JP2011516876A - 肺動脈高血圧を診断するための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、患者由来の生物学的試料における抗テネイシンＣ抗体の存在および／または量を決定することを含む、肺動脈高血圧（ＰＡＨＴ）、またはＰＡＨＴを発達させる危険性を検出するためのインビトロ方法に関する。

Description

本発明は、肺動脈高血圧の診断および追跡に関する。

先行技術：
肺動脈高血圧（ＰＡＨ）は、死を生じさせ得る右心臓代償不全の発生を担う稀な病態である。ＰＡＨは、上昇した肺毛細管圧の非存在下での、安静の間の２５ｍｍＨｇ以上の、または運動の間の３０ｍｍＨｇ以上の平均肺動脈圧の、右カテーテル処置による、実証によって規定される（Rubin, 1997）。ＰＡＨの発生は、内皮細胞、血管平滑筋細胞および線維芽細胞の増殖に二次的な小肺動脈の慢性閉塞の結果である（Dorfmuller et al., 2003）。特に、重症のＰＡＨの間、この状態に特徴的である、新生内膜と呼ばれる、内皮と内弾性板との間に位置する筋線維芽細胞および細胞外マトリックスの層が形成される。

ＰＡＨは、自己免疫成分を伴う病態、すなわち結合組織疾患、特に、全身性強皮症（Hachulla et al., 2005）、シャープ症候群（le syndrome de Sharp）および全身性エリテマトーデスの進行の間に生じ得る。さらに、特発性ＰＡＨの間に、自己免疫紅斑、すなわち抗核抗体または抗サイログロブリン抗体が時折見出される。

抗内皮細胞抗体（Tamby et al., 2005）および抗線維芽細胞抗体（Tamby et al., 2006）の存在が、特発性ＰＡＨまたは全身性強皮症に関連するＰＡＨの間に報告されている。しかし、ＰＡＨの発生に関するこれらの抗体の予測的価値は研究されておらず、そして特発性ＰＡＨ病原性における自己免疫現象の潜在的役割は不確かなままである（Mouthon et al., 2005）。

大部分の場合、患者がＩＩＩ度またはＩＶ度の呼吸困難を示す場合に、ＰＡＨについてスクリーニングされる。患者が全身性強皮症のような慢性疾患についてモニターされる場合、年一回の心エコーによって、ＰＡＨについてスクリーニングされる。

しかし、ＰＡＨについてスクリーニングするための簡単なそして信頼できる試験は、なお欠如しており、そして最も早期の可能な診断のために非常に価値があり、それは、患者の状態および前記患者についての生存見込みを改善するための治療ストラテジーを迅速に立てることを可能にする。

発明の概要：
本発明はここに、ＰＡＨ、またはＰＡＨを発達させる危険性を検出するためのインビトロ方法であって、方法は、患者由来の生物学的試料における抗テネイシンＣ（ＴＮ−Ｃ）抗体の存在および／または量を決定することを含み、抗ＴＮ−Ｃ抗体の存在がＰＡＨまたはＰＡＨを発達させる危険性の指標となる、方法を提供する。

好ましくは、生物学的試料における抗テネイシンＣ抗体の存在はコントロール値と比較され、コントロール値より多い量の抗テネイシンＣ抗体の存在がＰＡＨまたはＰＡＨを発達させる危険性の指標となる。

本発明の別の主題は、ＰＡＨの予後または追跡のためのインビトロ方法であって、方法は、種々の時点で、患者由来の生物学的試料における抗ＴＮ−Ｃ抗体の存在および／または量を決定することを含み、経時的な抗ＴＮ−Ｃ抗体の量の増加がＰＡＨの悪化の指標となる、方法である。

本発明の別の主題は、ＰＡＨのための処置の効力を評価するためのインビトロ方法であって、方法は、処置の前、間または後の種々の時点で、患者由来の生物学的試料における抗ＴＮ−Ｃ抗体の存在および／または量を決定することを含み、経時的な抗ＴＮ−Ｃ抗体の量の減少がＰＡＨの改善の指標となる、方法である。

発明の詳細な説明：
ＴＮ−Ｃは、胎児肺において血管の内側および周囲で発現されるが（Rettig et al., 1994）、それは、正常成体肺動脈においてはその後もはや発現されない（Jones et al., 1996）。さらに、ＰＡＨの発生の素因となり得る調節性Ｔ細胞の欠如を担う、ＢＭＰＲＩＩを介するシグナル伝達の喪失も（Nicolls et al., 2005）、インビボでの、そして培養中の血管細胞上でのＴＮ−Ｃの発現を誘導し得る（Ihida-Stansbury et al., 2006）。これに基づいて、本発明者らは、ＰＡＨを有する患者がＴＮ−Ｃに対する免疫応答を発達させ得るという仮説を進めた。従って、本発明者らは、ＰＡＨに罹患している患者の血清中の抗ＴＮ−Ｃ抗体について探索することにした。

