RU2816512C1 - Способ выявления антител в сыворотке крови, ассоциированных с аутоиммунными эндокринными и коморбидными патологиями, на гидрогелевом биочипе - Google Patents
Способ выявления антител в сыворотке крови, ассоциированных с аутоиммунными эндокринными и коморбидными патологиями, на гидрогелевом биочипе Download PDFInfo
- Publication number
- RU2816512C1 RU2816512C1 RU2022128472A RU2022128472A RU2816512C1 RU 2816512 C1 RU2816512 C1 RU 2816512C1 RU 2022128472 A RU2022128472 A RU 2022128472A RU 2022128472 A RU2022128472 A RU 2022128472A RU 2816512 C1 RU2816512 C1 RU 2816512C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- autoimmune
- antibodies
- median
- resulting signal
- values
- Prior art date
Links
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 title claims abstract description 87
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 title claims abstract description 74
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 title claims abstract description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 45
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 title claims abstract description 27
- 230000007170 pathology Effects 0.000 title claims abstract description 18
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 73
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 73
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 73
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims abstract description 48
- 238000011161 development Methods 0.000 claims abstract description 42
- 206010047642 Vitiligo Diseases 0.000 claims abstract description 26
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 206010001367 Adrenal insufficiency Diseases 0.000 claims abstract description 23
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 claims abstract description 23
- 208000017515 adrenocortical insufficiency Diseases 0.000 claims abstract description 23
- 201000005000 autoimmune gastritis Diseases 0.000 claims abstract description 23
- 108091022930 Glutamate decarboxylase Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 201000009771 autoimmune polyendocrine syndrome type 1 Diseases 0.000 claims abstract description 22
- 102100031413 L-dopachrome tautomerase Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims abstract description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 claims abstract description 18
- 102000008214 Glutamate decarboxylase Human genes 0.000 claims abstract description 18
- 231100000360 alopecia Toxicity 0.000 claims abstract description 18
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 208000015943 Coeliac disease Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 206010058359 Hypogonadism Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 208000002500 Primary Ovarian Insufficiency Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 206010052649 Primary hypogonadism Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 208000016685 primary ovarian failure Diseases 0.000 claims abstract description 17
- 108010051081 dopachrome isomerase Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 108010074109 interleukin-22 Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 102100030703 Interleukin-22 Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108010011732 Steroid 21-Hydroxylase Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 102000014169 Steroid 21-Hydroxylase Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 claims abstract description 10
- 239000010755 BS 2869 Class G Substances 0.000 claims abstract description 9
- 108010060374 FSH Receptors Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 102000018343 Follicle stimulating hormone receptors Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 9
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims abstract description 9
- 108700039882 Protein Glutamine gamma Glutamyltransferase 2 Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102100038095 Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase 2 Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 102000004248 Zinc Transporter 8 Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108090000702 Zinc Transporter 8 Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102000003746 Insulin Receptor Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 102100040441 Keratin, type I cytoskeletal 16 Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108010066364 Keratin-16 Proteins 0.000 claims abstract description 7
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 claims abstract description 7
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 102000009878 3-Hydroxysteroid Dehydrogenases Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 101000744001 Ruminococcus gnavus (strain ATCC 29149 / VPI C7-9) 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 102000003673 Symporters Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108090000088 Symporters Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 208000020450 carbohydrate metabolism disease Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 210000001914 gastric parietal cell Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 208000017745 inborn carbohydrate metabolic disease Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 108010045648 interferon omega 1 Proteins 0.000 claims abstract description 6
- ZIQRIAYNHAKDDU-UHFFFAOYSA-N sodium;hydroiodide Chemical compound [Na].I ZIQRIAYNHAKDDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 108010084976 Cholesterol Side-Chain Cleavage Enzyme Proteins 0.000 claims abstract description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims abstract description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims abstract description 5
- -1 thyroperoxidase Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 3
- 208000035900 Autoimmune polyendocrinopathy type 1 Diseases 0.000 claims description 21
- 108010036012 Iodide peroxidase Proteins 0.000 claims description 19
- 102000014267 Thyroid peroxidases Human genes 0.000 claims description 19
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 claims description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 102100032250 Trichohyalin Human genes 0.000 claims description 9
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 8
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims description 8
- 108010031667 trichohyalin Proteins 0.000 claims description 8
- 208000000038 Hypoparathyroidism Diseases 0.000 claims description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 5
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical group C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 4
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 claims description 4
- 229940029329 intrinsic factor Drugs 0.000 claims description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 claims description 2
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 claims 1
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 claims 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 25
- 208000030172 endocrine system disease Diseases 0.000 abstract description 18
- 208000031212 Autoimmune polyendocrinopathy Diseases 0.000 abstract description 7
- 208000020176 autoimmune hypoparathyroidism Diseases 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 45
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 21
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 17
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 17
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 102100035902 Glutamate decarboxylase 1 Human genes 0.000 description 5
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 102100033938 AP-1 complex subunit gamma-1 Human genes 0.000 description 4
- 101000779234 Homo sapiens AP-1 complex subunit gamma-1 Proteins 0.000 description 4
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 4
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 4
- 102100034091 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase-like N Human genes 0.000 description 3
- 108060008539 Transglutaminase Proteins 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 102000003601 transglutaminase Human genes 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000026872 Addison Disease Diseases 0.000 description 2
- 206010018429 Glucose tolerance impaired Diseases 0.000 description 2
- 208000013260 Hirata disease Diseases 0.000 description 2
- 101000591210 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase-like N Proteins 0.000 description 2
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 description 2
- 206010022472 Insulin autoimmune syndrome Diseases 0.000 description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 2
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 2
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 2
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 208000025302 chronic primary adrenal insufficiency Diseases 0.000 description 2
- 210000000750 endocrine system Anatomy 0.000 description 2
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150020927 Aire gene Proteins 0.000 description 1
- 108010044226 Class 8 Receptor-Like Protein Tyrosine Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 241000709687 Coxsackievirus Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000027754 Endocrine autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 208000017701 Endocrine disease Diseases 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 101000873546 Homo sapiens Glutamate decarboxylase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000753506 Homo sapiens Potassium-transporting ATPase alpha chain 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000738765 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase N2 Proteins 0.000 description 1
- 101000798165 Homo sapiens Trichohyalin Proteins 0.000 description 1
- 102100036721 Insulin receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010014726 Interferon Type I Proteins 0.000 description 1
- 102000002227 Interferon Type I Human genes 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000711386 Mumps virus Species 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 102100021904 Potassium-transporting ATPase alpha chain 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 1
- 102100037404 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase N2 Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 102100040987 Volume-regulated anion channel subunit LRRC8D Human genes 0.000 description 1
- 101710171985 Volume-regulated anion channel subunit LRRC8D Proteins 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001064 anti-interferon Effects 0.000 description 1
- 208000010928 autoimmune thyroid disease Diseases 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000023852 carbohydrate metabolic process Effects 0.000 description 1
- 235000021256 carbohydrate metabolism Nutrition 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 230000035614 depigmentation Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000011496 digital image analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000002641 glycemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229940098197 human immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000003228 microsomal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000007837 multiplex assay Methods 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 230000003234 polygenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000003498 protein array Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 102220335924 rs1553231820 Human genes 0.000 description 1
- 201000005404 rubella Diseases 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000003335 steric effect Effects 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 108090000721 thyroid hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000004217 thyroid hormone receptors Human genes 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к молекулярной биологии, иммунологии, эндокринологии и может быть использовано в клинической лабораторной диагностике для выявления антител - иммуноглобулинов класса G в сыворотке крови, характерных для аутоиммунных эндокринопатий, таких как аутоиммунные формы нарушения углеводного обмена (сахарный диабет 1 типа и др.), аутоиммунный тиреоидит, гипергонадотропный гипогонадизм аутоиммунной природы, аутоиммунная надпочечниковая недостаточность, гипопаратиреоз аутоиммунной природы, аутоиммунный полигландулярный синдром 1 типа, а также антител, характеризующих развитие коморбидных патологий, включая аутоиммунный гастрит, витилиго, алопецию, целиакию. Способ включает обеспечение гидрогелевого биочипа с иммобилизованными антигенами, такими как декарбоксилаза глютаминовой кислоты, инсулин, проинсулин, рецептор инсулина, транспортер цинка 8, тирозинфосфатаза, антиген островковых клеток поджелудочной железы, тиреопероксидаза, тиреоглобулин, натрий-йодный симпортер, 21-гидроксилаза, рецептор фолликулостимулирующего гормона, 3β-гидроксистероиддегидрогеназа, 17-гидроксилаза, фермент расщепления боковой цепи холестерина, белок 5, содержащий богатый лейцином NACHT-повтор, интерферон омега, интерферон альфа-2-a, интерлейкин 22, внутренний фактор Кастла, альфа-субъединица Н+/К+-АТФазы париетальных клеток желудка, трихогиалин, кератин 16, тирозиназа, дофахром-таутомераза, трансглютаминаза 2. Способ также включает взаимодействие образца сыворотки крови человека с элементами биочипа с образованием специфичных бинарных иммунных комплексов антигенов, иммобилизованных в элементах биочипа, с антителами, находящимися в образце сыворотки крови, детекцию образовавшихся иммунных комплексов, регистрацию и интерпретацию результатов анализа на биочипе. Изобретение позволяет повысить эффективность способа выявления антител в сыворотке крови, ассоциированных с аутоиммунными эндокринными и коморбидными патологиями, на гидрогелевом биочипе. 1 з.п. ф-лы, 7 ил., 6 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к молекулярной биологии, иммунологии, эндокринологии и может быть использовано в клинической лабораторной диагностике для выявления антител в сыворотке крови, характерных для аутоиммунных эндокринопатий, таких как аутоиммунные формы нарушения углеводного обмена (сахарный диабет 1 типа и др.), аутоиммунный тиреоидит, гипергонадотропный гипогонадизм аутоиммунной природы, аутоиммунная надпочечниковая недостаточность, гипопаратиреоз аутоиммунной природы, аутоиммунный полигландулярный синдром 1 типа, а также антител, характеризующих развитие коморбидных патологий, включая аутоиммунный гастрит, витилиго, алопецию, целиакию. Способ основан на проведении мультиплексного иммуноанализа с использованием гидрогелевого биочипа с иммобилизованными белками - антигенами, специфичными к антителам - иммуноглобулинам класса G, ассоциированными с развитием аутоиммунных эндокринных и коморбидных патологий.
