DE102006043369A1

DE102006043369A1 - Verfahren zur Diagnose und Verlaufskontrolle von Multipler Sklerose sowie die Verwendung eines Test-Kits hierfür

Info

Publication number: DE102006043369A1
Application number: DE102006043369A
Authority: DE
Inventors: Torsten Matthias
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2006-09-15
Filing date: 2006-09-15
Publication date: 2008-03-27
Also published as: WO2008031429A1; US20100003696A1; EP2035832A1; JP2010503835A

Abstract

Es wird ein Verfahren sowie ein Test-Kit zur Diagnose und Verlaufskontrolle von Multipler Sklerose durch Ermittlung von Autoantikörpern in Körperflüssigkeiten beschrieben, in dem diejenigen Antikörper bestimmt werden, die an ein Spektrin binden. Ein typisches Spektrin ist alpha-Fodrin.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose von Multipler Sklerose, insbesondere zur Diagnose und Verlaufskontrolle von bevorstehenden bzw. beginnenden entzündlichen Schüben, sowie die Verwendung eines Test-Kits hierfür.
Multiple Sklerose (MS), die auch als Enzephalomyelitis disseminata bezeichnet wird, ist eine primär entzündliche Erkrankung des zentralen Nervensystems. Sie stellt jedoch keine homogene Krankheitsform dar, sondern beschreibt einen heterogenen Formenkreis entzündlich demyelisierender Erkrankungen des zentralen Nervensystems mit sehr variablen klinischen Verläufen. Dabei kann der Verlauf von einem einmaligen Ereignis bzw. einem gutartigen Verlauf mit nur wenigen Schüben und geringem Behinderungsrisiko bis hin zu den klassischen schubhaft remittierenden Verlaufsformen mit oder ohne sekundär chronisch progredienten Verläufen reichen. Sie tritt gehäuft zwischen dem 20. und 50. Lebensjahr auf, wobei Frauen annähernd doppelt so häufig betroffen sind wie Männer. Auch eine Assoziation mit den HLA-Antigenen, insbesondere HLA-DR2, sowie HLA-DW2 tritt gehäuft auf. Bei der Multiplen Sklerose handelt es sich um eine Autoimmunerkrankung, bei der die körpereigene Immunabwehr die Nervenstränge umwickelnden Schwannschen Scheidezellen, bzw. Myelinscheiden angreifen und zerstören. Dadurch wird die Weiterleitung der Nerven reize geschädigt. Dies führt im weiteren Krankheitsverlauf dazu, dass sowohl die sensorischen als auch die motorischen Nerven ihre Funktion immer weniger aufrecht erhalten können, so dass die für die Multiple Sklerose typischen Sensibilitätsstörungen, sowie spastische Paresen bis hin zu Schluckstörungen und Lähmungen der Muskulatur entstehen. In vielen Fällen (ca. 80%) verläuft die Erkrankung primär schubförmig, wobei sich die Symptome nach überstandenem Schub häufig wieder teilweise zurück bilden. Üblicherweise ist der Verlauf jedoch chronisch progredient mit einer häufig fatalen Pathogenese.
Multiple Sklerose (MS) tritt in unterschiedlichen Formen auf, die entweder
nach ihrem Verlauf, z. B. nach ihrem Demyelinisierungsmuster der Läsionen im zentralen Nervensystem oder Läsionen im Gehirn unterschieden werden, was jedoch nur mittels einer Biopsie möglich ist, oder
nach ihrem immunologischen Mechanismus unterschieden werden, d. h. einer durch Makrophagen vermittelten Entzündung,
einer durch Antikörper vermittelten Erscheinungsform,
einer distalen oligodentroglio Partie mit einer chemischen Schädigung der weißen Substanz (durch Vaskulitis kleinster Gefäße) sowie
einer sekundären Demyelinisierung.
Es hat sich nun gezeigt, dass die unterschiedlichen Formen der MS auch einer verschiedenen Therapie bedürfen. http://de.wikipedia.org/wiki/multiple_sklerose
Mittels Kernspinresonanztomographie (MRT) konnte auch gezeigt werden, dass die Schädigung von Axonen an den Nervenenden einen wesentlicher Schritt in der Entstehung irreversibler Nervenschädigungen darstellt. Die einzelnen dabei ablaufenden immunologischen Reaktionen werden bisher jedoch noch nicht in ihrem Zusammenhang vollständig verstanden. Bislang erfolgt die Diagnose durch neurologische Untersuchungen, wie z. B. durch verzögerte Erregungsleitungen von Nerven, Untersuchungen des Liquors cerebrolumbalis mittels Lumbalpunktion oder der bereits erwähnten Magnetresonanztomographie, bei der Entzündungen und Narben im Gehirn sichtbar gemacht werden. Eine laborchemischen Untersuchung erfolgt bislang durch Ermittlung von Anti-MOG-Antikörpern (myelin oligodentrozyten Glycoprotein) und Anti-MBP-Antikörpern (ein entsprechendes an der Membraninnenseite der Myelinzellen (Schwannsche Scheidezellen) auftretendes Protein). (T. Berger in „Antimyelin Antikörper zur Voraussage der klinisch definitiven MS bei Patienten mit Erstmanifestation einer MS", „Neue Horizonte" (4), 2003, S. 6–7) (http://www.gfmk.de)