本発明者らは、このようにして、ＰＡＨの発生と抗ＴＮ−Ｃ抗体の産生との間の相関を実証することができた。これに基づいて、本発明者らは、ＰＡＨ、またはＰＡＨを発達させる危険性の診断または予後のためのインビトロ方法であって、患者由来の生物学的試料における抗ＴＮ−Ｃ抗体の存在および／または量を決定することを含む方法を提唱する。検出される抗ＴＮ−Ｃ抗体は、好ましくは、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である。

定義
テネイシンＣ（またはＴＮ−Ｃ）は、細胞外マトリックス糖タンパク質である。それは、ヘキサブレイキオンまたはサイトタクチンとしても知られている。ヒトＴＮ−Ｃ配列を付属書類において報告する（配列番号１）。

用語「生物学的試料」は、患者由来の任意の生物学的試料を指す。試料の例としては、生物学的液体および組織バイオプシーが挙げられる。好ましくは、試料は、血液、血清、唾液、尿または精液であってもよい。より好ましくは、生物学的試料は、血液または血清試料である。

用語「患者」は、試験されることのできる任意の個体を指す。好ましくは、それはヒトであるが、この用語は、任意の他の哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、げっ歯類、ウシ、ウマ、サルなどを含む。患者は、その性別または年齢を問わず試験されることができる。患者は、危険性のある個体であり得るか、無症候であり得るか、または初期のもしくは進行したＰＡＨの徴候を示し得る。例えば、患者は、ＰＡＨを発達させる素因のある個体、特に、ＢＭＰＲＩＩをコードする遺伝子における１つ以上の変異を保有する個体であってもよい。

用語「診断」は、病態の同定または病態の重症度の状況の評価を意味する。

用語「予後」は、悪化の危険性、およびその成り行きの評価を意味する。

用語「コントロール値」は、ＰＡＨまたはＰＡＨに導き得る疾患に罹患していない、健常個体由来の生物学的試料を用いて得られる値の平均に対応する基礎値を指す。それは統計学的参照値であってもよい。

病態の進行を評価するために、患者を試験し、そして処置の効果または病態の進行を、再度、例えば数ヶ月の間隔で、患者を試験することによって検証することが有用であり得る。この場合、第２の試験の結果は、第１の試験の結果と、そしてしばしば「コントロール」値とも、比較される。

「コントロール値より多い」抗ＴＮ−Ｃ抗体の量は、一般に、例えば、全ての健常個体のＩｇＧ反応性の光学密度の平均を上回る少なくとも２標準偏差の、統計学的に有意な増加を意味する。

「捕捉抗原」は、親和性結合によって、生物学的試料中に存在する抗ＴＮ−Ｃ抗体を保持することができる、好ましくは固相に結合された、抗原を意味することが意図される。捕捉抗原は、標識されることができる。

用語「標識」は、直接標識（酵素、放射性同位体、蛍光色素、発光化合物などによる）および間接標識（例えば、それ自体が直接標識されている抗体によるか、または、排他的ではないが、標識アビジン−ビオチン対などのような標識「親和性対」の試薬を使用する）の両方を指す。

抗体のアッセイ：
生物学的試料は、好ましくは、１／１００、またはそれ以上、例えば１／２００または１／４００希釈された、血清試料である。

有利には、抗ＴＮ−Ｃ抗体の量をイムノアッセイによって決定することができる。

生物学的試料を、場合により先の工程において処理することができ、または少なくとも１つの捕捉抗原と直接接触させることができる。

本発明による方法を、当業者に周知の種々のフォーマットに従って：固相でまたは均質相で；１工程でまたは２工程で；競合方法で（非限定的な例として）、行うことができる。

１つの好ましい実施態様によれば、捕捉抗原は固相上に固定化される。固相の非限定的な例として、マイクロプレート、特にポリスチレンマイクロプレート、例えば、デンマークの企業Nuncによって販売されているものを使用してもよい。固体粒子またはビーズ、常磁性ビーズ、例えばDynalまたはMerck-Eurolab（France）によって提供される（商標Estapor（商標）の下に）もの、またはそうでなければポリスチレンもしくはポリプロピレン試験管などを使用してもよい。

