CN113917158A - 一种细胞因子检测试剂盒的开发方法 - Google Patents
一种细胞因子检测试剂盒的开发方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113917158A CN113917158A CN202111161454.3A CN202111161454A CN113917158A CN 113917158 A CN113917158 A CN 113917158A CN 202111161454 A CN202111161454 A CN 202111161454A CN 113917158 A CN113917158 A CN 113917158A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- detection kit
- solution
- liquid
- testing
- microspheres
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 title claims abstract description 26
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 title claims abstract description 26
- 238000011161 development Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 claims abstract description 42
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 claims abstract description 41
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 29
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 22
- 239000000047 product Substances 0.000 claims abstract description 18
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 15
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 claims description 9
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 7
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 claims description 6
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 claims description 6
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 6
- 238000011033 desalting Methods 0.000 claims description 6
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 6
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 claims description 6
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 5
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 claims description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 claims description 3
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 3
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 claims description 3
- 229960001008 heparin sodium Drugs 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- RPENMORRBUTCPR-UHFFFAOYSA-M sodium;1-hydroxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].ON1C(=O)CC(S([O-])(=O)=O)C1=O RPENMORRBUTCPR-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 claims 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 abstract 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229940047120 colony stimulating factors Drugs 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
- G01N33/6869—Interleukin
