに十分な、約６５０ｎｍなどのようなポアサイズを有する内腔および壁を含む、複数の細長い中空アフェレーシスファイバー、チャンバー、および出口を含む血液フィルターデバイスであって、入口が、内腔と大部分が流体接続しており（ｉｎ ｂｕｌｋ ｆｌｕｉｄ ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ）、ファイバーが、チャンバー内に含有され、チャンバーが、出口と大部分が流体接続しており、操作中に、血液が入口から内腔に入り、血漿が、ファイバーの壁を通過してチャンバーの中に入り、その後、出口から出る、血液フィルターデバイスをも提供する。

特定の実施形態では、本発明のデバイスが、４〜１００または５〜２５本の細長く平行なファイバーを含む、１００ｕｌ未満のデッドボリュームを有する、および／または、細胞溶解を回避するために２ＰＳＩ未満の圧力を必要とする。

本発明は、あたかもそれぞれが入念に個々に記載されるかのように、詳述されるすべての実施形態の組み合わせを特に提供する。

中空糸管分離の実施形態の概略図を示す図である。ＬＦＡランニングバッファーと混合された全血は、中空糸管を含有する直列のフィルターに押し込まれる。中空糸管のポアサイズは約６５０ｎｍであり、これは血漿を通すが、細胞は通さない。結果として生じる血漿は、出力先で収集される。 フィルターアセンブリーの固体部分（ｓｏｌｉｄ ｗｏｒｋｓ）の概略図を示す図である。チャンバー全体は、６０ｕｌのデッドボリュームを有する。 サンプルフィルタリングデバイスの内側の特徴を示す図である。挿入図は、ラテラルフローストリップに接続されたデバイス全体を示す。ランニングバッファーは、収集された全血を希釈し、阻止シール（ｆｏｉｌ ｓｅａｌ）によって引き止められる。プランジャーは、チャンバーの下方へ移動し、阻止シールが貫通し、ランニングバッファーがサンプルを下方へ、を介して、中空糸管分離デバイスまで移動するのを可能にする。中空糸管は、血球から、血漿およびランニングバッファーの混合物を分離する。

血液サンプルは、見込みのある放射線に応答性のマーカーを同定するために、イムノアッセイ技術およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ技術の両方を使用して分析した。ＮＨＰモデルでは、発明者らは、放射線被曝に応じて変化する３０種を超える血漿タンパク質を同定した−これらのうちの２５種はアップレギュレートされ、５種はダウンレギュレートされる。これらのタンパク質のたった４つのパネル（Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド−Ｆｌｔ３Ｌ、唾液アルファアミラーゼ−ＡＭＹ１Ａ、インターロイキン１５−ＩＬ１５、およびα１抗キモトリプシン−ＡＣＴ）が、＞９６％の精度でＮＨＰ照射研究サンプルを正確に分類することができる。ＩＬ１５を好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）に置き換えても、本質的に同一の結果がもたらされる。４つ（またはそれ以上の）タンパク質の他の組み合わせもまた、優れた分類スコアを実現し、これらは、放射線に曝露された動物および交絡条件を有する動物を識別するのに有用であると分かった。

ＮＨＰパネル由来のタンパク質のうちの３つ（Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５、およびＡＭＹ１Ａ）は、現在まで分析された全身照射（ＴＢＩ）ヒトサンプルについて優れた分類指標になる。これらの２つのタンパク質のみで、９５％の精度でヒトデータセットを分類することができ、軽度の（または重篤な）感染症によっても外傷によっても交絡されない。

発明者らはまた、関心のある４つの異なる標的に対する、ラテラルフローアッセイをベースとしたアップコンバーティング蛍光体（ＵＰＴ）レポーターを開発し、それらを組み合わせて、２つのデュプレックスアッセイにした。調査した４つの標的は、Ｆｌｔ３Ｌ、ＡＭＹ１Ａ、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、およびテネイシン−Ｃ（ＴＮＣ）を含んだ。以前の政府出資の下で実証されたように、ＵＰＴラテラルフローシステムは、１５分未満でＥＬＩＳＡと同等の感度を実現することができ、そのため、ＰＯＣ放射線生体線量計についてのＢＡＲＤＡのビジョンを実現するための理想的なプラットフォームとなる。

発明者らはまた、ＵＰＴラテラルフローアッセイと共にリーダーシステムをも開発した。従来のイムノアッセイと同等の感度は、Ｆｌｔ３ＬおよびＡＭＹ１Ａについて実証された。指の刺し傷からわずかな血液量を収集し、血球から血漿を分離し、バッファーと血漿を混合し、ラテラルフローデバイスにある一定量を適用することができる、新規なサンプル収集ツールを開発した。

発明者らは、５つまでの異なる標的に対する製造可能なラテラルフローアッセイおよび４つの標的に対するマルチプレックスアッセイ、カスタマイズされたラテラルフローカセットに統合されたサンプル収集システム、ならびにリーダーシステムを開発した。

ＮＨＰベースラインサンプル（ＳＲＩ研究Ａ２４６−１２）：発明者らは、２８匹のＮＨＰのコホートからベースラインサンプルを収集した（ＮＩＨ契約（ＮＩＨ−ＮＩＣＨＤ契約ＨＨＳＮ２７５２００９０００１４Ｃ）に基づいてＳＲＩで維持された１４匹のオスおよび１４匹のメスのアカゲザル））。ＮＩＨからの承認に際して、これらの動物をＢＡＲＤＡ生体線量測定（ｂｉｏｄｏｓｉｍｅｔｒｙ）プロジェクトに移し、ＳＲＩ研究Ａ２４６−１２に登録した。これらの動物は、１１〜１６歳の年齢の範囲にわたった（下記に記載した研究Ｍ９１８−１２において使用した約４歳のＮＨＰよりもかなり年をとっている）。この研究の目標は、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、ＣａｎａｄａのＣｉＴｏｘＬＡＢで計画された放射線研究に由来する照射および偽処置ＮＨＰサンプルにより、バイオマーカー検証研究に向けての、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ／ＭＳ−ＭＳ）およびＥＬＩＳＡ法の開発ならびに標的タンパク質基準範囲の確立のために、血漿サンプルを収集することであった。

サンプルは、４週間にわたってこれらの動物から収集した。オスの動物は、毎週２回サンプリングし、メスの動物は毎週１回サンプリングした。各週、平均１２５００μｌの一定分量を、それぞれのオスの動物から集め、８５００μｌの一定分量をそれぞれのメスの動物から集めた。合計４８および３２の一定分量を、それぞれのオスおよびメスの動物からそれぞれ得られた。研究の終了時に、動物をＮＩＨ契約先に返した。

ＮＨＰ照射研究（ＳＲＩ研究Ｍ９１８−１２）：試験的非ＧＬＰ照射研究（ＳＲＩ研究＃Ｍ９１８−１２、ＣｉＴｏｘＬＡＢ研究＃２０１２−０８８３）を行い、完了させた。研究の目的は、オスおよびメスの照射アカゲザルの血液および唾液におけるバイオマーカーパネルの開発のためのサンプルを提供することであった。

２匹の予備の動物／性別を含む５４匹のアカゲザル（２７Ｍ／２７Ｆ）を、２０１２年６月１５日にＰａｃｉｆｉｃ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（Ｋｕｎｍｉｎｇ Ｂｉｏｍｅｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）から受け取った。動物の年齢は、２．５〜５．１歳の範囲にわたった。体重は、オスについて３．４〜６ｋｇおよびメスについて３．０〜４．８ｋｇの範囲にわたった。適切な健康状態の評価は、動物受け取りの前、後、および研究の全過程の間、動物を無作為化して行った。研究スケジュールはずらした。研究Ｍ９１８−１２の計画を、表２に記載する。

リアルタイム線量測定は、電位計を有するＭａｒｋｕｓ電離箱を使用して、研究の前に行い、加えられた線量の精度は、決められた放射線量の１％の範囲内にあることが決定された。ナノドットもまた、線量検証用の動物の胴体（前および後ろ）ならびに頭（前頭部および後頭部）に置いた。ナノドットからの半定量的結果は、±１０％の精度の範囲内で加えられた線量を確認した。

動物は、照射後７日間、観察した。動物は、非照射動物（グループ１）をグループ６に再度割り当てた以外、全身照射法後に観察された有害な臨床的なサインの前に、７日目に人道的に安楽死させた（表３における研究計画を参照されたい）。グループ６の動物もまた、照射後７日間、観察し、その後、人道的に安楽死させた。

到着後、この研究の過程の全体にわたって、動物は、死亡率チェックのために毎日観察した。詳細な試験は、投与前、１、３、５、および７日目に実行した。臨床的なサインは、毎日２回観察した（感染症、出血、および粘膜炎ならびに下痢の評価に特に注意した）。体温および食欲を毎日モニターした。体重は、処置前、１、３、５、および７日目に記録した。血液採取（ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ）は、１０回の時点：−３、−２、−１、１、２、３、４、５、６、および７日目ですべての動物に対して実行した。

頬の細胞および全血サンプルを６回；照射前、照射後（４〜１２時間）、ならびに１、２、３、および７日目に動物から収集した。

血液の結果は、すべての照射グループからの動物が、投与依存的な重症度で、１〜７日目まで、リンパ球数を含む白血球の著しい減少を示したことを示す。好中球、白血球、リンパ球、および血小板数の低下ならびに体重の減少もまた、８および１０Ｇｙに曝露された動物において観察された。照射後に注目された臨床的なサインは、無食欲、活動レベルの減少；嘔吐および下痢を含み、最も高い照射線量でより頻繁に観察された。グループ６（１０Ｇｙ）の１匹のメスは、低体温症、振戦、および活動レベルの重度の減少を示し、終了前６日目に安楽死させた。

