JP2003507742A - シェーグレン症候群の診断法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、シェーグレン症候群の診断法およびこのために適切な試薬キットに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、シェーグレン症候群の診断法およびこのために適切な試薬キットに
関する。

【０００２】 シェーグレン症候群は、慢性の全身性疾患であり、目の乾燥（乾性角結膜炎）
、口の乾燥（口腔乾燥症）およびその他の粘膜の乾燥を特徴とする。シェーグレ
ン症候群が、目および口のみに現れる場合、１次シェーグレン症候群と呼ぶ。２
次シェーグレン症候群の場合、さらに、リウマチ性同型団の種々の疾患の合併症
として、たとえばリウマチ性関節炎、硬皮症およびエリテマトーデスが現れる。
疾患の罹患率は、人口の約０．１〜０．５％の間で変動する。

【０００３】 シェーグレン症候群の診断法は、特定の分類基準により行うが、これは次のも
のを含む： （１）眼の症状、 （２）口の症状、 （３）眼の所見、つまり陽性のシルマー試験またはローズ・ベーガル試験、 （４）組織学的な所見、 （５）たとえば唾液腺の生検に基づいた唾液腺の所見および （６）自己抗体、たとえば抗Ｒｏ／ＳＳＡまたは抗Ｌａ／ＳＳＢ、抗核抗体ま
たはリウマチ原質因子の検出。

【０００４】 アメリカではシェーグレン症候群を診断するために上記の６つの基準全てを満
たさなくてはならないが、その一方でヨーロッパではこれらの６つの基準のうち
、４つを満たせばよい。

【０００５】 自己抗体はシェーグレン症候群において重要な役割を果たすので、ここ数年来
、この疾患のための特異的マーカーを見出す努力がなされている。しかし、上の
ポイント６で記載した自己抗体は非特異的であり、かつリウマチ性同型団の多く
のその他の疾患においても現れる。

【０００６】 α−フォドリンに対する自己抗体は、シェーグレン症候群を有する患者におい
て検出されている（Haneji et al., Science 276 (1997), 604-607; Miyagawa e
t al., J. Invest. Dermatol. 111(1998) 1189-1192およびWatanabe et al., De
rmatol. 135(1999), 535-539）。免疫グロブリンクラスＧのα−フォドリン−自
己抗体は、シェーグレン症候群を有する患者においても、あるいはまたエリテマ
トーデスを有する患者においても、免疫ブロット法を用いて発見された。これら
の所見はさらに、α−フォドリンに対するＩｇＧ抗体が、シェーグレン症候群の
存在と特別な関連を有していないことを示している。さらにこのデータは比較的
少数の患者において集計されたものであった。ある刊行物中では、１次シェーグ
レン症候群を有する患者４３人および２次シェーグレン症候群を有する患者８人
からなる患者集団を試験した。全てのその後の刊行物は、１次シェーグレン症候
群を有する患者９人および２次シェーグレン症候群を有する患者１５人を試験し
た。

【０００７】 発明者の独自の調査では、より大きな患者集団（シェーグレン症候群を有する
患者９４人、全身性エリテマトーデスを有する患者３５２人および対照者１６０
人）において、シェーグレン症候群のための、α−フォドリンに対するＩｇＧ自
己抗体の高い特異性を確認することができなかった。その代わり、α−フォドリ
ンに対するＩｇＡ自己抗体が、実質的により高い特異性を有する、つまり１次シ
ェーグレン症候群に関して９９．７％であることを示すことができた。

【０００８】 従って本発明は、シェーグレン症候群の診断法に関し、その際、通常、試験す
べき患者に由来する検体中で、α−フォドリンに対するＩｇＡ自己抗体の存在お
よび／または量を測定する。

【０００９】 著しい量の、α−フォドリンに対するＩｇＡ自己抗体の出現は、シェーグレン
症候群、特に１次シェーグレン症候群の存在に対して高度に特異的である、つま
り偽陽性の診断を十分に排除することができる。本方法はその他に、約７０％の
高い感度を有しており、これは、ＩｇＡの測定に加えて、α−フォドリンに対す
るその他の免疫グロブリンクラスの自己抗体、たとえばＩｇＧおよび／またはＩ
ｇＭの存在および／または量を測定する場合に、さらに改善することができる。
たとえばＩｇＧ自己抗体の付加的な測定により、本方法の感度はさらに１０％高
めることができる。

【００１０】 本発明による方法は、定性的もしくは定量的な測定として実施することができ
る。定性的な測定の場合、いわゆる中断(Cut-Off)値を越えるＩｇＡ自己抗体の
濃度は、陽性として分類される。中断値の測定は、陽性および陰性の対照検体を
用いた試験系列の校正により行うことができる。あるいはまた、定量的な測定を
実施してもよい。

【００１１】 試験すべき検体は、一般にヒトの体液であり、これはＩｇＡ抗体および場合に
よりその他の抗体を含有しうることが公知である。適切な体液の例は、血液、血
清、血漿または唾液であり、その際、血清が特に有利である。

【００１２】 α−フォドリンに対するＩｇＡの測定は、専門分野で公知のテストフォーマッ
トにより任意に行うことができる。有利には、α−フォドリン−抗原およびＩｇ
Ａ特異的受容体を使用する。α−フォドリン−抗原は、ヒトの細胞系から得られ
る天然蛋白であってもよいし、または異種の宿主細胞、たとえばE. coliのよう
な細菌細胞または昆虫細胞のような真核宿主細胞中で、組み換えタンパク発現に
より製造された組み換え抗原であってもよい。有利には、天然のα−フォドリン
の配列またはその一部、特にＮ末端フラグメントを有する組み換えα−フォドリ
ン−抗原を使用する。さらに組み換え抗原は、異種のペプチドドメインもしくは
ポリペプチドドメイン、たとえばポリ−Ｈｉｓ−配列を有していてもよく、これ
は発現後の精製を容易にする。

【００１３】 ＩｇＡ特異的受容体は一般に、クラスＡの免疫グロブリンを、その他のクラス
、たとえばＧおよび／またはＭの免疫グロブリンの存在下で選択的に認識するこ
とができる抗体である。この目的のために、ヒトのＩｇＡを用いて、公知の方法
により、試験動物、たとえばヤギ、ラット、マウス、ウサギなどを免疫化するこ
とにより得られるポリクローナル抗ＩｇＡ抗血清を使用することができる。しか
し、同様に相応するモノクローナル抗ＩｇＡ抗体を使用することもできる。

【００１４】 すでに記載したように、特殊なテストフォーマットは一般に重要ではない。し
かし、有利には異種のテストフォーマット、特に有利にはα−フォドリン−抗原
、検出すべきＩｇＡ自己抗体およびＩｇＡ特異的受容体からなる免疫複合体を固
相に結合させる異種のテストフォーマットを使用する（サンドイッチ−テストフ
ォーマット）。しかし同様に、競合的なテストフォーマットを選択してもよい。

【００１５】 異種のサンドイッチ−テストフォーマットの場合、 （ａ）固相上に固定化したα−フォドリン−抗原および標識したＩｇＡ−特異的
受容体または （ｂ）固相上に固定化したＩｇＡ特異的受容体および標識したα−フォドリン
−抗原 を使用することができる。

【００１６】 固相として、反応容器、微量滴定プレート、ビーズ、バイオチップなどを使用
することができる。固相上での抗原もしくは受容体の固定化は、吸着による相互
作用、共有結合または親和性の高い結合対(Bindepaar)（ストレプタビジン／ビ
オチン、ハプテン／抗−ハプテン−抗体）により行うことができる。固定化した
試験試薬はすでに固相結合した形で使用することができるが、しかしまた、試験
の経過においてはじめて固定化してもよい。

【００１７】 本方法を液状試験（たとえば反応容器中で）として、あるいはまた乾燥試験（
たとえば試験ストリップ上で）として実施することができる。

【００１８】 標識した試験試薬は、自体、検出可能な、もしくは信号を与える基を有してい
てもよいし（直接標識）、または検出可能な基と結合可能であってもよい（間接
標識）。標識基は、免疫学的な検出方法のために従来技術から公知の全ての標識
基、たとえば酵素、金属粒子もしくはラテックス粒子、ならびに発光基もしくは
蛍光基から任意で選択することができる。特に有利には酵素、たとえばペルオキ
シダーゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼから選択し、
かつ本方法をＥＬＩＳＡフォーマット中で実施する。

【００１９】 本発明のもう１つの対象は、 （ａ）α−フォドリン−抗原および （ｂ）ＩｇＡ特異的受容体 を含む、シェーグレン症候群を診断するための試験キットである。

【００２０】 さらに試験キット（ｃ）は、試験試薬（ａ）または（ｂ）の一方が結合してい
るか、または結合可能である固相を含んでいてもよい。さらに試験キットは有利
には、試験試薬（ａ）または（ｂ）に結合しているか、または結合可能である標
識基（ｄ）を含んでいてもよい。

【００２１】 さらに、試験キット（ｅ）は、ＩｇＡ自己抗体以外にさらに、その他の免疫グ
ロブリンクラスのα−フォドリン−自己抗体を測定すべき場合には、別の抗体ク
ラス−特異的な試験試薬を少なくとも１種含んでいてもよい。そのような抗体ク
ラス−特異的な試験試薬の例は、ＩｇＧ自己抗体の選択的な結合のための抗Ｉｇ
Ｇ抗体または蛋白質Ｇ、もしくはＩｇＭ自己抗体の選択的な結合のための抗Ｉｇ
Ｍ抗体である。試験キットはさらに、また別の通例の試薬、たとえば緩衝液、基
質および洗浄液を含有していてもよい。

【００２２】 本発明をさらに以下の実施例により明らかにする。

【００２３】 実施例 １．材料および方法 １．１ 血清 １次シェーグレン症候群を有する患者の血清を、オースチン、テキサス（ｎ＝
４９）、フライブルク、ドイツ（ｎ＝２０）およびハノーファー、ドイツ（ｎ＝
１８）で回収した。シェーグレン症候群の診断は、オースチンではアメリカ合衆
国、サン・ディエゴ基準により、およびドイツではシェーグレン症候群の分類の
ために修正を加えたヨーロッパ基準により行った。

【００２４】 ２次シェーグレン症候群を有する、または有していない、全身性エリテマトー
デス（ＳＬＥ）患者の血清を、ハノーファーで入手した。２次シェーグレン症候
群の診断は、修正を加えたヨーロッパ分類基準の使用下で行った。

【００２５】 付加的に、予めドイツのＳＬＥ調査のために回収してあった、超低温凍結した
血清検体３５２のアリコートを使用した。３５２人の患者はみな、ＳＬＥの診断
のためのＡＣＲ基準の少なくとも４つの基準を満たしていた（Tan et al., Arth
r. and Rheum. 25(1982), 1271-1277）。オーバーラップする症候群を排除した
。先行する調査において、患者の臨床および実験室パラメータに関して詳細に特
徴付けた。これらのパラメータのいくつかは、３５２人の患者全てにおいて測定
しなかったので、入手可能なデータにより相関させ、その際、それぞれの臨床パ
ラメータのために、少なくとも３３９人の患者のデータを、およびそれぞれの実
験室パラメータのために、少なくとも１人の患者のデータを使用した。

【００２６】 血液提供者の１６０の血清を検出法の特殊性のための対照として調査した。

【００２７】 １．２ ＥＬＩＳＡによるα−フォドリンに対する抗体の検出 α−フォドリンのＮ−末端フラグメントのためのｃＤＮＡは、ヒトの唾液線か
ら単離したｍＲＮＡからＰＣＲによりクローン化した。プライマーは位置９３〜
１３０（上流）および１８２７〜１８８２（下流）を有しており、その際、１７
３１ｂｐを有する構成が得られた（番号はMoon et al., J. Biol. Chem. 265 (1
991) 4427-4433による）。ｃＤＮＡは、原核および真核発現ベクター（ｐｅｔ３
２ｂ(Novagen)もしくはｐＶＬ１３９３(Pharmingen)）中でクローン化し、かつ
Ｈｉｓ−Ｔａｇ−融合蛋白質の形でE. coliおよびＳｆ９昆虫細胞中で発現した
。組み換え蛋白質をＥＬＩＳＡプレートの被覆のために使用した。

【００２８】 血清を希釈緩衝液ｐＨ７．４（７５ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Tween 20）中で
１：１００に希釈した。希釈した血清１００μｌをＥＬＩＳＡプレート上で３０
分間培養した。希釈緩衝液を用いて自動化ＥＬＩＳＡ洗浄装置（SLT Labinstrum
ents, Groedig, Oesterreich）の使用下に３回洗浄工程を行った後、ＩｇＧまた
はＩｇＡに対して特異的な、ホースラディッシュペルオキシダーゼにより標識し
たヤギの抗血清を１５分間添加した。希釈緩衝液を用いてさらに３回洗浄工程を
行った後、テトラメチルベンジジン１００μｌを基質として１５分間添加した。
反応を１Ｍ ＨＣｌ １００μｌの添加により停止し、かつＥＬＩＳＡ評価装置
（Rainbow Reader SLT-Labinstruments, Groedig, Oesterreich）を使用して４
５０ｎｍで吸光率（ＯＤ）を測定した。

【００２９】 ＥＬＩＳＡのための標準を測定するために、１次シェーグレン症候群を有する
患者１０人の血清を測定した。最も高いＯＤを有する血清中のα−フォドリン−
抗体の濃度を１００Ｕ／ｍｌで任意に定義した。この血清を実験室の標準として
使用した。

【００３０】 １日毎の校正のために、この参照血清を０、１２、５、２５、５０および１０
０Ｕ／ｍｌに相応する濃度で使用した。標準曲線を得るために、測定されたＯＤ
値を対数／均等目盛でプロットした。

【００３１】 １．３ リウマチ原質因子および自己抗原ＲｏおよびＬａの検出 ＩｇＧ−、ＩｇＡ−およびＩｇＭ−リウマチ原質因子ならびに抗原Ｒｏおよび
Ｌａに対する自己抗体を、市販のＥＬＩＳＡシステムを使用して、製造元（ORGe
n Tec GmbH、マインツ、ドイツ）の規定に従って測定した。

【００３２】 １．４ 統計学的評価 ＳＬＥ患者から得られる３５２の血清中のα−フォドリンに対するＩｇＧ抗体
およびＩｇＡ抗体の存在を、臨床パラメータおよび実験室パラメータを用いて相
関させた。

【００３３】 統計学的な評価のために、非パラメータ試験を使用した。というのも、リウマ
チ原質因子の分布は、明らかにガウス分布から逸脱していたからである。臨床パ
ラメータおよび実験室パラメータによるα−フォドリンに対する抗体の校正は、
カイ２乗試験を使用して測定した。０．０５より小さい連合確率を、統計学的に
顕著であると見なした。

【００３４】 ２．結果 ２．１ 患者の検体および対照検体における、α−フォドリンに対するＩｇＡ およびＩｇＧ抗体の分布 １６０人の血液提供者の血清中で、α−フォドリンに対するＩｇＡ抗体もしく
はＩｇＧ抗体の濃度の平均値（±標準偏差）は、９．２Ｕ／ｍｌ±５．５Ｕ／ｍ
ｌもしくは１１．１Ｕ／ｍｌ±７．２Ｕ／ｍｌであった。α−フォドリンに対す
る抗体を有する血清のパーセンテージは、中断値を使用して算出し、これは血液
提供者の血清中のα−フォドリンに対する抗体の平均濃度プラス３の標準偏差と
して定義した（ＩｇＡ抗体に関して２５Ｕ／ｍｌに、およびＩｇＧ抗体に関して
３２Ｕ／ｍｌに相応）。

【００３５】 １．２に記載したＥＬＩＳＡ試験を用いて、α−フォドリンに対するＩｇＡ抗
体を１次シェーグレン症候群の患者８３人の血清の５３中で同定した（６４％）
。ＳＬＥおよびシェーグレン症候群を有する１５人の患者からの血清の７つ中で
同様にα−フォドリンに対するＩｇＡ抗体が判明した（４７％）。

【００３６】 α−フォドリンに対するＩｇＡ抗体は、シェーグレン症候群を有していない１
６０の血液提供者の血清の１つの中およびＳＬＥ患者の５０の血清中の１つので
検出可能であったにすぎない。ここから９９．７％の試験特異性が生じた。

【００３７】 α−フォドリンに対するＩｇＧ抗体は、１次シェーグレン症候群を有する患者
からの８３の血清の４８中で検出された（５７％）。ＳＬＥおよび２次シェーグ
レン症候群を有する患者からの１５の血清の６つ中で、同様にα−フォドリンに
対するＩｇＧ抗体が判明した（４０％）。

【００３８】 α−フォドリンに対するＩｇＧ抗体は、１６０の血液提供者血清の３つ中で検
出され、かつシェーグレン症候群を有していないＳＬＥ患者からの５０の血清中
では検出されなかった。

【００３９】 １次シェーグレン症候群を有する患者の１０％は、ＩｇＧ抗体を有していたの
みで、α−フォドリンに対するＩｇＡ抗体は有していなかった。

【００４０】 １次シェーグレン症候群を有する８３人の患者において、ＩｇＧ−およびＩｇ
Ｇ−抗−α−フォドリン−抗体の存在と、Ｒｏ、ＬａおよびＩｇＡもしくはＩｇ
Ｇリウマチ原質因子に対する自己抗体との相関関係を見出すことはできなかった
。

【００４１】 ２．２ ＳＬＥの臨床パラメータによるα−フォドリンに対するＩｇＡ抗体お よびＩｇＧ抗体の関連 α−フォドリンに対するＩｇＡ抗体の存在は、紅斑（ｐ＜０．０１）および胎
児損失（ｐ＜０．０５）のパラメータと正相関を示した。α−フォドリンに対す
るＩｇＧ抗体の存在は、皮膚血管炎（ｐ＜０．０５）および関節痛（ｐ＜０．０
５）と相関した。

【００４２】 ２．３ ＳＬＥ実験室パラメータによるα−フォドリンに対するＩｇＧ抗体お よびＩｇＡ抗体の関連 α−フォドリンに対するＩｇＡ抗体の存在は、高められたＩｇＡ濃度（ｐ＜０
．００１）、高められたＩｇＭ濃度（ｐ＜０．０５）、好中球減少（ｐ＜０．０
５）、カルジオリピンに対するＩｇＧ抗体（ｐ＜０．０１）、β２グリコプロテ
インに対するＩｇＡ自己抗体（ｐ＜０．００１）およびＩｇＭ自己抗体（ｐ＜０
．０５）およびＩｇＧリウマチ原質因子（ｐ＜０．０５）のパラメータとの正相
関を示した。α−フォドリンに対するＩｇＧ抗体は、陽性のクリチジエ反応(Cri
tidie-Reaktion)（ｐ＜０．０５）と弱い相関を示したのみである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 トルステン ヴィッテ ドイツ連邦共和国 ハノーファー イビク スヴェーク 16ベー

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 シェーグレン症候群の診断法において、患者由来の検体中で
   、α−フォドリンに対するＩｇＡ自己抗体の存在および／または量を測定するこ
   とを特徴とする、シェーグレン症候群の診断法。
2. 【請求項２】 検体として、ヒトの体液、特に血液、血清、血漿または唾液
   を使用する、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 ＩｇＡ自己抗体を測定するために、α−フォドリン−抗原お
   よびＩｇＡ特異的受容体を使用する、請求項１または２記載の方法。
4. 【請求項４】 異種のテストフォーマットを使用する、請求項１から３まで
   のいずれか１項記載の方法。
5. 【請求項５】 サンドイッチ−テストフォーマットを使用する、請求項４記
   載の方法。
6. 【請求項６】 （ａ）固定化α−フォドリン−抗原および標識したＩｇＡ特
   異的受容体または （ｂ）固定化ＩｇＡ特異的受容体および標識したα−フォドリン−抗原 を使用する、請求項４または５記載の方法。
7. 【請求項７】 標識基を酵素、金属粒子もしくはラテックス粒子ならびに発
   光基もしくは蛍光基から選択する、請求項６記載の方法。
8. 【請求項８】 さらに、α−フォドリンに対するその他の免疫グロブリンク
   ラスの自己抗体の存在および／または量を測定する、請求項１から７までのいず
   れか１項記載の方法。
9. 【請求項９】 さらに、α−フォドリンに対するＩｇＧ自己抗体および／ま
   たはＩｇＭ自己抗体を測定する、請求項９記載の方法。
10. 【請求項１０】 （ａ）α−フォドリン−抗原および （ｂ）ＩｇＡ特異的受容体 を含む、シェーグレン症候群の診断用の試験キット。
11. 【請求項１１】 （ａ）試験試薬（ａ）または（ｂ）が結合しているか、ま
    たは結合可能である固相を含む、請求項１０記載の試験キット。
12. 【請求項１２】 （ｄ）試験試薬（ａ）または（ｂ）に結合しているか、ま
    たはこれらと結合可能な標識基 を含む、請求項１０または１１記載の試験キット。
13. 【請求項１３】 さらに、 （ｅ）少なくとも１種の別の抗体クラス特異的な試験試薬 を含む、請求項１０から１２までのいずれか１項記載の試験キット。