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/52—Assays involving cytokines
- G01N2333/54—Interleukins [IL]
- G01N2333/5412—IL-6
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明公开了一种细胞因子检测试剂盒的开发方法。本发明中，加入封闭液，使用涡旋振荡机对其进行涡旋振荡处理，之后使用超声震荡机对其进行超声震荡处理结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；之后就可以结束标记抗体的过程；试产品各组分的形式及保存稳定性；测试各组分的保存形式，以及在2‑8度下的稳定性，未开封应至少保存18个月，开封后保存30天，从而完成细胞因子检测试剂盒的开发；实现自主标记微球、搭配组合检测因子，形成适应市场需求的产品，为进入临床市场打下基础，并在国内同行业中处于领先地位；与商品化的产品相比，在准确度、灵敏度、特异性、稳定性、检测因子数量等方面接近或达到国内外厂家的领先水平。
Description
技术领域
本发明属于细胞因子技术领域，具体为一种细胞因子检测试剂盒的开发方法。
背景技术
细胞因子是指由免疫细胞(如T细胞、B细胞、NK细胞等)和某些非免疫细胞(内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等)经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质。细胞因子可被分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等，具有调节固有免疫和适应性免疫、血细胞生成、细胞生长以及损伤组织修复等多种功能。检测细胞因子水平可用来监测人体的免疫状态，辅助各类疾病(如炎症、肿瘤、自身免疫病和移植排斥等)的诊断及预后。但由于检测的细胞因子较多，如果采用单个因子检测，需要大量的样本，且总的操作时间较长，影响临床诊断出具报告的及时性。当前检测多因子的仪器有Luminex和流式，采用的编码微球有磁性和非磁性两种，磁性的微球为粒径相同的二维荧光编码微球，通过两种不同的荧光染料组合进行区分，理论上可同时检测数百种因子，非磁性的微球通常为2种不同粒径的一维荧光编码微球，可检测几十种因子。
但是常见的检测试剂盒在准确度、灵敏度、特异性方面都不够高，从而使得检测时不够精确。
发明内容
本发明的目的在于：为了解决上述提出的问题，提供一种细胞因子检测试剂盒的开发方法。
本发明采用的技术方案如下：一种细胞因子检测试剂盒的开发方法，所述细胞因子检测试剂盒的开发方法包括以下步骤：
S1:查找合适的荧光编码微球；根据拟开发产品所检测的因子数量及适用仪器，确定合适的荧光编码微球；
S2:摸索微球标记抗体的方法；取来离心机和50μl微球，将微球加入到离心机的内部，开始对微球进行离心操作，离心过程结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；
S3:加入80μl 50mM且pH为5.0MES溶液，涡旋振荡20秒，超声20秒，加入10μl 50mg/ml EDC和10μl 50mg/ml sulfo-NHS，涡旋振荡混匀；
S4:室温避光振荡孵育20分钟，孵育结束后，1000×g离心10分钟，弃上清
S5:加入50mMMES重悬沉淀，使用涡旋振荡机对其进行涡旋振荡处理，之后使用超声震荡机对其进行超声震荡处理结束之后，将微球溶液加入到离心机的内部，对其进行离心处理，离心过程结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；之后使用清水再对溶液重复洗涤一次备用；
S6:取70～～90μl抗人IL-6抗体，加入脱盐柱脱盐一次；
S7:将脱盐后的IL-6抗体加入微球中，使用涡旋振荡机对其进行涡旋振荡处理，等其混合均匀之后，室温避光振荡孵育2小时；
S8:加入封闭液，使用涡旋振荡机对其进行涡旋振荡处理，之后使用超声震荡机对其进行超声震荡处理结束之后，将微球溶液加入到离心机的内部，对其进行离心处理，离心过程结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；
S9:筛选标准品稀释液，测试样本类型，确定线性范围、最低检测限，测试准确度筛选标准品稀释液，测试不同的样本类型，使检测结果的相对偏差在±15％以内；确定线性范围和最低检测限；
S10:测试重复性、分析特异性测试标曲变异系数，应小于15％；
S11:降低多个因子组合后的干扰影响；测试每个因子单独检测和组合检测，对结果的影响，并根据结果进行优化，使干扰影响降至最低；
S12:测试产品各组分的形式及保存稳定性；测试各组分的保存形式，以及在2-8度下的稳定性，未开封应至少保存18个月，开封后保存30天，从而完成细胞因子检测试剂盒的开发。
在一优选的实施方式中，所述步骤S3中，旋振荡的时间为35秒，超声处理的时间为30秒，离心的速度控制为1200xg。
在一优选的实施方式中，所述步骤S8中，用封闭液离心洗涤两次备用之后加入250～～300μl封闭液重悬，流式上机计数。
在一优选的实施方式中，所述步骤S9中，不同的样本类型包括如血清、血浆、EDTA抗凝、肝素钠抗凝、柠檬酸钠抗凝。
在一优选的实施方式中，所述步骤S10中，测试每个因子受样本干扰因素的影响，如甘油三酯应小于等于10mM、血红蛋白应小于等于5.0mg/ml、胆红素应小于等于10mM258μM。
在一优选的实施方式中，所述步骤S5中，旋振荡的时间为40秒，超声处理的时间为25秒，离心的速度控制为900xg。