Bislang war es zu einer sicheren Diagnose von MS notwendig, entweder zwei getrennte Krankheitsschübe zu diagnostizieren und/oder in zwei verschiedenen Regionen des Gehirns oder Rückenmarks Entzündungsherde nachzuweisen. Dabei hat sich insbesonders die Magnetfeldresonanztomographie (MRT) bewährt. Mit diesem Verfahren ist es möglich, nunmehr auch Läsionen bis hin zu einer Auflösung bis hin zu einer Größe von etwa 1 mm nachzuweisen.
Ein Test, mit dem die Multiple Sklerose bereits zu einem frühen Zeitpunkt bzw. den Beginn eines Verschlechterungsschubs erkannt und entsprechende therapeutische Maßnahmen ergriffen werden können, steht bislang noch nicht zur Verfügung. Darüber hinaus besteht Bedarf für eine Verlaufskontrolle, mit dem die Wirkung therapeutischer Maßnahmen kontrolliert werden kann.
Die Erfindung hat daher zum Ziel, ein derartiges Verfahren bereitzustellen. Dieses Ziel wird durch das in den Ansprüchen definierte Verfahren sowie dem dabei verwendeten Test-Kit erreicht.
Erfindungsgemäß wurde nämlich gefunden, dass Multiple Sklerose mit einer Erhöhung an Antikörpern einhergeht, die gegen Spektrin gerichtet sind. Diese Antikörper lassen sich in Körperflüssigkeiten nachweisen.
Spektrine sind Proteine, welche an F-Aktin binden und damit die Gelierung von Aktin hervorrufen. Es liegt im Cytoskelett der Zelle vor und stabilisiert die Zellform. Spektrin selbst liegt als heterotetrameres Protein vor, welches aus einem 260 kDa großen alpha-Spektrin und einem 225 kDa großen beta-Spektrin besteht (alpha₂ beta₂). Eine Subform, die auch als Spektrin ähnliches Protein bezeichnet wird, ist Fodrin. Fodrin vernetzt benachbarte Aktinfilamente miteinander. In einer bevorzugten Ausführungsform werden erfindungsgemäß Antikörper gegen Fodrin bestimmt. Fodrin selbst ist bislang als ein Differenzierungsmarker für Neoplasmen des Darms (M. Younes et al., Am. J. Pathol, Vol. 135 (1989), 1197-1212 bekannt.
In einer erfindungsgemäß besonders bevorzugten Ausführungsform werden Antikörper bestimmt, die gegen alpha-Fodrin gerichtet sind, wobei solche Antikörper ganz besonders bevorzugt sind, die gegen ein 100 bis 140 kDa bzw. 110 bis 130 kDa, insbesonders ein ca. 120 großes kDa Neoantigen von alpha-Fodrin gerichtet sind. Ein solches Neoantigen wird beispielsweise bei der Apoptose durch eine Protease, insbesondere eine Kaspase abgespalten. Typische Kaspasen spalten Peptidbindungen C-terminal von Aspartat, weshalb diese auch als C-Asp-ase bezeichnet werden. Die Abspaltung des 120 kD Fragmentes von alpha-Fodrin erfolgt im Körper mittels Kaspase-3. Obwohl Autoantikörper gegen Spektrine, insbesondere Fodrin in allen Formen der MS aufgefunden werden können, sind sie besonders für die Subtypen 3 und insbesondere 2 besonders charakteristisch.
Prinzipiell ist das Auftreten von IgA und IgG Autoantikörpern gegen alpha-Fodrin beim Lupus erythematodes sowie beim Sjögren Syndrom bekannt. So beschreibt beispielsweise die WO 01/14877 einen Test-Kit zur Bestimmung von Autoantikörpern gegen alpha-Fodrin als spezifischen Marker für die Diagnose des Sjögren Syndroms. Die Erfindung betrifft daher auch die Verwendung eines solchen Tests zur Diagnose und Verlaufskontrolle von MS sowie zur Bestimmung der Subtypen 3 (vorwiegend Apoptose) und insbesonders 2 (Antikörper-vermittelt).
Das Auftreten signifikanter Mengen von IgA Autoantikörpern gegen alpha-Fodrin ist somit ein typischer Nachweis für das Vorliegen von MS, insbesonders der Subtypen 3 sowie 2. Dabei kann die Sensitivität des Tests durch zu sätzliche Bestimmung von IgA und IgG sowie gegebenenfalls IgM gegen die zuvor genannten Spektrine, insbesonders alpha-Fodrin noch erhöht werden. Allein die zusätzliche Bestimmung von IgG Autoantikörpern erhöht die Sensitivität um ca. 10–20%.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann sowohl zur qualitativen als auch zur quantitativen Bestimmung der auftretenden Antikörper erfolgen. Eine quantitative Bestimmung der Autoantikörper zeigt den akuten Zustand der Erkrankung an bzw. die Schwere des Verlaufs. Darüber hinaus lassen sich damit auch sehr gut reaktive Schübe bereits zu Beginn feststellen, wodurch eine frühzeitige und damit erfolgreichere Behandlung dieser schweren Erkrankung möglich wird. Dadurch kann die Entstehung irreversibler Schäden minimiert, gegebenenfalls auch ganz vermieden werden. Prinzipiell wird bei einer qualitativen Bestimmung die Antikörperkonzentration, die oberhalb eines Grenzwertes liegt, als positives Ergebnis definiert. Die Bestimmung derartiger Grenzwerte erfolgt durch entsprechendes Eichen des Testsystems mit Seren aus gesunden sowie erkrankten Patienten.
Üblicherweise werden erfindungsgemäß die Antikörper in einer Körperflüssigkeit bestimmt. Typische Körperflüssigkeiten sind hier Blut, Serum und Plasma, wobei der Liquor cerebrospinalis bevorzugt ist.
Die Bestimmung der IgA bzw. IgG Antikörper gegen alpha-Fodrin, bzw. dem ca. 120 kDa großen Neoantigen davon, kann mittels den dem Fachmann bekannten Techniken, wie z. B. einer ELISA oder RIA durchgeführt werden.
Erfindungsgemäß ist es auch möglich, die Antikörperkonzentration mittels Biosensoren zu bestimmen, wie z.B. amperometrische Sensoren, potentiometrische, innenselektive potentiometrische oder photometrische Sensoren oder auch solche mittels Halbleiterelektroden wie Feldeffekttransistoren (FET), chemosensitive Feldeffekttransistoren (CHEMFET), suspended-gate-Feldeffekttransistoren (SGFET) oder innensensitiven Feldeffekttransistoren. Derartige Biosensoren sind zusammenfassend in E. A. H. Hall und G. Hummel in „Biosensoren", Springer Verlag Heidelberg, Deutschland, 1995 beschrieben. Weitere Entwicklungen von innensensitiven Feldeffekttransistoren (ISFET) oder optischen Detektoren sind u. a. von F. Aberl und H. Wolf in „Aktuelle Trends in der Immunsensorik", Labor 2000, S.70-96 (1993) beschrieben. Ebenfalls geeignet ist das erfindungsgemäße Verfahren für die Durchführung mittels piezoelektrischen Schwingquarzen und Oberflächenwellenelementen, welche als Mikrowaagen verwendet werden können. Dabei wird der primäre Antikörper (der sog. Catcher) auf einem piezoelektrischen Substrat immobilisiert und nach Bindung mit dem zu analysierendem GFAP gemessen. Derartige Sensoren sind beispielsweise von A. Leidl et al. in „Proceedings of the Second International Symposium an Minaturized Total Analyses Systems μTAS", Basel 1996, beschrieben. Quarzkristallmikrowaagen, wie sie von C. Köslinger et al., Fresenius J. Anal. Chem. (1994), 349: 349-354, beschrieben sind, haben sich als besonders geeignet erwiesen.
Das alpha-Fodrin Antigen kann ein natives Protein, welches aus humanen Zellinien erhältlich ist, oder ein re kombinantes Antigen sein, welches in einer heterologen Wirtszelle, Z. B. einer Bakterienzelle wie E. coli oder einer eukaryontischen Wirtszelle, wie einer Insektenzelle durch rekombiante Proteinexpression hergestellt wurde. Vorzugsweise verwendet man ein rekombinantes alpha-Fodrin Antigen, welches die Sequenz des nativen alpha-Fodrins oder Teile davon, insbesondere den N-terminalen Abschnitt enthält. Das rekombinate Antigen kann darüber hinaus heterologe Peptid- oder Polypeptiddomänen enthalten, z. B. eine poly-His-Sequenz, welche die Aufreinigung nach der Expression erleichtert.
Der IgA-spezifische Rezeptor ist im Allgemeinen in Antikörper, der in der Lage ist, Immunglobuline der Klasse A in Gegenwart von Immunglobulinen anderer Klassen, z. B. G oder/und M, selektiv zu erkennen. Für diesen Zweck können polyklonale Anti-IgA Antiseren verwendet werden, die durch Immunisierung von Versuchstieren, Z. B. Ziegen, Ratten, Mäusen, Kaninchen etc. mit humanen IgA nach bekannten Methoden erhältlich sind. Ebenso können jedoch entsprechende monoklonale Anti-IgA Antikörper eingesetzt werden.
Wie bereits ausgeführt, ist das spezifische Testformat im Allgemeinen unkritisch. Vorzugsweise wird jedoch ein heterogenes Testformat verwendet, besonders bevorzugt ein heterogenes Testformat, bei dem ein Immunkomplex bestehend aus Spektrin, insbesonders alpha-Fodrin Antigen, nachzuweisendem IgA-Autoantikörper und IgA-spezifischem Rezeptor an eine Festphase gebunden wird (Sandwich-Testformat). Ebenso kann jedoch auch ein kompetitives Testformat gewählt werden.
Bei einem heterogenen Sandwich-Testformat kann man

(a) ein auf der Festphase immobilisiertes Spektrin, wie z. B. alpha-Fodrin Antigen und einen markierten IgA-spezifischen Rezeptor oder
(b) einen auf der Festphase immobilisierten IgA-spezifischen Rezeptor und ein markiertes Spektrin, wie alpha-Fodrin Antigen verwenden.

Als Festphasen können Reaktionsgefäße, Mikrotiterplatten, Beads, Biochips etc. eingesetzt werden. Die Immobilisierung des Antigens bzw. des Rezeptors auf der Festphase kann durch adsorptive Wechselwirkungen, kovalente Bindung oder vermittelt über ein hochaffines Bindepaar (Streptavidin/Biotin, Hapten/Anti-Hapten-Antikörper) erfolgen. Das immobilisierte Testreagenz kann in einer bereits festphasengebundenen Form eingesetzt oder aber auch erst im Verlauf des Test immobilisiert werden.
Das Verfahren kann als Flüssigtest (z. B. in einem Reaktionsgefäß) oder auch als Trockentest (z. B. auf einem Teststreifen) durchgeführt werden.
Das markierte Testreagenz kann selbst eine nachweisbare bzw. signalgebende Gruppe tragen (direkte Markierung) oder mit einer nachweisbaren Gruppe bindefähig sein (indirekte Markierung). Die Markierungsgruppe kann beliebig aus allen aus dem Stand der Technik für immunologische Nachweisverfahren bekannten Markierungsgruppen ausgewählt werden, beispielsweise aus Enzymen, Metall- oder Latexpartikeln, sowie lumineszierenden oder fluoreszierenden Gruppen. Besonders bevorzugt wird die Markierungsgruppe aus Enzymen, z. B. Peroxidase, β-Galactosidase oder Alkalische Phosphatase ausgewählt und das Verfahren im ELISA-Format druchgeführt.
Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung eines Test-Kits zur Diagnose von Multipler Sklerose umfassend

(a) ein Spektrin Antigen, insbesonders ein alpha-Fodrin Antigen und
(b) einen IgA-spezifischen Rezeptor.