ＮＨＰ照射研究（ＳＲＩ研究Ｍ９２０−１２）：発明者らは、２、５．５、および６．５Ｇｙの放射線に曝露されたまたは偽処置された３２匹のＮＨＰ由来の血漿サンプルをＣｉｔｏｘＬＡＢから受け取った。これらのサンプルは、ＢＡＲＤＡの契約の下でＣｈｒｏｍｏｌｏｇｉｃが行った研究に由来した。最終的な血液サンプルは、照射の７日後に収集された。ＳＲＩ研究番号Ｍ９２０−１２をこの研究に割り当てた。血液サンプルの収集にＰ１００チューブが使用され、結果として生じた血漿量は、０．２ｍＬの複数の一定分量に分配され、凍結して輸送された。

ヒト患者研究：放射線治療患者：Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（ＳＵＭＣ）のＤｒ．Ｓｕｓａｎ Ｋｎｏｘと共同で、ヒト放射線治療患者由来のサンプルは、全身（ＴＢＩ）または部分（ＴＬＩ）照射された３９の新しい患者サンプルの追加により存続させた。患者はすべて、化学療法を以前に受けていたが、照射の３０日以内に化学療法を受けた患者はいなかった。ＴＢＩ患者は、全身にわたる線量を受けた。ＴＬＩ患者は、彼らの体の中心部分にわたるが、頭部、首、および肝臓の大部分を除外した線量を受けた。患者の年齢、性別、医学的状態、放射線／医学的治療、線量分割、および血液採取などのようなデータは、発明者らに利用可能にした。

ＳＵＭＣで使用したＴＢＩに対する標準的な治療計画は、３回の１２０ｃＧｙ／日を含み、それぞれの線量は、３日間、約３時間ずつ分けた。ＳｔａｎｆｏｒｄでのＴＬＩ患者についての標準的な治療計画は、主なリンパ組織への約１０日間の１２０ｃＧｙ／日の局所照射線量を含むが、肺、肝臓、腎臓、およびできるだけ多くの腸などのような組織を遮蔽する。ＴＬＩ照射線量は非骨髄破壊性であるのに対して、ＴＢＩ照射線量は、骨髄破壊性であり、骨髄移植の成功率を増加させる。そのうえ、ＴＬＩ患者は、Ｔ細胞を抑制するために、放射線被曝の直後に、ある用量のウサギ抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）を受け、移植の準備を患者に施す。ほとんどすべての患者は、様々なアルキル化剤による化学療法を以前に受けていた。

発明者らは、ＴＬＩ患者について、第１の放射線治療の前、その後、２または３回の収集時点、典型的に、各１２０ｃＧｙ被曝の２４時間後に、血液サンプルを収集した。ＴＢＩ患者由来のサンプルは、処置前ならびに第１および第２の３６０ｃＧｙ線量の約２４時間後に収集した。

ヒト交絡因子研究：交絡条件を有するヒト患者由来の血液サンプルの収集は、重篤な感染症を有する１２の患者由来の血清サンプルを含んだ。軽度の感染症が、大量の死傷者の場合には、個人においてより可能性の高い交絡因子となってしまうという理由から、発明者らは、重篤な感染症を有する患者由来のサンプルの収集を中止し、軽度の感染症を有する患者から収集されたサンプルの評価に専念した。軽度の感染症を有する２８人の患者由来のサンプルを収集し、分析した。６７人のさらなる外傷患者由来のサンプルもまた、収集し、分析した。

イムノアッセイ法：実行したイムノアッセイは、従来のシングルプレックスＥＬＩＳＡまたはＬｕｍｉｎｅｘマルチプレックスプラットフォームを利用した。両方のアッセイタイプは、サンドイッチ方式で実行する（測定されることになる分析物は、２つの一次抗体−捕捉抗体および検出抗体の間で結合する）。ＥＬＩＳＡでは、興味のある抗原は、プレートに付加された捕捉抗体を介して固定される。次いで、抗原は、直接（標識一次抗体によって）または間接的に（標識二次抗体によって）検出される。この方法は、高感度で、頑健（ｒｏｂｕｓｔ）である。

Ｌｕｍｉｎｅｘにおいて、捕捉抗体を、蛍光マイクロスフェアに結合し、分析物の結合は、ビオチン化検出抗体およびフィコエリトリン（ＰＥ）カップルストレプトアビジンを使用し、フローサイトメーターによって測定する。複数の分析物に対する捕捉抗体を異なる蛍光特性を有するマイクロスフェアにコンジュゲートすると、単一のサンプル中で複数の分析物を同時に測定することが可能である。この有意な利点は、サンプル容量が限られている場合に役立つ。さらに、蛍光ベースの検出系は、典型的に、比色定量ＥＬＩＳＡよりも優れた感度を提供する。

それぞれのアッセイについて、発明者らは、標的タンパク質濃度（Ｙ軸）に対してそれぞれの標準濃度のシグナル（Ｘ軸）をプロットすることによって、標準曲線を得る。それらの結果を使用して、発明者らは、４パラメーター（ＥＬＩＳＡ）または５パラメーター（Ｌｕｍｉｎｅｘ）回帰分析を介して最良適合曲線を生成し、正確で（実際の値と比較した計算値）、再現可能な結果を提供する標準曲線の一部を使用して、興味のあるサンプルの値を計算する。標準曲線の範囲から脱落する吸光度を有するサンプルは、さらに希釈した後に再び試験し、次いで、結果の分析後に標準曲線から得られた濃度に希釈係数をかけた。

ＵＰＴ試薬＆ＬＦＡ法：ラテラルフローアッセイ（ＬＦＡ）検出限界および変動係数（ＣＶ）を改善するために、発明者らは、２つの変えることができるものに焦点を当てることによって新しい蛍光体試薬を開発した：（１）様々なサイズ粒子の生成および（２）様々なリンカー化学作用の試験。発明者らは、ＵＰＴ粒子を生成するために以前使用されたプロセスに改良を加えた、また、現在、ＵＰＴ粒子のサイズを効果的にコントロールすることができる。これは、ＵＰＴ粒子前駆物質を生成するために利用されるプロセスパラメーター、特に溶媒および全レアアースイオン（ＲＥＩ）濃度の操作によって達成される。発明者らは、３つの特有の色を有する９つのより小さな蛍光体を同定した（表４）。

いくつかの蛍光体−抗体コンジュゲーション戦略について調査した。プロセスは、架橋剤による粒子表面機能化、抗体コンジュゲーション、非結合抗体を除去するための洗浄、および蛍光体粒子濃度の最終的な調整を含む。小さな蛍光体に抗体をコンジュゲートするための最適な方法を決定するために、発明者らは、緑色の蛍光体を用い、４つの異なる架橋剤を介して抗体にそれらを付加した。そのうえ、発明者らは、それぞれのコンジュゲーション方法について３つの異なる蛍光体結合部位対抗体の比について試験した。発明者らの分析から、発明者らは、蛍光体に抗体をコンジュゲートするための最良の方法が、２０×の抗体対結合部位の比で、カルボン酸末端シランを通してのものであることを決定した。

ＬＦＡ感度は、選択される抗体ペア、用いられる材料、および利用されるバッファー構成成分に依存する。興味のある発明者らの標的について、発明者らは、民間の供給源から標的当たり１０種までの異なる抗体を購入し、ＥＬＩＳＡまたはドットブロットを介してそれらを試験した。発明者らの試験において、発明者らは、興味のある範囲内で、強く特異的なシグナルを産生し、かつ標的タンパク質の高および低濃度を発明者らが区別するのを可能にした、それぞれの標的に対する抗体ペアを選択した。

上記に記載される新しい蛍光体と共に最適に機能するＬＦＡを作製するために、発明者らは、最良のアッセイ材料を選択するための研究を実行した。発明者らは、３つの新しいコンジュゲート放出パッドを検査し、最良の放出を提供し、最も高い材料稠性を有するとして、Ｇ０２８を選択した。

発明者らは、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅおよびＷｈａｔｍａｎからの８つの新しいニトロセルロース膜を試験し、蛍光体凝集を低下させるためにいくらか最適化した後に、発明者らの低感度アッセイにＨＦ１３５をおよび発明者らの高感度アッセイにＨＦ２４０を選択した。最終的に、発明者らは、７つの異なる吸収パッドを検査し、Ｃ０４８が１５分間で最適に機能して、十分な標的ピークおよびより低いバックグラウンドノイズをもたらすことが分かった。

アップコンバーティング蛍光体を使用して開発されているアッセイはほとんどないので、発明者らは、コンジュゲート放出バッファーおよびランニングバッファーを含むアッセイの非材料的な条件を最適化した。主な問題のうちの１つがコンジュゲート放出パッドからの蛍光体の不十分な放出であるので、発明者らはそこに発明者らの努力を集中させた。発明者らの研究は、様々なバッファーの利用、コンジュゲート放出パッドの前処置、および蛍光体の直接的な超音波処理を含んだ。実行した多数の研究のうちで、発明者らは、蛍光体のパルスプローブ（ｐｕｌｓｅｄ−ｐｒｏｂｅ）超音波処理は、アッセイの最大の増強をもたらし、より高い標的ピークに関連する、蛍光体の優れた放出およびクリアランスならびにより好適な稠性を提供することを発見した。

ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（＆ＭＲＭ）法：照射研究で収集されたサンプルは、ＬＣおよびタンデム質量分析計（Ｏｒｂｉｔｒａｐ（商標）ＭＳ／ＭＳ）を使用して分析した。サンプルの発明者らのＬＣ−ＭＳ／ＭＳの分析は、ゲルフリー（ｇｅｌ−ｆｒｅｅ）定量的ショットガン（ボトムアップ）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳプロテオミクスアプローチを利用する。このアプローチでは、特異的なプロテアーゼ酵素が、血漿サンプル由来のものなどのようなタンパク質の複雑な混合物を消化し、ペプチドの混合物を産生する。次いで、ペプチド混合物は、実クロマトグラフィー時間（ｒｅａｌ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｔｉｍｅ）で、フルスキャンＭＳモードでペプチドの高解像度で正確な質量測定値を得、フラグメンテーションＭＳ／ＭＳモードでペプチドの配列情報を得る能力を有するハイブリッドＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にオンラインでつながれた逆相キャピラリー高速ＬＣ（ＨＰＬＣ）によって分離される。このように、何千ものペプチドを、自動化ソフトウェアパッケージを使用して、単一の分析で、同時にプロファイルし、同定することができる。ペプチド配列およびタンパク分析は、標準的な種特異的タンパク質配列データベースに対して、ＭＳ／ＭＳにおいて検出されたトリプシンペプチドについて観察されたフラグメントイオンをマッチングするためのデータベース検索によって決定されるが（ＢｙＯｎｉｃ／ＣｏｍＢｙｎｅ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ）、相対的な定量的情報は、サンプルにわたってＭＳモードにおいて対応するペプチドイオン電流を比較することによって得られる（ＳＩＥＶＥ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。全体として、これは、効率的で偏りがないアプローチに相当し、血漿中の放射線応答性タンパク質バイオマーカー候補を同定し、定量化するために本明細書で適用される。有望な新しい標的は、イムノアッセイを使用して、さらに試験した。イムノアッセイのための抗体が入手可能でなかった場合、安定同位体希釈による多重反応モニタリング（ＭＲＭ）として知られている、同位体標識ペプチド標準物質を用いる標的定量的質量分析法を検証のために適用した。

結果
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ＆ＭＲＭ 結果：ＮＨＰサンプル ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析：
サンプル調製法の開発：発明者らは、存在量がより低いタンパク質の濃縮を可能にする、血漿サンプルから非常に豊富なタンパク質を除去するための標準的な免疫除去技術が、ＮＨＰのために特別にデザインされた市販の製品がないにもかかわらず、ＮＨＰ血漿において実行することに成功することができたことが分かった。ヒト血漿における豊富なタンパク質の除去のためにデザインされたいくつかの市販で入手可能な材料を試験した後、ヒト血漿において１４種の最も豊富なタンパク質を標的にするようにデザインされたＳｅｐｐｒｏ鳥類ＩｇＹ１４除去カラム（Ｓｉｇｍａ）が、装填量を注意深くコントロールした場合、ＮＨＰ血漿サンプルについて効率的に作動することが分かった。このカラムからの免疫除去された材料は、Ｓｕｐｅｒｍｉｘとして知られている免疫除去の第２のステージにつなぐことができたまたはその代わりに、さらなるタンパク質クロマトグラフィー分離もしくはトリプシン後ペプチド分画にかけ、発明者らがＮＨＰ血漿においておよそ５００種のタンパク質をプロファイルするのを可能にし、現在までに、ＮＨＰ血漿プロテオームの最も綿密な研究を実現することができた。決まって濃縮される、いくつかの存在量がより低いタンパク質の例を表５に示す。

放射線応答性タンパク質候補の同定：前のマウス研究およびＮＨＰのために開発した方法において発明者らが用いた戦略に次いで、発明者らは、最終的な屠殺時に収集されたサンプルからの材料のプールを使用して、放射線応答性タンパク質同定のための発明者らの実験を始めた。このために、多くの一定分量が詳細な分析に利用可能である。発明者らが０Ｇｙコントロール、１Ｇｙ、５．５Ｇｙ、および６．５Ｇｙサンプル（オスのみからなったＭ９２０研究）の結果と直接比較することができるように、一定分量を、１Ｇｙ、４Ｇｙ、８Ｇｙ、および１０Ｇｙ線量グループからの４匹のオスの動物（Ｍ９１８研究）のそれぞれからプールした。いくつかの放射線応答性タンパク質は、非除去血漿の分析用の３マイクロリットルほどから始めて、より掘り下げた除去／分画方法用の２２５マイクロリットルの血漿まで、様々に掘り下げた分析で発見された。アップレギュレートされたタンパク質の中で、ＡＭＹ１Ａ、ＣＲＰ、ハプトグロビン、およびアルファ−１−抗キモトリプシンは、非除去血漿中に直ちに見出された。たとえば、アルファ−１−抗キモトリプシンに割り当てられる複数のペプチドからのシグナルは、７日目に、最終的に４倍の増加まで、線量の関数として、単調に増加した。さらなる、存在量がより低いタンパク質は、除去血漿において変化していることが発見されたが（たとえばアルファ−アミラーゼおよびロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質）、より掘り下げた除去が、他の潜在的に有望な新しいタンパク質候補を明らかにし、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ、リポカリン２としても知られている）、大唾液腺由来タンパク質、仮説上のタンパク質ＬＯＣ６９５０１８（塩基性唾液プロリンリッチタンパク質２としても知られている）、およびインスリン様成長因子結合タンパク質４（ＩＧＦＢＰ４）が有意に増加するように思われた。より掘り下げた血漿分画は、さらなる候補：再生島由来タンパク質３−アルファ様（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｉｓｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ３−ａｌｐｈａ−ｌｉｋｅ）（ＲＥＧ３Ａ）およびＧＤＨ／６ＰＧＬ内質二機能性タンパク質様（ＧＤＨ／６ＰＧＬ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｌｉｋｅ）をもたらした。

個々の血漿サンプルの分析：様々な線量グループからの初期時点のサンプルのサブセットを、さらなる初期応答性放射線感受性タンパク質をスクリーニングするために処理し、分析した。発明者らは、１日目に、２つの唾液タンパク質アルファ−アミラーゼおよび塩基性唾液プロリンリッチタンパク質２が、強くアップレギュレートされた（＞２０倍）ことを観察した。

サル血漿における唾液タンパク質の同定：表６は、ヒトおよびサルについての全唾液において同定された主な唾液タンパク質を列挙する。ＮＨＰ血漿サンプルにおける２つの唾液タンパク質の同定を確認した。

アイソフォーム特異的な変化の同定：血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）および唾液アミラーゼについて、発明者らは、アイソフォーム特異的な放射線応答を同定し、ＥＬＩＳＡアッセイ開発のための詳細な情報をもたらした。

要約すると、発明者らは、開発した方法によるＭ９２０およびＭ９１８ ＮＨＰサンプルの発明者らのＬＣ−ＭＳ／ＭＳの分析に基づいて、血漿中で２６種のアップレギュレートされた候補および５種のダウンレギュレートされた候補（倍数変化によるカットオフ＞２倍で）を同定した。結果を表７に要約する。

ＭＲＭ法を使用する確認／検証：発明者らは、同位体標識ペプチド標準物質による標的定量的分析法、ＭＲＭを使用して、多くの個々のサンプルをスクリーニングすることによって、バイオマーカー確定のためにＥＬＩＳＡ分析を補完するため、発明者らのＬＣ−ＭＳ／ＭＳの試みを広げた。発明者らは、マウスにおける唾液腺損傷に特異的な耳下腺分泌タンパク質（ＰＳＰ）のマーカー検証／確認のためにこの方法の利用に以前に成功した。サル研究のためのＭＲＭアッセイは、アミラーゼ、アルファ−１抗キモトリプシン、およびＮＧＡＬなどを含む、タンパク質候補のために開発した（表８）。概念実証として、発明者らは、アルファ−１抗キモトリプシンからの発明者らのＭＲＭ結果を比較した。発明者らのデータは、２つのアッセイ測定値の間で良好な相関性を示す。ＥＬＩＳＡの結果と同様に、線量の増加に伴うアップレギュレーションの明らかな傾向が観察された。発明者らは、３００のＭ９１８サンプルおよび３０のＭ９２０サンプルならびにＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎから購入したＮＨＰ血漿の大きなプールから作られた品質コントロールをすべて含むように、１８バッチのサンプルを処理し、分析した。アッセイ再現性の例は、除去ステップについて３．８％のバッチ間ＣＶおよび様々なＭＲＭアッセイについて８〜２６％の全体としてのＣＶによって実証される。ＭＲＭアッセイ確認研究の一部として、６つのサンプルを、新しい一定分量のサンプルの分取からサンプル処理および質量分析法による分析まで全プロセスにかけ、全体的なアッセイ再現性を評価した。

ヒトサンプルＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析：発明者らは、放射線治療患者（ＴＬＩおよびＴＢＩの両方）由来の血漿サンプルのさらなるセットについてＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を完了させた。ＩｇＹ上位１４除去方法を使用して、発明者らは、いくつかの発明者らが以前に報告した重要な応答性タンパク質についてアップレギュレーションを確認した。これらのタンパク質は、ＴＢＩ患者サンプルについてＡＭＹ１および唾液酸性プロリンリッチリンタンパク質１／２前駆物質（ＰＲＰＣ）を含んだ。

放射線による塩基性唾液プロリンリッチ２（ＰＲＢ２）タンパク質レベルの劇的な増加が得られた。これらの結果により、唾液腺への放射線障害についてのマーカーとしての、以前に報告されたアルファ−アミラーゼ（ＡＭＹ１）以外の、血漿における２つのさらなる唾液タンパク質の同定が確認された。発明者らはまた、患者のサブセットが、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）について放射線によるアップレギュレーションを示したことを発見した。ヒトＴＢＩサンプルの分析からの結果を表９に要約する。

イムノアッセイ結果：ＮＨＰおよびヒトサンプルセットの両方を、本明細書において記載されるように、タンパク質の様々なパネルについてＥＬＩＳＡまたはＬｕｍｉｎｅｘイムノアッセイに使用して分析した。

