DE102018000855A1 - Verfahren zur Eliminierung von Störungen bei der Antikörperdifferenzierung und prätransfusionellen Kreuzprobe durch therapeutische Antikörper und zur Verbesserung der Antikörperdifferenzierung beim Vorliegen mehrerer Auto-, Allo- oder therapeutischer Antikörper in der Tansfusionsmedizin - Google Patents

Verfahren zur Eliminierung von Störungen bei der Antikörperdifferenzierung und prätransfusionellen Kreuzprobe durch therapeutische Antikörper und zur Verbesserung der Antikörperdifferenzierung beim Vorliegen mehrerer Auto-, Allo- oder therapeutischer Antikörper in der Tansfusionsmedizin Download PDF

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Abstract

Therapeutische, einem Patienten infundierte Antikörper (AK) können den sog. Antikörpersuchtest (AKSU) und die serologische Verträglichkeitsprobe (SVP, Kreuzprobe) stören und so die sichere Versorgung von Patienten mit einer Anämie mit Blutprodukten (Erythrozyten) gefährden. Bisher ist keine Problemlösung beschrieben, wie man Blutgruppenantigene einfach blockieren und die Interferenz ausschalten kann.Lösung des ProblemsDie störenden Antigene auf AKSU-Suchzellen oder Spenderzellen (Erythrozyten) werden mit Substanzen maskiert. Diese Substanzen werden vorher oder gleichzeitig mit der Patientenprobe zugesetzt. Danach kann der AKSU und die SVP ohne Interferenz durchgeführt werden. Ein Beispiel für einen solchen AK ist Daratumumab, ein AK gegen CD38 auf Eythrozyten. Die Spaltung des Antikörpers in vitro mit einer Protease (z.B. Papain) führt zu AK-Fragmenten, z.B. Fab. Diese AK-Fragmente werden zur Maskierung des CD38 in vitro verwendet. Die DARA-AK im Patientenblut können danach im Testsystem nicht mehr stören.AnwendungsgebietIn der Transfusionsmedizin ist zu erwarten, dass der vermehrte Einsatz von therapeutischen Antikörpern wie z.B. Daratumumab zunehmend ein diagnostisches Problem für die Patientenversorgung mit kompatiblem Blut verursacht. Das beschriebene Verfahren kann in Zukunft auch auf andere iatrogene AK oder immune Auto- oder Alloantikörper angewandt werden.

Description

  • Stand der Technik mit Fundstellen:
  • In der Transfusionsmedizin wird die Kompatibilität von Spenderblut (Erythrozytenkonzentraten) getestet, bevor das Blut einem Patienten (Empfänger) transfundiert wird. Mit der sog. Kreuzprobe (Majortest) untersucht man in vitro, ob das Serum oder Plasma des Patienten die Spendererythrozyten agglutiniert. Diese serologische Verträglichkeitsprobe (SVP) ist wichtig, weil der Patient Antikörper (AK) gegen die zu transfundierenden Erythrozyten haben könnte und dies könnte dann zur Zerstörung der transfundierten Erythrozyten (Hämolyse) führen mit z.T. schwerer Schädigung des Patienten. Zusätzlich zur SVP bei einer Transfusion sucht man bei Patienten nach AK in einem Antikörpersuchtest (AKSU) meist im indirekten Antihumanglobulintest (indAHG). Standardmässig erfolgt dieser AKSU z.B. auch bei Patienten vor Operationen, um rechtzeitig Allo- oder Auto-AK zu erkennen, ggf. zu differenzieren und das richtige Spenderblut bereitstellen zu können.
  • Für den AKSU werden von Firmen i.d.R. Testzellen von drei verschiedenen, speziell ausgewählten Spendern gekauft, die bekannte Blutgruppenantigen(BGA)-Profile aufweisen. Wenn das Patientenserum oder -plasma nicht gegen diese ausgewählten Zellen im AKSU reagiert, der Test also negativ ist, dann geht man davon aus, dass keine relevanten AK vorliegen. Zusätzlich wird immer noch das Spenderblut wie o.g. getestet (SVP).