Weiterhin kann der Test-Kit (c) eine Festphase umfassen, an die eines der Testreagenzien (a) oder (b) gebunden ist oder bindefähig ist. Darüber hinaus umfasst der Test-Kit vorzugsweise (d) eine Markierungsgruppe, die an eines der Testreagenzien (a) oder (b) gebunden ist oder damit bindefähig ist.
Außerdem kann der Test-Kit (e) mindestens ein weiteres Antikörperklassen-spezifisches Testreagenz enthalten, falls neben IgA-Autoantikörpern auch noch Spektrin, insbesonders alpha-Fodrin Autoantikörper anderer Immunglobulinklassen bestimmt werden sollen. Beispiele für solche Antikörperklassen-spezifische Testreagenzien sind Anti-IgG-Antikörper oder Protein G zur selektiven Bindung von IgG-Autoantikörpern bzw. Anti-IgM-Antikörper zur selektiven Bindung von IgM-Autoantikörpern. Der Test-Kit kann darüber hinaus noch weitere übliche Reagenzien wie Puffer, Substrate und Waschlösungen enthalten.
Die Erfindung soll durch die nachfolgenden Beispiele weiter verdeutlicht werden:
Beispiel
Es wurden die Seren von 99 Patienten untersucht, welche an klinisch stabiler MS litten, sowie 27 Patienten, welche einen akuten Schub aufwiesen und mit hohen Dosen intravenös verabreichter Steroide behandelt wurden. Dabei wurde das Serum vor und nach der Behandlung abgenommen. Es wurden sowohl unbehandelte Patienten in die Studie aufgenommen als auch Patienten, welche mit Intraferon-β oder Glatirameracetat behandelt wurden. Die Seren wurden bei minus 20°C eingefroren und später auf das Vorliegen von IgG- und IgA-alpha-Fodrin Antikörpern mittels eines handelsüblichen ELISAs (Aeskulisa alpha-Fodrin-A der Aesku. Diagnostics, Wendelsheim, DE) sowie auf antinukleare Antikörper ANA von Hep2-Zellen (Aesku. slides der Aesku. Diagnostics, Wendelsheim, DE) untersucht. Dabei wurden auch die Konzentration dieser Antikörper bestimmt und die Seren als positiv angegeben, die den Grenzwert von 15 U/ml überschritten, und zwar sowohl für die IgG- als auch die IgA-Werte.

Dabei zeigten 6 von 99 Patienten (6,06%) einen erhöhten IgG- und/oder IgA-anti-alpha-Fodrin Spiegel verglichen mit 10 der 27 Patienten (37,04%) mit akuten Schüben (P < 0,001). In sämtlichen Patienten nahm der Antikörperspiegel nach einer Therapie mit Steroiden ab. In 26 klinisch stabilen Patienten wurde das Serum wiederholt über einen Zeitraum von einem Jahr (nach 0, 1, 3, 6 und 12 Monaten) abgenommen. Dabei zeigte sich, dass der Antikörperspiegel in diesen Patienten gleich blieb. Der Test auf ANA zeigte in 77 Patienten mit MS einen Wert größer gleich 1:320 (23,4%) und in 49,4% der Patienten einen Wert von größer gleich 1:160. Ein Zusammenhang der Titer von Anti-alpha-Fodrin und ANA konnte nicht festgestellt werden. Alpha-Fodrin bzw. sein ca. 120 kDa großes Neoantigen ist damit ein wichtiger Indikator für das Auftreten von MS-Schüben, insbesondere vom Subtyp 3 und ganz besonders für den Subtyp 2.

Patient	IgA-Fodrin	IgG-Fodrin
	(μ/ml)	(μ/ml)
1	3	24
2	2	36
3	30	8
4	7	13
5	3	19
6	27	47
7	5	13
8	19	14
9	48	28
10	4	3
11	3,2	3,9
12	6,5	11,6
13	3,1	4,8
14	10,7	6,2
15	29,5	6,2
16	5,8	8,8
17	47,6	32,1
18	8,1	6,1
19	10,1	11,1
20	11	5,2
21	1	3,4
22	26,7	27,9
23	19,8	4,6
24	4,6	4,3
25	6,4	4
26	6,5	5,1
27	14,2	6,3
28	11,1	6,1
29	6,9	6,8
30	15,1	6,9
31	3,2	3,8

Claims

Verfahren zur Diagnose und Verlaufskontrolle von Multiple Sklerose durch Ermittlung von Autoantikörpern in Körperflüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, dass man Antikörper bestimmt, die an ein Spektrin binden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Spektrin Fodrin ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörper gegen die alpha-Form gerichtet sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper gegen ein Spektrinbruchstück einer Größe von 100 bis 140 kDa gerichtet ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörper gegen ein 120 kDa großes Neoantigen gerichtet sind, welches mittels Kaspase-3 abspaltbar ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man als Autoantikörper die IgA- und IgG-Autoantikörper bestimmt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man damit Multiple Sklerose der Subtypen 2 und/oder 3 bestimmt.
Verwendung eines Test-Kits zur Diagnose und Verlaufskontrolle von Multiple Sklerose umfassend a) ein Spektrin Antigen und b) einen spezifischen Rezeptor für einen Autoantikörper.
Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Spektrin Antigen ein alpha-Fodrin Antigen und der Rezeptor ein IgA- oder IgG-spezifischer Rezeptor ist.
Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Festphase umfasst, an die eine der Testreagenzien (a) oder (b) gebunden oder bindefähig ist.
Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Markierungsgruppe umfasst, die an eines der Testreagenzien (a) oder (b) gebunden oder damit bindefähig ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Kit mindestens ein weiteres Antikörperklassen-spezifisches Testreagenz umfasst.