ＮＨＰサンプル：ＮＨＰサンプルセットは、３３種までの異なるタンパク質についてイムノアッセイによって二通り分析した。最初のスクリーニング研究は、最も有望な放射線応答性タンパク質を同定するために、Ｍ９２０およびＡ２４６サンプルセットに対して実行した。この研究からのより有望なタンパク質は、Ｍ９１８サンプルセットの分析のために使用したパネル中に保持した。それぞれのＮＨＰデータセットにおいて分析したタンパク質の全部のリストを、下記の表１０に列挙する。

イムノアッセイはすべて、標準曲線を生成するために使用される通常のアッセイ較正標準物質とは別個に、標準物質として果たしたＮＨＰ血漿のプール（正常で健康な動物由来の）からなるコントロールサンプルを含んだ。これらの血漿コントロールサンプルについてのＣＶを、興味のある重要なタンパク質のうちの２つ、Ｆｌｔ３ＬおよびＡＣＴについて表１１および１２に列挙する。コントロールサンプルについてのプレート間のＣＶは、Ｆｌｔ３Ｌについて約１３％（１５のプレートで平均して）およびＡＣＴについて約１６％である。それぞれのプレート上での反復実験について計算した差異％は、典型的に、１０％未満であったが、Ｆｌｔ３Ｌについての少数の実例において高かった（＞２０％）。

放射線応答性タンパク質（イムノアッセイによって測定）のうちのいくつかについてのボックスプロットを、ＡＭＹ１Ａ、ＡＣＴ、ＩＬ１５、およびＦｌｔ３Ｌについて調製した。２４種の異なるタンパク質について５つの異なる放射線グループおよびコントロールグループの間で実行したｔ−検定の結果を示すヒートマップを作成した。ｔ−検定は、所定の日のそれぞれの放射線グループのタンパク質濃度のｌｏｇ１０を、同じ日に測定したコントロールグループタンパク質値のｌｏｇ１０と比較することによって実行した。重要な放射線応答性タンパク質は、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＭＣＰ１、ＡＣＴ、Ｆｌｔ３Ｌ、血清アミロイドＡ、ＡＰＯＡ４、ヘモペキシン（ＨＰＸ）、ＮＧＡＬ、および唾液アミラーゼを含む。（ＡＰＯＡ４、ＨＰＸ、および唾液アミラーゼについて好適な市販のイムノアッセイキットがなかったため、これらのタンパク質は、イムノアッセイではなくＭＲＭを使用して測定した）。

ヒトサンプル：ヒトデータセットは、主として、Ｆｌｔ３Ｌ、ＣＲＰ、クラスタリン、エラスターゼ、唾液アミラーゼ、ＩＬ１５、ハプトグロビン、アルファフィブリノーゲン、ＴＮＣ、ＭＣＰ１、ＳＡＰ、ＧＣＳＦ、およびＩＬ１８を含んだ１３種の異なるタンパク質について分析した。ヒートマップは、ＴＢＩサンプルセットに対して実行した対応および独立（コントロールに対して）ｔ−検定を示し、放射線応答性である可能性の高いタンパク質を示す（ｐ−値＜０．０１、１、２、または３日目）。ＴＢＩ患者については、これらは、Ｆｌｔ３Ｌ、唾液アミラーゼ、ＩＬ１５、ハプトグロビン、ＭＣＰ１、およびＴＮＣを含む。

最も重要な放射線応答性タンパク質のうちの２つ、Ｆｔｌ３Ｌおよび唾液アミラーゼのボックスプロットは、左から右に、コントロールサンプル、軽度の感染症、重度の感染症、外傷、およびＴＢＩ患者についての血漿タンパク質濃度のｌｏｇ１０を示す。これらのデータは、両方がＴＢＩ患者について優れたマーカーとなることを明らかにする−Ｆｌｔ３Ｌは、２および３日目に明らかに上昇し、唾液アミラーゼは、照射後のすべての日で明らかに上昇する。Ｆｌｔ３Ｌは、おそらく、軽度の感染症患者ではなく外傷患者において穏やかに上昇する。軽度の感染症および外傷患者の両方における唾液アミラーゼレベルは、コントロールと有意には異ならない。これらの結果は、下記に議論される様々な分類指標により得られた結果と一致して、Ｆｌｔ３Ｌおよび唾液アミラーゼがヒトにおける全放射線被曝の優れたマーカーとなるという発明者らの発見を補強する。

ＬＦＡ結果：発明者らは、非ヒト霊長動物および／またはヒトにおいて放射線被曝後に増加する４つの異なるバイオマーカーについてシングルプレックスおよびデュプレックスアッセイを開発した。これらは、ＡＭＹ１Ａ、ＴＮＣ、ＣＲＰ、およびＦｌｔ３Ｌを含む。ＡＭＹ１ＡについてシングルプレックスＵＰＴ−ＬＦＡを最初に開発した。このアッセイについて、健康なレベル（１０％血漿中１０ｎｇ／ｍＬ）から照射レベル（１０％血漿中１００ｎｇ／ｍＬ）まで、シグナルが５．５倍増加する。

ＣＲＰの血漿濃度は、通常、０．５〜１０ｕｇ／ｍＬであり、放射線被曝により１００ｓｕｇ／ｍＬに上がる（ＴＬＩ患者において）。発明者らのＣＲＰ ＬＦＡを開発するために、発明者らは、放射線被曝によって引き起こされる高レベルのＣＲＰで必然的に生じるであろうフック効果（ｈｏｏｋ ｅｆｆｅｃｔ）を回避するために阻害型アッセイを構築した。

健康なヒトは、１１３ｐｇ／ｍＬの平均Ｆｌｔ３Ｌ血漿濃度を有し、これは、放射線被曝により１０００ｐｇ／ｍＬまで増加し得る。したがって、Ｆｌｔ３Ｌ ＬＦＡ開発のために、発明者らは高感度アッセイを作り出すことを目指した。これをするために、発明者らは、サンドイッチ型アッセイを選択し、８００ｎｍで明るいシグナルを有するＹｂ／Ｔｍ Ｙ２Ｏ２Ｓ蛍光体を用いた。

そのうえ、発明者らは、ＡＭＹ１Ａ／ＣＲＰおよびＦｌｔ３Ｌ／ＴＮＣについてデュプレックスアッセイを開発した。発明者らは、５％血漿中健康なおよび照射患者に適用可能な濃度の範囲にわたる６つの異なる濃度のＡＭＹ１Ａおよび６つの異なる濃度のＣＲＰを有する格子状の３６のサンプルに対して発明者らのＡＭＹ１Ａ／ＣＲＰデュプレックスアッセイを試験した。発明者らは、デュプレックスアッセイが、低および高レベルのＡＭＹ１ＡおよびＣＲＰの間の好適な区別をもたらし、ＡＭＹ１ＡおよびＣＲＰの測定値が、比較的、互いに無関係であることを発見した。さらに、発明者らは、デュプレックスＡＭＹ１ＡおよびＣＲＰ測定値のＣＶを計算した。ＡＭＹ１Ａ測定値のＣＶは、８％未満であったが、ＣＲＰ測定値はより変動し、１３％未満のＣＶを有した。最初の研究で、発明者らは、ＣＲＰ、ＡＭＹ１Ａ、ＴＮＣ、およびＦｌｔ３Ｌの測定について４つの機能するＬＦＡならびにＣＲＰ／ＡＭＹ１ＡおよびＦｌｔ３Ｌ／ＴＮＣについて２つのデュプレックスアッセイを開発し、最適化した。

データ分析：ＮＨＰサンプル．発明者らの照射研究（Ｍ９１８−１２）は、合計３００の血漿サンプルについての５つの時点でのそれぞれのグループに１０匹の動物を有する６放射線量グループを含有した。３００のサンプルのうち、１８０は４Ｇｙ未満であり、１２０のサンプルは４Ｇｙまたは４Ｇｙ超であった。そのうえ、発明者らは、０、２、５．５、または６．５Ｇｙの照射に曝露された動物の３０の政府提供サンプル（Ｍ９２０−１２）を得た。サンプルは、照射後７日目に収集された。発明者らは、３３０のサンプルのそれぞれにおいて、ＥＬＩＳＡ、Ｌｕｍｉｎｅｘ、またはＭＲＭを使用して、２４種の異なるタンパク質の濃度レベルを決定した。

それぞれのグループおよび時点（合計１０匹の動物）について、発明者らは、グループ平均、標準偏差、最大値、および最小値を決定した。表１３は、単一時点（７日目）での１つのタンパク質（Ｆｌｔ３Ｌ）の代表的な日を示す。そのうえ、発明者らは、すべてのグループおよび時点にわたって単一のタンパク質の放射線応答を視覚化するためにボックスプロットを作り出した。最終的に、発明者らは、すべての時点について、それぞれの照射グループおよび０Ｇｙコントロールグループの間の対数底１０のタンパク質濃度に基づいてｔ−検定を実行した。発明者らは、すべてのタンパク質が、分位数−分位数プロットを使用して、対数正規分布によって十分に説明されることが分かった。表１４は、同じ時点の０Ｇｙグループと比較した、それぞれのグループおよび時点についてのｐ−値を示す。

単一のタンパク質応答を見ることに加えて、発明者らは、被曝分類指標を得るために複数のタンパク質を互いに組み合わせ、高い（≧４Ｇｙ）または低い（＜４Ｇｙ）被曝クラスの予測因子として、タンパク質の様々な組み合わせを試験するために、５分割交差確認を７回繰り返した。発明者らは、３つの異なる統計学習アルゴリズムを主として使用した：（１）条件推測木（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｔｒｅｅ）、（２）サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、または（３）ロジスティック回帰分析。定性的に、分類指標は、全般的な精度、正解率に対する特定のタンパク質の重要性の点から同等に機能し、類似するサンプルを決まって誤って分類した。表１５は、ロジスティック回帰分析、ＳＶＭ、または条件推測木統計学習アルゴリズムを使用する、タンパク質の様々な組み合わせについての精度、偽陰性率、および偽陽性率を示す。