  • Der Vorteil von ausgewählten AKSU-Zellen besteht darin, dass sehr viele BGA mit nur drei Testzellansätzen untersucht werden. Wenn der Patient AK gegen eine oder mehrere Zellen des AKSU hat, dann wird der AK weiter differenziert mit Testzellpanels mit z.B. weiteren 11 verschiedenen Zellen und oft auch noch einem weiteren Zellpanel (z.B. der Fa. Bio-Rad Laboratories GmbH oder Fa. Grifols Deutschland GmbH). Diese Zellen haben speziell ausgewählte Blutgruppenantigene. Die Auswertung der Antikörperdifferenzierung (AKDIFF) aufgrund des Reaktionsmusters des Patientenserums oder -plasmas mit den Testzellen erlaubt meist die Aussage, gegen welches Blutgruppenmerkmal der AK gerichtet ist. Z.B. AK gegen Rh(D), E, c, K, Fy(a), Jk(a).
  • Für eine Transfusion wählt man dann Erythrozytenkonzentrate (EK) aus, die dieses Blutgruppenmerkmal (Antigen) nicht tragen, um eine Hämolyse oder AK-Boosterung zu vermeiden.
  • Wenn mehrere AK vorliegen, dann kann man evtl. die Spezifität der AK nicht mehr ermitteln, weil man zu viele definierte Testzellen bräuchte, um z.B. 3 oder 4 oder 5 AK durch logische Schlussfolgerungen aufgrund des Reaktionsausfalles zu ermitteln. Die Reaktion von AK mit erythrozytären Antigenen (Agglutination) kann mit verschiedenen Systemen nachgewiesen werden, z.B. in sog. Röhrchentests, in Gelkartensystemen (Particle Gel Immuno Assay, PAGIA) oder in Mikrotiterplatten. Das beschriebene Procedere ist seit vielen Jahren Standard in der Transfusionsmedizin und in den meisten medizinischen Laboratorien etabliert.
  • Problem:
  • Es bestehen folgende Probleme in der Transfusionsmedizin bei der Auswertung von AKSU und AKDIFF.
  • (P1) Es werden in der Humanmedizin zunehmend AK iatrogen appliziert, die mit Antigenen auf allen AKSU- und AKDIFF-Zellen reagieren. In der Biotechnologie werden für die Anwendung am Menschen zunehmend Antikörper hergestellt, die gegen bestimmte Moleküle gerichtet sind. Die Zielantigene dieser AK können z.B. auf Tumorzellen lokalisiert sein. Zweck der therapeutischen Gabe (Infusion, Injektion) der AK ist dann, möglichst selektiv Krebszellen zu zerstören. Außer in der Onkologie können solche AK bei vielen Erkrankungen eingesetzt werden, so z.B. auch in bei Autoimmunerkrankungen. Dies AK sind i.d.R. monoklonal und werden in Biotechnologiefirmen wie z.B. MorphoSys AG entwickelt und in Therapiestudien untersucht. Diese AK können teilweise auch gegen Antigene auf Erythrozyten gerichtet sein. Ein Beispiel wird im Patent beschrieben: Daratumumab (DARA) ist der erste monoklonale Antikörper, der zur Behandlung des Multiplen Myeloms eingesetzt wird. Der Antikörper bindet an das Oberflächenprotein CD38, das von den Tumorzellen in allen Stadien der Erkrankung gebildet wird. Die Bindung des Antikörpers führt zum Absterben der Tumorzelle durch Apoptose sowie durch eine verstärkte Immunreaktion. Als unerwünscher Nebeneffekt reagiert DARA auch mit dem CD38 auf Erythrozyten und führt dementsprechend zu einer Agglutination im AKSU und im AKDIFF. Erythrozyten enthalten zwar CD38 in viel geringerer Zahl pro Zelle als die Myelomzelle, jedoch ist der AKSU und AKDIFF nicht mehr auswertbar, weil alle Erythrozyten agglutinieren und man nicht mehr erkennen kann, ob ein immuner Auto- oder Alloantikörper im Patientenblut vorhanden ist. Die SVP ist ebenfalls positiv und nicht auswertbar, d.h. man kann nicht erkennen, ob das Spenderblut kompatibel ist. Zufälligerweise ist das CD38 Molekül empfindlich gegenüber einer chemischen Substanz, dem Dithiotreitol, sodass man mit einer Vorbehandlung der Suchzellen oft das CD38 weitestgehend zerstören kann und so DARA nicht mehr die Testzellen agglutiniert. Diese DTT-Vorbehandlung hat jedoch erhebliche Nachteile, weil auch bestimmte Blutgruppenmerkmale wie z.B. Kell zerstört werden und so AK gegen Kell nicht mehr erkannt werden (Chapuy et al., 2016; Carreno-Tarragona et al., 2018; Subramaniyan et al., 2017; Selleng, 2016). Die DTT-Behandlung mag für DARA noch einigermassen funktionieren, jedoch mit dem Aufkommen weiterer therapeutischer AK ist das DTT mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit nicht einsetzbar.