競合によって抗体を検出するためのイムノアッセイフォーマットも可能である。他のイムノアッセイ様式も意図され得、そしてそれらは当業者に周知である。

ＥＬＩＳＡアッセイ、ラジオイムノアッセイ、または任意の他の検出技術を、形成された抗原−抗体複合体の存在を明らかにするために使用することができる。

１つの好ましい実施態様によれば、本発明の方法は、生物学的試料を、配列番号１に示すヒトＴＮ−Ｃ配列のアミノ酸１８１〜２９０のフラグメントを含むタンパク質と接触させることを含む。

１つの特定の例において、捕捉抗原（これは、ヒトＴＮ−Ｃ配列のアミノ酸１８１〜２９０のフラグメントを含むタンパク質であることができる）を、マイクロプレート上に沈着させる前に、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に結合させることができる。

１／１００に事前希釈された、試験しようとする血清試料を、マイクロプレート上でインキュベートする。洗浄後、標識抗ヒトＦｃγ抗体（例えば、アルカリホスファターゼで標識されている）を加え、複合体を、例えば、吸光度を読み取ることによってその切断を検出することができる、ホスファターゼの基質の添加によって、明らかにする。

目的の患者：
目的の患者は、ＰＡＨを発達させ得る患者である。

これは、結合組織疾患、例えば、全身性強皮症、シャープ症候群（これは、混合性結合組織疾患である）または全身性エリテマトーデスに罹患している患者を含み得る。

患者は、特発性または家族性ＰＡＨに罹患していてもよい。

より一般的には、肺血管疾患に罹患している任意の患者が、本発明において定義されるようなＰＡＨを検出するための方法に有利に供されることができる。

さらに、検出されるＰＡＨは、門脈肺高血圧（すなわち、門脈圧亢進に関連するＰＡＨ）であってもよく、または先天性心疾患、またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染に関連していてもよく、またはそうでなければ、慢性閉塞性気管支炎のもしくはシアン形成心疾患の進行を併発する、塞栓後肺高血圧であってもよい。

他の目的の患者は、特定の食欲抑制薬、例えば、フェンフルラミン（その処方はＰＡＨの発生に寄与し得る）に曝露された患者である。

この型の試験から利益を受けることができる他の個体は、その後にＰＡＨを発達させ得る個体についてスクリーニングするために、ＢＭＰＲＩＩをコードする遺伝子における変異を保有し、そして、場合により、心エコーによって検出可能なＰＡＨを示さない個体である。

処置の効力の評価
本発明の別の主題は、ＰＡＨのための処置の効力を評価するためのインビトロ方法であって、方法は、処置の前、間または後の種々の時点で、患者由来の生物学的試料における抗ＴＮ−Ｃ抗体の存在および／または量を決定することを含み、経時的な抗ＴＮ−Ｃ抗体の量の減少がＰＡＨの改善の指標となる、方法である。

ＰＡＨのための現在の従来の処置は、対処療法および血管拡張薬処置を組み合わせる。対処療法は、抗凝固薬、酸素療法および利尿薬を組み合わせる。血管拡張薬処置は以下の分子に基づく：カルシウムチャネルブロッカー、持続注入として静脈内で処方されるエポプロステノール（プロスタサイクリン）、選択的または非選択的エンドセリン受容体阻害剤、特に、ボセンタン、シタクスセンタン（sytaxentan）およびアンブリセンタン（ambrysentan）、ホスホジエステラーゼ５型阻害剤、特に、シルデナフィル（全てのこれらの医薬は経口投与される）、および吸入されるイロプロスト（吸入によって投与されるプロスタサイクリンアナログ）。これらの処置を場合により組み合わせることができる。これらの治療が失敗である場合、肺または心肺移植が提案され得る。

以下の図および実施例は、その範囲を限定することなしに本発明を例証する。

図１は、ＥＬＩＳＡアッセイによる抗ＴＮ−Ｃ抗体の検出を示すグラフである。性別および年齢について組にした、特発性ＰＡＨに罹患している患者由来、全身性強皮症に罹患している患者由来、および健常個体由来の血清ＩｇＧを、１／１００希釈で、組換えＴＮ−Ｃフラグメントに関して試験した。点を付した区域の下限および上限は、健常患者において得られた光学密度の平均を上回る標準偏差の２倍および３倍によって規定される閾値を表す。患者および健常個体の群の間の有意差は、Mann-Whitney順位検定を使用して見積もられ、そして以下によって示される：＊：ｐ＜０．０１＊＊：ｐ＜０．００１。 図２は、抗ＴＮ−Ｃ抗体の存在または非存在に応じたKaplanおよびMeierに従う生存曲線を表す。Ｘ軸に沿って、月での時間；Ｙ軸に沿って、％累積生存。