在一优选的实施方式中，所述步骤S8中，封闭液为99.88％PBS溶液、0.1％BSA溶液和0.02％Tween20溶液的混合物，离心洗涤的速率为控制为1000xg。
在一优选的实施方式中，所述步骤S9中，封闭液为99.88％PBS溶液、0.1％BSA溶液和0.02％Tween20溶液的混合物，离心洗涤的速率为控制为1000xg。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明中，实现自主标记微球、搭配组合检测因子，形成适应市场需求的产品，为进入临床市场打下基础，并在国内同行业中处于领先地位；与商品化的产品相比，在准确度、灵敏度、特异性、稳定性、检测因子数量等方面接近或达到国内外厂家的领先水平。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例：
一种细胞因子检测试剂盒的开发方法，其特征在于：所述细胞因子检测试剂盒的开发方法包括以下步骤：
S1:查找合适的荧光编码微球；根据拟开发产品所检测的因子数量及适用仪器，确定合适的荧光编码微球；
S2:摸索微球标记抗体的方法；取来离心机和50μl微球，将微球加入到离心机的内部，开始对微球进行离心操作，离心过程结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；
S3:加入80μl 50mM且pH为5.0MES溶液，涡旋振荡20秒，超声20秒，加入10μl 50mg/ml EDC和10μl 50mg/ml sulfo-NHS，涡旋振荡混匀；所述步骤S3中，旋振荡的时间为35秒，超声处理的时间为30秒，离心的速度控制为1200xg；
S4:室温避光振荡孵育20分钟，孵育结束后，1000×g离心10分钟，弃上清
S5:加入50mMMES(pH5.0)重悬沉淀，使用涡旋振荡机对其进行涡旋振荡处理，之后使用超声震荡机对其进行超声震荡处理结束之后，将微球溶液加入到离心机的内部，对其进行离心处理，离心过程结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；之后使用清水再对溶液重复洗涤一次备用；步骤S5中，旋振荡的时间为40秒，超声处理的时间为25秒，离心的速度控制为900xg；
S6:取70～～90μl抗人IL-6抗体(500μg/ml)，加入脱盐柱脱盐一次；
S7:将脱盐后的IL-6抗体加入微球中，使用涡旋振荡机对其进行涡旋振荡处理，等其混合均匀之后，室温避光振荡孵育2小时；
S8:加入封闭液，使用涡旋振荡机对其进行涡旋振荡处理，之后使用超声震荡机对其进行超声震荡处理结束之后，将微球溶液加入到离心机的内部，对其进行离心处理，离心过程结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；之后就可以结束标记抗体的过程；步骤S8中；
S9:筛选标准品稀释液，测试样本类型，确定线性范围、最低检测限，测试准确度筛选标准品稀释液，测试不同的样本类型，使检测结果的相对偏差在±15％以内；确定线性范围和最低检测限；步骤S9中，不同的样本类型包括如血清、血浆、EDTA抗凝、肝素钠抗凝、柠檬酸钠抗凝；步骤S9中，封闭液为99.88％PBS溶液、0.1％BSA溶液和0.02％Tween20溶液的混合物，离心洗涤的速率为控制为1000xg；
S10:测试重复性、分析特异性测试标曲变异系数(CV)，应小于15％；步骤S10中，测试每个因子受样本干扰因素的影响，如甘油三酯应小于等于10mM、血红蛋白应小于等于5.0mg/ml、胆红素应小于等于10mM258μM；
S11:降低多个因子组合后的干扰影响；测试每个因子单独检测和组合检测，对结果的影响，并根据结果进行优化，使干扰影响降至最低；
S12:测试产品各组分的形式及保存稳定性；测试各组分的保存形式，以及在2-8度下的稳定性，未开封应至少保存18个月，开封后保存30天，从而完成细胞因子检测试剂盒的开发。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (8)
1.一种细胞因子检测试剂盒的开发方法，其特征在于：所述细胞因子检测试剂盒的开发方法包括以下步骤：
S1:查找合适的荧光编码微球；根据拟开发产品所检测的因子数量及适用仪器，确定合适的荧光编码微球；
S2:摸索微球标记抗体的方法；取来离心机和50μl微球，将微球加入到离心机的内部，开始对微球进行离心操作，离心过程结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；
S3:加入80μl 50mM且pH为5.0MES液，涡旋振荡20秒，超声20秒，加入10μl 50mg/ml EDC和10μl 50mg/ml sulfo-NHS，涡旋振荡混匀；
S4:孵育结束后，1000×g离心10分钟，弃上清；
S5:加入50mMMES重悬沉淀，使用涡旋振荡机对其进行涡旋振荡处理，之后使用超声震荡机对其进行超声震荡处理结束之后，将微球液加入到离心机的内部，对其进行离心处理，离心过程结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；之后使用清水再对液重复洗涤一次备用；
S6:取70～～90μl抗人IL-6抗体，加入脱盐柱脱盐一次；
S7:将脱盐后的IL-6抗体加入微球中，使用涡旋振荡机对其进行涡旋振荡处理，等其混合均匀之后，室温避光振荡孵育2小时；
S8:加入封闭液，使用涡旋振荡机对其进行涡旋振荡处理，之后使用超声震荡机对其进行超声震荡处理结束之后，将微球液加入到离心机的内部，对其进行离心处理，离心过程结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；之后就可以结束标记抗体的过程；
