CN110672860B - 五种细胞因子组合作为电离辐射损伤生物标志物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了五种细胞因子作为电离辐射损伤生物标志物。本发明提供了IL‑5、IL‑6、IL‑10、IL‑15和IL‑33五种细胞因子组合作为生物标志物在监测辐射泄漏引起动物个体危害或人群危害中的应用。本发明方法以辐照受害者血清样本作为检测对象，可在辐照后任意时间采血进行检测评估，实现及时评估；本发明基于MSD设备的优点，可实现低样本量需求，高通量、高灵敏度的检测；本发明检测所需样本量小，一次检测5种经严格分析筛选的辐射损伤生物标志物，可实现低成本、快速、高效的检测功能，服务辐射危害的及时评估。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及五种细胞因子组合作为电离辐射损伤生物标志物。
背景技术
随着核能和核医学技术的广泛应用，辐射对环境和人类健康的影响越来越引起人们的关注。评估放射危害，诊断和治疗各类放射损伤，需要积极发展新的快速评估生物受照剂量的方法技术。传统的用于估算辐射剂量的生物方法，包括染色体畸变分析、早熟凝聚染色体片段分析、微核分析、体细胞突变分析等。新近，美国哥伦比亚大学建立了以检测DNA损伤标志物γ-H2AX的高通量方法-RABiT(Rapid Automated Biodosimetry Tool)。不过，这些方法都存在一定的缺点。
染色体畸变分析、早熟凝聚染色体片段分析、微核分析等这些方法是基于细胞染色体数量与构型进行分析，以及基于细胞DNA断裂或突变的分析方法。采用这些方法检测时，首先需要从辐射受害者或动物取血；做染色体分析的，加上促有丝分裂的植物血凝素(PHA)，然后置于CO2培养箱中培养三天；收集细胞，离心，低渗处理，制作有丝分裂中期相染色体玻片；吉姆萨染色后，显微镜下，分析染色体的断裂(染色单体断裂或染色双体断裂)或数量多少等畸变形态，确定辐照的严重程度。做微核分析相对简单一点，但也要培养细胞2天后，收集细胞，低渗处理后，0.01％吖啶橙染色，荧光显微镜下镜检分析，或培养皿中的细胞培养液移去，甲醇固定处理20分钟后，0.01％吖啶橙染色，荧光显微镜下镜检分析。这些方法都存在一定的缺点，如需二天以上的细胞培养因而耗时长、实验操作步骤多繁琐，对一些畸变类型的分析人为因素影响大，响应剂量量度范围窄(低剂量时，有一定的剂量效应依赖性关系，在高剂量时，损伤效应的检测指标达到一种平台期，与剂量不存在正相关性)。
体细胞突变分析是取辐照对象细胞、血样或组织样本，采用分子生物学技术处理样本后，进行PCR分析，根据与正常对照数据库的比对，分析体细胞突变程度与受照射剂量的相关性。该方法实验操作要求高，响应剂量量度范围窄，对辐照后期的受害者对象，此分析方法有一定的可靠性。
以检测DNA损伤标志物γ-H2AX的高通量方法-RABiT，也需要从受照射对象取血，培养细胞一天以上，固定细胞，破膜、加γ-H2AX抗体孵育1小时；洗去多余未结合的一抗，加抗γ-H2AX的二抗孵育1小时；洗去多余未结合的二抗，避光风干；加含DAPI的荧光增强液，封片后，荧光显微镜下采集图像，计算机软件辅助计算采集到的γ-H2AX荧光强度与照射剂量之间的相关性，评估照射剂量。该技术的缺点是需采血后培养细胞一天以上，才能进行相关实验；γ-H2AX荧光强度与照射剂量之间的响应量度范围窄。
因此寻找与电离辐射相关的新生物标志物，以及建立灵敏、可靠、快速、微创、适用范围广为前提的检测方法显得尤为迫切，这对于提高救援效率和救治效果具有重要意义。
发明内容
为了解决传统的辐射损伤监测与剂量估算的生物学方法，耗时长、实验繁琐、成本高、响应剂量量度范围窄的问题，本发明提供了利用五种细胞因子组合作为生物标志物检测电离辐射损伤的方法。
第一方面，本发明要求保护五种细胞因子组合作为生物标志物在如下任一中的应用(用于检测五种细胞因子的物质在如下任一中的应用)：
(A1)制备用于监测辐射泄漏情况的产品，或监测辐射泄漏情况；
(A2)制备用于监测辐射泄漏引起动物个体危害的产品，或监测辐射泄漏引起动物个体危害；
(A3)制备用于监测辐射泄漏引起人群危害的产品，或监测辐射泄漏引起人群危害；
所述五种细胞因子为IL-5、IL-6、IL-10、IL-15和IL-33。
第二方面，本发明要求保护三种细胞因子组合作为生物标志物在如下任一中的应用(用于检测三种细胞因子的物质在如下任一中的应用)：
(B1)制备用于评估辐射暴露剂量的产品，或评估辐射暴露剂量；
(B2)制备用于评估辐射损伤的产品，或评估辐射损伤；
所述三种细胞因子为IL-5、IL-6和IL-33。
第三方面，本发明要求保护两种细胞因子组合作为生物标志物在如下中的应用(用于检测两种细胞因子的物质在如下中的应用)：
(C1)制备用于区分低LET电离辐射和高LET电离辐射的产品，或区分低LET电离辐射和高LET电离辐射；
所述两种细胞因子为IL-10和IL-15。
第四方面，本发明要求保护细胞因子A和细胞因子B作为生物标志物在如下中的应用(用于检测细胞因子A和细胞因子B的物质在如下中的应用)：
(D1)制备用于估算辐射暴露剂量的产品，或估算辐射暴露剂量；
