CN104111329A - 一种改良的同时定量检测多个细胞因子的抗体芯片试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种改良的同时定量检测多个细胞因子的抗体芯片试剂盒。所述试剂盒包括用活性氨基团包被的标准组织玻片作为表面载体，将多种抗原特异性抗体通过非接触性点样仪点微阵列在玻片表面；用可拆装的2×8孔塑料框架把玻片分割成16个互不干扰的小区，每个小区含有一个抗体微阵列。每个捕获抗体在每个抗体微阵列中有四次的重复。玻片和框架之间通过两侧的塑料夹板紧扣形成抗体芯片；在玻片表面完成多重夹心ELISA反应的实验试剂。本发明的抗体芯片试剂盒能够同时定量检测多项细胞因子，其灵敏度与单项ELISA类似，但细胞因子的动态检测范围更广，从单一样品实验中可得到四倍于ELISA的重复数据，具有高灵敏度、高通量、样品用量少、廉价、易推广等优点。

Description

一种改良的同时定量检测多个细胞因子的抗体芯片试剂盒

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种同时定量检测多个细胞因子的抗体芯片试剂盒。

技术背景

细胞因子（cytokines）是机体的免疫细胞和非免疫细胞合成和分泌的具有调节多种细胞生理功能的小分子的多肽(低分子蛋白质)。

细胞因子具有非常广泛的生物学活性，包括促进靶细胞的增殖和分化，增强抗感染和细胞杀伤效应，促进或抑制其它细胞因子和膜表面分子的表达，促进炎症过程，影响细胞代谢等。与免疫有关的细胞因子主要包括淋巴细胞产生的淋巴因子、单核巨噬细胞产生的单核因子、白细胞介素(interleukin，IL)、干扰素(interferon，IFN)、集落刺激因子(colony stimulating factor，CSF)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、趋化因子(chemokine)、转化生长因子β（transforminggrowth factorβ，TGFβ）等，它们在免疫系统中起着非常重要的调控作用，在异常情况下也会导致免疫病理反应。

细胞因子都是通过与靶细胞表面的细胞因子受体特异结合后才能发挥其生物学效应，这些效应包括促进靶细胞的增殖和分化，增强抗感染和杀肿瘤细胞效应，促进或抑制其他细胞因子的合成，促进炎症过程，影响细胞代谢等。细胞因子的这些作用具有网络性的特点，即每种细胞因子可作用于多种细胞；每种细胞可受多种细胞因子的调节；不同细胞因子之间具有相互协同或相互制约的作用，由此构成了复杂的细胞因子免疫调节网络。

细胞因子研究具有非常重要的理论和实用意义，它有助于阐明分子水平的免疫调节机理，有助于疾病的预防、诊断和治疗。

目前常用的细胞因子的检测方法主要包括：酶联免疫吸附法（ELISA），放射免疫分析（radio immunoassay，RIA），免疫印迹法（western blot），流式细胞仪（Flow-Cytometry）等。其中，酶联免疫吸附法是最普遍的方法，具灵敏度高、特异性较好、操作简便等优点。但一次试验只能检测单一指标，通量低、成本高，在具有多指标特性的细胞因子检测中，该方法存在明显的不足；放射免疫分析（RIA）虽然灵敏度高，是由于具有放射性污染，现在已很少采用；免疫印迹法能测定分子的大小，且无非特异的反应，但操作繁琐，灵敏度低，且只能检测单一指标，不适合运用于细胞因子的检测；流式细胞仪能在细胞水平上检测细胞因子的水平，但却存在低灵敏、低通量、高成本等缺点。

在细胞因子的多重ELISA检测上，常用的方法包括液相磁珠法(LUMINEX)和96-孔ELISA板法。液相磁珠法(LUMINEX)是把不同的捕获抗体固定在有不同荧光波长的磁珠上，不同的磁珠在同一液相完成反应后流经一检测小管并由两个不同的荧光检测仪来读数。其中的一个读不同的磁珠信号用以代表不同的检测因子，另一个则读该磁珠上的检测信号用以代表该因子的浓度。因为固定有不同捕获抗体的磁珠在同一反应体系中进行，捕获抗体彼此之间就有交叉干扰，以至于同时检测因子的数目有限。另外一个常用的方法是把不同的捕获抗体以微阵列的方式固定在96-孔酶标板底，然后通过类似ELISA的操作来达到多因子的联合检测。但由于96孔酶标板受孔径大小限制，在一个孔内点的数目有限。另外由于96孔酶标板有很强的自身荧光，所以检测通常只能用化学发光法。由于化学发光法信号的弥散特性以至于检测的数目受到进一步的限制。用以上两类多因子联合检测的方法一次最多只能检测几个因子，并且检测结果的重复性也差。

