CN102539740A - 可同时检测80种自身抗体的蛋白质芯片和方法 - Google Patents

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Abstract

可同时检测80种自身抗体的蛋白质芯片和方法，它涉及一种检测自身抗体的芯片和检测方法。它的检测装置是由玻片、橡胶分隔片和金属固定夹组成，橡胶分隔片设置在玻片上方，两侧分别插入金属固定夹的凹槽中，将芯片和橡胶分隔片固定在一起。它的检测方法为：1、玻片表面硝酸纤维素膜的活化；2、抗原蛋白与生物素交联：增加抗原的结合强度和灵活度；3、制备抗原芯片；4、利用抗原芯片检测微量血液标本中多种自身抗体；5、数据分析。它可同时检测80种自身抗体，操作简便，可自动进行标准化校正，并生成各自身抗体信号强度的图表。

Description

可同时检测80种自身抗体的蛋白质芯片和方法
技术领域：
本发明涉及一种检测自身抗体的芯片和检测方法，具体涉及一种可同时检测80种自身抗体的蛋白质芯片和方法。
背景技术：
自身抗体为人体内出现的针对自体蛋白质(或称自身抗原)的抗体。自身抗体的出现通常预示着机体免疫系统出现异常状况，不能正确识别和处理凋亡坏死的自身抗原物质，从而产生针对自身抗原的抗体。自身抗体的出现与多种疾病的发生发展有密切关系，特别是自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、多发性硬化、强直性脊柱炎等，自身抗体在疾病发展的早期即可以出现在血液中，随着病情的发展，自身抗体的种类和滴度不断增加。因此，测定体内自身抗体的种类和水平对疾病的早期诊断、病情监测以及预后判定都有重要意义。传统检测自身抗体方法为基于微孔板的酶联免疫检测法(ELISA)，或基于微球载体的免疫荧光检测技术，这些技术的缺点是检测的自身抗体数量有限(一般不超过10种)，且需要较大量的样本(一般需要100μL血清)。近年虽有应用蛋白质芯片技术检测自身抗体的方法和产品问世，但一般仅能检测8种自身抗体。能同时检测十种以上自身抗体的蛋白质芯片和技术目前尚未成熟。
发明内容：
本发明的目的是提供一种可同时检测80种自身抗体的蛋白质芯片和方法，它可同时检测80种自身抗体，用生物素标记抗原为内参，利用橡胶分隔片和玻片固定夹，可在一张芯片上同时检测16个生物样本，操作简便、节省样本和时间，可自动进行标准化校正，并生成各自身抗体信号强度的图表。
为了解决背景技术所存在的问题，本发明采用以下技术方案：它的检测装置是由玻片、橡胶分隔片和金属固定夹组成，橡胶分隔片设置在玻片上方，两侧分别插入金属固定夹的凹槽中，将芯片和橡胶分隔片固定在一起。
它的检测方法为：1、玻片表面硝酸纤维素膜的活化；2、抗原蛋白与生物素交联：增加抗原的结合强度和灵活度；3、制备抗原芯片；4、利用抗原芯片检测微量血液标本中多种自身抗体；5、数据分析。
所述的玻片上有16个硝酸纤维素膜包被的区域，玻片用亲合素溶液浸泡处理，用蛋白点样仪将80种自身抗原和6种对照蛋白打印在亲合素处理后的玻片上制作成自身抗原芯片，每张芯片上含有16个蛋白微阵列区。
所述的橡胶分隔片厚度约1mm，大小和玻片一致，分隔片上有16个孔，孔的位置和孔径与抗原点样区相当，将橡胶分隔片覆盖在芯片表面，抗原点样区位于各个孔的正中位置。
本发明精选80种目前已经临床证实的与自身免疫性疾病相关的自身抗体，首先选择与这些自身抗体相对应的抗原(蛋白质)，通过蛋白质交联技术，将抗原蛋白和生物素(Biotin)联接，然后利用微阵列技术，用微阵列点样仪将生物素化的抗原固定于包被了亲和素(Streptavidin)的玻片载体上。每张玻片(25mm×73mm)被划分为16个区块，每个区块均含有70种自身抗原和8种对照蛋白，每种蛋白均重复两次。因此，每张芯片均含有16个包含了80种自身抗原和8种对照蛋白的蛋白质微阵列，可同时检测16个样本。检测装置为一个有16个孔的橡胶分隔垫片和两个固定夹，橡胶分隔垫片与玻片大小一致，其孔的位置和大小与玻片上16个蛋白点样区的位置符合。