所述细胞因子A为IL-10和IL-15；所述细胞因子B为IL-6和/或IL-5。
进一步地，前文所述检测细胞因子为检测动物(包括人)血清中或培养细胞上清中所述细胞因子的相对表达量。
在本发明中，可按照如下任一评估待测动物(包括人)或待测细胞的辐射损伤情况：
(E1)若所述待测动物(包括人)的血清或所述待测细胞的培养上清中IL-5、IL-6、IL-33的表达量值均高于对应的对照值，则所述待测动物(包括人)或所述待测细胞存在辐射损伤或疑似存在辐射损伤；
(E2)若所述待测动物(包括人)的血清或所述待测细胞的培养上清中IL-5、IL-6、IL-33的表达量值高出对应的所述对照值越多，则预测所述待测动物(包括人)或所述待测细胞的辐射损伤越严重；
所述对照值为相应细胞因子在没有被辐射的正常动物(包括人)血清或正常细胞上清中的表达量。
在本发明中，可按照如下任一评估待测动物(包括人)或待测细胞的辐射暴露剂量：
(F1)若所述待测动物(包括人)的血清或所述待测细胞的培养上清中IL-5、IL-6、IL-33的表达量值均高于对应的对照值，则说明所述待测动物(包括人)或所述待测细胞被辐射或疑似被辐射；
(F2)若所述待测动物(包括人)的血清或所述待测细胞的培养上清中IL-5、IL-6、IL-33的表达量值高出对应的所述对照值越多，则预测所述待测动物(包括人)或所述待测细胞的辐射暴露剂量越大；
所述对照值为相应细胞因子在没有被辐射的正常动物(包括人)血清或正常细胞上清中的表达量。
在本发明中，可按照如下(G1)确定待测动物(包括人)或待测细胞所经受的辐射是高LET电离辐射还是低LET电离辐射：
(G1)在辐射后1h所述待测动物(包括人)血清或所述待测细胞的培养上清中检测到的IL-10、IL-15表达量值与所述对照值无明显差异的前提下，若辐射后24h所述待测动物(包括人)血清或所述待测细胞的培养上清中检测到的IL-10表达量值显著低于所述对照值，则预测所述辐射为低LET电离辐射；若辐射后24h所述待测动物(包括人)血清或所述待测细胞的培养上清中检测到的IL-10、IL-15表达量值高于所述对照值，则预测所述辐射为高LET电离辐射；
所述对照值为相应细胞因子在没有被辐射的正常动物(包括人)血清或正常细胞上清中的表达量。
在本发明中，可按照包括如下步骤的方法估算待测动物(包括人)或待测细胞的辐射暴露剂量：
(H1)按照所述(G1)确定所述待测动物(包括人)或所述待测细胞所经受的辐射是高LET电离辐射还是低LET电离辐射；
(H2)检测辐射后1h和/或辐射后7d所述待测动物(包括人)的血清或所述待测细胞的培养上清中检测到的IL-6和/或IL-5的相对表达量值；
(H3)结合(H1)结果，将(H2)的检测结果代入相应的剂量-效应模拟公式的y值，计算所得X值即为所述待测动物(包括人)或所述待测细胞的辐射暴露剂量；
低LET电离辐射：
辐射后1h：y＝1.0047e0.3165x；y值代表辐射后1h，检测到的IL-6相对含量；
辐射后7d：y＝1.4246e0.5247x；y值代表辐射后7d，检测到的IL-6相对含量；
高LET电离辐射：
辐射后1h：y＝0.9052e0.3425x；y值代表辐射后1h，检测到的IL-6相对含量；
辐射后7d：y＝1.171e0.2443x；y值代表辐射后7d，检测到的IL-5相对含量。
其中，y值所示的相对含量为相对没有被辐射的正常动物(包括人)血清或正常细胞上清中的表达量。
第五方面，本发明要求保护一种用于评估待测动物(包括人)或待测细胞的辐射损伤情况的系统。
本发明所要求保护的用于评估待测动物(包括人)或待测细胞的辐射损伤情况的系统，可包括：
(1)用于检测待测动物(包括人)血清或待测细胞的培养上清中三种细胞因子表达水平的试剂和/或仪器；所述三种细胞因子为IL-5、IL-6和IL-33；
(2)装置，所述装置包括数据输入模块、数据比较模块和结论输出模块；
所述数据输入模块用于输入(1)检测得到的所述待测动物(包括人)血清或所述待测细胞的培养上清中所述三种细胞因子的表达量值和对照值；
所述数据比较模块用于将所述表达量值与对应的所述对照值进行比较；
所述对照值为相应细胞因子在没有被辐射的正常动物(包括人)血清或正常细胞上清中的表达量；
所述结论输出模块用于按照如下输出结论：若所述待测动物(包括人)的血清或所述待测细胞的培养上清中IL-5、IL-6、IL-33的表达量值均高于对应的对照值，则输出“所述待测动物(包括人)或所述待测细胞存在辐射损伤或疑似存在辐射损伤”和/或“所述待测动物(包括人)的血清或所述待测细胞的培养上清中IL-5、IL-6、IL-33的表达量值高出对应的所述对照值越多，所述待测动物(包括人)或所述待测细胞的辐射损伤越严重”的结论。
第六方面，本发明要求保护一种用于评估待测动物(包括人)或待测细胞的辐射暴露剂量的系统。
本发明要求保护的用于评估待测动物(包括人)或待测细胞的辐射暴露剂量的系统，可包括：
(a1)用于检测待测动物(包括人)血清或待测细胞的培养上清中三种细胞因子表达水平的试剂和/或仪器；所述三种细胞因子为IL-5、IL-6和IL-33；
