RU2781976C2 - Способ выявления аутоантител в сыворотке крови, ассоциированных с аутоиммунным полигландулярным синдромом i типа, на гидрогелевом биочипе - Google Patents
Способ выявления аутоантител в сыворотке крови, ассоциированных с аутоиммунным полигландулярным синдромом i типа, на гидрогелевом биочипе Download PDFInfo
- Publication number
- RU2781976C2 RU2781976C2 RU2021106134A RU2021106134A RU2781976C2 RU 2781976 C2 RU2781976 C2 RU 2781976C2 RU 2021106134 A RU2021106134 A RU 2021106134A RU 2021106134 A RU2021106134 A RU 2021106134A RU 2781976 C2 RU2781976 C2 RU 2781976C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- elements
- biochip
- autoantibodies
- blood serum
- immobilized
- Prior art date
Links
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 title claims abstract description 49
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 title claims abstract description 37
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 title claims abstract description 37
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 title claims abstract description 37
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 title claims abstract description 34
- 201000010874 syndrome Diseases 0.000 title claims abstract description 26
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 title claims abstract description 22
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 18
- 239000010755 BS 2869 Class G Substances 0.000 claims abstract description 16
- 102000018358 Immunoglobulins Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108060003951 Immunoglobulins Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 229940072221 IMMUNOGLOBULINS Drugs 0.000 claims abstract description 10
- 108010047814 Antigen-Antibody Complex Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 4
- 108090000206 Autoantibodies Proteins 0.000 claims description 68
- 102000003852 Autoantibodies Human genes 0.000 claims description 68
- 108010074109 interleukin-22 Proteins 0.000 claims description 25
- 102100014204 IL22 Human genes 0.000 claims description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 22
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 claims description 20
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 16
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 16
- 102000008214 Glutamate decarboxylases Human genes 0.000 claims description 14
- 108091022086 Glutamate decarboxylases Proteins 0.000 claims description 14
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 claims description 14
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 claims description 13
- 201000004304 Addison's disease Diseases 0.000 claims description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 10
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims description 10
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 9
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 claims description 9
- 210000004153 Islets of Langerhans Anatomy 0.000 claims description 8
- 108010011732 Steroid 21-Hydroxylase Proteins 0.000 claims description 8
- 102000014169 Steroid 21-Hydroxylase Human genes 0.000 claims description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 8
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 7
- 229960002175 Thyroglobulin Drugs 0.000 claims description 7
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 claims description 7
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 claims description 7
- 101710006546 Hsp70Aa Proteins 0.000 claims description 6
- 206010043709 Thyroid disease Diseases 0.000 claims description 6
- 108010045648 interferon omega 1 Proteins 0.000 claims description 6
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 claims description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 14
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 abstract description 14
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 abstract description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 101710042463 ANAPC1 Proteins 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 19
- 102100018229 AIRE Human genes 0.000 description 8
- 101700051889 AIRE Proteins 0.000 description 8
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 7
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 7
- 206010003816 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 229940047124 Interferons Drugs 0.000 description 6
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 5
- 235000019395 ammonium persulphate Nutrition 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 201000011385 autoimmune polyendocrine syndrome Diseases 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 206010012601 Diabetes mellitus Diseases 0.000 description 3
- 201000009771 autoimmune polyendocrine syndrome type 1 Diseases 0.000 description 3
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 3
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004100 Adrenal Glands Anatomy 0.000 description 2
- 208000008818 Chronic Mucocutaneous Candidiasis Diseases 0.000 description 2
- 210000004907 Glands Anatomy 0.000 description 2
- 206010020707 Hyperparathyroidism primary Diseases 0.000 description 2
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N Indole-3-acetic acid Natural products C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 2
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 2
- 230000036740 Metabolism Effects 0.000 description 2
- 206010028080 Mucocutaneous candidiasis Diseases 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 210000001685 Thyroid Gland Anatomy 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 230000003092 anti-cytokine Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000035786 metabolism Effects 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 201000000981 primary hyperparathyroidism Diseases 0.000 description 2
- 238000000575 proteomic Methods 0.000 description 2
- 230000000405 serological Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 101710019883 AGPS1 Proteins 0.000 description 1
- 101710019882 AGPS2 Proteins 0.000 description 1
- 101700024603 ANNU Proteins 0.000 description 1
- 101700064729 AP1S1 Proteins 0.000 description 1
- 101700071543 APS1 Proteins 0.000 description 1
- 206010001367 Adrenal insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000006647 Autoimmune Polyendocrinopathy Diseases 0.000 description 1
- 208000005783 Autoimmune Thyroiditis Diseases 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 206010007134 Candida infection Diseases 0.000 description 1
- 208000002458 Carcinoid Tumor Diseases 0.000 description 1
- 241000709687 Coxsackievirus Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 101710019502 DARS1 Proteins 0.000 description 1
- 231100000655 Enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101700018758 GLG1 Proteins 0.000 description 1
- 208000001365 Hyperprolactinemia Diseases 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108010000345 Immobilized Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000003746 Insulin Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 description 1
- 206010022498 Insulinoma Diseases 0.000 description 1
- 229960003521 Interferon Alfa-2a Drugs 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102000011845 Iodide Peroxidase Human genes 0.000 description 1
- 108010036012 Iodide Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 229920000126 Latex Polymers 0.000 description 1
- 210000004072 Lung Anatomy 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 241000711386 Mumps virus Species 0.000 description 1
- 101710036865 NUDT10 Proteins 0.000 description 1
- 102100000108 NUDT10 Human genes 0.000 description 1
- 101710036864 NUDT11 Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010025310 Other lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 210000000496 Pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 206010052381 Primary adrenal insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 description 1
- 101700034322 TGAS Proteins 0.000 description 1
- 102100017295 TGM2 Human genes 0.000 description 1
- 208000008732 Thymoma Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000001919 adrenal Effects 0.000 description 1
- 230000001058 adult Effects 0.000 description 1
- 201000005794 allergic hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001064 anti-interferon Effects 0.000 description 1
- 108010042982 antiglomerular basement membrane antibody Proteins 0.000 description 1
- 101700071439 aps-2 Proteins 0.000 description 1
- 201000009596 autoimmune hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional Effects 0.000 description 1
- 201000003984 candidiasis Diseases 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic Effects 0.000 description 1
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 201000001708 duodenal gastrinoma Diseases 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 108010024780 glutamate decarboxylase 2 Proteins 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic Effects 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- -1 interferon alfa-2-a Proteins 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N methacrylic acid Chemical class CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000003228 microsomal Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 201000009752 monogenic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 201000005895 multinodular goiter Diseases 0.000 description 1
- 230000000849 parathyroid Effects 0.000 description 1
- 101700012230 pho-1 Proteins 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 230000003234 polygenic Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000007430 reference method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory Effects 0.000 description 1
- 201000005404 rubella Diseases 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000003335 steric effect Effects 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 101700012968 tgl Proteins 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 102000004217 thyroid hormone receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000721 thyroid hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 1
- 108010058974 transglutaminase 2 Proteins 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ выявления аутоантител в сыворотке крови, характерных для аутоиммунного полигландулярного синдрома 1 типа (АПС-1). Способ предназначен для мультиплексного обнаружения специфичных для АПС-1 аутоантител. Способ включает обеспечение гидрогелевого биочипа с иммобилизованными аутоантигенами, взаимодействие образца сыворотки крови человека с элементами биочипа с образованием специфичных бинарных иммунных комплексов аутоантигенов, иммобилизованных в элементах биочипа, с аутоантителами, находящимися в образце сыворотки крови, детекцию образовавшихся комплексов с использованием флуоресцентно-меченных антивидовых антител против иммуноглобулинов человека класса G, регистрацию и интерпретацию результатов анализа на биочипе. 6 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл., 4 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к молекулярной биологии, иммунологии, эндокринологии и может быть использовано в клинической лабораторной диагностике для выявления аутоантител в сыворотке крови, характерных для аутоиммунного полигландулярного синдрома 1 типа (АПС-1). Способ предназначен для мультиплексного обнаружения как специфичных для АПС-1 аутоантител к интерферону омега, интерферону альфа-2-a, интерлейкину 22, так и органо-специфичных аутоантител к 21-гидроксилазе, глутаматдекарбоксилазе, цитоплазматическому антигену островковых клеток, тирозинфосфатазе, тиреоглобулину, тиреопероксидазе.