有鉴于此，有必要开发一种新型的多细胞因子定量检测试剂盒，以克服现有技术中亟待解决的问题，实现多细胞因子的高通量、高灵敏度、高特异性和低成本检测。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种改良的同时定量检测多个细胞因子的体芯片试剂盒，该试剂盒采用荧光检测信号，能够同时定量检测几十项细胞因子，克服了现有技术操作繁琐、检测指标单一、灵敏度低等缺陷，具有低成本、便利、高通量、高灵敏度、高特异性、标本用量少、能在普通实验室推广和规模化等优点。

本发明所述的改良的同时定量检测多个细胞因子的抗体芯片试剂盒，反应装置包括固相载体，为用活性氨基包被的标准组织玻片；在一张玻片表面用非接触性点样仪将多种抗原特异性抗体通过微阵列的方式点有2×8个相同的抗体微阵列，将点有2×8个抗体微阵列的标准组织玻片用可拆装的2×8孔框架结构把玻片分割成16个互不干扰的小区，每个小区含有一个抗体微阵列；反应剂包括：抗体混合液，所述抗体混合液为所述若干种特异性抗体的混合溶液，抗体混合液中的特异性抗体上标记有生物素；识别生物素标记的链霉亲和素，所述链霉亲和素标记有荧光染料，所述荧光染料为Cy3或具有类似吸收波长的荧光染料；细胞因子标准品，包含若干种所述的细胞因子的具有梯级浓度的混合物。

根据本发明所述的试剂盒的进一步特征，所述的框架结构由三部分组成：上层塑料硬框，下层软乳胶片，和两侧的塑料夹板；通过两侧的塑料夹板将上层塑料硬框与下层软乳胶片紧扣在玻片上，形成矩阵为2×8的16孔抗体芯片；框架的每个孔的尺寸大小与常规ELISA的96孔板的孔间距相符，以致适用于标准ELISA系统的自动化操作。

根据本发明所述的试剂盒的进一步特征，所述的多种抗原特异性抗体是细胞-巨噬细胞集落刺激因子、干扰素γ、白介素-2、白介素4、白介素5、白介素6、白介素8、白介素10、白介素13、和肿瘤坏死因子α这10种T细胞分泌因子的特异性抗体。

根据本发明所述的试剂盒的进一步特征，每种特异性抗体的点制浓度分别为200ug/ml；每个捕获抗体在每个抗体微阵列中有四次的重复。

根据本发明所述的试剂盒的进一步特征，芯片处理完成后，拆除可拆装的框架，玻片由含Cy3通道的激光扫描仪扫描成像，所成的像用芯片读数软件将每个点的荧光信号转化为数码信号，再通过与细胞因子标准曲线的对应关系，定量测出样品中细胞因子的浓度。

与现有技术相比，本发明所述的改良的同时定量检测多个细胞因子的抗体芯片试剂盒具有以下优点和特点：

（1）选用没有空间限制的标准组织玻片作为载体，这样点在同一微阵列上检测因子的数目就可以不受空间的限制。

（2）本发明采用活性氨基包被的玻片，不仅可增加在玻片上捕获抗体的稳定性，同时也可以减少背景干扰，增加检测灵敏度。活性氨基包被的玻片多用来作为DNA芯片的载体，在蛋白芯片的载体选择上还不曾有类似的报导。