    In der aktuellen Literatur werden auch z.B. für DARA anti-idiotypische AK beschrieben, die die Störung beseitigen könnten oder die Zugabe von CD38-Molekülen in vitro, die den DARA AK im Patientenblut in vitro bei einer Vorinkubation blockieren können, sodass der AKSU weniger oder gar nicht gestört wird. Diese Möglichkeiten, lösliches CD38 und anti-idiotypischen AK zu verwenden, sind sehr teuer und für neue AK müssen neue lösliche Moleküle entwickelt und anti-Idiotypische AK gefunden werden. Deshalb haben sich diese Methoden auch nicht in den Laboratorien durchsetzen können und sind keine universelle Lösung des Problems.
  • (P2) Es besteht aktuell noch ein weiteres Problem beim AKDIFF. Wenn mehrere AK im Patientenblut vorkommen, können diese oft nicht alle sicher differenziert werden. Das Reaktionsmuster der in der Routinediagnostik kommerziell verfügbaren Testzellpanels ist dann mehrdeutig, sodass durch logische Schlussfolgerung der z.B. dritte oder vierte AK nicht mehr zu ermitteln ist.
  • Lösung:
  • Diese Probleme werden durch die im Patentanspruch 1 aufgeführten Merkmale gelöst:
  • Analyseverfahren zur Verbesserung der Bestimmung von Antikörpern gegen Blutgruppenantigene in einer Serum- oder Plasmaprobe
    mit den Schritten
    1. 1. Kontaktieren einer Substanz, die Antigene auf Erythrozyten maskiert, mit Erythrozytenantigen-haltigen Partikeln, z.B. intakte Erythrozyten oder Membranfragmente, die ein definiertes vorbestimmtes Antigenmuster aufweisen,
    2. 2. ggf. gefolgt von einem notwendigen Abtrennen der maskierenden, ungebundenen Substanz,
    3. 3. mit zeitgleicher oder ggf. späterer Zugabe eines Aliquots einer Serum- oder Plasmaprobe
    4. 4. und Inkubation über einen bestimmten Zeitraum bei einer bestimmten Temperatur in einem gemeinsamen Flüssigkeitsvolumen
    5. 5. ggf. gefolgt von einem notwendigen Abtrennen der Flüssigkeiten von den Erythrozytenantigen-haltigen Partikeln
    6. 6. gefolgt von der Zugabe eines Reagenzes, das mit einer Markierung versehen sein kann und das an die (möglicherweise) vorhandenen Antikörper im Serum oder Plasma bindet, die (möglicherweise) an die Erythrozytenantigen-haltigen Partikel gebunden sind,
    7. 7. ggf. gefolgt von einem notwendigen Abtrennen der Flüssigkeiten
    8. 8. gefolgt von einer Detektion der Bindung des Reagenzes an die möglicherweise vorhandenen Antikörper im Serum oder Plasma, die an die Erythrozytenantigen-haltigen Partikel gebunden sind,
    9. 9. durch z.B. Zentrifugation durch ein Gel im Falle eines anti-human-lg Antikörpers als Reagenz und visuellen Bewertung, ob ein Agglutinat vorliegt (PAGIA-Test)
    10. 10. oder durch ein anderes Verfahren, das den Nachweis der Bindung des Reagenzes an die Antikörper im Serum oder Plasma, die an die Erythrozytenantigen-haltigen Partikel gebunden sind, ermöglicht wie z.B. Agglutinatauswertung im Röhrchentest, ELISA, RIA, PCR, NAT, Hybridisierung
  • Zur Lösung des Problems (P1) der Interferenz von therapeutischen, i.d.R. monoklonalen AK wurde folgendes Verfahren erfunden für die Anwendung in der Transfusionsmedizin. Als Beispiel wurde der kommerziell verfügbare AK (DARA) mit mit einer Protease in mehrere Teile gespalten. Die Teile des AK, die mit dem Antigen (hier CD38) reagieren (z.B. Fab Fragmente), wurden von den Teilen abgetrennt (z.B. Fc Fragmente), die mit dem AHG-Reagenz reagieren. Es wird ein kommerzielles AHG-Reagenz verwendet, das nur oder ganz überwiegend an das Fc-Fragment humaner IgG-AK bindet und nicht oder nur gering an kappa- oder lambda-Leichtketten. Ein AHG-Reagenz, das in geringem Ausmaß auch Fab-Fragmente erfasst, kann evtl. auch eingesetzt werden. Dies