Уровень техники
Аутоиммунные эндокринопатии, в связи с общими звеньями патогенеза, часто сочетаются друг с другом в рамках аутоиммунных полигландулярных синдромов (АПС). Различают несколько типов АПС. Аутоиммунный полигландулярный синдром первого типа (АПС-1) - редкое моногенное заболевание, опосредованное мутациями в гене AIRE. Распространенность среди популяции составляет примерно 1:80000, болезнь дебютирует преимущественно в детском возрасте. АПС-1 характеризуется развитием как минимум двух из трех основных компонентов: хронического слизисто-кожного кандидоза, гипофункции паращитовидных желез и первичной недостаточности надпочечников (болезни Аддисона), а также возможным проявлением других иммуноопосредованных заболеваний [Husebye, Е.S., Anderson, М.S., & (2018). Autoimmune Polyendocrine Syndromes. New England Journal of Medicine, 378(12), 1132-1141. https://doi.org/10.1056/NEJMra1713301]. Критерием диагностики АПС-1 является присутствие двух из трех характерных заболеваний, однако классическая диагностическая диада позволяет распознавать лишь небольшую часть новых случаев [Perheentupa, J. (2006). Autoimmune Polyendocrinopathy-Candidiasis-Ectodermal Dystrophy. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 91(8), 2843-2850. https://doi.org/10.1210/jc.2005-2611]. Диагноз АПС-1 может быть подтвержден генетическим тестированием, в настоящее время описано более 100 мутаций в гене AIRE [Bruserud, ∅., Oftedal, В.Е., Wolff, А.В., & Husebye, E.S. (2016). AIRE-mutations and autoimmune disease. Current Opinion in Immunology, 43, 8-15. https://doi.org/10.1016/j.coi.2016.07.003].
Выделяют также другие типы аутоиммунных полигландулярных синдромов (-2,-3 и т.д.) которые имеют отличный от АПС-1 патогенез заболевания, полигенный тип наследования, а эндокринопатии в большинстве случаев манифестируют во взрослом возрасте. Кроме того, по мере появления новых компонентов синдрома, диагноз может быть переклассифицирован из одного типа АПС в другой. Поэтому большинство специалистов выделяют единый тип АПС: АПС второго типа (АПС-2) или АПС взрослых (Husebye E.S., Anderson M.S., Autoimmune Polyendocrine Syndromes. N Engl J Med. 2018; № 378 (12):1132-1141). На практике нередко возникают сложности в дифференциальной диагностике АПС-1 и АПС-2 (нетипичная картина заболевания, неполная манифестации основных компонентов), а проведение молекулярно-генетической диагностики (особенно полное секвенирование гена AIRE) не всегда возможно. В таких случаях выявление циркулирующих аутоантител может быть эффективным диагностическим критерием АПС-1. В настоящее время установлено, что более чем у 95% пациентов с АПС-1 обнаруживаются аутоантитела к интерферонам первого типа, в том числе против интерферонов α2 и ω [Meager, A., Visvalingam, K., Peterson, Р., Krohn, K., Willcox, N. (2006). Anti-interferon autoantibodies in autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1. PLoS Medicine, 3(7), 1152-1164. https://doi.org/10.13711\ournal.pmed.0030289"]. Исследование антител к интерлейкину 22 также показало свою высокую эффективность в диагностике АПС-1 (определяются у 91% пациентов). При этом повышение данных антител ассоциировано с наличием кожно-слизистого кандидоза и, предположительно, является предиктором его развития [Kisand K, Wolff ASB, et al., Chronic mucocutaneous candidiasis in APECED or thymoma patients correlates with autoimmunity to Th17-associated cytokines (2010). J. Exp. Med. 207(2), 299-308. https://doi.org/10.1084/iem.200916691]. Однако определение аутоантител против интерферонов первого типа и к интерлейкину 22 до сих пор доступно только в исследовательских лабораториях.
У пациентов с АПС могут быть выявлены органо-специфичные аутоантитела, обнаруживаемые при иных аутоиммунных заболеваниях Myhre, A.G., Ekwall, О., Gebre-Medhin, G., Hedstrand, Н., Landgren, Е., Nilsson, Т. (2004). Prevalence and Clinical Associations of 10 Defined Autoantibodies in Autoimmune Polyendocrine Syndrome Type I. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 89(2), 557-562. https://doi.org/10.1210/ic.2003-0302791], [Landegren, N., Sharon, D., Freyhult, E., Hallgren, A., Eriksson, D., Edqvist, P.H., (2016). Proteome-wide survey of the autoimmune target repertoire in autoimmune polyendocrine syndrome type 1. Scientific Reports, 6 (October 2015), 1-11. https://doi.org/10.1038/srep20104]. Среди них антитела против глутаматдекарбоксилазы GAD-65, антитела к цитоплазматическому антигену островковых клеток ICA и тирозинфосфатазе IA2 при сахарном диабете первого типа (СД1) [Hansen, М.Р. (2015). Туре 1 diabetes and polyglandular autoimmune syndrome: A review. World Journal of Diabetes, 6(1), 67. https://doi.org/10.4239/wid.v6.il.671. антитела против 21-гидроксилазы (21-OH) при болезни Аддисона [Betterle, С, & Morlin, L. (2011). Autoimmune Addison's Disease (Vol. 20, pp. 161-172). https://doi.Org/10.1159/000321239], аутоантитела к тиреопероксидазе (ТРО) и тиреоглобулину (Tg) в случае аутоиммунных заболеваний щитовидной железы [Soh, S.-B., & Aw, Т.-С. (2019). Laboratory Testing in Thyroid Conditions - Pitfalls and Clinical Utility. Annals of Laboratory Medicine, 39(1), 3. https://doi.org/10.3343/alm.2019.39.l.3].