（3）由于不同捕获抗体是分开固定在玻片的表面，所以可以减少捕获抗体彼此干扰的因素，使得细胞因子高通量检测成为可能。由于玻片具有非常低的自身荧光，而且荧光信号不具扩散性，不同点间的荧光信号不会彼此干扰，所以一次可以同时检测成上百个细胞因子。所开发出的这套在玻片表面进行多重ELISA反应的荧光检测的系统不仅一次可以检测多达几十个细胞因子，并且该系统所检测的细胞因子灵敏度可达到单因子的ELISA检测灵敏度。

（4）本发明将点有2×8个抗体微阵列的标准组织玻片用可拆装的2×8孔框架结构把玻片分割成16个互不干扰的小区，每个小区含有一个抗体微阵列。这样，在同一张玻片上可同时检测16个不同的样品。该16孔可拆装的框架的尺寸大小与常规96孔板的孔间距相符，可以适用于标准ELISA系统的自动化操作。与常规ELISA相符，该反应体系为在玻片表面上进行的多个样品的多重ELISA检测。

（5）每个捕获抗体在每个抗体微阵列中有四次的重复，因而可以从单一样本中得到该细胞因子四倍于ELISA的实验结果。

（6）本发明设计了独特的框架结构，它由三部分组成:上层塑料硬框，下层软乳胶片，和两侧的塑料夹板。玻片和框架之间通过两侧的塑料夹板紧扣形成抗体芯片，每个孔框架的尺寸大小与常规96孔板的孔间距相符，因而可适用于标准ELISA系统的自动化操作。自动化操作系统在标准组织芯片上的应用使得高通量样品的标准化处理成为可能，为芯片的临床应用铺平道路。

（7）现有的蛋白检测系统多采用化学发光法。由于化学发光信号的弥散使得能同时在一个芯片上检测的细胞因子数目受到限制，本发明采用荧光信号不存在信号扩散的问题，这使得高密度蛋白芯片的开发成为可能。

（8）本发明实现了对样品中细胞因子的浓度的定量检测。这是因为本发明采用荧光检测，它具有与化学发光法类似的检测灵敏度，但又具有以下独特的优越性：首先，由于荧光信号的非扩散性，相同面积芯片上可以同时检测的细胞因子数目可比化学发光法高几十倍到上百倍。其次，所成的像可根据信号的强弱调节以达到最佳检测效果。再次，荧光成像的玻片可永久保存。与传统ELISA检测方法不同，芯片处理完成后，拆除可拆装的框架之后，用含Cy3通道的激光扫描仪对反应结束的玻片进行扫描成像，并存储为.GIFf文件。所成的像用芯片读数软件将每个点的信号转化为数码信号。通过与细胞因子标准曲线的对应关系，定量测出样品中细胞因子的浓度。

（9）本发明所述的试剂盒可以同时从单一的样品中定量检测出十个由T辅助细胞所分泌的细胞因子，其中包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、干扰素γ、白介素-2、白介素4、白介素5、白介素6、白介素8、白介素10、白介素13和肿瘤坏死因子α等。它可以用来判断机体所介导的免疫反应是Th1型细胞介导的免疫反应(干扰素γ、白介素-2，肿瘤坏死因子α等)或Th2型体液介导的免疫反应(白介素4、白介素6、白介素10等)以达到辅助临床疾病诊断的效果。

（10）可制备成混合溶液进行点样。现有的检测芯片，点样后处理通常包括水合、紫外交联、洗脱、封闭等步骤。由于本发明所采用的点样液的优良特性，使得将特异性抗体固定于玻片的步骤等到了极大的简化，无须现有技术中普遍采用的点样后封闭玻片上的有效成分的操作步骤。

为确保样品间不容易发生相互作用以致影响检测结果，以便发展成高通量方法，在本发明的一个实施例中，采用美国伯乐（Bio-Rad）公司或铂金艾尔默（PerkinElmer）公司生产的全自动点样仪器。各特异性抗体蛋白质芯片点阵排布于玻片，而在具体的操作过程中，各特异性抗体的排布可以按照实验设计需要进行调整，根据不同的抗体蛋白芯片排布阵列，控制全自动点样仪，制备出所需要的中间产品。

附图说明

图1为本发明蛋白质芯片试剂盒工作原理图。

图2本发明细胞因子检测蛋白质芯片试剂盒的蛋白质芯片的点样示意图。

图3配制系列标准品浓度的示意图。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1：最佳抗体芯片载体的筛选。