ist jedoch experimentell für jedes AHG-Reagenz einfach zu testen. AHG-Reagenzien, die auch Complement erfassen, stören die Methode nicht. Während der Inkubation des fragmentierten Antikörpers DARA mit den Suchzellen reagieren die Fab-Fragmente mit dem Zielantigen CD 38 und maskieren das Antigen auf den AKSU- und AKDIFF-Zellen. Wenn man nun mit dem Serum oder Plasma von DARA-behandelten Patienten, die z.B. an einem Myelom leiden, einen AKSU oder AKDIFF durchführt, kann das im Patientenserum oder -plasma vorhandene intakte DARA nicht mehr mit dem maskierten CD38 reagieren. Die selektive, spezifische Maskierung (Blockade) des Zielmoleküls des therapeutischen AK erlaubt dann eine ungestörte Durchführung des AKSU und des AKDIFF. Die Konzentration des AK-Fragments zur Antigenmaskierung wird so gewählt, dass der intakte therapeutsche AK (z.B. DARA) im Patientenblut nicht oder kaum mehr an die Erythrozyten-Suchzellen binden kann. Das maskierende AK-Fragment kann vor Zugabe des Patientenserums oder -plasmas erfolgen oder zeitgleich. Die bessere Variante muss jeweils evaluiert werden. Dieses Prinzip, denselben AK, der auch zur Therapie eingesetzt wird, auch für die Maskierung zu verwenden, ist somit für alle weiteren therapeutischen AK, die die transfusionsmedizinische in vitro Diagnostik stören, anwendbar.
  • Die Lösung des zweiten Problems (P2), dass mehrere AK im Patientenplasma oder -serum nicht mehr sicher oder gar nicht differenziert werden können bei einer limitierten Anzahl von Suchzellen, ergibt sich analog zum Vorgehen zur Eliminierung der DARA-Interferenz. Kommerziell verfügbare, i.d.R. monoklonale AK gegen Blutgruppenantigene werden gespalten in antigenbindende Anteile und solche, die mit dem AHG reagieren. Durch Inkubation der Suchzellen mit z.B. anti-Rh(D) oder anti-Lu(a) oder anti-Fy(a) AK-Fragmenten kann man die Antigene auf den Suchzellen spezifisch und selektiv maskieren (blockieren). Diese so behandelten Zellen reagieren dann nur noch mit den AK im Patientenplasma oder -serum gegen die nicht maskierten (blockierten) Antigene. So kann man einfach aus dem dann vorliegenden Reaktionsmuster auf den oder die AK schließen. Liegen mehrere AK vor, kann man auch mehrere Antigene wie o.g. blockieren und so auch die Diagnostik ermöglichen.
  • Wenn man AK differenziert hat, kann die selektive Blockade von einzelnen oder mehreren Antigenen auch die Spezifität des AK beweisen. Stellt sich z.B. die Frage, ob ein Plasma oder Serum Daratumumab enthält, dann kann man durch Blockade des CD38-Antigens beweisen, dass ein anti-CD38 AK vorliegt. Ist z.B. fraglich, ob nur ein anti-Fy(a) AK vorliegt, dann müssen nach Blockade des Fy(a)-Antigens alle Suchzellen negativ reagieren, die Fy(a) als Antigen tragen. Reagieren Zellen immer noch positiv, dann liegt ein weiterer AK vor.
  • Dieses Prinzip ist für jeden transfusionsmedizinisch Tätigen sehr einfach verständlich.
  • Erreichte Vorteile:
  • Das erfundene Verfahren erlaubt, (P1) die Interferenz des z.Zt. zunehmend in der Humanmedizin eingesetzten AK DARA zu eliminieren ohne dass es zu weiteren Störungen des AKSU- oder AKDIFF Tests oder der SVP kommt. Das Verfahren ist auch anwendbar auf in Zukunft entwickelte therapeutische AK, wenn diese zu einer Agglutination von Erythrozyten (oder anderen für den AKSU- oder AK-DIFF eingesetzten Antigenen) führt.
  • Das erfundene Verfahren erlaubt (P2), durch die Maskierung von bekannten Antigenen auf den Suchzellen (AKSU, AKDIFF) auch problematische Patientenproben mit mehreren AK zu untersuchen und diese AK auch zu differenzieren.
  • Das beschriebene Verfahren ist einfach anwendbar und kostengünstig.