Из уровня техники известно множество способов, основанных на использовании биологических микрочипов (биочипов) для выявления аутоантител (например, CN 1338633 A "Protein chip for diagnosing autoimmune diseases", US 20050260770 A1 "Antigen array and diagnostic uses thereof, US 6159748 A "Evaluation of autoimmune diseases using a multiple parameter latex bead suspension and flow cytometry", CN 1866013 А "Liquid phase chip for parallel detection of autoantibodies, preparation method and application thereof). Однако в настоящее время ни один из заявленных способов не предназначен для выявления аутоантител, характерных для эндокринологических аутоиммунных синдромов. Наиболее разработанной областью мультиплексного иммуноанализа в случае аутоиммунных эндокринопатий является диагностика сахарного диабета первого типа. Так Amoroso и др. разработали систему «3 Screen» - метод, основанный на ИФА-анализе, предназначенный для комбинированного измерения аутоантител к GAD-65, к IA2 и к ZnT8 [Amoroso, М., Achenbach, P., Powell, M., Coles, R., Chlebowska, M., Carr, L., … Rees Smith, B. (2016). 3 Screen islet cell autoantibody ELISA: A sensitive and specific ELISA for the combined measurement of autoantibodies to GAD-65, to IA2 and to ZnT8. Clinica Chimica Acta, 462, 60-64. https://doi.Org/10.1016/i.cca.2016.08.0131]. В патенте CN1448724A "Type 1 diabetes related antigen-antibody simultaneous detection egg white slice" заявлен способ одновременного обнаружения антигенов и антител, соответствующих СД1, с помощью микрочипа, содержащего белки, закрепленные на твердой подложке, в том числе антиген вируса эпидемического паротита, В4 антиген вируса Коксаки, антиген краснухи, антиген респираторно-кишечного вируса, Tg, ТРО, рецептор тиреоидного гормона, антиген микросомальной фракции щитовидной железы, ICAs, IAAs, GADAs, IA-2As, поверхностный антиген островковых клеток, рецептор инсулина, Н-карбоксипептидаза, IA-2β, антитело против клубочковой базальной мембраны. Однако описанные методы не содержат аутоантигенов, специфичных для АПС-1.
Также опубликованы работы по применению планарных белковых микрочипов для исследования анти-цитокиновых антител и новых кандидатных-аутоантигенов. Rosenberg и соавторами создан планарный микрочип с 102 белками, который апробировали на 58 образцах сывороток крови, включая 7 образцов пациентов с АПС-1 [Rosenberg, J.М., Price, J.V., Barcenas-Morales, G., Ceron-Gutierrez, L., Davies, S., Kumararatne, D.S., … Utz, P.J. (2016). Protein microarrays identify disease-specific anti-cytokine autoantibody profiles in the landscape of immunodeficiency. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 137(1), 204-213.e3. https://doi.org/10.1016/i.jaci.2015.07.032]. Микрочипы высокой плотности для поиска новых серологических маркеров АПС-1 были использованы в работе Landegren и соавторов [Landegren, N., Sharon, D., Freyhult, E., Hallgren, A., Eriksson, D., Edqvist, P.H., (2016). Proteome-wide survey of the autoimmune target repertoire in autoimmune polyendocrine syndrome type 1. Scientific Reports, 6 (2015), 1-11. https://doi.org/10.1038/srep20104]. Авторы провели анализ сывороток 51 пациента с АПС-1 и 21 здорового донора для выявления аутоантител на белковых микрочипах, содержащих более 9000 полноразмерных белков (ProtoArray®, ThermoFisher). Поиск новых серологических маркеров АПС-1 требует иммобилизации сотен молекул, такие микрочипы отличаются высокой себестоимостью, интерпретация результатов теста требует применения специальных математических методов, применение данных биочипов в рутинной клинической лабораторной практике с целью выявления АПС-1 нецелесообразно.
Gu и соавторами разработан мультиплексный анализ аутоантител к инсулину (IAA), GADA, IA2A и к тканевой трансглутаминазе (TGA), ТРО, Tg, IFNαA на основе электрохемилюминисценции [Gu, Y., Zhao, Z., Waugh, K., Miao, D., Jia, X., Cheng, J., … Yu, L. (2019). High-throughput multiplexed autoantibody detection to screen type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases simultaneously. EBioMedicine, 47, 365-372. https://doi.org/10.1016/i.ebiom.2019.08.0361. Метод основан на проведении конкурентного анализа аутоантител к семи иммобилизованным в лунке иммунологического планшета через специфической линкер антигенам. При инкубации образца биспецифичные аутоантитела из сыворотки крови связываются одновременно с иммобилизованными аутоантигенами и с добавленным в реакционную смесь аутоантигенами, меченными SULFO-TAG® (Meso Scale Diagnostics, LLC, США). Авторы апробировали метод с использованием сывороток крови пациентов с СД1 (3 когорты: n=186, n=168, n=1022) и контрольных образцов (2 когорты: n=118, n=1026). Предложенный в работе Gu, et al. метод предназначен для скрининга маркеров сахарного диабета 1 типа и не апробирован на когорте пациентов с АПС-1. Более того, описанный микрочип включал только один специфичный для АПС-1 аутоантиген (интерферон α), а также не содержал аутоантиген 21-ОН, антитела к которому характерны для аутоиммунной надпочечниковой недостаточности, одного из мажорных компонентов АПС-1.
Из анализа уровня техники можно сделать вывод, что в настоящее время существует необходимость разработки способа выявления набора аутоантител, ассоциированных с АПС-1, который выгодно отличался бы от известных способов возможностью одновременного обнаружения различных аутоантител, как непосредственно характерных для АПС-1 (к интерферону омега, интерферону альфа-2-a, интерлейкину 22), так и органо-специфичных, а также отличался высокой скоростью и простотой проведения анализа.