分類指標が同じように十分に機能したので、発明者らは、主として、アウトプットが、高線量または低線量グループに属するサンプルの確率であるという理由から、さらなる分析にロジスティック回帰分析を選択した。表１５は、高スコアタンパク質パネルの代表的なセットについてのロジスティック回帰分析による分類指標結果を示す。Ｆｌｔ３ＬおよびＡＣＴが最も良く機能するパネルに概して含まれることに気づくことは重要であるが、多くの他のタンパク質（ＣＲＰ、ＩＬ１５、ＭＣＰ１、ＮＧＡＬ、ＡＭＹ１Ａ、およびＨＰ）を、同等の結果がもたらされるよう区別なく使用することができる。このさらなるタンパク質は、発明者らの補足的な交絡研究のように、リスク軽減として果たすであろう。

上位のパネルのうちの１つは、ＡＣＴ、ＡＭＹ１Ａ、ＩＬ１５、およびＦｌｔ３Ｌであった。表１６は、３０％の被曝カットオフの確率と共に５分割交差確認を使用する、３００のサンプルについてのパネルの精度、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率、偽陽性率、および偽陰性率を示す。発明者らは、線量の関数として被曝の確率をプロットし、曝露分類についてのカットオフ確率を１００％から０％に調整して、データセットについての受信者動作特性曲線を示した。このパネルについての曲線下面積（ＡＵＣ）は、０．９８５である。平均して、このパネルは、３００のサンプルのうちの２９０を正確に分類する。表１７は、４つの共通の偽陰性サンプルを示す。表１８は、６つの共通の偽陽性サンプルを示す。発明者らのやり方を確認するために、発明者らは、初期の照射研究（Ｍ９１８）に基づいて分類モデルを開発し、異なる研究由来の政府によって提供された３０のサンプル（Ｍ９２０）のクラスを予測した。これらの動物は、第２の研究において、異なる高線量（５．５および６．５Ｇｙ）ならびに異なる全プロトコールに曝露された。Ｍ９１８研究からのモデルは、３０サンプルのうち２７を正確に分類し、０の偽陰性および３つの偽陽性を伴った（３０％の被曝の確率）。発明者らは、偽陰性に対して偽陽性にバイアスをかけるために３０％の被曝の確率を選んだ。そのうえ、発明者らは、発明者らのＡ２４６研究からのサンプルに対して発明者らのモデルのサブセット（ＡＣＴ、ＦＬＴ３Ｌ、およびＩＬ１５）を検証することができた。Ａ２４６研究では、４週間の期間にわたって２８匹のより高齢のＮＨＰから採血した。これらの動物は、いかなるガンマ線照射をも受けず、そのため、コントロール動物と等価である。発明者らは、これらの動物についてＡＭＹ１Ａのデータを持っていなかった。練習用に、バイオマーカーパネルのサブセットおよびＭ９１８サンプルを使用すると、発明者らは、７４のサンプルが曝露されていないと１００％予測することができた。これらの７４のサンプルについての被曝の最も高い確率は、０．３％であり、放射線バイオマーカーとしてのＡＣＴ、ＦＬＴ３Ｌ、およびＩＬ１５の発明者らの使用を再び確認することができた。

ヒトサンプル．以前に議論されたように、ヒトサンプルイムノアッセイデータに対して実行したｔ−検定は、ＴＢＩ患者サンプルにおける重要な放射線応答性タンパク質を示し、主としてＦｌｔ３Ｌ、ＡＭＹ１Ａ、ＩＬ１５、ハプトグロビン、ＭＣＰ１、およびＴＮＣを含んだ。データにより、いかなる分類指標も使用することなく、ただ２つのタンパク質、Ｆｌｔ３ＬおよびＡＭＹ１Ａを使用して、ＴＢＩおよびコントロールサンプルの間で得ることができるという区別が示された。ただこれらの２つのタンパク質により、ＴＢＩ（≧２．４Ｇｙ）およびＴＢＩ（０Ｇｙ）＋コントロールグループの間の優れた判別がもたらされる。

ロジスティック回帰分析においてＡＭＹ１Ａ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ１５を使用して、５分割交差確認の１０回の繰り返しを使用する分類指標により、９５．７％の分類精度がもたらされ、偽陰性率および偽陽性率は、それぞれ７％および３．２％である（５０％のカットオフ閾値を使用）。同様の精度は、ＭＣＰ１をＩＬ１５またはＦｌｔ３Ｌと交換することによって得ることができる。発明者らは、ＡＭＹ１Ａ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ１５タンパク質パネルを使用して、ロジスティック回帰分析によって計算したサンプルの５つのグループのそれぞれについての被曝確率をプロットした（コントロール、軽度の感染症、外傷、ＴＢＩ非曝露、およびＴＢＩ照射≧２．４Ｇｙ）。カットオフ閾値を連続的に変え、それぞれのケースについてＴＰ、ＦＰ、ＴＮ、およびＦＮ（したがって感度および特異度）を計算することによって、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を得ることができる。ＮＨＰデータでのケースのように、これは非常に優れたＲＯＣ曲線であり、曲線下の総面積は、０．９８である。これらの結果の確かな特徴は、ヒトパネルが、ＮＨＰパネルにおける同じ４つのタンパク質のうちの３つを使用することである。

ヒトＴＢＩデータおよびＮＨＰ（およびＣＲＰの場合、マウス）モデルの間の相違は、ＣＲＰもＡＣＴも放射線応答性であるようには観察されないということである。文献の報告によると、ＣＲＰレベルの上昇が、チェルノブイリ事故の犠牲者において（以前はおそらく健康であった）観察されたこと［Ｍａｌ’ｔｓｅｖ ｅｔ ａｌ．，２００６］およびＴＢＩ患者におけるＣＲＰレベルが、放射線治療の間に上昇するようには思われないこともまた［ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０］示される。発明者らは、動物およびヒトＴＢＩモデルの間で４つの重要な差異があることを知っている：（１）照射プロトコール（高い単一の急性線量に対して、ＴＢＩ患者は、より低い、分割された線量を受けた）、（２）健康状態（健康な動物に対して、ＴＢＩ患者は、重篤である）、（３）前の処置による被曝（未処置に対して、ＴＢＩ患者は、癌細胞を破壊するための化学療法を受けた）、および（４）サンプル収集時間（動物モデルが急性被曝の１、２、３、および７日目にサンプルを収集するのに対して、ＴＢＩ患者サンプルは、常に、分割放射線療法の１日後に収集される）。モデルの間の著しい差異を考慮すると、差異について多くの説明が可能であり、発明者らは、ＮＨＰモデルが発明者らの診断デバイスについてより代表的なものとなると考える。

リーダーシステム：発明者らは、ＵＰＴラテラルフローアッセイを読み取るための３つのリーダーデバイスを構築し、試験した。アルファシステムは、ファイバブラッググレーティングによってロックされた９８０ｎｍのレーザーからなる。９８０ｎｍビームは、球面レンズを使用して、３００μｍのスポットに焦点を合わせる。２つの微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）ミラーは、ＬＦＡホルダーにおいて分析されることとなるウィック（ｗｉｃｋ）および全３０ｍｍの選択されたウィックを横切るラスターを選択するために使用される。ウィックは、ＴｈｏｒＬａｂｓからのｆ／２．８ ５ｍｍ有効焦点距離レンズを使用して画像化される。センサーは、９８０ｎｍの励起レーザー光線をはね返すための帯域フィルターを有する電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラである。発明者らは、ＭＥＭＳミラーの任意アクセス制御（ＤＡＣ）、レーザードライバー、および熱電冷却機（ＴＥＣ）ドライバーを実装するためにカスタムプリント回路板を開発した。システム全体は、タッチスクリーン液晶ディスプレー（ＬＣＤ）と共にＧｕｍｓｔｉｘプロセッサーによってコントロールされる。そのうえ、ｇｕｍｓｔｉｘプロセッサーは、ウィックケース上に印刷されたＱＲコードから標準曲線をロードする高速応答（ＱＲ）コードリーダーをコントロールする。

発明者らは、最後のオプションであるリーダーシステムおよびＬＦＡの再現性について試験した。発明者らは、ＡＭＹ１ＡおよびＦｌｔ３Ｌ用にＬＦＡを開発した。アッセイの再現性を試験するために、発明者らは、ＡＭＹ１Ａ捕捉抗体を有する１２のウィックおよびＦｌｔ３Ｌ捕捉抗体を有する１２のウィックに縞をつけた。発明者らは、４つの異なる濃度：５、２５、５０、および１００ｎｇ／ｍｌのＡＭＹ１Ａ分析物ならびに４つの異なる濃度：０．００２、０．１、０．５、および１ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ３Ｌ分析物を試験した。発明者らは、三通りそれぞれの濃度を試験した；そのうえ、発明者らは、それぞれの分析物について合計３６試験について異なる３日間、ストリッピングおよびＬＦＡプロセス全体を繰り返した。発明者らは、すべてのサンプルについて日内および日間変動係数（ＣＶ）を決定した。表１９は、結果として生じるＣＶを示す。全体として、ＣＶは、ＡＭＹ１Ａアッセイ（すべての実例において１３％未満）についてよりも、発明者らのＦｌｔ３Ｌ ＬＦＡ（すべての実例において１０％未満）についてより好適であった。典型的に、ＣＶは、低濃度よりも高濃度でより悪かった。発明者らはまた、２つのＡＭＹ１Ａウィック（５および５０ｎｇ／ｍｌ）を１５回測定した、各回でウィックを除去し、再挿入した。これらの２つのウィックについての器機ＣＶは、０．８４％および１．６％であった。結果を表２０に示す。