  • Weitere Ausgestaltung der Erfindung:
  • Die Erfindung beschreibt, wie man in der Transfusionmedizin Störungen des Antikörpersuchtests (AKSU) und der serologischen Verträglichkeitsprobe (SVP, Kreuzprobe) in der in vitro Diagnostik durch Auto-, Allo- oder therapeutische (z.B. Daratumumab), d.h. dem Menschen applizierte Antikörper (AK), eliminieren kann. Die Anwendung der Erfindung kann problemlos weitere Fragestellungen lösen wie in den Patenansprüchen angegeben.
  • Die in einem in vitro Testsystem eingesetzten Blutgruppenantigene (BGAtest) (wie z.B. Suchzellen wie Erythrozyten (ERY) oder Erythrozytenfragmente (Efrag; Seltsam et al., 2014) oder isolierte Blutgruppenantigene (iBGA) oder rekombinante Blutgruppenantigene (rBGA) werden mit Substanzen vorbehandelt oder gleichzeitig inkubiert, die spezifisch einzelne Blutgruppenmerkmale maskieren. Die die BGA maskierenden Substanzen werden hier BGAmask genannt.
  • BGAmask in diesem Sinne sind z.B. Auto-, Allo- oder diagnostische oder therapeutische monoklonale oder polyklonale Antikörper, die so ausgewählt oder verändert sind, dass sie in dem in vitro Testsystem BGA maskieren und somit o.g. Interferenzen eliminieren können oder unerwünsche Antigene maskieren, die das Testsystem stören, wie z.B. CD38. Die BGAmask selbst ergeben in den routinemässig in der Transfusionsmedizin eingesetzten in vitro Systemen kein Signal. Die Maskierung von bestimmten Antigenen auf AKSU-Zellen oder Spenderzellen verhindert die Bindung von störenden Substanzen (wie z.B. bei therapeutischen AK wie z.B. CD38 bei Daratumumab) an diese Zellen.
  • Die BGAmask werden vor oder gleichzeitig mit dem Serum oder Plasma des Patienten mit den BGAtest (den Antigenen im Testsystem) inkubiert. Je nach Konzentration und Avidität der maskierenden Substanz kann diese auch gleichzeitig mit dem Patientenserum oder -plasma inkubiert werden. Durch die Maskierung bestimmter Antigene werden nur noch Antikörper des Patienten gegen nicht maskierte Antigene nachgewiesen. Dies ermöglicht auf einfache Weise, Störungen der in vitro Diagnostik zu eliminieren und die sog. Antikörperdifferenzierung zu verbessern oder erst zu ermöglichen.
  • Dieses Prinzip ist folglich auch anwendbar, wenn ein Patient mehr als nur einen AK gegen BGA der Testzellen oder des Spenderblutes hat.
  • Für die Maskierung von Blutgruppenantigenen (BGAmask) in in vitro Testsystemen können alle Antikörper auch ohne Fragmentierung eingesetzt werden, wenn das im Testsystem eingesetzte Antihumanglobulin-Antiserum (AHG) diesen zur Maskierung verwendeten AK oder das verwendete AK-Fragment nicht detektiert. Das kann z.B. der Fall sein bei intakten AK, die ein nicht humanes Fc-Fragment aufweisen (z.B. Kaninchen, Ziege etc.) oder z.B. gentechnisch hergestellten Antiköpern mit modifizierten Fc-Fragmenten oder z.B. gentechnisch hergestellten F(ab)2- oder Fab-Fragmenten.
  • Für die Maskierung von Antigenen in in vitro Testsystemen können neben den o.g. genannten AK auch andere Substanzen dienen wie z.B. Kohlenhydrate, Lipide, Proteine oder Glykoproteine, Lectine, Peptide oder andere Substanzen, die spezifisch an BGA oder andere, das Testsystem störende Antigene binden können. Die Beschreibung des Prinzips ist für jeden Transfusionsmediziner oder der Transfusionsmedizin in den wesentlichen Grundlagen ausgebildeten Arzt leicht nachvollziehbar.
  • Das beschriebene Verfahren der Maskierung (Blockierung) von Antigenen ist priniziell auf viele verschiedene Varianten der AK-Suche in der Transfusionsmedizin anwendbar. Suchzellen können ersetzt werden durch z.B. mit Erythrozytenmembranfragmente oder synthetischen Blutgruppenantigene, die an Oberflächen immobilisiert werden oder-je nach Testsystem - in Lösung vorliegen. Die Visualisierung der Reaktion der AK im Patientenblut mit Blutgruppenantigenen kann neben dem beschriebenen Gelsäulentest (Partikel-Gel-Immuntest, PAGIA) auch in einem ELISA, Fluoreszenzmesssystem, erfolgen oder weiteren Methoden (z.B. Oligonukleotidmarkierung, PCR oder anderer Nukleinsäureamplifikationsmethoden).