Раскрытие сущности изобретения
В настоящем изобретении предложен способ выявления аутоантител в сыворотке крови, ассоциированных с аутоиммунным полигландулярным синдромом I типа, который выгодно отличается от известных из уровня техники способов возможностью одновременного обнаружения в сыворотке крови как специфичных для АПС-1 аутоантител к интерферону омега (IFN-ω), интерферону альфа-2-a (IFN-α-2-a), интерлейкину 22 (IL-22), так и органо-специфичных аутоантител к 21-гидроксилазе (21-ОН), глутаматдекарбоксилазе (GAD-65), цитоплазматическому антигену островковых клеткок поджелудочной железы (ICA), тирозинфосфатазе (IA2), тиреоглобулину (Tg), тиреопероксидазе (ТРО) с использованием гидрогелевого биочипа, представляющего собой матрицу трехмерных гидрогелевых элементов на подложке.
Технология гидрогелевых биочипов разработана в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (ИМБ РАН) и основана на одновременном формировании гидрогелевых ячеек с иммобилизацией молекулярных зондов [Грядунов Д.А., Шаскольский Б.Л., Наседкина Т.В., Рубина А.Ю., Заседателев А.С. 2018. Технология гидрогелевых биочипов ИМБ РАН: 30 лет спустя. Acta Naturae. 10(4): 4-18. https://doi.org/10.32607/20758251-2018-10-4-4-181]. При этом молекулярные зонды равномерно распределены по всему объему ячейки. За счет развитой поверхности гидрогеля молекулярные зонды иммобилизованы с достаточной плотностью иммобилизации, однако, на значительном удалении друг от друга для нивелирования стерических эффектов. Структура геля предотвращает контакт соединений с гидрофобной подложкой, и обеспечивает нативное водное окружение биологических молекул. Таким образом, иммобилизация белков в геле стабилизирует их нативную структуру и биологическую активность, в противоположность двумерным носителям, которые не обеспечивают водное окружение для молекул белков. Данный метод подходит для иммобилизации белковых молекул и по своим характеристикам выгодно отличается от классических методов планарной иммобилизации [Rubina AY, Dementieva EI, Stomakhin AA, Darii EL, Pan'kov SV, Barsky VE, Ivanov SM, Konovalova EV, Mirzabekov AD. Hydrogel-based protein microchips: manufacturing, properties, and applications. Biotechniques. 2003 May; 34(5): 1008-14, 1016-20, 1022. https://doi.org/l0.2144/03345rr01].
Заявленный способ основан на проведении мультиплексного иммуноанализа образца сыворотки крови на гидрогелевом биочипе. Для выявления аутоантител проводят последовательно: инкубацию содержащего иммобилизованные аутоантигены гидрогелевого биочипа с образцом сыворотки крови, инкубацию с раствором меченных вторичных антивидовых антител против иммуноглобулинов человека класса G, регистрацию и обработку флуоресцентных сигналов, интерпретацию сигналов. Способ включает следующие стадии:
а) обеспечение биочипа, представляющего собой матрицу элементов, в которых иммобилизованы специфичные белки - аутоантигены (интерферон омега, интерферон альфа-2-a, интерлейкин 22, 21-гидроксилаза, глутаматдекарбоксилаза, цитоплазматический антиген островковых клеток, тирозинфосфатаза, тиреоглобулин, тиреопероксидаза, каждый - в группе из четырех отдельных элементов) к аутоантителам - иммуноглобулинам класса G, ассоциированным с аутоиммунным полигландулярным синдромом I типа, элементов, содержащих человеческий иммуноглобулин класса G и антивидовые антитела против иммуноглобулинов человека класса G, и группы контрольных элементов, не содержащих иммобилизованных белков;
б) взаимодействие образца сыворотки крови человека с элементами биочипа с образованием специфичных бинарных иммунных комплексов аутоантигенов, иммобилизованных в элементах биочипа, с аутоантителами, находящимися в образце сыворотки крови;
в) детекцию образовавшихся иммунных комплексов;
г) регистрацию и интерпретацию результатов анализа.
В одном из воплощений способ характеризуется тем, что биочип представляет собой подложку с гидрогелевыми элементами, полученными способом химической или фотоиндуцируемой сополимеризации, содержащими иммобилизованные белки. Перечень белков, используемых для изготовления биочипа, приведен в Таблице 1.
В другом воплощении способ характеризуется тем, что стадию (в) детекции иммунных комплексов в элементах биочипа проводят, добавляя флуоресцентно-меченные антивидовые антитела против иммуноглобулинов человека класса G с образованием тройного комплекса «иммобилизованный аутоантиген - аутоантитело - антивидовое флуоресцентно-меченное антитело».
В следующем воплощении способ характеризуется тем, что на стадии (г) регистрацию результатов проводят с использованием анализатора флуоресценции и программного обеспечения, регистрируя флуоресцентную картину и определяя значения флуоресцентных сигналов элементов биочипа, полученных в результате образования тройного комплекса на стадии (в).
В следующем воплощении способ характеризуется тем, что на стадии (г) интерпретации результатов, для каждой группы элементов, содержащих одинаковые аутоантигены, результирующее значение сигнала рассчитывают как медиану значений сигналов от четырех соответствующих элементов, а для группы контрольных элементов, не содержащих иммобилизованных белков, результирующее значение сигнала рассчитывают как медиану значений от сигналов соответствующих элементов.
В следующем воплощении способ характеризуется тем, что на стадии (г) интерпретации результатов, проводят анализ групп элементов, содержащих интерферон омега, интерферон альфа-2-a и интерлейкин 22, и в случае, если для двух и более белков отношение результирующего сигнала группы элементов с соответствующим иммобилизованным белком к результирующему сигналу группы контрольных элементов превышает пороговое значение, делают заключение о наличии в сыворотке крови соответствующих аутоантител, ассоциированных с аутоиммунным полигландулярным синдромом I типа.
Наконец, в еще одном своем воплощении способ характеризуется тем, что на стадии (г) интерпретации результатов, проводят анализ групп элементов, содержащих 21-гидроксилазу, глутаматдекарбоксилазу, цитоплазматический антиген островковых клеток, тирозинфосфатазу, тиреоглобулин, тиреопероксидазу, и в случае, если для одного или нескольких белков отношение результирующего сигнала группы элементов с соответствующим иммобилизованным белком к результирующему сигналу группы контрольных элементов превышает пороговое значение, делают заключение о наличии в сыворотке крови соответствующих органоспецифических аутоантител, характерных для других компонентов аутоиммунных полигландулярных синдромов, включая болезнь Аддисона, сахарный диабет 1 типа, аутоиммунные заболевания щитовидной железы.
Заявляемый способ позволяет одновременно выявлять необходимое и достаточное число аутоантител для скрининга АПС-1, что не требует проведения дополнительных тестов для подтверждения результатов.