発明者らはまた、従来のフラットなフィルターデバイスよりも低い圧力でクリーナー（より少ない細胞溶解およびより優れた細胞除去）を提供する、中空糸フィルターアプローチを含むサンプル収集デバイスを開発した。図１は、中空糸フィルター機能の概略図を示す。図２は、最終的な統合デバイスの概念を示す。発明者らは、マウス血液のサンプルに対して最終的なプロトタイプフィルターデザインについて１０回試験した。サンプルは、２１０μＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）により希釈し（５％血漿濃度の発明者らの最終的なランニングバッファーに似せるために）、２１０ｎｇ／ｍｌ濃度でヒトＦｌｔ３Ｌを加えた。結果として生じる血漿における回収容量、細胞継代、細胞溶解、およびＦｌｔ３Ｌ濃度を表２１に示す。細胞継代、細胞溶解、およびＦｌｔ３Ｌの実例では、発明者らのデバイスは、血漿を従来の遠心分離法によって収集したコントロールよりも好適に機能した。

議論
発明者らの研究は、２Ｇｙ（ＮＨＰモデルにおいて４Ｇｙ）超および未満の等価なヒト放射線被曝を識別するための、ＮＨＰモデルにおける血漿タンパク質バイオマーカーパネルの実現可能性を実証した。発明者らの最も良い結果は、４つのタンパク質のパネル：ＡＣＴ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＡＭＹ１Ａ、およびＩＬ１５により得られた。これらの４つのタンパク質を使用して、発明者らのＭ９１８ベースライン研究セットにおける３００サンプルのそれぞれに対する被曝確率を割り当てるロジスティック回帰分析分類指標は、７回繰り返す５分割交差確認を使用して９６．５％の平均分類精度を実現する。練習セットとしてＭ９１８データを使用して、発明者らはまた、２つの別々の研究から得られたＮＨＰサンプルに基づいて分類指標を試験し、優れた分類精度を実現し、偽陰性はなく、偽陽性は３つのみであった。

このパネルのサブセット、すなわち３つのタンパク質Ｆｌｔ３Ｌ、ＡＭＹ１Ａ、およびＩＬ１５は、１０４のヒトＴＢＩサンプル（３６の照射前および≧２．４Ｇｙ累積線量の６８の被曝後）プラス８２のヒトコントロールサンプルを含有するデータセットを分類するために使用することができ、精度は、９５．７％であり、偽陰性率および偽陽性率は、それぞれ７％および３．２％である（５０％のカットオフ閾値を使用）。さらに、分類精度は、外傷および軽度の感染症患者からのサンプルがデータセットに含まれても、有意に低下しない。ＴＢＩ患者が重症である（多くが白血病または他の白血病を有する）、免疫無防備状態である（患者らは前の化学療法処置の一部として多くの免疫抑制薬を受けた）、かつ分割された（急性単一ではなく）放射線量を受けたという事実を考慮すると、ヒトおよびＮＨＰタンパク質パネルの間の部分的な一致は、注目すべき結果である。これらの結果を考慮して、発明者らは、４つのタンパク質、ＡＣＴ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＡＭＹ１Ａ、およびＩＬ１５のパネルを好ましいベースラインバイオマーカーパネルと見なす。

発明者らはまた、２つの他の放射線応答性タンパク質（ＴＮＣおよびＣＲＰ）に加えて、上記のパネルからの標的のうちの２つ（ＡＭＹ１ＡおよびＦｌｔ３Ｌ）を検出するのに十分に感受性であるラテラルフローアッセイをも実証した。発明者らはまた、ＡＭＹ１Ａ／ＣＲＰおよびＦｌｔ３Ｌ／ＴＮＣによる二重アッセイをも実証した。アルファプロトタイプリーダーシステムをデザインし、３つのユニットを構築し、試験した。発明者らは、ＬＦＡ試験ストリップの複数の読み取りで＜２％の再現性を実証した。そのうえ、新規なサンプル収集ツールを開発し、指刺し傷の血液サンプルを収集し、ある一定量の血液をバッファー溶液と混合し、二重ラテラルフローストリップカセットにサンプルを加える、２構成成分のデザインを生み出した。