(a2)装置，所述装置包括数据输入模块、数据比较模块和数据处理及结论输出模块；
所述数据输入模块用于输入(a1)检测得到的所述待测动物(包括人)血清或所述待测细胞的培养上清中所述三种细胞因子的表达量值和对照值；
所述数据比较模块用于将所述表达量值与对应的所述对照值进行比较；
所述对照值为相应细胞因子在没有被辐射的正常动物(包括人)血清或正常细胞上清中的表达量；
所述数据处理及结论输出模块用于按照如下输出结论：若所述待测动物(包括人)的血清或所述待测细胞的培养上清中IL-5、IL-6、IL-33的表达量值均高于对应的对照值，则输出“所述待测动物(包括人)或所述待测细胞被辐射或疑似被辐射”和/或“所述待测动物(包括人)的血清或所述待测细胞的培养上清中IL-5、IL-6、IL-33的表达量值高出对应的所述对照值越多，则所述待测动物(包括人)或所述待测细胞所受的辐射剂量越大”的结论。
第七方面，本发明要求保护一种用于区分低LET电离辐射和高LET电离辐射的系统。
本发明要求保护的用于区分低LET电离辐射和高LET电离辐射的系统，可包括：
(1)用于检测待测动物(包括人)血清或待测细胞的培养上清中两种细胞因子表达水平的试剂和/或仪器；所述两种细胞因子为IL-10和IL-15；
(2)装置，所述装置包括数据输入模块、数据比较模块和结论输出模块；
所述数据输入模块用于输入(1)检测得到的所述待测动物(包括人)血清或所述待测细胞的培养上清中所述两种细胞因子的表达量值和对照值；
所述数据比较模块用于将所述表达量值与对应的所述对照值进行比较；
所述对照值为相应细胞因子在没有被辐射的正常动物(包括人)血清或正常细胞上清中的表达量；
所述结论输出模块用于按照如下输出结论：在辐射后1h所述待测动物(包括人)血清或所述待测细胞的培养上清中检测到的IL-10、IL-15表达量值与所述对照值无明显差异的前提下，若辐射后24h所述待测动物(包括人)血清或所述待测细胞的培养上清中检测到的IL-10表达量值显著低于所述对照值，则输出“所述辐射为低LET电离辐射”的结论；若辐射后24h所述待测动物(包括人)血清或所述待测细胞的培养上清中检测到的IL-10、IL-15表达量值高于所述对照值，则输出“所述辐射为高LET电离辐射”的结论。
第八方面，本发明要求保护一种用于估算待测动物(包括人)或待测细胞的辐射暴露剂量的系统。
本发明要求保护的用于估算待测动物(包括人)或待测细胞的辐射暴露剂量的系统，可包括：
(d1)用于检测待测动物(包括人)血清或待测细胞的培养上清中细胞因子A和细胞因子B表达水平的试剂和/或仪器；所述细胞因子A为IL-10和IL-15；所述细胞因子B为IL-6和/或IL-5；
(d2)装置，所述装置包括数据输入模块、数据比较模块、数据运算模块和结论输出模块；
所述数据输入模块用于输入(d1)检测得到的所述待测动物(包括人)血清或所述待测细胞的培养上清中所述细胞因子A和所述细胞因子B的表达量值和对照值；
所述数据比较模块用于将所述表达量值与对应的所述对照值进行比较，并按照如下确定所述待测动物(包括人)血清或所述待测细胞所经受的辐射是低LET电离辐射还是高LET电离辐射，并发送指令给所述数据运算模块：在辐射后1h所述待测动物(包括人)血清或所述待测细胞的培养上清中检测到的IL-10、IL-15表达量值与所述对照值无明显差异的前提下，若辐射后24h所述待测动物(包括人)血清或所述待测细胞的培养上清中检测到的IL-10表达量值显著低于所述对照值，则视所述辐射为低LET电离辐射；若辐射后24h所述待测动物(包括人)血清或所述待测细胞的培养上清中检测到的IL-10、IL-15表达量值高于所述对照值，则视所述辐射为高LET电离辐射；
所述对照值为相应细胞因子在没有被辐射的正常动物(包括人)血清或正常细胞上清中的表达量；
所述数据运算模块根据所述数据比较模块发来的所述辐射为低LET电离辐射还是高LET电离辐射的指令，按照如下选择相应剂量-效应模拟公式进行运算：将辐射后1h和/或辐射后7d所述待测动物(包括人)的血清或所述待测细胞的培养上清中检测到的IL-6和/或IL-5的相对表达量值代入相应的剂量-效应模拟公式的y值，计算得到X值，即为所述待测动物(包括人)或所述待测细胞的辐射暴露剂量；
低LET电离辐射：
辐射后1h：y＝1.0047e0.3165x；y值代表辐射后1h，检测到的IL-6相对含量；
辐射后7d：y＝1.4246e0.5247x；y值代表辐射后7d，检测到的IL-6相对含量；
高LET电离辐射：
辐射后1h：y＝0.9052e0.3425x；y值代表辐射后1h，检测到的IL-6相对含量；
辐射后7d：y＝1.171e0.2443x；y值代表辐射后7d，检测到的IL-5相对含量。
其中，y值所示的相对含量为相对没有被辐射的正常动物(包括人)血清或正常细胞上清中的表达量。
在本发明中，所述辐射可为电离辐射。
进一步地，所述电离辐射可为低LET电离辐射或高LET电离辐射。
更进一步地，所述低LET电离辐射可为X射线；所述高LET电离辐射可为重离子辐射，如碳离子束辐射。