常规的抗体芯片多以硝酸纤维素膜为载体，由于硝酸纤维素膜是多层结构，芯片的洗涤难度大，以致芯片的结果波动大。同时由于硝酸纤维素膜芯片不易于大规模的操作，用于大规模临床样本的使用还不普遍。不同的厂家用不同的方法把硝酸纤维素膜固定在玻片的表面，其中有Whatman的SS玻片，它在一张玻片上固定了16个含硝酸纤维素膜的小区，另外Gentel用加工过的硝酸纤维素材料包被在玻片表面而生产了PATH玻片。除此以外，为了使抗体包被在玻片表面，我们筛选了不同方法活化的载体。用全自动点样仪把Cy3和Cy5标记的链霉亲和素点在在玻片的表面，然后用激光扫描仪来读数。实验结果如下表所示。硝酸纤维素膜芯片在Cy3通道有强的信号，但它们的背景也高。用活性氨基包被的玻片在Cy3通道时有最高的信号背景比。

载体及荧光波长	信号强度	背景信号	信号背景比(S/N)
				硝酸纤维素膜Cy5	12345	9177	1
硝酸纤维素膜Cy3	57206	46155	1
				Gentel PATH Cy5	2086	837	2
Gentel PATH Cy3	7415	959	8
				Whatman SS Cy5	13791	5101	3
Whatman SS Cy3	65328	12963	5
				活性醛基玻片Cy5	8063	612	13
活性醛基玻片Cy3	22507	722	31
				活性羟基玻片Cy5	5123	359	14
活性羟基玻片Cy3	58091	797	73
				活性氨基玻片Cy5	8193	323	25
活性氨基玻片Cy3	43129	403	107
				空白组织玻片Cy5	3869	561	7
空白组织玻片Cy3	23940	1648	15

实施例2：一种同时定量检测多个细胞因子的抗体芯片试剂盒的制备。

为了检测样品中是否存在相应的细胞因子，制备固定有针对于如下蛋白质的特异性抗体的玻片：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、干扰素γ（IFNgamma）、白介素2（IL-2）、白介素4（IL-4）、白介素5（IL-5）、白介素6（IL-6）、白介素8（IL-8）、白介素10（IL-10）、白介素13（IL-13）、肿瘤坏死因子α（TNFalpha）。

1、抗体的制备：

采用针对表1中所列蛋白质的特异性抗体，抗体的来源、浓度、及其针对的蛋白质名称均在表1详细说明：

表1特异性抗体所针对的抗原蛋白质名称，抗体的来源、浓度信息

2、抗体芯片的制备与保存

将100-1000pl的含0.02-2ng的特异性的抗体的PBS缓冲液（含有0.01-10g/100ml牛白蛋白）用全自动点样仪点样于玻片上。具体的芯片点阵示意图如图2所示，生物素标记的牛IgG作为阳性对照。每种抗体还有两种不同浓度的阳性对照在每个芯片中都有四次的重复。在本实施例中芯片点阵采用如图2所示的排布方式，但事实上，在其他实施例中，用于点样的芯片点阵还可以以其他方式的排布方式进行组合，并不局限于如图所表示的形式。每张玻片上有16个相同的芯片点阵。将点样好的玻片放于室温条件下静置过夜，然后在干燥器中抽气干燥2小时。

干燥后的玻片装上特殊设计的16孔框架，把一张玻片分割成16个互不干扰的小区。所述的框架结构由三部分组成：上层塑料硬框，下层软乳胶片，和两侧的塑料夹板；通过两侧的塑料夹板将上层塑料硬框与下层软乳胶片紧扣在玻片上，形成矩阵为2×8的16孔抗体芯片；框架的每个孔的尺寸大小与常规ELISA的96孔板的孔间距相符，以致适用于标准ELISA系统的自动化操作。用粘性膜封闭框架后，把整张芯片用不透气的小袋封装然后于2℃到8℃保存备用。

本实施例中，全自动点样仪为美国伯乐公司或铂金艾尔默公司生产的产品；玻片为美国康宁公司产品。当然，在发明技术方案的上述步骤中，仪器和材料的采用并不局限于本实施例的列举，而是以能够解决本发明的技术问题，并实现相应的技术效果为依据。