Далее изобретение будет раскрыто подробнее со ссылками на фигуры, которые приводятся исключительно с целью иллюстрации и пояснения сущности заявленного изобретения, но которые не предназначены для ограничения объема притязаний.
Краткое описание фигур
Фигура 1. Схема размещения элементов биочипа для выявления аутоантител, ассоциированных с АПС-1. Элементы биочипа представлены в виде кругов. Биочип содержит функциональные группы элементов, каждая группа из которых состоит из четырех идентичных элементов. Функциональные группы включают элементы с иммобилизованными аутоантигенами, характерными для АПС-1 (элементы IFN-ω, IFN-α-2-а, IL-22), и с органо-специфичными аутоантигенами, характерными для компонентов синдрома (21-ОН, как маркер болезни Аддисона, GAD-65, ICA, IA2, как маркеры сахарного диабета 1 типа, Tg и ТРО, как маркеры аутоиммунных заболеваниях щитовидной железы). Характеристика аутоантигенов, иммобилизованных на биочипе приведена в таблице 1. Биочип также содержит элементы 'human igG' и 'anti-human igG' с иммобилизованными иммуноглобулинами класса G человека и антителами к ним, соответственно. Получение флуоресцентных сигналов от данных элементов является необходимым условием для контроля соблюдения условий проведения анализа, исключения грубых мануальных ошибок, а также контроля сохранности способности детектирующих антител узнавать свою мишень, а иммобилизованных белков сохранять свою биологическую активность. Контрольная группа из восьми элементов 'Empty', не содержащих иммобилизованных белков, предназначена для вычисления значения фонового сигнала. Биочип также включает 4 элемента, обозначенных 'М', содержащих флуоресцентный маркер для обработки сигналов элементов биочипа после проведения анализа.
Фигура 2. Примеры флуоресцентных изображений биочипа после анализа образца сыворотки крови здорового пациента (А), пациента с аутоиммунным заболеванием щитовидной железы (Б), пациента с изолированной болезнью Аддисона (В) и пациента с АПС-1 (Г).
Фигура 3. Пример репертуара аутоантител у пациентов с различными полиэндокринопатиями, а именно аутоиммунных полигландулярных синдромов 1 и 2 типа.
Фигура 4. Спектр выявленных аутоантител против интерферонов омега (А) и альфа (Б), а также интерлейкина-22 (В) у пациентов с АПС-1 и АПС-2.
Фигура 5. Аутоантитела против интерферонов омега (А) и альфа (Б), а также интерлейкина 22 (В) у пациентов, не имеющих диагностированного АПС-1.
Осуществление изобретения
Целью изобретения являлось создание способа одновременного выявления девяти аутоантител в сыворотке крови, ассоциированных с аутоиммунным полигландулярным синдромом I типа. Заявленный в данном изобретении способ заключается в обеспечении биочипа, содержащего как аутоантигены, специфичные для АПС-1, включая ИФН-ω, ИФН-α-2а, IL-22, так и органоспецифические аутоантигены, характерные для компонентов синдрома, а именно: 21-ОН, GAD-65, ICA, IA2, Tg и ТРО. Схема биочипа представлена на Фиг. 1. Каждый тип аутоантигенов иммобилизован в четырех одинаковых элементах, повторы используются для увеличения воспроизводимости анализа.
Биочип для осуществления заявляемого способа представляет собой матрицу трехмерных гидрогелевых элементов на подложке из стекла или пластика [Грядунов Д.А., Шаскольский Б.Л., Наседкина Т.В., Рубина А.Ю., Заседателев А.С. 2018. Технология гидрогелевых биочипов ИМБ РАН: 30 лет спустя. Acta Naturae. 10(4): 4-18. https://doi.org/10.32607/20758251-2018-10-4-4-181]. Технология основана на иммобилизации молекул в трехмерных ячейках в виде микрокапель, закрепленных на твердой подложке. Макропористая структура гидрогелевых элементов формируется за счет сополимеризации мономера - производного метакриловой кислоты, бифункционального кроссшивающего агента и иммобилизуемых молекул. При этом белковые молекулы не нуждаются в дополнительной модификации, поскольку имеют в своей структуре соответствующие функциональные группы аминокислот (N-концевые аминогруппы, ε-аминогруппы лизинов, сульфгидрильные группы цистеинов и др.). Для белков подобраны условия полимеризации (длина волны при фотополимеризации, температура) позволяющие максимально сохранить их исходную биологическую активность. Ячейки с иммобилизованными белками располагаются рядами на подготовленных стеклянных подложках. Контроль качества нанесения осуществляется с помощью специализированной оптики и компьютерного анализа изображения.
Для выявления аутоантител, ассоциированных с АПС-1, проводят последовательно: инкубацию содержащего иммобилизованные аутоантигены гидрогелевого биочипа с анализируемым образцом, инкубацию с флуоресцентно-меченным вторичным антивидовым антителом против иммуноглобулинов человека класса G, регистрацию флуоресцентных сигналов элементов биочипа и их интерпретацию. Анализируемый образец представляет собой сыворотку крови человека, предварительно разведенный в 100 раз буфером 100 мМ Трис-HCl с 0.1% Triton Х-100. Во время инкубации ячеек биочипа с образцом происходит образование бинарных комплексов «иммобилизованный аутоантиген - специфическое аутоантитело». Инкубацию с образцом проводят при 37°С в течение ночи, поскольку установлено, что через 16 часов инкубации на гидрогелевом биочипе процесс формирования бинарных комплексов «антиген-антитело» выходит на насыщение [Rubina AY, Kolchinsky A, Makarov АА, Zasedatelev AS. Why 3-D? Gel-based microarrays in proteomics. Proteomics, 8(4), 817-831 (2008). https://doi.org/10.1002/pmic.2007006291]. После отмывки непрореагировавших компонентов реакции, связавшиеся с иммобилизованными аутоантигенами аутоантитела детектируют антивидовыми флуоресцентно-меченными антителами. Экспериментально установлено, что оптимальная рабочая концентрация детектирующих антивидовых антител составляет 5 мкг/мл при 37°С, время инкубации 30 мин. Во время инкубации ячеек биочипа с антивидовыми флуоресцентно-меченными антителами происходит образование тройных комплексов «иммобилизованный аутоантиген - специфическое аутоантитело - антивидовое флуоресцентно-меченное антитело». После финальной отмывки проводят регистрацию флуоресцентных изображений биочипов, используя анализаторы флуоресценции или сканеры микрочипов со специальным программным обеспечением, позволяющим вычислить значения флуоресцентного сигнала каждого элемента биочипа. Интерпретацию результатов выполняют посредством сравнения интенсивностей сигналов элементов с иммобилизованными аутоантигенами и интенсивностей сигналов элементов контрольной группы, не содержащих белков. Для каждой функциональной группы элементов n, содержащих одинаковые иммобилизованные антигены, результирующее значение сигнала In рассчитывают как медиану значений от четырех соответствующих элементов. В контрольной группе из восьми элементов 'Empty', не содержащих иммобилизованных белков, результирующее значение сигнала Iref рассчитывают как медиану значений от 8 соответствующих сигналов элементов. Наличие аутоантитела в сыворотке крови определяют в случае, если отношение результирующего сигнала In к результирующему сигналу Iref превышает пороговое значение. Экспериментально установлены пороговые значения, характеризующие наличие аутоантител в сыворотке крови по результатам анализа с использованием заявленного способа: In/Iref ≥ 5,0 для IFN-ω, IFN-α-2a, IL-22 и In/Iref ≥ 2,0 для 21-ОН, GAD-65, IA2, ICA, Tg и ТРО.