Уровень техники
Доля больных с патологией эндокринной системы постоянно увеличивается во всех экономически развитых странах мира. Ведущее место в структуре всех эндокринных заболеваний занимает сахарный диабет (СД), являющийся на сегодняшний день одним из самых опасных вызовов мировому сообществу и важным приоритетом национальных систем здравоохранения. Особую роль в структуре эндокринных заболеваний занимают аутоиммунные эндокринопатий (АЭ) и, в первую очередь, СД 1-го типа - наиболее распространенная АЭ в педиатрии, при которой более 80% случаев заболевания диагностируют в возрасте до 18 лет (American Diabetes Asssociation, 2020, Annual report, https://diabetes.org/sites/default/files/202l-08/ADA-2020-AnnualReport-FINAL.pdf). У детей СД 1-го типа характеризуется выраженной лабильностью гликемии, трудностями в достижении компенсации углеводного обмена, склонностью к развитию других аутоиммунных патологий на фоне повышенной реактивности иммунной системы.
Коморбидность аутоиммунных заболеваний эндокринной системы представляет серьезную проблему для компенсации, поскольку в данном случае резко повышается вероятность мультиорганного поражения. При этом интервал между клиническим дебютом отдельных компонентов АЭ может составить много лет. Таким образом, у пациентов с АЭ важно спрогнозировать развитие других эндокринопатий с помощью исследования иммунологических маркеров - антител к тканям органов-мишеней, которые могут выявляться за несколько лет до появления ранних специфических симптомов заболевания.
Пациенты с наиболее частыми в структуре эндокринных аутоиммунных заболеваний патологиями, такими как сахарный диабет 1 типа (СД1) и аутоиммунные заболевания щитовидной железы (АЗЩЖ), в частности, аутоиммунный тиреоидит (АИТ), подвержены более высокому риску развития других аутоиммунных заболеваний. При этом у 10-40% пациентов с АИТ выявляют аутоиммунный гастрит, в тоже время у примерно 40% пациентов с аутоиммунным гастритом также выявляют АИТ (Cellini et al. Hashimoto's Thyroiditis and Autoimmune Gastritis. Front Endocrinol. 2017. 8:92. doi: 10.3389/fendo.2017.00092). АЗЩЖ могут сосуществовать с другими органоспецифическими аутоиммунными заболеваниями, такими как целиакия (Freeman HJ. Endocrine manifestations in celiac disease. World J Gastroenterol. 2016. 22(38): 8472-8479. doi: 10.3748/wjg.v22.i38.8472) и СД1 (Kakleas et al. Associated autoimmune diseases in children and adolescents with type 1 diabetes mellitus (T1DM). Autoimmun Rev. 2015. 14(9):781-97. doi: 10.1016/j.autrev.2015.05.002). Отмечается также ассоциация АЗЩЖ и СД1 с витилиго - распространенным полигенным аутоиммунным заболеванием, при котором в результате гибели меланоцитов образуются очаги депигментации на коже и/или слизистых оболочках (Трошина с соавт. Распространенность аутоиммунных эндокринных заболеваний у больных витилиго. Терапевтический архив. 2020. 92(10): 88-96).
В свою очередь, СД1 часто ассоциирован с другими органоспецифическими аутоиммунными заболеваниями. На момент постановки диагноза СД1 пациентам рекомендуется обследование на наличие аутоантител, ассоциированных с АЗЩЖ, аутоиммунным гастритом, целиакией, аутоиммунной надпочечниковой недостаточностью (болезнью Аддисона) и другими аутоиммунными заболеваниями. Поскольку ассоциированный аутоиммунитет может развиться в любое время в течение болезни, все пациенты с СД1 должны ежегодно/раз в два года проходить скрининг на наличие соответствующих аутоантител, независимо от предшествующего отрицательного результата тестирования (Kakleas et al. Associated autoimmune diseases in children and adolescents with type 1 diabetes mellitus (T1DM). Autoimmun Rev. 2015. 14(9):781-97. doi: 10.1016/j.autrev.2015.05.02).
В настоящее время не существует простого и недорогого теста для выявления всего спектра аутоиммунных эндокринопатий и коморбидных заболеваний. Отсутствие возможности выявления в одном анализе ряда аутоантител при традиционном подходе к лабораторному тестированию (твердофазные иммунометрические методы, непрямая реакция иммунофлюоресценции) привело к возникновению альтернативного мультиплексного подхода к выявлению коморбидных состояний. Тем не менее, на сегодняшний день число работ, направленных на создание мультиплексного метода для скрининга биомаркеров, ассоциированных с АЭ, весьма ограничено. Существуют отдельные работы по мультиплексному анализу применительно к скринингу биомаркеров СД1 и ряд работ, направленных на поиск новых аутоантител (Amoroso et al. 3 Screen islet cell autoantibody ELISA: A sensitive and specific ELISA for the combined measurement of autoantibodies to GAD65, to IA-2 and to ZnT8. Clin Chim Acta. 2016. 462: 60-64. doi: 10.1016/j.cca.2016.08.013; Bian et al. Tracking the Antibody Immunome in Type 1 Diabetes Using Protein Arrays. J Proteome Res. 2017. 16(l):195-203. doi: 10.1021/acs.jproteome). В патенте CN1448724A "Type 1 diabetes related antigen-antibody simultaneous detection egg white slice", заявлен способ одновременного обнаружения антигенов и антител, соответствующих СД1, с помощью микрочипа, содержащего белки, закрепленные на твердой подложке, в том числе антиген вируса эпидемического паротита, В4 антиген вируса Коксаки, антиген краснухи, антиген респираторно-кишечного вируса, тиреоглобулин (Tg), тиреопероксидаза (ТРО), рецептор тиреоидного гормона, антиген микросомальной фракции щитовидной железы, островковые клетки поджелудочной железы (ICA), инсулин (IAA), декарбоксилазу глютаминовой кислоты (GAD), тирозинфосфатазу (IA2), поверхностный антиген островковых клеток, рецептор инсулина, Н-карбоксипептидаза, IA-2β, антитело против клубочковой базальной мембраны. Однако описанные методы предназначены для выявления СД1 и не содержат аутоантигенов, специфичных для других АЭ и коморбидных заболеваний.