3、细胞因子标准品的制备：

采用针对表2中所列重组蛋白质的的来源、浓度、及其针对的蛋白质名称均在表2详细说明：

表2：细胞因子标准品中重组蛋白的名称，来源、以及浓度信息

将以上各个重组蛋白质用含0.1％小牛白蛋白的磷酸缓冲液稀释后按照一定的量混合在一起，分装后用冷冻干燥法干燥并于－80℃保存。在本实施例中，用于做标准曲线用的每种重组蛋白的最终使用浓度如表3所示。但事实上，在其他实施例中，用于做标准曲线的重组蛋白浓度可以选用不同的区间，并不局限于表3的实施例。

实施例3：用本发明的试剂盒定量检测细胞因子的实验。

1、玻片芯片的完全干燥

将玻片芯片从盒子中取出来，在室温平衡20-30min后，将包装袋打开，揭开密封条，然后将芯片放在真空干燥器或者室温干燥1-2小时。

2、按图3中所示方式对细胞因子标准品梯度进行梯度稀释

2.1、添加500μl的样品稀释液到细胞因子标准混合物的小管中，重新溶解标准品。打开小管前，先快速的离心，轻轻的上下抽打溶解粉末，标记这个小管为Std1。

2.2、分别标记6个干净的离心管为Std2、Std3到Std7，添加200μl的样品稀释液到每个小管中。

2.3、抽取100μl的Std1加入到Std2中轻轻混合，然后从Std2中抽取100μl加入到Std3中，如此梯度稀释至Std7。

2.4、抽取100μl的样品稀释液到另一个新的离心管中，标记为CNTRL，作为阴性对照。

注：因为每种细胞因子的起始浓度是不同的，所以Std1到Std7的梯度稀释后，每个细胞因子的系列浓度是不同的，本实施例中，梯度重组蛋白稀释液的浓度如表3所示。

表3：经梯度稀释后用于作标准曲线的重组细胞因子标准品的浓度(pg/ml)

3、芯片操作流程

3.1、每个孔中加100μl的样品稀释液，室温摇床上孵育30分钟，封闭定量抗体芯片。

3.2、抽去每个孔中的缓冲液，添加100μl的标准液和样品到孔中，在摇床上4℃过夜孵育。

注：不同样品的加样量不一样：血浆、血清使用前用样品稀释液1：1稀释；细胞上清液可用原液；细胞或组织裂解液经蛋白浓度测定后加入50－500ug/ml的量。

3.3、清洗

抽去每个孔中的标准品或样品，1从洗液I清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液I，每次清洗要抽干净洗液，用去离子水稀释20×洗液I。

抽去每个孔中的1×洗液I，加入1×洗液II清洗2次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液II，每次清洗要抽干净洗液，用去离子水稀释20×洗液II。

3.4检测抗体混合物的孵育

离心检测抗体混合物小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μl的检测抗体到每个孔中，室温摇床上孵育2小时。

2.3.5清洗

抽去每个孔中的检测抗体，1×洗液I清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液I，每次清洗要抽干净洗液，然后加入1×洗液II清洗2次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液II，每次清洗要抽干净洗液。

2.3.6Cy3-链霉亲和素的孵育

离心Cy3-链霉亲和素小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μl的Cy3-链霉亲和素到每个孔中，用铝箔纸包住玻片避光孵育，室温摇床上孵育1个小时。

3.7清洗

抽去每个孔中的Cy3-链霉亲和素，1×洗液I清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液I，每次清洗要抽干净洗液。

3.8荧光检测

1）将玻片框架拆掉，小心不要用手接触到玻片印制抗体的一面。

2）将玻片放置在玻片清洗管中，添加约30ml的1×洗液I，能整个覆盖住玻片，在室温摇床上震荡15min，弃去1×洗液I，添加约30ml的1×洗液II，在室温摇床上震荡5min。