本发明是在基于MSD仪器的高灵敏性与高通量基础上，对辐射后实验小鼠取血分离血清，对血清中与应激响应较敏感的29种细胞因子(包括炎症细胞因子、促炎细胞因子、免疫因子)进行检测，通过实验分析与比较筛选，发现5种细胞因子中，IL-5、IL-6的表达水平，在辐射后与受照剂量有一定的相关性，IL-33的表达水平在辐照后升高，并且IL-10和IL-15的表达水平对高、低LET射线辐照有差异性，因此，以这5种细胞因子为生物标志物，建立应用于辐射损伤监测与剂量估算的高效检测方法。本发明是一种辐射后即时采血即可检测的快速检测技术。另外，本发明是利用MSD仪器独具一格的“六合一”特点：亚fg/μL灵敏度、低背景、多靶点生物标志物检测，6个数量级线性范围，适用不同样本基质(脑脊液、不同抗凝剂处理的血浆、细胞裂解液等)，5-25μL微量样本检测。实现建立辐射响应损伤监测与剂量估算的高精度、高灵敏度、高通量、高数据质量的生物检测方法。再有，本发明一个样本加样孔，一次精准检测5种生物标志物，可节省检测成本与样本量，准确高效。
附图说明
图1为辐射小鼠血清中，IL-5表达与辐射剂量、辐射后时间的响应关系。A为辐射后1h结果；B为辐射后24h结果；C为辐射后7d结果。
图2为辐射小鼠血清中，IL-6表达与辐射剂量、辐射后时间的响应关系。A为辐射后1h结果；B为辐射后24h结果；C为辐射后7d结果。
图3为辐射小鼠血清中，IL-33表达与辐射剂量、辐射后时间的响应关系。A为辐射后1h结果；B为辐射后24h结果；C为辐射后7d结果。
图4为辐射小鼠血清中，IL-10表达与辐射剂量、辐射后时间的响应关系。A为辐射后1h结果；B为辐射后24h结果；C为辐射后7d结果。
图5为辐射小鼠血清中，IL-15表达与辐射剂量、辐射后时间的响应关系。A为辐射后1h结果；B为辐射后24h结果；C为辐射后7d结果。
各图的图例中，“C-IR”的表示碳离子束辐射；“X-IR”的表示X射线辐射。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所涉及的定量测定均至少进行了3次以上的独立实验。
实施例1、五种细胞因子作为电离辐射损伤生物标志物
本发明是在基于MSD仪器(MSD：超敏因子电化学发光分析仪)的高灵敏性与高通量基础上，对辐射后实验小鼠取血分离血清，对血清中与应激响应较敏感的29种细胞因子(包括炎症细胞因子、促炎细胞因子、免疫因子，具体为IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12p70、IL-15、IL-16、IL-17A、IL-17A/F、IL-17C、IL-17E/IL-25、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-23、IL-27p28/IL-30、IL-31、IL-33、IP-10、KC/GRO、MCP-1、MIP-1α、MIP-2、MIP-3α、TNF-α)进行检测，通过实验分析与比较筛选，发现5种细胞因子中，IL-5、IL-6的表达水平，在辐射后与受照剂量有一定的相关性，IL-33的表达水平在辐照后升高，并且IL-10和IL-15的表达水平对高、低LET射线辐照有差异性，因此，以这5种细胞因子为生物标志物，建立应用于辐射损伤监测与剂量估算的高效检测方法。
一、常规血清样本采集
从正常或辐射后的动物或辐射受害者个体常规取血，分离血清。
二、基于MSD仪器的5种细胞因子检测
(1)实验前准备
MSD公司提供的20×Wash Buffer(Cat:R61AA-1)、4×Read Buffer T(Cat:R92TC-3)、Stop Solution(Cat:R50AO-1)和MSD plate(Cat:N05231A-1)室温平衡，Diluent41(Cat:R50AH-1)，Diluent45(Cat:R50AI-3)冰上融化，ddH2O2配制1×Wash Buffer和2×ReadBuffer。
(2)标准品配制(此步骤可在孔板包被孵育间隙时进行)
①Calibrator5(Cat:C0065-2)、Calibrator8(Cat:C0074-2)和Calibrator12(Cat:C0092-2)分别各用250μl的Diluent41溶解，颠倒几次，室温放置20分钟后涡旋混匀；
②按照提供的使用说明书，制作标准曲线，用作推算检测样本中细胞因子的相对含量。
(3)包被
①计算待检样及标准样所需的孔数，按每孔3μl的biotinylated antibody：IL-5(Cat:C22UO-2)、IL-6(Cat:C22TX-2)、IL-10(Cat:C22TZ-2)、IL-15(Cat:C22UR-2)、IL-33(Cat:C22WF-2)，+2μl对应的assigned Linker，：IL-5(Cat:E2226-2)，IL-6(Cat:E2227-2)，IL-10(Cat:E2228-2)，IL-15(Cat:E2233-2)，IL-33(Cat:E2235-2)，分别配制5种细胞因子所需试剂[即5管，每管为5μl*总孔数]，涡旋混匀室温放置30分钟；
②按每检测样孔2μl的stop solution加入上述每种混合液中，涡旋混匀室温放置30分钟；
③按每检测样孔6μl取上述每种混合液，涡旋混匀；