実施例：肺動脈高血圧に罹患している患者における抗テネイシンＣ抗体の検出
材料および方法：
患者
４０ｍｍＨｇより高い収縮期肺動脈圧を、経胸壁心エコーを通して、実証することによって、ＰＡＨについてスクリーニングした。全ての場合で、右カテーテル処置を行い、そして安静時の２５ｍｍＨｇ以上の、そして身体的運動での３０ｍｍＨｇ以上の平均肺動脈圧を実証することによって、ＰＡＨを確認した。慣例により、患者が関連する病態を示さなかった場合にＰＡＨは特発性として記載され、ＰＡＨは、散発性ＰＡＨ、家族性ＰＡＨまたはフェンフルラミンへの曝露に関連するＰＡＨに対応する可能性がある。米国リウマチ学会（l'American College of Rheumatology）（ＡＣＲ）の基準および／またはLeRoyおよびMedsgerの基準に対応する特発性ＰＡＨ（ＩＰＡＨ）を有する６６人（７２．５％）の患者および全身性強皮症を有する２５人の患者を含む９１人の患者が研究に含まれた（Masi et al., 1980；LeRoy et al., 2001）。

ＰＡＨなしでびまん性全身性強皮症を有する全ての患者は、高分解能胸部スキャン、および予測値の８０％未満の肺活量および／または予測値の７５％未満の一酸化炭素搬出係数（ＤＬＣＯ）によって実証される肺間質合併症を有していた。患者のいずれもが試料を取った時点でコルチコイドステロイドまたは免疫抑制剤を受けておらず、そしてそれらのいずれもが固形腫瘍または別の関連する結合組織疾患を有していなかった。性別および年齢について組にした４６人の健常個体をコントロールとして使用した。

ＥＬＩＳＡアッセイ
テネイシンＣ（ＴＮ−Ｃ）を企業Abnova（Abnova Corporation, Taipei city, Taiwan）から得た。使用した抗原は、ＧＳＴ要素に結合されたＴＮ−Ｃのフラグメント１８１〜２９０（配列番号１）からなった。ＴＮ−Ｃを重炭酸緩衝液中で希釈し、そして９６ウェルプレート（Maxisorb, NalgeNunc Int. Rochester, NY, USA）上に４μｇ／ｍｌの終濃度で４℃で沈着させた。患者由来および健常個体由来の血清を１％アルブミンを含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中で１／１００希釈し、そして１時間３７℃でインキュベートした。洗浄後、アルカリホスファターゼ結合ウサギ抗ヒトＦｃγ抗体（Dakocytomation, Golstrup, Denmark）を加え、そして１時間周囲温度でインキュベートした。反応性を、炭酸マグネシウム緩衝液（ｐＨ９．８）中の０．０５Ｍ ｐ−ニトロフェニルホスファートを加えることによって明らかにし、そして４０５ｎｍにおける吸光度をＥＬＩＳＡプレートリーダー（Fusion, Packard BioScience, Meriden, CT, USA）を使用して決定した。ウェル間の変動を考慮するために、参照血清の光学密度を１００％の抗ＴＮ−Ｃ活性として任意に規定した。試験した試料の結果を、二連のウェルの吸光度の平均から算出し、そしてこの参照値の百分率として表した。全ての試料を二連で試験した。

統計分析
全ての統計分析を、Systatソフトウェア（version 11.0 Systat Software Inc, Point Richmond, CA, USA）を使用して行った。種々の群の相対的光学密度を比較するためにMann-Whitney検定を使用した。０．０５未満のＰ値を統計的に有意であるとみなした。生存をKaplanおよびMeierの方法（Kaplan and Meier, 1958）によって算出した。

結果：
ＴＮ−Ｃに関しての、特発性ＰＡＨに罹患している患者の、ＰＡＨ有りまたは無しで全身性強皮症に罹患している患者の、そしてコントロール個体のＩｇＧの反応性を、ＥＬＩＳＡによって研究した。全ての健常個体のＩｇＧ反応性の光学密度の平均を上回る２標準偏差によって規定される閾値を使用して、特発性ＰＡＨを有する患者の３６／６６（５４．５％）および強皮症患者の２／２５（８％）が抗ＴＮ−Ｃ ＩｇＧを有していた。健常個体のいずれもが抗ＴＮ−Ｃ ＩｇＧを有していなかった（図１）。閾値を健常個体のＩｇＧ反応性の平均を上回る３標準偏差に移動させた場合、特発性ＰＡＨを有する患者の１２／６６（１８．１％）が抗ＴＮ−Ｃ ＩｇＧを有しており、そしていずれの強皮症患者も抗ＴＮ−Ｃ ＩｇＧを有していなかった。特発性ＰＡＨを有する患者の抗ＴＮ−Ｃ抗体血清ＩｇＧの反応性は、強皮症患者のものより（ｐ＜０．００１）そして健常個体のものより（ｐ＜０．００１）有意に高かった。同様に、強皮症患者の抗ＴＮ−Ｃ抗体血清ＩｇＧの反応性は健常個体のものより有意に高かった（ｐ＝０．０２１）（図１）。