S9:筛选标准品稀释液，测试样本类型，确定线性范围、最低检测限，测试准确度筛选标准品稀释液，测试不同的样本类型，使检测结果的相对偏差在±15％以内；确定线性范围和最低检测限；
S10:测试重复性、分析特异性测试标曲变异系数，应小于15％；
S11:降低多个因子组合后的干扰影响；测试每个因子单独检测和组合检测，对结果的影响，并根据结果进行优化，使干扰影响降至最低；
S12:测试产品各组分的形式及保存稳定性；测试各组分的保存形式，以及在2-8度下的稳定性，未开封应至少保存18个月，开封后保存30天，从而完成细胞因子检测试剂盒的开发。
2.如权利要求1所述的一种细胞因子检测试剂盒的开发方法，其特征在于：所述步骤S3中，旋振荡的时间为35秒，超声处理的时间为30秒，离心的速度控制为1200xg。
3.如权利要求1所述的一种细胞因子检测试剂盒的开发方法，其特征在于：所述步骤S8中，用封闭液离心洗涤两次备用之后加入250～～300μl封闭液重悬，流式上机计数。
4.如权利要求1所述的一种细胞因子检测试剂盒的开发方法，其特征在于：所述步骤S9中，不同的样本类型包括如血清、血浆、EDTA抗凝、肝素钠抗凝、柠檬酸钠抗凝。
5.如权利要求1所述的一种细胞因子检测试剂盒的开发方法，其特征在于：所述步骤S10中，测试每个因子受样本干扰因素的影响，如甘油三酯应小于等于10mM、血红蛋白应小于等于5.0mg/ml、胆红素应小于等于10mM258μM。
6.如权利要求1所述的一种细胞因子检测试剂盒的开发方法，其特征在于：所述步骤S5中，旋振荡的时间为40秒，超声处理的时间为25秒，离心的速度控制为900xg。
7.如权利要求1所述的一种细胞因子检测试剂盒的开发方法，其特征在于：所述步骤S8中，封闭液为99.88％PBS溶液、0.1％BSA溶液和0.02％Tween20溶液的混合物，离心洗涤的速率为控制为1000xg。
8.如权利要求1所述的一种细胞因子检测试剂盒的开发方法，其特征在于：所述步骤S9中，封闭液为99.88％PBS溶液、0.1％BSA溶液和0.02％Tween20溶液的混合物，离心洗涤的速率为控制为1000xg。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111161454.3A CN113917158B (zh) | 2021-09-30 | 2021-09-30 | 一种细胞因子检测试剂盒的开发方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111161454.3A CN113917158B (zh) | 2021-09-30 | 2021-09-30 | 一种细胞因子检测试剂盒的开发方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113917158A true CN113917158A (zh) | 2022-01-11 |
| CN113917158B CN113917158B (zh) | 2024-03-29 |
Family
ID=79237448
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111161454.3A Active CN113917158B (zh) | 2021-09-30 | 2021-09-30 | 一种细胞因子检测试剂盒的开发方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113917158B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114720684A (zh) * | 2022-04-01 | 2022-07-08 | 武汉爱博泰克生物科技有限公司 | 一种白介素细胞因子多重流式荧光检测试剂盒、检测方法及应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030008410A1 (en) * | 1995-03-13 | 2003-01-09 | Hechinger Mark K. | Immunoassay apparatus, kit and methods |
| CN101201357A (zh) * | 2007-11-05 | 2008-06-18 | 广州益善生物技术有限公司 | 一种用于乳腺癌早期诊断的液相芯片试剂盒及其制备方法 |
| CN104111329A (zh) * | 2013-04-17 | 2014-10-22 | 广州瑞博奥生物科技有限公司 | 一种改良的同时定量检测多个细胞因子的抗体芯片试剂盒 |
| CN108027373A (zh) * | 2015-07-13 | 2018-05-11 | 佰欧迪塞克斯公司 | 受益于阻断t细胞程序性细胞死亡1(pd-1)检查点蛋白的配体活化的抗体药物的黑素瘤患者的预测性测试和分类器开发方法 |
| WO2021036105A1 (zh) * | 2019-08-30 | 2021-03-04 | 广州中科蓝华生物科技有限公司 | 一种用于分析CD1c+树突状细胞亚群表型和功能的组合配方试剂盒及其应用 |
-
2021
- 2021-09-30 CN CN202111161454.3A patent/CN113917158B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030008410A1 (en) * | 1995-03-13 | 2003-01-09 | Hechinger Mark K. | Immunoassay apparatus, kit and methods |