Следует отметить ряд работ, направленных на создание мультиплексных ИФА-тестов для диагностики ряда аутоиммунных эндокринопатий и сопутствующих патологий, в частности тест-система для доклинической диагностики СД1 и целиакии, направленная на выявление аутоантител к IAA, GAD, IA2 и тканевой трансглутаминазе (TGA) (Zhao et al. A multiplex assay combining insulin, GAD, IA-2 and transglutaminase autoantibodies to facilitate screening for pre-type 1 diabetes and celiac disease. J Immunol Methods. 2016. 430: 28-32. doi: 10.1016/j.jim.2016.01.011). Метод основан на проведении конкурентного анализа аутоантител к иммобилизованным в лунке иммунологического планшета через специфической линкер антигенам. При инкубации образца биспецифичные аутоантитела из сыворотки крови связываются одновременно с иммобилизованным аутоантигенами и с добавленным в реакционную смесь аутоантигенами, меченными SULFO-TAG® (Meso Scale Diagnostics, LLC, США). После валидации (Не et al. Large-Scale Screening in General Population Children for Celiac Disease with a Multiplex Electrochemiluminescence (ECL) Assay. J Immunol Res. 2020. 2020: 8897656. doi: 10.1155/2020/8897656), метод был успешно применен в масштабном исследовании «Autoimmunity Study in Kids» (ASK), предназначенном для обследования детей с целью скрининга СД1 и целиакии в общей популяции штата Колорадо, США (Stahl et al. Mass Screening for Celiac Disease: The Autoimmunity Screening for Kids Study. Am J Gastroenterol. 2021. 116 (1): 180-187. doi: 10.14309/ajg.0000000000000751). Метод был также расширен для одновременного скрининга СД1 и нескольких соответствующих аутоиммунных заболеваний, включая целиакию, аутоиммунный полигландулярный синдром 1 типа (АПС-1) и АЗЩЖ и валидирован на образцах пациентов (n=1026) и здоровых доноров (n=1022). Анализ включал определение семи аутоантител против GAD, IAA, IA2, TGA, тиреопероксидазе (ТРО), тиреоглобулину (Tg), интерферону альфа (IFNα) (Gu et al. High-throughput multiplexed autoantibody detection to screen type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases simultaneously. EBioMedicine. 2019. 47: 365-372. doi: 10.1016/j.ebiom.2019.08.036). Масштабная валидации метода с использованием большой когорты пациентов с СД1 и здоровых людей соответствующего возраста была продолжена в работе Jia et al. (A High-Throughput Electrochemiluminescence 7-Plex Assay Simultaneously Screening for Type 1 Diabetes and Multiple Autoimmune Diseases. J Vis Exp. 2020. 29(159). doi: 10.3791/61160). Несмотря на хорошие специфичность и чувствительность разработанного метода, сравнимыми с радиоиммунным анализом (РИА), данный метод имеет ограничения для дальнейшего развития, поскольку основан на применении стандартных ИФА-планшетов и ограничен по возможному числу иммобилизуемых аутоантигенов (максимум 4 на дне 384-луночного планшета или 10 на дне 96-луночного планшета). Кроме того, созданный метод не выявляет биомаркеры развития других АЭ, таких как аутоиммунная надпочечниковая недостаточность (болезнь Аддисона), гипергонадотропный гипогонадизм и гипопаратиреоз аутоиммунной природы, а также коморбидных патологий (алопеция, витилиго, аутоиммунный гастрит и др.).
Из уровня техники известно множество способов, основанных на использовании биологических микрочипов (биочипов) для выявления аутоантител (например, CN1338633A "Protein chip for diagnosing autoimmune diseases", US 20050260770 A1 "Antigen array and diagnostic uses thereof, US6159748A "Evaluation of autoimmune diseases using a multiple parameter latex bead suspension and flow cytometry", CN1866013A "Liquid phase chip for parallel detection of autoantibodies, preparation method and application thereof, CN1338633A "Protein chip for diagnosing autoimmune diseases", US20050260770A1 "Antigen array and diagnostic uses thereof). Однако в настоящее время ни один из заявленных способов не предназначен для выявления аутоантител, характерных для широкого спектра аутоиммунных эндокринопатий и коморбидных заболеваний.
ФГБУ «НМИЦ эндокринологии» Минздрава России и Институтом молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН) разработан метод мультиплексного иммуноанализа на основе гидрогелевого биочипа для одновременного выявления аутоантител, характеризующих АПС-1. Метод предназначен для одновременной детекции органоспецифичных аутоантител и аутоантител к интерферонам (IFN-ω, IFN-α-2a) и интерлейкину IL-22 (Дедов с соавт.Способ выявления аутоантител в сыворотке крови, ассоциированных с аутоиммунным полигландулярным синдромом 1 типа, на гидрогелевом биочипе. Патент РФ №2781976. Заявка на патент РФ 2021106134, опубл. 12.09.2022 г., приоритет от 10.03.2021 г.). Установлено, что для АПС 1 типа характерно наличие по крайней мере двух специфических аутоантител к цитокинам, при этом у 16 из 18 пациентов с АПС-1 был выявлен характерный триплет аутоантител (IFN-ω+IFN-α-2a+IL-22). Совпадение результатов, полученных на биочипе, с методом ИФА, при выявлении органоспецифичных аутоантител у пациентов как с изолированными, так и с множественными эндокринопатиями, составило от 89,9% до 97,6% (Savvateeva et al. Multiplex Autoantibody Detection in Patients with Autoimmune Polyglandular Syndromes. Int J Mol Sci. 2021. 22(11): 5502. doi: 10.3390/ijms22115502). Однако созданный метод позволяет выявлять только биомаркеры развития АПС-1, не обеспечивая анализ антител, характеризующих другие АЭ.
Из анализа уровня техники можно сделать вывод, что в настоящее время существует необходимость разработки способа обнаружения антител, ассоциированных с аутоиммунными эндокринными патологиями и коморбидными заболеваниями, который выгодно отличался бы от известных способов возможностью одновременного выявления широкого спектра антител, а также отличался простотой и быстротой проведения анализа.
Раскрытие сущности изобретения
В результате проведенных обширных научных исследований авторы настоящего изобретения обнаружили, что задача разработки способа выявления антител в сыворотке крови, ассоциированных с аутоиммунными эндокринными и коморбидными патологиями, может быть успешно решена путем использования биологических микрочипов (биочипов), в элементах которых иммобилизованы антигены белковой природы, специфичные для различных аутоиммунных эндокринопатий и коморбидных заболеваний. Заявленный способ выгодно отличается от известных из уровня техники способов возможностью одновременного обнаружения в сыворотке крови до 26 антител (иммуноглобулинов класса G), характерных для развития аутоиммунных форм нарушения углеводного обмена (сахарный диабет 1 типа, латентный диабет взрослых (LADA), инсулиновый аутоиммунный синдром, инсулинорезистентность типа В), аутоиммунного тиреоидита, аутоиммунной надпочечниковой недостаточности, гипергонадотропного гипогонадизма аутоиммунной природы, гипопаратиреоза аутоиммунной природы, аутоиммунного полигландулярного синдрома 1 типа, аутоиммунного гастрита, алопеции, витилиго, целиакии. Метод не требует дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала. Данные, полученные с помощью метода мультиплексного иммуноанализа на биочипах, могут быть использованы для обследования пациентов учреждений эндокринологического профиля и лиц из групп риска, например, имеющих в семейном анамнезе соответствующих больных, с целью прогноза развития других аутоиммунных эндокринопатий и коморбидных заболеваний посредством обнаружения аутоантител к тканям органов-мишеней, которые могут выявляться за несколько лет до появления ранних специфических симптомов заболевания.