  • Beschreibung eines Ausführungsbeispiels:
  • Als Beispiel für eine transfusionsmedizinsch häufig eingesetzte diagnostische Technik wird der PAGIA (Partikel-Gel-Immuntest) verwendet, der kurz beschrieben sei. Die Testerythrozyten des AKSU oder AKDIFF (50 µl) werden in die Gelkarte pipettiert, unmittelbar danach die Serum- oder Plasmaprobe (25 µl) des Patienten. Ggf. wird inkubiert und dann wird die Gelkarte zentrifugiert. Wenn die Erythrozyten nicht agglutinieren, weil keine AK gegen Erythrozyten im Patientenblut vorhanden sind, dann wandern die Erythrozyten durch das Gel auf den Boden des Säulchens. Es bildet sich eine glatte Oberfläche aus. Wenn AK vorhanden sind, dann bleiben die Agglutinate auf dem Gel liegen oder türmen sich am Boden des Gelsäulchens auf. Der AKSU ist dann positiv. Die AK-Differenzierung erfolgt dann mit mehr Testzellen, z.B. mit Panels von 11 oder 22 Testzellen.
  • Als Beispiel für die Eliminierung einer AK-Interferenz mit dem AKSU und AKDIFF dient Daratumummab, ein therapeutischer anti-CD38 AK.
  • DARA (DARZALEX 20 mg/ml Konzentrat zur Herstellung einer Infusionslösung; Hersteller JANSSEN-CILAG GmbH) wurde verwendet. Als Kit zur Herstellung von Fc- und Fab-Fragmenten wurde verwendet: Pierce™ FAB Preparation Kit, Best. Nr. 44985, Fa. ThermoScientific. Der Kit enthält alle Materialien zur Herstellung und Reinigung von Fab Fragmenten und eine exakte Beschreibung des Vorgehens. Wir haben 100 µl Darzalex™ verwendet und mit 400 µl Digestion-Buffer gemischt, um das gewünschte Endvolumen der IgG Lösung von 500µl zu erhalten mit einer Konzentration von 4 mg/ml (Zielbereich nach Anleitung zwischen 0,5-8mg/ml). Das weitere Procedere entsprach der Anleitung des Testkits.
  • Die im Pierce™ FAB Preparation Kit zeigt das Prinzip der Fab Herstellung.
  • Die Wirksamkeit der Spaltung des Darzalex wurde mittels Immunfixation überprüft. 10µl verschiedener Lösungen wurden auf das IFE-Gel aufgetragen (Hydragel Immunofixation 4 IF, Fa. Sebia). In Spur 1 (ELP) ist aufgetragen das intakte Darzalex worden, in Spur 3 (A), 4(M) und 5(K) das Darzalex nach Papain-Verdau und noch vor Protein A Aufreinigung. Nach der Proteintrennung im Agarosegel durch Elektrophorese wurden folgende Antiseren für die Immunfixation aufgetragen: in Spur 1 (ELP) und Spur 3 (M) wurden anti-IgG AK aufgetragen, in Spur 4 (M) das antikappa-Leichtkettenantiserum und in Spur 5 (K) anti-lambda-Leichtkettenantiserum. Man sieht nach Papain-Verdau die erwarteten Fragmente Fc in Spur 3(A) und Kappa-Leichtketten Spur 4(K). Da Darzalex ein monoklonaler IgG1 AK vom Kappa-Leichtkettentyp ist, reagiert das anti-Lambda-Antiserum (Spur 5) nicht mit der Darzalex-Spaltprodukten. Ohne Protein A Aufreinigung sind noch geringste Mengen von intaktem IgG zu erkennen.
  • Die AKSU-Tests wurden mit dem PAGIA System der Fa. BioRad durchgeführt (ID-Karte „Coombs Anti-IgG“ Id-n:50540 und auch mit der Karte „LISS/Coombs“ ID Karte Id.n: 50531, Fa. BioRad Laboratories)
  • Es wurden 50µl Suchzellen mit 12,5 µl Dara-Fab vorinkubiert für 30 min bei 37°C in einem 2 ml Eppendorf-Gefäß. Als Kontrolle wurden 50µl Suchzellen mit 12,5 µl Diluent II (Fa. BioRad) vorinkubiert. Diese Zellsuspensionen wurden dann auf die Gelkarte aufgebracht wie üblich und mit 25µl Patientenplasma 10 min bei 37°C inkubiert. In den Gelsäulen mit DARA-Fab sind keine Agglutinate zu erkennen, in den Gelsäulen ohne DARA-Fab sieht man die Agglutination durch die Bindung von Daratumumab an das CD38 auf den Suchzellen.