参考文献
Ａｋａｓｈｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｉｎｉｔｉａｌ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｉｎ ｔｈｅ ＪＣＯ ｃｒｉｔｉｃａｌｉｔｙ ａｃｃｉｄｅｎｔ ｉｎ Ｔｏｋａｉ−ｍｕｒａ，Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｒｅｓ，４２ Ｓｕｐｐｌ，Ｓ１５７−１６６．
Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．，Ａ．Ｊａｃｏｂｓ，Ｊ．Ｋｏｈｎ，Ｊ．Ｒａｙｍｏｎｄ，ａｎｄ Ｒ．Ｌ．Ｐｏｗｌｅｓ（１９８２），Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ａｍｙｌａｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｓｏｅｎｚｙｍｅｓ ａｆｔｅｒ ｗｈｏｌｅ ｂｏｄｙ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ，Ｂｒ Ｍｅｄ Ｊ（Ｃｌｉｎ Ｒｅｓ Ｅｄ），２８５（６３３６），１７０−１７１．
Ｂｅｒｔｈｏ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ Ｌ．Ｒｏｙ（２００９），Ａ ｒａｐｉｄ ｍｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｖｉｃｔｉｍ ｔｒｉａｇｅ ｉｎ ｃａｓｅｓ ｏｆ ａｃｃｉｄｅｎｔａｌ ｐｒｏｔｒａｃｔｅｄ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ ｏｒ ｄｅｌａｙｅｄ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｂｒ Ｊ Ｒａｄｉｏｌ，８２（９８１），７６４−７７０．
Ｂｅｒｔｈｏ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｌｅｖｅｌ ｏｆ Ｆｌｔ３−ｌｉｇａｎｄ ｉｎ ｐｌａｓｍａ：ａ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｎｅｗ ｂｉｏ−ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｆｏｒ ｒａｄｉａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｌａｓｉａ，Ｉｎｔ Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｂｉｏｌ，７７（６），７０３−７１２．
Ｂｌａｋｅｌｙ，Ｗ．Ｆ．，Ｄ．Ｊ．Ｓａｎｄｇｒｅｎ，Ｖ．Ｎａｇｙ，Ｓ．Ｋｉｍ，ａｎｄ Ｎ．Ｏｓｓｅｔｒｏｖａ（２０１１），Ｍｕｒｉｎｅ ｐａｒｔｉａｌ−ｂｏｄｙ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｂｉｏｄｏｓｉｍｅｔｒｙ ｓｔｕｄｉｅｓ−ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｒｅｐｏｒｔ，Ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ，４６，８９８−９０２．
Ｂｌａｋｅｌｙ，Ｗ．Ｆ．，Ｎ．Ｉ．Ｏｓｓｅｔｒｏｖａ，Ｍ．Ｈ．Ｗｈｉｔｎａｌｌ，Ｄ．Ｊ．Ｓａｎｄｇｒｅｎ，Ｖ．Ｉ．Ｋｒｉｖｏｋｒｙｓｅｎｋｏ，Ａ．Ｓｈａｋｈｏｖ，ａｎｄ Ｅ．Ｆｅｉｎｓｔｅｉｎ（２０１０），Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｉｎｊｕｒｙ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｕｓｉｎｇ ａ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌ−ｂｉｏｄｏｓｉｍｅｔｒｙ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈｅａｌｔｈ Ｐｈｙｓ，９８（２），１５３−１５９．
Ｂｒａｔｔｓｔｒｏｍ，Ｃ．，Ｊ．Ｔｏｌｌｅｍａｒ，Ｏ．Ｒｉｎｇｄｅｎ，Ｋ．Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ，ａｎｄ Ｇ．Ｔｙｄｅｎ（１９９１），Ｉｓｏａｍｙｌａｓｅ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｒｅ ａｆｆｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｏｔａｌ ｂｏｄｙ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｏｔ ｂｙ ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｔｒａｎｓｐｌ Ｉｎｔ，４（２），９６−９８．
Ｃａｏ，Ｓ．，Ａ．Ｂ．Ｔｒｏｕｔｔ，ａｎｄ Ｙ．Ｍ．Ｒｕｓｔｕｍ（１９９８ａ），Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １５ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ａｌｏｎｅ ａｎｄ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ ｉｎ ｒａｔｓ ｂｅａｒｉｎｇ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５８（８），１６９５−１６９９．
Ｃａｏ，Ｓ．，Ｊ．Ｄ．Ｂｌａｃｋ，Ａ．Ｂ．Ｔｒｏｕｔｔ，ａｎｄ Ｙ．Ｍ．Ｒｕｓｔｕｍ（１９９８ｂ），Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １５ ｏｆｆｅｒｓ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ａ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５８（１５），３２７０−３２７４．
Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ，Ａ．，Ｔ．Ｂｊｏｒｋ，Ｏ．Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｕ．Ｄａｈｌｅｎ，Ｍ．Ｔ．Ｍａｔｉｋａｉｎｅｎ，Ａ．Ｔ．Ｃｏｃｋｅｔｔ，Ｐ．Ａ．Ａｂｒａｈａｍｓｓｏｎ，ａｎｄ Ｈ．Ｌｉｌｊａ（１９９３），Ｓｅｒｕｍ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｔｏ ａｌｐｈａ １−ａｎｔｉｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ ａｓ ａｎ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ，Ｊ Ｕｒｏｌ，１５０（１），１００−１０５．
Ｃｏｗｌａｎｄ，Ｊ．Ｂ．，ａｎｄ Ｎ．Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ（１９９７），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎｓ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４５（１），１７−２３．
Ｄｕｂｒａｙ，Ｂ．，Ｔ．Ｇｉｒｉｎｓｋｉ，Ｈ．Ｄ．Ｔｈａｍｅｓ，Ａ．Ｂｅｃｃｉｏｌｉｎｉ，Ｓ．Ｐｏｒｃｉａｎｉ，Ｃ．Ｈｅｎｎｅｑｕｉｎ，Ｇ．Ｓｏｃｉｅ，Ｍ．Ｂｏｎｎａｙ，ａｎｄ Ｊ．Ｍ．Ｃｏｓｓｅｔ（１９９２），Ｐｏｓｔ−ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ ｈｙｐｅｒａｍｙｌａｓｅｍｉａ ａｓ ａ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｏｓｉｍｅｔｅｒ，Ｒａｄｉｏｔｈｅｒ Ｏｎｃｏｌ，２４（１），２１−２６．
Ｇｕｉｐａｕｄ，Ｏ．，ａｎｄ Ｍ．Ｂｅｎｄｅｒｉｔｔｅｒ（２００９），Ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｅｘｐｏｓｕｒｅ：ｔｏｗａｒｄｓ ａ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ａｓ ａ ｎｅｗ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｔｏｏｌ，Ａｎｎ Ｉｓｔ Ｓｕｐｅｒ Ｓａｎｉｔａ，４５（３），２７８−２８６．
Ｈｏｎｇ，Ｊ．Ｈ．，Ｃ．Ｓ．Ｃｈｉａｎｇ，Ｉ．Ｌ．Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｊ．Ｒ．Ｓｕｎ，Ｈ．Ｒ．Ｗｉｔｈｅｒｓ，ａｎｄ Ｗ．Ｈ．ＭｃＢｒｉｄｅ（１９９５），Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｐｈａｓｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｂｒａｉｎ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ，Ｉｎｔ Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｏｎｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｈｙｓ，３３（３），６１９−６２６．
Ｊｕｎｇｌｅｅ，Ｄ．，Ａ．Ｋａｔｒａｋ，Ｊ．Ｍｏｈｉｕｄｄｉｎ，Ｈ．Ｂｌａｃｋｌｏｃｋ，Ｈ．Ｇ．Ｐｒｅｎｔｉｃｅ，ａｎｄ Ｐ．Ｄａｎｄｏｎａ（１９８６），Ｓａｌｉｖａｒｙ ａｍｙｌａｓｅ ａｎｄ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ａｆｔｅｒ ｔｏｔａｌ ｂｏｄｙ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ，３２（４），６０９−６１０．
Ｌａｉ，Ｙ．Ｇ．，Ｖ．Ｇｅｌｆａｎｏｖ，Ｖ．Ｇｅｌｆａｎｏｖａ，Ｌ．Ｋｕｌｉｋ，Ｃ．Ｌ．Ｃｈｕ，Ｓ．Ｗ．Ｊｅｎｇ，ａｎｄ Ｎ．Ｓ．Ｌｉａｏ（１９９９），ＩＬ−１５ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｂｕｔ ｎｏｔ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ８＋ ＴＣＲａｌｐｈａｂｅｔａ＋ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６３（１１），５８４３−５８５０．
Ｌｉｌｊａ，Ｈ．，Ａ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ，Ｕ．Ｄａｈｌｅｎ，Ｍ．Ｔ．Ｍａｔｉｋａｉｎｅｎ，Ｏ．Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｋ．Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ，ａｎｄ Ｔ．Ｌｏｖｇｒｅｎ（１９９１），Ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ｏｃｃｕｒｓ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ａｌｐｈａ １−ａｎｔｉｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ，３７（９），１６１８−１６２５．
Ｌｕｇｅｒｉｎｇ，Ｎ．，Ｔ．Ｋｕｃｈａｒｚｉｋ，Ｃ．Ｍａａｓｅｒ，Ｍ．Ｋｒａｆｔ，ａｎｄ Ｗ．Ｄｏｍｓｃｈｋｅ（１９９９），Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５ ｓｔｒｏｎｇｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８ ａｎｄ ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−１ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎｉｃ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，９８（４），５０４−５０９．
Ｍａｌ’ｔｓｅｖ，Ｖ．Ｎ．，Ａ．Ａ．Ｉｖａｎｏｖ，Ｖ．Ｆ．Ｍｉｋｈａｉｌｏｖ，ａｎｄ Ｖ．Ｋ．Ｍａｚｕｒｉｋ（２００６），［Ｔｈｅ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｒａｖｉｔｙ ａｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｅｘｅｓ］，Ｒａｄｉａｔｓｉｏｎｎａｉａ ｂｉｏｌｏｇｉｉａ，ｒａｄｉｏｅｃｏｌｏｇｉｉａ ／ Ｒｏｓｓｉｉｓｋａｉａ ａｋａｄｅｍｉｉａ ｎａｕｋ，４６（２），１５２−１５８．
Ｎｏｔｏ，Ａ．，Ｆ．Ｃｉｂｅｃｃｈｉｎｉ，Ｖ．Ｆａｎｏｓ，ａｎｄ Ｍ．Ｍｕｓｓａｐ（２０１３），ＮＧＡＬ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ：Ｔｈｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｔｏ Ｒｅｖｅａｌ ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｊｕｒｙ，Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ，２０１３，６１２０３２．
Ｏｓｓｅｔｒｏｖａ，Ｎ．，Ｄ．Ｊ．Ｓａｎｄｇｒｅｎ，ａｎｄ Ｗ．Ｆ．Ｂｌａｋｅｌｙ（２０１１），Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｓｅｒｕｍ ａｍｙｌｏｉｄ Ａ ａｓ ｅａｒｌｙ ｐｈａｓｅ ａｎｄ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｉｎ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅ ｔｏｔａｌ−ｂｏｄｙ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ，Ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ，４６，１０１９−１０２４．
Ｏｓｓｅｔｒｏｖａ，Ｎ．Ｉ．，ａｎｄ Ｗ．Ｆ．Ｂｌａｋｅｌｙ（２００９），Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｂｌｏｏｄ−ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｕｓｉｎｇ ａｎ ｉｎ ｖｉｖｏ ｍｕｒｉｎｅ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌ，Ｉｎｔ Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｂｉｏｌ，８５（１０），８３７−８５０．
Ｏｓｓｅｔｒｏｖａ，Ｎ．Ｉ．，Ｄ．Ｊ．Ｓａｎｄｇｒｅｎ，Ｓ．Ｇａｌｌｅｇｏ，ａｎｄ Ｗ．Ｆ．Ｂｌａｋｅｌｙ（２０１０），Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ ＳＡＡ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｄｏｓｅ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｔｒｉａｇｅ ｉｎ ｂｉｏｄｏｓｉｍｅｔｒｙ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈｅａｌｔｈ Ｐｈｙｓ，９８（２），２０４−２０８．
Ｏｓｓｅｔｒｏｖａ，Ｎ．Ｉ．，Ａ．Ｍ．Ｆａｒｅｓｅ，Ｔ．Ｊ．ＭａｃＶｉｔｔｉｅ，Ｇ．Ｌ．Ｍａｎｇｌａｐｕｓ，ａｎｄ Ｗ．Ｆ．Ｂｌａｋｅｌｙ（２００７），Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｅａｒｌｙ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｕｓｉｎｇ ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅ ６−Ｇｙ ｗｈｏｌｅ−ｂｏｄｙ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌ，Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ，４２，１１５８−１１６３．
Ｐａｔｅｌ，Ｓ．，Ｆ．Ｈ．Ｗａｎｇ，Ｔ．Ｌ．Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ，ａｎｄ Ｕ．Ｋａｓｉｄ（１９９８），Ｉｏｎｉｚｉｎｇ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ＴＮＦ−ａｌｐｈａ ａｎｄ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ１−ａｎｔｉｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ ｇｅｎｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ，Ａｃｔａ Ｏｎｃｏｌ，３７（５），４７５−４７８．
Ｐｒａｔ，Ｍ．，Ｃ．Ｄｅｍａｒｑｕａｙ，Ｊ．Ｆｒｉｃｋ，Ｄ．Ｔｈｉｅｒｒｙ，Ｎ．Ｃ．Ｇｏｒｉｎ，ａｎｄ Ｊ．Ｍ．Ｂｅｒｔｈｏ（２００５），Ｒａｄｉａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｐｌａｓｍａ Ｆｌｔ３ ｌｉｇａｎｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｖｅｒａｌ ｃｅｌｌ ｔｙｐｅｓ，Ｒａｄｉａｔ Ｒｅｓ，１６３（４），４０８−４１７．
Ｐｒａｔ，Ｍ．，Ｃ．Ｄｅｍａｒｑｕａｙ，Ｊ．Ｆｒｉｃｋ，Ｎ．Ｄｕｄｏｉｇｎｏｎ，Ｄ．Ｔｈｉｅｒｒｙ，ａｎｄ Ｊ．Ｍ．Ｂｅｒｔｈｏ（２００６），Ｕｓｅ ｏｆ ｆｌｔ３ ｌｉｇａｎｄ ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ ａｆｔｅｒ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ，Ｒａｄｉａｔ Ｒｅｓ，１６６（３），５０４−５１１．
Ｒｅｉｎｅｃｋｅｒ，Ｈ．Ｃ．，Ｒ．Ｐ．ＭａｃＤｅｒｍｏｔｔ，Ｓ．Ｍｉｒａｕ，Ａ．Ｄｉｇｎａｓｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｋ．Ｐｏｄｏｌｓｋｙ（１９９６），Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｂｏｔｈ ｅｘｐｒｅｓｓ ａｎｄ ｒｅｓｐｏｎｄ ｔｏ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １５，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１１１（６），１７０６−１７１３．
Ｒｏｕｄｋｅｎａｒ，Ｍ．Ｈ．，Ｙ．Ｋｕｗａｈａｒａ，Ｔ．Ｂａｂａ，Ａ．Ｍ．Ｒｏｕｓｈａｎｄｅｈ，Ｓ．Ｅｂｉｓｈｉｍａ，Ｓ．Ａｂｅ，Ｙ．Ｏｈｋｕｂｏ，ａｎｄ Ｍ．Ｆｕｋｕｍｏｔｏ（２００７），Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ ２ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ ｉｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｈａｒｍｆｕｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｒｅｓ，４８（１），３９−４４．
Ｓｈａｒｍａ，Ｍ．，ａｎｄ Ｊ．Ｅ．Ｍｏｕｌｄｅｒ（２０１３），Ｔｈｅ ｕｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ａｓ ａ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｂｉｏｄｏｓｉｍｅｔｅｒ，Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ，９９０，８７−１００．
Ｓｈｉｉｂａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３），Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ−２ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ，Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ，４２（４），１１９７−１２０４．
Ｓｕｇｉｈａｒａ，Ｔ．，Ｈ．Ｍｕｒａｎｏ，Ｍ．Ｎａｋａｍｕｒａ，ａｎｄ Ｋ．Ｔａｎａｋａ（２０１３），Ｉｎ ｖｉｖｏ ｐａｒｔｉａｌ ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｂｙ ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｅｄｉｕｍ−ｄｏｓｅ−ｒａｔｅ ｇａｍｍａ−ｒａｙ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ，Ｒａｄｉａｔ Ｒｅｓ，１７９（２），２２１−２３１．
ｖａｎ ｄｅｒ Ｖｅｌｄｅｎ，Ｗ．Ｊ．，Ａ．Ｈ．Ｈｅｒｂｅｒｓ，Ｔ．Ｆｅｕｔｈ，Ｎ．Ｐ．Ｓｃｈａａｐ，Ｊ．Ｐ．Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，ａｎｄ Ｎ．Ｍ．Ｂｌｉｊｌｅｖｅｎｓ（２０１０），Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｄａｍａｇｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｔｈｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｅａｒｌｙ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ｆｏｒ ａ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，ＰＬｏＳ ＯＮＥ，５（１２），ｅ１５１５６．
Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｃ．Ｇｕｏ，Ｈ．Ｚｈａｎｇ，ａｎｄ Ｓ．Ｄｏｎｇ（２００９），Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ＣＤ３４＋ ｃｅｌｌｓ ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｂｏｔｈ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３ ａｎｄ Ｆｌｔ３ ｌｉｇａｎｄ ｏｎ ｌｅｔｈａｌｌｙ ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ｍｉｃｅ，Ｉｎｔ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ，９０（１），６４−７３．
本発明は、詳述される特定の好ましい実施形態の組み合わせをすべて包含する。本明細書において記載される実施例および実施形態は、説明的な目的のみのためのものであり、それを考慮した様々な修飾または変更は、当業者らに示唆され、本出願の精神および範囲ならびに添付される請求項の範囲内に含まれることが理解される。本明細書において引用される刊行物、特許、および特許出願はすべて、その中の引用文を含めて、すべての目的のために、それらの全体が参照によってこれによって組み込まれる。