В своем первом аспекте данное изобретение обеспечивает способ выявления антител в сыворотке крови, ассоциированных с аутоиммунными эндокринными и коморбидными патологиями, на гидрогелевом биочипе. Способ предусматривает следующие стадии:
а) обеспечение биочипа, представляющего собой матрицу элементов, в которых иммобилизованы белки, каждый белок в четырех повторах, в том числе: антигены, специфичные для аутоиммунных форм нарушения углеводного обмена, таких как сахарный диабет 1 типа, включая декарбоксилазу глютаминовой кислоты, инсулин, проинсулин, рецептор инсулина, транспортер цинка 8, тирозинфосфатазу, антиген островковых клеток поджелудочной железы, антигены, специфичные для аутоиммунного тиреоидита, включая тиреопероксидазу, тиреоглобулин, натрий-йодный симпортер, антиген - 21-гидроксилаза, специфичная для аутоиммунной надпочечниковой недостаточности, антиген - рецептор фолликулостимулирующего гормона, специфичный для гипергонадотропного гипогонадизма аутоиммунной природы, антигены, вовлеченные в развитие аутоиммунной надпочечниковой недостаточности и/или гипергонадотропного гипогонадизма аутоиммунной природы, включая 3β-гидроксистероиддегидрогеназу, 17-гидроксилазу, фермент расщепления боковой цепи холестерина, антиген - белок 5, содержащий богатый лейцином NACHT-повтор, специфичный для гипопаратиреоза аутоиммунной природы, антигены, специфичные для аутоиммунного полигландулярного синдрома 1 типа, включая интерферон омега, интерферон альфа-2-a, интерлейкин 22, антигены, специфичные для аутоиммунного гастрита, включая внутренний фактор Кастла и альфа-субъединицу Н+/К+-АТФазы париетальных клеток желудка, антигены, специфичные для алопеции, включая трихогиалин и кератин 16, антигены, вовлеченные в развитие витилиго и/или алопеции, включая тирозиназу и дофахром-таутомеразу, антиген - трансглютаминаза 2, характерная для развития целиакии, контрольных элементов, содержащих человеческие иммуноглобулины класса G, и группы контрольных элементов, не содержащих иммобилизованных белков;
б) взаимодействие образца сыворотки крови человека с элементами биочипа с образованием специфичных бинарных иммунных комплексов антигенов, иммобилизованных в элементах биочипа, с антителами, находящимися в образце сыворотки крови;
в) детекцию образовавшихся иммунных комплексов с использованием флуоресцентно-меченных антивидовых антител против иммуноглобулинов человека класса G с образованием тройного комплекса «иммобилизованный антиген - антитело -антивидовое флуоресцентно-меченное антитело»;
г) регистрацию флуоресцентной картины биочипа и определение значений флуоресцентных сигналов элементов биочипа, в которых на стадии (в) образовались тройные комплексы, и контрольных элементов, не содержащих иммобилизованных белков, с использованием анализатора флуоресценции и программного обеспечения, с последующей интерпретацией, при которой антитела, ассоциированные с развитием сахарного диабета 1 типа, выявляют в случае, если отношение результирующего сигнала, полученного как медиана значений сигналов четырех элементов, содержащих одинаковые антигены, включая декарбоксилазу глютаминовой кислоты, инсулин, проинсулин, рецептор инсулина, транспортер цинка 8, тирозинфосфатазу, антиген островковых клеток поджелудочной железы, к результирующему сигналу в виде медианы значений контрольных элементов, превышает пороговое значение, антитела, ассоциированные с развитием аутоиммунного тиреоидита, выявляют в случае, если отношение результирующего сигнала, полученного как медиана значений сигналов четырех элементов, содержащих одинаковые антигены, включая тиреопероксидазу, тиреоглобулин, натрий-йодный симпортер, к результирующему сигналу в виде медианы значений контрольных элементов, превышает пороговое значение, антитела, ассоциированные с развитием аутоиммунной надпочечниковой недостаточности, выявляют, если отношение результирующего сигнала, полученного как медиана значений сигналов четырех элементов, содержащих 21-гидроксилазу, к результирующему сигналу в виде медианы значений контрольных элементов, превышает пороговое значение, антитела, ассоциированные с развитием гипергонадотропного гипогонадизма аутоиммунной природы, выявляют, если отношение результирующего сигнала, полученного как медиана значений сигналов четырех элементов, содержащих рецептор фолликулостимулирующего гормона, к результирующему сигналу в виде медианы значений контрольных элементов, превышает пороговое значение, антитела, ассоциированные с развитием аутоиммунной надпочечниковой недостаточности и/или гипергонадотропного гипогонадизма аутоиммунной природы, выявляют в случае, если отношение результирующего сигнала, полученного как медиана значений сигналов четырех элементов, содержащих одинаковые антигены, включая 3β-гидроксистероиддегидрогеназу, 17-гидроксилазу, фермент расщепления боковой цепи холестерина, к результирующему сигналу в виде медианы значений контрольных элементов, превышает пороговое значение, антитела, ассоциированные с развитием гипопаратиреоза аутоиммунной природы, выявляют, если отношение результирующего сигнала, полученного как медиана значений сигналов четырех элементов с иммобилизованным белком 5, содержащем богатый лейцином NACHT-повтор, к результирующему сигналу в виде медианы значений контрольных элементов, превышает пороговое значение, антитела, ассоциированные с аутоиммунным полигландулярным синдромом 1 типа, выявляют в случае, если отношение результирующего сигнала, полученного как медиана значений сигналов четырех элементов, содержащих одинаковые антигены, включая интерферон омега, интерферон альфа-2-a и интерлейкин 22, к результирующему сигналу в виде медианы значений контрольных элементов, для двух и более белков превышает пороговое значение, антитела, ассоциированные с развитием аутоиммунного гастрита, выявляют в случае, если отношение результирующего сигнала, полученного как медиана значений сигналов четырех элементов, содержащих одинаковые антигены, включая внутренний фактор Кастла и альфа-субъединицу Н+/К+-АТФазы париетальных клеток желудка, к результирующему сигналу в виде медианы значений контрольных элементов, превышает пороговое значение, антитела, ассоциированные с развитием алопеции, выявляют в случае, если отношение результирующего сигнала, полученного как медиана значений сигналов четырех элементов, содержащих одинаковые антигены, включая трихогиалин и кератин 16, к результирующему сигналу в виде медианы значений контрольных элементов, превышает пороговое значение, антитела, ассоциированные с развитием витилиго и/или алопеции, выявляют в случае, если отношение результирующего сигнала, полученного как медиана значений сигналов четырех элементов, содержащих одинаковые антигены, включая тирозиназу и дофахром-таутомеразу, к результирующему сигналу в виде медианы значений контрольных элементов, превышает пороговое значение, антитела, ассоциированные с развитием целиакии, выявляют, если отношение результирующего сигнала, полученного как медиана значений сигналов четырех элементов, содержащих 2 трансглютаминазу 2, к результирующему сигналу в виде медианы значений контрольных элементов, превышает пороговое значение.
В одном из воплощений способ характеризуется тем, что биочип представляет собой подложку с гидрогелевыми элементами, полученными способом химической или фотоиндуцируемой сополимеризации, и содержащими иммобилизованные белки - антигены.
Далее изобретение будет раскрыто подробнее со ссылками на фигуры, которые приводятся исключительно с целью иллюстрации и пояснения сущности заявленного изобретения, но которые не предназначены для ограничения объема притязаний.
Краткое описание фигур и таблиц
Фигура 1. Схема размещения элементов биочипа для выявления антител, ассоциированных с аутоиммунными эндокринопатиями и коморбидными патологиями. Элементы биочипа представлены в виде кругов. Каждый из 26 иммобилизованных белков - антигенов, специфичных к антителу, характеризующему развитие АЭ и коморбидных патологий, иммобилизован в четырех повторяющихся элементах. Биочип также включает 4 элемента, обозначенных 'М', содержащих флуоресцентный маркер для обработки сигналов элементов биочипа после проведения анализа. Группа из восьми элементов 'PBS', не содержащих иммобилизованных белков, предназначена для вычисления значения фонового сигнала. Получение флуоресцентных сигналов от контрольных элементов биочипа 'human IgG' (два элемента), включающих иммуноглобулины класса G человека, является необходимым условием для контроля соблюдения условий проведения анализа, исключения грубых мануальных ошибок, а также контроля сохранности способности детектирующих антител узнавать свою мишень.
Фигура 2. Флуоресцентное изображение биочипа (А) и гистограмма результирующих сигналов элементов биочипа (Б) после анализа образца сыворотки крови пациента с аутоиммунным полигландулярным синдромом 1 типа, аутоиммунной надпочечниковой недостаточностью, гипергонадотропным гипогонадизмом аутоиммунной природы и аутоиммунным гастритом.
Фигура 3. Флуоресцентное изображение биочипа (А) и гистограмма результирующих сигналов элементов биочипа (Б) после анализа образца сыворотки крови пациента с сахарным диабетом 1 типа, аутоиммунным тиреоидитом и витилиго.
Фигура 4. Флуоресцентное изображение биочипа (А) и гистограмма результирующих сигналов элементов биочипа (Б) после анализа образца сыворотки крови пациента с сахарным диабетом 1 типа, аутоиммунной надпочечниковой недостаточностью, аутоиммунным гастритом и витилиго.
Фигура 5. Флуоресцентное изображение биочипа (А) и гистограмма результирующих сигналов элементов биочипа (Б) после анализа образца сыворотки крови пациента с аутоиммунным тиреоидитом и алопецией.
Фигура 6. Флуоресцентное изображение биочипа (А) и гистограмма результирующих сигналов элементов биочипа (Б) после анализа образца сыворотки крови пациента с сахарным диабетом 1 типа и витилиго.
Фигура 7. Флуоресцентное изображение биочипа (А) и гистограмма результирующих сигналов элементов биочипа (Б) после анализа образца сыворотки крови здорового донора.
Таблица 1. Перечень антигенов, иммобилизованных на гидрогелевом биочипе, с указанием соответствующей характерной патологии
Осуществление изобретения
Целью изобретения являлось создание способа одновременного выявления антител в сыворотке крови, ассоциированных с аутоиммунными эндокринными патологиями и коморбидными заболеваниями. Способ основан на проведении мультиплексного иммуноанализа образца сыворотоки крови на гидрогелевом биочипе. Биочип для осуществления заявляемого способа представляет собой матрицу трехмерных гидрогелевых элементов на подложке из стекла или пластика с иммобилизованными антигенами белковой природы. Биочип включает 26 антигенов, в том числе декарбоксилазу глютаминовой кислоты (GAD65), инсулин (INS), проинсулин (proINS), рецептор инсулина (IR/CD220), транспортер цинка 8 (ZnT8), тирозинфосфатазу (ICA512), антиген островковых клеток поджелудочной железы (ICA-1), тиреопероксидазу (ТРО), тиреоглобулин (Tg), натрий-йодный симпортер (NIS), 21-гидроксилазу (21-ОН), рецептор фолликулостимулирующего гормона (FSHR), 3β-гидроксистероиддегидрогеназу (3βHSD), 17-гидроксилазу (17-ОН), фермент расщепления боковой цепи холестерина (P450scc), белок 5, содержащий богатый лейцином NACHT-повтор (NALP5), интерферон омега (IFN-ω), интерферон альфа-2-a (IFN-α-2a), интерлейкин 22 (IL-22), внутренний фактор Кастла (GIF), альфа-субъединицу Н+/К+-АТФазы париетальных клеток желудка (АТР4А), трихогиалин (ТСНН), кератин 16 (KRT16), тирозиназу (TYR), дофахром-таутомеразу (TYRP2), трансглютаминазу 2 (TGM2) (Таблица 1). Схема биочипа представлена на Фигуре 1. Каждый антиген иммобилизован в четырех одинаковых гидрогелевых элементах, повторы используются для повышения воспроизводимости анализа.
