CN1338633A - 自身免疫性疾病联合诊断的蛋白质芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明自身免疫病联合诊断的蛋白质芯片涉及一种蛋白质芯片、制备方法及检测方法,是将自身免疫病各项指标相应的抗原以及阳性对照、阴性对照同时高密度点阵于固相载体上,蛋白质通过化学键连接于固相载体上而被固定,将所述蛋白质样品点阵于多样品微阵列生物芯片的同一个腔室内,使多样品微阵列生物芯片的每一个腔室均点阵了上述多项指标的抗原。具有仅仅通过一次反应即可得到多种指标的逐项反应结果,可以同时检测多个人份的多种自身免疫病指标,灵敏度高,特异性高,利于及早诊断,检测结果稳定,可靠性高,工艺简单,操作安全,对病人伤害小。不仅效率高而且降低了成本,从而使诊断费用降低,实用性强。
Description
技术领域
本发明自身免疫病联合诊断的蛋白质芯片属于生命科学领域。涉及一种蛋白质芯片、制备方法及检测方法，蛋白质芯片是在固态基底上有序排布的蛋白质或多肽阵列，以实现对蛋白质进行并行检测、识别、鉴定和诊断的器件。可广泛应用于生物学、医学及其相关领域。
背景技术
自身免疫性疾病(autoimmune diseases)是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。常见的自身免疫性疾病可分为非器官特异性和器官特异性两类，系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)等属于前者，重症肌无力、自身免疫性溶血性贫血等属于后者。自身免疫性疾病的起始原因和确切发病机制都不明确，病程一般较长，多呈反复发作和慢行性迁延的过程，任何年龄、性别均可发病，女性多见且有遗传倾向，易伴发于免疫缺陷病或恶性肿瘤。特别是非器官特异性自身免疫性疾病会导致全身多器官病变、损害，由此导致患者死亡。自身免疫性疾病是危害人类健康的重要疾病，目前尚无法根治，因此尽早发现以便及时对症治疗尤为重要。多数自身免疫病患者血清中都会出现针对自身抗原的自身抗体，且其与疾病的相关性已得到认可，所以这些自身抗体在自身免疫病的诊断和疗效评价方面都具有重要的意义。自身免疫病的常用检测指标有：检测系统性红斑狼疮的抗核抗体(抗双链DNA抗体，抗Sm抗体等)，检测类风湿性关节炎的类风湿因子(RF)，检测重症肌无力的抗乙酰胆碱受体(AchR)抗体，检测自身免疫性溶血性贫血的抗血细胞抗体，检测乔本甲状腺炎的抗甲状腺球蛋白及微粒体抗体等。然而，上述指标尚有不足之处，因为在一些所谓的器官特异性自身免疫性疾病患者血清中也可检测出非病变组织的特异性抗体，如在乔本甲状腺炎患者血清中，可同时检出抗甲状腺球蛋白抗体、抗核抗体，甚至类风湿因子。在临床实践中也常见到二种以上的自身免疫病相重叠或混合出现的情况，如类风湿关节炎与系统性红斑狼疮并存，系统性硬化症可合并肌炎等。按照传统的方法，容易出现误诊或漏诊。
目前临床上用免疫细胞化学技术检查相应抗体作为自身免疫病诊断的重要依据之一。具体地说，该方法分为直接法和间接法。直接法首先要将待检测组织进行组织切片、固定后，将适当稀释的针对自身抗体的荧光抗原滴加到标本上，洗涤后用荧光显微镜观察；间接法是预先制备好抗原切片，加待测病人血清杂交，反应后再加荧光二抗，洗涤后用荧光显微镜观察。
免疫细胞化学技术诊断自身免疫疾病的常用方法存在一定的缺陷：第一，组织切片操作烦琐，费时费力，尤其是直接法，需要对病人进行组织活检，伤害较大；第二，直接法敏感性较差，且一种荧光抗原只能检查一种抗体，尤其是非器官特异性自身免疫性疾病，需要多项指标综合判断；而间接法虽然敏感性略有提高，但操作繁琐，且特异性不高。第三，由于这两种方法依赖于检测人员对显微镜下组织的观察，因此对技术要求极高，增加了结果的风险性。第四，采用传统技术，一张载玻片上只能对一个病人进行检测，且检测指标有限。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可多指标同时检测的蛋白质芯片，以及芯片的制备方法和检测方法，把多种自身免疫病指标的抗原同时点阵于蛋白质芯片上，仅仅通过一次反应即可得到多种指标的逐项反应结果，从而大大提高检测的速度和效率。