  • Zur Absicherung der Ergebnisse wurden alle Suchzellen des AKSU und des AKDIFF getestet mit dem gleichen Ergebnis.
  • Es wurden Plasmen und Seren von drei verschiedenen Patienten getestet zu verschiedenen Zeitpunkten der Blutentnahme. Wir untersuchten die IgG1-Konzentration vor Darzalex-Gabe und am Folgetag und ermittelten einen IgG1-Anstieg, bedingt durch die DARA-Infusion, von ca. 400 mg/l (IgG-Subklassen-Bestimmung am Gerät BN ProSpec, Fa. Siemens Healthcare Diagnostics GmbH). Sogar am Folgetag der Darzalex Infusion (16mg/kg KG; ca. 1000 mg) war die Daratumumab-Interferenz verhindert.
  • Dieses Beispiel zeigt, dass das beschriebene Verfahren die o.g. Probleme sicher lösen kann.
  • Literatur:
    • Chapuy Cl, Aguad MD, Nicholson RT, AuBuchon JP, Cohn CS, Delaney M, Fung MK, Unger M, Doshi P, Murphy MF, Dumont LJ, Kaufman RM; DARA-DTT Study Group* for the BEST Collaborative.Transfusion. International validation of a dithiothreitol (DTT)-based method to resolve the daratumumab interference with blood compatibility testing. 2016 Dec;56(12):2964-2972. doi: 10.1111/trf.13789. Epub 2016 Sep 7. PMID: 27600566
    • Carreño-Tarragona G, Cedena T, Montejano L, Alonso R, Miras F, Valeri A, Rivero A, Lahuerta JJ, Martinez-Lopez J. Papain-treated panels are a simple method for the identification of alloantibodies in multiple myeloma patients treated with anti-CD38-based therapies. Transfus Med. 2018 Jan 25. doi: 10.1111/tme.12508. [Epub ahead of print] PMID: 29369430
    • Subramaniyan R, Satheshkumar R, Pereira KR. Role of daratumumab in transfusion medicine: a must know entity. Rev Bras Hematol Hemoter. 2017 Oct - Dec;39(4):375-378. doi: 10.1016/j.bjhh.2017.07.002. Epub 2017 Aug 8. PMID: 29150115 (Free PMC Article)
    • Selleng, K.; Positiver indirekter Antihumanglobulintest durch Daratumumab - Strategien für die transfusionsmedizinische Versorgung; Transfusionsmedizin 2016; 6: 70-75
    • Seltsam A, Wagner F, Lambert M, Bullock T, Thornton N, Scharberg EA, Grueger D, Schneeweiss C, Blasczyk R. Recombinant blood group proteins facilitate the detection of alloantibodies to high-prevalence antigens and reveal underlying antibodies: results of an international study.Transfusion. 2014 Jul;54(7):1823-30. doi: 10.1111/trf.12553. Epub 2014 Mar 18. PMID: 24635443

Claims (9)

  1. Analyseverfahren zur Verbesserung der Bestimmung von Antikörpern gegen Blutgruppenantigene in einer Serum- oder Plasmaprobe mit den Schritten 1. Kontaktieren einer Substanz, die Antigene auf Erythrozyten maskiert, mit Erythrozytenantigen-haltigen Partikeln, z.B. intakte Erythrozyten oder Membranfragmente, die ein definiertes vorbestimmtes Antigenmuster aufweisen, 2. ggf. gefolgt von einem notwendigen Abtrennen der maskierenden, ungebundenen Substanz, 3. gefolgt von der Zugabe eines Aliquots einer Serum- oder Plasmaprobe 4. und Inkubation über einen bestimmten Zeitraum bei einer bestimmten Temperatur 5. ggf. gefolgt von einem notwendigen Abtrennen der Flüssigkeiten von den Erythrozytenantigen-haltigen Partikeln 6. gefolgt von der Zugabe eines Reagenzes, das mit einer Markierung versehen sein kann und das an die (möglicherweise) vorhandenen Antikörper im Serum oder Plasma bindet, die (möglicherweise) an die Erythrozytenantigen-haltigen Partikel gebunden sind, 7. ggf. gefolgt von einem notwendigen Abtrennen der Flüssigkeiten 8. gefolgt von einer Detektion der Bindung des Reagenzes an die möglicherweise vorhandenen Antikörper im Serum oder Plasma, die an die Erythrozytenantigen-haltigen Partikel gebunden sind, 9. durch z.B. Zentrifugation durch ein Gel im Falle eines anti-human-lg Antikörpers als Reagenz und visuellen Bewertung, ob ein Agglutinat vorliegt (PAGIA-Test) 10. oder durch ein anderes Verfahren, das den Nachweis der Bindung des Reagenzes an die Antikörper im Serum oder Plasma, die an die Erythrozytenantigen-haltigen Partikel gebunden sind, ermöglicht wie z.B. Agglutinatauswertung im Röhrchentest, ELISA, RIA, PCR, NAT, Hybridisierung
  2. Analyseverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt 1 die sog. Erythrozytenantigen-haltigen Partikel bestehen können aus Blutgruppen- oder anderen erythrozytären Antigenen, die rekombinant hergestellt wurden oder aus menschlichen Zellen, insbesondere menschlichen Erythrozyten, gereinigt oder synthetisch hergestellt wurden.