Заявленный способ выявления аутоантител, характерных для аутоиммунных заболеваний, обеспечивает возможность скрининга образцов крови от пациентов на наличие АПС-1 посредством одновременного выявления 9 различных аутоантител. Способ позволит существенно упростить и удешевить выявление АПС-1 в случаях неполной или скрытой клинической манифестации компонентов синдрома.
Далее изобретение будет проиллюстрировано примерами, которые предназначены для обеспечения лучшего понимания сущности заявленного изобретения, но не должны рассматриваться как ограничивающие данное изобретение
Пример 1. Выявление аутоантител в сыворотках крови пациентов с помощью гидрогелевого биочипа
Гидрогелевые биочипы изготавливали методом сополимеризационной иммобилизации по ранее разработанной методике, описанной выше [Rubina, A.Y., Filippova, М.A., Feizkhanova, G.U., Shepeliakovskaya, А.О., Sidina, Е.I., Boziev, K.М., … Grishin, Е.V. (2010). Simultaneous detection of seven staphylococcal enterotoxins: Development of hydrogel biochips for analytical and practical application. Analytical Chemistry, 82(21), 8881-8889. https://doi.org/10.1021/ас10166341. Схема размещения элементов изготовленного биочипа для выявления аутоантител, ассоциированных с АПС-1, приведена на Фигуре 1.
Для проведения анализа образцы сывороток крови пациентов разводили 1:100 буфером 100 мМ Трис-HCl с 0.1% Triton Х-100, 120 мкл вносили в реакционную камеру биочипа. После инкубации с образцом в течение ночи при 37°С, промежуточной отмывки (PBS с 0,01% Tween 20, 20 мин), споласкивания и высушивания, биочипы проявляли флуоресцентно-меченными антивидовыми антителами (5 мкг/мл; F(ab')2-Goat anti-Human IgG-Cy5; 50 мкл) в буфере PBS с 0,14% поливинилового спирта (50 кДа) и 0,14% поливинилпирролидона (360 кДа). После инкубации (30 мин, 37°С) биочипы отмывали (PBS с 0,01% Tween 20, 30 мин), споласкивали, высушивали центрифугированием. Флуоресцентные изображения биочипов получали с помощью биочип-анализатора с лазерным возбуждением, разработанного в ИМБ РАН, Москва [Lysov, Y., Barsky, V., Urasov, D., Urasov, R., Cherepanov, A., Mamaev, D., … Zasedatelev, A. (2017). Microarray analyzer based on wide field fluorescent microscopy with laser illumination and a device for speckle suppression. Biomedical Optics Express, 8(11), 4798. https://doi.org/10.1364/boe.8.0047981]. Вычисление флуоресцентных сигналов осуществляли с помощью программного обеспечения Image Assay (ИМБ РАН, Москва).
Фигура 2 иллюстрирует флуоресцентные изображения биочипов после проведения анализа сывороток крови здорового донора (А) и сывороток крови пациентов, страдающими разными эндокринопатиями, такими как болезнь Аддисона (Б), аутоиммунный тиореоидит (В), АПС-1 (Г). Для образца сыворотки крови здорового пациента (А) наблюдали отсутствие сигналов от функциональных групп элементов, содержащих иммобилизованные аутоантигены. Для образца сыворотки пациента с аутоиммунным заболеванием щитовидной железы (Б) сигналы от групп элементов с иммобилизованными антигенами Tg и ТРО превышали пороговое значение, т.е. выполнялось условие ITg/Iref ≥ 2,0; ITPO/Iref ≥ 2,0, сигналы других элементов функциональных групп не превышали сигналов элементов контрольной группы. Для образца сыворотки пациента с изолированной болезнью Аддисона (В) было выполнено условие I21-OH/Iref ≥ 2,0, что соответствовало наличию аутоантител к 21-гидроксилазе, характерных для данной патологии. Сигналы других элементов функциональных групп не превышали сигналов элементов контрольной группы. Анализ образца сыворотки крови пациента с АПС-1 (Г) выявил превышение пороговых значений для следующих групп элементов IIFN-ω/Iref ≥ 5,0; IIFN-α-2a/Iref ≥ 5,0; IIL-22/Iref ≥ 5,0, что свидетельствовало о присутствии в образце от пациента соответствующих специфичных для АПС-1 аутоантител. Кроме того, зарегистрировано превышение пороговых значений I21-OH/Iref ≥ 2,0; IGAD-65/Iref ≥ 2,0; ITg/Iref ≥ 2,0; ITPO/Iref ≥ 2,0, подтверждающее наличие органо-специфических аутоантител к 21-ОН, GAD-65, TG and ТРО.
Для всех образцов флуоресцентные изображения которых представлены на Фиг. 2, зарегистрированы сигналы элементов биочипа 'anti-human IgG' и 'human IgG'. При проведении анализа на стадии взаимодействия образца сыворотки крови с элементами биочипа, иммобилизованные в элементе 'anti-human IgG' антивидовые антитела к иммуноглобулину класса G человека взаимодействуют с аутоантителами класса G, формируя бинарные комплексы «иммобилизованные антивидовые антитела - антитела класса G из сыворотки крови». На стадии детекции образовавшихся иммунных комплексов в элементе 'anti-human IgG', образуются тройные комплексы «иммобилизованные антивидовые антитела- антитела класса G из сыворотки крови - флуоресцентно-меченные детектирующие антивидовые антитела», а в элементах биочипа 'human IgG', содержащих иммуноглобулина класса G человека, образуются двойные комплексы «иммобилизованные антитела класса G человека - флуоресцентно-меченные детектирующие антивидовые антитела».