3）去除玻片的残留洗液。将玻片放置在玻片清洗管/干燥管中，不盖盖子，在1000rpm离心3min。

4）采用激光扫描仪例如Axon GenePix扫描信号，采用Cy3或者绿色通道（激发频率=532nm）。

2.3.9芯片的数据提取以及用分析软件来进行数据分析

1）用GenePix软件来读取生物芯片的荧光值。芯片的微阵列参数用6（行）x8（列），点的直径用120um。

2）读数后选用的数值为除掉地方背景的中间值读数（F532Median－LocalBackground）。用特定的定量芯片计算软件QAH-TH-1-SW来作每个重组蛋白的标准曲线如图4所示。

实施例4：定量芯片试剂盒检测细胞因子的数据分析。

在某次实验中使用本发明的芯片对八个未知样品的检测中标准品和样品的荧光读数分别如表4和5所示。

表4：三倍梯度稀释的标准品荧光读数(F532中值–局部背景)

表5：未知样品的荧光读数(F532中值–局部背景)

根据表3中各个标准重组蛋白的浓度和表4中相对应的荧光数值计算出表5中未知样品中各个细胞因子的浓度如表6所示。

表6：未知样品中细胞因子的浓度(pg/ml)

实施例5：实验体系交叉反应的测试。

抗体对间的交叉反应测试是根据以下方法进行的。不同芯片首先与单个抗原浓度为100ng/ml的不同抗原孵育，洗片后再与每种抗原相对应的检测抗体反应。最后经Cy3-链霉亲和素孵育，芯片扫描后读数。以每种抗原的捕获抗体为横轴，以加入的抗原和相对应的检测抗体为纵轴可以得到表7的实验结果。

表7：抗体对间的交叉反应测试结果

抗体\抗原	GM-CSF	IFNg	IL-10	IL-13	IL-2	IL-4	IL-5	IL-6	IL-8	TNFa
											GM-CSF	24258	22	12	31	27	29	40	43	31	43
IFNg	78	24333	30	60	55	60	80	96	79	107
											IL-10	58	31	21100	35	36	35	71	61	52	65
IL-13	112	102	47	34904	71	82	124	132	125	138
											IL-2	98	80	45	63	11021	67	102	115	100	122
IL-4	76	27	20	42	39	15998	66	67	53	71
											IL-5	130	67	38	81	65	77	49412	115	94	127
IL-6	127	90	46	76	65	81	129	26287	133	149
											IL-8	161	106	55	83	72	87	142	161	54535	159
TNFa	140	102	60	82	86	98	138	165	134	25753

实验结果表明每种抗体对可以特异地识别自己的检测抗原而与其他的抗原没有交叉反应。

实施例6：实验体系的检测精确度。

为了比较传统ELISA和定量芯片试剂盒对同一细胞因子的检测精确度，我们用同样IL-6的抗原-抗体对优化制备了IL-6的ELISA试剂盒。然后在相同的条件下用该IL-6ELISA试剂盒和定量芯片试剂盒检测了八个相同未知样品中IL-6的浓度。检测的结果如表8所示。

表8：用传统IL-6ELISA和定量芯片试剂盒检测的八个相同未知样品中IL-6的浓度

(pg/ml)	样本1	样本2	样本3	样本4	样本5	样本6	样本7	样本8
									IL-6ELISA	2	1	5	6	184	24	137	65
IL-6定量芯片	4	2	8	5	178	27	142	68

实验结果表明用定量芯片和单项ELISA对IL-6所检测的结果具有非常强的相关性(相关系数r=0.9975)。两者不仅具有相同的准确度，而且也有相似的检测灵敏度。

实施例7：实验体系的介质回收率。

该定量抗体芯片在不同样品介质中的适用程度通过测定介质回收率来显示。在5倍稀释的正常人血清H4522和细胞上清液中分别加入标准品1浓度一半的重组蛋白，然后计算样品的介质回收率=(介入样品的细胞因子浓度–对照样品的细胞因子浓度)/理论上介入的细胞因子浓度。实验显示该发明的试剂盒在人血清和细胞上清液中的回收率达80-128%。

表9：定量抗体芯片在不同介质中的回收率

细胞因子	样品数	血清	细胞上清液
				IL-2	6	99%	92%
IL-4	6	112%	99%
				IL-5	6	92%	88%
IL-6	6	80%	88%
				IL-8	6	128%	122%
IL-10	6	120%	94%
				IL-13	6	117%	84%
GM-CSF	6	107%	106%
				IFNg	6	100%	87%
TNFa	6	97%	88%