| CN101201357A (zh) * | 2007-11-05 | 2008-06-18 | 广州益善生物技术有限公司 | 一种用于乳腺癌早期诊断的液相芯片试剂盒及其制备方法 |
| CN104111329A (zh) * | 2013-04-17 | 2014-10-22 | 广州瑞博奥生物科技有限公司 | 一种改良的同时定量检测多个细胞因子的抗体芯片试剂盒 |
| CN108027373A (zh) * | 2015-07-13 | 2018-05-11 | 佰欧迪塞克斯公司 | 受益于阻断t细胞程序性细胞死亡1(pd-1)检查点蛋白的配体活化的抗体药物的黑素瘤患者的预测性测试和分类器开发方法 |
| WO2021036105A1 (zh) * | 2019-08-30 | 2021-03-04 | 广州中科蓝华生物科技有限公司 | 一种用于分析CD1c+树突状细胞亚群表型和功能的组合配方试剂盒及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 华碧春;陈小峰;杜建;林久茂;郑良朴;: "补肾B方对老龄SD大鼠细胞因子表达的调节作用", 中华中医药学刊, no. 06 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114720684A (zh) * | 2022-04-01 | 2022-07-08 | 武汉爱博泰克生物科技有限公司 | 一种白介素细胞因子多重流式荧光检测试剂盒、检测方法及应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113917158B (zh) | 2024-03-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bernard et al. | Continuous-flow system for automation of latex immunoassay by particle counting. | |
| Zicha et al. | Chemotaxis of macrophages is abolished in the Wiskott‐Aldrich syndrome | |
| CN110007074B (zh) | 用于检测c反应蛋白的试剂盒、其制备方法及用途 | |
| CN111337691B (zh) | 一种灵敏、稳定的血清降钙素原测定试剂盒及其制备方法和应用 | |
| CN107942069A (zh) | 一种ngal胶乳免疫比浊法检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN113917158A (zh) | 一种细胞因子检测试剂盒的开发方法 | |
| JP2020146039A (ja) | 抗ｍｒｊｐ４モノクローナル抗体ペア、ｍｒｊｐ４検出用ｅｌｉｓａキット及び金コロイド免疫検出テストストリップ | |
| Matsuura et al. | Comparison of the tube test and column agglutination techniques for anti‐A/‐B antibody titration in healthy individuals | |
| CN107167589A (zh) | 一种快速检测血液中肝素结合蛋白浓度的方法 | |
| CN102809654A (zh) | 一种双粒子复合的c-反应蛋白检测试剂盒 | |
| CN110982793A (zh) | 一种体外筛选体内抗菌活性噬菌体的方法 | |
| CN112858698B (zh) | 一种d-二聚体胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法 | |
| CN110887967B (zh) | 一种检测抗体结合能力的方法及其应用 | |
| CN106198962A (zh) | 用于封闭生物磁珠的方法 | |
| CN111912990B (zh) | 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒 | |
| CN117470819A (zh) | 自身免疫性肌炎病检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN113125741A (zh) | 降钙素原的检测试剂、试剂盒、系统及检测方法 | |
| CN116593709A (zh) | 一种基于乳胶增强免疫比浊法测定oxLDL的试剂盒及其制备方法 | |
| KR20010025027A (ko) | 면역측정시약 및 면역측정법 | |
| CN116482375A (zh) | 人膜性肾病相关指标检测试剂盒及其制备方法和使用方法 | |
| CN110887961A (zh) | 一种用于抗体筛选的固相载体及试剂盒 | |
| CN111426845B (zh) | 一种血清载脂蛋白b测定试剂盒及其制备方法和应用 | |
| CN112574302B (zh) | 杂交瘤细胞lcz8a3及其分泌的单克隆抗体和应用 | |
| CN109541225A (zh) | 一种检测乙型肝炎病毒e抗原试剂盒及其制备方法 | |
| Moore et al. | Reappraisal of an Auto Analyzer Haemagglutination System for Anti‐D Quantification |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |