RU2818115C1 - Способ определения индекса авидности аутоантител в сыворотке крови человека на гидрогелевых биочипах - Google Patents
Способ определения индекса авидности аутоантител в сыворотке крови человека на гидрогелевых биочипах Download PDFInfo
- Publication number
- RU2818115C1 RU2818115C1 RU2023129901A RU2023129901A RU2818115C1 RU 2818115 C1 RU2818115 C1 RU 2818115C1 RU 2023129901 A RU2023129901 A RU 2023129901A RU 2023129901 A RU2023129901 A RU 2023129901A RU 2818115 C1 RU2818115 C1 RU 2818115C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hydrogel
- biochip
- elements
- autoantibodies
- immobilized
- Prior art date
Links
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 title claims abstract description 83
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 48
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 title claims abstract description 45
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 title claims abstract description 35
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 29
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 claims abstract description 28
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 239000010755 BS 2869 Class G Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229940098197 human immunoglobulin g Drugs 0.000 claims abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 15
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 7
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 7
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 claims description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 4
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 abstract description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 108010036012 Iodide peroxidase Proteins 0.000 description 27
- 102000014267 Thyroid peroxidases Human genes 0.000 description 27
- 208000010928 autoimmune thyroid disease Diseases 0.000 description 25
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 22
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 15
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 15
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 15
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 15
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 15
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 13
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 12
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 6
- 206010033701 Papillary thyroid cancer Diseases 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 6
- 208000030045 thyroid gland papillary carcinoma Diseases 0.000 description 6
- 101710167917 Carbonic anhydrase 2 Proteins 0.000 description 5
- 102100024633 Carbonic anhydrase 2 Human genes 0.000 description 5
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 4
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 4
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 238000007430 reference method Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 4
- 208000015943 Coeliac disease Diseases 0.000 description 3
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 description 3
- 102100035278 Pendrin Human genes 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 208000031212 Autoimmune polyendocrinopathy Diseases 0.000 description 2
- 208000023328 Basedow disease Diseases 0.000 description 2
- 208000015023 Graves' disease Diseases 0.000 description 2
- 102000011384 Pendrin Human genes 0.000 description 2
- 108050001616 Pendrin Proteins 0.000 description 2
- 208000024799 Thyroid disease Diseases 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 0.1% Tween 20 Chemical compound 0.000 description 1
- 208000026872 Addison Disease Diseases 0.000 description 1
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 description 1
- 241000272522 Anas Species 0.000 description 1
- 208000003343 Antiphospholipid Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000035900 Autoimmune polyendocrinopathy type 1 Diseases 0.000 description 1
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 208000017701 Endocrine disease Diseases 0.000 description 1
- 241000736355 Euthyroides Species 0.000 description 1
- 108010061711 Gliadin Proteins 0.000 description 1
- 102000008214 Glutamate decarboxylase Human genes 0.000 description 1
- 108091022930 Glutamate decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 208000013260 Hirata disease Diseases 0.000 description 1
- 101000933607 Homo sapiens Protein BTG3 Proteins 0.000 description 1
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 1
- 206010022472 Insulin autoimmune syndrome Diseases 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical class CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 108700039882 Protein Glutamine gamma Glutamyltransferase 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100038095 Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase 2 Human genes 0.000 description 1
- 208000025747 Rheumatic disease Diseases 0.000 description 1
- 108060008539 Transglutaminase Proteins 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 1
- 206010047642 Vitiligo Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 1
- 231100000360 alopecia Toxicity 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000078 anti-malarial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003208 anti-thyroid effect Effects 0.000 description 1
- 239000003430 antimalarial agent Substances 0.000 description 1
- 229940043671 antithyroid preparations Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 201000009771 autoimmune polyendocrine syndrome type 1 Diseases 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000025302 chronic primary adrenal insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000003532 hypothyroidism Diseases 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 229940099472 immunoglobulin a Drugs 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 238000012775 microarray technology Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 201000010198 papillary carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000003498 protein array Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000009392 systemic autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 208000021510 thyroid gland disease Diseases 0.000 description 1
- 102000003601 transglutaminase Human genes 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- ZJHHPAUQMCHPRB-UHFFFAOYSA-N urea urea Chemical compound NC(N)=O.NC(N)=O ZJHHPAUQMCHPRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к молекулярной биологии, иммунологии, эндокринологии и может быть использовано в клинической лабораторной диагностике для определения индекса авидности аутоантител - иммуноглобулинов класса G в сыворотке крови. Способ основан на проведении мультиплексного иммуноанализа на гидрогелевых биочипах, содержащих иммобилизованные белки - аутоантигены. Способ включает стадии инкубации на биочипе образца сыворотки крови с образованием комплексов иммобилизованных аутоантигенов с аутоантителами, добавления хаотропного агента на биочип и детекции комплексов «иммобилизованный аутоантиген - аутоантитело» с использованием флуоресцентно-меченных антивидовых антител против иммуноглобулинов человека класса G. Индекс авидности аутоантитела рассчитывают как процентное отношение флуоресцентного сигнала элемента биочипа, содержащего соответствующий аутоантиген, при анализе, включающем стадию обработки хаотропным агентом, к флуоресцентному сигналу элемента биочипа, полученному без такой обработки. Способ позволяет определять индекс авидности аутоантител в сыворотке крови человека на гидрогелевых биочипах. Определение авидности аутоантител может быть дополнительной характеристикой, позволяющей повысить специфичность иммуноанализа. 2 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 табл., 4 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к молекулярной биологии, иммунологии, эндокринологии и может быть использовано в клинической лабораторной диагностике для определения индекса авидности аутоантител - иммуноглобулинов класса G в сыворотке крови. Способ основан на проведении мультиплексного иммуноанализа на гидрогелевых биочипах, содержащих иммобилизованные белки - аутоантигены. Определение авидности аутоантител может быть дополнительной характеристикой, позволяющей повысить специфичность иммуноанализа.
Уровень техники
Аутоантитела (аутоАТ) - это антитела, вырабатываемые иммунной системой и направленные против одного или нескольких собственных белков человека -аутоантигенов (аутоАГ).
При развитии аутоиммунных заболеваний (АИЗ), таких как, например, системная красная волчанка, ревматоидный артрит, болезнь Грейвса, тиреоидит Хашимото и многих других, в сыворотке крови могут быть выявлены аутоантитела против различных аутоантигенов. При этом аутоАТ могут быть обнаружены до клинической манифестации заболевания (Landegren N. et al. Proteome-wide survey of the autoimmune target repertoire in autoimmune polyendocrine syndrome type 1. Sci Rep.20166:20104. doi: 10.1038/srep20104). Тем не менее, выявление аутоАТ играет роль вспомогательного, но не абсолютного диагностического критерия для АИЗ, поскольку аутоАТ могут присутствовать у здоровых людей и пациентов с неаутоиммунными заболеваниями. В частности, доля здоровых лиц в популяции с положительными тестами на аутоАТ к тиреопероксидазе, основному антигену ткани щитовидной железы, может достигать 26% (Prummel MF, Wiersinga WM. Thyroid peroxidase autoantibodies in euthyroid subjects. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 2005. 19(1): 1-15. doi: 10.1016/j.beem.2004.11.003). У части пациентов при длительно протекающем аутоиммунном заболевании можно наблюдать отсутствие выявляемых аутоАТ (Wilmot-Roussel Н. et al. Factors associated with the presence of glutamic acid decarboxylase and islet antigen-2 autoantibodies in patients with long-standing type 1 diabetes.Diadetes Metab. 2013 39(3): 244-9. doi: 10.1016/j.diabet.2013.01.002). Кроме того, частота выявления аутоАТ резко увеличивается в пожилом возрасте (Bastard Р. et al. Autoantibodies neutralizing type I IFNs are present in ~4% of uninfected individuals over 70 years old and account for ~20% of COVID-19 deaths. Sci Immunol. 2021 6(62): eabl4340. doi: 10.1126/sciimmunol.abl4340).
Для мультиплексного выявления аутоантител в образцах сыворотки крови человека разработан ряд подходов, включая анализ с использованием нитроцеллюлозных мембран или тест-полосок (Line immunoassay, Satoh М. et al. The uses and misuses of multiplex autoantibody assays in systemic autoimmune rheumatic diseases. Front Immunol. 2015. 6:181. doi: 10.3389/fimmu.2015.00181), микросфер со связанными аутоантигенами (мультиплексные панели MILLIPLEX® на основе платформы Luminex®, Merck, Германия, https://www.sigmaaldrich.com/RU/en/technical-documents/product-supporting/milliplex/multiplex-analysis-of-autoantibodies) и белковых микрочипов с иммобилизованными аутоантигенами (Патент РФ 2781976, дата публикации 21.10.2022 г.; Savvateeva E.N. et al. Multiplex Autoantibody Detection in Patients with Autoimmune Polyglandular Syndromes, Int J Mol 5ci. 2021. 22(11):5502. doi: 10.3390/ijms22115502; Kuzumi A. et al. Comprehensive autoantibody profiling in systemic autoimmunity by a highly-sensitive multiplex protein array. Front Immunol 2023. 14: 1255540. doi: 10.3389/fimmu.2023). Принимая во внимание встречаемость ряда аутоАТ у здоровых людей, такие методы могут обладать низкой специфичностью при использовании в качестве диагностического теста.
В настоящее время предполагается, что аутоАТ состоят из политональной смеси, различающейся по сродству к аутоАГ. Одной из дополнительных характеристик для гетерогенной группы определяемых аутоАТ, которая может быть получена при иммуноанализе, является величина силы связывания антител со своим антигеном-мишенью, возникающей в результате многомерных аффинных взаимодействий. Такая сила связывания называется функциональной аффинностью или авидностью AT и широко применяется при диагностике инфекционных заболеваний с целью различения первичной и хронической форм (Correa V.A. et al. Modified ELISA for antibody avidity evaluation: The need for standardization. J. 2021. 44(4): 433-438. doi: 10.1016/j.bj.2020.10.009). В настоящее время высказываются предположения, что при аутоиммунных заболеваниях авидность аутоАТ может оказывать влияние на их патогенность (Oostindie S.C. et al. Avidity in antibody effector functions and biotherapeutic drug design. Nat Rev Drug Discov. 2022. 21(10): 715-735. doi: 10.1038/s41573-022-00501-8). Основная доля исследований, направленных на изучение авидности аутоАТ при АИЗ, сосредоточена на системных заболеваниях, таких как системная красная волчанка и антифосфолипидный синдром (Yuan W. et al. Clinical evaluation of total and high-avidity anti-dsDNA antibody assays for the diagnosis of systemic lupus erythematosus. Lupus. 2019. 28(12): 1387-1396. doi: 10.1177/0961203319877243; Zeng Y. et al. Assessment of a high-avidity IgG ANAs for the diagnosis and activity prediction of systemic lupus erythematosus. Clin Rheumatal. 2020. 39(9): 2619-2629. doi: 10.1007/s10067-020-05040-4; FialovÁ L. et al. Avidity of anti-phospholipid antibodies in relation to their levels. Cent Eur J Immunol. 2020. 45(2): 136-143. doi: 10.5114/ceji.2020.97901). Ряд исследований был посвящен изучению авидности аутоАТ при целиакии (Westerlund A. et al. Affinity maturation of immunoglobulin A anti-tissue transglutaminase autoantibodies during development of coeliac disease. Clin Exp Immunol. 2007. 148(2): 230-40. doi: 10.1111/j.l365-2249.2007.03336.x.; Gelderman K.A. et al. Serum autoantibodies directed against transglutaminase-2 have a low avidity compared with alloantibodies against gliadin in coeliac disease. Clin Exp Immunol 2014. 177(1): 86-93. doi: 10.1111cei.l2302) и сахарном диабете 1 типа (СД1). Данные, известные из литературных источников по авидности аутоАТ при других АИЗ, например щитовидной железы (ЩЖ), крайне ограничены (Zhang Y. et al. Avidity of thyroglobulin antibody in sera from patients with Hashimoto's thyroiditis with different thyroid functional status. Clin Exp Immunol. 2010. 161(1): 65-70. doi: 10.1111/j.l365-2249.2010.04155.x; Silva L.M. et al. Determination of IgG Subclasses and Avidity of Antithyroid Peroxidase Antibodies in Patients with Subclinical Hypothyroidis. Horm Res Paediatr. 2003, 59, 118-124, doi: 10.1159/000069069.).
Авидность антител можно измерить различными иммунологическими методами, в том числе, с помощью модифицированной процедуры иммуноферментного анализа (ИФА), который является наиболее распространенным иммунологическим методом анализа из-за своей простоты и доступности. Характеристикой авидности антител является индекс авидности (ИА), рассчитываемый по формуле:
Для дестабилизации комплекса «антиген-антитело» могут быть использованы изменение рН, ионной силы раствора, и различные денатурирующие агенты, в частности, хаотропные, такие как мочевина и гуанидина тиоцианат. Хаотропные агенты дестабилизируют водородные связи, силы Ван-дер-Ваальса и гидрофобные взаимодействия. После инкубации иммобилизованного на твердой фазе антигена с сывороткой, с помощью подобранной концентрации хаотропных агентов можно элюировать антитела, слабо связанные с антигеном. Таким образом, можно выявить антитела с высокой авидностью. ИА как количественную характеристику авидности антител можно рассматривать как информативный биологический параметр развития патологии или инфекции.
Предложены мультиплексные иммунологические методы определения индекса авидности антител к вирусу папилломы человека (Brady A.M. et al. Description of a novel multiplex avidity assay for evaluating HPV antibodies. J Immunol Methods. 2017. 447: 31-36. doi: 10.1016/j.jim.2017.04.004) и для дифференциации подклассов иммуноглобулинов G к возбудителю малярии (Ssewanyana I. et al. Impact of a Rapid Decline in Malaria Transmission on Antimalarial IgG Subclasses and Avidity. Front Immunol. 2021. 11: 576663. doi: 10.3389/fimmu.2020.576663). В то же время, аналогичные разработки в отношении ИА аутоантител, характеризующих развитие АИЗ, пока не описаны.
Из анализа уровня техники можно сделать вывод, что в настоящее время существует необходимость разработки способа определения индекса авидности аутоантител на основе мультиплексного иммуноанализа, который бы выгодно отличался от известных из уровня техники решений простотой проведения анализа, высокой специфичностью и информативностью в отношении аутоантител, выявляемых в сыворотке крови человека.
Раскрытие сущности изобретения
Техническим результатом изобретения является способ определения индекса авидности аутоантител в сыворотке крови человека на гидрогелевых биочипах. Способ основан на проведении мультиплексного иммуноанализа на гидрогелевых биочипах, содержащих иммобилизованные аутоантигены. Способ предусматривает стадии параллельной инкубации образца сыворотки крови на двух идентичных гидрогелевых биочипах с образованием иммунных комплексов между иммобилизованным аутоАТ и аутоАТ из сыворотки крови, обработку одного из биочипов хаотропным агентом, детекцию иммунных комплексов в элементах биочипов с использованием вторичных флуоресцентно-меченных антител, регистрацию флуоресцентных сигналов биочипов для определения наличия аутоантител в сыворотке крови с последующим расчетом индекса авидности выявленных аутоантител по значениям сигналов от соответствующих элементов каждого из биочипов.
В своем первом аспекте данное изобретение обеспечивает способ определения индекса авидности аутоантител в сыворотке крови человека на гидрогелевых биочипах.
Способ включает следующие стадии:
а) обеспечение биочипа, представляющего собой матрицу элементов, в которых иммобилизованы белки - аутоантигены, специфичные к аутоантителам, каждый - в группе из четырех отдельных элементов, контрольных элементов, содержащих иммуноглобулин человека класса G, и контрольных элементов, не содержащих иммобилизованных белков;
б) параллельную инкубацию образца сыворотки крови человека на двух идентичных биочипах и взаимодействие образца сыворотки с элементами биочипов с образованием специфичных бинарных иммунных комплексов аутоантигенов, иммобилизованных в элементах биочипа, с аутоантителами, находящимися в образце сыворотки крови;
в) обработку одного из биочипов хаотропным агентом;
г) детекцию образовавшихся иммунных комплексов с использованием флуоресцентно-меченных антивидовых антител против иммуноглобулинов человека класса G с образованием тройного комплекса «иммобилизованный аутоантиген -аутоантитело - антивидовое флуоресцентно-меченное антитело»;
д) регистрацию флуоресцентной картины биочипа и определение значений флуоресцентных сигналов элементов биочипа, в которых на стадии (г) образовались тройные комплексы, и контрольных элементов, не содержащих иммобилизованных белков, с использованием анализатора флуоресценции и программного обеспечения;
е) выявление аутоантитела в сыворотке крови в случае, если отношение результирующего сигнала, полученного как медиана значений сигналов группы элементов биочипа с соответствующим иммобилизованным аутоантигеном, не прошедшего обработку хаотропным агентом, к результирующему сигналу в виде медианы значений контрольных элементов, превышает пороговое значение;
ж) расчет индекса авидности выявленного аутоантитела, как процентного отношения результирующего сигнала элемента группы элементов биочипа, содержащих соответствующий аутоантиген и прошедшего стадию обработки хаотропным агентом, к результирующему сигналу группы элементов биочипа, содержащих тот же аутоантиген и полученному без обработки хаотропным агентом.
В одном из воплощений способ характеризуется тем, что биочип представляет собой подложку с гидрогелевыми элементами, полученными способом химической или фотоиндуцируемой сополимеризацией, и содержащими иммобилизованные белки -аутоантигены.
В другом воплощении способ характеризуется тем, что на стадии (в) один из биочипов обрабатывают хаотропным агентом, используя в качестве такового мочевину в концентрации не менее 5 моль/л.
Далее изобретение будет раскрыто подробнее со ссылками на фигуры, которые приводятся исключительно с целью иллюстрации и пояснения сущности заявленного изобретения, но которые не предназначены для ограничения объема притязаний.
Краткое описание фигур и таблиц
Фигура 1. Схема проведения мультиплексного иммуноанализа образца сыворотки крови с использованием двух гидрогелевых биочипов для выявления аутоантител и расчета индекса авидности. Обозначения: PBS - фосфатно-солевой буфер (phosphate buffered saline), 5М Urea - мочевина в концентрации 5 моль/л (хаотропный агент), Ab* -флуоресцентно-меченные антивидовые антитела.
Фигура 2. Схема гидрогелевого биочипа с иммобилизованными аутоантигенами к ткани щитовидной железы для выявления аутоантител, характеризующих аутоиммунные заболевания щитовидной железы. Иммобилизованные аутоантигены - тиреопероксидаза (ТРО), тиреоглобулин (Tg), конъюгат гормона Т3 с пероксидазой хрена (Т3), конъюгат гормона Т4 с пероксидазой хрена (Т4), карбоангидраза 2 (СА2), пендрин (PDS), пируват киназа (РК). Маркерные элементы - иммобилизованный иммуноглобулин человека (human IgG), флуоресцентный маркер Су5 (М). Элементы отрицательного контроля, не содержащие иммобилизованных белков (PBS).
Фигура 3. (А) Значения флуоресцентных сигналов элементов гидрогелевых биочипов с иммобилизованными тиреопероксидазой (ТРО) и тиреоглобулином (Tg) без обработки хаотропным агентом и после обработки. (Б) Расчет индекса авидности для аутоантител к тиреопероксидазе и тиреоглобулину при анализе образца сыворотки крови от здорового донора без признаков эндокринных нарушений.
Фигура 4. Значения индекса авидности аутоантител к тиреоглобулину, полученного с использованием заявленного способа и метода модифицированного ИФА в качестве референсного.
Фигура 5. Распределение значений индекса авидности аутоантител к тиреопероксидазе у пациентов различных когорт и здоровых носителей. (А) индексы авидности у здоровых носителей, пациентов с АИЗЩЖ и с сахарным диабетом 1 типа (СД1). (Б) индексы авидности в подгруппах пациентов с изолированным АИЗЩЖ, АИЗЩЖ в сочетании с другими аутоиммунными заболеваниями (АИЗ), с СД1 и с папиллярным раком щитовидной железы (ПРЩЖ).
Фигура 6. Распределение значений индекса авидности аутоантител к тиреоглобулину у пациентов различных когорт и здоровых носителей. (А) индексы авидности у здоровых носителей, пациентов с АИЗЩЖ и с СД1. (Б) индексы авидности в подгруппах пациентов с изолированным АИЗЩЖ, АИЗЩЖ в сочетании СД1, с другими АИЗ, с СД1 без признаков заболеваний щитовидной железы.
Таблица 1. Характеристики пациентов и здоровых доноров в исследуемой когорте.
Осуществление изобретения
В результате проведенных обширных научных исследований авторы настоящего изобретения обнаружили, что задача определения индекса авидности аутоантител в сыворотке крови человека может быть успешно решена посредством проведения мультиплексного иммуноанализа на гидрогелевых биочипах, содержащих иммобилизованные аутоантигены. Модифицированный мультиплексный анализ, заявленный в настоящем способе, основан на непрямом методе выявления аутоАТ, в котором проводят последовательно: инкубацию содержащего иммобилизованные аутоантигены гидрогелевого биочипа с анализируемой пробой, инкубацию с флуоресцентно-меченными вторичными антивидовыми антителами против иммуноглобулинов человека класса G, регистрацию и интерпретацию флуоресцентного изображения биочипа.
Заявленный в данном изобретении способ включает обеспечение биочипа, содержащего аутоантигены, специфичные для аутоантител, контрольных элементов, не содержащих иммобилизованных белков. Каждый тип аутоантигенов иммобилизован в четырех одинаковых элементах, повторы используются для увеличения воспроизводимости анализа.
Биочип для осуществления заявляемого способа представляет собой матрицу трехмерных гидрогелевых элементов на подложке из стекла или пластика (Gryadunov D.A. et al. The EIMB Hydrogel Microarray Technology: Thirty Years Later. Acta Naturae. 2018, v. 10 (4), p.4-18. doi: 10.32607/20758251-2018-10-4-4-18). Технология гидрогелевых биочипов разработана в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (ИМБ РАН) и основана на ковалентной сополимеризационной иммобилизации антигенов в гидрогелевых ячейках биочипа объемом 0,1 нл. Поскольку структура геля предотвращает контакт соединений с гидрофобной подложкой, и обеспечивает водное окружение биологических молекул; иммобилизация белков в геле стабилизирует их нативную структуру и позволяет сохранить биологическую активность, таким образом данный метод по своим характеристикам выгодно отличается от классических методов планарной иммобилизации. Макропористая структура гидрогелевых элементов формируется за счет сополимеризации мономера - производного метакриловой кислоты, бифункционального кроссшивающего агента и иммобилизуемых белков, имеющих в своей структуре соответствующие функциональные группы аминокислот (N-концевые аминогруппы, е-аминогруппы лизинов, сульфгидрильные группы цистеинов и др.).
В заявленном способе для определения индекса авидности аутоантител используется два идентичных гидрогелевых биочипа, на каждый из которых наносят один и тот же образец анализируемой пробы. Анализируемая проба представляет собой сыворотку крови человека, предварительно разведенную в 100 раз специальным буфером. В ходе инкубации осуществляется взаимодействие образца сыворотки крови человека с элементами биочипа с образованием специфичных бинарных иммунных комплексов аутоантигенов, иммобилизованных в элементах биочипа, с аутоантителами, находящимися в образце сыворотки крови.
После инкубации биочипов с анализируемой пробой на один из биочипов наносят хаотропный агент, дестабилизирующий комплекс «иммобилизованный аутоантиген -аутоантитело», на второй биочип на этой стадии добавляют фосфатно-солевой буфер (PBS), не нарушающий стабильности образованного комплекса (Фигура 1). Ковалентная иммобилизация белков в элементах гидрогелевого биочипа позволяет воздействием хаотропного агента селективно высвободить связавшиеся с иммобилизованным антигеном аутоантитела с низкой авидностью. В качестве денатурирующего белок агента могут быть использованы хаотропные агенты, такие как мочевина, тиомочевина, гуанидин хлорид, гуанидин тиоцианат и др. Для инкубации на биочипе предпочтительно использование мочевины в концентрации не менее 5 моль/л, поскольку меньшие концентрации не оказывают воздействия на стабильность комплекса «иммобилизованный аутоантиген -аутоантитело».
На следующем этапе на каждый из биочипов наносят раствор детектирующих антивидовых флуоресцентно-меченных антител. Предпочтительно используют конъюгаты флуоресцентного красителя Су5 с антивидовыми антителами против иммуноглобулинов человека. Во время инкубации ячеек биочипов с антивидовыми флуоресцентно-меченными антителами происходит образование тройных комплексов «иммобилизованный аутоантиген - специфическое аутоантитело - антивидовое флуоресцентно-меченное антитело».
После финальной отмывки проводят регистрацию флуоресцентных изображений биочипов, используя анализаторы флуоресценции со специальным программным обеспечением, позволяющим вычислить значения флуоресцентного сигнала каждого элемента биочипа.
Выполняют сравнение интенсивностей сигналов элементов с иммобилизованными аутоантигенами и интенсивностей сигналов элементов контрольной группы, не содержащих белков. Для каждой группы элементов n, содержащих одинаковые иммобилизованные аутоантигены, результирующее значение сигнала In рассчитывают как медиану значений от четырех соответствующих элементов. В группе элементов, не содержащих иммобилизованных белков, результирующее значение сигнала Iref рассчитывают как медиану значений от соответствующих сигналов элементов. Наличие аутоантитела в сыворотке крови определяют в случае, если отношение результирующего сигнала In в группы элементов биочипа, не прошедшего обработку хаотропным агентом, к результирующему сигналу Iref превышает пороговое значение. Предпочтительным является пороговое значение In/Iref>2,0, характеризующее наличие аутоантител в сыворотке крови.
В случае определения аутоантитела в сыворотке крови его индекс авидности рассчитывают как процентное отношение результирующего сигнала группы элементов биочипа, содержащих соответствующий аутоантиген и прошедшего стадию обработки хаотропным агентом, к результирующему сигналу группы элементов биочипа, содержащих тот же аутоантиген и полученному без обработки хаотропным агентом. Индекс авидности аутоАТ определяют как процент аутоАТ, которые остались связанными с иммобилизованным антигеном после обработки хаотропным агентом.
Заявленный способ определения индекса авидности аутоантител обеспечивает возможность скрининга образцов крови пациентов на наличие различных аутоантител с одновременным установлением индекса авидности, что позволяет классифицировать такие аутоантитела на низко- и высоко-авидные и делать заключение о специфичности мультиплексного иммуноанализа.
Далее изобретение будет проиллюстрировано примерами, которые предназначены для обеспечения лучшего понимания сущности заявленного изобретения, но не должны рассматриваться как ограничивающие данное изобретение.
Пример 1. Определение индекса авидности аутоантител к аутоантигенам ткани щитовидной железы в образце сыворотки крови с помощью гидрогелевого биочипа
Гидрогелевые биочипы изготавливают методом сополимеризационной иммобилизации по методике, описанной ранее в публикации Savvateeva E.N. et al. Multiplex Autoantibody Detection in Patients with Autoimmune Polyglandular Syndromes. International Journal of Molecular Sciences. 2021. 22, 5502. doi: 10.3390/ijms22115502.
Схема размещения элементов изготовленного биочипа для выявления аутоантител к антигенам ткани щитовидной железы (ЩЖ) приведена на Фигуре 2. Биочип содержит иммобилизованные аутоантигены, в т.ч. тиреопероксидазу (ТРО), тиреоглобулин (Tg), конъюгат гормона Т3 с пероксидазой хрена (Т3), конъюгат гормона Т4 с пероксидазой хрена (Т4), карбоангидразу 2 (СА2), пендрин (PDS), пируват киназу (PK). Биочип также включает маркерные элементы - иммобилизованный иммуноглобулин человека (human IgG), флуоресцентный маркер Су5 (М), и элементы отрицательного контроля, не содержащие иммобилизованных белков (PBS).
Для проведения анализа образец сыворотки крови человека разводят 1:100 буфером 100 мМ Трис-HC1 с 0,1% Triton Х-100, 100 мкл вносят в реакционные камеры двух идентичных биочипов. После инкубации биочипов с образцом сыворотки крови в течение двух часов при 37°С, промежуточной отмывки (PBS, включающий 0,1% Tween 20, 20 мин) на один из биочипов наносят раствор 5М мочевины, на другой - буфер PBS, инкубируют в течение 10 мин и после проводят отмывку буфером PBS, включающим 0,1% Tween 20 в течение 20 мин. Для формирования тройного комплекса «иммобилизованный аутоантиген - специфическое аутоантитело - антивидовое флуоресцентно-меченное антитело» на биочипы наносят 50 мкл коньюгата флуоресцентно-меченных антивидовых антител (Goat anti-Human IgG-Cy5 в буфере PBS с 0,14% поливинилового спирта (50 кДа) и 0,14% поливинилпирролидона (360 кДа)). После инкубации в течение ночи при 37°С биочипы отмывают буфером PBS с 0,01% Tween 20 в течение 30 мин, споласкивают дистиллированной водой и высушивают центрифугированием либо обдувом.
Флуоресцентные изображения биочипов получают с помощью анализатора биочипов с лазерным возбуждением, разработанного в ИМБ РАН, Москва и оснащенного специализированным программным обеспечением (Lysov Y. et al. Microarray analyzer based on wide field fluorescent microscopy with laser illumination and a device for speckle suppression. Biomed Opt. Express 2017. 8, 4798, doi:10.1364/boe.8.004798).
Проводят анализ сигналов элементов биочипа, не подвергавшегося обработке хаотропным агентом. Для каждой группы п из четырех элементов, содержащих иммобилизованный аутоантиген, вычисляют значение результирующего сигнала, как медианное значение сигналов от четырех элементов In. Вычисляют значение результирующего сигнала Iref в группе элементов пустого геля 'PBS', не содержащих иммобилизованных белков, как медиану соответствующих сигналов элементов. Наличие соответствующего аутоантитела в сыворотке крови определяют, если выполняется условие In/Iref≥2,0. На Фигуре 3А представлены сигналы элементов биочипа, соответствующие условию ITPO/Iref≥2,0, ITg/Iref≥2,0 при анализе образца сыворотки крови здорового донора, не имеющего признаков патологии щитовидной железы (ультразвуковое исследование ЩЖ в норме, значение ТТГ=0,669 мМЕ/л (норма)), однако, с выявленными по результатам анализа на биочипе аутоантителами к тиреоглобулину и тиреопероксидазе.
В случае выявления аутоантител к определенному аутоантигену ткани ЩЖ, проводят анализ сигналов элементов биочипа, прошедшего стадию обработки хаотропным агентом, содержащих соответствующий аутоантиген. Для каждой группы n из четырех элементов, содержащих соответствующий аутоантиген, вычисляют значение результирующего сигнала, как медианное значение сигналов от четырех элементов In (Фигура ЗА). Рассчитывают индекс авидности аутоантитела согласно формуле:
На Фигуре 3Б представлены значения индекса авидности аутоантител к тиреопероксидазе и тиреоглобулину при анализе образца сыворотки крови здорового донора, не имеющего признаков патологии щитовидной железы. Значение ИА аутоАТ к ТРО составляет 20,78%, ИА аутоАТ к Tg - 23,24%.
Пример 2. Выявление аутоантител в когорте пациентов и здоровых доноров и корреляция результатов выявления аутоантител к тиреоглобулину и тиреопероксидазе, полученных заявленным способом и референсными методами
Заявляемым способом анализируют образцы сывороток крови от когорты, включающей, суммарно, 10 условно здоровых доноров и 113 пациентов: 19 - с аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы (АИЗЩ), включая 11 - с тиреоидитом Хашимото, 8 - с болезнью Грейвса; 17 - с АИЗЩЖ и сахарным диабетом 1 типа (СД1); 61 - с АИЗЩЖ и другими аутоиммунными заболеваниями (болезнь Аддисона, и/или болезнь Хирата, и/или витилиго, и/или алопеция); 6 - с АИЗЩЖ и папиллярным раком щитовидной железы (ПРЩЖ); 10 - с СД1 без признаков наличия АИЗЩЖ. Характеристики когорты приведены в Таблице 1.
Образцы сыворотки крови анализируют заявленным способом с получением значений индекса авидности выявленных аутоантител, как приведено в Примере 1. Частота выявления аутоантител к различным аутоантигенам мультиплексным методом составляет: к ТРО - 68,3% (84/123), к Tg - 35,8% (44/123), к PDS - 0% (0/123), к Т3-1,6% (2/123), к Т4 - 8,1% (10/123), к СА2 - 0,8% (1/123), к - РК 1,6% (2/123). Для положительных хотя бы по одному аутоантителу образцов рассчитывают индексы авидности в мультиплексном анализе согласно формуле (2).
Все образцы сыворотки крови проверяют на наличие аутоантител к тиреопероксидазе и тиреоглобулину референсным методом хемилюминесцентного иммуноанализа (CLIA). Уровень аутоАТ к ТРО определяют методом хемилюминесцентного иммуноанализа на автоматическом анализаторе ARCHITECT i2000 (Abbott, США). Уровень аутоАТ к Tg определяют методом электрохемилюминесцентного анализа на автоматическом анализаторе Cobas 6000 (Roche Diagnostics, Германия).
Для всех образцов с выявленными аутоАТ к тиреопероксидазе и тиреоглобулину по результатам анализа на биочипах также проверяют их наличие и рассчитывают значения индекса авидности референсным методом модифицированного ИФА. Используют соответствующие наборы компании «Хема-Медика» (Россия). В стандартный протокол производителя добавляют стадию инкубации с хаотропным агентом: после инкубации с образцами и отмывки добавляют по 100 мкл PBS или 5М мочевину в соответствующие лунки микропланшета и инкубируют 5 мин при 37°С, далее отмывают и проводят дальнейшие стадии без изменений. Индекс авидности аутоантител рассчитывают по формуле (1).
Сравнение результатов выявления аутоАТ к ТРО тремя методами показывает удовлетворительную корреляцию. Коэффициенты корреляции при выявлении аутоантител составляют: между CLIA и заявленным способом r=0,6255 (р<0,0001, n=121), между ИФА и заявленным способом r=0,5795 (р<0,0001, n=44), между CLIA и ИФА r=0,6286 (р<0,0001, n=42). Отсутствует положительная корреляция между значениями индекса авидности для аутоАТ к ТРО, полученными заявленным способом и референсным методом модифицированного ИФА.