综上所述，本发明公开了一种改良的同时定量检测多个细胞因子的抗体芯片试剂盒。该试剂盒一方面克服了常规ELISA在细胞因子检测中的检测指标单一、耗时、耗力、耗材等缺点，同时也克服了现有多因子检测技术中的低通量，重复性差等弱点。该系统使用标准组织玻片作为表面载体，可以在玻片表面完成多重夹心ELISA的反应。同时抗体芯片的规格符合标准96孔酶标板的尺寸，使得高通量样品操作成为可能。另外，我们也证实用该发明所检测的细胞因子的浓度可以达到单个ELISA的检测灵敏度和精确度。最后，通过对该芯片在不同样品中介质回收率的测定确准该发明的芯片试剂盒可以运用于血清，细胞上清液等不同的生物样品。

除此以外，本发明的试剂盒还有其重要的临床应用价值。人机体抵抗外源物质入侵有两种基本的免疫反应：由Th1细胞因子介导细胞免疫反应和Th2细胞因子介导的体液免疫反应。Th1细胞主要分泌γ-干扰素（IFN-γ）、白细胞介素-2（IL-2）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）；而Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10及IL-13等因子。在正常的机体内，Th1/Th2之间存在着交互调节而达到一定的平衡。但在疾病状态下，这一平衡将被破坏而向一极偏移。Th1细胞因子功能亢进将导致炎症反应、器官特异性自身免疫病、急性排斥反应和接触性皮炎等；而Th2细胞因子功能亢进将导致特异性过敏反应，参与高IgE综合症和嗜酸性粒细胞增多症等。通过同时检测T细胞分泌的这十个细胞因子可以用来判断机体所介导的免疫反应是Th1型细胞介导的免疫反应（干扰素γ、白介素-2，肿瘤坏死因子α等）还是Th2型体液介导的免疫反应（白介素4、白介素6、白介素10等）以达到辅助临床疾病诊断的效果。

应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.一种改良的同时定量检测多个细胞因子的抗体芯片试剂盒，其特征在于：

反应装置包括固相载体，为用活性氨基包被的标准组织玻片；在一张玻片表面用非接触性点样仪将多种抗原特异性抗体通过微阵列的方式点有2×8个相同的抗体微阵列，将点有2×8个抗体微阵列的标准组织玻片用可拆装的2×8孔框架结构把玻片分割成16个互不干扰的小区，每个小区含有一个抗体微阵列；

反应剂包括：抗体混合液，所述抗体混合液为所述若干种特异性抗体的混合溶液，抗体混合液中的特异性抗体上标记有生物素；识别生物素标记的链霉亲和素，所述链霉亲和素标记有荧光染料，所述荧光染料为Cy3或具有类似吸收波长的荧光染料；细胞因子标准品，包含若干种所述的细胞因子的具有梯级浓度的混合物。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的框架结构由三部分组成：上层塑料硬框，下层软乳胶片，和两侧的塑料夹板；通过两侧的塑料夹板将上层塑料硬框与下层软乳胶片紧扣在玻片上，形成矩阵为2×8的16孔抗体芯片；框架的每个孔的尺寸大小与常规ELISA的96孔板的孔间距相符，以致适用于标准ELISA系统的自动化操作。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的多种抗原特异性抗体是细胞-巨噬细胞集落刺激因子、干扰素γ、白介素-2、白介素4、白介素5、白介素6、白介素8、白介素10、白介素13和肿瘤坏死因子α这10种T细胞分泌因子的特异性抗体。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：每种特异性抗体的点样浓度分别为200ug/ml；每个捕获抗体在每个抗体微阵列中有四次的重复。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：每种特异性抗体的点样液为含有0.01-10g/100ml牛白蛋白的PBS缓冲液。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：芯片处理完成后，拆除可拆装的框架，玻片由含Cy3通道的激光扫描仪扫描成像，所成的像用芯片读数软件将每个点的荧光信号转化为数码信号，再通过与细胞因子标准曲线的对应关系，定量测出样品中细胞因子的浓度。