Технология гидрогелевых биочипов разработана в ИМБ РАН и основана на одновременном формировании гидрогелевых ячеек с иммобилизацией молекулярных зондов (Gryadunov et al. The EIMB hydrogel microarrays technology: thirty years later. Acta Naturae. 2018. 10(4): 4-18, doi: 10.32607/20758251-2018-10-4-4-18). Макропористая структура гидрогелевых элементов формируется за счет сополимеризации мономера -производного метакриловой кислоты, бифункционального кроссшивающего агента и иммобилизуемых молекул. При этом белковые молекулы не нуждаются в дополнительной модификации поскольку имеют в своей структуре соответствующие функциональные группы аминокислот (N-концевые аминогруппы, е-аминогруппы лизинов, сульфгидрильные группы цистеинов и др.). Для белков подобраны условия полимеризации (длина волны при фотополимеризации, температура), позволяющие максимально сохранить их исходную биологическую активность. Иммобилизуемые молекулярные зонды равномерно распределены по всему объему ячейки. За счет развитой поверхности гидрогеля молекулярные зонды иммобилизованы с достаточной плотностью иммобилизации, однако, на значительном удалении друг от друга для нивелирования стерических эффектов. Структура геля предотвращает контакт зондов с гидрофобной подложкой, и обеспечивает водное окружение иммобилизованных биомолекул. Таким образом, иммобилизация белков в геле стабилизирует их нативную структуру и биологическую активность, в противоположность двумерным носителям, которые не обеспечивают водное окружение для молекул белков. Данный метод подходит для иммобилизации белковых молекул и по своим характеристикам выгодно отличается от классических методов планарной иммобилизации (Rubina AY, Kolchinsky A, Makarov АА, Zasedatelev AS. Why 3-D? Gel-based microarrays in proteomics. Proteomics. 2008. 8(4): 817-831. doi: 10.1002/pmic.200700629). Ячейки с иммобилизованными белками располагаются упорядоченными рядами на специально подготовленных подложках. Контроль качества нанесения осуществляется с помощью специализированной оптики и компьютерного анализа изображения.
Для выявления антител гидрогелевый биочип, содержащий иммобилизованные антигены, сначала инкубируют с анализируемой пробой, а затем с флуоресцентно-меченным вторичным антивидовым антителом против иммуноглобулинов человека класса G (IgG) и, наконец, регистрируют и проводят интерпретацию флуоресцентного изображения биочипа. Анализируемый образец представляет собой сыворотку крови человека, предварительно разведенную в 100 раз буфером 100 мМ Трис-HCl с 0.1% Triton Х-100. Во время инкубации ячеек биочипа с пробой происходит образование бинарных комплексов «иммобилизованный антиген - специфическое антитело». Инкубацию с образцом проводят при 37°С в течение ночи, поскольку было установлено, что через 16 часов инкубации на гидрогелевом биочипе процесс формирования бинарных комплексов «антиген-антитело» выходит на насыщение (Rubina AY, Kolchinsky А, Makarov AA, Zasedatelev AS. Why 3-D? Gel-based microarrays in proteomics. Proteomics. 2008. 8(4): 817-831. doi: 10.1002/pmic.200700629). После отмывки непрореагировавших компонентов реакции связавшиеся с иммобилизованными антигенами антитела детектируют вторичными антивидовыми флуоресцентно-меченными антителами. Экспериментально было установлено, что оптимальная рабочая концентрация детектирующих антивидовых антител составляет 5 мкг/мл при 37°, время инкубации 30 мин. Во время инкубации ячеек биочипа с антивидовыми флуоресцентно-меченными антителами происходит образование тройных комплексов «иммобилизованный антиген - специфическое антитело - антивидовое флуоресцентно-меченное антитело». После финальной отмывки проводят регистрацию флуоресцентных изображений биочипов, используя анализатор флуоресценции микрочипов со специальным программным обеспечением, позволяющим вычислить значения флуоресцентного сигнала каждого элемента биочипа (Lysov et al. Microarray analyzer based on wide field fluorescent microscopy with laser illumination and a device for speckle suppression. Biomed Opt Express. 2017 8(11): 4798-4810. doi: 10.1364/BOE.8.004798).
Интерпретацию результатов выполняют посредством сравнения интенсивностей сигналов элементов с иммобилизованными антигенами и интенсивностей сигналов элементов контрольной группы, не содержащих белков. Для каждой функциональной группы элементов n, содержащих одинаковые иммобилизованные антигены, результирующее значение сигнала In рассчитывают как медиану значений от четырех соответствующих элементов. В группе из восьми элементов 'PBS', не содержащих иммобилизованных белков, результирующее значение сигнала Iref рассчитывают как медиану значений от соответствующих сигналов элементов. Наличие антитела в сыворотке крови определяют в случае, если отношение результирующего сигнала In к результирующему сигналу Iref превышает пороговое значение. Ранее, при анализе аутоантител, ассоциированных с АПС-1, экспериментально были установлены и валидированы пороговые значения сигналов элементов биочипа, характеризующие наличие аутоантител в сыворотке крови (Savvateeva et al. Multiplex Autoantibody Detection in Patients with Autoimmune Polyglandular Syndromes. Int J Mol Sci. 2021. 22(11): 5502. doi: 10.3390/ijms22115502; Nuralieva et al. Diagnostic Accuracy of Methods for Detection of Antibodies against Type I Interferons in Patients with Endocrine Disorders. J Pers Med. 2022; 12(12): 1948. doi: 10.3390/jpm12121948). В настоящем изобретении используют пороговые значения In/Iref≥5,0 для IFN-ω, IFN-α-2a, IL-22 и In/Iref≥2,0 для остальных иммобилизованных антигенов.
Заявленный способ обеспечивает возможность скрининга образцов крови от пациентов и лиц из групп риска на наличие 26 антител, ассоциированных с различием аутоиммунных эндокринопатий и коморбидных заболеваний. Способ позволит существенно упростить и удешевить диагностику аутоиммунных эндокринопатий, в том числе, в случаях неполной или скрытой клинической манифестации компонентов коморбидных состояний.
Далее изобретение будет проиллюстрировано примерами, которые предназначены для обеспечения лучшего понимания сущности заявленного изобретения, но не должны рассматриваться как ограничивающие данное изобретение.
Пример 1. Выявление антител в образце сыворотки крови пациента с диагностированным аутоиммунным полигландулярным синдромом 1 типа, аутоиммунной надпочечниковой недостаточностью, гипергонадотропным гипогонадизмом аутоиммунной природы и аутоиммунным гастритом.
Гидрогелевые биочипы изготавливают методом сополимеризационной иммобилизации по ранее разработанной методике (Savvateeva et al. Multiplex Autoantibody Detection in Patients with Autoimmune Polyglandular Syndromes. Int J Mol Sci. 2021. 22(11): 5502. doi: 10.3390/ijms22115502).
Для проведения анализа образец сыворотки крови пациента разводят 1:100 буфером 100 мМ Трис-HCl с 0.1% Triton Х-100. 120 мкл смеси вносят в реакционную камеру биочипа. После инкубации с образцом в течение ночи при 37°С, промежуточной отмывки (PBS с 0,01% Tween 20, 20 мин), споласкивания и высушивания, биочипы проявляют флуоресцентно-меченными антивидовыми антителами (5 мкг/мл; F(ab')2-Goat anti-Human IgG-Cy5; 50 мкл) в буфере PBS с 0,14% поливинилового спирта (50 кДа) и 0,14% поливинилпирролидона (360 кДа). После инкубации (30 мин, 37°С) биочипы отмывают (PBS с 0,01% Tween 20, 30 мин), споласкивают, высушивают центрифугированием. Регистрацию флуоресцентных изображений биочипов проводят с помощью универсального аппаратно-программного комплекса для анализа биочипов (ООО «БИОЧИП-ИМБ», Россия). Вычисление флуоресцентных сигналов осуществляют с помощью программного обеспечения Image Assay (ИМБ РАН).