④将上述混合液用stop solution稀释十倍；
⑤每孔中加入上述混合液50μl，盖上封片玻璃纸，密封后震动摇床700rpm室温孵育1小时；
⑥弃去孔内液体，每孔200μl的1×MSD Wash Buffer洗三次，每次板子倒置拍干。
(4)加样
①已包被好的板子每孔加入25μl的Diluent 41，轻拍板子四周；
②每孔再加入25μl的标准品或血清样品，密封后震动摇床700rpm室温孵育1小时；
③弃去孔内液体，每孔200μl的1×MSD Wash Buffer洗三次，每次板子倒置拍干；
④每孔加入50μl的1×detection antibody混合液：IL-5(Cat:B22UO-2)、IL-6(Cat:B22TX-2)、IL-10(Cat:B22TZ-2)、IL-15(Cat:B22UR-2)、IL-33(Cat:B22WF-2)，(用Diluent 45稀释所有因子的100×detection antibody为1×detection antibody混合液)，密封后震动摇床700rpm室温孵育1小时；
⑤弃去孔内液体，每孔200μl的1×MSD Wash Buffer洗三次，每次板子倒置拍干；
⑥每孔加入150μl的2×MSD Read Buffer，置MSD仪器，读取数值。
(5)仪器设置和样品检测
①检测前至少20分钟，打开电脑和MSD仪器，平衡仪器温度；
②按照仪器操作说明书，点开检测程序；
③待检样品孵育洗准备好后，将孔板放入MSD仪器Input Stack中，点击相关操作按钮；建立相应的检测结果文件名和保存路径；
④点击Assign Assays，按照说明书设置5种细胞因子的位置；
⑤选择标准品加样孔，点击Assign Standards To Wells按说明书设置标准品浓度；
⑥选择Plate Date History，找到检测到的数据文件，右键点击选择AnalyzePlates,选择上述设置的plate layout进行数据读取分析；
⑦在Plate栏中选择检测命名文件，点击样品孔，选择Assign Unknown SamplesTo Wells点击确定后保存；
⑧点击每种因子栏下的Plot Standards或Unknowns查找每种因子的检测数据，
或者在Experment栏下的Experiment Date Table中查找所有因子检测数据，复制所有数据并导出。
三、数据分析与处理
对MSD检测的数据作图，进行剂量效应关系分析，输出相关评判结论，为决策机构提出相关应急方案。
四、本发明所得标志物验证
1、待测样品的制备：
利用Faxitron R650型X射线仪产生的X射线作为低LET电离辐射的代表，以兰州重离子加速器冷却储存环(HIRFL-CSR)生物辐照终端产生的碳离子束作为高LET电离辐射的代表，对6-8周生长状态良好的实验动物昆明小鼠进行全身照射。照射剂量为0Gy、0.5Gy、2Gy、4Gy和8Gy，每组15只；在辐射后1小时、24小时和7天时，采用眼球取血方式采血。4℃3000转离心10分钟，吸取上层血清备用。
2、按前述方案准备缓冲液、包被液、标准样品液等；待检样品按步骤稀释和加样及孵育。
3、仪器设置和样品检测
继续按前述方案设置MSD仪器和进行样品检测并导出数据。
4、数据分析与评估
对经MSD检测实验获得的5种细胞因子表达水平数据，以Origin软件作图，进行结果分析。
辐射小鼠血清中，五种细胞因子表达与辐射剂量、辐射后时间的响应关系，利用Orignal软件作图(如图1至图5所示)。
从上述图形结果可看出：IL-5、IL-6、IL-33的表达水平在辐照后升高，IL-10与IL-15对高LET与低LET辐射诱导的响应有差异。此外，小鼠血清中IL-5与IL-6两种细胞因子的相对表达水平与辐射剂量有一定的相关性，可用于辐射剂量估算，因此，利用EXCELL软件中的指数函数程序，得到如下剂量-效应模拟公式。具体如下：
IL-5：
C-IR-1h:y＝1.3623e0.062x，R2＝0.26。
X-IR-1h:y＝0.8843e-0.026x，R2＝0.36。
C-IR-24h:y＝1.3437e0.1259x，R2＝0.68。
X-IR-24h:y＝1.1948e0.0472x，R2＝0.21。
C-IR-7d:y＝1.171e0.2443x，R2＝0.96。
X-IR-7d:y＝2.4335e0.3447x，R2＝0.64。
IL-6：
C-IR-1h:y＝0.9052e0.3425x，R2＝0.96。
X-IR-1h:y＝1.0047e0.3165x，R2＝0.85。
C-IR-24h:y＝1.153e0.1199x，R2＝0.81。
X-IR-24h:y＝2.0359e0.1246x，R2＝0.41。
C-IR-7d:y＝0.6298e1.1118x，R2＝0.94。
X-IR-7d:y＝1.4246e0.5247x，R2＝0.95。
式中，y为细胞因子相对表达水平值(相对于未辐射对照组)，x为辐射剂量。“C-IR”的表示高LET的碳离子束辐射；带“X-IR”的表示低LET的X射线辐射。
根据以上R2(拟合因子)数值，提出如下用于估算辐照剂量的公式：
低LET辐射：