Claims (15)

1. 入口、それぞれが、血球ではなく血漿を通過させるのに十分な、ポアサイズを有する内腔および壁を含む、複数の細長い中空アフェレーシスファイバー、チャンバー、および出口を含み、前記入口が、前記内腔と大部分が流体接続しており、前記ファイバーが、前記チャンバー内に含有され、前記チャンバーが、前記出口と大部分が流体接続しており、操作中に、血液が前記入口から前記内腔に入り、血漿が、前記ファイバーの前記壁を通過して前記チャンバーの中に入り、その後、前記出口から出る、血液フィルターデバイス。
2. ４〜１００もしくは５〜２５本の細長く平行なファイバーを含む、１００ｕｌ未満のデッドボリュームを有する、または２ＰＳＩ未満の作業圧力を必要とする、請求項１に記載のデバイス。
3. ４〜１００もしくは５〜２５本の細長く平行なファイバーを含み、１００ｕｌ未満のデッドボリュームを有し、かつ２ＰＳＩ未満の作業圧力を必要とする、請求項１に記載のデバイス。
4. 電離放射線への人の被曝の定性的評価のためのキットであって、
   （ａ）キャピラリー血液収集デバイス、
   （ｂ）血球から血漿を分離する、請求項１に記載の血液フィルターデバイス、
   （ｃ）前記血漿およびバッファー溶液の混合物を形成するミキサー、
   （ｄ）単一のカセットケース中に保持されたラテラルフローストリップまたは１組のストリップに前記混合物を適用するアプリケーター、ならびに
   （ｅ）１または複数の前記ラテラルフローストリップをスキャンし、結果を出力して、バイオマーカーの量または電離放射線への人の被曝の評価を報告するコンパクトリーダーシステムを含む、キット。
5. 血球から血漿を分離し、前記血漿のバイオマーカーを検出するための血液フィルターデバイス、基質中にまたは上に含有される、前記バイオマーカーに特異的なアフィニティ捕捉分子を含み、前記基質が、複数のラテラルフローストリップを含み、それぞれが、異なる所定のタンパク質捕捉特異性を有し、前記バイオマーカーが、（ｉ）アルファ−１−抗キモトリプシン（ＡＣＴ）（ｉｉ）Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、および（ｉｉｉ）血清アミロイドＡアイソフォーム１または２（ＳＡＡ１またはＳＡＡ２）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、唾液アルファアミラーゼ（ＡＭＹ１Ａ）、アルファ−１−抗トリプシンアイソフォーム４（ＳＥＲＰＩＮＡ１）、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）、アルファ−１−酸性糖タンパク質１または２、ロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質（ＬＲＧ１）、テネイシン−Ｃ（ＴＮＣ）、クラスタリン（ＣＬＵ）、ヘモペキシン（ＨＰＸ）、ハプトグロビン（ＨＰ）、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ（ＡＰＯＡ４）、インターロイキン１５（ＩＬ１５）、インターロイキン１８（ＩＬ１８）、および単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ１）からなる群から選択される１つ以上のさらなるタンパク質を含む、電離放射線への人の被曝の定性的評価のためのキットに統合された、請求項１に記載のデバイス。
6. 前記さらなるタンパク質が、ＡＭＹ１Ａ、ＮＧＡＬ、ＡＰＯＡ４、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＭＣＰ１、およびＨＰＸからなる群から選択される、請求項５に記載のデバイス。
7. 前記バイオマーカーが、
   （ｉ）ＡＣＴ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＡＭＹ１Ａ、およびＩＬ１５または
   （ｉｉ）ＡＣＴ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＮＧＡＬ、およびＡＭＹ１Ａ
   （ｉｉｉ）ＡＣＴ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＮＧＡＬ、およびＭＣＰ１
   を含む、請求項５に記載のデバイス。
8. 電離放射線への人の被曝の定性的評価のための方法であって、
   （ａ）前記人の血液サンプルのバイオマーカーを分離するステップおよび
   （ａ）前記分離されたバイオマーカーの量を測定するステップを含み、前記バイオマーカーの対応する非照射コントロール基準範囲と比較した量の変化が、評価を提供し、
   前記バイオマーカーが、（ｉ）アルファ−１−抗キモトリプシン（ＡＣＴ）（ｉｉ）Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、および（ｉｉｉ）血清アミロイドＡアイソフォーム１または２（ＳＡＡ１またはＳＡＡ２）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、唾液アルファアミラーゼ（ＡＭＹ１Ａ）、アルファ−１−抗トリプシンアイソフォーム４（ＳＥＲＰＩＮＡ１）、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）、アルファ−１−酸性糖タンパク質１または２、ロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質（ＬＲＧ１）、テネイシン−Ｃ（ＴＮＣ）、クラスタリン（ＣＬＵ）、ヘモペキシン（ＨＰＸ）、ハプトグロビン（ＨＰ）、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ（ＡＰＯＡ４）、インターロイキン１５（ＩＬ１５）、インターロイキン１８（ＩＬ１８）、および単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ１）からなる群から選択される１つ以上のさらなるタンパク質を含む、方法。
9. 測定ステップが、ラテラルフローイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、マイクロスフェアベースのイムノアッセイ、ウェスタンブロット、免疫ドットブロット、または定量的質量分析を含む、請求項８に記載の方法。
10. 放射線被曝が、＞２Ｇｙである、請求項８に記載の方法。
11. 測定ステップが、放射線被曝の１〜１４日後に行われる、請求項８に記載の方法。
12. 所定の被曝閾値以上または以下という評価に基づいて、放射線照射曝露または非曝露として人を分類するステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
13. 放射線被曝について前記人を処置するステップをさらに含み、前記処置が、療法、モニタリング、またはさらなる評価の指示である、請求項８に記載の方法。
14. 請求項８に記載の方法に適合され、基質中にまたは上に含有される、バイオマーカーに特異的なアフィニティ捕捉分子を含むキットであって、前記基質が、複数のラテラルフローストリップを含み、それぞれが、異なる所定のタンパク質捕捉特異性を有するキット。
15. 請求項８に記載の方法に適合され、
    （ａ）キャピラリー血液収集デバイス、
    （ｂ）血球から血漿を分離する血液フィルター、
    （ｃ）前記血漿およびバッファー溶液の混合物を形成するミキサー、
    （ｄ）単一のカセットケース中に保持されたラテラルフローストリップ、または１組のストリップに前記混合物を適用するアプリケーター、ならびに
    （ｅ）１または複数の前記ラテラルフローストリップをスキャンし、結果を出力して、バイオマーカーの量または電離放射線への人の被曝の評価を報告するコンパクトリーダーシステム
    を含むキットであって、
    前記リーダーシステムが、励起レーザー、ウィックセレクター、放射フィルター、収集光学装置類、および強度センサーを含み、特に、前記センサーが、光電子増倍管、電荷結合素子（ＣＣＤ）、または相補性金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）を含む、キット。

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