Фигура 2А иллюстрирует флуоресцентное изображение биочипа после проведения анализа образца сыворотки крови пациента с диагностированным АПС-1, аутоиммунной надпочечниковой недостаточностью, гипергонадотропным гипогонадизмом аутоиммунной природы и аутоиммунным гастритом. Гистограмма нормированных результирующих сигналов элементов биочипа представлена на Фигуре 2Б. В соответствии с алгоритмом интерпретации результатов выявляют превышение пороговых значений для следующих групп элементов: IIFN-ω/Iref≥5,0; IIFN-α-2a/Iref≥5,0; IIL-22/Iref≥5,0, что свидетельствует о присутствии в образце от пациента соответствующих специфичных для АПС-1 аутоантител к IFN-ω, IFN-α-2a, IL-22. В других группах значение результирующих сигналов In/Iref≥2,0 получено для 21-ОН, свидетельствующее о наличии антител к 21-гидролазе, маркеру развития аутоиммунной надпочечниковой недостаточности; для FSHR, свидетельствующее о наличии антител к рецептору фолликулостимулирующего гормона, как маркера развития гипергонадотропного гипогонадизма; для GIF, свидетельствующее о наличии антител к внутреннему фактору Кастла, как маркера развития аутоиммунного гастрита. Кроме того, соотношение In/Iref≥2,0 было также зарегистрировано для групп элементов Tg, ТРО и GAD65, свидетельствующее о наличии антител к тиреоглобулину, тиреопероксидазе и декарбоксилазе глютаминовой кислоты. Однако присутствие таких аутоантител в образцах сыворотки крови больных АПС-1 описано ранее (Savvateeva et al. Multiplex Autoantibody Detection in Patients with Autoimmune Polyglandular Syndromes. Int J Mol Sci. 2021. 22(11):J502. doi: 10.3390/ijms22115502) и не влияет на специфичность анализа. Во всех других группах результирующие значения сигналов не превышали пороговые значения.
Диагноз «АПС-1» пациента был также подтвержден методом секвенирования гена AIRE с обнаружением R257X/c.821delG как описано ранее (Yukina et al. Novel gene mutations regulating immune responses in autoimmune polyglandular syndrome with an atypical course. Journal of the Endocrine Society. 2021. doi:10.1210/jendso/bvab077).
Наличие в исследуемом образце сыворотки крови антител к IFN-α-2a было подтверждено с использованием референсного набора «Human Anti-IFN alpha ELISA kit» (Thermo Fisher, кат. № BMS217); наличие антител к IFN-ω - с использованием референсного набора «Human anti-Interferon Omega-1 ELISA kit anti-IFN-ω1» (BlueGene кат. № E01A4288); наличие антител к 21-ОН - с использованием референсного набора «Human anti cytochrome Р450с21/21 hydroxylase antibody ELISA kit» (BlueGene, кат. № Е01А2059); наличие антител к внутреннему фактору Кастла (GIF) - с использованием соответствующего референсного ИФА-набора (Orgentec, кат. №416-6470); наличие антител к GAD65 - с использованием референсного ИФА-набора (Biomerica, кат. №7009); наличие антител к ТРО - с использованием соответствующего референсного ИФА-набора (Orgentec, кат. №416-5030); наличие антител к Tg - с использованием соответствующего референсного ИФА-набора (Orgentec, кат. №416-5020).
Таким образом, результаты анализа на биочипе по выявлению антител в сыворотке крови пациента с рядом аутоиммунных эндокринопатий и коморбидным заболеванием -аутоиммунным гастритом полностью совпали с результатами референсных тестов.
Пример 2. Выявление антител в образце сыворотки крови пациента с сахарным диабетом 1 типа, аутоиммунным тиреоидитом и витилиго.
Изготовление гидрогелевых биочипов и анализ образца сыворотки крови пациента проводят, как описано в Примере 1.
Фигура 3А иллюстрирует флуоресцентное изображение биочипа после проведения анализа образца сыворотки крови пациента с диагностированным СД1, АИТ и витилиго. Гистограмма нормированных результирующих сигналов элементов биочипа представлена на Фигуре 3Б. В соответствии с алгоритмом интерпретации результатов выявляют превышение пороговых значений для группы элементов IICA-1/Iref≥2,0, что свидетельствует о присутствии в образце от пациента соответствующих специфичных для СД1 антител к антигену островковых клеток поджелудочной железы. Превышение пороговых значений зарегистрировано также для групп элементов ITPO/Iref≥2,0 и ITg/Iref≥2,0, свидетельствующее о наличии антител к тиреоглобулину и тиреопероксидазе, характерных для аутоиммунного тиреоидита. Наконец, превышение пороговых значений зарегистрировано также для групп элементов ITYR/Iref≥2,0 и ITYRP2/Iref≥2,0, свидетельствующее о наличии антител к тирозиназе и дофахром-таутомеразе, характерных для витилиго. Во всех других группах результирующие значения сигналов не превышали пороговые значения.
Наличие в исследуемом образце сыворотки крови антител к ICA-1 было подтверждено с использованием соответствующего референсного набора «GAD1/2 Antibody» (Biomerica, кат. №7010); наличие антител к ТРО - с использованием соответствующего референсного ИФА-набора (Orgentec, кат. №416-5030); наличие антител к Tg - с использованием соответствующего референсного ИФА-набора (Orgentec, кат. №416-5020); наличие антител к тирозиназе (TYR) - с использованием референсного набора «Human Anti-Tyrosinase antibody ELISA kit anti-TYR» (BlueGene кат. № E01A4289); наличие антител к дофахром-таутомеразе (TYRP2) - с использованием референсного набора «Human Anti-Dopachrome Tautomerase antibody ELISA kit anti-DCT» (BlueGene, кат. №Е01А4291).
Таким образом, результаты анализа на биочипе по выявлению антител в сыворотке крови пациента с сахарным диабетом 1 типа, аутоиммунным тиреоидитом и коморбидным заболеванием - витилиго полностью совпали с результатами референсных тестов.
Пример 3. Выявление антител в образце сыворотки крови пациента с сахарным диабетом 1 типа, аутоиммунной надпочечниковой недостаточностью, аутоиммунным гастритом и витилиго.
Изготовление гидрогелевых биочипов и анализ образца сыворотки крови пациента проводят, как описано в Примере 1.
Фигура 4А иллюстрирует флуоресцентное изображение биочипа после проведения анализа образца сыворотки крови пациента с диагностированным СД1, аутоиммунной надпочечниковой недостаточностью, аутоиммунным гастритом и витилиго. Гистограмма нормированных результирующих сигналов элементов биочипа представлена на Фигуре 4Б. В соответствии с алгоритмом интерпретации результатов выявляют превышение пороговых значений для группы элементов IGAD65/Iref≥2,0, что свидетельствует о присутствии в образце от пациента соответствующих характерных для СД1 антител к декарбоксилазе глютаминовой кислоты. Превышение пороговых значений зарегистрировано также для групп элементов I21-OH/Iref≥2,0 и IP450scc/Iref≥2,0, свидетельствующее о наличии антител к 21-гидроксилазе и ферменту расщепления боковой цепи холестерина, характерных для аутоиммунной надпочечниковой недостаточности. Превышение пороговых значений зарегистрировано также для группы IGIF/Iref≥2,0, свидетельствующее о наличии антител к внутреннему фактору Кастла, как маркера развития аутоиммунного гастрита. Наконец, превышение пороговых значений зарегистрировано также для групп элементов ITYR/Iref≥2,0 и ITYRP2/Iref≥2,0, свидетельствующее о наличии антител к тирозиназе и дофахром-таутомеразе, характерных для витилиго. Во всех других группах результирующие значения сигналов не превышали пороговые значения.
Наличие в исследуемом образце сыворотки крови антител к GAD65 было подтверждено с использованием референсного ИФА-набора (Biomerica, кат. №7009); наличие антител к 21-ОН - с использованием референсного набора «Human anti cytochrome Р450с21/21 hydroxylase antibody ELISA kite (BlueGene, кат. №E01A2059); наличие антител к внутреннему фактору Кастла (GIF) - с использованием соответствующего референсного ИФА-набора (Orgentec, кат. №416-6470); наличие антител к тирозиназе (TYR) - с использованием референсного набора «Human Anti-Tyrosinase antibody ELISA kit anti-TYR» (BlueGene кат. №E01A4289); наличие антител к дофахром-таутомеразе (TYRP2) - с использованием референсного набора «Human Anti-Dopachrome Tautomerase antibody ELISA kit anti-DCT» (BlueGene, кат. №E01A4291).
Таким образом, результаты анализа на биочипе по выявлению антител в сыворотке крови пациента с сахарным диабетом 1 типа, аутоиммунной надпочечниковой недостаточностью, аутоиммунным гастритом и витилиго полностью совпали с результатами референсных тестов.
Пример 4. Выявление антител в образце сыворотки крови пациента с аутоиммунным тиреоидитом и алопецией.