辐射后1h：y＝1.0047e0.3165x(y值代表辐射后1h，检测到的IL-6相对含量)。
辐射后7d：y＝1.4246e0.5247x(y值代表辐射后7d，检测到的IL-6相对含量)。
高LET辐射：
辐射后1h：y＝0.9052e0.3425x(y值代表辐射后1h，检测到的IL-6相对含量)。
辐射后7d：y＝1.171e0.2443x(y值代表辐射后7d，检测到的IL-5相对含量)。
实际应用中具体而言：
(1)可按照如下任一评估待测动物(包括人)或待测细胞的辐射损伤情况：
若所述待测动物(包括人)的血清或所述待测细胞的培养上清中IL-5、IL-6、IL-33的表达量值均高于对应的对照值，则所述待测动物(包括人)或所述待测细胞存在辐射损伤或疑似存在辐射损伤。
若所述待测动物(包括人)的血清或所述待测细胞的培养上清中IL-5、IL-6、IL-33的表达量值高出对应的所述对照值越多，则预测所述待测动物(包括人)或所述待测细胞的辐射损伤越严重。
(2)可按照如下初步评估待测动物(包括人)或待测细胞的辐射暴露剂量：
若所述待测动物(包括人)的血清或所述待测细胞的培养上清中IL-5、IL-6、IL-33的表达量值均高于对应的对照值，则说明所述待测动物(包括人)或所述待测细胞被辐射或疑似被辐射。
若所述待测动物(包括人)的血清或所述待测细胞的培养上清中IL-5、IL-6、IL-33的表达量值高出对应的所述对照值越多，则预测所述待测动物(包括人)或所述待测细胞所受的辐射剂量越大。
(3)可按照如下评估待测者是否经受高LET或低LET辐射：在辐射后1h待测动物(包括人)血清或待测细胞的培养上清中检测到的IL-10、IL-15表达量值与所述对照值无明显差异的前提下，若辐射后24h所述待测动物(包括人)血清或所述待测细胞的培养上清中检测到的IL-10表达量值显著低于所述对照值，则预测所述辐射为低LET电离辐射；若辐射后24h所述待测动物(包括人)血清或所述待测细胞的培养上清中检测到的IL-10、IL-15表达量值高于对照组值，则预测所述辐射为高LET电离辐射。
(4)可按照包括如下步骤的方法估算待测动物或待测细胞的辐射暴露剂量：第一步，按照步骤(3)确定待测者所经受的辐射是高LET电离辐射还是低LET电离辐射；第二步，检测辐射后1h和/或辐射后7d待测动物(包括人)的血清或待测细胞的培养上清中检测到的IL-6和/或IL-5的相对表达量值；第三步，结合第一步的结果，将第二步的检测结果代入相应的剂量-效应模拟公式的y值，计算所得X值即为待测动物(包括人)或待测细胞的辐射暴露剂量；
低LET电离辐射：
辐射后1h：y＝1.0047e0.3165x；y值代表辐射后1h，检测到的IL-6相对含量；
辐射后7d：y＝1.4246e0.5247x；y值代表辐射后7d，检测到的IL-6相对含量；
高LET电离辐射：
辐射后1h：y＝0.9052e0.3425x；y值代表辐射后1h，检测到的IL-6相对含量；
辐射后7d：y＝1.171e0.2443x；y值代表辐射后7d，检测到的IL-5相对含量。
其中，所述对照值可为相应细胞因子在没有被辐射的正常动物(包括人)血清或正常细胞上清中的表达量。
以上结果表明：将这5种细胞因子进行一次性检测，综合分析它们的表达水平，可以作为辐射损伤生物标志物。
此外，利用此MSD仪器，IL-5检出限浓度：12-1078pg/mL；IL-6检出限浓度：196-100000pg/mL：IL-10检出限浓度：81-7468pg/mL；IL-15检出限浓度：1467-25222pg/mL；检出限浓度：37-17133pg/mL。
另外，本发明检测的与应激响应较敏感的29种细胞因子(包括炎症细胞因子、促炎细胞因子、免疫因子)除了IL-5、IL-6、IL-10、IL-15和IL-33五种细胞因子外，其他细胞因子的检测结果没有反应一定的剂量-效应关系，也不能有助于判定高或低LET辐射的性质。
实施例2、利用IL-5、IL-6两因子估算辐射剂量实例
1、待测样品的制备：
利用Faxitron R650型X射线仪产生的X射线作为低LET电离辐射的代表，以兰州重离子加速器冷却储存环(HIRFL-CSR)生物辐照终端产生的碳离子束作为高LET电离辐射的代表，对6-8周生长状态良好的实验动物昆明小鼠进行全身照射。照射剂量为0.5Gy、2Gy、4Gy和8Gy，每组15只；在辐射后1小时和7天时，采用眼球取血方式采血。4℃3000转离心10分钟，吸取上层血清备用。对照组为未经辐射的6-8周生长状态良好的实验动物昆明小鼠。
2、按实施例1所述方案准备缓冲液、包被液、标准样品液等；待检样品按步骤稀释和加样及孵育。
3、仪器设置和样品检测
继续按实施例1所述方案设置MSD仪器和进行样品检测并导出数据。
4、数据分析与评估
对经MSD检测实验获得IL-5、IL-6这两种细胞因子表达水平数据。然后将相应数据分别带入实施例1所得的辐射后1h和7d的剂量-效应模拟公式(根据IL-10和IL-15检测值评定是否为高LET或低LET辐射，具体方法参见实施例1，然后代入各自相应公式)。最终估算的辐射剂量水平即为剂量-效应模拟公式中的X值。
结果如表1所示：根据IL-5、IL-6两种细胞因子表达量水平，推算出其受辐照的剂量，与实验实际接受的辐照剂量相比，误差值很小。由此可见，利用本发明实施例1所提供的利用IL-5、IL-6两种细胞因子法，可以估算辐射剂量。
表1利用IL-5、IL-6两种细胞因子估算辐射剂量
Claims (12)
1.两种细胞因子组合作为生物标志物在制备用于区分低LET电离辐射和高LET电离辐射的产品中的应用；
所述两种细胞因子为IL-10和IL-15；
在所述应用中，按照如下步骤确定待测动物或待测细胞所经受的电离辐射是高LET电离辐射还是低LET电离辐射：
在辐射后1h所述待测动物血清或所述待测细胞的培养上清中检测到的IL-10、IL-15表达量值与对照值无明显差异的前提下，若辐射后24h所述待测动物血清或所述待测细胞的培养上清中检测到的IL-10表达量值低于所述对照值，则预测所述电离辐射为低LET电离辐射；若辐射后24h所述待测动物血清或所述待测细胞的培养上清中检测到的IL-10、IL-15表达量值高于所述对照值，则预测所述电离辐射为高LET电离辐射；
所述对照值为相应细胞因子在没有被辐射的正常动物血清或正常细胞上清中的表达量。
2.用于检测两种细胞因子的物质在制备用于区分低LET电离辐射和高LET电离辐射的产品中的应用；
所述两种细胞因子为IL-10和IL-15；
在所述应用中，按照如下步骤确定待测动物或待测细胞所经受的电离辐射是高LET电离辐射还是低LET电离辐射：
在辐射后1h所述待测动物血清或所述待测细胞的培养上清中检测到的IL-10、IL-15表达量值与对照值无明显差异的前提下，若辐射后24h所述待测动物血清或所述待测细胞的培养上清中检测到的IL-10表达量值低于所述对照值，则预测所述电离辐射为低LET电离辐射；若辐射后24h所述待测动物血清或所述待测细胞的培养上清中检测到的IL-10、IL-15表达量值高于所述对照值，则预测所述电离辐射为高LET电离辐射；
所述对照值为相应细胞因子在没有被辐射的正常动物血清或正常细胞上清中的表达量。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述用于检测两种细胞因子的物质为能够检测所述两种细胞因子在待测动物的血清或待测细胞的培养上清中的含量的物质。
4.细胞因子A和细胞因子B作为生物标志物在制备用于估算辐射暴露剂量的产品中的应用；所述辐射为电离辐射；
所述细胞因子A为IL-10和IL-15；所述细胞因子B为IL-6和/或IL-5；
在所述应用中，按照包括如下步骤估算待测动物或待测细胞的辐射暴露剂量：
（H1）按照如下步骤确定所述待测动物或所述待测细胞所经受的电离辐射是高LET电离辐射还是低LET电离辐射：
在辐射后1h所述待测动物血清或所述待测细胞的培养上清中检测到的IL-10、IL-15表达量值与对照值无明显差异的前提下，若辐射后24h所述待测动物血清或所述待测细胞的培养上清中检测到的IL-10表达量值低于所述对照值，则预测所述辐射为低LET电离辐射；若辐射后24h所述待测动物血清或所述待测细胞的培养上清中检测到的IL-10、IL-15表达量值高于所述对照值，则预测所述辐射为高LET电离辐射；
所述对照值为相应细胞因子在没有被辐射的正常动物血清或正常细胞上清中的表达量；
（H2）检测辐射后1h和/或辐射后7d所述待测动物的血清或所述待测细胞的培养上清中检测到的IL-6和/或IL-5的相对表达量值；
（H3）结合（H1）结果，将（H2）的检测结果代入相应的剂量-效应模拟公式的y值，计算所得X值即为所述待测动物或所述待测细胞的辐射暴露剂量；
低LET电离辐射：
辐射后1h：y = 1.0047e0.3165x；y值代表辐射后1h，检测到的IL-6相对含量；
辐射后7d：y = 1.4246e0.5247x；y值代表辐射后7d，检测到的IL-6相对含量；
高LET电离辐射：
辐射后1h：y = 0.9052e0.3425x；y值代表辐射后1h，检测到的IL-6相对含量；
辐射后7d：y = 1.171e0.2443x；y值代表辐射后7d，检测到的IL-5相对含量。
5.用于检测细胞因子A和细胞因子B的物质在制备用于估算辐射暴露剂量的产品中的应用；所述辐射为电离辐射；
所述细胞因子A为IL-10和IL-15；所述细胞因子B为IL-6和/或IL-5；
在所述应用中，按照包括如下步骤估算待测动物或待测细胞的辐射暴露剂量：
（H1）按照如下步骤确定所述待测动物或所述待测细胞所经受的电离辐射是高LET电离辐射还是低LET电离辐射：
在辐射后1h所述待测动物血清或所述待测细胞的培养上清中检测到的IL-10、IL-15表达量值与对照值无明显差异的前提下，若辐射后24h所述待测动物血清或所述待测细胞的培养上清中检测到的IL-10表达量值低于所述对照值，则预测所述辐射为低LET电离辐射；若辐射后24h所述待测动物血清或所述待测细胞的培养上清中检测到的IL-10、IL-15表达量值高于所述对照值，则预测所述辐射为高LET电离辐射；
所述对照值为相应细胞因子在没有被辐射的正常动物血清或正常细胞上清中的表达量；
（H2）检测辐射后1h和/或辐射后7d所述待测动物的血清或所述待测细胞的培养上清中检测到的IL-6和/或IL-5的相对表达量值；
（H3）结合（H1）结果，将（H2）的检测结果代入相应的剂量-效应模拟公式的y值，计算所得X值即为所述待测动物或所述待测细胞的辐射暴露剂量；
低LET电离辐射：
辐射后1h：y = 1.0047e0.3165x；y值代表辐射后1h，检测到的IL-6相对含量；
辐射后7d：y = 1.4246e0.5247x；y值代表辐射后7d，检测到的IL-6相对含量；
高LET电离辐射：
辐射后1h：y = 0.9052e0.3425x；y值代表辐射后1h，检测到的IL-6相对含量；
辐射后7d：y = 1.171e0.2443x；y值代表辐射后7d，检测到的IL-5相对含量。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述用于检测细胞因子A和细胞因子B的物质为能够检测所述细胞因子A和所述细胞因子B在待测动物的血清或待测细胞的培养上清中的含量的物质。
7.根据权利要求1或2或4或5所述的应用，其特征在于：所述低LET电离辐射为X射线；所述高LET电离辐射为重离子辐射。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述重离子辐射为碳离子束辐射。
9.用于区分低LET电离辐射和高LET电离辐射的系统，包括：
（c1）用于检测待测动物血清或待测细胞的培养上清中两种细胞因子表达水平的试剂和/或仪器；所述两种细胞因子为IL-10和IL-15；
（c2）装置，所述装置包括数据输入模块、数据比较模块和结论输出模块；
所述数据输入模块用于输入（c1）检测得到的所述待测动物血清或所述待测细胞的培养上清中所述两种细胞因子的表达量值和对照值；
所述数据比较模块用于将所述表达量值与对应的对照值进行比较；
所述对照值为相应细胞因子在没有被辐射的正常动物血清或正常细胞上清中的表达量；所述辐射为电离辐射；
所述结论输出模块用于按照如下输出结论：在辐射后1h所述待测动物血清或所述待测细胞的培养上清中检测到的IL-10、IL-15表达量值与所述对照值无明显差异的前提下，若辐射后24h所述待测动物血清或所述待测细胞的培养上清中检测到的IL-10表达量值显著低于所述对照值，则输出“所述辐射为低LET电离辐射”的结论；若辐射后24h所述待测动物血清或所述待测细胞的培养上清中检测到的IL-10、IL-15表达量值高于所述对照值，则输出“所述辐射为高LET电离辐射”的结论。
10.用于估算待测动物或待测细胞的辐射暴露剂量的系统，所述辐射为电离辐射；所述系统包括：
（d1）用于检测待测动物血清或待测细胞的培养上清中细胞因子A和细胞因子B表达水平的试剂和/或仪器；所述细胞因子A为IL-10和IL-15；所述细胞因子B为IL-6和/或IL-5；
（d2）装置，所述装置包括数据输入模块、数据比较模块、数据运算模块和结论输出模块；
所述数据输入模块用于输入（d1）检测得到的所述待测动物血清或所述待测细胞的培养上清中所述细胞因子A和所述细胞因子B的表达量值和对照值；
所述数据比较模块用于将所述表达量值与对应的所述对照值进行比较，并按照如下确定所述待测动物血清或所述待测细胞所经受的辐射是低LET电离辐射还是高LET电离辐射，并发送指令给所述数据运算模块：在辐射后1h所述待测动物血清或所述待测细胞的培养上清中检测到的IL-10、IL-15表达量值与所述对照值无明显差异的前提下，若辐射后24h所述待测动物血清或所述待测细胞的培养上清中检测到的IL-10表达量值显著低于所述对照值，则视所述辐射为低LET电离辐射；若辐射后24h所述待测动物血清或所述待测细胞的培养上清中检测到的IL-10、IL-15表达量值高于所述对照值，则视所述辐射为高LET电离辐射；
所述对照值为相应细胞因子在没有被辐射的正常动物血清或正常细胞上清中的表达量；
所述数据运算模块根据所述数据比较模块发来的所述辐射为低LET电离辐射还是高LET电离辐射的指令，按照如下选择相应剂量-效应模拟公式进行运算：将辐射后1h和/或辐射后7d所述待测动物的血清或所述待测细胞的培养上清中检测到的IL-6和/或IL-5的相对表达量值代入相应的剂量-效应模拟公式的y值，计算得到X值，即为所述待测动物或所述待测细胞的辐射暴露剂量；
低LET电离辐射：
辐射后1h：y = 1.0047e0.3165x；y值代表辐射后1h，检测到的IL-6相对含量；
辐射后7d：y = 1.4246e0.5247x；y值代表辐射后7d，检测到的IL-6相对含量；
高LET电离辐射：
辐射后1h：y = 0.9052e0.3425x；y值代表辐射后1h，检测到的IL-6相对含量；
辐射后7d：y = 1.171e0.2443x；y值代表辐射后7d，检测到的IL-5相对含量。
11.根据权利要求9或10所述的系统，其特征在于：所述低LET电离辐射为X射线；所述高LET电离辐射为重离子辐射。
12.根据权利要求11所述的系统，其特征在于：所述重离子辐射为碳离子束辐射。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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