本发明的目的可通过下述技术方案实现：采用多样品微阵列生物芯片技术，可以同时检测多个人份的多种自身免疫性疾病，自身免疫性疾病联合诊断的蛋白质芯片，是把蛋白质样品点阵于固相载体上，蛋白质样品的点样阵列设计成多样品微阵列生物芯片，所述蛋白质样品是指自身免疫病各项指标的抗原以及阳性对照、阴性对照，将其点阵于多样品微阵列生物芯片的同一个腔室内，使多样品微阵列生物芯片的每一个腔室均点阵了上述多项指标的抗原。
其中，自身免疫病的检测指标为所有已知的自身抗体，主要有：抗核抗体(抗双链DNA抗体，抗Sm抗体等)，类风湿因子(RF)，抗乙酰胆碱受体(AchR)抗体，抗血细胞抗体，抗甲状腺球蛋及微粒体抗体等。在固相载体上点阵的抗原为纯化的、能与上述抗体特异性结合的特征性抗原。
在上述技术方案基础上，可以采用抗原—抗体—荧光二抗方法(间接法)检测病人血清中的自身抗体，具体的说，是将病人血清滴加于芯片表面，病人血清中的待测抗体分别与固定在芯片上的相对应的抗原结合，洗去未结合的其他物质后，加入荧光标记的二抗，洗去未结合的二抗，样品点的荧光强度与血清中抗体浓度大小成正比。用这种蛋白质芯片可以分别检测到血清中针对自身免疫病的多项指标。原理如图1所示。
也可以采用双抗原夹心法检测病人血清中的自身抗体，具体的说，是将病人血清滴加于芯片表面，病人血清中的待测抗体分别与固定在芯片上的相对应的抗原结合，洗去未结合的其他物质后，加入荧光标记的另一种抗原，可以用多种荧光染料标记多种抗原，洗去未结合的抗原，样品点的荧光强度与血清中抗体浓度大小成正比。原理见图2所示。
本发明具有下述优越性：1，多指标可同时检测。本发明把多种自身免疫病指标的抗原同时点阵于一张载玻片上，仅仅通过一次反应即可得到多种指标的逐项反应结果，因而大大提高了检测的速度和效率。同时，多指标同时用于结果判断，可以为医生提供更多的线索，因而可以更早、更准确地判断病情。2，由于采用了多样品微阵列生物芯片技术，可以同时检测多个人份的多种自身免疫病指标。3，灵敏度高，特异性高，利于及早诊断，检测结果稳定，可靠性高。4，工艺简单，操作安全，对病人伤害小。5，不仅效率高而且降低了成本，从而使诊断费用降低，实用性强。
附图说明
附图1，间接法原理图。
附图2，双抗原夹心法原理图。
附图3，列举几种抗原的点样阵列。
附图4，该病人抗双链DNA抗体，抗Sm抗体阳性，表明感染系统性红斑狼疮。
附图5，该病人抗甲状腺球蛋白及微粒体抗体阳性，表明感染乔本甲状腺炎。
附图6，该病人抗乙酰胆碱受体抗体阳性，表明感染重症肌无力。
附图7，该病人类风湿因子阳性，表明感染类风湿性关节炎。
附图8，该病人抗血细胞抗体阳性，表明感染自身免疫性溶血性贫血。
具体实施方式
本发明自身免疫性疾病联合诊断的蛋白质芯片是把自身免疫病的检测指标包括所有已知的自身抗体，主要有：抗核抗体，类风湿因子(RF)，抗乙酰胆碱受体(AchR)抗体，抗血细胞抗体，抗甲状腺球蛋白及微粒体抗体等，在固相载体上点阵的抗原为能与上述抗体特异性结合的特征性抗原。蛋白质样品点阵于固相载体上，蛋白质样品的点样阵列设计在多样品微阵列生物芯片上，蛋白质样品是指自身免疫病各项指标的抗原以及阳性对照、阴性对照，将其点阵于多样品微阵列生物芯片的同一个腔室内，使多样品微阵列生物芯片的每一个腔室均点阵了上述多项指标的抗原。将病人血清滴加于芯片表面，病人血清中的待测抗体分别与固定在芯片上的相对应的抗原结合，洗去未结合的其他物质后，加入荧光标记的另一种抗原，用多种荧光染料标记多种抗原，洗去未结合的抗原，样品点的荧光强度与血清中抗体浓度大小成正比。本实施例点阵法采用如图3几种抗原的点样阵列，检测病人血清，检测结果如图4～8所示。