Изготовление гидрогелевых биочипов и анализ образца сыворотки крови пациента проводят, как описано в Примере 1.
Фигура 5А иллюстрирует флуоресцентное изображение биочипа после проведения анализа образца сыворотки крови пациента с диагностированным аутоиммунным тиреоидитом и алопецией. Гистограмма нормированных результирующих сигналов элементов биочипа представлена на Фигуре 5Б. В соответствии с алгоритмом интерпретации результатов выявляют превышение пороговых значений для группы элементов ITPO/Iref≥2,0, что свидетельствует о присутствии в образце от пациента соответствующих характерных для аутоиммунного тиреоидита антител к тиреопероксидазе. Превышение пороговых значений зарегистрировано также для группы элементов ITCHH/Iref≥2,0, свидетельствующее о наличии антител к трихогиалину, характерных для алопеции. Во всех других группах результирующие значения сигналов не превышали пороговые значения.
Наличие в исследуемом образце сыворотки крови антител к ТРО было подтверждено с использованием соответствующего референсного ИФА-набора (Orgentec, кат. №416-5030); наличие антител к трихогиалину - с использованием референсного набора «Human Anti-Trichohyalin antibody ELISA kit anti-ТСНН» (BlueGene, кат. №E01A4290).
Таким образом, результаты анализа на биочипе по выявлению антител в сыворотке крови пациента с аутоиммунным тиреоидитом и алопецией полностью совпали с результатами референсных тестов.
Пример 5. Выявление антител в образце сыворотки крови пациента с сахарным диабетом 1 типа и витилиго.
Изготовление гидрогелевых биочипов и анализ образца сыворотки крови пациента проводят, как описано в Примере 1.
Фигура 6А иллюстрирует флуоресцентное изображение биочипа после проведения анализа образца сыворотки крови пациента с диагностированным СД1 и витилиго. Гистограмма нормированных результирующих сигналов элементов биочипа представлена на Фигуре 6Б. В соответствии с алгоритмом интерпретации результатов выявляют превышение пороговых значений для группы элементов IGAD65/Iref≥2,0, что свидетельствует о присутствии в образце от пациента соответствующих специфичных для СД1 антител к декарбоксилазе глютаминовой кислоты. Превышение пороговых значений зарегистрировано также для групп элементов ITYR/Iref≥2,0 и ITYRP2/Iref≥2,0, свидетельствующее о наличии антител к тирозиназе и дофахром-таутомеразе, характерных для витилиго. Во всех других группах результирующие значения сигналов не превышали пороговые значения.
Наличие в исследуемом образце сыворотки крови антител к GAD65 было подтверждено с использованием референсного ИФА-набора (Biomerica, кат. №7009); наличие антител к тирозиназе (TYR) - с использованием референсного набора «Human Anti-Tyrosinase antibody ELISA kit anti-TYR» (BlueGene кат. №E01A4289); наличие антител к дофахром-таутомеразе (TYRP2) - с использованием референсного набора «Human Anti-Dopachrome Tautomerase antibody ELISA kit anti-DCT» (BlueGene, кат. №E01A4291).
Таким образом, результаты анализа на биочипе по выявлению антител в сыворотке крови пациента с сахарным диабетом 1 типа и коморбидным заболеванием - витилиго полностью совпали с результатами референсных тестов.
Пример 6. Выявление антител в образце сыворотки крови здорового донора.
Изготовление гидрогелевых биочипов и анализ образца сыворотки крови пациента проводят, как описано в Примере 1.
Фигура 7А иллюстрирует флуоресцентное изображение биочипа после проведения анализа образца сыворотки крови от здорового донора. Гистограмма нормированных результирующих сигналов элементов биочипа представлена на Фигуре 7Б. В соответствии с алгоритмом интерпретации, ни в одной из групп элементов с иммобилизованными антигенами, результирующие значения сигналов не превышали пороговые значения. Отсутствие сигналов на чипе свидетельствует об отсутствии соответствующих антител в крови здорового донора и о специфичности разработанного способа.
Таким образом, представленное изобретение позволяет выявлять в образце сыворотки крови до 26 антител (иммуноглобулинов класса G), характерных для развития аутоиммунных форм нарушения углеводного обмена (сахарный диабет 1 типа, латентный диабет взрослых (LADA), инсулиновый аутоиммунный синдром, инсулинорезистентность типа В), аутоиммунного тиреоидита, аутоиммунной надпочечниковой недостаточности, гипергонадотропного гипогонадизма аутоиммунной природы, гипопаратиреоза аутоиммунной природы, аутоиммунного полигландулярного синдрома 1 типа, аутоиммунного гастрита, алопеции, витилиго, целиакии. Данные, полученные с помощью метода мультиплексного иммуноанализа на биочипах, могут быть использованы для обследования пациентов учреждений эндокринологического профиля и лиц из групп риска, например, имеющих в семейном анамнезе соответствующих больных, с целью прогноза развития других аутоиммунных эндокринопатий и коморбидных заболеваний посредством обнаружения антител (аутоантител) к тканям органов-мишеней, которые могут выявляться за несколько лет до появления ранних специфических симптомов заболевания.
Все патенты, публикации, научные статьи, и другие документы, и материалы, цитируемые или упоминаемые здесь, включены в настоящее описание путем отсылки в такой степени, как если бы каждый из этих документов был включен путем отсылки индивидуально или приведен здесь в его полном виде.
Хотя предпочтительные воплощения настоящего изобретения и их преимущества были подробно описаны выше, специалист в данной области сможет внести различные изменения, дополнения, не выходя при этом за рамки данного изобретения, которые определяются прилагаемой ниже формулой изобретения.
Claims (6)
1. Способ выявления антител в сыворотке крови, ассоциированных с аутоиммунными эндокринными и коморбидными патологиями, на гидрогелевом биочипе, включающий:
а) обеспечение биочипа, представляющего собой матрицу элементов, в которых иммобилизованы белки, каждый белок в четырех повторах, в том числе: антигены, специфичные для аутоиммунных форм нарушения углеводного обмена, таких как сахарный диабет 1 типа, включая декарбоксилазу глютаминовой кислоты, инсулин, проинсулин, рецептор инсулина, транспортер цинка 8, тирозинфосфатазу, антиген островковых клеток поджелудочной железы, антигены, специфичные для аутоиммунного тиреоидита, включая тиреопероксидазу, тиреоглобулин, натрий-йодный симпортер, антиген - 21-гидроксилаза, специфичная для аутоиммунной надпочечниковой недостаточности, антиген - рецептор фолликулостимулирующего гормона, специфичный для гипергонадотропного гипогонадизма аутоиммунной природы, антигены, вовлеченные в развитие аутоиммунной надпочечниковой недостаточности и/или гипергонадотропного гипогонадизма аутоиммунной природы, включая 3β-гидроксистероиддегидрогеназу, 17-гидроксилазу, фермент расщепления боковой цепи холестерина, белок 5, содержащий богатый лейцином NACHT-повтор, специфичный для гипопаратиреоза аутоиммунной природы, антигены, специфичные для аутоиммунного полигландулярного синдрома 1 типа, включая интерферон омега, интерферон альфа-2-a, интерлейкин 22, антигены, специфичные для аутоиммунного гастрита, включая внутренний фактор Кастла и альфа-субъединицу Н+/К+-АТФазы париетальных клеток желудка, антигены, специфичные для алопеции, включая трихогиалин и кератин 16, антигены, вовлеченные в развитие витилиго и/или алопеции, включая тирозиназу и дофахром-таутомеразу, антиген - трансглютаминаза 2, характерная для развития целиакии, контрольных элементов, содержащих человеческие иммуноглобулины класса G, и группы контрольных элементов, не содержащих иммобилизованных белков;
б) взаимодействие образца сыворотки крови человека с элементами биочипа с образованием специфичных бинарных иммунных комплексов антигенов, иммобилизованных в элементах биочипа, с антителами, находящимися в образце сыворотки крови;
в) детекцию образовавшихся иммунных комплексов с использованием флуоресцентно-меченных антивидовых антител против иммуноглобулинов человека класса G с образованием тройного комплекса «иммобилизованный антиген - антитело - антивидовое флуоресцентно-меченное антитело»;