Пример 2. Обнаружение органоспецифических аутоантител с помощью заявляемого способа и референсного метода на основе иммуноферментного анализа (ИФА)
Заявляемым способом были проанализированы образцы сывороток крови от 206 пациентов: АПС1 (n=18), АПС2 (n=39), изолированная аутоимунная эндокринная патология (n=50), неаутоиммунная эндокринная патология (n=71), условно здоровые (n=28). Характеристики пациентов приведены в Таблице 2. Все образцы были измерены также методом ИФА для выявления аутоантител к 21-ОН (BioVendor, Czech Republic), GAD-65 (Euroimmun AG, Германия и Biomerica Inc., США), IA2 (Medipan Gmbh, Германия), ICA (Medipan Gmbh, Германия), ТРО (Abbott Laboratories, США), Tg (Roche Diagnostics, Germany). Сравнение результатов, полученных с использованием ИФА и заявляемого способа показало, что совпадение двух методов при детекции органо-специфических антител варьировалось в пределах от 69,8% до 94% (69,8% для 21-ОН, 80,0% для GAD-65, 77,3% для IA2, 90,0% для ICA, 94,6% для Tg, 87,7% для ТРО), что позволяет использовать разработанный биочип для скрининга органо-специфических аутоантител в сыворотке крови.
Пример 3. Сравнение репертуара аутоантител у пациентов с полиэндокринопатиями
Заявленным способом было проведено сравнение результатов выявления аутоантител в образцах пациентов с диагностированным АПС-1 (n=18) и пациентов из группы сравнения с АПС-2 (n=38). АПС-2, также как и АПС-1, редко дебютирует двумя и более заболеваниями одновременно, полная клиническая картина синдрома также может проявляться в течение многих лет. Кроме того серодиагностика синдромов также затруднена, поскольку наличие орган-специфических аутоантител не всегда указывает на недостаточность соответствующей железы. В этой связи, выявление более одного аутоантитела к тканям железы несет большую диагностическую ценность. С помощью разработанного способа показаны статистически значимые различия для уровней аутоантител к интерферонам INF-ω (Р<0,0001), INF-α-2a (Р<0,0001), интерлейкину IL-22 (Р<0,0001) для пациентов с аутоимунными полигландулярными синдромами 1 и 2 типов (Фигура 3).
Пример 4. Выявление аутоантител против IFN-ω, IFN-α-2a и IL-22
С помощью заявляемого способа было проанализировано 206 образцов пациентов и здоровых доноров, при этом 18 образцов были получены от пациентов с АПС-1 (Таблица 2). Согласно заявленному способу, на стадии интерпретации результатов, был проведен анализ групп элементов, содержащих интерферон омега, интерферон альфа-2-a и интерлейкин 22. В случае если для двух и более белков отношение результирующего сигнала группы элементов с соответствующим иммобилизованным белком к результирующему сигналу группы контрольных элементов превышало пороговое значение ≥ 5,0, делали заключение о наличии в сыворотке крови соответствующих аутоантител, ассоциированных с АПС-1, а результат теста считали положительным. Для обследованной когорты пациентов не было выявлено ни одного ложноотрицательного результата среди 18 пациентов с АПС-1 и был выявлен 1 ложноположительный результат среди 188 пациентов без диагностированного АПС-1. Таким образом, диагностическая специфичность и чувствительность мультиплексного метода определения аутоантител в данной когорте пациентов составили 99,5% и 100% для АПС-1, соответственно.
Из 18 пациентов с АПС-1, у 16 с помощью заявляемого способа выявлен триплет аутоантител IFN-ω+IFN-α-2a+IL-22 (Фигура 4). У двух пациентов с АПС-1 определены одновременно аутоантитела к IFN-ω и IFN-α-2a. При этом связать отсутствие аутоантител к IL-22 у данных двух пациентов с клиническими признаками и результатами генетического тестирования не удалось.
Среди 188 образцов от пациентов из групп сравнения, не имеющих диагностированного АПС-1, превышение порогового значения ≥ 5,0 для аутоантител к IFN-ω, IFN-α-2a и/или IL-22 зафиксировано в трех образцах (Фигура 5). У одного пациента (женщина, 56 лет) с диагностированным первичным гиперпаратиреозом и многоузловым зобом выявлены повышенные аутоантитела к интерлейкину 22. У второго пациента (женщина, 45 лет) с генетически доказанным синдромом МЭН-1 (первичный гиперпаратиреоз; множественные инсулиномы, нефункционирующие опухоли поджелудочной железы, гастриномы 12-перстной кишки; карциноиды легких, мультифокальные гормонально - неактивные образования обоих надпочечников, гиперпролактинемия) выявлены аутоантитела к IFN-α-2a. В образце сыворотки крови третьего пациента выявлены аутоантитела к интерферонам IFN-ω и IFN-α-2a, при этом аутоантитела к IL-22 определены не были. У данного пациента (мужчина, 70 лет) был диагностирован первичный гипокортицизм неаутоимунного генеза вследствие впервые выявленной лимфомы надпочечников, что было подтверждено данными КТ надпочечников, а также нормальным уровнем аутоантител к 21-ОН. Других патологий выявлено не было. Генетическое тестирование на наличие мутаций в гене AIRE для данных пациентов не проводилось.
Стоит отметить, что ни в одном образце от пациентов из групп сравнения не были выявлены триплеты аутоантител IFN-ω+IFN-α-2a+IL-22.
Claims (11)
1. Способ выявления аутоантител в сыворотке крови, ассоциированных с аутоиммунным полигландулярным синдромом I типа, на гидрогелевом биочипе, включающий:
а) обеспечение биочипа, представляющего собой матрицу элементов, в которых иммобилизованы специфичные белки - аутоантигены (интерферон омега, интерферон альфа-2-a, интерлейкин 22, 21-гидроксилаза, глутаматдекарбоксилаза, цитоплазматический антиген островковых клеток, тирозинфосфатаза, тиреоглобулин, тиреопероксидаза, каждый - в группе из четырех отдельных элементов) к аутоантителам - иммуноглобулинам класса G, ассоциированным с аутоиммунным полигландулярным синдромом I типа, элементов, содержащих человеческий иммуноглобулин класса G и антивидовые антитела против иммуноглобулинов человека класса G, и группы контрольных элементов, не содержащих иммобилизованных белков;
б) взаимодействие образца сыворотки крови человека с элементами биочипа с образованием специфичных бинарных иммунных комплексов аутоантигенов, иммобилизованных в элементах биочипа, с аутоантителами, находящимися в образце сыворотки крови;
в) детекцию образовавшихся иммунных комплексов;
г) регистрацию и интерпретацию результатов анализа.
2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что биочип представляет собой подложку с гидрогелевыми элементами, полученными способом химической или фотоиндуцируемой сополимеризации.