其中，点样、制作技术：(1)根据样品数目选择合适的多样品微阵列生物芯片，确定点阵的排列方式和点样位置。(2)点样针从多孔板取出蛋白质样品(自身免疫性疾病各项指标的相应抗原)后直接高密度点印于固相载体上，例如醛基化的玻璃片上。(3)室温过夜或37℃温育1小时，使蛋白质的氨基和玻璃片上的醛基发生缩合反应，以固定样品。(4)利用制作蛋白质芯片的常规方法封闭、洗涤、干燥、包装、保存。
杂交反应：(1)在点好样的芯片上滴加病人血清样品，37℃温育1小时，使抗原抗体充分反应。(2)用低浓度钠离子盐为主的洗脱液洗去多余样品，室温晾干。(3)加封阻液封阻并再次洗净晾干。(4)滴加以封阻液稀释过的荧光标记二抗或荧光标记抗原。(5)在37℃避光温育30分钟。洗净并室温晾干。
结果的检测：反应结束后，利用专业的芯片扫描分析仪进行结果的判读和分析。
结果如图4，该病人抗双链DNA抗体，抗Sm抗体阳性，表明感染系统性红斑狼疮。图5，该病人抗甲状腺球蛋白及微粒体抗体阳性，表明感染乔本甲状腺炎。图6，该病人抗乙酰胆碱受体抗体阳性，表明感染重症肌无力。图7，该病人类风湿因子阳性，表明感染类风湿性关节炎。图8，该病人抗血细胞抗体阳性，表明感染自身免疫性溶血性贫血。
Claims (6)
1，自身免疫性疾病联合诊断的蛋白质芯片，其特征在于，将自身免疫病各项指标相应的抗原以及阳性对照、阴性对照同时高密度点阵于固相载体上，蛋白质通过化学键连接于固相载体上而被固定，将所述蛋白质样品点阵于多样品微阵列生物芯片的同一个腔室内，使多样品微阵列生物芯片的每一个腔室均点阵了上述多项指标的抗原。
2，根据权利要求1所述的自身免疫性疾病联合诊断的蛋白质芯片，其特征在于，自身免疫病的检测指标为已知的自身抗体，包括：抗核抗体，类风湿因子(RF)，抗乙酰胆碱受体(AchR)抗体，抗血细胞抗体，抗甲状腺球蛋白及微粒体抗体，在固相载体上点阵的抗原为能与上述抗体特异性结合的特征性抗原。
3，根据权利要求1、2所述的自身免疫性疾病联合诊断的蛋白质芯片，其特征在于，采用抗原—抗体—荧光二抗方法检测病人血清中的自身抗体，即是将病人血清滴加于芯片表面，病人血清中的待测抗体分别与固定在芯片上的相对应的抗原结合，洗去未结合的其他物质后，加入荧光标记的二抗，洗去未结合的二抗，样品点的荧光强度与血清中抗体浓度大小成正比。
4，根据权利要求1、2所述的自身免疫性疾病联合诊断的蛋白质芯片，其特征在于，采用双抗原夹心法检测病人血清中的自身抗体，即是将病人血清滴加于芯片表面，病人血清中的待测抗体分别与固定在芯片上的相对应的抗原结合，洗去未结合的其他物质后，加入荧光标记的另一种抗原，洗去未结合的抗原，样品点的荧光强度与血清中抗体浓度大小成正比。
5，自身免疫性疾病联合诊断的蛋白质芯片的制备方法，其特征在于，第一步，根据样品数目选择合适的多样品微阵列生物芯片，确定点阵的排列方式和点样位置；第二步，点样针从多孔板取出自身免疫性疾病各项指标的相应抗原后，直接高密度点印于固相载体上；第三步，室温过夜或37℃温育1小时，以固定样品；第四步，利用制作蛋白质芯片的常规方法封闭、洗涤、干燥、包装、保存。
6，自身免疫性疾病联合诊断的蛋白质芯片的检测方法，其特征在于，进行杂交反应：第一，在点好样的芯片上滴加病人血清样品，37℃温育1小时，使抗原抗体充分反应；第二，用低浓度钠离子盐为主的洗脱液洗去多余样品，室温晾干；第三，加封阻液封阻并再次洗净晾干；第四，滴加以封阻液稀释过的荧光标记二抗或荧光标记抗原；第五，37℃避光温育30分钟，洗净并室温晾干；第六，反应结束后，利用专业的芯片扫描分析仪进行结果的判读和分析。
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