臨床症状、および心エコーからの、右カテーテル処置からの、そして６分間歩行試験からのデータにおける有意な差は、患者の２つの群の間で実証されなかった。生存は、抗ＴＮ−Ｃ抗体を有しない患者と比較して、抗ＴＮ−Ｃ抗体を有する患者の群において減少したが、しかし、この差はこの場合有意ではなかった（ｐ＝０．１７）。

ＴＮ−Ｃに対する免疫応答の出現は、ＴＮ−Ｃ発現の誘導を、そして平滑筋細胞の増殖を生じるものと同じ機構から生じ得る。抗ＴＮ−Ｃ抗体の存在は、それゆえ、血管リモデリングの出現と相関し、ＰＡＨの発生についてのマーカーを構成する。

参考文献
- Dorfmuller et al., 2003, Eur Respir J, 22(2):358-63
- Hachulla et al., 2005, Arthritis Rheum 52(12):3792-3800
- Ihida-Stansbury et al., 2006, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 291(4):L694-702
- Jones et al., 1996, Circ Res 79(6):1131-42
- Kaplan and Meier, 1958, J Am Stat Assoc 53:457-81
- LeRoy et al., 2001, J Rheumatol 28(7):1573-76
- Masi et al., 1980, Arthr Rheum 23:581-90
- Mouthon et al., 2005, Eur Respir J 26(6):986-8
- Nicolls et al., 2005, Eur Respir J 26(6):1110-8
- Rettig et al., 1994, J Cell Sci;107 (Pt 2):487-97
- Rubin, 1997, N Engl J Med, 336(2):111-7
- Tamby et al., 2005, Thorax 60(9):765-72
- Tamby et al., 2006, Eur Respir J 28(4):799-807

Claims (16)

1. 肺動脈高血圧（ＰＡＨ）、またはＰＡＨを発達させる危険性を検出するためのインビトロ方法であって、方法は、患者由来の生物学的試料における抗テネイシンＣ抗体の存在および／または量を決定することを含み、抗テネイシンＣ抗体の存在がＰＡＨまたはＰＡＨを発達させる危険性の指標となる、方法。
2. 生物学的試料が血液または血清試料である、請求項１記載の方法。
3. 生物学的試料における抗テネイシンＣ抗体の存在がコントロール値と比較され、コントロール値より多い量の抗テネイシンＣ抗体の存在がＰＡＨまたはＰＡＨを発達させる危険性の指標となる、請求項１または２記載の方法。
4. 抗テネイシンＣ抗体の量がイムノアッセイによって決定される、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
5. イムノアッセイがＥＬＩＳＡアッセイである、請求項４記載の方法。
6. 生物学的試料を、配列番号１に示すヒトテネイシンＣ配列のアミノ酸１８１〜２９０のフラグメントを含むタンパク質と接触させることを含む、請求項４または５記載の方法。
7. 患者がヒトである、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
8. 患者が全身性強皮症に罹患している、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
9. 患者がシャープ症候群に罹患している、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
10. 患者が全身性エリテマトーデスに罹患している、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
11. 患者が特発性ＰＡＨに罹患している、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
12. ＰＡＨが、門脈圧亢進、先天性心疾患、もしくはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染に関連するか、または塞栓後肺高血圧である、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
13. 患者がＰＡＨを発達させる素因のある個体である、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
14. 個体がＢＭＰＲＩＩをコードする遺伝子における１つ以上の変異を保有する、請求項１３記載の方法。
15. ＰＡＨの予後または追跡のためのインビトロ方法であって、方法は、種々の時点で、患者由来の生物学的試料における抗テネイシンＣ抗体の存在および／または量を決定することを含み、経時的な抗テネイシンＣ抗体の量の増加がＰＡＨの悪化の指標となる、方法。
16. ＰＡＨのための処置の効力を評価するためのインビトロ方法であって、方法は、処置の前、間または後の種々の時点で、患者由来の生物学的試料における抗テネイシンＣ抗体の存在および／または量を決定することを含み、経時的な抗テネイシンＣ抗体の量の減少がＰＡＨの改善の指標となる、方法。

Images