3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что на стадии (в) детекцию иммунных комплексов в элементах биочипа проводят, добавляя флуоресцентно-меченные антивидовые антитела против иммуноглобулинов человека класса G с образованием тройного комплекса «иммобилизованный аутоантиген - аутоантитело - антивидовое флуоресцентно-меченное антитело».
4. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что на стадии (г) регистрацию результатов проводят с использованием анализатора флуоресценции и программного обеспечения, регистрируя флуоресцентную картину и определяя значения флуоресцентных сигналов элементов биочипа, полученных в результате образования тройного комплекса по п. 3.
5. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что на стадии (г) интерпретации результатов для каждой группы элементов, содержащих одинаковые аутоантигены, результирующее значение сигнала рассчитывают как медиану значений сигналов от четырех соответствующих элементов, а для группы контрольных элементов, не содержащих иммобилизованных белков, результирующее значение сигнала рассчитывают как медиану значений от сигналов соответствующих элементов.
6. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что на стадии (г) интерпретации результатов проводят анализ групп элементов, содержащих интерферон омега, интерферон альфа-2-a и интерлейкин 22, и в случае, если для двух и более белков отношение результирующего сигнала группы элементов с соответствующим иммобилизованным белком к результирующему сигналу группы контрольных элементов превышает пороговое значение, делают заключение о наличии в сыворотке крови соответствующих аутоантител, ассоциированных с аутоиммунным полигландулярным синдромом I типа.
7. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что на стадии (г) интерпретации результатов проводят анализ групп элементов, содержащих 21-гидроксилазу, глутаматдекарбоксилазу, цитоплазматический антиген островковых клеток, тирозинфосфатазу, тиреоглобулин, тиреопероксидазу, и в случае, если для одного или нескольких белков отношение результирующего сигнала группы элементов с соответствующим иммобилизованным белком к результирующему сигналу группы контрольных элементов превышает пороговое значение, делают заключение о наличии в сыворотке крови соответствующих органоспецифических аутоантител, характерных для мажорных и минорных компонентов аутоиммунных полигландулярных синдромов, включая болезнь Аддисона, сахарный диабет 1 типа, аутоиммунные заболевания щитовидной железы.
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2021106134A RU2021106134A (ru) | 2022-09-12 |
RU2781976C2 true RU2781976C2 (ru) | 2022-10-21 |
Family
ID=
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2816512C1 (ru) * | 2022-11-02 | 2024-04-01 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Способ выявления антител в сыворотке крови, ассоциированных с аутоиммунными эндокринными и коморбидными патологиями, на гидрогелевом биочипе |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2568242C2 (ru) * | 2012-04-24 | 2015-11-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им В.А. Энгельгарда Российской академии наук (ИМБ РАН) | Способ обработки образца крови при проведении иммунологического анализа аллерген-специфических и общих иммуноглобулинов е |
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2568242C2 (ru) * | 2012-04-24 | 2015-11-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им В.А. Энгельгарда Российской академии наук (ИМБ РАН) | Способ обработки образца крови при проведении иммунологического анализа аллерген-специфических и общих иммуноглобулинов е |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Savvateeva E.N. et al., Multiplex autoantibody detection in patients with autoimmune polyglandular syndromes, International journal of molecular sciences, 2021. Т. 22. No. 11, pp. 5502. Butvilovskaya V.I. et al., Multiplex determination of serological signatures in the sera of colorectal cancer patients using hydrogel biochips, Cancer medicine, 2016. Т. 5. No. 7, pp. 1361-1372. Roh Y.H., Lee H.J., Bong K.W. Microfluidic fabrication of encoded hydrogel microparticles for application in multiplex immunoassay, BioChip Journal, 2019. Т. 13. No. 1, pp. 64-81. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2816512C1 (ru) * | 2022-11-02 | 2024-04-01 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Способ выявления антител в сыворотке крови, ассоциированных с аутоиммунными эндокринными и коморбидными патологиями, на гидрогелевом биочипе |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Li et al. | Hydrogel droplet microarrays with trapped antibody-functionalized beads for multiplexed protein analysis | |
JP5703460B2 (ja) | タンパク質含有量の測定方法 | |
US8969009B2 (en) | Identification of discriminant proteins through antibody profiling, methods and apparatus for identifying an individual | |
EP2539713B1 (en) | Method and system for disease diagnosis via simultaneous detection of antibodies bound to synthetic and cellular substrates | |
US20110306511A1 (en) | Methods for multiplex analyte detection and quantification | |
US7700373B2 (en) | Assay method and apparatus | |
RU2746815C1 (ru) | Способ выявления антител - иммуноглобулинов класса g в сыворотке крови к возбудителям тяжелых острых респираторных вирусных инфекций, включая sars-cov-2, с одновременным прогнозом тяжести протекания коронавирусной инфекции covid-19, на гидрогелевом биочипе | |
Manole et al. | Immunoassay techniques highlighting biomarkers in immunogenetic diseases | |
Xia et al. | The glycan array platform as a tool to identify carbohydrate antigens | |
CN109725158B (zh) | 多肽sle2018-v001在诊断系统性红斑狼疮试剂盒中的应用 | |
EP2047269B1 (en) | Measurement of complement activation products on antigen microarrays | |
CN110716050A (zh) | 抗原组合在制备用于肺癌相关自身抗体检测的试剂盒中的用途以及相应的试剂盒和检测方法 | |
US20190204310A1 (en) | Multiplex measure of isotype antigen response | |
JP4920173B2 (ja) | 較正マイクロアレイ | |
RU2781976C2 (ru) | Способ выявления аутоантител в сыворотке крови, ассоциированных с аутоиммунным полигландулярным синдромом i типа, на гидрогелевом биочипе | |
KR20160110701A (ko) | 막 기반 다중튜브를 포함하는 생체 물질 분석 장치 | |
US20190324019A1 (en) | Calibration reagent and method | |
Hartmann et al. | Expanding assay dynamics: a combined competitive and direct assay system for the quantification of proteins in multiplexed immunoassays | |
CN109725156B (zh) | 多肽sle2018-v002在诊断系统性红斑狼疮试剂盒中的应用 | |
RU2816512C1 (ru) | Способ выявления антител в сыворотке крови, ассоциированных с аутоиммунными эндокринными и коморбидными патологиями, на гидрогелевом биочипе | |
Van Lieshout et al. | Three-dimensional flow-through protein platform | |
RU2818115C1 (ru) | Способ определения индекса авидности аутоантител в сыворотке крови человека на гидрогелевых биочипах | |
JP2005069788A (ja) | リン酸化蛋白質の検出方法 | |
CN116735878B (zh) | 多肽在诊断癌症中的应用 | |
CN109725157B (zh) | 多肽sle2018-v003在诊断系统性红斑狼疮试剂盒中的应用 |