г) регистрацию флуоресцентной картины биочипа и определение значений флуоресцентных сигналов элементов биочипа, в которых на стадии (в) образовались тройные комплексы, и контрольных элементов, не содержащих иммобилизованных белков, с использованием анализатора флуоресценции и программного обеспечения, с последующей интерпретацией, при которой антитела, ассоциированные с развитием сахарного диабета 1 типа, выявляют в случае, если отношение результирующего сигнала, полученного как медиана значений сигналов четырех элементов, содержащих одинаковые антигены, включая декарбоксилазу глютаминовой кислоты, инсулин, проинсулин, рецептор инсулина, транспортер цинка 8, тирозинфосфатазу, антиген островковых клеток поджелудочной железы, к результирующему сигналу в виде медианы значений контрольных элементов, превышает пороговое значение, антитела, ассоциированные с развитием аутоиммунного тиреоидита, выявляют в случае, если отношение результирующего сигнала, полученного как медиана значений сигналов четырех элементов, содержащих одинаковые антигены, включая тиреопероксидазу, тиреоглобулин, натрий-йодный симпортер, к результирующему сигналу в виде медианы значений контрольных элементов, превышает пороговое значение, антитела, ассоциированные с развитием аутоиммунной надпочечниковой недостаточности, выявляют, если отношение результирующего сигнала, полученного как медиана значений сигналов четырех элементов, содержащих 21-гидроксилазу, к результирующему сигналу в виде медианы значений контрольных элементов, превышает пороговое значение, антитела, ассоциированные с развитием гипергонадотропного гипогонадизма аутоиммунной природы, выявляют, если отношение результирующего сигнала, полученного как медиана значений сигналов четырех элементов, содержащих рецептор фолликулостимулирующего гормона, к результирующему сигналу в виде медианы значений контрольных элементов, превышает пороговое значение, антитела, ассоциированные с развитием аутоиммунной надпочечниковой недостаточности и/или гипергонадотропного гипогонадизма аутоиммунной природы, выявляют в случае, если отношение результирующего сигнала, полученного как медиана значений сигналов четырех элементов, содержащих одинаковые антигены, включая 3β-гидроксистероиддегидрогеназу, 17-гидроксилазу, фермент расщепления боковой цепи холестерина, к результирующему сигналу в виде медианы значений контрольных элементов, превышает пороговое значение, антитела, ассоциированные с развитием гипопаратиреоза аутоиммунной природы, выявляют, если отношение результирующего сигнала, полученного как медиана значений сигналов четырех элементов с иммобилизованным белком 5, содержащим богатый лейцином NACHT-повтор, к результирующему сигналу в виде медианы значений контрольных элементов, превышает пороговое значение, антитела, ассоциированные с аутоиммунным полигландулярным синдромом 1 типа, выявляют в случае, если отношение результирующего сигнала, полученного как медиана значений сигналов четырех элементов, содержащих одинаковые антигены, включая интерферон омега, интерферон альфа-2-a и интерлейкин 22, к результирующему сигналу в виде медианы значений контрольных элементов, для двух и более белков превышает пороговое значение, антитела, ассоциированные с развитием аутоиммунного гастрита, выявляют в случае, если отношение результирующего сигнала, полученного как медиана значений сигналов четырех элементов, содержащих одинаковые антигены, включая внутренний фактор Кастла и альфа-субъединицу Н+/К+-АТФазы париетальных клеток желудка, к результирующему сигналу в виде медианы значений контрольных элементов, превышает пороговое значение, антитела, ассоциированные с развитием алопеции, выявляют в случае, если отношение результирующего сигнала, полученного как медиана значений сигналов четырех элементов, содержащих одинаковые антигены, включая трихогиалин и кератин 16, к результирующему сигналу в виде медианы значений контрольных элементов, превышает пороговое значение, антитела, ассоциированные с развитием витилиго и/или алопеции, выявляют в случае, если отношение результирующего сигнала, полученного как медиана значений сигналов четырех элементов, содержащих одинаковые антигены, включая тирозиназу и дофахром-таутомеразу, к результирующему сигналу в виде медианы значений контрольных элементов, превышает пороговое значение, антитела, ассоциированные с развитием целиакии, выявляют, если отношение результирующего сигнала, полученного как медиана значений сигналов четырех элементов, содержащих 2 трансглютаминазу 2, к результирующему сигналу в виде медианы значений контрольных элементов, превышает пороговое значение.
2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что биочип представляет собой подложку с гидрогелевыми элементами, полученными способом химической или фотоиндуцируемой сополимеризации.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2816512C1 true RU2816512C1 (ru) | 2024-04-01 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6159748A (en) * | 1995-03-13 | 2000-12-12 | Affinitech, Ltd | Evaluation of autoimmune diseases using a multiple parameter latex bead suspension and flow cytometry |
| CN1338633A (zh) * | 2001-09-29 | 2002-03-06 | 上海晶泰生物技术有限公司 | 自身免疫性疾病联合诊断的蛋白质芯片 |
| RU2781976C2 (ru) * | 2021-03-10 | 2022-10-21 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение "Национальный Медицинский Исследовательский Центр Эндокринологии" Министерства Здравоохранения Российской Федерации (Фгбу "Нмиц Эндокринологии" Минздрава России) | Способ выявления аутоантител в сыворотке крови, ассоциированных с аутоиммунным полигландулярным синдромом i типа, на гидрогелевом биочипе |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6159748A (en) * | 1995-03-13 | 2000-12-12 | Affinitech, Ltd | Evaluation of autoimmune diseases using a multiple parameter latex bead suspension and flow cytometry |
| CN1338633A (zh) * | 2001-09-29 | 2002-03-06 | 上海晶泰生物技术有限公司 | 自身免疫性疾病联合诊断的蛋白质芯片 |
| RU2781976C2 (ru) * | 2021-03-10 | 2022-10-21 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение "Национальный Медицинский Исследовательский Центр Эндокринологии" Министерства Здравоохранения Российской Федерации (Фгбу "Нмиц Эндокринологии" Минздрава России) | Способ выявления аутоантител в сыворотке крови, ассоциированных с аутоиммунным полигландулярным синдромом i типа, на гидрогелевом биочипе |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Savvateeva E.N., Yukina M.Y., Nuralieva N.F., Filippova M.A., Gryadunov D.A., Troshina E.A. Multiplex Autoantibody Detection in Patients with Autoimmune Polyglandular Syndromes. Int J Mol Sci. 2021 May 23;22(11):5502. doi: 10.3390/ijms22115502. PMID: 34071130; PMCID: PMC8197071. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20070054326A1 (en) | Antibody-based protein array system | |
| CZ305183B6 (cs) | Způsob detekce imunoglobulinů založený na alergenovém čipu | |
| RU2746815C1 (ru) | Способ выявления антител - иммуноглобулинов класса g в сыворотке крови к возбудителям тяжелых острых респираторных вирусных инфекций, включая sars-cov-2, с одновременным прогнозом тяжести протекания коронавирусной инфекции covid-19, на гидрогелевом биочипе | |
| Xia et al. | The glycan array platform as a tool to identify carbohydrate antigens | |
| Manole et al. | Immunoassay techniques highlighting biomarkers in immunogenetic diseases | |
| JP7455843B2 (ja) | 非小細胞肺がんのバイオマーカーの検出 | |
| CN109725158B (zh) | 多肽sle2018-v001在诊断系统性红斑狼疮试剂盒中的应用 | |
| Chin et al. | Dual-enhanced plasmonic biosensing for point-of-care sepsis detection | |
| CN110716050A (zh) | 抗原组合在制备用于肺癌相关自身抗体检测的试剂盒中的用途以及相应的试剂盒和检测方法 | |
| US20100075864A1 (en) | Measurement of complement activation products on antigen arrays | |
| US20150293120A1 (en) | Marker sequences for rheumatoid arthritis | |
| CA2513317A1 (en) | Composition for the diagnosis of retinal vascular disease comprising aldolase and method for diagnosis using it | |
| RU2816512C1 (ru) | Способ выявления антител в сыворотке крови, ассоциированных с аутоиммунными эндокринными и коморбидными патологиями, на гидрогелевом биочипе | |
| US20190324019A1 (en) | Calibration reagent and method | |
| JP4850001B2 (ja) | 新規ストレスバイオマーカー及びその用途 | |
| DK2721413T3 (en) | Biomarkers for AUTOIMMUNE LIVER DISEASES AND USES THEREOF | |
| CN110850096B (zh) | 生物标记物组及其应用和蛋白芯片、蛋白芯片试剂盒和elisa试剂盒 | |
| CN109725156B (zh) | 多肽sle2018-v002在诊断系统性红斑狼疮试剂盒中的应用 | |
| Guo et al. | A fast universal immobilization of immunoglobulin G at 4 C for the development of array-based immunoassays | |
| US20150323529A1 (en) | Marker sequences for neuromyelitis optica (nmo) and use thereof | |
| RU2781976C2 (ru) | Способ выявления аутоантител в сыворотке крови, ассоциированных с аутоиммунным полигландулярным синдромом i типа, на гидрогелевом биочипе | |
| RU2818115C1 (ru) | Способ определения индекса авидности аутоантител в сыворотке крови человека на гидрогелевых биочипах | |
| WO2016119044A1 (en) | Methods and compositions in diagnosis of chronic fatigue syndrome/myalgic encephalomyelitis | |
| JP2008241704A (ja) | 新規ストレスバイオマーカー及びその用途 | |
| RU2702900C1 (ru) | Способ количественного определения антител к бензо[а]пирену в биологических жидкостях человека |