检测时，首先将橡胶分隔片放置于玻片表面，用固定夹将玻片和橡胶分隔片固定在一起，将1μL样本与50μL样本稀释剂混合后，加入橡胶分隔片的孔中进行反应，60min后弃反应液，加入100μL洗涤液，振荡洗涤3次，每次5min。然后加入荧光素Cy3标记的亲合素和荧光素Cy5标记的羊抗人IgG抗体(1∶1000稀释)，室温反应60min，吸去反应液，加入洗涤液洗3次，除去固定夹和分隔垫片，将玻片浸入PBS缓冲液中漂洗30s，低速离心(500rpm)3min使玻片干燥。用激光扫描仪扫描玻片，扫描波长为535nm(Cy3)和632nm(Cy5)。图像用Genepix6.0软件分析，得出各点Cy3和Cy5的荧光强度，并以Cy3为内参算出各点的校正信号强度，然后用自身抗体分析软件，计算出各个自身抗体的平均强度。
本发明可同时检测80种自身抗体，用生物素标记抗原为内参，利用橡胶分隔片和玻片固定夹，可在一张芯片上同时检测16个生物样本，操作简便、节省样本和时间，可自动进行标准化校正，并生成各自身抗体信号强度的图表。
附图说明：
图1为本发明中玻片的结构示意图，
图2为本发明中处理后玻片的结构示意图，
图3为本发明中橡胶分隔片的结构示意图，
图4为本发明中金属固定夹的结构示意图，
图5为本发明检测装置的装配结构示意图。
具体实施方式：
参照图1-5，本具体实施方式采用以下技术方案：它的检测装置是由玻片1、橡胶分隔片2和金属固定夹3组成，橡胶分隔片2设置在玻片1上方，两侧分别插入金属固定夹3的凹槽中，将玻片1和橡胶分隔片2固定在一起。
它的检测方法为：1、玻片表面硝酸纤维素膜的活化：将玻片浸泡在一定浓度的亲合素(Streptavidin)溶液中，室温放置30min，取出后用PBS溶液洗一次，离心干燥，放4℃冰箱备用。
2、抗原蛋白与生物素交联：增加抗原的结合强度和灵活度。用Solulink ChromaLink试剂盒进行抗原蛋白和生物素分子的交联，将100μg抗原蛋白在交联液透析平衡，然后加入试剂Chromalin-biotin进行标记反应(室温90min)，将标记物过柱，去除游离的Chromalin-biotin，收集标记后的蛋白，进行蛋白定量并测定交联效率。
3、抗原芯片的制备：将抗原用抗原稀释剂稀释为1mg/mL，并转入384孔板中。用喷射式微阵列点样仪将抗原打印在玻片表面的NC膜上。每张玻片上点制16个膜块，每个膜块都含有80个抗原和8个对照蛋白，每个蛋白在每个膜块上重复两次。点样时湿度保持在75％。完成后室温放置2h，然后真空包装，4℃可保存两年。
4、利用抗原芯片检测微量血液标本中多种自身抗体：检测时，首先将芯片恢复至室温，然后将橡胶分隔片放置于玻片表面，使带有抗原的NC膜块位于分隔片的孔中。用固定夹将玻片和橡胶分隔片固定在一起。加入50μL封闭液于每孔中，室温封闭30min后吸去封闭液，将1μL样本与50μL样本稀释剂混合后，加入孔中进行反应，60min后吸去反应液，加入100μL洗涤液，振荡洗涤3次，每次5min。然后加入荧光素Cy3标记的亲合素和荧光素Cy5标记的羊抗人IgG抗体(1∶1000稀释)，室温反应60min，吸去反应液，加入洗涤液洗3次，除去固定夹和分隔垫片，将玻片浸入PBS缓冲液中漂洗30s，低速离心(500rpm)3min，使玻片干燥。用激光扫描仪扫描玻片，扫描波长为535nm(Cy3)和632nm(Cy5)，图像用Genepix6.0软件分析，得出各点Cy3和Cy5的荧光强度。
5、数据分析：用自身抗原芯片分析软件进行分析。首先每个抗原点荧光强度(Cy5)用内参(Cy3)进行标准化校正，然后每个抗原取平均值，即为抗原所对应抗体的表达强度。
所述的玻片上有16个硝酸纤维素膜包被的区域，玻片用亲合素溶液浸泡处理，用蛋白点样仪将80种自身抗原和6种对照蛋白打印在亲合素处理后的玻片上制作成自身抗原芯片，每张芯片上含有16个蛋白微阵列区。
所述的橡胶分隔片厚度约1mm，大小和玻片一致，分隔片上有16个孔，孔的位置与孔径与抗原打印区相当，将橡胶分隔片覆盖在芯片表面，抗原打印区位于各个孔的正中位置。
本具体实施方式可同时检测80种自身抗体，用生物素标记抗原为内参，利用橡胶分隔片和玻片固定夹，可在一张芯片上同时检测16个生物样本，操作简便、节省样本和时间，可自动进行标准化校正，并生成各自身抗体信号强度的图表。