Сравнение результатов выявления аутоАТ к Tg тремя методами (заявленным способом, CLIA и ИФА) демонстрирует удовлетворительную корреляцию. Коэффициенты корреляции при выявлении аутоантител составляют: между CLIA и заявленным способом r=0,6412 (р<0,0001, n=121), между ИФА и заявленным способом г=0,6417 (р<0,0001, п=44), между CLIA и ИФА r=0,6286 (р<0,0001, n=42). Обнаруживают положительную корреляцию между значениями индекса авидности аутоАТ к Tg, полученными с использованием заявленного способа и методом модифицированного ИФА г=0,6539 (р<0,001, n=34) (Фигура 4).
Пример 3. Определение значений индекса авидности аутоантител к тиреопероксидазе у пациентов различных когорт и здоровых доноров
Заявленным способом получают значения индекса авидности для всех образцов сыворотки крови, в которых были выявлены аутоантитела к тиреопероксидазе, включая пациентов с АИЗЩЖ (n=79) и носителей аутоАТ (n=11) из групп пациентов с СД1 и здоровых доноров. Медианы ИА аутоАТ к ТРО составляет для здоровых носителей аутоАТ 39,9%, пациентов с изолированным АИЗЩЖ 73,4%, пациентов АИЗЩЖ, сочетанной с другими АИЗ 64,8-80,6%, пациентов АИЗЩЖ с сочетанным ПРЩЖ 98,5%, и пациентов носителей аутоАТ с СД1 - 83,2% (Фигура 5). Различие в медианах ИА аутоАТ к ТРО в представленных группах является статистически значимым для групп АИЗЩЖ/ Здоровые носители (р=0,0223) и СД1/ Здоровые носители (р=0,0247), но не является таковым для групп АИЗЩЖ/ СД1 (р>0,05) (Фигура 5А). Внутри группы пациентов с АИЗЩЖ дополнительно проводят разбивку по подгруппам, исходя из изолированного АИЗЩЖ или сочетанного с другими аутоимунными эндокринными и коморбидными патологиями (АИЗЩЖ+др АИЗ; АИЗЩЖ+СД1) или сочетания аутоиммуного процесса в щитовидной железе с папиллярной карциномой (АИЗЩЖ+ПРЩЖ). Различия в медианах ИА аутоАТ к ТРО для подгрупп являются статистически незначимым (р>0,05) (Фигура 5Б).
Пример 4. Определение значений индекса авидности аутоантител к тиреоглобулину у пациентов различных когорт и здоровых доноров
Заявленным способом получают значения индекса авидности для всех образцов сыворотки крови, в которых были выявлены аутоантитела к тиреоглобулину, включая пациентов с АИЗЩЖ (n=35) и носителей аутоАТ (n=9) из групп пациентов с СД1 и здоровых доноров. Медианы ИА аутоАТ к Tg составляет для здоровых носителей аутоАТ 29,9%, пациентов с изолированным АИЗЩЖ 52,6%, пациентов АИЗЩЖ, сочетанной с другими АИЗ 81,4-85,9% и пациентов носителей аутоАТ с СД1 - 92,7% (Фигура 6). Различие в медианах ИА аутоАТ к Tg в представленных группах является статистически значимым для групп АИЗЩЖ/ Здоровые носители (р=0,0071) и СД1/ Здоровые носители (р=0,0201), но не является таковым для групп АИЗЩЖ/ СД1 (р>0,05) (Фигура 6А). При этом медианы ИА аутоАТ к Tg пациентов с СД1 отличаются от пациентов с изолированным АИЗЖ без коморбидных патологий (р=0,0452). Различия в медианах ИА аутоАТ к Tg среди подгрупп пациентов с АИЗЩЖ являются статистически незначимы (р>0,05) (Фигура 6Б).
Таким образом, заявленное изобретение, направленное на определение индекса авидности аутоантител в сыворотке крови с использованием гидрогелевых биочипов, позволяет дифференцировать, например, низкоавидные аутоантитела к тиреоглобулину и тиреопероксидазе у здоровых носителей без признаков заболеваний щитовидной железы от аутоантител у больных с аутоиммунными заболеваниями ЩЖ и, наконец, от высокоавидных аутоантител к тиреоидным белкам у больных с нетиреоидной аутоиммунной патологией, в частности с сахарным диабетом 1 типа. Определение авидности аутоантител, предложенное в настоящем изобретении, может быть дополнительной характеристикой, позволяющей повысить специфичность иммуноанализа.
Хотя предпочтительные воплощения настоящего изобретения и их преимущества были подробно описаны выше, специалист в данной области сможет внести различные изменения, дополнения, не выходя при этом за рамки данного изобретения, которые определяются прилагаемой ниже формулой изобретения.
