CN114526971A - 一种基于电化学法测定血清中细胞因子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于电化学法测定血清中细胞因子的方法，涉及生物医药技术领域，通过溶液/标准曲线/质控样品的配制，然后对所配制样品溶液进行操作，测定人血清中6种细胞因子白介素‑1β（IL‑1β），白介素‑2（IL‑2），白介素‑4（IL‑4），白介素‑6（IL‑6），白介素‑8（IL‑8）和肿瘤坏死因子‑α（TNF‑α）浓度，验证该分析方法的选择性，准确度和精密度、稀释线性、基质短期、冷冻解冻循环和长期稳定性。本发明的方法不仅在于可以准确检测不同个体来源的血清分析物，并且还可以在同一个反应中同时检测6个指标，减少了血清用量且提高了检测速度。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种基于电化学法测定血清中细胞因子的方法。
背景技术
传统酶联免疫分析ELISA主要基于酶标仪，酶标仪的灵敏度往往在10-1pg/ml。传统ELISA常规线性范围在10pg/ml-1000pg/ml，对于一个生物学实验，往往要兼顾正常对照组与疾病组的样本，样本中的待测蛋白浓度分布一般从零点几个pg到几千pg不等，所以一个ELISA试剂盒的线性范围不能同时兼顾高低丰度蛋白的检测，需要非常多的预实验进行稀释度摸索，费时费力。
人血清中细胞因子白介素-1β（IL-1β），白介素-2（IL-2），白介素-4（IL-4），白介素-6（IL-6），白介素-8（IL-8）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）浓度的分析方法验证，包括选择性，线性范围，批内/批间准确度和精密度，MRD，稀释线性，基质短期、冷冻解冻循环和长期稳定性，对于病毒感染、免疫缺陷病及自身免疫病的治疗具有重要意义，对于细胞因子的检测ELISA方法检测灵敏度较低，线性范围较窄，检测过程耗时长，并且通常只适用手工操作，不利于全自动检测仪器的检测，从而限制了该方法的推广应用。
发明内容
为解决上述背景技术中存在的问题，本发明提出了一种基于电化学法测定血清中细胞因子的方法，用以解决传统ELISA方法检测细胞因子存在到的灵敏度较低，线性范围较窄，检测过程耗时长的问题，旨在同时且准确地测定不同个体来源的人血清中IL-1β，IL-2，IL-4，IL-6，IL-8和TNF-α这6中细胞因子的浓度，减少血清用量，验证该分析方法的选择性，准确度和精密度、稀释线性、基质短期、冷冻解冻循环和长期稳定性。
为实现上述目的，本发明提出了一种基于电化学法测定血清中细胞因子的方法，采取的技术方案如下：
步骤一：样品测定前，样品、稀释液2和稀释液3通过离心机进行离心操作，2000g离心20min，确保无絮状沉淀，并去除泡沫或气泡。在使用前，所有的试剂和样本需平衡至室温，其中样品为人体血清基质，稀释液2购自MSD公司，货号为R51BB-4，稀释液3购自MSD公司，货号为R51BA-4。
质控样品稀释：该方法的最小稀释倍数为1/2，因此除了评价稀释线性和最小稀释倍数的质控样品外，其余质控样品需用稀释液2进行2倍混悬稀释。
样本稀释：浓度在线性范围内的样品加入稀释液2对样本进行2倍混悬稀释。
步骤二：用移液器加入洗液200 μL/孔，洗板3次。所述洗液由40 mL 稀释10倍的PBS缓冲液和200 µL吐温20至500 ml塑料瓶中，加去离子水稀释成400 mL，混匀制成。最后一次洗涤后，将板倒置在吸水纸上，并轻轻拍打。
步骤三：用移液器每孔加入50.0 μL校正标样、稀释后的质控样品和待测样品。用封板膜密封板，室温下用微孔板振荡器振荡孵育2h，微孔板振荡器的震荡频率为670rpm。
步骤四：倒掉板中液体，用移液器加入洗液200 μL/孔，洗板3次。最后一次洗涤后，将板倒置在吸水纸上，并轻轻拍打。
步骤五：用移液器每孔加入25.0 μL Detection Antibody溶液。用封板膜密封板，室温下用微孔板振荡器振荡孵育2 h，微孔板振荡器的震荡频率为670rpm。
步骤六：倒掉板中液体，用移液器加入洗液200 μL/孔，洗板3次。最后一次洗涤后，将板倒置在吸水纸上，并轻轻拍打。
步骤七：用移液器每孔加入稀释两倍的150 μL Read Buffer T，使用MSDQuickPlex SQ 120仪器对板进行分析。
所述步骤一至步骤七中用移液器加液体时采用反吸法，用以减少气泡产生。
本发明提供了一种基于电化学法测定血清中细胞因子的方法，其有益效果是：成功验证了该方法的选择性，准确度和精密度、稀释线性、基质短期、冷冻解冻循环和长期稳定性。综上，本方法可以同时且准确地测定不同个体来源的人血清中IL-1β，IL-2，IL-4，IL-6，IL-8和TNF-α的浓度。此分析方法的优势不仅在于可以准确检测不同个体来源的血清分析物，并且还可以在同一个反应中同时检测6个指标，减少了血清用量且提高了检测速度。
附图说明
图1是有代表性的IL-1β的校准曲线图。
图2是有代表性的IL-2的校准曲线图。
图3是有代表性的IL-4的校准曲线图。
图4是有代表性的IL-6的校准曲线图。
图5是有代表性的IL-8的校准曲线图。
图6是有代表性的TNF-α的校准曲线图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行更加详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明保护范围。
实施例
本发明的基于电化学法测定血清中细胞因子的方法，测定的细胞因子包括白介素-1β（IL-1β），白介素-2（IL-2），白介素-4（IL-4），白介素-6（IL-6），白介素-8（IL-8）和肿瘤坏死因子-α和（TNF-α）在人血清中浓度的分析方法。该方法的最小稀释倍数（MRD）为1/2，线性范围分别为：IL-1β：0.135–554 pg/mL，IL-2：0.352–1440 pg/mL，IL-4：0.0532–218pg/mL，IL-6：0.181–742 pg/mL，IL-8：0.133–545 pg/mL，TNF-α：0.0852–349 pg/mL，校准曲线采用4参数回归方程拟合，权重系数为1/y2。
本发明采用的人血清基质来自于至少10个健康受试者并冷冻保存，然后配制相关试剂，具体如下：
一、配制相关试剂
1.洗液（0.05%吐温20，1X PBS缓冲溶液）的配制
取40 mL稀释十倍的 PBS缓冲液和200 µL吐温20至500 ml塑料瓶中，加去离子水稀释成400 mL，混匀，洗液置于2-8°C条件下可储存1个月。
2.标准曲线的配制
向校正标样瓶中加入Diluent2 1000 μL，混悬后上下颠倒至少3次，但不要涡旋。室温下平衡15-30分钟后简短的涡旋一下，作为校准曲线最高点STD1，其他校正标样用Diluent2稀释（见下表），STD8作为校准曲线零点（0 pg / mL）。除了STD1可分装、储存在≤-70℃条件下外，其它校正标样在每个分析批前需新鲜配制。
3.质控样品的配制
高、中、低3组质控样品分别加入250 μL Diluent2混悬，不要颠倒或涡旋，等待15-30min。制备完成后，剩余质控样品可分装储存于≤-70℃条件下。ULOQ、LLOQ质控样品和中间溶液每次新鲜配制，配制过程见下表：
（1）中间溶液的配制
（2）质控样品的配制
（3）用于选择性和稳定性评价的质控样品的配制
向校准品瓶中加入Diluent2 100 μL，混悬后上下颠倒至少3次，不要涡旋。室温下平衡15-30分钟后简短的涡旋一下，命名为STD-M（剩余可分装并储存于≤-70℃条件下），用于制备评价选择性和稳定性的高浓度质控样品。评价选择性的质控样品(Sel-HQC与Sel-LQC)配制于至少10个不同来源的空白人血清中，评价稳定性的质控样品(Stab-HQC与Stab-LQC)配制于混合空白人血清中。
（4）用于评价稀释线性和MRD的质控样品的配制
用于评价稀释线性和MRD的质控样品配制于空白人血清中。然后用Diluent2分别稀释2倍、4倍、8倍后进行样品分析。
4.Detection Antibody溶液的配制
5.Read buffer(2X)溶液的配制
二、对样品进行操作测定，其操作流程如下：
步骤一：样品测定前，样品、稀释液2和稀释液3通过离心机进行离心操作，2000g离心20min，确保无絮状沉淀，并去除泡沫或气泡。在使用前，所有的试剂和样本需平衡至室温。
质控样品稀释：该方法的最小稀释倍数为1/2，因此除了评价稀释线性和最小稀释倍数的质控样品外，其余质控样品需用稀释液2进行2倍混悬稀释。
样本稀释：浓度在线性范围内的样品加入稀释液2对样本进行2倍混悬稀释。
步骤二：用移液器加入洗液200 μL/孔，洗板3次。最后一次洗涤后，将板倒置在吸水纸上，并轻轻拍打。
步骤三：用移液器每孔加入50.0 μL校正标样、稀释后的质控样品和待测样品。用封板膜密封板，室温下用微孔板振荡器振荡孵育2h。
步骤四：倒掉板中液体，用移液器加入洗液200 μL/孔，洗板3次。最后一次洗涤后，将板倒置在吸水纸上，并轻轻拍打。
步骤五：用移液器每孔加入25.0 μL Detection Antibody溶液。用封板膜密封板，室温下用微孔板振荡器振荡孵育2 h。
步骤六：倒掉板中液体，用移液器加入洗液200 μL/孔，洗板3次。最后一次洗涤后，将板倒置在吸水纸上，并轻轻拍打。
步骤七：用移液器每孔加入稀释两倍的150 μL Read Buffer T，使用MSDQuickPlex SQ 120仪器对板进行分析。
三、数据处理
校准曲线采用4参数回归方程拟合，权重系数为1/y2。校正标样和未知样本的回算浓度以至少3位有效位数的pg/mL来表示。
3.1校准曲线
请参阅图1-6，校准曲线包括7个浓度点和一个空白样品（每个样品2个平行样），配制于稀释液2中。线性范围分别为IL-1β：0.135–554 pg/mL，IL-2：0.352–1440 pg/mL，IL-4：0.0532–218 pg/mL，IL-6：0.181–742 pg/mL，IL-8：0.133–545 pg/mL，TNF-α：0.0852–349pg/mL。使用MSD Discovery Workbench 4.0.12建立4参数回归方程，权重系数为1/y2。
3.2平均值的计算
平均值(
)= 
其中Xi为得到的单个样品浓度，n为样品数。
3.3标准偏差 (SD)
SD = 
其中Xi为单个样品浓度，n为样品数，
为浓度平均值。
3.4准确度和精密度
准确度由测定值和理论值间的%RE衡量。准确度和精密度通过分析6个分析批中，5个质控浓度水平（LLOQ、LQC、MQC、HQC、ULOQ）下重复分析3次得到。批内/批间精密度和批内准确度分别由%CV和%RE表示，批间准确度用总体接受率来表示。
批内准确度和精密度通过分析每个分析批内5组质控浓度水平的3个平行样计算得到。6种细胞因子在各质控浓度水平的%CV分别为IL-1β：0.6~8.5，IL-2：0.3~6.9，IL-4：0.8~9.5，IL-6：0.8~5.0，IL-8：0.5~10.8，TNF-α：0.5~12.3，%RE分别为IL-1β：-19.7~4.8，IL-2：-16.2~8.4，IL-4：-15.7~8.9，IL-6：-12.2~17.5，IL-8：-14.8~12.0，TNF-α：-18.3~15.3。
批间准确度和精密度通过分析6个分析批，5组质控样品浓度，每组3个平行样，共18个平行样计算得到。6种细胞因子在各质控浓度水平的%CV分别为IL-1β：3.7~9.6，IL-2：3.4~6.4，IL-4：5.6~7.2，IL-6：3.9~9.0，IL-8：3.5~10.8，TNF-α：5.8~11.4。6种待测细胞因子LQC浓度的总体接受率均为17/17，其他4组质控的总体接受率均为18/18。
准确度（%RE）=(Cm- Cn) /Cn x100
其中Cm=测定值，Cn=每个浓度水平的理论值。
精密度（%CV）=
结论：准确度和精密度分析批证实了此分析方法的准确度可以达到100±20%以内，精密度可以小于等于20.0%（对于定量上限和定量下限分别是25.0%）。
3.5 MRD和稀释线性
MRD和稀释线性通过测定高浓度人血清质控样品（Dil-HQC）得到。Dil-HQC是将校正标样加入人血清稀释20倍配制而成，IL-1β，IL-2，IL-4，IL-6，IL-8和TNF-α的浓度分别为277、720、109、371、273、175 pg/mL。用Diluent2 分别稀释2倍、4倍、8倍，每个稀释因子平行5份，共3个分析批，所用血清分别来自3个个体。以2倍稀释的稀释前浓度平均值作为理论浓度，分别计算其与4倍、8倍稀释的%RE，结果IL-1β，IL-8和TNF-α的稀释前浓度平均值均在理论浓度的±25%范围内，IL-2，IL-4和IL-6均在±30%范围内，符合接受标准，因此本分析方法的MRD为1/2。另外，通过计算稀释前浓度平均值和添加到血清中的浓度（血清中内源性细胞因子浓度与添加的浓度相比可以忽略不计）的%RE评价稀释线性。3个分析批的Dil-HQC的测定浓度%CV分别为IL-1β：4.5~7.6，IL-2：6.1~8.6，IL-4：3.0~7.3，IL-6：3.2~5.5，IL-8：8.2~10.2，TNF-α：8.1~10.3，%RE分别为IL-1β：-12.7~-10.2，IL-2：-3.9~2.6，IL-4：-25.6~-15.1，IL-6：-22.6~-20.4，IL-8：-2.2~-1.1，TNF-α：-11.0~-8.1（表14-表19），符合验证计划中的接受标准。
结论：稀释线性分析批证实高浓度样品经过稀释后仍然可以在此分析方法中被精确定量。
3.6选择性
分析12个不同个体血清基质，包括1个溶血血清基质和1个高脂血血清基质，分别测定待测细胞因子未添加，添加LLOQ浓度（Sel-LLOQ）和高浓度（Sel-HQC）的样本，复孔检测。12个未添加校正标样的血清样本中内源性IL-1β，IL-2，IL-4，IL-6的测定值全部小于LLOQ，但IL-6的本底浓度对添加LLOQ浓度的质控样品影响较大，因此在计算准确度时IL-6的理论浓度需加上血清内源性浓度。IL-8和TNF-α在所有未添加校正标样的血清中的测定值均高于LLOQ，因此计算准确度时需加上血清内源性浓度。10个非溶血非高脂血Sel-LLOQ质控样品中，IL-1β，IL-2，IL-4，IL-6，IL-8和TNF-α分别有10、8、10、9、10、10个质控符合验证计划中的接受标准，10个Sel-HQC质控样品中，IL-1β，IL-2，IL-4，IL-6，IL-8和TNF-α分别有10、10、10、8、10、10个质控符合验证计划中的接受标准。溶血和高脂血质控样品全部符合接受标准（表20-表25）。
结论：选择性分析证实此分析方法可以在不同个体来源的血清中对分析物进行准确定量。
3.7稳定性
在稳定性测试中，标准曲线及质控样品需要新鲜配制。稳定性样品每个浓度3份，冻融/短期稳定性样品配制好后需放在-80℃冷冻冰箱冻存至少12小时以上方可进行后续处理。
a.冻融稳定性：
稳定性样品经过至少3个冻融循环（冷冻于-80oC（+30/-10oC），而后在室温下融化，此视为一个循环）后，与新配制的校准曲线同时分析，计算测定浓度平均值与初始浓度的%RE评价其稳定性。结果表明，6个细胞因子5次冻融循环后是稳定的。
b.短期稳定性：
将稳定性样品放置在室温或湿冰上至少2h，并与新鲜配制的校准曲线样品同时分析，计算测定浓度平均值与初始浓度的%RE评价其稳定性。结果表明，6种细胞因子室温或在湿冰上放置4h是稳定的。
c.长期稳定性：
稳定性样品在-20oC（+8/-14oC）和-80oC（+30/-10oC）条件下分别储存至少2周后，与新配制的校准曲线一起分析，计算测定浓度平均值与初始浓度的%RE评价其稳定性。
结论：稳定性证实血清样品在不同温度环境下均是稳定的。
因此，本发明的基于电化学法测定血清中细胞因子的方法建立并验证了同时检测人血清中6种细胞因子IL-1β，IL-2，IL-4，IL-6，IL-8和TNF-α在各自线性范围内的MSD电化学发光法，成功验证了该分析方法的选择性，准确度和精密度、稀释线性、基质短期、冷冻解冻循环和长期稳定性。综上，本方法可以同时且准确地测定不同个体来源的人血清中IL-1β，IL-2，IL-4，IL-6，IL-8和TNF-α的浓度。此分析方法的优势不仅在于可以准确检测不同个体来源的血清分析物，并且还可以在同一个反应中同时检测6个指标，减少了血清用量且提高了检测速度。
上述实施仅为本发明优选地实施案例，不能以此来限定本发明所要求保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的替换均属于本发明要求保护的范围。
Claims (6)
1.一种基于电化学法测定血清中细胞因子的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一：样品测定前，样品、稀释液2和稀释液3通过离心机进行离心操作，2000g离心20min，确保无絮状沉淀，并去除泡沫，在使用前，所有的试剂和样本需平衡至室温；
质控样品稀释：该方法的最小稀释倍数为1/2，因此除了评价稀释线性和最小稀释倍数的质控样品外，其余质控样品需用稀释液2进行2倍混悬稀释；
样本稀释：浓度在线性范围内的样品加入稀释液2对样本进行2倍混悬稀释；
步骤二：用移液器加入洗液200 μL/孔，洗板3次。最后一次洗涤后，将板倒置在吸水纸上，并拍打；
步骤三：用移液器每孔加入50.0 μL校正标样、稀释后的质控样品和待测样品，用封板膜密封板，室温下用微孔板振荡器振荡孵育2h；
步骤四：倒掉板中液体，用移液器加入洗液200 μL/孔，洗板3次，最后一次洗涤后，将板倒置在吸水纸上，并拍打；
步骤五：用移液器每孔加入25.0 μL Detection Antibody溶液。用封板膜密封板，室温下用微孔板振荡器振荡孵育2 h；
步骤六：倒掉板中液体，用移液器加入洗液200 μL/孔，洗板3次，最后一次洗涤后，将板倒置在吸水纸上，并拍打；
步骤七：用移液器每孔加入稀释两倍的150 μL Read Buffer T，使用MSD QuickPlexSQ 120仪器对板进行分析。
2.根据权利要求1所述的一种基于电化学法测定血清中细胞因子的方法，其特征在于，所述步骤一中样品为人体血清基质，稀释液2购自MSD公司，货号为R51BB-4，稀释液3购自MSD公司，货号为R51BA-4。
3.根据权利要求2所述的一种基于电化学法测定血清中细胞因子的方法，其特征在于，所述步骤一中质控样品稀释和样本稀释的温度应小于等于70℃，3次冻融循环内有效。
4.根据权利要求1所述的一种基于电化学法测定血清中细胞因子的方法，其特征在于，所述步骤二中洗液由40 mL稀释10倍的PBS缓冲液和200 µL吐温20至500 ml塑料瓶中，加去离子水稀释成400 mL，混匀制成。
5.根据权利要求1所述的一种基于电化学法测定血清中细胞因子的方法，其特征在于，所述步骤三与步骤五中微孔板振荡器的震荡频率为670rpm。
6.根据权利要求1所述的一种基于电化学法测定血清中细胞因子的方法，其特征在于，所述步骤一至步骤七中用移液器加液体时采用反吸法。
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