Claims (4)

1.可同时检测80种自身抗体的蛋白质芯片和方法，其特征在于它的检测装置是由玻片(1)、橡胶分隔片(2)和金属固定夹(3)组成，橡胶分隔片(2)设置在玻片(1)上方，两侧分别插入金属固定夹(3)的凹槽中，将玻片(1)和橡胶分隔片(2)固定在一起。
2.根据权利要求1所述的可同时检测80种自身抗体的蛋白质芯片和方法，其特征在于它的检测方法为：1、玻片表面硝酸纤维素膜的活化：将玻片浸泡在一定浓度的亲合素溶液中，室温放置30min，取出后用PBS溶液洗一次，离心干燥，放4℃冰箱备用；2、抗原蛋白与生物素交联：增加抗原的结合强度和灵活度；3、制备抗原芯片：将抗原用抗原稀释液稀释为1mg/mL，并转入384孔板中，用喷射式微阵列点样仪将抗原点在玻片表面的NC膜上，每张玻片上分为16个膜块，每个膜块都含有80个抗原和8个对照蛋白，每个蛋白在每个膜块上重复点样两次，点样时湿度保持在75％，点样完毕后室温放置2h，然后真空包装；4、利用抗原芯片检测微量血液标本中多种自身抗体；5、数据分析：用自身抗原芯片分析软件进行分析。
3.根据权利要求1所述的可同时检测80种自身抗体的蛋白质芯片和方法，其特征在于所述的玻片上有16个硝酸纤维素膜包被的区域，玻片用亲合素溶液浸泡处理，用蛋白点样仪将80种自身抗原和6种对照蛋白点样在亲合素处理后的玻片上制作成自身抗原芯片，每张芯片上含有16个蛋白微阵列区。
4.根据权利要求1所述的可同时检测80种自身抗体的蛋白质芯片和方法，其特征在于所述的橡胶分隔片厚度约1mm，大小和玻片一致，分隔片上有16个孔，孔的位置和孔径与抗原点样区相当，将橡胶分隔片覆盖在芯片表面，抗原点样区位于各个孔的正中位置。
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