Claims (10)
1. Способ определения индекса авидности аутоантител в сыворотке крови человека на гидрогелевых биочипах, включающий:
а) обеспечение гидрогелевого биочипа, представляющего собой матрицу элементов, в которых иммобилизованы белки - аутоантигены, специфичные к аутоантителам, каждый - в группе из четырех отдельных элементов, контрольных элементов, содержащих иммуноглобулин человека класса G, и контрольных элементов, не содержащих иммобилизованных белков;
б) параллельную инкубацию образца сыворотки крови человека на двух идентичных гидрогелевых биочипах и взаимодействие образца сыворотки с элементами гидрогелевых биочипов с образованием специфичных бинарных иммунных комплексов аутоантигенов, иммобилизованных в элементах биочипа, с аутоантителами, находящимися в образце сыворотки крови;
в) обработку одного из гидрогелевых биочипов хаотропным агентом;
г) детекцию образовавшихся иммунных комплексов с использованием флуоресцентно-меченных антивидовых антител против иммуноглобулинов человека класса G с образованием тройного комплекса «иммобилизованный аутоантиген-аутоантитело-антивидовое флуоресцентно-меченное антитело»;
д) регистрацию флуоресцентной картины гидрогелевого биочипа и определение значений флуоресцентных сигналов элементов гидрогелевого биочипа, в которых на стадии (г) образовались тройные комплексы, и контрольных элементов, не содержащих иммобилизованных белков, с использованием анализатора флуоресценции и программного обеспечения;
е) выявление аутоантитела в сыворотке крови в случае, если отношение результирующего сигнала, полученного как медиана значений сигналов группы элементов гидрогелевого биочипа с соответствующим иммобилизованным аутоантигеном, не прошедшего обработку хаотропным агентом, к результирующему сигналу в виде медианы значений контрольных элементов, превышает пороговое значение;
ж) расчет индекса авидности выявленного аутоантитела как процентного отношения результирующего сигнала элемента группы элементов гидрогелевого биочипа, содержащих соответствующий аутоантиген, и прошедшего стадию обработки хаотропным агентом, к результирующему сигналу группы элементов биочипа, содержащих тот же аутоантиген и полученному без обработки хаотропным агентом.
2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что гидрогелевый биочип представляет собой подложку с гидрогелевыми элементами, полученными способом химической или фотоиндуцируемой сополимеризации.
3. Способ по п. 1, в котором на стадии (в) в качестве хаотропного агента используют мочевину в концентрации не менее 5 моль/л.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2818115C1 true RU2818115C1 (ru) | 2024-04-24 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2596794C1 (ru) * | 2015-08-03 | 2016-09-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт детских инфекций" Федерального медико-биологического агентства | Способ определения авидности иммуноглобулинов класса g к вирусу герпеса 6 типа |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2596794C1 (ru) * | 2015-08-03 | 2016-09-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт детских инфекций" Федерального медико-биологического агентства | Способ определения авидности иммуноглобулинов класса g к вирусу герпеса 6 типа |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Allison M. Brady. et al. Description of a novel multiplex avidity assay for evaluating HPV antibodies, J. Immunol Methods. 2017 Aug; 447: 31-36. * |
| Соколова В.В. Определение индекса авидности аутоантител к антигенам ткани щитовидной железы: разработка методики мультиплексного анализа на основе специализированного гидрогелевого биочипа, XXV ЗИМНЯЯ МОЛОДЁЖНАЯ НАУЧНАЯ ШКОЛА "ПЕРСПЕКТИВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ", Москва, 07-10 февраля 2023 года, с. 231. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2746815C1 (ru) | Способ выявления антител - иммуноглобулинов класса g в сыворотке крови к возбудителям тяжелых острых респираторных вирусных инфекций, включая sars-cov-2, с одновременным прогнозом тяжести протекания коронавирусной инфекции covid-19, на гидрогелевом биочипе | |
| JPH11513802A (ja) | 抗ポリマー抗体の検出方法およびシリコーン関連疾患（ｓｒｄ）の診断を援助するのに有用な診断試験キット | |
| US10266568B2 (en) | Cyclic citrullinated peptide, rheumatoid arthritis diagnosis composition including the same, rheumatoid arthritis diagnosis method using the peptide or the composition, and method of screening diagnostic marker for rheumatoid arthritis | |
| CN109725158B (zh) | 多肽sle2018-v001在诊断系统性红斑狼疮试剂盒中的应用 | |
| CN110297093B (zh) | 一种检测人免疫球蛋白g4的方法和试剂盒 | |
| US20180059107A1 (en) | Method of detecting or diagnosing sjogren's syndrome based on the presence of auto-antibody against aquaporin 5 | |
| US20100240076A1 (en) | Immunoassay involving mutant antigens to reduce unspecific binding | |
| RU2818115C1 (ru) | Способ определения индекса авидности аутоантител в сыворотке крови человека на гидрогелевых биочипах | |
| JP6499342B2 (ja) | 脳梗塞の診断マーカー | |
| JP6312302B2 (ja) | 脳梗塞の診断マーカー | |
| JP2003507742A (ja) | シェーグレン症候群の診断法 | |
| US20220276243A1 (en) | Inflammatory bowel disease diagnosis method, diagnosis probe and diagnosis kit | |
| CN109725156B (zh) | 多肽sle2018-v002在诊断系统性红斑狼疮试剂盒中的应用 | |
| RU2629310C2 (ru) | Калибровочный реагент и способ | |
| RU2816512C1 (ru) | Способ выявления антител в сыворотке крови, ассоциированных с аутоиммунными эндокринными и коморбидными патологиями, на гидрогелевом биочипе | |
| AU2015280271B2 (en) | Compositions and methods for the diagnosis of systemic autoimmune disease | |
| RU2741382C1 (ru) | Способ иммуноферментного анализа идиотипических и антиидиотипических антител к бензо[а]пирену в биологических жидкостях человека | |
| CN110018156A (zh) | 抗CarP抗体作为系统性红斑狼疮诊断标志物的应用 | |
| KR20180023563A (ko) | 측방유동 면역 분석 기반의 항ccp 항체 및 류마티스인자를 이용한 류마티스 관절염 진단 방법 | |
| RU2781976C2 (ru) | Способ выявления аутоантител в сыворотке крови, ассоциированных с аутоиммунным полигландулярным синдромом i типа, на гидрогелевом биочипе | |
| RU2702900C1 (ru) | Способ количественного определения антител к бензо[а]пирену в биологических жидкостях человека | |
| KR102621473B1 (ko) | 성인형 스틸병 진단용 바이오마커 조성물 | |
| CN109725157B (zh) | 多肽sle2018-v003在诊断系统性红斑狼疮试剂盒中的应用 | |
| CN109725155B (zh) | 多肽sle2018-v004在诊断系统性红斑狼疮试剂盒中的应用 | |
| Savvateeva et al. | Multiplex Avidity Assay for Evaluating Thyroid Autoantibodies |