  3. Analyseverfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt 1 die Erythrozytenantigen-haltigen Partikel kein definiertes vorbestimmtes Antigenmuster haben müssen, wenn man nur untersuchen will, ob ein bestimmter Antikörper (z.B. Daratumumab) im Plasma oder Serum vorhanden ist indem man prüft, ob man die Antikörperbindung an die Erythrozytenantigen-haltigen Partikel spezifisch durch die maskierende Substanz (z.B. Daratumumab- Fab-Fragmente) beseitigen kann.
  4. Analyseverfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt 2 entfallen kann und die Zugabe des Aliquots der Serum- oder Plasmaprobe sofort oder nach erst nach einer Vorinkubation der Substanz in Schritt 1 erfolgen kann.
  5. Analyseverfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt 1 statt nur einer auch mehrere Substanzen verwendet werden können zur Maskierung von erythrozytären Antigenen und somit beim Vorliegen mehrerer Antikörper im Serum oder Plasma die AK-Differenzierung ohne die Interferenz durch diese Antikörper erfolgen kann und die Richtigkeit und Spezifität der AK-Differenzierung überprüft werden kann, weil nach der Maskierung die Antikörper, die gegen die maskierten Antigene gerichtet sind, nicht mehr mit den Erythrozytenantigen-haltigen Partikel reagieren
  6. Analyseverfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt 1 die maskierende Substanz ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper ist, der nicht mit dem Reagenz zum Nachweis des Antikörpers im Serum oder Plasma reagiert, weil er z.B. kein humanes Fc-Fragment hat, weil er z.B. von einem Tier stammt oder weil das Fc-Fragment z.B. durch eine Protease oder andere biochemische Prozesse oder durch chemische Spaltung abgetrennt wurde oder weil der monoklonale AK biotechnologisch ohne Fc Fragment hergestellt wird
  7. Analyseverfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt 1 die maskierende Substanz ein Protein sein kann oder ein Glykoprotein oder ein Lectin oder ein Kohlenhydrat oder ein Lipid oder eine anorganische Substanz.
  8. Analyseverfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt 3 nicht Serum oder Plasma eines Patienten verwendet wird sondern eine andere Flüssigkeit, die die zu untersuchenden AK enthält
  9. Analyseverfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt 1 die Substanz andere Antigene auf Zellen (wie z.B. Plasmazellen) oder in Geweben (z.B. Tumorzellen im Tumorgewebe) maskiert als die als Beispiel dienenden Erythrozytenantigene und in Schritt 1 auch eine Mischung von maskierenden Substanzen verwendet werden kann und ggf. Schritt 2 und/oder Schritt 5 und/oder Schritt 7 entfallen und in Schritt 3 andere Flüssigkeiten als Serum und Plasma unersucht werden und in Schritt 6 das Reagenz AK gegen andere Antigene als erythrozytäre Antigene erfasst und in Schritt 8 die Detektion der Bindung eines Reagenzes an AK, die gegen andere als erythrozytäre Antigene gerichtet sind, erfolgt
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CN115541895A (zh) * 2022-11-29 2022-12-30 天津德祥生物技术股份有限公司 一种提高微流控反定检测卡灵敏度的配方液及应用
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